KR20240119868A - 키메라 tim4 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20240119868A
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cancer
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다니엘 마크 코리
브랜든 시에니비츠
수닐 토마스
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세로 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim4 수용체 분자를 포함하도록 변형된 숙주 세포, 및 이러한 수용체 분자 및 변형된 세포를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

키메라 TIM4 수용체 및 이의 용도
전자 서열 목록에 대한 언급
전자 서열 목록(200265_41801WO_SequenceListing.xml; 크기: 266,847바이트; 및 생성일: 2022년 7월 28일)의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
항원에 노출 시, 나이브 항원-특이성 T 세포는 동족 항원(예를 들어, 종양 세포)을 발현하는 세포를 사멸할 수 있는 기능성 효과기 T 세포로의 클론 확대, 분화, 및 발달을 촉진하는 활성화를 겪는다. 항원 제거 후 대부분의 효과기 T 세포는 아팝토시스(apoptosis)를 겪고, 살아남은 효과기 T 세포의 일부는 항원 재-노출에 대한 장기간 보호를 부여할 수 있는 기억 T 세포로 분화한다. 그러나 항원에 장기간 노출되면 T 세포가 고갈(exhaustion)되어 종양 세포가 지속될 수 있다. T 세포 고갈은 면역 체크포인트(checkpoint) 분자(예를 들어, PD-1, CTLA-4, Tim-3)의 상향조절된 발현, 손상된 효과기 기능, 불충분한 증식 및 대사 결함을 특징으로 하는 지속적인 TCR 자극을 경험하는 T 세포에 의해 획득된 기능 장애 상태를 지칭한다. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 T 세포도 또한 고갈을 유발할 수 있다.
한 양태에서, 본 개시내용은 단쇄 키메라 단백질(single chain chimeric protein)을 포함하는 키메라 Tim4 수용체를 제공하며, 상기 단쇄 키메라 단백질은 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain); (b) CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 TLR2 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체의 세포외 도메인은 선택적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, (b) 세포내 신호전달 도메인으로서, 여기서 상기 세포내 신호전달 도메인이 (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 제1 CD28 세포내 신호전달 도메인, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 제2 TLR2 TIR 세포내 신호전달 도메인, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제3 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인; 또는 (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 제1 CD28 세포내 신호전달 도메인, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제2 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 제3 TLR2 TIR 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 CD28 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 18, 또는 아미노산 1-24가 없는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 19, 또는 아미노산 1-24가 없는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다.
본원은 또한 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector), 및 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포를 제공한다.
본원은 또한 선택적으로 추가 치료제와 함께, 대상체(subject)를 치료하는 방법을 위한 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포의 사용 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 암을 치료하는데 사용된다.
도 1A-1D: T 세포 항원 제시 기능을 평가하기 위한 시험관내 공-배양 시스템은 CD3ζ 신호전달 도메인(및 선택적으로 CD28 신호전달 도메인)에 부가된 TLR 세포내 신호전달 도메인과 함께 키메라 Tim4 수용체를 함유하는 T 세포의 부가가 항원 제시 세포(APC)로서 작용하는 향상된 능력을 나타냄을 도시한다. 도 1A: pCTX247(본원에서는 CER247로도 지칭됨) 및 pCTX1107(본원에서는 CER1107 또는 CER1236으로도 지칭됨) 키메라 Tim4 수용체 및 항원 제시 능력을 평가하기 위해 E7 펩티드로 펄스화되고 E7-특이적 T 세포와 공-배양된 pCTX1107 T 세포의 개략도. 도 1B: E7-특이적 증식 반응이 E7 펩티드로 펄스화된 자기유래 CER-T(TLR 함유 또는 비-함유 CER)의 존재 하에서 6일 후 CT 바이올렛 염료 희석에 의해 측정되었다. 도 1C: TLR-2 ICD(pCTX1107)의 부가는 E7-특이적 TCR의 증식 반응을 촉발한 반면, 비-TLR 함유 CER은 덜 자극적이었다. 모든 데이터는 FACS에 의해 수집되었다. 세포 추적은 항-마우스 TCRb를 사용하는 E7 TCR-T 세포를 나타낸다. E7 TCR-T 세포는 공-배양 시 CT 바이올렛으로 표지되었다. 도 1D: 세포 추적 바이올렛 저 E7 TCRb+ 세포의 염색에 기반한 유세포 분석에 의해 측정된 살아있는 CD3+ 세포 중 배양물 중에서 증식된 E7 TCR 세포의 백분율.
도 2: CD3ζ 신호전달 도메인(및 선택적으로 CD28 신호전달 도메인)에 TLR 세포내 신호전달 도메인이 부가된 키메라 Tim4 수용체를 함유하는 T 세포는 자기유래 E7-특이적 T 세포 반응의 강한 자극인자이다. CER-T 세포를 E7 펩티드로 펄스화하고 자기유래 E7 특이적 T 세포 반응을 촉발하는 능력에 대해 시험하였다. T 세포 활성화 마커인 CD25는 CER-T 세포에 E7 펩티드를 펄스화한 지 24시간 후에 E7 TCR-T 세포에서 평가되었다. CER-T pCTX1107은 TLR-2 세포내 도메인(ICD)을 포함하고 있으며 E7 특이적 활성화를 강하게 자극한다.
도 3: CD3ζ 신호 전달 도메인(및 선택적으로 CD28 신호 전달 도메인)에 TLR 세포내 신호 전달 도메인이 부가된 키메라 Tim4 수용체를 함유하는 T 세포는 자기유래 E7 특이적 T 세포 반응의 강한 자극인자이다. CER-T 세포를 E7 펩티드로 펄스화하고 자기유래 E7 특이적 T 세포 반응을 촉발하는 능력에 대해 시험하였다. T 세포 활성화에 대한 초기 마커인 CD69는 CER-T 세포에 E7 펩티드를 펄스화한 지 24시간 후에 E7 TCR-T 세포에서 평가되었다. CER-T pCTX1107은 TLR-2 세포내 도메인을 포함하고 있으며 E7 특이적 활성화의 강한 자극인자이다.
도 4: 항-Tim-4 항체를 사용한 확고한 세포 표면 키메라 Tim4 수용체 발현 및 검출. 키메라 Tim4 수용체 세포 표면 염색은 형질도입 후 5일차에 항-Tim-4 항체(9F4)를 사용하여 평가되었다. pCTX1107에는 TLR-2 세포내 서열이 포함되어 있다. 렌티바이러스 카세트에는 p2A 단편에 이어서 절두된 EGFRt 폴리펩티드가 포함되어 있다.
도 5A-5C: pCTX131 CER-T 세포는 효능있는 CD1928z CAR-T 세포를 향상시킨다. 도 5A: CD1928z CAR-T 세포에 대한 반응으로 JeKo-1 MCL 세포에 대한 Ptd-Ser 유도의 동역학. JeKo-1 MCL 세포를 효과기:표적 비를 증가시키면서 공-배양하고 시간 경과에 따른 Ptd-Ser 유도를 평가하였다. 동역학 곡선은 Ptd-Ser 결합 단백질인 rTim-4에 결합하는 생육성 JeKo-1 표적의 백분율을 나타낸다. 도 5B 상단: JeKo-1 세포를 pCTX184(1928z) + pCTX131, pCTX184 + CTX156 대조용 T 세포 또는 pCTX184 세포 단독과 1:1 T 세포:JeKo-1 비로 48시간 동안 공-배양하였다. CTX184 + CER 131로 처리된 샘플은 CTX184 단독으로 처리된 샘플 또는 CTX184 + CTX156 대조용 T 세포와 비교했을 때 ~2일 후 배양물에서 종양 세포가 실질적으로 더 적음을 나타내었다. 모든 데이터는 FAC를 통해 수집되었다. 도 5B 하단: 48시간 공동 배양 후 남은 JeKo-1 세포의 계산을 위한 전형적인 흐름도. 도 5B 상단: 남아있는 JeKo-1 세포의 막대 그래프 계산에 사용된 도 5B 하단으로부터의 원 흐름 데이터. 도 5C: JeKo-1 세포를 pCTX184(1928z) + pCTX131, pCTX184 + CTX156 대조용 T 세포 또는 pCTX184 세포 단독과 함께 0.5:1 T 세포:JeKo-1 비로 48시간 동안 공-배양하였다. CTX184 + CER 131로 처리된 샘플은 CTX184 단독 또는 CTX184 + CTX156 대조용 T 세포로 처리된 샘플과 비교하여 증가된 IFN-γ 분비를 나타내었다.
도 6A-6B: pCTX131 키메라 Tim4 수용체-T 세포는 효능있는 CD1928z CAR-T 세포를 향상시킨다. CD1928z CAR-T(pCTX184, CAR184라고도 함) + pCTX131 키메라 Tim4 수용체-T 세포의 혼합물을 평가하는 세포독성 반응. 도 6A: pCTX131 키메라 Tim4 수용체-T 세포를 CD1928z CAR-T 세포(pCTX184)와 다양한 비로 조합하고 JekO-1 세포 수를 시간 경과에 따라 정량화하였다. 도 6B: 카스파제 3/7 반응. 모든 데이터는 incucyte를 통해 수집되었다.
도 7A-7B: 키메라 Tim4 수용체를 함유하는 TLR-2인 pCTX133은 난소암 모델에서 니라파립의 효능을 향상시킨다. 도 7A: 표면 PtdSer의 유세포 분석 측정. 쿠라모치(Kuramochi) 세포를 1.56 또는 25 μM 니라파립 또는 동량의 DMSO(대조용)로 처리하였다. 48시간 후 샘플을 트립신 처리하고 Tim4-Fc를 사용하여 염색한 다음 Tim4-Fc에 대한 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 염색하였다. 도 7B: 1.56 μM 니라파립으로 ~20시간 동안 전-처리된 쿠라모치 세포를 pCTX133 및 공여자(32)로부터의 형질도입되지 않은 CD4 T 세포와 2:1 T 세포:쿠라모치 비 및 1.56 μM의 니라파립 최종 농도로 공-배양하였다. 니라파립 + pCTX133으로 처리한 샘플은 니라파립 단독으로 처리한 샘플 또는 니라파립 + 형질도입되지 않은 T 세포로 처리한 샘플과 비교할 때 ~3일 후 배양물에서 종양 세포가 실질적으로 더 적음을 나타내었다. 모든 데이터는 IncuCyte를 통해 수집되었다.
도 8A-8B: 혈액학적 악성종양에 대한 키메라 Tim4 수용체-T 세포 + BTK 억제제(이브루티닙) 조합. 도 8A: 이브루티닙은 표적 세포에서 포스파티딜세린의 발현을 유도한다. 도 8B: BTK 억제제 소분자와 조합된 상승적 키메라 Tim4 수용체-T 세포 매개된 세포 사멸. 이브루티닙 존재 하에 3:1, 2:1 및 1:1 E:T로 공-배양된 CTX136(Tim4-CD28-CD3z) T 세포는 빈 벡터 형질도입된 세포 또는 이브루티닙 처리 단독과 비교하여 사멸이 실질적으로 증가한 것으로 나타났다.
도 9A-9B는 다양한 키메라 Tim4 수용체 작제물(construct), pCTX1183, pCTX1161, pCTX1189, pCTX1184, pCTX1163, pCTX1162, pCTX1190, pCTX1186, pCTX1187, pCTX1164, pCTX1185 및 pCTX1165를 사용한 Jurkat 세포의 형질감염을 도시한다. 도 9B는 형질감염되지 않은 세포에 대해 정규화된다.
도 10은 키메라 Tim4-T 세포에 의한 항원 제시에 의해 매개되는 HPV E7 TCR T 세포의 활성화가 항-HLA-1 항체에 의해 차단된다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 11은 설계된 다양한 키메라 Tim4 수용체(본원에서는 키메라 삼킴 수용체(CER)로도 지칭됨)를 도시한다. SP = 신호 펩티드; TMD = 막관통 도메인.
도 12A-12B는 24시간(도 12A) 및 48시간(도 12B)에 이브루틴 처리에 의한 REC-1 및 JEKO-1 세포에서 포스파티딜세린 노출 유도를 도시한다.
도 13A-13D는 이브루티닙 처리 후 CER T 세포에 의한 REC-1 세포의 식세포 활성(phagocytic activity)을 도시한다. 도 13A: CER1234, CER1161 및 CER1183 T 세포에 의한 pHrodo 레드-표지된 REC-1 표적 세포의 삼킴(engulfment)을 나타내는 전형적인 유세포 분석 히스토그램. 도 13B: CER1234, CER1161 및 CER1183 T 세포에 의한 pHrodo 레드-표지된 REC-1 표적 세포의 삼킴을 보여주는 유세포 분석 데이터의 그래픽 요약. *P<0.01, **P<0.001, ***P<0.0001; 평균 + SD, n = 4. 도 13C: CER1234, CER1161 및 CER1183 T 세포에 의한 pHrodo 레드-표지된 REC-1 표적 세포의 삼킴을 보여주는 전형적인 형광 현미경검사 이미지(40x). 도 13D: 삼켜진(engulfed) pHrodo-그린-표지 REC-1 종양 단편이 리소-추적자 레드-표지된 리소솜에 공동-국소화된다.
도 14A-14B: REC-1 세포에 대한 이브루티닙에 의한 CER1183 및 CER1234 T 세포의 세포독성 활성. 도 14A: 비히클 전-처리 후 +/- 0.5 μM 이브루티닙. 도 14B: μM 이브루티닙 전-처리 후 +/- 0.5 μM 이브루티닙.
도 15A-15B: CER1183 및 CER1234 T 세포 및 REC-1 표적 세포의 이브루티닙 처리된 공-배양물에서 T 세포 활성화의 세포 표면 마커의 유도. 왼쪽에서 오른쪽으로 막대 그래프로 묘사된 샘플, 형질도입되지 않은, CER-1183 및 CER-1234. 도 15A: 공-배양물에서의 PD-1 발현. 도 15B: 공-배양물에서의 4-1BB 발현.
도 16A-16H: CER1183 및 CER1234 T 세포 및 REC-1 표적 세포의 이브루티닙-처리된 공-배양물에서 사이토카인의 유도. 왼쪽에서 오른쪽으로 막대 그래프로 표시된 샘플, 형질도입되지 않은, CER-1183 및 CER-1234. 도 16A: TNFα 유도. 도 16B: IL-2 유도. 도 16C: IFNγ. 도 16D: IL-5 유도. 도 16E: IL-6 유도. 도 16F: IL-10 유도. 도 16G: IL-4 유도. 도 16H: 그랜자임 B 유도.
도 17A-17B: CER1236 T 세포의 발현. CER1236 T 세포는 형질도입 후 6일차에 형질도입된 T 세포에서 Tim4를 쉽게 발현한다.
도 18: CER T-세포 특성. 상단 그래프: 위에서 아래로 기억 T 세포 하위집합: Temra, Tem, Tcm, 나이브.
도 19A-19C: CER T 세포는 무-세포 시험관내 시스템에서 포스파티딜세린 관여에 반응하여 활성화되고 IFN-γ를 생성한다. 도 19A: 포스파티딜세린(PS)에 반응하여 IFN-γ 생성. IFN-γ 생성은 PS로 자극된 CER-1236 및 CER-1234 T 세포에서 유도되었지만(도 19A), 포스파티딜에탄올아민(PE)에 의해서는 그렇지 않았다(도 19B). 공여자(38) 및 (41)의 CER-1234 및 CER-1236에 대한 PS EC50 값은 하기와 같았다: CER-1234, 각각 3.52 ㎍/㎖(SE ± 0.13) 및 1.88 ㎍/㎖(SE ± 0.48); CER-1236, 각각 4.74 ㎍/㎖(SE ± 0.02) 및 3.16 ㎍/㎖(SE ± 0.09). 도 19C: CER1236 T 세포는 시험관내에서 반복적 자극이 가능하다. 첫 번째 자극 후 24시간-휴지에 이어서 표시된 시점에서 3회 연속 자극을 통한 반복적 IFN-γ 유도.
도 20: pHrodo 염료-표지된 종양 세포 식세포작용(phagocytosis) 및 세포내이입(endocytosis)의 FAC 및 영상화-기반 검출.
도 21: CER1236 T 세포는 Jeko1 TMEM30A-/- 세포의 삼킴 증가를 나타낸다(왼쪽 패널 - 형광 현미경검사 이미지; 오른쪽 패널 식균 지수(phagocytic index) 값).
도 22: CER1234 또는 CER1236 T 세포는 incucyte 분석에 의해 측정된 Jeko1 TMEM30A-/- MCL 세포에 대해 세포독성 기능을 나타낸다.
도 23: CER1236 T 세포는 이브루티닙과 상승작용하여 REC-1 MCL 세포의 사멸을 향상시킨다.
도 24: 이브루티닙-유도된 포스파티딜세린 노출은 CER1234 T 세포 사이토카인 반응을 향상시킨다(IFN-γ - 왼쪽 그래프; 그랜자임 B - 오른쪽 그래프; 형질도입되지 않은 왼쪽 샘플, CER-1234 오른쪽 샘플).
도 25A-25B: CER1236 T 세포는 HLA-I 의존적 방식으로 종양 세포-유래 E7 항원의 제시를 통해 E7 TCR T 세포를 활성화시킨다. 도 25A: E7 종양단백질 양성/PS-양성 SCC152 표적 세포와 공-배양 후, CER-1236(형질도입되지 않은 T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포는 아님)은 E7 TCR 세포에서 HLA-DR을 유도하였다. 도 25B: 별도의 실험에서, E7 종양단백질 양성/PS-양성 SCC152 세포와 CER-1236과의 공-배양 후 E7 TCR 세포상의 HLA-DR의 유도는 HLA-I 차단 항체에 의해 차단되었지만 대조용 아이소타입 항체에서는 그렇지 않았다. 막대는 활성화 마커인 HLA-DR을 발현하는 E7 TCR T 세포의 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 26: CER1236 T 세포는 MCL 이종이식편(Jeko1 TMEM30A-/- 세포)에서 항종양 효과를 매개한다(왼쪽 위). 오른쪽 상단 그래프는 생체내 확장 데이터를 나타낸다. 하단 그래프는 세포독성 데이터를 나타낸다.
도 27A-27B는 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체, CER-1234 및 CER1236의 개략도(도 27A); 및 PARP 억제제 처리된 난소암 세포와의 공-배양에서 키메라 Tim4 수용체의 면역 표현형을 평가하기 위해 설정된 분석 설정의 개략도(도 27B)를 나타낸다. CER-1234 및 CER1236은 세포외 Tim4 결합 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 신호전달 도메인, TLR2 신호전달 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 가지며, 키메라 Tim4 수용체 작제물에서 신호전달 도메인의 배향(orientation)을 나타낸다. Tim4 세포외 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인 및 Tim4 신호전달 도메인을 갖는 대조용 분자 CER-1183도 묘사되어 있다.
도 28은 공여자 T 세포에 CER-1234, CER-1236 및 대조용 CER-1183을 형질도입시켜 생성된 다양한 T 세포 생성물, 감염 다중도(MOI) 및 CER+인 T 세포%를 나타낸다.
도 29A-29C는 키메라 Tim4 수용체 형질도입 T 세포, 올라파립 또는 니라파립, 및 표적 A2780 난소암 세포의 120시간의 공-배양에서 Tim4+ T 세포(CER-1234, CER-1236 또는 대조용 CER-1183으로 형질도입된 T 세포)에서 CCR7+ 발현 세포의 %를 나타낸다. 막대 그래프의 샘플은 왼쪽에서 오른쪽으로: A2780 + T 세포, A2780 + T 세포 + 니라파립, 및 A2780 + T 세포 + 올라파립. 도 29A는 공여자(41)로부터의 Tim4+ T 세포에서의 CCR7 발현을 나타낸다. 도 29B는 공여자(38)로부터의 Tim4+ T 세포에서의 CCR7 발현을 나타낸다. 도 3C는 공여자(45)로부터의 Tim4+ T 세포에서의 CCR7 발현을 나타낸다. 도 29A-29C의 경우, 공-배양 조건 A2780+T 세포; A2780 + T 세포 + 니라파립; A27080 + T 세포 + 올라파립은, 각 공여자 T 세포 샘플에 대한 막대 그래프에서 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다.
도 30A-30C는 키메라 Tim4 수용체 형질도입 T 세포, 올라파립 또는 니라파립, 및 표적 A2780 난소암 세포의 공-배양 120시간째의 CD4/CD8 T 세포 비를 나타낸다. 막대 그래프의 샘플은 왼쪽에서 오른쪽으로: A2780 + T 세포, A2780 + T 세포 + 니라파립, A2780 + T 세포 + 올라파립. 도 30A는 공여자(41)로부터의 T 세포에서의 CD4/CD8 T 세포 비를 나타낸다. 도 30B는 공여자(38)로부터의 T 세포에서의 CD4/CD8 T 세포 비를 나타낸다. 도 30C는 공여자(45)의 T 세포에서 CD4/CD8 T 세포 비를 나타낸다. 도 4A-4C의 경우, 공-배양 조건 A2780+T 세포; A2780 + T 세포 + 니라파립; A27080 + T 세포 + 올라파립이 각 공여자 T 세포 샘플에 대한 막대 그래프에서 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다.
도 31A-31B: PARP 억제제는 A2780 난소암 세포에서 포스파티딜세린을 유도한다. 96시간째에 니라파립 또는 올라파립(둘 다 0.25 내지 6 μM)으로 처리된 A2780 세포의 생존율(도 31A) 및 포스파티딜세린(PS) 노출(도 31B).
도 32: CER T-세포 특성.
도 33A-33C: CER T 세포는 무-세포 시험관내 시스템에서 포스파티딜세린 결합에 반응하여 활성화되고 IFN-γ를 생성한다. 도 33A: 포스파티딜세린(PS)에 반응하여 IFN-γ 생성. IFN-γ 생성은 PS로 자극된 CER-1236 및 CER-1234 T 세포에서 유도되었지만(도 33A), 포스파티딜에탄올아민(PE)에 의해서는 그렇지 않았다(도 33B). 공여자(38) 및 (41)의 CER-1234 및 CER-1236에 대한 PS EC50 값은 하기와 같았다: CER-1234, 각각 3.52 ㎍/㎖(SE ± 0.13) 및 1.88 ㎍/㎖(SE ± 0.48); CER-1236, 각각 4.74 ㎍/㎖(SE ± 0.02) 및 3.16 ㎍/㎖(SE ± 0.09). 도 33C: CER1236 T 세포는 시험관내에서 반복적 자극이 가능하다. 첫 번째 자극 후 24시간 휴지에 이어서 표시된 시점에서 3회 연속 자극을 통한 반복적 IFN-γ 유도.
도 34A-34C: PARP 억제제와 조합된 CER T 세포는 A2780 세포에 대해 세포독성이다. 도 34A: A2780 세포의 증식 감소는 2명의 공여자에 대해 CER 및 PARPi와의 공-배양 후 120시간째에 관찰되었으며 incucyte로 측정되었다. 도 34B: 120시간째에, 처리되지 않은 A2780 샘플과 비교하여 처리된 샘플에 남아 있는 세포의 비를 도 34A로부터의 incucyte 데이터를 사용하여 정량화하였다. 도 34C: 공-배양 분석에서 CER T 세포의 증식.
도 35A-35C: PARP 억제제 처리된 A2780 난소암 세포와의 공-배양에 대한 반응으로 CER T 세포에 의한 사이토카인 생성. 샘플 왼쪽부터 오른쪽으로: 약물 없음, 니라파립 처리, 올라파립 처리. 도 35A - IFN-γ. 도 35B - TNF-α. 도 35C - 그랜자임 B.
도 36A-36B: CER1236 T 세포는 HLA-I 의존적 방식으로 종양 세포-유래된 E7 항원의 제시를 통해 E7 TCR T 세포를 활성화시킨다. 도 36A: E7 종양단백질 양성/PS-양성 SCC152 표적 세포와의 공-배양 후에, CER-1236(형질도입되지 않은 T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포는 아님)은 E7 TCR 세포에서 HLA-DR을 유도하였다. 도 6B: 별도의 실험에서, E7 종양단백질 양성/PS-양성 SCC152 세포와 CER-1236과의 공-배양 후 E7 TCR 세포상의 HLA-DR의 유도는 HLA-I 차단 항체에 의해 차단되었지만 대조용 아이소타입 항체에서는 그렇지 않았다. 막대는 활성화 마커인 HLA-DR을 발현하는 E7 TCR T 세포의 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 37: 이브루티닙-유도된 포스파티딜세린 노출은 CER1236 T 세포 IFN-γ 반응을 향상시킨다. 형질도입되지 않은 세포에 대해서는 반응이 나타나지 않았다. JeKo-1 MCL mCherry+ 세포를 20 μM 이브루티닙 또는 비히클로 48시간 동안 전-처리하였다. 그런 다음 Jeko-1 MCL 세포를 0.5 μM 이브루티닙 또는 비히클과 함께 무혈청 배지 + 200 IU/㎖ IL-2에서 CER1236 T 세포와 공-배양하였다. 120시간 후, ELLA 자동화 ELISA를 사용하여 IFN-γ 분비를 측정하였다.
도 38: CER1236 T 세포는 이브루티닙-처리된 REC-1 MCL 세포에 대해 향상되고 더 완전한 세포독성 효과를 가지지만, 처리되지 않은 REC-1 MCL 세포에는 그렇지 않았다.
도 39: 100 nM 오시메르티닙 또는 비히클로 전-처리한 후 CER1236 T 세포와 공-배양한 세포에 대한 NSCLC H1975 세포 성장을 나타내는 그래프.
도 40: 100 nM 오시메르티닙 또는 비히클과 함께 NSCLC H1975 세포와 공-배양된 CER1236 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 나타내는 그래프(왼쪽에서 오른쪽으로: 그랜자임 B, TNFα, IL-6 및 IFNγ).
도 41: 시간 경과(48시간, 96시간, 120시간 및 144시간)에 걸쳐 정량화 비드를 사용한 정량적 유세포 분석에 의해 결정된 전체 CD3+ T 세포(형질도입되지 않은 + 비히클, 형질도입되지 않은 + 오시메르티닙, CER1236 + 비히클, CER1236 + 오시메르티닙)의 확대 배수를 나타내는 막대 그래프.
도 42: 비히클 또는 오시메르티닙(4m88 nM, 19.53 nM)으로 전-처리된 H1975 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포(상단 열) 또는 CER1236 T 세포(하단 열)를 사용한 공-배양 실험에서 CD3+ 세포(y축) 및 H1975 세포(x축)를 측정하는 유세포 분석 플롯.
도 43은 CER1236 T 세포의 반복적인 포스파티딜세린 자극에 의한 자극에 대한 반응으로 CER1236 재활성화를 측정하고 IFNγ 생성을 측정하기 위한 분석 설계를 묘사하는 개략도이다.
도 44는 적정 용량의 플레이트-결합된 포스파티딜세린에 반응하여 3명의 공여자로부터의 CER1234 T 세포(왼쪽) 또는 CER1236 T 세포(오른쪽)에서의 IFNγ 생성을 나타내는 그래프이다.
도 45는 증가하는 용량의 플레이트-결합된 포스파티딜세린에 반응하여 공여자에 의한 CER1234 T 세포 또는 CER1236 T 세포에서의 IFNγ 생성을 나타내는 그래프이다.
도 46은 해동 후 14일차에 증가하는 용량의 플레이트-결합된 포스파티딜세린에 대한 반응으로 공여자에 의한 CER1234 T 세포 또는 CER1236 T 세포에서의 IFNγ 생성을 나타내는 그래프이다.
도 47은 증가하는 용량의 플레이트-결합된 포스파티딜세린에 대한 반응으로 CER1236 T 세포에서 T 세포 확장(왼쪽), IFNγ 생성(중앙) 및 세포 생존율(오른쪽)을 나타내는 그래프이다.
도 48은 증가하는 용량의 플레이트-결합된 포스파티딜세린에 대한 반응으로 CER1234 T 세포에서 T 세포 확장(왼쪽), IFNγ 생성(중앙) 및 세포 생존율(오른쪽)을 나타내는 그래프이다.
도 49는 항원 제시 실험에 사용된 예시적인 키메라 Tim4 작제물의 설계를 묘사하는 개략도이다.
도 50은 유세포 분석에 의해 측정된 T 세포 활성화 마커 CD25(왼쪽) 및 HLA-DR(오른쪽)을 측정하는 막대 그래프를 나타낸다. CER1183, CER1161, CER1234 또는 CER1236 T 세포를 단독으로 배양하거나 포스파티딜세린-양성 HPV E7 종양단백질-양성 세포(TMEM30A-/- SCC152)와 48시간 동안 배양한 다음, T 세포를 양성 선택하고, 세포 추적 바이올렛 표지된-HPV E7 TCR T 세포와 함께 4일 동안 공-배양하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 51은 유세포 분석에 의해 측정된 T 세포 활성화 마커 HLA-DR을 측정하는 막대 그래프를 나타낸다. CER1183, CER1161, CER1234 또는 CER1236 T 세포를 단독으로 배양하거나 포스파티딜세린-양성 HPV E7 종양단백질-양성 세포(TMEM30A-/- SCC152)와 48시간 동안 공-배양한 다음, T 세포를 양성 선택하고 4일(도 51, 왼쪽 그래프) 또는 6일(도 51, 오른쪽 그래프) 동안 세포 추적 바이올렛 표지된-HPV E7 TCR T 세포와 공-배양하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 52는 유세포 분석에 의해 측정된 T 세포 활성화 마커 CD25(왼쪽) 및 HLA-DR(오른쪽)을 측정하는 막대 그래프를 나타낸다. CER1183, CER1161, CER1234 또는 CER1236 T 세포를 단독으로 배양하거나 포스파티딜세린-양성 HPV E7 종양단백질-양성 세포(TMEM30A-/- SCC152)와 48시간 동안 배양한 다음, T 세포를 양성 선택하고, 세포 추적 바이올렛 표지된-HPV E7 TCR T 세포와 함께 4일 동안 공-배양하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 53은 유세포 분석에 의해 측정된 T 세포 활성화 마커 HLA-DR을 측정하는 막대 그래프를 나타낸다. CER1183, CER1161, CER1234 또는 CER1236 T 세포를 단독으로 배양하거나 포스파티딜세린-양성 HPV E7 종양단백질-양성 세포(TMEM30A-/- SCC152)와 48시간 동안 배양한 다음, T 세포를 양성 선택하고, 세포 추적 바이올렛 표지된-HPV E7 TCR T 세포와 함께 6일 동안 공-배양하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 54는 유세포 분석에 의해 측정된 T 세포 활성화 마커 CD25(왼쪽) 및 HLA-DR(오른쪽)을 측정하는 막대 그래프를 나타낸다. CER1183, CER1161, CER1234 또는 CER1236 T 세포를 단독으로 배양하거나 포스파티딜세린-양성 HPV E7 종양단백질-양성 세포(TMEM30A-/- SCC152)와 48시간 동안 배양한 다음, T 세포를 양성 선택하고, 세포 추적 바이올렛 표지된-HPV E7 TCR T 세포와 함께 4일 동안 공-배양하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
한 양태에서, 본 개시내용은 키메라 삼킴(engulfment) 수용체(CER)로도 지칭되는 키메라 T 세포 면역글로불린 뮤신(mucin) 단백질 4(Tim4) 수용체를 제공한다. 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 키메라 Tim4 수용체-변형 숙주 세포(예를 들어, T 세포)에 삼킴 및/또는 세포독성 활성을 부여하며, 이때 세포독성 활성은 키메라 Tim4 수용체가 그의 표적 항원인 포스파티딜세린에 결합할 때 유도된다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 변형된 숙주 세포(예를 들어, T 세포)에 삼킴, 세포독성 및 향상된 항원 포획, 항원 가공 및 항원 제시 활성을 부여한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체는 단쇄 키메라 단백질을 포함하며, 상기 단쇄 키메라 단백질은 (a) (i) Tim4 IgV 도메인 및 Tim4 뮤신 도메인을 포함하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 세포내 신호전달 도메인(여기서 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM) 함유 신호전달 도메인, 공동자극 신호전달 도메인; 및 TLR 신호 전달 도메인을 포함한다)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체의 세포외 도메인은 선택적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 단쇄 키메라 단백질을 포함하고, 상기 단쇄 키메라 단백질은 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 TLR2 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체의 세포외 도메인은 선택적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 단쇄 키메라 단백질을 포함하고, 상기 단쇄 키메라 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 막관통 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, (c) CD3ζ 신호전달 도메인 및 (d) TLR2 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 이러한 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 단쇄 키메라 단백질을 포함하고, 상기 단쇄 키메라 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 막관통 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, (c) TLR2 신호전달 도메인, 및 (d) CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 이러한 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, T 세포와 같은 숙주 세포에서 발현되는 경우, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 또한 숙주 세포에 삼킴 활성을 부여한다. 예를 들어, 이러한 특정 구현예에서, 숙주 세포에서 발현된 키메라 Tim4 수용체의 포스파티딜세린 표적에의 결합은 숙주 세포에 의한 세포용해 및 삼킴 반응 둘 다를 유도할 수 있다. 본원에 기재된 변형된 숙주 세포의 특정 구현예에서, 숙주 세포는 키메라 Tim4 수용체에 의한 변형 이전에 삼킴 표현형을 자연적으로 나타내지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체에 의해 변형된 숙주 세포를 예를 들어 암 치료를 위해 표면 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 표적 세포의 제거 방법에 사용할 수 있다. 정상적이고 건강한 세포에서 포스파티딜세린은 원형질막의 내부 소엽(inner leaflet)에 위치한다. 그러나 손상, 아팝토시스, 괴사 및 스트레스와 같은 특정 세포 사건은 포스파티딜세린을 세포 표면에 빠르게 노출시키는 "스크램블라제(scramblase)"를 활성화하여 Tim4와 같은 수용체에 결합할 수 있다. 내인성 종양 특이적 효과기 T 세포는 세포용해 동안 표적 종양 세포 의 외막에 포스파티딜세린의 노출을 유도할 수 있다. 더욱이, 특정 암 요법(예를 들어, 화학요법, 분자 표적요법, 방사선요법, CAR-T 세포 등)은 아팝토시스, 세포 스트레스, 세포 손상 등을 유도함으로써 표적 종양 세포 또는 종양 미세환경의 세포상에서 포스파티딜세린의 노출을 유도할 수 있다. 본원에 개시된 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 조작된 숙주 세포는 표면 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 종양 세포에서 아팝토시스를 유도함으로써 표면 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 손상되거나, 스트레스를 받거나, 세포자멸성 또는 괴사성인 종양 세포를 제거할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 아팝토시스 유도 및 삼킴에 의해 표면 노출된 포스파티딜세린을 함유하는 손상되거나, 스트레스를 받거나, 세포자멸성 또는 괴사성인 종양 세포를 제거한다. 본 설명에 따른 키메라 Tim4 수용체를 포함하는 조작된 숙주 세포는 대상체에게 단독으로 투여되거나, 또는 예를 들어 CAR-T 세포, TCR, 항체, 방사선요법, 화학요법, 분자 표적요법, 소분자, 종양 용해성 바이러스, 전기 펄스 요법(electric pulse therapy) 등을 포함한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체에 의해 변형된 숙주 세포는 효과기 반응(effector response)(예를 들어, 종양 특이적 면역 반응)을 향상시키기 위한 방법에 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체로 변형된 숙주 세포는 항종양 효능(예를 들어, 종양 수송, 확장 및 지속성)을 향상시키는 방법에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체의 구현예는 포스파티딜세린 결합 시 적어도 하나의 공동자극 신호전달 경로를 통해 T 세포를 공동자극할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체는 적어도 2개의 별개의 신호전달 경로를 통해 공동자극 신호를 제공한다. 특정 구현예에서, 향상된 효과기 반응은 향상된 T 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포독성 활성, 지속성 또는 이들의 임의의 조합이다. 본 설명에 따른 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 대상체에게 단독으로 투여되거나, 또는 예를 들어 CAR-T 세포, TCR, 항체, 방사선요법, 화학요법, 소분자, 종양 용해성 바이러스, 전기 펄스 요법 등을 포함한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용의 키메라 Tim 4 수용체로 변형된 숙주 세포는 면역 세포 고갈을 억제하거나 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포 고갈은 T 세포 고갈, NK 세포 고갈, 또는 둘 다를 지칭한다. 종양 세포는 종종 보조자극 리간드 없이 면역 세포에 지속적인 항원 자극을 제공할 수 있으며, 이는 면역 세포 고갈을 초래할 수 있다(예를 들어, 증식 능력 감소, 효과기 기능 감소 및 면역억제 분자의 상향 조절). 화학요법, 분자 표적요법, 방사선요법, CAR-T 세포 요법 등과 같은 암 요법은 공동 자극 신호가 없거나 공동 자극 신호의 강도 또는 지속기간이 제한되는 경우 장기간 항원 자극을 제공할 수도 있다. 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 포스파티딜세린 결합 시 적어도 하나의 공동자극 신호전달 도메인을 통해 면역 세포를 공동자극할 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 적어도 2개의 별개의 신호전달 경로를 통해 공동자극 신호를 제공한다. 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 단독으로, 또는 예를 들어 CAR-T 세포, TCR, 항체, 방사선요법, 화학 요법, 소분자, 종양 용해성 바이러스, 전기 펄스 요법 등을 포함한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체로 변형된 숙주 세포(예를 들어, T 세포)는 향상된 항원 포획, 항원 가공 및/또는 항원 제시 활성을 나타낸다. 키메라 Tim4 수용체의 식세포 수용체 부분에 대한 리간드 결합은 T 세포 활성화, 신호 전달, 세포 용해 기능, 사이토카인 및 케모카인 생성, 표적 세포의 부분 삼킴, 및 표적 세포 항원의 제시로 이어지는 하류 전사 프로그램을 포함한 일련의 사건을 매개한다. 성숙한 다클론 T 세포와 같은 비- 또는 약한 식세포 면역 세포에서 키메라 Tim4 수용체의 발현은 표적 세포 단편의 삼킴을 통해 항원 특이적 포획을 가능하게 하고 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 매개 항원 포획의 추가된 기능성은 프라이밍된 종양 세포 표적에 대해 직접적인 세포용해 활성을 유도하는 동시에 비-표적 항원의 향상된 제시를 지원한다.
본 설명에 따른 키메라 Tim4 수용체 및 세포 면역요법, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 포함하는 병용 요법 조성물 및 방법의 경우, 키메라 Tim4 수용체 및 세포 면역요법제(예를 들어 CAR 또는 TCR)는 별도의 조작된 세포에서 발현되거나 동일한 조작된 세포에서 발현되어 이중특이성, 다기능 조작된 세포를 생성할 수 있다. 동일한 조작된 세포에서 발현된 키메라 Tim4 수용체 및 세포 면역요법제는 별도의 벡터에서 발현되거나 다시스트론 작제물과 동일한 벡터에서 발현될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체로 변형된 숙주 세포를 사용하여 세포 스트레스, 손상, 괴사 또는 아팝토시스를 유도하는 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다. 예를 들어 특정 치료제, 예를 들어 화학요법, 암과 관련된 특정 운전자 돌연변이 억제제(예를 들어, BRAF 억제제, EGFR 억제제, ALK/ROS1 키나제 억제제, BTK 억제제, PARP 억제제와 같은 분자 표적요법), 방사선요법, UV 광선요법, 전기 펄스 요법, 입양 세포 면역요법(예를 들어, CAR-T 세포, TCR) 및 종양 용해성 바이러스 요법은 종양 세포 또는 질병에 걸린 세포에서 세포 손상 또는 사멸을 유도할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 세포는 임의의 하나 이상의 이러한 치료제로 인해 발생하는 손상되거나 죽어가는 세포의 외부 소엽에 노출된 포스파티딜세린 부분에 결합하여 표적 세포의 세포용해를 유도하거나 세포용해 및 삼킴을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 난관암(fallopian cancer), 복막암(peritoneal cancer), 전립선암(prostate cancer), 폐암(lung cancer), 또는 흑색종(melanoma)인 암을 앓고 있는 대상체에서 CCR7+ 발현 T 세포를 향상시키는 방법을 제공하며, 방법은 상기 대상체에게 유효량의 본 설명에 따른 키메라 Tim4 수용체 및 (ii) 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서 키메라 Tim4 수용체는 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인 (b) CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 TLR2 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다. 케모카인 수용체 CCR7은 초기 분화 상태의 T 세포, 예를 들어 나이브, 줄기세포 기억(TSCM) 및 중심 기억(TCM) T 세포에서 발현된다. 치료용 T 세포에 대한 초기 전임상 연구는 나이브 및 초기 분화 T 세포가 장기간 지속성을 위한 향상된 능력을 보유하고 효능있는 항종양 반응을 유도할 수 있음을 입증하였다. 따라서 CCR7 키메라 Tim4 수용체 T 세포를 향상시키는 것은 생체내 생착 및 지속성을 향상시킬 가능성이 높다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 유방암, 난소암, 결장직장암, 난관암, 복막암, 전립선암, 폐암 또는 흑색종인 암을 앓고 있는 대상체에서 CD4/CD8 T 세포 비를 향상시키는 방법을 제공하며, 방법은 상기 대상체에게 유효량의 본 설명에 따른 키메라 Tim4 수용체 및 선택적으로 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인 (b) CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 TLR2 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다. CD4 T 세포는 헬퍼 기능으로 알려져 있으며 사이토카인 생성을 통해 CD8 T 세포 활성을 향상시켜 세포용해 활성을 유발한다. 그러나 CD4 T 세포(키메라 항원 수용체(CAR))를 사용한 입양 세포 요법은 시험관내 및 생체내 모두에서 표적 종양 세포를 직접 사멸시키는 데 있어서 필적하는 유효성을 입증하였다. CD4 T 세포(CAR)를 이용한 입양 세포 요법은 초기에 더 느린 그랜자임 B 분비 및 종양 사멸을 보여주지만, CD4 CAR T 세포에 항원 노출 후 비교적 더 양호한 지속성을 부여하는 CD8 대응물에 비해 활성화 유도된 세포사 및 고갈 경향이 적다. 따라서, 키메라 Tim4 수용체 입양 세포 요법을 위한 CD4 T 세포 하위집합의 향상은 개선된 지속성과 적은 고갈을 제공할 가능성이 높다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 키메라 Tim 수용체를 발현하는 숙주 세포는 아팝토시스 유도 및 삼킴에 의해, 표면 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 손상되거나, 스트레스를 받거나, 세포자멸성 또는 괴사성인 종양 세포를 제거한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 키메라 Tim 수용체에 의해 변형된 숙주 세포를 사용하여 세포 스트레스, 손상, 괴사 또는 아팝토시스를 유도하는 PARP 억제제의 효과를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, PARP 억제제의 투여는 표면 포스파티딜세린의 수준을 증가시켜 상승작용적 조합을 초래할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 키메라 Tim 수용체를 발현하는 세포는 PARP 억제제의 투여로 인해 손상되거나 죽어가는 세포의 외부 소엽에 노출된 포스파티딜세린 부분에 결합하여 표적 세포의 세포용해, 또는 세포용해 및 삼킴을 모두 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 키메라 Tim4 수용체를 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 억제제와 함께 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 치료 방법을 제공한다. 키메라 Tim4 수용체는 키메라 Tim 수용체, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 포함하는 조작된 숙주 세포를 포함하는 조성물로서 투여될 수 있으며, 상기 벡터의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 선택적으로 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. PARP 억제제는 치료 용량 미만(subtherapeutic dosage)으로 투여될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 키메라 Tim4 수용체 및 PARP 억제제를 포함하는 약학 조성물 또는 조합을 제공한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 유용한 키메라 Tim4 수용체는 키메라 Tim4 수용체-변형된 숙주 세포(예를 들어, T 세포)에 삼킴, 세포독성 및/또는 항원 제시 활성을 부여하며, 이때 세포독성 활성은 키메라 Tim4 수용체의 그의 표적 항원인 포스파티딜세린에 결합시 유도된다. PARP 억제제와 같은 DNA 손상제는, 세포 손상을 촉진하고 포스파티딜세린의 외부화를 촉진함으로써 키메라 Tim4 수용체와 상승작용 효과를 발휘할 수 있으며, 이는 삼킴, 세포독성, 보조자극 활성, 항원 제시 또는 이들의 조합과 같은 키메라 Tim4 수용체의 효과기 기능을 유도한다.
본 개시내용을 더 상세히 설명하기 전에, 본원에 사용되는 특정 용어에 대한 정의를 제공하는 것이 본 개시내용을 이해하는 데 도움이 될 수 있다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 그 분수(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100분)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 관련하여 본원에 인용된 임의의 숫자 범위는 달리 표시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 "약"이라는 용어는 달리 표시되지 않는 한 표시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에 사용된 "a" 및 "an"이라는 용어는 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 "포함하다", "가지다" 및 "내포하다"라는 용어는 동의어로 사용되며, 이 용어 및 그 변형은 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.
항체 기술 분야의 당업자가 이해하는 용어는 본원에서 다르게 명시적으로 정의되지 않는 한 각각 당업계에서 획득한 의미를 부여받는다. "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함한다. "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 온전한 항체뿐만 아니라 표적 분자에 결합하는 능력을 갖거나 유지하는 온전한 항체의 항원 결합 부분(또는 항원 결합 도메인)을 지칭할 수 있다. 항체는 자연 발생이거나, 재조합 생성되거나, 유전자 조작되거나 또는 변형된 형태의 면역글로불린, 예를 들어 인트라바디, 펩티바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, SMIP, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 탠덤 디-scFV, 탠덤 트리-scFv, ADAPTIR)일 수 있다. 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 비-인간, 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있으며, 바람직하게는 인간화 또는 인간일 수 있다. 면역글로불린 구조 및 기능은 예를 들어 문헌[Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)]에 검토되어 있다. 온전한 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 도메인"은 온전한 항체의 일부를 나타내고 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역 또는 상보적 결정 영역을 지칭하는 "항체 단편"을 포함하는 것을 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv 항체, VH, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. "Fab"(단편 항원 결합)는 항원과 결합하는 항체의 한 부분으로 쇄간 디설파이드 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역과 CH1을 포함한다. 항체는 IgG 및 그의 하위부류(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 부류 또는 하위부류일 수 있다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조하시오). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; 문헌[Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조하시오.
"고가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어인 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"이라는 용어는 항원에 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여하는 항체 가변 영역 내 아미노산의 비-인접 서열을 지칭한다. 일반적으로 각 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 있고 각 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다.
본원에 사용된 "결합 도메인", "결합 영역" 및 "결합 모이어티"라는 용어는 표적 분자(예를 들어, 포스파티딜세린)와 특이적으로 및 비공유적으로 결합하거나, 회합하거나, 통합하거나, 인식하거나 조합하는 능력을 보유하는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 분자를 지칭한다. 결합 도메인은 생물학적 분자 또는 기타 관심 표적에 대한 임의의 자연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합 생성된 결합 상대를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 항체 또는 기능적 결합 도메인 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 항원 결합 도메인이다. 예시적인 결합 도메인에는 단쇄 항체 가변 영역(예를 들어, 도메인 항체, sFv, scFv, Fab), 수용체 엑토도메인(예를 들어, Tim4), 리간드(예를 들어, 사이토카인, 케모카인), 또는 생물학적 분자에 결합하는 특정 능력에 대해 선택된 합성 폴리펩티드가 포함된다.
"T 세포 수용체"(TCR)는 일반적으로 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 하는 T 세포(T 림프구라고도 함)의 표면에서 발견되는 분자를 지칭한다. TCR은 일반적으로 대부분의 T 세포에서 매우 가변적인 α 및 β 쇄(각각 TCRα 및 TCRβ라고도 함)의 디설파이드 연결 이종이량체로 구성된다. T 세포의 작은 하위집합에서, TCR은 γ 및 δ쇄의 이종이량체(각각 TCRγ 및 TCRδ라고도 함)로 구성된다. TCR의 각 쇄는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며 하나의 N 말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C 말단 단부에 짧은 세포질 꼬리를 보유한다(문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997]을 참조하시오). 본 개시내용의 TCR은 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 염소, 말 또는 기타 포유동물을 포함한 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합되거나(즉, 막관통 영역 또는 도메인을 갖거나) 가용성 형태일 수 있다. TCR에는 예를 들어 scTCR, 가용성 TCR, TCR 융합 작제물(TRuCTM; 미국특허 공보 2017/0166622 참조)을 포함한 재조합적으로 생성되거나, 유전적으로 조작되거나, 융합 또는 변형된 형태의 TCR이 포함된다.
TCR α-쇄(Vα) 및 β-쇄(Vβ), 또는 γδTCR의 경우 Vγ 및 Vδ의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 항원에 대한 TCR의 결합에 관련된다. 고유 TCR의 Vα 및 Vβ는 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 가변 도메인은 4개의 보존된 FR과 3개의 CDR을 포함한다. Vα 도메인은 2개의 개별 DNA 분절인 가변 유전자 분절(V 유전자) 및 결합 유전자 분절(J 유전자)에 의해 암호화되고; Vβ 도메인은 3개의 개별 DNA 분절, 즉 가변 유전자 분절(V 유전자), 다양성 유전자 분절(D 유전자) 및 결합 유전자 분절(J 유전자)에 의해 암호화된다. 단일 Vα 또는 Vβ 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. "주조직적합성 복합체 분자"(MHC 분자)는 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 부류 I 분자는 막에 걸쳐 있는 α 쇄(3개의 α 도메인을 갖는다)와 비-공유 회합된 β2 마이크로글로불린으로 구성된 이종이량체이다. MHC 부류 II 분자는 2개의 막관통 당단백질인 α 및 β로 구성되며, 이들 둘 다 막을 가로지른다. 각 쇄에는 2개의 도메인이 있다. MHC 부류 I 분자는 세포질에서 발생하는 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 부류 II 분자는 소포 시스템에서 유래한 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 이들은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 분자는 인간, 마우스, 래트 또는 기타 포유동물을 포함한 다양한 동물 종에서 유래할 수 있다.
"키메라 항원 수용체"(CAR)는 2개 이상의 별개의 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 지칭하며 세포 표면에서 발현될 때 수용체로서 기능할 수 있다. CAR은 일반적으로 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 선택적인 세포외 스페이서 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)-함유 T 세포 활성화 모티프 및 선택적으로 세포내 공동자극 도메인)으로 구성된다. 특정 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 ITAM-함유 T 세포 활성화 도메인(예를 들어, CD3ζ) 및 세포내 공동자극 도메인(예를 들어, CD28)을 갖는다. 특정 구현예에서, CAR은 단일 폴리펩티드 쇄로서 합성되거나 단쇄 폴리펩티드로서 핵산 분자에 의해 암호화된다.
특정 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 결합 도메인을 식별하고 결합 도메인 친화도를 결정하기 위한 다양한 분석, 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA 및 BIACORE® 분석이 공지되어 있다(또한 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949]; 및 미국특허 5,283,173, 5,468,614, 또는 등가물을 참조하시오). 본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합한다"는 샘플 내 다른 분자 또는 성분과 유의미하게 회합하거나 통합하지 않으면서, 결합 도메인 또는 이의 융합 단백질이 표적 분자에 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M 단위로 특정한 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 회합 또는 통합함을 지칭한다.
"항원" 및 "Ag"라는 용어는 면역 반응을 유도할 수 있는 분자를 지칭한다. 유도된 면역 반응에는 항체 생성, 특정 면역학적 능력이 있는 세포의 활성화 또는 이들 둘 다가 포함될 수 있다. 단백질, 당 단백질 및 당지질을 포함한 거대분자가 항원 역할을 할 수 있다. 항원은 재조합 또는 게놈 DNA에서 유래될 수 있다. 본원에서 고려되는 바와 같이, 항원은 (i) 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 또는 (ii) "유전자"에 의해서만 암호화될 필요는 없다. 항원은 생성되거나 합성될 수 있으며, 항원은 생물학적 샘플에서 유래될 수 있다. 이러한 생물학적 샘플에는 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 체액이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
"에피토프(epitope)" 또는 "항원 에피토프"라는 용어는 항체 또는 이의 단편(예를 들어 scFv), T 세포 수용체(TCR), 키메라 Tim4 수용체, 또는 기타 결합 분자, 도메인 또는 단백질과 같은 동족 면역 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되는 항원 내의 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산이나 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 포함하며 특정한 3차원 구조적 특성뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태적 에피토프일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "Tim4"(T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질 4)(또한 "TimD4"라고도 알려짐)는 전형적으로 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에서 발현되는 포스파티딜세린 수용체를 지칭한다. Tim4는 세포막의 외안면(외부) 소엽에 포스파티딜세린(PtdSer)을 제시하는 세포자멸성, 괴사성, 손상성, 상처난 또는 스트레스를 받은 세포의 식세포작용을 매개한다. Tim4는 또한 T 세포 표면에 발현된 Tim1과 결합하여 증식과 생존을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, Tim4는 인간 Tim4를 지칭한다. 예시적인 인간 Tim4 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "Tim4 결합 도메인"이라는 용어는 PtdSer에 선택적으로 결합하는 금속 이온-의존성 포켓을 보유하는 Tim4의 N-말단 면역글로불린-폴딩 도메인을 지칭한다. 예시적인 인간 Tim4 결합 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 예시적인 마우스 Tim4 결합 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
Tim4 결합 도메인은 가변 면역글로불린(IgV) 유사 도메인(본원에서는 "IgV 도메인"으로 지칭됨) 및 뮤신 유사 도메인("본원에서는 "뮤신 도메인"으로 지칭됨)을 포함한다. 예시적인 인간 Tim4 IgV 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 예시적인 인간 Tim4 뮤신 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 예시적인 인간 Tim4 신호 펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 마우스 Tim4 신호 펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "효과기 도메인"은 적절한 신호를 수신할 때 효과기 도메인을 발현하는 세포에서 생물학적 또는 생리학적 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 융합 단백질 또는 수용체의 세포내 부분이다. 특정 구현예에서, 효과기 도메인은 결합될 때 신호를 수신하는 단백질 또는 단백질 복합체의 일부이거나, 효과기 도메인으로부터 신호를 촉발하는 표적 분자에 직접 결합한다. 효과기 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)와 같은 하나 이상의 신호 전달 도메인 또는 모티프를 포함하는 경우 세포 반응을 직접적으로 촉진할 수 있다. 다른 구현예에서, 효과기 도메인은 세포 반응을 직접적으로 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 회합함으로써 세포 반응을 간접적으로 촉진할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "공동자극 신호전달 도메인"은 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 부분을 지칭하며, 이는 1차 또는 고전적(예를 들어, ITAM-구동된) 활성화 신호(예를 들어, CD3ζ 세포내 신호전달 도메인에 의해 제공됨)와 함께 활성화될 때, T 세포 활성화, 사이토카인 생성, 증식, 분화, 생존, 효과기 기능 또는 이들의 조합과 같은 T 세포 반응을 촉진하거나 향상시킨다. 공동자극 신호전달 도메인에는 예를 들어 CD27, CD28, CD40L, GITR, NKG2C, CARD1, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD226, CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLP76, TRIM, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 활성화 도메인"은 면역 세포 수용체 또는 세포 표면 마커에 자연적으로 또는 내인성으로 존재하고 적어도 하나의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 부분을 지칭한다. ITAM은 YXXL/I-X6-8-YXXL/I의 보존된 모티프를 지칭한다. 특정 구현예에서 ITAM 신호전달 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 ITAM을 포함한다. ITAM 신호전달 도메인은 항원 결합 또는 리간드 관여 후에 T 세포 활성화 신호전달을 개시할 수 있다. ITAM-신호전달 도메인은 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD79a 및 CD66d의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
"접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 2개의 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이의 하나 이상(예를 들어, 약 2-20개)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 키메라 단백질(예를 들어, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 구성 동안 제한 효소 부위의 사용으로부터 생성된 아미노산 잔기)의 작제물 설계로부터 생성될 수 있다.
"핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 형태일 수 있으며, 여기에는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA가 포함된다. 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드), 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 자연 발생 뉴클레오티드의 α-거울상 이성질체 형태), 또는 이들 둘 다의 조합으로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티, 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에 변형 또는 대체를 가질 수 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포아닐리데이트, 포스포아미데이트 등이 포함된다. 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 단일 가닥인 경우 암호화 가닥 또는 비-암호화(안티센스 가닥)일 수 있다. 암호화 분자는 당업계에 공지된 암호화 서열과 동일한 암호화 서열을 가질 수 있거나 또는 유전자 코드의 중복성(redunduncy) 또는 축퇴(degeneracy)의 결과로서 또는 스플라이싱에 의해 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 상이한 암호화 서열을 가질 수 있다.
"암호화"는 뉴클레오티드(즉 rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성에 대한 주형으로서 작용하는 DNA, cDNA 및 mRNA 서열과 같은 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 본래의 특성을 지칭한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 단백질을 암호화한다. 암호화 가닥과 비-암호화 가닥 둘 다 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 다른 생성물을 암호화하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩티드에는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질이 포함된다. 본원에 사용된 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되는 단쇄 및 일반적으로 당업계에서 단백질로 지칭되는 장쇄를 모두 지칭하며, 이들 중 다수의 유형이 존재한다. "폴리펩티드"에는 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등이 포함된다. 폴리펩티드에는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이들의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "성숙한 폴리펩티드" 또는 "성숙한 단백질"이라는 용어는 세포막 또는 특정 세포 소기관(예를 들어 소포체, 골지체 또는 엔도솜) 내부에서 분비되거나 국소화되고 N-말단 신호 펩티드는 포함하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
"신호 서열", "리더 서열", "리더 펩티드", "국소화 신호" 또는 "국소화 서열"이라고도 불리는 "신호 펩티드"는 분비 경로로 향하는 새로 합성된 단백질의 N 말단에 존재하는 짧은 펩티드(대개는 15-30개 아미노산 길이)이다. 신호 펩티드는 전형적으로 N-말단에 짧은 길이의 친수성의 양으로 하전된 아미노산, 5-15개 잔기의 중앙 소수성 도메인, 및 신호 펩티다제에 대한 절단 부위가 있는 C-말단 영역을 포함한다. 진핵생물에서, 신호 펩티드는 새로 합성된 단백질의 소포체로의 이동을 유도하며 여기서 단백질은 신호 펩티다제에 의해 절단되어 성숙한 단백질을 생성시키며 이어서 적절한 목적지로 이동한다.
"키메라"라는 용어는 자연에서 통상적으로 함께 연결되거나 결합된 것으로 발견되지 않는, 함께 연결되거나 결합된 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 키메라 핵산 분자는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되었으나 자연에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "내인성" 또는 "고유"라는 용어는 유전자, 단백질, 화합물, 분자의 자연 발생 변이체 또는 활성을 포함하여 숙주 또는 숙주 세포에 통상적으로 존재하는 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "상동성" 또는 "상동체"는 예를 들어 동일한 숙주 세포로부터, 상이한 숙주 세포로부터, 상이한 유기체로부터, 상이한 균주로부터, 상이한 종으로부터 제2 유전자 또는 활성에 혈통에 의해 관련되는 숙주 세포로부터의 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종 분자 또는 상기 분자를 암호화하는 이종 유전자는 각각 그 분자를 암호화하는 고유의 숙주 세포 분자 또는 유전자와 상동성일 수 있고 변경된 구조, 서열, 발현 수준 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "이종" 핵산 분자, 작제물 또는 서열은 숙주 세포에 고유하지 않지만 숙주 세포의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부와 상동일 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부를 지칭한다. 이종 핵산 분자, 작제물 또는 서열의 공급원은 상이한 속 또는 종으로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 핵산 분자는 자연적으로 발생하지 않는다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자는 예를 들어 접합, 형질전환, 형질감염, 형질도입, 일렉트로포레이션 등에 의해 숙주 세포 또는 숙주 게놈에 부가되며(즉, 내인성이거나 고유하지 않음), 여기서 부가된 분자는 숙주 세포 게놈에 통합되거나 염색체외 유전 물질(예를 들어, 플라스미드 또는 자가 복제 벡터의 다른 형태)로 존재하며, 다수의 사본으로 존재할 수 있다. 또한, "이종성"은 숙주 세포가 상동성 단백질 또는 활성을 암호화하는 경우에도 숙주 세포에 도입된 비-내인성 핵산 분자에 의해 암호화된 비-고유 효소, 단백질 또는 기타 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "조작된", "재조합", "변형된" 또는 "비-천연"이라는 용어는 이종 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하거나, 또는 인간의 개입에 의해 유전적으로 조작된, 즉 이종 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 세포 또는 미생물을 의미하거나, 또는 내인성 핵산 분자 발현이 조절되거나, 조절해제되거나 또는 구성적이도록 변경된 세포 또는 미생물을 지칭하며, 여기서 이러한 변경이나 변형은 유전공학에 의해 도입될 수 있다. 인간-생성 유전자 변형에는 예를 들어 하나 이상의 단백질, 키메라 수용체 또는 효소를 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, 프로모터와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있음)를 도입하는 변형, 또는 기타 핵산 분자 부가, 결실, 치환 또는 세포의 유전 물질에 대한 기타 기능적 파괴 또는 부가가 포함될 수 있다. 예시적인 변형에는 참조 또는 모 분자로부터의 이종성 또는 상동성 폴리펩티드의 암호화 영역 또는 이의 기능적 단편의 변형이 포함된다. 추가적인 예시적 변형에는, 예를 들어 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경하는 비-암호화 조절 영역에서의 변형이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "트랜스유전자"라는 용어는 숙주 세포에서 발현을 원하고 유전 공학 기법에 의해 세포 내로 전달된 관심 단백질(예를 들어, 키메라 Tim4 수용체)을 암호화하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 트랜스유전자는 리포터, 태그, 마커, 자살 단백질 등인 단백질뿐만 아니라 치료 목적의 단백질을 암호화할 수 있다. 트랜스유전자는 천연 공급원, 천연 유전자의 변형, 또는 재조합 또는 합성 분자로부터 유래할 수 있다. 특정 구현예에서, 트랜스유전자는 벡터의 성분이다.
항원의 "과발현된" 또는 "과발현"이라는 용어는 세포에서 비정상적으로 높은 수준의 항원 발현을 지칭한다. 과발현된 항원 또는 항원의 과발현은 혈액학적 악성종양 및 대상체의 특정 조직 또는 기관 내에서 고형 종양을 형성하는 세포와 같은 질병 상태와 종종 연관된다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양은 당업계에 공지된 표준 분석에 의해 결정될 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "일치성 백분율"은 2개 이상의 서열 정렬을 최적화하기 위해 도입되어야 하는 간격의 수와 각 간격의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, %일치성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 2개 이상의 서열 사이의 서열 비교 및 일치성 백분율 결정은 수학적 알고리즘, 예를 들어 기본 매개변수에서 BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990]을 참조하시오; 또한 BLASTN at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST를 참조하시오).
"보존적 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것으로서 당업계에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 1997년 3월 13일에 공개된 WO 97/09433, 페이지 10; 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition]; 문헌[Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77]; 문헌[Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8]을 참조하시오)
본원에 사용된 "프로모터"라는 용어는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용된 "프로모터/조절 서열"이라는 용어는 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에, 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 유전자 산물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 서열일 수 있다.
"구성적" 프로모터는 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재할 때만 실질적으로 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이적" 프로모터는 유전자를 암호화하거나 유전자에 의해 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 실질적으로 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 "전사 조절 하에 있는" 또는 "작동적으로 연결된"이란 문구는 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 올바른 위치 및 배향에 있음을 의미한다.
"벡터"는 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지일 수 있다. 이 용어는 또한 핵산을 세포로 전달하는 것을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다 . "발현 벡터(expression vector)"는 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현을 지시할 수 있는 벡터이다.
특정 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "레트로바이러스"는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마 레트로바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 감마 레트로바이러스의 예에는 마우스 줄기 세포 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 및 조류 세망내피증(reticuloendotheliosis) 바이러스가 포함된다. "렌티바이러스"는 분열 세포와 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 속을 의미한다. 렌티바이러스의 예로는 HIV(HIV 1형 및 HIV 2형을 포함한 인간 면역결핍 바이러스), 말 감염성 빈혈 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함된다.
다른 구현예에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 비-바이러스 벡터의 예로는 지질 기반 DNA 벡터, 변형된 mRNA(modRNA), 자가 증폭 mRNA, 폐쇄형 선형 이중(CELiD) DNA 및 트랜스포손-매개 유전자 전달(PiggyBac, Sleeping Beauty)이 있다. 비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 전달 수단은 리포솜일 수 있다. 지질 제형은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 숙주 세포에 핵산을 도입하는 데 사용될 수 있다. 핵산은 리포솜의 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜과 핵산 모두와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 미셀에 함유되거나 복합체화되거나, 또는 그렇지 않으면 지질과 회합 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "삼킴"이라는 용어는 직경이 100 ㎚를 초과하는 내인성 또는 외인성 세포 또는 입자가 본 개시내용의 식세포 또는 숙주 세포에 의해 내재화되는 수용체-매개 과정을 지칭한다. 삼킴은 전형적으로 여러 단계로 구성된다: (1) 삼킴 수용체를 삼킴-촉진 마커 또는 항원 마커에 직접적으로 또는 간접적으로(가교 분자를 통해) 표적 세포 또는 입자에 결합시킴으로써 표적 세포 또는 입자를 테더링(tethering)하는 단계; 및 (2) 전체 표적 세포 또는 입자, 또는 이의 일부를 내재화 또는 삼키는 단계. 특정 구현예에서, 내재화는 내재화된 표적을 함유하는 막-결합 구획인 식포(phagosome)를 형성하기 위한 식세포 또는 숙주 세포의 세포골격 재배열을 통해 일어날 수 있다. 삼킴은 식포의 성숙을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 식포는 점점 더 산성이 되어 리소솜과 융합하고(포식용해소체(phagolysosome)를 형성함), 이때 삼켜진 표적이 분해된다(예를 들어, "식세포작용"). 대안적으로, 식포-리소솜 융합이 삼킴에서 관찰되지 않을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 식포는 완전히 분해되기 전에 그 내용물을 역류시키거나 세포외 환경으로 배출할 수 있다. 일부 구현예에서, 삼킴은 식세포작용을 지칭한다. 일부 구현예에서, 삼킴은 본 개시내용의 숙주 세포의 식세포에 의한 표적 세포 또는 입자의 테더링을 포함하지만 내재화는 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 삼킴은 본 개시내용의 숙주 세포의 식세포에 의한 표적 세포 또는 입자의 테더링 및 표적 세포 또는 입자의 일부의 내재화를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "식세포작용"이라는 용어는 표적 세포 또는 입자의 테더링, 표적 세포 또는 입자의 삼킴 및 내재화된 표적 세포 또는 입자의 분해가 일어나는 세포 또는 큰 입자(≥0.5 ㎛)의 삼킴 과정을 의미한다. 특정 구현예에서, 식세포작용은 내재화된 표적 세포 또는 입자를 포함하는 식포의 형성 및 리소솜과 식포 융합하여 포식용해소체를 형성함을 포함하며, 여기서 그 안의 내용물은 분해된다. 특정 구현예에서, 식세포작용 동안, 본 개시내용의 숙주 세포 상에 발현된 키메라 Tim4 수용체가 표적 세포 또는 입자에 의해 발현된 포스파티딜세린에 결합한 후, 식세포 시냅스가 형성되고; 액틴-풍부 식세포 컵이 식세포 시냅스에서 생성되고; 식세포 가지가 세포골격 재배열을 통해 표적 세포 또는 입자 주위로 연장되며; 궁극적으로, 표적 세포 또는 입자가 운동 단백질에 의해 생성된 힘을 통해 식세포 또는 숙주 세포로 끌어당겨진다. 본원에 사용된 바와 같이, "식세포작용"은 "사멸세포제거(efferocytosis)" 과정을 포함하며, 이는 구체적으로 비-염증성 방식의 세포자멸성 또는 괴사성 세포의 식세포작용을 지칭한다.
"면역계 세포" 또는 "면역 세포"라는 용어는 골수에 있는 조혈 줄기 세포에서 유래하는 면역계의 모든 세포를 의미한다. 조혈 줄기 세포는 2가지 주요 계통, 즉 골수 전구 세포(단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구 및 과립구와 같은 골수 세포를 생성시킴) 및 림프 전구 세포(T 세포, B 세포 및 자연살해(NK) 세포와 같은 림프 세포를 생성시킴)를 생성시킨다. 예시적인 면역계 세포에는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 세포 및 수지상 세포가 포함된다. 대식세포 및 수지상 세포는 "항원 제시 세포" 또는 "APC"로도 지칭될 수 있으며, 이는 펩티드와 복합체를 형성한 APC 표면의 주조직적합성 복합체(MHC) 수용체가 T 세포 표면의 TCR과 상호작용할 때 T 세포를 활성화할 수 있는 특화된 세포이다.
"T 세포"라는 용어는 T 세포 계통의 세포를 지칭한다. "T 세포 계통의 세포"는 세포를 다른 림프 세포, 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포와 구별하는 T 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징에는 T 세포(예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+)에 특이적인 하나 이상의 단백질의 발현, 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능적 또는 면역학적 특징이 포함될 수 있다. 예를 들어, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통에 투입된 전구체 또는 전구 세포; CD25+ 미성숙 및 비활성화된 T 세포; CD4 또는 CD8 계통 투입을 겪은 세포; CD4+CD8+ 이중 양성인 흉선세포 전구 세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCRγδ; 또는 성숙하고 기능적이거나 활성화된 T 세포일 수 있다. "T 세포"라는 용어는 나이브() T 세포(CD45 RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중심 기억 T 세포(CD45RO+, CD62L+, CD8+), 효과기 기억 T 세포(CD45RA+, CD45RO-, CCR7-, CD62L-, CD27-), 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포, Tregs, 자연 살해 T 세포 및 조직 상주 T 세포를 포함한다.
"B 세포"라는 용어는 B 세포 계통의 세포를 지칭한다. "B 세포 계통의 세포"는 세포를 다른 림프 세포, 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포와 구별하는 B 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징에는 B 세포에 특이적인 하나 이상의 단백질(예를 들어, CD19+, CD72+, CD24+, CD20+), 또는 B 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능적 또는 면역학적 특징이 포함될 수 있다. 예를 들어, B 세포 계통의 세포는 B 세포 계통에 속한 전구 세포 또는 전구체 세포(예를 들어, pre-pro-B 세포, pro-B 세포 및 pre-B 세포); 미성숙하고 비활성화된 B 세포 또는 성숙하고 기능적이거나 활성화된 B 세포일 수 있다. 따라서, "B 세포"는 나이브 B 세포, 형질 세포, 조절 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 림프형질세포양 세포, 형질모세포 및 기억 B 세포(예를 들어, CD27+, IgD-)를 포함한다.
표면 상에서 본 개시내용에 따른 면역 수용체(예를 들어, TCR) 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)와 관련하여 "세포용해 활성"으로도 지칭되는 "세포독성 활성"이라는 용어는 또한 항원-특이적 신호전달(예를 들어, TCR, 키메라 Tim4 수용체를 통해) 시 상기 세포가, 표적 세포가 아팝토시스를 겪도록 유도한다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 세포독성 세포는 과립으로부터 퍼포린, 그랜자임 및 그래눌리신과 같은 세포독소의 방출을 통해 표적 세포에서 아팝토시스를 유도할 수 있다. 퍼포린은 표적 세포막에 삽입되어 물과 염분이 표적 세포에 빠르게 들어갈 수 있도록 하는 구멍을 형성시킨다. 그랜자임은 표적 세포에서 아팝토시스를 유도하는 세린 프로테아제이다. 그래눌리신은 또한 표적 세포막에 구멍을 형성할 수 있으며 전염증성 분자이다. 일부 구현예에서, 세포독성 세포는 항원-특이적 신호전달 후 T 세포에서 상향조절되는 Fas 리간드와 표적 세포에서 발현되는 Fas 분자와의 상호작용을 통해 표적 세포에서 아팝토시스를 유도할 수 있다. Fas는 다양한 세포 표면에 있는 아팝토시스-신호전달 수용체 분자이다.
면역 세포와 관련하여 "고갈"이라는 용어는 불량한 효과기 기능(예를 들어, 사이토카인 생성 감소, 세포 독성 활성 감소), 증식 능력 감소, 면역 체크포인트 분자 발현 증가, 및 기능적 효과기나 기억 세포의 상태와는 다른 전사 상태로 정의되는 면역 세포 기능 장애 상태를 지칭한다. 특정 구현예에서, 고갈된 면역 세포는 표적 항원의 존재에 반응하지 않게 된다. 면역 세포 고갈은 표적 항원에 대한 만성 노출(예를 들어, 만성 감염으로 인해 발생할 수 있음)이나 면역억제 환경(예를 들어, 종양 미세환경)에 들어갈 때 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포 고갈은 T 세포 고갈, NK 세포 고갈, 또는 이들 둘 다를 지칭한다. 특정 구현예에서, 고갈된 T 세포는 하기를 나타낸다: (a) PD-1, TIGIT, LAG3, TIM3 또는 이들의 임의 조합의 발현 증가; (b) IFN-γ, IL-2, TNF-α 또는 이들의 조합의 생성 감소; 또는 (a) 및 (b) 모두. 특정 구현예에서, 고갈된 NK 세포는 하기를 나타낸다; (a) PD-1, NKG2A, TIM3 또는 이들의 조합의 발현 증가; (b) IFN-γ, TNF-α 또는 이들 둘 다의 생성 감소; 또는 (a) 및 (b) 모두.
"질병"은 대상체가 항상성을 유지할 수 없는 상기 대상체의 건강 상태이고, 질병이 개선되지 않으면 대상체의 건강이 계속해서 악화된다. 대조적으로, 대상체의 "장애" 또는 "바람직하지 않은 상태"는 대상체가 항상성을 유지할 수 있는 건강 상태이지만, 대상체의 건강 상태는 장애 또는 바람직하지 않은 상태가 없는 경우보다 덜 유리하다. 치료하지 않고 방치될 때, 장애 또는 바람직하지 않은 상태는 반드시 대상체의 건강 상태를 추가로 감소시키는 결과를 가져오는 것은 아니다.
본원에 사용된 "암"이라는 용어는 이상 세포의 빠르고 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질병으로서 정의된다. 이상 세포는 고형 종양을 형성하거나 혈액학적 악성종양을 구성할 수 있다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예로는 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 피부암(skin cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 뇌암(brain cancer), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 폐암(lung cancer) 등이 있으나 이들로 제한되지 않는다.
"대상체", "환자" 및 "개인"이라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용되며 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유동물)를 포함하도록 의도된다. 대상체의 예에는 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지 및 이들의 트랜스제닉 종이 포함된다.
"입양 세포 면역요법" 또는 "입양 면역요법"은 자연 발생 또는 유전적으로 조작된 질병 항원-특이적 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 투여를 지칭한다. 입양 세포 면역요법은 자기유래(면역 세포가 수용자로부터 유래함), 동종이계(면역 세포가 동일한 종의 공여자로부터 유래됨) 또는 동계(면역 세포가 수용자와 유전적으로 동일한 공여자로부터 유래함)일 수 있다.
"자기유래"는 나중에 재도입되는 동일한 대상체로부터 유래된 임의의 물질(예를 들어, 장기, 조직, 세포의 이식편)을 지칭한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본 개시내용의 키메라 단백질 또는 키메라 단백질을 발현하는 세포(예를 들어, 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 세포)의 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 치료되는 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태의 하나 이상의 증상을 개선시키기에 충분한 단백질 또는 세포의 양을 지칭한다. 단독으로 투여되는 개별 활성 성분 또는 단일 활성 성분을 발현하는 세포를 언급할 때, 치료학적 유효량은 해당 성분 또는 해당 성분을 단독으로 발현하는 세포의 효과를 지칭한다. 조합을 언급할 때, 치료학적 유효량은 연속적으로 또는 동시에 투여되는지 여부에 관계없이 치료 효과를 초래하는 활성 성분을 발현하는 세포와 활성 성분 또는 조합된 보조 활성 성분의 조합된 양을 지칭한다.
"치료하다" 또는 "치료" 또는 "개선시키다"는 대상체의 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태의 의학적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 본 개시내용의 키메라 단백질을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 적절한 용량 또는 치료 섭생은 치료적 또는 예방적 이점을 이끌어내기에 충분한 양으로 투여된다. 치료 또는 예방적/방지적 이득에는 개선된 임상 결과; 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태와 관련된 증상의 완화 또는 경감; 증상 발생 감소; 삶의 질 개선; 보다 긴 무병 상태; 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태의 정도 감소; 질병 상태의 안정화; 질병 진행의 지연; 관해; 생존; 연장된 생존; 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
"항-종양 효과"란 용어는 종양의 부피 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가 또는 암 상태와 관련된 다양한 생리적 증상의 개선 등으로 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항-종양 효과"는 또한 혈액학적 악성종양 또는 종양 형성의 예방에 의해 나타날 수 있다.
"자가면역 질환"은 자가면역 반응으로 인해 발생하는 장애를 지칭한다. 자가면역질환은 자기-항원에 대한 부적절하게 과도한 반응의 결과이다. 자가면역 반응에는 자가항체를 생성하는 자기-반응성 B 세포, 자기-반응성 T 세포, 또는 이들 둘 다가 포함될 수 있다. 본원에 사용된 "자가항체"는 대상체에 의해 생성된 자기항원에 결합하는 대상체에 의해 생성된 항체이다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 추가적인 정의가 제공된다.
키메라 Tim 4 수용체
본 개시내용은 단쇄 키메라 단백질을 포함하는 키메라 Tim4 수용체를 제공하며, 상기 단쇄 키메라 단백질은 (a) Tim4 IgV 도메인 및 Tim4 뮤신 도메인을 포함하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 세포내 신호전달 도메인(여기서 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 함유 신호전달 도메인, 공동자극 신호전달 도메인; 및 TLR 신호 전달 도메인을 포함한다); 및 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 단쇄 키메라 단백질을 포함하고, 상기 단쇄 키메라 단백질은 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 TLR2 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체의 세포외 도메인은 선택적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 단쇄 키메라 단백질을 포함하고, 상기 단쇄 키메라 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 막관통 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, (c) CD3ζ 신호전달 도메인 및 (d) TLR2 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 단쇄 키메라 단백질을 포함하고, 상기 단쇄 키메라 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 막관통 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, (c) TLR2 신호전달 도메인, 및 (d) CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다.
추가의 키메라 Tim4 수용체는 본 개시내용에 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체의 세포외 도메인은 선택적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다.
숙주 세포에서 발현될 때, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 식세포작용 및 항원 가공 및 제시의 선천적 기능과 함께 변형된 숙주 세포, 예를 들어 T-세포에 포스파티딜세린 특이적 T-세포 세포독성을 부여할 수 있다(예를 들어, 숙주 세포는 표면상에 포스파티딜세린을 발현하는 스트레스를 받거나, 손상되거나, 상처나거나, 세포자멸성 또는 괴사성인 세포에 대해 세포독성으로 된다). 세포내 CD28 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 신호 전달 도메인은 T 세포 활성화제 역할을 한다. 세포내 TLR2 신호전달 도메인은 외인성 가용성 항원을 제시하고 부류 I-제한된 T 세포를 활성화하는 숙주 세포의 능력을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 그랜자임, 퍼포린, 그래눌리신 또는 이들의 임의의 조합의 방출을 통해 표적 세포에서 아팝토시스를 유도한다. 일부 구현예에서, 본 설명에 따른 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 세포는 포스파티딜세린 제시 세포에 특이적인 삼킴 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 세포, 예를 들어 T 세포는 향상된 항원 제시 활성을 나타낸다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, T 세포 항원 포획 및 제시 능력과 단일 T 세포의 유도성 및 표적 특이적 세포독성 기능과의 조합은 내인성 항종양 면역의 활성화 및 향상을 통한 2차 면역 반응의 가능성을 제시한다.
N-말단에서 C-말단으로: (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 막관통 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, (c) CD3ζ 신호전달 도메인, 및 (d) TLR2 TIR 신호전달 도메인, 예를 들어 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 Tim4 수용체를 포함하는 키메라 Tim4 수용체를 포함하는 T 세포는, 시험관내에서 추가 항원 노출 시 재활성화되는 능력을 입증하며, 이는 생체내 지속 효과를 시사한다. 더욱 또한, N-말단에서 C-말단으로: (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 막관통 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, (c) CD3ζ 신호전달 도메인, 및 (d) TLR2 TIR 신호전달 도메인, 예를 들어 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 Tim4 수용체를 포함하는 키메라 Tim4 수용체는, N-말단에서 C-말단으로: (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 막관통 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, (c) TLR2 TIR 신호전달 도메인, 및 (d) CD3ζ 신호전달 도메인, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 Tim4 수용체를 포함하는 키메라 Tim4 수용체와 비교하여 더 일관된 항원-제시 기능을 나타내었다.
세포내 신호전달 도메인은 키메라 Tim4 수용체 및 포스파티딜세린의 세포외 도메인의 결합에 반응하여 기능적 신호를 세포에 전달할 수 있는 하나 이상의 효과기 도메인을 포함할 수 있다. 세포내 신호전달 도메인(들)에 의한 신호전달은 세포외 도메인의 포스파티딜세린에의 결합에 의해 촉발된다. 세포내 신호전달 도메인에 의해 전달된 신호는 키메라 Tim4 수용체 함유 세포의 효과기 기능을 촉진한다. 효과기 기능의 예에는 세포독성 활성, 사이토카인의 분비, 증식, 아팝토시스-방지 신호전달, 지속성, 확장, 표면에서 포스파티딜세린을 발현하는 표적 세포 또는 입자의 삼킴, 항원 제시 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용에 따른 키메라 Tim4 수용체는 세포자멸성, 괴사성, 손상성 또는 스트레스를 받은 세포의 제거가 유익한 다양한 치료 방법에 사용될 수 있으며, 동시에 세포 면역 반응을 향상시키거나, 면역 세포 고갈을 감소시키거나, 또는 이들 둘 모두를 제공하는 공동자극을 제공한다.
본 개시내용의 융합 단백질의 성분 부분은 본원에 추가로 상세히 기재된다.
세포외 도메인
본원에 기재된 바와 같이, 키메라 Tim4 수용체는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. Tim4 결합 도메인은 음으로 하전된 헤드-기가 있는 인지질이자 세포막의 성분인 포스파티딜세린(PtdSer)에 특이성을 부여한다. 건강한 세포에서는 포스파티딜세린이 세포막의 내부 소엽에서 우선적으로 발견된다. 그러나 세포가 스트레스를 받거나 손상되거나 아팝토시스 또는 괴사가 발생하면 포스파티딜세린이 세포막의 외부 소엽에 노출된다. 따라서 포스파티딜세린은 스트레스를 받은 세포, 손상된 세포, 세포자멸성 세포, 괴사성 세포, 발열 세포 또는 종양 세포를 구별하는 마커로 사용될 수 있다. Tim 결합 도메인에 의한 포스파티딜세린의 결합은 포스파티딜세린과 다른 분자 사이의 상호작용을 차단할 수 있으며, 예를 들어 포스파티딜세린의 특정 기능(예를 들어 신호 전달)을 방해, 감소 또는 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스파티딜세린의 결합은 특정 생물학적 경로를 유도하거나, 또는 제거를 위해 포스파티딜세린 분자 또는 포스파티딜세린을 발현하는 세포를 식별할 수 있다.
본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체에 사용하기에 적합한 Tim4 결합 도메인은 포스파티딜세린에 특이적으로 결합하는 Tim4 분자로부터 유래된 임의의 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 Tim4의 IgV 도메인 및 Tim4의 뮤신 도메인을 포함한다.
포스파티딜세린 결합은 일반적으로 IgV 도메인에 의해 조절된다. 코어 포스파티딜세린 결합 도메인은 IgV 도메인의 4개 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3의 아미노산 95-98)이다. Tim4 결합 도메인은 포스파티딜세린 밀도가 낮은 세포에 최소한으로 결합한다.
일부 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 인간 Tim4로부터 획득되거나 유래된다. 예시적인 인간 Tim4 분자는 Uniprot. Ref. Q96H15(서열번호 1)에 제공된다. 예시적인 인간 Tim4 결합 도메인은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 예시적인 마우스 Tim4 결합 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 23-279를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 2 또는 서열번호 2의 아미노산 23-279에 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 2 또는 서열번호 2의 아미노산 23-279의 아미노산 서열에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형(예를 들어, 결실, 부가, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 Tim4로부터의 IgV 도메인을 포함한다. 예시적인 인간 Tim4 IgV 도메인은 서열번호 3에 제공된다. 일부 구현예에서, Tim4 IgV 도메인은 서열번호 3에 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, Tim4 IgV 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형(예를 들어, 결실, 부가, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 Tim4로부터의 뮤신 도메인을 포함한다. 예시적인 인간 Tim4 뮤신 도메인은 서열번호 4에 제공된다. 일부 구현예에서, Tim4 뮤신 도메인은 서열번호 4에 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, Tim4 뮤신 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형(예를 들어, 결실, 부가, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Tim4 결합 도메인은 Tim4 IgV 도메인 및 Tim4 뮤신 도메인을 포함한다. 예시적인 Tim4 IgV 도메인은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, Tim4 뮤신 도메인은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Tim4 IgV 도메인 및 Tim4 뮤신 도메인은 함께 서열번호 5 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Tim4 결합 도메인 또는 Tim4 IgV 도메인은 서열번호 7의 Tim4 신호 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인은 선택적으로 세포외, 비-신호전달 스페이서 또는 링커 도메인을 포함한다. 포함되는 경우, 이러한 스페이서 또는 링커 도메인은 결합 도메인을 숙주 세포 표면으로부터 멀리 위치시켜 적절한 세포/세포 접촉, 결합 및 활성화를 추가로 가능하게 할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체에 포함될 때, 세포외 스페이서 도메인은 일반적으로 키메라 Tim4 수용체의 세포외 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다. 세포외 스페이서의 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 결합 도메인 크기 및 친화도에 기초하여 표적 분자 결합을 최적화하기 위해 다양할 수 있다(예를 들어, 문헌[Guest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005]; PCT 공보 WO　2014/031687를 참조하시오). 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD)이다. 면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 변경된 IgG4 힌지 영역은 PCT 공보 WO 2014/031687에 기재되어 있으며, 이 힌지 영역은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 ESKYGPPCPPCP(서열번호 9)의 아미노산 서열을 갖는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함한다. 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체에 사용될 수 있는 힌지 영역의 다른 예에는 야생형 또는 이의 변이체일 수 있는 CD8a, CD4, CD28 및 CD7과 같은 1형 막 단백질의 세포외 영역으로부터의 힌지 영역이 포함된다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CD28 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 면역글로불린 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다(예를 들어, 스페이서에 대해 내용 전체가 본원에 참고로 포함된 PCT 공보 WO2014/031687를 참조하시오). 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 II형 C-렉틴의 줄기 영역(C-형 렉틴 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 도메인)을 포함할 수 있다. II형 C-렉틴에는 CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D가 포함된다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인은 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 이들의 트랜스제닉 종, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 포유동물 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 도메인은 쥐, 인간 또는 키메라 도메인이다.
세포내 신호전달 도메인
본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 효과기 도메인이고, 키메라 Tim4 수용체의 세포외 도메인과 포스파티딜세린의 결합에 반응하여 기능적 신호를 세포에 전달할 수 있다. 세포내 신호전달 도메인에 의해 전달된 신호는 키메라 Tim4 수용체 함유 세포의 효과기 기능을 촉진한다. 효과기 기능의 예에는 세포독성 활성, 사이토카인 분비, 증식, 아팝토시스-방지 신호 전달, 지속성, 확장, 표면에 포스파티딜세린을 발현하는 표적 세포 또는 입자의 삼킴, 항원 포획, 항원 가공, 항원 제시 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
세포내 신호전달 도메인은 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 제1, 제2 및/또는 제3 세포내 신호전달 도메인은 독립적으로 충분한 신호전달 활성을 유지하는 신호전달 분자의 임의의 부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 전장 신호전달 분자 또는 신호전달 분자의 전장 세포내 성분이 사용된다. 일부 구현예에서, 신호전달 분자의 절두된 부분 또는 신호전달 분자의 세포내 성분이 사용되나, 단 상기 절두된 부분은 충분한 신호 전달 활성을 유지해야 한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 신호전달 분자의 전체 또는 절두된 부분의 변이체이나, 단 상기 변이체는 충분한 신호 전달 활성을 유지해야 한다(즉, 기능적 변이체이다).
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28 신호전달 도메인, TLR2 신호전달 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 TLR2 TIR 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR2 TIR 신호전달 도메인은 TLR2 신호전달 도메인의 N-말단으로부터 제거된 HRFHGLWYMKMMWAWLQAKRKPRKAPSRN의 펩티드 서열을 갖는 TLR2 신호전달 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같이, 제1, 제2 및 제3 세포내 신호전달 도메인의 지정은 키메라 Tim4 수용체의 세포내 부분의 N-말단에 제1 세포내 신호전달 도메인, 중간에 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 C-말단에 제3 세포내 신호전달 도메인의 배열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 제1 세포내 신호전달 도메인의 지정은 키메라 Tim4 수용체의 세포내 부분의 N-말단에서 선택된 세포내 신호전달 도메인의 사용을 제한하지 않는다. 제2 세포내 신호전달 도메인의 지정은 키메라 Tim4 수용체의 세포내 부분의 중간(또는 2개의 세포내 신호전달 도메인만 갖는 키메라 Tim4 수용체의 경우 C-말단)에서 선택된 세포내 신호전달 도메인의 사용을 제한하지 않는다. 제3 세포내 신호전달 도메인의 지정은 키메라 Tim4 수용체의 세포내 부분의 C-말단에서 선택된 세포내 신호전달 도메인의 사용을 제한하지 않는다. 따라서, 키메라 Tim4 수용체의 세포내 부분 내의 제1, 제2 및/또는 제3 세포내 신호전달 도메인의 다양한 배열이 고려된다.
예시적인 CD28 신호전달 도메인은 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 예시적인 CD3ζ 신호전달 도메인은 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 예시적인 TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 16 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, CD28 신호전달 도메인은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD28 신호전달 도메인은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호전달 도메인은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호전달 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, TLR2 신호전달 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 N-말단에서 C-말단으로: CD28 제1 세포내 신호전달 도메인, TLR2 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 N-말단에서 C-말단으로: CD28 제1 세포내 신호전달 도메인, CD3ζ 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 TLR2 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR2 세포내 신호전달 도메인은 TLR2 TIR 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 39 또는 서열번호 40에 제시된 바와 같은 제1, 제2 및 제3 세포내 신호전달 도메인의 조합을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인은 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지 및 이들의 트랜스제닉 종을 포함한 포유동물 종으로부터 유래될 수 있다.
막관통 도메인
키메라 Tim4 수용체의 막관통 도메인은 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하고 이들 사이에 위치한다. 막관통 도메인은 숙주 세포막을 가로지르는 소수성 알파 나선이다. 막관통 도메인은 결합 도메인 또는 존재하는 경우 세포외 스페이서 도메인에 직접 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 내재 막 단백질(예를 들어, 수용체, 분화 클러스터(CD) 분자, 효소, 수송체, 세포 부착 분자 등)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 도메인이 유래된 분자와 동일한 분자로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 세포내 신호전달 도메인이 유래되는 분자와 동일한 분자로부터 선택된다. 예를 들어, Tim4 수용체 키메라 Tim4 수용체는 CD28 막관통 도메인 및 CD28 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인 및 세포외 도메인은 상이한 분자로부터 유래되거나; 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인은 상이한 분자로부터 유래되거나; 또는 막관통 도메인, 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 모두 상이한 분자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. 예시적인 CD28 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 11에 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, %, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 일치성을 갖는 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 아미노산 서열 서열번호 11에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형(예를 들어, 결실, 부가, 치환) 을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
막관통 도메인은 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지 및 이들의 트랜스제닉 종을 포함한 임의의 포유동물 종으로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 이들의 트랜스제닉 종, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한 임의의 포유동물 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 쥐, 키메라, 인간 또는 인간화 수용체이다.
본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체의 한 도메인과 또 다른 도메인의 직접적인 융합은 개재 접합 아미노산의 존재를 배제하지 않는 것으로 이해된다. 접합 아미노산은 천연이거나 비천연(예를 들어, 키메라 단백질의 작제물 설계로부터 생성됨)일 수 있다. 예를 들어, 접합 아미노산은 한 도메인을 다른 도메인에 연결하거나 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 벡터로 클로닝하는데 사용되는 제한 효소 부위로부터 생성될 수 있다.
예시적인 키메라 Tim4 수용체
예시적인 키메라 Tim4 수용체 및 성분 서열은 표 1 및 2에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim 4 수용체는 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 신호 서열(아미노산 1-24)이 없는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim 4 수용체는 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 신호 서열(아미노산 1-24)이 없는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다.
[표 1]
키메라 Tim4 수용체 및 성분
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 Tim4 결합 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 제1 세포내 신호전달 도메인, TLR2 TIR 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 5를 포함하는 Tim4 결합 도메인, 서열번호 11을 포함하는 CD28 막관통 도메인, 서열번호 12를 포함하는 CD28 제1 세포내 신호전달 도메인, 서열번호 17을 포함하는 TLR2 TIR 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 서열번호 14를 포함하는 CD3ζ 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 7의 N-말단 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 18 또는 신호 펩티드(아미노산 1-24)가 없는 서열번호 18을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 Tim4 결합 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 제1 세포내 신호전달 도메인, CD3ζ 제2 세포내 신호전달 도메인 및 TLR2 TIR 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 5를 포함하는 Tim4 결합 도메인, 서열번호 11을 포함하는 CD28 막관통 도메인, 서열번호 12를 포함하는 CD28 제1 세포내 신호전달 도메인, 서열번호 14를 포함하는 CD3ζ 제2 세포내 신호전달 도메인 및 서열번호 17을 포함하는 TLR2 TIR 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 7의 N-말단 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 19 또는 신호 펩티드(아미노산 1-24)가 없는 서열번호 19를 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 19 또는 신호 펩티드(아미노산 1-24)가 없는 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열에 의해 제공되는 것과 같이, N-말단에서 C-말단으로: Tim4 결합 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 제1 세포내 신호전달 도메인, CD3ζ 제2 세포내 신호전달 도메인 및 TLR2 TIR 제3 세포내 신호전달 도메인의 특정 도메인 및 배열을 갖는 키메라 Tim4 수용체는 서열번호 18 또는 신호 펩티드(아미노산 1-24)가 없는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열에 의해 제공되는 것과 같이, 동일한 도메인을 갖지만 TLR2 TIR 및 CD3ζ 신호 전달 도메인의 위치가 전환된 키메라 Tim4 수용체(또한 CER1234로서 지칭됨)와 비교하여 개선된 특성을 가질 수 있다. 서열번호 19 또는 신호 펩티드(아미노산 1-24)가 없는 서열번호 19에 따른 키메라 삼킴 수용체(또한 CER1236 T 세포로서 지칭됨)가 형질도입된 T 세포는 하기 중 임의의 조합을 나타낸다: (i) 다중 공여자 T 세포 샘플에 걸쳐 포스파티딜세린 자극에 반응하여 보다 일관되고 더 높은 유도성; (ii) 보다 일관된 항원 제시 기능; (iii) CER1234 T 세포와 비교하여 다중 공여자에 걸쳐 더 높은 CD4:CD8 T 세포 비. 더욱 또한, 서열번호 19 또는 신호 펩티드(아미노산 1-24)가 없는 서열번호 19에 따른 키메라 삼킴 수용체로 형질도입된 T 세포는 우세하게 중심 기억 및 효과기 기억 표현형, 일련의 포스파티딜세린 노출에 대한 반응으로 반복된 활성화, 및 PARP 억제제, BTK 억제제 또는 EGFR 억제제와 조합 시 표적 세포에 대한 상승작용 활성을 나타내었다.
[표 2]
예시적인 키메라 삼킴 수용체
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
본 개시내용은 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, cDNA 또는 RNA를 지칭할 수 있으며 안티센스 DNA, cDNA 및 RNA를 포함하여 서로 보완하는 핵산의 양성 및 음성 가닥을 포함할 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA의 자연 발생 또는 합성 형태일 수 있다. 원하는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)] 및 문헌[Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 2003)]에 기재된 바와 같이, 원하는 서열 또는 이의 일부를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 같은 것을 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 서열을 유도하거나, 또는 같은 것을 함유하는 세포 또는 조직으로부터 직접 서열 또는 그의 일부를 단리하는 것과 같은 표준 기법을 사용하는 당업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여 획득되나 생성될 수 있다. 대안적으로, 관심 서열을 클로닝하기보다는 합성적으로 생성시킬 수 있다.
본원에 제공된 키메라 Tim4 수용체 조성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지 또는 이들의 조합과 같은 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 삽입되는 숙주 세포와 동일한 동물 종으로부터 유래된다.
본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 조절 서열에는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 가공 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 가능하게는 단백질 분비를 향상시키는 서열이 있을 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전구체 단백질을 분비 경로에 표적화하기 위해 5'-단부에 신호 펩티드를 암호화하는 서열(리더 펩티드 또는 신호 서열로도 지칭됨)을 포함한다. 신호 펩티드는 세포 가공 및 키메라 Tim4 수용체의 숙주 세포막으로의 국소화 동안 세포외 도메인의 N-말단에서 선택적으로 절단된다. 신호 펩티드 서열이 절단되거나 제거된 폴리펩티드도 성숙한 폴리펩티드로 불릴 수 있다. 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체에 사용될 수 있는 신호 펩티드의 예는 예를 들어 GM-CSF(서열번호 27의 아미노산 서열), Tim1(서열번호 28의 아미노산 서열), 또는 Tim4(서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열)를 포함한 내인성 분비 단백질로부터 유래된 신호 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 성숙한 키메라 Tim4 수용체 폴리펩티드를 암호화하거나, 폴리펩티드 서열은 성숙한 키메라 Tim4 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 신호 펩티드 서열을 포함하는 본원에 개시된 서열의 경우, 신호 펩티드 서열이 암호화된 단백질을 세포외 막으로 수송할 수 있는 또 다른 신호 펩티드로 대체될 수 있음을 이해한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 키메라 Tim4 수용체는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 숙주 세포에서 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화된다(예를 들어, 문헌[Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135-145 (2006)]을 참조하시오). 본원에 사용된 "코돈 최적화된" 폴리뉴클레오티드는 관심 숙주 세포에서 tRNA의 존재비에 상응하는 침묵 돌연변이로 변형된 코돈을 갖는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
단일 폴리뉴클레오티드 분자는 본원에 개시된 임의의 구현예에 따른 1개, 2개 또는 그 이상의 키메라 Tim4 수용체를 암호화할 수 있다. 하나 초과의 트랜스유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다시스트론 발현을 위해 각 유전자 사이에 배치된 서열(예를 들어, IRES, 바이러스 2A 펩티드)을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 제공된 적어도 2개의 트랜스유전자(예를 들어, 키메라 Tim4 수용체 및 CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 탠덤 발현 카세트를 구성할 수 있다. 탠덤 발현 카세트는 적어도 2개의 트랜스유전자의 탠덤 또는 동시-발현을 위한 동일한 조절 서열 세트의 조절 하에 있거나 이에 작동적으로 연결된 적어도 2개의 트랜스유전자를 포함하는 벡터 핵산의 성분을 지칭한다. 본 개시내용의 탠덤 발현 카세트에 사용될 수 있는 조절 서열에는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 가공 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 단백질 분비를 향상시키는 서열, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 세포 면역요법제(예를 들어, CAR, TCR 등)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탠덤 발현 카세트를 제공한다.
특정 구현예에서, 공간적 및 시간적 조절을 최적화하기 위해 탠덤 발현 카세트를 구성할 수 있다. 예를 들어, 탠덤 발현 카세트는 공간적 및 시간적 조절을 최적화하기 위해 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 탠덤 발현 카세트는 기관, 세포 유형(예를 들어, 면역 세포), 또는 병리학적 미세환경, 예를 들어 종양 또는 감염된 조직에 대한 탠덤 발현 카세트의 특이적 유도를 가능하게 하는 조직 특이적 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. "인핸서"는 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 추가 프로모터 요소이다. 특정 구현예에서, 탠덤 발현 카세트는 구성적 프로모터를 포함한다. 본 개시내용의 탠덤 발현 카세트에 사용하기 위한 예시적인 구성적 프로모터는 EF-1α 프로모터이다. 특정 구현예에서, 탠덤 발현 카세트는 유도성 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 탠덤 발현 카세트는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
탠덤 발현 카세트 내에 함유된 적어도 2개의 트랜스유전자는 임의의 순서로 존재할 수 있다. 예를 들어, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탠덤 발현 카세트는 5'에서 3'로: 키메라 Tim4 수용체-CAR 또는 CAR-키메라 Tim4 수용체로 배열될 수 있다.
특정 구현예에서, 다량체 또는 복합체를 형성하기 위해 회합하는 2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 수용체는 탠덤 발현 구조물 내 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 암호화될 수 있다. 본 개시내용의 탠덤 발현 작제물에서의 발현을 위해 고려되는 예시적인 다량체 수용체에는 다중쇄 CAR, TCR, TCR-CAR 및 TRuCTM 작제물이 포함된다. 따라서, 키메라 Tim4 수용체 및 TCR을 암호화하는 예시적인 탠덤 발현 카세트 구현예는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, TCRα 쇄 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 TCRβ 쇄 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 탠덤 발현 카세트는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 절단 부위, 예를 들어 퓨린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩티드를 포함할 수 있으며, 이는 탠덤 발현 카세트 내에 함유된 각각의 폴리뉴클레오티드 사이에 배치되어 단일 mRNA로부터 여러 단백질의 동시발현을 가능하게 한다. 예를 들어, IRES, 퓨린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩티드는 탠덤 발현 카세트 내에서 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 배치될 수 있다. 또 다른 예에서, IRES, 퓨린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩티드는 각각의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, TCRα 쇄 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 TCRβ 쇄 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 배치될 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스 2A 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1(P2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스(T2A), 말 비염 A 바이러스(E2A), 구제역 바이러스(F2A) 또는 이들의 변이체이다. 예시적인 T2A 펩티드는 서열번호 29-33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 P2A 펩티드는 서열번호 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 E2A 펩티드 서열은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 F2A 펩티드 서열은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 탠덤 발현 카세트의 특정 구현예는 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)에 특이적인 CAR/또는 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. CAR/또는 TCR 에 의해 표적 항원을 발현하는 표적 세포와 결합시, 이러한 탠덤 발현 카세트를 발현하도록 변형된 세포는 표적 세포의 아팝토시스를 유도한다. 아팝토시스는 포스파티딜세린과 같은 표적 세포에 삼킴 촉진 마커의 노출을 유도하며, 이어서 이는 키메라 Tim4 수용체에 의한 삼킴에 대해 손상된 세포 또는 아팝토시스 세포를 표적화할 수 있다.
원하는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 관심 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에 도입하기 위해 적절한 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 비-바이러스성 플라스미드 벡터 및 비-바이러스 벡터, 예를 들어 지질 기반 DNA 벡터, 변형된 mRNA(modRNA), 자기-증폭 mRNA, CELiD 및 트랜스포손 매개 유전자 전달(PiggyBac, Sleeping Beauty)에 삽입할 수 있다. 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터, 복제 벡터, 탐침 생성 벡터 또는 서열분석 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 클로닝할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포외 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 막관통 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 단일 폴리뉴클레오티드에 함께 결합시키고 이어서 벡터에 삽입한다. 다른 구현예에서, 세포외 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 막관통 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 발현된 아미노산 서열이 기능성 키메라 Tim4 수용체를 생성하도록 벡터에 별도로 삽입할 수 있다. 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 벡터는 본원에서 "키메라 Tim4 수용체 벡터"로서 지칭된다.
특정 구현예에서, 벡터는 하나의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터는 2개 이상의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 2개 이상의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드는 클로닝 부위에 클로닝되고, 단일 프로모터로부터 발현되며, 이때 각각의 키메라 Tim4 수용체 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 퓨린 절단 부위, 또는 바이러스 2A 펩티드에 의해 서로 분리되어, 단일 개방 판독 프레임(예를 들어, 다시스트론 벡터)으로부터의 다중 유전자의 공동 발현을 허용한다. 특정 구현예에서, 바이러스 2A 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1(P2A), 토세아 아시그나 바이러스 (T2A), 말 비염 A 바이러스(E2A), 구제역 바이러스(F2A), 또는 이들의 변이체이다. 예시적인 T2A 펩티드는 서열번호 29-33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 P2A 펩티드는 서열번호 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 E2A 펩티드 서열은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 F2A 펩티드 서열은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 벡터는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각 폴리뉴클레오티드는 키메라 Tim4 수용체를 암호화한다. 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 상이한 클로닝 부위에서 벡터로 순차적으로 클로닝될 수 있으며, 이때 각 키메라 Tim4 수용체는 상이한 프로모터의 조절 하에서 발현된다. 특정 구현예에서, 트랜스유전자의 장기간 통합 및 딸 세포로의 증식을 허용하는 벡터가 활용된다. 예에는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스, 폭스 바이러스와 같은 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터가 포함된다. 렌티바이러스에서 유래된 벡터는 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 사용될 수 있으며 간세포와 같은 비-증식 세포를 형질도입하는 능력, 및 낮은 면역원성을 포함하여, 벡터에 비해 추가 이점을 갖는다.
특정 구현예에서, 벡터는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 세포 면역요법제(예를 들어, 키메라 항원 수용체, 재조합 TCR 등)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 및 세포 면역요법제(예를 들어, CAR)를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 퓨린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩티드에 의해 서로 분리된 키메라 Tim4 수용체 서열 및 세포 면역요법제(예를 들어, CAR) 서열과 함께 클로닝 부위에 클로닝되고 단일 프로모터로부터 발현되어 단일 개방 판독 프레임(예를 들어, 다시스트론 벡터)으로부터 다중 유전자의 공동 발현을 허용한다. 특정 구현예에서, 바이러스 2A 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1(P2A), 토세아 아시그나 바이러스(T2A), 말 비염 A 바이러스(E2A), 구제역 바이러스(F2A) 또는 이들의 변이체이다. 예시적인 T2A 펩티드는 서열번호 29-33의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 P2A 펩티드는 서열번호 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 E2A 펩티드 서열은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 F2A 펩티드 서열은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 세포성 면역요법제(예를 들어, CAR) 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리뉴클레오티드로 함께 결합되고 이어서 벡터에 삽입된다. 다른 구현예에서, CER을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 CAR 또는 TCR 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 클로닝 부위에서 벡터에 별도로 삽입되어, 발현된 아미노산 서열이 기능성 CER 및 CAR/또는 TCR을 생성할 수 있다. 탠덤 발현 카세트를 암호화하는 벡터는 본원에서 "탠덤 발현 벡터"로 지칭된다.
특정 구현예에서, 벡터는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 세포 면역요법제(예를 들어, CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 키메라 Tim4 수용체 및 세포 면역요법제(예를 들어, CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상이한 클로닝 부위에서 벡터에 순차적으로 클로닝될 수 있으며, 키메라 Tim4 수용체 및 세포 면역요법제(예를 들어, CAR)는 상이한 프로모터의 조절 하에서 발현된다.
코어 바이러스를 암호화하는 벡터는 본원에서 "바이러스 벡터"로서 지칭된다. 인간 유전자요법 적용을 위해 식별된 것들을 포함하여, 본 발명의 조성물과 함께 사용하기에 적합한 다수의 이용 가능한 바이러스 벡터가 존재한다(문헌[Pfeifer and Verme, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001]을 참조하시오). 적합한 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 유래 벡터, 예를 들어 말로니 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 유래 벡터와 같은 RNA 바이러스 기반 벡터가 포함되며, 보다 복잡한 레트로바이러스 유래 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 유래 벡터가 포함된다. HIV-1 유래 벡터가 이 범주에 속한다. 다른 예로는 HIV-2, FIV, 말 감염성 빈혈 바이러스, SIV 및 Maedi-Visna 바이러스(양 렌티바이러스)에서 유래된 렌티바이러스 벡터가 있다. 키메라 수용체 트랜스유전자를 함유하는 바이러스 입자로 포유동물 숙주 세포를 형질도입하기 위해 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터 및 패키징 세포를 사용하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 앞서 예를 들어 하기 문헌에 기재되었다: 미국특허 8,119,772; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물 및 발현 시스템도 상업적으로 이용 가능하다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 비-내인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 데 사용된다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 형질도입을 위한 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 대한 형질도입 마커는 당업계에 공지되어 있으며, 약물 내성을 부여할 수 있는 선택 마커, 또는 유세포 분석과 같은 방법으로 검출될 수 있는 형광 마커 또는 세포 표면 단백질과 같은 검출 가능한 마커를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 형광 단백질(예를 들어, 녹색, 황색), 인간 CD2의 세포외 도메인, 또는 절두된 인간 EGFR(EGFRt 또는 tEGFR; 문헌[Wang et al., Blood 118 :1255, 2011]을 참조하시오)을 포함하는 형질도입용 유전자 마커를 추가로 포함한다. 예시적인 tEGFR은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함한다. 바이러스 벡터 게놈이 단일 전사체로부터 별도의 단백질로서 숙주 세포에서 발현될 다수의 유전자를 포함하는 경우, 바이러스 벡터는 다시스트론 발현을 허용하는 2개(또는 그 이상) 유전자 사이에 추가 서열을 또한 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 사용되는 이러한 서열의 예에는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 퓨린 절단 부위, 바이러스 2A 펩티드(예를 들어, T2A, P2A, E2A, F2A) 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
기타 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 기반 벡터 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 기반 벡터를 포함하는 DNA 바이러스 벡터; 앰플리콘 벡터, 복제 결함 HSV 및 약독화 HSV를 포함하는 단순 포진 바이러스(HSV)로부터 유래된 벡터를 폴리뉴클레오티드 전달에 또한 사용할 수 있다(Krisky et al., Gene Ther. 5:1517, 1998).
유전자요법을 위해 최근 개발된 다른 바이러스 벡터도 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 벡터에는 바큘로바이러스 및 α-바이러스로부터 유래된 벡터(Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab), 또한 플라스미드 벡터(예를 들어 sleeping beauty 또는 다른 트랜스포손 벡터)가 포함된다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 공간적 및 시간적 조절을 최적화하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 공간적 및 시간적 조절을 최적화하기 위해 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 기관, 세포 유형(예를 들어, 면역 세포), 또는 병리학적 미세환경(예를 들어, 종양 또는 감염된 조직)에 대한 키메라 Tim4 수용체의 특이적 유도를 가능하게 하는 조직 특이적 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. "인핸서"는 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 추가 프로모터 요소이다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 구성적 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 유도성 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 생체내 귀소 및 항종양 활성을 개선하기 위해 CCR4 또는 CXCR4와 같은 귀소 수용체를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다 .
시간적 조절이 필요한 경우, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 형질도입된 세포의 유도성 고갈(depletion)을 허용하는 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 벡터는 유도성 자살 유전자를 포함할 수 있다. 자살 유전자는 세포자멸성 유전자, 또는 작용제(예를 들어, 약물)에 민감성을 부여하는 유전자일 수 있다. 예시적인 자살 유전자에는 화학적으로 유도 가능한 카스파제 9(iCASP9)(미국 특허 공보 2013/0071414), 화학적으로 유도 가능한 Fas, 또는 간사이클로비르에 민감성을 부여하는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK)가 포함된다. 추가 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 관련 항체의 주입 시 형질도입된 세포의 고갈을 가능하게 하는 공지된 세포 표면 항원을 발현하도록 설계될 수 있다. 형질도입된 세포의 고갈에 사용될 수 있는 세포 표면 항원 및 관련 항체의 예에는 CD20 및 리툭시맙, RQR8(CD34 및 CD20 에피토프가 결합되어 CD34 선택 및 항-CD20 결실을 허용함) 및 리툭시맙, EGFR 및 세툭시맙이 포함된다.
유도성 벡터 시스템, 예를 들어 독시사이클린에 의해 트랜스유전자 발현을 활성화하는 테트라사이클린(Tet)-On 벡터 시스템(Heinz et al., Hum. Gene Ther. 2011, 22:166-76)이 또한 유도성 키메라 Tim4 수용체 발현을 위해 사용될 수 있다. 유도성 키메라 Tim4 수용체 발현은 또한, 후크를 통해 소포체의 막에 고정된 스트렙트아비딘 및 키메라 Tim4 수용체 구조에 도입된 스트렙트아비딘 결합 단백질을 기반으로 하는 선택적 후크(RUSH) 시스템을 사용한 유지를 통해 달성될 수도 있으며, 이때 시스템에 대한 비오틴 부가는 소포체로부터의 키메라 Tim4 수용체의 방출로 이어진다(Agaugue et al., 2015, Mol. Ther. 23(Suppl. 1):S88).
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포는 또한 하나 이상의 작은 GTPase를 공동 발현하도록 변형될 수 있다. 작은(~21 k Da) 신호전달 G 단백질 패밀리이자 또한 Ras 슈퍼패밀리의 하위패밀리인 Rho GTPase는 다양한 세포 유형에서 액틴 세포골격 구성을 조절하고 식세포작용 동안 위족 확장 및 식포 폐쇄를 촉진한다(예를 들어, 문헌[Castellano et al., 2000, J. Cell Sci. 113:2955-2961]을 참조하시오). 삼킴(Engulfment)은 테더링된 세포 또는 입자 아래에 F-액틴 모집을 필요로하며, 세포 또는 입자 내재화를 초래하는 막 확장을 허용하기 위한 F-액틴 재배열을 필요로한다. RhoGTPase에는 RhoA, Rac1, Rac2, RhoG 및 CDC42가 포함된다. Rap1과 같은 다른 작은 GTPase는 보체 매개 식세포작용의 조절에 관여한다. 작은 GTPase와 키메라 Tim4 수용체의 공동 발현은 표적 세포 또는 입자 내재화 및/또는 숙주 세포에 의한 식포 형성을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, GTPase를 암호화하는 재조합 핵산 분자는 키메라 Tim4 수용체 함유 벡터와는 별도의 벡터 상에서 암호화된다. 다른 구현예에서, GTPase를 암호화하는 재조합 핵산 분자는 키메라 Tim4 수용체와 동일한 벡터에서 암호화된다. GTPase 및 키메라 Tim4 수용체는 동일한 벡터(예를 들어, 상이한 다중 클로닝 부위)에서 상이한 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있다. 대안적으로, 키메라 Tim4 수용체 및 GTPase는 다시스트론 벡터에서 하나의 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있다. 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 작은 GTPase(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다시스트론 벡터에서 IRES 또는 바이러스 2A 펩티드에 의해 서로 분리될 수 있다. 예시적인 2A 펩티드는 T2A(서열번호 29-33), P2A(서열번호 34 또는 35), E2A(서열번호 36), F2A(서열번호 37)를 포함한다. 키메라 Tim4 수용체와 함께 발현될 수 있는 GTPase의 예에는 Rac1, Rac2, Rab5(Rab5a라고도 함), Rab7, Rap1, RhoA, RhoG, CDC42 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 특정 구현예에서, GTPase는 서열번호 41의 Rac1 아미노산 서열, 서열번호 42의 Rab5 아미노산 서열, 서열번호 43의 Rab7 아미노산 서열, 서열번호 44의 Rap1 아미노산 서열, 서열번호 45의 RhoA 아미노산 서열, 서열번호 46의 CDC42 아미노산 서열, 또는 이들의 임의의 조합에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97 %, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 대상체로부터 수득된 세포, 예를 들어 면역 세포는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 비-천연 또는 재조합 세포(예를 들어, 비-천연 또는 재조합 면역 세포)로 조작될 수 있으며, 이에 의해 세포는 세포 표면에 국한된 키메라 Tim4 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 골수 전구 세포 또는 림프 전구 세포와 같은 면역 세포이다. 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하도록 변형될 수 있는 예시적인 면역 세포에는 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 림프 전구 세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 골수 전구체 세포, 성숙한 골수 세포, 단핵구 또는 대식세포가 포함된다.
특정 구현예에서, B 세포는 하나 이상의 키메라 Tim4 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된다. B 세포는 염증 부위로의 수송, 항원 내재화 및 제시 가능, T 세포 공동자극 가능, 높은 증식성 및 자기-재생(평생 지속)을 포함하여 숙주 세포로서 유리할 수 있는 특정한 특성을 보유한다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 B 세포는 삼킨 표적 세포 또는 삼킨 표적 입자를 더 작은 펩티드로 절단하고 이를 MHC 분자를 통해 T 세포에 제시할 수 있다. 키메라 Tim4 수용체 변형 B 세포에 의한 항원 제시는 비-표적 항원에 대한 면역 반응의 항원 확산에 기여할 수 있다. B 세포에는 B 세포 계통에 속하는 선조 또는 전구 세포(예를 들어, pre-pro-B 세포, pro-B 세포 및 pre-B 세포); 미성숙하고 비활성화된 B 세포; 또는 성숙하고 기능적이거나 활성화된 B 세포가 포함된다. 특정 구현예에서, B 세포는 나이브 B 세포, 형질 세포, 조절 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 림프형질세포양 세포, 형질모세포, 기억 B 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 기억 B 세포는 나이브 B 세포에는 없는 CD27의 발현에 의해 나이브 B 세포와 구별될 수 있다. 특정 구현예에서, B 세포는 인간, 마우스, 래트 또는 기타 포유동물로부터 유래된 1차 세포 또는 세포주일 수 있다. B 세포주는 당업계에 주지되어 있다. B 세포는 포유동물로부터 수득되는 경우, 혈액, 골수, 비장, 림프절 또는 기타 조직이나 체액을 포함한 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. B 세포 조성물은 농축되거나 정제될 수 있다.
특정 구현예에서, T 세포는 하나 이상의 키메라 Tim4 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 예시적인 T 세포에는 CD4+ 헬퍼, CD8+ 효과기(세포독성), 나이브(CD45 RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중심 기억(CD45RO+, CD62L+, CD8+), 효과기 기억(CD45RA+, CD45RO-, CCR7-, CD62L-, CD27-), T 기억 줄기, 조절, 점막 관련 불변(MAIT), γδ(gd), 조직 상주 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 특정 구현예에서, T 세포는 인간, 마우스, 래트 또는 기타 포유동물로부터 유래된 1차 세포 또는 세포주일 수 있다. T 세포는 포유동물로부터 수득되는 경우, 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 기타 조직이나 체액을 포함한 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포 조성물은 농축되거나 정제될 수 있다. T 세포주는 당업계에 주지되어 있으며, 이들 중 일부는 문헌[Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000]에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, T 세포에는 TCRα 유전자, TCRβ 유전자, 또는 이들 둘 다의 내인성 발현이 결여되어 있다. 이러한 T 세포는 자연적으로 TCR α 및 β 쇄의 내인성 발현이 부족할 수 있거나, 또한 발현을 차단하거나(예를 들어, TCR α 및 β 쇄를 발현하지 않는 트랜스제닉 마우스의 T 세포, 또는 TCR α 및 β 쇄의 발현을 억제하도록 조작된 세포) 또는 TCRα 쇄, TCRβ 쇄, 또는 두 유전자 모두를 녹아웃하도록 변형되었을 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 표면에서 본 개시내용의 키메라 Tim 단백질을 발현하는 숙주 세포는 T 세포 또는 T 세포 계통의 세포가 아니라 전구 세포, 줄기 세포 또는 세포 표면 항-CD3을 발현하도록 변형된 세포인 세포이다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포는 또한 세포 면역요법제(예를 들어, CAR, TCR 등)를 공동 발현하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포성 면역요법제는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. CAR은 일반적으로 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, ITAM 함유 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 세포내 공동자극 도메인), 및 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 막관통 도메인을 포함하는 재조합 수용체이다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기에 적합한 결합 도메인에는 임의의 항원-결합 폴리펩티드가 포함된다. 결합 도메인은 예를 들어 전장 중쇄, Fab 단편, Fab', F(ab')2, sFv, VH 도메인, VL 도메인, dAb, VHH, CDR, 및 scFv를 포함한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CAR 결합 도메인은 쥐, 키메라, 인간 또는 인간화 도메인이다.
특정 구현예에서, CAR의 결합 도메인은 암 또는 종양 항원을 표적화한다. CAR이 표적화할 수 있는 예시적인 항원에는 CD138, CD38, CD33, CD123, CD72, CD79a, CD79b, 메소텔린, PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, CD20, CD23, CD24, CD37, CD30, CA125, CD56, c-Met, EGFR, GD-3, HPV E6, HPV E7, MUC-1, HER2, 폴레이트 수용체 α, CD97, CD171, CD179a, CD44v6, WT1, VEGF-α, VEGFR1, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-11Rα, PSA, FcRH5, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, CEA, 에프린 A2, 에프린 B2, Lewis A 항원, Lewis Y 항원, MAGE, MAGE-A1, RAGE-1, 폴레이트 수용체 β, EGFRviii, VEGFR-2, LGR5, SSX2, AKAP-4, FLT3, 푸코실 GM1, GM3, o-아세틸-GD2, 및 GD2가 포함된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용에 제공된 CAR의 세포외 도메인은 선택적으로 세포외, 비-신호전달 스페이서 또는 링커 도메인을 포함한다. 포함되는 경우, 이러한 스페이서 또는 링커 도메인은 결합 도메인을 숙주 세포 표면으로부터 멀리 위치시켜 적절한 세포 대 세포 접촉, 결합 및 활성화를 추가로 가능하게 할 수 있다. 세포외 스페이서 도메인은 일반적으로 CAR의 세포외 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다. 세포외 스페이서의 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 결합 도메인 크기 및 친화도에 기초하여 표적 분자 결합을 최적화하기 위해 다양할 수 있다(예를 들어, 문헌[Guest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005]; PCT 공보 WO 2014/031687을 참조하시오). 특정 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD)이다. 면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 변경된 IgG4 힌지 영역은 PCT 공보 WO 2014/031687에 기재되어 있으며, 이는 상기 힌지 영역에 대해서 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함한다.
본원에 기재된 CAR에 사용될 수 있는 힌지 영역의 다른 예에는 야생형 또는 이의 변이체일 수 있는 CD8a, CD4, CD28 및 CD7과 같은 1형 막 단백질의 세포외 영역으로부터의 힌지 영역이 포함된다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 172의 아미노산 서열을 갖는 CD8a 힌지 영역을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CD28 힌지 영역을 포함한다. 추가 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 조합 중에서 선택된 면역글로불린 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다(예를 들어, PCT 공보 WO2014/031687를 참조하시오, 이는 스페이서에 대해 전체가 본원에 참고로 포함된다). 더욱 추가 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 II형 C-렉틴의 줄기 영역(C-형 렉틴 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 도메인)을 포함할 수 있다. II형 C-렉틴에는 CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D가 포함된다.
본 개시내용의 CAR은 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인의 길이는 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산이다. 막관통 도메인은 숙주 세포막을 가로질러 숙주 세포막에 CAR을 고정시키는 소수성 알파 나선이다. 막관통 도메인은 결합 도메인, 또는 존재하는 경우, 세포외 스페이서 도메인에 직접 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 내재 막 단백질(예를 들어, 수용체, 분화 클러스터(CD) 분자, 효소, 수송체, 세포 부착 분자 등)로부터 유래된다. 막관통 도메인은 세포외 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인과 동일한 분자로부터 선택 될 수 있다(예를 들어, CAR은 CD28 공동자극 신호전달 도메인 및 CD28 막관통 도메인을 포함한다). 특정 구현예에서, 막관통 도메인 및 세포외 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인, 세포외 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기 위한 예시적인 막관통 도메인은 CD28, CD2, CD4, CD8a, CD5, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD9, CD16, CD22, CD25, CD27, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95(Fas), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD154(CD40L), CD200R, CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD300, CD357(GITR), A2aR, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPα, pTα, TCRα, TCRβ, TIM3, TRIM, LPA5, 및 Zap70 막관통 도메인을 포함한다. 예시적인 CD28 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖는 CD8a 막관통 도메인을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 효과기 도메인이고, CAR의 세포외 도메인이 표적 분자(예를 들어, 암 항원)에 결합하는 것에 반응하여 세포에 기능적 신호를 전달할 수 있으며, 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상적인 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화한다. 일부 구현예에서, CAR은 T 세포의 기능, 예를 들어 세포용해 활성 또는 T 헬퍼 활성, 예를 들어 사이토카인 분비 또는 기타 인자를 유도한다. 세포내 신호전달 도메인은 충분한 신호전달 활성을 유지하는 세포내 신호전달 분자의 임의의 부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 항원 수용체 성분(예를 들어, TCR) 또는 공동자극 분자로부터 획득된다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 또는 공동자극 분자의 전장 세포내 신호전달 도메인이 사용된다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 또는 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되나, 단 상기 절두된 부분은 충분한 신호 전달 활성을 유지해야 한다. 추가 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 변이체가 충분한 신호전달 활성을 보유하는 한(즉, 기능적 변이체), 항원 수용체 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 전장 또는 절두된 부분의 변이체이다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 함유 신호전달 도메인을 포함한다. 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM은 일반적으로 YXXL/I-X6-8-YXXL/I의 보존된 모티프를 지칭하는 적어도 하나(1개, 2개, 3개, 4개 이상)의 ITAM을 포함한다. ITAM 함유 신호전달 도메인은 항원 결합 또는 리간드 관여 후에 T 세포 활성화 신호전달을 개시할 수 있다. ITAM-신호전달 도메인은 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD278(ICOS), DAP12, FcRγ 및 CD66d의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 CD3ζ 신호전달 도메인은 서열번호 177 또는 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함한다.
CAR 세포내 신호전달 도메인은 선택적으로 공동자극 신호전달 도메인을 포함하며, 이는 1차 또는 고전적(예를 들어, ITAM 구동) 활성화 신호와 함께 활성화될 때, T 세포 반응, 예를 들어 T 세포 활성화, 사이토카인 생성, 증식, 분화, 생존, 효과기 기능, 또는 이들의 조합을 촉진하거나 향상시킨다. CAR에 사용하기 위한 공동자극 신호전달 도메인에는 예를 들어 CD27, CD28, CD40L, GITR, NKG2C, CARD1, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD226, CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLP76, TRIM, ZAP70, 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 또는 4-1BB(CD137) 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 CD28 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호 179 또는 180의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 1개, 2개 또는 그 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 항체로부터 유래된 scFv 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(들)으로 구성된 재조합 수용체이다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인(들)은 TCR로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 이들의 트랜스제닉 종, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 포유동물 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 쥐, 키메라, 인간 또는 인간화된다.
특정 구현예에서, CAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 또는 3세대 CAR이다. 1세대 CAR은 일반적으로 T 세포 활성화 신호를 제공하기 위해 CD3ζ, FcγRI, 또는 다른 ITAM 함유 활성화 도메인의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는다. 2세대 CAR은 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어, 내인성 T 세포 공동자극 수용체, 예를 들어 CD28, 4-1BB 또는 ICOS로부터의 공동자극 신호전달 도메인)을 추가로 포함한다. 3세대 CAR은 ITAM 함유 활성화 도메인, 제1 공동자극 신호전달 도메인 및 제2 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인, 결합 도메인, 링커, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 또는 공동자극 도메인 중 하나 이상은 접합 아미노산을 포함한다. "접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 단백질의 2개의 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 사이, 예를 들어 결합 도메인과 인접한 링커 사이, 막관통 도메인과 인접한 세포외 또는 세포내 도메인 사이, 또는 2개의 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편을 연결하는 링커의 한쪽 또는 양쪽 단부 사이(예를 들어, 링커와 인접한 결합 도메인 사이 또는 링커와 인접한 힌지 사이)의 하나 이상(예를 들어 약 2-20개)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질의 작제물 설계로부터 생성될 수 있다(예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구성하는 동안 제한 효소 부위 또는 자기-절단 펩티드 서열의 사용으로부터 생성되는 아미노산 잔기). 예를 들어, 융합 단백질의 막관통 도메인은 아미노-말단 단부, 카르복시-말단 단부, 또는 이들 둘 다에 하나 이상의 접합 아미노산을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 조작된 숙주 세포는 키메라 Tim4 수용체 및 항-CD72 CAR을 공동-발현한다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포는 재조합 TCR을 공동발현한다. 재조합 TCR 단백질에는 α 쇄 폴리펩티드와 β 쇄 폴리펩티드의 이종이량체 또는 γ 쇄 폴리펩티드와 δ 쇄 폴리펩티드의 이종이량체로 구성된 "전통적인" TCR, 이들의 결합 단편 및 융합 단백질이 포함되며, 예를 들어 단쇄 TCR, 단일 도메인 TCR, 가용성 TCR 융합 TCR 단백질 및 TCR 융합 작제물(TRuCTM)이 포함한다. 특정 구현예에서, 탠덤 발현 카세트는 TCR 베타 가변 영역 및 TCR 베타 불변 영역을 포함하는 재조합 TCR 베타 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 TCR 알파 가변 영역 및 TCR 알파 불변 영역을 포함하는 재조합 TCR 알파 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR은 향상된 친화성 TCR이다. 한 구현예에서, 재조합 TCR은 향상된 친화성 TCR이다.
특정 구현예에서, 재조합 TCR 결합 단백질은 유연한 링커에 의해 Vβ에 결합된 Vα를 포함하는 단쇄 TCR(scTCR)이다. 일부 구현예에서, scTCR은 Vα-링커-Vβ 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, scTCR은 Vβ-링커-Vα 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포는 또한 단쇄 TCR(scTCR) 융합 단백질을 공동-발현하도록 변형될 수 있다. scTCR 융합 단백질은 scTCR(TCR Vβ 도메인에 연결된 TCR Vα 도메인)을 포함하는 결합 도메인, 선택적 세포외 스페이서, 막관통 도메인, 및 T 세포 활성화 신호를 제공하는 단일 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ ITAM-함유 활성화 도메인) 및 선택적으로 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다(문헌[Aggen et al., 2012, Gene Ther. 19:365-374]; 문헌[Stone et al., Cancer Immunol. Immunother. 2014, 63:1163-76]을 참조하시오).
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포는 또한 T 세포 수용체 기반 키메라 항원 수용체(TCR-CAR)를 공동 발현하도록 변형될 수 있다. TCR-CAR은 일반적으로 가용성 TCR(Vα 도메인과 Cα 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄 및 Vβ 도메인과 Cβ 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄)을 포함하는 이종이량체 융합 단백질이며, 여기서 VβCβ 폴리펩티드 쇄는 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 성분(예를 들어, ITAM-함유 활성화 도메인 및 선택적으로 공동자극 신호전달 도메인)에 연결된다(예를 들어, 문헌[Walseng et al., 2017 Scientific Reports 7:10713]을 참조하시오).
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 및 세포성 면역요법제(예를 들어, CAR, TCR 등)를 공동 발현하는 조작된 숙주 세포는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 재조합 핵산, 및 조작된 숙주 세포 내의 별도의 벡터상의 세포성 면역요법제를 암호화하는 재조합 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 및 세포성 면역요법제(예를 들어, CAR, TCR 등)를 공동-발현하는 조작된 숙주 세포는 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 재조합 핵산, 및 조작된 숙주 세포 내의 키메라 Tim4 수용체와 동일한 벡터상의 세포성 면역요법제를 암호화하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 키메라 Tim4 수용체 및 세포성 면역요법제는 동일한 벡터 상의 상이한 프로모터(예를 들어, 상이한 다중 클로닝 부위)의 조절 하에서 발현될 수 있다. 대안적으로, 키메라 Tim4 수용체 및 세포 면역요법제는 다시스트론 벡터(예를 들어, 탠덤 발현 벡터)에서 하나의 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있다. 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 세포성 면역요법제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다시스트론 벡터에서 IRES 또는 바이러스 2A 펩티드에 의해 분리될 수 있다.
탠덤 발현 카세트, 탠덤 발현 벡터, 및 이를 포함하는 조작된 숙주 세포는 국제 출원 공보 WO2019/191339에 기재되어 있으며, 이는 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, 유전자 편집 방법을 사용하여 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 숙주 세포 게놈을 변형시킨다. 유전자 편집 또는 게놈 편집은 유전자 조작된 엔도뉴클레아제를 사용하여 숙주 세포의 게놈에서 DNA를 삽입, 교체 또는 제거하는 유전 공학 방법이다. 뉴클레아제는 게놈의 표적 유전자좌에서 특정 이중 가닥 절단을 생성시킨다. 이어서, 숙주 세포의 내인성 DNA 복구 경로는 예를 들어 비-상동성 단부 결합(NHEJ) 및 상동성 재조합에 의해, 상기 유발된 절단(들)을 복구한다. 유전자 편집에 유용한 예시적인 엔도뉴클레아제에는 아연 집게 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기(TALE) 뉴클레아제, 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복부(CRISPR)/Cas 뉴클레아제 시스템(예를 들어, CRISPR-Cas9), 메가뉴클레아제 또는 이들의 조합이 포함된다. 유전자 편집 엔도뉴클레아제를 사용하여 B 세포 및 T 세포를 비롯한 면역 세포에서 유전자 또는 유전자 발현을 방해하거나 녹아웃시키는 방법은 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 하기에 기재되어 있고: 국제 출원 공보 WO　2015/066262; WO　2013/074916; WO　2014/059173; Cheong et al., Nat. Comm. 2016 7:10934; Chu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016 113:12514-12519; 이들 각각의 방법은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, 숙주 세포의 내인성 유전자의 발현은 억제되거나, 녹다운되거나, 녹아웃된다. B 세포에서 억제되거나, 녹다운되거나, 녹아웃될 수 있는 내인성 유전자의 예에는 IGH, IGκ, IGλ 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. T 세포에서 억제되거나, 녹다운되거나 또는 녹아웃될 수 있는 내인성 유전자의 예로는 TCR 유전자(TRA 또는 TRB), HLA 유전자(HLA 부류 I 유전자 또는 HLA 부류 II 유전자), 면역 체크포인트 분자(PD-L1, PDL2, CD80, CD86, B7-H3, B7H4, HVEM, 아데노신, GAL9, VISTA, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, PVRL2, PD1, CTLA4, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, A2aR, CD244/2B4, CD160, TIGIT, LAIR1 또는 PVRIG/CD112R) 또는 이들의 임의의 조합이 있다. 내인성 유전자의 발현은 유전자 수준, 전사 수준, 번역 수준 또는 이들의 조합에서 억제되거나, 녹다운되거나, 녹아웃될 수 있다. 내인성 유전자를 억제하거나, 녹다운하거나 또는 녹아웃하는 방법은 예를 들어 RNA 간섭제(예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA 등) 또는 조작된 엔도뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템, 아연 집게 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제), 또는 이들의 임의의 조합에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 내인성 B 세포 유전자(예를 들어, IGH, IGκ 또는 IGλ)는 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 내인성 B 세포 유전자의 유전자좌 내로 삽입함으로써, 예를 들어 조작된 엔도뉴클레아제를 통해 녹아웃된다. 특정 구현예에서, 내인성 T 세포 유전자(예를 들어, TCR 유전자, HLA 유전자 또는 면역 체크포인트 분자 유전자)는 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 내인성 T 세포 유전자의 유전자좌에 삽입함으로써, 예를 들어 조작된 엔도뉴클레아제를 통해 녹아웃된다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 한 유형의 키메라 Tim4 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 적어도 2개 이상의 상이한 키메라 Tim4 수용체를 발현할 수 있다.
본 개시내용은 또한 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 숙주 세포의 집단은 B 세포 집단, T 세포 집단, 자연 살해 세포 집단, 림프 전구 세포 집단, 항원 제시 세포 집단, 수지상 세포 집단, 랑게르한스 세포 집단, 골수 전구 세포 집단, 성숙한 골수 세포 집단, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 더욱 또한, 특정 세포 유형의 키메라 Tim4 수용체 변형 숙주 세포 집단은 하나 이상의 하위유형으로 구성될 수 있다. 예를 들어, B 세포 집단은 키메라 Tim4 수용체 변형 나이브 B 세포, 형질 세포, 조절 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 림프형질세포양 세포, 형질모세포, 기억 B 세포, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, T 세포 집단은 키메라 Tim4 수용체 변형된 CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ 효과기(세포독성) T 세포, 나이브(CD45 RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-) T 세포, 중심 기억(CD45RO+, CD62L+, CD8+) T 세포, 효과기 기억(CD45RA+, CD45RO-, CCR7-, CD62L-, CD27-) T 세포, T 기억 줄기 세포, 조절 T 세포, 점막 관련 불변 T 세포(MAIT), γδ(gd) 세포, 조직 상주 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포 집단은 각각 동일한 키메라 Tim4 수용체(들)을 발현하는 세포로 구성된다. 다른 구현예에서, 숙주 세포 집단은 2개 이상의 숙주 세포 하위 집단의 혼합물로 구성되며, 여기서 각각의 하위 집단은 상이한 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 세트를 발현한다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포, 예를 들어 B 세포 또는 T 세포를 제조할 때, 숙주 세포, 예를 들어 B 세포 또는 T 세포의 증식을 촉진하는 하나 이상의 성장 인자 사이토카인이 세포 배양물에 부가될 수 있다. 사이토카인은 인간이거나 비-인간일 수 있다. T 세포 증식을 촉진하는데 사용될 수 있는 예시적인 성장 인자 사이토카인에는 IL-2, IL-15 등이 포함된다. B 세포 증식을 촉진하는데 사용될 수 있는 예시적인 성장 인자 사이토카인에는 CD40L, IL-2, IL-4, IL-15, IL-21, BAFF 등이 포함된다.
키메라 Tim4 수용체 벡터를 사용하여 숙주 세포를 유전자 변형하기 전에, 숙주 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포 등)의 공급원을 대상체(예를 들어, 전혈, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막삼출, 비장 조직)로부터 수득하며, 이로부터 숙주 세포를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리한다. 특정 숙주 세포 하위집합은 공지된 기법에 따라 수집될 수 있고, 항체에 대한 친화성 결합, 유세포 분석 및/또는 면역자기 선택과 같은 공지된 기법에 의해 농축되거나 고갈될 수 있다. 농축 및/또는 고갈 단계 및 키메라 Tim4 수용체의 도입 후, 원하는 변형된 숙주 세포의 시험관내 확장은 공지된 기법, 또는 당업자에게 자명할 그의 변형에 따라 수행될 수 있다.
본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 포스파티딜세린에 특이적인 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포에 세포독성 활성을 부여한다. 따라서, 표적 세포의 표면에 노출된 포스파티딜세린과 결합하면, 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 표적 세포의 아팝토시스를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 그랜자임, 퍼포린, 그래눌리신 또는 이들의 임의의 조합의 방출; Fas 리간드-Fas 상호작용; 또는 이들 둘 다를 통해 표적 세포의 아팝토시스를 유도한다. 추가 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포에 포스파티딜세린 특이적 삼킴 활성을 추가로 부여한다. 추가 구현예에서, 숙주 세포는 키메라 Tim4 수용체를 사용한 변형 이전에 삼킴 표현형을 자연적으로 나타내지 않는다.
본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 또한 적어도 하나의 신호전달 경로를 통해 T 세포를 공동자극할 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 적어도 2개의 별개의 신호전달 경로를 통해(예를 들어, 키메라 Tim4 수용체에서 선택된 공동자극 신호전달 도메인(들)을 통해) T 세포에 공동자극 신호를 제공한다. 예를 들어, CD28 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 Tim4 수용체는 CD28 및 Tim1을 통해 공동자극 신호를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 면역 세포는 면역 세포 고갈의 감소 또는 억제를 나타낸다. 특정 구현예에서, 숙주 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 특정 구현예에서, 고갈된 T 세포는 하기를 나타낸다: (a) PD-1, TIGIT, LAG3, TIM3 또는 이들의 임의 조합의 발현 증가; (b) IFN-γ, IL-2, TNF-α 또는 이들의 임의의 조합의 생성 감소; 또는 (a) 및 (b) 둘 다. 특정 구현예에서, 고갈된 NK 세포는 하기를 나타낸다; (a) PD-1, NKG2A, TIM3 또는 이들의 조합의 발현 증가; (b) IFN-γ, TNF-α 또는 이들 둘 다의 생성 감소; 또는 (a) 및 (b) 둘 다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 향상된 효과기 반응(예를 들어, 종양 특이적)을 나타낸다. 특정 구현예에서, 효과기 반응은 향상된 T 세포 증식, 사이토카인 생성(예를 들어, IFN-γ, IL-2, TNF-α), 세포독성 활성, 지속성, 또는 이들의 임의의 조합이다.
키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 대상체에게 단독으로 투여되거나, 예를 들어 CAR-T 세포, TCR, 항체, 방사선요법, 화학요법, 소분자, 종양용해성 바이러스, 전기 펄스 요법 등을 비롯한 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 포스파티딜세린에 대해 감소된 면역억제 반응을 나타낸다. 포스파티딜세린은 식세포에 "나를 먹어라"라는 신호를 보내는 주요 아팝토시스 세포 리간드 중 하나이다. 식세포에 의한 아팝토시스 세포의 제거는 일반적으로 소염성 사이토카인 IL-10 및 TGF-β의 분비 및 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-12의 분비 감소를 통해 염증 반응을 감소 또는 예방한다. 따라서 포스파티딜세린은 아팝토시스 세포를 제거하는 동안 면역억제 신호로 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 포스파티딜세린 결합 시, 키메라 Tim4 수용체 변형 숙주 세포는 증가된 항원 특이적 사이토카인 생성(예를 들어, IFN-γ, IL-2, TNF-α)을 나타냄으로써 포스파티딜세린에 대한 면역억제 반응을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 T 세포는 증가된 또는 향상된 항원 포획, 항원 가공 및/또는 항원 제시 활성을 나타낸다. 제시된 표적 펩티드 항원을 제시하고 표적 펩티드 특이적 T 세포에 대한 표적 펩티드 특이적 활성화를 유도하는 키메라 Tim4 수용체 T 세포의 능력을 측정하는 방법이 실시예 2 및 4에 기재되어 있다.
숙주 세포에서의 키메라 Tim4 수용체의 발현은 T 세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정을 포함하고 또한 항원 특이적인 T 세포 반응의 결정을 포함한, 숙주 세포(예를 들어, T 세포)의 다수의 당업계-인정된 분석 방법 중 어느 하나에 따라 기능적으로 특성화될 수 있다. 예에는 T 세포 증식 결정, T 세포 사이토카인 방출, 항원 특이적 T 세포 자극, CTL 활성(예를 들어, 미리 로딩된 표적 세포에서 51Cr 또는 유로피움 방출을 검출함으로써), T 세포 표현형 마커 발현의 변화 및 T 세포 기능의 다른 측정이 있다. 이들 및 유사한 분석을 수행하기 위한 절차를 예를 들어 문헌[Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998]에서 찾을 수 있다. 또한 하기의 문헌을 참조하시오: Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998) 및 여기에 인용된 참고문헌. 사이토카인 수준은 예를 들어 ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색, 유세포 분석, 및 이들의 임의의 조합(예를 들어, 세포내 사이토카인 염색 및 유세포 분석)을 비롯한 당업계에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 항원 특이적 유도 또는 면역 반응 자극으로 인한 면역 세포 증식 및 클론 확장은 말초 혈액 세포 또는 림프절 세포 샘플에서 순환 림프구와 같은 림프구를 단리하고, 항원으로 세포를 자극하고, 사이토카인 생성, 세포 증식 및/또는 세포 생존율(예를 들어, 삼중수소화된 티미딘의 통합 또는 MTT 분석 등과 같은 비-방사성 분석 등에 의해)을 측정함으로써 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 숙주 세포는 표적 세포에 대해 약 20 내지 약 1,500의 식균 지수를 갖는다. "식균 지수"는 배지 중에서 표적 세포 또는 입자 및 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포의 현탁액 배양의 설정된 기간 동안 키메라 Tim4 수용체 변형 숙주 세포당 섭취된 표적 세포 또는 입자의 수를 카운팅함으로써 결정되는 형질도입된 숙주 세포의 식작용 활성의 척도이다. 식균 지수는 [삼킨 표적 세포의 총 수/카운팅된 키메라 Tim4 수용체 변형 세포의 총 수(예를 들어, 식세포 빈도)] x [키메라 Tim4 수용체 + 숙주 세포당 표적 세포 또는 입자 염색의 평균 면적 x 100(예를 들어 하이브리드 포획)] 또는 [삼킨 입자의 총 수 /카운팅된 키메라 Tim4 수용체 변형 숙주 세포의 총 수] x [삼킨 입자를 포함하는 키메라 Tim4 수용체 변형된 숙주 세포의 수/카운팅된 키메라 Tim4 수용체의 총 수 세포]에 100을 곱하여 계산될 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포는 약 30 내지 약 1,500; 약 40 내지 약 1,500; 약 50 내지 약 1,500; 약 75 내지 약 1,500; 약 100 내지 약 1,500; 약 200 내지 약 1,500; 약 300 내지 약 1,500; 약 400 내지 약 1,500; 약 500 내지 약 1,500; 약 20 내지 약 1,400; 약 30 내지 약 1,400; 약 40 내지 약 1,400; 약 50 내지 약 1,400; 약 100 내지 약 1,400; 약 200 내지 약 1,400; 약 300 내지 약 1,400; 약 400 내지 약 1,400; 약 500 내지 약 1,400; 약 20 내지 약 1,300; 약 30 내지 약 1,300; 약 40 내지 약 1,300; 약 50 내지 약 1,300; 약 100 내지 약 1,300; 약 200 내지 약 1,300; 약 300 내지 약 1,300; 약 400 내지 약 1,300; 약 500 내지 약 1,300; 약 20 내지 약 1,200; 약 30 내지 약 1,200; 약 40 내지 약 1,200; 약 50 내지 약 1,200; 약 100 내지 약 1,200; 약 200 내지 약 1,200; 약 300 내지 약 1,200; 약 400 내지 약 1,200; 약 500 내지 약 1,200; 약 20 내지 약 1,100; 약 30 내지 약 1,100; 약 40 내지 약 1,100; 약 50 내지 약 1,100; 약 100 내지 약 1,100; 약 200 내지 약 1,100; 약 300 내지 약 1,100; 약 400 내지 약 1,100; 또는 약 500 내지 약 1,100; 약 20 내지 약 1,000; 약 30 내지 약 1,000; 약 40 내지 약 1,000; 약 50 내지 약 1,000; 약 100 내지 약 1,000; 약 200 내지 약 1,000; 약 300 내지 약 1,000; 약 400 내지 약 1,000; 또는 약 500 내지 약 1,000; 약 20 내지 약 750; 약 30 내지 약 750; 약 40 내지 약 750; 약 50 내지 약 750; 약 100 내지 약 750; 약 200 내지 약 750; 약 300 내지 약 750; 약 400 내지 약 750; 또는 약 500 내지 약 750; 약 20 내지 약 500; 약 30 내지 약 500; 약 40 내지 약 500; 약 50 내지 약 500; 약 100 내지 약 500; 약 200 내지 약 500; 또는 약 300 내지 약 500의 식균 지수를 갖는다. 추가 구현예에서, 배양 시간은 약 2시간 내지 약 4시간, 약 2시간, 약 3시간, 또는 약 4시간이다. 추가 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 세포는 절두된 EGFR 대조군으로 형질도입된 세포보다 통계적으로 유의하게 더 높은 식균 지수를 나타낸다. 식균 지수는 유세포 분석 또는 형광 현미경검사에 의한 정량화를 포함하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 계산될 수 있으며 실시예 및 PCT 출원 PCT/US2017/053553(전체 내용이 본원에 참고로 포함됨)에 추가로 기재되어 있다.
숙주 세포는 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 돼지 또는 이들의 조합과 같은 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 동물은 인간이다. 숙주 세포는 건강한 대상체 또는 항원의 발현 또는 과발현과 관련된 질병을 앓고 있는 대상체로부터 수득될 수 있다.
사용 방법
한 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 구현예에 따른 적어도 하나의 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 벡터를 암호화하는 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입시키고; 상기 숙주 세포에서 적어도 하나의 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 것을 포함하는, 세포의 포스파티딜세린 특이적 세포독성 활성을 부여하거나 향상시키는 방법을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 키메라 Tim4 수용체는 키메라 Tim4 수용체를 발현하도록 변형되기 전의 숙주 세포와 비교하여 숙주 세포의 포스파티딜세린 특이적 세포독성 활성을 향상시킨다. 특정 구현예에서, 숙주 세포의 세포독성 활성은 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 벡터를 암호화하는 핵산 분자로 변형되기 전의 숙주 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 그 이상 증가된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 숙주 세포, 특히 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포의 세포독성 활성을 측정하는 방법에는 크롬(51Cr) 방출 분석, β-gal 또는 개똥벌레 루시퍼라제 방출 분석, 표적 세포사 및 효과기 세포 활성을 매개하는 유세포 분석법이 있다(예를 들어, 문헌[Expert Rev. Vaccines, 2010, 9:601-616]을 참조하시오).
특정 구현예에서, 세포의 포스파티딜세린 특이적 세포독성 활성을 부여하거나 향상시키는 방법은 적어도 하나의 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포의 포스파티딜세린-특이적 삼킴 활성을 부여하거나 향상시키는 것을 추가로 포함한다. 그러한 특정 구현예에서, 숙주 세포는 키메라 Tim4 수용체를 사용한 변형 이전에 삼킴 표현형을 자연적으로 나타내지 않는다. 예를 들어, 이러한 특정 구현예에서, 숙주 세포의 삼킴 활성은 키메라 Tim4 수용체 벡터를 발현하도록 변형되기 전의 숙주 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 그 이상 증가된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 자연적으로 삼킴 활성을 보유하지 않는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 숙주 세포의 삼킴 활성을 측정하는 방법에는 국제 출원 공보 WO2018/064076(본원에 내용 전체가 참고로 포함된다)에 기재된 방법이 포함된다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 구현예 중 임의의 것에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포가 숙주 세포의 효과기 기능을 향상시키는 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 향상된 효과기 기능은 증가된 세포독성 활성, 증가된 항원 특이적 사이토카인 생성(예를 들어, IFN-γ, IL-2, TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합), 증가된 항-아팝토시스 신호전달, 증가된 지속성, 증가된 확장, 증가된 증식, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포의 효과기 기능은 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 벡터를 암호화하는 핵산 분자로 변형되지 않은 숙주 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 그 이상으로 향상된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 면역 세포이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체로 변형된 숙주 세포는 면역 세포 고갈을 억제하거나 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 특정 구현예에서, T 세포의 감소된 고갈은 하기를 포함한다; (a) T 세포에서 PD-1, TIGIT, LAG3, TIM3 또는 이들의 임의 조합의 발현 감소; (b) T 세포에서 IFN-γ, IL-2, TNF-α 또는 이들의 조합의 생성 증가; 또는 (a) 및 (b) 둘 다. 특정 구현예에서, NK 세포의 감소된 고갈은 하기를 포함한다; (a) NK 세포에서 PD-1, NKG2A, TIM3 또는 이들의 조합의 발현 감소; (b) NK 세포에서 IFN-γ, TNF-α 또는 둘 다의 생성 증가; 또는 (a) 및 (b) 둘 다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 발현은 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 벡터를 암호화하는 핵산 분자로 변형되지 않은 숙주 면역 세포와 비교하여 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 면역 세포에서 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소된다. 특정 구현예에서, 사이토카인의 발현은 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 벡터를 암호화하는 핵산 분자로 변형되지 않은 숙주 면역 세포와 비교하여 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 면역 세포에서 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 그 이상 증가된다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 구현예 중 임의의의 것에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 숙주 세포에서 포스파티딜세린에 대한 면역억제 반응을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역억제 반응은 소염성 사이토카인(예를 들어, IL-10, TGF-β, 또는 둘 다)의 분비, 염증성 사이토카인(예를 들어, TNF-α, IL-1β, 및 IL-2)의 분비 감소, 또는 이들 둘 다를 포함한다. 특정 구현예에서, 포스파티딜세린에 대한 숙주 세포의 면역억제 반응은 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 벡터를 암호화하는 핵산 분자로 변형되지 않은 숙주 세포와 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 감소된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 면역 세포이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
더욱 또 다른 양태에서, 본원에 제공된 구현예 중 임의의의 것에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 표면에 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 표적 세포를 제거하는 방법에, 예를 들어 표면에 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 암세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 표면 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 손상된, 스트레스를 받은, 세포자멸성, 괴사성 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)이다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 아팝토시스 유도, 또는 아팝토시스 및 삼킴 둘 다를 유도함으로써 표면 노출된 포스파티딜세린을 보유하는 손상되거나, 스트레스를 받거나, 세포자멸성 또는 괴사성인 표적 세포를 제거한다. 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 대상체에게 단독으로 투여되거나, 또는 예를 들어 CAR-T 세포, TCR, 항체, 방사선요법, 화학요법, 소분자, 종양 용해성 바이러스, 전기 펄스 요법 등을 포함한 다른 요법제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 구현예 중 임의의의 것에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 세포 스트레스, 손상, 괴사 또는 아팝토시스를 유도하는 요법제의 효과를 향상시키는 방법에 사용될 수 있다. 화학 요법, 방사선요법, UV 광선요법, 전기 펄스 요법, 입양 세포 면역요법(예를 들어, CAR-T 세포, TCR) 및 종양 용해성 바이러스 요법과 같은 특정 치료법은 종양 세포, 질병에 걸린 세포, 및 그 주변 환경의 세포에 세포 손상이나 사멸을 유도할 수 있다. 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 세포는 표적 세포의 외부 소엽에 노출된 포스파티딜세린 모이어티에 결합하고, 스트레스를 받거나, 손상되거나, 병에 걸리거나, 세포자멸성이거나 괴사성인 세포를 제거하기 위해 세포 손상/세포독성 요법과 함께 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 구현예 중 임의의 것에 따른 적어도 하나의 키메라 Tim4 수용체 또는 키메라 Tim4 수용체 벡터를 암호화하는 핵산 분자를 숙주 세포에 도입하고; 상기 숙주 세포에서 상기 적어도 하나의 키메라 Tim4 수용체를 발현시키는 것을 포함하는, 세포의 항원 포획, 항원 가공 및/또는 항원 제시 활성을 부여하거나 향상시키는 방법을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 키메라 Tim4 수용체는 키메라 Tim4 수용체를 발현시키는 변형 전의 숙주 세포와 비교하여 숙주 세포의 항원 포획, 항원 가공 및/또는 항원 제시 활성을 향상시킨다.
본원에 제공된 임의의 구현예에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim 수용체 벡터, 키메라 Tim 수용체를 발현하는 숙주 세포, 또는 그의 약학 조성물은, 선택적으로 PARP 억제제와 함께, 암을 앓고 있는 대상체에서 CCR7+ 발현 T 세포를 향상시키기 위한 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 유방암, 난소암, 결장직장암, 난관암, 복막암, 전립선암, 폐암 또는 흑색종이다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인, 및 TLR2 TIR 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함하는 단쇄 키메라 단백질이다.
키메라 Tim4 발현 T 세포에 대한 CCR7 발현의 향상은 PARP 억제제와 함께 투여되지 않은 키메라 Tim4 발현 T 세포상에서의 발현과 비교하여 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400% 또는 그 이상의 CCR7 발현일 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim 수용체 벡터, 키메라 Tim 수용체를 발현하는 숙주 세포, 또는 그의 약학 조성물은, 선택적으로 PARP 억제제와 함께, 암을 앓고 있는 대상체에서 CD4/CD8 T 세포 비를 향상시키기 위한 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 유방암, 난소암, 결장직장암, 난관암, 복막암, 전립선암, 폐암 또는 흑색종이다. 일부 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 (a) Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인, 및 TLR2 TIR 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및 (c) 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함하는 단쇄 키메라 단백질이다.
키메라 Tim4 발현 T 세포에서 CD4/CD8 T 세포 비의 향상은 PARP 억제제와 함께 투여되지 않은 키메라 Tim4 발현 T 세포상에서의 발현과 비교하여 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상의 CD4/CD8 T 세포 비일 수 있다.
키메라 Tim 수용체, 키메라 Tim 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim 수용체를 발현하는 숙주 세포는 본원에 제공된 임의의 구현예에 따른 PARP 억제제와 함께 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태로 고통받는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 이들 방법의 구현예는 대상체에게 (i) 치료학적 유효량의, 본 기재 내용에 따른 하나 이상의 키메라 Tim 수용체, 하나 이상의 키메라 Tim 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 키메라 Tim 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 하나 이상의 키메라 Tim 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포 집단; 및 (ii) 치료학적 유효량의 PARP 억제제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체 조성물은 PARP 억제제 치료 전에(예를 들어, PARP 억제제 치료 1일 내지 30일 이상 전에), PARP 억제제 치료와 동시에(같은 날에), 또는 PARP 억제제 치료 후에(예를 들어, PARP 억제제 치료 후 1일 내지 30일 이상에) 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포는 PARP 억제제 투여 후에 투여된다. 추가 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 세포는 PARP 억제제 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일차에 투여된다. 추가 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포는 PARP 억제제 요법 투여 후 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내 또는 1주 이내에 투여된다. PARP 억제제 요법이 수회 용량을 포함하는 경우, 키메라 Tim 수용체 변형 세포는 PARP 억제제의 초기 용량 후, PARP 억제제의 최종 용량 후, 또는 PARP 억제제의 수회 용량 사이에 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 임의의 구현예에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포는 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태로 고통받는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 이들 방법의 구현예는 치료학적 유효량의, 본 기재 내용에 따른 하나 이상의 키메라 Tim4 수용체, 하나 이상의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 하나 이상의 키메라 Tim4 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포 집단을 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용에 기재된 바와 같은 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 세포로 치료될 수 있는 질병에는 암 및 감염성 질병(바이러스, 세균, 진균, 원생동물 감염)이 포함된다. 입양 면역 및 유전자 요법은 다양한 유형의 암(Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007) 및 감염성 질병(Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011)에 대한 유망한 치료법이다.
고형 종양 및 백혈병을 포함한 매우 다양한 암이 본원에 개시된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있다. 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 암에는 유방, 전립선 및 결장의 선암종(adenocarcinoma); 모든 형태의 기관지성 폐암종(bronchogenic carcinoma of the lung); 골수성 백혈병(myeloid leukemia); 흑색종(melanoma); 간종양(hepatoma); 신경모세포종(neuroblastoma); 유두종(papilloma); 아푸도마(apudoma); 융모종(choristoma); 가지종(branchioma); 악성 카르시노이드 증후군(malignant carcinoid syndrome); 카르시노이드 심장병(carcinoid heart disease); 및 암종(carcinoma)(예를 들어, 워커(Walker), 기저 세포(basal cell), 기저편평세포(basosquamous), Brown-Pearce, 담관(ductal), Ehrlich 종양, Krebs 2, Merkel 세포, 점액성(mucinous), 비-소세포 폐(non-small cell lung), 귀리 세포(oat cell), 유두상(papillary), 경화성(scirrhous), 기관지(bronchiolar), 기관지원성(bronchogenic), 편평세포(squamous cell) 및 전이 세포(transitional cell))가 있다. 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 추가 유형의 암으로는 조직구 장애(histiocytic disorders); 악성 조직구증(malignant histiocytosis); 백혈병(leukemia); 호지킨병(Hodgkin's disease); 면역증식성 작은(immunoproliferative small); 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma); 형질세포종(plasmacytoma); 다발성 골수종(multiple myeloma); 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)(CML); 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)(AML); 형질세포종(plasmacytoma); 세망내피증(reticuloendotheliosis); 흑색종; 연골모세포종(chondroblastoma); 연골종(chondroma); 연골육종(chondrosarcoma); 섬유종(fibroma); 섬유육종(fibrosarcoma); 거대세포 종양(giant cell tumor); 조직구종(histiocytoma); 지방종(lipoma); 지방육종(liposarcoma); 중피종(mesothelioma); 점액종(myxoma); 점액육종(myxosarcoma); 골종(osteoma); 골육종(osteosarcoma); 척색종(chordoma); 두개인두종(craniopharyngioma); 이상세포종(dysgerminoma); 과오종(hamartoma); 간엽종(mesenchymoma); 중신종(mesonephroma); 근육종(myosarcoma); 사기질모세포종(ameloblastoma); 시멘트종(cementoma); 치아종(odontoma); 기형종(teratoma); 흉선종(thymoma); 융모성 종양(trophoblastic tumor)이 있다. 더욱이, 하기 유형의 암이 또한 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 것으로 고려된다: 선종(adenoma); 담관종(cholangioma); 진주종(cholesteatoma); 원형종(cyclindroma); 낭선암종(cystadenocarcinoma); 낭선종(cystadenoma); 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor); 부인과모세포종(gynandroblastoma); 간종양(hepatoma); 땀샘종(hidradenoma); 섬세포 종양(islet cell tumor); 라이디히 세포 종양(Leydig cell tumor); 유두종; 세르톨리 세포 종양(sertoli cell tumor); 포막 세포 종양(theca cell tumor); 평활근종(leimyoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 근모세포종(myoblastoma); 근종(myomma); 근육종(myosarcoma); 횡문근종(rhabdomyoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 상의세포종(ependymoma); 신경절신경종(ganglioneuroma); 신경교종(glioma); 수모세포종(medulloblastoma); 수막종(meningioma); 신경종양(neurilemmoma); 신경모세포종; 신경상피종(neuroepithelioma); 신경섬유종(neurofibroma); 신경종(neuroma); 부신경절종(paraganglioma); 부신경절종 비크로마핀(paraganglioma nonchromaffin). 또한 치료될 수 있는 암 유형으로는 혈관각화종(angiokeratoma); 호산구 증가증을 동반한혈관림프성 증식증(angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia); 혈관종 경화(angioma sclerosing); 혈관종증(angiomatosis); 사구체종(glomangioma); 혈관내피종(hemangioendothelioma); 혈관종(hemangioma); 혈관주위세포종(hemangiopericytoma); 혈관육종(hemangiosarcoma); 림프관종(lymphangioma); 림프관근종(lymphangiomyoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 송과체종(pinealoma); 암육종(carcinosarcoma); 연골육종(chondrosarcoma); 방광육종 엽상체(cystosarcoma phyllodes); 섬유육종(fibrosarcoma); 혈관육종(hemangiosarcoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 백혈종(leukosarcoma); 지방육종(liposarcoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 근육종(myosarcoma); 점액육종(myxosarcoma); 난소암종(ovarian carcinoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 육종; 신생물(neoplasm); 신경섬유종증(nerofibromatosis); 자궁경부 이형성증(cervical dysplasia), 및 복막암(peritoneal cancer)이 있다.
본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 과증식성 장애의 예에는 B 세포 림프종(예를 들어, 다양한 형태의 호지킨병, 비-호지킨 림프종(NHL) 또는 중추신경계 림프종)을 포함한 B 세포암(B 세포 악성종양), 백혈병(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털세포 백혈병(Hairy cell leukemia), 만성 골수성 백혈병의 B 세포 모세포 변형, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 및 골수종(예를 들어 다발성 골수종)이 있다. 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 추가적인 B 세포 암에는 소 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), 소 림프구성 백혈병(small lymphocytic leukemia), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), B-세포 전림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia), 림프형질구성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma), 비장 변연부 림프종(splenic marginal zone lymphoma), 형질세포 골수종(plasma cell myeloma), 뼈의 고립성 형질세포종(solitary plasmacytoma of bone), 골외 형질세포종(extraosseous plasmacytoma), 결절외 변연부 점막 관련(MALT) 림프 조직의 B 세포 림프종(extra-nodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa-associated (MALT) lymphoid tissue), 결절 변연부 B 세포 림프종(nodal marginal zone B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 종격동(흉선) 거대 B 세포 림프종(mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma), 혈관내 거대 B 세포 림프종(intravascular large B-cell lymphoma), 원발성 삼출성 림프종(primary effusion lymphoma), 버킷 림프종/백혈병(Burkitt's lymphoma/leukemia), 불명확한 암성 잠재성의 B 세포 증식(B-cell proliferations of uncertain malignant potential), 림프종성 육아종증(lymphomatoid granulomatosis), 및 이식-후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder)가 있다.
일부 구현예에서, 본 원에 제공된 임의의 구현예에 따른 키메라 Tim4 수용체, 키메라 Tim4 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 키메라 Tim4 수용체 벡터, 또는 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 숙주 세포 및 PARP 억제제를 포함하는 병용 요법이 고형 종양의 치료에 유용하다. 일부 구현예에서, 고형 종양 암은 유방암, 난소암, 결장직장암, 난관암, 복막암 또는 전립선암이다. 일부 구현예에서, 유방암은 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer)이다. 일부 구현예에서, 난소암은 진행성 난소암(advanced ovarian cancer)이다. 일부 구현예에서, 전립선암은 진행성 전립선암이다. 일부 구현예에서, 고형 종양 암은 흑색종이다. 일부 구현예에서, 고형 종양 암은 폐암이다. 일부 구현예에서, 폐암은 비-소세포 폐암이다. 일부 구현예에서, 고형 종양 암은 유방암(BRCA) 돌연변이 암이다. 일부 구현예에서, 암은 BRCA1 돌연변이 암, BRCA2 돌연변이 암, 또는 둘 다이다.
감염병에는 감염원과 관련된 질병이 포함되며 다양한 세균(예를 들어, 병원성 이 콜라이, 에스 티피뮤리움(S. typhimurium), 피 아에루기노사(P. aeruginosa), 비 안트라시스(B. anthracis), 씨 보툴리늄(C. botulinum), 씨 디피실레(C. difficile), 씨 페르프린젠스(C. perfringens), 에이치 파이로리(H. pylori), 브이 콜레라에(V. cholerae), 리스테리아 스페시즈(Listeria spp.), 리켓차 스페시즈(Rickettsia spp.), 클라미디아 스페시즈(Chlamydia spp.) 등), 마이코박테리아 및 기생충(원생동물의 알려진 기생충 구성원 포함) 중 어느 하나를 포함한다. 감염성 바이러스에는 아데노바이러스, 분야바이러스, 헤르페스바이러스, 파포바바이러스, 유두종바이러스(예를 들어, HPV), 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 랍도바이러스(예를 들어, 광견병), 오르토믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자), 폭스바이러스(예를 들어, 우두), 레오바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스(예를 들어, HIV), 플라비바이러스(예를 들어, HCV, HBV) 등과 같은 진핵 바이러스가 포함된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용에 따른 키메라 Tim4 수용체를 포함하는 조성물은 대상체에서 지속적인 감염을 확립할 수 있는 미생물에 의한 감염을 치료하는데 사용된다.
본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 세포-결합된 형태(예를 들어, 표적 세포 집단의 유전자 요법)로 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, 림프 전구 세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 골수 전구 세포, 성숙한 골수 세포(이의 하위 집합 포함) 또는 이들의 조합의 표면 상에 발현된 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체를 치료하는 방법은 유효량의 키메라 Tim4 수용체 변형 세포(즉, 하나 이상의 키메라 Tim4 수용체를 발현하는 재조합 세포)를 투여하는 것을 포함한다. 키메라 Tim4 수용체 변형된 세포는 대상체에 대해 이종발생성, 동계, 동종이계 또는 자기유래일 수 있다.
키메라 Tim4 수용체 변형된 세포를 포함하는 약학 조성물은 의학 분야의 당업자에 의해 결정되는 바와 같이 치료(또는 예방)될 질병 또는 상태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 투여량, 적절한 기간 및 투여 빈도는 환자의 상태, 크기, 체중, 체표면적, 연령, 성별, 질병 유형 및 중증도, 투여되는 특정 치료법, 활성 성분의 특정 형태, 투여 시간 및 방법, 및 병용 투여되는 다른 약물과 같은 요인에 의해 결정될 것이다. 본 개시내용은 키메라 Tim4 수용체 변형 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합한 부형제에는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합이 포함된다. 다른 적합한 주입 배지는 식염수, Normosol R(Abbott), Plasma-Lyte A(Baxter), 수 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트를 포함하는 임의의 등장성 배지 제형일 수 있다.
약학 조성물 중 세포의 치료학적 유효량은 적어도 하나의 세포(예를 들어, 하나의 키메라 Tim4 수용체 변형 T 세포)이거나 보다 일반적으로 102개 초과 세포, 예를 들어 최대 106, 최대 107, 최대 108 세포, 최대 109 세포, 최대 1010 세포, 또는 최대 1011개 이상의 세포이다. 특정 구현예에서, 세포를 약 106 내지 약 1010 세포/㎡의 범위, 바람직하게는 약 107 내지 약 109 세포/㎡의 범위로 투여한다. 세포의 수는 조성물이 의도하는 궁극적인 용도 및 이에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 키메라 Tim4 수용체를 함유하도록 변형된 세포를 포함하는 조성물은 이러한 세포를 약 5% 내지 약 95% 이상 함유하는 세포 집단을 포함할 것이다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포를 포함하는 조성물은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 55%, 55%, 55%, 55%, 55%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 이와 같은 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 본원에 제공된 용도의 경우, 세포의 부피는 일반적으로 1리터 이하, 500 ㎖ 이하, 250 ㎖ 이하, 또는 100 ㎖ 이하이다. 따라서 원하는 세포의 밀도는 전형적으로 104 세포/㎖을 초과하며, 일반적으로 107 세포/㎖ 초과, 일반적으로 108 세포/㎖ 이상이다. 세포는 단일 주입으로 투여되거나 일정 기간에 걸쳐 수회 주입으로 투여될 수 있다. 키메라 Tim4 수용체 변형 세포의 반복 주입은 질병의 재발이나 질병 활성이 존재하는 경우, 수일, 수주, 수 개월 또는 심지어 수년 단위로 분리될 수 있다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 누적해서 106, 107, 108, 109, 1010, 또는 1011 세포 이상인 수회 주입으로 할당될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 투여를 위한 바람직한 용량은 약 107 세포/㎡, 약 5 x 107 세포/㎡, 약 108 세포/㎡, 약 5 x 108 세포/㎡, 약 109 세포/㎡, 약 5 x 109 세포/㎡, 약 1010 세포/㎡, 약 5 x 1010 세포/㎡, 또는 약 1011 세포/㎡이다.
본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체 조성물은 정맥내, 복강내, 비강내, 종양내, 골수, 림프절내 및/또는 뇌척수액내로 투여될 수 있다.
키메라 Tim4 수용체 조성물은 하나 이상의 추가 요법제와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 본 설명에 따른 키메라 Tim 조성물과 함께 투여될 수 있는 요법제의 예에는 방사선요법, 입양 세포 면역요법제(예를 들어, 재조합 TCR, 향상된 친화성 TCR, CAR, TCR-CAR, scTCR 융합 단백질, 수지상 세포 백신), 항체요법, 면역 체크포인트 분자 억제요법, UV 광선요법, 전기 펄스 요법, 고강도 집속 초음파요법, 종양 용해성 바이러스요법, 또는 약제 요법, 예를 들어 화학요법제, 치료펩티드, 호르몬, 앱타머, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, 소분자 요법 또는 이들의 조합이 포함된다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 숙주 세포는 하나 이상의 추가 요법제에 의해 유도된 표면 포스파티딜세린을 나타내는 스트레스 받거나, 손상되거나, 세포자멸성이거나, 괴사성이거나, 감염된 죽은 세포를 제거할 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 및 입양 세포 면역요법제(예를 들어, 상기 기재된 CAR, TCR-CAR, TCR 등)는 동일한 숙주 세포 또는 상이한 숙주 세포 중에서 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 및 입양 세포 면역요법제는 동일한 벡터 또는 별도의 벡터로부터 동일한 숙주 세포에서 발현된다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 및 입양 세포 면역요법제는 다시스트론 벡터로부터 동일한 숙주 세포에서 발현된다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 입양 세포 면역요법제와 동일한 숙주 세포 유형에서 발현된다(예를 들어, 키메라 Tim4 수용체는 CD4 T 세포에서 발현되고 CAR/또는 TCR은 CD4 T 세포에서 발현되거나, 또는 키메라 Tim4 수용체는 CD8 T 세포에서 발현되고 CAR/또는 TCR은 CD8 T 세포에서 발현된다). 다른 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체는 입양 면역요법제와 상이한 숙주 세포 유형에서 발현된다(예를 들어, 키메라 Tim4 수용체는 CD4 T 세포에서 발현되고 CAR/또는 TCR은 CD8 T 세포에서 발현된다). 키메라 Tim4 수용체로 조작된 면역 세포 또는 세포 하위집합과 세포 면역요법제(예를 들어, CAR, TCR 등)와의 조합을 포함하는 세포 면역요법 조성물, 제조 방법 및 사용 방법은 PCT 국제 공보 WO2019/191340에 기재되어 있으며, 이는 전체 내용이 참고로 본원에 포함된다.
재조합 TCR, 향상된 친화성 TCR, CAR, TCR-CAR, 또는 scTCR 융합 단백질이 표적화할 수 있는 예시적인 항원은 WT-1, 메소텔린, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A3, HPV E7, 설비빈, α태아단백질 및 종양 특이적 신생항원을 포함한다.
본 개시내용의 CAR은 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 종양 항원, 자가면역 질환 항원을 포함하는 다양한 항원을 표적화할 수 있다. CAR이 표적화할 수 있는 예시적인 항원은 CD138, CD38, CD33, CD123, CD72, CD79a, CD79b, 메소텔린, PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, CD20, CD23, CD24, CD37, CD30, CA125, CD56, c-Met, EGFR, GD-3, HPV E6, HPV E7, MUC-1, HER2, 폴레이트 수용체 α, CD97, CD171, CD179a, CD44v6, WT1, VEGF-α, VEGFR1, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-11Rα, PSA, FcRH5, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, CEA, 에프린 A2, 에프린 B2, Lewis A 항원, Lewis Y 항원, MAGE, MAGE-A1, RAGE-1, 폴레이트 수용체 β, EGFRviii, VEGFR-2, LGR5, SSX2, AKAP-4, FLT3, 푸코실 GM1, GM3, o-아세틸-GD2 및 GD2를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 Tim4 수용체는 CD72-특이적 CAR과 함께 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, CD72-특이적 CAR의 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ii) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 109에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(iii) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 302에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 303에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 304에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 305에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 306에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 307에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(iv) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 308에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 309에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 310에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 311에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 312에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 313에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(v) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 314에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 315에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 316에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 317에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 319에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(vi) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 320에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 321에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 322에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 323에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 324에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 325에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(vii) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 326에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 327에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 328에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 329에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 330에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 331에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(viii) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 332에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 333에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 334에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 335에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 336에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 337에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ix) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 338에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 339에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 340에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 341에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 342에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 343에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(x) 중쇄 가변(VH) 영역으로서, 여기서 VH 영역이 서열번호 344에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR-1); 서열번호 345에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR-2); 및 서열번호 346에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR-3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 경쇄 가변(VL) 영역으로서, 여기서 VL 영역이 서열번호 347에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR-1); 서열번호 348에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR-2); 및 서열번호 349에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR-3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 구현예에서, CAR의 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 113에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 113에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 114에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 114에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역;
(ii) 서열번호 115에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 115에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 116에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 116에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역;
(iii) 서열번호 117에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 117에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 118에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 118에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역;
(iv) 서열번호 119에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 119에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 120에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 120에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역;
(v) 서열번호 121에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 121에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 122에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역;
(vi) 서열번호 123에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 123에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 124에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역;
(vii) 서열번호 125에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 125에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 126에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역;
(viii) 서열번호 127에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 127에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 128에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역; 또는
(ix) 서열번호 129에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 129에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 130에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 130에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역.
일부 구현예에서, VH 영역과 VL 영역은 유연한 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 VH-링커-VL 배향 또는 VL-링커-VH 배향일 수 있는 VH 영역, VL 영역, 및 유연성 링커를 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 유연성 링커는 약 5 내지 약 50개의 아미노산 길이를 갖고 글리신, 세린 및/또는 트레오닌이 풍부한 서열을 포함한다. 예시적인 링커에는 (GGGGS)x 또는 (GGGS)x(여기서 x=2-5)를 갖는 링커가 포함된다. 일부 구현예에서, 유연한 링커는 서열번호 165-170 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 도메인은 서열번호 131-164 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 131-164 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용에 제공된 CAR의 세포외 도메인은 선택적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 세포외, 비-신호전달 스페이서 또는 링커 도메인을 포함한다. 포함되는 경우, 이러한 스페이서 또는 링커 도메인은 결합 도메인을 숙주 세포 표면으로부터 멀리 위치시켜 적절한 세포 대 세포 접촉, 결합 및 활성화를 추가로 가능하게 할 수 있다. 세포외 스페이서 도메인은 일반적으로 CAR의 세포외 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다. 세포외 스페이서의 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 결합 도메인 크기 및 친화도에 기반하여 표적 분자 결합을 최적화하기 위해 다양할 수 있다(예를 들어, 문헌[Guest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005]; PCT 공보 WO　2014/031687을 참조하시오). 특정 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD)이다. 면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 변경된 IgG4 힌지 영역은 PCT 공보 WO 2014/031687에 기재되어 있으며, 이는 힌지 영역에 대해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 ESKYGPPCPPCP(서열번호 9)의 아미노산 서열을 갖는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함한다.
본원에 기재된 CAR에 사용될 수 있는 힌지 영역의 다른 예에는 야생형 또는 이의 변이체일 수 있는 CD8a, CD4, CD28 및 CD7과 같은 1형 막 단백질의 세포외 영역으로부터의 힌지 영역이 포함된다. 예시적인 CD8a 힌지 영역은 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 CD28 힌지 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 면역글로불린 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다(예를 들어, PCT 공보 WO2014/031687을 참조하며, 이는 스페이서에 대해 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다). 더욱 추가의 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 II형 C-렉틴의 줄기 영역(C-형 렉틴 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 도메인)을 포함할 수 있다. II형 C-렉틴에는 CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D가 포함된다.
본 개시내용의 CAR은 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이들을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인의 길이는 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산이다. 막관통 도메인은 숙주 세포막을 가로질러 숙주 세포막에 CAR을 고정시키는 소수성 알파 나선이다. 막관통 도메인은 결합 도메인, 또는 존재하는 경우, 세포외 스페이서 도메인에 직접 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 내재 막 단백질(예를 들어, 수용체, 분화 클러스터(CD) 분자, 효소, 수송체, 세포 부착 분자 등)로부터 유래된다. 막관통 도메인은 세포외 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인과 동일한 분자로부터 선택 될 수 있다(예를 들어, CAR은 CD28 공동자극 신호전달 도메인 및 CD28 막관통 도메인을 포함한다). 일부 구현예에서, 막관통 도메인 및 세포외 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인, 세포외 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기 위한 예시적인 막관통 도메인은 CD28, CD2, CD4, CD8a, CD5, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD9, CD16, CD22, CD25, CD27, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95(Fas), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD154(CD40L), CD200R, CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD300, CD357(GITR), A2aR, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPα, pTα, TCRα, TCRβ, TIM3, TRIM, LPA5, 및 Zap70 막관통 도메인을 포함한다. 예시적인 CD8a 막관통 도메인은 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 CD28 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 효과기 도메인이고, CAR의 세포외 도메인이 표적 분자(예를 들어, CD72)에 결합하는 것에 반응하여 기능적 신호를 세포에 전달할 수 있으며, 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상적인 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화한다. 일부 구현예에서, CAR은 T 세포의 기능, 예를 들어 세포용해 활성 또는 T 헬퍼 활성, 예를 들어 사이토카인 분비 또는 기타 인자를 유도한다. 세포내 신호전달 도메인은 충분한 신호전달 활성을 유지하는 세포내 신호전달 분자의 임의의 부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 항원 수용체 성분(예를 들어, TCR) 또는 공동자극 분자로부터 획득된다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 또는 공동자극 분자의 전장 세포내 신호전달 도메인이 사용된다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 또는 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되나, 단 상기 절두된 부분은 충분한 신호 전달 활성을 유지해야 한다. 추가 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 변이체가 충분한 신호전달 활성을 유지하는 한(즉, 기능적 변이체), 항원 수용체 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 전장 또는 절두된 부분의 변이체이다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 함유 신호전달 도메인을 포함한다. 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM은 일반적으로 YXXL/I-X6-8-YXXL/I의 보존된 모티프로 지칭되는 적어도 하나(1개, 2개, 3개, 4개 이상)의 ITAM을 포함한다. ITAM 함유 신호전달 도메인은 항원 결합 또는 리간드 관여 후에 T 세포 활성화 신호전달을 개시할 수 있다. ITAM-신호전달 도메인은 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD278(ICOS), DAP12, FcRγ 및 CD66d의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 CD3ζ 신호전달 도메인은 서열번호 177 또는 178의 아미노산 서열을 포함한다.
CAR 세포내 신호전달 도메인은 선택적으로 공동자극 신호전달 도메인을 포함하며, 이는 1차 또는 고전적(예를 들어, ITAM 구동) 활성화 신호와 함께 활성화될 때, T 세포 반응, 예를 들어 T 세포 활성화, 사이토카인 생성, 증식, 분화, 생존, 효과기 기능, 또는 이들의 조합을 촉진하거나 향상시킨다. CAR에 사용하기 위한 공동자극 신호전달 도메인에는 예를 들어 CD27, CD28, CD40L, GITR, NKG2C, CARD1, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD226, CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLP76, TRIM, ZAP70, 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 또는 4-1BB(CD137) 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 CD28 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호 179 또는 서열번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함한다(고유 CD28 단백질의 L186G, L187G 돌연변이를 함유하는 변이체). 예시적인 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 1개, 2개 또는 그 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 또는 3세대 CAR이다. 1세대 CAR은 일반적으로 T 세포 활성화 신호를 제공하기 위해 CD3ζ, FcγRI의 세포내 신호전달 도메인, 또는 다른 ITAM 함유 활성화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는다. 2세대 CAR은 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어, 내인성 T 세포 공동자극 수용체, 예를 들어 CD28, 4-1BB 또는 ICOS로부터의 공동자극 신호전달 도메인)을 추가로 포함한다. 3세대 CAR은 ITAM 함유 활성화 도메인, 제1 공동자극 신호전달 도메인 및 제2 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인, 결합 도메인, 링커, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 또는 공동자극 도메인 중 하나 이상은 접합 아미노산을 포함한다. "접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 단백질의 2개의 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 사이, 예를 들어 결합 도메인과 인접한 링커 사이, 막관통 도메인과 인접한 세포외 또는 세포내 도메인 사이, 또는 2개의 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편을 연결하는 링커의 한쪽 또는 양쪽 단부 사이(예를 들어, 링커와 인접한 결합 도메인 사이 또는 링커와 인접한 힌지 사이)의 하나 이상(예를 들어 약 2-20개)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질의 작제물 설계로부터 생성될 수 있다(예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구성하는 동안 제한 효소 부위 또는 자기-절단 펩티드 서열의 사용으로부터 생성되는 아미노산 잔기). 예를 들어, 융합 단백질의 막관통 도메인은 아미노-말단 단부, 카르복시-말단 단부, 또는 이들 둘 다에 하나 이상의 접합 아미노산을 가질 수 있다.
본 개시내용의 CAR은 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 이들의 트랜스제닉 종, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 포유동물 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 쥐, 키메라, 인간 또는 인간화 수용체이다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 182 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 183 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 183에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 184 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 184에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 185 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 185에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD28 힌지, CD28 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 186 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD28 힌지, CD28 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 187 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 187에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD28 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 188 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD28 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 189 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 189에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD8a 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 190 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 190에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD8a 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 191 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 191에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD8a 힌지, CD8a 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 192 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD8a 힌지, CD8a 막관통 도메인, CD28 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 193 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 193에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD8a 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 194 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD8a 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 195 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 195에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD8a 힌지, CD8a 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 196 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 196에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 CD8a 힌지, CD8a 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 197 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 197에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 198 또는 아미노산 1-21이 없는 서열번호 198에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 199 또는 아미노산 1-20이 없는 서열번호 199에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 200 또는 아미노산 1-18이 없는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 CAR은 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 IgG4 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 서열번호 201 또는 아미노산 1-20이 없는 서열번호 201에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 표 3, 예를 들어 서열번호 182-234 중 어느 하나에 제시된 CAR의 아미노산 서열, 또는 신호 서열이 없는 서열번호 182-234 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기 위한 신호 펩티드, 결합 도메인, 세포외 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 대한 예시적인 서열 및 예시적인 CAR 서열이 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
CD72 CAR 및 성분의 구현예
일부 구현예에서, 본 개시내용의 CD72 CAR은 펩티드 태그, 예를 들어 Myc 태그(서열번호 239)를 함유한다. 일부 구현예에서, Myc 태그는 CD72 CAR 내로, 신호 펩티드 다음이지만 scFv 결합 도메인의 제1 가변 영역 앞에 삽입된다. Myc 태그를 포함하는 본원에 제공된 CAR 서열의 경우, 서열 내에 삽입된 Myc 태그 없이 동일한 CAR 서열이 고려되는 것으로 이해된다.
방사선요법에는 외부 빔 방사선요법(예를 들어, 통상적인 외부 빔 방사선요법, 정위 방사선, 3차원 등각 방사선요법, 강도 변조 방사선요법, 체적 변조 아크 요법, 입자 요법, 양성자 요법 및 오거 요법), 근접요법, 전신 방사성 동위원소 요법, 수술 중 방사선요법 또는 이들의 임의의 조합이 있다.
본원에 기재된 키메라 Tim 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 항체에는 리툭시맙, 페르투주맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 베바시주맙, 압식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 바실리지맙, 벨리무맙, 베즐로톡수맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 올라라투맙, 팔리비주맙, 파니투무맙 및 토실리주맙이 있다.
본원에 기재된 키메라 Tim 조성물과 함께 사용될 수 있는 면역 체크포인트 분자의 예시적인 억제제에는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, HVEM, 아데노신, GAL9, VISTA, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, PVRL2, PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, A2aR, CD244/2B4, CD160, TIGIT, LAIR-1, PVRIG/CD112R을 표적화하는 체크포인트 억제제, 또는 이들의 임의의 조합이 있다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체, 펩티드, RNAi 작용제 또는 소분자일 수 있다. CTLA-4에 특이적인 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙일 수 있다. PD-1에 특이적인 항체는 피딜리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙일 수 있다. PD-L1에 특이적인 항체는 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙일 수 있다.
본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 화학요법제는 알킬화제, 백금계 작용제, 세포독성제, 염색질 기능 억제제, 토포이소머라제 억제제, 미세소관 억제 약물, DNA 손상제, 대사길항물질(예를 들어, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당 변형 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제(예를 들어, 삽입제) 및 DNA 복구 억제제를 포함할 수 있다.
화학요법에는 유사분열 또는 세포 분열을 억제하는 비특이적 세포독성제뿐만 아니라 종양 성장, 진행 및 전이에 관여하는 특정 분자(예를 들어, 종양유전자)를 표적화하여 암세포의 성장과 확산을 차단하는 분자 표적요법이 포함된다. 본원에 기재된 발현 카세트 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 비특이적 화학요법제는 알킬화제, 백금계 제제, 세포독성제, 염색질 기능 억제제, 토포이소머라제 억제제, 미세소관 억제 약물, DNA 손상제, 대사길항물질(예를 들어, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당 변형 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제(예를 들어, 삽입제), 저메틸화제 및 DNA 복구 억제제를 포함할 수 있다.
본원에서 고려되는 병용 요법에 사용하기 위해 고려되는 화학요법제의 예에는 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 코비메티닙, 아나스트로졸(Arimidex®), 비칼루타마이드(Casodex®), 블레오마이신 설페이트(Blenoxane®), 부설판(Myleran®), 부설판 주사(Busulfex®), 카페시타빈(Xeloda®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카보플라틴(Paraplatin®), 카무스틴(BiCNU®), 클로람부실(Leukeran®), 시스플라틴(Platinol®), 클라드리빈(Leustatin®), 사이클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 시타라빈, 시토신 아라비노사이드(Cytosar-U®), 시타라빈 리포솜 주사(DepoCyt®), 다카르바진(DTIC-Dome®), 닥티노마이신(Actinomycin D, Cosmegan), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®)), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사(DaunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀(Taxotere®), 독소루비신 하이드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 에토포사이드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 5-플루오로우라실(Adrucil®, Efudex ®), 플루타미드(Eulexin®), 테자시티빈, 젬시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아(Hydrea®), 이다루비신(Idamycin®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(Camptosar® ), L-아스파라기나제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(Alkeran®), 6-메르캅토퓨린(Purinethol®), 메토트렉세이트(Folex®), 미톡산트론(Novantrone®), 마일로타그, 파클리탁셀(Taxol®), 피닉스(Yttrium90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 폴리페프로산 20(카르무스틴 임플란트 함유)(Gliadel®), fdabra 타목시펜 시트레이트(Nolvadex®), 테니포사이드(Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(Tirazone®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(Hycamptin®), 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Oncovin) ®), 이브루티닙, 베네토클락스, 크리조티닙, 알렉티닙, 브리가티닙, 세리티닙 및 비노렐빈(Navelbine®)이 포함된다.
본원에서 고려되는 병용 요법에 사용하기 위한 예시적인 알킬화제에는 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠: 우라실 머스타드(Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen Mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), 클로르메틴(Mustargen®), 사이클로포스파미드(Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™), 이포스파미드(Mitoxana®), 멜팔란(Alkeran®), 클로람부실(Leukeran®), 피포브로만(Amedel®, Vercyte®), 트리에틸렌멜라민(Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), 트리에틸렌티오포스포라민, 테모졸로마이드(Temodar®), 티오테파(Thioplex®), 부설판(Busilvex®, Myleran®), 카르무스틴(BiCNU®), 로무스틴(CeeNU®), 스트렙토조신(Zanosar®) 및 다카르바진(DTIC-Dome®)이 포함된다. 본원에서 고려되는 병용 요법에 사용하기 위한 추가의 예시적인 알킬화제에는 옥살리플라틴(Eloxatin®); 테모졸로미드(Temodar® 및 Temodal®); 닥티노마이신(악티노마이신-D로도 알려짐, Cosmegen®); 멜팔란(L-PAM, L-사르콜리신 및 페닐알라닌 머스타드, Alkeran®으로도 알려짐); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 알려짐, Hexalen®); 카르무스틴(BiCNU®); 벤다무스틴(Treanda®); 부설판(Busulfex® 및 Myleran®); 카르보플라틴(Paraplatin®); 로무스틴(CCNU로도 알려짐, CeeNU®); 시스플라틴(CDDP로도 알려짐, Platinol® 및 Platinol®-AQ); 클로람부실(Leukeran®); 사이클로포스파미드(Cytoxan® 및 Neosar®); 다카르바진(DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복스아미드로도 알려짐, DTIC-Dome®); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 알려짐, Hexalen®); 이포스파마이드(Ifex®); 프레드누무스틴; 프로카바진(Matulane®); 메클로레타민(질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 하이드로클로라이드로도 알려짐, Mustargen®); 스트렙토조신(Zanosar®); 티오테파(티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA로도 알려짐, Thioplex®); 사이클로포스파미드(Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); 및 벤다무스틴 HCl(Treanda®)이 포함된다.
본원에서 고려되는 병용 요법에 사용하기 위한 예시적인 백금계 작용제에는 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 피코플라틴, 사트라플라틴, 페난트리플라틴 및 트리플라틴 테트라니트레이트가 포함된다.
병용 요법에 사용하기 위한 예시적인 저메틸화제에는 아자시티딘 및 데시타빈이 포함된다.
본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 분자 표적화 억제제에는 암세포 성장 및 생존과 관련된 분자를 표적화하는 소분자가 포함되며, 예를 들어 수용체 티로신 키나제 억제제, RAF 억제제, BCL-2 억제제, ABL 억제제, TRK 억제제, c-KIT 억제제, c-MET 억제제, CDK4/6 억제제, FAK 억제제, FGFR 억제제, FLT3 억제제, IDH1 억제제, IDH2 억제제, PDGFRA 억제제 및 RET 억제제가 포함된다.
예시적인 분자 표적요법에는 호르몬 길항제, 신호 전달 억제제, 유전자 발현 억제제(예를 들어, 번역 억제제), 아팝토시스 유도제, 혈관신생 억제제(예를 들어, VEGF 경로 억제제), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, EGF/EGFR 경로 억제제), 성장 인자 억제제, GTPase 억제제, 세린/트레오닌 키나제 억제제, 전사 인자 억제제, 암과 관련된 운전자 돌연변이 억제제, B-Raf 억제제, RAF 억제제, MEK 억제제, mTOR 억제제, 아데노신 경로 억제제, EGFR 억제제, PI3K 억제제, BCL2 억제제, VEGFR 억제제, MET 억제제, MYC 억제제, BCR-ABL 억제제, ABL 억제제, HER2 억제제, H-RAS 억제제, K-RAS 억제제, PDGFR 억제제, ALK 억제제, ROS1 억제제, BTK 억제제, TRK 억제제, c-KIT 억제제, c-MET 억제제, CDK4/6 억제제, FAK 억제제, FGFR 억제제, FLT3 억제제, IDH1 억제제, IDH2 억제제, PARP 억제제, PDGFRA 억제제 및 RET 억제제가 포함된다. 특정 구현예에서, 분자 표적요법의 사용은 분자 표적(예를 들어, 운전자 종양유전자)을 보유하는 종양을 갖는 것으로 확인된 대상체에게 분자 표적에 특이적인 분자 표적 요법을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 분자 표적은 활성화 돌연변이를 갖는다. 특정 구현예에서, 분자 표적 억제제와 병용되는 키메라 Tim4 수용체 변형 세포의 사용은 항종양 반응의 크기, 항종양 반응의 지속성, 또는 이들 둘 다를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 전형적인 용량보다 낮은 분자 표적요법이 키메라 Tim4 수용체 변형 세포와 함께 사용된다.
예시적인 혈관신생 억제제에는 A6(Angstrom Pharmaceuticals), ABT-510(Abbott Laboratories), ABT-627(Atrasentan)(Abbott Laboratories/Xinlay), ABT-869(Abbott Laboratories), 액티미드(CC4047, Pomalidomide)(Celgene Corporation), AdGVPEDF.11D(GenVec), ADH-1(Exherin)(Adherex Technologies), AEE788(Novartis), AG-013736(Axitinib)(Pfizer), AG3340(Prinomastat)(Agouron Pharmaceuticals), AGX1053(AngioGenex), AGX51(AngioGenex), ALN-VSP(ALN-VSP O2)(Alnylam Pharmaceuticals), AMG 386(Amgen), AMG706(Amgen), 아파티닙(YN968D1)(Jiangsu Hengrui Medicine), AP23573(Ridaforolimus/MK8669)(Ariad Pharmaceuticals), AQ4N(Novavea), ARQ 197(ArQule), ASA404(Novartis/Antisoma), 아트프리모드(Callisto Pharmaceuticals), ATN-161(Attenuon), AV-412(Aveo Pharmaceuticals), AV-951(Aveo Pharmaceuticals), 아바스틴(Bevacizumab)(Genentech), AZD2171(Cediranib/Recentin)(AstraZeneca), BAY 57-9352(Telatinib)(Bayer), BEZ235(Novartis), BIBF1120(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals), BIBW 2992(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals), BMS-275291(Bristol-Myers Squibb), BMS-582664(Brivanib)(Bristol-Myers Squibb), BMS-690514(Bristol-Myers Squibb), 칼시트리올, CCI-779(Torisel)(Wyeth), CDP-791(ImClone Systems), 세플라토닌(Homoharringtonine/HHT)(ChemGenex Therapeutics), 셀레브렉스(Celecoxib)(Pfizer), CEP-7055(Cephalon/Sanofi), CHIR-265(Chiron Corporation), NGR-TNF, COL-3(Metastat)(Collagenex Pharmaceuticals), 콤브레타스타틴(Oxigene), CP-751,871(Figitumumab)(Pfizer), CP-547,632(Pfizer), CS-7017(Daiichi Sankyo Pharma), CT-322(Angiocept)(Adnexus), 커큐민, 달테파린(Fragmin)(Pfizer), 디설피람(Antabuse), E7820(Eisai Limited), E7080(Eisai Limited), EMD 121974(Cilengitide)(EMD Pharmaceuticals), ENMD-1198(EntreMed), ENMD-2076(EntreMed), 엔도스타(Simcere), 에르비툭스(ImClone/Bristol-Myers Squibb), EZN-2208(Enzon Pharmaceuticals), EZN-2968(Enzon Pharmaceuticals), GC1008(Genzyme), 제니스테인, GSK1363089(Foretinib)(GlaxoSmithKline), GW786034(Pazopanib)(GlaxoSmithKline), GT-111(Vascular Biogenics Ltd.), IMC-1121B(Ramucirumab)(ImClone Systems), IMC-18F1(ImClone Systems), IMC-3G3(ImClone LLC), INCB007839(Incyte Corporation), INGN 241(Introgen Therapeutics), 이레사(ZD1839/Gefitinib), LBH589(Faridak/Panobinostst)(Novartis), 류센티스(Ranibizumab)(Genentech/Novartis), LY317615(Enzastaurin)(Eli Lilly and Company), 마쿠젠(Pegaptanib)(Pfizer), MEDI522(Abegrin)(MedImmune), MLN518(Tandutinib)(Millennium), 네오바스타트(AE941/Benefin)(Aeterna Zentaris), 넥사바(Bayer/Onyx), NM-3(Genzyme Corporation), 노스카핀(Cougar Biotechnology), NPI-2358(Nereus Pharmaceuticals), OSI-930(OSI), 팔로미드 529(Paloma Pharmaceuticals, Inc.), 판젬 캡슐(2ME2)(EntreMed), 판젬 NCD(2ME2)(EntreMed), PF-02341066(Pfizer), PF-04554878(Pfizer), PI-88(Progen Industries/Medigen Biotechnology), PKC412(Novartis), 폴리페논 E(녹차 추출물)(Polypheno E International, Inc.), PPI-2458(Praecis Pharmaceuticals), PTC299(PTC Therapeutics), PTK787(Vatalanib)(Novartis), PXD101(Belinostat)(CuraGen Corporation), RAD001(Everolimus)(Novartis), RAF265(Novartis), 레고라페닙(BAY73-4506)(Bayer), 레블리미드(Celgene), 레타안(Alcon Research), SN38(Liposomal)(Neopharm), SNS-032(BMS-387032)(Sunesis), SOM230(Pasireotide)(Novartis), 스쿠알라민(Genaera), 슈라민, 수텐트(Pfizer), 타세바(Genentech), TB-403(Thrombogenics), 템포스타틴(Collard Biopharmaceuticals), 테트라티오몰리브데이트(Sigma-Aldrich), TG100801(TargeGen), 탈리도마이드(Celgene Corporation), 틴자파린 나트륨, TKI258(Novartis), TRC093(Tracon Pharmaceuticals Inc.), VEGF Trap(Aflibercept)(Regeneron Pharmaceuticals), VEGF Trap-Eye(Regeneron Pharmaceuticals), 베글린(VasGene Therapeutics), 보르테조밉(Millennium), XL184(Exelixis), XL647(Exelixis), XL784(Exelixis), XL820(Exelixis), XL999(Exelixis), ZD6474(AstraZeneca), 보리노스타트(Merck), 및 ZSTK474가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 B-Raf 억제제에는 베무라페닙, 다브라페닙 및 엔코라페닙이 포함된다.
예시적인 MEK 억제제에는 비니메티닙, 코비메티닙, 레파메티닙, 셀루메티닙 및 트라메티닙이 포함된다.
예시적인 BTK 억제제에는 이브루티닙, 피르토브루티닙(Loxo-305), 티라브루티닙, 톨레브루티닙, 에보브루티닙, 페네브루티닙(GDC-0853), 아칼라브루티닙, 베카브루티닙(SNS-062), ONO-4059, 스페브루티닙, 자누브루티닙(BGB-3111), HM71224, 및 M7583이 포함된다.
예시적인 TRK 억제제에는 엔트렉티닙, 라로트렉티닙, CH7057288, ONO-7579, LOXO-101, 레스타우르티닙 및 LOXO-195가 포함된다.
예시적인 c-KIT 억제제에는 이마틴브, 수니틴브 및 포나티닙이 포함된다.
예시적인 c-MET 억제제에는 카프마티닙, 크리조티닙, 티반티닙, 오나르투주맙, INCB28060, AMG-458, 사볼리티닙 및 테포티닙이 포함된다.
예시적인 CDK4/6 억제제에는 팔보시클립, 리보시클립, 아베마시클립 및 트리라시클립이 포함된다.
예시적인 FAK 억제제에는 데팩티닙, GSK2256098, BI853520 및 PF-00562271이 포함된다.
예시적인 FGFR 억제제에는 에르다피티닙, 페미가티닙, 인피그라티닙, 로가라티닙, AZD4547, BGJ398, FP-1039 및 ARQ 087이 포함된다.
예시적인 FLT-3 억제제에는 퀴자르티닙, 크레놀라닙, 길테리티닙, 미도스타우린 및 레스타우르티닙이 포함된다.
예시적인 IDH1 억제제에는 이보시데닙, BAY-1436032 및 AGI-5198이 포함된다.
예시적인 IDH2 억제제에는 에나시데닙이 포함된다.
예시적인 PARP 억제제에는 탈라조파립, 니라파립, 루카파립, 올라파립(AZ 2281, KU59436), 벨리파립(ABT 888), CEP 9722, E7016, AG014699, MK4827, BMN-673 및 파미파립(BGB-290)이 포함된다. 예시적인 PDGFRA 억제제에는 이마티닙, 레고라페닙, 크레놀라닙 및 올라라투맙이 포함된다.
예시적인 범-RAF 억제제에는 벨바라페닙, LXH254, LY3009120, INU-152 및 HM95573이 포함된다.
예시적인 RET 억제제에는 렌바티닙, 알렉티닙, 반데타닙, 카보잔티닙, BLU-667 및 LOXO-292가 포함된다.
예시적인 ROS1 억제제에는 세리티닙, 로라티닙, 엔트렉티닙, 크리조티닙, TPX-0005 및 DS-6051b가 포함된다.
예시적인 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 억제제에는 베바시주맙(Avastin®), 악시티닙(Inlyta®); 브리바닙 알라니네이트(BMS-582664, (S)-((R)-1-(4-(4-플루오로-2-메틸-1H-인돌-5-일옥시)-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일옥시)프로판-2-일)2-아미노프로파노에이트); 소라페닙(Nexavar®); 파조파닙(Votrient®); 수니티닙 말레이트(Sutent®); 세디라닙(AZD2171, CAS 288383-20-1); 바르가테프(BIBF1120, CAS 928326-83-4); 포레티닙(GSK1363089); 텔라티닙(BAY57-9352, CAS 332012-40-5); 아파티닙(YN968D1, CAS 811803-05-1); 이마티닙(Gleevec®); 포나티닙(AP24534, CAS 943319-70-8); 티보자닙(AV951, CAS 475108-18-0); 레고라페닙(BAY73-4506, CAS 755037-03-7); 바탈라닙 디하이드로클로라이드(PTK787, CAS 212141-51-0); 브리바닙(BMS-540215, CAS 649735-46-6); 반데타닙(Caprelsa® 또는 AZD6474); 모테사닙 디포스페이트(AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인돌-6-일)-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-3-피리딘카르복스아미드, PCT 공보 WO 02/066470에 기재됨); 도비티닙 디락트산(TKI258, CAS 852433-84-2); 린파닙(ABT869, CAS 796967-16-3); 카보잔티닙(XL184, CAS 849217-68-1); 레스타우르티닙(CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸릴]메틸]티오]-2-티아졸릴]-4-피페리딘카르복스아미드(BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸사이클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8); 4-메틸-3-[[1-메틸-6-(3-피리디닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]아미노]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈아미드(BHG712, CAS 940310-85-0); 및 아플리베르셉트(Eylea®)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
예시적인 EGF 경로 억제제에는 티르포스틴 46, EKB-569, 에를로티닙(Tarceva®), 게피티닙(Iressa®), 에르비툭스, 니모투주맙, 라파티닙(Tykerb®), 세툭시맙(항-EGFR mAb), 188Re-표지된 니모투주맙(항-EGFR mAb), 및 WO 97/02266, EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0 520 722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, 미국특허 5,747,498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 및 WO 96/33980에 일반적이고 구체적으로 개시된 화합물이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 EGFR 항체에는 세툭시맙(Erbitux®); 파니투무맙(Vectibix®); 마투주맙(EMD-72000); 트라스투주맙(Herceptin®); 니모투주맙(hR3); 잘루투무맙; TheraCIM h-R3; MDX0447(CAS 339151-96-1); 및 ch806(mAb-806, CAS 946414-09-1)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에는 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®); 세리티닙; 브리가티닙; 오시메르티닙; 다코미티닙; 이코티닙; 게피티닙(Iressa®); N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3"S")-테트라하이드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4(디메틸아미노)-2-부텐아미드, Tovok®); 반데타닙(Caprelsa®); 라파티닙(Tykerb®); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); 카네르티닙 디하이드로클로라이드(CI-1033); 6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(AEE788, CAS 497839-62-0); 무브리티닙(TAK165); 펠리티닙(EKB569); 아파티닙(BIBW2992); 네라티닙(HKI-272); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카르밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르(BMS599626); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸사이클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8); 4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀(PKI166, CAS 187724-61-4); 로셀리티닙이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 mTOR 억제제에는 라파마이신(Rapamune®), 및 이의 유사체 및 유도체; SDZ-RAD; 템시롤리무스(Torisel®; CCI-779로도 알려짐); 리다포롤리무스(공식적으로 데페롤리무스로 알려짐, (1R,2R,4S)-4-[(2R) -2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디하이드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시사이클로헥실 디메틸포스피네이트(AP23573 및 MK8669로도 알려짐, PCT 공보 WO 03/064383에 기재됨); 에베롤리무스(Afinitor® 또는 RAD001); 라파마이신(AY22989, Sirolimus®); 시마피모드(CAS 164301-51-3); (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올(AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-하이드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파틸L-세린-, 내부 염(SF1126, CAS 936487-67-1)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K) 억제제에는 듀벨리십, 이델라리십, 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸설포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린(GDC 0941로도 알려짐, PCT 공보 WO 09/036082 및 WO 09/055730에 기재되어 있음); 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디하이드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴(BEZ 235 또는 NVP-BEZ 235로도 알려짐, PCT 공보 WO 06/122806에 기재되어 있음); 4-(트리플루오로메틸)-5-(2,6-디모르폴리노피리미딘-4-일)피리딘-2-아민(BKM120 또는 NVP-BKM120으로도 알려짐, PCT 공보 WO2007/084786에 기재됨); 토자세르팁(VX680 또는 MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-피리디닐)-6-퀴놀리닐]메틸렌]-2,4-티아졸리딘디온(GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(아세틸옥시)-1-[(디-2-프로페닐아미노)메틸렌]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-옥타하이드로-11-하이드록시-4-(메톡시메틸)-4a,6a-디메틸-사이클로펜타[5,6]나프토[1,2-c]피란-2,7,10(1H)-트리온(PX866, CAS 502632-66-8); 및 8-페닐-2-(모르폴린-4-일)-크로멘-4-온(LY294002, CAS 154447-36-6)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 단백질 키나제 B(PKB) 또는 AKT 억제제에는 8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온(MK-2206, CAS 1032349-93-1); 페리포신(KRX0401); 4-도데실-N-1,3,4-티아디아졸-2-일-벤젠설폰아미드(PHT-427, CAS 1191951-57-1); 4-[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-7-[(3S)-3-피페리디닐메톡시]-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-4-일]-2-메틸-3-부틴-2-올(GSK690693, CAS 937174-76-0); 8-(1-하이드록시에틸)-2-메톡시-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6H-디벤조[b,d]피란-6-온(팔로미드 529, P529 또는 SG-00529); 트리시르빈(6-아미노-4-메틸-8-(β-D-리보푸라노실)-4H,8H-피롤로[4,3,2-de]피리미도[4,5-c]피리다진); (αS)-α-[[[5-(3-메틸-1H-인다졸-5-일)-3-피리디닐]옥시]메틸]-벤젠에탄아민(A674563, CAS 552325-73-2); 4-[(4-클로로페닐)메틸]-1-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딘아민(CCT128930, CAS 885499-61-6); 4-(4-클로로페닐)-4-[4-(1H 피라졸-4-일)페닐]-피페리딘(AT7867, CAS 857531-00-1); 및 아르켁신(RX-0201, CAS 663232-27-7)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포와 병용되는 티로신 키나제 억제제는 역형성 림프종 키나제(ALK) 억제제이다. 예시적인 ALK 억제제에는 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙, 달란터셉트, 엔트렉티닙 및 로라티닙이 포함된다.
키메라 Tim4 수용체 변형된 세포가 하나 이상의 추가 요법과 함께 투여되는 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 요법은 단일 요법으로 투여되는 경우 치료 수준 이하로 간주될 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 조성물은 하나 이상의 추가 요법이 더 낮은 용량으로 투여될 수 있도록 추가 또는 상승 효과를 제공할 수 있다. 병용 요법은 추가 요법 전에(예를 들어, 추가 요법 1일 내지 30일 이상 전에), 추가 요법과 동시에(같은 날에), 또는 추가 요법 후에(예를 들어, 추가 요법 1일 내지 30일 이상 후에) 본원에 기재된 키메라 Tim4 수용체 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포는 하나 이상의 추가 요법의 투여 후에 투여된다. 추가 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형된 세포는 하나 이상의 추가 요법 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일차에 투여된다. 더욱 추가 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포는 하나 이상의 추가 요법의 투여 후 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내, 또는 1주 이내에 투여된다. 하나 이상의 추가 요법이 수회 용량을 포함하는 경우, 키메라 Tim4 수용체 변형 세포는 하나 이상의 추가 요법의 초기 용량 후, 하나 이상의 추가 요법의 최종 용량 후, 또는 하나 이상의 추가 요법의 수회 용량 사이에 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 고갈 단계를 포함한다. 대상체에 대한 독성을 완화시키기 위해 대상체로부터 키메라 Tim4 수용체를 제거하기 위한 고갈 단계는 치료학적 이점을 위해 충분한 시간 후에 발생할 수 있다. 이러한 구현예에서, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 iCASP9, 유도성 Fas 또는 HSV-TK와 같은 유도성 자살 유전자를 포함할 수 있다. 유사하게, 키메라 Tim4 수용체 벡터는 예를 들어 관련 단클론 항체(mAb)의 주입을 통해, 예를 들어 CD20의 경우 리툭시맙 또는 EGFR의 경우 세툭시맙을 통해 형질도입된 세포의 고갈을 촉진하는 CD20 또는 절두된 EGFR(서열번호 38)과 같은 공지된 세포 표면 항원의 발현을 위해 설계될 수 있다. 성숙한 림프구 표면에 존재하는 CD52를 표적화하는 알렘투주맙은 형질도입된 B 세포, T 세포 또는 자연 살해 세포를 고갈시키는 데에 또한 사용될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 대상체에는 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 또는 돼지와 같은 동물이 포함된다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있으며 유아, 아동, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함한 임의의 적합한 연령일 수 있다.
실시예
실시예 1: CER-T 세포는 프라이밍된-PTD-SER+ 종양 세포에 대한 세포독성 효과를 유도한다
TLR-함유 키메라 Tim4 수용체-T 세포를, 세포막 스트레스-신호인 포스파티딜세린(Ptd-Ser)의 증가된 수준을 나타내는 세포를 표적화하도록 조작한다. Ptd-Ser는 통상적으로 형질 세포막의 내부 소엽에서 발견되는 인지질이다. 특정 하류 신호의 활성화(예를 들어, 카스파제 3/7 활성화) 시 Ptd-Ser는 외부 세포막으로 외부화된다. 전문 식세포/항원 제시 세포(APC)에 대한 Ptd-Ser 특이적 수용체의 관여는 궁극적으로 액틴 세포골격의 재구성에서 최고조에 달하는 다중 성분 신호전달 복합체를 촉발한다. Tim-4(T 세포 면역글로불린 뮤신-4)는 Ptd-Ser에 특이적으로 결합하는 여러 수용체 중 하나이다. 상주 및 복막 대식세포에서의 발현은 정상 조직 항상성 동안 아팝토시스 세포의 제거와 연관된다. 수지상 세포(DC)에서 Tim-4-Ptd-Ser 상호작용은 T 세포의 교차 프라이밍을 위한 항원 포획 및 삼킴을 매개한다.
다양한 종양 세포주에서 Ptd-Ser를 효율적으로 유도하거나 프라이밍하기 위한 여러 전략이 개발되었다. 이 프라이밍 단계에서는 표적 소분자 억제제와 같은 표준 치료 요법을 사용하여 세포 스트레스 및/또는 아팝토시스를 유도한다. 일단 유도되면 Ptd-Ser는 키메라 Tim4 수용체-T 세포 관여, 활성화 및 세포용해 기능에 대한 표적으로서 작용한다. 이 2단계 '프라이밍 및 사멸(prime and kill)' 전략은 다양한 소분자 억제제(키메라 Tim4 수용체-T 세포 생성물 조합)뿐만 아니라, 조작된 CAR T 및 TCR 생성물과의 조합을 사용하여 표시된다.
난소 종양에서 니라파립과 같은 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP) 억제제는 DNA 손상 반응 경로를 표적화하는 임상적으로 승인된 약물이다. 반응이 완전해지는 경우는 거의 없으며 치료 후 재발이 흔하다. Ptd-Ser 노출을 유도하기 위해 BRCA-2 돌연변이 쿠라모치(Kuramochi) 세포주를 치료 용량의 PARP 억제제 니라파립으로 처리하였다. 니라파립에 대한 짧은 노출은 용량 의존 방식으로 막 인지질 대칭의 변화를 유도하고 쿠라모치 세포의 성장을 억제하는 데 유효하다(도 7A). 낮은 효과기:표적 비(1:1)에서 키메라 Tim4 수용체 pCTX133(Tim4 결합 도메인-TLR2 신호 전달 도메인-CD3z 신호 전달 도메인)을 추가하면 형질도입 대조군에 비해 시험관내 니라파립의 효능이 향상되며, 이는 pCTX133이 표적 세포에 대한 직접적인 세포독성 효과를 유도하는 능력을 입증한다(도 7B).
맨틀 세포 림프종의 경우, 이브루티닙과 같은 브루톤(Bruton) 티로신 키나제(BTK) 억제제는 생존-촉진 키나제를 표적화하는 임상적으로 승인된 약물이다. 반응이 완전해지는 경우는 거의 없으며, 치료 후 재발이 흔한다. 이브루티닙에 의한 JeKo-1 MCL의 처리는 재조합 쥐 Tim4 단백질을 사용한 면역조직화학에 의해 결정된 바와 같이 Ptd-Ser를 노출시킨다(도 8A). JeKo-1 맨틀 세포 림프종 세포주를 25 uM 이브루티닙으로 24시간 동안 처리한 후 약물 세척하고 키메라 Tim4 수용체 pCTX136(Tim4 결합 도메인-CD28 신호 전달 도메인-CD3z 신호 전달 도메인) 또는 대조용 세포와 함께 3:1, 2:1 또는 1:1 E:T 비로 0.5 uM 이브루티닙과 공-배양하였다. 키메라 Tim4 수용체 세포와의 공-배양은 이브루티닙 처리 또는 대조용 T 세포를 사용한 처리와 비교하여 JeKo-1 표적 세포의 거의 제거를 유도하였다(도 8B).
TLR2 세포내 신호전달 도메인 또는 TLR8 세포내 신호전달 도메인 및 CD28 세포내 신호전달 도메인 또는 CD3제타 세포내 신호전달 도메인을 갖는 키메라 Tim-4 수용체를, 종양 세포 획득을 촉진하고 세포독성 및 APC 유사 기능을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 항원 획득을 평가하기 위해 표적 세포를 키메라 Tim-4 수용체 T 세포와 공-배양하고 투과 전자 현미경검사(TEM) 또는 유세포 분석으로 평가하였다. 표적 세포를 소분자 억제제로 처리하여 Ptd-Ser 외부화를 유도하고 pH 지시약 염료(pHrodo Red)를 사용하여 리소솜 흡수에 대해 평가하였다.
대안적인 프라이밍 및 사멸 치료 전략은 TLR 함유 키메라 Tim4 수용체-T 세포를 키메라 항원 수용체-T(CAR)-T 세포와 조합한다. 이 조합 접근법은 CAR을 활용하여 종양 세포를 특이적으로 표적화하여 Ptd-Ser의 상향 조절을 유도한다. CD19 CAR-T 세포 생성물(항-CD19 scFv--CD28 공동자극 신호전달 도메인-CD3ζ 신호전달 도메인, "1928z CAR")은 용량 의존적인 방식으로 CD19+ 맨틀 세포 림프종(MCL) 세포에서 Ptd-Ser를 신속하게 유도한다(도 5A). incucyte와 FACS로 측정한 공-배양 연구에서 1928z CAR-T 세포(pCTX184)와 pCTX131(Tim4-TLR8-CD3z)의 조합은 향상된 효능을 보여주었다. 1928z CAR T 세포를 pCTX131(Tim4-TLR8-CD3z) 세포를 사용하여 다중 CAR:CER 비에서 낮은 효과기:표적 비로 조합하였다(도 5B, 도 6A). pCTX156은 절두된 EGFR(EGFRt) 대조군이다. 관찰된 세포용해 기능의 증가와 일치하여 IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인의 증가가 상등액에서 관찰되었다(도 5C). 또한, incucyte로 측정한 공-배양 연구에서 1928z CAR-T 세포와 pCTX131(Tim4-TLR8-CD3z)의 조합은 표적 세포에서 절단된 카스파제의 향상된 유도를 보여주었다. 1928z CAR T 세포를, pCTX131(Tim4-TLR8-CD3z) 세포를 사용하여 다중 CAR:CER 비에서 낮은 효과기:표적 비로 조합하였다(도 6B).
따라서, 이 실시예에서는 pCTX133 및 pCTX131(TLR2 및 TLR8) 함유 키메라 Tim4 수용체-T 세포가, 프라이밍된 고형 종양 및 세포 표면 Ptd-Ser을 발현하는 혈액학적 표적 세포주에 대한 세포용해 활성을 유도하고 소분자 및 CAR 기반 치료 접근법을 강화할 수 있음을 강조한다.
실시예 2: 키메라 Tim4 수용체-T 세포는 항원 포획 및 제시를 매개한다
활성화된 T 세포는 부류 II 분자를 발현하고, 세포 표면 상에서 항원을 디스플레이하고, 다른 T 세포에 공동자극 신호를 전달할 수 있기 때문에 Ag 가공 및 제시가 가능할 수 있는 것으로 나타났다10. 그러나 전문적인 APC와 달리, T 세포는 수용성 항원의 비효율적 포획에 의해 제한된다9. 이와 대조적으로 APC는 구성적으로 발현된 Ag 흡수 수용체를 활용하여 후속 분해 및 MHC 로딩을 위해 항원을 포획하고 삼킨다1213. 가용성 항원의 포획은 높은 친화력으로 Ag에 결합하는 표면 수용체가 있는 경우 최대 103 배 더 효율적일 수 있다14.
수지상 세포(DC)에서, Tim-4-Ptd-Ser 상호작용은 항원의 포획, 삼킴 및 농축을 매개하여, DC가 T 세포에 항원을 높은 효율로 제시할 수 있도록 한다. 실제로, 전임상 NSCLC 모델에서 Tim-4 수용체 차단은 종양 특이적 CD8+ T 세포의 활성화를 손상시키고 종양 진행을 촉진한다12. 더욱이, 유전자 발현 프로파일링은 진행성 종양 세포에서 Tim-4 발현의 하향조절을 보여주며, 이는 감소된 항원 흡수, 제시 및 T 세포 활성화와 일치한다.
여기에 제시된 실험 결과는 T 세포가 항원 흡수, 포획 및 공동 자극 능력을 강화함으로써 면역요법을 위한 항원 제시 T 세포로서 재지시될 수 있음을 나타낸다. 항원 가공 및 제시뿐만 아니라 항원 흡수를 구동하는 세포내 신호전달 수용체에의 인간 Tim-4 식세포 흡수 수용체의 융합은 T 세포에 강화된 APC 능력을 추가한다. 키메라 Tim4 수용체의 모듈식 설계에는, CD3ζ, CD28, 4-1BB, ITAM 및 TLR 신호전달과 같은 다성분 신호전달 복합체를 구동하여 세포 활성화, 세포용해 기능, 사이토카인 및 케모카인 분비, 부착 및 공동자극 분자의 상향 조절, 및 효율적인 T 세포 활성화를 매개하는 데 필요한 항원 분해-과정을 유도하는 세포내 도메인이 통합되어 있다15.
키메라 Tim4 수용체-T 세포를 시험하여 상기 세포가 가용성 항원을 포획 및 제시하고 공-배양 시스템에서 재조합 E7 제한 T 세포 클론의 활성화 및 증식을 촉발할 수 있는지 여부를 확인하였다. Tim4의 첫 번째 발현은 유세포 분석을 통해 형질도입된 CER T 세포에서 확인되었다. Tim4 결합 도메인-CD28 막관통-CD28 신호전달 도메인-CD3z 신호전달 도메인(CTX247, CER1161이라고도 함) 및 Tim4 결합 도메인-CD28 신호전달 도메인-CD3z 신호전달 도메인-TLR2 신호전달 도메인(CTX1107, CER1107 또는 CER1236이라고도 함 - 서열번호 19)을 Tim4 및 각 벡터에 암호화된 형질도입 마커인 EGFR에 대해 염색하였다. CER1107과 CER1236은 동일한 아미노산 서열을 가지고 있지만 벡터 주쇄가 상이하다. Tim4 발현이 CTX247 또는 CTX1107 형질도입 세포에서 관찰되었으나 모의 형질도입 대조군에서는 관찰되지 않았다(도 4) E7 제한 TCR은 HPV16으로부터 E7 단백질을 표적화하고 서열번호 241에 제공된 TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄 서열을 갖는다. E7 TCR은 MHC 부류 I을 통해 E7 펩티드로 펄스화된 APC에 반응하여 증식한다. 자기유래 APC의 경우, 상이한 Tim-4 키메라 수용체로 형질도입된 CD4+ 및 CD8+ 키메라 Tim4 수용체 T 세포 생성물을 HPV16의 E7 단백질로부터 유래된 11량체 중복을 함유하는 15량체 펩티드 풀 또는 비히클로 펄스화하였다. 키메라 Tim4 수용체 T 세포에 E7 펩티드를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 펄스화하고 E7-특이적 활성화 및 증식을 촉발하는 능력을 시험하였다. E7-TCR 세포 표면 활성화 마커 반응을 키메라 Tim4 수용체-T 세포 생성물과 함께 공-배양 24시간 후에 유세포 분석에 의해 평가하였다. 추가 5일의 공-배양 후에, 세포 추적(CT) 바이올렛 희석으로 증식 반응을 평가하였다.
도 1B-1D는 pCTX1107(Tim4 결합 도메인 - CD28 세포내 신호전달 도메인 - CD3ζ 세포내 신호전달 도메인 - TLR2 세포내 신호전달 도메인; 서열번호 19) CER T 세포가 실제로 E7-특이적 T 세포를 자극한 반면, pCTX247(Tim4 결합 도메인-CD28 세포내 신호전달 도메인-CD3ζ 세포내 신호전달 도메인) 또는 형질도입되지 않은 T 세포는 고농도의 E7 펩티드로 펄스를 가한 경우에도 자극성이 없었음을 도시한다. 이들 실험에서, pCTX247과 pCTX1107 간의 작제물 디자인의 유일한 차이점은 TLR-2 세포내 서열의 추가였으며(도 1A), 이는 가용성 항원의 T 세포 제시 증폭 및 E7 TCR의 촉발에 TLR 신호전달이 관련되어 있음을 의미한다. CER T 세포에 의한 증식은 HLA 의존적이며, 이는 CER 매개 활성에서 항원 제시의 역할을 입증한다.
pCTX1107이 E7-특이적 활성화를 강하게 자극한다는 증거는 유세포 분석으로 측정한 CD25 및 CD69 상향 조절에서도 나타났다(도 2). T 세포를 함유하는 E7-TCR의 보다 높은 빈도는 공-배양 24시간 후에 두 활성화 마커를 모두 발현시켰다(도 2). E7 TCR-T 세포 표면 활성화 마커인 CD25 및 CD69는 키메라 Tim4 수용체-T와의 공-배양 후에 24시간 동안 대조군에 비해 41.2% 대 23.1% 상향조절되었으며, 6일까지 E7-TCR-T 세포 분열 백분율은 TIM4/CD28/CD3z/TLR2 키메라 Tim4 수용체 T 세포의 경우 44% 대 대조군 8%였다.
세포 추적 바이올렛 표지된 E7-특이적 TCR T 세포를, 형질도입되지 않은 T 세포(UT), Tim4-CD28-CD3z 작제물(CTX247) 또는 Tim4-CD28-CD3z-TLR2 작제물(CTX1107)로 형질도입된 T 세포 및 JeKo-1 세포와 HPV16 E7 단백질에서 유래된 11aa 중복(각 펩티드 100 ng)을 갖는 15량체 펩티드 풀의 존재 하에서 1:2:2 비로 배양하였다. 배양 기간 동안 중복 배양물을 HLA A, B, C 차단 항체(클론 W6/32) 또는 합치하는 마우스 IgG2a 항체와 함께 배양하였다. 도 10은 마우스 TCRb+ 세포의 염색에 기반한 유세포 측정에 의해 측정된 살아있는 세포 중의, 배양물 중 E7 TCR 세포의 백분율을 나타낸다. 키메라 Tim4 수용체 항원 제시에 의해 매개되는 E7 특이적 TCR T 세포의 활성화는 항-HLA-I 항체에 의해 차단된다.
실시예 3: 키메라 Tim4 수용체에 의한 T 세포의 형질감염
키메라 Tim4 수용체 pCTX1183, pCTX1161, pCTX1189, pCTX1184, pCTX1163, pCTX1162, pCTX1190, pCTX1186, pCTX1187, pCTX1164, pCTX1185 및 pCTX1165(표 8 참조)를 Jurkat T 림프구 세포주에 형질감염시켰다(도 9A-9B).
실시예 4: 키메라 TIM4 수용체 T 세포에 의한 향상된 항원 포획, 항원 제시 세포-유사 기능 및 세포독성 반응
방법:
다양한 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 융합된 Tim-4 수용체를 함유하는 키메라 Tim4 수용체 T 세포(CER T 세포라고도 함)를 건강한 공여자 T 세포를 사용하여 생성하였다(도 11). CER1234는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. CER1107(본원에서는 CTX1107 또는 CER1236으로도 지칭됨)은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. CER1107 및 CER1236은 동일한 아미노산 서열을 가지고 있지만 렌티바이러스 주쇄가 다르다. CER247 및 CER1161(Tim4 결합 도메인-CD28tm-CD28icd-CD3zICD, 서열번호 21)은 동일한 아미노산 서열을 갖지만 렌티바이러스 주쇄 및 프로모터 시스템이 다르다.
CER T 세포 생성물은 Tim-4, CD45RA, CCR7 및 CD4/CD8 비의 발현에 대해 형질도입 후 6일차에 특성화되었으며, 이들 모두 상업적으로 이용 가능한 형광색소 결합 항체를 사용하여 유세포 분석(FC)에 의해 측정되었다.
이브루티닙으로 처리된 REC-1 및 JeKo-1 맨틀 세포 림프종(MCL) 세포주의 표면 포스파티딜세린 발현 유도를 히스티딘-태그된 재조합 쥐 Tim-4를 사용하여 FC에 의해 측정하였으며; 항히스티딘 항체를 사용하여 2차 검출을 수행하였다.
식세포작용을 REC-1 세포와 CER T 세포의 공-배양 분석에서 평가하였다. REC-1 세포를 10 μM 이브루티닙으로 24시간 동안 전처리하고, pHrodo 레드로 표지한 다음, 0.1 대 1의 효과기 대 표적(E:T) 비로 형질도입되지 않은 T 세포 또는 CER T 세포와 함께 배양하였다. pHrodo 레드-양성 세포의 백분율을 16시간 또는 40시간의 공-배양 후에 유세포 분석으로 결정하였다. CER T-세포 리소솜 구획 내 종양 단편의 국소화를 pHrodo 그린으로 표지된 REC-1 세포를 사용한 별도의 실험에서 평가하고; 공-배양 후, 모든 세포를 Lyso-추적제 레드로 표지하였다. 삼킴의 시각화를 형광 현미경검사에 의해 수행하였다. 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 Dunnett의 사후 검정과 함께 일원 분산 분석을 수행하였다.
CER T 세포 세포독성 기능을 REC-1 세포와의 공-배양 분석에서 Incucyte® 생세포 분석 시스템을 사용하여 평가하였다. mCherry(REC-1 mCherry)를 구성적으로 발현하도록 조작된 REC-1 세포를 10 μM 이브루티닙 또는 비히클(20% 2-OH β-사이클로덱스트린)로 24시간 동안 전처리하였다. CER T 세포와 공-배양하기 전에 이브루티닙을 씻어내었다. CER T 세포(형질도입 후 6일 확장)를 0.5 μM 이브루티닙 또는 비히클의 존재 하에서 이브루티닙-전처리된 REC-1 세포와 1:1의 E:T 비로 공배양하였다. REC-1 mCherry 세포의 총 형광은 세포독성이 발생함에 따라 감소하였다.
T-세포 활성화 마커 세포예정사-1(PD-1) 및 4-1BB를 시판되는 형광색소-접합 항체를 사용하여 유세포 분석을 통해 생육성 CD3+ T 세포에서 평가하였다. REC-1 mCherry 세포를 10 μM 이브루티닙 또는 비히클로 24시간 동안 전처리하고; 세척 후, 0.5 μM 이브루티닙 또는 비히클로 공-배양을 개시시켰다. 분석을 CER T 세포와 REC-1 세포의 공-배양 개시 96시간 후에 수행하였다.
사이토카인 유도를 상술한 세포독성 분석에서 96시간 후에 수확한 순화된(conditioned) 상등액을 사용하여 다중매개변수 ELISA로 평가하였다.
CER T 세포의 항원 제시 세포(APC)-유사 기능을 하기와 같이 평가하였다(도 1A). 세포 추적 바이올렛(CTV)-표지된 E7 T 세포 수용체(TCR) T 세포를 형질도입되지 않은 T 세포 또는 CER T 세포 및 JeKo-1 세포와 HPV16 E7 단백질에서 유래된 11 아미노산 중복(각 펩티드 100 ng)을 갖는 15량체 펩티드 풀의 존재 하에서 1:2:2 비로 6일 동안 배양하였다. 주조직적합성 복합체(MHC) 부류 I 항원 제시의 역할을 입증하기 위해 상술한 배양물을 마우스 항-인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I(A, B 및 C) 차단 항체(클론 W6/32) 또는 합치하는 마우스 IgG2a 항체와 함께 분석 전 4일 동안 배양하였다. 증식은 CTV의 염료 희석에 의해 측정되었다.
결과:
CER은 T 세포에 의해 발현되었다(표 4). 높은 비율의 CER T 세포가 조작된 Tim-4 수용체를 발현한다. CD4/CD8 비는 CER T 세포 대 형질도입되지 않은 T 세포의 형질도입 및 확장 후에 유사하였다. CER T 세포는 CCR7 및 CD45RA에 의해 측정된 바와 같이 주로 중심 기억 및 효과기 기억 표현형을 나타낸다.
[표 4]
CER T 세포 특징(형질도입 후 6일차에 측정됨)
이브루티닙은 REC-1 및 JEKO-1 세포에서 포스파티딜세린 노출을 유도한다
이브루티닙(24 내지 48시간 동안 0.05 내지 50 μM)은 유세포 분석에 의해 측정된 PS 노출을 유도하였다(도 12A-12B). REC-1 세포는 JeKo-1 세포보다 이브루티닙으로 유도된 포스파티딜세린 노출에 더 민감하였다.
CER1161 및 CER1234 T 세포는 식세포 기능을 나타낸다
CER-1161 및 CER-1234 T 세포는 유세포 분석 및 형광 현미경검사로 측정한 바와 같이 공-배양 16시간 및 40시간 후에 형질도입되지 않은 T 세포에 비해 pHrodo 레드+ 표적 세포의 삼킴을 증가시켰다(도 13A 내지 13D). 세포내 신호전달 도메인(즉, CD28, CD3ζ, TLR2)을 포함하는 CER 작제물은 세포용해 기능을 향상시켜 식세포작용을 향상시킬 수 있다.
CER1234 T 세포는 이브루티닙과 함께 세포독성 활성을 나타낸다
종양 세포 사멸은 CER-1234 T 세포와 이브루티닙의 조합에 의해 향상되었다(전처리, 공-배양 또는 둘 다; 도 14A 및 14B). 0.5 μM 이브루티닙과의 공-배양은 표준 투여(1일 1회 560 ㎎) 후의 농도(Cmax)를 반영하며 단독 전처리 또는 전처리 및 이브루티닙과의 공-배양 모두와 유사한 세포독성 효과를 나타내었다. CER-1183 T 세포(세포내 신호 전달 도메인 없음)는 이브루티닙과의 부가 효과를 나타내지 않는다. CER-1234 T 세포만으로는 제한된 세포독성 활성을 나타내었다.
CER1234 T 세포는 이브루티닙-처리된 REC-1 세포와 공-배양 시 T 세포 활성화의 세포-표면 마커를 발현한다
0.5 μM 이브루티닙 존재 하의 CER-1234 T 세포와 표적 REC-1 세포의 공-배양은 T 세포 표면에서 PD-1 및 4-1BB 발현을 증가시켰다(도 15A 및 B). PD-1 및 4-1BB는, 세포내 신호전달 도메인이 결여된 CER-1183 T 세포를 함유한 공-배양에서 증가하지 않았다.
사이토카인 발현이 CER1234 T 세포와 이브루티닙-처리된 REC1 세포와의 공-배양에서 유도되었다
하기 범주의 사이토카인이 0.5 μM 이브루티닙 존재 하에 CER-1234 T 세포 및 표적 REC-1 세포의 공-배양에서 유도되었다(도 16A 내지 16H): T1 - 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ) 및 인터류킨(IL)-10; T2 - IL-5; 효과기 - 그랜자임 B. 사이토카인 발현은, Tim-4를 함유하지만 세포내 신호 전달 도메인이 결여된 CER-1183 T 세포 함유 공-배양에서 유도되지 않았다. IL-2(항상성), IL-4(T2) 및 IL-6(염증성)은 명목상 증가하였다. IL-12p70(APC), IL-17A(염증) 및 IL-1β(염증)는 모든 공-배양 조건에 대해 검출 한계에 있었다.
실시예 5: 키메라 TIM4 수용체 T 세포요법은 포스파티딜세린 의존성 세포독성 및 항원 제시 세포 유사 기능을 유도하고 혈액학적 악성종양에 대해 승인된 BTK 억제제와 상승작용한다
종양 미세환경은, 부분적으로 항원 제시의 기능 장애로 인해 면역 반응을 크게 억제한다. 활성화된 통상적인 αβ T 세포는 명목상 항원을 가공하고 표시할 수 있지만 비효율적인 항원 포획으로 인해 항원 제시 능력이 제한된다. 키메라 Tim4 수용체는 항원 제시 세포(APC) 유사 기능을 촉진하고 표적 의존성 세포독성 반응을 부여한다. 수지상 세포의 하위집합에서 교차 제시에 중심적인 역할을 하는 포스파티딜세린(PS) 수용체 Tim-4는 선천적 신호전달 도메인과 융합되어 종양 항원 흡수를 구동하고 APC-유사 기능을 향상시키켰다. 톨/인터류킨-1(TIR) 도메인 및 T 세포-유래 신호전달 도메인 CD28 및 CD3ζ와 융합된 Tim-4 결합 도메인으로 조작된 키메라 Tim4 수용체 T 세포를 사용하여, APC-유사 및 세포 독성 반응을 맨틀 세포 림프종(MCL) 세포주에 대해 시험하였다.
키메라 Tim-4 수용체 작제물은 표적-의존성 식세포작용 및 세포독성을 향상시키도록 설계되었다. 구성적 포스파티딜세린 노출(JeKo-1 PS+)된 조작된 TMEM30a 인지질 플립파제 녹아웃 JeKo-1 림프종 세포주를 사용하여, 종양 단편 흡수, 세포독성, 사이토카인 분비(GrB, IFN-γ 및 TNF-α) 및 APC-유사 활성을 시험관내에서 평가하였다. JeKo-1 PS+ 세포를 pH 민감성 pHrodoTM 염료로 표지하여 종양 세포의 흡수를 정량화하였다. 키메라 Tim4 수용체-T 세포를, 키메라 Tim4 수용체-T 세포를 JeKo PS+ 세포 및 HPV-유래 펩티드와 공-배양 후 자기유래 HPV E7 TCR T 세포 활성화 및 증식을 평가함으로써 항원-디스플레이 능력에 대해 시험하였다. 마지막으로, 이종 이식된 MCL 모델에서 키메라 Tim4 수용체 T 세포 항종양 활성을 검사하였다. 통계 분석을 2-원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
T 세포를 발현하는 CER-1234(서열번호 18) 및 CER-1236(서열번호 19)을, 세포 표면에서 Tim-4를 쉽게 발현하고 TLR2 TIR 신호전달 도메인의 배향이 T 세포 유래 신호전달 도메인 CD28 및 CD3ζ에 비해 상이하도록 조작하였다. CER1234 및 CER1236 T 세포 모두 시험관내 공-배양 시 JeKo-1 PS+ 종양 세포 단편의 흡수 증가를 보였다(p <0.001). pHrodo+ JeKo-1 단편의 내재화는 포스파티딜세린(PS) 결합에 의존하였으며, 액틴 중합 억제제인 사이토칼라신 D 또는 리소좀 억제제인 바필로마이신 A를 사용한 처리는 종양 세포 단편 흡수를 차단하였다(p <0.0001 및 p <0.0001). BTK 억제제(BTKi)-프라이밍된 REC-1 세포에서, CER-1234 내재화된 단편은 리소솜 구획에 국한되었다.
JeKo-1 PS+ 세포와의 시험관내 공-배양 시, 두 CER T 세포 작제물 모두 세포독성 기능을 나타내었으며, 이때 CER-1234는 낮은 효과기:표적(E:T) 비에서 96시간째에 표적의 90%를 제거하였다. CER-1234와 병용된 BTKi 처리는 Th1 사이토카인(GrB, IFN-γ 및 TNF-α)의 생성과 함께 >90%의 세포독성을 나타내었다. 마지막으로, CER T 세포를 시험관내에서 APC 유사 활성에 대해 평가하였다. HPV E7 TCR T 세포는 대조군에 비해 72시간째에 상당한 증식 증가(p <0.05)를 나타내었는데, 이는 Tim-4 CER T 세포가 항원 특이적 T 세포의 증식을 가공, 디스플레이 및 촉발할 수 있음을 나타낸다. 생체내에서, CER T 세포는 MCL의 이종이식 모델의 대조군에 비해 종양 부담을 감소시켰으며 명백한 이환율은 관찰되지 않았다.
CER1234 및/또는 CER1236 T 세포는 항원 획득, APC-유사 기능 및 세포독성 반응을 향상시킴으로써 종양 미세환경에서 항원 제시 결함을 극복한다. 이러한 CER T 세포는 시험관내에서 이러한 결합된 기능을 나타내고, BTK 억제와 상승 효과를 발휘하며, 임상적으로 관련된 맨틀 세포 림프종 모델에 대해 생체내에서 유의한 항-종양 효과를 매개한다.
단일 T 세포의 유도성 및 표적-특이적 세포독성 기능과 결합된 T 세포 항원 포획 및 제시 능력은 내인성 항-종양 면역의 활성화 및 향상을 통한 2차 면역 반응의 가능성을 시사한다.
방법
다양한 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 융합된 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-4(TIM-4) 수용체를 함유하는 CER T 세포를 건강한 공여자 T 세포를 사용하여 생성하였다(하기 표 5 참조).
[표 5]
CER 작제물 설계
CER T-세포 활성화를 플레이트 기반 분석 및 세포 기반 분석을 통해 IFN-감마 유도를 측정함으로써 평가하였다. 단일 유도 플레이트 분석: 다양한 농도의 포스파티딜세린(PS) 또는 포스파티딜에탄올아민(PE), 야생형 TIM-4(wtTIM-4)에 의해 인식되지 않는 대조용 막 인지질을 고-결합 조직 배양 플레이트에 코팅하였다. CER T 세포를 첨가하고 IFN-γ 수준을 ELISA에 의해 리간드 노출 24시간 후에 측정하였다. EC50 농도를 비선형 회귀(효능제 대 반응 - 가변 기울기(4개 매개변수))에 의해 결정하였다. 반복되는 자극 플레이트 분석에 의한 유도: CER T 세포를 포스파티딜세린 코팅된 플레이트(2.5-20 ㎍/㎖ PS 코팅)에 첨가하였다. 5일 후, CER T 세포를 24시간 동안 새로운 T 세포 최적화 배지가 포함된 코팅되지 않은 플레이트로 옮겼다. 이어서, CER T 세포를 새로운 PS 코팅 플레이트로 다시 옮겼다. 재-자극 동안 다양한 시점(24, 72 및 120시간)에서 ELISA에 의해 IFN-γ 유도를 평가하기 위해 상등액을 수집하였다. 세포 기반 분석: 사이토카인 유도를 하기 기재된 세포독성 분석으로부터 120시간 후에 수확된 순화된 상등액을 사용하여 다중 매개변수 ELISA에 의해 평가하였다.
CER T-세포 세포독성 기능을, Jeko1 TMEM30A-/- 세포(TMEM30A 유전자(포스파티딜세린(PS) 내재화에 필요한 플립파제 샤페론)의 녹아웃에 의해 조작됨) 또는 REC-1 MCL 세포와의 공-배양 분석에서 Incucyte® 생-세포 분석 시스템을 사용하여 평가하였다. mCherry를 구성적으로 발현하도록 조작된 REC-1 MCL 세포를 100 nM 이브루티닙으로 전처리하거나 약물 없이 96시간 동안 처리하였다. IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 T 세포 최적화 배지에서 CER T 세포(형질도입 후 6일 동안 확장됨)를 동일한 농도의 이브루티닙의 존재 하에서 0.25:1의 효과기:표적(E:T) 비로 A2780 세포와 공-배양하였다.
TIM-4, CD45RA 및 CCR7의 발현뿐만 아니라 CD4/CD8 비를 시판되는 형광색소-접합 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 평가하였다. 공-배양 종료 시 생육성 T 세포의 절대 갯수를 결정하기 위해 정밀 계수 비드를 사용하여 유세포 분석에 의해 증식을 측정하였다. T 세포 증식을 0시간 대비 120시간 T 세포 수의 확대 배수로 보고한다.
CER T 세포의 항원 제시 세포(APC)-유사 기능을 포스파티딜세린-양성 E7 종양단백질-양성 세포와 48시간 공-배양 후 평가하였다. T 세포를 분리하고 세포 추적 바이올렛-표지된 E7 TCR T 세포와 4일 동안 공-배양하였다. E7 TCR T 세포 상의 활성화 마커 HLA-DR을 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. 포스파티딜세린 양성 SCC152 편평 세포 암종 세포를 TMEM30A 유전자(PS 내재화에 필요한 플립파제 샤페론)의 녹아웃에 의해 조작하였다. APC-유사 기능에서 HLA-I의 역할을 HLA-I 차단 또는 해당 아이소타입 항체의 존재 하에서 동일한 실험을 수행함으로써 결정하였다.
결과:
표 5에 따른 CER(CER1234 및 CER1236)을 구성하고 T 세포에서 발현시켰다. CER T 세포는 형질도입 후 6일차에 형질도입된 T 세포에서 TIM-4를 쉽게 발현한다(도 17A). CD4:CD8 비는 CER T 세포 대 형질도입되지 않은 T 세포의 형질도입 및 확장 후에 유사하였다. CER1234 또는 CER1236 T 세포는 CCR7 및 CD45RA 발현에 의해 측정된 바와 같이 주로 나이브 및 중심 기억 표현형을 나타내었다(도 18).
CER1234 또는 CER1236 T 세포는 포스파티딜세린(PS)에 대한 결합에 반응하여 용량 의존적 방식으로 IFN-γ를 특이적으로 생성하지만, 포스파티딜에탄올아민(PE)에는 반응하지 않는다(도 19A-19B). 세포내 T 세포 신호전달 모이어티가 결여된 wtTIM-4는 포스파티딜세린 자극 시 IFN-γ를 유도하지 않았다. CER-1236 T 세포는 포스파티딜세린에 대한 3회 연속 노출 시 반복된 IFN-γ 반응을 유도하였다(도 19C). 분석 설계는 도 43에 도시되어 있다. 시험관내에서 추가 항원 노출 시 재활성화되는 CER-1236 T 세포의 능력은 생체내에서 지속적인 효과를 시사한다.
CER1234 T 세포에 의한 pHrodo 염료-표지된 종양 세포(Jeko1 TMEM30A-/- 세포)의 식세포작용 및 세포내이입의 FACS 및 영상 기반 검출이 도 20에 도시되어 있다.
CER1236 T 세포는 Jeko1 TMEM30A-/- 세포의 삼킴 증가를 나타내었다(도 21). CER1236 T 세포 및 wtTIM-4 T 세포의 삼킴이 향상된다. 삼킴은 TIM-4 포스파티딜세린 결합 도메인(CER1250) 또는 액틴 중합 억제제의 돌연변이에 의해 차단된다. CER-1250(Tim-4 결합 돌연변이/CD28/TLR2/CD3z; 서열번호 24)은 CER1236과 동일한 세포내 신호전달 도메인을 갖지만 포스파티딜세린 결합을 무효화하기 위해 AAAA 치환을 갖는 돌연변이된 IgV 도메인을 갖는다. wtTim-4, CER1250 및 CER1236 + 액틴 중합 억제제에 비해 CER-1236 T 세포에서 더 높은 빈도와 흡수 크기(식균 지수)가 관찰되었다.
CER1234 또는 CER1236 T 세포는 공-배양 분석에서 Jeko1 TMEM30A-/- 세포를 효율적으로 제거한다(도 22).
CER1236 T 세포는 이브루티닙과 상승작용하여 REC-1 맨틀 세포 림프종 세포의 사멸을 향상시킨다. BTK 경로 억제는 세포 스트레스와 막 포스파티딜세린 노출을 유도한다. 일단 프라이밍되면, CER1236 T 세포는 종양 세포를 제거한다(도 23). CER1236 T 세포는 이브루티닙 처리된 REC-1 MCL 세포에 대해 향상되고 보다 완전한 세포독성 효과를 갖지만 처리되지 않은 REC-1 MCL 세포에는 그렇지 않다(도 38). 처리되지 않은 REC-1 세포에 대한 일부 CER1236 T 세포독성이 관찰되었으며, 이는 이 세포주에서 측정된 구성적 포스파티딜세린 노출과 일치한다. CER1251(Tim-4 결합 돌연변이체/CD28/CD3z/TLR2; 서열번호 25)은 CER1236과 동일한 세포내 신호전달 도메인 및 배향을 갖지만 포스파티딜세린 결합을 무효화하기 위해 AAAA 치환을 갖는 돌연변이된 IgV 도메인을 갖는다.
세포독성 상승작용에 맞춰, CER1234 세포 또는 CER1236 세포 + 이브루티닙에 의한 BTK 억제는 유도성 사이토카인 생성을 입증한다(도 24 및 도 37).
CER1236 T 세포는 시험관내 시스템에서 항원 제시 세포-유사 기능을 나타낸다. E7 HLA2 제한 TCR 시스템에서, CER1236-T 세포는 자기유래 E7 TCR T 세포의 더 큰 활성화를 지원했는데, 이는 형질도입되지 않은 T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포와 비교할 때 CER-1236 T 세포에 의한 향상된 E7 항원 제시를 나타낸다(도 25A). CER1236 T-세포-유도 E7 TCR 활성화는 HLA 부류 I 시스템을 통한 항원 제시에 의존한다(도 25B). CER1236 T 세포는 항원을 획득할 수 있는데, 이는 항원을 가공하고 이를 나이브 T 세포에 제시하는 능력에 있어서 장벽으로 간주되는 기능이다. CER1236 T 세포의 조작된 항원 제시 세포(APC) 기능은 생체내에서 2차 면역 반응의 개시로 이어질 수 있다.
CER1236 T 세포는 맨틀 세포 림프종 마우스 모델에서 Jeko1 TMEM30A-/- 세포 피하 종양 생착에 대해 항종양 효과를 나타내었다(도 26).
실시예 6: PARP 억제제 및 표적 난소암 세포와 공-배양된 키메라 TIM4 수용체 형질도입된 T 세포에 대한 T 세포 표현형 분류
본원에 기재된 분석을 위해, A2780(인간 난소암 세포주) 세포를 도말하고 부착되게 하고, -2일차에 25% 세포(EC25)를 사멸시키는 유효 농도의 PARP 억제제(PARPi), 0.5 μM의 니라파립 또는 1.5 μM의 올라파립으로 처리하였다. 0일차에, 배지를 교환하고, CER-1234, CER-1236 또는 대조용 CER-1183(도 27A)으로 형질도입된 3명의 대상체(도 28)로부터의 공여자 T 세포를 다양한 효과기:표적 비로 PARPi로 처리된 A2780 세포에 첨가하여 키메라 Tim4 수용체-T 세포 활성화, 사이토카인 생성, 증식 및 세포독성 반응을 평가하였다. 키메라 Tim4 수용체-T 세포 면역표현형 분류 및 벌크 상등액 분석을 공-배양 개시 후 2일 및 5일차에 수행하였다.
CCR7 발현을 Tim4+ T 세포 중의 % CCR7 + 세포를 측정함으로써 120시간의 공-배양 후에 측정하였다(도 29A-29C). 올라파립 처리된 A2780 세포와 함께 배양된 CER-1234 및 CER-1236을 발현하는 T 세포에서 더 높은 CCR7 발현이 관찰되었다. CCR7은 나이브 및 중심 기억 T 세포에서 높은 수준으로 발현되며 항상성 T 세포 하위집합이 재순환하여 비장 및 림프절의 백비수(white pulp) 영역과 같은 림프 기관의 T 세포 영역으로 돌아갈 수 있게 한다. CCR7 발현 T 세포는 초기 분화 상태의 T 세포 집단을 반영할 수 있다.
CD4/CD8 비를 PARPi로 처리된 A280 세포와의 120시간 공-배양 후에 측정하였다(도 30A-30C). CER-1236 형질도입된 T 세포는 공여자(38) 및 공여자(41) 샘플 모두에서 CER-1234 또는 대조용 CER-1183으로 형질도입된 T 세포에 비해 더 높은 CD4/CD8 비를 가졌다.
실시예 7: TIM4 키메라 수용체-T 세포는 난소암 모델에서 포스파티딜세린 의존성 세포독성 및 선천적-유사 기능을 유도하고 승인된 PARP 억제제와 상승작용을 나타낸다
CER T 세포를 PARP에 민감한 난소암 모델에서 승인된 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP) 효소의 소분자 억제제와 함께 평가하였다.
소분자 PARP 억제제 니라파립 또는 올라파립으로 처리 시 A2780 난소암 세포에 대한 포스파티딜세린 노출을 아넥신 v 염색에 의해 평가하여 적절한 약물 용량을 결정하였다. 세포 독성 및 표적 의존적 종양 세포 단편 흡수를 향상시키도록 설계된 Tim-4 CER 작제물을 표적화하는 포스파티딜세린이 조작되었다. CER T 세포 설계는 하기와 같다: CER-1234(Tim-4/CD28/TLR2/CD3z; 서열번호 18); CER-1236(Tim-4/CD28/CD3z/TLR2; 서열번호 19); 및 CER-1250(Tim-4 결합 돌연변이/CD28/TLR2/CD3z; 서열번호 24). CER-1250은 CER1236과 동일한 세포내 신호 전달 도메인을 갖고 있지만 포스파티딜세린 결합을 무효화하기 위해 AAAA 치환이 있는 돌연변이된 IgV 도메인을 갖는다. 니라파립(0.5 μM) 및 올라파립(1.5 μM)을 사용하여 CER T 세포 인식 및 세포 독성을 위해 A2780 세포 표면에 포스파티딜세린을 노출시키고 T 세포 활성화 및 사이토카인 반응을 평가하였다. CER-1236 T 세포에 의한 항원 흡수를, 인간 유두종 바이러스 E7 항원 발현 편평상피암종(SCC152) TMEM30A 인지질 플립파제 녹아웃 세포를 사용하여 모델링하였다. 이들 세포는 외부 표면 포스파티딜세린을 구성적으로 노출시켰다. CER-1236 T 세포에 의한 E7 항원 제시는 자기유래 HLA-A2-제한 E7 TCR T 세포에서 T 세포 활성화 마커인 HLA-DR의 표면 발현에 의해 분석되었다.
PARP 억제제는 처리 96시간 후 생육성 A2780 세포에서 치료 용량 미만으로 외부 세포 표면에 포스파티딜세린 노출을 유도하였다. 처리하지 않은 것과 비교하여, 니라파립 첨가 후 A2780 세포의 23%가 제거되었고 올라파립 첨가 후 34%가 제거되었다. CER-1234 또는 CER-1236은 A2780 세포를 각각 39% 또는 19% 제거하였다. 니라파립은 CER-1234 또는 CER-1236과 상승작용하여 5일의 공-배양 후 A2780 세포를 58% 또는 81% 제거한 반면, 올라파립은 CER-1234의 경우 표적의 66% 또는 CER-1236의 경우 73%를 제거하였다. 약물을 사용하지 않은 CER-1234에 비해 96시간째에 CER-1234와 병용된 어느 한 약물의 경우 인터페론 -γ는 7배, 그랜자임 B는 5-7배 증가하였다. CER-1236 T 세포 단독에 비해 TMEM30A- SCC152 암세포에 노출된 CER-1236 T 세포는 E7 TCR T 세포의 활성화 상태를 5배 증가시켜 부분적인 삼킴, 항원 가공 및 HLA-A2 동족 펩티드의 제시를 입증하였다.
CER1234 및 CER1236 T 세포는 적응 및 선천적 기능성을 나타낸다. CER1234 및 CER1236 T 세포는 치료 용량 미만의 PARP 억제제로 처리된 A2780 난소암 세포에 대해 세포용해 활성을 입증하였다. CER1236은 HPV E7 모델에서 입증된 향상된 APC-유사 기능성을 입증하였다. CER T 세포 생성물의 조합된 기능은 승인된 PARP 억제제를 투여받는 난소암 환자의 치료 옵션으로서 유망한 임상 적용을 제공한다.
방법
PARP 억제제 올라파립 및 니라파립으로 처리된 A2780 난소 세포에서 표면 포스파티딜세린 발현 유도를 아넥신 V를 사용하여 유세포 분석(FC)에 의해 측정하였다.
다양한 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 융합된 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-4(TIM-4) 수용체를 함유하는 CER T 세포를 건강한 공여자 T 세포를 사용하여 생성하였다(표 5 참조).
CER T-세포 활성화를, 플레이트- 및 세포-기반 분석을 통해 IFN-감마 유도를 측정함으로써 평가하였다. 단일 유도 플레이트 분석: 다양한 농도의 포스파티딜세린(PS) 또는 포스파티딜에탄올아민(PE), 야생형 TIM-4(wtTIM-4)에 의해 인식되지 않는 대조용 막 인지질을 고-결합 조직 배양 플레이트에 코팅하였다. CER T 세포를 첨가하고 IFN-γ 수준을 ELISA에 의해 리간드 노출 24시간 후에 측정하였다. EC50 농도를 비선형 회귀(효능제 대 반응 - 가변 기울기(4개 매개변수))에 의해 결정하였다. 반복되는 자극 플레이트 분석에 의한 유도: CER T 세포를 포스파티딜세린 코팅된 플레이트(2.5-20 ㎍/㎖ PS 코팅)에 첨가하였다. 5일 후, CER T 세포를 24시간 동안 새로운 T 세포 최적화 배지가 포함된 코팅되지 않은 플레이트로 옮겼다. 이어서, CER T 세포를 새로운 PS 코팅 플레이트로 다시 옮겼다. 재-자극 동안 다양한 시점(24, 72 및 120시간)에서 ELISA에 의해 IFN-γ 유도를 평가하기 위해 상등액을 수집하였다. 세포 기반 분석: 사이토카인 유도를 하기 기재된 세포독성 분석으로부터 120시간 후에 수확된 순화된 상등액을 사용하여 다중 매개변수 ELISA에 의해 평가하였다.
CER T-세포 세포독성 기능을 A2780 세포와의 공-배양 분석에서 Incucyte® 생-세포 분석 시스템을 사용하여 평가하였다. mCherry를 구성적으로 발현하도록 조작된 A2780 세포를 1.5 μM 올라파립, 0.5 μM 니라파립으로 전처리하거나 약물 없이 96시간 동안 처리하였다. IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 T 세포 최적화 배지에서 CER T 세포(형질도입 후 6일 동안 확장됨)를 동일한 농도의 올라파립 또는 니라파립의 존재 하에서 1:2의 효과기:표적(E:T) 비로 A2780 세포와 공-배양하였다.
TIM-4, CD45RA 및 CCR7의 발현뿐만 아니라 CD4/CD8 비를 시판되는 형광색소-접합 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 평가하였다. 공-배양 종료 시 생육성 T 세포의 절대 갯수를 결정하기 위해 정밀 계수 비드를 사용하여 유세포 분석에 의해 증식을 측정하였다. T 세포 증식을 0시간 대비 120시간 T 세포 수의 확대 배수로서 보고한다.
CER T 세포의 항원 제시 세포(APC)-유사 기능을 포스파티딜세린-양성 E7 종양단백질-양성 세포와 48시간 공-배양 후 평가하였다. T 세포를 분리하고 세포 추적 바이올렛-표지된 E7 TCR T 세포와 4일 동안 공-배양하였다. E7 TCR T 세포 상의 활성화 마커 HLA-DR을 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. 포스파티딜세린 양성 SCC152 편평 세포 암종 세포를 TMEM30A 유전자(PS 내재화에 필요한 플립파제 샤페론)의 녹아웃에 의해 조작하였다. APC-유사 기능에서 HLA-I의 역할을 HLA-I 차단 또는 해당 아이소타입 항체의 존재 하에서 동일한 실험을 수행함으로써 결정하였다.
결과:
치료 용량 미만의 니라파립 및 올라프립은 생육성 A2780 세포에서 포스파티딜세린 노출을 유도한다(도 31A-31B). 이러한 곡선을 기반으로 점선으로 표시된 대로 CER T 세포와의 병용 요법을 위해 올라파립에 대해 1.5 μM의 용량을 선택하고 니라파립에 대해 0.5 μM의 용량을 선택하였다.
CER 작제물을 표 5에 따라 단쇄 키메라 단백질로 설계하였다. CER T 세포의 표현형은 일반적으로 2명의 공여자에 걸쳐 일치하였다(도 32). 높은 비율의 CER T 세포가 조작된 Tim-4 수용체를 발현한다. CD4:CD8 비는 CER T 세포 대 형질도입되지 않은 T 세포의 형질도입 및 확장 후에 유사하였다. CER1234 또는 CER1236 T 세포는 CCR7 및 CD45RA 발현으로 측정했을 때 주로 나이브 및고 중심 기억 표현형을 나타내었다.
CER1234 또는 CER1236 T 세포는 포스파티딜세린으로 자극 시 농도 의존적 IFN-γ 반응을 생성하였다(도 33A-33B). CER T 세포는 포스파티딜세린에 대한 표적 특이적 사이토카인 유도를 나타내지만 포스파티딜에탄올아민에 대해서는 그렇지 않다. CER T 세포에 의한 IFN-γ 유도의 포화는 5 내지 10 ㎍/㎖의 포스파티딜세린에서 발생하였다. 세포내 T 세포 신호 전달 모이어티가 결여된 wtTIM-4는 포스파티딜세린 자극 시 IFN-γ를 유도하지 않았다. CER-1236 T 세포는 포스파티딜세린에 대한 3회 연속 노출 시 반복된 IFN-γ 반응을 유도하였다(도 33C). 시험관내에서 추가 항원 노출 시 재활성화되는 CER-1236 T 세포의 능력은 생체내에서 지속적인 효과를 시사한다.
CER1234 또는 CER1236 T 세포는 A2780 세포에 대한 니라파립 및 올라파립과의 상승적인 세포독성 활성을 입증하였다. 종양 세포 사멸은 CER-1236 또는 CER-1234 T 세포와 니라파립 또는 올라파립과의 조합에 의해 향상되었다(도 34A-34B). wtTIM-4 T 세포(세포내 신호 전달 도메인 없음)는 니라파립 또는 올라파립과 함께 추가 효과를 나타내지 않는다. CER-1236 및 CER-1234 T 세포 단독은 제한된 세포독성 활성을 나타내었다. CER-1234 및 CER-1236은 wtTIM-4 발현 T 세포 또는 약물 없음과의 공-배양과 비교하여 PARPi로 처리된 공-배양에서 증식되었다(도 34C). 0일, 0시간, 0분의 공-배양에 대해 정규화되었다. A2780 세포는 mCherry를 발현한다. 효과기:표적(E:T) 비는 도 34A 및 4B에 대해 1:2이다. E:T 비는 도 34의 경우 1:1이다. 니라파립 = 0.5 μM, 올라파립 = 1.5 μM.
CER1234 또는 CER1236 T 세포는 PARP 억제제로 처리된 A2780 난소암 세포와의 공-배양에 반응하여 활성화되고 IFN-γ를 생성한다. TNF-α(도 35A), IFN-γ(도 35B), 그랜자임 B(도 35C)는 CER1234 또는 CER1236 T 세포에 의해 유도되었으나 형질도입되지 않은 T 세포 또는 wtTIM-4 T 세포에 의해서는 유도되지 않았다. TNF-α, IFN-γ 및 그랜자임 B는 PARP 억제제 존재 하에서 유도되었으나 비히클에서는 유도되지 않았다. 효과기:표적 비는 1:1이다. 니라파립 = 0.5 μM, 올라파립 = 1.5 μM.
CER1236 T 세포는 시험관내 시스템에서 항원 제시 세포 유사 기능을 나타낸다. E7 HLA2 제한 TCR 시스템에서 CER1236-T 세포는 자기유래 E7 TCR T 세포의 더 큰 활성화를 지원하였는데, 이는 형질도입되지 않은 T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포와 비교할 때 CER-1236 T 세포에 의한 향상된 E7 항원 제시를 나타낸다(도 36A). CER1236 T 세포-유도된 E7 TCR 활성화는 HLA 부류 I 시스템을 통한 항원 제시에 따라 달라진다(도 36B). CER1236 T 세포는 항원을 획득할 수 있는데, 이는 나이브 T 세포에 대해 항원을 가공하고 이를 제시하는 능력에 있어서 장벽으로 간주되는 기능이다. CER1236 T 세포의 조작된 항원 제시 세포(APC) 기능은 생체내에서 2차 면역 반응의 개시로 이어질 수 있다.
실시예 8: 오시메르티닙과 조합된 CER1236 T 세포의 시험관내 연구
CER1236 T 세포를 비-소세포 폐암(NSCLC) 세포주에서 EGFR 티로신 키나제 억제제 오시메르티닙과 함께 시험하였다. 10,000개의 NSCLC H1975 세포를 100 nM 오시메르티닙 또는 비히클(DMSO)과 함께 24시간 동안 배양하고 이어서 4.88 nM 오시메르티닙 또는 비히클의 존재 또는 부재 하에서 0.25:1의 효과기:표적 세포 비로 2500개의 CER1236 T 세포와 공-배양하였다. 종양 세포 성장을 Incucyte 분석에서 120시간 동안 모니터링하였다. 도 39에 도시된 바와 같이, 오시메르티닙과 CER1236 T 세포와의 조합은 시험관내에서 H1975 NSCLC 세포를 억제하는 데 상승적으로 작용한다.
사이토카인 생성을 또한 오시메르티닙 또는 비히클로 전처리된 H1975 NSCLC 세포와 공-배양된 CER1236 T 세포에서 측정하였다. 10,000개의 NSCLC H1975 세포를 100 nM 오시메르티닙 또는 비히클(DMSO)과 함께 24시간 동안 배양하고, 이어서 4.88 nM 오시메르티닙 또는 비히클의 존재 또는 부재 하에 E:T 1:4에서 96시간 동안 CER T 세포와 공-배양하였다. 효과기:표적 비는 1:4였으며, H1975 세포를 10,000개 세포/웰로 도말하였다. 사이토카인 생성을 Ella 분석에 의해 결정하였다. 도 40에 도시된 바와 같이, 증가된 사이토카인 생성(그랜자임 B, TNFα, IL-6 및 IFNγ)이, CER1236 T 세포 + 비히클 및 오시메르티닙이 있거나 없는 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 CER1236 T 세포 + 오시메르티닙에서 관찰되었다.
오시메르티닙 또는 비히클로 전처리된 H1975 NSCLC 세포와 공-배양된 CER1236 T 세포의 증식을 또한 측정하였다. NSCLC H1975 세포를 100 nM의 오시메르티닙 또는 DMSO로 24시간 동안 전처리한 다음, 1:4의 효과기:표적 비로 형질도입되지 않은 T 세포 또는 CER-1236 T 세포의 존재 하에서 지속적으로 더 낮은 용량의 4.88 nM 오시메르티닙/DMSO 처리를 수행하였다. 총 CD3+ T 세포 폴딩 확장을 시간 경과(48시간, 96시간, 120시간 및 144시간)에 걸쳐 정량화 비드를 사용하여 정량적 유세포 분석에 의해 결정하였다. 실험을 5,000개의 표적 H1975 세포로 한 번, 10,000개의 표적 H1975 세포로 한 번해서, 두 번 수행하였다. 도 41에 도시된 바와 같이, 오시메르티닙은 CER1236 T 세포 + 비히클 및 오시메르티닙 존재 또는 부재 하에 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 CER1236 T 세포 증식을 구동한다.
도 42는 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 오시메르티닙 또는 비히클로 전처리된 H1975 NSCLC 세포(4:1 효과기:표적 비)와 120시간 동안 공-배양한 CER1236 T 세포를 사용한 실험에서 CD3+ T 세포의 확장 및 H1975 표적 세포의 감소를 나타낸다. 도 42, 하단 열에 도시된 바와 같이, CD3+ T 세포 증식은 오시메르티닙으로 처리된 H1975 세포와 공-배양된 CER1236 T 세포가 있는 샘플에서 가장 높았고 H1975 세포 수는 가장 낮았다.
실시예 9: CER1234 T 세포 대 CER1236 T 세포의 비교
3명의 상이한 공여자로부터 수득된 T 세포를 CER1234 또는 CER1236으로 형질도입하고 적정 용량의 플레이트 결합 포스파티딜세린에서 배양하였다. 도 44에 도시된 바와 같이, 플레이트 결합 포스파티딜세린은 CER1236으로 형질도입된 모든 공여자 T 세포에서 IFNγ를 유도할 수 있으며, 이 유도된 반응은 CER1234 T 세포보다 CER1236 T 세포에서 더 일관된 것으로 보인다. 도 45는 증가하는 용량의 플레이트 결합 포스파티딜세린에 반응하여 공여자에 의한 CER1234 T 세포 또는 CER1236 T 세포에서의 IFNγ 생성을 나타낸다. 모든 공여자의 CER1236 T 세포는 강한 활성화를 나타낸다. CER1234 T 세포는 공여자(32)와 (38)에 대해 더 낮은 활성화를 보이지만, 공여자(31)의 CER1234 T 세포는 통과하지 못하였다. 도 46은 해동 후 14일차에 플레이트 결합 포스파티딜세린의 용량 증가에 반응하여 공여자에 의한 CER1234 T 세포 또는 CER1236 T 세포에서의 IFNγ 생성을 나타낸다. 다시 말하자면, CER1236 T 세포는 CER1234 T 세포에 비해 모든 공여자에서 더 많은 IFNγ를 생성한다.
도 47은 증가하는 용량의 플레이트 결합 포스파티딜세린에 반응하여 CER1236 T 세포에서의 T 세포 확장(왼쪽), IFNγ 생성(가운데) 및 세포 생존율(오른쪽)을 나타낸다. 플레이트 결합 포스파티딜세린에 의한 24시간 IFNγ 자극은 CER1236 T 세포에 대한 활성화 후 확장 5일차와 일치한다. 도 48은 증가하는 용량의 플레이트 결합 포스파티딜세린에 반응하여 CER1234 T 세포에서의 T 세포 확장(왼쪽), IFNγ 생성(가운데) 및 세포 생존율(오른쪽)을 나타낸다. 플레이트 결합 포스파티딜세린에 의한 24시간 IFNγ 자극은 CER1234 T 세포에 대한 활성화 후 확장 5일차와 일치한다.
형질도입되지 않은 T 세포 또는 CER1183, CER1161, CER1234 또는 CER1236 T 세포의 항원 제시 세포(APC)-유사 기능(작제물의 개략도에 대해 도 49)을 배양물 단독 또는 포스파티딜세린 양성 HPV E7 종양단백질-양성 세포(TMEM30A-/- SCC152)와 48시간 동안 공-배양한 다음, T 세포를 양성 선택하고 4 내지 6일 동안 세포 추적 바이올렛 표지된-HPV E7 TCR T 세포와 공-배양한 후에 평가하였다. E7 TCR T 세포 상의 활성화 마커 HLA-DR 및 CD25를 반복 실험에서 유세포 분석을 사용하여 분석하였다(도 50-54).
도 50에서, HLA-DR MFI의 유의한 차이가 형질도입되지 않은 T 세포와 CER1236 T 세포 사이에서 관찰되었다. CER1234와 CER1236 T 세포 간에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 도 51에서, HLA-DR MFI의 유의한 차이가, 형질도입되지 않은 T 세포와 CER1236 T 세포 사이에서 관찰되었으며, CER1236은 두 가지 상이한 실험에서 CER1234에 비해 더 양호한 항원 제시 기능을 갖는 것으로 나타났다. 도 52에서, CER1234 및 CER1236 T 세포는 모두 형질도입되지 않은 T 세포보다 더 양호한 항원 제시 기능을 나타낸다. CER1234와 CER1236 사이에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 도 53에서, CER1234 및 CER1236 T 세포는 모두 형질도입되지 않은 T 세포보다 더 양호한 항원 제시 기능을 나타낸다. CER1234와 CER1236 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 도 54에서, HLA-DR MFI의 유의한 차이가 형질도입되지 않은 T 세포와 CER1236 T 세포 사이에서 관찰되었다. CER1236 T 세포는 또한 CER1234 T 세포에 비해 CD25 및 HLA-DR로 측정 시 향상된 항원 제시 기능을 나타내었다.
전반적으로, 이들 결과는 CER1236 T 세포가 형질도입되지 않은 T 세포 또는 포스파티딜세린에 결합할 수 없는 작제물을 갖는 T 세포에 비해 지속적으로 더 양호한 항원 제시 기능을 가짐을 나타낸다. CER1234는 일부 실험에서 형질도입되지 않은 T 세포에 대해 항원 제시 기능을 나타내지 않았다. CER1234 T 세포와 비교하여 CER1236 T 세포는 지속적으로 항원 제시 기능을 나타내었다.
앞서 실시예 5에 기재된 바와 같이, CER-1236 T 세포는 포스파티딜세린에 3회 연속 노출 시 반복된 IFN-γ 반응을 입증하였다(도 19C). 시험관내에서 추가 항원 노출 시 CER-1236 T 세포가 재활성화되는 능력은 생체내에서 지속적인 효과를 시사한다.
참고문헌
상술한 다양한 구현예는 추가 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 하기를 포함하여, 본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 나열된 모든 미국특허, 미국특허 출원 간행물, 미국특허 출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 간행물은 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다: 2021년 7월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 63/226,643, 2021년 7월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 63/226,712, 2021년 7월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 63/226,736, 2022년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 63/311,016, 2022년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 63/311,042, 2022년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 63/311,043, 2022년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 63/311,045, 2022년 4월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 63/336,972, 2022년 4월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 63/336,980, 2022년 5월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 63/341,999, 2022년 5월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 63/342,031, 2021년 8월 13일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2021/046043, 2021년 8월 13일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2021/046014 및 2021년 8월 13일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2021/046041. 구현예의 양태는 필요한 경우 추가 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 채택하도록 수정될 수 있다.
상기 상세한 설명을 고려하여 구현예에 이들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기의 청구범위에서 사용된 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 가능한 모든 구현예와 청구범위에 부여되는 균등물의 전체 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 청구범위는 개시 내용에 의해 제한되지 않는다.
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Claims (76)

  1. 단쇄 키메라 단백질(single chain chimeric protein)을 포함하는 키메라 T-세포 면역글로불린 및 뮤신(mucin) 4(Tim4) 수용체로서, 상기 단쇄 키메라 단백질이
    (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain),
    (b) 세포내 신호전달 도메인으로서, 여기서 상기 세포내 신호전달 도메인이
    (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 제1 CD28 세포내 신호전달 도메인, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 제2 TLR2 TIR 세포내 신호전달 도메인, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제3 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인; 또는
    (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 제1 CD28 세포내 신호전달 도메인, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제2 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 제3 TLR2 TIR 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인; 및
    (c) 세포외 도메인과 CD28 세포내 신호전달 도메인 사이에 위치하며 이들을 연결하는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 막관통 도메인(transmembrane domian)
    을 포함하는, 키메라 Tim4 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    N-말단에 신호 펩티드를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 신호 펩티드가 Tim4 신호 펩티드이고, 추가로 선택적으로 Tim4 신호 펩티드가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 Tim4 수용체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 18, 또는 아미노산 1-24가 없는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 Tim4 수용체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 19, 또는 아미노산 1-24가 없는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 Tim4 수용체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 키메라 Tim4 수용체를 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
  7. 제6항에 있어서,
    발현 벡터가 바이러스 벡터이고, 선택적으로 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 발현 벡터.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 키메라 Tim4 수용체, 제5항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제6항 또는 제7항의 발현 벡터를 포함하는 조작된 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    세포가 면역 세포인, 조작된 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    세포가 T 세포인, 조작된 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+/CD8+ T 세포인, 조작된 세포.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 인간 세포인, 조작된 세포.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 키메라 Tim4 수용체, 제5항의 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항의 벡터, 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 키메라 Tim4 수용체, 제5항의 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항의 벡터, 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 또는 제13항 또는 제14항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(subject)에서 질병을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    질병이 암인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    암이 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 피부암(skin cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 뇌암(brain cancer), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 또는 폐암(lung cancer); 유방, 전립선 및 결장의 선암종(adenocarcinoma); 모든 형태의 기관지성 폐암종(bronchogenic carcinoma of the lung); 골수성 백혈병(myeloid leukemia); 흑색종(melanoma); 간종양(hepatoma); 신경모세포종(neuroblastoma); 유두종(papilloma); 아푸도마(apudoma); 융모종(choristoma); 가지종(branchioma); 악성 카르시노이드 증후군(malignant carcinoid syndrome); 카르시노이드 심장병(carcinoid heart disease); 및 암종(carcinoma)(예를 들어, 워커(Walker), 기저 세포(basal cell), 기저편평세포(basosquamous), Brown-Pearce, 담관(ductal), Ehrlich 종양, Krebs 2, Merkel 세포, 점액성(mucinous), 비-소세포 폐(non-small cell lung), 귀리 세포(oat cell), 유두상(papillary), 경화성(scirrhous), 기관지(bronchiolar), 기관지원성(bronchogenic), 편평세포(squamous cell) 및 전이 세포(transitional cell)); 조직구 장애(histiocytic disorders); 악성 조직구증(malignant histiocytosis); 백혈병(leukemia); 호지킨병(Hodgkin's disease); 면역증식성 작은(immunoproliferative small); 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma); 형질세포종(plasmacytoma); 다발성 골수종(multiple myeloma); 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)(CML); 형질세포종(plasmacytoma); 세망내피증(reticuloendotheliosis); 흑색종; 연골모세포종(chondroblastoma); 연골종(chondroma); 연골육종(chondrosarcoma); 섬유종(fibroma); 섬유육종(fibrosarcoma); 거대세포 종양(giant cell tumor); 조직구종(histiocytoma); 지방종(lipoma); 지방육종(liposarcoma); 중피종(mesothelioma); 점액종(myxoma); 점액육종(myxosarcoma); 골종(osteoma); 골육종(osteosarcoma); 척색종(chordoma); 두개인두종(craniopharyngioma); 이상세포종(dysgerminoma); 과오종(hamartoma); 간엽종(mesenchymoma); 중신종(mesonephroma); 근육종(myosarcoma); 사기질모세포종(ameloblastoma); 시멘트종(cementoma); 치아종(odontoma); 기형종(teratoma); 흉선종(thymoma); 융모성 종양(trophoblastic tumor), 선종(adenoma); 담관종(cholangioma); 진주종(cholesteatoma); 원형종(cyclindroma); 낭선암종(cystadenocarcinoma); 낭선종(cystadenoma); 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor); 부인과모세포종(gynandroblastoma); 간종양(hepatoma); 땀샘종(hidradenoma); 섬세포 종양(islet cell tumor); 라이디히 세포 종양(Leydig cell tumor); 유두종; 세르톨리 세포 종양(sertoli cell tumor); 포막 세포 종양(theca cell tumor); 평활근종(leimyoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 근모세포종(myoblastoma); 근종(myomma); 근육종(myosarcoma); 횡문근종(rhabdomyoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 상의세포종(ependymoma); 신경절신경종(ganglioneuroma); 신경교종(glioma); 수모세포종(medulloblastoma); 수막종(meningioma); 신경종양(neurilemmoma); 신경모세포종; 신경상피종(neuroepithelioma); 신경섬유종(neurofibroma); 신경종(neuroma); 부신경절종(paraganglioma); 부신경절종 비크로마핀(paraganglioma nonchromaffin); 혈관각화종(angiokeratoma); 호산구 증가증을 동반한 혈관림프성 증식증(angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia); 혈관종 경화(angioma sclerosing); 혈관종증(angiomatosis); 사구체종(glomangioma); 혈관내피종(hemangioendothelioma); 혈관종(hemangioma); 혈관주위세포종(hemangiopericytoma); 혈관육종(hemangiosarcoma); 림프관종(lymphangioma); 림프관근종(lymphangiomyoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 송과체종(pinealoma); 암육종(carcinosarcoma); 연골육종(chondrosarcoma); 방광육종 엽상체(cystosarcoma phyllodes); 섬유육종(fibrosarcoma); 혈관육종(hemangiosarcoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 백혈종(leukosarcoma); 지방육종(liposarcoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 근육종(myosarcoma); 점액육종(myxosarcoma); 난소암종(ovarian carcinoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 육종; 신생물(neoplasm); 신경섬유종증(nerofibromatosis); 자궁경부 이형성증(cervical dysplasia), 및 복막암(peritoneal cancer); B 세포 림프종(예를 들어, 다양한 형태의 호지킨병, 비-호지킨 림프종(NHL) 또는 중추신경계 림프종)을 포함한 B 세포암, 백혈병(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털세포 백혈병(Hairy cell leukemia), 만성 골수성 백혈병의 B 세포 모세포 변형) 및 골수종(예를 들어 다발성 골수종); 소 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), 소 림프구성 백혈병(small lymphocytic leukemia), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), B-세포 전림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia), 림프형질구성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma), 비장 변연부 림프종(splenic marginal zone lymphoma), 형질세포 골수종(plasma cell myeloma), 뼈의 고립성 형질세포종(solitary plasmacytoma of bone), 골외 형질세포종(extraosseous plasmacytoma), 결절외 변연부 점막 관련(MALT) 림프 조직의 B 세포 림프종(extra-nodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa-associated (MALT) lymphoid tissue), 결절 변연부 B 세포 림프종(nodal marginal zone B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 종격동(흉선) 거대 B 세포 림프종(mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma), 혈관내 거대 B 세포 림프종(intravascular large B-cell lymphoma), 원발성 삼출성 림프종(primary effusion lymphoma), 버킷 림프종/백혈병(Burkitt's lymphoma/leukemia), 불명확한 암성 잠재성의 B 세포 증식(B-cell proliferations of uncertain malignant potential), 림프종성 육아종증(lymphomatoid granulomatosis), 및 이식-후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder)인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    암이 B 세포 암이고, 선택적으로 B 세포 암이 B 세포 림프종이며, 추가로 선택적으로 B 세포 림프종이 맨틀 세포 림프종인, 방법.
  19. 제15 항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    추가 치료제가 방사선, 세포면역요법제, 항체, 면역 체크포인트(checkpoint) 분자 억제제, 화학요법, 호르몬 요법, 펩티드, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, UV 광선 요법, 전기 펄스 요법(electric pulse therapy), 고강도 집속 초음파 요법, 종양 용해성 바이러스 요법, 소분자 요법 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    세포 면역요법이 키메라 항원 수용체인, 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    추가 치료제가 혈관신생 억제제(예를 들어, VEGF 경로 억제제), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, EGF 경로 억제제), 수용체 티로신 키나제 억제제, 성장 인자 억제제, GTPase 억제제, 세린/트레오닌 키나제 억제제, 전사 인자 억제제, B-Raf 억제제, RAF 억제제, MEK 억제제, mTOR 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, PARP 억제제, ROS1 억제제, BCL-2 억제제, PI3K 억제제, VEGFR 억제제, BCR-ABL 억제제, MET 억제제, MYC 억제제, ABL 억제제, HER2 억제제, BTK 억제제, H-RAS 억제제, K-RAS 억제제, PDGFR 억제제, TRK 억제제, c-KIT 억제제, c-MET 억제제, CDK4/6 억제제, FAK 억제제, FGFR 억제제, FLT3 억제제, IDH1 억제제, IDH2 억제제, PDGFRA 억제제, 또는 RET 억제제를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    억제제가 BTK 억제제인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    BTK 억제제가 이브루티닙, 피르토브루티닙(Loxo-305), 티라브루티닙, 톨레브루티닙, 에보브루티닙, 페네브루티닙(GDC-0853), 아칼라브루티닙, ONO-4059, 스페브루티닙, 자누브루티닙(BGB-3111), HM71224 또는 M7583인, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    암이 외투세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 소 림프구성 림프종, 소 림프구성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 변연부 림프종(marginal zone lymphoma)인, 방법.
  26. 제22항에 있어서,
    억제제가 EGFR 억제제인, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    EGFR 억제제가 오시메르티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 아파티닙 또는 다코미티닙인, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    암이 비-소세포 폐암인, 방법.
  29. 제22항에 있어서,
    억제제가 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제인, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    PARP 억제제가 탈라조파립, 니라파립, 루카파립, 올라파립, 벨리파립, CEP 9722, E7016, AG014699, MK4827, BMN-673 또는 파미파립인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    암이 유방암, 난소암, 결장직장암, 난관암, 복막암, 전립선암, 폐암 또는 흑색종인, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    유방암이 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer)인, 방법.
  33. 제31항에 있어서,
    난소암이 진행성 난소암인, 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    전립선암이 진행성 전립선암인, 방법.
  35. 제31항에 있어서,
    폐암이 비-소세포 폐암인, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 BReast CAncer 유전자(BRCA) 돌연변이 암인, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    암이 BRCA1 돌연변이 암, BRCA2 돌연변이 암, 또는 이들 둘 다인, 방법.
  38. 제21항에 있어서,
    키메라 항원 수용체가 항-CD72 키메라 항원 수용체인, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    항-CD72 키메라 항원 수용체가 표 3에 제공된 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2), 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3), 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함하는 결합 도메인을 갖는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    항-CD72 키메라 항원 수용체가 서열번호 131-164 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인을 갖는, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CD72 키메라 항원 수용체가 서열번호 182-234 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 B 세포 악성종양인, 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    B 세포 악성종양이 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 전-림프구성 백혈병, 털세포 백혈병, 일반 급성 림프구성 백혈병, 무(Null)-급성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 비장, 변연부 림프종, 외투세포 림프종, 무통성 B 세포 림프종, 및 호지킨 림프종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    대상체가 불응성(refractory) B 세포 악성종양을 앓고 있는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 CD19 또는 CD22를 표적화하는 키메라 항원 수용체를 이전에 투여받은, 방법.
  46. 제15항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 치료제가 치료 용량 미만(subtherapeutic dose)으로 투여되는, 방법.
  47. 제15항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 치료제가 키메라 Tim4 수용체와 순차적으로 또는 동시에 대상체에게 투여되는, 방법.
  48. 대상체에서 효과기 반응(effector response) 또는 항-종양 효능을 향상시키는 방법으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 키메라 Tim4 수용체, 제5항의 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항의 발현 벡터, 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 또는 제13항 또는 제14항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 암을 앓고 있는 대상체에서 CCR7+ 발현 T 세포를 향상시키기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 키메라 Tim4 수용체, 제5항의 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항의 발현 벡터, 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 또는 제13항 또는 제14항의 조성물; 및 선택적으로 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    암이 유방암, 난소암, 결장직장암, 난관암, 복막암, 전립선암, 폐암 또는 흑색종인, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    유방암이 삼중 음성 유방암인, 방법.
  52. 제50항에 있어서,
    난소암이 진행성 난소암인, 방법.
  53. 제50항에 있어서,
    전립선암이 진행성 전립선암인, 방법.
  54. 제50항에 있어서,
    폐암이 비-소세포 폐암인, 방법.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 BReast CAncer 유전자(BRCA) 돌연변이 암인, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    암이 BRCA1 돌연변이 암, BRCA2 돌연변이 암, 또는 이들 둘 다인, 방법.
  57. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    PARP 억제제가 탈라조파립, 니라파립, 루카파립, 올라파립, 벨리파립, CEP 9722, E7016, AG014699, MK4827, BMN-673, 파미파립 또는 이들의 조합인, 방법.
  58. 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서,
    추가 치료제가 방사선, 세포면역요법제, 항체, 면역 체크포인트 분자 억제제, 화학요법, 호르몬 요법, 펩티드, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, UV 광선 요법, 전기 펄스 요법, 고강도 집속 초음파 요법, 종양 용해성 바이러스 요법, 소분자 요법 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    세포 면역요법이 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체인, 방법.
  61. 제58항 또는 제59항에 있어서,
    추가 치료제가 혈관신생 억제제(예를 들어, VEGF 경로 억제제), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, EGF 경로 억제제), 수용체 티로신 키나제 억제제, 성장 인자 억제제, GTPase 억제제, 세린/트레오닌 키나제 억제제, 전사 인자 억제제, B-Raf 억제제, RAF 억제제, MEK 억제제, mTOR 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, ROS1 억제제, BCL-2 억제제, PI3K 억제제, VEGFR 억제제, BCR-ABL 억제제, MET 억제제, MYC 억제제, ABL 억제제, HER2 억제제, BTK 억제제, H-RAS 억제제, K-RAS 억제제, PDGFR 억제제, TRK 억제제, c-KIT 억제제, c-MET 억제제, CDK4/6 억제제, FAK 억제제, FGFR 억제제, FLT3 억제제, IDH1 억제제, IDH2 억제제, PDGFRA 억제제 또는 RET 억제제를 포함하는, 방법.
  62. 제49항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    향상된 CCR7+ 발현 T 세포가 키메라 Tim4 수용체를 발현하는, 방법.
  63. 암을 앓고 있는 대상체에서 CD4/CD8 T 세포를 향상시키기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 키메라 Tim4 수용체, 제5항의 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항의 발현 벡터, 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 또는 제13항 또는 제14항의 조성물; 및 선택적으로 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    암이 유방암, 난소암, 결장직장암, 난관암, 복막암, 전립선암, 폐암 또는 흑색종인, 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    유방암이 삼중 음성 유방암인, 방법.
  66. 제64항에 있어서,
    난소암이 진행성 난소암인, 방법.
  67. 제64항에 있어서,
    전립선암이 진행성 전립선암인, 방법.
  68. 제64항에 있어서,
    폐암이 비-소세포 폐암인, 방법.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 BReast CAncer 유전자(BRCA) 돌연변이 암인, 방법.
  70. 제55항에 있어서,
    암이 BRCA1 돌연변이 암, BRCA2 돌연변이 암, 또는 이들 둘 다인, 방법.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    PARP 억제제가 탈라조파립, 니라파립, 루카파립, 올라파립, 벨리파립, CEP 9722, E7016, AG014699, MK4827, BMN-673, 파미파립 또는 이들의 조합인, 방법.
  72. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서,
    추가 치료제가 방사선, 세포면역요법제, 항체, 면역 체크포인트 분자 억제제, 화학요법, 호르몬 요법, 펩티드, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, UV 광선 요법, 전기 펄스 요법, 고강도 집속 초음파 요법, 종양 용해성 바이러스 요법, 소분자 요법 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서,
    세포 면역요법이 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체인, 방법.
  75. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    추가 치료제가 혈관신생 억제제(예를 들어, VEGF 경로 억제제), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, EGF 경로 억제제), 수용체 티로신 키나제 억제제, 성장 인자 억제제, GTPase 억제제, 세린/트레오닌 키나제 억제제, 전사 인자 억제제, B-Raf 억제제, RAF 억제제, MEK 억제제, mTOR 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, ROS1 억제제, BCL-2 억제제, PI3K 억제제, VEGFR 억제제, BCR-ABL 억제제, MET 억제제, MYC 억제제, ABL 억제제, HER2 억제제, BTK 억제제, H-RAS 억제제, K-RAS 억제제, PDGFR 억제제, TRK 억제제, c-KIT 억제제, c-MET 억제제, CDK4/6 억제제, FAK 억제제, FGFR 억제제, FLT3 억제제, IDH1 억제제, IDH2 억제제, PDGFRA 억제제 또는 RET 억제제를 포함하는, 방법.
  76. 제63항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    향상된 CD4 T 세포가 키메라 Tim4 수용체를 발현하는, 방법.
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