KR20220007852A - Rubp 재생 및 전자 수송의 자극을 통한 식물의 바이오매스 향상 방법 - Google Patents

Rubp 재생 및 전자 수송의 자극을 통한 식물의 바이오매스 향상 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 양상들은 RubP 재생 및 전자 전달을 자극하는 유전자 변형들을 포함하는 향상된 바이오매스를 가지는 유전자 변형된 식물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CB 단백질 (예를 들어, FBPase/SBPase 또는 SBPase)의 과발현, 및 광합성 전자 전달 단백질 (예를 들어, 시토크롬 c6 및 Rieske FeS)의 과발현을 통해 바이오매스가 향상된 유전자 변형 식물에 관한 것이다.

Description

RUBP 재생 및 전자 수송의 자극을 통한 식물의 바이오매스 향상 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 62/821,786의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로 서열 목록 제출
다음과 같은 ASCII 텍스트 파일 제출 내용은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다: 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF)의 서열 목록 (파일명: 794542000640SEQLIST.TXT, 기록일자: 2020년 3월 16일, 크기: 316 KB).
기술 분야
본 발명은 유전자 변형된 식물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 캘빈 벤슨 회로 (CB) 단백질, 예를 들어, FBPase/SBPase 또는 SBPase의 과발현에 의한 것을 포함하는 RuBP 재생을 자극하는 유전자 변형, 그리고 광합성 전자 전달 단백질, 예를 들어, 시토크롬 c6 및 Rieske FeS의 과발현에 의한 것을 포함하는, 전자 전달을 자극하는 유전자 변형을 포함하는, 바이오매스가 개선된 유전자 변형된 식물에 관한 것이다.
배경
작물 종의 잠재적인 수확량은 농업 관리 및 환경 조건을 포함한 여러 외부 요인들에 의해 제한된다. 그러나 최적의 관리 및 조건 하에서도 작물 종의 에너지 전환 효율이 여전히 수확량을 제한할 수 있다. 에너지 변환 효율은 생산된 바이오매스 에너지를 주어진 기간 동안 작물 캐노피에 의해 차단된 빛 에너지로 나눈 비율이며 광합성 및 호흡과 같은 식물 내부 과정에 의해 결정된다. 모델링 결과 주요 작물 종의 에너지 전환 효율이 다른 잠재적인 수확량 개선 요소보다 뒤쳐지며 작물 종의 잠재적인 수확량 개선에 있어 주요 장애물임을 나타냄을 보여주었다 (Zhu, et al., Annu. Rev. Plant. Biol. (2010) 61:235-261).
캘빈 벤슨 회로 (CB)는 탄소 동화, 즉 바이오매스 에너지 생성에 관여하기 때문에 광합성 개선에 유망한 표적이다. 초기 연구들은 개별 CB 효소를 조금만 줄여도 탄소 동화와 식물 성장을 줄이는 데 충분함을 보여주었다. 일부 효소는 다른 효소보다 더 큰 효과가 있지만 연구 결과 서로 다른 개별 CB 효소들을 과발현시키면 광합성 탄소 동화가 증가하고 식물 성장이 향상됨을 보여주었다. 따라서 광합성 탄소 동화에 어떠한 제한 단계도 없다. 이는 CB 효소 활성을 조작하여 생산성을 높일 수 있지만 현재까지는 주요 작물 종에 대한 효과적인 조작 전략을 개발하는 것이 하나의 구성 요소를 변경하는 것만큼 간단하지 않음이 입증되었음을 의미한다.
광합성 전자 전달은, 작물 캐노피가 가로채는 빛 에너지를 이용하는 것과 관련이 있기 때문에 광합성을 개선할 수 있는 또 다른 가능한 표적이다. 광합성 전자 전달계의 개별 구성요소들은 전자 전달 속도를 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 식물 Rieske FeS 단백질의 과발현은 전자 전달 속도를 증가시키고 식물 바이오매스를 증가시켰다 (Simkin, et al., Plant Physiol. (2017) 175:134-145). 개별 구성요소들이 유망한 결과를 제공했지만 연구에 따르면 전반적으로 고등 식물의 광합성 전자 전달 효율은 플라스토시아닌과 같은 고등 식물의 광합성 전자 전달 단백질에 의해 제한됨을 보여주었다 (Chida, et al., Plant Cell Physiol. (2007) 48:948-957; Finazzi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (2005) 102:7031-7036).
작물 종의 잠재적인 최적 수확량을 달성하기 위해 에너지 변환 효율 개선에 대한 분명한 수요가 존재한다. 에너지 변환 효율이 향상된 식물을 개발하기 위해서는 광합성의 다양한 측면들을 통합시키는 여러 구성성분들의 조작이 필요하다.
간단한 요약
이러한 수요를 충족시키기 위해, 본 발명은 RuBP 재생 및 전자 전달을 자극함으로써 식물 바이오매스를 향상시키는 수단을 제공한다. 특히, 본 발명은 CB 단백질 (예를 들어, FBPase/SBPase 또는 SBPase)의 과발현, 및 광합성 전자 전달 단백질 (예를 들어, 시토크롬 c6 및 Rieske FeS)의 과발현을 통해 바이오매스를 향상시킨 유전자 변형된 식물에 관한 것이다.
본 발명의 한 양상은 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포를 포함하고, 여기서 식물, 이의 일부 또는 세포는 CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질의 과발현인 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예는 시토크롬 c6 단백질, Rieske FeS 단백질, 또는 시토크롬 c6 단백질 및 Rieske FeS 단백질의 군에서 선택된 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 c6 단백질인 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 조류 시토크롬 c6 단백질인 시토크롬 c6 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 조류 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 95, 또는 서열 번호: 102에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 조류 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 95에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 Rieske FeS 단백질인 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 또는 서열 번호: 101에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 c6 단백질 및 Rieske FeS 단백질인 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 95, 또는 서열 번호: 102에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 또는 서열 번호: 101에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
시토크롬 c6을 갖는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이러한 본 발명의 양상의 또 다른 구체예에서, 시토크롬 c6 단백질은 유전자 변형된 식물의 세포 내 적어도 하나의 엽록체의 틸라코이드 루멘에 국재화된다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 c6 단백질을 틸라코이드 루멘에 국재화시키는 전이 펩티드 (transit peptide)를 포함하는 시토크롬 c6 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 엽록소 a/b 결합 단백질 6 전이 펩티드, 광-수확 복합체 I 엽록소 a/b 결합 단백질 1 전이 펩티드, 또는 플라스토시아닌 신호 펩티드의 군에서 선택되는 시토크롬 c6 전이 펩티드를 포함한다. Rieske FeS를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이러한 본 양상의 또 다른 구체예에서, Rieske FeS 단백질은 Rieske FeS 단백질을 틸라코이드 막에 국재화하는 전이 펩티드를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 f 전이 펩티드, 시토크롬 b6 전이 펩티드, PetD 전이 펩티드, PetG 전이 펩티드, PetL 전이 펩티드, PetN 전이 펩티드, PetM 전이 펩티드, 및 플라스토퀴논 전이 펩티드의 군에서 선택되는 Rieske FeS 전이 펩티드를 포함한다. 시토크롬 c6를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 본 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 인코딩하는 시토크롬 c6 단백질을 추가로 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. Rieske FeS를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 본 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 인코딩하는 Rieske FeS 단백질을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다.
상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형은 CB 단백질의 과발현을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제(SBPase), 프럭토스-1,6-비스포스페이트 알돌라제(FBPA), 클로로플라스틱 프럭토스-1,6-비스포스파타제(FBPase), 이작용기성 프럭토스-1,6-비스포스파타제/세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제(FBP/SBPase), 또는 트랜스케톨라제(TK)의 군에서 선택되는 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 SBPase인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, SBPase는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 또는 서열 번호: 96에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 SBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, SBPase는 SBPase를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. SBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 SBPase 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 FBPA인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPA는 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 또는 서열 번호: 97에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 FBPA를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPA는 FBPA를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. FBPA를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 FBPA 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 FBPase인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPase는 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 또는 서열 번호: 98에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 FBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPase는 FBPase를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. FBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 SBPase 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 FBP/SBPase인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시아노박테리아 FBP/SBPase인 FBP/SBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 남세균 FBP/SBPase는 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 또는 서열 번호: 99에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. FBP/SBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 유전적으로 변경된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 FBP/SBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBP/SBPase는 FBP/SBPase를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 제라니올 합성효소 전이 펩티드, SBPase 전이 펩티드, FBPA 전이 펩티드, FBPase 전이 펩티드, 트랜스케톨라제 전이 펩티드, PGK 전이 펩티드, GAPDH 전이 펩티드, AGPase 전이 펩티드, RPI 전이 펩티드, RPE 전이 펩티드, PRK 전이 펩티드, 또는 루비스코 전이 펩티드의 군에서 선택되는 전이 펩티드를 포함한다. FBP/SBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 FBP/SBPase 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 트랜스케톨라제인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 트랜스케톨라제는 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 또는 서열 번호: 100에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 트랜스케톨라제를 포함한다. 트랜스케톨라제를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스케톨라제 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다.
식물에 내인성일 수 있는 CB 단백질을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 추가 구체예는 내인성인 CB 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 CB 단백질을 과발현, 유도적으로 발현, 특정 조직 또는 세포 유형에서 발현, 유도적으로 과발현, 또는 특정 조직 또는 세포 유형에서 유도적으로 발현하도록 유전자 조작된 CB 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 또한 CB 단백질을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 추가 구체예는 이종인 CB 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또한 헥산 서열을 인코딩하는 Rieske FeS 단백질을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 추가 구체예는 내인성인 Rieske FeS 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 Rieske FeS 단백질을 과발현, 유도적으로 발현, 특정 조직 또는 세포 유형에서 발현, 유도적으로 과발현, 또는 특정 조직 또는 세포 유형에서 유도적으로 발현하도록 유전자 조작된 Rieske FeS 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 또한 핵산 서열을 인코딩하는 Rieske FeS 단백질을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 추가 구체예는 이종인 CB 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 식물은 변형되지 않은 야생형 (WT) 식물에 비해 증가된 바이오매스를 가진다. 이 양상의 추가 구체예는 1000 mmol m-2 s-1 이상의 광도를 갖는 조건에서 재배될 때 변형되지 않은 WT 식물과 비교하여 개선된 물 사용 효율을 갖는 식물을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 동부콩, 대두, 카사바, 벼, 밀, 보리, 토마토, 감자, 담배, 캐놀라 또는 기타 C3 작물의 군에서 선택되는 식물을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 동백, 대두, 카사바, 벼, 밀, 보리 및 담배의 군에서 선택되는 식물을 포함한다.
식물 부분과 관련하여 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 꽃, 종자, 낟알, 곡물, 열매, 세포 또는 이의 일부인 식물 부분, 및 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 유전자 변형된 식물 부분을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 열매, 괴경, 낟알 또는 곡물인 식물 부분을 포함한다. 또한 화분립 또는 난세포들에 관한 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나의 식물의 유전자 변형된 화분립 또는 유전자 변형된 난세포를 포함하고, 이때 상기 유전자 변형된 화분립 또는 유전자 변형된 난세포는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물로부터 생산된 유전자 변형된 원형질체를 포함하고, 이때 유전자 변형된 원형질체는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 원형질체로부터 생성된 유전자 변형된 조직 배양물 또는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물에서 얻은 세포를 포함하며, 여기서 세포 또는 원형질체는 잎, 잎 엽육 세포, 꽃밥, 암술, 줄기, 잎자루, 뿌리, 뿌리 끝, 괴경, 열매, 종자, 낟알, 곡물, 꽃, 떡잎, 배축, 배 또는 분열 세포의 군에서 선택되는 식물 부분으로부터 생성되며, 이때 유전자 변형된 조직 배양물은 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 유전자 변형된 조직 배양물로부터 재생된 유전자 변형된 식물을 포함한다. 또한 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물로부터 생산된 유전자 변형된 식물 종자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 (a) CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형, 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형, 또는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형 모두를 식물 세포, 조직, 또는 다른 외식편에 도입하는 단계; (b) 이러한 식물 세포, 조직, 또는 다른 외식편을 유전자 변형된 묘목으로 재생시키는 단계; 및 (c) 이러한 유전자 변형된 묘목을, CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형, 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형, 또는 CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형 모두를 가진 유전자 변형된 식물로 성장시키는 단계를 포함하는, 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물의 생산 방법을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 단계 (b) 전에 식물 세포, 조직 또는 다른 외식편을 스크리닝하거나 선별함으로써 하나 이상의 유전자 변형의 성공적인 도입을 확인하는 단계; 단계 (b)와 (c) 사이에 묘목을 스크리닝 또는 선별하는 단계; 또는 단계 (c) 후에 식물을 스크리닝 또는 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 형질전환은 입자 충격 (즉, biolistics, 유전자 총), 아그로박테리움-매개 형질전환, 리조비움-매개 형질전환, 또는 원형질체 형질감염 또는 형질전환 군으로부터 선택된 형질전환 방법을 사용하여 수행된다.
또한 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 벡터와 함께 도입되는 유전자 변형을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 벡터는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드, 하나 이상의 CB 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질 및 하나 이상의 CB 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터의 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 광합성 전자 전달 단백질은 시토크롬 c6 단백질, Rieske FeS 단백질, 또는 시토크롬 c6 단백질 및 Rieske FeS 단백질의 군에서 선택된다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 95, 또는 서열 번호: 102에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 또는 서열 번호: 101에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 벡터는 CB 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 핵 게놈 서열을 표적으로 하는 하나 이상의 유전자 편집 성분을 포함한다. 이러한 본 발명의 양상의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 유전자 편집 성분은 다음 군에서 선택된다: 핵 게놈 서열을 표적으로 하는 리보핵단백질 복합체; TALEN 단백질 인코딩 서열을 포함하는 벡터, 이때 TALEN 단백질은 핵 게놈 서열을 표적하고; ZFN 단백질 인코딩 서열을 포함하는 벡터, 이때 ZFN 단백질은 핵 게놈 서열을 표적하고; 올리고뉴클레오티드 공여자 (ODN), 이때 ODN은 핵 게놈 서열을 표적하고; 또는 CRISPR/Cas 효소 인코딩 서열 및 표적화 서열을 포함하는 벡터, 이때 표적화 서열은 핵 게놈 서열을 표적한다.
하나 이상의 CB 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제 (SBPase), 프럭토스-1,6-비스포스페이트 알돌라제 (FBPA), 클로로플라스틱 프럭토스-1,6-비스포스파타제 (FBPase), 이작용기성 프럭토스-1,6-비스포스파타제/세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제 (FBP/SBPase), 또는 트랜스케톨라제(TK)의 군에서 선택된다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 SBPase이고, SBPase는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 또는 서열 번호: 96에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 FBPA이고, FBPA는 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 또는 서열 번호: 97에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 FBPase이고, FBPase는 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 또는 서열 번호: 98에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 FBP/SBPase이고, FBP/SBPase는 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 또는 서열 번호: 99에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 트랜스케톨라제이고, 트랜스케톨라제는 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 또는 서열 번호: 100에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 유전자 변형된 식물을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물을 재배하는 방법을 포함하고, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: 토양에서 유전자 변형된 모종, 유전자 변형된 묘목, 유전자 변형된 절단, 유전자 변형된 괴경, 유전자 변형된 뿌리, 또는 유전자 변형된 종자를 식재하여 유전자 변형된 식물을 생산하거나 또는 유전자 변형된 모종, 유전자 변형된 묘목, 또는 유전자 변형된 절단을 뿌리 줄기 또는 토양에서 성장시킨 제2 식물에 접목시켜 유전자 변형된 식물을 생산하는 단계; 이러한 식물을 재배하여 수확가능한 종자, 수확가능한 잎, 수확가능한 뿌리, 수확가능한 절단, 수확가능한 목재, 수확가능한 열매, 수확가능한 낟알, 수확가능한 괴경, 및/또는 수확가능한 곡물을 생산하는 단계; 및 수확가능한 종자, 수확가능한 잎, 수확가능한 뿌리, 수확가능한 절단, 수확가능한 목재, 수확가능한 열매, 수확가능한 낟알, 수확가능한 괴경 및/또는 수확가능한 곡물을 수확하는 단계.
도면의 간단한 설명
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도 1A-1B는 형질전환 N. 타바쿰 계통을 생성하기 위해 사용되는 구조체들의 개략도를 보여준다. 도 1A는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana에서 FBP/SBPase (SynFBP/SBPase)의 발현을 위해 사용된 구조체 (상단, EC23083) 및 포르피라 움빌리칼리스(Porphyra umbilicalis) 시토크롬 c 6 (PuCytc6)의 발현을 위해 사용된 구조체 (하단, EC23028)를 보여준다. 도 1B는 N. 타바쿰 재배종 Samsun에서 시토크롬 c 6 (PuCytc6)의 발현을 위해 사용되는 구조체 (B2-C6)를 보여준다. RB = T-DNA 오른쪽 경계; pFMV = 무화과 모자이크 바이러스 프로모터; tNOS = 노팔린 합성효소 종결인자; 35S = 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터; HPT = 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) 열 충격 단백질 18.2 (HSP) 종결인자; LB = T-DNA 왼쪽 경계; p2x35S = 2x 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터; tHSP = 아라비돕시스 탈리아나 열 충격 단백질 18.2 (HSP) 종결인자; pNos = 노팔린 합성효소 프로모터; NPT II = 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
도 2A-2E는 FBP/SBPase, SBPase, 및 시토크롬 c 6을 과발현하는 형질전환 식물의 스크리닝을 보여준다. 도 2A는 SB 계통 (FBP/SBPase를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통 ; SB 계통 03, 06, 21, 및 44), C6 계통 (시토크롬 c 6를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통; C6 계통 15, 41, 47, 및 50), SBC6 계통 (FBP/SBPase 및 시토크롬 c 6를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통 ; SBC6 계통 1, 2, 및 3), 및 대조 계통 (CN; WT 및 접합 식물 모두)에서 전사체 수준을 보여준다. 도 2B는 S 계통 (SBPase를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통; S 계통 30 및 60), SC6 계통 (SBPase 및 시토크롬 c 6를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통; SC6 계통 1, 2, 및 3), 및 대조 계통 (CN; WT 및 접합 식물 모두)에서 전사체 수준을 보여준다. 도 2C는 대조 (CN; WT 및 접합 식물 모두)에 대한 SB 계통 및 SBC6 계통의 FBPase 활성을 보여준다. 도 2D-2E는 600-650 μmol m-2 s-1 (PPFD)에서 Fq'/Fm' (최대 PSII 작동 효율)을 결정하는데 사용되는 제어된 환경 조건에서 성장한 식물의 엽록소 형광 이미징을 보여준다. 도 2D는 600 PPFD에서 대조 (CN; WT 및 접합 식물 모두), SB, C6, 및 SBC6 계통 (계통 별 6개의 식물; 조작 별 3-4 계통)의 최대 PSII 작동 효율을 보여준다. 도 2E는 650 PPFD에서 대조 (CN, WT 식물), S 및 SC6 계통 (CN = 11주 식물, S 및 SC6 계통 = 조작 별 6-7개 식물)의 최대 PSII 작동 효율을 보여준다. 도 2C-2E에서, 별표는 대조군과 통계적으로 상이한 계통들을 나타낸다 (*P < 0.05).
도 3A-3B는 형질전환 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 및 N. 타바쿰 재배종 Samsun 식물들의 생화학적 분석을 보여준다. 도 3A는 FBP/SBPase (SB 계통 03, 06, 21, 및 44) 및 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6 계통 1, 2, 및 3)을 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통의 성숙한 잎들로부터 얻은 다수의 실험들을 나타내는 단백질 추출물들을, 야생형 (WT) 대조 식물 (CN)의 추출물과 비교하여 FBP/SBPase 항체에 대하여 블롯한 면역블롯 분석 결과들을 보여준다. 글리신 절단 시스템으로부터의 H-단백질의 발현을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 3B는 SBPase (S 계통 S30 및 S60) 및 SBPase + 시토크롬 c 6 (SC6 계통 1, 2, 및 3)을 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통의 성숙한 잎들로부터 얻은 다수의 실험들을 나타내는 단백질 추출물들을, 야생형 (WT) 대조 식물 (CN)의 추출물과 비교하여 SBPase 항체에 대하여 블롯한 면역블롯 분석 결과들을 보여준다. 도 3A-3B에서, 글리신 절단 시스템으로부터의 H-단백질 (H-단백질), 트랜스케톨라제 (TK), 및 루비스코의 발현이 로딩 대조군으로서 사용되었다. 면역블롯 분석은 여러 세트의 식물에 대해 반복되었으며, 제시된 결과는 전형적인 블롯을 나타낸다.
도 4는 도 2C에 도시된 분석된 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물에서 FBPase 효소 분석에 관한 완성된 데이터 세트를 보여준다. 막대는 테스트된 형질전환 계통의 FBPase 활성을 대조군 (WT 및 접합 식물 모두)의 FBPase 활성에 대해 나타낸다. 각 막대는 FBP/SBPase를 발현하는 SB 계통 (SB03, SB06, SB21, SB44; 중앙에 “B” 표지되어 제시됨), FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC1, SBC2, SBC3; 오른쪽에 “BC6” 표지되어 제시됨)를 발현하는 SBC6 계통, 및 대조 계통 (CN; WT 및 접합 식물 모두; 왼쪽에 검은색으로 제시됨)의 개별 식물이다. 평균 대조 활성은 1.0 상대 FBPase 활성에서 검은색 수평 막대로 표시되고 "CN"으로 표지된다.
도 5A-5B는 시토크롬 c 6를 발현하는 형질전환 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물들의 생화학적 분석을 보여준다. 도 5A는 C6 계통 (C15, C41, 및 C47), WT 대조 계통, 및 널 분리체 (A) 대조 계통, 뿐만 아니라 포르피라 움빌리칼리스 미정제 단백질 추출물 (P)의 잎들을 발달시킨 풀에서 얻은 단백질 추출물의 면역블롯 분석을 보여준다. 도 5B는 도 5A의 면역블롯 막의 Ponceau 염색을 보여주며, 도 5A의 식물 잎 추출물들의 유사한 로딩 수준을 나타낸다
도 6A-6B는 2017년 현장 실험 (즉, 현장에서 자란 식물을 평가하는 실험) 동안의 평균 환경 조건을 보여준다. 도 6A는 2017년 현장 실험에서 얻은 평균 일광 강도 (μmol m-2 s-1)를 보여준다. 도 6B는 2017 현장 실험에서 얻은 대기 온도 (˚를 보여준다. 도 6A-6B에서, 검은색 = 2017 실험 1 및 회색 = 2017 실험 2.
도 7A-7B는 통제된 조건(즉, 온실(GH)에서)에서 성장한 형질전환 식물의 광합성 반응을 보여준다. 도 7A-7B는 광합성 탄소 고정화 속도 (A (μmol m-2 s-1)), 명반응에서 PSII의 실제 작동 효율 (Fq'/Fm'), PSII로부터 멀어지는 전자 싱크 (Fq'/Fv'), 및 PSII 최대 효율 (Fv'/Fm')을 보여준다. 매개변수들은 포화 광 수준 (400 μmol m-2 s-1 내지 1000 μmol m-2 s-1에서 진동하는 온실의 자연광 수준; 400 μmol m-2 s-1의 최소 복사조도 수준을 유지하기 위해 필요에 따라 보조 조명이 제공되었음)에서 CO2 농도 (C i (μmol m-2)) 증가에 따른 함수로서 결정되었다. 도 7A는 FBP/SBPase (SB), 시토크롬 c 6 (C6), FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6), 및 대조 (CN; WT 및 접합 식물 모두)를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통의 성숙한 잎들의 광합성 반응을 보여준다. 도 7B는 SBPase (S), SBPase + 시토크롬 c 6 (SC6), 및 대조 (CN; WT 및 접합 식물 모두)를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통의 성숙 잎 (왼쪽 열) 및 발달 중인 잎 (즉, 11-13 cm 길이; 오른쪽 열)의 광합성 반응을 보여준다. 도 7A-7B에서, 3-4가지 독립 형질전환 계통으로부터 얻은 3-4개의 개별 식물들을 평가하였다. 별표는 선형 혼합 효과 모델 및 유형 III ANOVA를 사용하여 결정된 형질전환 및 대조군 간의 유의도를 나타낸다, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 8는 SBPase의 발현 또는 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6의 발현의 증가가 통제된 조건에서 (즉, 온실 (GH)에서) 성장한 식물들에서 바이오매스를 증가시킴을 보여준다. 그래프의 왼쪽 열은 FBP/SBPase (SB), 시토크롬 c 6 (C6), 및 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6)을 발현하는 40일령 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통에 대하여, 식물 높이, 잎 면적, 및 지상 바이오매스 건조 중량의 평균 ± SE를 대조 값들의 백분율로 표시하여 보여준다. 그래프의 오른쪽 열은 SBPase (S) 및 SBPase + 시토크롬 c 6 (SC6)을 발현하는 56일령 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통에 대하여, 식물 높이, 잎 면적, 및 지상 바이오매스 건조 중량의 평균 ± SE를 대조 값들의 백분율로 표시하여 보여준다. 2-4가지 독립 형질전환 계통으로부터 얻은 5-6개의 개별 식물들을 평가하였다. WT 및 접합 식물 모두를 포함하는 대조군들에 대해 얻은 값들은 100%로 설정된 회색 음영으로 도시되어 그래프 위에 중첩된다. 별표는 Tukey의 사후 검정과 함께 ANOVA를 사용하여 결정된 형질전환과 대조군 사이 또는 유전자형들 사이의 유의도를 나타낸다, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 9는 SBPase의 발현, 또는 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6의 발현 증가가 GH 성장 식물의 바이오매스 증가를 야기함을 보여준다. 그래프의 왼쪽 열은 FBP/SBPase (SB), 시토크롬 c 6 (C6), 및 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6)을 발현하는 40일령 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통에 대하여, 잎의 수, 잎 건조 중량, 및 줄기 건조 중량의 평균 ± SE를 대조 값들의 백분율로 표시하여 보여준다. 그래프의 오른쪽 열은 SBPase (S) 및 SBPase + 시토크롬 c 6 (SC6)을 발현하는 56일령 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통에 대하여, 잎의 수, 잎 건조 중량, 및 줄기 건조 중량의 평균 ± SE를 대조 값들의 백분율로 표시하여 보여준다. 2-4가지 독립 형질전환 계통으로부터 얻은 5-6개의 개별 식물들을 평가하였다. WT 및 접합 식물 모두를 포함하는 대조군들에 대해 얻은 값들은 100%로 설정된 회색 음영으로 도시되어 그래프 위에 중첩된다. 별표는 Tukey의 사후 검정과 함께 ANOVA를 사용하여 결정된 형질전환과 대조군 사이 또는 유전자형들 사이의 유의도를 나타낸다, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 10A-10C는 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6의 동시 발현이 현장에서 재배된 식물에서 바이오매스를 증가시킨다는 것을 보여준다. 도 10A는 시토크롬 c 6 (C6) 또는 FBP/SBPase (SB)을 발현하는 40일령 (즉, 어린) 2016 현장-재배 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물에 대하여, 식물 높이, 잎 면적, 및 지상 바이오매스 건조 중량의 평균 ± SE를 대조 값들의 백분율로 표시하여 보여준다. 도 10B는 FBP/SBPase (SB 계통; 밝은 회색 막대) 또는 시토크롬 c 6 (C6 계통; 어두운 회색 막대)를 발현하는 57일령 (즉, 어린) 2016 현장-재배 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물에 대하여, 식물 높이, 잎 면적, 및 지상 바이오매스 건조 중량의 평균 ± SE를 대조 값들의 백분율로 표시하여 보여준다. 도 10C는 시토크롬 c 6 (C6 계통; 어두운 회색 막대) 또는 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6 계통; 흰색 막대)를 발현하는 71일령 (즉, 개화) 현장-재배 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물에 대하여, 식물 높이, 잎 면적, 및 지상 바이오매스 건조 중량의 평균 ± SE를 대조 값들의 백분율로 표시하여 보여준다. 2-3개의 독립적인 형질전환 계통으로부터의 6개의 개별 식물 (도 10A) 또는 2-3개의 독립적인 형질전환 계통으로부터의 24개의 개별 식물 (도 10B-10C)을 평가하였다. WT 및 접합 식물 모두를 포함하는 대조군들에 대해 얻은 값들은 100%로 설정된 회색 음영으로 도시되어 그래프 위에 중첩된다. 별표는 Tukey의 사후 검정과 함께 ANOVA를 사용하여 형질전환과 대조군 사이 또는 유전자형들 사이의 유의도를 나타낸다, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 11A-11B는 현장에서 재배된 형질전환 식물의 광합성 능력을 보여준다. 도 11A는 FBP/SBPase (SB), 시토크롬 c 6 (C6)을 발현하는 현장 재배된 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통, 및 대조 식물 (CN; WT 및 접합 식물 모두)에서 얻은 성숙한 잎들에서 광합성 탄소 고정화 속도 (A (μmol m-2 s-1)) 및 PSII의 작동 효율 (Fq'/Fm')을 포화 광 수준에서 CO2 농도 (Ci (μmol m-2)) 증가의 함수로서 보여준다. 삽입된 막대 그래프는 현장에서 재배한 SB 및 C6 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 및 CN 계통으로부터 얻은 성숙한 잎들에 대한 최대 탄소 고정화 속도 (A max)를 보여준다. 도 11B는 시토크롬 c 6 (C6), FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6)을 발현하는 현장 재배된 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통, 및 대조 식물 (CN; WT 및 접합 모두)에서 얻은 성숙한 잎들에서 광합성 탄소 고정화 속도 (A (μmol m-2 s-1)) 및 PSII의 작동 효율 (Fq'/Fm')을 포화 광 수준에서 CO2 농도 (Ci (μmol m-2)) 증가의 함수로서 보여준다. 삽입된 막대 그래프는 현장에서 재배한 C6 및 SBC6 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 및 CN 계통으로부터 얻은 성숙한 잎들에 대한 최대 탄소 고정화 속도 (A max)를 보여준다. 도 11A-11B에서, 2-3가지 독립 형질전환 계통으로부터 얻은 4-5개 개별 식물들의 평균 ± SE가 제시된다. 별표는 선형 혼합 효과 모델 및 유형 III ANOVA로 결정된 형질전환 및 대조군 간의 유의도를 나타낸다, *P < 0.05.
도 12A-12D는 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6의 동시 발현은 현장 조건에서 물 이용 효율을 증가시킴을 보여준다. 도 12A는 평균 ± SE 순 CO2 동화 속도 (A (μmol m-2 s-1))를 보여주고, 도 12B는 평균 ± SE 기공 전도도 (gs (mol m-2 s-1))를 보여주고, 도 12C는 평균 ± SE 세포간 CO2 농도 (Ci (μmol m-2))를 보여주고, 및 도 12D는 평균 ± SE 고유 물 이용 효율 (iWUE (A/gs))을 보여준다. 도 12A-12D에 도시된 매개변수들은 시토크롬 c6 (C6), FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6)을 발현하는 현장 재배된 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통, 및 대조 식물들 (CN; WT 및 접합 모두)에서 빛의 함수로서 (PPFD (μmol m-2 s-1)) 제공된다. 2-3가지 독립 형질전환 계통으로부터 얻은 4-5개의 개별 식물들을 평가하였다. 별표는 선형 혼합 효과 모델 및 유형 III ANOVA를 사용하여 결정된 형질전환 계통들 및 대조군 간의 유의도를 나타낸다, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 13A-13D는 2017 현장 실험 1에서 FBP/SBPase 또는 시토크롬 c 6를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물들에서 흡수된 광 강도에 대한 가스 교환 매개변수의 반응을 보여준다. 도 13A는 순 CO2 동화 속도 (A (μmol m-2 s-1))를 보여주고, 도 13B는 기공 전도도 (gs (mol m-2 s-1))를 보여주고, 도 13C는 세포간 CO2 농도 (Ci (μmol m-2))를 보여주고, 그리고 도 13D는 고유 물 이용 효율 (iWUE (A/gs))을 보여준다. 도 13A-13D에 도시된 매개변수들은 FBP/SBPase (SB), 시토크롬 c 6 (C6)을 발현하는 현장 재배된 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통, 및 대조 식물들 (CN; WT 및 접합 식물들 모두)에서 빛의 함수로서 (PPFD (μmol m-2 s-1)) 제공된다. 2-3가지 독립 형질전환 계통으로부터 얻은 4-5개의 개별 식물들을 평가하고 평균 ± SE을 제시한다. 별표는 선형 혼합 효과 모델 및 유형 III ANOVA를 사용하여 결정된 군들 간의 유의도를 나타낸다, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 14A-14D는 클라미도모나스 레인하르드티이 (Chlamydomonas reinhardtii) (C_reinhardtii_SBPase_XP_001691997.1 (서열 번호: 13); C reinhardtii_SBPase_P46284.1 (서열 번호: 14)), 제아 메이스 (Zea mays)(Z_mays_SBPase_NP_001148402.1 (서열 번호: 10); Z_mays_SBPase_ONM36378.1 서열 번호: 11)), 브라키포디움 디스타키온 (Brachypodium distachyon) (서열 번호: 9), 트리티쿰 아에스티붐 (트리티쿰 aestivum) (T_aestivum_SBPase_P46285.1 (서열 번호: 7); T_aestivum_SBPase_CBH32512.1 (서열 번호: 8)), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) (서열 번호: 1), 브라시카 나푸스 (Brassica napus) (서열 번호: 2), 아나나스 코모수스 (Ananas comosus) (서열 번호: 6), 글리신 맥스 (Glycine max) (서열 번호: 12), 솔라눔 사이코페르시쿰 (Solanum lycopersicum) (서열 번호: 3), 및 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) (N_타바쿰_SBPase_016455125.1 (서열 번호: 4); N_타바쿰_SBPase_016497321.1 (서열 번호: 5))에서 얻은 SBPase 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 도 14A는 SBPase 폴리펩티드의 N 말단부의 정렬을 보여준다. 도 14B는 SBPase 폴리펩타이드의 중앙부의 첫 번째 부분의 정렬을 보여준다 (상자는 비-TRx (산화환원) 활성화된 SBPase를 갖는 식물을 생산하기 위해 돌연변이될 시스테인 잔기를 나타냄). 도 14C는 SBPase 폴리펩티드의 중앙부의 두 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 14D는 SBPase 폴리펩티드의 C 말단부를 보여준다.
도 15A-15D는 클라미도모나스 레인하르드티이 (서열 번호: 26), 아라비돕시스 탈리아나 (서열 번호: 17), 브라시카 나푸스 (서열 번호: 18), 솔라눔 사이코페르시쿰 (서열 번호: 15), 니코티아나 타바쿰 (서열 번호: 16), 글리신 맥스 (G_max_FBPA_NP_001347079.1 (서열 번호: 22); G_max_FBPA1_XP_003522841.1 (서열 번호: 23)), 아나나스 코모수스 (서열 번호: 24), 제아 메이스 (Z_mays_FBPA_ACG36798.1 (서열 번호: 19); Z_mays_FBPA_PWZ45921.1 (서열 번호: 20)), 트리티쿰 아에스티붐 (서열 번호: 21), 및 브라키포디움 디스타키온 (서열 번호: 25)에서 얻은 FBPA 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 도 15A는 FBPA 폴리펩티드의 N 말단부의 정렬을 보여준다. 도 15B는 FBPA 폴리펩티드의 중앙부의 첫 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 15C는 FBPA 폴리펩티드의 중앙부의 두 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 15D는 FBPA 폴리펩티드의 C 말단부의 정렬을 보여준다.
도 16A-16D는 클라미도모나스 레인하르드티이 (서열 번호: 37), 제아 메이스 (서열 번호: 35), 브라키포디움 디스타키온 (서열 번호: 33), 트리티쿰 아에스티붐 (서열 번호: 36), 아라비돕시스 탈리아나 (서열 번호: 27), 브라시카 나푸스 (서열 번호: 34), 글리신 맥스 (G_max_FBPase_NP_001238269.2 (서열 번호: 28); G_max_FBPase_XP_003552216.1 (서열 번호: 29)), 니코티아나 타바쿰 (서열 번호: 30), 및 솔라눔 사이코페르시쿰 (서열 번호: 32)에서 얻은 FBPase 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 도 16A는 FBPase 폴리펩티드의 N 말단부의 정렬을 보여준다. 도 16B는 FBPase 폴리펩티드의 중앙부의 첫 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 16C는 FBPase 폴리펩티드의 중앙부의 두 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 16D는 FBPase 폴리펩티드의 C 말단부의 정렬을 보여준다. 도 16B-16C에서, 상자는 비-TRx (산화환원) 활성화된 FBPase를 갖는 식물을 생산하기 위해 돌연변이될 시스테인 잔기를 나타낸다.
도 17A-17B는 시네코시스티스 종 (Synechocystis sp.) PCC 6803 (서열 번호: 38), 시네코시스티스 종 PCC 6714 (서열 번호: 39) 및 마이크로시스티스 아에루기노사 (Microcystis aeruginosa) (서열 번호: 40)에서 얻은 FBP/SBPase 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 도 17A는 FBP/SBPase 폴리펩티드의 N 말단부의 정렬을 보여준다. 도 17B는 FBP/SBPase 폴리펩티드의 C 말단부의 정렬을 보여준다.
도 18A-18E는 브라키포디움 디스타키온 (B_distachyon_TK_XP_003557240.1 (서열 번호: 46); B_distachyon_TK_XP_003581128.1 (서열 번호: 47)), 제아 메이스 (서열 번호: 45), 니코티아나 타바쿰 (서열 번호: 43), 솔라눔 사이코페르시쿰 (서열 번호: 44), 아라비돕시스 탈리아나 (A_thaliana_TK1 (서열 번호: 41); A_thaliana_TK2 (서열 번호: 48)), 및 브라시카 나푸스 (서열 번호: 42)에서 얻은 트랜스케톨라제 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 도 18A는 트랜스케톨라제 폴리펩티드의 N 말단부의 정렬을 보여준다. 도 18B는 트랜스케톨라제 폴리펩티드의 중앙부의 첫 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 18C는 트랜스케톨라제 폴리펩티드의 중앙부의 두 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 18D는 트랜스케톨라제 폴리펩티드의 중앙부의 세 번째 부분의 정렬을 보여준다. 도 18E는 트랜스케톨라제 폴리펩티드의 C 말단부의 정렬을 보여준다.
도 19A-19B는 클라미도모나스 레인하르드티이 (서열 번호: 80), 아나나스 코모수스 (서열 번호: 74), 제아 메이스 (서열 번호: 78), 오리자 사티바 (Oryza sativa) (서열 번호: 76), 트리티쿰 아에스티붐 (서열 번호: 75), 브라키포디움 디스타키온 (서열 번호: 77), 아라비돕시스 탈리아나 (서열 번호: 70), 브라시카 나푸스 (서열 번호: 71), 글리신 맥스 (서열 번호: 79), 솔라눔 사이코페르시쿰 (서열 번호: 72), 및 니코티아나 타바쿰 (서열 번호: 73)에서 얻은 Rieske FeS 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 도 19A는 Rieske FeS 폴리펩티드의 N 말단부의 정렬을 보여준다. 도 19B는 트랜스케톨라제 폴리펩티드의 C 말단부의 정렬을 보여준다.
도 20A-20C는 클라미도모나스 레인하르드티이 (서열 번호: 49), 오실라토리아 아쿠미나타 (Oscillatoria acuminata) (서열 번호: 68), 샤마에시폰 폴리모르푸스 (Chamaesiphon polymorphus) (서열 번호: 69), 파이로피아 테네라 (Pyropia tenera) (서열 번호: 53), 포르피라 움빌리칼리스 (서열 번호: 95), 포르피라 푸르푸레아 (Porphyra purpurea) (서열 번호: 51), 반지아 푸스코푸르푸레아 (Bangia fuscopurpurea) (서열 번호: 50), 파이로지아 풀크라 (Pyropia pulchra) (서열 번호: 52), 울바 파시아타 (Ulva fasciata) (서열 번호: 64), 토레아 히스피다 (Thorea hispida) (서열 번호: 55), 프라실라리아 페록스 (Gracilaria ferox) (서열 번호: 58), 그라실라리옵시스 맥라클라니이 (Gracilariopsis mclachlanii) (서열 번호: 62), 안펠티아 플리카타 (Ahnfeltia plicata) (서열 번호: 56), 포롤리톤 온코데스 (Porolithon onkodes) (서열 번호: 57), 사카리나 자포니카 (Saccharina japonica) (서열 번호: 67), 사르가숨 콘푸숨 (Sargassum confusum) (서열 번호: 59), 푸쿠스 베시쿨로수스 변종 스피랄리스 (Fucus vesiculosus var. spiralis) (서열 번호: 65), 포르피리디움 푸르푸레움 (Porphyridium purpureum) (서열 번호: 54), 트라키디스쿠스 미누투스 (Trachydiscus minutus) (서열 번호: 60), 난노클로롭시스 오쿨라타 (Nannochloropsis oculata) (서열 번호: 66), 비셰리아 종 (Vischeria sp.) CAUP Q (서열 번호: 61), 및 모노돕시스 종 (Monodopsis sp.) MarTras21 (서열 번호: 63)에서 얻은 시토크롬 c6 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 도 20A는 시토크롬 c6 폴리펩티드의 N 말단부의 정렬을 보여준다. 도 20B는 시토크롬 c6 폴리펩티드의 중앙부의 정렬을 보여준다. 도 20C는 시토크롬 c6 폴리펩티드의 C 말단부의 정렬을 보여준다.
상세한 설명
다음 설명은 예시적인 방법, 매개변수 등을 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라 예시적인 실시예의 설명으로서 제공된다는 것을 알아야 한다.
유전자 변형된 식물 및 종자
본 발명의 한 양상은 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포를 포함하고, 여기서 식물, 이의 일부 또는 세포는 CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질의 과발현인 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예는 시토크롬 c6 단백질, Rieske FeS 단백질, 또는 시토크롬 c6 단백질 및 Rieske FeS 단백질의 군에서 선택된 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 c6 단백질인 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 조류 시토크롬 c6 단백질인 시토크롬 c6 단백질을 포함한다. 본 양상의 또 다른 구체예에서, 조류 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 95, 또는 서열 번호: 102에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 조류 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 95에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 조류 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 102에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 Rieske FeS 단백질인 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 또는 서열 번호: 101에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 101에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 c6 단백질 및 Rieske FeS 단백질인 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 95, 또는 서열 번호: 102에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 또는 서열 번호: 101에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
시토크롬 c6을 갖는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이러한 본 발명의 양상의 또 다른 구체예에서, 시토크롬 c6 단백질은 유전자 변형된 식물의 세포 내 적어도 하나의 엽록체의 틸라코이드 루멘에 국재화된다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 c6 단백질을 틸라코이드 루멘에 국재화시키는 전이 펩티드 (transit peptide)를 포함하는 시토크롬 c6 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 엽록소 a/b 결합 단백질 6 전이 펩티드, 광-수확 복합체 I 엽록소 a/b 결합 단백질 1 전이 펩티드, 또는 플라스토시아닌 신호 펩티드의 군에서 선택되는 시토크롬 c6 전이 펩티드를 포함한다. Rieske FeS를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이러한 본 양상의 또 다른 구체예에서, Rieske FeS 단백질은 Rieske FeS 단백질을 틸라코이드 막에 국재화하는 전이 펩티드를 포함한다. 이러한 발명의 양상의 또 다른 구체예는 시토크롬 b6f 복합체 단백질 전이 펩티드인 Rieske FeS 전이 펩티드를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시토크롬 f 전이 펩티드, 시토크롬 b6 전이 펩티드, PetD 전이 펩티드, PetG 전이 펩티드, PetL 전이 펩티드, PetN 전이 펩티드, PetM 전이 펩티드, 및 플라스토퀴논 전이 펩티드의 군에서 선택되는 Rieske FeS 전이 펩티드를 포함한다. 시토크롬 c6를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 본 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 인코딩하는 시토크롬 c6 단백질을 추가로 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. Rieske FeS를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 본 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 인코딩하는 Rieske FeS 단백질을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다.
상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형은 CB 단백질의 과발현을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제(SBPase), 프럭토스-1,6-비스포스페이트 알돌라제(FBPA), 클로로플라스틱 프럭토스-1,6-비스포스파타제(FBPase), 이작용기성 프럭토스-1,6-비스포스파타제/세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제(FBP/SBPase), 또는 트랜스케톨라제(TK)의 군에서 선택되는 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 SBPase인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, SBPase는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 또는 서열 번호: 96에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, SBPase 단백질은 서열 번호: 96에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 SBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, SBPase는 SBPase를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. SBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 SBPase 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 FBPA인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPA는 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 또는 서열 번호: 97에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPA는 서열 번호: 97에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 FBPA를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPA는 FBPA를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. FBPA를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 FBPA 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 FBPase인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPase는 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 또는 서열 번호: 98에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPase는 서열 번호: 98에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 FBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBPase는 FBPase를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. FBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 SBPase 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 FBP/SBPase인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 시아노박테리아 FBP/SBPase인 FBP/SBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 남세균 FBP/SBPase는 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 또는 서열 번호: 99에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, 남세균 FBP/SBPase은 서열 번호: 99에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. FBP/SBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 유전적으로 변경된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 FBP/SBPase를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, FBP/SBPase는 FBP/SBPase를 엽록체 기질에 국재화시키는 전이 펩티드를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 식물에서 엽록체 기질 단백질 전이 펩티드인 전이 펩티드를 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 제라니올 합성효소 전이 펩티드, SBPase 전이 펩티드, FBPA 전이 펩티드, FBPase 전이 펩티드, 트랜스케톨라제 전이 펩티드, PGK 전이 펩티드, GAPDH 전이 펩티드, AGPase 전이 펩티드, RPI 전이 펩티드, RPE 전이 펩티드, PRK 전이 펩티드, 또는 루비스코 전이 펩티드의 군에서 선택되는 전이 펩티드를 포함한다. FBP/SBPase를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 FBP/SBPase 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 트랜스케톨라제인 CB 단백질을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 트랜스케톨라제는 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 또는 서열 번호: 100에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, 트랜스케톨라제는 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 또는 서열 번호: 100에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 유전자 변형된 식물의 세포 내에서 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되는 트랜스케톨라제를 포함한다. 트랜스케톨라제를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스케톨라제 인코딩 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다.
FBP/SBPase가 아닌 CB 단백질을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 추가 구체예는 내인성인 CB 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 CB 단백질을 과발현, 유도적으로 발현, 특정 조직 또는 세포 유형에서 발현, 유도적으로 과발현, 또는 특정 조직 또는 세포 유형에서 유도적으로 발현하도록 유전자 조작된 CB 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 또한 CB 단백질을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 추가 구체예는 이종인 CB 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 식물은 변형되지 않은 야생형 (WT) 식물에 비해 증가된 바이오매스를 가진다. 이 양상의 추가 구체예는 1000 mmol m-2 s-1 이상의 광도를 갖는 조건에서 재배될 때 변형되지 않은 WT 식물과 비교하여 개선된 물 사용 효율을 갖는 식물을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 동부콩(예를 들어, 검은콩, 캣장, 야드롱 콩, 비그나 운구이쿨라타 (Vigna unguiculata)), 대두 (예를 들어, 글리신 맥스, 글리신 소자 (Glycine soja)), 카사바 (예를 들어, 마니옥, 유카, 마니호트 에스쿨렌타), 쌀 (예를 들어, 인디카 벼, 자포니카 벼, 향미 벼, 찰성 벼, 오리자 사티바, 오리자 글라베리마 (Oryza glaberrima)), 밀 (예를 들어, 일반 밀, 스펠트, 듀럼, 외알, 엠머, 카무트, 트리티쿰 아에스티붐, 트리티쿰 스펠타, 트리티쿰 듀럼, 트리티쿰 우라르투, 트리티쿰 모노코쿰, 트리티쿰 투라니쿰, 트리티쿰 아종), 보리 (예를 들어, 호르데움 불가레), 토마토 (예를 들어, 솔라눔 사이코페르시쿰), 감자 (예를 들어, 러셋 감자, 노란 감자, 홍 감자, 솔라눔 투베로숨), 담배 (예를 들어, 니코티아나 타바쿰), 카놀라 (예를 들어, 브라시카 라파, 브라시카 나푸스, 브라시카 준세아), 또는 다른 C3 작물 군에서 선택되는 식물을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 동부콩(예를 들어, 검은콩, 캣장, 야드롱 콩, 비그나 운구이쿨라타), 대두 (예를 들어, 글리신 맥스, 글리신 소자), 카사바 (예를 들어, 마니옥, 유카, 마니호트 에스쿨렌타), 쌀 (예를 들어, 인디카 벼, 자포니카 벼, 향미 벼, 찰성 벼, 오리자 사티바, 오리자 글라베리마), 밀 (예를 들어, 일반 밀, 스펠트, 듀럼, 외알, 엠머, 카무트, 트리티쿰 아에스티붐, 트리티쿰 스펠타, 트리티쿰 듀럼, 트리티쿰 우라르투, 트리티쿰 모노코쿰, 트리티쿰 투라니쿰, 트리티쿰 아종), 보리 (예를 들어, 호르데움 불가레), 및 담배 (예를 들어, 니코티아나 타바쿰)의 군에서 선택되는 식물을 포함한다.
식물 부분과 관련하여 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 꽃, 종자, 낟알, 곡물, 열매, 세포 또는 이의 일부인 식물 부분, 및 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 유전자 변형된 식물 부분을 포함한다. 이 양상의 추가 구체예는 열매, 괴경, 낟알 또는 곡물인 식물 부분을 포함한다. 또한 화분립 또는 난세포들에 관한 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나의 식물의 유전자 변형된 화분립 또는 유전자 변형된 난세포를 포함하고, 이때 상기 유전자 변형된 화분립 또는 유전자 변형된 난세포는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물로부터 생산된 유전자 변형된 원형질체를 포함하고, 이때 유전자 변형된 원형질체는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 원형질체로부터 생성된 유전자 변형된 조직 배양물 또는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물에서 얻은 세포를 포함하며, 여기서 세포 또는 원형질체는 잎, 잎 엽육 세포, 꽃밥, 암술, 줄기, 잎자루, 뿌리, 뿌리 끝, 괴경, 열매, 종자, 낟알, 곡물, 꽃, 떡잎, 배축, 배 또는 분열 세포의 군에서 선택되는 식물 부분으로부터 생성되며, 이때 유전자 변형된 조직 배양물은 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 유전자 변형된 조직 배양물로부터 재생된 유전자 변형된 식물을 포함한다. 또한 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물로부터 생산된 유전자 변형된 식물 종자를 포함한다.
유전자 변형된 식물들을 생산 및 재배하는 방법
본 발명의 또 다른 양상은 (a) CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형, 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형, 또는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형 모두를 식물 세포, 조직, 또는 다른 외식편에 도입하는 단계; (b) 이러한 식물 세포, 조직, 또는 다른 외식편을 유전자 변형된 묘목으로 재생시키는 단계; 및 (c) 이러한 유전자 변형된 묘목을, CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형, 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형, 또는 CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형 모두를 가진 유전자 변형된 식물로 성장시키는 단계를 포함하는, 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물의 생산 방법을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예는 단계 (b) 전에 식물 세포, 조직 또는 다른 외식편을 스크리닝하거나 선별함으로써 하나 이상의 유전자 변형의 성공적인 도입을 확인하는 단계; 단계 (b)와 (c) 사이에 묘목을 스크리닝 또는 선별하는 단계; 또는 단계 (c) 후에 식물을 스크리닝 또는 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 형질전환은 입자 충격 (즉, biolistics, 유전자 총), 아그로박테리움-매개 형질전환, 리조비움-매개 형질전환, 또는 원형질체 형질감염 또는 형질전환 군으로부터 선택된 형질전환 방법을 사용하여 수행된다.
또한 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예는 벡터와 함께 도입되는 유전자 변형을 포함한다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 벡터는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드, 하나 이상의 CB 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질 및 하나 이상의 CB 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터의 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, 광합성 전자 전달 단백질은 시토크롬 c6 단백질, Rieske FeS 단백질, 또는 시토크롬 c6 단백질 및 Rieske FeS 단백질의 군에서 선택된다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 95, 또는 서열 번호: 102에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 도 20A-20C는 예시적인 시토크롬 c6 단백질 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 또는 서열 번호: 101에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 도 19A-19B는 예시적인 Rieske FeS 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, 벡터는 CB 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 핵 게놈 서열을 표적으로 하는 하나 이상의 유전자 편집 성분을 포함한다. 이러한 본 발명의 양상의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 유전자 편집 성분은 다음 군에서 선택된다: 핵 게놈 서열을 표적으로 하는 리보핵단백질 복합체; TALEN 단백질 인코딩 서열을 포함하는 벡터, 이때 TALEN 단백질은 핵 게놈 서열을 표적하고; ZFN 단백질 인코딩 서열을 포함하는 벡터, 이때 ZFN 단백질은 핵 게놈 서열을 표적하고; 올리고뉴클레오티드 공여자 (ODN), 이때 ODN은 핵 게놈 서열을 표적하고; 또는 CRISPR/Cas 효소 인코딩 서열 및 표적화 서열을 포함하는 벡터, 이때 표적화 서열은 핵 게놈 서열을 표적한다.
하나 이상의 CB 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나와 조합될 수 있는 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제 (SBPase), 프럭토스-1,6-비스포스페이트 알돌라제 (FBPA), 클로로플라스틱 프럭토스-1,6-비스포스파타제 (FBPase), 이작용기성 프럭토스-1,6-비스포스파타제/세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제 (FBP/SBPase), 또는 트랜스케톨라제(TK)의 군에서 선택된다. 본 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 SBPase이고, SBPase는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 또는 서열 번호: 96에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 도 14A-14D는 예시적인 SBPase 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 FBPA이고, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 또는 서열 번호: 97에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 도 15A-15D는 예시적인 FBPA 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 또한 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 FBPase이고, 그리고 FBPase는 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 98에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 도 16A-16D는 예시적인 FBPase 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 FBP/SBPase이고, 그리고 FBP/SBPase는 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 또는 서열 번호: 99에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 도 17A-17B는 예시적인 FBP/SBPase 폴리펩티드 서열들의 정렬을 보여준다. 이 양상의 또 다른 구체예에서, CB 단백질은 트랜스케톨라제이고, 그리고 트랜스케톨라제는 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 또는 서열 번호: 100에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 71% 서열 동일성, 적어도 72% 서열 동일성, 적어도 73% 서열 동일성, 적어도 74% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 76% 서열 동일성, 적어도 77% 서열 동일성, 적어도 78% 서열 동일성, 적어도 79% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 81% 서열 동일성, 적어도 82% 서열 동일성, 적어도 83% 서열 동일성, 적어도 84% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 86% 서열 동일성, 적어도 87% 서열 동일성, 적어도 88% 서열 동일성, 적어도 89% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 도 18A-18E는 예시적인 트랜스케톨라제 서열들의 정렬을 보여준다.
본 발명의 또 다른 양상은 유전자 변형된 식물을 가지는 상기 구체예들 중 어느 하나의 유전자 변형된 식물을 재배하는 방법을 포함하고, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: 토양에서 유전자 변형된 모종, 유전자 변형된 묘목, 유전자 변형된 절단, 유전자 변형된 괴경, 유전자 변형된 뿌리, 또는 유전자 변형된 종자를 식재하여 유전자 변형된 식물을 생산하거나 또는 유전자 변형된 모종, 유전자 변형된 묘목, 또는 유전자 변형된 절단을 뿌리 줄기 또는 토양에서 성장시킨 제2 식물에 접목시켜 유전자 변형된 식물을 생산하는 단계; 이러한 식물을 재배하여 수확가능한 종자, 수확가능한 잎, 수확가능한 뿌리, 수확가능한 절단, 수확가능한 목재, 수확가능한 열매, 수확가능한 낟알, 수확가능한 괴경, 및/또는 수확가능한 곡물을 생산하는 단계; 및 수확가능한 종자, 수확가능한 잎, 수확가능한 뿌리, 수확가능한 절단, 수확가능한 목재, 수확가능한 열매, 수확가능한 낟알, 수확가능한 괴경 및/또는 수확가능한 곡물을 수확하는 단계.
유전자 변형된 식물, 식물 부분 및 식물 세포를 생산하는 분자 생물학적 방법
본 발명의 한 양상은 변형되지 않은 식물, 식물 부분 또는 식물 세포와 비교하여 하나 이상의 CB 단백질의 변형된 발현 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질의 변형된 발현을 갖는 유전자 변형된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질이 추가된 그리고 하나 이상의 CB 단백질이 추가된 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포를 제공하며, 이때 상기 하나 이상의 CB 단백질 및/또는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 인코딩하는 핵산이 상기 식물의 유전자 변형에 의해 도입되어 있거나, 상기 프로모터가 상기 식물의 유전자 변형에 의해 도입되어 있거나, 또는 하나 이상의 CB 단백질 및/또는 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질을 인코딩하는 핵산 및 상기 프로모터 모두가 상기 식물의 유전자 변형에 의해 도입되어 있다.
유전자 변형된 단자엽 및 쌍자엽 식물 세포의 형질전환 및 생성은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Weising, et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988); 미국 특허 제 5,679,558; Agrobacterium Protocols, ed: Gartland, Humana Press Inc. (1995); Wang, et al. Acta Hort. 461:401-408 (1998), 및 Broothaerts, et al. Nature 433:629-633 (2005)를 참고하라. 방법의 선택은 형질전환될 식물의 유형, 특정 적용 및/또는 원하는 결과에 따라 다르다. 적절한 형질전환 기술은 숙련된 실무자에 의해 용이하게 선택된다.
세포 DNA (예를 들어, 게놈 DNA 및 세포소기관 DNA)를 결실, 삽입 또는 변형하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법론이 본원에 개시된 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 한 예로서, CRISPR/Cas-9 시스템 및 관련 시스템 (예를 들어, TALEN, ZFN, ODN 등)을 사용하여, 예를 들어, 억제인자 결합 부위의 제거 또는 인핸서 결합 부위의 도입을 통해 이종 유전자를 게놈 DNA의 표적 부위에 삽입하거나 내인성 유전자를 실질적으로 편집하여 프로모터를 변형시키거나 이종성 유전자를 변형시켜 내인성 유전자의 발현을 증가시키거나 다른 방식으로 변경시킨다. 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(아그로박테리움 투메파시엔스)에서 표적 유전자의 결실 또는 삽입을 위한 유전자 구성물을 함유하는 무장 해제된 Ti 플라스미드를 사용하여 식물 세포를 형질전환할 수 있고, 그 후 형질전환된 식물은 해당 분야, 예를 들어, EP 0116718, EP 0270822, PCT 공개공보 WO 84/02913 및 유럽 특허 출원 공개공보 (“EP”) 0242246에 기재된 절차들을 사용하여 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. Ti-플라스미드 벡터는 각각 Ti-플라스미드의 T-DNA의 경계 서열들 사이, 또는 적어도 오른쪽 경계 서열의 왼쪽에 위치한 유전자를 함유한다. 물론, 직접 유전자 전달 (예를 들어, EP 0233247에 기재), 꽃가루 매개 형질전환 (예: EP 0270356, PCT 공개공보 WO 85/01856, 및 미국 특허 4,684,611에 기재), 식물 RNA 바이러스-매개 형질전환 (예를 들어, EP 0 067 553 및 미국 특허 4,407,956에 기재), 리포솜-매개 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 4,536,475에 기재), 및 특정 옥수수 계통을 형질전환시키는 방법과 같은 다른 방법 (예를 들어, 미국 특허 6,140,553; Fromm et al., Bio/Technology (1990) 8, 833-839); Gordon-Kamm et al., The Plant Cell, (1990) 2, 603-618), 쌀 (Shimamoto et al., Nature, (1989) 338, 274-276; Datta et al., Bio/Technology, (1990) ) 8, 736-740) 및 단자엽 식물을 일반적으로 형질전환시키는 방법 (PCT 공개공보 WO 92/09696)과 같은 절차들을 사용하여 다른 유형의 벡터들을 사용하여 식물 세포를 형질전환 할 수 있다. 면 형질전환의 경우, PCT 특허 공개공보 WO 00/71733에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 대두 형질전환의 경우, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, Hinchee et al. (Bio/Technology, (1988) 6, 915) 및 Christou et al. (Trends Biotech, (1990) 8, 145) 또는 WO 00/42207의 방법을 참고한다.
본 발명의 유전자 변형된 식물은 동일한 특성을 갖는 유전자 변형된 식물을 더 생산하기 위해, 또는 동일하거나 관련된 식물 종의 다른 변종에 유전적 변형(들)을 도입하기 위해 통상적인 식물 육종 계획에 사용될 수 있다. 변형된 식물로부터 얻은 종자는 유전자 변형(들)을 바람직하게는 염색체 DNA의 안정한 삽입물로서 또는 내인성 유전자 또는 프로모터에 대한 변형으로서 함유한다. 본 발명에 따른 유전자 변형(들)을 포함하는 식물은 본 발명의 유전자 변형(들)을 포함하는 식물, 예를 들어, 과실 나무 또는 관상용 식물의 뿌리 줄기를 포함 또는 이로부터 유래된 식물을 포함한다. 따라서, 형질전환된 식물 또는 식물 부분에 삽입된 임의의 비-형질전환 접목된 식물 부분이 본 발명에 포함된다.
도입된 유전자의 발현 또는 내인성 유전자의 변형된 발현을 초래하는 발현 벡터 또는 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 유전자 변형은 전형적으로 식물-발현성(plant-expressible) 프로모터를 이용할 것이다. 본원에 사용된 '식물-발현성 프로모터'는 식물 세포에서 본 발명의 유전적 변형(들)의 발현을 보장하는 프로모터를 의미한다. 식물 세포에서 종종 사용되는 항시성 프로모터들의 예들은 콜리플라워 모자이크 (CaMV) 35S 프로모터 (KAY et al. Science, 236, 4805, 1987), 최소 CaMV 35S 프로모터 (Benfey & Chua, Science, (1990) 250, 959-966), CaMV 35S 프로모터의 다양한 다른 유도체들, 무화과 모자이크 바이러스 (FMV) 프로모터 (Richins, et al., Nucleic Acids Res. (1987) 15:8451-8466), 메이즈 유비퀴틴 프로모터 (CHRISTENSEN & QUAIL, Transgenic Res, 5, 213-8, 1996), 트레포일 프로모터 (Ljubql, MAEKAWA et al. Mol Plant Microbe Interact. 21, 375-82, 2008), 베인 모자이크 카사바 바이러스 프로모터 (국제 특허 출원 제 WO 97/48819), 및 아라비돕시스 UBQ10 프로모터, Norris et al. Plant Mol. Biol. 21, 895-906, 1993)이다.
식물에서 항시 발현을 지시하는 프로모터들의 추가 예들은 해당 분야에 공지되어 있으며 다음을 포함한다: 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV), 예를 들어, 분리주 CM 1841 (Gardner et al., Nucleic Acids Res, (1981) 9, 2871-2887), CabbB S (Franck et al., Cell (1980) 21, 285-294) 및 CabbB JI (Hull and Howell, Virology, (1987) 86, 482-493)의 강한 항시성 35S 프로모터 (“35S 프로모터”); 유비퀴틴 패밀리의 프로모터 (예를 들어, Christensen et al., Plant Mol Biol, (1992) 18, 675-689의 메이즈 유비퀴틴 프로모터), gos2 프로모터 (de Pater et al., The Plant J (1992) 2, 834-844), 에무 프로모터 (Last et al., Theor Appl Genet, (1990) 81, 581-588), 액틴 프로모터, 예를 들어, An 등의 (The Plant J, (1996) 10, 107)이 기재한 프로모터, Zhang et al. (The Plant Cell, (1991) 3, 1155-1165)이 기재한 쌀 액틴 프로모터; 무화과 모자이크 바이러스 (FMV)의 프로모터 (Richins, et al., Nucleic Acids Res. (1987) 15:8451-8466), 카사바 베인 모자이크 바이러스의 프로모터 (WO 97/48819; Verdaguer et al., Plant Mol Biol, (1998) 37, 1055-1067), 서브테레니언 클로버 스턴트 바이러스의 프로모터들의 pPLEX 계열 (WO 96/06932, 특히 S4 또는 S7 프로모터), 알콜 탈수소효소 프로모터, 예를 들어, pAdh1S (GenBank 등록 번호 X04049, X00581), 및 T DNA의 각 1' 및 2' 유전자들의 발현을 유도하는 TR1' 프로모터 및 TR2' 프로모터 (각각 “TR1' 프로모터” 및 “TR2' 프로모터”) (Velten et al., EMBO J, (1984) 3, 2723-2730).
대안적으로, 식물-발현성 프로모터는 조직-특이적 프로모터, 즉, 식물의 일부 세포 또는 조직, 예를 들어, 녹색 조직에서 더 높은 수준의 발현을 지시하는 프로모터 (예를 들어, 엽록소 a/b 결합 단백질 (Cab)의 프로모터)일 수 있다. 식물 Cab 프로모터(Mitra et al., Planta, (2009) 5: 1015-1022)는 녹색 조직(예를 들어, 잎 및 줄기)에서의 발현을 위한 강력한 양방향 프로모터인 것으로 기재되어 있으며, 본 발명의 한 구체예에서 유용하다. 이러한 식물-발현성 프로모터는 원하는 발현 프로파일을 보장하기 위해 인핸서 요소와 조합될 수 있거나, 최소 프로모터 요소와 조합될 수 있거나, 또는 반복 요소를 포함할 수 있다.
조직-특이적 프로모터들의 추가적인 비-제한적 예들에는 메이즈 알로티오네인 프로모터 (DE FRAMOND et al, FEBS 290, 103-106, 1991; 출원 EP 452269),키티나제 프로모터 (SAMAC et al. Plant Physiol 93, 907-914, 1990), 메이즈 ZRP2 프로모터 (미국 특허 제 5,633,363), 토마토 LeExtl 프로모터 (Bucher et al. Plant Physiol. 128, 911-923, 2002), 글루타민 합성효소 대두 뿌리 프로모터 (HIREL et al. Plant Mol. Biol. 20, 207-218, 1992), RCC3 프로모터 (PCT 출원 WO 2009/016104), 쌀 안티퀴틴 프로모터 (PCT 출원 WO 2007/076115), LRR 수용체 키나아제 프로모터 (PCT 출원 WO 02/46439), 및 아라비돕시스 pCO2 프로모터 (HEIDSTRA et al, Genes Dev. 18, 1964-1969, 2004)가 포함된다. 추가적인 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 예들에는 RbcS2B 프로모터, RbcS1B 프로모터, RbcS3B 프로모터, LHB1B1 프로모터, LHB1B2 프로모터, cab1 프로모터, 및 Engler et al., ACS Synthetic Biology, DOI: 10.1021/sb4001504, 2014에 기재되어 있는 그 외 프로모터들이 포함된다. 이들 식물 프로모터는 원하는 발현 프로파일을 보장하기 위해 인핸서 요소와 조합될 수 있거나, 최소 프로모터 요소와 조합될 수 있거나, 또는 반복 요소를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 식물 세포에서 발현을 증가시키기 위한 추가의 유전자 변형이 이용될 수 있다. 도입된 유전자의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 도입된 유전자의 코딩 서열에 있는 인트론, 예를 들어, hsp70 인트론이 그 예이다. 그 외 이러한 유전 요소들은, 프로모터 인핸서 요소들, 이중복제 또는 삼중복제 프로모터 영역, 또 다른 트랜스진과 상이한 또는 내인성 (식물 숙주) 유전자 리더 서열과 상이한 5' 리더 서열들, 동일한 식물에서 사용되는 또 다른 트랜스진과 상이한 또는 내인성 (식물 숙주) 트레일러 서열과 상이한 3' 트레일러 서열들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 도입된 유전자는 삽입되는 유전자 부분이 적합한 3' 말단 전사 조절 신호 (즉, 전사체 형성 및 폴리아데닐화 신호)의 상류 (즉, 5')가 되도록 숙주 세포 DNA에 삽입될 수 있다. 이것은 바람직하게는 식물 세포 게놈 (핵 또는 엽록체)에 유전자를 삽입함으로써 달성된다. 바람직한 폴리아데닐화 및 전사체 형성 신호들은, 형질전환된 식물 세포에서 3' 비번역 DNA 서열들로 작용하는, 노팔린 합성효소 유전자 (Depicker et al., J. Molec Appl Gen, (1982) 1, 561-573), 옥토핀 합성효소 유전자 (Gielen et al., EMBO J, (1984) 3:835-845), SCSV 또는 말산 효소 종결인자 (Schunmann et al., Plant Funct Biol, (2003) 30:453-460), 및 T DNA 유전자 7 (Velten and Schell, Nucleic Acids Res, (1985) 13, 6981-6998)을 포함한다. 일부 구체예에서, 도입된 유전자 중 하나 이상은 핵 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 핵산 서열이 핵 게놈에 통합된 상태로 유지되고 후속 식물 세대 전반에 걸쳐 계속 발현될 때 (즉, 검출가능한 mRNA 전사체 또는 단백질이 생성될 때) 안정적인 통합이 존재한다. 핵 게놈으로의 안정적인 통합은 당업계에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 미세입자 충격, 아그로박테리움 매개 형질전환, CRISPR/Cas9, 원형질체의 전기천공, 미세주입 등)에 의해 달성될 수 있다.
재조합 또는 변형된 핵산이라는 용어는 유전 공학 기술 또는 화학적 합성에 의해 폴리뉴클레오티드의 단리된 세그먼트의 인공 조작에 의해 달성되는 서열의 다른 방식으로 분리된 2개 세그먼트들의 조합에 의해 만들어지는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그렇게 함으로써 원하는 기능의 폴리뉴클레오타이드 세그먼트를 함께 결합하여 기능들의 원하는 조합을 생성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 “과발현”은 유전자 변형의 결과로서 야생형 유가스(예를 들어, 식물)에서의 발현에 비해 증가된 (예를 들어, mRNA, 폴리펩타이드 등의) 발현을 지칭하며 수율 증가와 같은 원하는 결과를 달성하기에 충분한 수준의 이종 유전자들의 발현을 지칭할 수 있다. 일부 구체예들에서, 발현의 증가는 야생형에서의 발현보다 약 10% 더 많은 약간의 증가이다. 일부 구체예에서, 발현의 증가는 야생형에서의 발현에 비해 50% 이상(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 100% 등)의 증가이다. 일부 구체예에서, 내인성 유전자는 상향조절된다. 일부 구체예에서, 외인성 유전자는 발현됨에 의해 상향조절된다. 식물에서 유전자의 상향조절은 유도성 반응 요소가 추가된 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 유도성 반응 요소가 첨가된 고발현 프로모터 (예를 들어, PsaD 프로모터), 인핸서, 전사 및/또는 번역 조절 서열, 코돈 최적화, 변형된 전사 인자, 및/또는 사이토키닌 신호와 같은 자극에 반응하여 상향조절될 유전자의 발현을 조절하는 돌연변이 또는 변형된 유전자의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 방법을 통해 달성될 수 있다.
재조합 핵산이 특정 서열의 발현, 클로닝 또는 복제를 목적으로 하는 경우, 숙주 세포 내로 도입하기 위해 준비된 DNA 구조체들은 일반적으로 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 의도한 DNA 단편을 비롯하여 숙주에 의해 인식되는 복제 시스템 (예를 들어, 벡터)을 포함하며, 그리고 또한 폴리펩티드-인코딩 세그먼트에 작동가능하게 연결되는 전사 및 번역 개시 조절 서열들을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 구조체들은 세포 국재화 신호 (예: 원형질막 국재화 신호)를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 DNA 구조체들은 숙주 세포의 게놈 DNA, 엽록체 DNA 또는 미토콘드리아 DNA 내로 도입된다.
일부 구체예에서, 통합되지 않은 발현 시스템을 사용하여 하나 이상의 도입된 유전자들의 발현을 유도할 수 있다. 발현 시스템 (발현 벡터)은 예를 들어, 복제 기점 또는 자가 복제 서열 (ARS) 및 발현 조절 서열, 프로모터, 인핸서 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예를 들어, 리보솜-결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 전사 종결인자 서열들, 및 mRNA 안정화 서열들을 포함할 수 있다. 동일 또는 관련 종들의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 펩티드 또한 적절한 경우 포함될 수 있는데, 이는 단백질이 세포막, 세포벽에서 교차 및/또는 체류하게 하거나 세포로부터 분비되게 한다.
본원에 개시된 본 발명의 방법론을 실행하는데 유용한 선별 마커는 양성 선별 마커일 수 있다. 전형적으로, 양성 선택은 관심 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에 존재하는 경우에만 유전자 변형된 세포가 독성 물질의 존재 하에 생존할 수 있는 경우를 지칭한다. 음성 선별 마커 및 스크리닝 가능한 마커 또한 당업계에 잘 알려져 있으며 본 발명에 의해 고려된다. 당업자는 이용가능한 임의의 관련 마커가 본원에 개시된 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 알고 있을 것이다
본 발명의 재조합 균주의 스크리닝 및 분자 분석은 핵산 혼성화 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 혼성화 절차는 본원에 개시된 이용가능한 본 발명의 조절 서열들에 충분한 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 본원에 기재된 기술들을 사용하여 변형된 것들을 식별함에 유용하다. 특정 혼성화 기술은 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 혼성화 기술이 개선됨에 따라, 이들은 당업자에 의해 용이하게 적용될 수 있다. 혼성화 프로브는 당업자에게 공지된 임의의 적절한 라벨로 표지될 수 있다. 혼성화 조건 및 세척 조건, 예를 들어 온도 및 염 농도를 변경하여, 검출 임계값의 엄격성을 변경할 수 있다. 혼성화 조건에 대한 추가 지침은 예를 들어, Sambrook et al. (1989) 하기 참조 또는 Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, N.Y.를 참조하라.
또한 중합효소 연쇄 반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 사용하여 유전자 변형 균주의 스크리닝 및 분자 분석, 원하는 단리된 핵산 생성을 수행할 수 있다. PCR은 반복적이고, 효소적이며, 프라이밍된 핵산 서열 합성이다. 이 절차는 널리 공지이며 해당 기술분야의 당업자들이 통상적으로 사용한다 (Mullis, 미국 특허 제 4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159; Saiki et al. (1985) Science 230:1350-1354 참조). PCR은 표적 서열의 반대 가닥에 혼성화하는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 연접된 관심 DNA 단편의 효소적 증폭을 기반으로 한다. 프라이머는 3' 말단이 서로를 향하도록 배향된다. 템플릿의 열 변성, 상보적인 서열에 대한 프라이머의 어닐링, 그리고 DNA 합성효소를 사용한 어닐링된 프라이머의 연장의 주기 반복은 PCR 프라이머의 5' 말단에 의해 정의된 세그먼트를 증폭시킨다. 각 프라이머의 연장 산물이 다른 프라이머의 주형 역할을 할 수 있기 때문에 각 주기는 본질적으로 이전 주기에서 생성된 DNA 주형의 양을 두 배로 늘린다. 그 결과 특정 표적 단편이 몇 시간 안에 수백만 배까지 기하급수적으로 축적된다. 호열성 세균인 테르무스 아쿠아리우무스 (Thermus Aquariumus)에서 단리한 Taq 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 사용하여 증폭 과정을 완전히 자동화할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 효소는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질은 또한 구체적으로 개시된 서열들의 상동체를 포함할 수 있다. 상동성 (예를 들어, 서열 동일성)은 50%-100% 일 수 있다. 일부 예에서, 이러한 상동성은 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과이다. 임의의 의도한 서열(들)의 사용에 필요한 상동성 또는 동일성 정도는 당업자에 의해 용이하게 확인된다. 본원에서 사용되는 2개 핵산들의 서열 동일성 퍼센트는 해당 분야에 공지된 알고리즘, 예를 들어, Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268에 개시되고, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서와 같이 변형된 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:402-410의 BLASTN, BLASTP, 및 BLASTX, 프로그램들에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램, 점수=100, 단어길이=12로 수행하여 원하는 서열 동일성 퍼센트를 갖는 뉴클레오티드 서열을 얻는다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402에 설명된 바와 같이 Gapped BLAST가 사용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때 각 프로그램 (BLASTN 및 BLASTX)의 기본 매개변수가 사용된다. www.ncbi.nih.gov 참조. 당업자는 기본 설정의 적합한 BLAST 프로그램을 사용하여 관심 서열을 참조 서열과 정렬함으로써 관심 서열에서 참조 서열의 아미노산 또는 핵산에 상응하는 위치가 발생하는 곳을 용이하게 결정할 수 있다 (예를 들어, BLASTP의 경우: 갭 오프닝 페널티: 11, 갭 연장 페널티: 1, 기대값: 10, 단어 크기: 3, 최대 점수: 25, 최대 정렬: 15, 및 매트릭스: blosum62; 및 BLASTN의 경우: 갭 오프닝 페널티: 5, 갭 연장 페널티:2, 핵 매치: 1, 핵 미스매치 -3, 기대값: 10, 단어 크기: 11, 최대 점수: 25, 및 최대 정렬: 15).
바람직한 숙주 세포는 식물 세포이다. 본 발명의 내용에서 재조합 숙주 세포는 단리된 핵산 분자를 함유하도록, 숙주 세포에 정상적으로 존재하고 기능하는 하나 이상의 결실된 또는 그 외 비기능적 유전자를 함유하도록, 또는 적어도 하나의 재조합 단백질을 생산하는 하나 이상의 유전자들을 함유하도록 유전자 변형되어 있는 세포들이다. 본 발명의 단백질(들)을 인코딩하는 핵산(들)은 형질전환, 리포펙션, 전기천공 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는, 특정 유형의 세포에 적합한 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 도입될 수 있다.
본 발명을 일반적으로 설명하였으나, 이는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 본원에 포함되고, 그리고 청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아닌 특정한 구체적인 실시예를 참조하면 더 잘 이해될 것이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 보다 상세히 설명되며, 이러한 실시예는 어떠한 방식으로든 청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 첨부된 도면은 본 발명의 명세서 및 설명의 필수적인 부분으로 간주하는 것으로 한다. 하기 실시예는 설명을 위해 제공되며, 청구범위 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 구조체 및 형질전환 N. 타바쿰 식물들의 생성
다음 예는 RuBP 재생에 관여하는 유전자 조작과 전자 전달에 관여하는 유전자 조작의 조합을 테스트하기 위하여 구조체 및 형질전환 N. 타바쿰 (담배) 식물의 생성을 설명한다. 매우 상이한 성장 습성을 가지는 2가지 상이한 담배 품종들이 사용되었다: 니코티아나 타바쿰 재배종 Petit Havana 및 니코티아나 타바쿰 재배종 Samsun.
재료 및 방법
구조체의 생성: 골든 게이트 클로닝 (Golden Gate cloning) (Engler, et al., Plos One (2009) 4; Engler, et al., Plos One (2008) 3:e3647) 또는 게이트웨이 클로닝 기술 (Gateway cloning technology) (Nakagawa, et al., J. Biosci. Bioeng. (2007) 104:34-41)을 사용하여 구조체들을 생성하였다. 트랜스진들은 CaMV35S 및 FMV 항시성 프로모터의 제어하에 발현되었다.
니코티아나 타바쿰 재배종 Petit Havana 형질전환 계통의 경우, 제라니올 합성효소 전이 펩티드 (Simkin, et al., Phytochemistry (2013) 85:36-43)에 연결된 코돈 최적화된 남세균 이작용기 프럭토스-1,6-비스포스파타제/세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제 (FBP/SBPase; slr2094 시네코시스티스 종 PCC 7942 (Miyagawa, et al., Nat. Biotechnol. (2001) 19:965-969)) , 및 아라비돕시스 탈리아나의 엽록소 a/b 결합 단백질 6 전이 펩티드 (AT3G54890)를 가지는 코돈 최적화된 P. 움빌리칼리스 시토크롬 c 6 (AFC39870)을 사용하여, FMV (Richins, et al., Nucleic Acids Res. (1987) 15:8451-8466) 및 CaMV 35S 프로모터 각각에 의해 유도되는 골든 게이트 (Engler, et al., Plos One (2008) 3:e3647) 과발현 구조체 (EC23083 및 EC23028)를 생성하였다 (도 1A).
N. 타바쿰 재배종 Samsun 형질전환 계통의 경우, CaMV 35S 프로모터에 의해 유도되는, 광-수확 복합체 I 엽록소 a/b 결합 단백질 6의 전이 펩티드 (AT3G54890)에 연결된 전장 P. 움빌리칼리스 시토크롬 c 6 유전자를 사용하여, 벡터 pGWB2 (Nakagawa, et al., J. Biosci. Bioeng. (2007) 104:34-41)에서 과발현 구조체 B2-C6를 생성하였다 (도 1B).
담배 형질전환체의 생산: 구조체 당 60개 계통의 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana, 및 12 내지 14개 계통의 N. 타바쿰 재배종 Samsun을 생성하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA4404를 사용하여 잎-디스크 형질전환 (Horsch, et al., Abstr. Pap. Am. Chem. S. (1985) 190:67)을 통해 재조합 플라스미드 EC23083 및 EC23028을 WT N. 타바쿰 재배종 Petit Havana에 도입하고, 하이그로마이신 (20 mg L-1) 및 세포탁심 (400 mg L-1)을 함유하는 MS 배지에서 싹들을 재생시켰다. 뿌리 시스템이 확립된 하이그로마이신 내성 일차 형질전환체 (T0 세대)를 토양으로 옮기고 자가 수정하도록 하였다. 통합된 트랜스진을 발현하는 T0 및 T1 계통들은 반정량적 RT-PCR을 사용하여 스크리닝되었다. 상기 설명한 바와 같이 생산된 일차 형질전환체들로부터 FBP/SBPase (SB 계통: 03, 06, 21, 44) 또는 시토크롬 c 6 (C6 계통: C15, C41, C47, C50)를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana T2/T3 자손들을 선별하였다. SB 및 C6 모두를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물들이 SB 계통 (SB06, SB44, SB21)과 C6 계통 (C15, C47, C50)을 교배하여, 4가지 독립 SBC6 계통: SBC1 (SB06 x C47), SBC2 (SB06 x C50), SBC3 (SB44 x C47) 및 SBC6 (SB21 x C15)를 생성하였다. 이어서 이들 4가지 독립 계통들을 자가 수분하게 하였다.
Lefebvre, et al., Plant Physiol. (2005) 138:451-460에 기재된 SBPase-과발현 N. 타바쿰 재배종 Samsun T4 계통에 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 AGL1을 사용하여 잎-디스크 형질전환을 통해 (Horsch, et al., Abstr. Pap. Am. Chem. S. (1985) 190:67) 재조합 플라스미드 B2-C6를 도입하였다. 카나마이신 (100 mg L-1), 하이그로마이신 (20 mg L-1) 및 어그멘틴 (500 mg L-1)을 함유하는 MS 배지에서 일차 형질전환체 (T0 세대, 39개 식물)들을 생성하였다. 통합된 트랜스진을 발현하는 식물들은 반정량적 RT-PCR을 사용하여 스크리닝되었다. SBPase + 시토크롬 c 6 (SC6 계통: 1, 2 및 3)를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통을 가 수분하도록 하였고, 후속 실험에 사용된 자손은 반정량적 RT-PCR에 의해 트랜스진의 존재 및 발현을 확인하였다.
이 연구에 사용된 대조 식물은 WT 그리고 형질전환 계통 (즉, 접합 계통)의 널 분리체가 결합된 군이었고, 이들을 PCR 및 반정량적 RT-PCR로 트랜스진 유전자의 비통합에 대해 확인하였다. 하기 실시예에 기재된 실험에 사용된 형질전환 계통 및 대조 계통의 전체 목록은 표 1에 제공된다.
표 1: 실험에 사용된 담배 형질전환 계통 및 대조 계통
Figure pct00001
담배 형질전환체의 선별: 반-정량적 RT-PCR (실시예 2에 기재)을 사용하여 계통 SB 및 SBC6에서 FBP/SBPase 전사체의 존재, 계통 C6, SBC6 및 SC6에서 시토크롬 c 6 전사체의 존재, 및 계통 S 및 SC6 에서 SBPase 전사체의 존재를 검출하였다(도 2A-2B). 면역블롯 분석은 선별된 SB 및 SBC6 계통이 FBP/SBPase 단백질을 축적하고 S 및 SC6 계통이 SBPase 단백질을 과발현한다는 것을 보여주기 위해 사용되었다 (도 3A-3B; 실시예 4에 기재된 면역블롯 분석). 면역블롯 분석 외에도, N. 타바쿰 재배종 Petit Havana SB 및 C6 계통 (T2/T4 세대) 및 SBC6 계통 (F3 동형접합 세대; F1은 교배에서 얻은 초기 종자였음)의 잎들에서 추출가능한 총 FBPase 활성을 결정하였다. 이 분석은 SB 및 SBC6 계통이 대조군 보다 더 많은 활성인 34% 내지 47% 범위의 FBPase 활성 수준 증가를 나타냈음을 보여주었다 (도 2B). 다수의 SB 및 SBC6 식물들의 FBPase 효소 활성의 변이를 보여주는 분석들의 전체 세트는 도 4에서 볼 수 있다. 또한, C6 계통에서 시토크롬 c 6 단백질의 발현은 P. 움빌리칼리스 시토크롬 c 6 단백질에 대하여 생성된 항체들을 사용한 면역블롯에 의해 결정되었다. 도 5A에서 보는 바와 같이, P. 움빌리칼리스 미정제 단백질 추출물 (P)에서 그리고 C6 계통 15, 41, 및 47의 조합 단백질 믹스 (C6)에서 독특한 밴드가 나타났다. 야생형 (WT) 또는 접합 (A) 대조에서 어떠한 밴드도 관찰되지 않았다 (도 5A-5B).
600 μmol m-2 s-1의 복사조도에서 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통 SB, C6 및 SBC6의 또는 650 μmol m-2 s-1의 복사조도에서 N. 타바쿰 재배종 Samsun 계통 S 또는 SC6의 엽록소 형광 분석은 어린 식물들에서, 광계 2 (PSII) 광화학의 작동 효율 (F q'/F m')이 WT 또는 널 분리체 대조에 비해 모든 형질전환 계통에서 유의하게 더 높았음을 보여주었다 (도 2C-2D). 그러나, SBC6 및 SC6 계통의 F q'/F m' 값들은 FBP/SBPase (SB), 시토크롬 c 6 (C6), 또는 SBPase (S)를 개별적으로 발현하는 식물들로부터 얻은 F q'/F m' 값들과 유의하게 다르지 않았다.
실시예 2: cDNA 생성 및 반-정량적 RT-PCR
cDNA 생성: cDNA 생성에 사용된 잎은 광합성 측정에 사용된 것과 동일한 잎이었다 (실시예 7 참조). NucleoSpin®RNA 플랜트 키트 (Macherey-Nagel, Fisher Scientific, UK)를 사용하여 담배 잎 디스크 (온실에서 재배한 식물에서 샘플링하고 액체 질소에서 신속하게 동결)에서 Total RNA를 추출했다. RevertAid 역 전사효소 키트 (Fermentas, Life Sciences, UK)의 프로토콜에 따라 올리고-dT 프라이머를 사용하여 20 μl 중 1 μg 총 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA의 4분의 1을 12.5ng μL-1의 최종 농도로 희석하였다.
RT-PCR: 반-정량 RT-PCR의 경우, 제조업체의 권장 사항에 따라 25 μL 총 부피 중 2 μL의 RT 반응 혼합물 (100 ng의 RNA)을 DreamTaq DNA 중합효소 (Thermo Fisher Scientific, UK)와 함께 사용하였다. PCR 생성물들을 1.0% 아가로스 겔에서 분획화하였다. 반-정량 RT-PCR에서 사용된 프라이머들을 하기 표 2에 제시한다.
표 2: 반-정량 RT-PCR에 사용된 프라이머.
Figure pct00002
실시예 3: 식물 성장
형질전환 식물 계통의 생성
야생형 담배 식물과 형질전환 식물의 자가 수정으로 발생한 T1 자손을 토양에서 종자로 재배하였다 (Levington F2, Fisons, Ipswich, UK). 실시예 1에 기재한 바와 같이, N. 타바쿰 재배종 Samsun에서의 실험을 위해, 널 분리체들을 형질전환된 계통으로부터 선별하였다. N. 타바쿰 재배종 Petit Havana의 실험을 위해, 널 분리체들을 SBC6 계통으로부터 선별하였다. 실험 연구에 사용되는 종자를 다음과 같이 발아시켰고, 생성된 식물은 통제된 조건에서 성장시켰다.
통제된 조건
실험 연구를 위해, T2-T4 및 F1-F3 자손 종자들을 130 mmol 광자 m-2 s-1의 복사조도, 22°C의 온도, 60%의 상대 습도, 및 16-h 광주기 (16-h 명: 8-h 암)의 제어된 환경 챔버의 토양에서 발아시켰다. 식물을 개별 8cm 화분으로 옮기고 동일한 조건 (130 mmol 광자 m-2 s-1의 복사조도, 22°C의 온도, 60%의 상대 습도, 및 16-h 광주기)에서 2주 동안 성장시켰다. 이어서 식물들을 4 L 화분으로 옮기고 제어된 환경의 온실 (16-h 광주기; 낮 동안 25°C-30°C 그리고 밤에 20°C의 온도)에서 재배하였다. 구름으로 인해 자연광이 낮은 기간 동안 고압 나트륨 전구로 자연광을 보충하여 화분 수준으로부터 식물의 상단까지 각각 380-1000 mmol 광자 m-2 s-1 (하이라이트)의 최소 복사조도를 제공하였다. 식물들의 위치를 매주 3번 변경하였으며 식물은 영양 배지가 함유된 물을 정기적으로 주었다 (Hoagland, et al., The College of Agriculture (1950) 1). 식물들은, 성숙기에서, 차단에 가까운 캐노피가 도달되고 온도 범위가 주변 외부 환경과 유사하게 유지되도록 배치되었다.
현장
식물들을 Lopez-Calcagno, et al., Plant Biotechnol. J. (2018)에 기재된 바와 같이 재배하였다. 현장 현장은 일리노이 에너지 팜 유니버시티 (the University of Illinois Energy Farm) (40.11°N, 88.21°W, Urbana, IL)에 위치하였다. 2가지 상이한 실험 설계가 상이한 2개 연도에 사용되었다.
도 6A는 2016에 사용된 복제된 대조 설계를 보여준다. 식물들을 30cm 간격으로 줄지어 재배했으며 바깥 경계는 야생형 식물의 경계였다. 전체 실험은 두 줄의 야생형 식물의 경계로 둘러싸여 있었다. 식물은 레인 타워를 사용하여 필요할 때 관개시켰다. T2 종자를 발아시키고 11일 후에 모종을 개별 화분 (350mL)으로 옮겼다. 모종들을 현장으로 옮기기 전에 추가로 15일 동안 온실에서 재배했다. 식물들을 수확 전 14일 동안 현장에서 재배하였다.
도 6B 는 2017년에 사용된 행 설계 내부의 블록들을 보여주며, 이때 2개의 실험들이 2주 간격으로 실시되었다. 이러한 설계에서 하나의 블록에는 5가지 구조체 각각의 독립적인 형질전환 계통이 하나씩 포함되어 있으며 각 행은 모든 계통을 가진다. 각 블록의 중앙 20개 식물은 유전자형당 4가지 식물의 5개 행으로 나뉜다. 2017 실험 1은 대조 (WT 및 널 분리체), FBP/SBPase 발현 계통 (SB) 및 시토크롬 c 6 발현 계통 (C6)을 포함하였다. 2017 실험 2는 대조 (WT 및 널 분리체), 시토크롬 c 6 발현 계통 (C6), 및 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 발현 계통 (SBC6)을 포함하였다. 2017 실험은 또한 별도로 평가되었던 다음 계통들을 포함하였다: 글리신 절단 시스템의 H-단백질을 과발현하는 계통 (G 계통) 및 이들 계통의 널 분리체 (aG 계통) (데이터는 Lopez-Calcagno, et al., Plant Biotechnol. J. (2019) 17(1):141-151에 공개되어 있음), 및 B 및 C 단백질을 발현하고 H-단백질을 과발현하는 계통 (SBCG 계통) 및 이들 계통으로부터 얻은 널 분리체 (a SBCG 계통) (데이터는 공개되지 않음). 종자를 발아시키고 12일 후에 수경 트레이 (Trans-plant Tray GP009 6912 cells; Speedling Inc., Ruskin, FL)로 옮겼다. 모종을 현장으로 옮기기 전에 온실에서 31-33일 동안 재배했다. 식물을 수확 전에 개화할 때까지 (추가로 24-30일) 현장에서 재배하였다.
현장은 Kromdijk, et al., Science (2016) 354:857-861에 기재된 바와 같이 두 해에 준비되었다. 광 강도 (LI-양자 센서; LI-COR) 및 대기 온도 (Model 109 온도 프로브; Campbell Scientific Inc., Logan, UT)를 동일한 현장 현장 근방에서 측정하고 데이터 로거 (CR1000; Campbell Scientific)를 사용하여 15분 평균 (도 6A-6B)을 기록하였다.
실시예 4: 단백질 추출 및 면역블롯 분석
광합성 측정에 사용된 (실시예 7 참조) 잎과 동일한 영역에서 잎 디스크 (직경 0.8 cm)을 채취하여 즉시 액체 N2에 담그고 -80˚에 보관하였다. 잎 디스크는 드라이아이스에서 분쇄되었다. 단백질 추출을 Lopez-Calcagno, et al., J. Exp. Bot. (2017) 68:2285-2298에 기재된 바와 같이, 또는 RNA를 준비하는 동안 Nucleospin RNA/단백질 키트 (Macherey-Nagel; www.mn-net.com)를 사용하여 수행하였다. Macherey-Nagel사의 단백질 정량 키트를 사용하여 단백질 정량을 수행하였다. 샘플을 동일한 단백질 기준으로 로딩하고, 12% (w/v) SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 니트로셀룰로오스 막 (GE Healthcare Life science, Germany)에 옮기고 SBPase 및 FBP/SBPase에 대해 생성된 항체를 사용하여 프로빙하였다. 단백질은 2차 항체와 ECL 화학발광 검출 시약 (Amersham, Buckinghamshire, UK)에 접합된 홀스래디쉬 퍼옥시다제를 사용하여 검출되었다. SBPase 항체들은 이전에 특성화되었다 (Lefebvre, et al., Plant Physiol. (2005) 138:451-460; Dunford, et al., Protein Expr. Purif. (1998) 14:139-145). FBP/SBPase 항체들은 단백질 [C]-DRPRHKELIQEIRNAG-아미드 (서열 번호: 93)의 보존된 영역으로부터의 펩티드에 대해 생성되었으며, 시토크롬 c 6 항체들은 펩티드 [C]-[Nle]-PDKTLKKDVLEANS-아미드 (서열 번호: 94)에 대해 생성되었다 (Cambridge Research Biochemicals, Cleveland, UK). 앞서 언급한 항체 외에도 트랜스케톨라제에 대해 생성된 항체 (Henkes, et al., Plant Cell (2001) 13:535-551; Khozaei, et al., Plant Cell (2015) 27:432-447) 및 로딩 대조군으로 글리신 탈탄산효소 H-단백질을 사용하여 프로빙하였다. 글리신 탈탄산효소 H-단백질 항체들은 Timm, et al., Febs Lett. (2012) 586:3692-3697에 이미 특성화되어 있다.
시토크롬 c 6 에 대한 단백질 추출
8주령 식물로부터 잎 전체를 수확하고 찬물로 세척한 다음 80% 에탄올에 적신 천으로 닦아 대부분의 잎 잔류물을 제거하였다. 그런 다음 잎을 찬물에 두 번 더 세척하고 주맥을 제거하고 남은 조직 50g을 밀봉된 비닐 봉지에 넣고 4˚의 암소에서 밤새 보관했다. 단백질들을 약간 수정된 Hiyama, Methods Mol. Biol. (2004) 274:11-17에서와 같은 방법으로 추출하였다. 잎 조직을 냉각된 엽록체 준비 완충액 (50mM 인산나트륨 완충액, pH 7, 10mM NaCl) 250ml에서 30초 동안 균질화하였다. 그런 다음 용액을 모슬린 천의 4개 층을 통해 여과시키고 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 생성된 펠릿을 냉각된 엽록소 제조 완충액 50ml에 부드럽게 재현탁하고 엽록소 농도를 측정하고 대략 2 mg ml-1로 조정하였다. 생성된 혼합물을 2 부피의 예열된 (45˚가용화 배지(50mM Tris-HCl, pH 8.8 및 3% triton X-100)에 첨가하고 45˚에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 추가로 30분 동안 얼음조에서 냉각시킨 후, 30분 동안 12000g에서 원심분리하였다. 상청액을 다음 단계에서 사용하기 위해 -80˚에서 보관하였다. 시토크롬 c 6 단백질을 정제하기 위하여, 1ml min-1의 유속에서 Biorad Econo-Pac High-Q 5ml형 세척 컬럼을 사용하였다. 먼저, 컬럼을 출발 완충액 (10mM Tris-HCl pH 8.8, 0.2% triton X-100, 20% 수크로스) 100ml로 세척하여 준비하였다. 그 다음, 이전 단계의 단백질 혼합물을 동일한 부피의 냉각된 출발 완충액으로 희석하고 1 ml min-1의 유속으로 컬럼을 통과시켰다. 모든 단백질이 컬럼에 로딩되면, 10mM NaCl이 보충된 1000ml의 출발 완충액으로 이를 세척하였다. 그런 다음, 컬럼을 50ml NaCl이 보충된 300ml의 출발 완충액으로 세척하고, 마지막으로 컬럼을 50 mM 내지 200 mM 농도의 NaCl이 보충된 출발 완충액의 선형 구배를 이용하여 1 ml min-1의 유속으로 4시간의 기간에 걸쳐 용리시켯으며, 분취량들을 여러번 수집하였다. 샘플들을 300ml 로딩 완충액 (50% 글리세롤, 25% β머캅토에탄올, 25% EDTA)과 혼합하고 동일한 단백질 기준으로 로딩하고, 18% (w/v) SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 니트로셀룰로스 막에 옮기고, 시토크롬 c 6에 대해 생성된 항체들을 사용하여 프로빙하였다.
실시예 5: 인산염 방출에 의한 FBPase 활성 측정
FBPase 활성은 이전에 SBPase에 대해 설명된 인산염 방출 (Simkin, et al., J. Exp. Bot. (2015) 66:4075-4090)에 의해 결정되었으며 이 방법은 약간 수정되었다. 광합성 측정에 사용된 것과 동일한 잎에서 잎 디스크를 얻었고 (실시예 7 참조), 광합성 측정이 완료된 후 디스크들을 분리하여 액체 질소에서 동결시켰다. 잎 디스크들을 액체 질소에서 미세 분말로 분쇄하고 추출 완충액 (50 mM HEPES, pH8.2; 5 mM MgCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 10% 글리세롤; 0.1% Triton X-100; 2 mM 벤즈아미딘; 2 mM 아미노카프로닉 애시드; 0.5 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드; 10 mM 디티오트레이톨)에 침지시키고, 14,000 x g, 4°C에서 1분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액 (1 ml)을 NAP-10 컬럼 (Amersham)을 통해 탈염시키고 액체 질소에 저장하였다. Simkin, et al., J. Exp. Bot. (2015) 66:4075-4090에 기재된 바와 같이 분석을 실시하였다. 간단히 요약하면, 20 ml의 추출물을 80 ml의 분석 완충액 (50 mM Tris, pH 8.2; 15 mM MgCl2; 1.5 mM EDTA; 10 mM DTT; 7.5 mM 프럭토스-1,6-비스포스페이트)에 첨가하고 25°C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 50 μl의 1 M 과염소산을 추가하여 반응을 중단시켰다. 300 μl의 Biomol Green (Affiniti Research Products, Exeter, UK)를 첨가한 후 30 μl의 샘플 또는 표준 (0.125 nmol 내지 4 nmol의 PO3- 4 농도)을 실온에서 인큐베이션하고 620 nm에서의 흡광도 (A620)를 마이크로플레이트 판독기 (VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 측정하였다. FBPase 활성을 트랜스케톨라제 활성에 대해 정규화하였다 (Zhao, et al., Biomed. Res. Int. (2014) 2014:572915).
실시예 6: 모종에서 엽록소 형광 이미징 스크리닝
130 μmol mol-2 s-1의 제어된 환경 챔버 및 주위 CO2 농도 (400 mmol mol-1)에서 재배한 2-3주령 담배 모종들에서 엽록소 형광 이미징을 실시하였다. 엽록소 형광 (CF) 이미징 시스템 (Technologica, Colchester, UK (Barbagallo, et al., Plant Physiol. (2003)132:485-493; von Caemmerer, et al., J. Exp. Bot. (2004) 55:1157-1166))을 사용하여 엽록소 형광 매개변수들을 얻었다. 광계 2 (PSII) 광화학의 작동 효율, F q'/F m'은 6300 mmol m-2 s-1 PPFD의 포화 800 ms 펄스 후 빛에서의 정상 상태 형광 (F') 및 최대 형광 (F m') 측정값으로부터 다음 방정식 F q'/F m' = (F m'-F')/F m'을 사용하여 계산되었다. F q'/F m '의 이미지들은 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana의 경우 600 μmol m-2 s-1의 안정한 PPFD 하에서 그리고 N. 타바쿰 재배종 Samsun의 경우 650 μmol m-2 s-1의 안정한 PPFD 하에서 촬영되었다 (Baker, et al., Journal of Experimental Botany (2001) 52:615-621; Oxborough, et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. (2000) 355:1489-1498; Lawson, et al., J. Exp. Bot. (2008) 59:3609-3619).
실시예 7: 잎 가스 교환
광합성 가스 교환 및 엽록소 형광 매개변수는 6400-40 형광계 헤드 유닛이 있는 휴대용 적외선 가스 분석기 (LI-COR 6400; LI-COR, Lincoln, NE, USA)를 사용하여 기록되었다. 달리 명시되지 않는 한 모든 측정은 LI-COR 6400 큐벳으로 수행되었다. 온실에서 자란 식물의 경우, 조건은 400 μmol mol-1의 CO2 농도, 25oC의 잎 온도, 및 1 ± 0.2 kPa의 증기압 차이 (VPD)에서 유지되었다. 현장 조건하에서 재배된 식물의 챔버 조건은 400 μmol mol-1의 CO2 농도였으며, 블록 온도는 주위 온도보다 2oC 높게 설정되었고 (주위 대기 온도는 각 가스 교환 반응 곡선을 생성하기 전 측정되었다) VPD는 가능한 한 1 kPa에 가깝도록 유지되었다.
A/C i 반응 곡선 (광합성 능력)
세포내 CO2 농도 (C i)에 대한 순 광합성 (A)의 반응을 2000 μmol mol-2 s-1.의 포화 광 강도에서 측정하였다. 조명은 잎 큐벳에 부착된 적색-청색 광원에 의해 제공되었다. A의 측정은 400 μmol mol-1의 주위 CO2 농도 (Ca)에서 시작되었으며 그 후 Ca는 50 μmol mol-1의 최저 농도까지 단계별로 감소된 다음 2000 μmol mol-1의 상단 농도까지 단계별로 증가되었다. 최대 포화 CO2 동화 속도 (A max), 최대 카르복실화 속도 (Vc max) 및 최대 전자 전달 유동 (J max)의 매개변수를 계산하기 위하여, C3 광합성 모델 (Farquhar, et al., Planta (1980) 149:78-90)을 Sharkey, et al., Plant Cell Environ. (2007) 30:1035-1040에서 제공한 스프레드시트를 사용하여 A/C i 데이터에 핏팅시켰다. 추가로, PSII 작동 효율 (F q'/F m') 및 PSII 효율 인자 F q'/F v'와 수학적으로 동일한 광화학 소광 계수 (q P)를 포함하는 엽록소 형광 매개변수들을 각 지점에서 기록하였다.
A/Q 반응 곡선
빛의 함수로서의 광합성 (A/Q 반응 곡선)은 상기 언급된 A/C i곡선들과 동일한 큐벳 조건하에서 측정되었다. 2200 μmol m-2 s-1의 포화 복사조도에서 잎들을 초기에 안정화시키고, 그 후 A 및 g s를 다음과 같은 광 수준에서 측정하였다: 2000 μmol m-2 s-1, 1650 μmol m-2 s-1, 1300 μmol m-2 s-1, 1000 μmol m-2 s1, 750 μmol m-2 s-1, 500 μmol m-2 s-1, 400 μmol m-2 s-1, 300 μmol m-2 s-1, 200 μmol m-2 s-1, 150 μmol m-2 s-1, 100 μmol m-2 s-1, 50 μmol m-2 s-1 및 0 μmol m-2 s-1. 측정은 A가 새로운 정상 상태에 도달한 후 (1분에서 3분) gs가 새로운 광 수준으로 변경되기 전에 기록되었다. A 및 g s의 값들을 사용하여 고유 물 이용 효율 (iWUE =A/gs)을 추정하였다.
실시예 8: 통계적 분석
모든 통계 분석은 Sys-stat, University of Essex, UK 및 R을 사용하여 수행되었다 (웹사이트 www.r-project.org 참조). 수확 데이터, 모종 엽록소 이미징 및 효소 활성에 대해 분산 분석(ANOVA) 및 사후 Tukey 테스트를 수행했다. 가스 교환 곡선의 경우 lmer 함수 및 유형 III ANOVA를 사용한 선형 혼합 모델 분석으로 데이터를 비교했다 (Vialet-Chabrand, et al., Plant Physiol. (2017) 173:2163-2179). 대비 분석 (lsmeans 패키지)을 사용하여 조작들 간의 유의한 차이가 식별되었다.
실시예 9: 전자 전달 및 RuBP 재생의 자극은 온실 조건에서 두 가지 다른 담배 품종의 광합성 성능을 증가시킨다
상기 기재된 초기 스크린들에 기반하여 선별된 형질전환 계통들을 온실에서 성장시켰으며, 400 μmol m-2 s-1 내지 1000 μmol m-2 s-1의 조명을 제공하도록 자연광이 보충되었다. 순 CO2 동화 속도 (A) 및 F q'/F m'은 N. 타바쿰 재배종 Samsun (S 및 SC6)의 성숙 및 발달 중인 잎들에서 그리고 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana (SB, C6 및 SBC6)의 성숙한 잎들에서 내부 CO2 농도 (C i)의 함수로서 결정되었다 (도 7A-7B). 형질전환 계통은 대조 식물들 (CN) 보다 더 큰 CO2 동화 속도를 보여주었다. A는 SC6,의 성숙한 잎들에서, 대략 300 μmol mol-1 의 C i에서 대조군 보다 15% 더 높았다 (반면에 현재 주위 CO2 농도는 약 400 μmol mol-1이지만 측정된 Ci 농도는 기공 제한을 포함한 여러 요인으로 인해 주변보다 낮다) (도 7B). 발달 중인 SC6 식물의 잎들은 또한 PSII 작동 효율 (F q'/F m')에서, 그리고 광합성 장치가 QA를 산화된 상태로 유지시키는 능력에 의해 결정되는 PSII 효율 인자 (F q'/F v')에서 유의한 증가를 보여주었으므로, 대조 식물과 비교할 때 광화학적 소광의 척도이다 (도 7B). 흥미롭게도, N. 타바쿰 재배종 Samsun 형질전환 식물의 성숙한 잎에서, 형질전환 및 대조 식물들 간의 동화 속도 그리고 PSII의 작동 효율 광화학에 있어서의 차이는 발달 중인 잎들에서 보다 더 작았다. 모든 측정된 CO2 농도에서 S 형질전환 식물의 성숙한 잎만이 대조 식물에 비해 F q'/F m' and F q'/F v'에 대해 더 높은 평균 값을 나타냈다 (도 7B). 대조적으로, SC6 식물들의 성숙한 잎들은 300 μmol m-1 내지 900 μmol m-1의 Ci 수준에서만 대조 보다 더 높은 F q'/F v' 값을 나타내었다 (도 7B).
N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 형질전환 식물들에서 유사한 경향이 나타났는데 이들은 대조에 비해 더 높은 A, F q'/F m', 및 F q'/F v'의 평균 값을 나타내었다 (도 7A). SBC6 식물들 (N. 타바쿰 재배종 Petit Havana)의 성숙한 잎들에서 이러한 유의한 증가는 SC6 계통 (N. 타바쿰 재배종 Samsun)의 발달 중인 잎들에서 나타난 경향과 유사하였다 (도 7A-7B).
S 및 SC6 식물들 (N. 타바쿰 재배종 Samsun) 모두의 발달 중인 잎들은 대조 식물들에 비해 J max 및 A max에 있어서 유의한 증가를 보여주었다 (표 3). SC6 형질전환 식물들의 성숙한 잎들은 또한 대조 식물에 비해 유의하게 더 높은 Vc max, J max, 및 A max 값들을 보여주었다. 대조적으로, SBC6 식물들 (N. 타바쿰 재배종 Petit Havana)의 잎들만이 A max의 유의한 증가를 가졌으나, Vc max, 및 J max 에 대한 평균 값들은 명확히 더 높았다. 이러한 결과는 FBP/SBPase 또는 SBPase와 조합된 시토크롬 c 6 의 발현에 의한 전자 전달 및 RuBP 재생의 동시 자극이 분석된 모든 식물에서 단일 조작보다 광합성에 더 큰 영향을 미친다는 것을 보여주었다.
표 3. 야생형 및 형질전환 계통의 최대 전자 전달 및 RuBP 재생 속도 (J max), 루비스코의 최대 카르복실화 속도 (Vc max) 및 최대 동화 (A max)1.
Figure pct00003
1 결과는 von Caemmerer, et al., Planta (1981) 153:376-387에 공개된 방정식들을 사용하여 도 7A-7B의 A/Ci 곡선들로부터 결정되었다. 통계적 차이는 볼드체로 나타내며 (*p<0.05), 조작 별로 n = 6-11개 식물이다. 평균 및 SE를 나타낸다.
실시예 10: 전자 전달 및 RuBP 재생의 자극은 온실 조건에서 두 가지 다른 담배 품종의 성장을 자극한다
병행 실험들에서, FBP/SBPase (SB), 시토크롬 c 6 (C6), 또는 FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6)를 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 식물들은 수확 전 4주 동안 통제된 조건하에서 재배되었으며, 그리고 SBPase (S), 또는 SBPase + 시토크롬 c 6 (SC6)을 발현하는 N. 타바쿰 재배종 Samsun 식물들은 수확 전 6주 동안 통제된 조건에서 재배되었다. 높이, 잎 수, 총 잎 면적 및 지상 바이오매스가 결정되었다 (도 8 및 9). All of분석된 형질전환 식물들 모두 대조 식물들에 비해 더 큰 높이를 나타내었다. 시토크롬 c 6를 발현하는 식물들 (C6 및 SBC6 = N. 타바쿰 재배종 Petit Havana; 및 SC6 = N. 타바쿰 재배종 Samsun)은 이들 각각의 대조들에 비해 잎 면적 그리고 줄기와 잎 바이오매스가 유의하게 증가하였다. SB 형질전환 식물들 (N. 타바쿰 재배종 Petit Havana)에서만 줄기의 바이오매스가 대조 식물들 보다 컸다. 특히, SBC6 및 SC6 형질전환 식물들은 각각 단일 SB 및 S 형질전환 식물들 보다 유의하게 더 큰 잎 면적을 나타내었다. 대조군과 비교할 때 지상 바이오매스의 총 증가는 SB의 경우 35%, C6의 경우 44%, 그리고 S의 경우 9%였다. 이중-조작 형질전환 계통 (SBC6 및 SC6)은 대조군에 비해 지속적으로 더 높은 지상 매스 평균을 보여주었는데; SBC6의 경우 52% 그리고 SC6의 경우 32%였다 (도 8 및 9).
실시예 11: FBP/SBPase 및 시토크롬 c 6 의 동시 발현은 현장 조건에서 물 이용 효율을 증가시킨다
제어된 온실 조건에서 형질전환 식물에서 관찰된 바이오매스의 증가가 현장 환경에서 재현될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 현장에서 테스트할 계통의 하위집합을 선택했다. 보다 큰 바이오매스 퍼센트 증가가 형질전환 N. 타바쿰 재배종 Petit Havana 계통에서 나타났기 때문에, 이들 식물들을 선택하여 서로 다른 두 연도 동안 (하나는 2016년, 그리고 다른 하나는 2017년) 3번의 현장 실험에서 테스트하였다.
2016년에, FBP/SBPase (SB) 및 시토크롬 c 6 (C6)에 대한 단일 유전자 구조체들을 발현하는 계통의 소규모 복제 대조 실험을 수행하여 현장에서의 영양 성장을 평가했다. 식물들을 26일 동안 제어된 환경 조건하에서 발아 및 재배한 후, 현장으로 옮겼다. 현장에서 14일 후, 식물들을 초기 영양생장 단계에서 수확하고 식물 높이, 전체 잎 면적 및 지상 바이오매스를 측정하였다 (도 10A). 이 데이터는 대조군에 비해 SB 식물이 각각 27%, 35% 및 25%의 높이, 잎 면적 및 지상 바이오매스 증가를 나타냄을 보여주었다 (도 10A). C6 식물은 또한 대조군에 비해 각각 50%, 41% 및 36%의 높이, 잎 면적 및 지상 바이오매스 증가를 보였다 (도 10A). 2017년에는 SB, C6, 및 SBC6 식물의 성능을 대조군 식물과 비교하여 평가하기 위해 2개의 대규모 무작위 블록 설계 현장 실험이 수행되었다. 식물들을 온실에서 31-13일 동안 종자로부터 재배한 다음, 현장으로 옮겨 개화가 시작될 때까지 (추가로 24-30일) 재배한 후 수확하였다. 도 10B-10C에서, 개화 후 수확한 SB 및 C6 식물은 높이, 잎 면적 또는 바이오매스의 유의한 증가를 나타내지 않았음을 알 수 있다. 흥미롭게도, FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6)를 발현하는 식물들은 대조에 비해 여러 성장 매개변수의 유의한 증가를 나타내었으며, 높이, 잎 면적, 및 지상 바이오매스가 각각 13%, 17% 및 27%였다 (도 10C).
또한, 2017년 현장 실험에서, 포화 광에서 C i 의 함수로서 A (A/C i)가 결정되었다. 2017 실험 1에서, SB 및 C6 식물들에서 A의 유의한 증가가 관찰되었으며 PSII 작동 효율 (F q '/F m ')의 차이는 없었다 (도 11A). 그러나, 2017 실험 2에서, C6 및 SBC6 식물들에서 대조 식물들에 비해 명백히 A 또는 F q '/F m ' 값의 차이가 없었다 (도 11B). A를 빛의 함수로서 분석한 결과 (PPFD)는 유전자형들 간에 A의 작은 또는 유의하지 않은 차이를 보여주었다 (도 12A 및 도 13A). 흥미롭게도, SBC6 식물들에서 기공 전도도 (g s )는 1000 mmol m-2 s-1 이상의 광 강도에서 C6 또는 대조 식물에서보다 유의하게 더 낮았다 (도 12B). 그 결과 SBC6 식물의 고유 물 이용 효율 (iWUE)이 유의하게 증가했다 (도 12D). SB 또는 C6 형질전환 식물들에서 iWUE의 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 12D 및 도 13D).
상기 실시예들은 두 가지 다른 담배 품종에서 전자 전달이 동시에 증가하고 RuBP 재생 능력이 개선된 형질전환 식물의 생성 및 분석을 설명한다. 이러한 예는 전자 전달의 (시토크롬 c 6의 발현에 의한) 독립적인 자극과 (FBP/SBPase의 발현 또는 SBPase의 과발현에 의한) RuBP 재생의 자극이 통제된 조건에서 성장한 식물에서 광합성과 바이오매스를 증가시켰음을 보여준다. 또한, 이들 실시예는 (SBC6 및 SC6 식물에서) 이 두 가지 과정을 동시에 표적하는 것이 광합성과 성장을 자극하는 데 훨씬 더 큰 효과가 있음을 보여주었다. 또한 현장 연구에서 전자 전달과 RuBP 재생을 동시에 자극한 식물은 iWUE와 바이오매스가 증가했다.
온실 조건에서 분석된 모든 형질전환 식물에서 광합성 매개변수의 증가가 관찰되었으며, 이는 바이오매스 증가와 일관되게 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 본원에 제시된 실시예들은 전자 전달 및 RuBP 재생의 동시 자극에 의해 증가된 광합성 및 바이오매스의 최초 보고를 제공한다. 본원에서 테스트된 두 담배 품종 (N. 타바쿰 재배종 Petit Havana and N. 타바쿰 재배종 Samsun)의 분석된 모든 형질전환 담배 식물의 잎에서 온실 조건 하에 A의 증가가 관찰되었다. A/C i 반응 곡선의 분석은 광합성 매개변수 Vc max, J max, 및 A max에 대한 평균 값이 각각 최대 17%, 14% 및 12% 만큼 증가하였음을 보여주었다. 이러한 결과는 전자 전달 및 RuBP 재생의 최대 속도가 증가했을 뿐만 아니라 루비스코에 의한 카르복실화 속도도 증가했음을 나타내었다. 루비스코 활성을 직접적으로 표적한 것은 아니지만, 이러한 결과는 J max와 V cmax .간의 선형 상관관계를 보여주었던 100종 이상의 식물에 관한 Wullschleger, et al., J. Exp. Bot. (1993) 44:907-920의 연구와 일치한다. 또한, SBPase의 과발현은 J max의 상당한 증가 뿐만 아니라 Vc max와 루비스코 활성화 상태의 증가를 초래함이 이전에 관찰된 바 있다.
특히 온실 연구에서 전자 전달과 RuBP 재생이 모두 증가한 식물들 (SBC6 및 SC6)의 잎에서 가장 높은 광합성 속도를 얻었으며, 이는 이들 유전자의 동시 발현은 광합성 개선에 있어서 부가적인 효과를 가져옴을 보여주는 것이다. A의 증가 이외에도, 전자 전달과 RuBP 재생을 동시에 자극하는 식물은 F q '/F m ' 에서 유의한 증가를 보였으며, 이는 대조 식물에 비해 PSII를 통한 선형 전자 플럭스의 더 높은 양자 수율을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 PSI의 환원이 PSI에 대한 대안적이고 보다 효율적인 전자 공여체를 사용함으로써 자극된다는 것을 보여주며 (Chida, et al., Plant Cell Physiol. (2007) 48:948-957; Finazzi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (2005) 102:7031-7036), 이는 아라비돕시스에서 Rieske FeS 단백질의 과발현 및 시토크롬 c 6의 도입이 (Simkin, et al., Plant Physiol. (2017) 175:134-145; Chida, et al., Plant Cell Physiol. (2007) 48:948-957) PSII의 양자 수율을 증가시키고 더 산화된 플라스토퀴논 풀을 유발함을 보여주는 공개된 데이터와 일치한다. 또한, SBC6 및 SC6 식물들에서, Fq'/Fm'의 증가는 주로 PSII 효율 인자 (Fq'/Fv')의 증가에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. 이는 이들 식물들의 효율 증가가 CO2 동화와 같은 PSII의 하류 과정의 자극으로 인한 것일 수 있음을 시사한다.
작물 수확량을 향상시키기 위해 전자 전달과 RuBP 재생을 모두 목표로 하는 것의 적용 가능성에 대한 추가 증거를 제공하기 위해 현장에서 식물을 테스트했다. 현장 결과는 초기 영양생장 성장 중에 (개화 시작 전) 수확하였을 때 FBP/SBPase 단독 발현이 2016년 현장 재배 식물들의 성장 및 바이오매스를 22% 내지 40% 증가시켰음을 보여주었다. 흥미롭게도, 2017년 현장 시험에서 동일한 형질전환 조작된 식물들을 개화 시작 후 차후에 발달 중에 수확하였을 때, 이러한 이점은 더 이상 명백하지 않았으며 단일 FBP/SBPase 발현 계통을 대조 식물들과 구별할 수 없었다.
시토크롬 c 6만 발현하는 형질전환 식물들 또한 발달 초기에 수확했을 때 성장과 바이오매스가 향상되었지만 FBP/SBPase 식물과 마찬가지로 개화 후 식물을 수확했을 때 이러한 개선은 더 이상 명백하지 않았다. 초기와 후기 수확 간의 바이오매스 증가에 있어서 이러한 표현형의 차이는 H-단백질의 과발현이 초기 발달 및 개화 개시 후에 수확된 식물들에서 현장 조건하에 바이오매스를 증가시키는 것으로 나타났던 병행 실험에서는 관찰되지 않았다 (Lopez-Calcagno, et al., Plant Biotechnol. J. (2019) 17(1):141-151)). 이러한 결과는 FBP/SBPase 또는 시토크롬 c 6 단독의 발현이 특정 설정의 조건들 하에서 또는 식물 발달의 특정 단계에서 이점을 제공할 수 있음을 시사한다. 이것은 초기 수확이 바람직한 일부 작물 (예를 들어, 일부 유형의 상추, 시금치 및 연한 채소)에 유용할 수 있다 (Ichikawa, et al., GM Crops (2010) 1:322-326). 상기 설명한 단일 조작의 결과와 대조적으로, 시토크롬 c 6 와 FBP/SBPase를 동시에 발현하는 식물은 현장 조건에서 개화 후 바이오매스의 일관된 증가를 나타냈다.
현장에서 재배된 형질전환 계통에서 광합성 및 바이오매스에서의 증가 사이의 상관관계는 온실 조건에서 관찰된 것보다 일관성이 더 작았다. 2017 실험 1에서 개별적으로 조작된 형질전환 계통들, 즉, FBP/SBPase (SB 계통) 및 시토크롬 c 6 (C6 계통)는 광합성 능력이 유의하게 증가하였으나 바이오매스 증가는 없었다. 대조적으로, 2017 실험 2에서 C6 계통은 바이오매스가 증가하였으나, 광합성 능력에 있어서는 유의한 차이가 없었다. 2017 실험 2에서 이중 유전자 조작된 형질전환 계통들, 즉, FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6) 또한 바이오매스가 증가하였으나, 광합성 능력에 있어서는 유의한 차이가 없었다. 모든 실험 전반에 걸쳐, 형질전환 식물들의 평균 A 값은 대조 식물들 보다 일관되게 더 높았다. 이러한 차이가 모든 실험들 전반에 걸쳐 일관되게 통계적으로 다르지 않다 하더라도, 식물의 일생에 걸쳐 동화에 있어서 작은 증가 조차도 누적 효과를 가질 것이며, 이는 유의한 바이오매스 누적으로 해석될 수 있음은 공지되어 있다 (Simkin, et al., J. Exp. Bot. (2015) 66:4075-4090).
1000 mmol m-2 s-1 이상의 광 강도에서, FBP/SBPase + 시토크롬 c 6 (SBC6)이 동시 발현된 식물들은 대조 식물들에 비해 보다 낮은 기공 전도도 (gs) 및 보다 낮은 C i 농도를 가졌음이 관찰되었다 (도 12C). 일반적으로 낮은 C i는 광합성의 감소를 가져올 것으로 예상되지만 흥미롭게도 이들 식물은 대조 식물과 같거나 더 높은 CO2 동화 속도를 유지하여, 결과적으로 iWUE를 개선시킬 수 있었다. iWUE의 유사한 개선이 NPQ 관련 단백질 PsbS를 과발현하는 식물에서 관찰되었다 (Glowacka, et al., Nat. Commun. (2018) 9). 빛에 의해 유발된 기공 개방은 이들 식물에서 감소된 것으로 나타났으며, 이들 식물은 기공 운동에서 신호로 작용하는 것으로 제안된 바 있는 보다 산화된 QA 풀을 가졌다 (Busch, Photosynth. Res. (2014) 119:131-140).
이들 실시예의 결과는 SBC6 식물의 광합성 능력 증가가 C i 감소를 보상한다는 제안을 뒷받침한다. RuBP 재생이 증가된 형질전환 계통들의 경우 CO2가 풍부한 현장 연구에서 대조군에 비해 더 높은 생산성이 보고되었다(Rosenthal, et al., BMC Plant Biol. (2011) 11:123; Ichikawa, et al., GM Crops (2010) 1:322-326)는 사실 및 보다 높은 iWUE는 기후 변화 시나리오에서 광합성과 수확량을 유지할 수 있는 새로운 식물 품종을 개발하기 위해 전자 전달 및 RuBP 재생을 조작할 수 있는 가능성을 강조한다.
이들 실시예의 결과는 테스트된 조건에서 전자 전달 및 RuBP 재생을 동시 자극하는 조작을 결합하는 것이 단일 조작에 비해 바이오매스를 유의하게 증가시키고 고수율 작물을 개발하기 위한 이러한 전략의 가능성을 강조함을 명확하게 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Essex Enterprises Limited <120> METHODS OF ENHANCING BIOMASS IN A PLANT THROUGH STIMULATION OF RUBP REGENERATION AND ELECTRON TRANSPORT <130> 79454-20006.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/821,786 <151> 2019-03-21 <160> 102 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Glu Thr Ser Ile Ala Cys Tyr Ser Arg Gly Ile Leu Pro Pro Ser 1 5 10 15 Val Ser Ser Gln Arg Ser Ser Thr Leu Val Ser Pro Pro Ser Tyr Ser 20 25 30 Thr Ser Ser Ser Phe Lys Arg Leu Lys Ser Ser Ser Ile Phe Gly Asp 35 40 45 Ser Leu Arg Leu Ala Pro Lys Ser Gln Leu Lys Ala Thr Lys Ala Lys 50 55 60 Ser Asn Gly Ala Ser Thr Val Thr Lys Cys Glu Ile Gly Gln Ser Leu 65 70 75 80 Glu Glu Phe Leu Ala Gln Ala Thr Pro Asp Lys Gly Leu Arg Thr Leu 85 90 95 Leu Met Cys Met Gly Glu Ala Leu Arg Thr Ile Ala Phe Lys Val Arg 100 105 110 Thr Ala Ser Cys Gly Gly Thr Ala Cys Val Asn Ser Phe Gly Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Ala Val Asp Met Leu Ala Asp Lys Leu Leu Phe Glu Ala Leu 130 135 140 Gln Tyr Ser His Val Cys Lys Tyr Ala Cys Ser Glu Glu Val Pro Glu 145 150 155 160 Leu Gln Asp Met Gly Gly Pro Val Glu Gly Gly Phe Ser Val Ala Phe 165 170 175 Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ser Ile Val Asp Thr Asn Phe Thr Val Gly 180 185 190 Thr Ile Phe Gly Val Trp Pro Gly Asp Lys Leu Thr Gly Ile Thr Gly 195 200 205 Gly Asp Gln Val Ala Ala Ala Met Gly Ile Tyr Gly Pro Arg Thr Thr 210 215 220 Tyr Val Leu Ala Val Lys Gly Phe Pro Gly Thr His Glu Phe Leu Leu 225 230 235 240 Leu Asp Glu Gly Lys Trp Gln His Val Lys Glu Thr Thr Glu Ile Ala 245 250 255 Glu Gly Lys Met Phe Ser Pro Gly Asn Leu Arg Ala Thr Phe Asp Asn 260 265 270 Ser Glu Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Tyr Tyr Val Lys Glu Lys Tyr Thr 275 280 285 Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Met Val Pro Asp Val Asn Gln Ile Ile Val 290 295 300 Lys Glu Lys Gly Ile Phe Thr Asn Val Thr Ser Pro Thr Ala Lys Ala 305 310 315 320 Lys Leu Arg Leu Leu Phe Glu Val Ala Pro Leu Gly Leu Leu Ile Glu 325 330 335 Asn Ala Gly Gly Phe Ser Ser Asp Gly His Lys Ser Val Leu Asp Lys 340 345 350 Thr Ile Ile Asn Leu Asp Asp Arg Thr Gln Val Ala Tyr Gly Ser Lys 355 360 365 Asn Glu Ile Ile Arg Phe Glu Glu Thr Leu Tyr Gly Thr Ser Arg Leu 370 375 380 Lys Asn Val Pro Ile Gly Val Thr Ala 385 390 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 2 Met Glu Thr Ser Val Thr Cys Tyr Ser Arg Gly Ile Ile Leu Pro Ser 1 5 10 15 Val Ser Ser Gln Arg Ser Ser Thr Leu Val Ser Pro Pro Tyr Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Ser Ser Ser Phe Lys Gln Arg Leu Lys Ser Ser Ser Ile Phe 35 40 45 Gly Glu Ser Leu Arg Val Ala Pro Arg Ser Gln Leu Lys Ala Thr Lys 50 55 60 Ala Lys Asn Asn Gly Gly Ser Thr Val Thr Lys Cys Glu Ile Gly Gln 65 70 75 80 Ser Leu Glu Glu Phe Leu Arg Glu Ala Thr Pro Asp Lys Gly Leu Arg 85 90 95 Thr Leu Leu Met Cys Met Gly Glu Ala Leu Arg Thr Ile Ala Phe Lys 100 105 110 Val Arg Thr Ala Ser Cys Gly Gly Thr Ala Cys Val Asn Ser Phe Gly 115 120 125 Asp Glu Gln Leu Ala Val Asp Met Leu Ala Asp Lys Leu Leu Phe Glu 130 135 140 Ala Leu Gln 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<213> Brassica napus <400> 42 Met Ala Ser Thr Ser Ser Leu Ala Leu Ser Gln Ala Leu Leu Ala Arg 1 5 10 15 Ala Ile Ser Leu His Gly Ser Asp Gln Arg Ile Ser Leu Pro Ser Ser 20 25 30 Phe Ser Arg Ala Ser Ala Ser Ser Arg Arg Arg Asn Ala Ala Ser Met 35 40 45 Thr Lys Leu Arg Ser Ile Arg Pro Leu Val Arg Ala Ala Ala Val Glu 50 55 60 Thr Leu Glu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Ile Ile Asp Lys Ser Val Asn 65 70 75 80 Ser Ile Arg Phe Leu Ala Ile Asp Ala Val Glu Lys Ala Lys Ser Gly 85 90 95 His Pro Gly Leu Pro Met Gly Cys Ala Pro Met Ala His Ile Leu Tyr 100 105 110 Asp Glu Val Met Arg Tyr Asn Pro Lys Asn Pro Tyr Trp Phe Asn Arg 115 120 125 Asp Arg Phe Val Leu Ser Ala Gly His Gly Cys Met Leu Leu Tyr Ala 130 135 140 Leu Leu His Leu Ala Gly Tyr Asp Ser Val Leu Glu Glu Asp Leu Lys 145 150 155 160 Ser Phe Arg Gln Trp Gly Ser Lys Thr Pro Gly His Pro Glu Asn Phe 165 170 175 Glu Thr Pro Gly Ile Glu Val Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile 180 185 190 Ala Asn Ala Val Gly Leu Ala Leu Ala Glu Lys His Leu Ala Ala Arg 195 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CAUP Q 202 <400> 61 Met Lys Leu Asn Pro Leu Arg Tyr Leu Ser Leu Ser Leu Phe Val Pro 1 5 10 15 Phe Leu Phe Ser Thr Val Ser Val Ala Ala Asp Ile Glu Asn Gly Glu 20 25 30 Arg Ile Phe Ser Ala Asn Cys Ser Ala Cys His Ala Gly Gly Asn Asn 35 40 45 Val Ile Ile Pro Glu Lys Thr Leu Lys Lys Glu Ala Leu Glu Ala Asn 50 55 60 Gly Met Asn Ser Val Asp Ala Ile Thr Tyr Gln Val Thr Asn Gly Lys 65 70 75 80 Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Asp Asp Ser Asp Ile Glu 85 90 95 Asp Val Ala Asn Tyr Val Leu Ser Gln Ser Glu Lys Gly Trp Asp 100 105 110 <210> 62 <211> 108 <212> PRT <213> Gracilariopsis mclachlanii <400> 62 Met Arg Leu Leu Phe Ile Leu Phe Ile Ile Cys Ser Ile Phe Thr Asn 1 5 10 15 Asn Val Asn Pro Thr Ile Ala Ala Asp Leu Gly Ala Gly Glu Gln Ile 20 25 30 Phe Ser Ala Asn Cys Ser Ala Cys His Ala Asn Gly Asn Asn Ala Ile 35 40 45 Met Pro Asp Lys Thr Leu Lys Lys Asp Ala Leu Glu Leu Tyr Gly Met 50 55 60 Asn Ser Ile Thr Ala Ile Thr Asn Gln Val Lys Asn Gly Lys Asn Ala 65 70 75 80 Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Ala Asp Glu Asp Ile Glu Asn Val 85 90 95 Ala Asn Tyr Val Leu Asn Gln Ser Glu Gln Gly Trp 100 105 <210> 63 <211> 111 <212> PRT <213> Monodopsis sp. MarTras21 <400> 63 Met Lys Pro Asn Ala Leu Arg Ile Leu Ser Leu Ser Leu Val Leu Pro 1 5 10 15 Phe Leu Val Ser Thr Val Ser Val Ala Ala Asp Ile Glu Asn Gly Glu 20 25 30 Arg Ile Phe Ser Ala Asn Cys Ser Ala Cys His Ala Gly Gly Asn Asn 35 40 45 Val Ile Ile Pro Glu Lys Thr Leu Lys Lys Glu Ala Leu Glu Ala Asn 50 55 60 Gly Met Asn Ser Val Asp Ala Ile Thr Tyr Gln Val Thr Asn Gly Lys 65 70 75 80 Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Asp Asp Ser Asp Ile Glu 85 90 95 Asp Val Ala Asn Tyr Val Leu Ser Gln Ser Glu Lys Gly Trp Asp 100 105 110 <210> 64 <211> 109 <212> PRT <213> Ulva fasciata <400> 64 Met Arg Arg Leu Leu Thr Phe Leu Ala Val Phe Ser Val Leu Phe Thr 1 5 10 15 Ser Ser Ile Thr Gln Ser Tyr Ala Ala Asp Leu Glu Ala Gly Ala Gln 20 25 30 Ile Phe Ser Ala Asn Cys Ser Ala Cys His Ala Gly Gly Asn Asn Ala 35 40 45 Ile Met Pro Glu Lys Thr Leu Lys Ser Glu Ala Leu Lys Asp Asn Asn 50 55 60 Met Asp Ser Val Ser Ala Ile Thr Thr Gln Val Lys Asn Gly Lys Asn 65 70 75 80 Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Ala 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Val Leu Leu Ala Ile Ala Ile Leu Thr 1 5 10 15 Val Ala Phe Val Pro Pro Ala Phe Ala Gly Asp Ala Ala Asn Gly Ala 20 25 30 Lys Ile Phe Ser Ala Asn Cys Ala Ala Cys His Ala Gly Gly Asn Asn 35 40 45 Val Ile Met Ala Asn Lys Thr Leu Lys Lys Asp Ala Leu Asp Gln Tyr 50 55 60 Ala Met Asn Ser Ile Glu Ala Ile Thr Ala Gln Val Thr Lys Gly Lys 65 70 75 80 Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Ser Asp Ala Gln Ile Glu 85 90 95 Asp Val Ala Thr Tyr Val Leu Glu Gln Ala Glu Lys Gly Trp 100 105 110 <210> 69 <211> 110 <212> PRT <213> Chamaesiphon polymorphus <400> 69 Met Lys Lys Leu Ile Ser Ile Leu Thr Val Ala Phe Ala Leu Phe Thr 1 5 10 15 Met Thr Phe Ser Ser Pro Ala Leu Ala Gly Asp Ala Ala Ser Gly Ser 20 25 30 Lys Ile Phe Ser Ala Asn Cys Ala Ala Cys His Ala Gly Gly Asn Asn 35 40 45 Val Ile Met Ala Asn Lys Asn Leu Lys Lys Glu Ala Leu Ala Glu Tyr 50 55 60 Gly Met Asn Ser Val Ala Ala Ile Thr Thr Gln Val Thr Asn Gly Lys 65 70 75 80 Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Ser Ala Ala Gln Ile Glu 85 90 95 Asp Val 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Val Arg Gly Pro 180 185 190 Ala Pro Leu Ser Leu Ala Leu Ala His Ala Asp Ile Asp Glu Ala Gly 195 200 205 Lys Val Leu Phe Val Pro Trp Val Glu Thr Asp Phe Arg Thr Gly Asp 210 215 220 Ala Pro Trp Trp Ser 225 <210> 71 <211> 231 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 71 Met Ala Ser Ser Pro Ile Ser Pro Ala Thr Gln Leu Gly Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Ala Thr Met Leu Ala Met Met Ser Arg Gly Met Phe Val Lys Pro 20 25 30 Ala Arg Thr Ser His Gln Met Val Arg Lys Glu Lys Ile Gly Leu Arg 35 40 45 Ile Ala Cys Gln Ala Thr Ser Ile Pro Ala Asp Asn Val Pro Asp Met 50 55 60 Glu Lys Arg Lys Leu Leu Asn Leu Leu Leu Val Gly Ala Leu Ser Leu 65 70 75 80 Pro Thr Gly Phe Met Leu Val Pro Tyr Ala Thr Phe Phe Ala Pro Pro 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Lys Asp Ala Leu Gly 100 105 110 Asn Asp Val Ile Ala Ala Glu Trp Leu Lys Thr His Gly Ala Gly Asp 115 120 125 Arg Thr Leu Thr Gln Gly Leu Lys Gly Asp Pro Thr Tyr Leu Val Val 130 135 140 Glu Asn Asp Lys Thr Leu Ala Thr Tyr Gly Ile Asn Ala Val Cys Thr 145 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Leu 180 185 190 Val His Ala Asp Val Asp Asp Gly Lys Val Val Phe Val Pro Trp Val 195 200 205 Glu Thr Asp Phe Arg Thr Gly Glu Asn Pro Trp Trp Lys 210 215 220 <210> 78 <211> 226 <212> PRT <213> Zea mays <400> 78 Met Ala Thr Ser Ala Ala Leu Ser Thr Ala Ala Asn Pro Thr Gln Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Ser Arg Ala Ser Leu Gly Lys Pro Val Lys Gly Leu Gly Leu 20 25 30 Ser Met Gly Arg Glu Arg Ala Gln Arg Ser Ile Val Cys Gln Ala Ala 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ala Asp Arg Val Pro Asp Met Glu Lys Arg Lys Leu 50 55 60 Met Asn Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu Pro Thr Val Gly Met 65 70 75 80 Val Val Pro Tyr Gly Ala Phe Phe Val Pro Ala Gly Ser Gly Asn Ala 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Tyr Ala Lys Asp Lys Leu Gly Asn Asp Ile Thr Val 100 105 110 Glu Ala Trp Leu Asn Thr His Gly Pro Asn Asp Arg Thr Leu Ala Gln 115 120 125 Gly Leu Lys Gly Asp Pro Thr Tyr Leu Val Val Glu Gln Asp Lys Thr 130 135 140 Leu Ala Thr Tyr Gly Ile Asn Ala Val Cys Thr His Leu Gly Cys Val 145 150 155 160 Val Pro Trp Asn Gly Ala Glu Asn Lys Phe 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Synthetic Construct <400> 85 tgcttctgct aagtggatgg g 21 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 tgagatgcac cacgaagctc 20 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 cgatcgttca aacatttggc a 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 88 cgatcgttca aacatttggc a 21 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 ccaacattgt caccaggaag tg 22 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 caactagccg accaccgaag 20 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 91 acatctcata gcagcagcag a 21 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 ccaacattgt caccaggaag tg 22 <210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Modified by an N-terminal cysteine <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Modified by a C-terminal amide <400> 93 Asp Arg Pro Arg His Lys Glu Leu Ile Gln Glu Ile Arg Asn Ala Gly 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Nle <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Modified by an N-terminal cysteine <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Modified by a C-terminal amide <400> 94 Xaa Pro Asp Lys Thr Leu Lys Lys Asp Val Leu Glu Ala Asn Ser 1 5 10 15 <210> 95 <211> 110 <212> PRT <213> Porphyra umbilicalis <400> 95 Met Lys Lys Met Leu Leu Val Leu Phe Thr Val Phe Ser Phe Phe Ala 1 5 10 15 Ile Gly Phe Thr Gln Val Ala Phe Ala Ala Asp Leu Asp Asn Gly Glu 20 25 30 Lys Val Phe Ser Ala Asn Cys Ala Ala Cys His Ala Gly Gly Asn Asn 35 40 45 Ala Ile Met Pro Asp Lys Thr Leu Lys Lys Asp Val Leu Glu Ala Asn 50 55 60 Ser Met Asn Gly Ile Asp Ala Ile Thr Tyr Gln Val Lys Asn Gly Lys 65 70 75 80 Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Val Asp Glu Asp Ile Glu 85 90 95 Asp Ala Ala Ser Tyr Val Leu Ser Gln Ser Glu Lys Gly Trp 100 105 110 <210> 96 <211> 419 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = A, E, or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = A, T, or none <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = M, V, or none <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = S, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = M, Y, or none <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = M, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = R, E, H, or none <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = I, G, or none <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = V, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = T, or none <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = Q, R, T, A <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = K, S, G <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa = V, P, I <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = A, T, or none <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = C, S, or none <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = C, Y, or none <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = A, S, T, or none <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> Xaa = A, R, or none <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = V, M, G, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> Xaa = I, A, T, or none <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa = V, P, S, A, D, or none <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = L, I, P, F, or none <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = A, P, L, N, or none <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = G, P, N, or none <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = A, S, I, N, or none <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, V, L, or none <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Xaa = A, S, or none <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = G, S, R, or none <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = E, Q, P, or none <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Xaa = R, Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = R, S, Y, or none <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Xaa = A, T, L, or none <220> <221> VARIANT <222> 39 <223> Xaa = V, L, A, T, or none <220> <221> VARIANT <222> 40 <223> Xaa = A, V, S, or none <220> <221> VARIANT <222> 41 <223> Xaa = P, K, I, L, or none <220> <221> VARIANT <222> 42 <223> Xaa = K, S, H, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 43 <223> Xaa = M, P, S, T, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 44 <223> Xaa = G, P, A, S, or none <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = R, S, Y, P, or none <220> <221> VARIANT <222> 46 <223> Xaa = A, S, L, or none <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = A, F, Y, I <220> <221> VARIANT <222> 48 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 49 <223> Xaa = T, Q, A, R, P <220> <221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = A, S, or none <220> <221> VARIANT <222> 51 <223> Xaa = P, Y, S <220> <221> VARIANT <222> 52 <223> Xaa = V, R, S, H, F <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = V, P, F, K, G, N, S <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = V, K, S, L, I, or none <220> <221> VARIANT <222> 55 <223> Xaa = A, K, Q, R <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = S, A, R, G <220> <221> VARIANT <222> 57 <223> Xaa = A, R, L, T <220> <221> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = N, P, K <220> <221> VARIANT <222> 59 <223> Xaa = A, P, S <220> <221> VARIANT <222> 60 <223> Xaa = S, T <220> <221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = A, T, S <220> <221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = F, I, L <220> <221> VARIANT <222> 63 <223> Xaa = K, Y, F <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = A, E, D <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = A, S <220> <221> VARIANT <222> 67 <223> Xaa = V, L <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = T, R, H <220> <221> VARIANT <222> 69 <223> Xaa = A, V, L <220> <221> VARIANT <222> 70 <223> Xaa = R, N, A, T <220> <221> VARIANT <222> 71 <223> Xaa = V, T, P, S <220> <221> VARIANT <222> 72 <223> Xaa = K, A, R <220> <221> VARIANT <222> 73 <223> Xaa = R, A, S <220> <221> VARIANT <222> 74 <223> Xaa = S, P, T, Q <220> <221> VARIANT <222> 75 <223> Xaa = T, S, L, Q, I, or none <220> <221> VARIANT <222> 76 <223> Xaa = R, L, F, K, N, or none <220> <221> VARIANT <222> 77 <223> Xaa = A, S, L, P, T, V <220> <221> VARIANT <222> 78 <223> Xaa = A, P, T, S <220> <221> VARIANT <222> 79 <223> Xaa = R, G, or none <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 81 <223> Xaa = Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 82 <223> Xaa = R, S, K <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = V, K, A, T <220> <221> VARIANT <222> 84 <223> Xaa = Q, A, K, G <220> <221> VARIANT <222> 85 <223> Xaa = S, A, N, G, or none <220> <221> VARIANT <222> 86 <223> Xaa = R, S, N, A <220> <221> VARIANT <222> 87 <223> Xaa = R, G, or none <220> <221> VARIANT <222> 88 <223> Xaa = T, A, G, S, Y <220> <221> VARIANT <222> 89 <223> Xaa = A, S <220> <221> VARIANT <222> 90 <223> Xaa = V, L, T <220> <221> VARIANT <222> 91 <223> Xaa = L, S, T, V, M <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = T, A, S <220> <221> VARIANT <222> 93 <223> Xaa = Q, R, K <220> <221> VARIANT <222> 94 <223> Xaa = A, C <220> <221> VARIANT <222> 95 <223> Xaa = K, E, A <220> <221> VARIANT <222> 98 <223> Xaa = D, Q <220> <221> VARIANT <222> 101 <223> Xaa = A, E <220> <221> VARIANT <222> 102 <223> Xaa = E, G <220> <221> VARIANT <222> 105 <223> Xaa = V, T, A, R, S <220> <221> VARIANT <222> 106 <223> Xaa = E, K, Q <220> <221> VARIANT <222> 107 <223> Xaa = A, S <220> <221> VARIANT <222> 109 <223> Xaa = P, S <220> <221> VARIANT <222> 111 <223> Xaa = P, K <220> <221> VARIANT <222> 112 <223> Xaa = K, N, G <220> <221> VARIANT <222> 114 <223> Xaa = R, I <220> <221> VARIANT <222> 115 <223> Xaa = Q, H, R, T, S <220> <221> VARIANT <222> 116 <223> Xaa = L, V <220> <221> VARIANT <222> 117 <223> Xaa = M, L <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa = M, I, V, L <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa = S, C <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa = A, G <220> <221> VARIANT <222> 124 <223> Xaa = T, M, L <220> <221> VARIANT <222> 128 <223> Xaa = A, S <220> <221> VARIANT <222> 129 <223> Xaa = H, F <220> <221> VARIANT <222> 132 <223> Xaa = R, K <220> <221> VARIANT <222> 137 <223> Xaa = A, G, S <220> <221> VARIANT <222> 140 <223> Xaa = A, Q <220> <221> VARIANT <222> 144 <223> Xaa = S, T <220> <221> VARIANT <222> 148 <223> Xaa = E, G <220> <221> VARIANT <222> 154 <223> Xaa = M, L <220> <221> VARIANT <222> 155 <223> Xaa = V, L <220> <221> VARIANT <222> 157 <223> Xaa = D, N <220> <221> VARIANT <222> 158 <223> Xaa = K, Q <220> <221> VARIANT <222> 162 <223> Xaa = E, D <220> <221> VARIANT <222> 165 <223> Xaa = K, E, Q, N, T <220> <221> VARIANT <222> 169 <223> Xaa = V, F <220> <221> VARIANT <222> 172 <223> Xaa = L, Y <220> <221> VARIANT <222> 174 <223> Xaa = C, S <220> <221> VARIANT <222> 178 <223> Xaa = V, N <220> <221> VARIANT <222> 181 <223> Xaa = P, L <220> <221> VARIANT <222> 182 <223> Xaa = V, Q, L <220> <221> VARIANT <222> 185 <223> Xaa = G, D <220> <221> VARIANT <222> 187 <223> Xaa = P, or none <220> <221> VARIANT <222> 188 <223> Xaa = V, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 189 <223> Xaa = E, D, I, or none <220> <221> VARIANT <222> 190 <223> Xaa = E, G <220> <221> VARIANT <222> 193 <223> Xaa = C, S <220> <221> VARIANT <222> 204 <223> Xaa = I, S <220> <221> VARIANT <222> 205 <223> Xaa = V, S <220> <221> VARIANT <222> 210 <223> Xaa = A, T <220> <221> VARIANT <222> 225 <223> Xaa = N, G <220> <221> VARIANT <222> 226 <223> Xaa = I, V <220> <221> VARIANT <222> 229 <223> Xaa = R, G <220> <221> VARIANT <222> 230 <223> Xaa = E, D <220> <221> VARIANT <222> 235 <223> Xaa = G, A <220> <221> VARIANT <222> 238 <223> Xaa = I, V <220> <221> VARIANT <222> 239 <223> Xaa = Y, F, L <220> <221> VARIANT <222> 244 <223> Xaa = V, T <220> <221> VARIANT <222> 245 <223> Xaa = F, Y <220> <221> VARIANT <222> 246 <223> Xaa = C, I, V <220> <221> VARIANT <222> 247 <223> Xaa = I, V, L <220> <221> VARIANT <222> 249 <223> Xaa = L, V <220> <221> VARIANT <222> 251 <223> Xaa = D, G <220> <221> VARIANT <222> 252 <223> Xaa = A, C, F, V <220> <221> VARIANT <222> 255 <223> Xaa = C, T <220> <221> VARIANT <222> 261 <223> Xaa = M, L <220> <221> VARIANT <222> 263 <223> Xaa = D, E <220> <221> VARIANT <222> 267 <223> Xaa = M, Q <220> <221> VARIANT <222> 271 <223> Xaa = E, D <220> <221> VARIANT <222> 274 <223> Xaa = H, T, S, E <220> <221> VARIANT <222> 276 <223> Xaa = G, A, N, E <220> <221> VARIANT <222> 280 <223> Xaa = M, L <220> <221> VARIANT <222> 282 <223> Xaa = A, S <220> <221> VARIANT <222> 290 <223> Xaa = F, V, S <220> <221> VARIANT <222> 293 <223> Xaa = P, S, A <220> <221> VARIANT <222> 294 <223> Xaa = A, E, D <220> <221> VARIANT <222> 296 <223> Xaa = E, D, S, A <220> <221> VARIANT <222> 297 <223> Xaa = R, K <220> <221> VARIANT <222> 299 <223> Xaa = I, V <220> <221> VARIANT <222> 300 <223> Xaa = N, D, E <220> <221> VARIANT <222> 301 <223> Xaa = F, Y <220> <221> VARIANT <222> 303 <223> Xaa = L, V <220> <221> VARIANT <222> 304 <223> Xaa = G, K, R, N <220> <221> VARIANT <222> 315 <223> Xaa = M, I <220> <221> VARIANT <222> 316 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 317 <223> Xaa = P, or none <220> <221> VARIANT <222> 318 <223> Xaa = D, or none <220> <221> VARIANT <222> 319 <223> Xaa = V, L, or none <220> <221> VARIANT <222> 320 <223> Xaa = F, N, or none <220> <221> VARIANT <222> 321 <223> Xaa = Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 329 <223> Xaa = V, I <220> <221> VARIANT <222> 333 <223> Xaa = V, L <220> <221> VARIANT <222> 337 <223> Xaa = T, S <220> <221> VARIANT <222> 338 <223> Xaa = T, A <220> <221> VARIANT <222> 344 <223> Xaa = I, L <220> <221> VARIANT <222> 352 <223> Xaa = A, G <220> <221> VARIANT <222> 353 <223> Xaa = L, F <220> <221> VARIANT <222> 355 <223> Xaa = I, M <220> <221> VARIANT <222> 357 <223> Xaa = K, N <220> <221> VARIANT <222> 361 <223> Xaa = A, Y, H, F <220> <221> VARIANT <222> 364 <223> Xaa = C, D <220> <221> VARIANT <222> 365 <223> Xaa = D, G <220> <221> VARIANT <222> 366 <223> Xaa = G, K, H, Y <220> <221> VARIANT <222> 367 <223> Xaa = K, Q <220> <221> VARIANT <222> 368 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 369 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 371 <223> Xaa = A, V <220> <221> VARIANT <222> 374 <223> Xaa = I, R, K <220> <221> VARIANT <222> 375 <223> Xaa = P, V, T <220> <221> VARIANT <222> 377 <223> Xaa = L, N, T, S, I, V, G <220> <221> VARIANT <222> 378 <223> Xaa = V, E, N, T <220> <221> VARIANT <222> 379 <223> Xaa = C, L, I <220> <221> VARIANT <222> 381 <223> Xaa = Q, E, D <220> <221> VARIANT <222> 385 <223> Xaa = I, V <220> <221> VARIANT <222> 386 <223> Xaa = C, A <220> <221> VARIANT <222> 390 <223> Xaa = I, K <220> <221> VARIANT <222> 391 <223> Xaa = G, N <220> <221> VARIANT <222> 393 <223> Xaa = V, I <220> <221> VARIANT <222> 394 <223> Xaa = R, I <220> <221> VARIANT <222> 399 <223> Xaa = Y, T <220> <221> VARIANT <222> 400 <223> Xaa = M, L <220> <221> VARIANT <222> 401 <223> Xaa = Y, C <220> <221> VARIANT <222> 403 <223> Xaa = T, S, K <220> <221> VARIANT <222> 405 <223> Xaa = P, R <220> <221> VARIANT <222> 406 <223> Xaa = R, L <220> <221> VARIANT <222> 407 <223> Xaa = F, A, K <220> <221> VARIANT <222> 408 <223> Xaa = S, A, N, D <220> <221> VARIANT <222> 409 <223> Xaa = E, S, G, V, A <220> <221> VARIANT <222> 410 <223> Xaa = K, A, T, V, E, Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 411 <223> Xaa = V, T, P, A <220> <221> VARIANT <222> 412 <223> Xaa = A, V, I <220> <221> VARIANT <222> 413 <223> Xaa = A, T, G <220> <221> VARIANT <222> 414 <223> Xaa = A, V, or none <220> <221> VARIANT <222> 415 <223> Xaa = R, T, N, A, or none <220> <221> VARIANT <222> 416 <223> Xaa = A, V, or none <220> <221> VARIANT <222> 417 <223> Xaa = L, or none <220> <221> VARIANT <222> 418 <223> Xaa = I, P, or none <220> <221> VARIANT <222> 419 <223> Xaa = N, or none <400> 96 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile 85 90 95 Gly Xaa Ser Leu Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Asp Xaa Xaa 100 105 110 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Glu Ala Xaa Arg Thr Ile Xaa 115 120 125 Xaa Lys Val Xaa Thr Ala Ser Cys Xaa Gly Thr Xaa Cys Val Asn Xaa 130 135 140 Phe Gly Asp Xaa Gln Leu Ala Val Asp Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Leu Leu 145 150 155 160 Phe Xaa Ala Leu Xaa Tyr Ser His Xaa Cys Lys Xaa Ala Xaa Ser Glu 165 170 175 Glu Xaa Pro Glu Xaa Xaa Asp Met Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe 180 185 190 Xaa Val Ala Phe Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ser Xaa Xaa Asp Thr Asn 195 200 205 Phe Xaa Val Gly Thr Ile Phe Gly Val Trp Pro Gly Asp Lys Leu Thr 210 215 220 Xaa Xaa Thr Gly Xaa Xaa Gln Val Ala Ala Xaa Met Gly Xaa Xaa Gly 225 230 235 240 Pro Arg Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Lys Xaa Xaa Pro Gly Xaa His 245 250 255 Glu Phe Leu Leu Xaa Asp Xaa Gly Lys Trp Xaa His Val Lys Xaa Thr 260 265 270 Thr Xaa Ile Xaa Glu Gly Lys Xaa Phe Xaa Pro Gly Asn Leu Arg Ala 275 280 285 Thr Xaa Asp Asn Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa 290 295 300 Glu Lys Tyr Thr Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Ile Ile Val Lys Glu Lys Gly Xaa Phe Thr Asn Xaa Thr Ser Pro 325 330 335 Xaa Xaa Lys Ala Lys Leu Arg Xaa Leu Phe Glu Val Ala Pro Leu Xaa 340 345 350 Xaa Leu Xaa Glu Xaa Ala Gly Gly Xaa Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Ser Xaa Leu Asp Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Arg Thr Gln 370 375 380 Xaa Xaa Tyr Gly Ser Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Arg Phe Glu Glu Xaa Xaa 385 390 395 400 Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 405 410 415 Xaa Xaa Xaa <210> 97 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = M,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = T,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = S,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = L,V,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = L, or none <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = P,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = T,L,P,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = V,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = L,I,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = D,K, or none <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa = K,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = S,C,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = E, or none <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = W,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = V,L,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> Xaa = K,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = G,A,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> Xaa = Q,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa = M,S,T,P,Q <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A,V,L,S <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = L,R,A <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = M,F,A,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = M,R,A,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = K,Q,R <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Xaa = S,P,T,Q <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = A,S,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Xaa = S,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = L,S,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Xaa = K,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Xaa = A,V,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 39 <223> Xaa = V,C, or none <220> <221> VARIANT <222> 40 <223> Xaa = S,L,H,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 41 <223> Xaa = A,R,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 42 <223> Xaa = G,N,T,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 43 <223> Xaa = R,N,T,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 44 <223> Xaa = S,A,P,M <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = R,T,S,A <220> <221> VARIANT <222> 46 <223> Xaa = R,S,G,A,V <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = A,L,S <220> <221> VARIANT <222> 48 <223> Xaa = V,T,A,F,M <220> <221> VARIANT <222> 49 <223> Xaa = V,I,T <220> <221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = V,R,K <220> <221> VARIANT <222> 51 <223> Xaa = R,A <220> <221> VARIANT <222> 52 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = G,S,A <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = K,S,P,A <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = D,A,S <220> <221> VARIANT <222> 57 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 60 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 64 <223> Xaa = G,K,N <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = T,S <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 69 <223> Xaa = K,P <220> <221> VARIANT <222> 88 <223> Xaa = D,A <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V,L <220> <221> VARIANT <222> 97 <223> Xaa = E,A <220> <221> VARIANT <222> 100 <223> Xaa = R,Q <220> <221> VARIANT <222> 102 <223> Xaa = Y,F <220> <221> VARIANT <222> 104 <223> Xaa = E,T <220> <221> VARIANT <222> 108 <223> Xaa = T,S,A <220> <221> VARIANT <222> 109 <223> Xaa = A,V,P <220> <221> VARIANT <222> 114 <223> Xaa = Q,E,N <220> <221> VARIANT <222> 116 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 130 <223> Xaa = T,A <220> <221> VARIANT <222> 131 <223> Xaa = A,T,V <220> <221> VARIANT <222> 132 <223> Xaa = S,E,D <220> <221> VARIANT <222> 134 <223> Xaa = K,R <220> <221> VARIANT <222> 136 <223> Xaa = F,M,I <220> <221> VARIANT <222> 139 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 140 <223> Xaa = M,L <220> <221> VARIANT <222> 141 <223> Xaa = K,V,I,L,A <220> <221> VARIANT <222> 142 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 144 <223> Xaa = N,G <220> <221> VARIANT <222> 146 <223> Xaa = V,M <220> <221> VARIANT <222> 159 <223> Xaa = S,V,A <220> <221> VARIANT <222> 160 <223> Xaa = N,G <220> <221> VARIANT <222> 161 <223> Xaa = T,S <220> <221> VARIANT <222> 163 <223> Xaa = G,N,D <220> <221> VARIANT <222> 168 <223> Xaa = M,Q <220> <221> VARIANT <222> 174 <223> Xaa = D,S,A <220> <221> VARIANT <222> 175 <223> Xaa = K,S <220> <221> VARIANT <222> 177 <223> Xaa = C,T,S,E <220> <221> VARIANT <222> 179 <223> Xaa = E,A <220> <221> VARIANT <222> 182 <223> Xaa = K,Q,E <220> <221> VARIANT <222> 183 <223> Xaa = A,Q <220> <221> VARIANT <222> 192 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 198 <223> Xaa = H,N <220> <221> VARIANT <222> 202 <223> Xaa = I,A,E <220> <221> VARIANT <222> 203 <223> Xaa = I,L <220> <221> VARIANT <222> 205 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 206 <223> Xaa = R,K <220> <221> VARIANT <222> 207 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 208 <223> Xaa = C,A <220> <221> VARIANT <222> 210 <223> Xaa = Y,W <220> <221> VARIANT <222> 219 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 221 <223> Xaa = N,D,E <220> <221> VARIANT <222> 222 <223> Xaa = A,S,N <220> <221> VARIANT <222> 232 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 233 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 239 <223> Xaa = D,G <220> <221> VARIANT <222> 241 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 243 <223> Xaa = C,T <220> <221> VARIANT <222> 244 <223> Xaa = L,Y,F <220> <221> VARIANT <222> 245 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 247 <223> Xaa = Q,A,S <220> <221> VARIANT <222> 248 <223> Xaa = E,Q <220> <221> VARIANT <222> 249 <223> Xaa = A,K,N <220> <221> VARIANT <222> 250 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 252 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 254 <223> Xaa = T,V <220> <221> VARIANT <222> 256 <223> Xaa = K,F,Y <220> <221> VARIANT <222> 257 <223> Xaa = Y,A <220> <221> VARIANT <222> 258 <223> Xaa = M,L <220> <221> VARIANT <222> 260 <223> Xaa = D,Q,E <220> <221> VARIANT <222> 262 <223> Xaa = K,N <220> <221> VARIANT <222> 264 <223> Xaa = M,L <220> <221> VARIANT <222> 265 <223> Xaa = F,L <220> <221> VARIANT <222> 273 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 280 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 281 <223> Xaa = C,S,A <220> <221> VARIANT <222> 283 <223> Xaa = N,D,E <220> <221> VARIANT <222> 284 <223> Xaa = K,R <220> <221> VARIANT <222> 286 <223> Xaa = G,T,S <220> <221> VARIANT <222> 288 <223> Xaa = A,E,Q,L <220> <221> VARIANT <222> 289 <223> Xaa = K,Q,T,E <220> <221> VARIANT <222> 292 <223> Xaa = E,A,D,S <220> <221> VARIANT <222> 296 <223> Xaa = K,S <220> <221> VARIANT <222> 297 <223> Xaa = M,L <220> <221> VARIANT <222> 299 <223> Xaa = R,K,Q,H <220> <221> VARIANT <222> 300 <223> Xaa = R,N <220> <221> VARIANT <222> 302 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 305 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 319 <223> Xaa = L,V <220> <221> VARIANT <222> 321 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 323 <223> Xaa = L,Q <220> <221> VARIANT <222> 331 <223> Xaa = S,A,G <220> <221> VARIANT <222> 349 <223> Xaa = V,C,A <220> <221> VARIANT <222> 354 <223> Xaa = Q,G <220> <221> VARIANT <222> 356 <223> Xaa = K,R,Q,L,E <220> <221> VARIANT <222> 357 <223> Xaa = P,A,Q <220> <221> VARIANT <222> 358 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 359 <223> Xaa = N,K <220> <221> VARIANT <222> 361 <223> Xaa = Q,N,K,A <220> <221> VARIANT <222> 365 <223> Xaa = A,T,D,E <220> <221> VARIANT <222> 366 <223> Xaa = A,T <220> <221> VARIANT <222> 368 <223> Xaa = L,A <220> <221> VARIANT <222> 369 <223> Xaa = K,A,V,T,F,L <220> <221> VARIANT <222> 373 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 376 <223> Xaa = D,L <220> <221> VARIANT <222> 379 <223> Xaa = Q,L <220> <221> VARIANT <222> 383 <223> Xaa = D,T <220> <221> VARIANT <222> 384 <223> Xaa = A,G,S <220> <221> VARIANT <222> 385 <223> Xaa = T,E,D <220> <221> VARIANT <222> 386 <223> Xaa = T,G <220> <221> VARIANT <222> 388 <223> Xaa = G,S,A <220> <221> VARIANT <222> 389 <223> Xaa = K,E,D,A <220> <221> VARIANT <222> 390 <223> Xaa = E,A <220> <221> VARIANT <222> 392 <223> Xaa = A,K,T,S <220> <221> VARIANT <222> 393 <223> Xaa = Q,E,K,R <220> <221> VARIANT <222> 394 <223> Xaa = G,E,N <220> <221> VARIANT <222> 395 <223> Xaa = M,L <220> <221> VARIANT <222> 396 <223> Xaa = Y,F <220> <221> VARIANT <222> 397 <223> Xaa = E,V <220> <221> VARIANT <222> 399 <223> Xaa = G,S,N <220> <221> VARIANT <222> 401 <223> Xaa = V,T,S <400> 97 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Glu Leu Xaa Lys Thr Ala Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Ala Ser Xaa Gly Arg Gly Ile Leu Ala Met Asp Glu Ser Asn 65 70 75 80 Ala Thr Cys Gly Lys Arg Leu Xaa Ser Ile Gly Xaa Glu Asn Thr Glu 85 90 95 Xaa Asn Arg Xaa Ala Xaa Arg Xaa Leu Leu Val Xaa Xaa Pro Gly Leu 100 105 110 Gly Xaa Tyr Xaa Ser Gly Ala Ile Leu Phe Glu Glu Thr Leu Tyr Gln 115 120 125 Ser Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Lys Xaa Val Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa 130 135 140 Ile Xaa Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Leu Val Pro Leu Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Asn Xaa Glu Ser Trp Cys Xaa Gly Leu Asp Gly Leu Xaa Xaa Arg 165 170 175 Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp Arg Xaa 180 185 190 Val Val Ser Ile Pro Xaa Gly Pro Ser Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Ala Xaa Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Ala Ile Xaa Gln Xaa Xaa Gly Leu 210 215 220 Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Xaa Xaa Leu Asp Gly Glu His Xaa Ile 225 230 235 240 Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Glu Xaa Phe Xaa 245 250 255 Xaa Xaa Ala Xaa Asn Xaa Val Xaa Xaa Glu Gly Ile Leu Leu Lys Pro 260 265 270 Xaa Met Val Thr Pro Gly Ala Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Ala Xaa Pro Xaa 275 280 285 Xaa Val Ala Xaa Tyr Thr Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Arg Xaa Pro Pro 290 295 300 Xaa Val Pro Gly Ile Met Phe Leu Ser Gly Gly Gln Ser Glu Xaa Glu 305 310 315 320 Xaa Thr Xaa Asn Leu Asn Ala Met Asn Gln Xaa Pro Asn Pro Trp His 325 330 335 Val Ser Phe Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Gln Asn Thr Xaa Leu Lys Thr 340 345 350 Trp Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Ala Ala Gln Xaa Xaa Leu Xaa 355 360 365 Xaa Arg Ala Lys Xaa Asn Ser Xaa Ala Gln Xaa Gly Lys Tyr Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Tyr 385 390 395 400 Xaa Tyr <210> 98 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = T,A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = M,A,T,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = T,A,G,M, or none <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = T,S,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = S,T,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = S,T,Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = S,T,L,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = S,I,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = H,R,F,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = L,P,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = L,K,F,Y, or none <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa = L,P <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = R,L,S,C <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = S,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = T,Q,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> Xaa = Q,H, or none <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = S,A,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> Xaa = G,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa = I,S,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = A,S,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = K,A,Q,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = A,G,S,P,L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = G,S,R,D <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Xaa = R,L,I,K <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = K,R,Q,L <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = E,C,S,F,T <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Xaa = A,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 39 <223> Xaa = R,S,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 40 <223> Xaa = A,S,L,Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 41 <223> Xaa = V,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 42 <223> Xaa = A,F,C, or none <220> <221> VARIANT <222> 43 <223> Xaa = Q,R,S,V,T,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 44 <223> Xaa = P,L,N,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = Q,S,P,N,D <220> <221> VARIANT <222> 46 <223> Xaa = R,F,G,T,K <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = Q,L,R,K <220> <221> VARIANT <222> 48 <223> Xaa = A,S,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 49 <223> Xaa = G,Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = A,Q,L,S,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 51 <223> Xaa = A,P,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 52 <223> Xaa = S,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = V,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = F,R,L,C, or none <220> <221> VARIANT <222> 55 <223> Xaa = S,R,F,P <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = S,P,A,V,K, or none <220> <221> VARIANT <222> 57 <223> Xaa = G,P,A,S,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = R,Q,T,V,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 59 <223> Xaa = V,T,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 60 <223> Xaa = T,S,V,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = A,G,R,K, or none <220> <221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = Q,A,N,K,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 63 <223> Xaa = S,A,Q,H,N,R <220> <221> VARIANT <222> 64 <223> Xaa = S,P,A,Q,H,V <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = S,A,M,Y,H,G,F <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = G,A,T,N <220> <221> VARIANT <222> 67 <223> Xaa = A,K,P,S,T,G <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = A,D,G,N <220> <221> VARIANT <222> 69 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 70 <223> Xaa = R,K <220> <221> VARIANT <222> 71 <223> Xaa = R,C <220> <221> VARIANT <222> 72 <223> Xaa = G,M,T <220> <221> VARIANT <222> 73 <223> Xaa = V,A <220> <221> VARIANT <222> 74 <223> Xaa = V,A,I <220> <221> VARIANT <222> 75 <223> Xaa = A,V,G,E <220> <221> VARIANT <222> 76 <223> Xaa = Q,D,A,E,T <220> <221> VARIANT <222> 77 <223> Xaa = A,T,D <220> <221> VARIANT <222> 78 <223> Xaa = T,A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 79 <223> Xaa = A,S,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = V,S,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 81 <223> Xaa = A,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 82 <223> Xaa = T,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = P,A,E, or none <220> <221> VARIANT <222> 84 <223> Xaa = A,T,G <220> <221> VARIANT <222> 85 <223> Xaa = A,E,K,T,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 86 <223> Xaa = K,T,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 87 <223> Xaa = P,S,A,G,E,Q <220> <221> VARIANT <222> 88 <223> Xaa = A,P,K,T <220> <221> VARIANT <222> 89 <223> Xaa = A,K,R <220> <221> VARIANT <222> 90 <223> Xaa = K,S <220> <221> VARIANT <222> 91 <223> Xaa = T,S,P,R,K <220> <221> VARIANT <222> 93 <223> Xaa = Q,S,G <220> <221> VARIANT <222> 95 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 96 <223> Xaa = L,I,M <220> <221> VARIANT <222> 97 <223> Xaa = F,V,I,Q <220> <221> VARIANT <222> 101 <223> Xaa = T,G,S,N <220> <221> VARIANT <222> 105 <223> Xaa = K,Q,R <220> <221> VARIANT <222> 106 <223> Xaa = E,Q <220> <221> VARIANT <222> 108 <223> Xaa = M,R,Q <220> <221> VARIANT <222> 109 <223> Xaa = K,T,A,E <220> <221> VARIANT <222> 111 <223> Xaa = T,A,V,E <220> <221> VARIANT <222> 114 <223> Xaa = G,N,A,T <220> <221> VARIANT <222> 116 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 117 <223> Xaa = A,T <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa = T,I <220> <221> VARIANT <222> 120 <223> Xaa = I,L,M <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 123 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 124 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 125 <223> Xaa = L,T,M <220> <221> VARIANT <222> 132 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 135 <223> Xaa = N,Q <220> <221> VARIANT <222> 138 <223> Xaa = G,P,N <220> <221> VARIANT <222> 146 <223> Xaa = A,Q <220> <221> VARIANT <222> 148 <223> Xaa = N,A <220> <221> VARIANT <222> 149 <223> Xaa = Q,V,T,I <220> <221> VARIANT <222> 151 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 162 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 168 <223> Xaa = K,S <220> <221> VARIANT <222> 172 <223> Xaa = A,K,R <220> <221> VARIANT <222> 173 <223> Xaa = S,W <220> <221> VARIANT <222> 174 <223> Xaa = C,S <220> <221> VARIANT <222> 179 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 187 <223> Xaa = Q,V <220> <221> VARIANT <222> 193 <223> Xaa = E,Q <220> <221> VARIANT <222> 194 <223> Xaa = T,S <220> <221> VARIANT <222> 200 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 215 <223> Xaa = G,A <220> <221> VARIANT <222> 216 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 218 <223> Xaa = V,T <220> <221> VARIANT <222> 226 <223> Xaa = E,N,S <220> <221> VARIANT <222> 228 <223> Xaa = S,N,A <220> <221> VARIANT <222> 229 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 232 <223> Xaa = P,L,H,I <220> <221> VARIANT <222> 233 <223> Xaa = I,A,V,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 234 <223> Xaa = D, or none <220> <221> VARIANT <222> 235 <223> Xaa = A,V,I,D,N,H,L <220> <221> VARIANT <222> 236 <223> Xaa = M,D,G,S <220> <221> VARIANT <222> 237 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 238 <223> Xaa = D,N <220> <221> VARIANT <222> 239 <223> Xaa = P,I,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 240 <223> Xaa = D,P,A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 241 <223> Xaa = T,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 242 <223> Xaa = L, or none <220> <221> VARIANT <222> 243 <223> Xaa = Q,D,G <220> <221> VARIANT <222> 244 <223> Xaa = K,S,Q,E,T,N <220> <221> VARIANT <222> 245 <223> Xaa = M,V,E,T,I <220> <221> VARIANT <222> 246 <223> Xaa = M,E,T <220> <221> VARIANT <222> 247 <223> Xaa = E,Q <220> <221> VARIANT <222> 248 <223> Xaa = Q,R,M,K <220> <221> VARIANT <222> 250 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 251 <223> Xaa = M,V <220> <221> VARIANT <222> 258 <223> Xaa = S,N,T <220> <221> VARIANT <222> 259 <223> Xaa = R,N <220> <221> VARIANT <222> 261 <223> Xaa = K,L <220> <221> VARIANT <222> 262 <223> Xaa = C,A <220> <221> VARIANT <222> 267 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 272 <223> Xaa = T,V,I <220> <221> VARIANT <222> 274 <223> Xaa = M,F <220> <221> VARIANT <222> 276 <223> Xaa = L,V <220> <221> VARIANT <222> 278 <223> Xaa = I,V,L <220> <221> VARIANT <222> 280 <223> Xaa = N,T,K <220> <221> VARIANT <222> 283 <223> Xaa = F,Y <220> <221> VARIANT <222> 284 <223> Xaa = G,V,S,A <220> <221> VARIANT <222> 286 <223> Xaa = T,N <220> <221> VARIANT <222> 290 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 291 <223> Xaa = V,Y <220> <221> VARIANT <222> 298 <223> Xaa = H,Q <220> <221> VARIANT <222> 299 <223> Xaa = P,E <220> <221> VARIANT <222> 300 <223> Xaa = N,K <220> <221> VARIANT <222> 301 <223> Xaa = V,I,L <220> <221> VARIANT <222> 302 <223> Xaa = Q,E <220> <221> VARIANT <222> 305 <223> Xaa = E,K,R <220> <221> VARIANT <222> 306 <223> Xaa = V,A,S <220> <221> VARIANT <222> 308 <223> Xaa = K,R <220> <221> VARIANT <222> 311 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 318 <223> Xaa = G,A,Q <220> <221> VARIANT <222> 319 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 322 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 323 <223> Xaa = S,K,N <220> <221> VARIANT <222> 324 <223> Xaa = V,L <220> <221> VARIANT <222> 326 <223> Xaa = A,L,S,K <220> <221> VARIANT <222> 328 <223> Xaa = M,I <220> <221> VARIANT <222> 330 <223> Xaa = S,D <220> <221> VARIANT <222> 333 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 335 <223> Xaa = K,G <220> <221> VARIANT <222> 336 <223> Xaa = K,D,T,P <220> <221> VARIANT <222> 337 <223> Xaa = W, or none <220> <221> VARIANT <222> 338 <223> Xaa = D,S,T <220> <221> VARIANT <222> 358 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 368 <223> Xaa = G,R,S <220> <221> VARIANT <222> 370 <223> Xaa = A,K,Q,R <220> <221> VARIANT <222> 372 <223> Xaa = N,S <220> <221> VARIANT <222> 389 <223> Xaa = I,L <220> <221> VARIANT <222> 390 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 396 <223> Xaa = L,K <220> <221> VARIANT <222> 399 <223> Xaa = T,D <220> <221> VARIANT <222> 401 <223> Xaa = Q,H <220> <221> VARIANT <222> 402 <223> Xaa = E,Q,S <220> <221> VARIANT <222> 404 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 407 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 408 <223> Xaa = N,T,I,M,Q <220> <221> VARIANT <222> 410 <223> Xaa = E,T <220> <221> VARIANT <222> 411 <223> Xaa = K,E,A <220> <221> VARIANT <222> 412 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 419 <223> Xaa = F,Y <220> <221> VARIANT <222> 420 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 423 <223> Xaa = K,V,T <220> <221> VARIANT <222> 424 <223> Xaa = K,E <220> <221> VARIANT <222> 427 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 428 <223> Xaa = Y,K <220> <221> VARIANT <222> 429 <223> Xaa = L,V <220> <221> VARIANT <222> 431 <223> Xaa = S,K <220> <221> VARIANT <222> 432 <223> Xaa = F,Y <220> <221> VARIANT <222> 433 <223> Xaa = T,L <220> <221> VARIANT <222> 434 <223> Xaa = K,A,S <220> <221> VARIANT <222> 435 <223> Xaa = K,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 436 <223> Xaa = H,E, or none <400> 98 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Thr Leu Thr Xaa Trp Leu Leu Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Gly Xaa Ile 100 105 110 Asp Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ala Cys Lys 115 120 125 Gln Ile Ala Xaa Leu Val Xaa Arg Ala Xaa Ile Ser Asn Leu Thr Gly 130 135 140 Val Xaa Gly Xaa Xaa Asn Xaa Gln Gly Glu Asp Gln Lys Lys Leu Asp 145 150 155 160 Val Xaa Ser Asn Glu Val Phe Xaa Asn Cys Leu Xaa Xaa Xaa Gly Arg 165 170 175 Thr Gly Xaa Ile Ala Ser Glu Glu Glu Asp Xaa Pro Val Ala Val Glu 180 185 190 Xaa Xaa Tyr Ser Gly Asn Tyr Xaa Val Val Phe Asp Pro Leu Asp Gly 195 200 205 Ser Ser Asn Ile Asp Ala Xaa Xaa Ser Xaa Gly Ser Ile Phe Gly Ile 210 215 220 Tyr Xaa Pro Xaa Xaa Glu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Asn Val Cys Gln Pro 245 250 255 Gly Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ala Gly Tyr Cys Xaa Tyr Ser Ser Ser Xaa 260 265 270 Ile Xaa Val Xaa Thr Xaa Gly Xaa Gly Val Xaa Xaa Phe Xaa Leu Asp 275 280 285 Pro Xaa Xaa Gly Glu Phe Val Leu Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Pro 290 295 300 Xaa Xaa Gly Xaa Ile Tyr Xaa Phe Asn Glu Gly Asn Tyr Xaa Xaa Trp 305 310 315 320 Asp Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Tyr Xaa Asp Xaa Leu Lys Xaa Pro Xaa Xaa 325 330 335 Xaa Xaa Gly Lys Pro Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Ser Leu Val Gly 340 345 350 Asp Phe His Arg Thr Xaa Leu Tyr Gly Gly Ile Tyr Gly Tyr Pro Xaa 355 360 365 Asp Xaa Lys Xaa Lys Asn Gly Lys Leu Arg Leu Leu Tyr Glu Cys Ala 370 375 380 Pro Met Ser Phe Xaa Xaa Glu Gln Ala Gly Gly Xaa Gly Ser Xaa Gly 385 390 395 400 Xaa Xaa Arg Xaa Leu Asp Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa His Gln Arg Val 405 410 415 Pro Leu Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Glu Val Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa 435 <210> 99 <211> 379 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = L, or none <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = P, or none <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> Xaa = T, or none <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Xaa = V,M <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 55 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = Q,H <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = K,R <220> <221> VARIANT <222> 96 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 111 <223> Xaa = R,Q <220> <221> VARIANT <222> 112 <223> Xaa = E,A <220> <221> VARIANT <222> 116 <223> Xaa = S,Q <220> <221> VARIANT <222> 117 <223> Xaa = F,Y <220> <221> VARIANT <222> 182 <223> Xaa = D,N <220> <221> VARIANT <222> 191 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 299 <223> Xaa = E,A <220> <221> VARIANT <222> 302 <223> Xaa = A,Q <220> <221> VARIANT <222> 303 <223> Xaa = S,E <220> <221> VARIANT <222> 307 <223> Xaa = K,T <220> <221> VARIANT <222> 311 <223> Xaa = Q,R <220> <221> VARIANT <222> 314 <223> Xaa = N,S <220> <221> VARIANT <222> 320 <223> Xaa = C,S <220> <221> VARIANT <222> 347 <223> Xaa = V,A <220> <221> VARIANT <222> 356 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 359 <223> Xaa = S,K <220> <221> VARIANT <222> 369 <223> Xaa = M,L <220> <221> VARIANT <222> 370 <223> Xaa = K,T,F <220> <221> VARIANT <222> 371 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 372 <223> Xaa = S,Q,R <220> <221> VARIANT <222> 375 <223> Xaa = V,Y <220> <221> VARIANT <222> 379 <223> Xaa = H,R <400> 99 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Leu Gly Leu Glu Ile Ile Glu Val Val Glu 35 40 45 Gln Ala Ala Ile Ala Ser Xaa Lys Trp Met Gly Lys Gly Glu Lys Asn 50 55 60 Thr Ala Asp Xaa Val Ala Val Glu Ala Met Arg Glu Arg Met Asn Xaa 65 70 75 80 Ile His Met Arg Gly Arg Ile Val Ile Gly Glu Gly Glu Arg Asp Xaa 85 90 95 Ala Pro Met Leu Tyr Ile Gly Glu Glu Val Gly Ile Cys Thr Xaa Xaa 100 105 110 Asp Ala Lys Xaa Xaa Cys Asn Pro Asp Glu Leu Val Glu Ile Asp Ile 115 120 125 Ala Val Asp Pro Cys Glu Gly Thr Asn Leu Val Ala Tyr Gly Gln Asn 130 135 140 Gly Ser Met Ala Val Leu Ala Ile Ser Glu Lys Gly Gly Leu Phe Ala 145 150 155 160 Ala Pro Asp Phe Tyr Met Lys Lys Leu Ala Ala Pro Pro Ala Ala Lys 165 170 175 Gly His Val Asp Ile Xaa Lys Ser Ala Thr Glu Asn Leu Lys Xaa Leu 180 185 190 Ser Asp Cys Leu Asn Arg Ser Ile Glu Glu Leu Val Val Val Val Met 195 200 205 Asp Arg Pro Arg His Lys Glu Leu Ile Gln Glu Ile Arg Asn Ala Gly 210 215 220 Ala Arg Val Arg Leu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ser Ala Ala Ile Ser 225 230 235 240 Cys Ala Phe Ser Gly Thr Asn Ile His Ala Leu Met Gly Ile Gly Ala 245 250 255 Ala Pro Glu Gly Val Ile Ser Ala Ala Ala Met Arg Cys Leu Gly Gly 260 265 270 His Phe Gln Gly Gln Leu Ile Tyr Asp Pro Glu Val Val Lys Thr Gly 275 280 285 Leu Ile Gly Glu Ser Arg Glu Gly Asn Leu Xaa Arg Leu Xaa Xaa Met 290 295 300 Gly Ile Xaa Asn Pro Asp Xaa Val Tyr Xaa Cys Glu Glu Leu Ala Xaa 305 310 315 320 Gly Glu Thr Val Leu Phe Ala Ala Cys Gly Ile Thr Pro Gly Thr Leu 325 330 335 Met Glu Gly Val Arg Phe Phe His Gly Gly Xaa Arg Thr Gln Ser Leu 340 345 350 Val Ile Ser Xaa Gln Ser Xaa Thr Ala Arg Phe Val Asp Thr Val His 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Lys Xaa Ile Gln Leu Xaa 370 375 <210> 100 <211> 750 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = T,A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = H,S,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = X,V,S <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = X,A,L <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = X,A,T <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = X,A,L <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = X,H,Q <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = T,I,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = M,I,L,F <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = A,S,T <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = X,R,P <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = X,S,A <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa = V,L,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = A,P,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = X,R,P,H,L <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = A,H,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> Xaa = X,A,S <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = X,A,S,E,D <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> Xaa = X,G,S,N,Q <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa = S,C,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = R,X,A,S,V,G,I <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = M,A,C,Q,S <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = P,S,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = T,A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = P,I,X <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Xaa = I,A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = P,S,F,I,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = T,X,L,S,P <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Xaa = T,E,A,S <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = F,R,X <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Xaa = X,L,S <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Xaa = X,G,A <220> <221> VARIANT <222> 39 <223> Xaa = X,F,L <220> <221> VARIANT <222> 40 <223> Xaa = A,R,K, or none <220> <221> VARIANT <222> 41 <223> Xaa = S,R,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 42 <223> Xaa = S,L,N,T <220> <221> VARIANT <222> 43 <223> Xaa = V,G,S,P,F <220> <221> VARIANT <222> 44 <223> Xaa = A,S,L,N,F,P <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = S,P,A,I,T,R <220> <221> VARIANT <222> 46 <223> Xaa = G,A,T,S <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = H,G,R,T,S <220> <221> VARIANT <222> 48 <223> Xaa = G,X,A <220> <221> VARIANT <222> 49 <223> Xaa = L,T,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = L,I,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 51 <223> Xaa = L,R,S,H <220> <221> VARIANT <222> 52 <223> Xaa = V,S,L,R <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = R,A,P <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = G,R,S,I,N <220> <221> VARIANT <222> 55 <223> Xaa = R,T,L,A <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = R,A,P,N,Q <220> <221> VARIANT <222> 57 <223> Xaa = S,Q,A <220> <221> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = T,L,A,S,M <220> <221> VARIANT <222> 59 <223> Xaa = R,A,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 60 <223> Xaa = A,S,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = A,S,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = R,S,A,K,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 63 <223> Xaa = A,X,S,N,L <220> <221> VARIANT <222> 64 <223> Xaa = L,A,S,V,X,H,R <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = S,R,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L, or none <220> <221> VARIANT <222> 67 <223> Xaa = G,R,Q,L,I <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = T,R,S,H <220> <221> VARIANT <222> 69 <223> Xaa = P,H,N,F <220> <221> VARIANT <222> 70 <223> Xaa = G,R,A,S,L <220> <221> VARIANT <222> 71 <223> Xaa = G,V,I <220> <221> VARIANT <222> 72 <223> Xaa = R,V <220> <221> VARIANT <222> 73 <223> Xaa = X,R,A <220> <221> VARIANT <222> 74 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 75 <223> Xaa = G,A,S <220> <221> VARIANT <222> 76 <223> Xaa = T,A,S <220> <221> VARIANT <222> 77 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 78 <223> Xaa = I,E,T,V <220> <221> VARIANT <222> 79 <223> Xaa = H,T,E,A <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = S,L,V,T,I <220> <221> VARIANT <222> 81 <223> Xaa = S,Q,X <220> <221> VARIANT <222> 82 <223> Xaa = R,G,I,L,V,E <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = Q,K,E,T,P <220> <221> VARIANT <222> 84 <223> Xaa = P,A,K,S,T <220> <221> VARIANT <222> 85 <223> Xaa = A,T,S <220> <221> VARIANT <222> 86 <223> Xaa = A,T,E,D <220> <221> VARIANT <222> 87 <223> Xaa = A,G,T,S <220> <221> VARIANT <222> 88 <223> Xaa = E,A,S <220> <221> VARIANT <222> 89 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 90 <223> Xaa = V,L,I <220> <221> VARIANT <222> 91 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = Q,K <220> <221> VARIANT <222> 96 <223> Xaa = T,S <220> <221> VARIANT <222> 102 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 109 <223> Xaa = N,K <220> <221> VARIANT <222> 122 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 123 <223> Xaa = G,S,A <220> <221> VARIANT <222> 125 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 127 <223> Xaa = F,Y <220> <221> VARIANT <222> 130 <223> Xaa = F,V <220> <221> VARIANT <222> 131 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 132 <223> Xaa = R,K <220> <221> VARIANT <222> 133 <223> Xaa = F,Y <220> <221> VARIANT <222> 136 <223> Xaa = R,K <220> <221> VARIANT <222> 139 <223> Xaa = G,Y <220> <221> VARIANT <222> 142 <223> Xaa = D,N <220> <221> VARIANT <222> 157 <223> Xaa = Q,L <220> <221> VARIANT <222> 167 <223> Xaa = P,D <220> <221> VARIANT <222> 168 <223> Xaa = G,S,A <220> <221> VARIANT <222> 170 <223> Xaa = T,K,R,Q,L <220> <221> VARIANT <222> 171 <223> Xaa = M,E <220> <221> VARIANT <222> 172 <223> Xaa = D,E,A <220> <221> VARIANT <222> 176 <223> Xaa = A,Q,S <220> <221> VARIANT <222> 183 <223> Xaa = R,S,K <220> <221> VARIANT <222> 184 <223> Xaa = T,I <220> <221> VARIANT <222> 196 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 198 <223> Xaa = V,A <220> <221> VARIANT <222> 207 <223> Xaa = F,I <220> <221> VARIANT <222> 215 <223> Xaa = L,V <220> <221> VARIANT <222> 216 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 229 <223> Xaa = L,S,A,N <220> <221> VARIANT <222> 230 <223> Xaa = C,E <220> <221> VARIANT <222> 231 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 238 <223> Xaa = V,C,S,A <220> <221> VARIANT <222> 239 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 240 <223> Xaa = L,V <220> <221> VARIANT <222> 249 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 250 <223> Xaa = V,A,S <220> <221> VARIANT <222> 251 <223> Xaa = N,Q <220> <221> VARIANT <222> 253 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 254 <223> Xaa = S,C,A <220> <221> VARIANT <222> 279 <223> Xaa = S,D <220> <221> VARIANT <222> 281 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 285 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 287 <223> Xaa = N,D,S <220> <221> VARIANT <222> 289 <223> Xaa = L,X,S,G,D <220> <221> VARIANT <222> 290 <223> Xaa = A,X,T,K,Q <220> <221> VARIANT <222> 291 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 292 <223> Xaa = Y,X,F <220> <221> VARIANT <222> 293 <223> Xaa = E, or none <220> <221> VARIANT <222> 294 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 295 <223> Xaa = L, or none <220> <221> VARIANT <222> 296 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 297 <223> Xaa = W, or none <220> <221> VARIANT <222> 298 <223> Xaa = H, or none <220> <221> VARIANT <222> 299 <223> Xaa = T,X,V <220> <221> VARIANT <222> 300 <223> Xaa = V,X,I <220> <221> VARIANT <222> 301 <223> Xaa = W, or none <220> <221> VARIANT <222> 302 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 303 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 304 <223> Xaa = N, or none <220> <221> VARIANT <222> 305 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 306 <223> Xaa = N, or none <220> <221> VARIANT <222> 307 <223> Xaa = S,X,D,T,N <220> <221> VARIANT <222> 308 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 309 <223> Xaa = Y, or none <220> <221> VARIANT <222> 310 <223> Xaa = D, or none <220> <221> VARIANT <222> 311 <223> Xaa = D,X,E <220> <221> VARIANT <222> 312 <223> Xaa = I, or none <220> <221> VARIANT <222> 313 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 314 <223> Xaa = A,X,K <220> <221> VARIANT <222> 315 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 316 <223> Xaa = I, or none <220> <221> VARIANT <222> 317 <223> Xaa = K,Q,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 318 <223> Xaa = E, or none <220> <221> VARIANT <222> 319 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 320 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 321 <223> Xaa = E,X,S,T,A <220> <221> VARIANT <222> 322 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 323 <223> Xaa = K,X,T <220> <221> VARIANT <222> 324 <223> Xaa = D, or none <220> <221> VARIANT <222> 325 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 326 <223> Xaa = P, or none <220> <221> VARIANT <222> 327 <223> Xaa = S,X,T <220> <221> VARIANT <222> 328 <223> Xaa = L,X,M <220> <221> VARIANT <222> 329 <223> Xaa = I, or none <220> <221> VARIANT <222> 330 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 331 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 337 <223> Xaa = Y,F <220> <221> VARIANT <222> 344 <223> Xaa = S,N <220> <221> VARIANT <222> 345 <223> Xaa = T,S <220> <221> VARIANT <222> 346 <223> Xaa = H,Y <220> <221> VARIANT <222> 351 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 355 <223> Xaa = P,A,T,E <220> <221> VARIANT <222> 356 <223> Xaa = K,N <220> <221> VARIANT <222> 363 <223> Xaa = N,Q,S <220> <221> VARIANT <222> 366 <223> Xaa = L,G <220> <221> VARIANT <222> 368 <223> Xaa = L,P <220> <221> VARIANT <222> 369 <223> Xaa = H,Y <220> <221> VARIANT <222> 370 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 371 <223> Xaa = P,T <220> <221> VARIANT <222> 373 <223> Xaa = H,F,Q <220> <221> VARIANT <222> 376 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 377 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 380 <223> Xaa = R,S <220> <221> VARIANT <222> 383 <223> Xaa = G,S <220> <221> VARIANT <222> 384 <223> Xaa = H,R <220> <221> VARIANT <222> 386 <223> Xaa = I,T,V <220> <221> VARIANT <222> 387 <223> Xaa = D,P,T <220> <221> VARIANT <222> 390 <223> Xaa = A,K <220> <221> VARIANT <222> 391 <223> Xaa = S,A,T <220> <221> VARIANT <222> 394 <223> Xaa = A,T,S <220> <221> VARIANT <222> 395 <223> Xaa = E,D,G <220> <221> VARIANT <222> 397 <223> Xaa = N,S <220> <221> VARIANT <222> 398 <223> Xaa = A,S,T <220> <221> VARIANT <222> 399 <223> Xaa = K,M,T <220> <221> VARIANT <222> 401 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 402 <223> Xaa = E,Q,A <220> <221> VARIANT <222> 408 <223> Xaa = H,A,P <220> <221> VARIANT <222> 409 <223> Xaa = Q,D,E <220> <221> VARIANT <222> 410 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 412 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 413 <223> Xaa = E,T,A,D <220> <221> VARIANT <222> 415 <223> Xaa = N,K <220> <221> VARIANT <222> 418 <223> Xaa = I,T <220> <221> VARIANT <222> 419 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 423 <223> Xaa = H,P <220> <221> VARIANT <222> 424 <223> Xaa = A,T,V <220> <221> VARIANT <222> 427 <223> Xaa = D,V,A,E <220> <221> VARIANT <222> 428 <223> Xaa = K,D <220> <221> VARIANT <222> 432 <223> Xaa = T,K,Q <220> <221> VARIANT <222> 435 <223> Xaa = P,T <220> <221> VARIANT <222> 436 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 439 <223> Xaa = A,G <220> <221> VARIANT <222> 445 <223> Xaa = I,L <220> <221> VARIANT <222> 449 <223> Xaa = C,N <220> <221> VARIANT <222> 453 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 454 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 455 <223> Xaa = K,N <220> <221> VARIANT <222> 456 <223> Xaa = V,A <220> <221> VARIANT <222> 457 <223> Xaa = I,V,L <220> <221> VARIANT <222> 460 <223> Xaa = F,L <220> <221> VARIANT <222> 461 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 474 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 475 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 477 <223> Xaa = M,A <220> <221> VARIANT <222> 478 <223> Xaa = F,S <220> <221> VARIANT <222> 480 <223> Xaa = D,N <220> <221> VARIANT <222> 484 <223> Xaa = D,N,A <220> <221> VARIANT <222> 486 <223> Xaa = P,A <220> <221> VARIANT <222> 487 <223> Xaa = Q,E <220> <221> VARIANT <222> 491 <223> Xaa = I,V,L <220> <221> VARIANT <222> 499 <223> Xaa = A,G <220> <221> VARIANT <222> 506 <223> Xaa = A,G <220> <221> VARIANT <222> 508 <223> Xaa = A,G <220> <221> VARIANT <222> 511 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 512 <223> Xaa = P,L <220> <221> VARIANT <222> 514 <223> Xaa = L,F <220> <221> VARIANT <222> 515 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 519 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 530 <223> Xaa = A,G <220> <221> VARIANT <222> 531 <223> Xaa = P,A <220> <221> VARIANT <222> 532 <223> Xaa = I,M <220> <221> VARIANT <222> 534 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 538 <223> Xaa = C,S <220> <221> VARIANT <222> 539 <223> Xaa = G,E <220> <221> VARIANT <222> 540 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 563 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 565 <223> Xaa = Q,H <220> <221> VARIANT <222> 566 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 567 <223> Xaa = F,V,A,S <220> <221> VARIANT <222> 569 <223> Xaa = L,F <220> <221> VARIANT <222> 575 <223> Xaa = I,M,T <220> <221> VARIANT <222> 576 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 577 <223> Xaa = V,M <220> <221> VARIANT <222> 578 <223> Xaa = L,F <220> <221> VARIANT <222> 584 <223> Xaa = N,K <220> <221> VARIANT <222> 587 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 588 <223> Xaa = A,G <220> <221> VARIANT <222> 591 <223> Xaa = R,K <220> <221> VARIANT <222> 592 <223> Xaa = T,V,I <220> <221> VARIANT <222> 595 <223> Xaa = V,L,T <220> <221> VARIANT <222> 596 <223> Xaa = N,K <220> <221> VARIANT <222> 597 <223> Xaa = R,W <220> <221> VARIANT <222> 598 <223> Xaa = Q,K <220> <221> VARIANT <222> 599 <223> Xaa = R,T <220> <221> VARIANT <222> 602 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 605 <223> Xaa = F,L <220> <221> VARIANT <222> 612 <223> Xaa = Q,H <220> <221> VARIANT <222> 614 <223> Xaa = A,P <220> <221> VARIANT <222> 616 <223> Xaa = T,S <220> <221> VARIANT <222> 618 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 620 <223> Xaa = G,S <220> <221> VARIANT <222> 621 <223> Xaa = V,A <220> <221> VARIANT <222> 622 <223> Xaa = A,E <220> <221> VARIANT <222> 627 <223> Xaa = I,T <220> <221> VARIANT <222> 628 <223> Xaa = I,L,V <220> <221> VARIANT <222> 631 <223> Xaa = N,D <220> <221> VARIANT <222> 633 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 639 <223> Xaa = L,F,V <220> <221> VARIANT <222> 641 <223> Xaa = L,V,I <220> <221> VARIANT <222> 642 <223> Xaa = I,M <220> <221> VARIANT <222> 643 <223> Xaa = G,S <220> <221> VARIANT <222> 652 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 653 <223> Xaa = K,Q <220> <221> VARIANT <222> 656 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 657 <223> Xaa = D,E,K,V <220> <221> VARIANT <222> 658 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 659 <223> Xaa = R,T,K <220> <221> VARIANT <222> 660 <223> Xaa = K,E <220> <221> VARIANT <222> 661 <223> Xaa = E,Q,D <220> <221> VARIANT <222> 664 <223> Xaa = T,A,S <220> <221> VARIANT <222> 670 <223> Xaa = L,F <220> <221> VARIANT <222> 672 <223> Xaa = C,S <220> <221> VARIANT <222> 676 <223> Xaa = F,Y <220> <221> VARIANT <222> 677 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 678 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 680 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 681 <223> Xaa = E,D,A <220> <221> VARIANT <222> 682 <223> Xaa = E,D,A <220> <221> VARIANT <222> 685 <223> Xaa = D,E <220> <221> VARIANT <222> 690 <223> Xaa = S,A,E <220> <221> VARIANT <222> 691 <223> Xaa = E,A,S,D,G <220> <221> VARIANT <222> 693 <223> Xaa = T,S <220> <221> VARIANT <222> 694 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 696 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 701 <223> Xaa = G,A <220> <221> VARIANT <222> 702 <223> Xaa = V,S <220> <221> VARIANT <222> 704 <223> Xaa = L,F <220> <221> VARIANT <222> 707 <223> Xaa = E,Q,G <220> <221> VARIANT <222> 709 <223> Xaa = Y,F,I <220> <221> VARIANT <222> 710 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 712 <223> Xaa = Q,A,S,D,G <220> <221> VARIANT <222> 713 <223> Xaa = K,Q <220> <221> VARIANT <222> 716 <223> Xaa = A,T,S <220> <221> VARIANT <222> 719 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 720 <223> Xaa = D,N <220> <221> VARIANT <222> 721 <223> Xaa = R,K,G,T,S <220> <221> VARIANT <222> 722 <223> Xaa = F,W <220> <221> VARIANT <222> 724 <223> Xaa = S,A <220> <221> VARIANT <222> 729 <223> Xaa = G,D,P <220> <221> VARIANT <222> 730 <223> Xaa = K,T,I,L <220> <221> VARIANT <222> 731 <223> Xaa = I,L <220> <221> VARIANT <222> 735 <223> Xaa = L,Y,F <220> <221> VARIANT <222> 737 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 739 <223> Xaa = V,A,I <220> <221> VARIANT <222> 741 <223> Xaa = H,S,A <220> <221> VARIANT <222> 742 <223> Xaa = I,V,M <220> <221> VARIANT <222> 743 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 744 <223> Xaa = A,E,D <220> <221> VARIANT <222> 745 <223> Xaa = T,A <220> <221> VARIANT <222> 748 <223> Xaa = S,Q <220> <221> VARIANT <222> 749 <223> Xaa = I,F,L,V <220> <221> VARIANT <222> 750 <223> Xaa = S,I,F, or none <400> 100 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Val Asn Xaa 85 90 95 Ile Arg Phe Leu Ala Xaa Asp Ala Val Glu Lys Ala Xaa Ser Gly His 100 105 110 Pro Gly Leu Pro Met Gly Cys Ala Pro Xaa Xaa His Xaa Leu Xaa Asp 115 120 125 Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Pro Xaa Asn Pro Xaa Trp Phe Xaa Arg Asp 130 135 140 Arg Phe Val Leu Ser Ala Gly His Gly Cys Met Leu Xaa Tyr Ala Leu 145 150 155 160 Leu His Leu Ala Gly Tyr Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Asp Leu Lys Xaa 165 170 175 Phe Arg Gln Trp Gly Ser Xaa Xaa Pro Gly His Pro Glu Asn Phe Glu 180 185 190 Thr Pro Gly Xaa Glu Xaa Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Xaa Ala 195 200 205 Asn Ala Val Gly Leu Ala Xaa Xaa Glu Lys His Leu Ala Ala Arg Phe 210 215 220 Asn Lys Pro Asp Xaa Xaa Xaa Val Asp His Tyr Thr Tyr Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Gly Asp Gly Cys Gln Met Glu Gly Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Ser Leu 245 250 255 Ala Gly His Trp Gly Leu Gly Lys Leu Ile Ala Phe Tyr Asp Asp Asn 260 265 270 His Ile Ser Ile Asp Gly Xaa Thr Xaa Ile Ala Phe Xaa Glu Xaa Val 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Thr Ile Gly 325 330 335 Xaa Gly Ser Pro Asn Lys Ala Xaa Xaa Xaa Ser Val His Gly Xaa Ala 340 345 350 Leu Gly Xaa Xaa Glu Val Glu Ala Thr Arg Xaa Asn Leu Xaa Trp Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Val Pro Xaa Xaa Val Lys Xaa His Trp Xaa Xaa 370 375 380 His Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Leu Glu Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Phe 385 390 395 400 Xaa Xaa Tyr Glu Lys Lys Tyr Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Leu Xaa Ser 405 410 415 Ile Xaa Xaa Gly Glu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa Ala Leu Pro Xaa 420 425 430 Tyr Thr Xaa Xaa Ser Pro Xaa Asp Ala Thr Arg Asn Xaa Ser Gln Gln 435 440 445 Xaa Leu Asn Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa Xaa Gly Gly Ser 450 455 460 Ala Asp Leu Ala Ser Ser Asn Met Thr Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Gly Xaa 465 470 475 480 Phe Gln Lys Xaa Thr Xaa Xaa Glu Arg Asn Xaa Arg Phe Gly Val Arg 485 490 495 Glu His Xaa Met Gly Ala Ile Cys Asn Xaa Ile Xaa Leu His Xaa Xaa 500 505 510 Gly Xaa Xaa Pro Tyr Cys Xaa Thr Phe Phe Val Phe Thr Asp Tyr Met 515 520 525 Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Ala Leu Xaa Xaa Xaa Gly Val Ile Tyr 530 535 540 Val Met Thr His Asp Ser Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His 545 550 555 560 Gln Pro Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Arg Ala Met Pro Asn Xaa Xaa 565 570 575 Xaa Xaa Arg Pro Ala Asp Gly Xaa Glu Thr Xaa Xaa Ala Tyr Xaa Xaa 580 585 590 Ala Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ser Xaa Leu Ala Xaa Ser Arg Gln 595 600 605 Lys Leu Pro Xaa Leu Xaa Gly Xaa Ser Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Lys Gly 610 615 620 Gly Tyr Xaa Xaa Ser Asp Xaa Ser Xaa Gly Asn Lys Pro Asp Xaa Ile 625 630 635 640 Xaa Xaa Xaa Thr Gly Ser Glu Leu Glu Ile Ala Xaa Xaa Ala Ala Xaa 645 650 655 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys Xaa Val Arg Val Val Ser Xaa Val Xaa 660 665 670 Trp Glu Leu Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Xaa Ser Val Leu 675 680 685 Pro Xaa Xaa Val Xaa Xaa Arg Xaa Ser Ile Glu Ala Xaa Xaa Thr Xaa 690 695 700 Gly Trp Xaa Lys Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Lys Xaa Ile Gly Xaa Xaa 705 710 715 720 Xaa Xaa Gly Xaa Ser Ala Pro Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Glu Xaa Gly 725 730 735 Xaa Thr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Lys Xaa Xaa Xaa 740 745 750 <210> 101 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = M,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = A,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = T,A,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = A,S,P,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = L,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = T,P,H, or none <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = S,A,T,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = N,T, or none <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = P,Q,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = T,L,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = Q,R,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = L,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = C,Y,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa = S,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = A,S,T,P,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = K,R,L,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = N,A,L,T,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = G,S,P,M, or none <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> Xaa = M,V,S,L,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = A,F,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> Xaa = M,S,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa = L,P,M,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = S,K,R,Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = R,A,G,C, or none <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = R,L,M, or none <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = V,L,F <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Xaa = A,G,C,V,L <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = A,K <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = P,R <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Xaa = A,I,V,T,M <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = K,R <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Xaa = A,G,M,T,R,I <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Xaa = S,L,N,Q <220> <221> VARIANT <222> 39 <223> Xaa = A,G,H,M,S <220> <221> VARIANT <222> 40 <223> Xaa = I,S,L,F,Q,M,H <220> <221> VARIANT <222> 41 <223> Xaa = F,M,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 42 <223> Xaa = G,S,A,V,M,L, or none <220> <221> VARIANT <222> 43 <223> Xaa = R,M,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 44 <223> Xaa = E,G,K, or none <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = K,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 46 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E, or none <220> <221> VARIANT <222> 48 <223> Xaa = K,E,V,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 49 <223> Xaa = Q,P,E,K,D, or none <220> <221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = S,R,K,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 51 <223> Xaa = R,G,A,T,N,I,K <220> <221> VARIANT <222> 52 <223> Xaa = R,G,Q,A,I <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = S,G,R,T,L,M <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = R,L,S,T,C,K <220> <221> VARIANT <222> 55 <223> Xaa = V,I,M <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = M,R,V,T,S,A,K, or none <220> <221> VARIANT <222> 57 <223> Xaa = P,C, or none <220> <221> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = V,Q,M, or none <220> <221> VARIANT <222> 59 <223> Xaa = V,A, or none <220> <221> VARIANT <222> 60 <223> Xaa = R,T,A,S <220> <221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = A,S,G <220> <221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = A,S,I <220> <221> VARIANT <222> 63 <223> Xaa = A,I,P <220> <221> VARIANT <222> 64 <223> Xaa = A,P,S <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = S,A,D, or none <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S,D <220> <221> VARIANT <222> 67 <223> Xaa = E,R,N <220> <221> VARIANT <222> 72 <223> Xaa = N,G,E,S <220> <221> VARIANT <222> 75 <223> Xaa = N,Q,K,E <220> <221> VARIANT <222> 76 <223> Xaa = I,L,T <220> <221> VARIANT <222> 77 <223> Xaa = M,L <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = I,L <220> <221> VARIANT <222> 82 <223> Xaa = A,L,V <220> <221> VARIANT <222> 84 <223> Xaa = G,A <220> <221> VARIANT <222> 85 <223> Xaa = A,V,I,L <220> <221> VARIANT <222> 86 <223> Xaa = G,S,A <220> <221> VARIANT <222> 89 <223> Xaa = I,T,S <220> <221> VARIANT <222> 90 <223> Xaa = T,A,V,F,G <220> <221> VARIANT <222> 91 <223> Xaa = T,I,G,Y,F <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = L,M <220> <221> VARIANT <222> 93 <223> Xaa = A,L,V <220> <221> VARIANT <222> 94 <223> Xaa = L,V,I <220> <221> VARIANT <222> 95 <223> Xaa = G,P <220> <221> VARIANT <222> 97 <223> Xaa = G,A,T <220> <221> VARIANT <222> 98 <223> Xaa = A,S,T,Y <220> <221> VARIANT <222> 100 <223> Xaa = F,L <220> <221> VARIANT <222> 101 <223> Xaa = V,I,A <220> <221> VARIANT <222> 103 <223> Xaa = P,A <220> <221> VARIANT <222> 104 <223> Xaa = S,G <220> <221> VARIANT <222> 105 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 107 <223> Xaa = G,N,S <220> <221> VARIANT <222> 108 <223> Xaa = G,A,N,S <220> <221> VARIANT <222> 109 <223> Xaa = G,A,T,S <220> <221> VARIANT <222> 110 <223> Xaa = G,S <220> <221> VARIANT <222> 112 <223> Xaa = Q,T,V <220> <221> VARIANT <222> 113 <223> Xaa = A,Y,V,P <220> <221> VARIANT <222> 117 <223> Xaa = A,K <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa = L,V,N <220> <221> VARIANT <222> 122 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 123 <223> Xaa = K,I,T,L,V <220> <221> VARIANT <222> 124 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 125 <223> Xaa = G,S,E,A,T <220> <221> VARIANT <222> 126 <223> Xaa = E,A,D,N <220> <221> VARIANT <222> 128 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 129 <223> Xaa = K,N <220> <221> VARIANT <222> 130 <223> Xaa = T,K,A <220> <221> VARIANT <222> 132 <223> Xaa = L,G,A,P <220> <221> VARIANT <222> 133 <223> Xaa = A,P <220> <221> VARIANT <222> 134 <223> Xaa = G,N <220> <221> VARIANT <222> 135 <223> Xaa = D,T,N <220> <221> VARIANT <222> 137 <223> Xaa = S,T <220> <221> VARIANT <222> 139 <223> Xaa = S,T,A <220> <221> VARIANT <222> 150 <223> Xaa = I,V <220> <221> VARIANT <222> 152 <223> Xaa = T,E <220> <221> VARIANT <222> 153 <223> Xaa = A,Q,S,N,K <220> <221> VARIANT <222> 155 <223> Xaa = S,R,K,G <220> <221> VARIANT <222> 157 <223> Xaa = I,L <220> <221> VARIANT <222> 158 <223> Xaa = E,A <220> <221> VARIANT <222> 159 <223> Xaa = K,T <220> <221> VARIANT <222> 161 <223> Xaa = G,A <220> <221> VARIANT <222> 162 <223> Xaa = L,I <220> <221> VARIANT <222> 175 <223> Xaa = W,F <220> <221> VARIANT <222> 176 <223> Xaa = V,N <220> <221> VARIANT <222> 177 <223> Xaa = A,K,G,T,Q <220> <221> VARIANT <222> 183 <223> Xaa = K,I,L <220> <221> VARIANT <222> 190 <223> Xaa = Q,R <220> <221> VARIANT <222> 193 <223> Xaa = A,N,D <220> <221> VARIANT <222> 194 <223> Xaa = E,Q <220> <221> VARIANT <222> 196 <223> Xaa = K,R <220> <221> VARIANT <222> 209 <223> Xaa = A,V <220> <221> VARIANT <222> 211 <223> Xaa = C,A <220> <221> VARIANT <222> 213 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 214 <223> Xaa = A,D <220> <221> VARIANT <222> 215 <223> Xaa = E,D <220> <221> VARIANT <222> 216 <223> Xaa = S,A,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 218 <223> Xaa = L,K <220> <221> VARIANT <222> 220 <223> Xaa = T,L,V <220> <221> VARIANT <222> 222 <223> Xaa = S,V <220> <221> VARIANT <222> 223 <223> Xaa = T,P <220> <221> VARIANT <222> 225 <223> Xaa = T,V <220> <221> VARIANT <222> 233 <223> Xaa = L,E,D <220> <221> VARIANT <222> 234 <223> Xaa = E,D,N,A <220> <221> VARIANT <222> 238 <223> Xaa = A,T,K,S <220> <221> VARIANT <222> 239 <223> Xaa = A, or none <400> 101 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Val Pro Asp Met Xaa Lys Arg Xaa Xaa Xaa Asn Leu Xaa 65 70 75 80 Leu Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Leu Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 85 90 95 Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 100 105 110 Xaa Ala Lys Asp Xaa Xaa Gly Asn Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa 115 120 125 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Leu Xaa Gln Gly Leu Lys Gly 130 135 140 Asp Pro Thr Tyr Leu Xaa Val Xaa Xaa Asp Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Tyr 145 150 155 160 Xaa Xaa Asn Ala Val Cys Thr His Leu Gly Cys Val Val Pro Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Ala Glu Asn Lys Phe Xaa Cys Pro Cys His Gly Ser Xaa Tyr Asn 180 185 190 Xaa Xaa Gly Xaa Val Val Arg Gly Pro Ala Pro Leu Ser Leu Ala Leu 195 200 205 Xaa His Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Val Xaa Phe Xaa Xaa Trp 210 215 220 Xaa Glu Thr Asp Phe Arg Thr Gly Xaa Xaa Pro Trp Trp Xaa Xaa 225 230 235 <210> 102 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = M, or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = F, or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = M,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = L,F,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Q,H,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = L,Y,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = A,K,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = N, or none <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = Q, or none <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> Xaa = V, or none <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa = S, or none <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = C, or none <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = A, or none <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = K, or none <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Xaa = R, or none <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = G,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = A,R,E, or none <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Xaa = D,M,R,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = V,M,K,Y, or none <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Xaa = A,K,R,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Xaa = P,R,K,M,T,L,W,N,S, or none <220> <221> VARIANT <222> 39 <223> Xaa = L,F,S,E,Y,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 40 <223> Xaa = T,L,I,S,K,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 41 <223> Xaa = S,V,T,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 42 <223> Xaa = A,I,L,F,N,T,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 43 <223> Xaa = L,V,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 44 <223> Xaa = T,A,V,I,G,K,R, or none <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = V,A,L,I,F,M,R,Y, or none <220> <221> VARIANT <222> 46 <223> Xaa = F,V,C,Y,T,L,I, or none <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = A,L,T,S,I,N,G, or none <220> <221> VARIANT <222> 48 <223> Xaa = V,L,F,Y,I,A,P,M, or none <220> <221> VARIANT <222> 49 <223> Xaa = T,A,F,C,L,I,V,M,Y,S <220> <221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = A,I,F,V,L,M <220> <221> VARIANT <222> 51 <223> Xaa = S,A,L,T,I,C,F,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 52 <223> Xaa = I,L,N,M,T,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = L,F,I,S,P, or none <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = L,T,S,F, or none <220> <221> VARIANT <222> 55 <223> Xaa = T,V,M,I,D,F,C,S <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = T,A,G,S,I,Y,N,C,Q,L <220> <221> VARIANT <222> 57 <223> Xaa = G,F,S,N,T,A,V <220> <221> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = A,V,S,T,I,G,F,P <220> <221> VARIANT <222> 59 <223> Xaa = A,P,S,Q,T,Y,N,V <220> <221> VARIANT <222> 60 <223> Xaa = S,P,I,V,Q,L,Y,N, or none <220> <221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = A,S,C,T,V, or none <220> <221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = S,F,L,Y,A,I,G,Q,M,V <220> <221> VARIANT <222> 64 <223> Xaa = A,G,S,F,V <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L,A,I <220> <221> VARIANT <222> 67 <223> Xaa = A,D,E,Q,G,N <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = L,N,S,A,H <220> <221> VARIANT <222> 70 <223> Xaa = A,S,E <220> <221> VARIANT <222> 71 <223> Xaa = Q,K,N,R <220> <221> VARIANT <222> 72 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 74 <223> Xaa = N,S,T <220> <221> VARIANT <222> 75 <223> Xaa = G,A <220> <221> VARIANT <222> 78 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 82 <223> Xaa = M,A,T <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = G,N <220> <221> VARIANT <222> 85 <223> Xaa = R,N <220> <221> VARIANT <222> 87 <223> Xaa = S,V,A <220> <221> VARIANT <222> 88 <223> Xaa = V,I <220> <221> VARIANT <222> 89 <223> Xaa = M,I <220> <221> VARIANT <222> 90 <223> Xaa = P,A <220> <221> VARIANT <222> 91 <223> Xaa = E,N,D <220> <221> VARIANT <222> 93 <223> Xaa = T,N <220> <221> VARIANT <222> 95 <223> Xaa = D,K,Q <220> <221> VARIANT <222> 96 <223> Xaa = K,S,G,Q <220> <221> VARIANT <222> 97 <223> Xaa = A,D,E <220> <221> VARIANT <222> 98 <223> Xaa = A,V,I,K <220> <221> VARIANT <222> 100 <223> Xaa = E,D,A,K,Q,S <220> <221> VARIANT <222> 101 <223> Xaa = Q,E,A,D,L,T,I <220> <221> VARIANT <222> 102 <223> Xaa = Y,N <220> <221> VARIANT <222> 103 <223> Xaa = L,A,G,S,N,Q <220> <221> VARIANT <222> 104 <223> Xaa = D, or none <220> <221> VARIANT <222> 105 <223> Xaa = G, or none <220> <221> VARIANT <222> 106 <223> Xaa = G,M <220> <221> VARIANT <222> 107 <223> Xaa = F,N,D <220> <221> VARIANT <222> 108 <223> Xaa = K,S,T,G,N <220> <221> VARIANT <222> 109 <223> Xaa = V,I,L <220> <221> VARIANT <222> 110 <223> Xaa = E,A,D,S,T,G,N <220> <221> VARIANT <222> 111 <223> Xaa = S,A,K <220> <221> VARIANT <222> 113 <223> Xaa = I,T <220> <221> VARIANT <222> 114 <223> Xaa = Y,A,T,N <220> <221> VARIANT <222> 117 <223> Xaa = E,T,Q,K <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa = N,K <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa = G,N <220> <221> VARIANT <222> 126 <223> Xaa = W,F <220> <221> VARIANT <222> 127 <223> Xaa = A,G <220> <221> VARIANT <222> 128 <223> Xaa = D,G <220> <221> VARIANT <222> 131 <223> Xaa = S,V,A,T,D <220> <221> VARIANT <222> 132 <223> Xaa = E,D,A <220> <221> VARIANT <222> 133 <223> Xaa = E,A,T,D,N,S <220> <221> VARIANT <222> 134 <223> Xaa = E,Q,D <220> <221> VARIANT <222> 136 <223> Xaa = Q,E,D <220> <221> VARIANT <222> 137 <223> Xaa = A,D,N <220> <221> VARIANT <222> 138 <223> Xaa = V,A <220> <221> VARIANT <222> 140 <223> Xaa = E,T,N,S,H <220> <221> VARIANT <222> 141 <223> Xaa = Y,F <220> <221> VARIANT <222> 143 <223> Xaa = F,L <220> <221> VARIANT <222> 144 <223> Xaa = K,E,A,S,T,N <220> <221> VARIANT <222> 145 <223> Xaa = Q,K <220> <221> VARIANT <222> 146 <223> Xaa = A,S <220> <221> VARIANT <222> 147 <223> Xaa = T,E,V <220> <221> VARIANT <222> 148 <223> Xaa = D, or none <220> <221> VARIANT <222> 149 <223> Xaa = A,K,Q,N <220> <221> VARIANT <222> 150 <223> Xaa = A,G,D,R <220> <221> VARIANT <222> 152 <223> Xaa = K,G,N,D, or none <220> <221> VARIANT <222> 153 <223> Xaa = Y, or none <400> 102 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa 50 55 60 Asp Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Asn Cys Xaa Ala Cys 65 70 75 80 His Xaa Xaa Gly Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Leu Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile 100 105 110 Xaa Xaa Gln Val Xaa Xaa Gly Lys Xaa Ala Met Pro Ala Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Arg Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Val Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa 145 150

Claims (20)

  1. 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포로서, 이때 이러한 식물, 이의 부분 또는 세포는 동일한 조건하에서 성장한 변형되지 않은 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포에 비해 캘빈 벤슨 회로 (CB) 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형은 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질의 과발현을 포함하고, 하나 이상의 광합성 전자 전달 단백질은 시토크롬 c6 단백질, Rieske FeS 단백질, 또는 시토크롬 c6 단백질과 Rieske FeS 단백질을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  3. 청구항 2에 있어서, 시토크롬 c6 단백질은 서열 번호: 102에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  4. 청구항 2에 있어서, Rieske FeS 단백질은 서열 번호: 101에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  5. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서, 시토크롬 c6 단백질은 유전자 변형된 식물의 세포 내 적어도 하나의 엽록체의 틸라코이드 루멘에 국재화되는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 시토크롬 c6 단백질은 시토크롬 c6 단백질을 틸라코이드 루멘에 국재화하는 전이 펩티드를 포함하고, 그리고 전이 펩티드는 엽록소 a/b 결합 단백질 6 전이 펩티드, 광-수확 복합체 I 엽록소 a/b 결합 단백질 1 전이 펩티드, 또는 플라스토시아닌 신호 펩티드를 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  7. 청구항 2 또는 청구항 4에 있어서, Rieske FeS 단백질은 유전자 변형된 식물의 세포 내 적어도 하나의 엽록체의 틸라코이드 막에 국재화되는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  8. 청구항 7에 있어서, Rieske FeS 단백질은 Rieske FeS 단백질을 틸라코이드 막에 국재화하는 전이 펩티드를 포함하고, 그리고 전이 펩티드는 시토크롬 f 전이 펩티드, 시토크롬 b6 전이 펩티드, PetD 전이 펩티드, PetG 전이 펩티드, PetL 전이 펩티드, PetN 전이 펩티드, PetM 전이 펩티드, 또는 플라스토퀴논 전이 펩티드를 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  9. 청구항 2-8 중 어느 한 항에 있어서, 시토크롬 c6 단백질 또는 Rieske FeS 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 식물 프로모터를 추가로 포함하고, 이때 이러한 식물 프로모터는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  10. 청구항 1-9 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형은 CB 단백질의 과발현을 포함하고, 그리고 CB 단백질은 세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제(SBPase), 프럭토스-1,6-비스포스페이트 알돌라제(FBPA), 클로로플라스틱 프럭토스-1,6-비스포스파타제(FBPase), 이작용기성 프럭토스-1,6-비스포스파타제/세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제(FBP/SBPase), 또는 트랜스케톨라제(TK)를 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  11. 청구항 10에 있어서, SBPase는 서열 번호: 96에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  12. 청구항 10에 있어서, FBPA는 서열 번호: 97에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  13. 청구항 10에 있어서, FBPase는 서열 번호: 98에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  14. 청구항 10에 있어서, FBP/SBPase는 서열 번호: 99에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  15. 청구항 10에 있어서, 트랜스케톨라제는 서열 번호: 100에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  16. 청구항 10-15 중 어느 한 항에 있어서, SBPase, FBPA, FBPase, FBP/SBPase, 또는 트랜스케톨라제는 유전자 변형된 식물의 세포 내 적어도 하나의 엽록체의 엽록체 기질에 국재화되고, 그리고 SBPase, FBPA, FBPase, FBP/SBPase, 또는 트랜스케톨라제는 SBPase, FBPA, FBPase, FBP/SBPase, 또는 트랜스케톨라제를 상기 식물의 엽록체 기질에 국재화하는 전이 펩티드를 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  17. 청구항 10-16 중 어느 한 항에 있어서, SBPase, FBPA, FBPase, FBP/SBPase, 또는 트랜스케톨라제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 식물 프로모터를 추가로 포함하고, 이때 식물 프로모터는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 유도성, 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함하는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  18. 청구항 1-17 중 어느 한 항에 있어서, 식물은 변형되지 않은 야생형 (WT) 식물에 비해 증가된 바이오매스를 가지는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  19. 청구항 1-18 중 어느 한 항에 있어서, 식물은 1000 mmol m-2 s-1 이상의 광도를 갖는 조건에서 재배될 때 변형되지 않은 WT 식물과 비교하여 개선된 물 사용 효율을 가지는, 유전자 변형된 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포.
  20. 청구항 1-19 중 어느 한 항의 유전자 변형된 식물을 생산하는, 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형, 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형, 또는 CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형 모두를 식물 세포, 조직, 또는 다른 외식편에 도입하는 단계;
    b) 상기 식물 세포, 조직, 또는 다른 외식편을 유전자 변형된 묘목으로 재생시키는 단계; 및
    c) 상기 유전자 변형된 묘목을, CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형, 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형, 또는 CB 단백질의 활성을 증가시키는 하나 이상의 RuBP 재생 향상 유전자 변형 및 하나 이상의 광합성 전자 전달 향상 유전자 변형 모두를 가지는 유전자 변형된 식물로 성장시키는 단계.
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