TW513307B - Pharmaceutical composition for treating vascular disorders comprising activated protein C - Google Patents

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513307 經濟部中央標隼局員工消費合作社印$1 A7 —________ B7 五、發明説明（1 ) 發明藏圍 本發明係關於醫藥科學之領域，並姓令、 岛禾灯子心唄埤，具特疋心範圍係指使用 活化的蛋白質C治療血管的不適症。 發明背景 蛋白質C是一種絲胺酸蛋白酶及天然抗凝血劑，其功能 是將因子Va及Villa去活化以調節一系列凝血串聯反應之 恆定性。在活體中，製造人類蛋白質c的主要器官是肝 臟，該蛋白質是一種461個胺基酸組成的單鏈多胜肽。其 前驅物分子在轉譯後會經過多重之修飾，包括：i)切除 信號序列的42個胺基酸；2)在酵素原第155位置的離胺酸 殘基和第156位置的精胺酸殘基間進行蛋白質水解產生雙 鏈形式的分子（即155個胺基酸殘基的輕鏈經雙硫鍵和含 262個胺基酸殘基的重鏈絲胺酸蛋白酶键結）；3 )將輕鏈 前42個胺基酸中的九個越胺酸進行維生素K-依賴性的幾 化反應產生9個r -羧基麩胺酸殘基；及4 )將碳水化合物結 合至四個位點（一個位於輕鏈，三個位於重鏈）。重鏈含絲 胺酸蛋白酶之活性三體（Asp 257、His 211及Ser 360)。最 後在循環系統中，此雙鏈酵素原於活體中、在每離子的存 在下，經凝血酶於磷脂質之表面活化。活化時於重鏈N-端 切除十二個胺基酸的胜肽後，產生具酵素活性的活化蛋白 質 C (aPC)。 和其他蛋白質比較下，蛋白質C可能是血液凝結中最重 要的下降調控子。換句話説，蛋白質C酵素系統是抗凝血 的主要生理機制。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 J· 項再填 裝— 寫本頁)

、1T 513307 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 凝血系統是一種連鎖反應，該連鎖反應包括經一系列的 反應來活化各種酵素原形而成爲具活性的絲胺酸蛋白酶， 最後產生酵素凝血酶，該反應經有限的蛋白質水解後，將 血漿纖維素原轉變成不溶的凝膠（纖維蛋白）。凝血串聯反 應中的兩個關鍵反應是用凝血因子IXa將凝血因子X轉變 成Xa，及用凝血因子χ將凝血酶原轉變成凝血酶。此二 反應均發生於細胞表面上（血小板表面）。此二反應進行時 須要輔助因子。主要、的輔助因子（因子V及VIII)是以不活 化的如驅物形式在系統循流，一旦首批少數的凝血酶分子 形成後，這些少數的凝血酶經有限的蛋白質水解後能活化 該輔助因子。輔助因子（Va及VIIIa)活化後能加速凝血酶 原轉變成凝血酶，及將因子χ轉變成因子/Xa，放大的倍 數大約爲1 0的五次方倍。因此活化的蛋白質C壓倒性的經 由水解及不可逆的反應產生此二血漿蛋白質底物。此血漿 蛋白質底物是活化形式的凝血輔助因子（Va及vma)。活 化的蛋白質C僅能少量的降解其不活化的前驅物一凝血因 子V及VIII。狗類的活化蛋白質c能急速的增加循環系統 中溶解生理纖維蛋白的主要酵素之含量，該酵素爲組織血 纖維蛋白溶酶原活化劑（tPA)。離體中活化的蛋白質C能 增進人類血液中纖維蛋白之水解。因此活化的蛋白質c是 人類活體水解纖維蛋白的重要酵素。 目前有少數的有效方法治療血管的閉塞，包括血栓形成 後引發的中風。FDA最近已批准在中風後三小時内使用 tPA。雖然有時可用肝素或口服的抗凝血劑治療中風，但 ____5函 本纸張尺度適财--^——一 i I 111 IT 1— - .· -Η........ - I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 --- 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 513307 A7 _____ B7 五、發明説明（3 ) 是？茨治療劑對梗塞的腦部區域具有致使出血的高度危險 性。Griffin，et al 於U.S. Patent No· 5，084,274 中發表一種狒 狒之模式，該模式使用重組的aPC (r-aPC)治療血栓形成 的閉塞或血栓性栓塞症。Griffin聲稱〇 2 mg/kg/hr至1」 mg/kg/hr之劑量範圍能治療血栓形成的閉塞。但是本發明 之申請者發現此劑量範圍是r-aPC的毒性範圍。例如非人 類靈長類的前臨床毒理學研究顯示注入r-apc之最高劑量 0.05 mg/kg/hr 96小時並不安全。而Griffin，et ai發表的最 低劑量（即0·2 mg/kg/hr)，亦大於本發明之申請者建立之 人類的毒性劑量的4倍。因此就算是Griffill指出的最低劑 量’對腦邵梗塞的區域亦有出血的危險，因此可能會加重 中風帶來的神經損害。據此就算從Griffin，et al的觀點而 言，仍須要確認用aPC治療人類動脈血栓的有效量。 和如述之研究者相反，本發明之申請者發現少量劑量之 r-aPC就能治療血栓形成的中風。使用apc亦能避免微血 管的局部擴張及大血管堵塞的動脈血栓，因此能降低中風 後神經的損害。 發明摘要 本發明提供一種方法治療人類血管阻塞及動脈血栓性栓 塞症的病人，該方法包括對該病人施用劑量大約〇〇1 mg/kg/hr至大約〇·〇5 mg/kg/hr之活化的蛋白質c。本發明亦 提供一種適於連續注入施用之單位劑量形式，該單位劑量 形式含一種接受的單位劑量，大約5 mg至大約2〇 mg之活 化的蛋白質C，適於大約〇·〇ΐ mg/kg/hr至大約〇.〇5 mg/kg/hr -6 - 本纸張尺度適用中關家標準（CNS ) M規格（训；7公瘦） ---,~~*..--·#衣------1T------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 A7 ---________Β7五、發明説明（4 ) —之施用劑量。 ：§L明之詳細説明 本發明之目的、揭示及申請專利範圍中，以下之名詞定 義如下。 aPC或活化的蛋白質c是指重組的或來自血漿的蛋白質 C。雖然許多種類動物之aPC或衍生物具備蛋白質c之蛋 白質水解、二氫氯酸二氨基驗水解、酉旨類水解、及生物的 (抗凝血劑或纖維蛋白原水解的性，但 類的蛋白質卜蛋白質C衍生物之實施例己描述於二， et al·、U· S · patent No· 5,453,373、及 Foster，et al·，U.S· patent No. 5,516,650，全文在此併入參考文獻。 APTT -部份凝血質活化的時間。 AU -二氫氣酸二氨基酚水解的單位。 HPC -人類的蛋白質c酵素原。MEA - 2-胺基乙醇。 tP A -组織血纖維蛋白溶酶原活化劑。 r-HPC -重組的人類蛋白質c酵素原。 生產r-aPC-重組的活化蛋白質c的方法，是將蛋白質c酵 素原在離體或活體中活化或直接自原核細胞、眞核細胞、 或導入外來基因的動物中分泌活化形式的蛋白質c，例如 自人類賢臟的293細胞分泌酵素原，然後用揭示於Yan， U.S. Patent No· 4,981，952，及 Cottingham，W0 97/20043 (全 文在此併入參考文獻）中已知的技藝，由熟悉此技藝之專 業人士將之純化及活化。 「 Γ請先閲讀背面之注意事¾再填寫本頁j m I 1...... 1 - ; I - If. ^衣 II -..... I ........ 訂------J—^1 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) ~- •連％的汪入-於一特定的時間内連續不斷的從血管注入 溶液。 、大_丸藥注射-於多至大約12〇分鐘的時間内注射定義量 之藥品（稱爲大丸藥）。 適當的治療_從冷凍乾燥的aPC製備配方或溶液作爲適 當的治療劑。 酵素原·一種蛋白質水解酵素之酵素不活化的前驅物。 此處之蛋白質c酵素原是分泌、不活化的形式，單鏈或雙 鏈之蛋白質c。 本發明之申請者從事人類之外靈長類的前臨床毒理學之 研究顯示，96小時内注入大約0 05 mg/kg/hr最高劑量之Γ_ aPC並不安全。此結果和前述之技藝相互矛盾。事實上， 基於前述前臨床及臨床研究之結果顯示，使用於人類的r_ aPC之劑量，高於上述毒理研究建立之毒性範圍。 本發明提供一種治療人類血管的閉塞及動脈血栓性栓塞 症病人的方法，此方法包括對該病人施用大約〇〇1 mg/kg/hr至大約〇·〇5 mg/kg/hr劑量之活化的蛋白質c。施用 低劑量的活化蛋白質C能治療血栓形成後引發的中風，同 時不會如高劑量般產生出血的問題。本發明進一步的用重 組的人類蛋白質C (r-aPC)進行人類的臨床實驗，以測定血 漿中r-aPC之濃度（實施例1)。 本發明亦用犬科動物模式之閉塞冠狀動脈血栓形成（實 施例2 )之完全阻塞的冠狀動脈，經靜脈注射r-aPC後產生 之再灌流效應。令人驚異的是經r_apC處理後，八隻實驗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐ〇χ 297公釐） ----J~~..--------、玎------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 513307 A7 B7 五、發明説明（6 ) 動物中有六隻出現血管再灌流的現象，而控制組的六隻動 物中沒有任何一隻出現再灌流的現象。 本發明係關於用活化的蛋白質C治療血管的閉塞或動脈 血检性检塞症，包括血检形成引發的中風、周邊動脈的血 栓形成、源自心臟或周圍的動脈栓子、急性的心肌梗塞、 及冠狀動脈的疾病。 本發明可依據己知的方法製備aPC的藥學組成物。施用 aPC時最好以非經腸的注射方式，連續的注入適當的劑量 大約1至大約4 8小時，以確保其有效形式能運送至血液。 較佳的施用方式是連續的注入適當劑量的ai>C大約4至大 約3 6小時。更佳的施用方式是連續的注入適當劑量的aPC 大約1 2至大約2 4小時。最佳的施用方式是連續的注入適 當劑量的aPC大約2 4小時。一旦診斷爲中風後，儘快施用 aPC ° aPC之施用量大約爲〇.〇1 mg/kg/hr至大約0.05 mg/kg/hr， 相當於大約20mg/70kg/24小時至大約84mg/70kg/24小時。 每2 4小時均aPC之施用量相同的特定劑量，但熟悉此技藝 的專業人士均知此指定劑量不必限於2 4小時内注入，可 在不同的時間連續的注入，例如大約1小時至大約4 8小 時。aPC之較佳aPC之施用量劑量大約爲0.01 mg/kg/hi*至大 約 0.04 mg/kg/hr (大約 20mg/70kg/24 小時至大約 67mg/70kg/ 24小時）。aPC之更佳施用劑量大約爲0.01 mg/kg/hr至大約 0.03mg/kg/hr (大約 20mg/70kg/24 小時至大約 50 mg/70kg/24 小時）。aP C之最佳施用劑量大約爲0.024 mg/kg/hr (大約 -9 - 衣纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I,--J-----·裝------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 513307 A7 B7 五、發明説明（7 ) 40mg/70kg/24 小時）。 此外部份的aPC可採用大丸藥注射的方式，每小時注射 適當劑量大約5分鐘至大約3 0分鐘，接著連續的注入適當 的劑量大約2 3小時至大約4 7小時，於2 4小時至4 8小時的 施用時間内注入適當的劑量。 如前述所言，此處之aPC劑量和Griffin等人所提之劑量 不同。Griffin申稱的治療血栓形成閉塞的劑量介於0.2 mg/kg/hr至1 · 1 mg/kg/hr。而本法方申稱的劑量爲上述劑量 之十分之一，約爲0.01 mg/kg/hr至大約0.05 mg/kg/hr。治 療血栓形成閉塞最佳之aPC劑量大約爲0.024 mg/kg/hr。値 得一提的是，本文中之最佳劑量0.024 mg/kg/hr比Griffin聲 稱之最低劑量低八倍、而比Griffin聲稱之最高劑量低44 倍0 製備1

製備人類的蛋白質C 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 重組的人類蛋白質C (rHPC)是用熟悉此技藝之專業人士 所熟知的方法在人類腎臟的293細胞中生產，參見Yan， U.S· Patent No. 4,981，952，全文在此併入參考文獻。人類 的蛋白質C的基因編碼揭示於Bang，et al.，之U. S. Patent No. 4,775,624，全文在此併入參考文獻。在2 93細胞中表達人 類蛋白質C的質體pLPC揭示於6&叩，61&1.，11.8.?3161^1^〇· 4,992,373，全文在此併入參考文獻。構建質體pLPC之方 法亦描述於European Patent Publication No. 0 445 939 5 及 Grinnell，et al.，1987，Bio/Technology 5:1189-1192，全文在 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 513307 A7 B7 五、發明説明（8 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此亦併入參考文獻。簡而言之，將質體轉染入293細胞後 分離穩定的轉形株，使其在不含血清的培養液中培養主 長。發酵後，用微離心法收集不含細胞之培養液。 可採用改良過的技藝（參見Yan，U.S. Patent No. 4,981，952，全文在此併入參考文獻）將人類的蛋白質C自 培養液中分離。將澄清的培養液調整至4 mM之EDTA後通 過陰離子交換樹脂（Fast Flow Q，Pharmacia)。用4倍管柱 體積之20 mM Tris，200 mM NaCl，pH 7.4及2倍管柱體積 之 20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4 清洗，結合至管柱 之重組的人類蛋白質C酵素原用20 mM Tris，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，pH 7.4進行溶析。溶析的蛋白質用 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢查後得知其純度大於95%。 蛋白質進一步的純化是將蛋白質在3 Μ之NaCl濃度下吸 附到用 20 mM Tris，3 M NaCl，10 mM CaCl2，pH 7.4 平衡 之疏水性作用之樹脂（Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas ) 上。用2倍管柱體積不含CaCl2之平衡緩衝溶液清洗後， 重組的人類蛋白質C用20 mM Tris，pH 7.4溶析。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 將溶析的蛋白質去除殘存的鈣離子以便活化。將重組的 人類蛋白質C通過金屬的親和性管柱（Chelex-100, Bio-Rad) 以去除妈離子，並再度結合至陰離子交換管柱（Fast Flow Q，Pharmacia)。依序使用上述管柱並用20 mM Tris，150 mM NaCl，5 mM EDTA，pH 6.5預先平衡管柱。管柱中加 入蛋白質後，Chelex-100管柱用一倍管柱體積之相同的缓 衝溶液清洗。陰離子交換管柱用3倍管柱體積之緩衝溶液 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 513307 A7 B7 五、發明説明（9 ) 清洗後，蛋白質用0.4 M NaCl，20 mM Tris-醋酸鹽，pH 6.5溶析。重組的人類的蛋白質C之蛋白質及重組的活化 的蛋白質C溶液之濃度用UV 280 nm測定，消光値（EG1%)分 別爲1.85或1.95。 製備2

活化重組的人類蛋白質C 將牛的凝血酶在50 mM HEPES，pH 7.5 .、4Ό下耦合至 活化的CH-Sepharose 4B (Pharmacia) 〇耦合反應在裝填好 樹脂之管柱中進行，大約5000單位凝血酶/毫升樹脂。凝 血酶溶液循環流經管柱約3小時，然後加入ME A使其濃度 爲0.6 mlA之循環溶液。含ME A之溶液繼續循流10-12小時 以保証將樹脂上未反應的胺類阻塞。阻塞後，凝血酶-耦 合樹脂用10倍管柱體積之1 M NaCl/20 mM Tris，pH 6.5清 洗以去除所有非專一結合的蛋白質，此管柱用活化缓衝溶 液平衡後進行活化反應。 將純化的rHPC溶液調整至5mM之EDTA (螯合任何殘存 的鈣離子）並用20 mM Tris，pH 7.4或20 mM Tris醋酸鹽， pH 6.5稀釋至2 mg/ml。此樣品在37°C下通過用50 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.4 或 20 mM Tris-醋酸鹽 pH 6.5 平衡 之凝血酶管柱。調整流速至使rHPC及凝血酶樹脂的接觸 時間約爲2 0分鐘。流出之溶析液收集後立刻進行二氫氯 酸二氨基酚水解活性的測定。若比活性（二氫氯酸二氨基 酚水解的活性）小於標準之aPC，則將樣品再度通過凝血 酶管柱活化rHPC。接著用1 : 1上述的20 mM緩衝溶液（p Η -12- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 :裝· 訂 513307 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 介於7.4至6·0，較低之pH較佳，因爲能避免自動降解）稀 釋樣品，進行下一步驟前將aPC在低濃度下保存。 將aPC樣品結合至用活化緩衝溶液（20 mM Tris，pH 7.4 或20 mM Tris-醋酸鹽，pH 6.5)之150 mM NaCl平衡的陰離 子交換樹脂（Fast Flow Q，Pharmacia )以去除上述步驟中從 管柱滲出之凝血酶。凝血酶在用2-6倍管柱體積之20 mM 平衡缓衝溶液清洗時會通過管柱。結合的aPC用0.4 Μ NaCl，5 mM Tris-醋酸鹽，pH 6.5 或 20 mM Tris，pH 7.4 梯 度溶析。清洗管柱之體積越大，清除十二胜肽越完全。從 管柱溶析的樣品以冷凍溶液（-20°C )或冷凍乾燥粉未的形 式儲存。 aPC水解二氫氯酸二氨基酚的活性（AU)是利用合成的受 質 H-D-Phe-Pip_Arg-p-硝基苯胺（S-2238，購自 Kabi Vitmm) 釋放p-硝基苯胺後用Beckman DU-7400兩極眞空管排列之 分光光度計測定。一個單位之活化的蛋白質C的定義是： 在25 C、pH 7.4下，1分鐘内能釋出1 umol之p-硝基苯胺之 酵素量，P-硝基苯胺在405 nm下之消光係數是。 抗凝血劑或活化的蛋白質C之活性，是測量在活化的部 分凝血質時間（APTT )之凝血測試中延長凝血時間後加以 測定。標準曲線是用稀釋缓衝溶液（1 mg/ml放射免疫檢定 法純度之 BSA，20 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl， 0.02% NaN3)製備之蛋白質C，其濃度介於125-1000 ng/ml，而樣品是用釋缓衝溶液稀釋（數次）至上述濃度範 圍後製備而成。各樣品光析管中加入50 ul之冷卻的馬血 -13- 本纸張尺度適用中國國^& ( CNS ) A4規格（210X297公釐 丨. 1—„--； ·--裝------訂--------1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 513307 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 --—-:-------B7______五、發明説明（11 ) 漿及50 μΐ之重組活化的局部凝血質時間試劑（Αρτ丁試 劑，Sigma)，並在37。(：下反應5分鐘。反應後，在各光析 管中加入50 μΐ之適當的樣品或標準樣品。用稀釋緩衝溶 液替代樣w或標準樣品測定基本凝血時間。各樣品或標準 樣品在37°C下加入50 μΐ之30 mM CaCL後啓動纖維計數器 fibrometer (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor)之計時器後進行測試。樣品中活化蛋白質c的濃度 用得自線性回歸之標準曲線計算。此處之凝血時間，包括 標準樣品曲線，至少是三重覆實驗的平均値。 熟悉此技藝的專業人士可經上述之描述，製備治療血栓 形成的中風之aPC。 實施例1 人類血漿中aPC的含量 六位病人以1 mg/m2 /小時的速度，在2 4小時内接受i. v. 注入aPC大約0.024 mg/kg/hr。施用之aPC冷凍乾燥配方中 含有2ml水、1〇 mg apc、5 mM Tris醋酸鹽緩衝溶液及 100mM NaCl、pH 6.5 〇 血漿中之aPC濃度用免疫捕獲-二氫氯酸二氨基酚水解的 測定法加以測量。在aPC之可逆的抗凝血劑擰檬酸鹽及苯 甲脒存在下採集血液。酵素自血漿中用apC之鼠科的單株 抗體（C3 )捕獲’固定在微量滴定盤。清洗去除抑制劑， 測量二氫氯酸二氨基酚水解的活性或用寡胜肽發色受質測 量aPC。在37°C下反應16-20小時，於405 nm下測定吸光， 得到的數據用對數重量線性曲線分析。從0-100 ng/ml的標 晒14- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ ~ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i - -- — - I - 1 - - ! V! - -- · J· •項再填· 裝·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 513307 A7 B7 五、發明説明（12 ) 準曲線中估算aPC之濃度。定量的下限是1.0 ng/ml。aPC 劑量及血漿濃度大約於2 4小時測定。血漿之範圍介於2 ng/ml至100 ng/ml。較佳的血漿範圍大約爲20 ng/ml至80 ng/ml。更佳的血漿範圍大約爲30 ng/ml至大約60 ng/ml而 最佳的血漿範圍大約爲50 ng/ml。因此0.024mg/kg/hr之劑 量在治療血栓形成的中風24小時後產生最佳之血漿濃度 50 ng/ml，而不會產生高劑量下出血的問題。 實施例2 在犬科動物模式血栓形成之冠狀動脈閉塞引發再灌流 將十二隻狗（17-22公斤，雌性或雄性，來自Butler Farms) 用戊巴比妥鈉（30 mg/kg，i.v·)麻醉並呼吸一般室内的空 氣。設置插管測量血壓，施用藥物，分別在頸動脈、股骨 靜脈、及頸靜脈採血。進行左邊胸廓切開術，將心贓懸掛 於心贓周圍的支架，於接近第一主要疹斷分枝上，分離出 一段2 cm長彎成圓的左形冠狀動脈（LCCA)。將此LCCA接 上電磁流動探針、刺激電極、及外咬合器分別測量冠狀動 脈血流、產生的血管傷害、及提供關鍵性的狹窄症。血管 傷害是將電極（陽極）和血管内膜端接觸並用100 pAd.c電 流（將陰極置於皮下端完成電路）刺激陽極。不論血管是否 咬合，傷害電流持續刺激6 0分鐘後停止。大約6 0分鐘， 血管從血管傷害處起完全閉塞。血管完全閉塞後30分鐘 (無冠狀動脈血流後3 0分鐘），連續靜脈内注入2.0 mg/kg/hr aPC或20 ml TRIS緩衝溶液，pH 7.4 (賦形劑控制 組）2 hr。從LCCA傷害起進行測試4 hrs。取得並分析動脈 -15- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） n m s » «In · -- I! - - i . - - - 1-:口、—1 -- - --- Μ I I I 11 II . 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 513307 Μ Β7 經濟部中央標準局貝工消費合作、社印製 五、發明説明（13 血壓、心跳及冠狀動脈血流。從實驗之不同時間點採血測 定血液凝血時間（Hemochron 801 )、及用Simplate II出血時 間裝置測定齒齦的模板出血時間。收集第二組血液樣品 (經檸檬酸處理）以測定血漿血纖維蛋白溶酶原活化劑之抑 制劑-1 (PAI-1)。血漿之PAI-1含量用IMUBIND TM血漿PAI-I ELISA工具組（American Diagnostica)測定。所有的數據 (用平均値+ SEM表示）用單尾ANOVA分析統計上的差異及 student-Neuman-Keuls 分析 ρ<·05 的顯著性。用 Fisher’s Exact測試分析ρ<·〇5時之再灌流及其效量。 Α連續的注入2.0 mg/kg/hr之aPC使全血凝血時間ΑΡΤΤ在 藥品注入2小時後（表1 )增加6倍。APTT在實驗結束詩回 復正常値。沒有發現凝血酶凝血時間或模板出血時間的效 應。結果列於表1。 表1 aPC之凝血效應及麻醉的狗之模板出血時間 處理 參數 樂品處 理前 灌流60 分鐘 灌流120 分鐘 實驗終止 控制組 凝血酶時間(秒） 36±1 38土4 33土1 34土1 (n=6) APTT(秒） 100土6 95±5 89士 10 91土10 模板流血時間(秒） 132±15 182±14 152115 159土13 aPC 凝血酶時間(秒） 33土1 34土1 34±1 34 士 1 (n=6) APTT(秒） 96 士 6 573±237 670±209* 138±13* 模板出血時間(秒） 199141 272土 84 204±20 193 土 39 -16- 紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - - - - - >- - - _ —iv- - ml·'_ - -- «ιϋ ml IT------ )U307

第87104413號專利申請案 中文說明書修正頁(88年6月） ---------- 五、發明説明（14 ) 賦形劑控制組是用20 ml之TRIS-緩衝的生理食鹽水灌流2 hr，而apC (2.0 mg/kg/hr χ 2h)是血管完全閉塞3〇分鐘後 施用。 *貫驗組及控制組間顯著之統計差異ρ<·05。各數值用平 均值土SEM表示。 表2說明冠狀動脈完全閉後靜脈注射apc之再灌流效 應。控制組及實驗組間血栓形成的後冠狀動脈完全閉塞的 時間非常類似，分別為66±7及Μ土6分鐘。實驗組的六個 受測對象中有五個對象之血管在在ap(>處理後出現再灌流 的現象’而控制組的六個對象中沒有人有再灌流的現象； 只驗組的冠狀動脈血液再灌流的現象出現時間是128 ± i7 分鐘，實驗組的冠狀動脈血液再灌流期間的流速為13 7 土 2.7 ml/min而再灌流的體積為1〇69±623 ml (大約恢復至冠 狀動脈血栓形成前的60_70%)。血管暴露aPC 4 hr後，五 個對象中仍有三個對象之血管呈現開放之狀態。因此數據 顯不aPC能有效的治療犬科動物模式之血栓形成引發的冠 狀動脈閉塞。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -17- I紙張ϋ财關家標準（CNS )八4祕（2歌297公羞) 513307

五、發明説明（15 ) 表2 aPC恢復犬科動物模式之血栓形成引發的冠狀動脈閉塞後 冠狀動脈血流之效應 參數 控制纽（載體） (n=6) 實驗組(aPC) (n=6) 閉塞時間（分鐘） 66±7 62±6 血栓大小（mg) 10.8±2·1 8·2±1.2 再灌流現象 0 5/6 * 再灌流時間（分鐘） 0 128土17 * 實驗後開放狀態之血管 0/6 3/5 再灌流期間之CBF (ml/min) 0 13.7±2.7 * 再灌流體積(ml) 0 1069±623 * 實驗組及控制組間顯著之統計差異p<.Q5。各數値用平 均値士 SEM表示。 (請先閱讀背面之注意事 1· 項再填· 裝— :寫本頁) 訂 各實驗之血液樣品採樣顯示和靜脈内的注入之aPC及血 液循環中之血纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)相 關。靜脈内的注入aPC後，血漿中PAI-1含量下降80%。停 止注入aPC後，血漿中之PAI-1回復注入前之水準。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 雖然犬科動物模式之劑量高於人類的劑量，但本發明之 申請者發現狗類對人類的活化的蛋白質C最不敏感，所以 本發明申稱之劑量適用於人類。 _ 18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. 513307 第0 8 7 1 044 1 3號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(91年10月） 々、申^屋範麗 ^ i ( 修正. 公象丨 ！補充抑 1. 一血j管閉塞及血栓性-組合物， 其包含劑量為約0.01 mg/kg/hr至約0.05 mg/kg/hr之經活 化蛋白質C。 2. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該血管的 閉塞或血栓性栓塞症係血栓形成的中風。 3. 根據申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該劑量係 約0·01 mg/kg/hi:至約0.03 mg/kg/hr之經活化蛋白質C。 4. 根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該劑量係 約0.024 mg/kg/hr之經活化蛋白質C。 5. —種套組，其包含溶於無菌溶液中之經活化蛋白質C， 其適合於介於0.01 mg/kg/hr至0.05 mg/kg/hr之劑量下投 遞。 6. 根據申請專利範圍第5項之套組，其中該投遞方式係連 續注入約1至約4 8小時。 O:\52\52188-911014.DOa 5 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)