JPH07505531A - 単子葉植物細胞の形質転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 葉　の〉　ム　゛ 本発明は、単子葉植物、特にイネ科植物、特定的にはイネ、小麦、トウモロコシ 、大麦及びその他の主要な穀物の右壁細胞を形質転換するための迅速かつ効果的 な方法に関する。

本発明は同様に、この方法によって得ることができる新規なトランスジェニック 単子葉植物、特定的にはイネ科植物にも関する。

１肛の五旦 近年、植物の遺伝子工学の能力に多大な拡張が見られてきた。数多（の双子葉植 物種のトランスジェニック−植物が生産されてきている。しかしながら、多くの 植物種、特に単子葉植物に属し、特定的にはトウモロコシ、小麦及びイネのよう な経済的に重要な種を含むイネ科植物に属するものは、安定な遺伝子形質転換に とって非常に手に負えないものであることが立証されてきた。

遭遇した問題点は、主として、単子葉植物細胞の組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉ ｖｅ）形質転換（すなわち、植物細胞の核ゲノム内への外来性ＤＮＡの安定した 挿入）を、これらの形質転換された細胞からの稔性の成体植物の再生と組合わせ ることが不可能であるということにあった。このような問題点は、主に、１）Ｄ ＮＡの取込み、２）ゲノム内へのＤＮＡの組込み、及び３）再生能力に関して、 能力がある細胞の利用が不可能であるという事実によるものであった［Ｐｏｔｒ ｙｋｕｓ　１．　（＋９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：　５３５ ］　、安定な形質転換を評価するのに必要な基準に照らし合わせて、穀物を形質 転換するために使用されたさまざまな方法が見直された［Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ 。

（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　’４二　５３５；　Ｐｏｔｒｙ ｋｕｓ　（１９９１）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４２：　 ２０５　）　ａ一般に、　［ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理及び／又は 電気穿孔法による］プロトプラストへの直接的遺伝子トランスファーは、最も優 れた可能性を有していたと思われるが、それでもプロトプラストからの再生が大 部分の遺伝子型について達成し難いものであったという事実により妨げられてき た。実際には、プロトプラストは細胞浮遊培養から得られることが最も多かった （Ｌａｚｚｅｒｉ及びＬ６ｒｚ　（１９８８）、　ｒ細胞培養における進歩（Ａ ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　（：ｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）　Ｊ第６巻。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　ｐ２９１；　０ｚｉａｓ−Ａｋｉｎｓ及びＬ ６ｒｚ　（１９８４、Ｔｒｅｎｄｓ　ｊ、ｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｇ：　 １１９．Ｈｏｄｇｅｓら　（１９９１）　、ｒイネのバイオテクノロジー（Ｒｉ ｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　ｅｄ、　Ｋｈｕｓｈ及びＴｏｅｎｎ ｉｅｓｓｅｎ。

Ｃ，Ａ、　Ｂ、　、　’　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国、のｐ、　１５７ 　；　１．ｙｎｃｈら、（１９９１）　ｒイネのバイオテクノロジーＪ　ｅｄ、 　Ｋｈｕｓｈ及びＴｏｅｎｎｉｅｓｓｅｎ、　Ｃ，Ａ、Ｂ。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国、のｐ、　１３５）。

プロトプラストからの植物の再生は、一般に、さまざまな種について比較的少数 の遺伝子型に制限されたきたため、一般に有効なプロトプラストベースの手順を 開発するのは困難であった。従って、最近になって特にイネにおいてその他のア プローチが探究されてきた。

Ｌｅｅら（１９９１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳ Ａ　（ｒＰＮＡｓＪ　）　８８：６３８９は、イネ浮遊培養から得られる小さな イネの細胞群の、ＰＥＧを媒体とする形質転換について報告した。β−グルクロ ニダーゼをコードする遺伝子（ｌ旦互）及びネオマイシンホスホトランスフエラ ーゼ■をコードする遺伝子（ユ旦旦）で安定に形質転換された小植物を再生する ことができた。

Ｃｈｒｉｓｔｏｕら　（１９９１）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　旦：　９５ ７は、ＤＮＡでコーティングされた金粒子で胚を砲撃（ボンバード）することに よる未成熟の接合体胚の細胞の形質転換について報告した。ホスフィノトリシン （互互工）又はハイグロマイシン（江Ｌ１）のいずれかに対する耐性を付与する 遺伝子と共にｌ旦互遺伝子を含むトランスジェニックイネ植−物を再生すること ができた。導入された遺伝子は、その子孫において正常なメンデル比で分離する と報告された。

電気穿孔法を用いたインタクトな（無傷の）植物細胞内へのＤＮＡの導入、これ は往々にして電気注入と呼ばれているプロセスであり［Ｍｏｒｉｗａｋａら　（ １９８８）による総説を参照のこと、「農業におけるバイオテクノロジー（Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）　ＪＡｌａｎ　Ｒ， Ｌｉ、ｓｓ、　Ｉｎｃ、中、ｐｐ、１７５−　）　、　・−・−・−１旧−・− 旧、、、旧、、カルス）、そこから表現型が正常な（例λば稔性の）植物を、器 官形成又は好ましくは胚形成によって再生することができる。従って、結果とし て得られる本発明の形質転換された細胞は、カルスへと成長させることができ、 次いで、単数又は複数のＤＮＡフラグメント」二にある目的の単数又は複数の遺 伝子を安定に有し、発現する植物、好ましくは表現型が正常な植物を再生させる ことが可能である。このような再生された植物（特に大麦、イネ及び小麦）なら びにその子孫、その種子、及びその形質転換された細胞も、本発明の一部を成し ている。

光朋ｍ町社説朋 本発明の方法を実施するにあたり、細胞浮遊培養のようなその植物細胞壁の少な （とも一部分を有する浮遊させた植物細胞の培養は、従来の要領で単子葉植物か ら得ることができる（ＬＬら（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　 Ｒｅｐ、　旦：　２７６；　Ｗｅｎら（１９９１）、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、　９：　３０８：　Ｈｏｄｇｅｓら（１９９１）　ｒイネ のバイオテクノロジーＪ　ｅ−ｄ、　Ｋｈｕｓｈ及びＴｏｅｎｎｉｅｓｓｅｎ、 　Ｃ，Ａ、Ｂ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国、のｐ、１５７；　Ｙａｎ ｇら（１９９１）　Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１８： 　４４５；Ｒｅｄｗａｙら　（１９９０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒ ｔｓ　旦：　７１４；　Ｊｉｈｎｅ　ら　（１９９１１Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ 、　Ｇｅｎｅｔ、　８２：　７４；　Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）　 Ｔｈｅ　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　ｇ：　６０３；　Ｆｒｏｍｍら　（１９９０）　 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　旦：　８３３；　Ｒｈｏｄｅｓ　ら（１９８８ ）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　旦：　５６；　Ｖａｓｉｌ及びＶａｓｉｌ 　（１９８６）　Ｊ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１２４：　３９９；　Ｋａｎ＋ｏ及びＨｏｄｇ ｅｓ　（１９８６）　ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ　４５：　１１１　］。細胞浮 遊培養は、後に形質転換し培養してトランスジェニック植物を産生ずることがで きるプロトプラストを提供することを目的として標準的に生成されてきたことか ら、このような細胞培養を作るための手順は、一般に、再生可能な浮遊培養（す なわち、再生可能なカルスを得ることができる細胞浮遊培養）を樹立し維持する ことへと向けられてきた。しかしながら、穀物における再生は主として胚形成に よって起こることから、再生可能な（この場合、胚形成性の）カルスを得るもと どなる穀物の細胞浮遊培養は、一般に胚形成性の浮遊培養である。従って、以下 の記載及び例においては、本発明の方法は、主として出発物質としてイネなどの 穀物の胚形成性浮遊培養を参照して記載されている。しがしながら、本発明の方 法は、あらゆる単子葉植物種から得られる浮遊させた右壁細胞のあらゆる培養、 特定的には器官形成により再生可能なあらゆる細胞培養を含む再生可能な浮遊細 胞のあらゆる培養、ならびにこのような浮遊した右壁細胞培養を形成するのに使 用できる、右壁単子葉植物細胞に対して応用することができる。浮遊細胞の好ま しい培養は、細胞浮遊培養を樹立する間に従来の方法で得ることができ、初めは 浮遊させたカルス塊、そして後には漸進的により均質な液体培地中の浮遊細胞凝 集塊により特徴づけられる、さまざまなタイプの液体培養である。本発明の方法 は、初期の段階にも後期の段階にも同じように適用可能であ−るーが、浮遊細胞 の塊又は凝集塊の好ましい培養に関して以下に特定的に例示するものとする。

単子葉植物種（例えばイネ）の特定の系統の、浮遊細胞塊の培養又は細胞浮遊培 ！（例えば胚形成性浮遊培養）のような浮遊右壁細胞の培養が植物の再生に適し ているか否かは、好適な再生培地上に懸濁液から誘導された多数（すなわち１０ ０以上）の細胞凝集塊（又は好適な増殖培地上のこのような細胞凝集塊から誘導 されたカルス）をブレーティングし、凝集塊のどれだけの割合が表現型の正常な 稔性植物を生み出すかを決定することによって、決定することができる。正常な 稔性植物が、少な（とも約１０％、好ましくは少なくとも２５％、特定的には少 なくとも５０％の細胞凝集塊から得られる場合、その浮遊培養は、本発明の方法 を使用してトランスジェニック単子葉植物を得る目的のために適しているとみな すことができる。

本発明の胚形成性浮遊培養は、従来の手順により樹立し維持することができる。

胚形成性浮遊培養は、一般に、細胞型が均質で急速に成長するものとして描写す ることができる。これらは、液体（例えば水性）培地中で、数個から約２００個 の密に詰まった胚形成性細胞から成る、充分に分散した凝集塊で構成されている 。胚形成性細胞は、丸形又は卵形をし、活発に分裂し細胞質が豊富であり、脂質 小滴及びでんぷん粒を含んでいる可能性があり、少なくともその細胞壁の一部分 、好ましくはその全てを保持している。胚形成性細胞は、例えば２７〜３２時間 のような倍加時間を有する可能性があり、適切な培地上にブレーティング後、植 物を再生することができるもとどなる胚形成性カルスを生じることができる。一 定の与えられた再生可能な浮遊培養の特異的な外観及び特徴、例えば細胞クラス ターのサイズ、成長速度又は色、及び浮遊培養を樹立するのに必要とされる時間 は、使用する植物の種及び栽培品種、培地、及び物理的培養条件によって左右さ れる。細胞浮遊培養でない浮遊した細胞の培養（すなわち浮遊した細胞塊の培養 ）は、一般に、１）比較的サイズ（そして培養には比較的大きい細胞塊が多数台 まれている可能性さえある）及び細胞型が不均一であり、２）容易に分裂し、一 般に壊死の兆候（例えば褐変）を示さない細胞を含む、細胞凝集塊で実質的に構 成されることになる。胚形成性浮遊培養を樹立し維持するのに使用できる手順は 、これまでに記載されている：例えば、イネについて（Ｌｉら（１９９０）　Ｐ ｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、　ｆｉ：　２７６；Ｗｅｎ　ら　（ １９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、　９：　３０８；　 Ｈｏｄｇｅｓら　（１９９１）「イネのバイオクチノロジーＪ　ｅｄ、　Ｋｈｕ ｓｈ及びＴｏｅｎｎｉｅｓｓｅｎ。

Ｃ，Ａ、Ｂ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国、のｐ、１５７　］　、小麦に ついて（Ｙａｎｇら（１９９１）　Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ ｏｌ、　１８：　４４５；　Ｒｅｄｗａｙら（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ 　Ｒｅｐｏｒｔｓ　８：　７１４　）　、大麦について［Ｊｉｈｎｅら（１９９ １）Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　８２：　７４］及びトウモロコ シについて［Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍａ＋　ら　（１９９０）　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎ ｔ　Ｃｅ１ｌ　＠：　６０３：　Ｆｒｏｗｍら　（１９９０）　Ｂｉ。

／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８−：　８３３；　Ｒｈｏｄｅｓら　（１９８８）　 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：　５６；Ｖａｓｉｌ及びＶａｓｉｌ　（１ ９８６）　Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１２４：　３９９；　Ｋａｍ ｏ及びＨｏｄｇｅｓ　（１９８６）　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　４５：　１ １１　］。

同様に、本発明の浮遊した細胞、特定的には細胞塊の培養、特に再生可能な培養 を樹立するための一般的な手順は、当業者にとって周知のものである。実際、細 胞浮遊培養の樹立中に従来から使用される培地及び手順は、細胞浮遊培養をそれ らから得ることができるか否かとは無関係に、このような浮遊細胞の培養の樹立 に一般に使用することができる。事実、このような浮遊細胞の培養の樹立は、一 般に細胞浮遊培養の樹立よりも容易であると信じられている。

本発明の浮遊細胞の好適な培養を得ることができるもとどなるカルスを誘導する のに用いることができる外植体（ｅｘｐｌａｎｔｓ）は、よく知られている。例 えば、イネについては、このような外植体には、乾燥種子、未成熟の胚、若い葉 脚、未成熟の花序、巧、小胞子、節及び根（特に根端）が含まれるが、その他の 穀物については、上述の外植体のい（つかは効果的に使用できない。カルス、特 定的には再生可能なカルスの誘導のためには、未成熟の胚が好ましい外植体であ ると考えられている。しかしながら、当業者であれば、一般に、特定の植物種に ついて又は１つの植物種の中の特定の系統及び遺伝子型について使用するため、 既存の培地及び手順を修正及び最適化することができる、と考えられる。

本発明の目的においては、特に形質転換された細胞をトランスジェニック植物へ と再生させるべき場合、特にイネの細胞の浮遊物については、浮遊培養が比較的 若く、好ましくは約４カ月未満であり、特に３力月未満であることが好ましい。

かくして、以下で記載する−ように浮遊した細胞の電気穿孔を、浮遊培養の開始 後、４力月目以前、好ましくは３力月目以前に、実施することが往々にして好ま しい。同様に、胚形成性浮遊培養の細胞の大部分が、その培養が由来する植物種 にとって正常な染色体数を有することも好ましい。

この点に関して、このような細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少な（とも ７５％、特定的には８０％、きわめて特定的には９０％が正常な染色体数を有し ていることが好ましい、従って、このような細胞から再生される植物におけるあ らゆるツマクローナル（ｓｏｍａｃｌｏｎａｌ）変動及びその他の不利な効果を 著しく減少させるため、樹立された細胞浮遊培養よりもはるかに若いものである 浮遊細胞の培養を、好ましくは使用する。

本発明は、浮遊させた有壁単子葉植物細胞の培養、特に再生可能な（例えば胚形 成性の）カルスを得ることができるこのような細胞の培養、特にこのような細胞 の比較的若い胚形成性浮遊培養、ならびに浮遊細胞のこのような培養を形成する のに用いることができる有壁単子葉植物細胞が、表現型が正常な植物の再生に関 してのみならず、電気穿孔によるＤＮＡの取込み及びそれに続く組込み型形質転 換に関しても能力を有するという驚くべき発見に基づいてい本発明の方法により 形質転換されるべき有壁単子葉植物細胞は、通常、細胞凝集塊の一部であろう。

このような細胞凝集塊が細胞浮遊培養、特定的には胚形成性細胞浮遊培養から得 られる場合には常に、このような細胞凝集塊は数個〜数百個（すなわち最高約５ ００個）の細胞で構成されることになり、一般に約０．５ｍｍ未満の平均直径を 有することになる。このような細胞凝集塊を、細胞凝集塊の液体培養を形成する のに使用できる組織又１よりルス、好ましくは再生可能なカルスから得る場合、 これらは通常はるかに大きく、平均直径は、約０．５〜３ｍｍの間、好ましくば 約１〜２ｍｍの間である。

このような細胞凝集塊を、浮遊細胞の液体培養、例えば細胞浮遊培養の樹立中に 得られる培養から得る場合、これらは一般にサイズがやや不均一なものとなり、 平均の大きさは約Ｏ４５〜３ｍｍの間である。しかしながら、上記及び例中に記 されている細胞凝集塊の大きさは、以下に記されている電気穿孔キュベツトの大 きさの点から好まｌｌ、い大きさと考えられるのであり、これらは本発明にとっ て必要な大きさではない。

本発明に従うと、従来の要領で電気穿孔を行なうことができる〔例えば、Ｆｒｏ ｍｌＩｌら　（１９８７）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５３＋　３５１ を参照のこと〕。この点に関して、有壁細胞、特に浮遊細胞の培養（例えば胚形 成性浮遊培養）に含まれているもののような、又はこのような培養を形成するの に用いることができるもののような有壁細胞の凝集塊は、電気穿孔装置と共に使 用するのに好適なキュベツトへ移すこより記載されているとおり）。代替的には 、有壁細胞、特にその凝集塊を電気穿孔緩衝液中に懸濁させ、ピペットを用いて キュベツトに移すこともできるし、あるいは、浮遊培養から液体培地を除去し、 その有壁細胞を次いで既に好適な量の電気穿孔緩衝液を含むキュベツトへスパチ ュラを用いて移すこともできる。好ましくは、１００〜２００μ、好ましくは１ ００〜１５０−の電気穿孔緩衝液あたり、約３０ｍｇ〜１５０ｍｇ、特定的には ５０１１Ｉ１ｇ〜１２５ｍｇ、最も特定的には７５ｍｇ〜１００ｍｇの細胞凝集 塊をキュベツトに移す。

キュベツトへの移送に先立ち、好ましくは振とうしながら、右壁細胞凝集塊を電 気穿孔緩衝液中に約１５分〜３時間、好ましくは約４５分〜１．５時間、懸濁さ せることが好ましいが、この時間は、数分（すなわち１〜５分）まで短縮するこ とができる。同様に、細胞材料のインキュベーションは電気穿孔緩衝液中で実施 する必要はなく、実際にはあらゆる高張性緩衝液中で実施することが可能である 。

電気穿孔に先立って、細胞壁をわずかに損傷させるか又は細胞凝集塊をサイズの 点でより均一にするために、植物細胞壁分解酵素又は機械的な力（例えば細かい メツシュを通してのふるいかけ）を用いて細胞凝集塊を簡単に処理することも望 ましい可能性がある。このような酵素前処理を用いる場合には、それは好ましく は３０分未満、特定的には１０分未満、きわめて特定的には３〜５分未満でなく てはならない。この目的に使用することができる酵素又は酵素組成物は、周知の ものである〔例えば、Ｐｏｗｅｒ及びＣｈａｐｍａｎ　（１９８５）。

［植物細胞組織培養：実践的アプローチ（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｅａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｊ　ＩＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ中、を参照のこと〕。

ＤＮＡフラグメントを、電気穿孔緩衝液中の有壁細胞、特定的にはその凝集塊を 含むキュベツトに添加した後、本発明に従って電気穿孔を実施することができる 。好ましくは、約２時間又は３時間の長い時間、又は約５分〜１５分の短い時間 （そして最低約１分）、ただし標準的には約１時間、電気穿孔に先立ち有壁細胞 とＤＮＡとを同時インキュベートする。比較的小さいサイズ、好ましくは約２０ ｋｂ未満、特に１５ｋｂ未満、特定的には１０ｋｂ未瀾、きわめて特定的には６ ｋｂ未満（例えば最低的２〜３　ｋｂ）の、環状ではなくむし７ろ線形のＤＮＡ を用いると、最高の結果を得ることができると考えられている。この点に関して 、複数の目的遺伝子を用いて本発明の能力がある（コンピテント）単子葉植物細 胞を形質転換するために、異なる組成の複数の線形ＤＮＡフラグメントを使用す ることができる。好ましくは、約５〜３０ｕｔ、特定的には約１０〜２５μｇ、 きわめて特定的には約１１０１Ｊ又は２０ｕｇのＤＮＡを、細胞凝集塊を含むキ ュベツトに添加する。スペルミジンのようなりＮＡ分解を妨げる物質を添加する ことが可能である。

特定の電気穿孔条件は非常に重要なものとは考えられておらず、約８００〜９０ ０ｐＦのコンデンサーから放出させた約６００−７００　Ｖ／ｃｍ電界強度の１ パルスで優れた結果を（例えばイネにおいて）得ることができる。異なるタイプ の細胞及びその凝集塊（例えば浮遊培養からの）について最適な電気穿孔条件は 異なる可能性が高いが、一般に、Ｆｒｏｍｍら（１９８７）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、　１５３：　３５１及びＤｅｋｅｙｓｅｒら″（１９９０１前出に より記載されているような条件を使用することができる。この点に関して、あら ゆるタイプの細胞凝集塊についての最適な電気穿孔条件は、形質転換する植物種 、及び浮遊培養を使用する場合には懸濁液の新旧及び全体的状態により左右され ると考えられ、かかる条件は実験により決定することができる。

従って、一般に、まず最初に、細胞凝集塊を用いて、電気穿孔緩衝液中の細胞凝 集塊を含む電気穿孔キュベツトにいかなるＤＮＡも添加しない予備的実験を実施 すること、そして電気穿孔パルスの後、少な（とも約５０％、好ましくは少なく とも７５％、特定的には少な（とも９０％の細胞凝集塊が固体培地上にブレーテ ィングした後にカルスへと発達することが好ましい。

電気穿孔緩衝液の組成も同様に非常に重要なものとは考えられておらず、一般に 、従来の電気穿孔緩衝液を使用することができる〔例えばＦｒｏｍｍら　（１９ ８７）前出を参照のこと〕。

電気穿孔法により形質転換が完了した時点で、形質転換された単子葉植物細胞を 含む細胞凝集塊を、好適な培地（固体培地、ビーズ型培地、又さらには液体培地 であってもよい）に、好ましくは形質転換された細胞が選択可能なマーカーをコ ードするＤＮＡフラグメントを含んでいる場合には選択培地に移す。この移送は 、形質転換事象の後できるだけ早（、好ましくは直後、特に形質転換事象の後約 １日〜３日以内に行なわなくてはならない。

好ましくは１選択可能なマーカーをコードするＤＮＡフラグメントで形質転換さ れた細胞凝集塊は、従来の培養条件、培養手順及び選択的作用物質を補足した培 地［例えば、Ｖａｓｉｌ　（１９８８）前出中の参考文献を参照のこと〕を用い て培養する。選択的作用物質の選択は、以下で論述するように、有壁細胞を形質 転換するためのＤＮＡフラグメント内で使用される選択可能なマーカーによって 左右される。選択的作用物質の濃度は、選択可能なマーカ・−をコードするＤＮ Ａフラグメントが細胞のゲノム内に組込まれている、好ましくは完全に組込まれ ている、安定に形質転換された細胞のみが生存し分離されつるように、形質転換 された細胞に対し好適な選択的圧力を提供しなくてはならない。このような形質 転換された細胞凝集塊は、非選択的培地上で数日間培養することができるが、こ れらをできるかぎり早く選択培地に移し、表現型が正常な植物を再生するために 使用できる形質転換された胚形成性カルスのような形質転換された形態形成カル スを有意量生成するのに充分な長い時間（例λば約６カ月もの長い期間）、好ま しくは少な（とも約１カ月、特に２〜３力月間、維持することが好ましい。同様 に、培地の高張性を、例えば培地にマンニトールを補足することによって限られ た時間だけ（例えば最高２〜３週間）維持することも好ましい。

本発明に従うと、あらゆるＤＮＡフラグメントを、単子葉植物のゲノム、特定的 には核ゲノムの中に組込ませることができる。一般に、ＤＮＡフラグメントは、 形質転換された植物細胞内で機能的であり、このような細胞及び細胞から再生さ れた植物に対して付加的な特性を付与する、外来性又は内在性の遺伝子又はその 他のＤＮＡ配列を含む。この目的のため、ＤＮＡフラグメントは、好ましくは、 作動可能に連結された以下のＤＮＡ配列を含む単数又は複数のキメラ遺伝子を含 んでいる：１）植物細胞内のコーディング配列の発現を指示することができるプ ロモーター配列（「プロモーターＪ）；２）植物細胞内で特異的な活性をもつタ ンパク質（「目的のタンパク質」）をコードする配列（「コーディング配列」） ；及び３）好適な３′転転写節シグナル。タンパク質の必要とされる機能性を得 るためには、タンパク質を、サイドシル、ミトコンドリア、葉緑体又は小胞体の ような植物細胞の単数又は複数の特定の区画にターゲティングすることも必要と なる可能性がある。サイドシルへのターゲツティングのためには、上述のような キメラ遺伝子をそのまま使用することができる。しかしながら、その他の区画に ターゲティングするためには、キメラ遺伝子のＤＮＡ配列１）及び２）の間に付 加的な配列（「ターゲツテング配列」）が存在することが必要である。必要とあ らば、キメラ遺伝子は、同様に転写及び／又は翻訳エンハンサ−を含んでいても よ（、ＤＮＡ配列のコドン利用を植物細胞内での発現のために最適化することが 可能である。

本発明に従ったキメラ遺伝子は、充分に確立された原理及び技術に従って構築す ることができる。この点において、タンパク質のコーディング配列（又は存在す る場合にはターゲツテング配列）の開始コドンで翻訳が開始されるように、さま ざまなりＮＡ配列を連結しなくてはならない。

形質転換された双子葉植物において遺伝子の発現を指示するのに現在使用されて いるさまざまな構成的ならびに器官特異的及び組織特異的プロモーターが、本発 明の形質転換された単子葉植物における使用にも適しているものと考えられてい る。この点に関して、目的のタンパク質をコードするコーディング配列；及びそ の上流（すなわち５′）の、コーディング配列の発現に好適な外来性又は内在性 プロモーターを含むキメラ遺伝子を用いて、特定の植物細胞を形質転換すること ができる。好適な外来性構成的プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウ ィルス（ｒＣａＭＶＪ）の単離株ＣＭ　１８４１　［Ｇａｒｄｎｅｒら（１９８ １）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　旦：　２８７１１及びＣａ　ｂ　ｂ 　Ｂ　−ｓ　［Ｆｒａｎｃｋら　（１９８０）　Ｃｅ１ｌ、　２１：　２８５　 ］のプロモーター（ｒ３５Ｓプロモーター」）（非相同遺伝子の構成的発現４８ ２〕から分離され、その配列［３５Ｓ３プロモーターの配列は欧州特許公報（ｒ ＥＰＪ　）３５９６１７に開示されている］及びトランスジェニック植物におけ るそのより大きい活性［Ｈａｒｐｓｔｅｒら（１９８８）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、 　Ｇｅｎｅｔ、　２１２：　１８２　］において３５Ｓプロモーターと異なって いる関連プロモーター（ｒ３５Ｓ３プロモーター」）；そして、アグロバクテリ ウム（桔胚αｓｃｔｅｒｉｕｍ）のＴ−ＤＮＡのそれぞれ１′及び２゛遺伝子の 発現を制御し［Ｖｅｌｔｅｎら（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、旦：　２７２３　） 　、創傷により誘導されるプロモーターである、ＴＲＩ′及びＴＲ２’プロモー ターが挙げられる。好適な器官特異的、組織特異的及び／又は誘導可能な外来性 プロモーター、例えば、光合成組織の中でのみ活性である光誘導性ブロモ−ラー ゼの小サブユニット遺伝子（例えばＩＡ遺伝子）のプロモーター（ｒｓｓｕＪプ ロモーター）；ＥＰ３４４０２９に開示されているめ特異的プロモーター；及び 仕妙星旺旺と肋旦卦皿などの種子特異的プロモーター［Ｋｒｅｂｂｅｒｓら（１ ９８ｇ）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｔｏｌ、　８７：８５９］なども同様に知られ ている〔例えば、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら　（１９８７）Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３８：　２２１において引用されている参考文 献を参照のこと〕。欧州特許公報（ｒＥＰＪ　）３４４０２９に記載されている ように、単子葉植物を形質転換してそれらを雄性不稔にするのに特に有用なプロ モーターは、ＥＰ３４４０２９のタペート組織に特異的なプロモーター、ＰＴＡ ２９、ＰＴＡ２６及びＰＴＡ１３、特にＰＴＡ２９である。

同様に、形質転換された双子葉植物において使用される既知の３′転写調節配列 及びポリアデニル化シグナルを、本発明の形質転換された単子葉植物においても 使用することが可能であると考えられる。このような３′転写調節シグナルは、 コーディング配列の下流（すなわち３′）に提供することができる。この点に関 して、キメラ遺伝子の発現を得るのに適した外来性の又は内在性のいずれかの転 写終結及びポリアデニル化シグナルを含むキメラ遺伝子を用いて、特定の植物細 胞を形質転換することが可能である。例えば、Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の遺伝子７　［Ｖｅ ｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ　（１９８５）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　＋３：６９９８７　、オクトビンシンターゼ遺伝子［Ｇｉｅｌｅｎら　（１９ ８３）　ＥＭＢＯＪ。

３：　８３５］及びツバリンシンターゼ遺伝子のような遺伝子の外来性３′非翻 訳末端を使用することができる。

形質転換された植物細胞中、好ましくはその細胞質中で、発現され、続いて細胞 のミトコンドリア、葉緑体及び／又は小胞体の管腔（ルーメン）への目的のタン パク質のトランスロケーションが起こりうるキメラ遺伝子の構築のためには、好 適なターゲティング配列が知られている。このようなターゲティング配列の選択 は、非常に重要であるとは考えられておらず、遺伝子の発現産物のトランスロケ ーションを提供することになるターゲティングペプチドをコードする外来性又は 内在性ターゲティング配列を含むキメラ遺伝子を用いて特許の植物細胞を形質転 換することができる。［ターゲティングペプチドｊというのは、真核細胞内で、 通常、葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はこのタンパク質のサブユニット と、又は小胞体にトランスロケーションされるタンパク質と関連しており、しか も細胞の核ＤＮＡによりコードされる前駆体タンパク質の一部として細胞内で産 生されるポリペプチドフラグメントのことである。

ターゲティングペプチドは、核にコードされた葉緑体又はミトコンドリアのタン パク質又はサブユニットの１葉緑体又はミトコンドリア又は小胞体の管腔内への トランスロケーションプロセスを担っている。トランスロケーションプロセスの 間に、ターゲティングベブチドはタンパク質又はサブユニットから分離されるか 又はタンパク質分解により除去される。欧州特許出願（ｒＥＰＡＪ　）８５４０ ２５９６．２及び８８４０２２２２．９に一般的に記載されているように、形質 転換された植物細胞内で発現された目的のタンパク質をトランスロケーションで きるターゲティングベブチドを発現するようにキメラ遺伝子内にターゲティング 配列を提供することが可能である。葉緑体内への輸送のために好適なターゲティ ングペプチドは、酵素１．５−リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブ ユニットのトランジットペプチド［１（ｒｅｂｂｅｒｓら　（１９Ｈ）Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１：　７４５；　ＥＰＡ　８５４０２５９６．２ ］であるが、Ｗａｔｓｏｎ（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １２：　５１４５及びＶｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅら　（１９９−１）Ｐｌａｎｔ　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、　９：　１０４によりリストアツブされているも ののようなその他の葉緑体トランジットペプチドも、同様に使用できる。好゛適 なミトコンドリアターゲティングペプチドは、５ｃｈａｔｚ（１９８７）　Ｅｕ ｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６５：　ｌにより記載され、Ｗａｔｓｏｎ（ １９８４）前出によりリストアツブされているようなミトコンドリアトランジッ トペプチドである。目的のタンパク質を植物細胞の小胞体の管腔にトランスロケ ーションできる好適なターゲティングペプチドは、例えば、Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎ ｅ　（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ９４７：　 ３０７により記載され、Ｗａｔｓｏｎ　（１９８４）前出によりリストアツブさ れているシグナルペプチドである。

トランスジェニック双子葉植物の生成に使用することができるコーディング配列 は、周知であり〔例久ば、Ｗｅｉｓｉｎｇら　（１９８８）Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅ ｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　２２：　４２１にリストアツブされているコーディング配 列を参照のこと］、このようなコーディング配列は、本発明に従った形質転換さ れた単子葉植物においても同様にうまく使用できるものと考えられている。この 点に関して、コーディング配列は、その植物にとって外来性であっても内在性で あってもよく、例えば、以下のようなタンパク質をコードしていることができる ：昆虫種に対し有毒で、従って昆虫の攻撃から植物を保護するもの（ＥＰ１９３ ２５９、ＥＰ３０５２７５及びＥＰ３５８５５９）；ストレス条件から植物を保 護するもの（ＥＰ３５９６１７）；植物に、特定の除草剤に対する耐性又は寛容 性を付与するもの（ＥＰ２４２２３６）；コーディング配列が雄性又は雌性の器 官特異的プロモーターの制御下にあるとき（ＥＰ３４４０２９、ＷＯ９２１００ ２７４及びＷＯ９２１００２７５）　、そのタンパク質が植物をそれぞれ雄性不 稔（ＥＰ３４４０２９）又は雌性不稔（ＥＰ４１２００６）にすることができる ように、そのタンパク質を発現する植物細胞を殺すか又は損傷するもの；植物を 経済的に重要なペプチド又はタンパク質の供給源として使用できるよう、植物又 は選択された植物器官から抽出でき、場合によってはさらに処理することができ るもの（ＥＰ３１９３５３）；又は、そのタンパク質を発現する形質転換された 植物又はその器官を、動物又は人間のために栄養価が増強された食物として使用 できるように、栄養的に重要なアミノ酸を豊富にしたもの（ＥＰ３１８３４１） 。

単子葉植物を形質転換してこれらを昆虫耐性にするために特に有用なコーディン グ配列は、殺虫性結晶タンパク質とその殺虫性ポリペプチド毒素をコードする、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　（ｒ　Ｂ　ｔ　Ｊ　）菌株か ら単離された遺伝子及びその一部が切除された部分であ一部・〔総説としては、 Ｈｏｆｔｅ及びＷｈｉｔｅｌｅｙ　（１９８９）　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅ ｖ、　５３：２４２を参照のこと〕。以下のＢｔ遺伝子が、穀物（例えば、イネ 、小麦、トウモロコシ及び大麦）における昆虫防除のために特に重要であると考 えられている：肚出工＝２種（例えば、Ｉｔ、　ｚｅａ及びＨ，ａｒ＋銭り堕） の防除のためのＣｒｙＩＡｂ遺伝子（ＥＰ１９３２５９）及びＣｒｙＩＡｃ遺伝 子；トウモロコシにおける０ｓｔｒｉｎｉａ種（例えば０．　ｎｕｂｉｌａｌｉ ｓ）の防除のためのＣｒｙＩＡｂ遺伝子及びＣｒｙＩｂ遺伝子（ＥＰ３５８５５ ７）；　トウモロコシ及び小麦における知二±堕種の防除のためのＣｒｙＩＡｃ 遺伝子；そして、トウモロコシにおける鉦皿匹ｔｅ　ｒａ種（例えば、鉦な皿江 肛血）の防除のためのＣｒｙＩＤ遺伝子及びＣｒｙ　Ｉ　Ｅ遺伝子（ＥＰ３５８ ５５７）。トランスジェニック植物の組織においてこのよ６な遺伝子の充分な発 現を達成するため、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ９１１００７３３　（ＰＣＴ公報Ｗ Ｏ９１／１６４３２）中に記されているように遺伝子を改変することが好ましい 。

本発明に従った選択可能なマーカーは、コーディング配列が、それを発現してい る植物細胞に対して抗生物質及び／又は除草剤のような選択的作用物質に対する 耐性を付与するタンパク質をコードしているキメラ遺伝子によってコードされう る０本発明に従ったスクリーニング可能なマーカーは、コーディング配列が、そ れを発現している植物細胞に対して異なる色のような異なる外観を付与してスク リーニング可能なマーカーで形質転換された植物を手で分離できるようにするタ ンパク質をコードしているキメラ遺伝子によってコードされつる。本発明に従っ て単子葉植物を形質転換するための、選択可能なマーカー又はスクリーニング可 能なマーカー、好ましくは選択可能なマーカーのコーディング配列の選択は、非 常に重要なものとは考えられておらず、従来の選択可能な及びスクリーニング可 能なマーカーのためのコーディング配列を使用することができると考えられる〔 例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら（１９８ｇ）前出にリストアツブされているマーカー を参照のこと〕。選択可能なマーカーのための好適なコーディング配列の例とし ては、以下のものがある：抗生物質力士マイシンに対する耐性を付与する酵素ネ オマイシンホスホる酵素ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードす る丘工１遺伝子［Ｇｒｉｔｚ及びＤａｖｉｅｓ　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５ ：　１７９）　；及び除草性化合物ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔ ｈｒｉｃｉｎ）及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する耐性を付うすあ ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａ工遺伝子（Ｅ Ｐ２４２２３６）。葉緑体代謝に作用する除庫剤又はその他の選択的作用物質に 対する寛容性又は耐性を付与するタンパク質をコードする選択可能なマーカー遺 伝子２例えばｂａ工遺伝子を使用するにあたっては、マーカー遺伝子が上述のよ うな葉緑体ターゲテイング配列と共にキメラ遺伝子の一部を成していることが好 ましい。スクリーニング可能なマーカーのための好適なコーディング配列の例と しては、β−グルクロニダーゼをコードするｌ旦ユ遺伝子ＥＪｅｆｆｅｒｓｏｎ ら（１９８６）　ＰＮＡＳ　旦：　３９０１１及びルシフエーゼ遺伝子［Ｏｗら 　（１９８Ｂ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：　８５６）がある。

本発明の形質転換された細胞凝集塊の培養の間、培地中の選択的作用物質の存在 によって提供される選択圧力は、形質転換されていない細胞から形質転換された 細胞を分離するのに充分高くなくてはならず、かつ充分長く維持されな（ではな らない。しかしながら、特定の選択圧力及び持続時間が非常に重要であるわけで はなく、選択圧力及びその持続時間の選択は従来の要領で行なうことができると 考えられる。ただし、互！工遺伝子を選択可能なマーカー遺伝子として用いる場 合、好ましくはホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を、培地１リツトルにつき約０． ５ｍｇ〜５０１１ｇ、特定的には２ｍｇ〜２０ｍｇの濃度で使用する。

このとき、本発明の電気穿孔された右壁細胞凝集塊（例えば浮遊培養からの）の 形質転換された細胞の培養において生成された形態形成性カルス、好ましくは胚 形成性カルスの形態形成性セクター好ましくは胚形成性セクターは、次いで従来 の要領で表現型が正常な（例えば成熟し稔性の）植物に再生させることが可能で ある【例えば、Ｖａｓｉｌ　（１９８８）前出の参考文献、Ｌａｚｚｅｒｉ及び Ｌ６ｒｚ　（１９８８）前出、及びＬｙｎｃｈら（１９９１）の「イネのバイオ テクノロジーＪ　、　ｅｄ、Ｋｈｕｓｈ及びＴｏｅｎｎｉｅｓｓｅｎ　、　Ｃ， Ａ、Ｂ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国、のｐ、　１３５とその中に引用 されている参考文献を参照のこと〕、か（して得られた再生された植物は、トラ ンスジェニック植物となり、少なくとも、その核ゲノム中に安定に組込まれた選 択可能なマーカー又はスクリーニング可能なマーカー、好ましくは選択可能なマ ーカーをコードする何らかのＤＮＡフラグメントを含んでいる０次いで、目的の その他の遺伝子の存在及び発現は、例えば、サザンブロ・ソティング及び／又は ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら　（１９８９ ）　ｒ分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ）　Ｊ　、第２版、Ｃｏｌ ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ 、）　、及び／又は目的の遺伝子の表現型発現を確認することにより、従来の要 領で評価することができる。

本発明の目的においては、本発明の形質転換及び再生手順によって生成されるよ うな表現型が正常な植物は、本発明に従った形質転換中に植物のゲノムに導入さ れたＤＮＡフラグメントの発現によって付加されるか又は変化する特徴を除いて 、その表現型特性のいずれにおいても、同じ系統の形質転換されていない植物と 実質的な差異をもたない少なくとも１つの植物として理解されるべきである。

当然のことながら、トランスジェニック植物を結果としてもたらす全ての手順は 、さまざまな表現型を表す多数のトランスジェニック植物を生成し、そのうちの いくつかだけが上述の定義のように表現型が正常なものである。

本発明の方法は、懸濁した右壁細胞の液体培養、特に右壁細胞凝集塊の液体培養 、例えば浮遊培養、好ましくは未成熟及び成熟接合体肢、葉脚、若い花序、豹、 小胞子などのさまざまな外槽体供給源から誘導された外植体のインビトロ培養に より得ることができる再生可能なカルス、特に胚形成性カルスのもとどなる浮遊 培養を与える、全ての単子葉植物種に適用することができる。この方法は、経済 的に重要なイネ科作物、特定的にはイネ、小麦、エンバク、大麦、トウモロコシ 、モロコシ類、ライ麦及びアワのような主要穀物の形質転換のために、特に有用 となる。結果として得られる本発明のトランスジェニック植物は、高い作物栽培 学的価値をもつ新しい系統及び／又は栽培作物を迅速かつ効率の良い形で作り出 すために使用することができる。

本発明は、浮遊細胞の培養（例えば、細胞浮遊培養）ならびにこのような培養を 形成することができる右壁細胞（例えば、外植体由来カルスから得られた細胞） の電気穿孔によって、単子葉植物の右壁細胞を形質転換するための迅速かつ効率 的な再現性の高い方法を提供する。本発明に従って再生可能な（例えば胚形成性 の）右壁細胞の浮遊培養を電気穿孔する場合、形質転換された形態形成性カルス の培養を作ることができ、そこから表現型が正常な稔性植物が再生されつる。こ のような右壁細胞、特定的には胚形成性浮遊培養のそれの電気穿孔は、一般に、 単子葉植物において安定な形質転換体を得るための好適な方法としてみなされて いなかったことから、これは驚くべきことである〔例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　 （１９９１）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４２：　 ２０５を参照のこと］。このような右壁細胞の、特定的にはその酵素的又は機械 的前処理を全（伴わない、本発明に従った電気穿孔は、既存の単子葉植物の形質 転換方法に対する明瞭な改良である。本発明の方法ではインビトロ培養の期間が 比較的短くてすむため、この方法は、従来の大部分の方法よりもはるかに時間及 び労力を消費しないものである。短い組織培養期間は、同様に、ツマクローナル 変動の発生をも確実に減少させる。

本発明の方法は、その核ゲノムに安定に組込まれた少なくとも１つの（例えば外 来性の）目的の遺伝子で形質転換されている、新規で表現型が正常な（例えば稔 性の）トランスジェニック単子葉植物、特定的にはイネ科植物、きわめて特定的 には穀物、最も特定的にはイネ、小麦及び大麦を生産するのに使用することがで きる。

この方法は、形質転換される植物の遺伝子型とは比較的無関係であり、少な（と もその組織の１つから得ることができる再生可能な（例えば胚形成性の）浮遊培 養のもとどなるあらゆる植物の細胞を形質転換することができると考えられる。

このため、単子葉植物種の大部分、そして各種内のかなりの数の系統を形質転換 することが可能になっている。実際、好適な再生可能な浮遊培養を形成する能力 は、古典的な育種プログラムを用いて、このような能力をもつ１つの植物系統か らもたないもう１つの系統へとトランスファーすることができ、このため本発明 は、さらに多くの植物系統に適用可能である。

上述のように、本発明に従った浮遊右壁植物細胞の培養の電気穿孔によって、有 利にも、安定に形質転換さした単子葉植物の細胞を得ることができる。この点に 関して、浮遊細胞の培養から再生可能なカルス（例えば胚形成性カルス）を得る ことができる場合、カルスのこのように形質転換された植物細胞のいくつかは、 それに続いて本発明に従って、その全ての細胞のゲノムに安定に組込まれた少な くとも１つの目的の遺伝子を含むトランスジェニック単子葉植物へと再生させ得 る。

しかしながら、本発明の浮遊細胞の培養は、厳密な意味での「細胞浮遊培養」で ある必要はない。これは、それがプロトプラストの調製のために使用されるべき 細胞培養に関して用いられるものであるからである。実際、本発明に従うと、そ の細胞壁を保持し、液体（例えば水性の）培地中に浮遊している植物細胞のいか なる培養の電気穿孔によっても、植物細胞の形質転換及び再生において実質的に 同じ結果を得ることができると考えられる。この点に関して、本発明の浮遊細胞 の培養は、植物組織から又は植物組織より得たカルスから得られる細胞凝集塊の あらゆる液体培養を包括するものとして理解されるべきである。実際、本発明の 方法におけるカルスから得られた浮遊細胞凝集塊の液体培養の使用は、インビト ロ培養時間と、その後の形質転換された細胞及び／又は植物におけるツマクロー ナル変動とをさらに減少させる。その上、本発明の浮遊細胞の培養を形成するた めに使用することができる各々の植物種について、二定のタイプのカルスからの 細胞の電気穿孔によって、実質的に同じ結果を得ることができると思われる。例 えば、イネにおいては、このようなカルスは、外植体に由来する（例えば肺由来 の）胚形成性カルスの一部で、カルス組織の残りの部分から容易に分離できる、 緻密で黄色及び／又は白味がかった、往々にして丸形又は卵形の細胞塊で構成さ れていてよい。

以下の実施例は、本発明を説明するものである。別の指示が無い限り、組換えＤ ＮＡを操作するための実験手順は全て、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１，９８９）　ｒ 分子クローニング：研究室マニュアルＪ　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、に記載されている櫟準化 された手順により実施した。あらゆるオリゴヌクレオチドは、Ｋｒａｉｅｒ及び Ｆｒ１ｔｚ　（１９６８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１ ５４：　３５０により概略的に示されている一般的規則に従って設計し、Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０Ａ　ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂ、Ｖｌ、　Ｍａａｒｓｓｅｎ。

オランダ）を用いて、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１１ ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２：　１８５９のホスホルアミダイ ト方法により合成した。例中で用いられている２Ｎ６、Ｎ６７、ＡＡ、Ｎ６Ｓ３ 、及び無ホルモンＮ６培地の組成は、日本タバコ産業株式会社（Ｊａｐａｎ　Ｔ ｏｂａｃｃ。

Ｉｎｃ、）　、植物育種及び遺伝学研究所、日本国静岡県イヮタ市トヨダ東原７ ００、〒４３８　（７００Ｈｉｇａｓｈｉｂａｒａ、　Ｔｏｙｏｄａ、　Ｉｗａ ｔａ。

５ｈｉｚｕｏｋａ　４３８．　Ｊａｐａｎ）の御厚意により提供されたものであ る。

以下の例では、次の配列リストを参考にする。

１ユユス上 ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１−例２のプラスミドｐＤＥ１１ｏの配列。

ＳＥＱ　ＩＤ　胤２−例４のプラスミドｐＤＥ４の配列。

以下の要領で、種子由来カルスからイネの栽培品種ニッポンバレ（肛圧並厘匹） 及びコチヒビキ（Ｋｏｃｈｉｈｉｂｉｋｉ）の細胞浮遊培養を作った。成熟した 乾燥イネ種子を脱穀し、表面殺菌し、固体２Ｎ６培地（０，５ｍｇ＃ニコチン酸 、０　、５　ｍｇ／ｌピリドキシンＨ（１，１，０ｍｇ／ｆチアミンＨＣｆｆ、 ２．０ｍｇ、＃　２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、３０ｇ／ｌ 　スクＤ−ス、２．０ｇ／ｌ　ケルーｙイト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）を補足した、Ｃ ｈｕら（１９７５）　Ｓｃｉ、　Ｓｉｎ、　Ｐｅｋｉｎｇ　１８：６５９により 記されているＮ６培地、ｐＨ５，８１上にブレーティングした。プレートを３０ ℃で４週間インキュベートし、その後、胚由来の緻密な胚形成性カルスの、緻密 で白味がかった及び／又は黄色い部分約１グラムを、２５〇−入り三角フラスコ 中の、６５−のＡＡ培地［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ　（１９６２）　 Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、　１５：　４７３により記載されているＭＳ培 地からの微量栄養素及びビタミンを含む、Ｔｏｒｉｙａｍａ及びＨｉｎａｔａ（ １９８５）　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　４１：　１７９のＡＡ培地について 記されたとおりの多量栄養素、アミノ酸、成長調節物質及び糖、ｐＨ５，８３へ と移した。これらの培養を、回転式振どう培養器上で約１２Ｏｒｐｍで暗所に維 持した。培養は、１週間毎に継代培養した。

最初の継代培養の後、培養フラスコから全てのＡＡ培地を除去し、６５−の新鮮 なＡＡ液体培地と交換した。その後の継代培養の間、より大きい細胞クラスター がより小さい断片に解離したときに形成された、より小さく、通常クリーム状又 は黄色い細胞塊の充実細胞量１〜２−を選択し、６５ｉｄの新鮮なＡＡ培地に移 した。各々の継代培養において、褐色の部域（壊死）をもつ細胞クラスターを除 くよう注意を払った。１〜２力月の継代培養の後、異なるサイズの緻密な細胞凝 集塊から成る充分に分散した清浄な（すなわち褐色の細胞クラスターの無い）浮 遊培養が得られた。

２つの栽培品種の細胞浮遊培養を、次いで、各々の継代培養の間、６５−の新鮮 培地に１−の充実細胞量を移すことによって維持した。懸濁液の細胞クラスター は、植物再生のためのＮ６３３培地（０，５ｍｇ＃ニコチン酸、０　、　５　ｍ ｇ／ｉ’ピリドキシンＨＣρ、１．０ｍｇ／ｌチアミンＨ（１，８７６ｍｇ＃グ ルタミン、２６６ａ＋ｇ＃アスパラギン酸、１７４ｍｇ／ｉ’アルギニン、７　 、　５　ｍｇ／ｌグリシン、１．０ｇ／ｉ’カザミノ酸、０　、２　ｍｇ／！ナ フタレン酢酸（ＮＡＡ）、１．０ｍｇ／ｆカイネチン、２０ｇ＃’スクロース、 ４．０ｇ／ｌゲルライトを補足し、主要塩類の強度を半分にしたＮ６培地、ｐＨ ５，８）上にこれらをブレーティングすることによって、その植物再生潜在能に ついて定期的にチェックした。

１２ニア、・　゛　し）るイネの　’Ｌ　の多辺下の要領で、例１のイネの栽培 品種ニッポンバレ及びコチヒビキからの細胞浮遊培養を、除草剤耐性遺伝子で形 質転換し、形質転換された細胞をトランスジェニック植物へと再生させた。

１、ニッポンバレ 細胞浮遊培養を樹立し、２力月間維持した。最後の継代培養から４日後、ＡＡ培 地を除去し、細胞クラスターを電気穿孔緩衝液ＡＡ［３５ｍＭＬ−アスパラギン 酸、３５ｍＭＬ−グルタミン酸、５ｍＭ　Ｄ−グルコン酸、５ｍＭ２−［Ｎ−モ ルフオリノコエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ５，８ （Ｔａｄａら（１９９０）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　８０二 ４７５））で洗浄し、３０ｒｐｍの振どう培養器上で１時間この緩衝液中に保つ 光。その後、細胞凝集塊を電気穿孔緩衝液ＡＡで２回洗浄した。約７５ｍｇ〜１ ００ｍｇの細胞クラスターを電気穿孔キュベツトに移し、約１００〜１５０４の 電気穿孔緩衝液中に再懸濁させた。ＨｉｎｄｌＴＩで線形化した１５ｕｇのｐＤ Ｅ１１０プラスミドＤＮＡを、各キュベツトに添加した。プラスミドｐＤＥ１１ ０は、長さ４．８８３ｂｐのプラスミドであり、ＣａＭＶ３５Ｓ３プロモーター （ＥＰ３５９６１７）の制御下にホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性遺伝子（旦 且工）を含んでいる。

ｐＤＥｌｌｏの完全な配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ（Ｌｌに示されている。プラス ミドＤＮＡの添加の後、キュベツトを１０分間氷上に置いた。次に、７００　Ｖ ／ｃｍの電界強度をもつ単一のパルスを、８００ｐＦのコンデンサーから細胞ク ラスターとＤＮＡの混合物に放出させた。パルスの直後に、細胞クラスターに液 体Ｎ６７培地（０，５ｍｇ／ｌニコチン酸、０　、　５　ｍｇ＃’ピリドキシン Ｈ（１，１，０ｍｇ／ｆチアミンＨＣｆｉ、１．　Ｏｒｎｇ／ｌ　２．４−Ｄ、 　０．５ｍｇ／ｉ’　６−ベンジルアミツブリン、２０ｇ／Ｉスクロース、３０ ｇ／ｌソルビトールを補足したＮ６培地、ｐＨ５，８）を加え、次にこれらの細 胞クラスターを、５　ｍｇ／ＩのＰＰＴを含む固体選択Ｎ６７培地（０，５ｍｇ ／、ｉ！ニコチン酸、０．５ｍｇ／ｉ’ピリドキシンＨＣＡ、１．０ｍｇ／ｉ’ チアミンＨ（１，１，０ｍｇ＃　２．４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ　６−ベンジルア ミノプリン、２０ｇ／ｌスクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２．０ｇ／Ｉゲ ルライトを補足したＮ６培地、ｐＨ５，８）上にブレーティングしたＪ 平板を、１６／８時間の明／暗管理様式で、２６℃でインキュベートした。６週 間の培養の後、処理した浮遊凝集塊から発達しなＰＰＴ耐性カルスな、新鮮なＮ ６７培地にＰＰＴを加えたものの上にさらに１２日日間−た。その後、ＰＰＴ耐 性カルスを、５ｍｇ／ＩのＰＰＴを補足した植物再生培地Ｎ６５３に移した。選 択したカルスの２つから、植物を再生することができた。発達する小植物が約ｉ ｏａｍの高さに達した時点で直ちに（通常１〜２力月以内）、これらをホルモン を含まないＮ６培地［０，５ｍｇ／ｆニコチン酸、０．５ｍｇ、Ｑ’ピリドキシ ンＨ（１，１、Ｏｍｇ／ＩチアミンＨＣｊ２、ｌｏｇ／ｌカザミノ駿（ビタミン 検定）、２０ｇ＃スクロース、２．０ｇ／Ｉゲルライトを補足したＮ６培地、ｐ Ｈ５，８３に移し、土壌及び温室に移すのに充分なほど強くなるまで（通常１〜 ３週間後）、この培地上で培養した。

２、コチヒビキ 細胞浮遊培養を樹立し、４．５力月間維持した。最後の継代培養から４日後に、 ＡＡ培地を除去し、細胞クラスターを電気穿孔緩衝液９　［０，４Ｍマンニトー ル、１０ｍＭＫＣｊ２．４ｍＭＣａ（、ｊＬ　・２Ｈ２０，１０ａ＋ＭＮ−２− ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）　、 ｐＨ７，２］で洗浄し、振どう培養器上で１時間この緩衝液中に保った。その後 、細胞クラスターな電気穿孔緩衝液９で２回洗浄した。約７５〜１００ｍｇの細 胞凝集塊を電気穿孔キュベツトに移し、キュベツト１つにつき約１００〜１５０ ＩＬｌの電気穿孔緩衝液９中にこれを再懸濁させた。

Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ”Ｉで線形化した１２ｔｔｇのｐＤＥ１１０プラスミドＤＮＡを 各々のキュベツトに添加し、室温（２５℃）で４５分間、細胞クラスターと同時 インキュベートした。キュベツトを１０分間氷上に置き、各キュベツト内の細胞 凝集塊を、７００Ｖ／ａｍ　−８００ＰＦ　（４キユベツト）　、６００Ｖ／ｃ ｍ　−９０ＯＦＦ　（４キユベツト）、７００Ｖ／ｃｍ　−９００ＪＩＦ　（５ キユベツト）のいずれかの電圧／静電容量特性で、コンデンサーから放出させた 単一パルスを適用することによって、電気穿孔した。液体Ｎ６７培地を、パルス の直後に各キュベツトに添加し、５　ｍｇ／ｌのＰＰＴを補足した固体選択Ｎ６ ７培地上に細胞クラスターをブレーティングした。

平板を、１６／８時間の明／暗管理様式で、１９日間２６℃でインキュベートし た。発達中のＰＰＴ耐性カルスを単離し、新鮮なＮ６７培地に５ｍｇ＃のＰＰＴ を加えたものへ移し、さらに１８日間増殖させた。この第２の選択サイクル後、 よく発達しているＰＰＴ耐性カルスを５　ｍｇ／ｌのＰＰＴを補足した植物再生 培地Ｎ６Ｓ３上に置いた。植物は、選択したカルスのうち１７個から再生された ；すなわち、５個のカルスは７００Ｖ／ｃ＋＋＋　−８００ｐＦパルスで電気穿 孔した細胞凝集塊からのものであり、２個のカルスは６００　Ｖ／ＣＤＩ　−９ ００ｐＦパルスで電気穿孔した細胞凝集塊からのものであり、１０個のカルスは ７００Ｖ／ｃｍ　−９００ＪＪＦパルスで電気穿孔した細胞凝集塊からのもので あった。発達中の小植物が約１０ｃｍの高さに達した時点で直ちに（通常１〜２ 力月）、これらをホルモンを含まないＮ６培地に移し、土壌及び温室に移すのに 充分なほど強（なるまで（通常１〜３週間後）、この培地の上で培養した。

２回目の実験においては、上述した同じコチヒビキ浮遊培養を、開始５力月後に 使用した。最後の継代培養から５日後、細胞クラスターを電気穿孔緩衝液９で洗 浄し、振どう培養器上でこの緩衝液中に４５分間保ち、その後同じ緩衝液で２回 洗浄した。１６個の電気穿孔キュベツトの各々に約７５〜１００ｍｇの細胞クラ スターを移し、１キユベツトあたり約１００〜１５０μの電気穿孔緩衝液９中に 再懸濁させた。Ｈｉｎｄｍで線形化した１５μｇのｐＤＥ１１０プラスミドＤＮ Ａを、各々のキュベツトに添加した。これらのキュベツトのうち８個（バッチＡ ）を１０分間氷上に置き、次いでパルスを与えた。他の８個のキュベツト（バッ チＢ）は、電気穿孔に先立ち１時間室温に保った。細胞クラスターとＤＮＡの混 合物に対して、６００Ｖ／ｃｍ　−９００ＰＦ　（各バッチから４個のキュベツ ト）及び７００Ｖ／ｃｍ　−９００ｐＦ　（各バッチから４個のキュベツト）を 適用した。パルスの直後に、各キュベツトにＮ６７液体培地を添加し、５　ｍｇ ／ｌのＰＰＴを補足した選択Ｎ６７培地上に細胞クラスターをブレーティングし た。

プレートを上述のとおりインキュベートした。２３日後、ブレーティングした浮 遊クラスターから誘導された発達中のＰＰＴ耐性カルスな、２回目の選択サイク ル及びさらなる増殖のため、新鮮な選択Ｎ６７培地に５　ｍｄｌのＰＰＴを加え たものへ移した。２１日後、植物再生培地Ｎ６Ｓ３に５ｍｇ／ｉ！のＰＰＴを加 えたものに、よ（成長しているカルスを移した。選択したカルスのうち２４個か ら植物を再生させることができた。すなわち、２個のカルスは、６００　Ｖ／Ｃ ｍ−９ＱＯｐＦのパルスで電気穿孔したバッチＡの細胞凝集塊からのものであり 、３個のカルスは、７００　Ｖ／ｃｍ及び９００ｐＦのパルスで電気穿孔したバ ッチＡの細胞凝集塊からのものであった。９個のカルスは、６００Ｖ／ｃｍ　− ９００μＦのパルスで１気穿孔したバッチＢの細胞凝集塊からのものであり、１ ０個のカルスは、７００　Ｖ／Ｃｍ　−９００ｐＦパルスで電気穿孔したバッチ Ｂの細胞凝集塊からのものであった。発達中の小植物が約１０ｃｍの高さに達し た時点で直ちに（通常１〜２力月以内）、これらをホルモンを含まないＮ６培地 に移し、土壌及び温室へ移すのに充分なほど強（なるまで（通常１〜３週間後） 、この培地上で培養した。

３：　２からのトランスジェニック官　の例２の植物を温室で栽培し、土壌に移 してから４〜６週間後に、０．５％のＢａ５ｔａ（Ｐ　Ｐ　Ｔ　）溶液を噴霧し た。全ての植物はＢａ５ｔａ耐性を有していたが、一方、形質転換されていない 対照植物は、除草剤処理後１週間以内に褐色に変わり、枯死した。

１３体の選択した一次形質転換体（１３個の別々の再生中のカルスから誘導され たインビトロ植物）について、サザン解析を行なった。サザン解析のためには、 イネのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶ、Ｂｇｌｎ及びＰｖｕＩＩで消化し、サザン プロットし、ｐＤＥｌｌｏＤＮＡでプローブした。このサザン解析は、植物のう ち３体が、イネのゲノム内に組込まれた完全なｐＤＥ１１０由来キメラｂａ工遺 伝子（すなわち、プロモーター及び３′非翻訳末端を有するｂａ工遺伝子）の単 一コピーのインサートを担持していることを示した。植物のうち５体は、そのゲ ノム中に組込まれたｐＤＥ１１０由来ＤＮＡを１〜３コピー有し、これらのコピ ーのうちの少なくとも１つは、完全なキメラｂａ工遺伝子を含んでいた。植物の うち３体は、ｐＤＥ１１０由来ＤＮＡの複数のインサートを担持し、一方、他の ２体の植物は、ゲノムに組込まれたキメラ旦旦工遺伝子の一部分のみを有してい た。

例２，１のニッポンバレの個別に形質転換された２つのカルスのうちの１つから 再生された植物のうちの３体を、成熟するまで成長させ、種子を生じさせた。こ れらの植物のうちの１つを詳細に分析した。この植物のサザン解析は、そのゲノ ムが、Ｐ３５Ｓ−ｂａｒ−３′ｎｏｓキメラ遺伝子を含めて、形質転換ＤＮＡ（ ｐＤＥｌｌｏ）の１つのほぼ完全なコピーを含むインサートを、イネのゲノム内 の単一の遺伝子座に有していることを立証した。この植物（Ｅ２５３と呼称され る）から、８１種子（自家受粉の後）を収穫した。種子のうちい（つかを、後代 植物における旦且工遺伝子の分離の分析のために使用した。９３の実生苗にＢａ ５ｔａを噴霧した。７３／９３の実生苗はＢａ５ｔａ耐性であり、２０／９３の 実生苗はＢａ５ｔａ感受性であった（Ｘ”　＝０．５２、これは、単一の優性遺 伝子座でのメンデルの分離と有意に異なっていない）　、　Ｂａ５ｔａ耐性後代 植物のうちの４つをサザンプロットで解析した。４つの植物全てが、−次形質転 換体Ｅ２５３について決定されたものと同じハイブリダイゼーションパターンを 有していた。

コチヒビキについては、形質転換ＤＮＡの組込みを、さまざまなカルスから得ら れた再生された植物又はインビトロ苗条のサザン分析によって確認した０例２． ２の個々に形質転換された２４個のカルスの１つから得られた１つの再生された 植物（Ｋ３２と呼称される）を、さらに詳しく解析し、完全なＰ３５Ｓ−ｂａｒ −３’ｎｏｓキメラ遺伝子を含めて、形質転換ＤＮＡ　（ｐＤＥｌ　１０）のほ ぼ完全なコピーを有することがわかった。−次形質転換体に３２から、８１種子 を収穫し、Ｂａ５ｔａ噴霧により９８の後代植物におけるｂａ工遺伝子の分離を 解析した。８０／９８の実生苗がＢａ５ｔａ耐性であり、１８／９８の実生苗が Ｂａ５ｔａ感受性であった（ｘ２＝２．３６、これは単一の優性遺伝子座でのメ ンデルの分離と有意に異なるものではない）。Ｂａ５ｔａ耐性後代植物のうち４ つをサザンプロットで解析した。４つの植物は全て、−次形質転換体に３２につ いて決定されたものと同じハイブリダイゼーションパターンを有していた。

４：　カルス細　のタ イネの栽培品種コチヒビキとチョニシキ（側証並旦旺料）の成熟した乾燥種子を 脱穀し、表面殺菌し、固体２Ｎ６培地上にブレーティングした。３０℃で約１カ 月の間プレートをインキュベートした。次いで、結果として得られたカルスに現 われ、培養中の観察されたカルスタイプの大部分を構成するか又はより大きいカ ルスの表面にあった、小さい丸形及び卵形をした黄色及び白色ががったカルス塩 （そのうちのい（つかは前胚を表わす可能性のある表面上の球状構造をもつ）を 用いて、胚形成性浮遊培養を開始した。これらのカルス塩は、通常、より大きな カルスの表面に又は互いに付着しておらず、一対の鉗子を用いて容易に個々には ずすことができた。

平均最大直径が約２ｍｍであるカルス塩を、直ちに注意深く電気穿孔緩衝液９に 移し、振どう培養器（３０ｒｐｍ）上で１時間この緩衝液中に保９た。その後、 カルス塩を、電気穿孔緩衝液９で１回洗浄した。約７５〜１００ｍｇのカルス塩 を電気穿孔キュベツトに移し、約１５０４の緩衝液９中に再懸濁させた。各キュ ベツトに、１０属のｐＤＥ４プラスミドＤＮＡを添加した。プラスミドｐＤＥ４ は、５．６４２ｂｐの長さをもつプラスミドであり、ＣａＭＶ３５Ｓ３プロモー ター（ＥＰ３５９６１７）の制御下にβ−グルクロニダーゼをコードする遺伝子 （（旦互）　（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８６）　ＰＮＡＳ　８３：８４４７ ］を含む。ｐ’ＤＥ４の完全な配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　阻２に示されている。プ ラスミドＤＮＡを、室温で４５分間カルス塊と同時インキュベートした。次に、 キュベツトを１０分間氷上に置いた。

その後、６００　Ｖ／ａｍの電界強度をもつ単一のパルスを、９００ｐＦのコン デンサーからカルス塩とＤＮＡの混合物に放出させた。パルスの直後に、各キュ ベツトに液体ＡＡ培地を添加し、カルス塩をベトリ皿（直径３．５ｍｍ）に移し た。液体を除去し、ベトリ皿１枚につき２ｍｌのＡＡ培地と交換した。カルス塩 を暗所で５日間培養した。

その後、カルス塩を、［［）（＋１ｅｃｋｅら（１９８９）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｍｏ１．　ａｎｄＣｅｌｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１９８９年１月／り月号、 １９−２７に記載されているような］β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性のイ ンサイチュ検出のため、Ｘ−ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ルグルクロニド）溶液へ移した。３７℃で２４〜４８時間インキュベーションし た後、ＧＵＳ活性の青色有色産物が視認可能であり、立体顕微鏡下で青色部域（ すなわち、ＧＵＢ発現を示す青色細胞）の数を計数した。処理したカルス塩の約 ３０％が１〜数個の青色部域を示していた（コチヒビキ＝４１個の電気穿孔した カルス塩のうち１２個；チョニシキ：３５個の電気穿孔したカルス塩のうち１０ 個）。

１５：イネの−のｔ“１９血立上且芳 イネの栽培品種コチヒビキ及びチョニシキの温室栽培植物の表面殺菌した発達中 のイネの穀粒（乳白段階）から、未成熟の接合体胚を単離した。この未成熟胚を 、胚軸を培地に向けて、固体２Ｎ６培地上に置いた（例１参照）。ブレーティン グした外植体を、２７℃で暗所に保った。培養開始から２〜３週間後、平滑な表 面をもつ小さく緻密な黄色がかったカルス塩が、−次カルスから、そして直接外 植体から成長した。直径０．１ｍｍ〜２．０ｍｍの異なるサイズのこのようなカ ルス塩のうち約３０個を、各々、２５０−の三角フラスコ中の、０．３ｇ／ｆカ ザミノ酸（ビタミン検定）、３０ｇ／ｉ’スクロース及び１　ｍｇ／ｆの２．４ −Ｄを補足した６５−のＮ６液体培地ｊＣｈｕら　（１９７５）前出〕中に移し た。培養の入ったこれらのフラスコを、約１２　Ｏｒｐｍの回転式振どう培養器 上で暗所に保った。継代培養は週１度行なった。最初の継代培養の際（培養開始 から１週間後）、柔らかく白色がかったカルス片を捨て、全ての培地を除去し、 ６５−の新鮮Ｎ６液体培地に交換した。同じ手順を２回目の継代培養（培養開始 から２週間後）でも用いた。最初の２週間、もとのカルス塩はより大きい部片へ と成長した。培養の３週目において、新たに発達した小さい細胞凝集塊がより大 きいカルス塩から分離し始めた。３回目の継代培養では、これらの小さい方の凝 集塊及び大きく黄色い緻密な部片を選択して、新鮮な液体Ｎ６培地へ移した。４ 回目の継代培養では、小さい緻密な黄色の塊のみを選択し、新鮮な培地へ移し、 より大きい塊は捨てた。その後の継代培養では、１〜２−の充実細胞量（ＰＶＣ ）の選択された小さい緻密な黄色い凝集塊を、６５−の新鮮なＮ６培地へ移した 。

６：イネの′　の培　のン 例５のイネの栽培品種コチヒビキ及びチョニシキからの浮遊細胞塊の培養を、以 下のように除草剤耐性遺伝子で形質転換させ、形質転換した細胞をトランスジェ ニック植物へ再生させた。

１、コチヒビキ 電気穿孔に先立って、浮遊細胞塊の培養を樹立し、１８日間Ｎ６培地中で維持し た。２回目の週１度の継代培養から４日後、Ｎ６培地を除去し、電気穿孔緩衝液 ９で細胞塊を洗浄し、次にこの緩衝液中で１時間室温に保った。細胞塊を緩衝液 ９中で再度洗浄し、電気穿孔キュベツトへ移し、約１２０４の緩衝液９中に再懸 濁させた。

Ｈｉ　ｎｄＩＩＩで線形化した約１３ｔｉｇのｐＤＥｌｌｏ　ＤＮＡを各キュベ ツトに添加し、緩衝液９中の細胞凝集塊とＤＮＡの混合物を、まず室温で４５分 間、次に氷上で１０分間インキュベートした。

次に、９００ｐＦのコンデンサーから細胞塊とＤＮＡの混合物へ、６５０　Ｖ／ ｃ＋ａの電界強度をもつ単一パルスを放出させた。

次に、キュベツトに液体Ｎ６７培地を添加し、電気穿孔した細胞塊を、５　ｌ１ １ｇ／ｌのＰＰＴを補足した固体のＮ６７培地へ移した。２３日後、発達中のカ ルスを、新鮮なＮ６７培地にＰＰＴを加えたものへ移した。選択Ｎ６７培地上で さらに２１日経過した後、選択したカルスを選択再生培地へ移した。再生培地上 で３５日経過後、苗条をホルモンな一含まないＮ６培地へ移した。各々のカルス について、約１００Ｉ１１の高さの３つのインビトロ小植物を土壌に移し、温室 へ移した。

類似の実験においては、浮遊細胞凝集塊の培養を、培養の樹立から６日後又は１ ２日後に電気穿孔した。これらの実験からは、形質転換されたカルスが得られ、 それらからトランスジェニック植物を再生させた。

２、ヂョニシキ 例６．１においてコチヒビキについて上述したものと基本的に同じ手順を用いて 、浮遊細胞塊の培養を樹立し、維持した。ただし、３回目の週１度の継代培養の ４日後に、電気穿孔のための細胞塊を収穫した。電気穿孔、その後のカルスの開 始及び増殖、そして植物の再生も、基本的に例６．１に記されているとおりに行 なった。いくつかの細胞塊はｐＤＥ１］、ｏを用いて電気穿孔し、その他の細胞 塊は、キメラ互旦工遺伝子と、Ｐ　’７”　７２、ＰＴ４２及びＰＥＩというイ ネの難度特異的プロモーター（Ｗ０９２１００２７４）のいずれかの制御下にバ ースター（ｂａｒｓｔａｒ）をコードするＤＮＡを含むもう１つのキメラ遺伝子 とを両方含んでいたプラスミドＤＮＡを用いて電気穿孔した。

７：　１６のトランスジェニック１１ｔ！２つの独立したトランスジェニックカ ルス系統から誘導された例６．１の６体のコチヒビキ植物を、温室内で栽培し、 Ｂａ５ｔａを噴霧し、Ｂａ５ｔａ耐性であることがわかった。

各々異なるトランスジェニックカルス系統から誘導されたＫＢ２５及びＫＢ２８ と呼称される２つの植物を詳細に解析した。両方の植物共、ホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＦＡＴ）活性についての酵素検定において陽性と 評定された。

サザン解析のためには、イネのゲノムＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ、Ｂ　ｇ　１ ．　ＩＩ及びＰｖｕＵで消化し、サザンブロッティングし、ｐＤＥ］、１０ＤＮ Ａでプローブした。両方の植物において、ｐＤＥ１１０由来のＤＮＡは、単一の Ｘｈｏ　Ｉ制限フラグメント上にあることがわかった。ＫＢ２５及びＫＢ２８は 両方共、１．５４ｋｂのＢｇ１ｍフラグメント及び１．６５ｋｂのＰ　ｖ　ｕ　 Ｈフラグメントにより示されるように、完全な旦且工遺伝子に連結された機能的 ３５Ｓプロモーターを含んでいた。ＫＢ２５は複数のインサートを担持し、ＫＢ ２８はｐＤＥ１１０由来ＤＮＡを１〜４コピー担持していた。両方の植物は、共 に種子を生ずることがわかった。

ｐＤＥｌｌｏでの形質転換後、例６．２の選択されたカルスから再生させた植物 を、温室内で栽培し、Ｂａ５ｔａを噴霧し、Ｂａ５ｔａ耐性であることがわかっ た。ＣＢ２３と呼称される１つの植物は、ＰＡＴ検定で陽性と評定され、コチヒ ビキについて上述したとおりに実施したサザンハイブリダイゼーションにおいて 、ｐＤＥｌｌｏ　ＤＮＡの１〜３個のほぼ完全なコピーを含んでいることがわか った。

ｂａｒｓｔｅｒ遺伝子を含め、２つのキメラ遺伝子を包含するＤＮＡでの形質転 換の後、例６．２の選択されたカルスから再生された植物は、Ｂａ５ｔ、ａ耐性 であり、ＰＡＴ陽性であり、しかもキメラ旦旦工遺伝子とキメラｂａｒｓｔａｒ 遺伝子の両方を含んでいることがわかった。

未成熟の小穂におけるｂａｒｓｔａｒ遺伝子の発現は、ノーザン解析により決定 した。

配列リスト（配列表） １、一般的情報 １）出願人：　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｎ、Ｖ。

１、発明の名称：単子葉植物細胞の形質転換法ｉ）配列の数：２ ｉｖ）通信用住所： Ａ、宛て先：　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｎ、Ｖ。

Ｂ１通り名：　Ｐｌａｔｅａｕｓｔｒａａｔ　２２Ｃ３郵便番号及び都市名：　 ９０００　ＧｈｅｎｔＤ０国名：ベルギー ■）コンピュータ読取り書式： Ａ、中型５．２５インチ、２ＨＤ、１．２Ｍｂのフロッピーディスク Ｂ、コンピューター：ＩＢＭ　ＰＣ／ＡＴＣ０作働システム：ＤＯＳバージョン ３．３Ｄ、ソフトウェア：　ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔｖｌ）現出願データ：入手 不能 ｖｉｉ）前出願データ：該当せず ２、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１についての情報１）配列の特徴 Ａ、タイプ：核酸 Ｂ、長さ：４．８８３ｂｐ Ｃ１鎖形態：２本鎖 Ｄ、トポロジー：環状 ｌ）分子タイプ：　ｐＤＥ　１１０　：Ｅ、　ｃｏｌｉ内で複製可能なプラスミ ドＤＮＡ １ｘ）特徴： １−３９５：ｐＵｃ１８由来の配列 ３９６−１７７９　：カリフラワーモザイクウィルス単離株ＣａｂｂＢ−ＪＩ由 来のｒ３５Ｓ３Ｊプロモーター配列１７８０−２３３１　：ホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のコーディング配列 ２３３２−２６１９　：知コあ巴匡妖憇Ｔ−ＤＮＡツバリンシンターゼ遺伝子由 来のポリアデニル化部位を含む３′調節配列２６２０−４８８３　：　ｐＵｃｌ 　８由来の配列その他の情報ニブラスミドはＥ、　ｃｏｌｉ内で複製可能であり 、細菌にアンピシリン耐性を付与する。

ｘｉ）配列の記載 ＣＧＧＣｋＴＣＪＧｋ　ＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡ　Ｃ丁ＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡ ＴＡＴ’Ｇ（Ｇ　ＧＴＧ丁ＧＡＡＡＴＸ　２００ＣＣＧＣλＣＡＧＸＴ　ＧＣｆ ｆＴＡλＧαＡＧＡλ入λＴ入ｃｃａｃ　λＴＣＴＣＧＣＧＣＧ　λ丁ＴＣＧＣ Ｃλ丁？　２５０ＧＣＣＣＪＣｋＴＣＣＧＣＣ’ＧＴＧＣ（ＪＣＣＧＡＧＧＣ’ ＣＧＡＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＧ　ＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴ　１Ｂ５０ＣＧＴＣｕＣ ＣＸＣＴＡＣＡ’ｌ’ＣＧＮＧＡ　ＣλλＧＣλＣＧＧＴ　Ｃ入λＣＴ丁ＣＣＧ Ｔ　λＣ０（ＪＧＣＣＧＣ１９００ＧＧ（：ＣＣ０ＣＴＧＧ　入ｋｃＨ２ｃ１ｃ ＧｃＪ、ｋｃＱｃｃＴｋｃＧλ　（’ＴＧＱＡＣＯＧＣＣ（１１（１？ｃ（ｕｃ ｃＧ　２０５０Ｔλ０Ｔ八ＧＸ、ＴＣＧ　ＧＧ入八へ入ＴＣＣＴ　ＣτλＧ入Ｇ ＴＣ（Ｊ　ＣＣＴＧＣλＧＧＣλＴＧＣ入ＡＧＣＴＴＧ　２６５０ＣＣＴ入ｈＴ ＯＡＧＴ　ＧＸＧＣＴ入λＣτＣλＣλＴＴＡ７ＬＴＴＧ　ＣＧ？ＴＧＣＧＣＴ ＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴ　２Ｂ００丁ＴＣＣ八ＧＴＣＧＧ　ＧＡ入九九（？ＴＧ ＴＣＧＴＧＣＣλＧＣτＧ　ＣＡＴＴＡλＴＧ入Ａ　ＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧ　２ ８５０ＣにＣＧＣＧ（ＪＧＡ　ＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴ’ＴＧＧＧＣＧ　 Ｃ？Ｃ丁ＴＣＣＧＣＴ　ＴＣＣＴＣＧＣＴＣ入　２９００ＣＴＧＸＣＴＣＧＣＴ 　ＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧλＧＣＧＧＴ　ＡＴＣＡ ＧＣτＣＡＣ２９５０ＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧ　ＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴ　ＡＴＣＣ ）％ＣＡ（ＪＸ　ＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡ　ＡＣＧＣＡＧＧＭ山　３０００Ｇ入八 Ｃ八τＧＴＧＡ　ＧＣ八へ九九ＧＧＣＣＡＧＣＡλＡ入ＧＧＣＣＸＧＧ入ＡＣＣ ＧＴ　Ａ九九入λＧＧＣＣＧ　３０５０ＣＧτ丁ＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣ ＪＩＴ　ＡＧＧＣＴＩ：’ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡ　Ｇ（ＪτＣＡＣ入Ａ Ａ　３１００ＡＸτＣＧＩＣＧＣτ　Ｃ九九ＧＴ（ＪＧ入Ｇ　ＧＴＧＧＣＧＡ入 入ＣＣＣ九九ＣＪＧＧ入ＣＴＡ丁λｕＧλＴＡ　３１５０ＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴ 　ＣＣ０ＣＴＧＧＡ入　ＧＣ’！’ＣＣ！：ＴＣＧＴ　ＧＣＧＣＴＣτＣＣ！’ ！’　ＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣ３２００ＴＧＣＣにＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴ Ｇ　ＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣ？ＣＣＣＴＴＣＧＧＧ　λ入ＧＣＧＴＧＧＣＧ　３２ ５０Ｃ”ＴＴＴＣＴＣ’入Ａ丁　ＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧ　Ｔ入ＧＧＴ入ＴＣ’ｊ ’ＣＡＧＴτＣＧＧＴＧＴ　λＧＧＴＣＧτＴＣＧ　３３００ＣＴＣＣ７ｕＧＣ ＴＧ　ＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴ’ＴＣλＧＣＣＣＧＡ ＣＣＧＣＴＧＣＧ　３３５０ＧＧ丁丁ＡＴＣ’ＣＧＧ　丁九九ＣＴ入ＴＯＧＴ　 ＣＴＴ（ＪｋＧＴＣＣＡ　ＡＣＣＣＧＧＴＪＬＡＧ　λＣ入ＣＧＡＣＴＴＸ　３ ４００ＴＣＧＣ（ＪＣＴＧＧ　ＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣ’　ＴＧＧＴＡｊｋＣＡＧ Ｇ　ＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧ　ＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴ　３４５０人ＧＧＣＧＧＴＧ ＣＴλＣ入ＧＡＧＴＴＣＴ　ＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧ　ＧＣＣＴＡＡＣＴ入ＣＧＧ ＣＴλＣ入Ｃ７Ａ　３５００ＧＡＮＧ（ＪＣＸＧＴ　λＴ丁ＴＣＧＴＸＴＣＴＧ ＣＧＣ’！’Ｃ？ＧＣＭ入λＧＣ（ＪＧＴ　？ＡＣＣＴＴＣＧＧＡ　３５５０丁 ＴＣＧＧＧＧＣＣＪλ入入Ａ九九ＣＴＣλλ　ＧＧ入ＴＣτＴ入ｃＣＧＯτＧＴ ＴＧ入σＡτＣＣλＧＴＴＣＧλ　４５５゜λＴＡ入λλλＴＡＧ　ＧＣＧＴＡ ＴＣλＣＧ　ＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧτＣ４Ｂ８３３、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎａ２に ついての情報１）配列の特徴 Ａ、タイプ：核酸 Ｂ、長さ：６，６４２ｂｐ　。

Ｃ９鎖形態：２本鎖 り、ｌ−ボロジー；環状 １）分子型＋　ｐＤＥ４　：Ｅ、　ｃｏｌｉ内で複製可能なプラスミドＮＡ ｉｘ）特徴： １−３９５　＋ｐＵＣ１８由来の配列 ３９６−１２８４＋力リフラワーモザイクウイルス単離株ＣａｂｂＢ−ＪＩ由来 のｒ３５　Ｓ　３Ｊプロモ一ター配列１２８５−３０９３　：β−グルクロニダ ーゼ遺伝子のコーディング配列 ３０９４−３３７８　＋Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　Ｔ−ＤＮＡツバリンシ ンターゼ遺伝子由来のポリアデニル化部位を含む３′調節配列３３７９−５６４ ２：ｐＵｃ１８由来の配列その他の情報ニブラスミドはＥ、　ｃｏｌｉ内で複製 可能であり、細菌にアンピシリン耐性を付与する。

ｘｉ）配列の記載 ＣλＧＧＣＴＧＣＧＣ入ＡＣＴＧＴＴＧＧＧ　λＸＧＧＧＣＧλＴＣＧＧＴＧＣ Ｃ；ＧＧＣＣ’　ＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴ　３００ＴＸＣＧＣＣＸＧＣＴ　ＧＧＣ ＧＩＬＩＧＧＧ　Ｇα入τＧ〒ａＣ〒Ｇ　（ＩＪＡＧＧｃＧλ？？　ｘｘＧ’ｒ ｒａａａｒｘ　３４５０ＴＧＧＴＧＧＣＣＡ７ｉ　ＴＧにＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣ ＧＴＴＣＡ五ＣＴＧＣＧＴ（ＪＴＧＣＧＧＡＴＣＡ７ＬＣＡＧ　１９５０ＧＴＧ ｌ’２ＴＴＧＣ入λＣ丁ＱＣλＣ入λＧＧＣλＣ〒入ａｃａｃａ　入ＣＴＴＴＧ ＣλλＧ　丁ａａτＧλλＴＣＣ２０００ＣＧ（ＪＪｔＣＪＧＣＪＴ　Ｘ〒’ｘ ａｃａｃａｒ丁　ＧＧＣＧＧτλＡαλλσ入Ｘ）ＩＧＧ（ｉλＴ　ｃτテ（Ｊ ＣＴＣＧＣコ０００Ｃ？ＧＣＣＣにＣＴＴ　ＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧ　Ａλ入ＣＣ ’ＴＧＴＣＧ　ｒＧｃｃλＧＣＴＧＣ入Ｔτ九九τＧ入λＴ　３６００ＣＧＣ（ ＪＴ７１ＪＴＡ　ＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡ　？’ＡＧＣＪＧＡＲＣＴ　？！’λＷ ＧＴＧＣＴＣλＴＣ入’！’ＴＧＧ　５２５０’ＡＡ）ＪｋＣＧＴ丁ｃＴ　ＴＣ ＧＧ（：ＧＣＧ入λ　入λＣＴＣＴＣＪＸＧ　Ｇ入τＣτＴ入Ｃｃに　ＣτＧＴ ＴＧｋＱ１Ｔ　５３００ＣＡＴＴＡλＣＣＴＡ　τ九九入入λＴ入ＧＧ　ＣＧＴ λＴ（ＪＣＧλ　ＧＧＣＣＣＴＴτＣＧ　ＴＣ５ｇ４２国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　９３００９０５ Ｓ＾　７３３８４

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．単子葉植物、特にイネ科植物の細胞のゲノム、特に核ゲノムを、遺伝的に形 質転換するための方法において、各々の細胞がその植物細胞壁の少なくとも一部 を有し、細胞浮遊培養のような浮遊細胞の培養の一部を成すか又は成すことがで きる、前記植物の細胞、好ましくはかかる細胞の凝集塊を、ＤＮＡフラグメント を用いて電気穿孔する工程 を舌むことを特徴とする方法。
2. ２．特に浮遊イネ細胞について、４ヵ月より若い、好ましくは３ヵ月より若い浮 遊細胞の培養を電気穿孔する、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記浮遊細胞の培養の大部分の細胞、好ましくは７５％以上、特定的には８ ０％以上、きわめて特定的には９０％以上が、正常な染色体数を有する、請求の 範囲第２項記載の方法。
4. ４．前記浮遊細胞の培養が、再生可能な細胞浮遊培養、特に胚形成性細胞浮遊培 養である、請求の範囲第２項又は第３項記載の方法。
5. ５．前記形質転換された細胞から、形質転換され、表現型が正常な植物を再生す る工程を付加的に含む、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項記載の方法。
6. ６．前記単子葉植物が、イネ、特に栽培品種ニッポンバレ又はコチヒビキである 、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の方法。
7. ７．前記電気穿孔を、３０〜１５０ｍｇ、好ましくは７５〜１００ｍｇの前記浮 遊細胞の培養の細胞凝集塊、及び５０〜３０μｇ、好ましくは１０〜２０μｇの 前記ＤＮＡフラグメントを、好ましくは１００〜２００μｌの電気穿孔緩衝液中 に含んでいるキュベットの中で行なう、請求の範囲第２項〜第６項のいずれか１ 項記載の方法。
8. ８．電気穿孔を６００〜７００ｖ／ｃｍの電圧及び８００〜９００μＦの静電容 量をもつコンデンサーから単一のパルスを放出させることによって行なう、請求 の範囲第７項記載の方法。
9. ９．請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項記載の方法によって作られた、単 子葉植物、特定的にはイネ科植物、きわめて特定的にはイネ、小麦又は大麦のよ うな穀物の、形質転換された細胞。
10. １０．請求の範囲第９項記載の細胞から実質的に構成されている、形質転換され た単子葉植物、特定的にはイネ科植物、きわめて特定的にはイネ、小麦又は大麦 のような穀物。
11. １１．請求の範囲第１０項記載の植物の種子。