PL131155B1 - Process for preparing novel peptides - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych peptydów O ogólnym wzorze przedsta¬ wianym na rysunku, w którym R oznacza atom wodoru, lub grupe metylowa, A oznacza D-Ala, Rj oznacza pierwszorzedowa grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla lub grupe cyklopropylometylo*wa, X oznacza atom bromu, jodu lub chloru lub grupe metylowa, a Z oznacza grupe o wzorze -C(0)NH2 ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczal¬ nych, nietoksycznych soli addycyjnych z kwasami, wykazujacych dzialanie przeciwbólowe.Ostatnio z mózgu ssaków lub z plynu mózgowo- -rdzeniowego (efs) wyekstrahowano substancje en¬ dogenna o wlasciwosciach podobnych do morfiny.Substancja ta, nazwana enkefalina, zostala zidenty¬ fikowana przez Eughesa i innych, Nafcure, 258, 577 {1975) jako *pentapeptydy o nastepujacych sekwen¬ cjach: H-Tyr-Gly^Gly-Phe-Met-CH H-Tyr^Gly-Cay-Phe-Iieu-OH Zwiazki te nazwano, odpowiednio, metwmfcaoentce- falina i leucynoenkefalina.Chociaz metionino- i leucynoenkefalina wykazuje dzialanie przeciwbólowe u myszy przy podawaniu do komory móagow^rdzeniowej fBtiisclier i inni, Nature, 861, 433 <1976], sa one jednak praktycznie pozbawiane wszelkiego dzialania przeciwbólowego przy podawaniu pozajelitowo.Dlatego, od czasu odkrycia enkefaliia, ttsilowano wytworzyc analogi ^nkefalin, w nadziei znalezie¬ nia zwiazków wykazujacych dzialanie i dajacych sie praktycznie stosowac w drodze podawania po¬ zajelitowego lub doustnego dzieki ich fciodostej?- nosci.§ Dutta i iimi, Life Sciences 21, sir. 559—562 11911) opisuja pewne modyCakacje steufctury, które, jak sugeruja, maja tendencje do zwiekszania mo¬ cy dzialania. Wedlug tcli s^gesta. aktywnosc dzia¬ lania zwiazku mozna zwiekszyc dsieki wszystkim 10 trzem luto tylfco jednej nastepujacej modjrftkaeji: a) podstawieniu D- lub a-azzaminokwasy; b) konwersje koncowej grupy karboksylowej w ester metylowy lub amid; c) modyfikacje Phe w pozycji 4 przez podstawienie 15 a-aza, N-metylowanie lub uwodornianie pierscie- Jiia aromatycznego.Obecnie odkryto klase analogów jenkefeUiny o wysokim poziomie dzialania przeciwbólowego spczeZKwiego z mala tendencja do powstawania uza- M leznien nalogowych. Analogi te sa czteropeptydamd zawierajacymi fenyloalanine podstawiona w pier¬ scieniu. Sa one wysoce specyficzne zarówno pod wzgledem rodzaju podstawiika j^ik i pozycji pod¬ stawienia. Sa to zwlaszcza czteropeptydy zawiera- M jace L-fenyloalankie m-podeiawtona w pozycji 4 peptydu.Z literatury znane «a inne podstawione w pier¬ scieniu 4-fenyloalanylowe analogi enkefaKny, nie sa Tone jednak m-podsfcawionymi analogami 4-fe- m nyk*ai^loenkefal*ny. AM. Day i jnni, Res. CoawBu 131 1553 131 155 4 in Chem. Path. and Pharmacol. 14 (4), 597—603 (1976) opisuje H-Tyr-Gly-Gly-pClPhe-Nle-OH.R. J. Miller i inni, Vitamins and Hormons, 36, 297—382, Academic Press (1978) wymienia H-Tyr- -D-Ala-Gly-pClPhenD-Leu-OH; H-Tyr-D-Ala-Gly- -pClPHe-D-Leu-OMe; i H-Tyr-D-Ala-Gly-p-ClPhe- -D-Leu-NHEt. Pless i inni, w referacie „Opioid Activity of Enkephalin Analogues", przedstawio¬ nym na 15 Europejskim Sympozjum Peptydów, 4—9 wrzesien 1978, Gdansk, Polska, omawia H- -Tyr-D-Ala-Gly-pClPhe-Met/O/ol. D.H. Coy i in- .ni, BBRC 83 (3), 977—983 wzmiankuje H-Tyr-D- -Ala-Gly-F5Phe-Met-NH2. W opisie patentowym Republiki Poludniowej Afryki nr 77/0579 ujawnio- ]npt pieciopeptydowet analogi enketaliny róznie pod¬ stawione w pierscieniu reszty fenyloalaniny. W pelgijskim .opisie patentowym nr 886 679 ujawnio¬ no czteró^eptydpwe analogi enkefaliny, zawierajace ^¦^UQrodDQ4»tgwiona fenyloalanine. Belgijski opis patentowy nr 870 819, opis patentowy Republiki Poludniowej Afryki nr 77/4479 oraz Mc Gregor i inni, Lifo Sciences 23, 1371—1378 (1978) ujawnia¬ ja czteropeptydowe analogi enkefaliny, ale zadna z tych publikacji nie ujawnia fenyloalaniny pod¬ stawionej w pierscieniu w pozycji 4. Referat R. Millera „Structural Pharmacology and Neuro- biology of the Enkephalins and Endophias" na 176 'American Chemical Society National Moeting in Miami Beach, Floryda, St. Zjedn. Am., 11—14 wrzesien, 1978 ujawnia pewne p-podstawione w pozycji 4-fenyloalaniny analogi enkefaliny, zwla¬ szcza zwiazki p-chloro- i p-bromopodstawione.Meltzer i inni, Life Sciences 22, 1931—1938 (1978) ujawniaja szereg analogów enkefaliny, zwlaszcza dwa p-chloropodstawione i jeden p-metoksypodsta- wione analogi fenyloalaniny.Zadna z przytoczonych publikacji nie opisuje zwiazku o ogólnym wzorze przedstawionym na ry¬ sunku, a stwierdzono, ze zarówno rodzaj jak i po¬ zycja podstawnika L-fenyloalaniny odgrywa znacz¬ na role zarówno w poziomie dzialania przeciwbó¬ lowego analogu enkefaliny jak i w stopniu popa¬ dania w narkotyczne uzaleznienie.Sposób wytwarzania peptydów o ogólnym wzorze przedstawionym na rysunku, w którym wszystkie podstawniki maja poprzednio podane znaczenie po¬ lega na tym, ze odszczepia sie grupy blokujace z odpowiednio chronionego zwiazku o wzorze przedstawionym na rysunku, stosujac srodek od- szczepiajacy, taki jak kwas, korzystnie kwas mrówkowy, kwas trójfluorooctowy, kwas p-tolu- enosulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas naf- talenosulfonowy, kwas metanosulfonowy lub lodo¬ waty kwas octowy w obecnosci gazowego HC1, z uzyciem akceptora jonu karboniowego, korzyst¬ nie anizolu, tioanizolu lub trójetylosilanu, w tem¬ peraturze od okolo — 10°C do okolo 30°C.Grupy blokujace, znajdujace sie w chronionym peptydzie sa znanymi grupami blokujacymi stoso¬ wanymi w syntezie peptydów do ochrony amino¬ kwasów w procesie sprzegania i obejmuja takze zywiczny nosnik stosowany w technice syntezy w fazie stalej.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku wchodza w sklad preparatów farmaceutycz¬ nych, zawierajacych zaróbke" i jako skladnik ak¬ tywny zwiazek o wzorze przedstawionym na ry- . sunku.Sposób wedlug wynalazku dotyczy równiez wy- 5 twarzania farmaceutycznie dopuszczalnych, nietok¬ sycznych soli addycyjnych zwiazków o wzorze przedstawionym na rysunku z kwasami. Do soli tych naleza sole addycyjne z kwasami organiczny¬ mi i nieorganicznymi, np. z kwasami takimi jak l0 kwas solny, siarkowy, sulfonowy, winowy, fuma¬ rowy, bromowodorowy, glikolowy, cytrynowy, ma¬ leinowy, fosforowy, bursztynowy, octowy, azotowy, benzoesowy, askorbinowy, p-toluenosulfonowy, ben¬ zenosulfonowy, naftalenosulfonowy, propionowy U i inne. Korzystnymi solami addycyjnymi sa sole z kwasem solnym, octowym lub ,. bursztynowym.Wszystkie powyzsze sole otrzymuje sie w znany SpOSOD.Jak mozna stwierdzic na podstawie róznych zna- 20 czen podstawników wystepujacych we wzorze przedstawionym na rysunku, zwiazki objete tym wzorem strukturalnym sa czteropeptydarni, których C-koncowa czesc stanowi pierwszorzedowy amid.Istotna cecha zwiazków o wzorze . przedstawio- 25 nym na rysunku jest ich stereokonfiguracja. Dla wygody reszty aminokwasowe czteropeptydów o wzorze przedstawionym na rysunku sa ponume¬ rowane kolejno poczawszy od reszty przy konco¬ wej funkcji aminowej. Chiralnosc reszt aminokwa- 30 sowych, czytajac od pozycji 1 do pozycji 4, jest L, D, zadna, i L. W pozycji 3 znajduje sie reszta glicyny i dlatego nie wystepuje w tej reszcie chi¬ ralnosc.Grupa Ri we wzorze przedstawionym na ry- 35 sunku oznacza „pierwszorzedowa grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla". Pod okresleniem tym ro¬ zumie sie metyl, etyl i n-propyl.Jesli chodzi o poszczególne pozycje reszt w czte- ropeptydzie o wzorze przedstawionym na rysunku, 4i przewazaja nastepujace wzgledy.A) Pozycja 1.Pozycja ta reprezentuje koniec peptydu zakon- 45 czony grupa aminowa. Reszta aminokwasu jest reszta L-tyrozyny. Reszta ta moze byc N-niepod- stawiona i w tym przypadku R oznacza atom wo-. doru. Ponadto reszta ta moze byc N-jednopodsta- wiona, bedac reszta N-metylo. W zwiazkach o wy- 5n ja-tkowo wysokim poziomie dzialania przeciwbólo¬ wego przy podawaniu pozajelitowym, reszta tyro- sylowa znajdujaca sie w pozycji 1 korzystnie jest N-niepodstawiona. W zwiazkach o wyjatkowo wy¬ sokim poziomie dzialania przeciwbólowego przy w podawaniu doustnym, reszta tyrosylowa jest ko¬ rzystnie N-podstawiona.B) Pozycja 2. 60 Reszta aminokwasu (A) znajdujaca sie na dru¬ giej pozycji peptydów o wzorze przedstawionym na rysunku musi byc D-stereoizomerem i jest nia D-Ala.C) Pozycja 3. r5 Reszta aminokwasu znajdujaca sie w tej pozy-s 131 155 6* cji jest reszta pochodzaca od glicyny (Gly).D) Pozycja 4.Reszta aminokwasu znajdujaca sie w tej pozycji jest reszta pochodzaca z m-podstawionej L~fenyto- alaniny [Phe(X». Beszta ta jest podstawiona przy atomie azotu grupy aminowej (Rt) metylem, etylem, n-propylem lub cytdopff^ylome^ytem.Ponadto reszta L-fenyloalaniny jest podstawiona w pierdoleniu w polozeniu meta. Podstawnikiem moze byc atom bromu, jodu, chloru lub metyl.Korzystnie podstawnikiem tym jest atom bromu lubJodu, najkorzystniej bromu.L-lenyloalanina stanowi reszte C-koneowa zwiafcku o wzorze przedstawionym na rysunku i jest aminokwasem strukturalnie przeksztalconym w jego^ amid fZ oznacza grupe -C(0)-NH*).W niniejszym opisie stosuje sie nastepujace skróty, któryeh wiekszosc jest dobrze znana i sze¬ roko stosowana: Ala — alanina Gly — glicyna Leu — leueyna Met — metionina Phe r— ienyloalawHia ' Tyr — tyrozyna Me — metyl Et — etyl DCC — NjN^wueyklofeeksylokarbodwAomid BBT — l-hydroksybenzetiaaol DMF — N,N-dwumetylo*ormamid TFA — kwas trójfhtoroectowy eter l8Hkoronowy-5i-l,4,7,10,13,W-heife9aoitsa€ykk)- oktadekan.Zwiazki wyjsciowe, to iest zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku z ochronionymi gru¬ pami funkcyjnymi- wytwarza sie w sposób znaaay w syntezie peptydów. Podczas syntezy pewnych zwiazków wyjsciowych mozliwe jest, ze moze na¬ stapic czesciowa racemizacja. Stopien- racemizaeji jednak, o ile nastepuje, nie jest wystarczajacy do znacznej zmiany dzialania przeciwbólowego zwiaz¬ ków o wzorze przedstawionym na rysunku.Zwiazki wyjsciowe mozna syntetyzowac na dro¬ dze syntezy peptydu w stanie stalym lub na dro¬ dze klasycznej syntezy w fazie roztworu. W me¬ todzie syntezy w stanie stalym konstruuje sie ko¬ lejno lancuch peptydu stosujac nosnik z zywicy, zwlaszcza z zywicy p-metylobenzhydryloaminowej lub ehlorometylowanej zywicy polistyrenowej. Pro¬ dukt odszczepia sie od zwicy HF w temperaturze 0°C lub kwasem octowym i oczyszcza, zwykle cjiromatograficznie. W syntezie w fazie roztworu lancuch peptydu_ tworzy sie przez reakcje, róznych aktywowanych i chronionych aminokwasów w nie¬ mal dpwolnej kolejnoscia po czym usuwa sie wszystkie pozostale grupy ochronne srodkiem usu¬ wajacym te grupy, takim jak kwas, np. kwas tr^ójfluorooctowy (TFA), kwas p-toluenosulfonowy j(TSA), 'kwas henzenosulfonowy (BSA), kwas meta- nosulfpnqwy (MCA)^ kwas naftalenosulfonowy, lo¬ dowaty kwas octowy z. gazem HC1 lub kwas mrówkowy. Qbecny jest zwykle takze srodek zdol¬ ny do, wiazania jonu.karboniowego, taki jak¦ anizcl, tioanizolj lub trójetylosilan, korzystnie anizol.Wszystkie warunki reakcji sa dobrze znane fa¬ chowcom z dziedziny chemii pejfrtydów. Np, tempe¬ ratura reakcji z TFA wynosi od ok^lo —10°C do okolo +30°C.Niezaleznie od stosowanej metody, wytwarzanie 5 wyjsciowych zwiazków polega na sprzeganiu ami¬ nokwasów lub fragmentów peptydów przez reakcje funkcji karboksylowej jednego z nich z funkcja aminowa drugiego i utworzenia wiaz&nia amido¬ wego. W celu skutecznego przeprowadzenia sprzt*- 10 gania pozadane jest, aby najpierw zdez&ktywowfcc wszystkie grupy funkcyjne hfe biorace bezposred¬ niego udzialu W reakcji przy uzyciu ódpdwiednkh grup ochronnych, a ponadto, aby odpowiednia zaktywowac funkcje karboksylowa, która niusi byc u* sprzegana tak, aby umózHwic zachodzenie sprzega¬ nia. Wszystko to wymaga dokladnego defeoru za¬ równo kolejnosci reakcji, jak i Warunków reakcji, a takze stosowania okreslonych gfup ochronnych, 20 aby otrzymac pozadariy produkt peptydoWy;." Kaz¬ dy z aminokwasów stosowanych do wytwarzania zwiazków o wyjsciowych ze szczególowo4 ctebrany^ mi grapami ochronnymi i/ltrb zaktywoWanymi gru¬ pami funkcyjnymi wytwarza sie w sposób ddbrtc many w chemii peptyóGW. 25 W kazctym etapie calkowitej syntezy zwiazk** wyjsciowego: stosuje sie wylatane kombinacje grup ochronnych. Te szczególne kombinacje gruf echTOtmych sa najlepsze, Baozna jednak stosowac inne koaiatoinacje, choc przypiuszczalnde z mniej za¬ dawalajacymi wynikami. I tak np<. w syntezie zwiaakw wyjsciowych jako grupy ochroone grapy asminowej, itoozna zamiennie stosowac grupy benw- bsykaribanyiow^ IH*riQd-butotesykarbonylowa, HJ- H!Zft4-*aryloksykarbonylowa, p-mefceksybenzyloksy- karbonylowa, adama©tyloi«yka*benylowa i frs&bor- nylofeBykarboirylowa. Pottad*0 j*ktf grupe, ochronna g^upy hgr»dro/ksykwei ressfcy* tycosylow/ej stoailjer sie zwykle grupe- benzylowa (Bzl)* chociaz równie do¬ brze mozna tez stosowac i inne grupy, tafcie jak p-nitrobensylowa (PNB), p-metoksyberszylowa fPMB) i podobctó.Grupami blokujacymi grupe karboksylowa pod¬ czas wytwarzania zwi^zików wyjsciowych moga 45 byc dowolne typowe grupy tworzace estry, obej¬ mujace np. metyl, etyl, benzyl, p-nitróbenzyi, p- -metoksybenzyl, 2,2l,2-trójchlbroetyl i podobne.Sprzeganie odpowiednio chronionego zblokowa¬ nego aminokwasu lub fragmentu peptydu z ddp*o- 5o wiednio chronionym aminokwasem lub fragmentem peptydu z zablokowana grupa karboksylowa pod¬ czas wytwarzania zwiazku wyjsciowego póiega^ na zaktywowaniu wolnej funkcji karbbkssytówef ami¬ nokwasu lub fragmentu peptydu dfr: reakcji sprze- 55 gania. Mozna to osiagnac, stosujac jeden sposród kilku znanych1 sposobów: Jeden z takiclr sposobów aktywowania polega na konwersji fsrifccji karbo¬ ksylowej w mieszany bezwodnik. Wbina- ftinkcje karboksylowa aktywuje sie w reakcji z innymi 60 kwasami, zwykle z pochodna kWasu1' weglowego, taka jak jego chlorek kwasowy. Przykladowymi chlorkami kwasowymi stosowanymi do tworzenia mieszanych bezwodników sa chloromrówczan etylu, chloromrówczan fenylu, chloromróWczan II-rzed- J5 -butylu, chloromrówczan izobutylu, chlorek piwa- 30 35 40I 131 155 8 loilu i podobne. Korzystnie stosuje sie chloromrów- czan izobutylu.Inny sposób aktywowania funkcji karboksylowej w celu przeprowadzenia reakcji sprzegania pole¬ ga na jej przeksztalceniu w aktywna pochodna estrowa. Takie aktywne estry obejmuja np. ester 2,4,5-trójchlorofenylowy, ester piecioehlorofenylowy, ester p-nitrofenylowy i podobne. Innym dostepnym do zastosowania sposobem sprzegania jest dobrze znana metoda sprzegania azydowego.Korzystny sposób sprzegania stosowany do wy¬ twarzania wyjsciowego zwiazku polega na stoso¬ waniu do aktywowania wolnej funkcji karboksy¬ lowej N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimidu (DDC) pozwalajac tym samynj^na sprzeganie. Ten spo¬ sób sprzegania i aktywizacji prowadzi sie, stosujac równomolowa ilosc DCC w stosunku do amino¬ kwasu lub fragmentu peptydu i w obecnosci rów- nomolowej ilosci 1-hydroksybenzotriazolu (HBT).Obecnosc HBT tlumi niepozadane reakcje ubocz¬ ne, wlacznie z mozliwa racemizacja.Odszczepianie wybranych grup blokujacych jest konieczne w poszczególnych etapach syntezy zwiaz¬ ków wyjsciowych. To usuwanie grup blokujacych prowadzi sie znanymi srodkami powodujacymi ich usuwanie. Chemik o przecietnej wiedzy w zakresie syntezy peptydów moze latwo wybrac sposród grup ochronnych te grupy, które sa przydatne w tym sensie, ze mozna osiagnac selektywne rozszczepia¬ nie produktu, pozwalajace usunac jedna lub wiecej lecz mniej niz wszystkie grupy ochronne znajdu¬ jace sie w aminokwasie lub fragmencie peptydu.Sposób ten jest dobrze znany w chemii peptydów.-Dokladniejsze omówienie dostepnych technik selek¬ tywnego odszczepiania podano w literaturze, Schróder and Lubke, The Peptides, • t. I. Acade- mic Press, New York (1965), a zwlaszcza w tablicy zamieszczonej na stronach 72—75 tej publikacji.Odszczepianie grup chroniacych grupy karboksy¬ lowe mozna osiagnac na drodze alkalicznego zmyd- lania. Do deestryfikacji chronionej grupy karbok¬ sylowej stosuje sie zwykle stosunkowo silne wa¬ runki alkaliczne stosujac zazwyczaj wodorotlenek metalu alkalicznego, taki jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek litu i podobne.Warunki reakcji zmydlania sa równiez dobrze zna¬ ne w technice. Wiele sposród grup blokujacych grupe karboksylowa mozna tez usuwac na drodze katalitycznej wodorolizy, obejmujacej np. wodoro- lize w obecnosci katalizatora takiego jak pallad na weglu. Ponadto w tych przypadkach, w których grupa blokujaca grupe karboksylowa jest p-nitro- benzyl lub 2,2,2-trójchloroetyl, odblokowanie moz¬ na osiagnac przez redukcje W obecnosci cynku i kwasu solnego.Wiele sposród grup blokujacych grupy aminowe odszczepia sie, traktujac chroniony aminokwas lub peptyd kwasem, takim jak kwas mrówkowy, trój- fluorooctowy (TFA), p-toluenosulfonowy (TSA), benzenosulfonowy (BSA), naftalenosulfonowy i po¬ dobne, tworzac odpowiednie sole addycyjne z kwa¬ sem. Odszczepianie innych grup mozna osiagnac, traktujac aminokwas lub peptyd z zablokowana grupa aminowa mieszanina HBr i kwasu octo¬ wego, otrzymujac odpowiednia sól addycyjna z kwasem bromowodorowym. Stosowanie okreslo¬ nego sposobu lub reagenta zalezy od wlasciwosci chemicznych lub fizycznych materialów bioracych udzial w konkretnej reakcji odblokowywania. Po¬ wstala sól addycyjna z kwasem mozna przeksztal¬ cic w bardziej dopuszczalna farmaceutycznie po- 5 stac przez traktowanie odpowiednia zywica jono¬ wymienna, taka jak DEAE Sephadex A 25, Amber- lyst A 27 i podobne.Grupe ochronna grupy hydroksylowej mozna za¬ chowac w peptydzie w ciagu kolejnych reakcji je- 1 go wytwarzania i usuwac ja w koncowym etapie syntezy wraz z odszczepianiem grupy blokujacej gru¬ pe aminowa. W zaleznosci jednak od warunków stosowanych do usuwania grupy blokujacej grupe karboksylowa, mozna ja usuwac w jednej z wcze- 15 sniejszych kolejnych reakcji prowadzacych do wy¬ tworzenia peptydu. Gdy grupe karboksylowa od¬ szczepia sie przez alkaliczne zmydlanie, ochroniona grupa hydroksylowa zostaje zachowana, gdy jed¬ nak do usuwania grupy ochronnej grupy karbo- 20 ksylowej stosuje sie katalityczna wodorolize, na¬ stepuje równiez odszczepienie grupy chroniacej grupe karboksylowa. Ta ostatnia sytuacja nie stwarza powaznych trudnosci, gdyz wytwarzanie zwiazków o wzorze przedstawionym na rysunku 25 mozna osiagnac w obecnosci niechronionej reszty tyrosylowej.Konkretny korzystny sposób wytwarzania zwiaz¬ ków wyjsciowych polega na sprzeganiu dwupepty- du reprezentujacego reszty aminokwasowe w pozy- 30 ejach 2- i 3- z C^koncowym aminokwasem i na¬ stepnie sprzeganiu powstalego trójpeptydu z N- -koncowa tyrozyna. C-koncowy aminokwas moze zawierac reszte amidowa, alkoholowa, eterowa lub estrowa. Alternatywnie, moze on zawierac grupe 35 stanowiaca prekursor pozadanej reszty C-konco- wej. Ogólna kolejnosc reakcji przedstawiono na schemacie 1, na którym Z oznacza reszte C-kon- cowa badz to w postaci ostatecznej badz jako pre¬ kursor, AA oznacza reszte aminokwasu a liczba 40 przy symbolu AA oznacza pozycje w ostatecznej sekwencji produktu peptydowego.Na schemacie 1 przedstawiono tylko jedna kolej¬ nosc reakcji wytwarzania zwiazków wyjsciowych.Mozliwe sa, oczywiscie, takze inne kolejnosci reak- 45 cji. Jedna z nich polega na sprzeganiu oddzielnie wytworzonego N-koncowego trójpeptydu z od¬ dzielnie wytworzonym C-koncowym aminokwasem z nastepnym odszczepieniem wszystkich pozosta¬ lych grup blokujacych. Inne rozwiazanie, które 50 mozna stosowac, polega na stopniowym, kolejnym dodawaniu poszczególnych aminokwasów do kon¬ struowanego lancucha peptydu poczynajac od C- -koncowej reszty aminokwasu. Technika prowa¬ dzenia wyzej opisanych reakcji ^est taka sama, 55 jak w przypadku innych kolejno prowadzonych czynnosci preparatywnych.W niektórych zwiazkach o wzorze przedstawio¬ nym na rysunku jedna lub wiecej grup R i Rx oznacza, zmiennie, grupe alkilowa lub cyklopropy- §o lometylowa. W tych przypadkach w kolejnych reakcjach prowadzacych do wytworzenia wyjscio¬ wego peptydu stosuje sie odpowiedni N-podsta- wiony aminokwas. Kazdy z N-monopodstawionych aminokwasów mozna wytworzyc jak przedstawiona 15 na schemacie 2, stosujac jako substancje wyjscio-9 wa N-chroniony aminokwas.Jak wskazuje kolejnosc reakcji na schemacie 2, aminokwas najpierw traktuje sie wodorkiem pota¬ su w obecnosci odpowiedniego eteru koronowego, aby wytworzyc dwuanion. Produkt posredni trak^ tuje sie nastepnie odpowiednim jodkiem alkilu lub cyklopropylometylu, aby otrzymac pozadany N- -podstawiony aminokwas.Dla fachowca w dziedzinie syntezy peptydów bedzie oczywiste, ze racemizacja przy atomie wegla w polozeniu a moze wystepowac w warunkach sil¬ nie alkalicznych, takich jak stosowane podczas opisanego wyzej alkilowania. Stopien racemizacji moze byc rózny, zaleznie od rodzaju aminokwasu, Racemizacje mozna zminimalizowac stosujac nad¬ miar srodka alkilujacego i jak najkrótszy czas reakcji. Pomimo to, nawet w przypadku wysta¬ pienia nadmiernej racemizacji, produkt mozna oczyscic przez przekrystalizowanie w postaci soli d-(+)-a-fenyloetyloaminy.C-Koncowa czesc peptydów o wzorze przedsta¬ wionym na rysunku jest przeksztalcona w jej po¬ chodna, to jest pierwszorzadowy amid. Przeksztal¬ cenie w amid osiaga sie przez aktywowanie grupy karboksylowej aminokwasu NnN^wucyikloheksylo- karbodwuimidem (DCC) w obecnosci 1-hydroksy- benzotriazolu (HBT), wytwarzajac ester HBT, któ¬ ry nastepnie poddaje sie reakcji z bezwodnym amoniakiem, otrzymujac amid.Korzystnymi zwiazkami wytwarzanymi sposo¬ bem wedlug wynalazku sa amid L-(N-metylo)tyro- sylo-D-alanyloglicylo-L-(N-cyklopropylometylo)-m- -bromofenyloalaniny, amid L-(N-metylo)tyrosylo-D- -alanylo-glicylo-L^(N-etylo)-m-bxomofenyloalaniny, amid L-tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L-(N-etylo)-m- bromofenyloalaminy, amid L-(N-metylo)-tyrosylo- -D-alanylo-glicylo-L-(N^metylo)-m-metylofenyloala- niny, amid L-tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L-(N-ety- lo)^m-chlorofenyloalaniny, amid L-(N-metylo)tyro- zylo-D-alanylo-glicylo-L-(N-etylo)-m-chlorofenylo- alaniny, amid L-tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L-(N- -etylo)^m-jodofenyloalaniny, amid L-tyrosylo-D- alanylo-glicylo-L-(N-cyklopropylometylo)-m-jodofe- nyloalaniny i amid L-(N-metylo)tyrosylo-D-alany- lo-gn^ylo-I^(N-cyklopropylometylo)-in-jodofenylo- alaniny. Zwiazki te wytwarza sie np. dzialajac ^na ^odpowiednio zabezpieczone zwiazki wyjsciowe kwasem trójfluorooctowym.Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku wykazuja wartosciowe wlasciwosci farmaceutycz¬ ne, takie jak dzialanie przeciwbólowe a takze neu- roleptyczne. Sa one szczególnie przydatne przy po¬ dawaniu pozajelitowym Jul? doustnym ssakom, wlacznie z ludzmi, do lagodzenia bólu i polepsza¬ nia, stanów zaburzen emocjonalnych. Dodatkowa wielka zaleta zwiazków o wzorze przedstawionym na rysunku jest to, ze wraz z dzialaniem przeciw¬ bólowym i neuroleptycznym wykazuja one bardzo niskie popadanie pacjentów w uzaleznienie.Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku mozna podawac same lub w polaczeniu z farma¬ ceutycznie dopuszczalnymi zarobkami, których ilosc jest okreslona rozpuszczalnoscia i chemiczna na¬ tura zwiazku, wybrana droga jego podawania, i standardowa praktyka farmaceutyczna. 155 10 Korzystne sa kompozycje nadajace sie do po¬ dawania pozajelitowego, to jest domiesniowo, pod¬ skórnie lub dozylnie. Obejmuja one sterylne, nada¬ jacej sie do iniekcji roztwory luib zawiesiny oraz sterylne, nadajace sie do iniekcji depo lub prepa¬ raty powoli uwalniajace skladnik czynny. Szcze * gólmie dogodne sterylne, nadajace sie do iniekcji roztwory sporzadza sie w izotonicznym roztworze soli lub dekstrozy. Sterylne, nadajace sie do iniek¬ cji kompozycje mozna sporzadzac i przechowywac jako takie lub mozna je sporzadzac bezposrednio przed uzyciem dodajac sterylne srodowisko, np. wode, do znanej ilosci wagowej sterylnego sklad¬ nika zawartego w nosniku, np. fiolce lub ampul¬ ce, która zachowuje sterylnosc skladnika. Znana ilosc wagowa sterylnego skladnika moze tez za¬ wierac sterylna dekstroze lub chlorek sodu w ilosci zapewniajacej izotoniczny roztwór lub zawie¬ sine po dodaniu sterylnego srodowiska.M Korzystne sa równiez kompozycje nadajace sie do podawania doustnego. Mozna je sporzadzac jako oddzielne jednostki, takie jak kapsulki, tabletki i podobne, z których kazda zawiera zalozona ilosc substancji czynnej. Ponadto mozna je spo- 28 rzadzac np. w postaci proszku lub granul, jako roztwór lub zawiesine w srodowisku wodnym lub niewodnym, lub jako emulsje.Tabletki mozna sporzadzac przez sprasowywa- nie, zwykle z jednym lub wiecej skladnikami po¬ mocniczymi. Tabletki sporzadza sie przez spraso- wywanie substancji czynnej w postaci zdolnej do swobodnego plyniecia, takiej jak proszek lub gra¬ nulat, i zwykle zmieszanej z jednym lub wieksza liczba innych skladników, takich jak srodki wiaza¬ ce, smarujace, obojetne rozcienczalniki, srodki zwilzajace, powierzchniowo-czynne, buforujace, smakowe, zageszczajace, konserwujace, rozpraszaja¬ ce i podobne.Lekarze ustala konkretna dawke zwiazków o wzorze przedstawionym na rysunku, która jest najbardziej odpowiednia. Zmienia sie ona w zalez¬ nosci od sposobu podawania, rodzaju podawanego zwiazku, leczonego -pacjenta i rodzaju leczenia.Zwykle jednak dawka wynosi Okolo 0,5 ng do okolo 2 mg na kilogram wagi ciala pacjenta, a korzystnie od okolo 10 ^g do okolo 100 ^g na kilo¬ gram wagi ciala przy podawaniu domiesniowym lub podskórnym, i od okolo 0,1 |ig do okolo 200 u.g na kilogram wagi ciala pacjenta, korzystnie od okolo l^g do okolo 50 ^g na kilogram wagi ciala przy podawaniu dozylnym. Przy podawaniu do¬ ustnym zwykla dawka waha sie w granicach od okolo 100 jjig do okolo 100 mg na kilogram wagi ciala pacjenta, korzystnie od okolo 500 |mg do oko¬ lo 50 mg na kilogram wagi ciala, zwlaszcza od okolo 1 mg do okolo 10 mg na kilogram wagi ciala.Nastepujace nieograniczajace przyklady ilustruja wytwarzanie i dzialanie zwiazków o wzorze przed¬ stawionym na rysunku. Wszystkie skróty uzywane w przykladach zdefiniowano wyzej.Przyklad I. Wytwarzanie soli octanowej ami¬ du L-(N-metylo)tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L-(N-cy- klopropylo-metylo)-m-bromofenylbalaniny.131 11 A. Ester etylowy Nó-acetylo-p-cyjano-D,L-m- -biromofenyloalaniny.Do mieszanej mechanicznie zawiesiny 16,8 g (0,35 mola) wodorku sodu (50% w oleju mineral¬ nym) w 260 ml suchego THF dodaje sie w tem¬ peraturze pokojowej w malych porcjach 59,56 g (0,35 mola) acetamidocyjanooctanu etylu. Do mie¬ szaniny reakcyjnej wkrapla sie roztwór 87,48 g (0,35 mola) bromku-m-bromobenzylu w 50 ml THF (suchy). Mieszanine najpierw chlodzi sie lektkc a nastepnie miesza w ciagu 72 godzin w tempera¬ turze pokojowej, po czym ogrzewa w ciagu 4 go dzin w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrot¬ na. Nastepnie mieszanine chlodzi sie do tempera¬ tury pokojowej, dodaje 80 ml etanolu i miesza w ciagu dalszych 30 minut, po czym wylewa do IN HC1. Mieszanine wodna ekstrahuje sie octanem etylu, oddziela warstwe octanowa i przemywa kt. lejno woda, IN kwasnym weglanem sodu i woda.Octan etylu suszy sie nad siarczanem magnezu i zateza pod zmniejszonym cisnieniem do oleju (107 g).NMR 6 2,0 (acetyl), 3,4^3,5 {metylen) i 7,1—7,5 (m-bromofenyl).B. D,L-m-bromofenyloalanina.Produkt otrzymany w czesci A (107 g, 0,32 mola) zawiesza sie w roztworze 58,8 g (.1,47 mola) table¬ tek wodorotlenku sodu w 220 ml wody. Powstala mieszanine ogrzewa sie w ciagu 24 godzin w wa runkach wrzenia pod chlodnica zwrotna. Nastap- »o nie mieszanine ochladza sie do temperatury poko¬ jowej i nastawia 6N HC1 wartosc pH na 6,5. Po- • wstaly osad zbiera sie i suszy, otrzymujac 41,01 g (53%) zwiazku tytulowego.C. Na-trójfluoroacetylo-D,L-m-bromofenyloalani- 35 na.Do 200 ml kwasu trójfluorooctowego dodaje sie 46,53 g (0,19 mola) D,L-m-bromofenyloalaniny. Mie¬ szanine chlodzi sie do temperatury 0°C i w ciagu 5 minut dodaje 29,3 ml (0,21 m) bezwodnika trój- 40 fluorooctowego. Otrzymany roztwór miesza sie w ciagu 1,5 godziny w temperaturze 0°C. Mieszani¬ ne miesza sie w ciagu 3 godzin w temperaturze pokojowej, po czym zateza pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Pozostalosc rozciencza sie 400 ml wody, * a powstaly osad zbiera sie i suszy, i krystalizuje z mieszaniny eteru z eterem naftowym, otrzymu¬ jac 28,4 g (44%) zwiazku tytulowego.Wyniki analizy obliczone dla CuH9N03BrF3 (340,1) C — 38,85; H — 2,67; N —4,12. *° Znaleziono: C — 39,09; H — 2,46; N — 4,32.D. L^m-bromofenyloalanina.Do 500 ml wody dodaje sie 28 g (0,082 mola) produktu z czesci C. Mieszanine poddaje sie mie- w szaniu i dodaje 2N NaOH az do otrzymania kla¬ rownego roztworu (pH 7,2). Dodaje sie karboksy- peptydaze A (25 mg) i roztwór utrzymuje sie w temperaturze 37°C za pomoca lazni wodnej z ter¬ mostatem i przy wartosci pH 7,2, za pomoca pH- 60 -statu typu Radiometer. Po pieciu dniach lagod¬ nego mieszania doprowadza sie pH roztworu do Wartosci 5,0, dodaje wegiel i mieszanine saczy sie.Wartosc pH przesaczu nastawia sie IN HC1 na 3 i ekstrahuje go trzykrotnie octanem .etylu. Na- — 155 12 stepnie nastawia sie za pomoca 2N NaOH wartosc pH wodnego roztworu na 7,0 i zateza roztwór pod zmniejszonym cisnieniem dopóki nie zacznie krystalizowac izomer L. Mieszanine pozestawia 9 sie do ostygniecia do temperatury pokojowej. Po¬ wstaly osad zbiera sie i suszy, otrzymujac 10,9 g (109%) tytulowego zwiazku.E. Na-III-rzed.-butoksykarbonylo-L-m-bromofe- nyloalanina. 10 Do mieszaniny 25 ml alkoholu IH-rzed.-butylo- wego i 20 ml wody dodaje sie 9,0 g (0,041 mola) produktu otrzymanego w czesci D, a nastepnie 20,5 ml (0,041 mola) 2N NaOH i 8,9 g (0,041 mola) weglanu dwu-III-rzed.-butylu. Mieszanine podda¬ je je sie mieszaniu w ciagu 5 godzin w temperaturze pokojowej, po czym dodaje sie 150 ml wody. Wod¬ na mieszanine ekstrahuje sie eterem. Warstwe wodna zakwasza sie do pH 2,5 zimnym IN HC1 i ekstrahuje eterem. Warstwe eterowa ekstrahu- 20 je sie woda, suszy nad siarczanem magnezu i od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem do otrzy¬ mania oleju. Olej ten rozpuszcza sie w eterze naf¬ towym i pozostawia do odstania w ciagu nocy w temperaturze 4°C. Powstale krysztaly zbiera sie i suszy, otrzymujac 11,3 g (80%) zwiazku tytulo¬ wego o temperaturze topnienia 124—125°C.[ Wyniki analizy dla C14H18N04Br (344) obliczono: C — 48,85; H — 5,27; N — 4,07 znaleziono: C — 49,25; H — 5,59; N — 4,04.F. Amid Nó-III-rzed.^buto mofenyloalaniny.Do 50 ml DMF dodaje sie 11,5 g (0,033 mola) Na-III-rzed.-butoksykarbonylo-L-m-bromofenyloala- niny. Mieszanine chlodzi sie do temperatury —15°C i dodaje 3,63 ml (0,033 mola) NMM i 4,33 ml (0,33 mola) chloromrówczanu izobutylu. Mieszanine poddaje sie mieszaniu w temperaturze —15°C w ciagu 5 minut, po czym przepuszcza przez nia w ciagu jednej godziny bezwodny amoniak (gaz) w postaci pecherzyków. Mieszanine poddaje sie mie¬ szaniu w ciagu dalszych czterech godzin w tempe¬ raturze —15°C, po czym wylewa sie ja na pokru¬ szony lód i IN wodoroweglan sodu. Powstaly wod¬ ny roztwór ekstrahuje sie octanem etylu. Oddziela sie warstwe organiczna i kolejno ekstrahuje woda, 1,5 N kwasem cytrynowym i woda. Faze orga¬ niczna suszy sie nad siarczanem magnezu i zate¬ za pod zmniejszonym cisnieniem do stalej pozo¬ stalosci, która rozciera sde z eterem a powstaly osad gromadzi sie i suszy, otrzymujac 11,3 g (100%) zwiazku tytulowego o temperaturze topnienia 146—• 147°C. [a]a5D+9,8° (c = 0,5 MeOH) Wyniki analizy dla Ci4H19N203Br (343,2) obliczono: C — 48,99; H — 5,58; N — 8,16 znaleziono: C — 48,85; H — 5,33; N — 7,91.G. Chlorowodorek amidu L-m-bromofenyloalani- ny.Do 60 ml swiezo sporzadzonego IN HC1 (gaz) w lodowatym kwasie octowyni zawierajacym 5 ml amidu dodaje sie 11,1 g (0,032 mola) produktu otrzymanego jak opisano w czesci F. Mieszanine poddaje sie mieszaniu w temperaturze pokojowej w ciagu 30 minut, po czym wylewa sie ja do131 155 13 14 8,75 g (98%) tytulowego zwiazku. [a]25D + 13,46° (c = 0,5, MeOH) Wyniki analizy dla C9H12N2OClBr (279,6) obliczono: C — 38,67; H — 4,33; N — 10,02 znaleziono: C — 38,55; H — 4,41; N — 10,00.H. Amid Na~-cyklopropylometylo-L-m-bromofe- nyloalaniny.Do 50 ml bezwodnego etanolu dodaje sie 4,2 g <(0,015 mola) produktu otrzymanego jak opisano w czesci G, a nastepnie 5,04 g (0,06 mola) stalego bezwodnego kwasnego weglanu sodu i 2,04 g (0,015 mola) bromku cyklopropylometylu. Miesza¬ nine ogrzewa sie w ciagu 7 godzin w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrotna, po czym odparo¬ wuje pod zmniejszonym cisnieniem do otrzymania oleju, który rozpuszcza sie w 20 ml chloroformu d przenosi na kolumne 3X40 cm z zelem krze¬ mionkowym Grace i Davidsona typ 62, w chloro¬ formie. Produkt eluuje sie przy stopniowym gra¬ diencie do 10% metanolu. Produkt izoluje sie wed¬ lug profilu gromadzonych .frakcji cienkowarstwo¬ wych, otrzymujac 2,2 g (49%) zwiazku tytulowego.NMR 8 1,6 (-NH-) i 7,0—7,4 (m-bromofenyl).I. Amid Na-III-rzed.^butoksykiarbonylo-D-alany- lo-glicylo-L-^N^-cyklopropylomety^-m-bromofeny- loalaniny.Do 40 ml DMF dodaje sie 2,1 g (7,1 milimoli) produktu otrzymanego jak opisano w czesci H.Mieszanine oziebia sie do temperatury 0°C i do¬ daje 1,87 g (7,1 milimoli) N bonylo-D-alanylo-glicyny, a nastepnie 0,96 g (7,1 milimoli) HBT i 1,46 g (7,1 milimoli) DCC. Mie¬ szanine poddaje sie mieszaniu w ciagu 4 godzin w temperaturze 0°C, po czym w ciagu 72 godzin w temperaturze pokojowej. Nastepnie mieszanine ochladza sie do temperatury 0°C, powstaly osad usuwa sie przez odsaczenie a przesacz odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpusz¬ cza sie w octanie etylu, i roztwór ekstrahuje sie kolejno IN wodoroweglanem sodu, woda, 1,5 N kwasem cytrynowym i woda. Faze organiczna su¬ szy sie nastepnie nad siarczanem magnezu i odpa¬ rowuje pod zmniejszonym cisnieniem do uzyska¬ nia oleju, otrzymujac 1,5 g (40%) zwiazku tytulo¬ wego.J. Amid ,Na^butoksykarbonylo-NA^metylo-L-tyro- sylo-D-alanylo-glicylo-L-tN^-cyklopropylometylo)- -ni-bromofenyloalaniny.Do 50 ml kwasu trójfluorooctowego zawierajace¬ go 5 ml anizolu dodaje sie 1,5 g (2,9 milimoli) pro¬ duktu otrzymanego jak opisano w czesci I. Miesza¬ nine poddaje sie mieszaniu w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C i odparowuje bez ogrzewania pod zmniejszonym cisnieniem. Powstaly olej roz- -ciencza sie eterem. Supernatant dekantuje sie, a powstaly olej suszy sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem.Do 15 ml DMF dodaje sie 0,856 g (2,9 milimola) N^-III-rzed.-butoksykarbanylo-Na-metylo-L-tyro- zyny. Mieszanine chlodzi sie do temperatury —15°C i do poddawanego mieszaniu roztworu do¬ daje sie 0,32 ml (2,9 milimola) NMM i 0,38 ml (2,9 milimola) IBCF. Mieszanie kontynuuje sie w temperaturze —15°C postepujac nastepujaco: Sól TFA trójpeptydu otrzymanego jak opisano wyzej rozpuszcza sie w 10 ml DMF. Mieszanine chlodzi sie do temperatury 0°C i dodaje w jednej porcji 0,32 ml (2,9 milimola) NMM. Roztwór mie- 5 sza sie, aby zapewnic kompletnosc przebiegu reak¬ cji. Powstala mieszanine dodaje sie nastepnie do wczesniej sporzadzonego roztworu mieszanego bez¬ wodnika. Powstala mieszanine miesza sie w ciagu 4 godzin w temperaturze —15°C, po czym pozwala 10 na jej stopniowe ogrzanie do temperatury pokojo¬ wej i kontynuuje mieszanie przez okres nocy. Na¬ stepnie mieszanine wylewa sie do IN wodoroweg¬ lanu sodu i ekstrahuje powstaly wodny roztwór octanem etylu. Oddziela sie faze organiczna i eks- 15 trahuje kolejno woda, 1,5 N kwasem cytrynowym i woda. Octan etylu suszy sie nastepnie nad siar¬ czanem magnezu i zateza pod zmniejszonym cis¬ nieniem, do oleju (1,6 g). Olej rozpuszcza sie w acetonie i naklada na dwie preparatywne plytki 20 cienkowarstwowe. Plytki eluuje sie mieszanina chloroformu i metanolu 9:1. Zbiera sie frakcje glównego skladnika z plytek do chromatografii cienkowarstwowej TLC i eluuje z zelu krzemion¬ kowego otrzymujac 0,8 g (39%) zwiazku tytulo- 25 we2°- K. Sól octanowa amidu NAnmetylo-L-tyrosyio- -D-alanylo-glicylo-L- -bromofenyloalaniny.Do 15 ml TFA zawierajacego 3 ml anizolu do- 3e daje sie 0,8 h (1,2 milimola) produktu otrzyma¬ nego jak opisano w czesci J. Mieszanine poddaje sie w ciagu 30 minut mieszaniu w temperaturze 0°C po czym suszy sie ja przez wymrazanie. Po¬ zostale cialo stale rozpuszcza sie w 9,0 ml 0,1 M 3g roztworu octanu amonu zawierajacym 31% aceto- nitrylu. Roztwór nanosi sie na kolumne NPLC 4X^2 cm z zelem krzemionkowym CM z odwró¬ ceniem fazy. Kolumna pracuje pod cisnieniem 4,116-105 Pa, a eluat bada sie przy 260 mm. Od- 4i powiednie frakcje laczy sie i liofilizuje. Powstale cialo stale rozpuszcza sie w 0,2 M kwasie octo¬ wym i nanosi na kolumne z Sephadexu G-10 o wymiarach 2,5X100 cm, zrównowazona poprzed¬ nio tym samym rozpuszczalnikiem. Eluat bada sie 41 przy 280 nm i odpowiednie frakcje laczy sie i lio¬ filizuje, otrzymujac 773 cm (97%) zwiazku tytulo¬ wego. ¦ . ' daP5D+6,64° l(c=0,5; IN HC1).Wyniki analizy dla C8oH4oN5Q7Br (662,6) 50 obliczono: C — 54,38; H — 6,09; N — 10,57 znaleziono: C — 54,30; H — 5,99; N — 10,28.Analiza aminokwasów: Ala — 0,97; Gly — 1,03; NH8 — 0,99.Przyklad II. w Postepujac jak w przykladzie I, wytwarza sie z odpowiednich zwiazków wyjsciowych nastepuja¬ ce zwiazki: A. Sól < octanowa amidu L-(N-metylo)tyrosylo-D- -alanyloglicylo-L-(N-etylo)-m-bromofenyloalaniny. et fa?5D+7,l° Wyniki analizy dla CssHsg^OyBr (636,5) obliczono: C — 52,83; H — 6,02; N — 11,00 znaleziono: C — 53,09; H — 6,13; N — 11,18.Analiza aminokwasów: Ala — 0,99; Gly — 1,01; 65 NH3 — 1,04. •131 155 15 16 B. Sól octanowa amidu L-tyrosylo-D-alanylo-glicy- lo-L^N-etylo)-m-broniofenyloalaniny. faF^j —8,3° Wyniki analizy dla C27H8sN507Br (623) obliczono: C — 52,09; H — 5,83; N — 11,25 znaleziono: C — 52,13; H — 6,09; N — 11,39.Analiza aminokwasów: Tyr — 1,01; Ala — 0,99; Gly — 0,99; NHa — 1,01.C. Sól octanowa amidu L-(N-metylo)tyrosylo-D- alanylo-glicylo-L-(N-etylo)-m-metylofenyloalaniny. fal^D +9,2° (c = 0,5, IN HC1).Wyniki analizy dla CtdH4iN507 (571,7) obliczono: C — 60,93; H — 7,23; N — 12,25 znaleziono: C — 60,68; H — 7,00; N — 12,46.Wyniki analizy aminokwasów: Ala — 0,98; Gly — 1,02; NH8 — 0,96.D. Sól octanowa amidu L-tyrosylo-D-alanylo-glicy- lo-L^N-etyloJ-m-chlorofenyloalaniny. fa]»D—13,7° (c = 0,5, IN HC1) Wyniki analizy dla C27H3«N507C1 (578,1) obliczono: C — 56,10; H — 6,28; N — 12,12 •znaleziono: C — 55,84; H — 6,37; N — 12,35.Analiza aminokwasów: Tyr — 1,02; Ala — 0,99; Gly — 0,98; NH8 — 0,88.E. Sól octanowa amidu L-(N-metylo)-tyrosylo-D- -alanylo-^cylo-L^N-etyloH^-chlorofenyloalaniny. [ap6D_9,2° (c=0,5, IN HC1).Wyniki analizy dla C^HgaNsOjCl (592,1) obliczono: G — 56,80; H — 6,47; N — 11,83 znaleziono: C — 57,11; H — 6,45; N — 12,15.Analiza aminokwasów: Ala — 0,9ft; Gly — 1,00; NH8 — 1,01. l\ Sól octanowa amidu L-tyrosylo-D-alanylo-L- -(N*etylo)-m-joótofenyloalaniny. faFD—14,0° (c = 0,5, IN HC1).- Wyniki analizy dla C^B^^Z (669,5) obliczono: C — 48,44; H — 5,42; N — 10,46 znaleziono: C — 48,40; H — 5,25; N — 10,66.^ Analiza aminokwasów: Tyr — 1,01; Ala — 0,99; Gly — 0,&d; NH, — 1,05.G. Sól octanowa amidu L-tyrosylo-D-alanylo-glicy- kh-L*(N-cyklopropyloimetylo)-ni-jodofenyloalaniny. fol^+MS0 (C^0,5,1H CHaCOOH) Wyniki analizy dla C^HjeNsOTJ obliczono: C — 5Q0a; H — 5,51; N — 10,07 znaleziono: C — 50,00; H — 5,22; N — 10,23.Analiza aminokwasów: Tyr — 0,99; Ala — 1,01; Gly ^ 0,99; NH3 — Q,*5.H. Sól octanowa amidu L- -alanylo-glicyk)-L-(N-cylklopTopylometylo)-m-jodo- fenyloalaniny. fa]a6D+0,787° (c=0,5, IM CHACOOH) Wyniki analizy dla CmH^sOtJ obliczono-. C — 50,78; H — 5,68; N — 9,81 znaleziono: C — 50,5&; H — 5,40; N — 9,88.Dzialanie znieczulajace zwiazków o wzorze przedstawionym na rysunku wykazywano w pró¬ bie goracej plyty na myszach. W próbie tej stosuje sie pionowy cylinder akatylanowy zawierajacy jako podstawe powierzchnie goracej plyty, utrzymywa¬ nej w temperaturze 52°C. Myszy podaje sie przez podskórne wstrzykniecie, wczesniej okreslona ilosc badanego zwiazku, rozpuszczonego lub zawieszone¬ go w odpowiednim nosniku i umieszcza sie ja po 15 minutach od chwili podania badanego zwiazku 10 15 20 25 30 35 40 50 55 na powierzchni goracej plyty. Mierzy sie w sekun¬ dach opóznienie, z jakim mysz zeskakuje z po¬ wierzchni goracej plyty. Srodek, który wykazuje dzialanie znieczulajace daje zwiekszenie tego opóz¬ nienia w porównaniu z myszami kontrolnymi, któ¬ re otrzymuja tylko nosnik. Musi to nastepowac w granicach dawki nie powodujacej braku koordy¬ nacji lub mozliwosci wykonywania ruchów. W po¬ nizszej tablicy 1 podano wartosci ED50 otrzymane w tej próbie. Pod okresleniem „ED50" rozumie sie dawke, która powoduje znieczulenie 50% bada¬ nych myszy. Znieczulenie okresla sie jako opóz¬ nienie reakcji na bodziec w obecnosci badanego zwiazku, które jest równe lub wieksze niz opóz¬ nienie reakcji zwierzat kontrolnych plus dwa od¬ chylenia standardowe. Procentowe dane dotyczace znieczulenia przeksztalca sie na probity i oblicza sie ED50 metoda analizy regresyjnej danych daw¬ ka — reakcja na bodziec. Kazda krzywa zaleznosci dawki od reakcji na bodziec musi zawierac co najmniej cztery punkty, a kazdy punkt okresla sie na podstawie danych uzyskanych z co naj¬ mniej 10 myszy traktowanych badanym zwiazkiem i myszy kontrolnych.Tablica 1 Dzialanie znieczulajace, próba goracej plyty Zwiazek z przykladu I II A II B II C II D II E II F Ed50, mg/kg 1,2 • 10-7 0,003 0,0049 0,003 0,0003 0,0018 0,0019 Ponadto, zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku wykazuja niska sklonnosc do fizycznego popadania w uzaleznienie. Wykazano to w próbie aktywnosci ruchowej myszy. Ustalono wysoka ko¬ relacje pomiedzy stopniem fizycznego popadania w uzaleznienie od podanego zwiazku a jego zdol¬ noscia do wywolywania aktywnosci ruchowej my¬ szy, patrz Coldstein i inni, The Journal of Phar- macoiogy and Experimental Therapeutica 169, 175—184 (1969); Rethy i inni, The Journal of Phar- macologdy and Experimental Therapeutica 176, 472—479 (1971); i Brase i inni, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 201 (2), 36&—374 (1977).Aktywnosc ruchowa myszy mierzy sie, stosujac klatki cylindryczne z siatki drucianej, o wysokos¬ ci 5,08 cm i srednicy 27,94 cm. Szesc klatek umieszcza sie w wentylowanej dzwiekoszczelnej komorze o jednolitym oswietleniu. Przez srodek klatki przechodzi wiazka swiatla do komórki lo- toelektrycznej na przeciwleglym krancu. W kaz¬ dej klatce umieszcza sie dwie myszy na okres jed¬ nej godziny aby przyzwyczaic je do otoczenia. Na¬ stepnie pieciu parom myszy wstrzykuje sie pod¬ skórnie ustalona wczesniej dawke badanego zwiazku, a pozostale pary otrzymuja solankowy nosnik, wolny od badanego zwiazku. Myszy131 155 17 18 umieszcza sie ponownie w ich odpowiednich klat¬ kach na okres trzech godzin. Rejestruje: sie licz¬ be zliczen w ciagu kazdego 15-minutowego okre¬ su jak równiez calkowita liczbe zliczen w ciagu 3 godzin. Kazda przerwa wiazki swiatla stanowi jedno zliczenie.¦• Zwiazek znany Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogól¬ nym wzorze przedstawionym na rysunku, w któ¬ rym R oznacza atom wodoru lub grupe metylo¬ wa, A oznacza D-Ala, R1 oznacza pierwszorzedowa grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla lub grupe cyklopropylometylowa, X oznacza atom bromu, jo¬ du lub chloru lub grupe metylowa, a Z oznacza .grupe o wzorze -C(0)NH2, ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych, nietoksycznych soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, * ze odszczepia sie grupy blokujace z odpowiednio chro¬ nionego zwiazku o wzorze przedstawionym na ry¬ sunku, stosujac srodek odszczepiajacy, taki jak kwas, korzystnie kwas mrówkowy, kwas trójflu- orooctowy, kwas p-toluenosulfónowy, kwas benze- nosulfonowy, kwas naftalenosulfonowy, kwas me- tanosulfonowy lub lodowaty kwas octowy w obec¬ nosci gazowego HC1, z uzyciem akceptora jonu karboniowego, korzystnie anizolu, tioanizolu lub trójetylosilanu, w temperaturze od okolo —10°C do okolo 30°C. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- rosylo-D-alanyloglicylo-L-(N-cyklopropylometylo)- -m^bromofenyloalaniny poddaje sie reakcji amid ^^-III-rzed.Hbutoksykarbonylo-iNA-metylo-L-tyro- solOnD-alanylo-glicylo-L^(N a-cyMopropylometylo)- -m-bromofenyloalaniny z kwasem trójfluoroocto¬ wym. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- Tosylo-D-alanylo^glicylo-L-(N-etylo)-m-bromofeny- loalaniny poddaje sie reakcji amid N«-III-rzed.-bu- Ponizsza tablica 2 odzwierciedla srednia calko¬ witej ilosci zliczen dla kazdej grupy 10 badanych myszy przy zastosowaniu okreslonego poziomu dawki badanego zwiazku. Oczywiste jest, ze w po¬ równaniu ze zwiazkami znanymi, zwiazki o wzo¬ rze przedstawionym na rysunku wykazuja znacz¬ ne zmniejszenie aktywnosci ruchowej. toksykarbonylOHNA-metylo-L-tyrosylo-D-alanylo- ^glicylo-L^N^-ety^-m-bromofenyloalaniny z kwa¬ sem trójfluorooctowym. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 35 w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- -alanylo-glicylo-L-(N-etylo)^m^bromofenyloalaniny poddaje sie reakcji amid tNa-III-rzed.-butoksykar- bonylo-L-tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L- -m-bromofenyloalaniny z kwasem trójfluoroocto- 40 wym. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- rosylo-D-alanylo^glicylo-L-(N-metylo)-m-metylofe- nyloalaniny, poddaje sie reakcji amid Na-III-rzed.- 45 -Lutoksykarboinylo-Na-metyl-p-LTtyrosylo-D-alany- lo-glicylo^L-i(Na-metylo)-ni-metylo!fenyloalaniny z kwasem trójfluorooctowym. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- 50 -alanylo-glicylo-L-(N-et3rlo)-m-chlorofenyloalaniny poddaje sie reafecji /amid iNa-III-rzed.Hbutoksykar- bonylo-L-tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L-(Na-etylo)- -4n-chlorofenyloalaniny z kwasem trójfluoroocto¬ wym. 55 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N^metylo)ty- rosylo-D-alanylo-glicylo-L-(N-etylo)-m-chlorofeny- loalaniny, poddaje sie reakcji amid N4-III-rzed.-bu- toksykarbonylo-N^-metylo-L-tyrosylo-D-alanylo- 60 -glicylo-L-(N4-etylo)-m-cMoro!fenyloalaniny z kwa¬ sem trójfluorooctowym. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- -alanylo-glicylo-L-(N-etylo)-m-jodofenyloalaniriy, poddaje sie reakcji amid NA^HI-rzed.-ibutoksykarbo- 65 nylo-L-tyrosylcHD-alanylo-glicylo-L^NA-etylo)-N- Tablica 2 R-Tyr-D-Ala-Gly-CN-R^RsJPhe-NHjj Znaczenie podstawników R H Me H Me Me H Me H Me Ri Et Et Et Et Cpm Et Et Et Et R2 m-Cl m-Cl m-Br m-Br m-Br m-I m-Me H* p-F* 4 ' 125 148 — 142 171 178 173 704 431 8 613 304 200 235 140 174 255 1204 1425 Dawka, 16 819 796 512 358 276 363 537 2916 2415 mg/kg 32 2388 1978 1092 701 320 852 , 1176 3528 2033 64 3667 4477 2820 2523 1888 1630 3231 — — 128 2807 3476 — 5153 2159 2871 3852 — —19 131 155 1% -jodofenyloalaniny z kwasem trójfluorooctowym. 9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- -alanylo-glicylo-L-(N^yklopropylometylo)-m-jodo¬ fenyloalaniny, poddaje sie reakcji amid N^-III- rzed.-butoksykarbonylo-L-tyrosylo-D-alanylo-glicy- lo-L-CNfl^y^klopropylometyloJnm-jodofenyloalainiiny z kwasem trójfluorooctowym. 10. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- rosylo-D-alanylo-glicylo-L^(N-cyklopropylometylo)- -m-jodofenyloalaniny, poddaje sie reakcji amid Nd-III-rzed.jbutoksykarbonylo-N*-metylo-L-tyro- sylo-D-alanylo-glicylo-L-(N^-cyklopropylometylo)- -m-jodofenyloalaniny z kwasem trójfluorooctowym.R-Tyr-A-Gly-N-CH-Z CH2 Wzór131 155 B0C-D-(AA)20H + H-Gly-OBzl I DCC I HBT BOC-D-(AA)2-Gly-OBzl H2 Pd/C B0C-D-(AA)2-Gly-0H RrL-Phe(X)-Z DCC | HBT B0C-D-(AA)2Gly-L- CRi) Phe(X)-Z | TFA BOC-L-Tyr-OH H-D-(AA)2-Gly-L-(R,) Phe(X)-Z fc »' IBCF NMM B0C-L-Typ-D-(AA)2-Gly-L-(Ri)PhQ(X)-Z DTFA 2/DEAE Sephadex A-25 ( w postaci OclanuJ AcOH-H-L-Tyr-D-(AA)2-GlrL-(R,)PhG(X)-Z Schemat 1 K H BOC-N-(AA)-COOH K + — - BOC-N-(AA)-COO"K eter 18-kesonowy-6 THF DMF halogenek cyklopropylomeiylu lub alkilu to jest bromek lub jodek (RaX) R a B0C-N-(AA)-C00H Schemat 2 PL PL

Claims (10)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogól¬ nym wzorze przedstawionym na rysunku, w któ¬ rym R oznacza atom wodoru lub grupe metylo¬ wa, A oznacza D-Ala, R1 oznacza pierwszorzedowa grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla lub grupe cyklopropylometylowa, X oznacza atom bromu, jo¬ du lub chloru lub grupe metylowa, a Z oznacza .grupe o wzorze -C(0)NH2, ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych, nietoksycznych soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, * ze odszczepia sie grupy blokujace z odpowiednio chro¬ nionego zwiazku o wzorze przedstawionym na ry¬ sunku, stosujac srodek odszczepiajacy, taki jak kwas, korzystnie kwas mrówkowy, kwas trójflu- orooctowy, kwas p-toluenosulfónowy, kwas benze- nosulfonowy, kwas naftalenosulfonowy, kwas me- tanosulfonowy lub lodowaty kwas octowy w obec¬ nosci gazowego HC1, z uzyciem akceptora jonu karboniowego, korzystnie anizolu, tioanizolu lub trójetylosilanu, w temperaturze od okolo —10°C do okolo 30°C.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- rosylo-D-alanyloglicylo-L-(N-cyklopropylometylo)- -m^bromofenyloalaniny poddaje sie reakcji amid ^^-III-rzed.Hbutoksykarbonylo-iNA-metylo-L-tyro- solOnD-alanylo-glicylo-L^(N a-cyMopropylometylo)- -m-bromofenyloalaniny z kwasem trójfluoroocto¬ wym.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- Tosylo-D-alanylo^glicylo-L-(N-etylo)-m-bromofeny- loalaniny poddaje sie reakcji amid N«-III-rzed.-bu- Ponizsza tablica 2 odzwierciedla srednia calko¬ witej ilosci zliczen dla kazdej grupy 10 badanych myszy przy zastosowaniu okreslonego poziomu dawki badanego zwiazku. Oczywiste jest, ze w po¬ równaniu ze zwiazkami znanymi, zwiazki o wzo¬ rze przedstawionym na rysunku wykazuja znacz¬ ne zmniejszenie aktywnosci ruchowej. toksykarbonylOHNA-metylo-L-tyrosylo-D-alanylo- ^glicylo-L^N^-ety^-m-bromofenyloalaniny z kwa¬ sem trójfluorooctowym.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 35 w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- -alanylo-glicylo-L-(N-etylo)^m^bromofenyloalaniny poddaje sie reakcji amid tNa-III-rzed.-butoksykar- bonylo-L-tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L- -m-bromofenyloalaniny z kwasem trójfluoroocto- 40 wym.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- rosylo-D-alanylo^glicylo-L-(N-metylo)-m-metylofe- nyloalaniny, poddaje sie reakcji amid Na-III-rzed.- 45 -Lutoksykarboinylo-Na-metyl-p-LTtyrosylo-D-alany- lo-glicylo^L-i(Na-metylo)-ni-metylo!fenyloalaniny z kwasem trójfluorooctowym.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- 50 -alanylo-glicylo-L-(N-et3rlo)-m-chlorofenyloalaniny poddaje sie reafecji /amid iNa-III-rzed.Hbutoksykar- bonylo-L-tyrosylo-D-alanylo-glicylo-L-(Na-etylo)- -4n-chlorofenyloalaniny z kwasem trójfluoroocto¬ wym. 55

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N^metylo)ty- rosylo-D-alanylo-glicylo-L-(N-etylo)-m-chlorofeny- loalaniny, poddaje sie reakcji amid N4-III-rzed.-bu- toksykarbonylo-N^-metylo-L-tyrosylo-D-alanylo- 60 -glicylo-L-(N4-etylo)-m-cMoro!fenyloalaniny z kwa¬ sem trójfluorooctowym.

8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- -alanylo-glicylo-L-(N-etylo)-m-jodofenyloalaniriy, poddaje sie reakcji amid NA^HI-rzed.-ibutoksykarbo- 65 nylo-L-tyrosylcHD-alanylo-glicylo-L^NA-etylo)-N- Tablica 2 R-Tyr-D-Ala-Gly-CN-R^RsJPhe-NHjj Znaczenie podstawników R H Me H Me Me H Me H Me Ri Et Et Et Et Cpm Et Et Et Et R2 m-Cl m-Cl m-Br m-Br m-Br m-I m-Me H* p-F* 4 ' 125 148 — 142 171 178 173 704 431 8 613 304 200 235 140 174 255 1204 1425 Dawka, 16 819 796 512 358 276 363 537 2916 2415 mg/kg 32 2388 1978 1092 701 320 852 , 1176 3528 2033 64 3667 4477 2820 2523 1888 1630 3231 — — 128 2807 3476 — 5153 2159 2871 3852 — —19 131 155 1% -jodofenyloalaniny z kwasem trójfluorooctowym.

9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-tyrosylo-D- -alanylo-glicylo-L-(N^yklopropylometylo)-m-jodo¬ fenyloalaniny, poddaje sie reakcji amid N^-III- rzed.-butoksykarbonylo-L-tyrosylo-D-alanylo-glicy- lo-L-CNfl^y^klopropylometyloJnm-jodofenyloalainiiny z kwasem trójfluorooctowym.

10. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania amidu L-(N-metylo)ty- rosylo-D-alanylo-glicylo-L^(N-cyklopropylometylo)- -m-jodofenyloalaniny, poddaje sie reakcji amid Nd-III-rzed.jbutoksykarbonylo-N*-metylo-L-tyro- sylo-D-alanylo-glicylo-L-(N^-cyklopropylometylo)- -m-jodofenyloalaniny z kwasem trójfluorooctowym. R-Tyr-A-Gly-N-CH-Z CH2 Wzór131 155 B0C-D-(AA)20H + H-Gly-OBzl I DCC I HBT BOC-D-(AA)2-Gly-OBzl H2 Pd/C B0C-D-(AA)2-Gly-0H RrL-Phe(X)-Z DCC | HBT B0C-D-(AA)2Gly-L- CRi) Phe(X)-Z | TFA BOC-L-Tyr-OH H-D-(AA)2-Gly-L-(R,) Phe(X)-Z fc »' IBCF NMM B0C-L-Typ-D-(AA)2-Gly-L-(Ri)PhQ(X)-Z DTFA 2/DEAE Sephadex A-25 ( w postaci OclanuJ AcOH-H-L-Tyr-D-(AA)2-GlrL-(R,)PhG(X)-Z Schemat 1 K H BOC-N-(AA)-COOH K + — - BOC-N-(AA)-COO"K eter 18-kesonowy-6 THF DMF halogenek cyklopropylomeiylu lub alkilu to jest bromek lub jodek (RaX) R a B0C-N-(AA)-C00H Schemat 2 PL PL