CN114164258B

CN114164258B - 一种多能性基因表达水平检验方法

Info

Publication number: CN114164258B
Application number: CN202111581332.XA
Authority: CN
Inventors: 张愚; 甘一迪; 张帅; 罗艳超; 徐然然; 王淑艳
Original assignee: Beijing Zehui Chenxing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Zehui Chenxing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: WO2023116616A1; EP4455305A1; CN114164258A

Abstract

本发明涉及参考品细胞用于检验多能性基因表达水平的用途，其中所述参考品细胞选自所述多能性基因的表达量低且稳定的细胞优选地，所述参考品细胞选自HFF细胞，任选地，所述多能性基因选自OCT4、NANOG。本发明还涉及OCT4、NANOG的引物和探针。本发明还涉及多能性基因表达水平检验方法。本发明进一步涉及所述检验方法在hPSC残留水平检验、hPSC分化过程表征中的用途。本发明的方法具有简便、稳定、灵敏度高、适用范围广、可及性强等优点，因此易于标准化，能够为细胞多能性基因表达水平的检验提供统一标准。

Description

一种多能性基因表达水平检验方法

技术领域

本发明涉及生物领域，并具体涉及一种多能性基因表达水平检验方法及其相关应用。

背景技术

目前，多能性基因表达量检验方法种类繁多，包括免疫杂交技术、RT-PCR及荧光定量PCR技术等。其中，荧光定量PCR技术因其特异性和灵敏度的优势，被行业内普遍接受。但是，荧光定量PCR技术在用于检验多能性基因表达量时仍然存在缺陷，例如缺乏统一参考品。

CN110573607A涉及一种多能干细胞测定，并具体涉及一种以掺入了多能干细胞(PSC)的参比培养物作对照品的PSC残留水平检验方法。但该方法中的参比培养物制备困难，且仅可用于检测未分化PSC残留的水平，因此，该方法不适用于细胞的一般性多能性基因表达水平检验。

CN110268056A涉及一种包封的肝组织，并具体涉及一种以人胚干细胞(hESC)作为对照细胞的多能性基因表达水平检验方法。但因hESC较难获取，不易于商业化；且不同培养条件下的hESC多能性基因表达量参差不齐，因而hESC不适宜作参考品细胞。因此，该方法无法作为细胞多能性基因表达水平检验的统一标准方法。

Monterubbianesi等人(“A comparative in vitro study of the osteogenicand adipogenic potential of human dental pulp stem cells,gingival fibroblastsand foreskin fibroblasts”，Sci Rep 9,1761(2019)9(1):1761)公开了一项人牙髓干细胞、牙龈成纤维细胞和包皮成纤维细胞的成骨和成脂潜力的体外比较研究，并具体提到人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast，HFF细胞)非常容易获取，且HFF细胞低表达OCT4与NANOG基因，因此可以将HFF细胞用于OCT4、NANOG基因的检测。可见，HFF细胞具有作为用于检验多能性基因表达水平的理想参考品细胞的潜力。

因此，目前在本领域中仍然存在对简便、稳定、可标准化的多能性基因表达水平检验方法的需求。

发明内容

本发明的目的之一在于建立一种简便、稳定、可标准化的多能性基因表达水平检验方法。

本发明提供了基于参考品细胞的细胞多能性基因OCT4与NANOG的表达量检验方法。该方法具有简便、稳定、灵敏度高、适用范围广、可及性强等优点，因而易于标准化，能够为细胞多能性基因表达水平的检验提供统一标准。因此，本发明提供的方法能够规范本领域目前存在的杂乱现状。

本发明可用于人多能干细胞(hPSC)的多能性评价、hPSC残留水平检验、hPSC分化过程表征以及间充质干细胞等的多能性基因表达水平检验。

因此，在一方面，本发明提供参考品细胞用于检验多能性基因表达水平的用途，其中所述参考品细胞选自所述多能性基因的表达量低且稳定的细胞，任选地，所述参考品细胞选自人包皮成纤维细胞(HFF)、人皮肤成纤维细胞(HSF)、骨髓间充质干细胞(BMMSC)、脂肪间充质干细胞(ADMSC)、脐带间充质干细胞(UCMSC)以及人原代前脂肪细胞、人脑血管周细胞、人软骨细胞、人原代主动脉平滑肌细胞、人原代成骨细胞，优选地，所述参考品细胞选自HFF细胞，任选地，所述多能性基因选自OCT4、NANOG。

在一个实施方案中，检验多能性基因表达水平包括选择内部对照，任选地，所述内部对照选自内部阳性对照、内部阴性对照，优选地，所述内部阳性对照选自GAPDH基因。

在另一个实施方案中，所述参考品细胞可用于检验hPSC相关制剂中的hPSC残留水平，或者用于表征hPSC分化过程。

在又一个实施方案中，所述多能性基因表达水平以2^-ΔΔCq形式进行定量。

在另一方面，本发明提供OCT4基因检测剂，其包含OCT4基因正向引物序列、OCT4基因反向引物序列以及任选地OCT4基因探针序列，任选地，所述OCT4基因正向引物序列(5’-3’)为AGGAAGCTGACAACAATGAA，所述OCT4基因反向引物序列(5’-3’)为TTGCCTCTCACTCGGTTC，所述OCT4基因探针序列(5’-3’)为FAM-TTCGCTTTCTCTTTCGGGCCTGCACG-BHQ1。

在又一方面，本发明提供NANOG基因检测剂，其包含NANOG基因正向引物序列、NANOG基因反向引物序列以及任选地NANOG基因探针序列，任选地，所述NANOG基因正向引物序列(5’-3’)为AACTCTCCAACATCCTGAACCT，所述NANOG基因反向引物序列(5’-3’)为CTGCGTCACACCATTGCTATT，所述NANOG基因探针序列(5’-3’)为FAM-CGGCCAGTTGTTTTTCTGCCACCTCT-BHQ1。

在另一方面，本发明提供GAPDH基因检测剂，其包含GAPDH基因正向引物序列、GAPDH基因反向引物序列以及任选地GAPDH基因探针序列，任选地，所述GAPDH基因正向引物序列(5’-3’)为GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，所述GAPDH基因反向引物序列(5’-3’)为ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA，所述GAPDH基因探针序列(5’-3’)为FAM-CCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCA-BHQ1。

在又一方面，本发明提供多能性基因表达水平检验方法，其包括：

(a)提供待检测样品；

(b)提供参考品细胞，其中所述参考品细胞选自所述多能性基因的表达量低且稳定的细胞，任选地，所述参考品细胞选自人包皮成纤维细胞(HFF)、人皮肤成纤维细胞(HSF)、骨髓间充质干细胞(BMMSC)、脂肪间充质干细胞(ADMSC)、脐带间充质干细胞(UCMSC)以及人原代前脂肪细胞、人脑血管周细胞、人软骨细胞、人原代主动脉平滑肌细胞、人原代成骨细胞，优选地，所述参考品细胞选自HFF细胞；

(c)提取所述待检测样品的RNA；

(d)检验所述多能性基因表达水平，检验基因为OCT4或NANOG，内参基因为GAPDH；

(e)通过比较所述待检测样品中检验基因的表达量与参考品细胞中检验基因的表达量，确定所述待检测样品的多能性基因表达水平。

在一个实施方案中，RNA提取过程包括两次基因组去除步骤以确保基因组去除效果。

在另一个实施方案中，通过RT-qPCR检验所述待测样品中所述多能性基因表达水平，任选地，RT-qPCR中所有基因的无逆转录酶对照(NRC)检测结果为阴性。

在另一方面，本发明提供本发明的检验方法在hPSC残留水平检验、hPSC分化过程表征中的用途。

本发明的有益效果：

本发明与CN110573607A相比，至少存在以下若干不同之处：

1)本发明设置了固定的参考品细胞，能够报告相对参考品细胞的多能性基因表达量，为多能性基因表达水平的检验检测提供了统一标准；

2)本发明在RNA提取过程中，加强了基因组去除过程，确保所提取的RNA无基因组残留，提高了检测qPCR定量结果的准确性；

3)本发明的OCT4、NANOG、GAPDH基因的引物探针序列与CN110573607A的引物探针序列不同。

本发明以ATCC来源的HFF细胞作为参考品细胞，以RT-qPCR方法对人源细胞中OCT4与NANOG基因的表达水平进行定量检验。该方法简便、快速，结果稳定、可靠。各实验室能够轻松实施本发明的技术方法，易于标准化。

附图说明

图1是三对OCT4候选引物扩增质粒的溶解峰结果图。

图2是三对NANOG候选引物扩增质粒的溶解峰结果图。

图3是三对GAPDH候选引物扩增质粒的溶解峰结果图。

图4是检验多能干细胞(PSC)中OCT4基因表达水平的扩增曲线结果图，其中内部阳性对照为GAPDH基因。

具体实施方式

本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。

本发明建立了一种以HFF细胞作参考品细胞的多能性基因OCT4与NANOG的RT-qPCR检验方法。以HFF细胞为基因表达量“标尺”，描述待检细胞的多能性基因表达水平和细胞多能性水平。

实验材料：

参考品细胞HFF及其他细胞均购买自ATCC。

OCT4、NANOG、GAPDH基因的引物和探针均由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

实验试剂：

DMEM改良培养基购自ATCC。

FBS购自赛默飞世尔科技公司。

Penicillin-Stretomycin购自赛默飞世尔科技公司。

Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

II U+One Step qRT-PCR Probe Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

II One Step qRT-PCR

Green Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

ChamQ Geno-SNP Probe Master Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

β-巯基乙醇购自赛默飞世尔科技公司。

无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

DNase I购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

DPBS购自赛默飞世尔科技公司。

无RNA酶的水(RNase-free water)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

实施例

实施例1-参考品细胞建库方法

本实施例所用的HFF细胞购买自ATCC。以新购的HFF细胞作为P0代，使用DMEM改良完全培养基(含DMEM改良培养基、FBS、Penicillin-Stretomycin)进行连续传代，其中P2代作为主细胞库，P5代作为工作细胞库。

实施例2-检验方法

2.1 RNA提取：

以Vazyme RNA提取试剂盒

Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit提取待测细胞与参考品细胞RNA。

2.1.1试剂准备：

①取试剂盒中的Buffer RL1储存液，加入1％的β-巯基乙醇，混匀，配制BufferRL1工作液。

②取试剂盒中的Buffer RL2储存液，加入两倍体积无水乙醇，混匀，配制BufferRL2工作液。

③取试剂盒中的Buffer RW2储存液，加入2.5倍体积无水乙醇，混匀，配制BufferRW2工作液。

④在65μl的RDD Buffer中加入5μl的DNase I溶液，混匀，制备DNase I工作液。

2.1.2细胞洗涤

取1×10⁶-2.5×10⁶个细胞，加入至少10倍体积的DPBS，500×g离心5min，去上清。加入1ml的DPBS重悬细胞，500×g离心5min，去上清，重复此操作，共两次。

2.1.3裂解

在经洗涤后的细胞中加入Buffer RL1工作液500μl，反复吹吸，直至细胞完全裂解。

2.1.4过滤

将细胞裂解液转移至gDNA-Filter Columns过滤柱上，12000rpm离心2min。弃掉gDNA-Filter Columns，保留收集管内滤液。

2.1.5吸附

向收集管内滤液中加入800μl的Buffer RL2工作液，反复吹吸，混匀。吸取混合溶液650μl，转入RNAPure Columns吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。剩余混合液按相同操作步骤进行离心。

2.1.6去蛋白

向RNAPure Columns吸附柱中加入500μl的Buffer RW1，12000rpm离心1min，去除收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.1.7脱盐

向RNAPure Columns吸附柱中加入700μl的Buffer RW2工作液。12000rpm离心1min，去除收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.1.8去除基因组DNA

①取DNase I工作液70μl，滴加到RNAPure Columns吸附柱中央，完全覆盖吸附柱膜，室温静置15-30min。

②向RNAPure Columns吸附柱中加入500μl的Buffer RW1，12000rpm离心1min，去除收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

③向RNAPure Columns吸附柱中加入700μl的Buffer RW2工作液。12000rpm离心1min，去除收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.1.9重复去除基因组DNA的步骤

2.1.10脱盐

在RNAPure Columns吸附柱中加入700μl的Buffer RW2工作液。12000rpm离心1min，去除收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.1.11去残余

将吸附柱转移至新的无RNA酶的离心管中，12000rpm离心2min，去除残余液体。

2.1.12洗脱

将RNAPure Columns吸附柱转入一个新的无核酸酶的离心管中，向吸附柱中央滴加100μl的无RNA酶的水，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集提取的总RNA溶液。

2.1.13RNA质量测定

以NanoDrop One检测RNA浓度和纯度。

2.2 RT-qPCR扩增：

以Vazyme试剂盒

II U+One Step qRT-PCR Probe Kit与ChamQ Geno-SNP Probe Master Kit对RNA样品进行基因表达量检验与基因组残留检验。

2.2.1工作浓度RNA样品制备

将待测细胞RNA与参考品细胞RNA用样品稀释液稀释至12.5ng/μl，制备工作浓度RNA模板。

2.2.2RT-qPCR反应体系配制

分别配制各RNA样品的检测(TEST)反应体系和无逆转录酶对照(NRC)反应体系，每种反应设置3个复孔。

①TEST反应体系配制

②NRC反应体系配制

配制NRC反应体系，内控基因组污染。配制方法如下：

2.2.3 RT-qPCR扩增

反应体系配制后，按如下反应程序在LightCycler 480II荧光定量PCR仪上进行扩增。

2.2.4数据分析

反应结束后，选择Abs Quant/Fit Point模式进行分析，设定Noiseband为1.50000，Threshold为2.00000，记录各样品Cq，并计算Cq均值。

①实验成立条件

一般情况下，NTC各孔Cq应>35.00或者未检出；

NRC各孔Cq应>35.00或者未检出。

②结果分析：

根据实验目的，按下式计算样品ΔCq、ΔΔCq和2^-ΔΔCq。

a.目标基因相对内参基因GAPDH的表达水平分析：

ΔCq＝目标基因Cq均值–GAPDH基因Cq均值

b.待测样品相对参考品细胞的表达水平分析：

ΔΔCq＝待测样品ΔCq–参考品细胞ΔCq

待测样品相对参考品细胞的表达量＝2^-ΔΔCq

实施例3-方法研究

3.1引物及探针筛选

3.1.1OCT4基因引物探针的筛选

OCT4候选引物如下：

以pOCT4质粒作模板，以染料法qPCR试剂

II One Step qRT-PCR

Green Kit(Vazyme，Q221)对三对OCT4引物进行特异性筛选，结果如图1所示。

由图1可知，三对引物扩增产物的溶解峰单一，特异性均符合要求。但OCT4-F-3/OCT4-R-3熔解曲线更稳定，因此优选OCT4-F-3/OCT4-R-3进行探针设计和筛选。

OCT4候选探针如下：

以pOCT4质粒作模板，以探针法qPCR试剂

II U+One Step qRT-PCRProbe Kit(Vazyme，Q222-CN)对三条OCT4探针进行扩增效率筛选，结果如表1所示。

表1OCT4探针扩增效率测试结果

注：“标准曲线误差值”为LightCycler 480标准曲线参数，小于0.2为可接受范围。

由表1可知，OCT4-P-3扩增效率最佳，因此优选OCT4-F-3/OCT4-R-3/OCT4-P-3引物探针组合进行工作浓度优化。

OCT4引物和探针工作浓度范围与检测结果见表2。

表2 OCT4引物探针不同工作浓度下的扩增效率

由表2可知，8种引物探针浓度组合的扩增效率均满足90％-110％可接受范围。本发明优选OCT4-F-3、OCT4-R-3工作浓度为400nM，OCT4-P-3工作浓度为200nM。

3.1.2 NANOG基因引物探针的筛选

NANOG候选引物如下：

以pNANOG质粒作模板，以染料法qPCR试剂

II One Step qRT-PCR

Green Kit对三对NANOG引物进行特异性筛选，结果如图2所示。

由图2可知，三对引物扩增产物的溶解峰单一，特异性均符合要求。本发明优选NANOG-F-3/NANOG-R-3进行探针设计和筛选。

NANOG候选探针如下：

以pNANOG质粒作模板，以探针法qPCR试剂

II U+One Step qRT-PCRProbe Kit对两条NANOG探针进行扩增效率筛选，结果如表3所示。

表3 NANOG探针扩增效率测试结果

由表3可知，NANOG-P-1与NANOGA-P-2扩增效率均符合90％-110％可接受范围。本发明优选NANOG-F-3/NANOG-R-3/NANOG-P-2引物探针组合进行工作浓度优化。

NANOG引物和探针工作浓度范围与检测结果见表4。

表4 NANOG引物探针不同工作浓度下的扩增效率

由表4可知，8种引物探针浓度组合的扩增效率均满足90％-110％可接受范围。本发明优选NANOG-F-3、NANOG-R-3工作浓度为400nM，NANOG-P-2工作浓度为200nM。

3.1.3 GAPDH基因引物探针的筛选

GAPDH候选引物如下：

以pGAPDH质粒作模板，以染料法qPCR试剂

II One Step qRT-PCR

Green Kit对三对GAPDH引物进行特异性筛选，结果如图3所示。

由图3可知，引物GAPDH-F-2/GAPDH-R-2与GAPDH-F-3/GAPDH-R-3扩增产物的溶解峰单一，特异性符合要求。本发明优选GAPDH-F-3/GAPDH-R-3进行探针设计和筛选。

GAPDH候选探针如下：

以pGAPDH质粒作模板，以探针法qPCR试剂

II U+One Step qRT-PCRProbe Kit对三条GAPDH探针进行扩增效率筛选，结果如表5所示。

表5 GAPDH探针扩增效率测试结果

由表5可知，三条GAPDH探针扩增效率均符合90％-110％可接受范围，其中GAPDH-P-3综合最佳，因此优选GAPDH-F-3/GAPDH-R-3/GAPDH-P-3引物探针组合进行工作浓度优化。

GAPDH引物和探针工作浓度范围与检测结果见表6。

表6 GAPDH引物探针不同工作浓度下的扩增效率

由表6可知，8种引物探针浓度组合的扩增效率均满足90％-110％可接受范围。本发明优选GAPDH-F-3、GAPDH-R-3工作浓度为400nM，GAPDH-P-3工作浓度为200nM。

3.2参考品细胞筛选

多能性基因表达量检验方法中的参考品细胞宜选择基因表达量低且稳定的细胞。分别取人包皮成纤维细胞(HFF)、人皮肤成纤维细胞(HSF)、骨髓间充质干细胞(BMMSC)、脂肪间充质干细胞(ADMSC)、脐带间充质干细胞(UCMSC)以及人原代前脂肪细胞、人脑血管周细胞、人软骨细胞、人原代主动脉平滑肌细胞、人原代成骨细胞，进行多能性基因OCT4与NANOG的表达量检测。检测结果见表7、表8。

表7细胞OCT4基因相对表达量检测结果

表8间充质干细胞NANOG基因表达量检验结果

结果表明，HSF细胞、HFF细胞、BMMSC、ADMSC、UCMSC、人原代前脂肪细胞、人脑血管周细胞、人原代主动脉平滑肌细胞、人软骨细胞以及人原代成骨细胞中的多能性基因OCT4与NANOG表达量相当(ΔCq接近)，因此，以上细胞均有作为多能性基因表达量检验方法中参考品细胞的潜力。

3.3参考品细胞确认

HFF细胞与HSF细胞可以直接从ATCC购买，易获取，且行业认可度较高。选择HFF细胞与HSF细胞进行多次检测，研究多能性基因表达稳定性。结果如见表9、表10。

表9 HFF与HSF细胞中OCT4基因表达量检测结果

表10 HFF与HSF细胞中NANOG基因表达量检测结果

由表9、表10可知，在多次实验中，HFF细胞的OCT4与NANOG基因ΔCp稳定性高，因此多能性基因表达量检验的参考品细胞优选HFF。HSF以及BMMSC、ADMSC、UCMSC、人原代前脂肪细胞、人脑血管周细胞、人原代主动脉平滑肌细胞、人软骨细胞、人原代成骨细胞等可作为参考品细胞备选。

实施例4-应用

4.1多能干细胞OCT4与NANOG基因表达量检验

以HFF细胞作为参考品细胞，分别检验不同批次hESC和hiPSC中多能性基因OCT4与NANOG的相对表达量。结果见表11-表14。

表11 hESC中OCT4基因表达量检验结果

表12 hESC中NANOG基因表达量检验结果

表13 hiPSC中OCT4基因表达量检验结果

表14 hiPSC中NANOG基因表达量检验结果

结果表明，P30、P34、P37、P40代次的hESC中OCT4基因相对表达量1871.53～2486.67，NANOG基因相对表达量2019.80～2538.93，不同代次hESC的多能性基因表达水平稳定。

结果表明，P19、P29代次的hiPSC中OCT4基因相对表达量2521.38～2556.58，NANOG基因相对表达量2241.11～2610.30，不同代次hiPSC的多能性基因表达水平稳定，且与hESC表达量相当。

因此，该检验方法能够用于hPSC中多能性基因表达量的检验，以及不同代次hPSC多能性基因表达稳定性研究。该检验方法能够用于hESC、hiPSC等细胞库的检验，且结果稳定。

4.2 hESC残留检验

对于多能干细胞来源的细胞治疗产品，必须关注其成瘤性。国际细胞治疗学会(ISCT)指出，hPSC衍生细胞成瘤性检验的本质在于检测其中残留的未分化细胞，但是目前在行业内尚未建立hPSC残留性检验的标准方法¹。本发明以HFF细胞作为参考品细胞，检测不同批次hESC来源的间充质样干细胞中多能性基因OCT4与NANOG的相对表达量，并判断其中的hESC残留水平。检测结果见表15、表16。

表15间充质样干细胞中OCT4基因表达量检验结果

表16间充质样干细胞中NANOG基因表达量检验结果

由表15、表16可知，不同批次的间充质样干细胞中OCT4基因相对表达量0.75～1.32，NANOG基因相对表达量0.97～1.77，均与参考品细胞HFF表达量相当，这表明以上间充质样干细胞中均无hESC残留。因此，上述检验方法能够用于hESC残留检验。该检验方法能够快速检验hESC或hiPSC衍生产品中的hPSC残留，且如下所示，该检验方法的灵敏度可达0.01％。

4.3多能干细胞定向分化的过程的研究

以HFF细胞作为参考品细胞，检测hESC定向分化过程细胞P0、P1、P2、P3、P4、P5的多能性基因OCT4与NANOG的相对表达量，以表征多能干细胞的分化过程。检测结果见表17、表18。

表17 hESC定向分化过程细胞中OCT4基因表达量检验结果

表18 hESC定向分化过程细胞中OCT4基因表达量检验结果

由表17、表18可知，hESC定向分化过程中OCT4基因与NANOG基因相对表达量逐渐降低，且P3～P5代表达量趋于稳定。因此，该检验方法能够用于表征hESC定向分化过程。

4.4多能性基因检验方法的灵敏度

向hESC分化细胞的间充质干细胞中加入10％、1％、0.1％、0.01％比例的hESC，以HFF细胞作为参考品细胞，检测各细胞样品中的多能性基因OCT4与NANOG相对表达水平，确定该检验方法的灵敏度。检验结果如表19、表20所示。

表19多能性基因OCT4表达量检验方法的灵敏度

表20多能性基因NANOG表达量检验方法的灵敏度

由表19、表20可知，向hESC分化细胞的间充质干细胞中加入0.01％hESC时，OCT4基因相对表达量为1.31，大于未加入hESC的细胞样品(相对表达量为0.76)；NANOG基因相对表达量为2.58，大于未加入hESC的细胞样品(相对表达量为1.91)。因此该检验方法用于hESC残留检验时，灵敏度可达到0.01％。

4.5中间精密度研究

以HFF细胞作为参考品细胞，在三个不同时间分别检测hESC多能性基因OCT4与NANOG的相对表达水平，每个时间检测3个hESC样品，研究检验方法的中间精密度。检验结果如表21、表22所示。

表21多能性基因OCT4表达量检验方法的中间精密度

表22多能性基因NANOG表达量检验方法的中间精密度

由表21、表22可知，不同时间检验的9份hESC样品中OCT4与NANOG基因的-ΔΔCpSD均小于1，结果相对稳定。因此该检验方法的中间精密度研究结果符合要求。

实施例5-其他参考品细胞

由于人皮肤成纤维细胞(HSF)与人牙龈成纤维细胞(HGF)作为成纤维细胞，同样表达了少量的OCT4和NANOG基因^2,3，因此将参考品细胞替换为HGF、HSF细胞，同样能够得到稳定的表达量检测结果。

此外，由于BMMSC、ADMSC、UCMSC、人原代前脂肪细胞、人脑血管周细胞、人原代主动脉平滑肌细胞、人原代成骨细胞等细胞中的多能性基因OCT4与NANOG表达量与HFF相当，因此同样也能够作为参考品细胞的候选。

参考文献：

1.Sato Y,Bando H,Di Piazza M,et al.Tumorigenicity assessment of celltherapy products:The need for global consensus and points toconsider.Cytotherapy 2019；21(11):1095-111.

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3.Hambiliki F,Strom S,Zhang P,Stavreus-Evers A.Co-localization ofNANOG and OCT4 in human pre-implantation embryos and in human embryonic stemcells.J Assist Reprod Genet 2012；29(10):1021-8.

尽管本文已经示出和描述了说明性实施方案，但本领域技术人员将理解的是，上述实施方案不应当被理解为对本发明内容进行限制，并且可在不背离本发明内容的精神、原则和范围的情况下进行变化、替换和修改。

Claims

1.参考品细胞用于检验多能性基因表达水平的用途，其中所述参考品细胞为人包皮成纤维细胞(HFF)，所述多能性基因选自OCT4、NANOG，通过比较待检测样品中检验基因的表达量与参考品细胞中检验基因的表达量，确定所述待检测样品的多能性基因表达水平。

2.根据权利要求1所述的用途，其中检验多能性基因表达水平包括选择内部对照。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述内部对照选自内部阳性对照、内部阴性对照。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述内部阳性对照为GAPDH基因。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述参考品细胞可用于检验人多能干细胞(hPSC)相关制剂中的hPSC残留水平，或者用于表征hPSC分化过程。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述多能性基因表达水平以2^-ΔΔCq形式进行定量。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其中使用OCT4基因检测剂检验多能性基因OCT4的表达水平，所述OCT4基因检测剂包含OCT4基因正向引物序列、OCT4基因反向引物序列以及OCT4基因探针序列。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述OCT4基因正向引物序列为5’-AGGAAGCTGACAACAATGAA-3’，所述OCT4基因反向引物序列为5’-TTGCCTCTCACTCGGTTC-3’，所述OCT4基因探针序列为5’-FAM-TTCGCTTTCTCTTTCGGGCCTGCACG-BHQ1-3’。

9.根据权利要求1或2所述的用途，其中使用NANOG基因检测剂检验多能性基因NANOG的表达水平，所述NANOG基因检测剂包含NANOG基因正向引物序列、NANOG基因反向引物序列以及NANOG基因探针序列。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述NANOG基因正向引物序列为5’-AACTCTCCAACATCCTGAACCT-3’，所述NANOG基因反向引物序列为5’-CTGCGTCACACCATTGCTATT-3’，所述NANOG基因探针序列为5’-FAM-CGGCCAGTTGTTTTTCTGCCACCTCT-BHQ1-3’。

11.根据权利要求4所述的用途，其中使用GAPDH基因检测剂检验内部阳性对照，所述GAPDH基因检测剂包含GAPDH基因正向引物序列、GAPDH基因反向引物序列以及GAPDH基因探针序列。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述GAPDH基因正向引物序列为5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’，所述GAPDH基因反向引物序列为5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’，所述GAPDH基因探针序列为5’-FAM-CCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCA-BHQ1-3’。

13.多能性基因表达水平检验方法，其包括：

(a)提供待检测样品；

(b)提供参考品细胞，其中所述参考品细胞为人包皮成纤维细胞(HFF)；

(c)提取所述待检测样品的RNA；

14.根据权利要求13所述的检验方法，其中RNA提取过程包括两次基因组去除步骤以确保基因组去除效果。

15.根据权利要求13或14所述的检验方法，其中通过RT-qPCR检验所述待检测样品中所述多能性基因表达水平，并且RT-qPCR中所有基因的无逆转录酶对照检测结果为阴性。

16.权利要求13-15中任一项所述的检验方法在hPSC残留水平检验、hPSC分化过程表征中的用途。