KR101460266B1 - 신규한 지속형 인간 성장호르몬의 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 고순도 정제 방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 인간 성장호르몬 및 알파-1 안티트립신 변이체가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; (b) 상기 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액, 또는 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및 (c) 상기 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액, 단계 (a), 또는 단계 (b)에서 생성된 용출액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 정제 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 고순도 정제 방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 인간 성장호르몬 및 알파-1 안티트립신 변이체가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; (b) 상기 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액, 또는 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및 (c) 상기 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액, 단계 (a), 또는 단계 (b)에서 생성된 용출액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 정제 방법에 관한 것이다.
인간 성장호르몬 (human growth hormone, hGH)은 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 21,500 Da의 단백질 호르몬으로 뇌하수체 전엽에서 분비된다. 인간 성장호르몬은 연골성장판의 세포 분화를 자극하여 성장을 촉진시키는 기능을 담당한다. 이러한 성장호르몬의 체내 합성 및 분비 결핍이 있을 경우, 저 신장증, 심혈관 질환의 위험도 증가, 근육 및 골밀도 감소 등을 유발할 수 있다.
이를 치료하기 위한 하나의 방편으로, 인간은 1950년대 후반부터 인간의 뇌하수체에서 유래한 성장호르몬의 형태로 성장호르몬 치료 (growth hormone therapy)를 받게 되었다. 유전공학기술의 발달로 1985년부터 성장호르몬은 대장균이나 효모에서 대량 생산이 가능해졌으며, 성장호르몬 치료가 보다 널리 시술되어 인간 성장호르몬은 2007년 세계시장규모 약 30억 달러의 블록 버스터 바이오의약품으로 성장하였다.
그러나 성장호르몬은 성장장애 환자에게 매일 피하주사로 투여하여야 하므로 아동들에게 많은 심리적 부담과 주사 공포증 등의 문제를 야기하고 있다. 이러한 환자의 투여 편의성을 개선 및 증대시키기 위하여 투여횟수를 크게 줄일 수 있는 지속형 인간 성장호르몬의 개발이 요구되어 왔다.
이러한 요구에 부합하여 1999년 제넨텍 사는 봉합체 (encapsulation)로 만든 서방형 제품인 뉴트로핀 디팟 (nutropin depot)을 최초로 출시하였으며, 국내에서는 LG 생명과학에서 히알루론산을 매트릭스로 한 서방형 제품인 디클라제를 2007년 국내에 출시하였다.
NexP는 본 발명자들에 의해 개발된 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 체내 단백질인 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체이다. 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체는 알파-1 안티 트립신이 지닌 단백질 분해 효소 억제제로서의 고유한 체내 활성을 없애고 반감기를 증가시킬 목적으로 일정 아미노산을 돌연변이시킨 것이다. 단백질 분해 효소로서의 고유한 활성을 없앤 알파-1 안티 트립신의 단백질 서열, 제작 방법 등은 대한민국 공개특허 제10-2010-0116558호에 개시되어 있다.
지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH은 이러한 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체를 인간 성장호르몬의 N-말단 또는 C-말단에 유전자 재조합 방식으로 융합한 단백질이며, 1세대 인간 성장호르몬에 비해 체내 반감기가 개선된 물질이다. 대다수의 1세대 인간 성장호르몬 의약품은 대장균에서 제조되는 반면, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH는 CHO 세포에서 발현되어 당화가 되도록 만들어졌다.
종래의 알파-1 안티 트립신 정제는 폴리글리콜 (polyglycol)과 pH로 불순물만을 침전시키는 방법 (유럽특허 제0097274호), 양이온 교환 수지 (유럽특허 제96929430호 및 유럽특허 제95112630호)으로 수행되었다. 또한 1세대 인간 성장호르몬은 일반적으로 대장균에서 봉입체 (inclusion body)형태로 과발현시킨 후, 리폴딩 (refolding)하고 이를 음이온교환 수지로 정제하는 방법에 의해 얻어졌다 (대한민국특허 제1998-0003752호 및 Patra AK, Mukhopadhyay R, Mukhija R, Krishnan A, Garg LC, Panda AK. (2000) 18, 182-192, 2000; Protein Expr.Purif.).
한편, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH은 분자량 약 70-90 kDa, 등전점 약 pI 4.0-6.0으로 1세대 인간 성장호르몬 또는 알파-1 안티 트립신과 분자량, 등전점 및 당쇄 패턴 등의 물리화학적 성질이 다른 신규물질로서, 1세대 인간 성장호르몬 또는 알파-1 안티 트립신과 동일/유사한 정제방법으로는 고순도의 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH을 얻을 수 없었다. 또한 현재까지 논문이나 특허로 개시된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH에 대한 정제방법은 없었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 기존의 방법으로 고순도의 정제가 어려웠던 NexP-hGH의 효율적인 정제 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 음이온 교환 수지, 소수성 수지, 항체 단편이 부착된 수지 등을 이용하여 고순도의 인간 성장호르몬 NexP-hGH을 정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 고 순도의 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 정제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 인간 성장호르몬 및 알파-1 안티트립신 변이체가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; (b) 상기 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액, 또는 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및 (c) 상기 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액, 단계 (a), 또는 단계 (b)에서 생성된 용출액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 정제 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "NexP-hGH"는 "지속형 인간 성장호르몬"과 혼용되어 사용될 수 있으며, 본 발명자들의 선행특허인 대한민국 특허 출원 제10-2010-0037496호에 개시된 지속형 인간 성장호르몬을 의미한다. NexP는 본 발명자들에 의해 개발된 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 체내 단백질인 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체로 본 발명자들에 의해 명명된 용어이다. 단백질 억제제의 활성을 없앤 알파-1 안티 트립신 변이체의 단백질 서열, 제작 방법 등은 본원에 참조로 인용된 대한민국 특허 출원 제10-2010-0037496호에 개시되어 있다. 다만, 본 발명의 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH에 적용될 수 있는 알파-1 안티 트립신 변이체는 상기 특허 출원 제10-2010-0037496호에 개시된 변이체에 한정되지 않고, 알파-1 안티 트립신이 지닌 단백질 분해 효소 억제제로서의 고유한 체내 활성을 없애고 반감기를 증가시킬 목적으로 일정 아미노산을 돌연변이시킨 것을 모두 포함한다. 또한, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH은 이러한 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체를 인간 성장호르몬의 N-말단 또는 C-말단에 유전자 재조합 방식으로 융합한 단백질이며, 1세대 인간 성장호르몬에 비해 체내 반감기가 개선된 물질이다. 대다수의 1세대 인간 성장호르몬 의약품은 대장균에서 제조되는 반면, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH는 CHO 등의 세포에서 발현되어 당화가 되도록 만들어졌다. 이와 같은 당화는 천연형과 유사한 인간 성장호르몬을 생산하여 인체 내에서 항원성을 유발시킬 위험을 줄일 수 있는 장점이 있다.
상기 알파-1 안티트립신은 분자량이 약 50,000 Da의 포유류의 혈액 내에 존재하는 단백질 중의 하나로서, 혈액 내 농도는 약 2㎎/㎖에 달하는 주 혈액 단백질 중의 하나이며, 알파-1 프로테아제 억제제 (alpha-1 protease inhibitor)라고도 불리운다. 이 단백질은 단백질 분해 효소와의 시험시 여러 종류의 단백질 분해 효소를 억제한다. 혈액 내에서 추출한 알파-1 안티트립신은 FDA의 허가를 거쳐서 프로라스틴 (Prolastin)이라는 상품명으로 폐기종 (emphysema) 치료제로 판매되고 있다. 프로라스틴은 통상적으로 60㎎/㎏의 용량으로 1주 간격으로 정맥 주사로 인체에 투여되며, 인체에서의 안전성 및 유해성이 입증이 된 단백질이다. 알파-1 안티 트립신의 프로테아제 억제제로의 역할 및 구조 등은 이미 잘 알려져 있다 (Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998). 알파-1 안티트립신의 P1 (N-말단에서부터 358번 위치) 아미노산은 메티오닌 기이지만, 이 단백질은 트립신, 키모트립신 (chymotrpsin), 트롬빈 및 엘라스타제 등의 다양한 프로테아제 등의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 알파-1 안티트립신은 자연계에 100여 종 이상의 대립유전자 (allele)가 존재하고, 표현형 (phenotype)은 IEF (isoelectric focusing) 유형에 따라 A에서 Z로 구분한다 (Stoller et al., The Lancet, 365, 2225 - 2236, 2005). 이중 가장 많은 M 대립 유전자는 정상형으로 아미노산 서열 변이에 의해 다시 M1 (Val213), M2, M3와 같이 여러 가지 아형 (subtype)으로 구분된다. 따라서, 본 발명에 사용된 알파-1 안티트립신은 자연계에 존재하는 특정 아형이며, 다른 아형에 대하여도 동일한 효과를 얻을 수 있다.
상기 알파-1 안티트립신 변이체는 하나 이상의 아미노산을 변이시켜 특정부위 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 제조된다. 예를 들어, 알파-1 안티트립신 변이체에서 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 특징으로 한다. 또한, 알파-1 안티트립신 변이체에서 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 포함하고 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 것을 포함한다. 또한, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 9번째 아미노산인 글루타민이 아스파라진으로 변이되거나 또는 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것을 포함한다. 이러한 알파-1 안티트립신 변이체는 Asn-X-Thr의 새로운 N-당화 부위가 생성되어 알파-1 안티트립신의 프로테아제 억제제의 활성을 중화시키는 동시에 체내 주입시에 아미노산 치환에 의한 면역원성 가능성을 최소화할 수 있으며, 유리 시스테인기에 의한 이중체 형성 등을 제거할 수 있다.
본 발명에서 용어, "생물학적 유액"은 세포, 세포 구성요소 또는 세포 산물을 함유하거나 그로부터 유래된 모든 배양액을 말하며, 이에 한정되는 것은 아니나 세포 배양물, 세포 배양 상등액, 세포 용해물, 세포 추출물, 조직 추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 밀크, 뇨, 이들의 분획 등을 포함한다. 본 발명의 정제 방법에서는 상기와 같은 다양한 형태의 생물학적 유액을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 지속형 인간 성장 호르몬인 NexP-hGH를 코딩하는 뉴클레오티드가 유전자 재조합 방식으로 형질 전환된 동물 세포 배양액을 사용하며, 더욱 바람직하게는 상기 동물세포가 CHO (중국햄스터 난소)인 동물 세포 배양액일 수 있다.
동물 세포 배양액 등을 이용하는 경우, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 배양액을 원심분리하여 그 상등액을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 인간 성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이체가 형질전환된 CHO 세포를 배양하여, 배양액의 상등 액에 20 mM 소듐 포스페이트 완충용액을 이용하여 한외 여과 시스템을 이용하여 정용여과 (diafiltration)하여 이용하였다. 상기 대한민국 특허 출원 제10-2010-0037496호 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로 포함된다.
본 발명의 각 단계를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(a) 단계는 인간 성장호르몬 및 알파-1 안티트립신 변이체가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계로서, 바람직하게는 평형화된 음이온 교환 수지에 지속형 인간 성장호르몬을 포함하는 배양액 또는 상기 배양액을 0 내지 100mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 정용여과한 배양액을 가하여 흡착시킨 후, 0 내지 100mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 세척한 후, 100 내지 1000mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 분획을 용출하는 단계일 수 있다. 이와 같은 음이온 교환 수지를 이용하여 배양액 내의 염색약 (dye), DNA/RNA 등의 핵산 등을 제거가능하고, 생물학적 유액 내의 지속형 인간 성장 호르몬을 농축할 수 있다.
본 발명에서 용어, "음이온 교환 수지 크로마토그래피"는 양으로 하전된 지지체에 음으로 하전된 (또는 산성) 분자를 결합시키는 것에 의해 분자들을 이들의 전하에 따라 분리할 수 있는 것으로서, 분자들의 동족체 (산성, 염기성 및 중성)는 이 기법에 의해 쉽게 분리할 수 있다. 본 발명의 음이온교환크로마토그래피에 사용될 수 있는 수지로는 강음이온 교환 수지와 약음이온 교환 수지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 세파덱스, 세파로즈, 소스, 모노, 미니 (상품명, GE healthcare) 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 수지의 작용기가 Q (Quaternary amine), DEAE (DiEthylAminoEthyl) 또는 QAE (Quaternary Amino Ethyl) 등인 수지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 수지의 작용기가 Q 또는 DEAE 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 강음이온 교환 수지인 Q-세파로즈를 사용할 수 있다.
음이온 교환 수지 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피에 의해 수행하거나, 또는 배치 모드(batch mode)로 수행할 수 있다. 상업적 제조인 경우, 배치 모드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 음이온 교환 수지를 세척하고, 단계식 염 구배 (stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 용출시킨다. 적당한 단계식 또는 연속식 염 구배는 불순물로부터 지속형 인간 성장호르몬의 분리를 허용하는 것이라면 어느 것이든 무방하다.
또한, 본 발명의 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 사용되는 음이온 교환 수지는 배양액을 흡착시키기 전에 수성 완충용액으로 평형화시킬 수 있다.
음이온 교환 수지에 배양액을 흡착시키기 전, 0 내지 100mM NaCl을 포함하는 pH 6 내지 9의 완충용액으로 배양액을 희석하거나 농축 및 투석을 수행하면 정제수율을 더욱 높일 수 있다. 이는 한외여과법을 이용한 정용여과를 수행하여 수득할 수 있다. 본 정용여과는 배양액 내의 30,000 M.W.C.O. (molecular weight cut off) 이하의 저분자 물질 (예를 들어, 계면활성제 (surfactant), 염색약, 저분자 펩타이드 (small peptide), 당성분 등) 제거 및 음이온 교환 수지 크로마토그래피 평형 완충용액으로 완충용액 교환을 통한 컬럼 흡착 효율을 향상시키는 것이 가능하다.
한편, 한외여과법은 액체 중에 용해되거나 분산된 물질을 입자크기별로 분획할 수 있는 것으로서, 보통은 분자량 수천 내지 수십만 정도의 분자 또는 콜로이드 입자를 대상으로 분리, 농축, 정제가 가능하다. 한외여과막의 성능은 분획분자량 (M.W.C.O., Molecular weight of cut-off)으로 나타내는데, 그 막의 분획분자량 이상의 물질은 배제되는 것을 의미한다. 보통 M.W.C.O.는 90% 이상 배제될 수 있는 구형 단백질의 분자량으로 나타내고 있다. 이러한 한외여과막의 주요 기능은 정용여과(Diafiltration), 정제 및 농축이다.
상기 각 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액으로는 바람직하게 소듐 포스페이트 (sodium phosphate) 완충용액, 칼륨 포스페이트 (potassium phosphate) 완충용액 또는 트리스 (Tris) 완충용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 CHO 세포로부터 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 발현하여 얻은 배양액을 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)으로 한외 여과 시스템으로 정용여과한 후, 상기 시료를 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)으로 평형화시킨 Q-세파로즈 수지가 충진된 XK-50 컬럼에 20 ㎖/min 유속으로 부하하여 결합시킨 후, 100mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 20 ㎖/min 유속으로 3 컬럼 용량으로 불순 단백질을 제거하는 세척 후, 200mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 20 ㎖/min 유속으로 3 컬럼 용량의 용출용매를 사용하여 지속형 인간 성장호르몬을 용출하였다. 그 결과, 순도는 약 85% 였다 (도 1).
(b) 단계는 상기 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 배양액, 또는 (a) 단계에서 생성된 용출액을 소수성 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계로서, 바람직하게는 평형화된 소수성 수지에 상기 음이온 교환수지 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용액을 가하여 흡착시킨 후, 1 내지 3M NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 세척한 후, 0 내지 1M NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 분획을 용출하는 단계일 수 있다. 소수성 수지는 음이온 교환 수지에서 정제하지 못한 세포유래 불순물들을 좀더 제거 가능하다. 이와 같은 결과들은 도 1의 음이온 교환 수지의 순도 약 80% 과 도 2의 소수성 수지의 순도 약 90%이상인 것을 비교해도 알 수 있다.
이와 같이, (a) 단계 이후에 (b) 단계를 수행하는, 본 발명 정제 방법의 구성적 특징이 기존의 정제 방법과 다른 이유는 다음과 같다: (1) 음이온 교환 수지 (약 10-20mg NexP-hGH/resin 1ml)는 NexP-hGH에 대한 결합 용량 (binding capacity)이 소수성 수지(약 6mg NexP-hGH/resin 1ml)보다 좋기 때문에, 배양액 내의 NexP-hGH 캡쳐 (capture)가 목적인 1차 컬럼은 음이온 교환수지가 적합한 것을 발견하고, (2) 공정 효율성에 있어서도, 음이온 교환 수지 공정 후 음이온 교환 수지 용출액에 대한 농투석 없이 소수성 수지 공정으로 곧바로 진행 가능한 컬럼의 특성을 발견한 데서 도출된 크로마토그래피 조합의 특징이 있다. 만약 소수성 수지 진행 단계인 (b) 단계가 먼저 진행될 경우 소수성 수지 용출액은 음이온 교환 수지 평형 완충용액으로 농투석된 후 음이온 교환 수지 공정으로 진행해야 하는 등 농투석 과정이 추가되야 하는 단점이 있다. 또한, (3) 배양액 유래 염색약 및 DNA 제거에 음이온 교환 수지가 효과적이므로 1차 컬럼에 사용하는 본 발명의 방법이 기존의 정제 방법보다 우수한 결과를 보일 수 있다.
본 발명에서 용어, "소수성 수지 크로마토그래피"는 시판되고 있는 여러 종류의 매트릭스에 결합된 소수성, 적합하게는 방향족 또는 지방족의 전하를 띄지 않는 리간드를 갖는 겔에서 실시되는 임의의 크로마토그래피로서, 상기 겔로 사용될 수 있는 수지로는 높은 해상도를 유지하기 위해 비교적 작은 비드 사이즈 (bead size)를 가지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 소스 (Source, GE healthcare), 리소스 (Resource, GE healthcare) 등의 수지를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 리간드로 작용하는 상기 수지의 작용기로는 페닐 (Phenyl), 옥틸 (octyl), 이소프로필 (Isopropyl), 부틸 (butyl) 또는 에틸 (ethyl)기 등이 바람직하다. 바람직하게는 페닐 수지일 수 있다.
본 발명의 소수성 크로마토그래피에 사용될 수 있는 용출액의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 0 내지 1M NaCl을 포함하는 pH 6 내지 8의 완충용액을 용출액으로 사용할 수 있다.
본 발명에서 음이온 교환 수지 용출액을 소수성 수지에 흡착시키기 전, 3 내지 4M NaCl을 포함하는 pH 6 내지 8의 완충용액으로 희석하거나 1 내지 3M NaCl을 포함하는 pH 6 내지 8의 완충용액으로 농축 및 투석을 수행하여 음이온 교환 수지 용출액 내의 NaCl 농도를 2M 이상으로 높이면 정제 수율을 높일 수 있다.
상기 각 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액으로는 바람직하게 소듐 포스페이트 (sodium phosphate) 완충용액, 칼륨 포스페이트 (potassium phosphate) 완충용액 또는 트리스 (Tris) 완충용액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 완충용액을 이용하여 음이온 교환수지 크로마토그래피 용출액을 소수성 수지 크로마토그래피 컬럼에 부하한 후, 크로마토그래피 수지에 결합된 지속형 인간 성장호르몬을 상기 완충용액을 이용하여 직선농도구배로 용출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Q-세파로즈 컬럼 용출액을 4M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 첨가하여 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)이 되도록 하여 페닐-세파로즈 로딩액을 준비한 후, 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)으로 평형화시킨 페닐-세파로즈가 충진된 XK-50 컬럼에 상기 로딩액을 20 ㎖/min 유속으로 흘린 후, 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 3 컬럼 용량으로 흘려서 세척 후, 0.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 4 컬럼 용량으로 흘려서 지속형 인간 성장호르몬을 용출하였다. 그 결과, 순도는 약 96% 였다 (도 2).
(c) 단계는 상기 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액, 단계 (a) 또는 (b)에서 생성된 용출액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계로서, 바람직하게는 평형화된 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지에 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 배양액, 상기 (a) 또는 (b) 단계의 용출액을 가하여 흡착시키고, 0 내지 200mM NaCl이 포함된 pH 6.5 내지 8.5의 트리스 (Tris) 완충용액으로 세척한 후, 0 내지 1M MgCl2가 포함된 pH 6.5 내지 8.5의 트리스(Tris) 완충용액으로 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 분획을 용출하는 단계일 수 있다.
본 발명의 정제 방법이 고순도 및 고수율의 정제를 할 수 있는 것은 이와 같이, 항체 단편이 부착된 수지 공정을 진행하는 (c) 단계를 마지막 단계로 진행하는 데 특징이 있다. 만약, (c) 단계를 첫 번째 공정으로 사용하여 정용여과된 배양액 내 잔존하는 세척제 (detergent), 염색약, 기타 불순물등이 다량 포함된 배양액을 직접 로딩하면 순도 90%이상의 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 얻을 수 있으나, 결합 용량이 낮아져 수율이 저하되는 단점을 본 발명자들이 처음 규명하였다. 첫번째 공정으로 세척제, 염색약, 기타 불순물등의 존재하에도 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH에 대한 결합 용량이 높은 (10mg/ml이상) (a) 단계를 진행하여 불순물을 일부 제거한 후, (b) 및 (c) 단계를 순차적으로 거치는 것이 98%이상 순도 및 25%이상 수율을 만족하는 정제 공정임을 발견하여 본 발명의 정제 방법을 구성한 것이다.
상기 음이온 교환수지 및 소수성 수지공정으로부터 90-95% 순도를 가진 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 얻을 수 있으며, 99% 이상의 고순도 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 얻기 위해서 항체 단편이 부착된 수지를 추가할 수 있다. 또한, 항체 단편이 부착된 수지만을 이용하여 배양액 정제시 수율은 상기공정 대비 약 20%정도 떨어지나 약 90-95% 순도를 가진 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH을 얻을 수 있음을 확인하였다.
바람직하게는 상기 소수성 수지로부터 얻은 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 용출액을 0 내지 100mM NaCl을 포함하는 pH 7 내지 9의 트리스 (Tris) 완충용액으로 농축 및 투석하거나 용액 내 NaCl농도가 200mM이하가 되도록 희석한다. 농축 및 투석 또는 희석된 용액을 항체 단편이 부착된 수지, 구체적으로 안티 알파-1 안티트립신 항체단편이 부착된 수지에 가하여 흡착시키고, 0 내지200mM NaCl을 포함하는 pH 6.5 내지 8.5의 트리스 (Tris) 완충용액으로 세척한 후, 0 내지 1M MgCl2을 포함하는 pH 6.5 내지 8.5의 트리스 (Tris) 완충용액으로 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 분획을 용출한다.
상기 각 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액으로는 바람직하게 소듐 포스페이트 (sodium phosphate) 완충용액, 칼륨 포스페이트 (potassium phosphate) 완충용액 또는 트리스 (Tris) 완충용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 (b) 단계에서 얻은 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 용액을 150mM NaCl이 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 이용하여 한외 여과 시스템으로 정용여과하였다. 안티 알파1-안티트립신 (A1AT) 항체 단편이 부착된 수지 (이하 'AIAT'로 명명)가 충진된 XK-50컬럼 (GE Healthcare사)에 충진하여 150mM NaCl이 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 정용여과액을 20 ㎖/min의 유속으로 상기 컬럼에 흘린 후, 다시 150mM NaCl이 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 약 3 컬럼 용량을 흘려 컬럼을 세척하였다. 이후 50mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)으로 컬럼을 세척한 후, 100mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4), 200mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4), 300mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 순차적으로 흘려 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 분획을 용출하였다. 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 용출액은 150mM NaCl이 포함된 PBS (pH 7.45) 완충용액을 이용하여 한외 여과 시스템 (분자량 컷 오프 30,000)으로 정용여과 (diafiltration)하여, 회수한 용출액의 순도를 확인한 결과, 약 99%임을 확인하였다 (도 3).
바람직하게, 상기 방법은 (d) 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피 정제 단계 중 0 내지 1000 mM MgCl2로 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 당사슬 패턴 및 등전점이 다른 구조적 아형 (isoform)을 분리 용출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 (d) 단계는 MgCl2이 아닌 NaCl을 이용할 수 있으며, 이때 바람직하게, MgCl2 대신 사용하는 Nacl은 0 내지 2000 mM NaCl로 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 당사슬 패턴 및 등전점이 다른 구조적 아형을 분리 용출하는 단계일 수 있다.
상기 항체 단편이 부착된 수지 분리 단계 중 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 당사슬 패턴 및 등전점이 다른 구조적 아형 (isoform)은 MgCl2 농도에 따라 분리용출이 가능하다. 예를 들어 100mM MgCl2 완충용액은 200mM MgCl2 완충용액보다 많은 당사슬과 낮은 등전점을 가진 구조적 아형을 선택적으로 용출할 수 있다 (도 4).
항체 단편이 부착된 수지로부터 얻은 용출액인 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH을 함유하는 용출액은 추가의 완충용액 교환공정을 수행할 수 있다. 완충용액 교환공정은 겔 여과 (gel-filtration)또는 농축 및 정용여과 (concentration and diafiltration)등으로 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은 음이온 교환 수지, 소수성 수지, 항체단편이 부착된 수지를 이용하여, 세포 배양액으로부터 99%이상 고순도의 재조합 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에서 제공하는 고순도의 정제 방법은 생산 공정에 적용할 경우, 대량으로 고순도의 지속형 인간 성장호르몬을 정제할 수 있어서, 단백질 치료제의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 분리한 지속형 인간 성장호르몬의 순도를 SDS-PAGE 및 C4 HPLC 분석 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 소수성 수지 크로마토그래피를 이용하여 분리한 지속형 인간 성장 호르몬의 순도를 SDS-PAGE 및 C4 HPLC 분석 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리한 지속형 인간 성장 호르몬의 순도를 SDS-PAGE 및 C4 HPLC 분석 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 MgCl2 농도에 따라 분리 용출된 지속형 인간 성장호르몬의 당사슬 패턴 및 등전점의 차이를 나타낸 도이다. 왼쪽 도면의 레인 1: 소수성 수지 용출액; 레인 2: 100mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬 인 NexP-hGH; 레인 3: 200mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 4: 300mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH. 오른쪽 도면의 레인 1: 50mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 2: 100mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 3: 200mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 4: 300mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH.
도 2는 소수성 수지 크로마토그래피를 이용하여 분리한 지속형 인간 성장 호르몬의 순도를 SDS-PAGE 및 C4 HPLC 분석 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리한 지속형 인간 성장 호르몬의 순도를 SDS-PAGE 및 C4 HPLC 분석 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 MgCl2 농도에 따라 분리 용출된 지속형 인간 성장호르몬의 당사슬 패턴 및 등전점의 차이를 나타낸 도이다. 왼쪽 도면의 레인 1: 소수성 수지 용출액; 레인 2: 100mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬 인 NexP-hGH; 레인 3: 200mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 4: 300mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH. 오른쪽 도면의 레인 1: 50mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 2: 100mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 3: 200mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH; 레인 4: 300mM MgCl2/트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)로 용출된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
1: 지속형 인간 성장호르몬
NexP
-
hGH
제조
<1-1> 인간 성장호르몬/알파-1
안티트립신
변이융합체의
벡터제조 [
hGH
/α1 AT(
Q9N
,
P357N
)]
인간 성장호르몬을 알파-1 안티트립신 변이융합체의 N 말단에 융합시킨 벡터를 제조하기 위하여 우선 부위 특이적 돌연변이 (site directed mutagenesis)를 통하여 P357N로 변이시킨 A1AT(P357N)를 제조하여, Xho1과 BamH1 부위를 가지는 pG001 유래 PCR product hGH와 벡터 pAV1과 클로닝하여 pT107을 제조하였다. pT107은 hGH와 A1AT가 링커 없이 결합되어 있는 P357N 변이체이다. 이 클론을 당화 증가를 위하여 A1AT를 Q9N으로 점 돌연변이 (point mutation)시켜서 이중 변이체를 만들고 DHFR 유전자 및 Kozac 서열 등을 추가 삽입하여 벡터를 제조하였다.
<1-2> 인간 성장호르몬/알파-1
안티트립신
변이융합체의
발현
상기 <1-1>의 벡터로 만들어진 클론을 이용하여 차이니즈 햄스터 난소세포 (CHO)에 형질전이시키고 인간 성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체 (107N)의 발현을 확인하였다. 인간 성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체 (107N) 발현 세포는 8% CO2와 37℃ 조건으로 CD Opti-CHO 배지에서 배양 0.5x106 cells/㎖ 농도로 접종하여 현탁 배양하였다.
실시예
2: 지속형 인간 성장호르몬
NexP
-
hGH
의 음이온 교환 수지 및 소수성 수지 크로마토그래피를 이용한 정제 방법
형질전환된 CHO 세포로부터 상기 실시예 1에서 제조한 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH을 발현하여 얻은 배양액 약 2ℓ를 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 이용하여 한외 여과 시스템 (분자량 컷 오프 30,000)을 이용하여 정용여과 (diafiltration)하였다.
약 250㎖ Q-sepharose (GE Healthcare사)수지를 XK-50컬럼 (GE Healthcare사)에 충진하여 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 준비된 Q-sepharose 컬럼에 상기 정용여과액 약 1ℓ를 20㎖/min의 유속으로 흘린 후, 다시 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 약 3CV(column volume)흘려 컬럼을 세척하였다.
100mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 20㎖/min의 유속으로 약 3CV정도 흘려 불순 단백질들을 제거한 후, 200mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 20㎖/min의 유속으로 약 3CV정도 흘려 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 용액을 회수하였다.
회수한 용출액의 순도를 C4 HPLC 분석 크로마토그래피를 통하여 측정한 결과는 도 1과 같으며, 그 결과, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 순도가 약 85%임을 확인할 수 있었다.
Q-sepharose 컬럼 용출액을 4M Nacl/20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)를 첨가하여 약 2.5M Nacl/20mM 소듐 포스페이트 (pH 8.0)가 되도록 하여 페닐-세파로즈 (Phenyl-sepharose) 로딩액을 준비하였다.
약 250㎖ 페닐-세파로즈 (GE Healthcare사)수지를 XK-50컬럼(GE Healthcare사)에 충진하여 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.5)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 준비된 페닐-세파로즈 컬럼에 상기 페닐-세파로즈 로딩액 약 1.2ℓ를 20㎖/min의 유속으로 흘린 후 다시 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 약 3CV(column volume)흘려 컬럼을 세척하였다.
0.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0) 완충용액을 20㎖/min의 유속으로 약 4CV정도 흘려 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 용액을 회수하였다.
회수한 용출액의 순도를 C4 HPLC 분석 크로마토그래피를 통하여 측정한 결과는 도 2와 같으며, 지속형 인간성장호르몬 NexP-hGH의 순도가 약 96%임을 확인할 수 있었다.
실시예
3:
안티
알파1
-
안티트립신
항체단편이
부착된 수지 정제방법
상기 실시예 2에서 얻은 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 용액 약 1ℓ를 150mM NaCl이 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 이용하여 한외 여과 시스템 (분자량 컷 오프 30,000)을 이용하여 정용여과 (diafiltration)하였다.
약 250㎖ 안티 알파1-안티트립신 (A1AT) 항체 단편이 부착된 수지 (GE Healthcare사, 이하 'AIAT'로 명명)를 XK-50컬럼 (GE Healthcare사)에 충진하여 150mM NaCl이 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다.
준비된 A1AT 컬럼에 상기 정용여과액 약 1ℓ를 20㎖/min의 유속으로 흘린 후 다시 150mM NaCl이 포함된 트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 약 3CV(column volume)흘려 컬럼을 세척하였다. 이후 50mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)으로 컬럼을 세척한 후, 100mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4), 200mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4), 300mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)을 순차적으로 흘려 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 분획을 용출하였다.
지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH을 함유하는 용출액은 150mM NaCl이 포함된 PBS (pH 7.45) 완충용액을 이용하여 한외 여과 시스템 (분자량 컷 오프 30,000)으로 정용여과 (diafiltration)하였다.
회수한 용출액의 순도를 C4 HPLC 분석 크로마토그래피를 통하여 측정한 결과는 도 3과 같으며, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 순도는 약 99%임을 확인하였다.
실시예
4: 지속형 인간 성장호르몬
NexP
-
hGH
의
당사슬
패턴 및
등전점에
따른 분리
상기 실시예 3에서 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 당사슬 패턴 및 등전점이 다른 구조적 아형 (isoform)은 MgCl2 농도에 따라 분리용출이 가능하였다. 100mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4), 200mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4), 300mM MgCl2가 포함된 트리스 (Tris) 완충용액 (pH 7.4)으로 분리 용출된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 당사슬 패턴 및 등전점의 차이는 도 4와 같다.
상기와 같은 결과들은, 본 발명의 음이온 교환수지, 소수성 수지, 항체 단편이 부착된 수지가 충진된 컬럼을 순차적으로 이용할 경우, 본 발명의 지속형 인간 성장호르몬을 99% 이상의 고순도로 분리 정제할 수 있음을 뒷받침하는 동시에, 당쇄화의 차이에 따라 원하는 당쇄화가 된 지속형 인간 성장호르몬을 분리 정제할 수 있음을 시사하는 것이다.
Claims (15)
- (a) 인간 성장호르몬 및 알파-1 안티트립신 변이체가 결합된, 체내 반감기가 증가된 단백질 융합체인 지속형 인간 성장호르몬을 포함하는 생물학적 유액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계;
(b) 상기 지속형 인간 성장호르몬을 포함하는 생물학적 유액, 또는 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및
(c) 상기 지속형 인간 성장호르몬을 포함하는 생물학적 유액, 단계 (a), 또는 단계 (b)에서 생성된 용출액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하여 50 내지 300 mM MgCl2로 목적하는 당사슬 패턴 및 등전점을 갖는, 체내 반감기가 증가된 지속형 인간 성장호르몬인 구조적 아형 (isoform)을 분리 용출하는 단계를 포함하는, 지속형 인간 성장호르몬의 정제 방법으로서, 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체로서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이는 357번째 아미노산인 프롤린이 변이된 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 평형화된 음이온 교환 수지에 지속형 인간 성장호르몬을 포함하는 배양액 또는 상기 배양액을 0 내지 100mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 정용여과한 배양액을 가하여 흡착시킨 후, 0 내지 100mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 세척한 후, 100 내지 1000mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 지속형 인간 성장호르몬을 함유하는 분획을 용출하는 단계인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 평형화된 소수성 수지에 지속형 인간 성장호르몬을 포함하는 배양액, 또는 상기 음이온 교환수지 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용액을 가하여 흡착시킨 후, 1 내지 3M NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 세척한 후, 0 내지 1M NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 지속형 인간 성장호르몬을 함유하는 분획을 용출하는 단계인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 평형화된 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지에 지속형 인간 성장호르몬을 함유하는 배양액, 또는 상기 (a) 또는 (b) 단계의 용출액을 가하여 흡착시키고, 0 내지 200mM NaCl이 포함된 pH 6.5 내지 8.5의 트리스 (Tris) 완충용액으로 세척한 후, 50 내지 300 mM MgCl2가 포함된 pH 6.5 내지 8.5의 트리스(Tris) 완충용액으로 지속형 인간 성장호르몬을 함유하는 분획을 용출하는 단계인 것인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액이 소듐 포스페이트 (sodium phosphate) 완충용액, 칼륨 포스페이트(potassium phosphate) 완충용액 또는 트리스(Tris) 완충용액인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 유액은 동물세포 배양액인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지의 작용기가 Q (Quaternary amine), DEAE (DiEthylAminoEthyl) 및 QAE (Quaternary Amino Ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 소수성 수지 크로마토그래피의 작용기가 페닐, 옥틸 (octyl), 이소프로필, 부틸 및 에틸 (ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 포함하고, 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 것을 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 9번째 아미노산인 글루타민이 아스파라진으로 변이된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 변이는 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것인 방법.
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