MX2014008365A

MX2014008365A - Mejora del transporte de moleculas terapeuticas a traves de la barrera hematoencefalica.

Info

Publication number: MX2014008365A
Application number: MX2014008365A
Authority: MX
Inventors: Graham K Farrington; William Sisk
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2014-10-06
Also published as: ZA201404873B; PL2802606T3; AU2013207927B2; ES2677111T3; JP6247226B2; PT2802606T; JP2015509097A; WO2013106577A2; HK1203977A1; AU2013207927A1; BR112014016887A2; TR201809743T4; DK2802606T3; LT2802606T; US20150210762A1; WO2013106577A3; MX350378B; HUE039033T2; CA2860579A1; SI2802606T1

Abstract

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que una versión dimérica de un anticuerpo de transmigración de la BBB (por ejemplo, el anticuerpo de unión TMEM30A (CDC-50A), FC5) mejora notablemente el transporte a través de la BBB en comparación con FCS VHH monovalente. La invención proporciona, entre otras cosas, moléculas que aumentan el transporte de agentes farmacológicamente activos a través de la barrera hematoencefálica y métodos de tratamiento de trastornos o enfermedades que tienen un componente neurológico.

Description

MEJORA DEL TRANSPORTE DE MOLECULAS TERAPEUTICAS A TRAVES DE LA BARRERA HEMATOENCEFALICA ANTECEDENTES DE LA INVENCION La distribución de macromoléculas en el cuerpo está generalmente mediada por difusión, por lo que las macromoléculas en la sangre se difunden en los tejidos a través del revestimiento de células endoteliales muy fenestrado de la vasculatura capilar. No existe libre difusión de macromoléculas en el cerebro muy vascularizado . Las células endoteliales de los capilares cerebrales no presentan las fenestraciones que se observan en el resto del sistema circulatorio y tienen uniones intracelulares estrechas y muy especializadas de células endoteliales. Estas uniones estrechas evitan la difusión libre de moléculas de más de 400 kDa desde el lumen de los capilares y hacia su exterior. Además, los capilares contienen diversos sistemas de transporte tales como los sistemas de transportadores de aniones orgánicos (OATS, por sus siglas en inglés) y los sistemas de resistencia multifármaco (MDR, por sus siglas en inglés) que establecen en forma activa gradientes de transporte de moléculas que, de otra manera, podría difundirse a través de las células endoteliales. La combinación de las barreras restrictivas evita la entrada de agentes imprevistos que incluyen toxinas y virus, por Ref. 249499 ejemplo, y limita la difusión de entidades terapéuticas. Además, estas barreras hematoencefálicas (BBB, por sus siglas en inglés) bloquean en forma eficaz la administración pasiva de proteínas, péptidos y moléculas pequeñas potencialmente terapéuticos a la parénquima cerebral en dosis farmacológicamente terapéuticas.

Una estrategia exitosa para lograr el transporte de moléculas terapéuticas a través de las células endoteliales de la BBB ha sido beneficiarse de la trancitosis mediada por receptores (RMT, por sus siglas en inglés) . Esta estrategia emplea anticuerpos o moléculas que se unen específicamente a proteínas en las células endoteliales de la BBB usualmente involucradas en el transporte de moléculas a través de las células endoteliales de la BBB. Tales anticuerpos son empleados como moléculas de transporte para administrar cargas útiles adjuntas mientras que ocurre trancitosis en las células endoteliales de la BBB. Los ejemplos de las aplicaciones de esta tecnología incluyen el uso de anticuerpos para el receptor de transferrina y los receptores de insulina (Yu et ál . 2011. Science Translational Medicine. Tomo 3). En ambos casos, los anticuerpos de RMT se fusionaron en el C-terminal a dominios proteicos terapéuticos y han demostrado transportar moléculas a través de la BBB. Desafortunadamente, los receptores de insulina y transferrina diana de RMT que se emplean normalmente se expresan en gran cantidad y amplitud en muchos tejidos. Esta amplia expresión diana tiene como consecuencia una semivida de circulación breve que, a su vez, limita el tiempo de exposición a las células endoteliales de la BBB y con ello dosifica la molécula en el cerebro. Además, estos anticuerpos toman funciones celulares críticas para el metabolismo como objetivo, por lo que generan un cierto riesgo potencial de seguridad.

Los restos diana mejorados que emplean las moléculas de transporte de la BBB para cruzar la barrera, por ejemplo, sitios de unión derivados de moléculas de anticuerpos que transmigran a través de la BBB serían muy beneficiosos para la administración de compuestos terapéuticos al cerebro.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que una proteína de fusión que comprende un anticuerpo de transmigración de barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) , por ejemplo, un anticuerpo de unión TMEM30A (CDC-50A) (tal como, por ejemplo, el anticuerpo de dominio simple FC5) aumenta en gran medida el transporte a través de la BBB en comparación con VHH monovalente. Los experimentos iniciales de transporte endotelial en la BBB y de unión demostraron que FC5 , un anticuerpo de dominio simple VHH de llama (sdAb, por sus siglas en inglés) , podría facilitar el transporte a través de una capa de células endoteliales de la BBB (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 7 943 129) . Es sabido que la semivida de circulación de un VHH es corta debida al bajo peso molecular y la falta de un dominio Fe (Jain, M. , Kamal, N. y Batra, S. K. (2007) Trends in biotechnology 25(7), 307-316; Batra, S. K. , Jain, M . , Wittel, U. A., Chauhan, S. C. y Colcher, D. (2002) Current opinión in biotechnology 13(6), 603-608) Sorprendentemente, la semivida de circulación de esta construcción mejoró notoriamente con la fusión de un anticuerpo de dominio simple de transmigración de la BBB al N-terminal de un Fe humano, lo que resultó en una construcción similar a un anticuerpo divalente. La incorporación de tal sitio de unión en una construcción Fe genera una molécula divalente con el potencial de unión divalente de cada resto de unión unido a la diana putativa, por ejemplo, TMEM30A, expresado en la superficie celular. La unión divalente puede ocasionar un cambio significativo en la afinidad de unión aparente debido a un efecto de avidez (Reynolds, J. A. (1979) Biochemistry 18(2), 264-269; Hubble, J. (1999) Molecular immunology 36(1), 13-18). Tal como se demostró en la presente, la afinidad de la interacción aumentó. Dado este aumento de afinidad, el hallazgo de que la adición de Fe para formar una molécula divalente aumenta significativamente el transporte a través de la BBB fue inesperado. No se esperaba un aumento del transporte debido a que, aunque la adición de un dominio Fe puede extender la farmacocinética de fase beta debido a un aumento de masa que impide el filtrado de las moléculas en los ríñones y la promoción del reciclaje in vivo de anticuerpos a través de la unión a FcRn, el aumento de afinidad aparente también podría tener el efecto opuesto debido a la eliminación de las moléculas de unión circulantes al unirse a una diana muy expresada. Sin embargo, lo más sorprendente, tal como se demostró en la presente, es que se observó que las proteínas de fusión en la conformación del sitio de unión Fe (del extremo amino al carboxilo, es decir, el sitio de unión fusionado al N-terminal de Fe) presentaban mayor actividad que aquellas en la conformación del sitio de unión Fe (sitio de unión fusionado al C-terminal de Fe) . Esto no perdió validez a pesar de que las proteínas de fusión del sitio de unión Fe (sitio de unión fusionado al C-terminal de Fe) exhibieron mayor unión a células endoteliales en experimentos iniciales realizados in vitro. También se proporcionan versiones monovalentes de las construcciones de sitio de unión Fe .

Por consiguiente, en un aspecto la invención hace referencia a una molécula de unión que comprende al menos un agente farmacológicamente activo y al menos un sitio de unión, por ejemplo, un sitio de unión de transmigración de la BBB, que se une a TMEM30A en el que al menos un sitio de unión que se une a TMEM30A se fusiona i) directamente o ii) a través de una secuencia de aminoácidos interviniente al N-terminal de un resto Fe.

En una modalidad, la molécula de unión comprende al menos dos sitios de unión.

En una modalidad, el al menos un sitio de unión comprende la secuencia de aminoácidos FC5. En una modalidad, la molécula de unión comprende al menos dos o al menos tres (por ejemplo, dos o tres) sitios de unión que se unen a TMEM30A. En una modalidad, la molécula de unión comprende al menos tres o al menos cuatro (por ejemplo, tres o cuatro) sitios de unión que se unen a TMEM30A.

En una modalidad, el al menos un sitio de transmigración de la BBB (por ejemplo, sitio de unión derivado de moléculas de anticuerpo que transmigran a través de la BBB) se fusiona genéticamente en forma directa al resto Fe.

En una modalidad, el al menos un sitio de transmigración de la BBB (por ejemplo, sitio de unión derivado de moléculas de anticuerpo que transmigran a través de la BBB) se fusiona genéticamente al resto Fe a través de una secuencia de aminoácidos interviniente que comprende un enlazador peptídico.

En una modalidad, el al menos un sitio de transmigración de la BBB (por ejemplo, sitio de unión derivado de moléculas de anticuerpo que transmigran a través de la BBB) se fusiona genéticamente al resto Fe a través de una secuencia de aminoácidos interviniente que consta de un enlazador peptídico.

En una modalidad, se fusionan dos sitios de transmigración de la BBB (por ejemplo, sitios de unión derivados de moléculas de anticuerpo que transmigran a través de la BBB) al N-terminal de dos restos Fe diferentes de una región Fe completa a través de una secuencia de aminoácidos que comprende un enlazador peptídico.

En una modalidad, el al menos un sitio de transmigración de la BBB (por ejemplo, sitio de unión derivado de moléculas de anticuerpo que transmigran a través de la BBB) se fusiona al N-terminal de una molécula scFc.

En una modalidad, el al menos un agente farmacológicamente activo se fusiona al C-terminal de la región Fe .

En una modalidad, el al menos un agente farmacológicamente activo es una entidad química pequeña.

En una modalidad, la entidad química pequeña se fusiona a la molécula de unión en un residuo de cisteína. En una modalidad, el residuo de cisteína es un residuo de cisteína modificado.

En una modalidad, el al menos un agente farmacológicamente activo es un polipéptido.

En una modalidad, el al menos un agente farmacológicamente activo comprende un sitio de unión al antígeno (por ejemplo, un sitio de unión al antígeno derivado de un anticuerpo que no transmigra la BBB) .

En una modalidad, el agente farmacológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en una molécula scFv, una molécula Fab y un anticuerpo de domino simple.

En una modalidad, el al menos un agente farmacológicamente activo se encuentra genéticamente fusionado a la molécula de unión.

En una modalidad, el al menos un agente farmacológicamente activo se encuentra covalentemente enlazado a la molécula de unión.

En una modalidad, el sitio de transmigración de la BBB se encuentra genéticamente fusionado a través de una secuencia de aminoácidos interviniente que comprende el dominio VH de una molécula de anticuerpo.

En una modalidad, el sitio de transmigración de la BBB se encuentra genéticamente fusionado a través de una secuencia de aminoácidos interviniente que comprende el dominio VL de una molécula de anticuerpo.

En una modalidad, al menos un sitio de transmigración de la BBB se encuentra genéticamente fusionado al N-terminal de un dominio VH de una molécula de anticuerpo intacta .

En una modalidad, al menos un sitio de transmigración de la BBB se encuentra genéticamente fusionado al N-terminal de un dominio VL de una molécula de anticuerpo intacta.

En una modalidad, dos sitios de transmigración de la BBB se encuentran genéticamente fusionados al N-terminal de un dominio VH y un dominio VL de una molécula de anticuerpo intacta.

En una modalidad, la secuencia de aminoácidos interviniente comprende adicionalmente un enlazador peptídico .

En una modalidad, el agente farmacéuticamente activo se selecciona del grupo que consiste en: un péptido neuroactivo, una entidad química pequeña y una región variable de un anticuerpo que se une a una diana en el sistema nervioso central.

En una modalidad, la invención hace referencia a un método para tratar un trastorno neurológico que comprende administrar la molécula de unión de la invención a un sujeto.

En una modalidad, el trastorno neurológico es un trastorno de almacenamiento. En una modalidad, el trastorno neurológico es dolor crónico. En una modalidad, el trastorno neurológico es epilepsia. En una modalidad, el trastorno neurológico es esclerosis múltiple. En una modalidad, el trastorno neurológico es la enfermedad proteinopatía . En una modalidad, el trastorno es un trastorno de desmielinizacion.

En otra modalidad, la invención hace referencia al uso de una molécula de unión de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras la-lg ilustran representaciones diagramáticas del anticuerpo de dominio pesado simple FC5 (fig. la) solo, (fig. Ib) fusionado ya sea al N-terminal (FC5-Fc) o (fig. le) al C-terminal (Fc-FC5) de un dominio Fe IgGl agly humano, así como posibles construcciones de tipo anticuerpo que incorporan un dominio que no transmigra la BBB como un resto farmacéuticamente activo (figs. Id, le) . Las moléculas (fig. lf y fig. lg) ilustran la adición de un anticuerpo de dominio pesado simple FC5 a una molécula de anticuerpo completo. El anticuerpo de dominio pesado simple puede fusionarse, por e emplo, al dominio VL o VH, o a ambos.

Figuras 2a-2c. Se ilustra la electroforesis de 2.5 ug de cada proteína purificada en Bis-Tris SDS PAGE 4-12 %. Se marcan estándares de peso molecular SDS PAGE de 10-220 kD en cada gel . En la fig. 2a se observan carriles sin reducción (1) y con reducción (2) de FC5. En la fig. 2b, carril sin reducción (1) y con reducción (2) de FC5-Fc. En en la fig. 2c, carriles sin reducción (1) y con reducción (2) de Fc-FC5.

Figura 3. Ilustra el aumento de velocidad de transporte de FC5Fc, FcFC5 y FC5 a través de la línea de células endoteliales transformadas de la BBB de ratas SV40 in vitro en comparación con los anticuerpos de control 12F6A (hlgGl) , CRL2434 (mlgGl) y C37H (sólo VHH) · Figuras 4a-4c. En la fig. 4a se ilustra la unión de FC5-Fc (o) , Fc-FC5 (¦) o un VHH camélido de control sin importancia fusionado a los extremos N de un dominio huFc agly (VHH -FC) (?) a una línea de células endoteliales transformadas de la BBB de ratas SV40. En la fig. 4b se muestra la unión de FC5-Fc (o) y Fc-FC5 (¦) a una línea de células endoteliales de la BBB principal de ratas. En la fig. 4c se muestra la unión de FC5-Fc a TMEM30A (?) de ratas o (0) humano, y de Fc-FC5 a TMEM30A (?) de ratas o (·) humano expresado transitoriamente en células EBNA293.

Figuras 5a-5c. En la fig. 5a se muestra la capacidad de FC5 de unirse en forma cruzada covalentemente a Dalargin (FC5-Dal) para eliminar el dolor en el modelo animal de Hargreaves . La velocidad de retiro de la pata se expresa como porcentaje de efecto posible máximo (%MPE) en base a un período de tiempo de 20 segundos. El control negativo muestra la velocidad de retiro de pata de la pata de control contralateral no inflamada (·) y el control positivo muestra la rápida velocidad de retiro de pata de la pata inflamada cuando se inyecta PBS sola a la rata por vía intravenosa (o) . Se compara la eficacia de una única dosis IV (¦) de FC5-Dal a 21 mg/Kg (mpk) con tres dosis IV de FC5-Dal a 7 mpk (?) para reducir la velocidad de retiro de la pata en los animales Hargreaves. En la fig. 5b se muestra el área promedio bajo la curva de respuesta de %MPE en función de tiempo para cada pata evaluada. En la fig. 5c se muestran experimentos de control negativo adicionales en los que se inyectan 7 mpk ya sea de VHH_Dal irrelevante (cuadrados grises) o de FC5 solo (cuadrados sin relleno) por vía intravenosa a ratas tres dosis en el momento 0, 1 hora y 2 horas después. También se ilustra la pata de control contralateral (círculos con relleno) . Se determinó el %MPE de reducción de retiro de la pata en los animales Hargreaves .

Figuras 6a-6d. Se evaluó la eficacia de Fc-FC5-Dal en el modelo de Hargreaves. Se administraron dosis IV de 2 mpk a las ratas en el momento 0 en la figura 6a y en el momento 0 y 2 horas después en la figura 6B . En las figuras 6c y 6d cada rata recibió dosis IV de 6.5 mpk en el momento 0.

Figuras 7a-7d. Se comparó la eficiencia de FC5-Fc-Dal en el modelo de Hargreaves con un control negativo de Fc-Dal. En el momento 0, las ratas recibieron dosis IV de una única concentración de FC5 -Fc-Dal o Fc-Dal a 0.5, 2.5 o 6.0 mpk. Los datos se presentan en las figuras 7a y 7b como porcentaje de efecto máximo posible (MPE) en el momento dado o en las figuras 7c y 7d como porcentaje de área bajo la curva.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se observó que una proteína de fusión que comprende al menos un anticuerpo de dominio simple de transmigración de la BBB, por ejemplo, que se une a TMEM30A (CDC-50A) (tal como un dominio simple FC5) , aumentó significativamente el transporte a través de la BBB en comparación con VHH monovalente. En particular, la conformación de sitio de unión Fe (de extremo amino a C-terminalarboxilo) exhibió actividad mejorada. Con base, al menos en parte, en el transporte significativamente mejorado, se describen en la presente moléculas con transporte mejorado a través de la barrera hematoencefálica, métodos para aumentar el transporte a través de la barrera hematoencefálica y métodos de tratamiento para emplear tales moléculas.

Antes de proceder con descripciones adicionales de la invención, se describen ciertos términos a continuación con fines de conveniencia: I. Definiciones Tal como se usa en la presente, los términos «proteína» o «polipéptido» se refieren a un polímero de dos o más de los aminoácidos naturales o aminoácidos no naturales.

El término «aminoácido» incluye alanina (Ala o A) , arginina (Arg o R) , asparagina (Asn o N) , ácido aspártico (Asp o D) , cisteína (Cys o C) , glutamina (Gln o Q) , ácido glutámico (Glu o E) , glicina (Gly o G) , histidina (His o H) ; isoleucina (lie o I) , leucina (Leu o L) , lisina (Lys o K) , metionina (Met o M) , fenilalanina (Phe o F) , prolina (Pro o P) , serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) , triptófano (Trp o W) , tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V) . Los aminoácidos no tradicionales se encuentran también dentro del alcance de la invención e incluyen norleucina, omitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos aminoácidos, tales como los descritos en Ellman et ál . Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) . Para generar los residuos aminoácidos de origen no natural, se pueden utilizar los procedimientos de Noren et ál., Science 244:182 (1989) y Ellman et ál . , supra. En resumen, estos procedimientos implican la activación química de un ARNt supresor con un residuo aminoácido de origen no natural, seguido de transcripción y traducción del AR in vitro. También se puede lograr la introducción del aminoácido no tradicional mediante químicas peptídicas conocidas en la técnica. Tal como se usa en la presente, la expresión «aminoácido polar» incluye aminoácidos que tienen carga neta cero, pero que tienen cargas parciales distintas a cero en diferentes partes de sus cadenas laterales (por ejemplo, M, F, W, S, Y, N, Q, C) . Estos aminoácidos pueden participar en interacciones hidrofóbicas e interacciones electrostáticas. Tal como se usa en la presente, la expresión «aminoácido cargado» incluye aminoácidos que pueden tener carga neta distinta de cero en sus cadenas laterales (por ejemplo, R, K, H, E, D) . Estos aminoácidos pueden participar en interacciones hidrofóbicas e interacciones electrostáticas.

Tal como se usa en la presente, la expresión «péptido enlazador» hace referencia a secuencias de aminoácidos que conectan o enlazan dos secuencias de polipéptidos, por ejemplo, que enlazan dos dominios polipeptídicos , en las que las secuencias de aminoácidos no conectan o enlazan naturalmente los dos dominios polipeptídicos en la naturaleza. En una modalidad, un péptido enlazador es sintético. Tal como se usa en la presente, el término «sintético» se refiere a secuencias de aminoácidos de origen no natural .

Los péptidos enlazadores de la invención conectan dos secuencias de aminoácidos mediante enlaces peptídicos. En una modalidad, un péptido enlazador conecta un resto de transmigración de la BBB a un segundo resto, por ejemplo, un resto de región o dominio Fe. En una modalidad, un péptido enlazador de la invención conecta un resto farmacológicamente activo a un segundo resto en una secuencia lineal, por ejemplo, un segundo resto que es un resto de transmigración de la BBB o un resto de región o dominio Fe . En otra modalidad, un péptido enlazador conecta dos restos farmacológicamente activos. En una modalidad, un péptido enlazador conecta o fusiona genéticamente uno o más restos de dominio o región Fe a un resto no Fe .

En el contexto de los polipéptidos , una «secuencia lineal» o una «secuencia» es el orden de aminoácidos en un polipéptido en dirección de amino a carboxilo terminal en la que los residuos que se encuentran unos junto a otros en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido .

Tal como se usan en la presente, los términos «enlazado», «fusionado» o «fusión» se utilizan en forma intercambiable. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes adicionales por cualquier medio, lo que incluye la conjugación química o medios recombinantes . Tal como se usa en la presente, las expresiones «fusionado en forma covalente» o «acoplado en forma covalente» significan que los restos especificados se encuentran enlazados directamente en forma covalente entre sí o se encuentran unidos uno a otro indirectamente en forma covalente a través de un resto o varios restos intervinientes , tales como restos o péptidos enlazadores. En una modalidad preferida, los restos se fusionan en forma covalente. Un enlace peptídico es un tipo de enlace covalente. Se conocen en la técnica métodos de conjugación química (por ejemplo, mediante agentes de reticulación heterobifuncionales) . Los restos fusionados también pueden encontrarse genéticamente fusionados. Tal como se usa en la presente, las expresiones «fusionado genéticamente», «enlazado genéticamente» o «fusión genética» hacen referencia a la unión o enlace colineal y covalente de dos o más proteínas, polipéptidos o fragmentos de ellos a través de sus estructuras peptídicas individuales, a través de la expresión genética de una única molécula de polinucleótido que codifica aquellas proteínas, polipéptidos o fragmentos. La fusión genética tiene como resultado la expresión de una única secuencia genética contigua. Las fusiones genéticas preferidas se encuentran en el mismo marco, es decir, dos o más marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés) se fusionan para formar un ORF continuo más largo, de manera que mantenga el marco de lectura correcto de los ORF originales. De este modo, la proteína de fusión recombinante resultante es un único polipéptido que contiene dos o más segmentos de proteínas que corresponden a los polipéptidos codificados por los ORF originales (los segmentos normalmente no se unen en la naturaleza) . En este caso, el polipéptido se escinde durante el procesamiento para proporcionar moléculas diméricas que comprenden dos cadenas de polipéptidos.

Los polipéptidos objetivo comprenden al menos un resto farmacológicamente activo. Un resto farmacológicamente activo se refiere a un resto capaz de llevar a cabo una acción o una reacción en un contexto biológico. Por ejemplo, la expresión «resto farmacológicamente activo» hace referencia a moléculas farmacológicamente activas o a partes de ella que se unen a componentes de un sistema biológico (por ejemplo, proteínas en fluidos biológicos o en la superficie de células o en la matriz celular) y cuya unión tiene como resultado un efecto biológico (por ejemplo, tal como se determinó mediante el cambio en el resto activo y/o el componente al que se une (por ejemplo, una escisión del resto activo y/o del componente al que se une, la transmisión de una señal o el aumento o inhibición de una respuesta biológica en una célula o un sujeto) ) . Los restos terapéuticos son restos farmacéuticamente activos preferidos.

Algunos ejemplos de restos farmacológicamente activos pueden comprender, por ejemplo, un fármaco, un fragmento de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo o parte (por ejemplo, F(ab), scFv, un dominio VH o un domino VL) (por ejemplo, para inducir o bloquear una respuesta biológica) , una parte de unión a ligandos de un receptor o una parte de unión a receptores de un ligando, una enzima, etc. En una modalidad, un resto farmacológicamente activo comprende la forma madura de una proteína. En otra modalidad, un resto farmacológicamente activo comprende una parte de una proteína de longitud completa que retiene actividad biológica. Otros ejemplos de restos farmacológicamente activos incluyen aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos terapéuticamente útiles que incluyen, de modo no taxativo, oligonucleótidos , carbohidratos y lípidos. Ejemplos de restos farmacológicamente activos de la presente invención incluyen factores neurotróficos , factores de crecimiento, enzimas, anticuerpos, neurotransmisores, neuromoduladores, antibióticos, agentes antivirales, agentes antifúngicos, agentes de imagenología o detectables, isótopos y agentes quimioterapéuticos , y similares. Los restos farmacológicamente activos de la presente invención también incluyen fármaco, profármacos y precursores que pueden ser activados cuando se administra el agente terapéutico al tejido diana. La expresión «restos farmacológicamente activos» no pretende incluir un resto de transmigración de la BBB. Los agentes farmacéuticamente activos son restos que no transmigran la BBB.

Las moléculas de unión de la invención son proteínas «quiméricas» o «de fusión». Tales proteínas comprenden una primera secuencia de aminoácidos enlazada a una segunda secuencia de aminoácidos a la que no se enlaza normalmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se juntan en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína, pero situadas en un nuevo arreglo en el polipéptido de fusión. Es posible crear una proteína quimérica a través de métodos conocidos en la técnica como mediante síntesis química o mediante la creación y traducción de un polinucleótido en el que se codifican las regiones peptídicas en la relación deseada.

Los polipéptidos de la invención son moléculas de unión, es decir, comprenden dominios de unión o sitios de unión derivados de anticuerpos de transmigración de la BBB. Un anticuerpo de transmigración de la BBB facilita la transmigración de un resto adjunto a él a través de la BBB. En la patente estadounidense 7 943 129 se describen algunos ejemplos de sitios de unión de anticuerpos de transmigración de la BBB. En una modalidad, el anticuerpo de transmigración de la BBB se une a TMEM30A. Tal como se usan en la presente, las expresiones «dominio de unión» o «sitio de unión» hacen referencia a la parte, región o sitio del polipéptido que media la unión específica con una molécula diana (por ejemplo, un sitio de unión a TMEM30A u otro sitio que facilite la transmigración de la BBB) . Los ejemplos de dominios de unión incluyen sitios de unión a antígenos (por ejemplo, un dominio VH y/o VL) o moléculas que comprenden tal sitio de unión (por ejemplo, un anticuerpo o un anticuerpo de dominio simple) .

Los polipéptidos de la invención son monovalentes o multivalentes respecto al resto de transmigración de la BBB, por ejemplo, comprenden al menos 1, 2, 3, 4, 5 o más restos de transmigración de la BBB.

Los restos farmacológicamente activos tal como se describen en la presente también pueden incluir dominios de unión o sitios de unión, por ejemplo, tal como derivan de una molécula de anticuerpo (por ejemplo, un dominio VH y/o VL de un anticuerpo que no transmigra la BBB) , moléculas que comprenden tal sitio de unión (por ejemplo, un anticuerpo o un anticuerpo de dominio simple) , un dominio de unión a receptores de un ligando, un dominio de unión a ligandos de un receptor o un dominio catalítico. Tal como se usa en la presente, la expresión «dominio de unión al ligando» se refiere a un receptor natural (por ejemplo, receptor de superficie celular) o a una región o derivado de él que retiene al menos una capacidad cualitativa de unión al ligando y, preferentemente, la actividad biológica del receptor natural correspondiente. Tal como se usa en la presente, la expresión «dominio de unión al receptor» se refiere a un ligando natural o a una región o derivado de él que retiene al menos una capacidad cualitativa de unión al receptor y, preferentemente, la actividad biológica del ligando natural correspondiente.

En una modalidad, los polipéptidos de la invención son anticuerpos modificados. Tal como se usa en la presente, el término «anticuerpo modificado» incluye formas sintéticas de anticuerpos que se alteran de manera que su origen no sea natural, por ejemplo, anticuerpos que comprenden al menos dos partes de cadena pesada, pero no dos cadenas pesadas completas (tales como anticuerpos o minicuerpos con dominio eliminado) , formas multiespecíficas de anticuerpos (por ejemplo, biespecíficas, triespecíficas , etc) alteradas para unirse a dos o más antígenos diferentes, por ejemplo, a TMEM30A y un sitio de unión diana terapéuticamente relevante, unidos a regiones, dominios, restos Fe o regiones scFc.

Tal como se usa en la presente, la expresión «región Fe» se define como la parte de un polipéptido que corresponde a una región Fe de inmunoglobulina de origen natural, es decir, tal como se forma por asociación dimérica de las dos cadenas pesadas de los respectivos dominios Fe. Una región Fe natural es homodimérica y comprende dos cadenas de polipéptidos . Por el contrario, las expresiones «región Fe genéticamente fusionada» o «región Fe de cadena sencilla» (región scFc) , tal como se usan en la presente, hacen referencia a una región Fe dimérica sintética que comprende dominios Fe (o restos Fe) genéticamente enlazados en una cadena sencilla de polipéptidos (es decir, codificada en una única secuencia genética contigua) tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud estadounidense 20110243966. En una modalidad, cuando se emplea una región scFc, la molécula de unión es monovalente respecto al resto de transmigración de la BBB.

Tal como se usa en la presente, la expresión «dominio Fe» se refiere a la parte de una cadena pesada sencilla de inmunoglobulina que comienza en la región bisagra anterior al sitio de escisión de la papaína (es decir, el residuo 216 en IgG, si se toma como 114 el primer residuo de la región constante de cadena pesada) y termina en el C-terminal del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio Fe completo comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Tal como se usa en la presente, la expresión «región Fe» hace referencia a dominios Fe dimerizados que se asemejan a la región Fe de anticuerpos de origen natural (por ejemplo, ya sean producidos en el formato de cadena de dos polipéptidos o como una región Fe de cadena sencilla) .

Tal como se usan en la presente, las expresiones «parte del dominio Fe» o «resto Fe» incluyen una secuencia de aminoácidos de un dominio Fe o derivada de un dominio Fe. En determinadas modalidades, un resto Fe comprende al menos uno de: un dominio bisagra (por ejemplo, una región bisagra superior, intermedia y/o inferior), un dominio CH2 , un dominio CH3 , un dominio CH4 o una variante, parte o fragmento de ellos. En otras modalidades, un resto Fe comprende un dominio Fe completo (es decir, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3) . En una modalidad, un resto Fe comprende un dominio bisagra (o parte de él) fusionado a un dominio CH3 (o parte de él) . En otra modalidad, un resto Fe comprende un dominio CH2 (o parte de él) fusionado a un dominio CH3 (o parte de él) . En otra modalidad, un resto Fe consiste en un dominio CH3 o una parte de él. En otra modalidad, un resto Fe consiste en un dominio bisagra (o parte de él) y un dominio CH3 (o parte de él) . En otra modalidad, un resto Fe consiste en un dominio CH2 (o parte de él) y un dominio CH3. En otra modalidad, un resto Fe consiste en un dominio bisagra (o parte de él) y un dominio CH2 (o parte de él) . En una modalidad, un resto Fe carece de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, de todo un dominio CH2 o de parte de él) .

En una modalidad, una molécula de unión de la invención comprende una región Fe completa presente ya sea como una cadena de polipéptidos (una molécula scFc) o en forma de tipo salvaje como dos cadenas de polipéptidos.

La unión específica hace referencia a dos moléculas que forman un complejo relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad de moderada a baja. Esto la distingue de la unión no específica, la que normalmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Normalmente, la unión es considerada específica cuando la constante de afinidad KA es mayor que 106 M'1 o más preferentemente, mayor que 108 M"1. Si fuera necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar en forma significativa la unión específica mediante la variación de las condiciones de unión. Las condiciones de unión adecuadas, tales como la concentración de las moléculas, la fuerza iónica de la solución, la temperatura, el tiempo permitido para la unión, la concentración de un agente de bloqueo (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de la leche), etc. pueden ser optimizados por un experto en la técnica mediante técnicas de rutina.

En una modalidad, un resto Fe de la invención comprende al menos la parte de una molécula de Fe que en la técnica es reconocida como necesaria para la unión FcRn, al que se hace referencia en la presente como compañero de unión del receptor neonatal (FcRn) . Un compañero de unión de FcRn es cualquier molécula o parte de ella que puede unirse específicamente al receptor FcRn con el consiguiente transporte activo del compañero de unión FcRn por parte del receptor FcRn.

Los compañeros de unión de FcRn de la presente invención abarcan moléculas que pueden unirse de manera específica al receptor FcRn y que incluyen IgG entera, el fragmento Fe de IgG y otros fragmentos que incluyen la región de unión completa del receptor FcRn. En otra modalidad, se modifica un resto de región o domino Fe de una molécula de unión de la invención de forma que exhiba unión reducida o mínima a FcRn, o que no exhiba unión a FcRn. Se describió la región de la parte Fe de la IgG que se une al receptor de FcRn en función de la cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). La principal área de contacto de Fe con FcRn se encuentra cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Todos los contactos Fc-FcRn se encuentran en una única cadena pesada de Ig. Los compañeros de unión FcRn incluyen IgG total, el fragmento Fe de IgG y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión de FcRn completa. Los principales sitios de contacto incluyen los residuos aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Las referencias a la numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos o regiones de inmunoglobulina se basan en Kabat et ál . 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest , Departmento de Salud Pública de Estados Unidos, Bethesda, d.

La región Fe de IgG puede ser modificada de acuerdo con procedimientos reconocidos, tales como la mutagénesis de sitio dirigido y similares, para proporcionar IgG modificada o partes o fragmentos de Fe de ella que puedan unirse con FcRn. Tales modificaciones incluyen modificaciones alejadas de los sitios de contacto de FcRn, así como modificaciones en los sitios de contacto que preservan o incluso mejoran la unión a FcRn. Por ejemplo, los siguientes residuos de aminoácidos simples en IgGl Fe (Fe ??) humana pueden ser sustituidos sin pérdida significativa de afinidad de unión de Fe por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A y K447A en los que, por ejemplo, P238A representa prolina de tipo salvaje sustituida por alanina en la posición número 238.

Algunas de las mutaciones antemencionadas pueden conferir nuevas funcionalidades al resto Fe. Por ejemplo, una modalidad incorpora N297A y elimina un sitio de N-glicosilación muy conservado. El efecto de esta mutación es la reducción de la glicosilacion y con ella, la reducción de la función efectora y/o la inmunogenicidad. Como ejemplo adicional de una nueva funcionalidad que surge de mutaciones descritas anteriormente, en algunos casos es posible aumentar la afinidad por FcRn por encima de la del tipo salvaje. Esta afinidad aumentada puede reflejar un aumento en la tasa «directa», una disminución en la tasa «inversa» o un aumento en la tasa «directa» y una disminución en la tasa «inversa». Las mutaciones que se cree que imparten una mayor afinidad para FcRn incluyen T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et ál. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

En una modalidad, el compañero de unión FcRn es un polipéptido que incluye la secuencia PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:) e incluye en forma adicional y opcional una secuencia que se selecciona de HQSLGTQ (SEQ ID NO:), HQNLSDGK (SEQ ID NO:), HQNISDGK (SEQ ID NO : ) O VISSHLGQ (SEQ ID NO:) (patente estadounidense N . ° 5 739 277).

Los expertos en la técnica están familiarizados con muchos otros análogos o mutaciones de Fe de ellas que exhiben función efectora y/o unión a FcRn alteradas. Adicionalmente, son conocidos en la técnica medios de modificación química de las regiones constantes de i munoglobulina (por ejemplo, pegilada) o fragmentos de ella (véase, por ejemplo, Aslam y Dent 1998, Bioconjugation : Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences, Macmilan Reference, Londres) , por ejemplo, en la solicitud estadounidense 20120003210.

En una modalidad, una región, domino o resto Fe al que se adjunta un resto de transmigración de la BBB se deglicosila mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la mutación de residuos normalmente glicosilados o mediante la alteración de la expresión del polipéptido de forma que no se produzca la glicosilación.

Como ejemplo, una modalidad específica incorpora la mutación N297A y elimina un sitio de N-glicosilación altamente conservado. En otra modalidad, un resto Fe incorpora una mutación en la posición 299, por ejemplo, una mutación T299 de otro aminoácido, tal como se describe en la patente estadounidense 7 863 419. Además de la sustitución de alanina, otros aminoácidos pueden ser sustituidos por aminoácidos de tipo salvaje en las posiciones anteriormente indicadas o conocidas en la técnica porque conducen a la reducción de la función de Fe.

En otra modalidad, es posible introducir las mutaciones descritas en Armour, K.L., Clark, M.R., Hadley, A.G. & Williamson L.M. (1999), Eur J Immunol 29: 2613-2624 en las moléculas de unión del sujeto.

Es posible introducir mutaciones en Fe en forma individual y generar más de cien restos Fe que difieren de Fe de origen natural. De manera adicional, es posible introducir combinaciones de dos, tres o más de estas mutaciones individuales en conjunto y obtener cientos más de posibles regiones Fe. Además, es posible mutar uno de los restos Fe de una construcción de la invención y no mutar el otro resto Fe en absoluto o mutar ambos, pero con diferentes mutaciones.

También se contempla el uso de miméticos peptídicos de al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un mimético peptídico de un fragmento Fe o un mimético peptídico de un compañero de unión de FcRn. En una modalidad, se identifica el mimético peptidico con expresión en fagos o mediante análisis de una biblioteca química (véase, por ejemplo, McCafferty et ál . 1990, Nature 348:552, Kang et ál . 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4363; EP 0 589 877 Bl) .

En otra modalidad, una región Fe de la invención (por ejemplo, una región scFc) comprende al menos la parte de una molécula de Fe que en la técnica es considerada necesaria para la unión con FcyR.

En una modalidad, una región Fe de la invención (por ejemplo, una región scFc) comprende al menos la parte de una molécula de Fe que en la técnica es considerada necesaria para la unión con proteína A. En una modalidad, una región Fe de la invención (por ejemplo, una región scFc) comprende al menos la parte de una molécula de Fe que en la técnica es considerada necesaria para la unión con proteína G. En una modalidad, tal molécula no se une a FcRn.

Tal como se establece en la presente, los expertos en la técnica comprenderán que también es posible modificar un dominio Fe mediante la inclusión de uno o más cambios en los aminoácidos (sustituciones, adiciones o supresiones), de forma tal que su secuencia de aminoácidos varíe respecto a un resto Fe de tipo salvaje. Muchos de los cambios o alteraciones son conocidos en la técnica. En determinadas modalidades ejemplares, el resto Fe retiene una función efectora (por ejemplo, unión a FCYR) y en determinadas modalidades, el resto Fe carece de función efectora o tiene función efectora reducida.

Los dominios o restos Fe de un polipéptido de la invención pueden provenir de cualquier isotipo (A, E, G o M) y pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un resto o dominio Fe de un polipéptido puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una molécula IgGl y una región bisagra derivada de una molécula IgG3. En otro ejemplo, un dominio o resto Fe puede comprender una bisagra quimérica derivada en parte de una molécula de IgGl y en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, un resto o dominio Fe puede comprender una bisagra quimérica derivada en parte de una molécula de IgGl y en parte, de una molécula de IgG4.

Los polipéptidos que comprenden los polipéptidos enlazadores de la invención pueden ser producidos mediante técnicas conocidas en la técnica. En una modalidad, los polipéptidos de la invención se «producen en forma recombinante» , es decir, se producen con tecnología de ADN recombinante . Ejemplos de técnicas para producir polipéptidos de la invención se plantean más detalladamente en la presente .

Tal como se usa en la presente, la expresión «portador farmacéuticamente aceptable» significa una composición o compuesto químico con el que se puede combinar un ingrediente activo y que, luego de combinarse, puede ser utilizado para administrar el ingrediente activo a un sujeto. Tal como se usa en la presente, la expresión sal o éster «fisiológicamente aceptable» significa el ingrediente activo en forma de éster o sal comparable a cualquier otro ingrediente de la composición farmacéutica y que no es perjudicial para el sujeto al que se debe administrar la composición. Tal como se usa en la presente, «portador farmacéuticamente aceptable» también incluye, de modo no taxativo, uno o más de los siguientes: excipientes, agentes tensioactivos , agentes de dispersión, diluyentes inertes, agentes de granulación y de desintegración, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes endulzantes, agentes saborizantes , agentes colorantes, conservantes, composiciones fisiológicamente degradables como gelatina, solventes y vehículos acuosos, solventes y vehículos oleosos, agentes de suspensión, agentes humectantes o de dispersión, agentes emulsionantes, emolientes, soluciones amortiguadoras, agentes espesantes, rellenos, agentes emulsionantes, antioxidantes, agentes estabilizantes y materiales hidrofóbicos o poliméricos farmacéuticamente aceptables. Otros «ingredientes adicionales» que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas de la invención son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Genaro, ed. , 1985, Remington ' s Pha.rma.ceutical Sciences, ack Publishing Co . , Easton, Pa . , que se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Tal como se usa en la presente, «una cantidad eficaz» es una cantidad suficiente para producir una respuesta terapéutica .

Tal como se usa en la presente, el término «prote inopat ía» hace referencia a trastornos caracterizados por proteínas plegadas en forma incorrecta o proteínas agregadas y son trastornos con componentes genéticos.

II. Anticuerpos de transmigración de la BBB En una modalidad, un anticuerpo de transmigración de la BBB es tal como se describe en la patente estadounidense 7 943 129. Por ejemplo, en una modalidad, un resto de transmigración de la BBB comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:58 (FC5), SEQ ID NO : 86 (FC44) y SEQ ID N0:87 (FC7) , tal como se establece en la patente estadounidense 7 943 129. En una modalidad, un resto de transmigración de la BBB es un resto FC5. FC5 es un anticuerpo de cadena pesada (HCA, aunque también se hace referencia a él como anticuerpo de dos cadenas, de cadena pesada doble cadena, VHH O anticuerpo de dominio simple) que proviene de un camélido. Cuando se comparan con inmunoglobulinas de cuatro cadenas de tipo IgG, también producidas por camélidos, estos anticuerpos carecen de las cadenas ligeras y los dominios CH1 de las inmunoglobulinas usuales. Una de las características prominentes de estos anticuerpos de cadena pesada de origen natural es la presencia predominante de Glu, Arg y Gly en las posiciones 44, 45 y 47 (numeración Kabat), respectivamente, en la interfaz VL de su dominio variable (designado VHH) . Gly, Leu y Trp ocupan casi exclusivamente las mismas posiciones en el dominio variable de la cadena pesada de los anticuerpos de cuatro cadenas (designados VH) . Se cree que estas diferencias son responsables de la solubilidad y la estabilidad elevadas del dominio variable (VHH) HCA camélido, en comparación con la insolubilidad relativa del dominio VH de los anticuerpos convencionales de cuatro cadenas . Otras dos características clave de los dominios camélidos VHH son su CDR3 comparativamente más extenso y la incidencia elevada de pares de cisteína en las CDR. Parece que los pares de cisteína median la formación de un puente disulfuro y, por lo tanto, están involucrados en la modulación de la topología superficial del sitio de combinación de anticuerpos. En la estructura cristalina de un complejo de lisozima y sdAb camélido, un bucle rígido prominente del sdAb y parcialmente estabilizado por enlace disulfuro en la CDR se extiende alejándose del sitio de combinación y entra en el sitio activo de la lisozima (Desmyter et ál . , Nature Struct. Biol., 3, 803-811 (1996) ) .

En una modalidad, un anticuerpo de transmigración de la BBB se une a TMEM30A (C6orf67, CDC50A) . Son conocidos ejemplos de restos que se unen a TMEM30A o pueden ser llevados a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de T EM30A o una parte de ella para producir anticuerpos que reconocen específicamente la secuencia de aminoácidos de T EM30A o para determinar la presencia de restos de unión que se unen específicamente a TMEM30A en una biblioteca de sitios de unión. Es posible utilizar los sitios de unión de tales anticuerpos o derivados de bibliotecas en una molécula de unión de la invención. A continuación se presenta la secuencia de aminoácidos de TME 30A : Los polipéptidos de la invención pueden comprender una región variable o una parte de ella (por ejemplo un dominio VL y/o VH) derivada de un anticuerpo que se une a T EM30A mediante protocolos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el dominio variable puede derivar de un anticuerpo producido en un mamífero no humano, por ejemplo, murino, cobayo, primate, conejo o rata, mediante la inmunización del mamífero con el antígeno o un fragmento de él. Véase Harlow & Lañe, supra, que se incorpora a la presente a todos los efectos. La inmunoglobulina puede ser generada por medio de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antigeno relevante (por ejemplo, tumor purificado asociado a antígenos o células o extractos celulares que comprenden los antígenos) y un adyuvante. Normalmente, esta inmunización provoca una respuesta inmune que comprende la producción de anticuerpos reactivos al antígeno de esplenocitos o linfocitos activados.

Aunque la región variable puede derivar de anticuerpos policlonales cultivados a partir del suero de un mamífero inmunizado, se suele desear aislar linfocitos individuales del bazo, nodulos linfáticos o sangre periférica para proporcionar preparaciones homogéneas de anticuerpos monoclonales (Mab) a partir de los que deriva la región variable. Es usual emplear conejos o cobayos para crear anticuerpos policlonales. Generalmente se usan ratones para crear anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados contra un fragmento mediante la inyección de un fragmento de anticuerpo en un ratón, la preparación de «hibridomas» y la detección de los hibridomas para un anticuerpo que se une específicamente al antígeno. En este proceso conocido (Kohler et ál. (1975), Nature, 256:495) los linfocitos de vida relativamente corta, o mortales, del ratón al que se le inyectó el antígeno se fusionan con una línea celular tumoral inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) y de esa manera producen células híbridas o «hibridomas» que son tanto inmortales como capaces de producir el anticuerpo codificado genéticamente por el linfocito B. Los híbridos resultantes se segregan en cepas genéticas simples por selección, dilución y neoformación con cada cepa individual que comprende genes específicos para la formación de un anticuerpo simple.

Estos producen anticuerpos que son homogéneos contra el antígeno deseado y, con referencia a su parentesco genético puro, se denominan «monoclonales» .

Las células de hibridoma preparadas de esta manera pueden sembrarse y cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Los expertos en la técnica observarán que los reactivos, las líneas celulares y el medio para la formación, selección y crecimiento de hibridomas se encuentran comercialmente disponibles en una variedad de fuentes y que existen protocolos estandarizados establecidos. En general, se hacen ensayos del medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno deseado. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo in vitro tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) . Luego de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, es posible subclonar los clones mediante procedimientos de dilución limitada y se pueden cultivar con métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, págs . 59-103 (Academic Press, 1986)). Adicionalmente , se observa que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, fluido ascitis o suero mediante procedimientos convencionales de purificación tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína-A, proteína-G o proteína-L) , cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel o diálisis .

Opcionalmente , es posible analizar la unión de los anticuerpos a una región específica o un fragmento deseado del antígeno sin unirlos a otros fragmentos del antígeno que no se superponen. El último análisis mencionado se puede llevar a cabo mediante la determinación de la unión de un anticuerpo a un conjunto de mutantes de supresión del antígeno y la determinación de qué mutantes de supresión se unen al anticuerpo. Por ejemplo, se puede evaluar la unión mediante transferencia Western o ELISA. El fragmento más pequeño que exhibe unión específica al anticuerpo define el epítopo del anticuerpo. De forma alternativa, la especificidad del epítopo puede ser determinada mediante un ensayo de competencia en el que una prueba y una referencia compiten por la unión al antígeno. Si los anticuerpos de prueba y de referencia compiten, luego se unen al mismo epítopo o a epítopos suficientemente cercanos como para que un anticuerpo interfiera con la unión del otro.

El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal deseado puede ser aislado y secuenciado rápidamente mediante cualquiera de los procedimientos convencionales descritos anteriormente para el aislamiento de las secuencias de dominio y región constante (por ejemplo, con sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células aisladas y de hibridoma subclonado sirven como una fuente preferida de tal ADN. Más particularmente, el ADN aislado (que puede ser sintético, tal como se describe en la presente) puede ser utilizado para clonar las secuencias de región variable deseadas e incorporarlas en los polipéptidos de la invención.

En otras modalidades, el sitio de unión deriva de un anticuerpo completamente humano. Es posible generar anticuerpos humanos o sustancialmente humanos en animales transgénicos (por ejemplo, en ratones) que no pueden producir inmunoglobulina endógena (véase por ejemplo, patentes estadounidenses N.° 6 075 181, 5 939 598, 5 591 669 y 5 589 369, las que se incorporan a la presente mediante esta referencia) . Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica de la región de unión de cadena pesada al anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de una matriz genética de inmunoglobulina humana a ratones mutantes con la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al exponerlos a antígenos. En la patente estadounidense N.° 5 811 524, que se incorpora a la presente mediante esta referencia, se describen otros medios preferidos para generar anticuerpos humanos con ratones SCID. Se observará que el material genético asociado a estos anticuerpos humanos también podrá aislarse y manipularse tal como se describe en la presente.

En Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992) se describe aun otro medio muy eficaz para generar anticuerpos recombinantes . En particular, esta técnica da como resultado la creación de anticuerpos primatizados que contienen dominios variables de mono y secuencias constantes humanas. Esta referencia se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad. Además, esta técnica también se describe en las patentes estadounidenses N.° 5 658 570, 5 693 780 y 5 756 096 comúnmente cedidas y que se incorporan a la presente mediante esta referencia.

En otra modalidad, los linfocitos pueden ser seleccionados mediante micromanipulación y los genes variables, aislados. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica se pueden aislar a partir de un mamífero inmunizado y cultivarse durante aproximadamente 7 días in vitro. Es posible analizar los cultivos para determinar la presencia de anticuerpos específicos que cumplan con los criterios de análisis. Pueden aislarse las células de los pocilios positivos. Los linfocitos B que producen Ig individual se pueden aislar por FACS o al identificarlas en un ensayo de placa hemolítica mediada por complemento. Los linfocitos B que producen Ig se pueden micromanipular en un tubo y los genes VH y VL se pueden ampliar, por ejemplo, con RT-PCR. Los genes VH y VL se pueden clonar en un vector de expresión de anticuerpo y se pueden transfectar en células (por ejemplo, células eucariotas y procariotas) para su expresión.

De forma alternativa, los dominios variables (V) se pueden obtener de bibliotecas de secuencias de genes variables del animal que se elija. Las bibliotecas que expresan combinaciones al azar de dominios, por ejemplo, dominios VH y VL, se pueden analizar con un antígeno deseado para identificar elementos que tienen las características de unión deseadas. Los métodos para llevar a cabo tal detección son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los repertorios genéticos de anticuerpos pueden clonarse en un vector de expresión de bacteriófago ? (Huse, WD et ál . (1989) . Science, 2476:1275). Además, es posible analizar células (Francisco et ál. (1994), PNAS, 90:10444; Georgiou et ál . (1997), Nat . Bioteoh., 15:29; Boder y Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553; Boder et ál . (2000), PNAS, 97:10701; Daugtherty, P. et ál. (2000) J". Immunol . Methods . 243:211) o virus (por ejemplo, Hoogenboom, HR. (1998), Immunotechnology 4:1; Winter et ál . (1994). Annu. Rev. Immunol . 12:433; Griffiths, AD. (1998) . Curr. Opin. 9:102) que expresan anticuerpos en su superficie .

Los expertos en la técnica también observarán que los dominios variables del anticuerpo que codifica el ADN también pueden ser derivados de bibliotecas de anticuerpos expresados en fagos, levaduras o bacterias con métodos conocidos en la técnica. Se plantean ejemplos de métodos en, por ejemplo, EP 368 684 Bl, la patente estadounidense N.° 5 969 108, Hoogenboom et ál . , (2000) Immunol. Today 21:371, Nagy et ál . (2002) Nat . Med. 8:801, Huie et ál . (2001), PNAS, 98:2682, Lui et ál . (2002), J. Mol. Biol . 315:1063, que se incorporan a la presente mediante esta referencia. Varias publicaciones (por ejemplo, Marks et ál . (1992), Bio/Technology 10:779-783) han descrito la producción de anticuerpos humanos con alta afinidad mediante transposición de cadenas, así como una infección combinatoria y una recombinación in vivo como estrategia para la construcción de grandes bibliotecas de fagos. En otra modalidad, se puede emplear la expresión ribosomal para reemplazar el bacteriófago como plataforma de expresión (véanse, por ejemplo, Hanes, et ál . (1998), PNAS 95:14130; Hanes y Pluckthun. (1999), Curr. Top. Microbiol . Immunol . 243:107; He y Taussig. (1997), Nuc . Acids Res., 25:5132; Hanes et ál. (2000), Nat. Biotechnol. 18:1287; Wilson et ál . (2001), PNAS, 98:3750; o Irving et ál . (2001) J". Immunol . Methods 248:31).

Las bibliotecas de genes variables humanos son ejemplos de bibliotecas que pueden ser analizadas. También se pueden usar dominios VL y VH de fuente no humana. Las bibliotecas pueden no presentar modificaciones, pertenecer a sujetos inmunizados o ser semisintéticas (Hoogenboom and Winter. (1992). J". Mol. Biol . 227:381; Griffiths et ál . (1995) EMBO J. 13:3245; de Kruif et ál . (1995). J. Mol. Biol. 248:97; Barbas et ál . (1992), PNAS, 89:4457). En una modalidad, se pueden generar mutaciones en los dominios de inmunoglobulina para crear una biblioteca de moléculas de ácido nucleico con mayor heterogeneidad (Thompson et ál . (1996) J. Mol. Biol. 256:77; Lamminmaki et ál . , (1999) J. Mol. Biol. 291:589; Caldwell y Joyce . (1992), PCR Methods Appl. 2:28; Caldwell y Joyce (1994), PCR Methods Appl . 3:S136). Se pueden usar procedimientos de detección estándares para seleccionar variantes de afinidad elevada. En otra modalidad, se pueden realizar cambios a las secuencias VH y VL para aumentar la avidez del anticuerpo, por ejemplo, con información obtenida a partir de estructuras cristalinas mediante técnicas conocidas en la técnica.

Otro ejemplo de biblioteca es una biblioteca camélida que comprende anticuerpos de dominio simple. Los ejemplos de moléculas de dominio simple incluyen un dominio variable de cadena pesada aislado (VH) de un anticuerpo, es decir, un dominio variable de cadena pesada, sin un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena ligera aislado (VL) de un anticuerpo, es decir, un dominio variable de cadena ligera, sin un dominio variable de cadena pesada. Ejemplos de anticuerpos de dominio simple empleados en las moléculas de unión de la invención incluyen, por ejemplo, el dominio variable de cadena pesada de camélidos (aproximadamente entre 118 y 136 residuos aminoácidos) , tal como se describe en Hamers-Casterman et ál . , Nature 363:446-448 (1993) y Dumoulin et ál., Protein Science 11:500-515 (2002) . Otros ejemplos de anticuerpos de dominio simple incluyen dominios VH o VL simples, también conocidos como Dabs® (Domantis Ltd. , Cambridge, RU) . Aun otros anticuerpos de dominio simple incluyen anticuerpos de tiburón (por ejemplo, Ig-NAR de tiburón) . Los Ig-NAR de tiburón comprenden un homodímero con un dominio variable (V-NAR) y cinco dominios constantes tipo C (C-NAR) en el que la diversidad se concentra en una región CDR3 elongada que varía entre 5 y 23 residuos de longitud. En especies de camélidos (por ejemplo, en llamas) , la región variable de cadena pesada, a la que se hace referencia como VHH, forma el dominio de unión al antígeno en su totalidad. Las diferencias principales entre las regiones variables VHH de camélidos y aquellas derivadas de anticuerpos convencionales (VH) incluyen (a) más aminoácidos adecuadas de región variable (por ejemplo, secuencias VL y VH) a partir de las secuencias mediante las técnicas reconocidas en la técnica.

En otra modalidad, un dominio de unión de un anticuerpo alterado de la invención consiste en un dominio VH, por ejemplo, derivado de camélidos, estable en ausencia de una cadena VL (Hamers-Casterman et ál . (1993). iVature, 363:446; Desmyter et ál . (1996). Nat . Struct. Biol . 3: 803; Decanniere et ál. (1999). Structure, 7:361; Davies et ál . (1996). Protein Eng. , 9:531; Kortt et ál . (1995). J. Protein Chem. , 14 : 167) .

Un polipéptido de la invención puede comprender un dominio variable o una CDR derivados de un anticuerpo completamente murino, completamente humano, quimérico, humanizado, primate no humano o primatizado. Los anticuerpos no humanos o fragmentos o dominios de estos pueden ser alterados para reducir su inmunogenicidad mediante el uso de técnicas reconocidas en la técnica. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos derivados de anticuerpos no humanos que han sido modificados para retener o retener sustancialmente las propiedades de unión del anticuerpo original pero que son menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos no humanos originales. En el caso de anticuerpos diana humanizados, esto se puede lograr mediante varios métodos que incluyen (a) injertar la totalidad de los dominios variables no humanos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos diana quiméricos, (b) injertar al menos una parte de una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) no humanas en un marco humano y regiones hidrofóbicos en la superficie de contacto de la cadena ligera de VH en comparación con la región correspondiente en VHH, (b) una CDR3 más larga en VHH y (c) la aparición frecuente de un enlace disulfuro entre CDR1 y CDR3 en VHH. En las patentes estadounidenses N.° 6 005 079 y 6 765 087, las que se incorporan a la presente mediante esta referencia, se describen métodos para producir moléculas de unión de dominio simple. Ejemplos de anticuerpos de dominio simple que comprenden dominios VHH incluyen Nanobodies® (Ablynx NV, Ghent, Bélgica) .

Además, es posible obtener las secuencias de región variable útiles para la producción de polipéptidos de la presente invención a través de una variedad de fuentes. Por ejemplo, tal como se discutió anteriormente, una variedad de secuencias de genes humanos se encuentra disponible en forma de depósitos de acceso público. Se han publicado varias secuencias de anticuerpos y de genes que codifican anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos conocidos por presentar propiedades clínicamente beneficiosas) , y se pueden sintetizar químicamente secuencias constantes con o sin retención de residuos de marcos críticos, (c) transplantar la totalidad de los dominios variables no humanos, pero «ocultándolos» con una sección similar a la humana mediante el reemplazo de residuos superficiales. Tales métodos se describen en Morrison et ál . , (1984), PNAS. 81: 6851-5; Morrison et ál., (1988), Adv. Immunol . 44: 65-92; Verhoeyen et ál., (1988), Science 239: 1534-1536; Padlan, (1991), Molec. Immun. 28: 489-498; Padlan, (1994), Molec. Im un. 31: 169-217; y las patentes estadounidenses N.° 5 585 089, 5 693 761 y 5 693 762 que se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

También se puede utilizar la desinmunización para reducir la inmunogenicidad de un polipéptido de la invención. Tal como se usa en la presente, el término «desinmunización» incluye la modificación de epítopos de linfocitos T (véase, por ejemplo, W09852976A1, WO0034317A2) . Por ejemplo, se analizan las secuencias VH y VL y se genera un «mapa» de epítopo de linfocito T de cada región V que muestra la ubicación de epítopos con relación a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de linfocitos T individuales del mapa de epítopos de linfocitos T se analizan para poder identificar las sustituciones de aminoácidos alternativas con poco riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseñan intervalos de secuencias VH y VL alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan posteriormente en un intervalo de polipéptidos de la invención cuyo funcionamiento es evaluado. Normalmente, se generan y se evalúan entre 12 y 24 anticuerpos diversos. Luego se clonan genes completos de cadena pesada y ligera que comprenden regiones modificadas V y C humanas en vectores de expresión y los plásmidos posteriores se introducen en líneas celulares para producir anticuerpos enteros. Luego, los anticuerpos se comparan en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados y se identifica la variante óptima.

En una modalidad, los dominios variables empleados en un polipéptido de la invención se alteran en al menos un reemplazo parcial de una o más CDR. En otra modalidad, los dominios variables se pueden alterar opcionalmente , por ejemplo, con un reemplazo parcial de la región flanqueante y un cambio de secuencias. Al producir una región variable humanizada, las CDR pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que derivan las regiones flanqueantes. Sin embargo, se prevé que las CDR deriven de un anticuerpo de distinta clase y preferentemente de un anticuerpo de diferente especie. Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR por las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. En cambio, puede sólo ser necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del dominio de unión. Dadas las explicaciones proporcionadas en las patentes estadounidenses N. ° 5 585 089, 5 693 761 y 5 693 762, la obtención de un sitio de unión al antígeno funcional con inmunogenicidad reducida será comprendida por la competencia de los expertos en la técnica, ya sea mediante la modalidad de experimentos de rutina o por el método de prueba y error.

FC5 es un resto de unión a TMEM30A de ejemplo que puede incorporarse a un polipéptido de la invención. La secuencia de aminoácidos de FC5 se establece a continuación: E V Q L Q A S G G G L V Q A G G S L R L S C A A S G F K I T H Y T M G W F R Q A P G K E R E F V S R I T G G D N T F Y S N S V K G R F T I S R D N A K N T V Y L Q M N S L K P E D T A D Y Y C A A G S T S T A T P L R V - - - D Y W G K G T Q V T V S S III. Péptidos enlazadores opcionales Los polipéptidos de la invención comprenden opcionalmente al menos un péptido enlazador. En una modalidad, dos o más péptidos enlazadores están presentes en un polipéptido del polipéptido de la invención. En otra modalidad, un polipéptido de la invención comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 péptidos enlazadores.

Los péptidos enlazadores de la invención pueden aparecer una vez en una posición dada, o pueden aparecer varias veces (es decir, la secuencia del péptido enlazador se puede repetir x cantidad de veces en la secuencia) en una posición dada en un polipéptido recombinante . Por ejemplo, en una modalidad, un péptido enlazador de la invención se repite entre 1 y 10 veces (inclusive) en una posición dada en un polipéptido. En otra modalidad, el péptido enlazador aparece 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces en una posición dada en un polipéptido .

Los péptidos enlazadores de la invención pueden tener distintas longitudes. En una modalidad, un péptido enlazador de la invención tiene entre alrededor de 5 y alrededor de 75 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, un péptido enlazador de la invención tiene entre alrededor de 5 y alrededor de 50 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, un péptido enlazador de la invención tiene entre alrededor de 10 y alrededor de 40 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, un péptido enlazador de la invención tiene entre alrededor de 15 y alrededor de 35 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, un péptido enlazador de la invención tiene entre alrededor de 15 y alrededor de 20 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, un péptido enlazador de la invención tiene alrededor de 15 aminoácidos de longitud.

Los péptidos enlazadores son tan frecuentemente utilizados en la modificación genética de proteínas que se han convertido en partes del ensamblaje estándar en la biología sintética (véase, por ejemplo, Anderson, J.C. et al., Journal of Biological Engineering 2010. 4:1 y en el sitio web para el registro de partes que enumera las partes biológicas estándar utilizadas en las construcciones genéticas) .

Algunos ejemplos de usos actuales y reconocidos en la técnica de los péptidos enlazadores incluyen su uso en: moléculas scFv (Freund et ál . FEBS 1993. 320:97), moléculas de inmunoglobulina de cadena simple (Shu et ál . 1993. PNAS. USA 90:7995), minicuerpos (Hu et ál . 1996 Cáncer Res. 56:3055), anticuerpos eliminados del dominio CH2 (Mueller, B.M. et ál., 1990 PNAS USA. 87:5702), anticuerpos biespecíficos de cadena simple (Schlereth et ál . 2005 Cáncer Res. 65:2882), anticuerpos biespecíficos de longitud completa similares a IgG (Marvin, J.S. et ál . 2005 Acta Pharmacol Sin 26:649 y las referencias que se citan allí, al igual que Michaelson, J.S. et ál. 2009 MAbs.1:128 y Orcutt K.D. et ál . 2010 Protein Eng Des Sel. 23:221), proteínas de fusión scFv (deGraaf et ál. 2002 British Journal of Cáncer 86:811), ensayos de desarrollo de complementariedad proteína-fragmento (Remy, I. et ál . 2007 BioTechiques 42:137).

Otros ejemplos de péptidos enlazadores incluyen los que reducen xilosa (por ejemplo, tal como se describe en PCT/US11/66947) y se pueden utilizar en las moléculas de unión de la presente.

Los péptidos enlazadores pueden unirse al N-terminal o al C-terminal (o a ambos) de los polipéptidos a los cuales se unen.

IV. Restos farmacéuticamente activos de ejemplo En función de la enfermedad o del trastorno o de la afección diana, una variedad de cargas del fármaco, por ejemplo, agentes farmacológicamente activos o, de manera equivalente, restos farmacéuticamente activos, se puede administrar satisfactoriamente in vivo mediante el uso de moléculas de unión de la invención, por ejemplo, moléculas de unión que comprenden los sitios de transmigración de la BBB de conformidad con la invención, por ejemplo, que se dirige a TMEM30A. Tal como se usa en la presente, las expresiones «resto farmacéuticamente activo» y «compuesto farmacológico» harán referencia a cualquier resto o compuesto útil en el tratamiento o la mejora de los efectos de una enfermedad o un trastorno. Por ejemplo, se puede dirigir a enfermedades o trastornos que incluyen enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig) , la epilepsia de dolor, las enfermedades de almacenamiento y la esclerosis múltiple .

Las moléculas farmacéuticamente activas de ejemplo incluyen: factor de crecimiento nervioso (NGF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) . Además, se ha demostrado que otros compuestos que tienen un potencial terapéutico y que se pueden administrar mediante anticuerpos de la invención son neuropéptidos que incluyen, de modo no taxativo, Sustancia P, neuropéptido Y, dalargina, alfa sinucleína, péptidos intestinales vasoactivos (VIP) , ácido gamma-aminobutírico (GABA) , dopamina, colecistoquinina (CCK) , endorfinas, enquefalinas y hormona liberadora de tirotropina (TRH) . Otros productos terapéuticos de ejemplo pueden incluir citocinas, agentes ansiolíticos , anticonvulsivos , polinucleótidos y trangenes que incluyen, por ejemplo, ARN interférente pequeño, y que se pueden utilizar para los trastornos neuronales que incluyen, de modo no taxativo, enfermedades psiquiátricas, tales como, por ejemplo, ansiedad, depresión, esquizofrenia y transtornos del sueño, así como también epilepsias, trastornos convulsivos, trastornos cerebrovasculares y apoplejía, encefalitis y meningitis, trastornos cognitivos y de memoria, dolor agudo o crónico (por ejemplo, refractario) y trauma físico.

En una modalidad, un resto farmacéuticamente activo comprende un sitio de unión al antígeno que no se une a TMEM30A. En determinadas modalidades, los polipéptidos de la invención pueden tener al menos un sitio de unión específico para una molécula diana distinta a TMEM30A que media un efecto biológico. En una modalidad, el sitio de unión modula la activación o inhibición celular (por ejemplo, mediante la unión a un receptor de superficie celular que da como resultado la transmisión de una señal de activación o inhibitoria) . En una modalidad, el sitio de unión es capaz de iniciar la transducción de una señal que da como resultado la muerte de la célula (por ejemplo, por una vía inducida por una señal celular, por fijación o exposición del complemento a una carga útil (por ejemplo, una carga útil tóxica) presente en la molécula de unión) o que modula una enfermedad o un trastorno en un sujeto (por ejemplo, mediante la mediación o promoción de la muerte celular, mediante la promoción de la lisis de un coágulo de fibrina o la promoción de la formación de coágulos o mediante la modulación de la cantidad de una sustancia que se encuentra biodisponible . En otra modalidad, los polipéptidos de la invención tienen al menos un sitio de unión específico para un antígeno a ser reducido o eliminado, por ejemplo, un antígeno de superficie celular o un antígeno soluble) .

En aun otras modalidades, un polipéptido de la invención se une a una molécula que es útil en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno neurológico. Por ejemplo, un polipéptido se puede unir a un antígeno presente en una célula neural (por ejemplo, una neurona, una célula glial o un) . En algunas modalidades, el antígeno asociado a un trastorno neurológico puede ser un trastorno autoinmunitario o inflamatorio descrito anteriormente. Tal como se usa en la presente, la expresión «enfermedad o trastorno neurológico» incluye trastornos o afecciones en un sujeto en los que el sistema nervioso se degenera (por ejemplo, trastornos neurodegenerativos, así como trastornos en los que el sistema nervioso no logra desarrollarse adecuadamente o no logra regenerarse luego de una lesión, por ejemplo, una lesión de médula espinal). Los ejemplos de trastornos neurológicos que se pueden diagnosticar, prevenir o tratar mediante los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen, de modo no taxativo, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, dolor neuropático, lesión cerebral traumática, síndrome Guillain-Barré y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) .

A continuación se tratan restos farmacológicamente activos de ejemplo: i. Partes de unión al antígeno En determinadas modalidades, un resto farmacéuticamente activo comprende al menos una parte de unión al antígeno (sitio de unión) , por ejemplo, de un anticuerpo o un anticuerpo de dominio simple. En una modalidad, la parte de unión al antígeno se dirige a la composición a un tejido o tipo celular específico.

En otras modalidades, un sitio de unión de un resto farmacéuticamente activo de la invención puede comprender un fragmento o una parte de unión al antígeno. La expresión «fragmento de unión al antígeno» hace referencia a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina, un anticuerpo o una variante de anticuerpo que se une al antígeno o compite con un anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del cual derivaron) para unirse al antígeno (es decir, unión específica) . Por ejemplo, los fragmentos de unión al antígeno pueden derivar de anticuerpos o variantes de anticuerpos que se describieron anteriormente. Las partes de unión al antígeno se pueden producir mediante métodos recombinantes o bioquímicos conocidos en la técnica. Los fragmentos de unión al antígeno de ejemplo incluyen VH y/o VL (si alguna de las regiones variables por sí sola basta para unirse al antígeno), Fv, Fab, Fab' y (Fab' )2- En otras modalidades, un resto farmacéuticamente activo de la invención puede comprender un sitio de unión de una molécula de unión de cadena simple (por ejemplo, una región variable de cadena simple o scFv) . Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente estadounidense N. ° 4 694 778; Bird, Science 242:423-442 (1988) ; Huston et ál . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988) ; y Ward et ál . , Nature 334:544-554 (1989)) se pueden adaptar para producir moléculas de unión de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple se forman mediante el enlace de fragmentos pesados y ligeros o la región Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un anticuerpo de cadena simple. También se pueden utilizar técnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et ál . , Science 242:1038-1041 (1988)) .

En determinadas modalidades, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende uno o más sitios de unión o regiones que comprenden o consisten en una secuencia de región variable de cadena simple (scFv) . Las secuencias de región variable de cadena simple comprenden un polipéptido simple que tiene uno o más sitios de unión al antígeno, por ejemplo, un dominio VL unido mediante un péptido enlazador a un dominio VH. Los dominios VL y/o VH pueden derivar de anticuerpos conocidos en la técnica o sus variantes. Las moléculas scFv se pueden construir en una orientación VH-enlazador-Vk o una orientación VL-enlazador-VH.

En determinadas modalidades, una molécula scFv utilizada en un resto farmacéuticamente activo de la invención es una molécula scFv estabilizada. En una modalidad, la molécula scFv estabilizada puede comprender un péptido enlazador interpuesto entre un dominio VH y un dominio VL, donde los dominios VH y VL se enlazan mediante un enlace disulfuro entre un aminoácido en el dominio VH y un aminoácido en el dominio VL. En otras modalidades, la molécula scFv estabilizada puede comprender un enlazador de scFv que tiene una longitud o composición optimizada. En aun otras modalidades, la molécula scFv estabilizada puede comprender un dominio VH o VL que tiene al menos una sustitución de aminoácidos estabilizante. En aun otra modalidad, una molécula scFv estabilizada puede tener al menos dos de los rasgos estabilizantes enumerados anteriormente .

Las moléculas scFv estabilizadas presentan una estabilidad proteica mejorada o imparten una estabilidad proteica mejorada al polipéptido al que están unidas de forma operativa. Los ejemplos de moléculas scFv estabilizadas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la invención se describen en la solicitud de patente estadounidense N.° 11/725 970, presentada el 19 de marzo de 2007, la cual se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia .

En determinadas modalidades, los restos farmacéuticamente activos de la invención comprenden al menos una molécula scFv unida de forma operativa a través de un enlace peptídico a los extremos C y/o N de una región Fe.

En una modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende al menos una CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la presente invención comprende al menos dos CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la presente invención comprende al menos tres CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la presente invención comprende al menos cuatro CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la presente invención comprende al menos cinco CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la presente invención comprende al menos seis CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos completa de una molécula de anticuerpo que reconoce una diana deseada (por ejemplo, en el caso de una molécula biespecífica, tetravalente) .

En la técnica se conocen ejemplos de anticuerpos de los que pueden derivarse sitios de unión en un resto farmacéuticamente activo de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos actualmente aprobados por la FDA para su uso en el tratamiento pueden ser utilizados para derivar sitios de unión. En una modalidad, un ejemplo de sitio de unión deriva de un anticuerpo anti-lingo (véase, por ejemplo, PCT/US2008/000316) .

En otros aspectos, un resto farmacéuticamente activo de la invención puede comprender una molécula de anticuerpo modificada o un sitio de unión al antígeno (o partes de este) derivado de una forma modificada del anticuerpo. Los ejemplos de las formas incluyen, por ejemplo, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, nanocuerpos, camélidos, Dabs, anticuerpos tetravalentes, intradiacuerpos (por ejemplo, Jendreyko et ál., 2003., J". Biol . Chem. 278:47813), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión citocina-anticuerpo, proteínas fusionadas a al menos una parte de un receptor Fe) y anticuerpos biespecífieos . Otros anticuerpos se describen en, por ejemplo, la patente estadounidense N. ° 4 745 055; EP 256 654; Faulkner et ál . , Nature 298:286 (1982); EP 120 694; EP 125 023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Kohler et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et ál . , Cáncer Res. 41:2073 (1981); Morrison et ál . , Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255 694; EP 266 663 y WO 88/03559. También se conocen cadenas de inmunoglobulina reordenadas. Véase por ejemplo, la patente estadounidense N.° 4 444 878, WO 88/03565 y EP 68 763 y referencias citadas en estas.

En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un sitio o región de unión al antígeno que es un diacuerpo o un sitio de unión al antígeno derivado de este. Los diacuerpos son moléculas diméricas tetravalentes que tienen cada una un polipéptido similar a las moléculas scFv, pero que normalmente tienen un enlace de residuos de aminoácidos corto (por ejemplo, menor a 10 y preferentemente 1-5) que conecta ambos dominios variables de manera que los dominios VL y VH en la misma cadena polipeptídica no puedan interactuar. En cambio, los dominios VL y VH de una cadena polipeptídica interactúa con los dominios VL y VH (respectivamente) en una segunda cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, O 02/02781) . En una modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un diacuerpo que se une de forma operativa al N-terminal y/o C de al menos una región Fe fusionada genéticamente (es decir, región scFc) .

En determinadas modalidades, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un sitio de unión al anticuerpo de la BBB que no transmigra (por ejemplo, una molécula de unión del dominio de simple único distinta a TMEM30A, tal como un anticuerpo de dominio simple) . ii. Moléculas de unión no inmunoglobulina En algunas modalidades, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende uno o más sitios de unión derivados de una molécula de unión no inmunoglobulina . Tal como se usa en la presente, la expresión «moléculas de unión no inmunoglobulinas» son moléculas de unión cuyos sitios de unión comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de un polipéptido distinto a una inmunoglobulina. Los ejemplos de moléculas de unión que comprenden sitios de unión no derivados de moléculas de anticuerpos incluyen sitios de unión al receptor y sitios de unión al ligando que se plantean más detalladamente a continuación.

Los restos farmacéuticamente activos no inmunoglobulina pueden comprender secuencias de aminoácidos derivadas de un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina que no es una inmunoglobulina (por ejemplo, un receptor de linfocitos T o una proteína de adhesión celular (por ejemplo, CTLA-4, N-CAM, telokin) ) . En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos pueden comprender una topología de proteína que no se basa en el plegamiento de inmunoglobulina (por ejemplo, tal como las proteínas de repetición de ankirina o fibronectinas) , pero que sin embargo son capaces de unirse específicamente a una diana.

Los restos farmacéuticamente activos basados en no inmunoglobulina se pueden identificar mediante la selección o el aislamiento de una variante de unión a la diana de una biblioteca de moléculas de unión con sitios de unión diversificados artificialmente. Las bibliotecas diversificadas se pueden generar mediante el uso de enfoques completamente aleatorios (por ejemplo, PCR propensa a errores, transposición de exones o evolución dirigida) o asistidos por estrategias de diseño reconocidas en la técnica. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos que normalmente están implicadas cuando el sitio de unión interactúa con su molécula diana cognada se pueden aleatorizar mediante la inserción de codones degenerados, trinucleótidos , péptidos aleatorios o bucles enteros en posiciones correspondientes dentro del ácido nucleico que codifica el sitio de unión (véase, por ejemplo, la publicación estadounidense N. ° 20040132028). La ubicación de las posiciones de aminoácidos se puede identificar mediante la investigación sobre la estructura cristalina del sitio de unión en un complejo con la molécula diana. Las posiciones candidatas para la aleatorización incluyen bucles, superficies planas, hélices y cavidades de unión del sitio de unión. En determinadas modalidades, los aminoácidos dentro del sitio de unión que son candidatos posibles para la diversificación se pueden identificar mediante su homología con el plegamiento de inmunoglobulina . Por ejemplo, los residuos dentro de los bucles similares a CDR de fibronectina se pueden aleatorizar para generar una biblioteca de moléculas de unión a la fibronectina (véase, por ejemplo, Koide et ál . , J. Mol. Biol . , 284: 1141-1151 (1998)). Otras partes del sitio de unión que se pueden aleatorizar incluyen superficies planas. La selección se puede lograr mediante métodos reconocidos en la técnica, tales como la expresión en fagos, la expresión en levadura o la expresión en ribosomas .

En una modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un sitio de unión de una molécula de unión a la fibronectina . Las moléculas de unión a la fibronectina (por ejemplo, moléculas que comprenden los dominios de fibronectina tipo I, II o III) expresan bucles similares a CDR que, contrario a las inmunoglobulinas , no se sustentan en las uniones disulfuro intracadena. Los métodos para crear polipéptidos de unión a la fibronectina se describen, por ejemplo, en WO 01/64942 y en las patentes estadounidenses N.° 6 673 901, 6 703 199, 7 078 490 y 7 119 171 que se incorporan a la presente mediante esta referencia. En un ejemplo de modalidad, el polipéptido de fibronectina es Ad ectin® (Adnexus Therpaeutics , Waltham, MA) .

En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un sitio de unión de un Affibody® (Abcam, Cambridge, MA) . Los affibody derivan de dominios de unión a la inmunoglobulina de la proteína A estafilocócicas (SPA) (véase, por ejemplo, Nord et ál . , Nat . Biotechnol . , 15: 772-777 (1997) ) . Los métodos para producir sitios de unión al affibody se describen en las patentes estadounidenses N.° 6 740 734, 6 602 977 y en WO 00/63243, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia.

En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un sitio de unión de Anticalin® (Pieris AG, Friesing, Alemania) . Las anticalinas (también conocidas como lipocalinas) son miembros de una familia de proteínas de barril beta cuya función es unir moléculas diana en su región barril/bucle. Los sitios de unión a la lipocalina pueden modificarse genéticamente mediante la aleatorización de secuencias de bucle que conectan las hebras del barril (véase, por ejemplo, Schlehuber et ál . , Drug Discov. Today, 10: 23-33 (2005); Beste et ál . , PNAS, 96: 1898-1903 (1999) . Los sitios de unión a la anticalina empleados en las moléculas de unión de la invención se pueden obtener a partir de polipéptidos de la familia de lipocalina que presentan mutaciones en cuatro segmentos que corresponden a las posiciones de secuencia de la cadena lineal de polipéptidos que comprende las posiciones de aminoácidos 28 a 45, 58 a 69, 86 a 99 y 114 a 129 de la proteína de unión a bilina (BBP) de Pieris brassica . Otros métodos para producir sitios de unión a la anticalina se describen en W099/16873 y WO 05/019254, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia.

En otra modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un sitio de unión de un polipéptido rico en cisteína. Normalmente, los dominios ricos en cisteína empleados en la práctica de la presente invención no forman una hélice a, una lámina ß o una estructura de barril ß. Comúnmente, los enlaces disulfuro promueven el plegamiento del dominio en una estructura tridimensional. Normalmente, los dominios ricos en cisteína tienen al menos dos enlaces disulfuro, más típicamente, al menos tres enlaces disulfuro. Un ejemplo de polipéptido rico en cisteína es una proteína de dominio A. Los dominios A (algunas veces llamados «repeticiones de tipo complemento») contienen aproximadamente 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden aproximadamente 35-45 aminoácidos y en algunos casos, aproximadamente 40 aminoácidos. Dentro de los 30-50 aminoácidos hay aproximadamente 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C3 , C2 y C5, C4 y C6. El dominio A constituye un resto de unión al ligando. Los residuos de cisteína del dominio se enlazan al disulfuro para formar un resto compacto, estable, funcionalmente independiente. Las agrupaciones de estas repeticiones conforman un dominio de unión al ligando y la agrupación diferencial puede impartir especificidad con respecto a la unión al ligando. Los ejemplos de proteínas que contienen dominios A incluyen, por ejemplo, componentes complementarios (por ejemplo, C6, C7, C8, C9 y Factor I) , proteasas de serina (por ejemplo, enteropeptidasa, matriptasa y corina) , proteínas transmembrana (por ejemplo, ST7, LRP3, LRP5 y LRP6) y receptores endocíticos (por ejemplo, receptores relacionados con Sortilina, receptor LDL, VLDLR, LRP1, LRP2 y ApoER2) . Se describen métodos para elaborar proteínas del dominio A de una especificidad de unión deseada, por ejemplo, en WO 02/088171 y WO 04/044011, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia.

En otras modalidades, un resto farmacéuticamente activo de la invención comprende un sitio de unión de una proteína de repetición. Las proteínas de repetición son proteínas que contienen copias consecutivas de pequeñas unidades estructurales o repeticiones (por ejemplo, entre alrededor de 20 y alrededor de 40 residuos de aminoácidos) que se apilan para formar dominios contiguos. Las proteínas de repetición se pueden modificar para adecuarse a un sitio de unión diana específico mediante el ajuste de la cantidad de repeticiones en la proteína. Los ejemplos de proteínas de repetición incluyen proteínas de repetición de ankirina modificadas (es decir, DARPins®, Molecular Partners, Zurich, Suiza) (véase, por ejemplo, Binz et ál . , Nat . Biotechnol . , 22: 575-582 (2004) ) o proteínas de repetición ricas en leucina (es decir, LRRP) (véase, por ejemplo, Pancer et ál . , Nature, 430: 174-180 (2004)) . Todas las estructuras terciarias de unidades de repetición de ankirina determinadas hasta el momento comparten una característica compuesta por una horquilla ß seguida de dos hélices antiparalelas que culminan en un bucle que conecta la unidad de repetición con la siguiente. Los dominios construidos a partir de unidades de repetición de ankirina se forman mediante el apilamiento de las unidades de repetición hasta obtener una estructura extendida y curva. Los sitios de unión a LRRP forman parte del sistema inmunitario adaptativo de lampreas de mar y otros peces sin mandíbula, y se asemejan a los anticuerpos en tanto están formados por la recombinación de un sistema de genes de repetición ricos en leucina durante la maduración de linfocitos. Los métodos para elaborar sitios de unión a DARpin o LRRP se describen en WO02/20565 y WO 06/083275, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia.

Otros sitios de unión no inmunoglobulina que se pueden emplear en moléculas de unión de la invención incluyen sitios de unión derivados de dominios de homología Src (por ejemplo, dominios SH2 o SH3) , dominios PDZ, beta-lactamasa, inhibidores de proteasa de alta afinidad o pequeños armazones de proteína de enlace disulfuro tales como toxinas de escorpión. Los métodos para elaborar sitios de unión derivados de estas moléculas se han descrito en la técnica, véase, por ejemplo, Silverman et ál . , Nat . Biotechnol . , 23(12): 1493-4 (2005); Panni et al, J. Biol . Chem. , 277: 21666-21674 (2002), Schneider et ál . , Nat. Biotechnol . , 17: 170-175 (1999); Legendre et ál . , Protein Sci . , 11:1506-1518 (2002); Stoop et ál . , Nat . Biotechnol., 21: 1063-1068 (2003); y Vita et ál . , PNAS, 92: 6404-6408 (1995). Aun otros sitios de unión pueden derivar de un dominio de unión seleccionado del grupo que consiste en un dominio similar a EGF, un dominio Kringle, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancreática Kunitz/bovina, un dominio inhibidor de proteasa serina tipo Kazal, un dominio trefoil (tipo P) , un dominio con factor von illebrand de tipo C, un dominio similar a la anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de trioglobulina de tipo I, un dominio clase A receptora de LDL, un dominio Sushi , un dominio Link, un dominio de trombospondina tipo I, un dominio similar a inmunoglobulina , un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio con factor von Willebrand de tipo A, un dominio de Somatomedina B, un dominio central de disulfuro WAP tipo cuatro, un dominio F5/8 tipo C, un dominio hemopexina, un dominio similar a EGF tipo laminina, un dominio C2 , un dominio CTLA-4 y otros tales dominios conocidos para aquellos expertos en la técnica así como derivados y/o variantes de estos. Los polipéptidos de unión no inmunoglobulina adicionales incluyen Avimers® (Avidia, Inc., Mountain View, CA, véanse la publicación internacional PCT ?.s WO 06/055689 y la publicación de patente estadounidense 2006/0234299) , Telobodies® (Biotech Studio, Cambridge, MA) , Evibodies® (Evogenix, Sydney, Australia, véase la patente estadounidense N.° 7 166 697) y Microbodies® (Nascacell Technologies, Múnich, Alemania) . iii. Partes de unión de receptores o ligandos En otros aspectos, un resto farmacéuticamente activo de la invención es una parte de unión al ligando de un receptor y/o una parte de unión al receptor de un ligando.

En otros ejemplos de modalidades, un resto farmacéuticamente activo de la invención puede comprender uno o más dominios de unión al ligando o dominios de unión al receptor derivados de una o más de las siguientes proteínas: a. Citocinas y receptores de citocinas Las citocinas tienen efectos pleiotrópicos sobre la proliferación, la diferenciación y la activación funcional de los linfocitos. Se pueden utilizar varias citocinas, o partes de unión al receptor de estas, en las proteínas de fusión de la invención. Los ejemplos de citocinas incluyen las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 e IL-18), los factores de estimulación de colonias (CSF) (por ejemplo, CSF de granulocitos (G-CSF) , CSF de macrófago-granulocito (GM-CSF) y CSF de monocito macrófago (M-CSF) ) , factor de necrosis tumoral (TNF) alfa y beta, antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4) e interferones , tales como interferón a, ß o ? (patentes estadounidenses N.° 4 925 793 y 4 929 554).

Los receptores de citocina consisten típicamente en una cadena alfa específica del ligando y una cadena beta común. Los ejemplos de receptores de citocina incluyen aquellos para GM-CSF, IL-3 (patente estadounidense N. ° 5 639 605), IL-4 (patente estadounidense N.° 5 599 905), IL-5 (patente estadounidense N. ° 5 453 491), receptor IL10, IFNv (EP0240975) y la familia TNF de receptores (por ejemplo, TNFOÍ (por ejemplo, TNFR-1 (EP 417 563), TNFR-2 (EP 417 014) receptor beta de linfotoxina) . b. Proteínas de adhesión Las moléculas de adhesión son proteínas unidas a la membrana que permiten que las células interactúen entre sí. Las diversas proteínas de adhesión, que incluyen los receptores de alojamiento de leucocitos y las moléculas de adhesión celular o las partes de unión al receptor de estas, se pueden incorporar a una proteína de fusión de la invención. Los receptores de alojamiento de leucocitos se expresan en superficies celulares de leucocitos durante la inflamación e incluyen las integrinas ß-l (por ejemplo, VLA-1, 2, 3, 4, 5 y 6) que median la unión a los componentes de matriz extracelular y las integrinas ß2 (por ejemplo, LFA-1, LPAM-1, CR3 y CR4) que unen las moléculas de adhesión celular (CAM, por sus siglas en inglés) sobre el endotelio vascular. Los ejemplos de CAM incluyen ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 y MAdCAM- 1. Otras CAM incluyen aquellas de la familia de selectina que incluye E-selectina, L-selectina y P-selectina. c. Quimiocinas Las quimiocinas, proteínas quimiotácticas que estimulan la migración de leucocitos hacia un sitio de infección, también se pueden incorporar a una proteína de fusión de la invención. Los ejemplos de quimiocinas incluyen proteínas inflamatorias de macrófagos (???-1-a y ???-1-ß), el factor quimiotáctico de neutrófilos y RANTES (regulada al momento de la activación, normalmente expresada y secretada por linfocitos T) . d. Hormonas Los ejemplos de hormonas de crecimiento para su uso como restos farmacológicamente activos en las proteínas de fusión de la invención incluyen renina, hormona de crecimiento humano (HGH; patente estadounidense N.° 5 834 598) , hormona de crecimiento humana N-metionilo, hormona de crecimiento bovina, factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroide (PTH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , tiroxina, proinsulina e insulina (patentes estadounidenses N. ° 5 157 021 y 6 576 608), hormona estimulante del folículo (FSH) , calcitonina, hormona luteinizante (LH) , leptina, glucagones, bombesina, somatropina, sustancia inhibidora de Müllerian, relaxina y prorrelaxina , péptido asociado a la gonadotropina, prolactina, lactógeno placentario, proteína OB o sustancia inhibidora de Müllerian. e. Receptores y ligandos En una modalidad, un resto farmacéuticamente activo de la invención combina el o los sitios de unión del ligando o del receptor (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con al menos una región Fe fusionada genéticamente (es decir, región scFc) . En determinadas modalidades, el sitio o dominio de unión de la parte de unión al ligando de un receptor puede derivar de un receptor unido por un anticuerpo o una variante del anticuerpo. En otras modalidades, la parte de unión al ligando de un receptor es derivada de un receptor seleccionado del grupo que consiste en un receptor de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig) (por ejemplo, un receptor de linfocitos T soluble, por ejemplo, mTCR® (Medigene AG, Múnich, Alemania) , un receptor de la superfamilia del receptor TNF que se describió anteriormente (por ejemplo, un receptor TNFa soluble de una inmunoadhesina, un receptor de la familia del receptor del factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF) (por ejemplo, GFROÍ3), un receptor de la superfamilia del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , un receptor de la superfamilia del receptor tirosina cinasa (TK) , un receptor de la superfamilia regulada por ligandos (LG) , un receptor de la superfamilia del receptor de quimiocina, una superfamilia del receptor IL-l/tipo Toll (TLR) y una superfamilia del receptor de citocinas.

En otras modalidades, el sitio o dominio de unión de la parte de unión al receptor de un ligando puede ser derivado de un ligando unido por un anticuerpo o una variante del anticuerpo. Por ejemplo, el ligando puede unirse a un receptor seleccionado del grupo que consiste en un receptor de la superfamilia de Inmunoglobulina (Ig) , un receptor de la superfamilia del receptor TNF, un receptor de la superfamilia del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , un receptor de la superfamilia del receptor de tirosina cinasa (TK) , un receptor de la superfamilia regulada por ligandos (LG) , un receptor de la superfamilia del receptor de quimiocina, una superfamilia del receptor IL-l/tipo Toll (TLR) y una superfamilia del receptor de citocinas. En un ejemplo de modalidad, el sitio de unión de la parte de unión al receptor de un ligando deriva de un ligando que pertenece a la superfamilia del ligando TNF (por ejemplo, CD40L) .

Los factores de crecimiento o sus receptores (o de unión al receptor o partes de unión al ligando de este) se pueden incorporar en las proteínas de fusión de la invención. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus isoformas (patente estadounidense N. ° 5 194 596) , factores del crecimiento fibroblástico (FGF) que incluyen aFGF y bFGF, factor natriurético atrial (ANF) , factores de crecimiento hepático (HGFs, patentes estadounidenses N.° 5 227 158 y 6 099 841) , factores neurotróficos tal como el factor neurotrófico derivado de huesos (BDNF) , ligandos del factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (por ejemplo, GDNF, neuturina, artemina y persefina) , neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas NGF-ß (PDGF) (patentes estadounidenses N.° 4 889 919, 4 845 075, 5 910 574 y 5 877 016), factores de crecimiento de transformación (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta (WO 90/14359) , factores osteoinductivos que incluyen la proteína morfogenética ósea (BMP) , factores de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II, patentes estadounidenses N. ° 6 403 764 y 6 506 874), eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO, factor de células madre (SCF) , trombopoyetina (TPO, ligando c-Mpl) y los polipéptidos nt (patente estadounidense N.° 6 159 462).

Los ejemplos de receptores del factor de crecimiento que se pueden utilizar como restos farmacológicamente activos de la invención incluyen receptores EGF, receptores VEGF (por ejemplo, Fltl o Flkl/KDR) , receptores PDGF (WO 90/14425) , receptores HGF (patentes estadounidenses N.° 5 648 273 y 5 686 292), y receptores neurotróficos que incluyen el receptor de baja afinidad (LNGFR) , también denominado p75NTR o p75, que se une a NGF, BDNF y NT-3, y receptores de alta afinidad que son miembros de la familia trk del receptor de tirosina cinasas (por ejemplo, trkA, trkB (EP 455 460), trkC (EP 522 530) ) . f . Fármacos En otra modalidad, un agente farmacológicamente activo es una sustancia del fármaco utilizado en el tratamiento, la cura, la prevención o el diagnóstico de la enfermedad o utilizado de otra manera para mejorar el bienestar físico o mental. Los fármacos pueden ser entidades químicas y en la presente se describen más detalladamente ejemplos de las entidades.

La presente invención se puede aplicar para administrar otros agentes en el tratamiento de trastornos que afectan el sistema nervioso y también puede aplicarse a los efectos del diagnóstico. Las clases preferidas de agentes para el tratamiento de trastornos del SNC incluyen: Los fármacos que actúan en los sitios sinápticos y de unión de neuroefectores, analgésicos y anestésicos generales y locales tales como analgésicos opioides y antagonistas, hipnotizantes y sedantes, fármacos para el tratamiento de trastornos psiquiátricos tales como depresión, esquizofrenia; antiepilépticos y anticonvulsionantes, enfermedad de Huntington, envejecimiento y enfermedad de Alzheimer; agentes neuroprotectores (tales como agonistas de aminoácidos excitatorios y factores neurotrópicos) y agentes neurodegenerativos, factores tróficos tales como el factor neurotrófico derivado del cerebro, el factor neurotrófico ciliar o un factor de crecimiento nervioso, fármacos dirigidos al tratamiento de una apoplejía o trauma del SNC y fármacos para el tratamiento de la adicción o el abuso de drogas, fármacos autacoides y antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos para infecciones parasitarias y enfermedades microbianas, agentes inmunosupresores y fármacos anticáncer, hormonas y antagonistas de la hormona, metales pesados y antagonistas de metales pesados, antagonistas para agentes tóxicos no metálicos, agentes citostáticos para el tratamiento de cáncer, sustancias de diagnóstico para su uso en medicina nuclear, agentes inmunorreacti os e inmunoactivos para radioterapia, y una cantidad de otros agentes tales como transmisores y sus respectivos receptores-agonistas y antagonistas, sus respectivos precursores o metabolitos, antibióticos, antiespasmódicos , antihistaminas , antinauseoso, relajantes, estimulantes, oligonucleótidos «sentido» y «antisentido», dilatantes cerebrales, psicotrópicos, antimaníacos, constrictores y dilatadores vasculares, antihipertensivos, tratamientos para migraña, hipnotizantes, agentes hiper o hipoglicémicos , agentes nutricionales o minerales, fármacos antiobesidad, anabólicos y antiasmáticos.

Los ingredientes activos típicos (por ejemplo, fármacos) pueden ser cualquier sustancia que afecte el sistema nervioso o que se utilice en pruebas de diagnóstico del sistema nervioso. Estos son descritos por Smith et ál. (1990), Goodman and Gilman' s--The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Nueva York, e incluyen los siguientes agentes : acetilcolina y ésteres sintéticos de la colina, alcaloides colinomiméticos de origen natural y sus congéneros sintéticos, agentes anticolinesterasa, estimulantes gangliónicos , atropina, escopolamina y fármacos antimuscarínicos relacionados, fármacos simpaticomiméticos y catecolaminas, tales como epinefrina, norepinefriña y dopamina, agonistas adrenérgicos , antagonistas del receptor adrenérgico, transmisores tales como GABA, glicina, glutamato, acetilcolina, dopamina, 5-hidroxitriptamina e histamina, péptidos neuroactivos ; analgésicos y anestésicos tales como analgésicos opioides y antagonistas; medicaciones preanestésicas y anestésicas tales como benzodiazepinas , barbitúricos, antihistaminas, fenotiazinas y butilfenonas ; opioides; antieméticos; fármacos anticolinérgicos tales como atropina, escopolamina o glicopirrolato; cocaína; derivados de doral; etclorvinol ; glutetimida; metiprilón; meprobamato; paraldehído; disulfiram; morfina, fentanil y naloxona; agentes antitusivos centralmente activos; fármacos psiquiátricos tales como fenotiazinas, tioxantenos y otros compuestos heterocíclicos (por ejemplo, halperiodol) ; antidepresivos tricíclicos tales como desimipramina y imipramina; antidepresivos atípicos (por ejemplo, fluoxetina y trazodona) , inhibidores de monoamina oxidasa tales como isocarboxazid; sales de litio; ansiolíticos tales como clordiazepóxido y diazepam; antiepilépticos que incluyen hidantoínas, barbitúricos anticonvulsivantes , iminoestilbenos (tales como carbamazepina) , succinimidas , ácido valproico, oxazolidindionas y benzodiacepinas ; fármacos antiparkinson tales como L-DOPA/CARBIDOPA, apomorfina, amantadina, ergolinas, selegilina, ropinirol, bromocriptina mesilato y agentes anticolinérgicos; agentes antiespasticidad tales como baclofeno, diazepam y dantroleno; agentes neuroprotectores, tales como antagonistas de aminoácidos excitatorios , factores neurotróficos y factor neurotrófico derivado del cerebro, factor neurotrófico ciliar o factor de crecimiento nervioso, neurotrófina (NT) 3 (NT3) ; NT4 y NT5 ; gangliósidos ; agentes neurodegenerativos; fármacos para el tratamiento de adicciones y abuso de drogas que incluyen antagonistas opioides y antidepresivos; fármacos autocoides y antiinflamatorios tales como histamina, bradiquinina, calidina y sus respectivos agonistas y antagonistas; agentes quimioterapéuticos para infecciones parasitarias y enfermedades microbianas; fármacos anticancerígenos que incluye agentes alquilantes (por ejemplo, nitrosoureas) y antimetabolitos ; mostazas de nitrógeno, etilenaminas y metilmelaminas ; alquilsulfonatos ; análogos de ácido fólico; análogos de pirimidina, análogos de purina, alcaloides de la vinca; y antibióticos .

La presente invención también es útil para la administración de antinauseosos, relajantes, estimulantes, oligonucleótidos «sentido» y «antisentido», dilatadores cerebrales, psicotrópicos , constrictores y dilatadores vasculares, antihipertensivos , tratamientos de migraña, agentes hiper e hipoglicémicos, agentes minerales o nutricionales , fármacos antiobesidad, anabólicos y antiasmáticos, fármacos antiinflamatorios tales como fenilbutazona, indometacina, naproxeno, ibuprofeno, flurbiprofeno, diclofenaco, dexametasona, prednisona y prednisolona; vasodilatadores cerebrales tales como soloctidilum, vincamina, naftidrofurilo oxalato, co-dergocrina mesilato, ciclandelato, papaverina, ácido nicotínico, agentes antiinfecciosos tales como estearato de eritromicina y cefalexina, hormona adrenocorticotrópica, adenosina deaminasa ribonucleasa, alcalina fosfatasa, angiotensina, anticuerpos, arginasa, arginina deiminasa, asparaginasa, ceruleína, calcitonina, quimotripsina, colecistoquinina, factores de coagulación, dinorfinas, endorfinas, endorfinas, encefaliñas, encefaliñas, eritropoyetina, péptido liberador de gastrina, glucagón, hemoglobina, factores de liberación hipotalámica, interferón, katacalcina, motilina, neuropéptido Y, neurotensina, opioides de origen no natural, oxitosina, papaína, hormona paratiroidea, péptidos prolactina, CD-4 soluble, somatomedina, somatostatina, somatostatina, somatotropina, superóxido dismutasa, hormona estimulante de la tiroides, activador tisular del plasminógeno, tripsina, vasopresina y análogos de estos péptidos, así como otras enzimas, hormonas, proteínas, polipéptidos , conjugados de enzima-proteína, conjugados de anticuerpo-hapteno, epítopos virales adecuados, etc.

V. Ejemplos de formatos de polipéptidos En las figuras adjuntas se establecen ejemplos de formatos de moléculas de unión de la invención. Por ejemplo, las figuras la-lg incluye modalidades en las que el resto farmacéuticamente activo no está ilustrado (por ejemplo, andamiajes de FC5Fc y FcFC5 a los que se pueden agregar restos farmacéuticamente activos) , así como modalidades en las que el resto farmacéuticamente activo es un sitio de unión al anticuerpo. Por ejemplo, en una modalidad, un andamiaje de una molécula de unión de la invención (es decir, una construcción a la cual se puede agregar un resto farmacéuticamente activo) comprende dos restos de transmigración de la BBB enlazados de forma covalente (por ejemplo, fusionados genéticamente) a una región, dominio o resto Fe. Los restos de transmigración de la BBB pueden estar enlazados directamente o a través de un péptido enlazador. En una modalidad preferida, los restos de transmigración de la BBB pueden estar enlazados al N-terminal del resto, el dominio o la región Fe. En una modalidad, los restos de unión adicionales (por ejemplo, restos farmacológicamente activos distintos a TMEM30A en la forma de moléculas scFv) también pueden estar enlazados al C-terminal del resto, el dominio o la región Fe.

En otra modalidad, los restos adicionales de transmigración de la BBB pueden estar enlazados al C-terminal del resto, el dominio o la región Fe. Los restos de transmigración de la BBB pueden estar enlazados directamente o a través de un péptido enlazador.

En otra modalidad, una molécula de unión de la invención comprende un resto de transmigración de la BBB fusionado en el N-terminal al dominio VH de una molécula de anticuerpo intacta. En otra modalidad, una molécula de unión de la invención comprende un resto de transmigración de la BBB fusionado en el N-terminal al dominio VL de una molécula de anticuerpo intacta. En aun otra modalidad, una molécula de unión de la invención comprende dos restos de transmigración de la BBB fusionados en el C-terminal a una molécula de anticuerpo intacta. Los restos de transmigración de la BBB pueden estar enlazados directamente o a través de un péptido enlazador.

Se entenderá que los restos farmacéuticamente activos (o restos adicionales farmacéuticamente activos) pueden unirse a cualquiera de estas construcciones mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.

En una modalidad, los polipéptidos de la invención comprenden únicamente un resto farmacéuticamente activo (que crea una molécula que es monomérica con respecto al resto farmacéuticamente activo, pero que es multimérica (por ejemplo, dimérica) con respecto a los restos de transmigración de la BBB) . En otra modalidad, un polipéptido de la invención comprende más de un resto farmacológicamente activo, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos farmacológicamente activos. Los restos farmacéuticamente activos pueden ser iguales o diferentes.

En una modalidad de la invención, un resto farmacéuticamente activo se une de forma operativa a través de un péptido enlazador al N-terminal de un resto, una región o un dominio Fe. En otra modalidad, un resto farmacológicamente activo se une de forma operativa a través de un péptido enlazador al C-terminal de un resto, una región o un dominio Fe.

En otra modalidad, dos o más restos farmacéuticamente activos están unidos entre sí (por ejemplo, a través de un péptido enlazador) en serie. En una modalidad, la matriz en tándem de restos farmacéuticamente activos se une de forma operativa a través de un péptido enlazador ya sea al C-terminal o al N-terminal de un resto, un dominio o una región Fe.

En el campo se conocen otros métodos para conjugar, enlazar y acoplar proteínas a compuestos farmacológicamente activos. Por ejemplo, véase Wu A M, Senter P D, Arming antibodies : prospeets and challenges for immunoconjugates, Nat. Biotechnol. Setiembre de 2005; 23 (9) : 1137-46 y Trail P A, King H D, Dubowchik G M, Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cáncer, Cáncer Immunol Immunother., mayo de 2003; 52 (5) : 328-37 ; Saito G, Swanson J A, Lee K D. Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities, Adv Drug Deliv Rev. , Feb 2003. 10; 55 (2) : 199-215. Asimismo, los anticuerpos presentes pueden ser provistos en combinación con liposomas, nanopartículas u otros portadores análogos cargados con un compuesto farmacéuticamente activo. Los métodos de preparación de las composiciones son conocidos en el campo (véase, por ejemplo, Sugano et ál . , Antibody Targeting of Doxorubicin-loaded Liposomes Suppresses the Growth and Metastatic Spread of Established Human Lung Tumor Xenografts in Severe Combined Immunodeficient Mice Cáncer Research 60, 6942-6949, 15 de diciembre de 2000 y Martin et ál . , Nanomaterials in Analytical Chemistry, Analytical Chemistry News & Features, 1 de mayo de 1998; págs . 322 A-327 A) .

Muchas moléculas efectoras carecen de grupos funcionales adecuados a los cuales se puedan enlazar polipéptidos de unión. En una modalidad, una molécula efectora, por ejemplo, un fármaco o profármaco, está unida al polipéptido a través de una molécula enlazadora. En una modalidad, la molécula enlazadora contiene un enlace químico que permite la activación de la citotoxicidad en un sitio específico. Los enlaces químicos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces ácidos lábiles, enlaces fotolábiles, enlaces peptidasa lábiles, enlaces tioéter formados entre grupos sulfhidrilo y maleimida, y enlaces esterasa lábiles. Más preferentemente, la molécula enlazadora comprende un enlace disulfuro o un enlace tioéter. De conformidad con la invención, la molécula enlazadora comprende preferentemente un grupo químico reactivo. Los grupos químicos reactivos particularmente preferidos son ésteres de N-succinimidilo y ésteres de N-sulfosuccinimidilo . En una modalidad preferida, el grupo químico reactivo puede estar unido de forma covalente a la molécula efectora a través de un enlace disulfuro entre los grupos tiol . En una modalidad, se modifica una molécula efectora para que comprenda un grupo tiol. Un experto en la técnica entenderá que un grupo tiol contiene un átomo de azufre unido a un átomo de hidrógeno y al que en la técnica normalmente se hace referencia como un grupo sulfhidrilo, el cual se puede denominar como «--SH» o «RSH» .

En una modalidad, se puede utilizar una molécula enlazadora para unir una molécula efectora con un polipéptido de la invención. La molécula enlazadora puede ser escindible o no escindible. En una modalidad, la molécula enlazadora escindible es una molécula enlazadora escindible por redox, de manera que la molécula enlazadora es escindible en medios con un potencial redox menor, tal como el citoplasma y otras regiones con concentraciones más altas de moléculas con grupos libres de sulfhidrilo. Los ejemplos de moléculas enlazadoras que pueden ser escindidas debido a un cambio en el potencial de redox incluyen a aquellas que contienen disulfuros. El estímulo de escisión puede proveerse tras la absorción intracelular de la proteína de unión de la invención y el menor potencial de redox del citoplasma facilita la escisión de la molécula enlazadora. En otra modalidad, una disminución del pH genera la liberación de la carga de maitansinoide en la célula diana. La disminución del pH ocurre en muchos procesos fisiológicos y patológicos, tales como tráfico de endosomas, crecimiento tumoral, inflamación e isquemia de miocardio. El pH disminuye de un 7.4 fisiológico a un 5-6 en los endosomas o 4-5 en los lisosomas. Los ejemplos de moléculas enlazadoras sensibles al ácido que pueden ser utilizadas para dirigirse a lisosomas o endosomas de células cancerosas incluyen aquellas que tienen enlaces escindibles con ácido, tales como las que se encuentran en acétales, cetales, ortoésteres, hidrazonas, tritilos, cis-aconitilos o tiocarbamoilos (véase, por ejemplo, Willner et ál . , (1993), Bioconj . Chem. , 4: 521-7; patentes estadounidenses N.° 4 569 789, 4 631 190, 5 306 809 y 5 665 358) . Otros ejemplos de moléculas enlazadoras sensibles al ácido comprenden las secuencias dipéptido Phe-Lys y Val-Lys (King et ál . (2002), J. Med. Che ., 45: 4336-43) . El estímulo de escisión puede ser provisto tras el tráfico de absorción intracelular hasta los compartimentos endosomales con pH bajo (por ejemplo, lisosomas) . Otros ejemplos de moléculas enlazadoras escindibles con ácido son las moléculas que contienen dos o más enlaces escindibles con ácido para la unión de dos o más maitansinoides (King et ál . (1999), Bioconj. Chem., 10: 279-88; WO 98/19705).

Las moléculas enlazadoras escindibles pueden ser sensibles a los agentes de escisión suministrados de forma biológica que están asociados a una célula diana específica, por ejemplo, enzimas lisosomales o asociadas a tumores. Los ejemplos de moléculas enlazadoras que pueden escindirse de forma enzimática incluyen, de modo no taxativo, péptidos y esteres. Los ejemplos de moléculas enlazadoras escindibles con enzimas incluyen aquellas que son sensibles a proteasas asociadas a tumores tales como Catepsina B o plasmina (Dubowchik et ál . , (1999), Pharm. Ther. , 83: 67-123; Dubowchik et ál . , (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett . , 8: 3341-52; de Groot et ál . , (2000), J. Med. Chem., 43: 3093-102; de Groot et ál . , (1999)m 42: 5277-83). Los sitios de escisión con Catepsina B incluyen las secuencias dipéptido valina-citrulina y fenilalanina-lisina (Doronina et ál . , (2003), Nat. Biotech., 21(7): 778-84); Dubowchik et ál . , (2002), Bioconjug. Chem., 13: 855-69). Otros ejemplos de sitios de escisión con enzimas incluyen aquellos formados con secuencias de oligopéptidos de 4 a 16 aminoácidos (por ejemplo, Suc- ß-Ala-Leu-Ala-Leu) , los cuales son reconocidos por proteasas trouse tales como la Thimet Oliogopeptidasa (TOP) , una enzima que es preferentemente liberada por neutrófilos, macrófagos y otros granulocitos.

En determinados aspectos particulares, un polipéptido de unión de la invención es multiespecífico, por ejemplo, tiene al menos un sitio de unión que se une a una primera molécula o epítopo de una molécula y al menos un segundo sitio de unión que se une a una segunda molécula o a un segundo epítopo de la primera molécula. Las moléculas de unión multiespecífica de la invención pueden comprender al menos dos sitios de unión. En determinadas modalidades, al menos dos sitios de unión de una molécula de unión multiespecífica de la invención son sitios de transmigración de la BBB.

VI . Síntesis de las moléculas de unión Tras seleccionar el formato de un polipéptido de la invención, hay disponible una variedad de métodos para producir el polipéptido. Los métodos incluyen, de modo no taxativo, las técnicas de síntesis química y las técnicas de expresión de ADN recombinante .

En una modalidad, la invención hace referencia a una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de polipéptido de la invención. Se entenderá que como resultado de la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácido nucleico codificará cada secuencia de aminoácidos del polipéptido. El polinucleótido deseado se puede producir mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, mediante la síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de un polinucleótido preparado anteriormente que codifica el polipéptido diana) .

La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método para preparar una sustitución, inserción dentro del marco o alteración (por ejemplo, codón alterado) para introducir un codón que codifique una sustitución de aminoácidos (por ejemplo, en un resto variante de Fe) . Por ejemplo, el ADN del polipéptido de partida se altera mediante la hibridación de un oligonucleótido que codifica la mutación deseada a una plantilla de ADN de cadena simple. Luego de la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa de la plantilla que incorpora el cebador de oligonucleótidos . En una modalidad, la modificación genética, por ejemplo, mutagénesis por PCR basada en cebadores, es suficiente como para incorporar una alteración, tal como se define en la presente, con el fin de producir un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención.

Para la producción recombinante , se inserta una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido en un vehículo de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia de codificación insertada o, en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la replicación y la traducción.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido se inserta en el vector en un marco de lectura adecuado. Posteriormente, el vector de expresión se transfecta a una célula diana adecuada que expresará el polipéptido. Las técnicas de transfección conocidas en la técnica incluyen, de modo no taxativo, la precipitación con fosfato de calcio (Wigler et ál . 1978, Cell 14: 725) y la electroporación (Neumann et ál. 1982, EMBO, J. 1: 841). También se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión hospederos que se describen en la presente en las células eucariotas. En una modalidad, la célula eucariota es una célula animal, que incluye las células de mamífero (por ejemplo, células CHO, BHK, Cos, HeLa) . Cuando el polipéptido se expresa en una célula eucariota, el ADN que codifica el polipéptido también puede codificar una secuencia de señal que permitirá que el polipéptido sea segregado. Un experto en la técnica entenderá que, al traducirse la proteína, la secuencia de señal es escindida por la célula para formar el polipéptido maduro. En una modalidad, la invención hace referencia a polipéptidos maduros que comprenden un péptido enlazador de la invención. De manera alternativa, cuando no se incluye una secuencia de señal, el polipéptido puede ser recuperado mediante el lisado de células.

El polipéptido de la invención también puede ser sintetizado en un animal transgénico, tal como un roedor, una cabra, una oveja, un cerdo o una vaca. La expresión «animales transgénicos» hace referencia a animales no humanos que han incorporado un gen extraño en su genoma . Debido a que este gen está presente en tejidos germinales, se pasa de los progenitores a su descendencia. Los genes exógenos se introducen en embriones de una célula (Brinster et ál . 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 4438). En la técnica se conocen métodos de producción de animales transgénicos que incluyen transgénicos que producen moléculas de inmunoglobulina ( agner et ál . 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et ál . 1983, Cell 34: 335; Brinster et ál. 1983, Nature 306: 332; itchie et ál . 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et ál . 2003, Theriogenology 59: 831 ; Robl et ál . 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et ál . 2003, Xenotransplantation 10 (3) : 267) .

Los vectores de expresión pueden codificar las etiquetas que permiten la fácil purificación o identificación del polipéptido producido de forma recombinante . Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, el vector pUR278 (Ruther et ál. 1983, EMBO J. 2: 1791) en el cual el polipéptido que se describe en la presente y que codifica la secuencia puede estar ligado al vector en marco con la región codificante lac z de manera que se produzca una proteína híbrida; los vectores pGEX pueden utilizarse para expresar proteínas con una etiqueta de glutatión S-transíerasa (GST) . Estas proteínas son normalmente solubles y pueden ser fácilmente purificadas de las células por adsorción a perlas de glutatión-agarosa, seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (por ejemplo, PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N.

J.)) para una eliminación fácil de la etiqueta luego de la purificación .

Para los efectos de esta invención se pueden emplear numerosos y distintos sistemas de vector de expresión reconocidos en la técnica.

Estos vectores de expresión normalmente se replican en los organismos hospederos ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosomal hospedero. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias de control de expresión que incluyen, de modo no taxativo, promotores (por ejemplo, promotores heterólogos o asociados naturalmente) , elementos potenciadores , secuencias de señal, señales de corte y empalme, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción. Preferentemente, las secuencias de control de expresión son sistemas de promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospederas eucariotas. Los vectores de expresión también pueden utilizar elementos de ADN que derivan de virus de animales, tales como el virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MO LV) , citomegalovirus (CMV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosomas internos .

Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a la ampicilina, resistencia a la higromicina, resistencia a la tetraciclina o resistencia a la neomicina) para permitir la detección de esas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, Itakura et ál . , patente estadounidense 4 704 362) . Las células que tienen el ADN integrado a sus cromosomas se pueden seleccionar mediante la introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de células hospederas transfectadas . El marcador puede proporcionar prototrofía a un hospedero auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados, tales como el cobre. El gen marcador seleccionable puede estar unido directamente a las secuencias de ADN para expresarse o puede introducirse en la misma célula mediante cotransformación .

En otras modalidades preferidas, los polipéptidos de la presente invención pueden expresarse con construcciones policistrónicas . En estos sistemas de expresión, se pueden producir múltiples productos génicos de interés, tales como polipéptidos múltiples de proteína que se une a multímero a partir de una construcción policistrónica simple. Estos sistemas usan de manera ventajosa un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de polipéptidos de la invención en células hospederas eucariotas. Las secuencias IRES compatibles de describen en la patente estadounidense N.° 6 193 980 que también se incorpora a la presente. Los expertos en la técnica comprenderán que tales sistemas de expresión se pueden usar para producir eficazmente el intervalo completo de polipéptidos descritos en la presente solicitud.

Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o secuencia de ADN que codifica un polipéptido, el vector de expresión se puede introducir en una célula hospedera adecuada. Esto es, las células hospederas pueden ser transformadas. La introducción del plásmido en la célula hospedera se puede lograr mediante varias técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica. Estas incluyen, de modo no taxativo, transfección (incluyendo electroforesis y electroporación) , fusión protoplástica, precipitación de fosfato de calcio, fusión celular con ADN cubierto, microinyección e infección con virus intacto. Véase, Ridgway, A. A. G Mammalian Expression Vectors . Capítulo 24.2, pág. 470-472 Vectors, Rodríguez y Denhardt, Eds . (Butterworths , Boston, Mass. 1988). Más preferentemente, la introducción de plásmidos en el hospedero se hace mediante electroporación. Las células transformadas que alojan la construcción de expresión se cultivan en condiciones adecuadas para la producción de cadenas ligeras y cadenas pesadas y se analizan para determinar la síntesis de proteína de cadena pesada y/o ligera. Los ejemplos de técnicas de ensayo incluyen el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) , o análisis distribuido celular activado por fluorescencia (FACS) , inraunohistoquímica y similares .

Tal como se usa en la presente, el término «transformación» deberá usarse en un amplio sentido para referirse a la introducción de ADN en una célula hospedera receptora que cambia el genotipo y consecuentemente da como resultado un cambio en la célula receptora.

«Células hospederas» hace referencia a células que se han transformado con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante y codificando al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procesos para el aislamiento de polipéptidos de hospederos recombinantes, los términos «célula» y «cultivo celular» se usan de manera intercambiable para indicar la fuente de polipéptido, a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación de polipéptidos desde las «células» puede significar desde células enteras centrifugadas o desde el cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

La línea celular hospedera usada para la expresión de proteínas es más preferentemente de origen mamífero. Los expertos en la técnica tienen la capacidad de determinar preferentemente las líneas celulares hospederas particulares que son más aptas para el producto del gen deseado a ser expresado allí. Los ejemplos de líneas celulares hospederas incluyen, de modo no taxativo, a DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, sin DHFR) , HELA (cáncer de cuello de útero humano) , CVI (línea de riñón de mono) , COS (un derivado de CVI con antlgeno SV40 T) , R1610 (fibroblasto de hámster chino) , BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón) , HAK (línea de riñón de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63 -Ag3.653 (mieloma de ratón) , BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas) , RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano) . Las células CHO son particularmente preferidas. Las líneas celulares hospederas normalmente se encuentran disponibles en servicios comerciales, en la American Tissue Culture Collection o en la bibliografía publicada.

Los genes que codifican los polipéptidos de la invención pueden expresarse también en células no mamíferas, tales como bacterias o levadura o células de plantas . En lo que a esto respecta, se observará que varios microorganismos unicelulares que no son mamíferos, tales como las bacterias, también pueden transformarse, es decir, aquellos que son capaces de crecer en cultivos o fermentación. Las bacterias, que son susceptibles a la transformación, incluyen miembros de enterobacteriaceae , tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. También se observará que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos se vuelven, normalmente, parte de los cuerpos de inclusión. Los polipéptidos deben aislarse, purificarse y luego ensamblarse en moléculas funcionales.

Además de los procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas . Saccharomyces cerevisiae o levadura común de panadería es la más usada comúnmente entre los microorganismos eucarióticos pese a que comúnmente otras cepas se encuentran comúnmente disponibles. Para la expresión en Saccharomyces, comúnmente se usa el YRp7 plásmido, por ejemplo, (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et ál., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et ál . , Gene, 10:157 (1980) ) . El plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que no tiene capacidad de crecimiento en triptófano, por ejemplo, ATCC N° 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977) ) . La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de célula hospedera de levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptófano.

También pueden emplearse otros hospederos de levaduras, tales como Pichia. Los vectores de expresión de levadura que tienen secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores) , un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee. Los promotores típicos incluyen cinasa de 3 -fosfoglicerato y otras enzimas glicolíticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables por la uso de metanol, maltosa y galactosa.

De manera alternativa, las secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos se pueden incorporar en transgenes para la introducción en el genoma de un animal transgénico y la expresión posterior en la leche del animal transgénico (véase, por ejemplo, Deboer et al., US 5 741 957, Rosen, US 5 304 489 y Meade et ál . , US 5 849 992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes en unión operativa con un promotor y potenciador de un gen específico de glándula mamaria, tales como la caseína o la beta lactoglobulina .

La producción in vitro permite que el aumento proporcione grandes cantidades de los polipéptidos deseados. En la técnica se conocen métodos de cultivo a gran escala de células de mamíferos en condiciones de cultivo de tejidos e incluyen el cultivo de suspensiones homogéneas, por ejemplo, en un reactor aerotransportado o en un reactor de agitación continuo o el cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas , en microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si se necesita y/o desea, las soluciones de los polipéptidos se pueden purificar mediante los métodos de cromatografía habituales, por ejemplo filtración de gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre celulosa DEAE o cromatografía por ( inmuno) afinidad, por ejemplo, después de la biosíntesis preferencial de un polipéptido de región bisagra sintética o antes o después de la etapa de cromatografía HIC descritos en la presente. Una secuencia de etiqueta de afinidad (por ejemplo, una etiqueta His(6)) puede estar opcionalmente unida o ser incluida dentro de la secuencia de polipéptidos para facilitar la purificación posterior.

El experto en la técnica puede sintetizar fácilmente péptidos más pequeños para utilizarlos con relación a la invención. En la técnica se conocen procedimientos estándar para preparar péptidos sintéticos. Los péptidos pueden sintetizarse utilizando un método de síntesis de fase sólida (SPPS) de Merrifield (J. Am. Chem. Soc. , 85:2149 (1964), que se incorpora a la presente mediante esta referencia) o utilizando métodos de solución estándar conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Bodanzsky, M. , Principies of Peptide Synthesis, 2a edición revisada (Springer-Verlag, 1988 y 1993) , que se incorpora a la presente mediante esta referencia) . De manera alternativa, pueden utilizarse simultáneamente métodos de síntesis de péptidos múltiples (SMPS) conocidos en la técnica. Los péptidos preparados mediante el método de Merrifield pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de péptidos automatizado tal como el sintetizador de péptidos 431 A-01 de Applied Biosystems (Mountain View, Calif.) o utilizando la técnica manual de síntesis de péptidos descrita por Houghten, Proc . Na . Acad. Sci. USA 82:5131 (1985), que se incorpora en la presente mediante esta referencia.

Los péptidos se pueden sintetizar utilizando aminoácidos o análogos de aminoácidos, cuyos grupos activos se encuentran protegidos según sea necesario con, por ejemplo un grupo t-butildicarbonato (t-BOC) o un grupo fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC) . Los aminoácidos y análogos de aminoácidos pueden adquirirse en el mercado (Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtec) o sintetizarse utilizando los métodos conocidos en la técnica. Los péptidos sintetizados utilizando el método de fase sólida pueden unirse a resinas, lo que incluye 4-metilbenzhidrilamina (MBHA) , 4- (oximetil) -fenilacetamidometil y 4- (hidroximetil) fenoximetil-copoli (estireno- divinilbenceno 1 %) (resina Wang) , todos ellos disponibles en el mercado, o a un polímero de oxima p-nitrobenzofenona (resina oxima) , que puede sintetizarse tal como se describe en De Grado y Kaiser, J. Org. Chem. 47:3258 (1982) , que se incorporan a la presente mediante esta referencia .

VII. Purificación de las moléculas de unión Una vez expresados, los polipéptidos de la invención pueden purificar según métodos estándar de la técnica, lo que incluye una precipitación de sulfato de amonio, cromatografía en columna por afinidad, purificación HPLC, electroforesis en gel y similares (véase en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, Nueva York, (1982) ) . Un péptido recientemente sintetizado puede purificarse mediante un método tal como la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa ( P-HPLC) u otros métodos de separación con base en el tamaño o la carga del péptido. Adicionalmente , el péptido modificado puede caracterizarse utilizando estos y otros métodos conocidos, tales como análisis de aminoácidos y espectrómetro de masas.

Para uso farmacéutico, se prefieren las proteínas sustancialmente puras de alrededor de un 90 % a 95 % de homogeneidad, y se prefieren aún más de 98 % a 99 % o más de homogeneidad.

VIII. Métodos de administración Los métodos para preparar y administrar los polipéptidos de la invención a un sujeto son bien conocidos para el experto en la técnica o son fácilmente determinados por este.

Las composiciones para su administración a sujetos incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica a una molécula de unión de la invención (para las aplicaciones de tratamientos genéticos) así como también moléculas de polipéptidos.

Los métodos de introducción incluyen, de modo no taxativo, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los conjugados se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes farmacológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local .

En determinadas circunstancias, puede resultar deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención directamente en el sistema nervioso central mediante cualquier vía adecuada, lo que incluye inyecciones intraventriculares e intratecales ; las inyecciones intraventriculares pueden facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommaya .

También puede utilizarse la administración nasal o pulmonar, por ejemplo, mediante un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de aerosolización .

En otra modalidad, los conjugados pueden administrarse en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede usar una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et ál . , Surgety 88:507 (1980); Saudek et ál . , N. Engl . J. Med. 321:574 (1989) ) . En aun otra modalidad, puede colocarse un sistema de liberación controlada próximo al objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, haciendo necesaria solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, tomo 2, pág. 115-138 (1984) ) .

Se establecen otros sistemas de liberación controlada en la reseña de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

El sujeto es preferentemente un animal, lo que incluye, de modo no taxativo, animales tales como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etc., y preferentemente es un mamífero, y más preferentemente un ser humano.

Frecuentemente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender una solución amortiguadora (por ejemplo, solución amortiguadora de acetato, fosfato o citrato) , un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato) , opcionalmente un agente estabilizante (por ejemplo, albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros métodos compatibles con las enseñanzas de la presente, los polipéptidos pueden administrarse directamente en el lugar de la población celular adversa, aumentando de esta forma la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales tales como aceite de oliva y ásteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados . En la presente invención, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, de modo no taxativo, amortiguador de fosfato 0.01-0.1M y preferentemente 0.05 o salino al 0.8 %. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer y similares. Los conservantes y otros aditivos también pueden estar presentes como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidates , agentes quelantes y gases inertes y similares.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen dispersiones o soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. En los casos, la composición debe ser estéril y fluida de manera que exista la posibilidad de incluirla en una jeringa fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y preferentemente, debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos . El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de estos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, utilizando un recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula necesario en caso de dispersión y utilizando tensioactivos .

La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación de un compuesto activo (es decir, un polipéptido solo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con un ingrediente de los mencionados anteriormente o una combinación de estos, según sea necesario, seguido por una esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo esterilizado que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los mencionados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y liofilización, que proporcionan un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de estos previamente filtrada en condiciones esterilizadas. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se colocan en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan en condiciones asépticas de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente , las preparaciones pueden empaquetarse y venderse en forma de un kit que, preferentemente, tendrá etiquetas o prospectos que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para el tratamiento de un sujeto que padece de trastornos neoplásicos o autoinmunes, o que tiene una predisposición a ellos.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de las afecciones varían en función de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el sujeto es un ser humano pero también se pueden tratar los mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos.

La dosificación del tratamiento se puede titular usando métodos de rutina conocidos por los expertos en la técnica, para optimizar la seguridad y eficacia. En una modalidad, un polipéptido de la invención es aquel que se ha administrado anteriormente a los pacientes, pero que se ha modificado para comprender un péptido enlazador de la invención en lugar de un péptido enlazador tradicional. En tales casos, la dosificación del polipéptido administrado será consistente con aquella que se encontró anteriormente que era segura y eficaz, es decir, de referencia.

Los polipéptidos de la invención pueden administrarse en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones simples pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares tal como se indica mediante la medición de los niveles en sangre del polipéptido, el polipéptido diana o el antígeno en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración in vivo en particular. De manera alternativa, los polipéptidos se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se necesita una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varía dependiendo de la semivida del polipéptido en el paciente.

La dosificación y frecuencia de administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los polipéptidos de la invención o un cóctel de estos se administran a un paciente que todavía no se encuentra en estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente. La cantidad se define como una «dosis profilácticamente eficaz». Se administra una dosificación relativamente baja en intervalos relativamente poco frecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas.

En aplicaciones terapéuticas, a veces se necesita una dosificación relativamente alta en intervalos de dosificación relativamente cortos hasta que la evolución de la enfermedad se reduzca o finalice, y preferentemente hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad.

También se observará que las moléculas de la presente invención pueden usarse junto o en combinación con un agente o agentes (por ejemplo, para proporcionar una pauta posológica combinada) . Los agentes de ejemplo con los que puede combinarse una molécula de la invención incluyen agentes que representan la referencia actual para un trastorno particular que se esté tratando. Los agentes pueden ser de naturaleza química o biológica. El término «biológico/a» o «agente biológico» se refiere a cualquier agente farmacéuticamente activo preparado a partir de organismos vivos y/o sus productos que se indica para su uso como producto terapéutico.

Los polipéptidos de la invención pueden opcionalmente administrarse en combinación con otros agentes que son eficaces para tratar el trastorno o afección que necesita tratamiento (por ejemplo, profiláctico o terapéutico) . Tal como se usa en la presente, la administración de polipéptidos de la invención junto o en combinación con una terapia adjunta significa la administración o aplicación secuencial, simultánea, coextensiva, concurrente, concomitante o contemporánea de la terapia y los polipéptidos descritos. Los expertos en la técnica entenderán que la administración o aplicación de los varios componentes del régimen terapéutico combinado pueden programarse para mejorar la eficacia general del tratamiento. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos o biológicos pueden administrarse en tratamientos conocidos y estándar junto con las moléculas de unión del sujeto. Un experto en la técnica (por ejemplo, un médico) será capaz de discernir fácilmente regímenes terapéuticos combinados eficaces sin experimentación indebida en función de la terapia adjunta seleccionada y las enseñanzas de la presente descripción .

En una modalidad, un polipéptido puede producirse en una paciente mediante su administración como molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo mediante vector, plásmido, liposoma, inyección de ADN, electroporación, biolística, inyección intravenosa o infusión arterial hepática. En la técnica se conocen vectores para su uso en las modalidades de terapia génica.

La cantidad de agente a ser usado en combinación con los polipéptidos de la presente invención puede variar según el sujeto o puede administrarse de acuerdo con lo que se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Bruce A Chabner et ál . , Antineoplastic Agents, en GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ( (Joel G. Hardman et ál., eds., 9A ed. 1996) . En otra modalidad, se administra la cantidad de el agente consistente con el estándar de atención médica .

Como se describió anteriormente, los polipéptidos de la presente invención, pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de los trastornos en mamíferos. En este aspecto, se observará que la molécula de la presente invención puede formularse para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden un portador estéril, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como una solución salina fisiológica, soluciones amortiguadoras no tóxicas, conservantes y similares. A los efectos de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un polipéptido de la invención, conjugado o no conjugado a un agente terapéutico, significará una cantidad suficiente para lograr una unión eficaz a un antígeno y lograr un beneficio, por ejemplo, mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno o detectar una sustancia o célula. En el caso de las células tumorales, el polipéptido será, preferentemente, capaz de interactuar con antígenos inmunorreactivos en células neoplásicas o inmunor eactivas y proporcionará un aumento en la muerte de esas células. Desde luego, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en dosis individuales o múltiples para proporcionar una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido.

De acuerdo con el alcance de la presente descripción, la molécula de la invención puede administrarse a un ser humano u otro animal según los métodos de tratamiento antemencionados en una cantidad suficiente como para producir un efecto terapéutico o profiláctico.

El modo de administración y las formas de dosificación afectarán por supuesto las cantidades terapéuticas de los compuestos que son deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dada. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad necesaria para prevenir, retrasar o reducir la gravedad de la aparición de la enfermedad o una cantidad necesaria para detener o reducir la gravedad de la enfermedad en curso. Será evidente para el experto en la técnica que esta cantidad variará según los factores, tales como el peso y la salud del receptor, el tipo de células que se transforman, el modo de administración de las presentes composiciones y el tipo de trastorno médico que se trate.

La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado con el recipiente o recipientes puede haber un aviso de la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por parte del organismo de la fabricación, el uso o la venta para su administración a humanos.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deberían considerarse como taxativos. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en toda la presente solicitud se incorporan a la presente mediante referencia .

Ej emplos Expresión, purificación y caracterización de las moléculas FC5 : FC5 se expresa en E. coli y se purifica utilizando un choque osmótico para liberar la proteína soluble del espacio periplásmico . Luego se capturó un FC5 soluble marcado con His a partir del lisado en una columna de níquel, mediante intercambio catiónico en fractogel SE, y una posterior filtración con gel en superdex 200. El camélido Vhh se caracterizó mediante SDS PAGE (Figura 2a-2c) . FC5-Fc, Fc-FC5 y FC5-scram-Fc se expresaron en las líneas celulares DG44 de CHO de acuerdo con los métodos antemencionados. El hFc deseado que contiene proteínas se purificó a partir de un medio de fermentación de células CHO (1L) mediante el ajuste del pH a 7.0 y la captura de proteínas en una columna HiTrap rProteinA FF de 5ml (GE healthcare) que fue previamente equilibrada. Todas las proteínas purificadas se caracterizaron en busca de niveles de endotoxina antes de la inyección para asegurar que no ocurriera una apertura generalizada de la BBB dependiente de la endotoxina. Los resultados se muestran en la Tabla I. Los péptidos neuroactivos , Dalargin, Galanina o NPY, se unieron a la molécula deseada (FC5, FC5-Fc) utilizando succininmidil-4- (N- maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) , un enlazador químico bifuncional, utilizando los métodos descritos en Uto et ál . 1991 (Uto, I., Ishimatsu, T., Hirayama, H., Ueda, S., Tsuruta, J. , y Kambara, T. (1991) Journal of immunological methods 138(1) , 87-94) . Se sintetizó cada péptido a ser unido con un análogo de cisteamida en el C-terminal, lo que permitió el retrocruzamiento del C-terminal del péptido mediante la cisteína libre con las cadenas laterales de lisina en la proteína, mediante la química de reticulación bifuncional SMCC. Luego del retrocruzamiento, se purificó cada molécula marcada mediante filtración preparativa con gel S-200 para eliminar todo agregado formado durante la reacción de retrocruzamiento. La cantidad promedio de péptidos Dalargin, NPY o Galanina unidos a cada dominio FC5 o dominios FC5-Fc se determinó mediante espectrometría de masas. La Tabla I muestra la cantidad promedio de péptidos unidos por un dominio FC5 , FC5-Fc o Fc-FC5.

Farmacocinética circulante de moléculas que contienen FC5 : Para entender la exposición del endotelio de la BBB a cada uno de los anticuerpos que contienen FC5 , se determinó la farmacocinética de las moléculas en ratas. Se administraron dosis intraperitoneales de 3 mpk a los animales tanto con el FC5 Vhh fusionado por el N-terminal (FC5-Fc) o fusionado por el C-terminal (Fc-FC5) a un dominio Fe humano. Las concentraciones de FC5-FC o Fe-FC5 en plasma se determinaron en varios momentos mediante ELISA. Se analizaron los resultados para determinar la semivida en fase beta de cada construcción (Tabla II) . Los resultados demostraron que las semividas de FC5-Fc y de Fc-FC5 fueron significativamente más prolongadas cuando se fusionan a un Fe humano que cuando se encuentra el FC5 Vhh solo, ya que se sabe que el Fe recicla y la masa de mayor tamaño impediría la filtración en los ríñones (Holt, L. J. , Herring, C, Jespers, L. S., Woolven, B. P. y Tomlinson, I. M. (2003) Trends in biotechnology 21 (11) , 484-490).

Velocidad de transporte in vi ro de moléculas que contienen FC5 : Se utilizó una capa de células endoteliales de la BBB in vitro para modelar las velocidades de flujo cruzado de la BBB in vivo para cada proteína que contiene FC5. El modelo in vitro utiliza una monocapa de células endoteliales inmortalizadas de cerebro de rata adulta (SV-ARBEC) en un sistema de ensayo de monocapas validado para vínculos estrechos con moléculas pequeñas (Garberg, P., Ball, M., Borg, N. , Cecchelli, R. , Fenart, L. , Hurst, R. D., Lindmark, T., Mabondzo, A., Nilsson, J. E., Raub, T. J. , Stanimirovic, D., Terasaki, T., Oberg, J. 0. y Osterberg, T. (2005) Toxicol In vitro 19(3), 299-334). Los métodos para la determinación de velocidad de flujo in vitro son casi idénticos a los descritos en (Caram-Salas , N. , Boileau, E., Farrington, G. K. , Garber, E., Brunette, E., Abulrob, A. y Stanimirovic, D., Methods in molecular biology 763, ed. 2010, 383-401) . Se determinaron las velocidades de influjo para FC5, FC5-FC y Fc-FC5 a través de la capa de células SV-ARBEC y los resultados son tal y como se muestran en la Figura 3.

Afinidad de unión de las moléculas FC5 con ????30?: Se evaluó la afinidad de unión de cada molécula en ensayos de citometría de flujo fluorescente por separado utilizando células endoteliales de la BBB de rata recientemente aisladas, células endoteliales de la BBB de rata transformadas SV40 (Caram-Salas , N., Boileau, E., Farrington, G. K. , Garber, E., Brunette, E., Abulrob, A. y Stanimirovic, D., Methods in molecular biology 763, ed. 2010, 383-401) y células Hek293 transíectadas transitoriamente con T EM30A diana identificado previamente. Las curvas de unión de cada línea celular se muestran en las Figuras 4a-4c y los valores de afinidad calculados se encuentran en la Tabla III. Los resultados muestran que la unión de FC5Fc a las células endoteliales de la BBB de rata primarias tiene una afinidad de 11 nM, mientras que la unión a la línea celular transformada con SV40 tiene como resultado un valor EC50 de 75 nM, aproximadamente una unión 7 veces más débil. Si bien la unión a la línea celular Hek293 transformada transitoriamente con TMEM30A de rata tiene como resultado una afinidad de aproximadamente 1700 nM, es casi 170 veces más débil que la unión a la línea celular endotelial de la BBB primaria. Estos datos muestran que FC5-Fc presenta un aumento sustancial en la afinidad aparente de FC5 Vhh solo cuando se mide por citometría de flujo, lo que indica que FC5-Fc se une con una avidez bidentada a las células que expresan TMEM-30A.

Evaluación de eficacia en modelos animales: Para evaluar qué efectos tendría la dimerización del dominio FC5 Vhh en la habilidad de la molécula para funcionar como transportador que administre una carga molecular a través de la BBB mediante RMT, se evaluó la actividad de estas moléculas en modelos con animales. Se conoce que existen varios factores que pueden afectar la eficiencia de transporte, por ejemplo, se ha informado que el descenso de la afinidad, incluso de varias veces, de un anticuerpo receptor de antitransferrina tuvo un efecto positivo en la habilidad de la molécula de soportar eficazmente la transmigración de la BBB (Yu, Y. J. , Zhang, Y., Kenrick, M . , Hoyte, K., Luk, W., Lu, Y., Atwal, J., Elliott, J. M., Prabhu, S., Watts, R. J. y Dennis, M. S. Science translational medicine 3(84), 84ra44) . De acuerdo con este concepto, se podría predecir que una mejora significativa en la afinidad tras la dimerización de FC5 Vhh perjudicaría la capacidad de FC5 Vhh de funcionar como molécula de transporte eficaz a través de la BBB. Por lo tanto, se evaluó la potencia de las moléculas a las que se unieron los péptidos neuroactivos, cada molécula con una valencia diferente para FC5 , en un modelo in vivo.

Los modelos Hargreaves miden el aumento de sensibilidad al dolor térmico inducido por la inyección de adyuvante de Freund en una pata. El dolor térmico puede suprimirse mediante la unión de un péptido de seis aminoácidos, como Dalargin, a los receptores mu de dolor expresados en la parte periacueductal del cerebro. El Dalargin inyectado por vía intravenosa no puede traspasar la BBB y no tiene como resultado la eliminación del dolor. Sin embargo, la inyección ICV permite que el Dalargin se disperse en los receptores mu y bloquee los receptores mu, y de este modo también bloquee el dolor. Por lo tanto, el Dalargin inyectado por vía intravenosa debe estar unido a un transportador mediado con un receptor para permitir que se transporte a través de la BBB y que se elimine el dolor. Para evaluar el transporte de Dalargin mediado por moléculas que contienen FC5 a través de la BBB, se utilizó el modelo animal de Hargreaves para comparar la potencia de las diferentes formas moleculares de FC5 Vhh unido a Dalargin. La molécula de control negativo para FC5-Dalargin fue EG2-Dalargin y para FC5-Fc-Dalargin fue Fe-FC5-Dalargin.

Para asegurar la comparabilidad de los artículos de prueba negativo y positivo, se caracterizaron FC5-Dal y EG2-Dal mediante espectrometría de masas para demostrar que la relación de péptidos Dalargin unidos a cada Vhh era comparable (Tabla I) .

Antes de la inyección intravenosa (IV) se analizó cada molécula mediante inyección intracerebroventricular (ICV) como control positivo para asegurar que todas las moléculas unidas fueran funcionalmente activas y capaces de inducir la eliminación del dolor. Se espera que tanto las moléculas de control positivo como las de control negativo eliminen el dolor tras la inyección ICV ya que las moléculas se inyectan directamente en el líquido cefalorraquídeo cerebral y son capaces de dispersarse en los receptores mu periacueductales de dolor y bloquearlos. En todos los casos, cuando se evaluó la inyección ICV de FC5-Dal, EG2-Dal , FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal o Dalargin solo se obtuvo una potencia similar según la cantidad de Dalargin administrado. Luego, se evaluó cada molécula marcada con Dalargin y la correspondiente proteína de control marcada con Dalargin para determinar la eficacia tras la administración IV. Inicialmente , se comparó la eficacia de FC5-Dal en oposición al control (EG2-Dal) . Los resultados muestran que se logró una eliminación total del dolor, similar al nivel de eliminación que puede observarse con morfina sola (Figura 5a y 5b) . Cabe destacar que tres dosis de 7.5 mg por kg (mpk) por dosis de FC5-Dal según se necesite antes de observar la eliminación total del dolor. Adicionalmente , el grupo de control no presentó eliminación del dolor, incluso luego de que los animales recibieran dosis en forma similar tres veces a 7.5 mg por kg (mpk) . Estos datos demuestran y confirman que FC5 es capaz de funcionar como transportador mediado por receptores que transporta Dalargin a través de la BBB hacia la parénquima cerebral y permite que el Dalargin se una y bloquee los receptores mu de dolor, al tiempo que el control EG2 -Dalargin no presentó eliminación del dolor. Estos datos se resumen en la Tabla IV.

Las formas dimerizadas de FC5 , FC5-Fc y Fc-FC5, demostraron afinidades de unión por TMEM 30A muy diferentes en las células endoteliales de la BBB (Tabla III) . Para determinar si la afinidad mejorada tuvo correlación con la potencia mejorada en el modelo de dolor de Hargreaves, se evaluaron tanto FC5-Fc-dal como Fc-FC5-dal para determinar la eliminación del dolor. Luego de la inyección IV, Fc-FC5-dal no resultó eficaz (Figuras 6a-6d) , mientras que FC5-Fc-dal (Figuras 7a y 7c) fue altamente eficaz en la eliminación del dolor. Adicionalmente , el control negativo Fc-Dal no fue eficaz in vivo (Figuras 7b y 7d) . FC5-Fc fue eficaz en la reducción del dolor dentro de la primera hora, incluso con una primera dosis inicial a 0.5 mpk, con un promedio 50 % MPE luego de la primera 0.5 hora. La comparación de la potencia de FC5-dal con los resultados de FC5-Fc-dal demostró que una dosis individual de 21 mpk de FC5-dal proporcionó aproximadamente el mismo nivel de eliminación que 0.5 mpk de FC5-Fc-Dal. Según la relación molar del Dalargin inyectado, 1 el FC5Fc-Dal presenta aproximadamente unas 80 veces más potencia que FC5-Dal en cuanto a su capacidad para eliminar el dolor en el modelo de Hargreaves. Una segunda dosis de FC5-Fc-Dal de 2.5 mpk fue suficiente para proporcionar el máximo posible de eliminación de dolor en un animal. La actividad biológica mejorada observada de FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal y FC5-Dal que se observó en el modelo de dolor de Hargreaves guarda correlación con una afinidad y una eficacia más elevadas de FC5-Fc, tal como se resume en la Tabla II.

Adicionalmente , la eficacia similar en cuanto a la eliminación del dolor puede lograrse utilizando otros péptidos neuroactivos . Por ejemplo, la Galanina, un péptido de 3.2 kD de 29 aminoácidos unido a FC5 o FC5-Fc con una química idéntica a la descrita anteriormente, eliminó el dolor crónico en el modelo de Hargreaves. En oposición, la Galanina unida al Fe solo no pudo proporcionar un alivio eficaz para el dolor. En la Tabla VI se resumen los resultados tanto para el control positivo por ICV como para las inyecciones IV. Para validar la actividad de la Galanina unida de unión de sus receptores cognados GalRl y GalR2 y la eliminación el dolor tanto en el control negativo como en las moléculas de ensayo, se analizaron todas las moléculas y se observó que se eliminó el dolor luego de la inyección ICV (Tabla VI) . Cuando se inyecta en forma IV, solo la Galanina unida a las moléculas que contienen FC5, ya sea FC5 o FC5-Fc, fue capaz de eliminar el dolor in vivo. Hubo una diferencia significativa en la dosificación de Galanina unida a FC5 en comparación con FC5-Fc necesaria para reducir el dolor en el modelo animal de Hargreaves. Una dosis individual de 6 mpk de Galanina-FC5 (Tabla VI) tuvo como resultado un 8 % MPE, al tiempo que una dosis individual de FC5-Fc-Gal tuvo como resultado un 45 % MPE.

La administración intraperitoneal de pentilentetrazol (PTZ) induce convulsiones en las ratas y se utilizó como modelo de episodios epilépticos (Chen, J.W.; Naylor, D.E.; Wasterlain, C.G., Advances in the pathophysiology of status epilepticus. Acta Neurol . Scand. Suppl . , 2007, 186, 7-15.; Werner, F.M.; Coveñas, R. Neuropeptides involved in schizophrenia, Curr. Top . Neurochem. , 2005, 4, 35-49.; Werner, F.M. ; Coveñas, R. In: Focus on Neuropeptide Research, Coveñas, Mangas y Narváez, Eds . ; Transworld Reasearch Network: Trivandrum, 2007; págs . 299-339; Werner, F.M.; Coveñas, R. , Classical neurotransmiters and neuropeptides involved in major depression. Int. J. Neurosci., 2010, 120, 455-70) . Es sabido que los péptidos neuroactivos tales como la Galanina y el neuropéptido Y proporcionan protección contra ataques inducidos por PTZ (Mazarati 1998a,- Mazarati, A M., Hohmann, J. G. , Bacon, A, Liu, H. , Sankar, R. , Steiner, R. A, Wynick, D. et ál . , Modulation of hippocampal excitability and seizures by galanin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, 2000, 20(16), 6276-81.). Mazarati et ál . (Mazarati A, Liu H, Soomets U, Sankar R, Shin D, Katsumori H, Langel U, Wasterlain CG, Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus. J Neurosci 1998, 18:10070-10077) . Estos estudios demostraron que la disminución de la galanina del hipocampo de las ratas se asocia con el desarrollo de un status epileticus autosuficiente . Además, la inyección de Galanina en la región del hipocampo cerebral puede eliminar ataques (Mazarati A, Liu H, Soomets U, Sankar R, Shin D, Katsumori H, Langel U, Wasterlain CG Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus . J Neurosci 1998, 18:10070-10077; Mazarati AM, Halaszi E, Telegdy G Anticonvulsive effects of galanin administered into the central nervous system upon the picrotoxinkindled seizure syndrome in rats. Brain Res 1992, 589:164-166). Sin embargo, los péptidos neuroactivos administrados de forma intravenosa no pueden atravesar la BBB y tienen una semivida breve debido a su pequeño tamaño (Jain, Kamal y Batra. Trends Biotechnol. Tomo 25. ed. : 2007:307-16, Batra, Jain, ittel, Chauhan y Colcher. Curr Opin Biotechnol., Tomo 13. ed. : 2002:603-8). Se evaluó la eficacia de la galanina en el modelo de PTZ mediante el análisis de la galanina unida tanto a FC5 , el anticuerpo de dominio simple, como a FC5-Fc. Si bien se espera que ambas construcciones mejoren el transporte a través de la BBB, la construcción de FC-5-Fc demostró en la presente un aumento en la afinidad práctica debido a una ávida unión a su diana putativa TMEM30A y tuvo una semivida mucho más prolongada debido al aumento de tamaño y el reciclaje que depende de Fe.

En el modelo de ataques inducidos por PTZ, el agente de interés se inyecta ya sea por IV o mediante inyección directa en el hipocampo. La inyección en el hipocampo administra el agente directamente al sitio de acción lo cual permite a la galanina unir sus receptores cognados y bloquear la aparición del ataque. Adicionalmente , la inyección directa al hipocampo de cada molécula sirve como control positivo para demostrar que la galanina unida a cada molécula, Fe, FC5 o FC5-Fc, conserva actividad supresora de ataques. Las dosis de cada molécula administrada variaron para proporcionar dosis de galanina con una molaridad casi equivalente. Para el estudio del control positivo, las ratas istar macho (4-6 semanas de vida) recibieron una inyección dentro del hipocampo de uno de los siguientes: ácido valproico, Gal-Cya o FC5-Gal en un volumen final de 5 uL, con una posterior inyección IP luego de 15 minutos de 50 mpk de PTZ para inducir los ataques.

Para evaluar la eficacia de la galanina unida a FC5, FC5-Fc o Fe para atravesar la BBB, se inyectó cada una de estas moléculas sistemá icamente tal como se detalla en la Figuras 7a y 7b. Para el estudio sistémico, las ratas recibieron 1, 2 o 3 inyecciones intravenosas (mediante la vena de la cola) de Gal-Cya o FC5-Gal, o una dosis individual de FC5-Fc-Gal o de Fc-Gal. En cada caso, luego de administrarse la inyección IP de PTZ a una dosis de 50 mpk intraperitonealmente , se registraron los movimientos de las ratas durante 30 minutos.

Luego, todos los movimientos registrados fueron revisados y un investigador objetivo midió el tiempo de aparición de los ataques y el tiempo de duración de estos para cada uno de los tres cambios de comportamiento característicos: primeros espasmos mioclónicos (FMJ; que se caracterizan por espasmos en oídos, cabeza y hombros) , la primera convulsión crónica (FCJ; que se caracteriza por ataques menores, ciónos de los músculos de la cabeza y extremidades anteriores, movimientos involuntarios de todo el cuerpo y movimientos de salto con reflejo para enderezarse) y primera extensión tónica generalizada (TGE; que se caracteriza por la pérdida de la habilidad de enderezarse, flexión o extensión de las extremidades anteriores y posteriores y ciónos de todo el cuerpo) .

La Tabla Vlla muestra los resultados para las inyecciones dentro del hipocampo de cada molécula. La inyección IP de 50mpk de PTZ tuvo como resultado una rápida aparición de cada tipo de convulsión, raioclónica, clónica y tónica generalizada con avance muy rápido del FMJ menos grave a la forma de ataque tónico generalizado más grave. El ácido valproico, una pequeña molécula conocida por eliminar parcialmente la aparición de los ataques inducidos por PTZ (Pollack G.M., Shen D.D. J Pharmacol Methods . (1985) 13 de abril, 13 (2) : 135-46) retrasó significativamente los tres tipos de ataques, pero no previno completamente la aparición de los ataques, con aproximadamente un retraso de 100 segundos en la aparición de los ataques mioclónicos y clónicos observados. La inyección de galanina sola dentro del hipocampo o unida a FC5 tuvo como resultado una demora significativa de los ataques mioclónicos y una prevención total de ataques clónicos más graves y tónicos generalizados.

Los resultados obtenidos con la dosificación intravenosa de cada molécula se muestran en la Tabla VIIb. PTZ lleva a una rápida aparición de cada tipo de ataque y el ácido valproico a 11.2 mpk en dosis IV elimina la aparición de los ataques mioclónicos y clónicos. La galanina y galanina-Fc intravenosa, versiones de semivida corta y larga del péptido neuroactivo, tuvieron como resultado un retraso nulo o muy pequeño en la aparición de los ataques, respectivamente. La FC5-galanina dosificada a 6 mpk, 1 hora antes de la dosificación de PTZ tuvo como resultado un retraso significativo de los ataques mioclónicos y una eliminación total de los ataques clónicos y tónicos generalizados. Una dosis individual de FC5-galanina dos horas antes de la dosificación de PTZ también tuvo como resultado un retraso significativo de los ataques mioclónicos y una eliminación total de los ataques clónicos y tónicos generalizados .

Pueden extraerse varias conclusiones a partir de estos resultados. La galanina unida a FC5, Fe o FC5-Fc conserva una actividad equivalente a la que se muestra cuando se dosifica por ICV en el modelo de Hargreaves (Tablas IV & V) . Adicionalmente, la Tabla Vlla muestra que la FC5-galanina presentó una actividad equivalente en cuanto a su molaridad con respecto a la galanina sola cuando se inyecta en el hipocampo de las ratas en el modelo de ataques inducidos por PTZ. En oposición, la galanina sola o como molécula de vida prolongada unida a una molécula hFc no atraviesa efectivamente la barrera hematoencefálica y elimina los ataques inducidos por PTZ. Solo cuando se une a FC5, ya sea FC5-galanina o FC5-Fc-galanina, es que la galanina es capaz de atravesar la BBB y retrasar eficazmente y eliminar los ataques inducidos por PTZ. La galanina unida a FC5-Fc es mucho más eficaz que la galanina unida a FC5 sola en la disminución de ataques según una comparación de dosificación molar; específicamente, es al menos dieciséis veces más potente. Adicionalmente, la galanina FC5-Fc presentó un mayor retraso de tiempo en la aparición del primer ataque mioclónico cuando se comparó con FC5 -galanina . Estos resultados indican que la semivida mejorada y el aumento de afinidad práctica de FC5-Fc para su diana mejora la administración de galanina a través de la BBB y esto tiene como resultado una reducción más eficaz de los ataques en el modelo de ataques inducidos por PTZ que en el modelo de FC5 galanina .

Tabla I. Caracterización de las moléculas expresadas y purificadas (1) contiene un marcador myc EQKLISEEDL, de C- terminal (1202 peso molecular) , 5H marcado con His en el C-terminal (2) los dominios Fe son IgGl humanos y agly (todos los dominios Fe contienen una mutación puntual T299A en la secuencia hlgG para eliminar la N-glicosilación de Fe) (3) evaluado por MS, para determinar la cantidad promedio de Dalargin unido covalentemente a los dominios FC5-Fe.

Tabla II. Determinaciones de la semivida farmacocinética de los dominios FC5 fusionados a hFc.

Se determinó la semivida mediante detección ELISA de los Fe humanos en suero de rata o con moléculas marcadas con AL680 y se determinó la fluorescencia a partir de sueros. No se observó diferencia alguna entre las moléculas en las que se determinó la semivida mediante fluorescencia en función de ELISA. Las moléculas se inyectaron intraperitonealmente a 3 mpk .

Tabla III. Resumen de las afinidades de unión y eficacia relativa de FC5-Dal, FC5-Fc-Dal y Fc-FC5-Dal en el modelo de Hargreaves, que muestra la correlación de la eficacia y la afinidad respecto a las células endoteliales de la BBB.

Tabla IV. Resumen de la eliminación de dolor crónico en modelo de Hargreaves mediante Dalargin solo o unido a FC5 La eliminación del dolor crónico se expresa como el porcentaje del máximo efecto posible (% MPE) . El valor se basa en el área bajo la curva de eliminación del dolor del animal con respecto a la pata de control contralateral durante el período de tiempo de medición. La eficacia de las moléculas inyectadas ya sea por ICV o IV se muestra como un porcentaje del máximo efecto posible (% MPE) en el modelo de Hargreaves. A20.1 y EG2 son anticuerpos de dominio simple que no se relacionan con FC5, que no tienen una afinidad aparente con las células endoteliales de la BBB. Las dosis en mpk para los valores de dosificación intravenosa (IV) se indican por inyección y luego por el número de inyecciones.

Tabla V. Resumen de la eliminación del dolor crónico en el modelo de Hargreaves mediante la unión de Dalargin a Fe o la unión de Dalargin a FC5-Fc.

En el segundo experimento se inyectó una dosis IV de FC5-Fc sin unión antes de la adición de FC5-Fc-Dal en las concentraciones indicadas.

Tabla VI. Eliminación del dolor crónico en el modelo de Hargreaves mediante la unión de Galanina tanto a Fe, FC5-Fc o FC5.

En el caso de las dosis múltiples para FC5-Gal, las dosis se espaciaron 1 hora. En el tercer experimento se inyectó por IV una dosis IV de FC5-Fc sin unión antes de la adición de FC5-Fc-Dal en las concentraciones indicadas.

Tabla VII. Comparación del tiempo respecto a la aparición de la convulsión utilizando una inyección en el hipocampo (a) o una inyección IV (b) en el modelo de ratas PTZ a) Inyección en el hipocampo. b) Inyección intravenosa.

Luego de la dosificación IP de las ratas con PTZ se analizó el tiempo de aparición para cada tipo de ataque que se indica a continuación: FMJ, FCJ y TGE. Los tipos de ataques se describen más detalladamente supra. (a) PTZ administrado IP establece el tiempo de control para cada tipo de ataque. La inyección en el hipocampo de ácido valproico, galanina o FC5 -galanina antes de la inyección IP de PTZ establece el efecto máximo que cada una de estas moléculas puede tener en el momento de cada tipo de ataque; (b) la dosificación IV de ácido valproico, el control positivo, galanina (1 3 dosis de inyección, cada dosis con 1 hora de diferencia completada 45 minutos antes de la dosificación de PTZ) o FC5-galanina (1 x 3 dosis, cada dosis con 1 hora de diferencia completada 45 minutos antes de la dosificación de PTZ) , FC5-Fc-Gal o Fc-Gal, ambos dosificados 2 horas antes de la inyección IP de PTZ, mide el efecto que cada una de estas moléculas puede tener tras la dosificación IV. Fc-Gal sirve como control negativo ya que la molécula carece del fragmento de FC5 F(ab), pero tiene un PK in vivo similar a FC5-Fc.

Sec. 1: La secuencia de FC5-agly (T299A)hFc. (pEAG2345) DVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT G FRQAPGKEREFVSRITW GGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATP LR^/DYWGKGTQVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCrWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE Y TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sec. 2: La secuencia de agly (T299A) hFc-FC5. (pEAG2403) EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRWSVLTVLHQD LNG EYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAK TVYLQMNSL KPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDY GKGTQVTVSS Sec. 3: La secuencia desordenada de FC5-agly (T299A)hFc (pYL605) EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQG VFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPGKEREFVSRIT GGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL KPEDTADYYCAADAGSTGSYGSFDY GKGTQVTVSS Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar usando solamente la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Se pretende que tales equivalentes estén comprendidos en las siguientes reivindicaciones .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una molécula de unión caracterizada porque comprende al menos un agente farmacológicamente activo y al menos un sitio de unión con TMEM30A, donde al menos un sitio de unión que se une a TMEM30A se fusiona i) directamente o ii) a través de una secuencia de aminoácidos interviniente al N-terminal de un resto Fe.

2. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende al menos dos sitios de unión.

3. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos un sitio de unión comprende la secuencia de aminoácidos FC5.

4. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos un sitio de unión consta de la secuencia de aminoácidos FC5.

5. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende al menos dos sitios de unión que se unen a TMEM30A.

6. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende al menos tres sitios de unión que se unen a TME 30A.

7. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende al menos cuatro sitios de unión que se unen a TMEM30A.

8. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un sitio de unión a TMEM30A es genéticamente fusionado directamente al resto Fe.

9. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un sitio de unión a TMEM30A es genéticamente fusionado directamente al resto Fe mediante una secuencia interviniente de aminoácidos que comprende un enlazador peptídico.

10. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un sitio de unión a TMEM30A es genéticamente fusionado al resto Fe mediante una secuencia interviniente de aminoácidos que consta de un enlazador peptídico.

11. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque dos sitios de unión a TMEM30A se fusionan al N-terminal de dos restos Fe diferentes de una región Fe completa mediante una secuencia de aminoácidos que comprende un enlazador peptídico.

12. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un sitio de unión a T EM30A es genéticamente fusionado al N-terminal de una molécula scFc .

13. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un agente farmacológicamente activo se fusiona al C-terminal de la región Fe.

14. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un agente farmacológicamente activo es una entidad química pequeña.

15. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la entidad química pequeña se fusiona a la molécula de unión en un residuo de cisteína .

16. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el residuo de cisteína es un residuo de cisteína modificado genéticamente.

17. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un agente farmacológicamente activo es un polipéptido.

18. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque al menos un agente farmacológicamente activo es un sitio de unión al antígeno.

19. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el sitio de unión al antígeno deriva de un anticuerpo de unión a una molécula distinta a TMEM3O .

20. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el agente farmacológicamente activo se selecciona del grupo que consta de una molécula scFv, una molécula Fab y un anticuerpo de dominio simple.

21. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un agente farmacológicamente activo se encuentra genéticamente fusionado a la molécula de unión.

22. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un agente farmacológicamente activo se encuentra unido covalentemente a la molécula de unión.

23. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio de unión se encuentra genéticamente fusionado mediante una secuencia interviniente de aminoácidos que comprende el dominio VH de una molécula de anticuerpo.

24. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio de unión se encuentra genéticamente fusionado mediante una secuencia interviniente de aminoácidos que comprende el dominio VL de una molécula de anticuerpo.

25. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque al menos un sitio de unión a TME 30A se encuentra genéticamente fusionado al N-terminal de un dominio VH de una molécula de anticuerpo intacta .

26. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque al menos un sitio de unión a TMEM30A se encuentra genéticamente fusionado al N-terminal de un dominio VL de una molécula de anticuerpo intacta .

27. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dos sitios de unión se fusionan genéticamente al N-terminal de un dominio VH y un dominio VL de una molécula de anticuerpo intacta.

28. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 23 o 24, caracterizada porque la secuencia interviniente de aminoácidos comprende adicionalmente un enlazador peptídico.

29. La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente farmacéuticamente activo se selecciona del grupo que consta de un péptido neuroactivo, una entidad química pequeña y una región variable de un anticuerpo que se une a una diana en el sistema nervioso central.

30. Un método para tratar un trastorno neurológico caracterizado porque comprende administrar la molécula de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29 a un sujeto.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno neurologico es un trastorno de almacenamiento.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno neurologico es un dolor crónico .

33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno neurologico es epilepsia .

34. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno neurologico es esclerosis múltiple.

35. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno neurologico es un proteinopatía .

36. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno es un trastorno desmielinizante .

37. El uso de una molécula de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurologico.