RU2643365C2 - Способ очистки дарбэпоетина альфа - Google Patents
Способ очистки дарбэпоетина альфа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2643365C2 RU2643365C2 RU2016123352A RU2016123352A RU2643365C2 RU 2643365 C2 RU2643365 C2 RU 2643365C2 RU 2016123352 A RU2016123352 A RU 2016123352A RU 2016123352 A RU2016123352 A RU 2016123352A RU 2643365 C2 RU2643365 C2 RU 2643365C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- darbepoetin alpha
- washing
- column
- buffer solution
- darbepoetin
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к способу очистки дарбэпоетина альфа с помощью селективного выделения из смеси структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих различное содержание сиаловой кислоты, только структурной изоформы, которая имеет высокое содержание сиаловой кислоты. Способ очистки дарбэпоетина альфа заключается в (а) связывании дарбэпоетина альфа на колонке для анионобменной хроматографии путем загрузки смеси, включающей дарбэпоетин альфа, имеющий различное содержание сиаловой кислоты, на колонку для анионобменной хроматографии; (b) промывании хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, для удаления структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих более высокие изоэлектрические точки, чем целевая изоэлектрическая точка, и (c) элюировании дарбэпоетина альфа, который остается связанным на хроматографической колонке, из этой колонки, при этом дарбэпоетин альфа, выделенный на стадии (с), имеет изоэлектрическую точку от pI 2,0 до 4,0. Способ позволяет увеличить производительность, а также получить высокочистый дарбэпоетин альфа в промышленном масштабе. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил., 4 пр.
Description
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область техники
Настоящее изобретение относится к способу очистки дарбэпоетина альфа с помощью селективного выделения из смеси структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих различное содержание сиаловой кислоты, только структурной изоформы, имеющей высокое содержание сиаловой кислоты.
2. Описание уровня техники
Дарбэпоетин альфа (NESP) является аналогом эритропоетина (ЭПО), который содержит пять заместителей в аминокислотной последовательности молекулы эритропоетина, обеспечивая две дополнительные N-гликозилированные цепочки (международная публикация No. WO 2001076640). Хотя дарбэпоетин альфа отличается от ЭПО с точки зрения биохимических характеристик, таких как, например, молекулярная масса, изоэлектрическая точка и т.д., он также, как ЭПО, является эритропоэз-стимулирующим протеином.
Известно, что дарбэпоетин альфа имеет период полувыведения в сыворотке крови, который примерно втрое длиннее, чем период полувыведения эритропоетина у мышей, крыс, собак, человека и т.д. из-за высокого содержания сиаловой кислоты (Pedrazzoli Р, Cinieri S, Lorusso V, Gamucci Т, Secondino S, Silvestris N 2007 Nov-Dec, 27(6C), 4419-24; Anticancer Res.), и, таким образом, его in vivo разложение ингибируется, тем самым обеспечивая более высокую биологическую активность в сравнении с ЭПО в нативном состоянии.
Из-за различия в содержании сиаловой кислоты в результате гликозилирования дарбэпоетин альфа максимально имеет 22 различных типа структурных изоформ, и чем выше содержание сиаловой кислоты, тем ниже изоэлектрическая точка и тем выше терапевтическая ценность. Соответственно, селективное выделение и очистка только тех структурных изоформ, которые имеют высокое содержание сиаловой кислоты, очень важно в области терапии, применяющей дарбэпоетин альфа.
Примеры традиционного способа очистки ЭПО и аналогов ЭПО включают анионобменную и катионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, эксклюзионную хроматографию и т.д. В частности, в международной публикации WO 2010/027869 описан способ очистки ЭПО путем последовательного применения хроматографии гидрофобного взаимодействия, анионобменной хроматографии, катионобменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии. В Международной публикации WO 2003/045996 описан способ очистки рекомбинантного человеческого ЭПО методом обращено-фазной хроматографии, анионобменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии.
В частности, в качестве способов очистки дарбэпоетина альфа в международной публикации WO 1995/005465 описан способ применения анионобменной смолы и С4 смолы, а в международной публикации WO 2010/008823 предложен проточный режим для очистки дарбэпоетина альфа, имеющего высокое содержание сиаловой кислоты, с изоэлектрической точкой, составляющей 4,5 или менее, в которых целевой протеин не связывается на колонке из катионобменной смолы, а вымывается в раствор хроматографической обработки. Однако эти способы чрезвычайно дорогостоящи и затратны по времени из-за их использования на различных стадиях с использованием смол, и, таким образом, не подходят для производства в промышленном масштабе.
Вместе с тем, в публикации Корейской патентной заявки No. 10-2013-0042107 описан способ, который более упрощен в сравнении с указанным выше четырехстадийным способом за счет внедрения трехстадийного способа, в котором последовательно применяют анионную, гидроксиаппатитовую, анионобменную хроматографию, а адсорбцию и промывание осуществляют при специфических условиях рН, когда применяют вторичную хроматографию на анионобменной смоле для селективного разделения изоформ, имеющих низкие изоэлектрические точки. В частности, для получения изоформ с низкими изоэлектрическими точками дарбэпоетин альфа связывают на колонке при рН, находящемся в области от 4,0 до 5,0, с последующим промыванием буферным раствором, имеющим рН в области от 2,0 до 2,4.
Вышеуказанный способ может обладать преимуществами с точки зрения времени и затрат, необходимых для производства в промышленном масштабе, потому что способ в некоторой степени упрощен в сравнении с традиционными способами, однако, для воплощения в условиях с низким значением рН (рН в области от 2,2 до 2,4), как предлагается в указанной выше опубликованной патентной заявке, необходимо, чтобы токсичный раствор кислоты, такой как HCl, использовали в большом количестве, а значит такой способ не желателен. Кроме того, поскольку реакции изоформ при данных условиях рН не являются постоянными, когда количество, подлежащее обработке с помощью колонки, возрастает при масштабировании, возможность воспроизводимости при производстве в промышленном масштабе является низкой, если изоформы с целевым диапазоном изоэлектрических точек нужно получать путем регулирования рН среды буферного раствора.
То есть поскольку традиционный способ очистки дарбэпоетина альфа требует комплексного подхода с применением хроматографии, включающей различные стадии с использованием смол, он требует чрезвычайно высоких материальных и временных затрат, а если осуществлять очистку с помощью способа, который упрощен в сравнении с традиционным способом, необходимо, чтобы условия, такие как рН, точно регулировались для компенсации возможного снижения эффекта очистки, но такое регулирование условий усложняется по мере увеличения масштаба производства.
Следовательно, существует растущая необходимость в улучшенном способе очистки дарбэпоетин альфа, который будучи упрощенным в сравнении с традиционными способами и имея более просто регулируемые условия, может стабильно воспроизводить успешные условия способа при снижении стоимости и временных затрат при использовании способа в условиях производства в промышленном масштабе.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения стремились разработать способ очистки дарбэпоетина альфа, который был бы более удобным и простым в сравнении с традиционными способами, и в результате неожиданно обнаружили, что простой способ применения только анионов и аргинина может отделять дарбэпоетин альфа, имеющий высокое содержание сиаловой кислоты, за короткий период времени, тем самым завершив настоящее изобретение.
Соответственно, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ очистки дарбэпоетина альфа, имеющего высокое содержание сиаловой кислоты, из смеси структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих различное содержание сиаловой кислоты.
ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ по настоящему изобретению представляет собой новый способ очистки дарбэпоетина альфа, который можно удобно и просто осуществить и в котором возможно значительно увеличить производительность из-за улучшения эффективности способа, а также выхода высокочистого дарбэпоетина альфа в процессе производства в промышленном масштабе согласно настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 представлена чистота элюатов дарбэпоетина альфа, которые получены путем очистки методом анионобменной хроматографии на гидроксиаппатитовой смоле при анализе методом С4 ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии).
На Фиг. 2 представлен ИЭФ (изоэлектрическое фокусирование) результата очистки методом анионобменной хроматографии, в процессе которой применяли буферный раствор глицина-HCl, содержащий аргинин.
На Фиг. 3 представлен ИЭФ результата очистки методом анионобменной хроматографии, в процессе которой применяли буферный раствор ацетата натрия, содержащий аргинин.
На Фиг. 4 представлен ИЭФ результата очистки методом анионобменной хроматографии, в процессе которой применяли буферный раствор глицина-HCl, не содержащий аргинина.
На Фиг. 5 представлены результаты гель-фильтрующей хроматографии фракций дарбэпоетина альфа, которые получены методом анионобменной хроматографии.
На Фиг. 6 представлен результат ИЭФ, демонстрирующий изоэлектрические точки для каждой из фракций, представленных на ФИГ. 5.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для достижения вышеуказанной цели в одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ очистки дарбэпоетина альфа из смеси структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих различное содержание сиаловой кислоты.
В частности, для селективного выделения структурных изоформ, имеющих высокое содержание сиаловой кислоты, из смеси структурных изоформ дарбэпоетина альфа в настоящем изобретении предложен способ очистки дарбэпоетина альфа методом анионобменной хроматографии, включающим промывание с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин.
Предпочтительно способ очистки дарбэпоетина альфа по настоящему изобретению включает осуществление по меньшей мере одной стадии хроматографирования методом анионобменной хроматографии, осуществление которой включает связывание смеси структурных изоформ дарбэпоетина альфа на анионобменной смоле, промывание этой смолы буферным раствором, содержащим аргинин, и элюирование дарбэпоетина альфа, связанного на хроматографической колонке, из этой колонки.
В другом типовом воплощении настоящего изобретения предложен способ очистки дарбэпоетина альфа, включающий стадии: (а) связывания дарбэпоетина альфа на анионобменной хроматографической колонке путем загрузки смеси, содержащей дарбэпоетин альфа, имеющий различное содержание сиаловой кислоты, на анионобменную хроматографическую колонку; (b) промывания хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин; и (с) элюирования дарбэпоетина альфа, который остается связанным на хроматографической колонке, из этой колонки.
В типовом воплощении настоящего изобретения предложен способ очистки дарбэпоетина альфа, включающий стадии: (а) элюирования фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, путем использования биологической жидкости, содержащей дарбэпоетин альфа, на стадии хроматографирования методом анионобменной хроматографии; (b) элюирования фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, путем использования элюата, полученного на стадии (а), на стадии хроматографирования на гидроксиаппатитовой смоле; (с) связывания дарбэпоетин альфа на анионобменной хроматографической колонке путем загрузки элюата, полученного на стадии (b), на анионобменную хроматографическую колонку; (d) промывания колонки, обработанной на стадии (с), с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин; и (е) элюирования дарбэпоетина альфа, который остается связанным на хроматографической колонке при промывании на стадии (d), из этой колонки. Настоящее изобретение подробно описано ниже.
В данной заявке термин "дарбэпоетин альфа", представляя собой рекомбинантную форму эритропоетина (ЭПО), который представляет собой гликопротеин, относится к гликопротеину, который имеет пять замещений в аминокислотной последовательности молекулы эритропоетина, тем самым обеспечивая две дополнительные N-гликозилированные цепочки. Дарбэпоетин альфа отличается от эритропоетина по биохимическим характеристикам, таким как молекулярная масса, изоэлектрическая точка и т.д. Дарбэпоетин альфа стимулирует эритропоэз и, значит, может применяться в качестве лекарственного средства при почечной недостаточности и анемии, которые связаны с химиотерапией рака. Благодаря добавленным в него гликанам, дарбэпоетин альфа имеет период полувыведения в сыворотке крови, который примерно втрое длиннее, чем у эритропоетина, и может присутствовать в различных изоформах в соответствии с содержанием сиаловой кислоты. Структурные изоформы дарбэпоетина альфа, имеющие высокое содержание гликанов и сиаловой кислоты, имеют низкие изоэлектрические точки, и эти структурные изоформы обладают высокой биологической активностью in vivo. Соответственно, селективное отделение и очистка только тех структурных изоформ, которые имеют высокое содержание гликанов и сиаловой кислоты, очень важно для лекарственных протеиновых средств, использующих дарбэпоетин альфа, однако, традиционные способы очистки имеют сложности, состоящие в том, что они требуют чрезвычайно высоких материальных и временных затрат из-за использования смол на нескольких стадиях. В этой связи, авторы настоящего изобретения разработали способ очистки дарбэпоетина альфа, имеющего высокую степень гликозилирования, только с помощью упрощенного способа за короткий период времени.
Поскольку дарбэпоетин альфа имеет более высокую степень гликозилирования в сравнении с ЭПО, содержание сиаловой кислоты на 1 моль дарбэпоетина альфа выше, чем у ЭПО, который имеет максимум 13 молей на 1 моль ЭПО, а, как известно, максимальное теоретическое значение содержания сиаловой кислоты на 1 моль дарбэпоетина альфа составляет 22 моля (Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP), British Journal of Cancer (2001) 84 (Supplement 1), 3-10).
В частности, дарбэпоетин альфа, будучи выделенным и очищенным согласно способу очистки по настоящему изобретению, имеет высокое содержание гликанов и сиаловой кислоты и предпочтительно представляет собой дарбэпоетин альфа, имеющий структурные изоформы с низкой изоэлектрической точкой в диапазоне от pI 2,0 до pI 4,0, более предпочтительно с изоэлектрической точкой 3,5 или менее.
В данной заявке термин "биологическая жидкость" относится к культуре, содержащей клетки, компонентам клетки или клеточным продуктам или их производным и, хотя не ограничивается указанным, может включать клеточные культуры, супернатанты клеточных культур, клеточные лизаты, клеточные экстракты, тканевые экстракты, кровь, сыворотку крови, молоко, мочу, ее фракции и т.д. В способе очистки по настоящему изобретению используемая биологическая жидкость может представлять собой различные типы. Предпочтительно биологическая жидкость может представлять собой дрожжи, растение или культуру животной клетки, более предпочтительно культуру животной клетки генетически модифицированного животного, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая дарбэпоетин альфа, трансфицирована путем генетической рекомбинации, и еще более предпочтительно культуру животной клетки, в которой животная клетка получена из яичника китайского хомячка (СНО). Как известно в уровне техники, когда используют культуру животной клетки, более предпочтительно использовать супернатант, полученный путем центрифугирования культуры.
Предпочтительно биологическую жидкость согласно настоящему изобретению можно получить при использовании способа ультрафильтрации/диафильтрации. Способ ультрафильтрации/диафильтрации может не только удалять в культуре материалы с низкой молекулярной массой с границей отсечки по молекулярной массе задерживаемых компонентов (MWCO) 10000 (например, поверхностно-активные вещества, красители, малые пептиды, компоненты сахаров и т.д.), но также могут улучшать адсорбционную эффективность колонки путем последовательного замещения буферного раствора хроматографически уравновешенным буферным раствором.
В типовом воплощении настоящего изобретения культивировали СНО клетки, трансфицированные вектором, содержащим дарбэпоетин альфа, а супернатант культуры диафильтровали с помощью ультрафильтрации (используя 10 ммолярный буферный раствор фосфата натрия) и использовали в качестве биологической жидкости.
В данной заявке термин "анионобменная хроматография" относится к способу, разделяющему молекулы на основе их зарядов путем связывания отрицательно заряженных (или кислотных) молекул с положительно заряженным твердым носителем, и с помощью этой методики легко можно разделить гомологичные молекулы (кислотные, основные, нейтральные). В настоящем изобретении без ограничения можно использовать как сильную анионобменную смолу, так и слабую анионобменную смолу, например, Sephadex™, Sepharose™, SOURCE™, Mono Q™ и Mini Q™ (производства GE healthcare), а также можно использовать, не ограничиваясь указанными, смолы, в которых функциональной группой является четвертичный амин (Q), диэтиламиноэтил (DEAE, ДЭАЭ) или четвертичный аминоэтил (QAE, ЧАЭ). Предпочтительно функциональная группа может представлять собой Q или ДЭАЭ и наиболее предпочтительно Q-Sepharose™, которая является сильной анионобменной смолой.
Анионобменную хроматографию можно осуществлять с помощью колоночной хроматографии. Кроме того, анионобменная смола, применяемая в анионобменной хроматографии по настоящему изобретению, может быть уравновешена с помощью водного буферного раствора перед адсорбированием на нее культуры, и примеры буферного раствора могут включать Tris-HCl (трис-(гидроксиметил)аминометан-НСI), буферный раствор фосфата натрия и т.д.
Кроме того, анионобменная смола, применяемая в анионобменной хроматографии по настоящему изобретению, может быть уравновешена с помощью водного буферного раствора перед адсорбированием на нее культуры.
Неподвижная фаза в методе адсорбционной хроматографии, применяемой в настоящем изобретении, может включать силикагель, оксид алюминия, оксид магния и гидроксиаппатит, и наиболее предпочтительно гидроксиаппатит. В частности, известно, что гидроксиаппатит широко используют для традиционного извлечения нуклеиновых кислот, таких как ДНК.
После удаления биологических примесей из фракции дарбэпоетина альфа фракцию дарбэпоетина альфа, включающую структурные изоформы с различным содержанием сиаловой кислоты, подвергают анионобменной хроматографии, осуществляя тем самым селективное отделение дарбэпоетина альфа, имеющего высокое содержание сиаловой кислоты. В способе очистки по настоящему изобретению промывание с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, может осуществляться для вымывания структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих более высокие изоэлектрические точки, чем целевая изоэлектрическая точка, для получения структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих целевую изоэлектрическую точку.
Для цели настоящего изобретения анионобменную хроматографическую колонку промывают с помощью промывающего раствора, содержащего аргинин.
В настоящем изобретении содержащий аргинин промывающий буферный раствор может предпочтительно иметь рН в области от 3,0 до 5,0 и дополнительно может включать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из NaCl и мочевины. В частности, промывающий буферный раствор может содержать NaCl с концентрацией от 5×10-3 М до 90×10-3 М и может содержать мочевину с концентрацией от 3 М до 8 М.
Предпочтительно способ очистки по настоящему изобретению может дополнительно включать промывание с помощью промывающего буферного раствора, содержащего или не содержащего аргинин, перед или после промывания хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, после загрузки смеси, содержащей дарбэпоетин альфа, имеющий различное содержание сиаловой кислоты, в анионобменную хроматографическую колонку и связывания дарбэпоетина альфа на этой колонке, и более предпочтительно может дополнительно включать первичное промывание хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, имеющего рН в области от 6 до 8, перед промыванием хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, а промывание хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, может представлять собой вторичное промывание хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, имеющего рН в области от 3 до 5.
Примеры промывающего буферного раствора, предназначенного для использования при промывании, могут включать буферный раствор фосфата натрия, буферный раствор ацетата натрия, буферный раствор цитрата, буферный раствор глицина-HCl, буферный раствор лимонной кислоты-фосфата натрия и т.д. Более предпочтительно промывающий буферный раствор, применяемый в первичном промывании, может представлять собой раствор фосфата натрия, имеющий рН в области от 6 до 8, а промывающий буферный раствор, используемый при вторичном промывании, может представлять собой раствор глицина-HCl, имеющий рН в области от 3 до 5, а также NaCl, мочевина и т.д. могут дополнительно включаться для достижения необходимой рН области или ионной силы подвижной фазы.
Применяемый в настоящем изобретении промывающий буферный раствор, содержащий аргинин, играет важную роль для извлечения дарбэпоетина альфа, имеющего низкое содержание сиаловой кислоты. На Фиг. 2 представлен результат хроматографирования, осуществленного с использованием раствора глицина-HCl, содержащего аргинин, в качестве промывающего буферного раствора, а на Фиг. 3 представлен результат хроматографирования, осуществленного с использованием раствора ацетата натрия, содержащего аргинин, в качестве промывающего буферного раствора. В обоих случаях было подтверждено, что элюировали дарбэпоетин альфа, имеющий высокое содержание сиаловой кислоты. То есть показано, что, когда применяют рН буферный раствор, содержащий аргинин, элюируют высококачественный дарбэпоетин альфа, имеющий изоэлектрическую точку от 2 до 3, и в частности, главным образом сосредоточенную в области изоэлектрической точки 2 (обозначенные стрелками участки на Фиг. 2 и Фиг. 3).
Напротив, когда промывающий буферный раствор не содержал аргинин, хотя другие условия оставались теми же, в большом количестве элюировали структурные изоформы дарбэпоетина альфа, имеющие низкое содержание сиаловой кислоты, с изоэлектрической точкой примерно 3 и выше, подтверждая таким образом значительное снижение очищающего действия промывающего буферного раствора на структурные изоформы дарбэпоетина альфа (Фиг. 4).
После осуществления промывания с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, дарбэпоетин альфа, имеющий высокое содержание сиаловой кислоты, элюировали с помощью ступенчатого изменения градиента соли с помощью буферного раствора, имеющего рН в области от 6 до 8.
В другом типовом воплощении настоящего изобретения предложен способ очистки дарбэпоетина альфа, в котором можно селективно отделить только структурные изоформы с высоким содержанием сиаловой кислоты с помощью дополнительного применения гель-фильтрующей хроматографии. То есть способ может представлять собой способ очистки, дополнительно включающий фракционирование элюата со стадии анионобменного хроматографирования, полученного выше, путем применения гель-фильтрующей хроматографии.
Гель-фильтрующая хроматография представляет собой способ разделения протеинов в соответствии с их размером и может применяться для разделения протеиновых полимеров. Примеры смолы, используемой в гель-фильтрующей хроматографии, могут включать Sephadex™, Sepharose™, Sephacryl™ и т.д. (производства GE healthcare), и наиболее предпочтительно может использоваться Sephacryl S-100, S-200 и S-300.
Когда элюат со стадии анионобменного хроматографирования, полученный путем осуществления анионного хроматографирования с использованием промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, дополнительно подвергают гель-фильтрующей хроматографии, можно элюировать дарбэпоетин альфа, имеющий высокое содержание сиаловой кислоты и чистоту 99% или выше.
Элюат, имеющий целевую изоэлектрическую точку, можно получить путем уравновешивания в достаточной степени колонки для гель-фильтрующей хроматографии буферным раствором, загрузкой элюата, полученного на стадии анионного хроматографирования с использованием промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, в уравновешенную колонку для гель-фильтрующей хроматографии с последующим фракционированием этого элюата. В порядке выхода фракций фракция, элюируемая раньше, может иметь более высокое содержание сиаловой кислоты.
В другом типовом воплощении настоящего изобретения около 1,7 л смолы Sephacryl от S-100 до S-200 (производства GE Healthcare) заполняли внутрь колонки XK-50/90 (производства GE Healthcare) и пропускали через нее достаточное количество 20×10-3 М буферного раствора фосфата натрия, содержащего 140 ммоль NaCl (рН 6,2), для уравновешивания колонки для гель-фильтрации. Затем раствор, содержащий дарбэпоетин альфа, концентрировали, и около 60 мл концентрата пропускали через колонку со скоростью 7,5 мл/мин, а 20×10-3 М буферный раствор фосфата натрия, содержащий 140 ммоль NaCl, (рН 6,2), в достаточном количестве пропускали через колонку, тем самым осуществляя фракционирование элюата, содержащего дарбэпоетин альфа с высоким содержанием сиаловой кислоты (Фиг. 5). Было подтверждено, что фракции элюата дарбэпоетина альфа имели более высокое содержание сиаловой кислоты в порядке выхода фракций (Таблица 1 и Фиг. 6).
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ очистки дарбэпоетина альфа, включающий стадии: (а) элюирования фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, путем хроматографирования биологической жидкости, содержащей дарбэпоетин альфа, методом анионобменной хроматографии; (b) элюирования фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, путем хроматографирования элюата, полученного на стадии (а), методом хроматографии на гидроксиаппатитовой смоле; (с) связывания дарбэпоетина альфа на анионобменной хроматографической колонке путем загрузки элюата, полученного на стадии (b), на анионобменную хроматографическую колонку; (d) промывания колонки, обработанной на стадии (с), с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин; и (е) элюирования дарбэпоетина альфа, который остается связанным на хроматографической колонке при промывании на стадии (d), из этой колонки.
Каждую стадию способа можно подробно объяснить, как показано ниже.
Стадия (а) представляет собой элюирование фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, путем хроматографирования биологической жидкости, содержащей дарбэпоетин альфа, методом анионобменной хроматографии и предпочтительно может представлять собой адсорбцию биологической жидкости, содержащей дарбэпоетин альфа, на уравновешенную анионобменную хроматографическую колонку путем добавления на нее биологической жидкости, содержащей дарбэпоетин альфа, промывание колонки с помощью промывающего буферного раствора, который имеет рН в области от 6 до 8 и содержит от 10 ммоль до 100 ммоль NaCl, и элюирование фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, с помощью элюирующего буферного раствора, который имеет рН в области от 6 до 8 и содержит от 100 ммоль до 300 ммоль NaCl.
Анионобменная хроматография и смола, наполняющая соответствующую колонку, такие же, как описаны выше.
В типовом воплощении настоящего изобретения около 1 л культуры, которая получена методом экспрессирования дарбэпоетина альфа в СНО клетки, транфицированные вектором, содержащим дарбэпоетин альфа, диафильтровали методом ультрафильтрации (MWCO равен 10000) с использованием 10 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0) для получения биологической жидкости, которую хроматографировали на XK-50 колонке, наполненной анионобменной смолой (Q быстрый поток, производства GE Healthcare), уравновешенной с помощью 10 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0), а потом примерно 2 колоночными объемами (CV) 10 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0) были пропущены через колонку для уравновешивания колонки. Затем колонку промывали с помощью промывающего буферного раствора, содержащего NaCl от 0 ммоль до 100 ммоль, и после проводили элюирование с использованием элюирующего буферного раствора, который имеет рН в области от 6 до 8 и содержит от 100 ммоль до 300 ммоль NaCl. В результате анионобменной хроматографии, как было показано методом ОФ-ВЭЖХ (обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии), примеси, находящиеся в биологической жидкости, удалялись, а элюат очищали в раствор, содержащий большое количество дарбэпоетина альфа (Фиг. 1В).
Стадия (b) представляет собой загрузку элюата, выделенного на стадии (а), на неподвижную фазу уравновешенной колонки для адсорбционной хроматографии, более предпочтительно на уравновешенную гидроксиаппатитовую смолу, промывание полученной в результате смолы с помощью промывающего буферного раствора, имеющего рН в области от 6 до 8, в котором содержание фосфата натрия составляет от 0 ммоль до 100 ммоль, тем самым получая фракцию, содержащую дарбэпоетин альфа, из жидкости, выделенной без адсорбирования на смолу во процессе загрузки и промывания.
Примеры неподвижной фазы для адсорбционной хроматографии, применяемые в настоящем изобретении, могут включать силикагель, оксид алюминия, оксид магния и гидроксиаппатит, и наиболее предпочтительно гидроксиаппатит. В данной заявке термин "хроматография на гидроксиаппатитовой смоле" или "хроматография на гидроксиаппатите" относится к адсорбционной хроматографии, включающей неподвижную фазу, наполненную гидроксиаппатитовой смолой, и может использоваться взаимозаменяемо с термином "гидроксиаппатитовая колонка".
Примеры буферных растворов, применяемых на каждой из стадий промывания и элюирования, предпочтительно включают буферный раствор фосфата натрия, буферный раствор фосфата калия, и буферный раствор, содержащий Tris (трис(гидроксиметил)аминометан).
В типовом воплощении настоящего изобретения элюат, полученный путем хроматографирования на анионобменной смоле, наносили на ХК-50 колонку, заполненную гидроксиаппатитовой смолой, уравновешенную 7 ммолярным буферным раствором фосфата натрия (рН 7,0), и пропускали через нее около трех колоночных объемов 7 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0), тем самым выделяя связанный на ней дарбэпоетин альфа, имеющий высокое содержание гликанов. В результате хроматографирования на гидроксиаппатитовой смоле, как было показано методом ОФ-ВЭЖХ, примеси, находящиеся в биологической жидкости, удаляли, а элюат очищали в раствор, содержащий большое количество дарбэпоетина альфа (Фиг. 1С).
Примеры воплощения изобретения
Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако эти примеры приведены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения.
Пример 1. Получение смеси изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих различное содержание сиаловой кислоты, методом анионобменной хроматографии и адсорбционной хроматографии на гидроксиаппатитовой смоле
Около 1 л культуры, которую получали методом экспрессирования дарбэпоетина альфа в СНО клетки, трансфицированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую дарбэпоетин альфа, диафильтровали методом ультрафильтрации (MWCO равен 10000) с использованием 10 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0) для получения биологической жидкости. Полученный в результате фильтрат последовательно подвергали обработке на двух колонках анионобменной и адсорбционной хроматографии на гидроксиаппатитовой смоле.
Во-первых, анионобменную хроматографию проводили следующим образом. Колонку ХK-50 (производства GE Healthcare) заполняли примерно 100 мл анионобменной смолы (Q быстрый поток, производства GE Healthcare) и пропускали через нее 10 ммолярный буферный раствор фосфата натрия (рН 7,0) для уравновешивания колонки. Диафильтрат в количестве от примерно 0,1 л до 0,2 л пропускали через подготовленную для этого колонку Q Sepharose FF со скоростью 15 мл/мин, и затем около 2 колоночных объемов (CV) 10 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0) снова пропускали через нее для уравновешивания колонки. Колонку промывали с помощью промывающего буферного раствора, содержащего от 10 ммоль до 100 ммоль NaCl, и затем элюировали с помощью элюирующего буферного раствора, который имеет рН от 6 до 8 и содержит от 100 ммоль до 300 ммоль NaCl.
Во-вторых, элюат, который подвергали анионобменной хроматографии, подвергали адсорбционной хроматографии на гидроксиаппатитовой смоле, как описано ниже. Колонку ХK-50 (производства GE Healthcare) заполняли примерно 100 мл гидроксиаппатитовой смолы (производства GE Healthcare) и пропускали через нее 7 ммолярный буферный раствор фосфата натрия (рН 7,0) для уравновешивания колонки. Около 0,1 л диафильтрата пропускали через подготовленную для этого гидроксиаппатитовую колонку со скоростью 10 мл/мин, и затем снова пропускали через нее около 3 колоночных объемов (CV) 7 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0).
В частности, растворы, выделенные без адсорбирования на смолу в процессе загрузки и промывания, содержали дарбэпоетин альфа с различным содержанием сиаловой кислоты, и эти растворы собирали и подвергали обработке следующим способом. После промывания буферный раствор фосфата калия с концентрацией от 0,1 М до 0,7 М (рН 7) пропускали через смолу и фракцию(и), содержащую(ие) дарбэпоетин альфа с низким содержанием гликанов и примеси, извлекали путем элюирования. Извлечение примесей биологического происхождения и большого количества дарбэпоетина альфа в эти растворы подтверждали методом ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 1).
Пример 2. Очистка дарбэпоетина альфа, имеющего высокое содержание сиаловой кислоты, с помощью способа промывания с применением аргинина в анионобменной хроматографии
Около 20 мл смолы Q Sepharose FF (производства GE Healthcare) заполняли внутрь ХK-26 колонки (производства GE Healthcare) и пропускали через нее достаточное количество 10 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0) для уравновешивания колонки.
Около 0,2 л раствора, содержащего дарбэпоетин альфа, полученный в примере 1, пропускали через колонку со скоростью 5 мл/мин, и затем пропускали через нее 10 ммолярный буферный раствор фосфата натрия (рН 7,0), который представляет собой равновесный буферный раствор, для уравновешивания колонки. Затем колонку подвергали первичному промыванию 10 ммолярным буферным раствором фосфата натрия (рН 7,0), содержащим 50 ммоль NaCl, а затем последовательно вторичному промыванию буферным раствором глицина-HCl, который имел рН от 3 до 5 и содержал мочевину, аргинин и NaCl, тем самым вымывая фракции, содержащие дарбэпоетин альфа с низким содержанием сиаловой кислоты. При использовании буферного раствора фосфата натрия, содержащего 190 ммоль NaCl (рН 6,2) выделяли протеины только с высокой степенью гликозилирования и низкими изоэлектрическими точками. Методом ИЭФ было показано, что дарбэпоетин альфа, полученный с помощью указанных способов промывания, является высококачественным (Фиг. 2).
Пример 3. Определение действия промывающего раствора, содержащего аргинин, на содержание сиаловой кислоты
Было подтверждено, что способ промывания с применением аргинина в примере 2 играет важную роль в очистке дарбэпоетина альфа, имеющего высокое содержание сиаловой кислоты.
Раствор, содержащий дарбэпоетин альфа, полученный в примере 1, тем же способом, что и в Примере 2, адсорбировали на колонку Q Sepharose FF и пропускали через нее около 2 колоночных объемов (CV) 10 ммолярного буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0), представляющего собой равновесный буферный раствор, для осуществления первичного промывания. Однако вторичное промывание осуществляли с использованием буферного раствора ацетата натрия с рН от 3 до 5 или менее вместо буферного раствора глицина-HCl, используемого в Примере 2. Было подтверждено, что в результате элюирования был получен дарбэпоетин альфа с высоким содержанием сиаловой кислоты, имеющий изоэлектрическую точку, равную 2~3 или менее (выделенные стрелками участки на Фиг. 3).
В другом аспекте настоящего изобретения первичное промывание и вторичное промывание осуществляли таким же способом, как в Примере 2, но без аргинина. В результате элюирования выделяли даже дарбэпоетин альфа с низким содержанием сиаловой кислоты, имеющий изоэлектрическую точку, равную 2~3 или выше, подтверждая таким образом существенное ухудшение качества продукта (выделенные стрелками участки на Фиг. 4).
В этом примере подтвердили, что аргинин является важным фактором в получении дарбэпоетина альфа, содержащего сиаловую кислоту, с низкой изоэлектрической точкой.
Пример 4. Очистка дарбэпоетина альфа, имеющего высокое содержание сиаловой кислоты, с помощью гель-фильтрующей хроматографии
Около 1,7 л смол Q Sephacryl от S-100 до S-200 (производства GE Healthcare) заполняли внутрь ХK-50/90 колонки (производства GE Healthcare) и пропускали через нее достаточное количество 20 ммолярного буферного раствора фосфата натрия, содержащего 140 ммоль NaCl (рН 6,2), для уравновешивания колонки.
Раствор, содержащий дарбэпоетин альфа, полученный в примере 2, концентрировали и около 5 мл этого концентрата пропускали через колонку со скоростью 7,5 мл/мин, а достаточное количество 20 ммолярного буферного раствора фосфата натрия, содержащего 140 ммоль NaCl (рН 6,2), пропускали через колонку для осуществления фракционирования элюата, содержащего дарбэпоетин альфа с высоким содержанием сиаловой кислоты (Фиг. 5). Было подтверждено, что фракции элюата дарбэпоетина альфа имели более высокое содержание сиаловой кислоты в порядке выхода фракций (Таблица 1 и Фиг. 6). Результаты, полученные методом ВЭЖХ на слабо анионобменной смоле (Wax-ВЭЖХ), демонстрирующие содержание сиаловой кислоты, соответствующее каждой фракции, приведены ниже в Таблице 1.
Суммируя вышеуказанные результаты, было подтверждено, что в случаях применения анионобменной колонки дарбэпоетин альфа, имеющий высокое содержание сиаловой кислоты, можно очистить с помощью способа промывания с использованием буферного раствора, содержащего аргинин. Кроме того, было показано, что в результате фракционирования после дополнительного осуществления гель-фильтрующей хроматографии дарбэпоетин альфа, имеющий высокое содержанием сиаловой кислоты и высокую чистоту, можно очистить согласно способу по настоящему изобретению.
На основании вышеизложенного, специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, сможет понять, что настоящее изобретение может быть реализовано в других специфических формах без изменения технической концепции или существенных признаков настоящего изобретения. В связи с этим, типовые воплощения изобретения приведены здесь только в качестве иллюстрации и не должны восприниматься в качестве основания для ограничения объема настоящего изобретения. Наоборот, настоящее изобретение предназначено охватить не только типовые воплощения, но и различные варианты, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые составляют объем и сущность настоящего изобретения, изложенного в прилагаемой формуле изобретения.
Claims (26)
1. Способ очистки дарбэпоетина альфа, включающий:
(а) связывание дарбэпоетина альфа на колонке для анионобменной хроматографии путем загрузки смеси, включающей дарбэпоетин альфа, имеющий различное содержание сиаловой кислоты, на колонку для анионобменной хроматографии;
(b) промывание хроматографической колонки с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, для удаления структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих более высокие изоэлектрические точки, чем целевая изоэлектрическая точка, и
(c) элюирование дарбэпоетина альфа, который остается связанным на хроматографической колонке, из этой колонки,
при этом дарбэпоетин альфа, выделенный на стадии (с), имеет изоэлектрическую точку от pI 2,0 до 4,0.
2. Способ по п. 1, в котором промывающий буферный раствор, содержащий аргинин, имеет рН в области от 3,0 до 5,0.
3. Способ по п. 1, в котором промывающий буферный раствор, содержащий аргинин, дополнительно включает по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из NaCl и мочевины.
4. Способ по п. 3, в котором промывающий буферный раствор включает NaCl с концентрацией от 5 ммоль до 90 ммоль.
5. Способ по п. 3, в котором промывающий буферный раствор включает мочевину с концентрацией от 3 моль до 8 моль.
6. Способ по п. 1, дополнительно включающий до или после стадии (b) промывание с помощью промывающего буферного раствора, содержащего или не содержащего аргинин.
7. Способ по п. 1, дополнительно включающий перед стадией (b) первичное промывание колонки с помощью промывающего буферного раствора, имеющего рН в области от 6 до 8, при этом на стадии (b) происходит вторичное промывание колонки содержащим аргинин промывающим буферным раствором, имеющим рН в области от 3 до 5.
8. Способ по п. 7, в котором промывающий буферный раствор для первичного промывания представляет собой раствор фосфата натрия, а промывающий буферный раствор для вторичного промывания представляет собой раствор глицина-HCl.
9. Способ по п. 1, в котором смесь представляет собой дрожжевую культуру, культуру растительной клетки или культуру животной клетки.
10. Способ по п. 1, в котором колонка для анионобменной хроматографии содержит смолу, имеющую функциональную группу, которая выбрана из группы, состоящей из четвертичного амина (Q), диэтиламиноэтила (DEAE) и четвертичного аминоэтила (QAE).
11. Способ по п. 1, дополнительно включающий (d) фракционирование элюата анионобменного хроматографирования, полученного на стадии (с), путем применения к нему гель-фильтрующей хроматографии.
12. Способ очистки дарбэпоетин альфа, включающий:
(a) элюирование фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, путем использования биологической жидкости, содержащей дарбэпоетин альфа, на стадии анионобменного хроматографирования;
(b) элюирование фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, путем использования элюата, полученного на стадии (а), на стадии адсорбционной хроматографии;
(c) связывание дарбэпоетина альфа на анионобменной хроматографической колонке путем загрузки элюата, полученного на стадии (b), на анионобменную хроматографическую колонку;
(d) промывание колонки, обработанной на стадии (с), с помощью промывающего буферного раствора, содержащего аргинин, для удаления структурных изоформ дарбэпоетина альфа, имеющих более высокие изоэлектрические точки, чем целевая изоэлектрическая точка, и
(e) элюирование дарбэпоетина альфа, который остается связанным на хроматографической колонке, при промывании на стадии (d), из этой колонки,
при этом дарбэпоетин альфа, выделенный на стадии (с), имеет изоэлектрическую точку от pI 2,0 до 4,0.
13. Способ по п. 12, в котором неподвижная фаза на стадии адсорбционной хроматографии представляет собой гидроксиапатитовую смолу.
14. Способ по п. 12, дополнительно включающий (f) фракционирование элюата со стадии анионобменного хроматографирования, полученного на стадии (е), путем его использования на стадии гель-фильтрующей хроматографии.
15. Способ по п. 12, стадия (а) которого включает адсорбирование биологической жидкости, содержащей дарбэпоетин альфа, на уравновешенную анионобменную смолу путем добавления на нее указанной жидкости, промывание полученной смолы с помощью промывающего буферного раствора, который имеет рН от 6 до 8 и содержит от 0 ммоль до 100 ммоль NaCl, и элюирование фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, с помощью элюирующего буферного раствора, который имеет рН от 6 до 8 и содержит от 100 ммоль до 300 ммоль NaCl.
16. Способ по п. 12, стадия (b) которого включает загрузку элюата, выделенного на стадии (а), на уравновешенную гидроксиаппатитовую смолу, промывание полученной смолы с помощью промывающего буферного раствора, который имеет рН от 6 до 8 и содержит от 0 ммоль до 100 ммоль фосфата натрия, и получение фракции, содержащей дарбэпоетин альфа, из жидкости, вымываемой со смолы, которая не адсорбируется на нее во время загрузки и промывания.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2013-0148026 | 2013-11-29 | ||
KR1020130148026A KR101414897B1 (ko) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | 다베포에틴 알파의 정제 방법 |
PCT/KR2014/011527 WO2015080509A1 (ko) | 2013-11-29 | 2014-11-28 | 다베포에틴 알파의 정제 방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2643365C2 true RU2643365C2 (ru) | 2018-02-01 |
Family
ID=51741060
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016123352A RU2643365C2 (ru) | 2013-11-29 | 2014-11-28 | Способ очистки дарбэпоетина альфа |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10723775B2 (ru) |
EP (1) | EP3075740B1 (ru) |
JP (1) | JP6232130B2 (ru) |
KR (1) | KR101414897B1 (ru) |
CN (1) | CN105764915B (ru) |
BR (1) | BR112016009421B1 (ru) |
HK (1) | HK1223633A1 (ru) |
MX (1) | MX2016005264A (ru) |
RU (1) | RU2643365C2 (ru) |
WO (1) | WO2015080509A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017154869A1 (ja) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Jcrファーマ株式会社 | 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法 |
JP6258536B1 (ja) * | 2017-03-03 | 2018-01-10 | 協和発酵キリン株式会社 | ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 |
DK3613486T3 (da) | 2018-08-24 | 2021-01-04 | Uga Biopharma Gmbh | Metode og anlæg til rengøring af epo og/eller et epo-derivat |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2009106083A (ru) * | 2006-09-08 | 2010-10-20 | Вайет (Us) | Аргининовая промывка для очистки белков с использованием аффинной хроматографии |
WO2013058485A1 (en) * | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp. | Methods for purifying erythropoietin analogs having lower isoelectric point |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1057534C (zh) | 1993-08-17 | 2000-10-18 | 柯瑞英-艾格公司 | 促红细胞生成素类似物 |
BR9917606A (pt) | 1998-11-06 | 2002-12-31 | Bio Sidus S A | Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
AU2002356733A1 (en) | 2001-11-28 | 2003-06-10 | Sandoz Ag | Chromatographic purification of recombinant human erythropoietin |
WO2007058584A1 (en) * | 2005-11-18 | 2007-05-24 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method for pre-fractionation of complex samples |
EP2307442A4 (en) | 2008-06-24 | 2012-05-30 | Reddys Lab Ltd Dr | PURIFICATION OF MODIFIED CYTOKINES |
US7877937B2 (en) | 2008-09-02 | 2011-02-01 | Amonix, Inc. | High-stiffness, lightweight beam structure |
WO2011024024A1 (en) * | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Avesthagen Limited | A process for recovering darbepoeitin alfa isoforms |
WO2011156369A2 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Dr. Reddy's Laboratories Ltd. | Purification of modified cytokines |
CN103429609A (zh) * | 2010-12-08 | 2013-12-04 | 安姆根有限公司 | 在氨基酸存在下的离子交换层析 |
JP6151640B2 (ja) | 2011-06-29 | 2017-06-21 | 協和発酵キリン株式会社 | たん白質の精製方法 |
US10611794B2 (en) * | 2013-09-25 | 2020-04-07 | Bioverativ Therapeutics Inc. | On-column viral inactivation methods |
-
2013
- 2013-11-29 KR KR1020130148026A patent/KR101414897B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-11-28 JP JP2016525549A patent/JP6232130B2/ja active Active
- 2014-11-28 EP EP14865782.8A patent/EP3075740B1/en active Active
- 2014-11-28 CN CN201480065236.1A patent/CN105764915B/zh active Active
- 2014-11-28 WO PCT/KR2014/011527 patent/WO2015080509A1/ko active Application Filing
- 2014-11-28 BR BR112016009421-2A patent/BR112016009421B1/pt active IP Right Grant
- 2014-11-28 US US15/039,569 patent/US10723775B2/en active Active
- 2014-11-28 MX MX2016005264A patent/MX2016005264A/es active IP Right Grant
- 2014-11-28 RU RU2016123352A patent/RU2643365C2/ru active
-
2016
- 2016-10-17 HK HK16111973.0A patent/HK1223633A1/zh unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2009106083A (ru) * | 2006-09-08 | 2010-10-20 | Вайет (Us) | Аргининовая промывка для очистки белков с использованием аффинной хроматографии |
WO2013058485A1 (en) * | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp. | Methods for purifying erythropoietin analogs having lower isoelectric point |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
EJIMA D. ET AL. "Improved column chromatography performance using Arginine.", AMERICAN LABORATORY., 200702. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105764915B (zh) | 2019-08-13 |
EP3075740B1 (en) | 2020-04-29 |
BR112016009421B1 (pt) | 2021-11-30 |
WO2015080509A1 (ko) | 2015-06-04 |
CN105764915A (zh) | 2016-07-13 |
JP6232130B2 (ja) | 2017-11-15 |
US10723775B2 (en) | 2020-07-28 |
JP2016538261A (ja) | 2016-12-08 |
EP3075740A1 (en) | 2016-10-05 |
BR112016009421A8 (pt) | 2020-03-24 |
EP3075740A4 (en) | 2017-06-28 |
HK1223633A1 (zh) | 2017-08-04 |
US20170022257A1 (en) | 2017-01-26 |
MX2016005264A (es) | 2016-07-08 |
KR101414897B1 (ko) | 2014-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Schwartz et al. | Comparison of hydrophobic charge induction chromatography with affinity chromatography on protein A for harvest and purification of antibodies | |
KR101831300B1 (ko) | 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법 | |
CN106536565A (zh) | 一种用于纯化TNFR‑Fc融合蛋白的方法 | |
Capela et al. | Sustainable strategies based on glycine–betaine analogue ionic liquids for the recovery of monoclonal antibodies from cell culture supernatants | |
US10981975B2 (en) | Method for efficient purification of human serum albumin | |
EA022396B1 (ru) | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин | |
JP6049740B2 (ja) | 低い等電点を有するエリスロポエチン類似体の精製方法 | |
RU2643365C2 (ru) | Способ очистки дарбэпоетина альфа | |
KR20160131113A (ko) | 고나도트로핀의 신규한 정제 방법 | |
JP2023139142A (ja) | 眼科用タンパク質医薬品の精製方法(Refining method of ophthalmic protein pharmaceuticals) | |
KR102140693B1 (ko) | 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체 정제 방법 | |
EP2857417B1 (en) | Highly glycosylated long-acting human growth hormone protein and production method for same | |
WO2011156369A2 (en) | Purification of modified cytokines | |
KR101460266B1 (ko) | 신규한 지속형 인간 성장호르몬의 정제 방법 | |
KR101475484B1 (ko) | 골형성 단백질 4의 정제방법 | |
JP2014529330A (ja) | 単一ユニットクロマトグラフィー抗体精製 | |
Bobruskin et al. | Aqueous Phenolic Extraction: a New Application to IFNβ Purification |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |