KR20190077560A - 만능성 줄기 세포 분석 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 만능성 줄기 세포 (PSC)로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 만능성 줄기 세포 (PSC)를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은: ROCK 저해제를 포함하는 배지 중에 라미닌-521 및 E-카드헤린으로 코팅된 기질에서 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포에서 잔류하는 미분화된 PSC의 마커의 발현을 정량화하는 단계; 및 상기 배양된 세포에서 마커 발현을, PSC의 알려져 있는 비율을 포함하는 참조 세포 배양물에서 마커 발현과 비교하는 단계를 포함하고, 상기 세포 배양물에서 마커 발현이 상기 참조 세포 배양물에서 마커 발현보다 더 적으면, 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하는 것을 나타내거나, 또는 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 참조 세포 배양물 중에 PSC의 알려져 있는 비율보다 더 적은 비율로 존재하는 것을 나타낸다. 본 발명은 또한 치료용 조성물을 제조하는 방법 및 피험체에서 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

만능성 줄기 세포 분석
본 발명은 만능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell: PSC)로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 만능성 줄기 세포 (PSC)를 검출하는 방법에 관한 것이다.
배아 줄기 세포 (Embryonic Stem Cell: ESC)와 유도 만능성 줄기 세포 (induced Pluripotent Stem Cell: iPSC)를 포함하는 만능성 줄기 세포 (PSC), 구체적으로 인간 PSC는 신규한 세포-기반 치료 제품을 개발할 수 있는 기회를 제공한다.
iPSC의 분화된 유도체는 다양한 질병 적용 (예컨대 간경화, 파킨슨병, 연령-관련 황반 변성, 심장 허혈 (cardiac ischemia), 당뇨병, 이식편대 숙주 질환 (graft-versus host disease))에서 치료적 효능을 갖는다.
그러나, PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물의 임상 시험에서의 사용에서 몇 가지 문제점, 구체적으로 최종 산물 중에 종양 형성에 대한 가능성이 알려져 있는 잔류하는 미분화된 PSC가 존재한다는 것이다. 이러한 문제점은 특히 고용량의 분화된 PSC-유래된 세포를 필요로 하는 요법과 관련이 있다.
따라서, PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물을 제조할 때 품질 관리에서 사용되기 위해, PSC로부터 유래된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 검출하는 방법, 또는 개선된 방법을 필요로 한다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌이 참고로 본원에 통합된다. 그러나 어떤 문헌이 본원에 언급되는 경우, 그러한 참고 문헌은 해당 문헌이 오스트레일리아나 기타 다른 국가에서의 당해 기술분야에서 통상의 지식의 일부를 형성한다고 인정하는 것은 아니다.
본 발명자들은 PSC-유래된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 검출하는 방법을 개발하여 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물의 제조에서 품질 관리의 필요성을 언급하였다. 상기 방법은 잔류하는 미분화된 PSC에 대한 민감성 (참 양성 (true positive)) 및 특이성 (참 음성 (true negative))을 증가시키기 위해 단일화되고 (singularised), 미분화된 PSC의 증식을 위한 세포 배양 프로토콜에 의존한다.
따라서, 제1 양상은 PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 만능성 줄기 세포 (PSC)를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
Rho-결합된 코일형-코일 함유 단백질 키나제 (Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase: ROCK) 저해제를 포함하는 배지 중에 라미닌-521 (laminin-521) 및 E-카드헤린 (E-cadherin)으로 코팅된 기질에서 세포를 배양하는 단계;
상기 배양된 세포에서 잔류하는 미분화된 PSC의 마커의 발현을 정량화하는 단계; 및
상기 배양된 세포에서 마커 발현을, PSC의 알려져 있는 비율을 포함하는 참조 세포 배양물에서 마커 발현과 비교하는 단계를 포함하고,
상기 세포 배양물에서 마커 발현이 상기 참조 세포 배양물에서 마커 발현보다 더 적으면, 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하는 것을 나타내거나, 또는 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 참조 세포 배양물 중에 PSC의 알려져 있는 비율보다 더 적은 비율로 존재하는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 상기 방법이 품질 관리를 위한 개선된 수단을 제공하고, PSC-유래된 세포에 의존하는 치료법의 안전성, 나아가서는 진보에 중요하게 기여한다고 제안하였다.
따라서, 일 구체예에서, 상기 방법은 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물을 치료용 조성물로 제제화하는 (formulating) 단계를 더 포함한다. 상기 방법은 상기 치료용 조성물을 피험체에게 투여하여 피험체에서 병태 (condition)를 치료 또는 예방하는 것을 더 포함할 수 있다.
제2 양상은 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 제1 양상의 방법에 의해 검출될 때 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물을 피험체에게 치료적 투여를 위한 조성물로 제제화하는 단계를 포함한다.
제3 양상은 피험체에서 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피험체에게 하기를 투여하는 단계를 포함한다:
상기 제1 양상의 방법에 의해 검출될 때 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물; 또는
상기 제2 양상의 방법에 의해 제조되는 치료용 조성물.
상기 제3 양상의 대안의 형태는 피험체에서 병태를 치료 또는 예방하기 위한 치료용 조성물과 같은 약제의 제조에 있어서, 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물의 용도로서, 상기 PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC는 상기 제1 양상의 방법에 의해 검출된다.
상기 제3 양상의 다른 대안의 형태는, 피험체에서 병태를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위해 하기를 제공한다:
상기 제1 양상의 방법에 의해 검출될 때 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물; 또는
상기 제2 양상의 방법에 의해 제조되는 치료용 조성물.
예방 또는 치료될 병태는 골 낭종, 골 신생물, 골절, 연골 결손, 골관절염, 인대 손상, 골형성 부전, 골괴사증, 골다공증, 재생불량성 빈혈, 이식편대 숙주 질환 (GvHD), 골수형성이상 증후군, 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 자가면역성 간염, 간경화, 간부전, 확장 심근병, 심부전, 심근 경색, 심근 허혈, 크론병, 궤양성 대장염, 화상, 물집표피 박리증, 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌병, 전신 경화증, 기관지폐형성 이상증, 만성 폐쇄성 기도 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 알츠하이머병, 뇌손상, 실조 (ataxia), 퇴행성 디스크 질환, 다계통 위축 (multiple system atrophy), 다발성 경화증, 파킨슨병, 색소성 망막염, 롬버그병 (Romberg's disease), 척수 손상, 뇌졸중, 근육퇴행 위축, 사지 허혈, 신장 손상, 루푸스 신염, 자궁 내막증 및 골수 또는 고형 장기 이식의 합병증일 수 있다.
제4 양상은 PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 검출하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트를 하기를 포함한다:
라미닌-521; 및
E-카드헤린; 및
ROCK 저해제.
일 구체예에서, 상기 키트는 상기 제1 양상의 방법에 따라 사용된다.
도 1은 인간 라미닌-521 α　사슬의 아미노산 서열의 예이다 (서열 번호: 1).
도 2는 인간 라미닌-521 β　사슬의 아미노산 서열의 예이다 (서열 번호: 2).
도 3은 인간 라미닌-521 γ　사슬의 아미노산 서열의 예이다 (서열 번호: 3).
도 4는 인간 E-카드헤린의 아미노산 서열의 예이다 (서열 번호: 4).
도 5는 인간 LIN28 (LIN28A)의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 5).
도 6은 인간 OCT4 (POU5F1)의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 6).
도 7은 인간 SOX2의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 7).
도 8은 인간 FOXD3의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 8).
도 9는 인간 NANOG의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 9).
도 10은 인간 PODXL의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 10).
도 11은 인간 REX1 (ZFP42)의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 11).
도 12는 인간 SSEA1 (FUT4)의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 12).
도 13은 인간 DPPA2의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 13).
도 14는 인간 DPPA3의 코딩 뉴클레오티드 서열의 예이다 (서열 번호: 14).
본원에 PSC로부터 유래된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 검출하는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 PSC-유래된 세포는 피험체에게 치료적 투여가 예정되어 있다. 따라서, 본 발명은 품질 관리 및 위험의 최소화, 예를 들어 상기 잔류하는 미분화된 PSC로부터 종양 형성의 위험을 최소화하는 개선된 방법을 제공한다.
상기 방법은 PSC 클론 성장을 지원하는 조건하에 미분화된 PSC를 증식시킨 후에, PSC에서는 고도로 발현되지만, 그러나 분화를 겪은 PSC-유래된 세포에서는 발현되지 않거나 또는 최소로만 발현되는 유전자의 발현을 정량화하는 특정 배양 조건에 의존한다. 상기 배양 조건은 PSC의 증식을 단일 세포 수준에서 선택적으로 지원할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 PSC는 단일 세포 현탁액으로부터 PSC 성장을 지원하는 조건하에 배양될 수 있다. 이러한 배양 조건은 당 분야에 알려져 있고, 본원에 개시된 바와 같은 라미닌-521 및 E-카드헤린뿐만 아니라 Cellartis iPSC 단일-세포 클로닝 DEF-CS 배양 배지 키트, GibcoTM StemFlexTM 배지 및 비트로넥틴 (vitronectin) 상에 단일 세포 성장과 결합된 PluriQTM G9TM 클로닝 배지를 포함하는 상업적으로 입수가능한 시스템을 포함한다.
시험 배양물에서 마커 발현이 미분화된 PSC의 알려져 있는 비율을 갖는 참조 배양물에서 마커 발현 정도 또는 그 이하인 경우, 상기 시험 배양물은 참조 배양물보다 더 적은 비율의 미분화된 PSC를 포함하는 것을 나타낸다.
중요하게도, 상기 방법은 PSC-유래된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 총 세포 수의 적은 비율, 예를 들어 0.001% 또는 10 ppm으로 검출할 수 있다.
본 명세서에서 다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 통상의 기술자 또는 공개된 문헌을 참고하여 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
"a" 또는 "an"이라는 용어는 하나 이상을 의미하는 것으로, 예를 들어, "분자"는 하나 이상의 분자를 나타내는 것으로 이해해야 한다. 이와 같이, 용어 "a" 또는 "an", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
하기 청구범위 및 본 발명의 설명에서, 명시적인 언어 또는 필수적인 함축으로 인해 문맥이 달리 요구하는 경우를 제외하고, 용어 "포함하다" 또는 이들의 파생어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 포괄적인 의미로 사용되며, 즉 기재된 특징의 존재를 명시하지만, 발명의 다양한 구체예에서 추가적인 특징의 존재 또는 부가를 배제하지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 주어진 수에 대해 그 수의 크기의 ± 25 % 값의 범위를 예상한다. 다른 구체예에서, 용어 "약"은 주어진 수에 대해 그 수의 크기의 ±20%, ±15%, ±10%, 또는 ±5% 값의 범위를 예상한다. 예를 들어, 일 구체예에서, "약 3 그람"은 2.7 내지 3.3 그람 (즉, 3 그람 ± 10 %) 등의 값을 나타낸다.
유사하게, 다른 구체예에서, 시간의 기간은 상기 시간의 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, 또는 ±5%까지 가변할 수 있다. 예를 들어, "1일"은 약 18시간에서 약 30시간의 기간을 포함할 수 있다. 다수의 일자의 기간으로 표시된 시간의 기간은 "1일"의 배수일 수 있으며, 예를 들어, 2일은 약 36 내지 약 60시간의 기간에 걸쳐있을 수 있다. 다른 구체예에서, 시간 변화는 감소될 수 있는데, 예를 들어, 1일은 0일로부터 24±3시간; 2일은 0일로부터 48±3시간; 3일은 0일로부터 72±3시간; 4일은 0일로부터 96±3시간; 5일은 0일로부터 120±3시간 등이다. 일부 구체예에서, 약 3일은 3일 ± 1일, 약 5일은 5일 ± 1일이다.
본원에서 사용되는 "만능성 줄기 세포" 또는 "PSC"는 무한정으로 자기 복제하고, 다른 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 만능성 줄기 세포에는 배아 줄기 세포 (ESC)와 유도 만능성 줄기 세포 (iPSC)의 두가지 주요 타입이 있다.
본원에서 사용되는 "배아 줄기 세포" 또는 "ESC"는 체외 수정 요법을 완료하고 잉여 배아를 갖는 환자가 동의한 후 기증한 5 내지 7일 된 배아로부터 분리된 세포를 말한다. ESC의 사용은 인간 배아에서 세포를 추출하는 것에 대한 윤리적인 우려로 어느 정도 장애가 되었다.
치료용 조성물을 제조하는데 적합한 인간 PSC는 H1 및 H9 인간 ESC를 포함한다.
본원에서 사용되는 "유도 만능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 성체 세포 유래의 ESC-유사 세포를 의미한다. iPSC는 ESC와 매우 유사한 특성을 가지고 있지만, iPSC는 배아에서 유래되지 않기 때문에 ESC와 관련된 윤리적인 우려를 피할 수 있다. 대신에, iPSC는 통상적으로 만능성 상태로 돌아가도록 "재프로그래밍된" 완전 분화된 성체 세포로부터 유래된다.
치료용 조성물을 제조하는데 적합한 인간 iPSC는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 섬유모세포 (fibroblast) 유래의 iPSC 19-9-7T, MIRJT6i-mND1-4 및 MIRJT7i-mND2-0 및 골수 단핵세포 유래 iPSC BM119-9를 포함한다. 다른 적합한 iPSC는 미국 위스콘신주 Madison의 Cellular Dynamics International (CDI; Nasdaq: ICEL)에서 입수할 수 있다.
본원에서 사용되는, "분화 (differentiating)"는 하나의 세포 타입에서 다른 세포 타입으로 세포가 변화하는 과정을 말하며, 구체적으로 덜 특화된 타입의 세포가 보다 특화된 타입의 세포가 되는 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는, 용어 "유래된"은 PSC가 다른 세포 타입으로 "분화"되는 것을 포함할 수 있다.
따라서, "미분화된 PSC"는 다른 세포 타입으로 분화되지 않은 PSC이다. 본 개시내용과 관련하여, 상기 미분화된 PSC는 다른 분화된 PSC의 개체군내에 존재한다.
본원에서 사용되는 "배지 (medium)" 또는 그의 복수형태 "배지들 (media)"은 세포의 증식 및 분화를 포함하는 성장을 지원하기 위해 설계된 액체 또는 겔을 나타낸다. 인 비트로에서 세포의 증식 및 분화를 포함하는 성장은 "배양 (culturing)" 세포, 또는 세포 "배양물 (culture)"이라고 한다.
그러나, 독성 대사산물 농도가 증가하고, 영양소 농도가 감소하며, 세포 분할로 인한 세포 수의 증가 때문에, 세포는 무한정으로 배양될 수 없다. 본원에서 사용되는, "계대배양 (passaging)"은 영양소의 새로운 농도, 독성 대사산물의 부재 및 선택적으로 원래 배양물보다 낮은 세포 밀도를 갖는 새로운 세포 배양물을 생산하는 과정을 나타낸다.
세포 배양물, 예컨대 본 발명에 의해 시험될 PSC-유래된 세포 배양물에 대한 계대 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일 수 있다. 바람직하게, 상기 계대 수는 10 또는 미만이다. 더 바람직하게, 상기 계대 수는 5 또는 6이다. 일 구체예에서, 상기 PSC-유래된 세포는 본 방법으로 처리되기 전에 5회의 계대를 수행하였다.
일 구체예에서, 상기 PSC-유래된 세포는 중간엽 줄기 (또는 간질) 세포 (MSC)이다.
일 구체예에서, 상기 ESC-유래된 세포는 MSC이다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 iPSC-유래된 세포는 MSC이고, 이는 또한 iPSC-MSC라고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 "중간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cell)" 또는 "MSC"는 골수, 지방 조직 (지방), 태반 및 제대혈을 포함하는 광범위한 조직으로부터 분리될 수 있는 특정 타입의 줄기 세포를 나타낸다. MSC는 뼈 세포 (골세포), 연골 세포 (콘드로사이트), 지방 세포 (아디포사이트) 및 힘줄에서와 같이 연결 조직 세포의 다른 종류로 분화될 수 있다.
본 개시내용에 따르면, MSC는 중간엽혈관모세포 (mesenchymoangioblast: MCA) 잠재성을 갖는 EMH lin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 원시 중배엽 세포를 통해 PSC로부터 형성될 수 있다. "중간엽혈관모세포 (MCA) 잠재성을 갖는 EMH lin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 원시 중배엽 세포"는 전형적인 원시 줄무늬 및 측판/여분-배아 중배엽 유전자를 발현하는 세포를 나타낸다. 상기 세포는 FGF2에 반응하여 무-혈청 배지에서 중간엽혈관모세포 (MCA) 및 혈관모세포 콜로니를 형성할 가능성이 있다. 상기 용어 EMH lin-는 CD31, VE-카드헤린 내피 마커 (endothelial markers), CD73 및 Cd105 중간엽/내피 마커 (mesenchymal/endothelial markers), 및 CD43 및 CD45 조혈 계통 마커 (hematopoietic lineage markers)의 발현이 결여됨을 나타낸다.
본원에서 사용되는, "중간엽" 또는 "중간엽의"는 중배엽으로부터 유도되고, 조혈 조직 (림프계 및 순환계) 및 뼈 및 연골과 같은 결합 조직으로 분화하는 배아 결합 조직을 의미한다. 그러나 MSC는 조혈 세포로 분화되지는 않는다.
MSC는 시토킨, 케모킨 및 성장인자와 같은 생체활성 분자를 분비하고, 면역계를 조절하는 능력을 갖는다. MSC는 이식 (engraftment)에 의존하지 않고 면역계에 대한 재생 효과를 촉진하는 것으로 나타났다. 즉, 상기 MSC 자체가 반드시 숙주에 통합되는 것은 아니며, 오히려 이들은 그 효과를 발휘할 수 있고 그 다음에 단기간 내에 제거된다. 그러나, MSC는 투여 및 이동 후에 손상된 조직으로 이식될 수 있다.
MSC는 현재 이식편대 숙주 질환을 포함하는 다수의 병태, 질환 및 장애의 치료에 대한 임상 시험 중에 있다.
특히 T 세포를 억제함으로써 면역조절/면역억제 효과를 발휘할 수 있는 MSC의 능력은 이식편대 숙주 질환, 자가면역 질환을 포함한 면역 질환, 심혈관 질환, 정형외과 질환 및 이식된 고형 장기의 거부를 포함하는 광범위한 병태, 질환 및 장애에 있어서 MSC의 치료 효과의 중심에 있다고 여겨진다. 일부 구체적인 예로는 골 낭종, 골 신생물, 골절, 연골 결손, 골관절염, 인대 손상, 골형성 부전, 골괴사증, 골다공증, 재생불량성 빈혈, 골수형성이상 증후군, 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 자가면역성 간염, 간경화, 간부전, 확장 심근병, 심부전, 심근 경색, 심근 허혈, 크론병, 궤양성 대장염, 화상, 물집표피 박리증, 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌병, 전신 경화증, 기관지폐형성 이상증, 만성 폐쇄성 기도 질환, 폐기종, 폐 섬유증, ALS, 알츠하이머병, 뇌손상, 실조, 퇴행성 디스크 질환, 다계통 위축, 다발성 경화증, 파킨슨병, 색소성 망막염, 롬버그병, 척수 손상, 뇌졸중, 근육퇴행 위축, 사지 허혈, 신장 손상, 루푸스 신염, 자궁 내막증 및 골수 또는 고형 장기 이식의 합병증을 포함한다.
MSC는 상처 치유에 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각되는데, 예를 들어 간경화 및 간부전과 같은 소화계, 근골격계, 치주 조직, 당뇨병성 사지 허혈, 골 괴사, 화상 관련 질환, 심근 경색, 각막 손상, 뇌, 척수, 폐 및 방사선 피폭 치료에서의 조직 손상 및 퇴행성 질환의 치료에 효과가 있는 것으로 나타났다.
MSC는 이식편대 숙주 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 크론병, 다계통 위축증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증 및 뇌졸중을 포함하는 면역 질환에서 치료 결과를 보여줬다.
MSC는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식 세포 및 자연 살해 세포에 대한 면역억제 활성을 발휘하는 것으로 나타났다. 이론에 국한되지 않고, 그 기저 메카니즘은 예를 들어 산화질소, 인돌아민 2,3, 디옥시게나제, 프로스타글란딘 E2, 종양 괴사 인자-유도성 유전자 6 단백질, CCL-2 및 프로그램된 사멸 리간드 1과 같은 면역억제성 매개체를 포함할 수 있다. 이러한 매개체는 예를 들어 IFNγ, TNFα 및 IL-17과 같은 염증성 시토킨에 의해 자극될 때까지 낮은 수준으로 발현된다.
iPSC-유래된 MSC (iPSC-MSC)는 직접 입수된 MSC, 즉 골수, 제대혈, 지방 조직과 같은 조직으로부터 유래되는 MSC보다 독특한 이점을 가지며, 이는 iPSC의 인 비트로 증식으로 MSC의 사실상 무제한 공급을 제공할 수 있기 때문이다.
iPSC-MSC는 실시예 1에 따라 생산될 수 있다.
PSC는 내배엽, 외배엽 및 중배엽 중 어느 것의 임의의 세포 타입으로 분화될 수 있다. PSC는 기능성 세포로 더 분화되는 다능성 선조 세포로 분화한다. 그러므로, 상기 MSC의 설명은 예시되는 것이고, 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, PSC-유래된 세포의 다른 예로는 하기를 포함할 수 있다: 적혈구, B 림프구, T 림프구, 자연 살해 세포, 중성구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포 및 혈소판을 포함하는 모든 타입의 혈액 세포를 생성하는 조혈 줄기 세포; 뇌에서 신경 세포 (뉴런), 및 비-신경 세포의 2개의 범주인, 별아교세포와 희소돌기아교세포 (oligodendrocytes)로, 3가지 주요 세포 타입을 생성하는 신경 줄기 세포; 흡수 세포 (absorptive cells), 배상 세포 (goblet cells), 파네스 세포 (Paneth cells) 및 장내분비 세포 (enteroendocrine cells)를 생성하는 소화관계 상피 줄기 세포; 및 표피의 기저층에서 나타나고 각질형성세포 (keratinocytes)를 생성하고, 또한 모낭의 기저에서 나타나고 모낭과 표피 모두를 생성하는 피부 줄기 세포.
본원에서 사용되는, "기질 (substrate)"은 PSC 및/또는 PSC로부터 유래된 세포를 배양하는데 적합한 임의의 재료이다. 예로는 플라스틱 배양 제품 예컨대 디쉬 (dishes), 멀티-웰 플레이트 (multi-well plates) 및 플라스크를 포함한다.
본원에 개시된 모든 단백질은 당분야의 기술자에게 알려져 있고, 상업적으로 입수가능하다.
라미닌-521은 인간 PSC에 의해 분비된 헤테로트리머 (heterotrimeric) 단백질이다. 라미닌-521은 5개의 α 사슬, 2개의 β 사슬 및 1개의 γ 사슬 (즉 α5β2γ1)을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 α 사슬, β 사슬 및 γ 사슬은 각각 서열번호: 1, 2 및 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는다 (도 1, 2 및 3).
E-카드헤린은 상피 세포 기능과 관련된 칼슘-의존성 세포 부착 단백질이다. 일 구체예에서, 인간 E-카드헤린은 서열 번호: 4로 나타내는 아미노산 서열을 갖는다 (도 4).
본 방법을 수행할 때, 상기 기질은 약 0.1　μg/mL, 0.2　μg/mL, 0.3　μg/mL, 0.4　μg/mL, 0.5　μg/mL, 0.6　μg/mL, 0.7　μg/mL, 0.8　μg/mL, 0.9　μg/mL, 1　μg/mL, 2　μg/mL, 3　μg/mL, 4　μg/mL, 5　μg/mL, 6　μg/mL, 7　μg/mL, 8　μg/mL, 9　μg/mL, 또는 10　μg/mL 및/또는 약 0.1　μg/cm2, 0.2　μg/cm2, 0.3　μg/cm2, 0.4　μg/cm2, 0.5　μg/cm2, 0.6　μg/cm2, 0.7　μg/cm2, 0.8　μg/cm2, 0.9　μg/cm2, 1　μg/cm2, 2　μg/cm2, 3　μg/cm2, 4　μg/cm2, 5　μg/cm2, 6　μg/cm2, 7　μg/cm2, 8　μg/cm2, 9　μg/cm2, 또는 10　μg/cm2을 사용하여 라미닌-521로 코팅될 수 있다.
상기 기질은 약 0.1　μg/mL, 0.2　μg/mL, 0.3　μg/mL, 0.4　μg/mL, 0.5　μg/mL, 0.6　μg/mL, 0.7　μg/mL, 0.8　μg/mL, 0.9　μg/mL, 1　μg/mL, 2　μg/mL, 3　μg/mL, 4　μg/mL, 5　μg/mL, 6　μg/mL, 7　μg/mL, 8　μg/mL, 9　μg/mL, 또는 10　μg/mL 및/또는 약 0.01　μg/cm2, 0.05　μg/cm2, 0.1　μg/cm2, 0.2　μg/cm2, 0.25　μg/cm2, 0.3　μg/cm2, 0.4　μg/cm2, 0.5　μg/cm2, 0.6　μg/cm2, 0.7　μg/cm2, 0.8　μg/cm2, 0.9　μg/cm2, 1　μg/cm2, 2　μg/cm2, 3　μg/cm2, 4　μg/cm2, 5　μg/cm2, 6　μg/cm2, 7　μg/cm2, 8　μg/cm2, 9　μg/cm2, 또는 10　μg/cm2을 사용하여 E-카드헤린으로 코팅될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 기질은 10　μg/mL 및 2　μg/cm2을 사용하여 라미닌-521로 코팅되고, 1.1　μg/mL 및 0.22　μg/cm2을 사용하여 E-카드헤린으로 코팅된다.
Rho-결합된 코일형-코일 함유 단백질 키나제 (ROCK)는 세포골격에 작용하여 세포의 형태 및 이동을 조절하는데 주로 관여한다. 그러므로, "ROCK 저해제"는 상기 기능을 저해하고, 본 목적을 위해, "ROCK 저해제"는 iPSC의 생존을 향상시킨다.
일 구체예에서 상기 ROCK 저해제는 Y27632 (CAS No: 129830-38-2)이다. 본 방법에서 사용될 수 있는 다른 ROCK 저해제의 예로는 AS 1892802 (CAS No: 928320-12-1), 파수딜 (Fasudil) 히드로클로리드 (CAS No: 105628-07-7), GSK 269962 (CAS No: 850664-21-0), GSK　429286 (CAS No: 864082-47-3), H 1152 디히드로클로리드 (CAS No: 871543-07-6), 글리실-H 1152 디히드로클로리드 (CAS No: 913844-45-8), HA 1100 히드로클로리드 (CAS No: 155558-32-0), OXA 06 디히드로클로리드, RKI 1447 디히드로클로리드, SB 772077B 디히드로클로리드 (CAS No: 607373-46-6), SR 3677 디히드로클로리드 (CAS No: 1072959-67-1) 및 TC-S 7001 (CAS No: 867017-68-3)이 있다.
세포 배양에서 ROCK 저해제의 농도는 예를 들어 약 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5　μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15　μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 40 μM, 50　μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM 또는 100 μM일 수 있다.
바람직하게, 상기 ROCK 저해제는 Y27632이고, 세포 배양에서 Y27632의 농도는 약 10　μM이다.
본 방법에 따르면, Rho-결합된 코일형-코일 함유 단백질 키나제 (ROCK) 저해제를 포함하는 배지 중에 라미닌-521 및 E-카드헤린으로 코팅된 기질에서 세포를 배양하기 위하여, 상기 세포는 상기 기질 상에 시딩되어야 한다. 상기 기질 상에 세포의 시딩 밀도 (seeding density)는 약 1x102　세포/cm2, 2x102　세포/cm2, 3x102　세포/cm2, 4x102　세포/cm2, 5x102　세포/cm2, 6x102　세포/cm2, 7x102　세포/cm2, 8x102　세포/cm2, 9x102　세포/cm2, 1x103　세포/cm2, 2x103　세포/cm2, 3x103　세포/cm2, 4x103　세포/cm2, 5x103　세포/cm2, 6x103　세포/cm2, 7x103　세포/cm2, 8x103　세포/cm2, 9x103　세포/cm2, 1x104　세포/cm2, 2x104　세포/cm2, 3x104　세포/cm2, 4x104　세포/cm2, 5x104　세포/cm2, 6x104　세포/cm2, 7x104　세포/cm2, 8x104　세포/cm2, 9x104　세포/cm2, 1x105　세포/cm2, 2x105　세포/cm2, 3x105　세포/cm2, 4x105　세포/cm2, 5x105　세포/cm2, 6x105　세포/cm2, 7x105　세포/cm2, 8x105　세포/cm2, 9x105　세포/cm2, 1x106　세포/cm2, 2x106　세포/cm2, 3x106　세포/cm2, 4x106　세포/cm2, 5x106　세포/cm2, 6x106　세포/cm2, 7x106　세포/cm2, 8x106　세포/cm2, 9x106　세포/cm2일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 시딩 밀도는 약 1.1x104　세포/cm2, 1.2x104　세포/cm2, 1.3x104　세포/cm2, 1.4x104　세포/cm2, 1.5x104　세포/cm2, 1.6x104　세포/cm2, 1.7x104　세포/cm2, 1.8x104　세포/cm2 또는 1.9x104　세포/cm2일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 시딩 밀도는 약 1.3x104　세포/cm2이다.
본 방법의 일부로서, 상기 세포는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 초과 동안 배양되고, 그 후에 상기 배양된 세포에서 마커 발현이 정량화될 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 약 5일 동안 배양되고, 그 후에 상기 배양된 세포에서 마커 발현이 정량화된다.
본 방법의 일부로서, 상기 세포는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 초과 동안 ROCK 저해제의 존재하에 배양되고, 그 후에 상기 배양된 세포에서 마커 발현이 정량화될 수 있다.
상기 세포를 ROCK 저해제의 존재하에 배양한 후에, 상기 세포는 ROCK 저해제의 부재하에 추가로 배양되고, 그 후에 상기 배양된 세포에서 마커 발현이 정량화될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세포는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 초과 동안 ROCK 저해제 부재하에 추가로 배양되고, 그 후에 상기 배양된 세포에서 마커 발현이 정량화된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 세포는 ROCK 저해제의 존재하에 약 3일 동안 배양되고, 그 다음에 ROCK 저해제의 부재하에 약 2일 동안 더 배양되고, 그 후에 상기 배양된 세포에서 마커 발현이 정량화되었다.
요약하면, 라미닌-521 및 E-카드헤린으로 코팅된 기질, 예컨대 플라스틱 배양 제품에서 PSC-유래된 세포, 예컨대 MSC의 증식으로, PSC-유래된 세포의 개체군내에 존재하는 단일화되고, 미분화된 PSC의 증식을 지원하고, 동시에 ROCK 저해제는 PSC의 생존을 증강시킨다는 것을 입증하였다.
본원에서 사용되는, "마커 발현 (marker expression)"은 잔류하는 미분화된 PSC에서 발현되지만, PSC-유래된 세포에서는 발현되지 않거나 또는 더 적은 수준으로만 발현되는 유전자를 나타낸다. 이러한 유전자는 코딩 또는 비-코딩, 예를 들어 mRNA, 마이크로RNA, 또는 비-코딩 RNA일 수 있다.
본 방법에 따라 발현이 정량화될 수 있는 마커는 LIN28 (LIN28A), OCT4 (POU5F1), SOX2, FOXD3, NANOG, PODXL (항체 TRA-1-60 및 TRA-1-81에 의해 검출되는 단백질 이소형태), REX1 (ZFP42), SSEA1 (FUT4), SSEA4, DPPA2 및 DPPA3을 포함한다. 바람직하게, 마커 발현은 LIN28 발현이다. 상기 LIN28 유전자는, 만능성을 촉진하고 또한 PSC에서는 고도로 발현되지만, 분화에 반응하여 하향-조절되는, RNA-결합 단백질인 LIN28 단백질을 코딩한다.
"마커 발현"은 단백질 또는 mRNA 발현으로 정량화될 수 있다. 바람직하게, 마커 발현은 mRNA 발현으로 정량화된다.
마커 단백질은 겔 전기영동 (예컨대 웨스턴 블롯 또는 2차원 겔 전기영동), 밀도측정계 (densitometry), 형광, 발광, 방사능, 어레이 및/또는 질량 분광분석법을 포함하는 과정에 의해 정량화될 수 있다.
마커 mRNA는 겔 전기영동 (예컨대 노던 블롯), 밀도측정계, 형광, 발광, 방사능, 어레이 및/또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 과정에 의해 정량화될 수 있다. PCR은 일반적으로 마커 mRNA로부터 마커 cDNA를 생성하기 위해 역전사에 의존한다.
바람직하게, 마커 발현은 PCR을 사용하여 정량화된다. 바람직하게, 마커 발현은 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR)을 사용하여 정량화된다. 바람직하게, qRT-PCR은, mRNA가 cDNA 주형으로 역전사되고 상기 cDNA 주형이 지수적으로 증폭되고 실시간으로 형광으로 정량화되는, 실시간 qRT-PCR이다.
마커 발현을 정량화하는 것은 상대적이거나 또는 절대적일 수 있다.
일 구체예에서, 마커 발현을 정량화하는 것은 상대적이고, 정량화 사이클 (Cq)을 측정하는 것이 의존하며, 이는 형광 신호가 qRT-PCR 분석을 위한 역치를 교차하는 사이클이다. 상기 Cq는 mRNA 발현에 반비례한다.
마커 발현의 상대 정량화는 하나 이상의 참조 배양물 (즉, 대조군)에서 마커 발현과 시험 세포 배양물에서 마커 발현의 비교에 의존한다.
"참조 배양물 (reference culture)"은 포지티브 대조군 또는 네가티브 대조군일 수 있다. 상기 참조 배양물이 포지티브 대조군일 때, 상기 참조 세포 배양물은 PSC를 포함한다. 바람직하게, 이러한 참조 배양물은 PSC의 알려져 있는 비율을 포함한다. 즉, 상기 참조 배양물은 미분화된 PSC의 알려져 있는 비율로 "스파이크 (spiked)"되고, 이로 인해 시험 배양물과 참조 배양물 간에 비교할 수 있다. 상기 구체예에서, 정량화는 상대적 (예컨대 정량화 유닛으로 Cq 사용) 및 절대적 (예컨대 Cq를 알려져 있는 정량으로 적용) 모두 일 수 있다. 이는 또한 반-정량적 (semi-quantitative)으로 지칭될 수 있다. 그러므로, 시험되는 세포 배양물에서 마커 발현이 참조 세포 배양물에서 마커 발현보다 더 적으면 상기 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하는 것을 나타낸다. 대안으로서, 시험되는 세포 배양물에서 마커 발현이 참조 세포 배양물에서 마커 발현보다 더 적으면, 상기 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 존재하지만, 상기 참조 세포 배양물 중에 PSC의 알려져 있는 비율보다 더 적은 비율로 존재하는 것을 나타낸다.
참조 배양물 중에 PSC의 알려져 있는 비율은 총 세포 수의 0.000001%, 0.000005%, 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.0006%, 0.0007%, 0.0008%, 0.0009%, 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 또는 0.01%일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 참조 배양물 중 PSC의 알려져 있는 비율은 총 세포수의 0.001%이다.
일부 구체예에서, 마커 발현은 "정규화되고 (normalised)", 이는 키네틱간 (intra-kinetic) 및 키네틱내 (inter-kinetic) 변화 (시료-대-시료 및 실행-대-실행 변화)를 보상한다. 정규화된 데이터는 qRT-PCR을 사용하는 유전자 발현을 정량화할 때 특히 유용하다. 상이한 정규화 방법이 당 분야의 기술자에게 알려져 있고, 하나 이상의 조절되지 않거나 또는 구성적 "하우스키핑 (housekeeping)" 유전자, 예컨대 GAPDH, ACTB, LDHA, NONO, PGK1, 또는 PPIH에 대한 정규화, 및 전체 RNA에 대한 정규화를 포함한다. 일 구체예에서, 마커 발현은 GAPDH 발현에 대해 정규화된다.
PCR은 뉴클레오티드 프라이머를 필요로 한다. 당 분야의 기술자는 PCR 및 qRT-PCR용 프라이머, 및 qRT-PCR용 프라이머/프로브 조합을 설계하는 방법을 이해할 것이다. 일부 유전자에 대한 프라이머는 상업적으로 이용가능하다. 일부 유전자에 대한 프라이머/프로브 조합은 또한 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 하기 TaqMan® 유전자 발현 분석은 상업적으로 이용가능하고, 모두 Catalog No. 4331182: 인간 LIN28 (LIN28A) 분석 Hs00702808_s1; 인간 OCT4 (POU5F1) 분석 Hs04260367_gH; 인간 SOX2 Hs01053049_s1; 인간 FOXD3 분석 Hs00255287_s1; 인간 NANOG 분석 Hs04399610_g1; 인간 PODXL (항체 TRA-1-60 및 TRA-1-81에 의해 검출되는 단백질 이소형태) 분석 Hs01574644; 인간 REX1 (ZFP42) 분석 Hs01938187_s1; 인간 SSEA1 (FUT4) 분석 Hs01106466_s1; 인간 DPPA2 분석 Hs00414515_m1 및 인간 DPPA3 분석 Hs01931905_g1이 있다.
프라이머 또는 프라이머/ 프로브 조합은 당 분야의 기술자가 온라인 툴을 사용하여 용이하게 설계할 수 있고, 예를 들어, 프라이머/ 프로브 조합은 툴로서 예컨대 Custom TaqMan® 분석 디자인 툴 또는 GenScript 실시간 PCR (TaqMan®) 프라이머 디자인 툴을 사용하여 맞춤 설계될 수 있다. 프라이머는 툴로서 예컨대 Primer3Plus 또는 PrimerQuest 툴을 사용하여 설계될 수 있다. 상기 툴은 단지 예이고, 더 많은 툴을 당 분야의 기술자가 용이하게 이용가능하다.
대안으로서 또는 부가적으로, 프라이머 또는 프라이머/ 프로브 조합은 제1 원리로부터 용이하게 설계될 수 있고, 이는 하기 고려사항을 포함한다.
PCR은 하기 사이클을 포함한다: 이중가닥 표적 DNA를 변성시키는 단계; 프라이머를 단일가닥 DNA의 상보성 영역에 어닐링하는 단계; 상기 DNA를 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 연장시키는 단계; 및 약 50회 사이클을 반복하는 단계. 상기 단계는 온도 민감성이고, 통상적으로 각각 94℃, 60℃ 및 70℃에서 수행된다. 양호한 프라이머 설계는 성공적인 반응을 위해 필수적이다. 중요한 설계 고려사항은 하기를 포함한다:
1. 프라이머 길이, 통상 18-22 bp;
2. 프라이머 용융 온도 (Tm), 통상 52-58℃ 범위;
3. 프라이머 어닐링 온도 (Ta);
4. GC 함량, 통상 40-60%;
5. GC 클램프, 즉 프라이머의 3' 말단으로부터 마지막 5개의 염기내에 위치한 G 또는 C 염기;
6. 프라이머 및 주형 2차 구조, 즉 분자내 또는 분자간 상호작용, 예컨대 헤어핀 (hairpins), 자기 이량체 (self dimers), 또는 교차 이량체 (cross dimers);
7. 디-뉴클레오티드 반복;
8. 단일 염기의 장기 실행;
9. 3' 말단 안정성;
10. 교차 상동성/ 특이성;
11. 앰플리콘 (amplicon) 길이, 통상 qRT-PCR에 대해 약 100 bp 및 표준 PCR에 대해 약 500 bp;
12. 산물의 Tm;
13. 프라이머 쌍 Tm, 통상 <5℃.
프라이머 Tm은 하기와 같이 산출될 수 있다:
Tm(K)={ΔH/ΔS + R ln(C)}, 또는 Tm(℃) = {ΔH/ΔS + R ln(C)} - 273.15, 여기서
ΔH (kcal/mole): H는 엔탈피이고, ΔH는 엔탈피 변화량이다
ΔS (kcal/mole): S는 엔트로피이고, ΔS는 엔트로피 변화량이다
ΔS (염 보정) = ΔS (1M NaCl) + 0.368 x N x ln([Na+]), 여기서
N은 프라이머에서 뉴클레오티드 쌍의 수 (프라이머 길이 -1)이다
[Na+]는 mM의 염 당량이다
[Na+] 산출:
[Na+] = 1가 이온 농도 +4 x 유리 Mg2 +.
프라이머 Ta는 하기와 같이 산출될 수 있다:
Ta = 0.3 x Tm (프라이머) + 0.7 Tm (산물) - 14.9
인간 LIN28 (LIN28A), 인간 OCT4 (POU5F1), 인간 SOX2, 인간 FOXD3, 인간 NANOG, 인간 PODXL, 인간 REX1 (ZFP42), 인간 SSEA1 (FUT4), 인간 DPPA2 및 인간 DPPA3에 대한 코딩 뉴클레오티드 서열의 예가 각각 도 5 내지 14 및 서열번호: 5 내지 14에 제공된다. 상기 서열들은 당 분야의 기술자에 의해 프라이머 및 프라이머/ 프로브 조합을 설계하는데 사용될 수 있다.
qRT-PCR은 형광에 의존하여 유전자 발현, 예컨대 마커 발현을 정량화한다. 이러한 형광은 하기를 포함할 수 있다: (1) 임의의 이중-가닥 DNA, 즉 증폭된 PCR 산물로 개재되는 비-특이적 형광 염료, 또는 (2) 프로브와 그의 상보 서열의 혼성화 후에만 형광을 내는 형광 리포터로 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브. 제1 형광 타입의 일례로는 SYBR® 그린 (CAS No. 163795-75-3)이다. 통상, 제2 타입은 프로브의 3'-말단에 공유적으로 부착된 퀀처를 포함하여 퀀처 (quencher)가 증폭 중에 프로브로부터 방출될 때까지 형광 리포터를 퀀칭한다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 검출하는 방법은 리포터 (report)를 생성하여 PSC-유래된 세포 배양물 중에 검출된 잔류하는 미분화된 PSC의 비율을 보고하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 검출하는 방법은, 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포 배양물을 피험체에게 투여하기 위한 치료용 조성물로 제제화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은, 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포 배양물, 또는 상기 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물을 피험체에게 투여하여 피험체에서 병태를 치료 또는 예방하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 병태는 골 낭종, 골 신생물, 골절, 연골 결손, 골관절염, 인대 손상, 골형성 부전, 골괴사증, 골다공증, 재생불량성 빈혈, 이식편대 숙주 질환 (GvHD), 골수형성이상 증후군, 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 자가면역성 간염, 간경화, 간부전, 확장 심근병, 심부전, 심근 경색, 심근 허혈, 크론병, 궤양성 대장염, 화상, 물집표피 박리증, 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌병, 전신 경화증, 기관지폐형성 이상증, 만성 폐쇄성 기도 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 알츠하이머병, 뇌손상, 실조, 퇴행성 디스크 질환, 다계통 위축, 다발성 경화증, 파킨슨병, 색소성 망막염, 롬버그병, 척수 손상, 뇌졸중, 근육퇴행 위축, 사지 허혈, 신장 손상, 루푸스 신염, 자궁 내막증 및 골수 또는 고형 장기 이식의 합병증일 수 있다
본원에서 사용되는, 용어 "병태 (condition)"는 병태, 질환 또는 장애, 및 그의 증상을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "치료용 조성물 (therapeutic composition)"은 피험체에게 투여하기 위해 제제화되어진 본원에 개시된 바와 같은 PSC-유래된 세포를 나타낸다. 바람직하게, 상기 치료용 조성물은 멸균되어 있다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과로 용이하게 수행된다. 바람직하게, 상기 치료용 조성물은 발열원 (pyrogen)이 없다.
본원에서 사용되는, "제제화 (formulating)"는, 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 세포 배양물을 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하고, 세포 생존력을 유지하는 것을 나타낸다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용 피험체에게 무독성이고, 하기를 포함할 수 있다: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카리드, 디사카리드 및 기타 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예컨대 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
제제화된 약학적 조성물은 또한 치료되는 특정 적응증에 대해 필요하다면 다른 활성 화합물, 바람직하게는 서로 역효과를 내지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 세포독성제, 시토킨 및/또는 성장 저해제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다.
잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포, 또는 이러한 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물은, 병태가 존재하기 전에, 존재하는 중에 또는 존재한 후에 투여될 수 있다. 일 구체예에서, PSC-유래된 세포 또는 치료용 조성물은 염증발생 중에 투여된다. PSC-유래된 세포는 (a) 예방적 조치로서, (b) 병태가 진단되자 마자, (c) 다른 치료가 실패했을 때, 및/또는 (d) 병태가 사전-정의된 중증도로 진행될 때 투여될 수 있다.
일 구체예에서, 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포, 또는 이러한 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물은, 투여 전에 사전-처리된다. 사전-처리는 성장 인자로 또는 유전자 에디팅 (gene editing)에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어 상기 성장 인자는 PSC-유래된 세포를 준비(prime)할 수 있고 유전자 에디팅은 상기 PSC-유래된 세포에 새로운 치료적 특성을 부여할 수 있다.
잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포, 또는 이러한 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물의 치료적으로 유효한 양을 피험체에게 투여하는 정확한 방식은 치료 또는 예방되는 병태와 관련하여 전문의의 재량에 따라 결정될 수 있다는 것을 당분야의 기술자는 이해할 것이다. 투여량, 다른 약제와의 조합, 투여 시기 및 빈도 등을 포함하는 투여 방식은, 피험체의 상태 및 병력뿐만 아니라, PSC-유래된 세포 또는 치료용 조성물에 의한 치료에 대한 피험체의 가능한 반응의 진단에 의해서도 영향을 받을 수 있다.
잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려해야 할 요인으로는 치료 또는 예방되는 특정 병태, 치료되는 특정 피험체, 피험체의 임상적 상태, 투여 부위, 투여 방법, 투여 일정, 가능한 부작용 및 전문의에게 알려져 있는 기타 요인들을 포함한다. 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포, 또는 이러한 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물이 투여될 때 이의 치료적으로 유효한 양은 이러한 고려사항에 의해 결정될 것이다.
잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포, 또는 이러한 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물은, 예를 들어 정맥내 (IV), 동맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하 (SC), 관절내, 윤활막내 (intrasynovial), 척수강내 (intrathecal), 관상동맥내 (intracoronary), 경심근내 (transendocardial), 외과적 이식, 국소 및 흡입 (예컨대 폐내)을 포함하는 경로에 의해 전신 또는 말초로 투여될 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 PSC-유래된 세포, 또는 치료용 조성물은 IV로 투여된다. PSC-유래된 세포 또는 치료용 조성물은 생체적합 물질의 골격 (scaffold)과 조합하여 투여될 수 있다.
용어 "치료적으로 유효한 양"은 피험체에서 병태를 치료하는데 유효한, 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 PSC-유래된 세포, 또는 이러한 PSC-유래된 세포를 포함하는 치료용 조성물의 양을 나타낸다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지 조치 모두를 나타내고, 상기 목적은 피험체의 병태, 질환 또는 장애를 방지 또는 개선하거나, 또는 피험체에서 병태, 질환 또는 장애의 진행을 지연(감속)시키는데 있다. 치료를 필요로 하는 피험체는 병태, 질환 또는 장애가 이미 있는 피험체뿐만 아니라 병태, 질환 또는 장애가 예방되어야 하는 피험체도 포함한다.
용어 "예방하는", "예방", "예방적" 또는 "예방적인"은 이상이나 증상을 비롯한 병태, 질환 또는 장애의 발생을 막거나, 방해하거나, 방지하거나, 방어하는 것을 나타낸다. 예방을 필요로 하는 피험체는 병태, 질환 또는 장애가 발생하기 쉬울 수 있다.
용어 "개선하다" 또는 "개선"은 이상이나 증상을 비롯한 병태, 질환 또는 장애의 감소, 줄어듦 또는 제거를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 피험체는 병태, 질환 또는 장애가 이미 있거나, 또는 병태, 질환 또는 장애를 가질 경향이 있거나, 또는 병태, 질환 또는 장애가 예방될 대상일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "피험체 (subject)"는 포유동물을 나타낸다. 포유동물은 영장류, 구체적으로 인간일 수 있거나, 또는 가축, 동물원 또는 반려 동물일 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 그에 따른 MSC 또는 MSC의 개체군은 인간의 의학적 치료에 적절하다는 것이 특히 고려됨에도 불구하고, 이들은 또한 말, 소 및 양과 같은 가축, 개와 고양이 같은 반려 동물, 또는 고양이과 동물, 개과 동물 (canids), 소과 동물 (bovids) 및 발굽동물 (ungulates)와 같은 동물원 동물의 치료를 포함하는 수의학적 치료에도 적용 가능하다.
또한 본원에는 제1 양상의 방법에 의해 검출될 때 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 적은 세포 배양물이 개시되어 있다.
또한 본원에는 제2 양상의 방법에 의해 제조되는 치료용 조성물이 개시되어 있다.
또한 본원에는 PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 만능성 줄기 세포 (PSC)를 검출하기 위한 키트가 개시되어 있고, 상기 키트는 하기를 포함한다:
라미닌-521; 및
E-카드헤린; 및
ROCK 저해제.
일 구체예에서, 상기 ROCK 저해제는 본원에 개시된 ROCK 저해제이다.
일 구체예에서, 상기 키트는 배양된 세포에서 잔류하는 미분화된 PSC의 마커의 발현을 정량화하기 위한 PCR 프라이머 및 선택적으로 PCR 프로브를 더 포함한다. 상기 PCR 프라이머 및 프로브는 상기 잔류하는 미분화된 PSC의 마커에 특이적이다. 일 구체예에서, 상기 PCR 프라이머 및/또는 프로브는 본원에 개시된 PCR 프라이머 및/또는 프로브이다.
일 구체예에서, 상기 키트는 DNA 주형을 제외한 PCR을 위한 성분들 및 프라이머, 및 선택적으로 프로브를 포함하는 "마스터 믹스 (master mix)"로 불리는, PCR, 선택적으로 qRT-PCR을 위한 즉시 사용가능한 (ready-to-use) 조성물을 포함한다. 상기 성분들은 완충제, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP), Mg2 + 및 폴리머라제를 포함할 수 있다. 마스터 믹스는 예를 들어 2X TaqMan® GE 마스터 믹스로 상업적으로 입수가능하다.
다른 구체예에서, 상기 키트는 배지를 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 배지는 본원에 개시된 배지이다. 일 구체예에서, 상기 배지는 ROCK 저해제를 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 키트는 기질을 더 포함하다. 이러한 기질은 PSC로부터 분화된 세포를 배양하는데 적합하고, 잔류하는 미분화된 PSC가 검출되어야 한다. 바람직하게, 상기 기질은 플라스틱 배양 제품 예컨대 디쉬, 멀티-웰 플레이트 또는 플라스크이다. 일 구체예에서, 상기 기질은 라미닌-521 및 E-카드헤린으로 코팅된다.
일 구체예에서, 상기 키트는 하기 단계를 포함하는 방법에서 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다:
ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 라미닌-521 및 E-카드헤린으로 코팅된 기질에서 세포를 배양하는 단계;
상기 배양된 세포에서 마커 발현을 정량화하는 단계; 및
상기 배양된 세포에서 마커 발현을, PSC의 알려져 있는 비율을 포함하는 참조 세포 배양물에서 마커 발현과 비교하는 단계,
상기 세포 배양물에서 마커 발현이 상기 참조 세포 배양물에서 마커 발현보다 더 적으면, 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하는 것을 나타내거나, 또는 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 참조 세포 배양물 중에 PSC의 알려져 있는 비율보다 더 적은 비율로 존재하는 것을 나타낸다.
일 구체예에서, 상기 키트는 제1 양상의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 키트는 제1 양상의 방법에 따라 사용된다. 이는 용어 "사용될 때"를 나타낼 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, iPSC-MSC는 ROCK 저해제인 10 μM Y27632를 포함하는 E8 배지에서 3일 동안 배양되고, 그 다음에 ROCK 저해제의 부재하에 2일 동안 배양되고, LIN28 발현은 qRT-PCR에 의해 정량화되고, GAPDH 발현에 대해 정규화되어, 0.001%의 잔류하는 미분화된 iPSC를 검출하였다.
본 개시내용, 구체적으로 실시예를 이해하는데 도움을 줄 수 있는 다른 정의는 하기를 포함한다.
a) TaqMan® 유전자 발현 (GE) 분석 (20X): 전매 (proprietary) Applied Biosystems® 소프트웨어 및 시약을 사용하여 설계된 Life Technologies로부터 입수가능한 실시간 qRT-PCR 분석 타입. 상기 분석은 시료 중에 특정 mRNA를 정량화하는데 사용되고, 사전-설계되거나 또는 맞춤 분석으로 이용가능하다. TaqMan® GE 분석은 유전자 특이적 프라이머 및 프로브의 20X 믹스로 제공된다.
i) FAMTM/MGB-NFQ 프로브: TaqMan® 프로브의 5'-말단에 공유적으로 부착된, 형광 리포터 분자 (FAM: 6-카르복시플루오레세인). MGB-NFQ (Minor Groove Binder-Non-Fluorescent Quencher)는 TaqMan® 프로브의 3'-말단에 공유적으로 부착된, MGB-NFQ 분자이다. 증폭 중에, 상기 프로브는 절단되어, 상기 퀀처로부터 리포터를 방출한다. 결과의 형광 신호는 시료 중에 mRNA 농도에 비례한다. 다른 형광 염료가 FAMTM 대신에 이용가능하다. VIC®은 GAPDH와 같이 정규화를 위해 사용되는 내인성 대조군 유전자에 통상적으로 사용된다.
b) 2X TaqMan® GE 마스터 믹스: 가열 개시 활성화 (hot start activation)를 위한 AmpliTaq Gold® DNA 폴리머라제, UP (Ultra Pure), 수반되는 PCR 오염을 최소화하기 위한 dNTP와 dTTP/dUTP 및 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 혼합물, 및 전매 ROXTM 염료에 기반한 수동 내부 참조를 포함한다.
c) cDNA: 역전사효소 (RT)를 사용하여 mRNA로부터 역전사된 상보적 DNA.
d) mRNA: 전령 RNA.
e) gDNA: 게놈 DNA.
f) 주형: PCR에 의해 증폭되는 핵산 표적 (예컨대, cDNA).
g) 전체 RNA: mRNA (~1-5%), 리보좀 RNA (rRNA) (~80%), 운반 RNA (tRNA) 및 마이크로 RNA (miRNA)를 포함하는 RNA 종들의 복합 혼합물. 정확한 조성은 세포 타입에 따라 가변한다.
h) RNase: RNA를 분해시키고 불활성화시키는데 매우 어려운 효소의 부류인 리보뉴클레아제.
i) 내인성 대조군 유전자: 모든 시료 타입에서 발현되는 포지티브 대조군 유전자. GAPDH: 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제는 정규화에 사용되는 통상적인 내인성 대조군 유전자이다.
j) 표적 유전자: 줄기 세포 대 분화된 세포 (예컨대, iPSC 대 iPSC-MSC)에서 차별적으로 발현되는 관심 있는 유전자, 예컨대 LIN28.
k) +RT 및 -RT 마스터 믹스: 전체 RNA 시료의 역전사에 필요한 시약을 포함한다. -RT는 전체 RNA를 포함하지만, 역전사효소가 결여된 네가티브 대조군이다. 상기 -RT 시료는 전체 RNA 시료의 gDNA 오염에 대해 시험한다.
l) +/-RT 반응 믹스: 역전사를 위한 각 전체 RNA 시료 또는 대조군과 +/-RT 마스터 믹스의 조합.
m) cDNA 증폭 믹스: 각 +/-RT 반응 믹스와 2X TaqMan® GE 마스터 믹스의 조합.
n) GE 분석 믹스 (예컨대, LIN28 또는 GAPDH 분석 믹스): 실시간 qRT-PCR을 위한 각 cDNA 증폭 믹스와 20X TaqMan® GE 분석의 조합.
o) 주형 없는 대조군 (No Template Control: NTC): 전체 RNA가 +/-RT cDNA 반응에서 물로 대체된 네가티브 대조군 (NEG) 타입. 핵산 주형에 의한 시약들의 오염을 검출하기 위해 사용된다.
p) SNP: 단일 뉴클레오티드 다형.
q) Cq: 정량화 사이클 (예컨대, Cq(X))은 형광 신호가 실시간 qPCR 및 qRT-PCR 분석에 대한 역치를 교차하는 사이클이다. 상기 Cq는 mRNA 농도에 반비례한다. 상기 Cq가 증가하면, mRNA 농도는 감소하고, 그 반대도 마찬가지이다. "Cq(50)"은 50회의 사이클이 수행된 것을 나타낸다. "Cq(50) 없음"은 Cq 값이 50회 사이클에서 생성되지 않았음을 나타낸다.
실시예
실시예 1 - iPSC -MSC 의 제조
물질
시약
설명 판매사 / 카탈로그 # 또는 참조 #
DMEM/F12 기본 배지 Invitrogen / A1516901
E8 보충제 Invitrogen / A1517101
비트로넥틴 Life Technologies / A14700
콜라겐 IV Sigma / C5533
H-1152 ROCK 저해제 EMD Millipore / 555550
Y27632 디히드로클로리드 ROCK 저해제 Tocris / 1254
FGF2 Waisman Biomanufacturing / WC-FGF2-FP
인간 내피-SFM Life Technologies / 11111-044
stemline II 조혈 줄기 세포 증식 배지 Sigma / S0192
GLUTAMAX Invitrogen / 35050-061
인슐린 Sigma / I9278
리튬 클로리드 (LiCl) Sigma / L4408
콜라겐 I 용액 Sigma / C2249
피브로넥틴 Life Technologies / 33016-015
DMEM/F12 Invitrogen / 11330032
재조합 인간 BMP4 Peprotech / 120-05ET
악티빈 A Peprotech / 120-14E
Iscove 변형 Dulbecco 배지 (IMDM) Invitrogen / 12200036
Ham F12 영양 믹스 Invitrogen / 21700075
소듐 비카르보네이트 Sigma / S5761
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + Sigma / A8960
1-티오글리세롤 Sigma / M6145
소듐 셀레나이트 Sigma / S5261
비필수 아미노산 HyClone / SH30853.01
화학적으로 규정된 지질 농축물 Invitrogen / 11905031
배아 전달 등급 물 (embryo transfer grade water) Sigma / W1503
폴리비닐 알콜 (PVA) MP Bio / 151-941-83
홀로-트란스페린 Sigma / T0665
ES-CULT M3120 Stem Cell Technologies / 03120
STEMSPAN 무혈청 증식 배지 (SFEM) Stem Cell Technologies / 09650
L-아스코르브산 Sigma / A4544
PDGF-BB Peprotech / 110-14B
표 1에 열거된 시약은 당해 기술분야의 기술자에게 알려져 있으며, 허용되는 조성물, 예를 들어 IMDM 및 Ham F12와 같은 조성물을 갖는다. GLUTAMAX는 L- 알라닐-L-글루타민 디펩티드를 포함하며, 일반적으로 0.85% NaCl 중 200 mM로 공급된다. GLUTAMAX는 배양되는 세포에 의해 디펩티드 결합이 절단될 때 L-글루타민을 방출한다. 화학적으로 규정된 지질 농축물은 아라키돈산 2 mg/L, 콜레스테롤 220 mg/L, DL-α-토코페롤 아세테이트 70 mg/L, 리놀레산 10 mg/L, 리놀렌산 10 mg/L, 미리스트산 10 mg/L, 올레산 10 mg/L, 팔미트산 10 mg/L, 팔미톨산 10 mg/L, 플루로닉 F-68 90 g/L, 스테아르산 10 mg/L, TWEEN 80® 2.2 g/L 및 에틸 알콜을 포함한다. H-1152 및 Y27632는 매우 강력한 세포-투과성의, 선택적 ROCK (Rho-결합된 코일형 코일 형성 단백질 세린/트레오닌 키나제) 저해제이다.
IF6S 배지 (10X 농축)
10X IF6S 정량 최종 농도
IMDM 1 패키지,
1 L에 대한 분말		 5X
Ham F12 영양 믹스 1 패키지,
1 L에 대한 분말		 5X
소듐 비카르보네이트 4.2 g 21 mg/mL
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 128 mg 640 μg/mL
1-티오글리세롤 80 μL 4.6　mM
소듐 셀레나이트 (0.7 mg/mL) 24 μL 84 ng/mL
GLUTAMAX 20 mL 10X
비필수 아미노산 20 mL 10X
화학적으로 규정된 지질 농축물 4 mL 10X
배아 전달 등급 물 ~ 200 mL NA
IF9S 배지 (1X 농축; IF6S 기반)
IF9S 정량 최종 농도
IF6S 5 mL 1X
폴리비닐 알콜 (PVA; 20 mg/mL) 25 mL 10 mg/mL
홀로-트란스페린 (10.6 mg/mL) 50 μL 10.6 μg/mL
인슐린 100　μL 20 μg/mL
배아 전달 등급 물 ~ 50 mL NA
분화 배지 (1X 농축; IF9S 기반)
분화 배지 정량 최종 농도
IF9S 36 mL 1X
FGF2 1.8 μg 50 ng/mL
LiCl (2M) 36 μL 2mM
BMP4 (100 μg/mL) 18 μL 50 ng/mL
악티빈 A (10 mg/mL) 5.4 μL 1.5 ng/mL
중간엽 콜로니 형성 배지 (1X 농축)
M- CFM 정량 최종 농도
ES-CULT M3120 40 mL 40%
STEMSPAN SFEM 30 mL 30%
인간 내피-SFM 30 mL 30%
GLUTAMAX 1 mL 1X
L-아스코르브산 (250 mM) 100 μL 250　μM
LiCl (2M) 50 μL 1　mM
1-티오글리세롤 (100 mM) 100 μL 100 μM
FGF2 600 ng 20 ng/mL
중간엽 무혈청 증식 배지 (1X 농축)
M- SFEM 정량 최종 농도
인간 내피-SFM 5 L 50%
STEMLINE II HSFM 5 L 50%
GLUTAMAX 100 mL 1X
1-티오글리세롤 87 μL 100 μM
FGF2 100 μg 10 ng/mL
방법
1. 비트로넥틴 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 제품상에, E8 완전 배지 (DMEM / F12 기본 배지 + E8 보충제)+ 1 μM H1152에서 iPSC를 해동시켰다. 도말된 iPSC를 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 인큐베이트하였다.
2. 비트로넥틴 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 제품상에, E8 완전 배지 (ROCK 저해제 없음)에서 iPSC를 3회 계대로 증식하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 인큐베이트하였고, 그 다음에 분화 과정을 개시하였다.
3. 수확한 다음, 콜라겐 IV 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 제품상에 E8 완전 배지 + 10 μM Y27632 중에 5x103 세포/cm2의 단일 세포/작은 콜로니로서 iPSC를 시딩하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 24시간 동안 인큐베이트하였다.
4. E8 완전 배지 + 10 μM Y27632를 분화 배지로 대체하고, 37 ℃, 5% CO2, 5% O2 (저산소)에서 48시간 동안 인큐베이트하였다.
5. 분화 배지 접착 배양물로부터 단일 세포 현탁액으로서 콜로니 형성 세포를 수확하고, M-CFM 현탁 배양물로 전달한 후, 37℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 12일 동안 인큐베이트하였다.
6. 수확한 다음, M-SFEM에서 피브로넥틴/콜라겐 I 코팅된 (0.67 μg/cm2 피브로넥틴, 1.2 μg/cm2 콜라겐 I) 플라스틱 제품상에 콜로니 (계대 0)를 시딩하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이트하였다.
7. 콜로니를 수확한 후, M-SFEM에서 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 제품상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포로서 (계대 1) 시딩하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이트하였다.
8. 수확한 다음, M-SFEM에서 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 제품상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 2)로 시딩하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이트하였다.
9. 수확한 다음, M-SFEM에서 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 제품상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 3)로 시딩하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이트하였다.
10. 수확한 다음, M-SFEM에서 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 제품상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 4)로 시딩하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이트하였다.
11. 수확한 다음, M-SFEM에서 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 제품상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 5)로 시딩하였고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이트하였다.
12. 계대 5 (P5) iPSC-MSC를 단일 세포로 수확하였고 최종 산물을 동결시켰다.
실시예 2 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
1) 목적
본 예시되는 프로토콜은 TaqMan® 유전자 발현 분석 (qRT-PCR)에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였다. LIN28 발현을 사용하여 iPSC-MSC 중에 미분화된 iPSC의 검출이 예시되었지만, 상기 프로토콜은 일반적으로, PSC에서 차별적으로 발현되지만, PSC-유래된 세포에서 발현되지 않는 임의의 PSC 마커를 사용하는 PSC-유래된 세포 배양물에 적용가능하다. 상기 프로토콜은 치료용 조성물로 제제화되는 PSC-유래된 세포의 품질 관리를 목적으로 한다.
2) 물질
a) iPSC-MSC 라미닌-521/E-카드헤린 증식 배양 프로토콜을 위한 물질:
i) LN521TM 인간 rLaminin-521, Biolamina, Catalog No. LN521-03
ii) E-카드헤린, 인간 재조합체, Advanced BioMatrix, Catalog No. 5085-0.1MG
iii) Mg2 + 및 Ca2 +를 갖는 Dulbecco 포스페이트-완충된 식염수 (1X) (DPBS++) (6 x 500 mL), Corning/Mediatech, Catalog No. 21-030-CV 또는 동등물
iv) Mg2 + 및 Ca2 +를 갖지 않는 HyCloneTM Dulbecco 포스페이트 완충된 식염수, 용액, (DPBS--), GE Healthcare Life Sciences, Catalog No. SH30028 또는 동등물
v) ROCK 저해제 Y27632, Sigma-Aldrich, Catalog No. Y0503-1MG 또는 Y0503-5MG
vi) 필수 8TM 배지 (키트), Thermo Fisher Scientific, Catalog No. A1517001
(1) 필수 8TM 기본 배지 (500 mL)
(2) 필수 8TM 보충제 (비트로넥틴) (10 mL)
vii) TrypLETM 선택 효소 (1X), 페놀 레드 없음 (100 mL), Thermo Fisher Scientific, Catalog No. 12563011
viii) 디메틸 술폭시드 (DMSO), Sigma-Aldrich, Catalog No. D2650
ix) Falcon® 75cm2 통기 캡을 구비한 직사각형 경사 목 (Rectangular Canted Neck)을 갖는 세포 배양 플라스크, Corning Life Sciences, Catalog No. 353136 또는 동등물
x) 25cm 핸들 및 1.8cm 블레이드를 구비한 Falcon® 세포 스크래퍼 (Cell Scraper), 멸균, Corning Life Sciences, Catalog No. 353086 또는 동등물
xi) HyCloneTM 0.4% 트립판 블루 (Trypan Blue), Thermo Fisher Scientific, Catalog No. SV30084 또는 동등물
xii) 커버 슬립 (cover slip)을 구비한 혈구계 (Hemocytometer), Reichert Right Line 또는 동등물
b) RNeasy® Protect Cell Mini 키트 (50): QIAGEN® Catalog No. 74624. 2개의 QIAGEN® 산물로 구성됨:
i) RNAprotect® 세포 시약 (박스 2 중 1): 배양되거나 또는 정렬된 세포에 대해 설계됨. 배양 배지 중 세포로 직접 첨가될 수 있음. 유전자 발현 패턴을 정지시켜서, 전체 RNA의 직각적인 안정화를 제공함. 시료는 4℃, -20℃ 또는 -80℃에서 보관될 수 있다.
ii) RNeasy® 플러스 미니 키트 (박스 2 중 2): 다양한 시료 타입으로부터 전체 RNA를 단리하도록 설계됨. "플러스 (Plus)"는 상기 키트가 게놈 DNA (gDNA) 제거 컬럼 및 관련된 시약을 포함하는 것을 나타낸다.
c) QIAshredder (50): QIAGEN® Catalog No. 79654. RNA 단리를 위해 세포 용해물을 균질화하는 것을 필요로 함.
d) RNase-프리 DNase 세트 (50 preps), QIAGEN®, Catalog No. 79254. 멤브레인상에 DNase 처리를 위해 QIAGEN® RNA 정제 키트를 사용함.
e) 에탄올 (96-100%): Fisher BioReagents, Molecular Biology Grade, Absolute (200 Proof), 100 mL, Fisher Scientific Catalog No. BP2818100 또는 동등물. QIAGEN® RNeasy® 플러스 미니 키트를 필요로 함.
f) UltraPureTM DNase/RNase-프리 증류수, Life Technologies, Catalog No. 10977-015 또는 동등물.
g) β-메르캅토에탄올 (β-ME), 14.3 M, Thermo Fisher Scientific, Catalog No. BP176-100 또는 동등물. RNase를 불활성화시키기 위해 QIAGEN® RNeasy® 플러스 미니 키트를 필요로 함.
h) Safetec Green-ZTM Biohazard Fluid Control Powder, Thermo Fisher Scientific, Catalog No. 19-023-901. 환경 위험물인 RNAprotect® 세포 시약의 처분을 위함.
i) RNase AWAYTM 탈오염 시약 (250 mL), Life Technologies, Catalog No. 10328-011 또는 동등물. 사용 준비된 용액을 표면, 예컨대 랩 벤치 (lab benches), 피펫, 유리제품 또는 플라스틱 제품에 적용됨. RNase 및 DNA 오염을 제거하기 위해 Milli-Q 물로 헹굼.
j) 고-용량 (High-Capacity) RNA-대-cDNATM 키트 (50): Thermo Fisher Scientific, Catalog No. 4387406
k) SUPERase·InTM RNase 저해제: Thermo Fisher Scientific, Catalog No. AM2694
l) TaqMan® 유전자 발현 마스터 믹스 (2X): Thermo Fisher Scientific, Catalog No. 4369016 (1-팩, 5 mL: 200 x 50 μL Rxs)
m) Ambion® RT-PCR 등급 물: Thermo Fisher Scientific Catalog No. AM9935 (10 x 1.5 ml) (바람직함) 또는 동등물. 참고: AM9935가 오토클레이브되고, 막-여과되고, DEPC-처리되지 않음. AM9935는 실시간 PCR에 의해 원핵세포 (16S rRNA) 및 진핵세포 (18S rRNA) 게놈 DNA 오염에 대해 시험됨. 이는 RNase-프리, DNase-프리 및 게놈 DNA-프리인 것으로 인증되었다.
n) TaqMan® 유전자 발현 분석(들), 이는 20X의, TE 중에 프라이머 및 FAM/MGB-NFQ 프로브의 사용 준비된 믹스를 포함함. FAM은 가장 일반적인 형광 리포터이다. (1X = 250 nM TaqMan 프로브 + 900 nM의 각 PCR 프라이머 (포워드 및 리버스)). 하기 카탈로그 번호는 맞춤 분석 크기를 나타낸다. 광 민감성. 바람직하게는 1.5 ml Ambion® 논-스틱 튜브에서 -20℃에서 1회 사용 알리코트로 보관하였다.
i) Custom TaqMan® 유전자 발현 분석 (20X, 단일 튜브), Thermo Fisher Scientific, 순서대로 만듦. (맞춤 분석은 FAM-MGB 프로브로 정리될 수 있음을 참고함.)
(1) Catalog No. 4331348 (Small = 360 rxn @ 20 μL qRT-PCR)
(2) Catalog No. 4332078 (Medium = 750 rxns @ 20 μL qRT-PCR)
ii) LIN28 Custom TaqMan® 유전자 발현 분석, Thermo Fisher Scientific; Catalog No: 4331348; 분석 ID: AIVI48S; 분석명: LIN28.QRT-PCR; 스케일: S: 360 rxns; 순서대로 만듦. 이는 Kuroda 등 (PLoS ONE 7, 1-9 (2012) Highly Sensitive In Vitro Methods for Detection of Residual Undifferentiated Cells in Retinal Pigment Epithelial Cells Derived from Human iPS Cells)에 개시된 알려져 있는 프라이머 및 프로브 서열로 맞춤 설계된 분석이다. LIN28 프로브 서열 (5′→3′) CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC (서열 번호: 14); LIN28 포워드 프라이머 서열 (5′→3′) CACGGTGCGGGCATCTG (서열 번호: 15); LIN28 리버스 프라이머 서열 (5′→3′) CCTTCCATGTGCAGCTTACTC (서열 번호: 16).
iii) TaqMan® 내인성 대조군 분석: 상기 분석은 사전설계되었고, 재고될 수 있다. 내인성 대조군은 FAM-MGB 또는 VIC-MGB 프로브로 이용가능하다. 바람직하게는 VIC-MGB 프로브를 선택하여 대조군 분석을 상기 분석으로부터 구별하였다.
(1) GAPDH TaqMan® 유전자 발현 분석 (유전자 기호: GAPDH, hCG2005673), Life Technologies; Catalog No: 4448489; 분석 ID: Hs02758991_g1 (VIC-MGB 프로브); 순서대로 만듦. "최선의 피복 (Best Coverage)" 분석은 다수의 사전설계된 GAPDH 분석으로부터 선택된다. 상기 분석은 인트론에 걸쳐 있으므로, 게놈 DNA를 검출하지 않아야 한다.
o) Ambion® 논-스틱 RNase-프리 마이크로퓨지 튜브 (Microfuge tube) (1.5 ml): Life Technologies Catalog No. AM12450. 참고: AM12450 1.5 ml 튜브는 낮은 결합 표면을 가지며, RNase-프리 및 DNase-프리인 것으로 인증되었다. 바람직하게는 맞춤 TaqMan® GE 분석 (20X)의 알리코트를 보관하고 cDNA를 제조하는데 사용되었다.
p) 1.5mL 스크류 캡 마이크로튜브 (Screw Cap Microtube) (Sarstedt 72.692.005): Fisher Scientific Catalog No. 50809238 또는 동등물; 조립된 O-링 캡을 구비한 원추형 바닥, 멸균. 바람직하게는 cDNA 증폭 믹스를 제조하는데 사용함. 외부-나사산의 스크류 캡은 에어로졸의 발생을 방지하고, 이는 PCR 오염을 일으킬 수 있다.
q) 화이트 하드-쉘 로-프로파일 96-웰 스커트 PCR 플레이트 (White Hard-Shell Low-Profile 96-Well Skirted PCR Plates): Bio-Rad Catalog No. HSP-9655. 화이트 플레이트는 투명 96-웰 플레이트 및 튜브보다 배경 잡음을 감소시키고 형광 신호를 증가시킬 것이다. 스트립 튜브는 본 절차를 위해 사용되지 않아야 한다.
r) 마이크로실 (Microseal) 'B' 접착제 실 (Adhesive Seals) (100): Bio-Rad Catalog No. MSB-1001. 상기는 Hard-Shell 96-웰 플레이트에 대해 광학적으로 투명한, 플레이트 실러가 권장된다.
s) 실링 롤러 (Sealing Roller): Bio-Rad Catalog No. MSR-0001. Hard-Shell 96-웰 플레이트를 Microseal 'B' 접착제 실로 밀봉하는데 사용된다.
t) Bio-Rad CFX 소프트웨어 (ID 0394)를 구비한 Bio-Rad CFX96 실시간 PCR 검출 시스템 또는 동등물.
u) 에펜도르프 MiniSpin 플러스 마이크로원심분리 (ID 0569) 또는 동등물.
v) 나노드롭 (Nanodrop) 2000 UV-가시광 분광광도계 (ID 0504) 또는 동등물.
3) 절차
a) 잔류하는 미분화된 iPSC의 산택적 증식을 사용하여 qRT - PCR 분석을 위한 P5 iPSC-MSC 최종 산물 (1 바이알)의 제조
i) 본 절차는 iPSC-MSC의 배경에서 미분화된 iPSC를 선택적으로 증식하여, 잔류하는 미분화된 iPSC에 대한 qRT-PCR의 민감성을 증가시켰다.
ii) 세포 배양 배지의 제조:
(1) E8 완전 배지 (E8CM)의 제조:
(a) E8 보충제를 밤새 2-8℃에서 해동시켰다.
(b) 500 ml의 보틀로부터 E8 기본 배지 10 ml을 제거하였다.
(c) 10 ml의 E8 보충제를 490 ml의 E8 기본 배지로 첨가하였다. 잘 혼합하였고, 2-8℃에서 보관하였다. 유효 기간은 제조후 2주이다.
(2) E8CM + 10μM Y27632 배지의 제조:
(a) 312 μl DPBS-- (Ca2 + 및 Mg2 + 없음)를 1 mg의 Y27632에 첨가하여 10 mM Y27632를 제조하였다. 알리코트를 -20℃에서 동결하였다.
(b) 1 μl의 10 mM Y27632를, 10 μM Y27632의 최종 농도를 위해 E8CM의 각 ml로 첨가하였다 (예컨대 75 μl의 10 mM Y27632를 75 ml의 E8CM으로 첨가). 4℃에서 보관하였다. 유효 기간은 제조후 2주이다.
iii) 동결 배지의 제조 (E8CM + 20% DMSO):
(1) 10 ml의 동결 배지를 하기와 같이 제조하였다: 8 ml의 E8CM을 2 ml의 DMSO와 배합하였다. 4℃로 옮겨서 사용하기 전에 차갑게 하였다.
(2) 1 μl의 10 mM Y27632를, 10 μM Y27632의 최종 농도를 위해 E8CM의 각 ml로 첨가하였다 (예컨대 75 μl의 10 mM Y27632를 75 ml의 E8CM으로 첨가). 4℃에서 보관하였다. 유효 기간은 제조후 2주이다.
iv) 라미닌 -521/E- 카드헤린 코팅 ( DPBS ++ 중)의 제조:
(1) 라미닌-521 및 E-카드헤린을 밤새 2-8℃에서 해동하였다.
(2) 코팅 물질을 제조하였다 (2 x T75 플라스크에 대해 30 ml가 필요함):
Figure pct00001
(3) 배양 제품 (2 x T75 플라스크)을 코팅하고, 2-8℃에서 사용하기 전에 적어도 밤새 보관하였다 (유효 기간 1개월). 코팅 용액으로 전체 배양 영역을 피복해야 한다.
v) 증식 배양물의 제조
(1) 시딩하기 최소 1시간 전에, 플라스크로부터 코팅 물질을 제거하였고, 15 ml E8CM + 10 μM Y27632/T75를 첨가하였다. 37℃로 평형화시켰다.
(2) 37℃ 수조에서 P5 iPSC-MSC를 해동하였다.
(3) 상기 바이알 내용물을 9 ml의 E8CM + 10 μM Y27632를 포함하는 15 ml 튜브로 옮겼다.
(4) 200 x g에서 5분 동안 원심분리하였다.
(5) 상등액을 흡인하였고, 펠렛을 5 ml E8CM + 10 μM Y27632에 재현탁시켰다.
(6) 혈구계를 사용하여 세포를 계수하였다. 추정된 농도 5x106 세포/5 ml = 1x106 세포/ml. 제시되는 트리판 블루 중 희석은 1:2이다. 생존도 퍼센트를 산출하였다.
(7) 각 T75 플라스크에 1.3x104 세포/cm2 또는 1x106 세포/T75로 시딩하는데 필요로 하는 세포 수를 산출하였다.
(8) 라미닌-521/E-카드헤린 코팅된 플라스크에 산출된 수의 세포로 시딩하였다.
(9) 상기 세포를 하기 일정으로 공급하였다:
(a) 일 1 - 공급 없음.
(b) 일 2 - 각 T75 플라스크에 15 ml E8CM + 10 μM Y27632를 공급하였다.
(c) 일 3 - 공급 없음.
(d) 일 4 및 5 - 각 T75 플라스크에 15 ml E8CM (Y27632 없음)을 공급하였다.
(10) 미생물 오염의 증후 (예컨대, 혼탁도)에 대해 매일 배양물을 확인하였다. 임의의 오염된 배양물은 버렸고, 단계 3)a)에서 다시 시작하였다.
vi) 수확 ( 시딩 후 6일)
(1) 참고: 라미닌-521/ E-카드헤린 코팅된 배양 제품으로부터 세포를 박리시키는 것은 어려웠다. 상기 세포를 박리시키는데 세포 스크래퍼의 사용을 권장한다. 평균 수확 밀도는 4x104 세포/cm2 또는 3x106 세포/T75 플라스크이다. 단일 T75 플라스크로부터 세포 수가 충분하지 않게 수확된다면 (< 2x10e6 세포), 제2 T75의 수확을 필요로 할 수 있다.
(2) 성장 배지를 흡인하였고, 상기 플라스크를 10 ml DPBS--로 헹궜다.
(3) 8 ml TrypLE를 T75 플라스크에 첨가하였다. 37℃에서 15분 동안 인큐베이트하였다.
(4) 플라스크를 단단히 두드려서 세포를 꺼내고, 50 ml의 원뿔형 튜브로 옮겼다 (대략 8 ml).
(5) 8 ml E8CM + 10 μM Y27632를 상기 플라스크에 첨가하였고, 피펫으로 업 다운하여, 50 ml 튜브 중에 세포 현탁액과 배합하였다 (총 16 ml).
(6) 8 ml E8CM + 10 μM Y27632를 상기 플라스크에 첨가하였고, 멸균 1회용 세포 스크래퍼를 사용하여 세포를 온화하게 긁어내었다. 상기 긁어낸 표면을 배지로 헹궈서 세포를 수집하였고, 세포 현탁액과 배합하였다 (총 24 ml).
(7) 추가의 8 ml E8CM + 10 μM Y27632를 상기 플라스크에 첨가한 후에 스크래핑을 반복하였다. 상기한 바와 같이 세포 현탁액을 수집하였다 (총 32 ml).
(8) 세포를 200 x g으로 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 흡인하였다.
(9) 상기 세포 펠렛을 E8CM + 10 μM Y27632에 재현탁하였고, 세포를 계수하였다. 제시되는 재현탁 부피는 2 ml이고, 추정된 농도 3x106 세포/2 ml = 1.5x106 세포/ml이다. 제시되는 트리판 블루 중에 희석은 1:2이다. 정확하게 계수하기 위해, 세포는 1 ml 피펫 팁을 사용하여 단일 세포로 해리시킬 필요가 있다.
(a) 혈구계를 사용하여 세포를 계수하였다.
(b) 요구되는 생존도 퍼센트는 ≥70%이다. 요구되는 수득율은 ≥2x106 세포이다.
(10) 세포를 200 x g에서 10분 동안 회전시켰다. 상등액을 흡인시켰다.
(11) 세포 펠렛을 E8CM에 2x106 세포/ml로 재현탁시켰다.
vii) 분석 전에 세포를 동결시킴
(1) 최종 농도 1x106 세포/ml를 위해 동일한 양의 COLD 동결 배지 (20% DMSO를 갖는 E8CM)를 첨가하였다.
(2) 1 ml의 세포 현탁액을 각 크라이오바이알 (cryovial)에 첨가하였다.
(3) 크라이오바이알을 -80℃ 동결기로 즉시 옮겼다.
(4) 다음 날 액체 질소 탱크로 옮겼다.
b) RNeasy ® 플러스 미니 키트용 시약의 제조:
i) QIAGEN® 버퍼 RPE 세척 용액의 제조:
(1) 보틀에 표시된 바와 같이, 100% 에탄올을 버퍼 RPE 농축물 (즉, 50 prep RNeasy® 보호 세포 미니 키트에 대해 44 mL)로 첨가하였다.
ii) 70% 에탄올의 제조:
(1) 7 mL의 100% 에탄올과 3 mL의 뉴클레아제-프리 물 (Nuclease-Free Water)을 배합하였다. 유효 기간은 제조 후 1개월이다.
iii) 전체 RNA 단리를 위한 용해 버퍼의 제조:
(1) 케미컬 흄 후드 (chemical fume hood)를 사용하여, 사용 전에 1 mL의 버퍼 RLT 플러스에 대해 10 μL β-메르캅토에탄올 (β-ME)을 첨가하였다.
iv) QIAGEN® RNase-프리 DNase 세트용 RNase-프리 DNase의 제조:
(1) 지시된 양의 RNase-프리 물 (즉, 550 μL)을 동결건조된 DNase에, 멸균 바늘 및 주사기를 사용하여 첨가하였다. 역위 (inversion)로 상기 DNase를 온화하게 재현탁하였다. 와동 (vortex)시키지 않는다. 재구성된 DNase를 -20℃에서 20 μL 알리코트로, 바람직하게는 Ambion® 논-스틱 RNase-프리 마이크로퓨지 튜브에 보관하였다. 재구성된 RNase의 유효 기간은 제조후 9개월이다. 나머지 키트 성분들은 2-8℃에서 보관하였다.
c) RNAprotect ® 세포 시약을 사용하는 전체 RNA 단리를 위한 배양된 세포의 제조.
i) RNAprotect® 세포 시약은 처리된 세포에서 전체 RNA를 즉시 안정화시켜서, 유전자 발현 프로파일을 보존하였다. 상기 시약을, 배지가 존재하거나 또는 존재하지 않는, 세포에 직접 첨가하였다. 또한 DMSO 중에 동결된 세포는 변형된 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다.
(1) 권장되는 세포 수는 전체 RNA miniprep에 대해 1-2 x 106 세포이다. 이는 시약 부피의 변화 없이 miniprep 당 최대 5 x 106 세포까지 증가될 수 있다. 더 많은 세포 수를 위해서, 제조자의 프로토콜에 따라 다수의 miniprep을 처리하거나 또는 RNA midiprep 절차를 사용한다.
(2) 5 mL의 RNAprotect® 세포 시약에 대해 1 mL의 시료의 비율을 사용한다.
ii) 5 mL의 RNAprotect® 세포 시약을 포함하는 적당한 수의 15 mL 튜브를 준비한다.
iii) 동결된 세포: 해동되는 것을 방지하기 위해 동결된 세포를 갖는 바이알을 드라이 아이스에 두었다. 시약을 첨가하기 전에 상기 세포를 해동하지 않는다. 한번에 하나의 바이알을 처리하여 RNA의 보호를 최대로 한다.
(1) 하나의 15 mL 튜브로부터의 RNAprotect® 세포 시약 ~750 μL를, ~1 mL의 동결 배지를 포함하는 동결된 세포의 크라이오바이알로 옮겼다. 다른 시나리오를 위해 필요하다면 부피를 조정하였다. 과도하게 채우지는 않아야 한다.
(a) 피펫팅에 의한 손실을 방지하기 위해 고품질의 낮은-유지력을 갖는 피펫 팁을 사용한다.
(2) 상기 혼합물을 ~10초 동안 즉시 와동시켰다. 일부 해동된 혼합물을 RNAprotect® 세포 시약을 포함하는 동일한 15 mL 튜브로 다시 빠르게 옮겼다.
(3) 상기 혼합물이 완전히 해동될 때까지 단계 3)c)iii)(1) 및 3)c)iii)(2)를 반복하였다. 이를 3-4회 반복하였다.
(4) 상기 시료가 균질하게 될 때까지 와동으로 잘 혼합하였다.
iv) 전체 RNA 단리를 즉시 진행하거나 또는 RNAprotect® 세포 시약 중에 제조된 시료를 보관하였다. 시료를 2-8℃에서 최대 4주 동안 보관하거나 또는 -20℃ 또는 -80℃에서 보관하였다.
d) 전체 RNA 단리를 위한 세포 용해물의 제조.
i) 동결된 경우, RNAprotect® 세포 혼합물을 실온에서 혼합 없이 해동하였다.
ii) 상기 RNAprotect® 세포 혼합물을 5분 동안 4000 rpm (Sorvall ID 0018 또는 동등물)으로 원심분리하여 세포 및 형성될 수 있는 임의의 침전물을 수집하였다. 눈에 보이는 백색 펠렛이 형성되어야 한다.
iii) 폐기물 용기로 가능한 많은 상등액을 제거하였다. 튜브를 톡톡 치거나 또는 와동하여 펠렛을 느슨하게 하였다. 이는 다음 단계에서 완전한 가용화를 위해 매우 중요하다.
(1) 350 μL의 새롭게 제조된 버퍼 RLT 플러스 + β-ME를 상기 펠렛에 첨가하였다. 상기 펠렛이 완전히 용해될 때까지, 1-2분 동안 거칠게 와동시켰다. 필요하다면, 상기 용해물을 -80℃로 보관할 수 있다. 사용 전에 실온에서 해동시키고 와동시켰다.
e) QIAGEN ® RNeasy ® 플러스 미니 키트를 사용하는 전체 RNA의 단리.
모든 단계들을 실온에서 수행하였다. 하기 냉동보존된 시료로부터 전체 RNA를 단리시켰다. 30 μL 뉴클레아제-프리 물에서 용리시켰다.
#1: iPSC-MSC (비-증식) (참조 배양물)
#2: iPSC-MSC (증식) (참조 배양물)
#3: iPSC-MSC 플러스 0.001% iPSC 스파이크 (비-증식) (참조 배양물)
#4: iPSC-MSC 플러스 0.001% iPSC 스파이크 (증식) (참조 배양물)
#5: iPSC-MSC P5 최종 산물 (비-증식)
#6: iPSC-MSC P5 최종 산물 (증식)
i) 용해물을 QIAshredder로 옮겼다. 상기 용해물을 전단 및 균질화하기 위해 전속력으로 2분 동안 원심분리하였다. 수집 튜브 바닥에 얇고 둥근 펠렛이 형성될 수 있다.
ii) 균질화된 용해물을 조립된 gDNA 엘리미네이터 스핀 컬럼 (Eliminator spin column)으로 옮겨서, 임의의 펠렛화된 물질을 피하였다. 30초 동안 최고 속도로 원심분리하였다. 필요하다면, 모든 용해물이 스핀 컬럼을 통과할 때까지 반복하였다.
iii) 350 μL의 70% 에탄올을 유출물 (flow-through)로 첨가하였고, 피펫팅으로 잘 혼합하였다. 원심분리하지 않았다. 상기 혼합물을 조립된 RNeasy® 스핀 컬럼으로 즉시 옮겼고, 임의의 침전물이 형성될 수 있다.
iv) 캡으로 온화하게 닫고, 전속력으로 15초 동안 원심분리하였다. 상기 수집 튜브로부터의 유출물은 버렸다. RNA는 RNeasy® 스핀 컬럼에 결합되어 있다.
v) 멤브레인상에 DNase 처리:
(1) 게놈 DNA를 최대한 제거하기 위해, 결합된 RNA를 RNase-프리 DNase로 처리하였다.
(a) 350 μL 버퍼 RW1를 상기 스핀 컬럼에 첨가하였다. 캡으로 온화하게 닫고, 전속력으로 15초 동안 원심분리하였다. 상기 수집 튜브로부터의 유출물을 버렸다.
(b) 각 시료에 있어서, 20 μL의 재구성된 DNase, 140 μL 버퍼 RDD 및 2 μL SUPERase. InTM을 배합하였다. 피펫팅으로 온화하게 혼합하였고, 모두를 하나의 튜브로 배합하였다. 와동하지 않는다.
(c) 피펫으로 80 μL의 DNase 믹스를 RNeasy® 멤브레인 중심에 직접 첨가하였다. 실온에서 20분 동안 인큐베이트하였다.
(d) 350 μL 버퍼 RW1을 상기 스핀 컬럼으로 첨가하였다. 캡으로 온화하게 닫고, 전속력으로 15초 동안 원심분리하였다. 상기 수집 튜브로부터의 유출물을 버렸다.
vi) 500 μL 버퍼 RPE를 상기 스핀 컬럼에 첨가하였다. 캡으로 온화하게 닫고, 전속력으로 15초 동안 원심분리하였다. 상기 수집 튜브로부터의 유출물을 버렸다.
vii) 500 μL 버퍼 RPE를 상기 스핀 컬럼에 첨가하여 세척을 반복하였다. 캡으로 온화하게 닫고, 전속력으로 2분 동안 원심분리하였다.
viii) 상기 스핀 컬럼을 새로운 2 mL 수집 튜브로 옮겼다. 전속력으로 1분 동안 원심분리하여 임의의 잔류하는 세척 용액을 제거하였다.
ix) 상기 스핀 컬럼을 1.5 mL 수집 튜브로 옮겼다. 30 μL RNase-프리 물을 상기 멤브레인으로 직접 첨가하였다. 캡으로 온화하게 닫고, 전속력으로 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출시켰다.
x) 스핀 컬럼을 버렸고, 튜브에 캡을 씌웠다. 상기 튜브에 일자와 시료 ID를 라벨링하였다.
xi) 각 전체 RNA 시료의 부피를 30 μL로 정규화하였다.
(1) 10-100 μL 피펫을 30 μL로 설정하였고, 용출액 부피를 측정하였다.
(2) 상기 부피가 30 μL 미만이면, RNeasy® 키트로부터의 뉴클레아제-프리 물을 최종 부피 30 μL로 첨가하였다.
(3) 상기 시료는 개시하는 세포의 수로 정규화하였다.
xii) Nanodrop 2000을 사용하여 각 시료에 대한 전체 RNA 농도를 결정하였다.
(1) 소프트웨어를 실행하기 전에 시료 받침대를 Milli-Q 물로 세척하여, 이전 사용으로 인한 임의의 가능한 오염을 제거하였다.
(2) 소프트웨어가 초기화되면, 340 nm Baseline Correction 박스의 선택을 해제하였다.
(3) 상기 기기를 Milli-Q 물로 검정하였다.
(4) Milli-Q 물 시료를 시험하여 배경을 영 (zero)으로 하였다. 필요하다면, 상기 시료 받침대를 Milli-Q 물로 재세척하였다.
(5) 단회 결정을 사용하여 각 시료의 전체 RNA 농도를 결정하였다.
(6) 전체 RNA 수득율 및 세포당 수득율을 산출하였다.
(7) 각 시료에 대해 1.0-2.0 μg 전체 RNA의 부피를 산출하였다. (cDNA 반응에 대해 최대 2.0 μg 전체 RNA가 역전사될 수 있다).
(8) 전체 RNA 농도는 역전사에 대해 10 μL (최대 부피)에 대해 1 μg 전체 RNA의 요건을 충족하기 위해 ≥100 ng/μL이어야 한다. 필요하다면 새로운 세포 바이알로부터 전체 RNA를 재단리 (re-isolate)한다.
1x106 냉동보존된 iPSC-MSC에 대한 예상되는 전체 RNA 수득율은 ~5-10 μg이다. 이는 세포당 전체 RNA ~5-10 pg과 동일하다.
xiii) cDNA 합성을 진행하거나 또는 전체 RNA를 -20℃에서 최대 1년 동안 보관하였다.
f) 고 용량 RNA-대- cDNA TM 키트를 사용하는 cDNA의 제조.
i) 각 전체 RNA 시료에 대해, 1 μg 전체 RNA / 22 μL RT를 사용하여 cDNA +/-RT를 제조하였다. H2O (NTC) +/-RT 대조군 (N=14)을 포함한다.
ii) 상기 키트 성분들을 얼음에서 해동시켰다.
iii) 분석될 전체 RNA 시료의 수에 따라, 얼음에서 하나의 +RT 및 하나의 -RT 마스터 믹스를 제조하였다. 상기 -RT 시료는 역전사효소가 결여된 네가티브 대조군으로 제공되었다. 전체 RNA를 RT-PCR 등급 물로 대체시킨 H2O (NTC) +/- RT 대조군을 포함한다.
iv) 각 전체 RNA 시료에 대해 개별의 +/-RT 반응 믹스를 얼음에서 제조하였다.
(1) 전체 RNA의 최대 부피는 22 μL +/-RT에 대해 10 μL이었다. 전체 RNA의 부피는, 전체 RNA 농도에 따라 가변될 것이다.
(2) 전체 RNA 부피를 10 μL에서 감산하여 각 튜브에 대한 RT-PCR 등급 물의 부피를 산출하였다.
(3) 적절한 부피의 RT-PCR 등급 물을 각 튜브로 피펫으로 넣었다. +/-RT H2O 대조군에 대해 10 μL를 사용하였다.
(4) 적절한 부피의 전체 RNA를 각 튜브에 첨가하였다.
(5) 12 μL의 +RT 또는 -RT 마스터 믹스를 각 튜브에 첨가하였고 피펫팅으로 온화하게 혼합하였다.
v) 37℃에서 60분 동안 인큐베이트하였다.
vi) 95℃에서 5분 동안 열 불활성화시켰다.
vii) 상기 튜브를 간단하게 원심분리하여 cDNA를 수집하였다.
viii) 상기 cDNA 부피를 검정된 10-100 μL 피펫을 사용하여 측정하였다.
(1) 상기 피펫을 cDNA 반응 부피 (20-22 μL)로 설정하고, cDNA 부피를 측정하였다.
(2) 상기 cDNA 부피를 뉴클레아제-프리 물로 100 μL까지 조정하였다. 이는 저해제를 희석하였고, 다수의 qRT-PCR 분석을 위해 충분한 cDNA를 제공하였다.
ix) 와동으로 혼합하고, 상기 시료를 간단하게 스핀다운시켰다.
x) qRT-PCR로 진행하거나, 또는 -20℃로 보관하였다.
g) qRT - PCR ( TaqMan ® 유전자 발현 분석)
i) 각 cDNA (N=14)에 있어서, LIN28 및 GAPDH에 대해 20 μL qRT-PCR 당 50 ng cDNA (전체 RNA 당량)를 증폭하였다 (각 N=3). 50 사이클을 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. (프로토콜 파일: TaqMan qRT-PCR 분석 Cq(50).prcl).
ii) 복제물의 수 및 수행될 TaqMan® GE 분석의 수에 따라, 각 +RT 및 -RT cDNA에 대해 cDNA 증폭 믹스를 제조하였다.
(1) 반응 당 cDNA의 권장되는 최대 양은 100 ng이다 (전체 RNA 당량).
iii) TaqMan® GE 분석 및 복제물의 수에 따라, 각 cDNA에 대해 GE 분석 믹스를 제조하였다. 하나의 GE 분석 믹스는 각 cDNA 및 수행될 각 TaqMan® GE 분석을 위해 제조될 것이다.
iv) 20 μL의 각 GE 분석 믹스를 화이트 CFX96 플레이트로 옮겼고, 광학 플레이트 실러 (optical plate sealer)로 밀봉하였다.
v) 상기 플레이트를 400 rpm에서 1분 동안 플레이트 어뎁터 (plate adapter)를 구비한 원심분리기 (ID #0018)에서 원심분리하여 웰의 바닥에 내용물을 수집하였다.
vi) 상기 플레이트를 서멀 사이클러 (thermal cycler)에, 상기 웰의 내용물을 방해하지 않도록 주의하면서 조심스럽게 넣었다.
vii) 부착된 컴퓨터에서 Bio-Rad CFX ManagerTM 소프트웨어를 사용하여 Bio-Rad CFX96 실시간 PCR 검출 시스템을 프로그램하였다. 하기 서멀 사이클링 파라미터를 갖는다:
(1) 50.0℃에서 2분 (UNG 인큐베이션; 적절한 우라실-N-글리코실라제 활성을 필요로 함; 이전에 증폭된, dUTP-혼입된 PCR 산물을 분해하여 PCR 오염을 감소시킴).
(2) 95℃에서 10분 (가열 개시: AmpliTaq Gold®, UP 폴리머라제 활성화).
(3) [95℃에서 15초 (변성) + 60℃에서 1분 (어닐링/연장) + 플레이트 판독] - 50 사이클을 위해 49회 반복 (증폭 및 실시간 검출).
viii) 상기 시료 부피를 20 μL로 설정하였다.
ix) 예상되는 실행 시간은 01:59:00 h이어야 한다.
x) 실행 중에 모든 웰 및 모든 채널을 판독하여 모든 데이터가 실행 중에 수집되는 것을 확인하였다.
(1) 플레이트 레이아웃 상에 위치한 미리보기 세팅은 다음과 같아야 한다:
(a) 형광단: FAM, HEX, Texas Red, Cy5, Quasar 705 (VIC는 이후에 첨가될 수 있음)
(b) 플레이트 타입: BR 화이트
(c) 스캔 모드: 모든 채널
xi) 모든 웰은 "Unk"로 표지되어야 하고, 이는 소프트웨어가 수행 중에 모든 웰을 알 수 없음으로 간주함을 나타낸다. 상기 실제 플레이트 레이아웃은 수행이 완료된 후에 설정될 것이다.
xii) 다음을 클릭하여 시작 실행 탭으로 이동시켰다. 참고 섹션에서 실행에 대한 식별 정보를 입력하였다.
xiii) 개시 실행 버튼을 클릭하여 qRT-PCR을 시작하였다.
h) 데이터 분석
i) 데이터 분석 창이 실행 종료시에 열렸다.
(1) qRT-PCR 데이터는 Cq 값 (즉 Cq(50))으로 보고되었다.
ii) 창의 상부 우측에 플레이트 셋업 버튼을 클릭하였다.
(1) 보기/편집 플레이트를 선택하였다. 플레이트 로딩 가이드를 따라 시료 정보를 갖는 플레이트를 설정하였다.
(a) 비어있는 웰을 깨끗하게 하였다.
(b) "분석에서 웰 제외"를 체크하지 않는다. 모든 데이터는 분석되어야 한다.
(2) OK를 클릭하고 파일을 저장하였다.
iii) 창 위쪽에 있는 정량화 탭을 클릭하였다.
iv) 하기 세팅을 확인하였다:
(1) Cq 결정 모드: 단일 역치
(2) 기준선 세팅: 기준선 감산된 곡선 피트
(3) 분석 모드: 형광단
v) 하기 섹션 및 관련된 하위섹션을 포함하는 툴 메뉴로부터 보고서를 생성하였다: 헤더 (Header), 실행 설정 (Run Setup), 정량화 (Quantification) 및 QC 파라미터.
(1) 섹션과 관련이 없는, 유전자 발현 옵션, 대립유전자 구별 (Allelic Discrimination) 및 종료점 (End Point)은 선택해제하였다.
vi) 내보내기 > "모든 데이터 시트를 엑셀로 내보내기"를 선택하여 분석을 위한 데이터를 내보냈다. 이는 상기 데이터를 스프레드시트 형태로 제공할 것이다.
vii) 스프레드시트를 사용하여 데이터를 분석하였다.
(1) "N/A"를 "Cq(50) 없음"으로 보고하였다.
(2) 각 LIN28 및 GAPDH +/-RT 데이터 세트에 대한 Av. Cq(50) 및 % 상대 표준 편차 (RSD, 또는 변동 계수 (CV))를 산출하였다.
(3) Av. GAPDH Cq(50) (N=3)를 Av. LIN28 Cq(50) (N=3)으로부터 감산하여 Av. Cq(50) 값을 정규화하였다.
(4) 모든 시료에 대해 Av. GAPDH Cq(50) 및 % RSD를 산출하였다.
(5) 시료 #2 (iPSC-MSC (증식)) 및 #4 (iPSC-MSC 플러스 0.001% iPSC 스파이크 (증식))의 정규화된 Av. Cq(50) 값을 비교하였다. 시료 #4 (iPSC-MSC 플러스 0.001% iPSC 스파이크 (증식)) 및 #6 (iPSC-MSC P5 최종 산물 (증식))의 정규화된 Av. Cq(50) 값을 비교하였다.
4) 허용 기준
a) 시료 #2 (iPSC-MSC (증식))의 정규화된 Av. Cq(50) 값은 시료 #4 (iPSC-MSC 플러스 0.001% iPSC 스파이크 (증식))의 정규화된 Av. Cq(50) 값보다 더 커야 한다. 이는 0.001% iPSC 스파이크 (증식)가 배경보다 높게 검출될 수 있다는 것을 보여주었다.
iPSC - MSC P5 최종 산물에 있어서 참조 배양물에 대한 예상되는 Av . Norm. Cq(50) 값.
시료 # 스파이크 증식 예상되는 Av . Norm. Cq (50)*
1 없음 아니오 15.16 ± 0.29
2 없음 예 19.85 ± 0.17
3 0.001% iPSC 아니오 14.93 ± 0.06
4 0.001% iPSC 예 13.86 ± 0.07
*Norm. LIN28 Cq(50) = (LIN28 Cq(50) - GAPDH Cq(50) ) +/- Std. Dev. (N=3x3)
b) 모든 시료에 대한 GAPDH Cq(50) % RSD는 ≤5%이어야 한다. 모든 평균 Cq(50) 값 및 정규화된 Cq(50) 값에 대한 % RSD는 ≤5%이어야 한다.
c) H2O (NTC) 대조군 (+/-RT)은 모든 복제물에 대해 50회 증폭 사이클내에서 검출가능한 증폭 신호를 생성하지 않아야 한다.
i) 상기 H2O (NTC) 대조군 (+/-RT)에 Cq(50) 값이 부여되어 있으면, 단계 3)g)로부터의 TaqMan® qRT-PCR 분석을 반복하였다. 이는 주형 DNA에 의한 시약의 오염을 나타내었다.
실시예 3 - 실시예 　2에 따라 수행된 프로토콜의 결과
참조 배양물 및 iPSC - MSC P5 최종 산물에 대해 실시예 2에 따라 수행된 프로토콜의 Av. Norm. Cq(50) 값.
시료 # 설명 Av . Norm. Cq (50):
iPSC-MSC-P5
배양물 1 배양물 2 배양물 3
1 iPSC-MSC (비-증식) (참조 배양물) 15.23 15.33 14.73
2 iPSC-MSC (증식) (참조 배양물) 19.97 21.51 20.53
3 iPSC-MSC 플러스 0.001% iPSC 스파이크 (비-증식) (참조 배양물) 14.90 15.02 14.69
4 iPSC-MSC 플러스 0.001% iPSC 스파이크 (증식) (참조 배양물) 14.30 14.20 13.99
5 iPSC-MSC P5 최종 산물 (비-증식) 15.97 15.42 14.09
6 iPSC-MSC P5 최종 산물 (증식) 20.46 21.06 20.72
실시예 4 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 OCT4 (POU5F1)로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 5 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 SOX2로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 6 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 FOXD3으로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 7 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 NANOG로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 8 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 PODXL로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 9 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 REX1 (ZFP42)로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 10 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 SSEA1 (FUT4)로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 11 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 SSEA4로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 12 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 DPPA2로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
실시예 13 - qRT - PCR에 의한 잔류하는 미분화된 줄기 세포의 정량화
본 실시예는 기본적으로 실시예 2의 프로토콜에 의한 잔류하는 미분화된 iPSC의 정량화를 개시하였지만, LIN28은 DPPA3으로 대체되었다. 예상되는 결과는 실시예 2, 표 7 및 실시예 3, 표 8에 일치한다.
SEQUENCE LISTING <110> Cynata Therapeutics Limited <120> PLURIPOTENT STEM CELL ASSAY <130> P104383.PCT <150> AU 2016904679 <151> 2016-11-16 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> laminin-521 alpha chain Met Ala Lys Arg Leu Cys Ala Gly Ser Ala Leu Cys Val Arg Gly Pro 1 5 10 15 Arg Gly Pro Ala Pro Leu Leu Leu Val Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala 20 25 30 Ala Arg Ala Arg Glu Glu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Leu His Pro Pro 35 40 45 Tyr Phe Asn Leu Ala Glu Gly Ala Arg Ile Ala Ala Ser Ala Thr Cys 50 55 60 Gly Glu Glu Ala Pro Ala Arg Gly Ser Pro Arg Pro Thr Glu Asp Leu 65 70 75 80 Tyr Cys Lys Leu Val Gly Gly Pro Val Ala Gly Gly Asp Pro Asn Gln 85 90 95 Thr Ile Arg Gly Gln Tyr Cys Asp Ile Cys Thr Ala Ala Asn Ser Asn 100 105 110 Lys Ala His Pro Ala Ser Asn Ala Ile Asp Gly Thr Glu Arg Trp Trp 115 120 125 Gln Ser Pro Pro Leu Ser Arg Gly Leu Glu Tyr Asn Glu Val Asn Val 130 135 140 Thr Leu Asp Leu Gly Gln Val Phe His Val Ala Tyr Val Leu Ile Lys 145 150 155 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Gly Tyr Phe His Phe Pro Leu Cys Gln Leu Cys Gly Cys Ser Pro Ala 580 585 590 Gly Thr Leu Pro Glu Gly Cys Asp Glu Ala Gly Arg Cys Leu Cys Gln 595 600 605 Pro Glu Phe Ala Gly Pro His Cys Asp Arg Cys Arg Pro Gly Tyr His 610 615 620 Gly Phe Pro Asn Cys Gln Ala Cys Thr Cys Asp Pro Arg Gly Ala Leu 625 630 635 640 Asp Gln Leu Cys Gly Ala Gly Gly Leu Cys Arg Cys Arg Pro Gly Tyr 645 650 655 Thr Gly Thr Ala Cys Gln Glu Cys Ser Pro Gly Phe His Gly Phe Pro 660 665 670 Ser Cys Val Pro Cys His Cys Ser Ala Glu Gly Ser Leu His Ala Ala 675 680 685 Cys Asp Pro Arg Ser Gly Gln Cys Ser Cys Arg Pro Arg Val Thr Gly 690 695 700 Leu Arg Cys Asp Thr Cys Val Pro Gly Ala Tyr Asn Phe Pro Tyr Cys 705 710 715 720 Glu Ala Gly Ser Cys His Pro Ala Gly Leu Ala Pro Val Asp Pro Ala 725 730 735 Leu Pro Glu Ala Gln Val Pro Cys Met Cys Arg Ala His Val Glu Gly 740 745 750 Pro Ser Cys Asp Arg Cys Lys Pro Gly Phe Trp Gly Leu Ser Pro Ser 755 760 765 Asn Pro Glu Gly Cys Thr Arg Cys Ser Cys Asp Leu Arg Gly Thr Leu 770 775 780 Gly Gly Val Ala Glu Cys Gln Pro Gly Thr Gly Gln Cys Phe Cys Lys 785 790 795 800 Pro His Val Cys Gly Gln Ala Cys Ala Ser Cys Lys Asp Gly Phe Phe 805 810 815 Gly Leu Asp Gln Ala Asp Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Cys Arg Cys Asp 820 825 830 Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gln Ser Cys Glu Pro Arg Thr Gly Val Cys 835 840 845 Arg Cys Arg Pro Asn Thr Gln Gly Pro Thr Cys Ser Glu Pro Ala Arg 850 855 860 Asp His Tyr Leu Pro Asp Leu His His Leu Arg Leu Glu Leu Glu Glu 865 870 875 880 Ala Ala Thr Pro Glu Gly His Ala Val Arg Phe Gly Phe Asn Pro Leu 885 890 895 Glu Phe Glu Asn Phe Ser Trp Arg Gly Tyr Ala Gln Met Ala Pro Val 900 905 910 Gln Pro Arg Ile Val Ala Arg Leu Asn Leu Thr Ser Pro Asp Leu Phe 915 920 925 Trp Leu Val Phe Arg Tyr Val Asn Arg Gly Ala Met Ser Val Ser Gly 930 935 940 Arg Val Ser Val Arg Glu Glu Gly Arg Ser Ala Thr Cys Ala Asn Cys 945 950 955 960 Thr Ala Gln Ser Gln Pro Val Ala Phe Pro Pro Ser Thr Glu Pro Ala 965 970 975 Phe Ile Thr Val Pro Gln Arg Gly Phe Gly Glu Pro Phe Val Leu Asn 980 985 990 Pro Gly Thr Trp Ala Leu Arg Val Glu Ala Glu Gly Val Leu Leu Asp 995 1000 1005 Tyr Val Val Leu Leu Pro Ser Ala Tyr Tyr Glu Ala Ala Leu Leu 1010 1015 1020 Gln Leu Arg Val Thr Glu Ala Cys Thr Tyr Arg Pro Ser Ala Gln 1025 1030 1035 Gln Ser Gly Asp Asn Cys Leu Leu Tyr Thr His Leu Pro Leu Asp 1040 1045 1050 Gly Phe Pro Ser Ala Ala Gly Leu Glu Ala Leu Cys Arg Gln Asp 1055 1060 1065 Asn Ser Leu Pro Arg Pro Cys Pro Thr Glu Gln Leu Ser Pro Ser 1070 1075 1080 His Pro Pro Leu Ile Thr Cys Thr Gly Ser Asp Val Asp Val Gln 1085 1090 1095 Leu Gln Val Ala Val Pro Gln Pro Gly Arg Tyr Ala Leu Val Val 1100 1105 1110 Glu Tyr Ala Asn Glu Asp Ala Arg Gln Glu Val Gly Val Ala Val 1115 1120 1125 His Thr Pro Gln Arg Ala Pro Gln Gln Gly Leu Leu Ser Leu His 1130 1135 1140 Pro Cys Leu Tyr Ser Thr Leu Cys Arg Gly Thr Ala Arg Asp Thr 1145 1150 1155 Gln Asp His Leu Ala Val Phe His Leu Asp Ser Glu Ala Ser Val 1160 1165 1170 Arg Leu Thr Ala Glu Gln Ala Arg Phe Phe Leu His Gly Val Thr 1175 1180 1185 Leu Val Pro Ile Glu Glu Phe Ser Pro Glu Phe Val Glu Pro Arg 1190 1195 1200 Val Ser Cys Ile Ser Ser His Gly Ala Phe Gly Pro Asn Ser Ala 1205 1210 1215 Ala Cys Leu Pro Ser Arg Phe Pro Lys Pro Pro Gln Pro Ile Ile 1220 1225 1230 Leu Arg Asp Cys Gln Val Ile Pro Leu Pro Pro Gly Leu Pro Leu 1235 1240 1245 Thr His Ala Gln Asp Leu Thr Pro Ala Met Ser Pro Ala Gly Pro 1250 1255 1260 Arg Pro Arg Pro Pro Thr Ala Val Asp Pro Asp Ala Glu Pro Thr 1265 1270 1275 Leu Leu Arg Glu Pro Gln Ala Thr Val Val Phe Thr Thr His Val 1280 1285 1290 Pro Thr Leu Gly Arg Tyr Ala Phe Leu Leu His Gly Tyr Gln Pro 1295 1300 1305 Ala His Pro Thr Phe Pro Val Glu Val Leu Ile Asn Ala Gly Arg 1310 1315 1320 Val Trp Gln Gly His Ala Asn Ala Ser Phe Cys Pro His Gly Tyr 1325 1330 1335 Gly Cys Arg Thr Leu Val Val Cys Glu Gly Gln Ala Leu Leu Asp 1340 1345 1350 Val Thr His Ser Glu Leu Thr Val Thr Val Arg Val Pro Lys Gly 1355 1360 1365 Arg Trp Leu Trp Leu Asp Tyr Val Leu Val Val Pro Glu Asn Val 1370 1375 1380 Tyr Ser Phe Gly Tyr Leu Arg Glu Glu Pro Leu Asp 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ctttttgttg tttttgccac 1620 cgtggagagc aactatttgg agtgcacagc ctattgaact acctcatttt tgccaataag 1680 agctggcttt tctgccatag tgtcctcttg aaaccccctc tgccttgaaa atgttttatg 1740 ggagactagg ttttaactgg gtggccccat gacttgattg ccttctactg gaagattggg 1800 aattagtcta aacaggaaat ggtggtacac agaggctagg agaggctggg cccggtgaaa 1860 aggccagaga gcaagccaag attaggtgag ggttgtctaa tcctatggca caggacgtgc 1920 tttacatctc cagatctgtt cttcaccaga ttaggttagg cctaccatgt gccacagggt 1980 gtgtgtgtgt ttgtaaaact agagttgcta aggataagtt taaagaccaa tacccctgta 2040 cttaatcctg tgctgtcgag ggatggatat atgaagtaag gtgagatcct taacctttca 2100 aaattttcgg gttccaggga gacacacaag cgagggtttt gtggtgcctg gagcctgtgt 2160 cctgccctgc tacagtagtg attaatagtg tcatggtagc taaaggagaa aaagggggtt 2220 tcgtttacac gctgtgagat caccgcaaac ctaccttact gtgttgaaac gggacaaatg 2280 caatagaacg cattgggtgg tgtgtgtctg atcctgggtt cttgtctccc ctaaatgctg 2340 ccccccaagt tactgtattt gtctgggctt tgtaggactt cactacgttg attgctaggt 2400 ggcctagttt gtgtaaatat aatgtattgg tctttctccg 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DNA <213> Homo sapiens <400> REX1 (ZFP42) agtttctcct ttgttttacg tttgggagga ggtggcattg gaaatagcag agtgcttcgc 60 ggtaacaggg gttggagtgc aatggtgtga tctcagctca ctgcaacccc tgcctcccag 120 gctccagcga tcctcccacc tcagcctcct gaatagctga ccaccagcac actaggcaaa 180 cccaccccac tcacggcctc ccttgggaat tcagacctaa ccatcgctga gctgaaacaa 240 atgtactgag gctggagcct gtgtgaacag aacagaagag gccttcactc tagtagtgct 300 cacagtccag caggtgtttg ctgaagacag cttactcaga tcactactgc ctggaggtgg 360 ttgatatatc ctggtgtaaa ccttcaagaa gggcacaggc aggaaaacat gagccagcaa 420 ctgaagaaac gggcaaagac aagacaccag aaaggcctgg gtggaagagc ccccagtggg 480 gctaagccca ggcaaggcaa gtcaagccaa gacctgcagg cggaaataga acctgtcagc 540 gcggtgtggg ccttatgtga tggctatgtg tgctatgagc ctggccctca ggctctcgga 600 ggggatgatt tctcagactg ttacatagaa tgcgtcataa ggggtgagtt ttctcaaccc 660 atcctggaag aggactcact ttttgagtcc ttggaatacc taaagaaagg atcagaacaa 720 cagctttctc aaaaggtttt cgaagcaagc tcccttgaat gttctttgga atacatgaaa 780 aaaggggtaa agaaagagct tccacaaaag atagttggag agaattcgct tgagtattct 840 gagtacatga caggcaagaa gcttccgcct ggaggaatac ctggcattga cctatcagat 900 cctaaacagc tcgcagaatt tgctagaaag aagcccccca taaataaaga atatgacagt 960 ctgagcgcaa tcgcttgtcc tcagagtgga tgcactagga agttgaggaa tagagctgcc 1020 ctgagaaagc atctcctcat tcatggtccc cgagaccacg tctgtgcgga atgtgggaaa 1080 gcgttcgttg agagctcaaa actaaagaga catttcctgg ttcatactgg agagaagccg 1140 tttcggtgca cttttgaagg gtgcggaaag cgcttctctc tggactttaa tttgcgtacg 1200 cacgtgcgca tccacacggg ggagaaacgt ttcgtgtgtc cctttcaagg ctgcaacagg 1260 aggtttattc agtcaaataa cctgaaagcc cacatcctaa cgcatgcaaa tacgaacaag 1320 aatgaacaag agggaaagta gtcctccaac aggatgaagc agattaacag aagagtgatc 1380 agtgacaaac atgcctcatt gattattgtt tctaggaagg aatttctaaa tcaatattgc 1440 aaccccaaaa gcggttataa tttggtgtta ctaagatgct cctacacttt gtgataccgt 1500 tttaaggaca tggtgcattt ttttttcttt tatttgtttt atttagaact ttttttattt 1560 gttttattta gaactttgtg tgttcttaaa gtgtgcttcc aacaggaagg tcagtgataa 1620 attttcaaaa gcataacctt caatatatta tctgttggat tattggatat aagacttatt 1680 ttcatgtact ataaatatga aaataacttt gatttttaat tgtgtagttt ccatttctta 1740 gcttttgcct tttaaattta tacttcagcc aggcatagtg actgatgcct gtaatcccaa 1800 cactttgttg ggaggccaaa gcaggaggat agcttgaggc caggagttcc agaccagcct 1860 gggcaacata gtgagatcct gtctctacaa aaaaatttgt ttttatttgt atttatatat 1920 ttttattttt gtttttgttg gtaggcgtct cgctctgtca cccaggctgg agtctagtgt 1980 cgtgatcttg gctcactgca acctccacct cccgggttca agtgattctc tggcctcagc 2040 ctcccaagta gctgggacta caggtgtgtg tcaccacgcc cggctaattt ttgtattttt 2100 agtagagatg gggtttcacc atgttggcca ggctagtctc aaactcctga cctccagtga 2160 tctgcccacc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggt gtgagccact gtgcctggcc 2220 ccccacaaca tgtttaaact tagctaggcc tggttgcata cgcctgtgtt cccagctact 2280 caggaggctg aagcaggagg atagcttgag cccaggagtt tgaggctaca gtgagctgtg 2340 attgcaccac tgtactccag actggataac agcaagagcc catcttttaa aaaaagtaaa 2400 aattaaaaat atacttcatg gttcatgtca tagccctaga gaatgaaaaa tttgcagtag 2460 atagtcaata aatgaatcag tagttaaata ttccttaaag tcaactgtat ttcattgtga 2520 tttttgtttt ctttttatca ttgtatcaaa ctatatggaa atcatatggt tagatgtgat 2580 tatttgataa tgttagtcca tttgaatcca ttttagatat ttcacaatta aagaatatga 2640 aacttcagaa aaaaaaaaaa 2660 <210> 12 <211> 6063 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> SSEA1 (FUT4) coding aatccctccc tccggcgggc gtcgctggcg ggtggctagg cccaacggca ggaagccgac 60 gctatcctcc gttccgcggc gccgggtccg ccttccgtct gttctagggc ctgctcctgc 120 gcggcagctg ctttagaagg tctcgagcct cctgtacctt cccagggatg aaccgggcct 180 tccctctgga aggcgagggt tcgggccaca gtgagcgagg gccagggcgg tgggcgcgcg 240 cagagggaaa ccggatcagt tgagagagaa tcaagagtag cggatgaggc gcttgtgggg 300 cgcggcccgg aagccctcgg gcgcgggctg ggagaaggag tgggcggagg cgccgcagga 360 ggctcccggg gcctggtcgg gccggctggg ccccgggcgc agtggaagaa agggacgggc 420 ggtgcccggt tgggcgtcct ggccagctca ccttgccctg gcggctcgcc ccgcccggca 480 cttgggagga gcagggcagg gcccgcggcc tttgcattct gggaccgccc ccttccattc 540 ccgggccagc ggcgagcggc agcgacggct ggagccgcag ctacagcatg agagccggtg 600 ccgctcctcc acgcctgcgg acgcgtggcg agcggaggca gcgctgcctg ttcgcgccat 660 gggggcaccg tggggctcgc cgacggcggc ggcgggcggg cggcgcgggt ggcgccgagg 720 ccgggggctg ccatggaccg tctgtgtgct ggcggccgcc ggcttgacgt gtacggcgct 780 gatcacctac gcttgctggg ggcagctgcc gccgctgccc tgggcgtcgc caaccccgtc 840 gcgaccggtg ggcgtgctgc tgtggtggga gcccttcggg gggcgcgata gcgccccgag 900 gccgccccct gactgccggc tgcgcttcaa catcagcggc tgccgcctgc tcaccgaccg 960 cgcgtcctac ggagaggctc aggccgtgct tttccaccac cgcgacctcg tgaaggggcc 1020 ccccgactgg cccccgccct ggggcatcca ggcgcacact gccgaggagg tggatctgcg 1080 cgtgttggac tacgaggagg cagcggcggc ggcagaagcc ctggcgacct ccagccccag 1140 gcccccgggc cagcgctggg tttggatgaa cttcgagtcg ccctcgcact ccccggggct 1200 gcgaagcctg gcaagtaacc tcttcaactg gacgctctcc taccgggcgg actcggacgt 1260 ctttgtgcct tatggctacc tctaccccag aagccacccc ggcgacccgc cctcaggcct 1320 ggccccgcca ctgtccagga aacaggggct ggtggcatgg gtggtgagcc actgggacga 1380 gcgccaggcc cgggtccgct actaccacca actgagccaa catgtgaccg tggacgtgtt 1440 cggccggggc gggccggggc agccggtgcc cgaaattggg ctcctgcaca cagtggcccg 1500 ctacaagttc tacctggctt tcgagaactc gcagcacctg gattatatca ccgagaagct 1560 ctggcgcaac gcgttgctcg ctggggcggt gccggtggtg ctgggcccag accgtgccaa 1620 ctacgagcgc tttgtgcccc gcggcgcctt catccacgtg gacgacttcc caagtgcctc 1680 ctccctggcc tcgtacctgc ttttcctcga ccgcaacccc gcggtctatc gccgctactt 1740 ccactggcgc cggagctacg ctgtccacat cacctccttc tgggacgagc cttggtgccg 1800 ggtgtgccag gctgtacaga gggctgggga ccggcccaag agcatacgga acttggccag 1860 ctggttcgag cggtgaagcc gcgctcccct ggaagcgacc caggggaggc caagttgtca 1920 gctttttgat cctctactgt gcatctcctt gactgccgca tcatgggagt aagttcttca 1980 aacacccatt tttgctctat gggaaaaaaa cgatttacca attaatatta ctcagcacag 2040 agatgggggc ccggtttcca tattttttgc acagctagca attgggctcc ctttgctgct 2100 gatgggcatc attgtttagg ggtgaaggag ggggttcttc ctcaccttgt aaccagtgca 2160 gaaatgaaat agcttagcgg caagaagccg ttgaggcggt ttcctgaatt tccccatctg 2220 ccacaggcca tatttgtggc ccgtgcagct tccaaatctc atacacaact gttcccgatt 2280 cacgtttttc tggaccaagg tgaagcaaat ttgtggttgt agaaggagcc ttgttggtgg 2340 agagtggaag gactgtggct gcaggtggga ctttgttgtt tggattcctc acagccttgg 2400 ctcctgagaa aggtgaggag ggcagtccaa gaggggccgc tgacttcttt cacaagtact 2460 atctgttccc ctgtcctgtg aatggaagca aagtgctgga ttgtccttgg aggaaactta 2520 agatgaatac atgcgtgtac ctcactttac ataagaaatg tattcctgaa aagctgcatt 2580 taaatcaagt cccaaattca ttgacttagg ggagttcagt atttaatgaa accctatgga 2640 gaatttatcc ctttacaatg tgaatagtca tctcctaatt tgtttcttct gtctttatgt 2700 ttttctataa cctggatttt ttaaatcata ttaaaattac agatgtgaaa ataaagcaga 2760 agcaaccttt ttccctcttc ccagaaaacc agtctgtgtt tacagacaga agagaaggaa 2820 gccatagtgt cacttccaca caattattta tttcatgtct ttactggacc tgaaatttaa 2880 actgcaatgc cagtcctgca ggagtgctgg cattaccctc tgcagaacag tgaaaggtat 2940 tgcactacat tatggaatca tgcaaaagga aaaaaagttt catgatatct gttgttggca 3000 gtttttgttt atctctgaca gtttttagtt aaatgtttag atcctcagaa ctacattagt 3060 gcctactatt aacttactct gtctcttgtt aaaggctaaa tctgcgcttc tccctggtgc 3120 cagcaggttc ccctcacagt caatgcagtg gtatagcata tcctcacatt tctagtgccc 3180 ttgagactgt gctatggaac caatcttgaa catacatgca ttgacttgac aagttactga 3240 gtaagcagca tattcagcag gtgccactac atgcctactc tgccagacac tgagcttggg 3300 gccctaggga agatagagaa ttatacaagg caaagtcctt ctctttaggg ctcttacaat 3360 ctatcacttc caaaaagtaa atggtgactg ataaaacaat tggcagaacc tgtttgatta 3420 ctgtgacagt cttaatgata ccataaatca atattagaaa gctagttgac ttaaagcctg 3480 aaataatggg agttttctcc tccacttatt agaataagga ccctcagtga ctaattattg 3540 tgggtagggt caagattaac tagttttata cagagttctg ctgtaaatag tcattttgca 3600 tttgattagt gcagttctct gaatcataaa gcaagtttta cctctctgta catgtttttg 3660 cagacatact tgaaaagctc acttaaatct aggtgcttca attcactttc ttgagaggac 3720 aaatgaaaag ctgtggagaa aatgtcctca ttaaagtatt aaagtgtggg cagaattaca 3780 attacaaagt gccagccacc gaataaagat aaaagttcag ttcttaaaat gagtttttat 3840 gagataacag tcagtgatct tggtgttacc gggattccac atggggcagt gggaaagagt 3900 tcaggttttg aaggtaacct agtttagatt tgaattccag ctatgtgaca ttgggtaaat 3960 tagtagtagt cctgagcctc agcgtcctca tctataaaat gactggcgaa aatacttcac 4020 aagctcattt tgagcacttt aggaagtaag tgaaagtacc taaaatagca ggcacccaat 4080 tgatgatttt atatcttcct tctttgcttg cagtgatttc aggatgtcct catatctatt 4140 tataggtcta aaattatatc ttaaggtatg ttgtagaata aattaaaagg ataatctaaa 4200 tcaccattta gattaagctt gacttgcaaa ctaggaagaa gcacctaggc tttctttgaa 4260 aatatttttt tggttcgttt tggtaaagct ctataaattg gtatctatta ttttaccaat 4320 ttttttttag tattaagtcc atttagaact aaccatatta tttatggaat aattagcatg 4380 aggaaggtat aattgcattt tttttttttt gagacggagt cttgcactgt agccccagct 4440 ggactgcagt ggcgtgatct tggctcactg caacctccgc ctcccaggtt caagcgattc 4500 tcctgcctca gcctcccgag cagctgagac tacaggcgcc tgccaccacg cctggccaat 4560 tttttgtatt tttagtagag actgcgtttc accatgttgg gcaggctggt cttgaactcc 4620 tgaccttgtg atccacctgc ctcggcctct cagagagctg ggattacagg tgtgagccgc 4680 cgtgcccagc cattgcattt ttattcacat acacattgtt aatgtggaac aatttaacac 4740 taatctcatc agagagcgag atgaatgtgg caattgctca ttttattttg catatattaa 4800 attgagtagg ttcagctcta acatacctta agaaaaatgc atatcggtgc actgtatgta 4860 tttcaaaatg cctttcctat gattgtcatg tcctccttta aggcttttcc ctcaaattta 4920 ttacaaattt agtattttta gtacttgatg actctaatta catgaatgca cctggaatga 4980 catttgtaac agaagacggt ctgacttgct ttcagtattc acaagttctt tccagtttcc 5040 aagtcttttc ctagcagtaa tttaggggag acagaggagt ttcatgtaaa gagcatgcag 5100 tttggagtca gaacctgggt atgactctgt ggccttgatg aagcaagtta cttaaactct 5160 tgagttttag ctttctcctt tacaatgcat gaatgcctat ccccctacaa aacaaagatt 5220 aaatgtgatg atgtatgcca aggtgctttg tatattgtaa agtgctatat aattataaga 5280 tgttctaaat tttcaaggat ctaaaccagg gattggcaaa cgtttttcca gggagtaaat 5340 attttacgct ttgcatatat aatttatgga ggtgttgaga ggatagatta gacacttgaa 5400 gtactcagga tagtgcctgg catgtaggaa gcacctggaa aatattcgct gtgattacca 5460 tcagtccatt ttaccgagga aggagccaag gtccaggccc actgaaggac ttgcataaca 5520 ttacaatagc agtggcagaa ccagccatgc ttctgcaaat cacaacctct ttgagcctct 5580 gtcacctgaa ctgcaaaatg agtgggttag acaaaatcat ctgttgggac ctcctagttc 5640 cacgtgctat cattctacta actggcaccc taaggttgaa agtgcttatc tgctttccaa 5700 tgtggcttcc ttacagtctg gaactgacaa tatgcaggag cagtaaactg gcagaaaacc 5760 aggaatcaga gaaagaaaat ataatttaac tttaaagatg taaattatat atatagtata 5820 ttatatatat ttttaaagct ttatatgcct caaatatcag ggaaaggagc caagtccttg 5880 gtatttagtt tggtgaatac ttgcattgaa tacatgtcaa gatgtcaagt catttttgaa 5940 tgtgtctcag ggatttctat gctacacatt cttttaacaa atcaagtatt tatgtacaca 6000 tgttcagatt ttttgacaaa atgattaaaa taatgagatg gaaaatgaaa aaaaaaaaaa 6060 aaa 6063 <210> 13 <211> 1393 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> DPPA2 coding agccctttgt ttatggcctg atctagctaa ggcttctaga cttcaggagc ttaagaatcg 60 tccggagggc tgggcgtggc ggtgcaggcc tgtagtccca cccactccga aggctgcgga 120 gggaggatca acttgagtct gggaactcag ccaggaattc aagaccagcc tgggcaacac 180 agtgaggccc cctacccaca tcctctccgt ccccgcaatc tccttccatc ccagggtgtt 240 gctgaaaatg tcagatgcaa atttggatag cagcaagaag aatttcttgg agggggaagt 300 agatgatgag gaaagtgtga ttttgacact ggtgccagtt aaagatgacg caaatatgga 360 acaaatggaa ccaagcgttt cttcaacttc tgatgtcaaa ctggagaagc ctaagaaata 420 caatccaggt catctacttc aaacaaatga gcaatttaca gctccacaaa aagctagatg 480 caaaatacca gcccttccct tgccgaccat tttgcctccc attaataagg tgtgtcggga 540 cactttgcgg gactggtgtc aacaactcgg tttgagtact aatggcaaga aaatcgaagt 600 ttatctgagg cttcataggc atgcttaccc tgaacaacgg caagatatgc ctgaaatgtc 660 acaagagacc agattacagc gatgttcgag gaaacgcaag gcagtgacca agagagcaag 720 gcttcagaga agttatgaga tgaatgagag agcagaagag accaatacag ttgaagtgat 780 aacttcagca ccgggagcca tgttggcatc atgggcaaga attgctgcaa gagctgttca 840 gcctaaggct ttgaattcat gttccattcc tgtttctgtt gaggcctttt tgatgcaagc 900 ctctggcgtc aggtggtgtg tggtccatgg cagacttctc tcggcagaca caaagggttg 960 ggtacgcctg cagtttcatg caggtcaggc ctgggtgcct accactcaca ggaggatgat 1020 ttctctcttc ttgttacctg cctgcatttt cccatcccca ggcatagaag ataatatgtt 1080 atgccccgac tgtgctaaga ggaataagaa gatgatgaaa agattaatga cagtagagaa 1140 gtagcagcaa cctgtttgaa tacaatgtac taaaggaggg atgtactttc agatcatgta 1200 acctattacg aaggagtgga agaggagaca atttgaatga 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gcaggttgag aaagctactc 660 tatgctagta tagactatac accaataatt ttgataatga gttctaggat gtatttttct 720 tgtatctttt tcttcctact atgatactag taattcataa gggatctgtg taatctgaat 780 gtatttgaat aactttagct ctactgtttg atttgaccca aagaagccaa gatgatataa 840 gtattcccat gtgtcttaga agcccaaagt cagtgagatg aaacccaaca tcaagaaatt 900 gaagcaaagt tacttatgga taaagaaagc attaggtagt tgggctatag cataattaga 960 ttttctggct ttcaaaaatt tggattgcaa tcacagcaaa ctttgttatt tttacagttt 1020 tcagtacaaa agtgtttata tagaaacaat aaagttgaca tttgagtacc ttttaaaaa 1079

Claims (25)

  1. 만능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell: PSC)로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 만능성 줄기 세포 (PSC)를 검출하는 방법으로서,
    Rho-결합된 코일형-코일 함유 단백질 키나제 (Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase: ROCK) 저해제를 포함하는 배지 중에 라미닌-521 (laminin-521) 및 E-카드헤린 (E-cadherin)으로 코팅된 기질에서 세포를 배양하는 단계;
    상기 배양된 세포에서 잔류하는 미분화된 PSC의 마커의 발현을 정량화하는 단계; 및
    상기 배양된 세포에서 마커 발현을, PSC의 알려져 있는 비율을 포함하는 참조 세포 배양물에서 마커 발현과 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 세포 배양물에서 마커 발현이 상기 참조 세포 배양물에서 마커 발현보다 더 적으면, 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하는 것을 나타내거나, 또는 배양된 세포 중에 잔류하는 미분화된 PSC가 참조 세포 배양물 중에 PSC의 알려져 있는 비율보다 더 적은 비율로 존재하는 것을 나타내는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 마커 발현은 LIN28, OCT4, SOX2, FOXD3, NANOG, PODXL, REX1, SSEA1, SSEA4, DPPA2 또는 DPPA3 발현인 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 ROCK 저해제는 Y27632인 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 세포는 약 10　μM Y27632에서 배양되는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 상기 ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 약 3일 동안 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 세포를, ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양한 후에, ROCK 저해제를 포함하지 않는 배지에서 약 2일 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마커 발현은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR)에 의해 정량화되는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 PCR은 정량적 실시간 PCR (quantitative real time PCR: qRT-PCR)인 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 qRT-PCR은 5′→3′서열 CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC (서열 번호: 14)로 구성된 프로브, 5′→3′서열 CACGGTGCGGGCATCTG (서열 번호: 15)로 구성된 프라이머, 및 5′→3′서열 CCTTCCATGTGCAGCTTACTC (서열 번호: 16)로 구성된 프라이머를 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마커 발현이 정규화되는 (normalised) 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 마커 발현이 GAPDH 발현에 대해 정규화되는 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알려져 있는 비율은 0.001%인 것인 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PSC는 iPSC인 것인 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 MSC인 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 MSC는 E8 완전 배지에서 배양되는 것인 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물을 치료용 조성물로 제제화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물 또는 치료용 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 치료용 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 방법에 의해 검출될 때 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물을 피험체에게 치료적 투여를 위한 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 피험체에서 병태 (condition)를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 피험체에게:
    청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 방법에 의해 검출될 때 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물; 또는
    청구항 18의 방법으로 제조되는 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 피험체에서 병태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 잔류하는 미분화된 PSC가 부재하거나 또는 알려져 있는 비율보다 더 적은 세포 배양물의 용도로서, 상기 PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC는 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 방법에 의해 검출되는 것인 용도.
  21. 청구항 19 또는 20에 있어서, 상기 병태는 골 낭종, 골 신생물, 골절, 연골 결손, 골관절염, 인대 손상, 골형성 부전, 골괴사증, 골다공증, 재생불량성 빈혈, 이식편대 숙주 질환 (graft versus host disease: GvHD), 골수형성이상 증후군, 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 자가면역성 간염, 간경화, 간부전, 확장 심근병, 심부전, 심근 경색, 심근 허혈, 크론병, 궤양성 대장염, 화상, 물집표피 박리증, 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌병, 전신 경화증, 기관지폐형성 이상증, 만성 폐쇄성 기도 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 알츠하이머병, 뇌손상, 실조 (ataxia), 퇴행성 디스크 질환, 다계통 위축 (multiple system atrophy), 다발성 경화증, 파킨슨병, 색소성 망막염, 롬버그병 (Romberg's disease), 척수 손상, 뇌졸중, 근육퇴행 위축, 사지 허혈, 신장 손상, 루푸스 신염, 자궁 내막증 및 골수 또는 고형 장기 이식의 합병증으로부터 선택되는 것인 방법 또는 용도.
  22. PSC로부터 분화된 세포 배양물 중에 잔류하는 미분화된 PSC를 검출하기 위한 키트로서, 상기 키트는 하기를 포함하는 것인 키트:
    라미닌-521; 및
    E-카드헤린; 및
    ROCK 저해제.
  23. 청구항 22에 있어서, 배양된 세포에서 잔류하는 미분화된 PSC의 마커의 발현을 정량화하기 위해 PCR 프라이머 및 선택적으로 PCR 프로브를 더 포함하는 것인 키트.
  24. 청구항 22 또는 23에 있어서, 선택적으로 ROCK 저해제를 포함하는 배지를 더 포함하는 것인 키트.
  25. 청구항 22 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 라미닌-521 및 E-카드헤린으로 코팅된 기질을 더 포함하는 것인 키트.
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