KR20060005595A - 인간 테나신―ｃ 유래의 신규한 헤파린-결합부위를포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 테나신-C(tenacin-C, TN) 유래의 신규한 헤파린-결합부위(heparin-binding site)를 포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것으로, 구체적으로 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)의 결합부위를 포함하고 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 5(TNⅢ5)에 대한 HSPG-의존성 세포 부착활성을 증가시키며, 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 4(TNⅢ4)의 아미노산 서열 일부를 포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 헤파린에 높은 친화력을 가지고 결합하고 세포의 부착을 증진시키므로 세포부착용 펩타이드로 유용하게 사용될 수 있다

Description

인간 테나신―Ｃ 유래의 신규한 헤파린-결합부위를 포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체{Polypeptide and derivatives thereof containing novel heparin-binding site derived from human tenacin C}

도 1a는 인간 테나신-C 타입 Ⅲ 단백질의 구성을 나타낸 모식도이고,

EGF: 상피세포 성장인자, FNⅢ: 피브로넥틴 타입 Ⅲ

Fbg: 단일 피브리노겐-유사 도메인

도 1b는 인간 테나신-C 타입 Ⅲ의 일부 도메인만을 포함하는 재조합 단백질들의 모식도 및 이를 SDS-PAGE에 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,

레인 1: 분자량 마커, 레인 2: TNⅢ5,

레인 3: TNⅢ4-5, 레인 4: TNⅢ3-5

도 2는 칩사에 고정된 헤파린에 대하여 인간 테나신-C 타입 Ⅲ의 일부 도메인만을 포함하는 재조합 단백질들의 결합 친화력을 BIAcore 시스템을 이용하여 분석한 결과이고,

A: TNⅢ3-5, B: TNⅢ4-5, C: TNⅢ5

도 3a는 인간 테나신-C 타입 Ⅲ의 도메인 3 내지 5 및 피브로넥틴 타입 Ⅲ의 도메인 10의 구조-기초 서열 정렬 결과를 나타낸 것이고,

도 3b는 인간 (Homo sapiences), 쥐 (Mus musculus), 닭 (Gallus gallus) 및 돼지 (Sus scrofa)에서의 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 4의 아미노산 서열을 비교한 것이고,

도 4는 인간 테나신-C 타입 Ⅲ의 일부 도메인만을 포함하는 재조합 단백질들 및 이의 치환 돌연변이체의 세포 부착활성을 측정한 결과이다.

본 발명은 인간 테나신-C(tenacin-C, TN) 유래의 신규한 헤파린-결합부위(heparin-binding site)를 포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)의 결합부위를 포함하고 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 5(TNⅢ5)에 대한 HSPG-의존성 세포 부착활성을 증가시키며, 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 4(TNⅢ4)의 아미노산 서열 일부를 포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것이다.

테나신-C(TN)는 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인(FNⅢ) 및 피브리노겐과 상동성을 갖는 도메인들이 일직선상으로 배열된 거대한 세포외 기질(ECM) 당단백질이다(Jones FS, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6497-6501, 1990; Jones FS, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2186-2190, 1988). 인간 테나신-C 유전자(GenBank Accession NO: NM_002160)는 서열번호 1로 기재되는 7560 bp의 염기서열을 가지며, 이로부터 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩한다. 테나신-C는 헥사브라키온(hexabrachion)이라 불리는 방사상으로 배열된 여섯 개의 가지 구조 내에 여섯 개의 동일한 아형들로 구성된 올리고머 구조(oligomeric structure)를 갖는다 (Erickson HP, et al., Nature 311: 267-269, 1984). 각각의 아형은 FNⅢ 도메인 8 내지 15를 포함하는 일련의 작은 구형의 도메인들로 존재한다(Gulcher JR, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9438-9442, 1991; Erickson HP, et al., Curr. Opin. Cell Biol. 5: 869-876, 1993). FNⅢ는 세포 표면 수용체들 및 세포 부착 분자들을 포함하는 매우 광범위한 범위의 단백질에서 발견되는데(Bork P, et al., Protein Sci. 2: 1185-1187, 1993), FNⅢ 반복단위들의 중심 구조는 한쪽에 네 개의 β-가닥을, 다른 한쪽에 세 개의 β-가닥을 가지고 있고 이들이 β-샌드위치를 형성하면서 보존되어 있다(Leahy DJ, et al., Science 258: 987-991, 1992; Dickson CD, et al., J. Mol. Biol. 236: 1079-1092, 1994). Arg-Gly-Asp(RGD) 삼중펩타이드 서열을 포함하는 테나신-C의 세 번째 FNⅢ 반복단위(TNⅢ3)는 다양한 인테그린들, 예를 들면 αvβ3, αvβ6, α9β1 및 α2β1과 같은 인테그린들을 통해 세포와 상호작용하는 것으로 보인다(Prieto AL, et al., J. Cell Biol. 119: 663-678; Prieto AL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10154-10158, 1993; Joshi P, et al., J. Cell Sci. 106: 389-400, 1993; Yokosaki Y, et al., J. Biol. Chem. 269: 26691-26696, 1994; Dorries U, et al., J. Neurosci. Res. 43: 420-438, 1996). 또한, 테나신-C는 CTB-프로데오글리칸(Hoffman S, et al., J. Cell Biol. 106: 519-532, 1988), 뉴로칸, 포스파칸(Grumet M, et al., J. Biol. Chem. 269: 12142-12146, 1994) 및 신데칸-1(Salmivirta M, et al., J. Biol. Chem. 266: 7733-7739, 1991)과 같은 다른 수많은 세포 표면 단백질들에 결합한다. 신데칸-1과 테나신-C는 중간엽과 상피 사이의 경계면에 존재하는 원시 기관에서 일시적으로 동시-발현되며(Thesleff I, et al., Development 101: 289-296, 1987; Vainio S, et al., J. Cell Biol. 108: 1945-1953, 1989), 테나신-C에 대한 신데칸-1의 결합은 프로테오글리칸의 헤파란 설페이트 곁가지들에 의존한다 (Salmivirta M, et al., J. Biol. Chem. 266: 7733-7739, 1991).

헤파린/헤파란 설페이트 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPGs)은 단백질 코어에 부착된 길고, 독특한 탄수화물 사슬을 갖는 거대분자들이다(Gallagher JT, et al., Biochem. J. 236: 313-325, 1986; Hardingham TE, et al., FASEB J. 6: 861-870, 1992). 이들은 세포외 기질(ECM)의 구성성분 또는 막-결합 단백질로서 존재하고, ECM 단백질을 포함하는 여러 단백질들과의 상호작용을 통해 다양한 생화학적 및 생리학적 과정에 참여하게 된다(Rouslahti E, Annu. Rev. Cell Biol. 4: 229-255, 1988; Jackson RL, et al., Physiol. Rev. 71: 481-539, 1991; Kjellen L, et al., Annu. Rev. Biochem. 60: 443-475, 1991). 헤파린은 배양시 말초 신경세포들이 테나신-C에 부착하는 것을 방해한다(Chiquet M, et al., Perspect. Dev. Neurobiol. 2: 67-74, 1994; Wehrler-Haller B, et al., J. Cell Sci. 106: 597-610, 1993). 헤파린-단백질의 상호작용은 단백질의 양전하를 띤 잔 기들(Arg, Lys)과 헤파린의 음전하를 띤 작용기(글루코사민의 황산기들 또는 이두론산의 카르복실기)간의 이온 접촉에 의해 이루어진다(Faham S, et al., Science 271: 1116-1120, 1996). 따라서, 테나신-C의 생물학적 기능을 규명하기 위해서는 글리코사미노글리칸과의 결합을 담당하는 특정한 도메인을 동정하는 것이 매우 중요하다. 이러한 연구의 일환으로, 두 개의 헤파린-결합부위가 테나신-C 내에서 동정되었는데(Aukhil I, et al., J. Biol. Chem. 268: 2542-2553, 1993; Weber P, et al., J. Biol. Chem. 270: 4619-4623, 1995), 하나는 다섯 번째 FNⅢ 반복단위를 포함(TNⅢ5)하고 다른 하나는 카복실기-말단 피브리노겐-유사 도메인(Fbg)을 포함한다.

헤파린/헤파란 설페이트 결합은 테나신-C를 포함하는 ECM 분자들의 공통적인 특징으로 파악된다. 헤파린에 대한 테나신-C의 결합 친화력에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀지지 않았지만, 테나신-C는 생리학적 염 농도에서 헤파린과 결합하는 것이 보고된 바 있다(Marton LS, et al., J. Biol. Chem. 264: 13145-13149, 2989).

헤파린과 상호작용을 하는 테나신-C 내 FNⅢ 도메인들에 대한 특징 규명은 대부분 TNⅢ5 도메인에 초점이 맞추어져 있는데, TNⅢ5 도메인이 헤파린과의 상호작용을 위해 요구되는 유일한 모티프인지는 아직까지 명확하게 밝혀지지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 헤파린과 테나신-C와의 상호작용을 보다 구체적으로 조 사하고 상기 상호작용을 매개하는 테나신-C 내 신규한 헤파린-결합부위를 추정하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 테나신-C 타입 Ⅲ의 도메인 4 절편을 포함하는 폴리펩티드가 이차적인 헤파린-결합부위를 포함하고 있어 테나신-C 타입 Ⅲ의 도메인 5(TNⅢ5)와의 공동작용에 의해 헤파린에 대한 테나신-C 타입 Ⅲ의 최적의 결합활성을 나타내고 TNⅢ5에 대한 HSPGs-의존성 세포 부착활성을 증가시킴을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 높은 헤파린-결합 친화력과 세포 부착활성을 나타내는 테나신-C 타입Ⅲ 내 신규한 헤파린-결합 도메인을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 테나신-C와 헤파린과의 상호작용에 관여하는 신규한 헤파린-결합부위로서 세포 부착활성을 나타내는 KEDK 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 그의 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드 및 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 세포부착용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 헤파린-결합부위로서 세포 부착활성을 나타내는 KEDK 서열 을 포함하는 폴리펩티드 및 그의 유도체를 제공한다.

본 발명은 헤파린과 테나신-C의 상호작용에 있어서 TNⅢ4 도메인의 역할을 규명하고 기존에 헤파린-결합부위로 알려진 TNⅢ5 도메인과 공동으로 헤파린-결합을 매개하는 TNⅢ4 도메인 내 폴리펩타이드 서열을 제공한다.

본 발명의 폴리펩타이드 서열은 헤파린-결합부위로서 서열번호 2의 아미노산 서열 중 테나신-C 타입 Ⅲ의 도메인 4에 해당하는 969 내지 972번째 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 KEDK 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (heparan sulfate proteoglycan, HSPG)의 결합부위를 포함하여 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 5 (TNⅢ5)의 헤파린-결합부위와 함께 공동 기작(cooperative mechanism)에 의해 테나신-C의 헤파린-결합 활성을 증가시키고, TNⅢ5에 대한 HSPG-의존성 세포 부착활성을 증진시키는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 본 발명에서는 헤파린-결합부위로서 세포 부착활성을 나타내는 TNⅢ4 내 특정 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 선별하기 위하여, 테나신-C(TNⅢ)의 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인들의 재조합 단백질을 제조한 후(도 1a 및 1b 참조), 이들의 헤파린에 대한 결합 친화력을 조사하였다. 그 결과, 이전에 보고된 바와 같이, 주요 헤파린-결합부위를 포함하는 TNⅢ5 도메인이 생리학적 염 농도 및 pH 조건에서 헤파린과 결합하였다. 그러나, 헤파린에 대한 TNⅢ5 도메인 단독의 결합 친화력은 TNⅢ5 및 TNⅢ4 도메인을 모두 포함하는 절편들보다 현저하게 낮았다(도 2 참조). 또한, 동역학 분석결과, TNⅢ3-5 및 TNⅢ4-5 도메인을 포함하는 재조합 절편들은 모두 헤파린에 대한 빠른 결합속도상수를 나타낸 반면, 느린 해리속도상수를 나타내어 매우 안정적임을 알 수 있다(표 1 참조). TNⅢ5 도메인만을 포함하는 재조합 절편의 헤파린에 대한 결합 친화력은 TNⅢ3-5 또는 TNⅢ4-5 도메인을 포함하는 제조합 절편들의 결합 친화력보다 훨씬 낮았는데, 이러한 결과는 TNⅢ4 도메인이 테나신-C와 헤파린간의 최적의 결합에 상당히 기여함을 의미하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 TNⅢ4 도메인이 일종의 공동기작(cooperative mechanism)에 의해 TNⅢ5 도메인의 헤파린-결합 활성을 증대시키는 것으로 판단하고, 헤파린에 동시에 결합할 수 있는 부위가 TNⅢ4 및 TNⅢ5 도메인에 각각 하나씩 존재한다고 가정하였다. 이러한 공동기작은 여러 도메인에서도 관찰되는데, 피브로넥틴의 13번째 타입 Ⅲ 반복단위(FNⅢ13) 내 일차 헤파린-결합부위 및 피브로넥틴의 14번째 타입 Ⅲ 반복단위(FNⅢ14) 내 잠정적 부위(∼60Å)가 상호 공동작용에 의해 헤파린-결합 활성을 최대한으로 유도하였고(Sharma A, et al., EMBO J. 18: 1468-1479, 1999), 테나신-X(TN-X)의 10번째 및 11번째 타입 Ⅲ 반복단위 내 두 개의 인접한 헤파린-결합부위 역시 이와 유사하게 작용함이 보고되었다(Lethias C, et al., J. Biol. Chem. 276: 16432-16438, 2001).

테나신-C 내 FNⅢ 반복단위 분자들의 전체적인 구조는 반복단위들 간의 기울어진 각도 및 이들 반복단위들 사이 지역의 길이에 의존하여 다양한 모양으로 변화될 수 있다. 이전의 보고에 따르면, TNⅢ4 및 5 반복단위들은 빽빽이 채워져 있어서 긴 일직선상의 가닥을 형성하고 있다(Leahy DJ, et al., Science 258: 987-991, 1992). TNⅢ 도메인 3 내지 5 및 FNⅢ 도메인 10의 구조-기초 서열 정렬분석 결과, TNⅢ3 내지 5 도메인들은 표면 루프를 점유하는 기능적 절편들을 갖는, 전체적으로 동일한 구조를 공유하고 있었다(도 3a 참조). 상기 루프 지역은 단백질의 표면에 위치하고 있어 주로 친수성 아미노산을 포함하고 있는데, 이들 중 현저하게 표면 양전하를 띠고 있는 TNⅢ4 내 KEDK 서열(서열번호 2의 아미노산 서열중 969-972 해당)이 잠정적인 헤파린-결합부위로서 작용가능함을 확인하였다. TNⅢ4의 KEDK 서열과 TNⅢ5의 KGR 서열은 약간 나선형으로 서로 연결되어 있지만, TNⅢ4의 F 및 G β-쉬트 사이의 루프 지역 내 KEDK 서열이 TNⅢ5 내 KGR 서열과 동일한 분자의 표면에 위치하고 있음을 알 수 있다(도 3a 참조). 더욱이, TNⅢ4 도메인 상의 KEDK 루프는 병아리, 쥐, 돼지 및 인간을 포함하는 서로 다른 종들 사이에서 높은 서열 상동성을 나타내며 보존되어 있다(도 3b 참조).

상기와 같이, TNⅢ4 도메인 내 KEDK 서열이 TNⅢ5 도메인과 함께 테나신-C의 헤파린에 대한 최적의 결합 활성을 유도함을 확인한 본 발명자들은 KEDK 서열 중 상기 활성에 필수적인 잔기를 선별하기 위하여 이들의 치환 돌연변이체를 제조하고 헤파린-결합 활성을 조사하였다. 그 결과, KEDK 서열에 이중 돌연변이를 갖는 치환 돌연변이체가 현저하게 감소된 헤파린-결합 활성을 나타내어 TNⅢ4 도메인의 KEDK 서열에서 서열번호 2의 969 내지 972번째 라이신 잔기들이 헤파린-결합활성에 필수적으로 작용함을 확인하였다(표 2 참조).

따라서, 구조-기초 서열 정렬, 돌연변이 및 서열 상동성 분석결과들을 종합해 볼 때, TNⅢ4 내 KEDK 서열이 헤파린에 대한 높은 결합 친화력을 나타내는데 필 수적임을 알 수 있다. TNⅢ4 내 KEDK 서열은 TNⅢ5 내 KGR 서열과 동일한 분자의 표면에 위치하고 있기 때문에, 테나신-C의 헤파린-결합부위들은 TNⅢ4-5 도메인들을 가로질러 존재하고, 그로 인해 TNⅢ4 유래 KEDK 잔기들이 TNⅢ5 도메인의 일차적인 헤파린-결합부위와 공동작용에 의해 최적의 헤파린-결합 활성을 유도하게 된다.

TNⅢ5 내 KGRHKSKPARVK 서열이 헤파린-결합 활성에 관여하는 것은 이미 보고된 바 있다(Weber P, et al., J. Biol. Chem. 270: 4619-4623, 1995). 본 발명에서는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 1057번째 라이신 및 1059번째 아르기닌 잔기에서의 돌연변이가 헤파린-결합 활성을 현저하게 감소시킴을 또한 확인하였다. 상기 결과들로부터, 테나신-C 타입 Ⅲ는 헤파린에 동시에 결합할 수 있는 부위를 TNⅢ5 및 TNⅢ4에 각각 하나씩 포함하고 있고, 상기 두 결합부위는 공동작용에 의해 테나신-C의 헤파린에 대한 최적의 결합 활성을 유도함을 알 수 있다.

상기에서 헤파린-결합 도메인으로 동정된 TNⅢ4의 헤파린-결합 활성이 세포부착과 연관되어 있는지 여부를 조사한 결과, TNⅢ4-5는 TNⅢ5보다 현저하게 높은 세포 부착활성을 나타낸 반면, KEDK 서열에 이중 돌연변이를 갖는 TNⅢ4-5 치환 돌연변이체는 세포 부착활성을 현저하게 감소시켰다. 또한, TNⅢ4-5에 대한 세포의 부착은 헤파린 존재하에 완벽하게 억제되었는데, 이는 수용성 헤파린이 TNⅢ4-5 내 헤파린-결합부위에 미리 결합하게 되면 세포 표면의 HSPGs에 대한 TNⅢ4-5의 결합활성이 저해될 수 있음을 나타내는 것이다. 이는 헤파리네이즈 Ⅰ 처리에 의해 TNⅢ4-5의 세포 부착활성이 상당히 감소된 결과로부터 입증되었다. 상기 결과로부 터, TNⅢ4가 HSPGs의 결합부위를 포함하고 있으며, 공동 기작에 의해 HSPGs에 대한 TNⅢ5의 부착활성을 증가시킴을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 헤파린에 높은 결합 친화력을 가지고 헤파린-결합부위로 작용가능하며, 세포 부착활성을 나타내는 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 기재되는 KEDK(Lys-Glu-Asp-Lys) 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것이 바람직하고, 상기 아미노산 서열의 수식(modification)된 형태를 모두 포함하며 이를 반복하여 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에서는 상기 서열번호 3으로 기재되는 KEDK 서열을 전체 또는 일부를 사용할 수도 있으나, 첫 번째 및 네 번째 라인신 잔기를 필수적으로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 헤파린에 대한 높은 결합 친화력을 나타내고 세포의 부착활성을 증진시킬 수 있는 상기 폴리펩타이드의 기능적 유도체를 포함한다. 본 발명에서 기능적 유도체는 높은 결합 친화력과 세포 부착활성을 가지고 헤파린에 결합할 수 있는 상기 폴리펩타이드의 가변체, 유사체 또는 화학적 유도체를 의미한다.

여기에서 사용된 가변체는 아미노산 서열내에 글리코실화 패턴 또는 비공유적 또는 공유적 방식으로 수정된 분자를 의미하는데, 여기에는 돌연변이를 포함한다. 높은 결합 친화력을 가지고 세포 부착활성을 증진시키는 방식으로 헤파린에 결합하는 능력이 최종 구조에 포함된다면, 본 발명에 속하는 가변체의 일부는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.

여기에서 사용된 화학적 유도체는 자연 발생 또는 다양한 화학적 수정, 예를 들면 알킬, 아실 또는 아민기에 의해 서로 대체되어 생산될 수 있는 폴리펩타이드 를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 세포부착용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 폴리펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 폴리펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용가능한 여러 담체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 펩타이드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 폴리펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할치료방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> TNⅢ 도메인들의 동역학 분석

<1-1> TNⅢ 도메인 발현벡터의 제조

테나신-C 타입 Ⅲ 도메인들 중 헤파린과의 상호작용에 필수적인 도메인을 밝히기 위하여 인간 테나신-C FNⅢ(TNⅢ)의 일부 도메인만을 포함하는 재조합 절편들을 제조하였다.

먼저, 인간 테나신-C(TN)의 cDNAs는 성인 인간 cDNA 라이브러리를 주형으로 사용하여 통상적인 PCR 방법에 의해 증폭하였다. 이때, PCR 프라이머로 TNⅢ 도메인 3 내지 5를 인식하도록 고안된 서열번호 4의 정방향 TN3F; 서열번호 5의 역방형 TN3R; 서열번호 6의 역방향 TN4R; 및 서열번호 7의 역방향 TN5R을 사용하였다.

PCR은 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂, 100 ㎍/㎖ 젤라틴, 0.2 mM dNTPs, 1.25 단위 Taq 중합효소(Perkin-Elmer) 및 50 pmol 프라이머를 포함하는 50 ㎕ 반응용액에서 수행하였다. PCR 조건은 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 및 94℃에서 1분의 반응을 30회 반복 수행하였다. 이로부터 증폭된 cDNA 산물들을 KpnⅠ 및 EcoRⅠ 제한효소로 절단한 후 PCR 정제 키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 분리하였다. 상기에서 분리된 PCR 산물을 C-말단에 6개의 His 표지(His tag)가 있는 pBAD/HisA 발현벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 폴리-His 표지를 포함하는 TNⅢ3-5, TNⅢ4-5 및 TNⅢ5 융합 단백질을 발현시키고 Ni²⁺ 친화 컬럼 (Invitrogen)을 사용하여 변성조건 하에서 제조사의 지침에 따라 정제하였다. 세포 분쇄액 및 정제된 융합 단백질은 12% (w/v) 아크릴아미드 겔에 환원조건 하에서 전기영동하여 분리한 후, 코마시 블루 (Coomassie Blue)로 염색하여 관찰하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 재조합 TNⅢ 도메인들이 발현되어 균질하게 분리·정제되었음을 확인하였다.

<1-2> 재조합 TNⅢ 도메인들의 헤파린-결합 활성 분석

상기 실시예 <1-1>에서 분리·정제된 각각의 재조합 TNⅢ 도메인 절편들의 헤파린에 대한 결합 활성을 분석하기 위하여 표면 양자 공명(surface plasmon resonance, SPR) 원리를 기본으로 하는 BIAcore X 시스템을 이용하였다. BIAcore 시스템은 실시간으로 분자간의 상호작용을 정량적으로 분석 가능하게 해주며, 이로부터 결합 및 해리속도상수가 즉시 계산된다.

사용한 칩은 단백질 고정을 위해 카르복시메틸-덱스트란(CM-Dex)으로 코팅되어 있는 CM5 센서 칩을 이용하였다. 먼저, HBS 완충용액(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.005% 계면활성제 P20 함유)으로 칩 표면을 안정화시킨 후, 0.1 M NHS(N-hydroxysuccnimide)와 0.4 M EDC(N-ethyl-N9-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide)의 혼합액 200 ㎕를 흘려주어 칩 표면을 활성화시켰다. 이 상태에서 스트렙타비딘(steptavidin)을 제조사의 지침에 따라 아민 커플링 키트(amine coupling kit, BIAcore Inc.)를 사용하여 상기 CM5 센서 칩에 결합시켰다. 바이아코어 X 시스템을 위한 센서 칩당 두 개의 유세포(flow cell)를 사용하는데, 상기 스트렙타비딘은 20k 공명단위(resonance unit, RU)로 첫 번째 유세포 내에서 고정되었고, BSA(bovine serum albumin)는 배경 수정을 위한 음성 대조군으로 950 공명단위로 두 번째 유세포 내에 고정되었다. 상기와 같이 준비된 스트렙타비딘-결합 CM5 센서 칩에 바이오틴화 헤파린(biotinylated heparin, BiHep, Sigma)을 제조사의 지침에 따라 고정시켰다. 이 후, 1.0 M 에탄올아민(ethanolamine) 20 ㎕를 흘려주어 BiHep와 붙지 않고 활성화 상태로 남아있는 칩 표면을 치환시켰다. 재조합 TNⅢ 도메인 절편들의 헤파린에 대한 결합 친화력 측정은 CM5 센서 칩에 BiHep를 고정시킨 후, 결합 완충용액(binding buffer)(0.01 M HEPES, 0.15 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 폴리소르베이트 20, pH 7.4)을 계속해서 흘려 평형화 (equilibration)시키고 상기 재조합 절편들이 20, 40 ,80 mM 농도로 용해되어 있는 결합 완충용액을 흘려주어 결정하였다. 이때, 재조합 절편과 헤파린과의 결합 친화력에 따라서 펩타이드가 각각 다른 속도와 기울기로 결합하게 되는데, 각각의 결과로부터 헤파린에 대한 결합 친화력을 측정하였다.

동역학 속도상수(k_a 및 k_d) 및 평형 분리상수(k_D)는 BIAcore 동역학 평가 소프트웨어(BIAcore kinetic evaluation software, BIAcore사, Uppsala, Sweden)를 사용하여 결정하였다. 재조합 TNⅢ 도메인 절편들 각각의 결합 동역학을 결정하기 위하여, 농도를 달리한 일련의 시료들을 5분간의 결합기(association phase) 동안 40 ㎕/분의 속도로 주입하였다. 상기 결합기는 10분 이상 수행되었다. 유세포는 1.0 mM NaCl을 3분간 주입하여 재생시켰고, 이로 인해 헤파린은 천연 상태로 남게되는 반면, 재조합 TNⅢ 도메인 절편들은 제거된다. 다양한 재조합 TNⅢ 도메인 절편들과 고정된 헤파린 사이의 상호작용 정도를 나타내는 BIAcore 감지장치 기록 (sensorgrams)의 동역학 분석은 하기 수학식 1에 따라 결정하였다.

dR/dt = k _a CR_max - (k _a C + k _d )R_t

상기 식에서, dR/dt는 시간 t초에서 고정된 헤파린과 시료간의 상호작용에 기인한 SRP 신호 (RU)의 변화율이고, k _a 및 k _d 는 각각 결합 및 해리속도상수를 나타내고, C는 시료의 농도이고, R_max는 RU에서 고정된 헤파린에 대한 시료의 최대 결합 용량(maximum analyte binding capacity)을 나타낸다. 결합 및 해리속도상수 모두 BIA 평가 소프트웨어(BIAevaluation software, version 3.0)를 사용하여 센소그람들의 크기 분석으로부터 결정되었다. 모든 결합 곡선들은 배경과 부피 굴절 지수 (bulk refractive index) 공여에 대해 유세포 대조군의 값을 공제함으로써 보정되었다.

테나신-C에서 TNⅢ 도메인 5는 이미 주요 헤파린-결합부위로 동정된 바 있는데(Weber P, et al., J. Biol. Chem. 270: 4619-4623, 1995), 본 발명의 SPR-기초 BIAcore 시스템 분석에서도 TNⅢ5가 헤파린과의 상효작용을 위한 결합부위로 작용함을 확인하였다. 생리적 조건하에서 스트렙타비딘-결합 CM5 센서 칩에 고정된 헤파린에 대한 재조합 TNⅢ3-5 및 TNⅢ4-5에 대한 k _d 는 각각 30 nM 및 40 nM로 측정되어 헤파린에 대해 높은 친화력을 나타내었다(도 2). 하기 표 1에 나타난 바와 같이, TNⅢ3-5 및 TNⅢ4-5는 모두 칩 표면에서 헤파린에 대한 빠른 결합속도 (k _a TNⅢ3-5, 8.64x10³xM^-1; k _a TNⅢ4-5, 4.46x10³xM ^-1s^-1)를 나타낸 반면, 느린 해리속도 (k _d TNⅢ3-5, 0.29x10³xs^-1; k _d TNⅢ4-5, 0.2x10³xs ^-1)를 나타내어 매우 안정적임을 확인하였다.

시료	k d (s-1x10-3)	k a (M-1s-1x103)	K D (μM)
TNⅢ3-5	0.29	8.64	0.03
TNⅢ4-5	0.2	4.46	0.04
TNⅢ5	0.82	0.19	0.25
TNⅢ4	NB	NB	NB
TNⅢ3	NB	NB	NB
k d : 해리속도상수,k a : 결합속도상수,K D : 평형상수, NB: not bind

흥미롭게도, TNⅢ5는 TNⅢ3-5 및 TNⅢ4-5에 비하여 각각 160배 및 106배 감소된 친화력(K _d =4.25 μM)을 나타내었다. 그러나, TNⅢ3 및 TNⅢ4는 모두 헤파린이 고정된 칩 표면에 매우 빈약하게 결합하기 때문에 결합 및 해리 동역학을 정량할 수 없었다(표 1). TNⅢ5를 포함하는 재조합 절편의 헤파린에 대한 결합 친화력은 항상 TNⅢ3-5 또는 TNⅢ4-5를 포함하는 제조합 절편들의 결합 친화력보다 훨씬 낮았는데, 이러한 결과는 TNⅢ4 도메인이 테나신-C와 헤파린간의 최적의 결합에 상당히 기여함을 나타내는 것이다.

<실시예 2> 서열 정렬 및 상동성 분석

NMR 및 결정 구조분석에 의해 피브로넥틴 타입 Ⅲ의 도메인 10(FⅢ10)의 RGD 서열이 도메인 표면으로부터 뻗어져 나온 루프내에 존재하고 있음이 보고되었다 (Sharma A, et al., EMBO J. 18: 1468-1479, 1999; Grant RP, et al., J. Biol. Chem. 272: 6159-6166, 1997). 이에, FⅢ10과 TNⅢ3, TNⅢ4 및 TNⅢ5의 구조를 기 초로한 서열 정렬 및 상동성 분석을 수행하여 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에서 초록색으로 표기된 아미노산 잔기는 FⅢ10, TNⅢ3, TNⅢ4 및 TNⅢ5 모두에서 보존되어 있는 잔기를 나타내고, 노란색 잔기는 상기 도메인들 중 적어도 세 개의 도메인에서 보존되어 있는 잔기를 나타낸다.

도 3a에 나타난 바와 같이, TNⅢ3 내지 5 도메인들은 표면 루프를 점유하는 기능적 절편들을 갖는, 전체적으로 동일한 구조를 공유하고 있었다. 상기 루프 지역은 단백질의 표면에 위치하고 있어 주로 친수성 아미노산을 포함하게 된다. TNⅢ5 내 KGRHKSKPARVK 서열(서열번호 2의 아미노산 서열에서 1057-1068에 해당)은 이미 헤파린-결합 활성에 관여하는 것으로 보고된 바 있다(Weber P, et al., J. Biol. Chem. 270: 4619-4623, 1995). F 및 G 가닥들 사이의 루프로부터 제공된 이들 여섯 개의 양전하를 띤 잔기들, 즉 K 또는 R은 용매 내로 돌출된다. 이에, 본 발명자들은 테나신-C 내 헤파린에 대한 새로운 결합부위를 밝히기 위하여 TNⅢ4 내 루프 지역에 초점을 맞추어 연구하였고, 그로부터 현저하게 표면 양전하를 띠고 있는 TNⅢ4 내 KEDK 서열(서열번호 2의 아미노산 서열에서 969-972에 해당)이 잠정적인 헤파린-결합부위로 작용가능함을 확인하였다. 더욱이, TNⅢ4 도메인 상의 KEDK 서열은 병아리, 쥐, 돼지 및 인간을 포함하는 서로 다른 종들 사이에서 높은 서열 상동성을 나타내었다 (도 3b).

<실시예 3> TNⅢ4 내 헤파린-결합부위 동정

<3-1> 위치-지정 돌연변이에 의한 치환 돌연변이체의 제조

상기 실시예 2의 서열 정렬 및 상동성 분석 결과 확인된 TNⅢ4 내 KEDK 서열의 헤파린에 대한 결합활성을 좀더 조사하기 위하여, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 969번째 및 972번째 라이신(Lys)을 글루타민(Gln)으로 치환시킨 이중 돌연변이를 포함하는 재조합 TNⅢ3-5 단백질의 치환 돌연변이체를 제조하였다.

구체적으로, 재조합 TNⅢ4-5 단백질의 KEDK 서열에서 Lys⁹⁶⁹과 Lys⁹⁷²가 각각 Gln으로 치환된 돌연변이체를 제조하기 위해 PCR을 이용한 위치-지정 돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 실시하였다. 위치-지정 돌연변이는 퀵체인지 킷트 (Quickchange kit, Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 주형으로 상기 실시예 1에서 제조된 재조합 TNⅢ3-5를 이용하고 서열번호 8 및 서열번호 9를 프라이머 쌍으로 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머 쌍은 재조합 TNⅢ3-5에서 Lys⁹⁶⁹과 Lys⁹⁷² 위치에 Gln으로의 치환이 도입되도록 고안되었다. PCR은 중합효소로서 2.5 단위의 Pfu turbo DNA 중합효소(Stratagen, Ca. No. 200518)를 사용하고 95℃에서 5분 동안 예비 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 60초, 72℃에서 2분의 반응을 30회 수행하였다.

또한, 상기와 동일한 방법으로 서열번호 2의 TNⅢ5 단백질의 KGR 서열에서 1057번째 라이신이 글루타민으로, 1059번째 아르기닌(Arg)이 글루타민으로 치환된 돌연변이체들을 제조하였다. 이때, 위치-지정 돌연변이를 위한 PCR의 시발체 쌍으로 재조합 TNⅢ5에서 Lys¹⁰⁵⁷ 위치에 Gln으로의 치환이 도입되도록 고안된 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 쌍; 및 Arg¹⁰⁵⁹ 위치에 Gln으로의 치환이 도입되도록 고안된 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 쌍을 사용하였다.

이로부터 재조합 TNⅢ4-5 단백질의 KEDK 서열에서 Lys⁹⁶⁹과 Lys⁹⁷²가 각각 Gln으로 치환된 이중 돌연변이체 K969Q/K972Q(KEDK); 및 재조합 TNⅢ5 단백질의 RGD 서열에서 Lys¹⁰⁵⁷이 Gln으로 치환된 돌연변이체 K1057Q(KGR) 및 Arg¹⁰⁵⁹이 Gln으로 치환된 돌연변이체 R1059Q(KGR)를 얻었다.

상기에서 증폭된 PCR 산물들을 회수하여 제한효소 KpnⅠ 및 EcoRⅠ으로 절단한 후 PCR 정제 키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 분리하였다. 이와 같이 분리된 PCR 산물들을 각각 C-말단에 6개의 His 표지가 있는 pBAD/HisA 발현벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 폴리-His 표지를 포함하는 K969Q/K972Q(KEDK), K1057Q(KGR) 및 R1059Q(KGR) 치환 돌연변이 융합 단백질을 발현시키고 Ni²⁺ 친화 컬럼(Invitrogen)을 사용하여 변성조건 하에서 제조사의 지침에 따라 정제하였다.

상기와 같이 정제된 치환 돌연변이 융합 단백질들의 염기서열을 분석하여 각각의 치환 돌연변이체에 목적하는 돌연변이가 도입되었음을 확인하였다.

<3-2> 헤파린-결합 활성 분석

상기에서 제조된 TNⅢ4-5 돌연변이체들의 헤파린-결합 활성을 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 BIAcore 시스템을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이때, TNⅢ4-5 돌연변이체들의 헤파린-결합 활성은 TNⅢ4-5 야생형 단백질과 비교하여 상대적인 값으로 나타내었다.

시료	k d (s-1x10-3)	k a (M-1s-1x103)	K D (μM)
K969Q/K972Q(KEDK)	0.01	1.38	9.2
K1057Q(KGR)	NB	NB	B
R1059Q(KGR)	NB	NB	B

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 재조합 TNⅢ4-5 K969QA/K972Q 이중 돌연변이체에 대한 k _d 는 야생형 TNⅢ4-5와 비교하여 헤파린에 대해 약 70배정도 감소된 결합 친화력(k _d =29.2 μM)을 나타내었고, TNⅢ5 내 KGR 서열의 돌연변이를 갖는 TNⅢ4-5 K1057Q 및 TNⅢ4-5 R1059Q는 헤파린에 대한 결합이 완벽하게 억제되었다. 상기 결과로부터, TNⅢ5 도메인이 일차적인 헤파린-결합부위이고, 상기 도메인 내 KGR 서열의 Arg¹⁰⁵⁹ 및 Lys¹⁰⁵⁷ 잔기들이 헤파린과의 상호작용에 결정적으로 중요하게 작용한다는 것을 확인하였다. 또한, TNⅢ4 도메인 내 KEDK 서열의 돌연변이가 헤파린에 대한 결합 친화력을 상당히 감소시킨다는 사실은 테나신-C와 헤파린과의 최적의 결합을 위해서 KEDK 잔기들이 이차적인 헤파린-결합부위로 작용한다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 결과들은 F 및 G가닥들 사이의 루프 지역 내 KEDK 잔기들이 테나신-C와 헤파린과의 최적의 결합활성을 유도하는데 기여하고, 테나신-C 내 헤파린-결합부위들이 TNⅢ4 및 TNⅢ5 도메인 모두에 걸쳐 연장되어 있음을 암시하는 것이다.

<실시예 4> TNⅢ4 헤파린-결합 도메인의 세포부착 활성

상기에서 헤파린-결합 도메인으로 동정된 TNⅢ4의 KEDK 서열의 생물학적 중요성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 테나신-C의 헤파린-결합 활성이 세포부착과 연관되어 있는지 여부를 하기와 같이 조사하였다.

인간 잇몸 섬유아세포(human gingival fibroblast, HGF)를 10% 소 태아 혈청, 100 단위/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함하는 최소 필수 배지(α-MEN)에서 배양하였다. HGFs를 다시 24시간 동안 동일한 배지에서 무혈청 배양한 후, 0.02% 트립신 및 1 mM EDTA 처리에 의해 수확하였다. 수확된 HGFs를 α-MEN에 재현탁한 후 100 ㎍/㎖ 콩 트립신 저해제 및 1% BSA를 포함하는 α-MEN으로 세 번 세척하여 준비하였다. 24-웰 플레이트에 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 재조합 단백질 TNⅢ4-5 및 TNⅢ5와 실시예 <3-2>에서 제조된 이중 돌연변이체 K969Q/K972Q(KEDK)를 각각 1 μM 농도로 참가한 후 4℃에서 밤새 배양하여 코팅하였다. 상기 웰 플레이트에 1%(w/v) BSA를 포함하는 PBS를 첨가하여 실온에서 30분 동안 블로킹시킨 후, BSA 무첨가 PBS로 세척하였다. 상기에서 준비된 HGFs를 5x10⁴ 세포/웰의 농도로 재조합 단백질이 코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이때, 세포를 웰 플레이트에 첨가하기 전에 2 단위/㎖ 농도의 헤파리네이즈 Ⅰ(heparinase Ⅰ) 또는 콘드로이티네이즈(chondroitinase) ABC로 37℃에서 1시간 동안 전처리하거나, 5 ㎍/㎖ 농도의 헤파린과 함께 37℃에서 1시간 동안 동시-배양 하였다. 대조군 세포의 현탁액은 정해진 시간동안 BSA-코팅 플레이트에서 유지하였다. 37℃에서 60분 동안 배양시킨 후, 부착되지 않은 세포들을 PBS로 두 번 세척하여 제거하였다. 부착된 세포는 3% 파라포름알데히드(Sigma)로 고정한 후 0.25% 크리스탈 바이올렛을 포함하는 2%(v/v) 에탄올 수용액으로 염색하였다. 웰 플레이트를 증류수로 충분히 세척하고 건조시킨 후, 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 비-특이적 세포부착은 음성 대조군으로서 1% BSA로 코팅된 웰에서 결정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, TNⅢ4-5는 TNⅢ5보다 현저하게 높은 세포 부착활성을 나타낸 반면, TNⅢ4-5 K969Q/K972Q 이중 돌연변이체는 세포 부착활성을 현저하게 감소시켰다. 또한, TNⅢ4-5에 대한 HGF의 부착은 5 ㎍/㎖의 헤파린 존재하에 완벽하게 억제되었는데, 이는 수용성 헤파린이 TNⅢ4-5 내 헤파린-결합부위에 미리 결합하게 되면 세포 표면 HSPGs에 대한 TNⅢ4-5의 결합활성이 저해될 수 있음을 암시하는 것이다. 이러한 가능성을 조사하기 위하여, 고도로 황화된 HSPGs에 작용하는 효소인 헤파리네이즈 Ⅰ으로 먼저 세포를 처리함으로써 (Feitsma K, et al., J. Biol. Chem. 275: 9396-9402, 2000) 세포 표면 HSPGs를 제거하였다. 그 결과, HGF 세포의 헤파리네이즈 Ⅰ 처리는 TNⅢ4-5의 HGF 세포에 대한 부착활성을 75% 정도 감소시켰다. 또한, HGF의 콘드로이티네이즈 ABC 처리 결과로부터, TNⅢ4-5의 세포 부착활성이 콘드로이틴 설페이트가 아닌 세포 표면의 헤파란 설페이트에 의해 매개된 것임을 알 수 있었다(도 4). 이러한 결과들은 TNⅢ4가 HSPGs의 결합부위를 포함하고 있으며, 공동 기작에 의해 HSPGs에 대한 TNⅢ5의 부착 활성을 증대시킴을 입증하는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 테나신-C 도메인 4 유래 KEDK 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체는 헤파린에 높은 친화력을 가지고 헤파린-결합부위로 작용할 수 있으며 세포의 부착활성을 증진시키므로 세포부착용 펩타이드에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> HUMAN TENACIN-C DERIVED POLYPEPTIDE AND A DERIVATIVE THEREOF AS A NOVEL HEPARIN-BINDING SITE <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7560 <212> DNA <213> Homo sapiens tenascin C <220> <221> CDS <222> (314)..(6916) <220> <221> misc_feature <222> (740)..(2095) <223> Fibrillins and related proteins containing Ca2+-binding EGF-like domains <220> <221> misc_feature <222> (785)..(1438) <223> Integrin beta subunit (N-terminal portion of extracellular region) <220> <221> misc_feature <222> (968)..(2665) <223> Teneurin-1 and related extracellular matrix proteins, contain EGF-like repeats <220> <221> misc_feature <222> (2186)..(3088) <223> Neural cell adhesion molecule L1 <220> <221> misc_feature <222> (2189)..(2398) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (2456)..(2692) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (2729)..(2965) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (2873)..(3211) <223> Teneurin-1 and related extracellular matrix proteins, contain EGF-like repeats <220> <221> misc_feature <222> (2999)..(3241) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (3275)..(3505) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (3545)..(3775) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (3818)..(4036) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (4091)..(4294) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (4097)..(5740) <223> Receptor mediating netrin-dependent axon guidance <220> <221> misc_feature <222> (4364)..(4594) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (4637)..(4837) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (4910)..(5143) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (5180)..(5413) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (5450)..(5683) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (5486)..(6196) <223> Receptor mediating netrin-dependent axon guidance <220> <221> misc_feature <222> (5717)..(5929) <223> Fibronectin type III domain <220> <221> misc_feature <222> (5909)..(6892) <223> Ficolin and related extracellular proteins <400> 1 accggccaca gcctgcctac tgtcacccgc ctctcccgcg cgcagataca cgcccccgcc 60 tccgtgggca caaaggcagc gctgctgggg aactcggggg aacgcgcacg tgggaaccgc 120 cgcagctcca cactccaggt acttcttcca aggacctagg tctctcgccc atcggaaaga 180 aaataattct ttcaagaaga tcagggacaa ctgatttgaa gtctactctg tgcttctaaa 240 tccccaattc tgctgaaagt gaatccctag agccctagag ccccagcagc acccagccaa 300 acccacctcc acc atg ggg gcc atg act cag ctg ttg gca ggt gtc 346 Met Gly Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val 1 5 10 ttt ctt gct ttc ctt gcc ctc gct acc gaa ggt ggg gtc ctc aag aaa 394 Phe Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys 15 20 25 gtc atc cgg cac aag cga cag agt ggg gtg aac gcc acc ctg cca gaa 442 Val Ile Arg His Lys Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Thr Leu Pro Glu 30 35 40 gag aac cag cca gtg gtg ttt aac cac gtt tac aac atc aag ctg cca 490 Glu Asn Gln Pro Val Val Phe Asn His Val Tyr Asn Ile Lys Leu Pro 45 50 55 gtg gga tcc cag tgt tcg gtg gat ctg gag tca gcc agt ggg gag aaa 538 Val Gly Ser Gln Cys Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys 60 65 70 75 gac ctg gca ccg cct tca gag ccc agc gaa agc ttt cag gag cac aca 586 Asp Leu Ala Pro Pro Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gln Glu His Thr 80 85 90 gta gat ggg gaa aac cag att gtc ttc aca cat cgc atc aac atc ccc 634 Val Asp Gly Glu Asn Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro 95 100 105 cgc cgg gcc tgt ggc tgt gcc gca gcc cct gat gtt aag gag ctg ctg 682 Arg Arg Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu 110 115 120 agc aga ctg gag gag ctg gag aac ctg gtg tct tcc ctg agg gag caa 730 Ser Arg Leu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln 125 130 135 tgt act gca gga gca ggc tgc tgt ctc cag cct gcc aca ggc cgc ttg 778 Cys Thr Ala Gly Ala Gly Cys Cys Leu Gln Pro Ala Thr Gly Arg Leu 140 145 150 155 gac acc agg ccc ttc tgt agc ggt cgg ggc aac ttc agc act gaa gga 826 Asp Thr Arg Pro Phe Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Ser Thr Glu Gly 160 165 170 tgt ggc tgt gtc tgc gaa cct ggc tgg aaa ggc ccc aac tgc tct gag 874 Cys Gly Cys Val Cys Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu 175 180 185 ccc gaa tgt cca ggc aac tgt cac ctt cga ggc cgg tgc att gat ggg 922 Pro Glu Cys Pro Gly Asn Cys His Leu Arg Gly Arg Cys Ile Asp Gly 190 195 200 cag tgc atc tgt gac gac ggc ttc acg ggc gag gac tgc agc cag ctg 970 Gln Cys Ile Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gln Leu 205 210 215 gct tgc ccc agc gac tgc aat gac cag ggc aag tgc gtg aat gga gtc 1018 Ala Cys Pro Ser Asp Cys Asn Asp Gln Gly Lys Cys Val Asn Gly Val 220 225 230 235 tgc atc tgt ttc gaa ggc tac gcc ggg gct gac tgc agc cgt gaa atc 1066 Cys Ile Cys Phe Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Asp Cys Ser Arg Glu Ile 240 245 250 tgc cca gtg ccc tgc agt gag gag cac ggc aca tgt gta gat ggc ttg 1114 Cys Pro Val Pro Cys Ser Glu Glu His Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu 255 260 265 tgt gtg tgc cac gat ggc ttt gca ggc gat gac tgc aac aag cct ctg 1162 Cys Val Cys His Asp Gly Phe Ala Gly Asp Asp Cys Asn Lys Pro Leu 270 275 280 tgt ctc aac aat tgc tac aac cgt gga cga tgc gtg gag aat gag tgc 1210 Cys Leu Asn Asn Cys Tyr Asn Arg Gly Arg Cys Val Glu Asn Glu Cys 285 290 295 gtg tgt gat gag ggt ttc acg ggc gaa gac tgc agt gag ctc atc tgc 1258 Val Cys Asp Glu Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Leu Ile Cys 300 305 310 315 ccc aat gac tgc ttc gac cgg ggc cgc tgc atc aat ggc acc tgc tac 1306 Pro Asn Asp Cys Phe Asp Arg Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr Cys Tyr 320 325 330 tgc gaa gaa ggc ttc aca ggt gaa gac tgc ggg aaa ccc acc tgc cca 1354 Cys Glu Glu Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Gly Lys Pro Thr Cys Pro 335 340 345 cat gcc tgc cac acc cag ggc cgg tgt gag gag ggg cag tgt gta tgt 1402 His Ala Cys His Thr Gln Gly Arg Cys Glu Glu Gly Gln Cys Val Cys 350 355 360 gat gag ggc ttt gcc ggt ttg gac tgc agc gag aag agg tgt cct gct 1450 Asp Glu Gly Phe Ala Gly Leu Asp Cys Ser Glu Lys Arg Cys Pro Ala 365 370 375 gac tgt cac aat cgt ggc cgc tgt gta gac ggg cgg tgt gag tgt gat 1498 Asp Cys His Asn Arg Gly Arg Cys Val Asp Gly Arg Cys Glu Cys Asp 380 385 390 395 gat ggt ttc act gga gct gac tgt ggg gag ctc aag tgt ccc aat ggc 1546 Asp Gly Phe Thr Gly Ala Asp Cys Gly Glu Leu Lys Cys Pro Asn Gly 400 405 410 tgc agt ggc cat ggc cgc tgt gtc aat ggg cag tgt gtg tgt gat gag 1594 Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Val Asn Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu 415 420 425 ggc tat act ggg gag gac tgc agc cag cta cgg tgc ccc aat gac tgt 1642 Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gln Leu Arg Cys Pro Asn Asp Cys 430 435 440 cac agt cgg ggc cgc tgt gtc gag ggc aaa tgt gta tgt gag caa ggc 1690 His Ser Arg Gly Arg Cys Val Glu Gly Lys Cys Val Cys Glu Gln Gly 445 450 455 ttc aag ggc tat gac tgc agt gac atg agc tgc cct aat gac tgt cac 1738 Phe Lys Gly Tyr Asp Cys Ser Asp Met Ser Cys Pro Asn Asp Cys His 460 465 470 475 cag cac ggc cgc tgt gtg aat ggc atg tgt gtt tgt gat gac ggc tac 1786 Gln His Gly Arg Cys Val Asn Gly Met Cys Val Cys Asp Asp Gly Tyr 480 485 490 aca ggg gaa gac tgc cgg gat cgc caa tgc ccc agg gac tgc agc aac 1834 Thr Gly Glu Asp Cys Arg Asp Arg Gln Cys Pro Arg Asp Cys Ser Asn 495 500 505 agg ggc ctc tgt gtg gac gga cag tgc gtc tgt gag gac ggc ttc acc 1882 Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Gln Cys Val Cys Glu Asp Gly Phe Thr 510 515 520 ggc cct gac tgt gca gaa ctc tcc tgt cca aat gac tgc cat ggc cag 1930 Gly Pro Asp Cys Ala Glu Leu Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gly Gln 525 530 535 ggt cgc tgt gtg aat ggg cag tgc gtg tgc cat gaa gga ttt atg ggc 1978 Gly Arg Cys Val Asn Gly Gln Cys Val Cys His Glu Gly Phe Met Gly 540 545 550 555 aaa gac tgc aag gag caa aga tgt ccc agt gac tgt cat ggc cag ggc 2026 Lys Asp Cys Lys Glu Gln Arg Cys Pro Ser Asp Cys His Gly Gln Gly 560 565 570 cgc tgc gtg gac ggc cag tgc atc tgc cac gag ggc ttc aca ggc ctg 2074 Arg Cys Val Asp Gly Gln Cys Ile Cys His Glu Gly Phe Thr Gly Leu 575 580 585 gac tgt ggc cag cac tcc tgc ccc agt gac tgc aac aac tta gga caa 2122 Asp Cys Gly Gln His Ser Cys Pro Ser Asp Cys Asn Asn Leu Gly Gln 590 595 600 tgc gtc tcg ggc cgc tgc atc tgc aac gag ggc tac agc gga gaa gac 2170 Cys Val Ser Gly Arg Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Ser Gly Glu Asp 605 610 615 tgc tca gag gtg tct cct ccc aaa gac ctc gtt gtg aca gaa gtg acg 2218 Cys Ser Glu Val Ser Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr 620 625 630 635 gaa gag acg gtc aac ctg gcc tgg gac aat gag atg cgg gtc aca gag 2266 Glu Glu Thr Val Asn Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu 640 645 650 tac ctt gtc gtg tac acg ccc acc cac gag ggt ggt ctg gaa atg cag 2314 Tyr Leu Val Val Tyr Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln 655 660 665 ttc cgt gtg cct ggg gac cag acg tcc acc atc atc cag gag ctg gag 2362 Phe Arg Val Pro Gly Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu 670 675 680 cct ggt gtg gag tac ttt atc cgt gta ttt gcc atc ctg gag aac aag 2410 Pro Gly Val Glu Tyr Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys 685 690 695 aag agc att cct gtc agc gcc agg gtg gcc acg tac tta cct gca cct 2458 Lys Ser Ile Pro Val Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala Pro 700 705 710 715 gaa ggc ctg aaa ttc aag tcc atc aag gag aca tct gtg gaa gtg gag 2506 Glu Gly Leu Lys Phe Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Val Glu Val Glu 720 725 730 tgg gat cct cta gac att gct ttt gaa acc tgg gag atc atc ttc cgg 2554 Trp Asp Pro Leu Asp Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe Arg 735 740 745 aat atg aat aaa gaa gat gag gga gag atc acc aaa agc ctg agg agg 2602 Asn Met Asn Lys Glu Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg Arg 750 755 760 cca gag acc tct tac cgg caa act ggt cta gct cct ggg caa gag tat 2650 Pro Glu Thr Ser Tyr Arg Gln Thr Gly Leu Ala Pro Gly Gln Glu Tyr 765 770 775 gag ata tct ctg cac ata gtg aaa aac aat acc cgg ggc cct ggc ctg 2698 Glu Ile Ser Leu His Ile Val Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly Leu 780 785 790 795 aag agg gtg acc acc aca cgc ttg gat gcc ccc agc cag atc gag gtg 2746 Lys Arg Val Thr Thr Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val 800 805 810 aaa gat gtc aca gac acc act gcc ttg atc acc tgg ttc aag ccc ctg 2794 Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu 815 820 825 gct gag atc gat ggc att gag ctg acc tac ggc atc aaa gac gtg cca 2842 Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro 830 835 840 gga gac cgt acc acc atc gat ctc aca gag gac gag aac cag tac tcc 2890 Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser 845 850 855 atc ggg aac ctg aag cct gac act gag tac gag gtg tcc ctc atc tcc 2938 Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser 860 865 870 875 cgc aga ggt gac atg tca agc aac cca gcc aaa gag acc ttc aca aca 2986 Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr 880 885 890 ggc ctc gat gct ccc agg aat ctt cga cgt gtt tcc cag aca gat aac 3034 Gly Leu Asp Ala Pro Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp Asn 895 900 905 agc atc acc ctg gaa tgg agg aat ggc aag gca gct att gac agt tac 3082 Ser Ile Thr Leu Glu Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser Tyr 910 915 920 aga att aag tat gcc ccc atc tct gga ggg gac cac gct gag gtt gat 3130 Arg Ile Lys Tyr Ala Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val Asp 925 930 935 gtt cca aag agc caa caa gcc aca acc aaa acc aca ctc aca ggt ctg 3178 Val Pro Lys Ser Gln Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly Leu 940 945 950 955 agg ccg gga act gaa tat ggg att gga gtt tct gct gtg aag gaa gac 3226 Arg Pro Gly Thr Glu Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu Asp 960 965 970 aag gag agc aat cca gcg acc atc aac gca gcc aca gag ttg gac acg 3274 Lys Glu Ser Asn Pro Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp Thr 975 980 985 ccc aag gac ctt cag gtt tct gaa act gca gag acc agc ctg acc ctg 3322 Pro Lys Asp Leu Gln Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr Leu 990 995 1000 ctc tgg aag aca ccg ttg gcc aaa ttt gac cgc tac cgc ctc aat tac 3370 Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr 1005 1010 1015 agt ctc ccc aca ggc cag tgg gtg gga gtg cag ctt cca aga aac acc 3418 Ser Leu Pro Thr Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr 1020 1025 1030 1035 act tcc tat gtc ctg aga ggc ctg gaa cca gga cag gag tac aat gtc 3466 Thr Ser Tyr Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val 1040 1045 1050 ctc ctg aca gcc gag aaa ggc aga cac aag agc aag ccc gca cgt gtg 3514 Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val 1055 1060 1065 aag gca tcc act gaa caa gcc cct gag ctg gaa aac ctc acc gtg act 3562 Lys Ala Ser Thr Glu Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr 1070 1075 1080 gag gtt ggc tgg gat ggc ctc aga ctc aac tgg acc gcg gct gac cag 3610 Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln 1085 1090 1095 gcc tat gag cac ttt atc att cag gtg cag gag gcc aac aag gtg gag 3658 Ala Tyr Glu His Phe Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu 1100 1105 1110 1115 gca gct cgg aac ctc acc gtg cct ggc agc ctt cgg gct gtg gac ata 3706 Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile 1120 1125 1130 ccg ggc ctc aag gct gct acg cct tat aca gtc tcc atc tat ggg gtg 3754 Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val 1135 1140 1145 atc cag ggc tat aga aca cca gtg ctc tct gct gag gcc tcc aca ggg 3802 Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly 1150 1155 1160 gaa act ccc aat ttg gga gag gtc gtg gtg gcc gag gtg ggc tgg gat 3850 Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp 1165 1170 1175 gcc ctc aaa ctc aac tgg act gct cca gaa ggg gcc tat gag tac ttt 3898 Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe 1180 1185 1190 1195 ttc att cag gtg cag gag gct gac aca gta gag gca gcc cag aac ctc 3946 Phe Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu 1200 1205 1210 acc gtc cca gga gga ctg agg tcc aca gac ctg cct ggg ctc aaa gca 3994 Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala 1215 1220 1225 gcc act cat tat acc atc acc atc cgc ggg gtc act cag gac ttc agc 4042 Ala Thr His Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser 1230 1235 1240 aca acc cct ctc tct gtt gaa gtc ttg aca gag gag gtt cca gat atg 4090 Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met 1245 1250 1255 gga aac ctc aca gtg acc gag gtt agc tgg gat gct ctc aga ctg aac 4138 Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn 1260 1265 1270 1275 tgg acc acg cca gat gga acc tat gac cag ttt act att cag gtc cag 4186 Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln 1280 1285 1290 gag gct gac cag gtg gaa gag gct cac aat ctc acg gtt cct ggc agc 4234 Glu Ala Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser 1295 1300 1305 ctg cgt tcc atg gaa atc cca ggc ctc agg gct ggc act cct tac aca 4282 Leu Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr 1310 1315 1320 gtc acc ctg cac ggc gag gtc agg ggc cac agc act cga ccc ctt gct 4330 Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala 1325 1330 1335 gta gag gtc gtc aca gag gat ctc cca cag ctg gga gat tta gcc gtg 4378 Val Glu Val Val Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val 1340 1345 1350 1355 tct gag gtt ggc tgg gat ggc ctc aga ctc aac tgg acc gca gct gac 4426 Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp 1360 1365 1370 aat gcc tat gag cac ttt gtc att cag gtg cag gag gtc aac aaa gtg 4474 Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val 1375 1380 1385 gag gca gcc cag aac ctc acg ttg cct ggc agc ctc agg gct gtg gac 4522 Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp 1390 1395 1400 atc ccg ggc ctc gag gct gcc acg cct tat aga gtc tcc atc tat ggg 4570 Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly 1405 1410 1415 gtg atc cgg ggc tat aga aca cca gta ctc tct gct gag gcc tcc aca 4618 Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr 1420 1425 1430 1435 gcc aaa gaa cct gaa att gga aac tta aat gtt tct gac ata act ccc 4666 Ala Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro 1440 1445 1450 gag agc ttc aat ctc tcc tgg atg gct acc gat ggg atc ttc gag acc 4714 Glu Ser Phe Asn Leu Ser Trp Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr 1455 1460 1465 ttt acc att gaa att att gat tcc aat agg ttg ctg gag act gtg gaa 4762 Phe Thr Ile Glu Ile Ile Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu 1470 1475 1480 tat aat atc tct ggt gct gaa cga act gcc cat atc tca ggg cta ccc 4810 Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro 1485 1490 1495 cct agt act gat ttt att gtc tac ctc tct gga ctt gct ccc agc atc 4858 Pro Ser Thr Asp Phe Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile 1500 1505 1510 1515 cgg acc aaa acc atc agt gcc aca gcc acg aca gag gcc ctg ccc ctt 4906 Arg Thr Lys Thr Ile Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu Ala Leu Pro Leu 1520 1525 1530 ctg gaa aac cta acc att tcc gac att aat ccc tac ggg ttc aca gtt 4954 Leu Glu Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr Gly Phe Thr Val 1535 1540 1545 tcc tgg atg gca tcg gag aat gcc ttt gac agc ttt cta gta acg gtg 5002 Ser Trp Met Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe Leu Val Thr Val 1550 1555 1560 gtg gat tct ggg aag ctg ctg gac ccc cag gaa ttc aca ctt tca gga 5050 Val Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe Thr Leu Ser Gly 1565 1570 1575 acc cag agg aag ctg gag ctt aga ggc ctc ata act ggc att ggc tat 5098 Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr Gly Ile Gly Tyr 1580 1585 1590 1595 gag gtt atg gtc tct ggc ttc acc caa ggg cat caa acc aag ccc ttg 5146 Glu Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln Thr Lys Pro Leu 1600 1605 1610 agg gct gag att gtt aca gaa gcc gaa ccg gaa gtt gac aac ctt ctg 5194 Arg Ala Glu Ile Val Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Asp Asn Leu Leu 1615 1620 1625 gtt tca gat gcc acc cca gac ggt ttc cgt ctg tcc tgg aca gct gat 5242 Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp Gly Phe Arg Leu Ser Trp Thr Ala Asp 1630 1635 1640 gaa ggg gtc ttc gac aat ttt gtt ctc aaa atc aga gat acc aaa aag 5290 Glu Gly Val Phe Asp Asn Phe Val Leu Lys Ile Arg Asp Thr Lys Lys 1645 1650 1655 cag tct gag cca ctg gaa ata acc cta ctt gcc ccc gaa cgt acc agg 5338 Gln Ser Glu Pro Leu Glu Ile Thr Leu Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg 1660 1665 1670 1675 gac tta aca ggt ctc aga gag gct act gaa tac gaa att gaa ctc tat 5386 Asp Leu Thr Gly Leu Arg Glu Ala Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr 1680 1685 1690 gga ata agc aaa gga agg cga tcc cag aca gtc agt gct ata gca aca 5434 Gly Ile Ser Lys Gly Arg Arg Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr 1695 1700 1705 aca gcc atg ggc tcc cca aag gaa gtc att ttc tca gac atc act gaa 5482 Thr Ala Met Gly Ser Pro Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu 1710 1715 1720 aat tcg gct act gtc agc tgg agg gca ccc acg gcc caa gtg gag agc 5530 Asn Ser Ala Thr Val Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser 1725 1730 1735 ttc cgg att acc tat gtg ccc att aca gga ggt aca ccc tcc atg gta 5578 Phe Arg Ile Thr Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val 1740 1745 1750 1755 act gtg gac gga acc aag act cag acc agg ctg gtg aaa ctc ata cct 5626 Thr Val Asp Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro 1760 1765 1770 ggc gtg gag tac ctt gtc agc atc atc gcc atg aag ggc ttt gag gaa 5674 Gly Val Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu 1775 1780 1785 agt gaa cct gtc tca ggg tca ttc acc aca gct ctg gat ggc cca tct 5722 Ser Glu Pro Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser 1790 1795 1800 ggc ctg gtg aca gcc aac atc act gac tca gaa gcc ttg gcc agg tgg 5770 Gly Leu Val Thr Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Arg Trp 1805 1810 1815 cag cca gcc att gcc act gtg gac agt tat gtc atc tcc tac aca ggc 5818 Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile Ser Tyr Thr Gly 1820 1825 1830 1835 gag aaa gtg cca gaa att aca cgc acg gtg tcc ggg aac aca gtg gag 5866 Glu Lys Val Pro Glu Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly Asn Thr Val Glu 1840 1845 1850 tat gct ctg acc gac ctc gag cct gcc acg gaa tac aca ctg aga atc 5914 Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr Thr Leu Arg Ile 1855 1860 1865 ttt gca gag aaa ggg ccc cag aag agc tca acc atc act gcc aag ttc 5962 Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gln Lys Ser Ser Thr Ile Thr Ala Lys Phe 1870 1875 1880 aca aca gac ctc gat tct cca aga gac ttg act gct act gag gtt cag 6010 Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp Leu Thr Ala Thr Glu Val Gln 1885 1890 1895 tcg gaa act gcc ctc ctt acc tgg cga ccc ccc cgg gca tca gtc acc 6058 Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr 1900 1905 1910 1915 ggt tac ctg ctg gtc tat gaa tca gtg gat ggc aca gtc aag gaa gtc 6106 Gly Tyr Leu Leu Val Tyr Glu Ser Val Asp Gly Thr Val Lys Glu Val 1920 1925 1930 att gtg ggt cca gat acc acc tcc tac agc ctg gca gac ctg agc cca 6154 Ile Val Gly Pro Asp Thr Thr Ser Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro 1935 1940 1945 tcc acc cac tac aca gcc aag atc cag gca ctc aat ggg ccc ctg agg 6202 Ser Thr His Tyr Thr Ala Lys Ile Gln Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg 1950 1955 1960 agc aat atg atc cag acc atc ttc acc aca att gga ctc ctg tac ccc 6250 Ser Asn Met Ile Gln Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Pro 1965 1970 1975 ttc ccc aag gac tgc tcc caa gca atg ctg aat gga gac acg acc tct 6298 Phe Pro Lys Asp Cys Ser Gln Ala Met Leu Asn Gly Asp Thr Thr Ser 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Lys Thr Arg Tyr Lys Leu Lys Val Glu Gly Tyr Ser 2095 2100 2105 ggg aca gca ggt gac tcc atg gcc tac cac aat ggc aga tcc ttc tcc 6682 Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met Ala Tyr His Asn Gly Arg Ser Phe Ser 2110 2115 2120 acc ttt gac aag gac aca gat tca gcc atc acc aac tgt gct ctg tcc 6730 Thr Phe Asp Lys Asp Thr Asp Ser Ala Ile Thr Asn Cys Ala Leu Ser 2125 2130 2135 tac aaa ggg gct ttc tgg tac agg aac tgt cac cgt gtc aac ctg atg 6778 Tyr Lys Gly Ala Phe Trp Tyr Arg Asn Cys His Arg Val Asn Leu Met 2140 2145 2150 2155 ggg aga tat ggg gac aat aac cac agt cag ggc gtt aac tgg ttc cac 6826 Gly Arg Tyr Gly Asp Asn Asn His Ser Gln Gly Val Asn Trp Phe His 2160 2165 2170 tgg aag ggc cac gaa cac tca atc cag ttt gct gag atg aag ctg aga 6874 Trp Lys Gly His Glu His Ser Ile Gln Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg 2175 2180 2185 cca agc aac ttc aga aat ctt gaa ggc agg cgc aaa cgg gca taaa 6920 Pro Ser Asn Phe Arg Asn Leu Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala 2190 2195 2200 ttggagggac cactgggtga gagaggaata aggcggccca gagcgaggaa aggattttac 6980 caaagcatca atacaaccag cccaaccatc ggtccacacc tgggcatttg gtgagaatca 7040 aagctgacca tggatccctg gggccaacgg caacagcatg ggcctcacct cctctgtgat 7100 ttctttcttt gcaccaaaga catcagtctc caacatgttt ctgttttgtt gtttgattca 7160 gcaaaaatct cccagtgaca acatcgcaat agttttttac ttctcttagg tggctctggg 7220 atgggagagg ggtaggatgt acaggggtag tttgttttag aaccagccgt attttacatg 7280 aagctgtata attaattgtc attatttttg ttagcaaaga ttaaatgtgt cattggaagc 7340 catccctttt tttacatttc atacaacaga aaccagaaaa gcaatactgt ttccatttta 7400 aggatatgat taatattatt aatataataa tgatgatgat gatgatgaaa actaaggatt 7460 tttcaagaga tctttctttc caaaacattt ctggacagta cctgattgta tttttttttt 7520 aaataaaagc acaagtactt ttgaaaaaaa accggaattc 7560 <210> 2 <211> 2201 <212> PRT <213> Homo sapiens tenascin C <400> 2 Met Gly Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val Phe Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys Val Ile Arg His Lys 20 25 30 Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val 35 40 45 Val Phe Asn His Val Tyr Asn Ile Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys 50 55 60 Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro 65 70 75 80 Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn 85 90 95 Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly 100 105 110 Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu 115 120 125 Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Cys Thr Ala Gly Ala 130 135 140 Gly Cys Cys Leu Gln Pro Ala Thr Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe 145 150 155 160 Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Ser Thr Glu Gly Cys Gly Cys Val Cys 165 170 175 Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu Pro Glu Cys Pro Gly 180 185 190 Asn Cys His Leu Arg Gly Arg Cys Ile Asp Gly Gln Cys Ile Cys Asp 195 200 205 Asp Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gln Leu Ala Cys Pro Ser Asp 210 215 220 Cys Asn Asp Gln Gly Lys Cys Val Asn Gly Val Cys Ile Cys Phe Glu 225 230 235 240 Gly Tyr Ala Gly Ala Asp Cys Ser Arg Glu Ile Cys Pro Val Pro Cys 245 250 255 Ser Glu Glu His Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Cys Val Cys His Asp 260 265 270 Gly Phe Ala Gly Asp Asp Cys Asn Lys Pro Leu Cys Leu Asn Asn Cys 275 280 285 Tyr Asn Arg Gly Arg Cys Val Glu Asn Glu Cys Val Cys Asp Glu Gly 290 295 300 Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Leu Ile Cys Pro Asn Asp Cys Phe 305 310 315 320 Asp Arg Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Glu Glu Gly Phe 325 330 335 Thr Gly Glu Asp Cys Gly Lys Pro Thr Cys Pro His Ala Cys His Thr 340 345 350 Gln Gly Arg Cys Glu Glu Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Phe Ala 355 360 365 Gly Leu Asp Cys Ser Glu Lys Arg Cys Pro Ala Asp Cys His Asn Arg 370 375 380 Gly Arg Cys Val Asp Gly Arg Cys Glu Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly 385 390 395 400 Ala Asp Cys Gly Glu Leu Lys Cys Pro Asn Gly Cys Ser Gly His Gly 405 410 415 Arg Cys Val Asn Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Cys Ser Gln Leu Arg Cys Pro Asn Asp Cys His Ser Arg Gly Arg 435 440 445 Cys Val Glu Gly Lys Cys Val Cys Glu Gln Gly Phe Lys Gly Tyr Asp 450 455 460 Cys Ser Asp Met Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gln His Gly Arg Cys 465 470 475 480 Val Asn Gly Met Cys Val Cys Asp Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys 485 490 495 Arg Asp Arg Gln Cys Pro Arg Asp Cys Ser Asn Arg Gly Leu Cys Val 500 505 510 Asp Gly Gln Cys Val Cys Glu Asp Gly Phe Thr Gly Pro Asp Cys Ala 515 520 525 Glu Leu Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asn 530 535 540 Gly Gln Cys Val Cys His Glu Gly Phe Met Gly Lys Asp Cys Lys Glu 545 550 555 560 Gln Arg Cys Pro Ser Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asp Gly 565 570 575 Gln Cys Ile Cys His Glu Gly Phe Thr Gly Leu Asp Cys Gly Gln His 580 585 590 Ser Cys Pro Ser Asp Cys Asn Asn Leu Gly Gln Cys Val Ser Gly Arg 595 600 605 Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Ser Gly Glu Asp Cys Ser Glu Val Ser 610 615 620 Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val Asn 625 630 635 640 Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val Tyr 645 650 655 Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro Gly 660 665 670 Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu Tyr 675 680 685 Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro Val 690 695 700 Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe 705 710 715 720 Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp 725 730 735 Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu 740 745 750 Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr 755 760 765 Arg Gln Thr Gly Leu Ala Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Ile Ser Leu His 770 775 780 Ile Val Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Val Thr Thr 785 790 795 800 Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp 805 810 815 Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly 820 825 830 Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr 835 840 845 Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys 850 855 860 Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met 865 870 875 880 Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu Asp Ala Pro 885 890 895 Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp Asn Ser Ile Thr Leu Glu 900 905 910 Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala 915 920 925 Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val Asp Val Pro Lys Ser Gln 930 935 940 Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly Leu Arg Pro Gly Thr Glu 945 950 955 960 Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu Asp Lys Glu Ser Asn Pro 965 970 975 Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp Thr Pro Lys Asp Leu Gln 980 985 990 Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr Leu Leu Trp Lys Thr Pro 995 1000 1005 Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr Ser Leu Pro Thr Gly 1010 1015 1020 Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr Thr Ser Tyr Val Leu 1025 1030 1035 1040 Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val Leu Leu Thr Ala Glu 1045 1050 1055 Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val Lys Ala Ser Thr Glu 1060 1065 1070 Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Gly Trp Asp 1075 1080 1085 Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln Ala Tyr Glu His Phe 1090 1095 1100 Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu 1105 1110 1115 1120 Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala 1125 1130 1135 Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg 1140 1145 1150 Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Glu Thr Pro Asn Leu 1155 1160 1165 Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp Ala Leu Lys Leu Asn 1170 1175 1180 Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe Phe Ile Gln Val Gln 1185 1190 1195 1200 Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Val Pro Gly Gly 1205 1210 1215 Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr His Tyr Thr 1220 1225 1230 Ile Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser Thr Thr Pro Leu Ser 1235 1240 1245 Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr Val 1250 1255 1260 Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr Pro Asp 1265 1270 1275 1280 Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Gln Val 1285 1290 1295 Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ser Met Glu 1300 1305 1310 Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr Val Thr Leu His Gly 1315 1320 1325 Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala Val Glu Val Val Thr 1330 1335 1340 Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Glu Val Gly Trp 1345 1350 1355 1360 Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His 1365 1370 1375 Phe Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn 1380 1385 1390 Leu Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu 1395 1400 1405 Ala Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr 1410 1415 1420 Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu 1425 1430 1435 1440 Ile Gly Asn Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro Glu Ser Phe Asn Leu 1445 1450 1455 Ser Trp Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr Phe Thr Ile Glu Ile 1460 1465 1470 Ile Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr Asn Ile Ser Gly 1475 1480 1485 Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Thr Asp Phe 1490 1495 1500 Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile Arg Thr Lys Thr Ile 1505 1510 1515 1520 Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu Asn Leu Thr 1525 1530 1535 Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr Gly Phe Thr Val Ser Trp Met Ala Ser 1540 1545 1550 Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe Leu Val Thr Val Val Asp Ser Gly Lys 1555 1560 1565 Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe Thr Leu Ser Gly Thr Gln Arg Lys Leu 1570 1575 1580 Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr Gly Ile Gly Tyr Glu Val Met Val Ser 1585 1590 1595 1600 Gly Phe Thr Gln Gly His Gln Thr Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val 1605 1610 1615 Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr 1620 1625 1630 Pro Asp Gly Phe Arg Leu Ser Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp 1635 1640 1645 Asn Phe Val Leu Lys Ile Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Leu 1650 1655 1660 Glu Ile Thr Leu Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg Asp Leu Thr Gly Leu 1665 1670 1675 1680 Arg Glu Ala Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly 1685 1690 1695 Arg Arg Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met Gly Ser 1700 1705 1710 Pro Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val 1715 1720 1725 Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr Tyr 1730 1735 1740 Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp Gly Thr 1745 1750 1755 1760 Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val Glu Tyr Leu 1765 1770 1775 Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro Val Ser 1780 1785 1790 Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser Gly Leu Val Thr Ala 1795 1800 1805 Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Arg Trp Gln Pro Ala Ile Ala 1810 1815 1820 Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile Ser Tyr Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu 1825 1830 1835 1840 Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly Asn Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp 1845 1850 1855 Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly 1860 1865 1870 Pro Gln Lys Ser Ser Thr Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp 1875 1880 1885 Ser 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Ser Val Gly Asp Ala Lys 2085 2090 2095 Thr Arg Tyr Lys Leu Lys Val Glu Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp 2100 2105 2110 Ser Met Ala Tyr His Asn Gly Arg Ser Phe Ser Thr Phe Asp Lys Asp 2115 2120 2125 Thr Asp Ser Ala Ile Thr Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe 2130 2135 2140 Trp Tyr Arg Asn Cys His Arg Val Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp 2145 2150 2155 2160 Asn Asn His Ser Gln Gly Val Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu 2165 2170 2175 His Ser Ile Gln Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg 2180 2185 2190 Asn Leu Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala 2195 2200 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> minor heparin-binding site <400> 3 Lys Glu Asp Lys 1 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer TN3F <400> 4 agccatatgg ctgttcctcc tcccactgac ctg 33 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer TN3R <400> 5 gccgaattca tgttgtgaag gtctc 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer TN4R <400> 6 ggaattcctc acttgggcgt gtccaac 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer TN5R <400> 7 tcgaattcta tgttcggtaa ttaat 25 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctgtgcagc aaaacaagga gagcaatc 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgctctcctt gttttgctgc acagcaga 28 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gacagccgag caaggcagac ac 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtctgccttg ctcggctgtc 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gacagccgag aaaggccgac ac 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtcggccttt ctcggctgtc 20

Claims (6)

1. 인간 테나신 C(human tenacin C)에서 유래한 헤파린-결합부위(heparin-binding site)를 포함하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체.
2. 제 1항에 있어서, 상기 헤파린 결합부위는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)의 결합부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체.
3. 제 1항에 있어서, 상기 헤파린-결합부위는 서열번호 3의 KEDK 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체.
4. 제 1항에 있어서, 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 5 (TNⅢ5)의 헤파린-결합부위와 함께 공동 기작(cooperative mechanism)에 의해 테나신-C의 헤파린-결합 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체.
5. 제 1항에 있어서, 테나신-C 타입 Ⅲ 도메인 5(TNⅢ5)에 대한 HSPG-의존성 세포 부착활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 그의 유도체.
6. 제 1항의 폴리펩타이드 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 세포부착 촉진용 약학 조성물.

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