KR102656470B1 - 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기 - Google Patents

질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기 Download PDF

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Abstract

질환을 치료하거나 예방하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직, 및 장기가 개시된다. 또한 유전적으로 변형된 세포 및 비인간 동물을 제조하는 방법이 개시된다.

Description

질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기{GENETICALLY MODIFIED CELLS, TISSUES, AND ORGANS FOR TREATING DISEASE}
상호 참조
본원은 2014년 12월 10일에 출원된 미국 가출원 제62/090,037호, 및 2015년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 제62/253,493호의 우선권을 주장하며, 이들 모두는 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있다.
서열 목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있다. 2015년 12월 10일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 47190-701.601_SL.txt로 명명되며 681,444 바이트 크기이다.
인간과 같은 수용자(recipient)에서 이식에 이용가능한 장기, 조직 또는 세포는 부족하다. 인간으로의 장기, 조직, 또는 세포의 이종이식 또는 동종이식은 이러한 요구를 충족시키고 매년 수십만 명의 사람들을 도울 가능성이 있다. 비인간 동물은 인간과의 해부학적 및 생리학적 유사성에 기초하여 장기 공여자(donor)로 선택될 수 있다. 또한, 이종이식은 인간뿐만 아니라 수의학 분야에도 영향을 미친다.
그러나, 변형되지 않은 야생형 비인간 동물 조직은 면역 체계에 의해 인간과 같은 수용자에 의해 거부될 수 있다. 거부반응은 적어도 어느 정도는 조직에 결합하는 항체 및 세포 매개성 면역에 의해 유발되어 이식편 손실을 야기하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 돼지 이식편은 적응 면역 세포에 의해 매개된 세포 기전에 의해 거부될 수 있다.
참조에 의한 통합
본원의 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 명시적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참고로 본원에 통합된다. 본원의 용어와 통합된 참고문헌 내의 용어가 상충하는 경우, 본원의 용어가 통제한다.
질환을 치료하거나 예방하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 또한, 유전적으로 변형된 세포 및 질환을 치료하거나 예방하기 위한 유전적으로 변형된 세포를 제조하는 방법이 개시된다. 또한, 유전적으로 변형된 비인간 동물 및 예컨대, 이후에 이들 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 세포, 조직, 또는 장기를 추출하고 이를 대상체에게 이식함으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법이 개시된다. 또한, 유전적으로 변형된 세포, 조직, 및 장기를 사용하여 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 개시된다. 또한, 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터의 세포, 조직, 및/또는 장기를 사용하여 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 개시된다.
일 양태에서, 하나 이상의 제1 유전자의 감소된 단백질 발현을 갖는 유전적으로 변형된 동물로서, 상기 유전적으로 변형된 동물은 로라시아상목(Laurasiatheria superorder)의 구성원이거나 또는 비인간 영장류이며, 상기 하나 이상의 제1 유전자는 a) 주조직적합성 복합체(MHC) I 특이적 인핸서좀(enhanceosome)의 성분, b) MHC I 결합 펩티드의 수송체, 및/또는 c) 보체 성분 3(C3)을 포함하고, 상기 감소된 단백질 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교되는, 유전적으로 변형된 동물이 본원에 개시된다. 일부 경우, 로라시아상목의 구성원은 유제류(ungulate)이다. 일부 경우, 유제류는 돼지이다. 일부 경우, 하나 이상의 제1 유전자의 단백질 발현은 유전적으로 변형된 동물에서 존재하지 않는다. 일부 경우, 단백질 발현의 감소는 하나 이상의 제1 유전자의 기능을 불활성화시킨다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 둘 이상의 제1 유전자의 감소된 단백질 발현을 갖는다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 MHC I 특이적 인핸서좀의 성분의 감소된 발현을 포함하며, 상기 MHC I 특이적 인핸서좀의 성분은 NOD 유사 수용체 패밀리 CARD 도메인 함유 5(NOD-like receptor family CARD domain containing 5; NLRC5)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 MHC I 결합 펩티드의 수송체의 감소된 발현을 포함하며, 상기 수송체는 항원 프로세싱과 관련된 수송체 1(transporter associated with antigen processing 1; TAP1)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 C3을 포함하는 감소된 발현을 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 셋 이상의 제1 유전자의 감소된 단백질 발현을 갖는다.
일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 하나 이상의 제2 유전자의 감소된 단백질 발현을 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 제2 유전자는: a) 자연 살해(NK) 그룹 2D 리간드, b) 인간에서 발현되지 않는 내인성 유전자, c) CXC 케모카인 수용체(CXCR) 3 리간드, 및/또는 d) MHC II 트랜스활성화인자(CIITA)를 포함하고, 상기 감소된 단백질 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교된다. 일부 경우, 하나 이상의 제2 유전자의 단백질 발현은 유전적으로 변형된 동물에서 존재하지 않는다. 일부 경우, 단백질 발현의 감소는 하나 이상의 제2 유전자의 기능을 불활성화시킨다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 NK 그룹 2D 리간드의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 NK 그룹 2D 리간드는 MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 A(MICA) 또는 MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 B(MICB)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 인간에서 발현되지 않는 내인성 유전자의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 인간에서 발현되지 않는 내인성 유전자는 당단백질 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1), 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH), 또는 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(B4GALNT2)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 CXCR3 리간드의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 CXCR3 리간드는 C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10)이다.
일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 하나 이상의 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 단백질은: a) MHC I 형성 억제자, b) 보체 활성화의 조절자, c) NK 세포에 대한 억제성 리간드, d) B7 패밀리 구성원, e) CD47, f) 세린 프로테아제 억제제, 및/또는 g) 갈렉틴을 포함한다. 일부 경우, 하나 이상의 단백질은 인간 단백질이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 MHC I 형성 억제자를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 MHC I 형성 억제자는 감염된 세포 단백질 47(ICP47)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 보체 활성화의 조절자를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 보체 활성화의 조절자는 분화 클러스터 46(CD46), 분화 클러스터 55(CD55), 또는 분화 클러스터 59(CD59)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 NK 세포에 대한 억제성 리간드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 NK 세포에 대한 억제성 리간드는 백혈구 항원 E(HLA-E), 인간 백혈구 항원 G(HLA-G), 또는 β-2-마이크로글로불린(B2M)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 HLA-G를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 HLA-G는 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7이다. 일부 경우, HLA-G는 HLA-G1이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 B7 패밀리 구성원을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 B7 패밀리 구성원은 프로그램된 사멸-리간드(programed death-ligand)이다. 일부 경우, 프로그램된 사멸-리간드는 프로그램된 사멸-리간드 1(programed death-ligand 1; PD-L1) 또는 프로그램된 사멸-리간드 2(programed death-ligand 2; PD-L2)이다. 일부 경우, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 PD-L1 및 PD-L2 둘 다를 코딩한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 세린 프로테아제 억제제를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 세린 프로테아제 억제제는 세린 프로테아제 억제제 9(serine protease inhibitor 9; Spi9)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 갈렉틴을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 갈렉틴은 갈렉틴-9이다.
일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은 NLRC5 또는 TAP1, C3의 감소된 단백질 발현, CXCL10, GGTA1, CMAH, 및/또는 B4GALNT2의 감소된 단백질 발현; 및/또는 HLA-G1, HLA-E, 또는 이의 기능적 단편, PD-L1 또는 이의 기능적 단편, PD-L2 또는 이의 기능적 단편, 및/또는 CD47 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터에 인접하여 삽입된다. 일부 경우, 유비쿼터스 프로모터는 Rosa26 프로모터이다. 일부 경우, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자의 프로모터에 인접하여 또는 표적화된 유전자 내에 삽입된다. 일부 경우, 표적화된 유전자는 제1 유전자 중 하나 또는 제2 유전자 중 하나이다. 일부 경우, 하나 이상의 제1 유전자의 단백질 발현은 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 감소된다. 일부 경우, 하나 이상의 제2 유전자의 단백질 발현은 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 감소된다.
또 다른 양태에서, 로라시아상목의 구성원이거나 또는 비인간 영장류인 유전적으로 변형된 동물로서, NK 세포에 대한 억제성 리간드 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드, 및 내인성 유전자의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 감소된 단백질 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교된 것인 유전적으로 변형된 동물이 본원에 개시된다. 일부 경우, NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-E 또는 HLA-G이다. 일부 경우, NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-G이며, 상기 HLA-G는 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7이다. 일부 경우, HLA-G는 HLA-G이다. 일부 경우, 내인성 유전자는 인간에서 발현되지 않는 유전자이다. 일부 경우, 내인성 유전자는 GGTA1, CMAH, 및/또는 B4GALNT2이다.
일부 경우, 유전적으로 변형된 동물은: a) PD-L1 또는 이의 기능적 단편, b) PD-L2 또는 이의 기능적 단편, 및/또는 c) CD47 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 경우, 외인성 폴리뉴클레오티드는 유비쿼터스 프로모터에 인접하여 삽입된다. 일부 경우, 유비쿼터스 프로모터는 Rosa26 프로모터이다. 일부 경우, 외인성 폴리뉴클레오티드는 내인성 유전자의 프로모터에 인접하여, 또는 내인성 유전자 내에 삽입된다. 일부 경우, 내인성 유전자의 단백질 발현은 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 감소된다.
본원에 개시된 둘 이상의 동물을 포함하는 유전적으로 변형된 동물의 집단이 본원에 추가로 개시된다. 일부 경우, 적어도 둘 이상의 동물은 동일한 표현형을 갖는다. 일부 경우, 적어도 둘 이상의 동물은 동일한 유전자형을 갖는다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 제1 유전자의 감소된 단백질 발현을 포함하는, 로라시아상목의 구성원 또는 비인간 영장류로부터의 유전적으로 변형된 세포로서, 상기 하나 이상의 제1 유전자는: a) MHC I 특이적 인핸서좀(enhanceosome)의 성분, b) MHC I 결합 펩티드의 수송체, 및/또는 c) C3을 포함하며, 상기 감소된 단백질 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 세포와 비교되는 유전적으로 변형된 세포가 본원에 개시된다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 MHC I 특이적 인핸서좀의 성분의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 MHC I 특이적 인핸서좀의 성분은 NLRC5이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 MHC I 결합 펩티드의 수송체의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 MHC I 결합 펩티드의 수송체는 TAP1이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 C3의 감소된 단백질 발현을 포함한다.
일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 제2 유전자의 감소된 단백질 발현을 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 제2 유전자는: a) NK 그룹 2D 리간드, b) 인간에서 발현되지 않는 내인성 유전자, c) CXCR3 리간드, 및/또는 d) CIITA를 포함하고, 상기 감소된 단백질 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 세포와 비교된다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 NK 그룹 2D 리간드의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 NK 그룹 2D 리간드는 MICA 및/또는 MICB이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 인간에서 발현되지 않는 내인성 유전자의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 인간에서 발현되지 않는 내인성 유전자는 GGTA1, CMAH, 및/또는 B4GALNT2이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 CXCR3 리간드의 감소된 단백질 발현을 포함하며, 상기 CXCR3 리간드는 CXCL10이다.
일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 단백질 또는 이의 기능적 단편은: MHC I 형성 억제자, 보체 활성화의 조절자, NK 세포에 대한 억제성 리간드, B7 패밀리 구성원, CD47, 세린 프로테아제 억제제, 및/또는 갈렉틴을 포함한다. 일부 경우, 하나 이상의 단백질 또는 이의 기능적 단편은 인간 단백질이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 MHC I 형성 억제자를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 MHC I 형성 억제자는 ICP47이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 보체 활성화의 조절자를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 보체 활성화의 조절자는 CD46, CD55, 및/또는 CD59이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 NK 세포에 대한 억제성 리간드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-E, HLA-G, 및/또는 B2M이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포에서 NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-G이고, HLA-G는 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 및/또는 HLA-G7이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 B7 패밀리 구성원을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 B7 패밀리 구성원은 프로그램된 사멸-리간드이다. 일부 경우, HLA-G는 HLA-G1이다. 일부 경우, 프로그램된 사멸-리간드는 프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1) 및/또는 프로그램된 사멸-리간드 2(PD-L2)이다. 일부 경우, 프로그램된 사멸-리간드는 PD-L1 및 PD-L2 모두이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 세린 프로테아제 억제제를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 세린 프로테아제 억제제는 세린 프로테아제 억제제 9(Spi9)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 갈렉틴을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 갈렉틴은 갈렉틴-9이다.
일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 NLRC5 또는 TAP1, C3, CXCL10, GGTA1, CMAH, 및/또는 B4GALNT2의 감소된 단백질 발현; 및/또는 i) HLA-G1, HLA-E, 또는 이의 기능적 단편, ii) PD-L1 또는 이의 기능적 단편, iii) PD-L2 또는 이의 기능적 단편, 및/또는 iv) CD47 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 유비쿼터스 프로모터에 인접하여 삽입된다. 일부 경우, 유비쿼터스 프로모터는 Rosa26 프로모터이다. 일부 경우, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자의 프로모터에 인접하여 또는 표적화된 유전자 내에 삽입된다. 일부 경우, 표적화된 유전자는 제1 유전자 중 하나 또는 제2 유전자 중 하나이다. 일부 경우, 하나 이상의 제1 유전자의 단백질 발현은 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 감소된다. 일부 경우, 하나 이상의 제2 유전자의 단백질 발현은 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 감소된다.
또 다른 양태에서, a) NK 세포에 대한 억제성 리간드 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 외인성 폴리펩티드, 및 b) 내인성 유전자의 감소된 단백질 발현을 포함하는, 로라시아상목의 구성원 또는 비인간 영장류로부터의 유전적으로 변형된 세포로서, 상기 감소된 단백질 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 세포와 비교되는 유전적으로 변형된 세포가 본원에 개시된다.
일부 경우, NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-E 또는 HLA-G이다. 일부 경우, NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-G이고, HLA-G는 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7이다. 일부 경우, HLA-G는 HLA-G1이다. 일부 경우, 내인성 유전자는 인간에서 발현되지 않는다. 일부 경우, 내인성 유전자는 GGTA1, CMAH, 및/또는 B4GALNT2이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는: a) PD-L1 또는 이의 기능적 단편, b) PD-L2 또는 이의 기능적 단편, 및/또는 c) CD47 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 경우, 외인성 폴리뉴클레오티드는 유비쿼터스 프로모터에 인접하여 삽입된다. 일부 경우, 유비쿼터스 프로모터는 Rosa26 프로모터이다. 일부 경우, 외인성 폴리뉴클레오티드는 내인성 유전자의 프로모터에 인접하여, 또는 내인성 유전자 내에 삽입된다. 일부 경우, 내인성 유전자의 단백질 발현은 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 감소된다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 췌장, 신장, 눈, 간, 소장, 폐, 또는 심장 세포이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 췌장 도세포이다. 일부 경우, 췌장 도세포는 췌장 β 세포이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 비장, 간, 말초 혈액, 림프절, 흉선, 또는 골수 세포이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 돼지 세포이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 발생 초기(embryotic) 조직, 비인간 태아 동물, 주산기(perinatal) 비인간 동물, 신생아 비인간 동물, 이유 전(preweaning) 비인간 동물, 어린 성체 비인간 동물, 또는 성체 비인간 동물 유래이다.
또 다른 양태에서, 세포, 조직 또는 장기를 이식하여 대상체에서 관용(tolerance)을 생성하는 데 사용하기에 적합한, 본원에 정의된 바와 같은 세포를 포함하는 주사용 조성물을 포함하는 백신이 본원에 또한 개시된다. 본원에 개시된 것은 또한 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 관용화 백신(tolerizing vaccine)을 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 세포자멸성 세포(apoptotic cell)이다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 고정된 세포이다. 일부 경우, 백신은 비고정된 세포를 추가로 포함한다. 일부 경우, 고정된 세포 및 비고정된 세포는 유전적으로 동일하다. 일부 경우, 고정된 세포는 화학물질에 의해 고정되고/거나 고정된 세포는 대상체에서 면역 세포의 아네르기(anergy)를 유도한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 1-에틸-3-(3-이메틸아미노프로필)카보디이미드(ECDI)로 고정된 세포이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조직 또는 장기가 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 췌장 또는 췌도가 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 병태를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 데 사용하기 위한 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기가 본원에 개시되며, 상기 대상체는 백신의 사용에 의해 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기에 대해 관용화된다. 일부 경우, 대상체에게 T 세포 활성화, B 세포 활성화, 및/또는 수지상 세포 활성화를 억제하는 하나 이상의 약학 제제가 투여된다.
또 다른 양태에서, a) 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포, 조직 또는 장기를 이식하는 단계; b) 대상체에게 본원에 기재된 백신을 투여하는 단계; 및/또는 c) T 세포 활성화, B 세포 활성화, 및/또는 수지상 세포 활성화를 억제하는 하나 이상의 약학 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, a) 백신을 대상체에게 투여하는 단계; 및 b) 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기를 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우, T 세포 활성화, B 세포 활성화, 및/또는 수지상 세포 활성화를 억제하는 하나 이상의 약학 제제가 대상체에게 투여된다. 일부 경우, 이식된 유전적으로 변형된 세포는 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포이다. 일부 경우, 백신은 본원에 기재된 백신이다. 일부 경우, 백신은 대상의 체중 kg당 0.001 내지 1.0 또는 약 0.001 내지 1.0의 내독소 단위를 포함한다. 일부 경우, 백신은 μl당 1 내지 10개 또는 약 1 내지 10개의 응집체를 포함한다. 일부 경우, 백신은 이식 7일 전 및 이식 1일 후에 투여된다. 일부 경우, 백신은 대상의 체중 kg당 적어도 1 x 108개 내지 4 x 108개 또는 약 1 x 108개 내지 4 x 108개 비장 세포 또는 비장 B 세포를 포함한다. 일부 경우, 비장 세포 또는 비장 B 세포는 80% 내지 100% 또는 약 80% 내지 100%의 CD21 양성 SLA 클래스 II 양성 B 세포를 포함한다. 일부 경우, 백신은 정맥내로 제공된다. 일부 경우, 이식된 세포, 조직, 또는 장기는 대상체에게 이식된 후 적어도 7일간 기능성이다. 일부 경우, 이식은 이종이식이다. 일부 경우, 약학 제제는 항-CD40 항체의 제1 용량을 포함한다. 일부 경우, 제1 용량은 이식 약 8일 전에 대상체에게 투여된다. 일부 경우, 제1 용량은 대상의 체중 kg당 30 mg 내지 70 mg 또는 약 30 mg 내지 70 mg의 항-CD40 항체를 포함한다. 일부 경우, 상기 방법은 대상체에게 하나 이상의 부가적인 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우, 하나 이상의 부가적인 면역억제제 B 세포 고갈 항체, mTOR 억제제, TNF-알파 억제제, IL-6 억제제, 보체 C3 또는 C5 억제제, 및/또는 질소 머스타드　알킬화제를 포함한다. 일부 경우, 부가적인 면역억제제 중 하나는 질소 머스타드　알킬화제이다. 일부 경우, 질소 머스타드　알킬화제 중 하나는 사이클로포스파미드이다. 일부 경우, 사이클로포스파미드는 백신의 투여 후 2일 또는 3일에 투여된다.
일부 경우, 사이클로포스파미드는 50 mg/kg/일 내지 60 mg/kg/일 또는 약 50 mg/kg/일 내지 60 mg/kg/일의 용량으로 투여된다. 일부 경우, 대상체는 인간 대상이다. 일부 경우, 대상체는 비인간 동물이다. 일부 경우, 비인간 동물은 고양이 또는 개이다. 일부 경우, 병태는 질환이다. 일부 경우, 질환은 당뇨병이다. 일부 경우, 당뇨병은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 수술 당뇨병(surgical diabetes), 낭포성 섬유증 관련 당뇨병, 및/또는 미토콘드리아 당뇨병이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 백신을 수용자에게 제공하는 것을 포함하는, 수용자를 이식편에 대해 면역관용화하는(immunotolerizing) 방법이 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포를 이식하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 병태를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포, 또는 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조직 또는 장기로서, 상기 대상체는 본원에 기재된 백신에 의해 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기에 대해 관용화되며, T 세포 활성화, B 세포 활성화, 및/또는 수지상 세포 활성화를 억제하는 하나 이상의 약학 제제가 대상체에게 투여되는, 유전적으로 변형된 세포가 본원에 제공된다. 일부 경우, 이식은 이종이식이다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 병태를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포, 또는 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조직 또는 장기가 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 수용자를 이식편에 대해 면역관용화하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 백신이 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, a) MHC I 특이적 인핸서좀(enhanceosome)의 성분, MHC I 결합 펩티드의 수송체, 및/또는 C3 중 하나 이상의 감소된 발현을 갖는 세포를 얻는 단계; b) 상기 세포로부터 배아를 발생시키는 단계; 및 c) 상기 배아를 유전적으로 변형된 동물로 성장시키는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 동물을 제조하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우, 세포는 접합자(zygote)이다.
또 다른 양태에서, a) MHC I 특이적 인핸서좀의 성분, MHC I 결합 펩티드의 수송체, 및/또는 C3 중 하나 이상의 감소된 발현을 갖는 제1 세포를 얻는 단계; b) 상기 제1 세포의 핵을 제2 세포에 이식하여 배아를 발생시키는 단계; 및 c) 상기 배아를 유전적으로 변형된 동물로 성장시키는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 동물을 제조하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우, 상기 감소는 유전자 편집(gene editing)에 의해 수행된다. 일부 경우, 유전자 편집은 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 수행된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 상세하게 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 MHC 클래스 I의 기능적 발현이 결여된 유전적으로 변형된 세포 및 장기 이식편의 사용을 중심으로 한 면역치료 전략을 나타낸다. 이식편 거부반응을 에방하는데 요구되는 유지 면역억제에 대한 필요성은, 유전적으로 변형된 세포 및 장기의 이식이 길항적 항-CD40 항체의 일시적인 사용과 조합될 때 그리고 더욱더 장기의 이식이 항-CD40 항체의 보호하에 세포자멸 공여자 세포를 포함하는 관용화 백신의 투여와 조합될 때 점진적으로 감소된다(또는 세포 및 장기 이종이식편의 이식 및 줄기 세포 유래 세포 동종이식편 및 이종이식편의 이식의 적용가능성이 점진적으로 증가됨).
도 2는 유전적으로 변형된 돼지 췌도 세포 및 관용화 백신을 제조하는 하나의 전략을 나타낸다. 돼지의 2개의 클론 집단을 생성한다. 적어도 GGTA1 넉아웃을 갖는 하나의 집단은 관용화 백신을 만드는데 사용될 수 있다. 적어도 GGTA1 및 MHC I 유전자(예컨대, NRLC5) 넉아웃을 갖는 돼지의 다른 클론 집단은 세포, 조직, 및/또는 장기 공여자를 위해 사용될 수 있다.
도 3은 양성 및 관용화 백신(음성 백신으로도 지칭됨)의 사용을 나타낸다.
도 4는 일시적인 면역억제의 보호하에 관용화 백신접종을 위한 세포자멸 공여자 비장 세포의 주입으로 대상체에서 이종이식편의 생존을 연장시키는 예시적인 접근법을 나타낸다.
도 5는 이종이식편 수용자의 만성적 및 전신 면역억제의 부재하에 수용자에서 이종이식편의 거부반응을 예방하고 생존을 연장하는 예시적인 접근법을 나타낸다. 이 예시적인 접근법은 3개의 성분을 포함하고 통합한다: i) αGal, MHC 클래스 I, 보체 C3, 및 CXCL10의 결핍되고/거나 감소된 발현 및 HLA-G의 형질전환 발현을 갖는 유전적으로 조작된 췌도; ii) αGal, Neu5Gc, 및 Sda/CAD의 결핍되고/거나 감소된 발현 뿐만 아니라 인간 CD47, 인간 PD-L1, 인간 PD-L2(예컨대, 유전적으로 조작된 백신)를 갖거나 갖지 않는 HLA-G의 형질전환 발현을 갖는 유전적으로 조작된 공여자 세포자멸 및 비세포자멸 단핵 세포(예컨대, 비장 세포); 및 iii) 길항적 항-CD40 mAb, 항-CD20 mAb, 라파마이신, 및 콤프스타틴(예컨대, 콤프스타틴 유도체 APL-2), 항-IL-6 수용체 mAb, 및 가용성 TNF 수용체를 포함하는 일시적인 항-염증 요법을 포함하는 일시적인 면역억제의 투여.
도 6은 돼지에서 사이노몰구스 원숭이로의 췌도 이종이식에서 이식 거부반응 예방을 위한 예시적인 프로토콜을 나타낸다. IE: 췌도수(islet equivalent); sTNFR: 가용성 TNF 수용체(예컨대, 에타너셉트); α-IL-6R: 항-인터루킨 6 수용체; Tx'd: 이식됨.
도 7A-7E는 GGTA1을 표적화하는 px330-Gal2-1 플라스미드의 클로닝 전략을 나타낸다. 도 7A는 GGTA1을 표적화하는 가이드 RNA를 제조하기 위한 클로닝 전략 및 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 7B는 px330 플라스미드 상의 삽입 부위를 나타낸다. 도 7C는 클로닝 및 확인 전략을 나타내는 순서도를 나타낸다. 도 7D는 클로닝 부위 및 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 도 7E는 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 8A-8E는 CMAH를 표적화하는 px330-CM1F 플라스미드를 클로닝하기 위한 전략을 나타낸다. 도 8A는 CMAH1을 표적화하는 가이드 RNA를 제조하기 위한 클로닝 전략 및 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 8B는 px330 플라스미드 상의 삽입 부위를 나타낸다. 도 8C는 클로닝 및 확인 전략을 나타내는 순서도를 나타낸다. 도 8D는 클로닝 부위 및 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 도 8E는 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 9A-9E는 NLRC5를 표적화하는 px330-NL1_FIRST 플라스미드를 클로닝하기 위한 전략을 입증한다. 도 9A는 NLRC5를 표적화하는 가이드 RNA를 제조하기 위한 클로닝 전략 및 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 9B 는 px330 플라스미드 상의 삽입 부위를 나타낸다. 도 9C는 클로닝 및 확인 전략을 나타내는 순서도를 나타낸다. 도 9D는 클로닝 부위 및 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 도 9E는 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 10A-10E는 C3을 표적화하는 px330/C3-5 플라스미드를 클로닝하기 위한 전략을 나타낸다. 도 10A는 C3을 표적화하는 가이드 RNA를 제조하기 위한 클로닝 전략 및 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 10B는 px330 플라스미드 상의 삽입 부위를 나타낸다. 도 10C는 클로닝 및 검증 전략을 나타내는 순서도를 나타낸다. 도 10D는 클로닝 부위 및 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 도 10E는 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 11A-11E는 B4GALNT2를 표적화하는 px330/B41_second 플라스미드를 클로닝하기 위한 전략을 나타낸다. 도 11A는 B4GALNT2를 표적화하는 가이드 RNA를 제조하기 위한 클로닝 전략 및 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 11B는 px330 플라스미드 상의 삽입 부위를 나타낸다. 도 11C는 클로닝 및 확인 전략을 나타내는 순서도를 나타낸다. 도 11D는 클로닝 부위 및 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 도 11E는 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 2에서 시퀀싱된 Rosa26 유전자좌의 지도를 나타낸다.
도 13A-13E는 Rosa26를 표적화하는 px330/Rosa 엑손 1 플라스미드를 클로닝하기 위한 전략을 나타낸다. 도 13A는 Rosa26를 표적화하는 가이드 RNA를 제조하기 위한 클로닝 전략 및 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 13B는 px330 플라스미드 상의 삽입 부위를 나타낸다. 도 13C는 클로닝 및 확인 전략을 나타내는 순서도를 나타낸다. 도 13D는 클로닝 부위 및 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 도 13E는 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 14A는 GGTA1의 지놈 서열의 지도를 나타낸다. 도 14B는 GGTA1의 cDNA 서열의 지도를 나타낸다.
도 15는 pSpCas9(BB)-2A-GFP로 형질감염된 돼지 태아 섬유아세포의 예시적인 현미경 사진을 나타낸다.
도 16은 염색체 1 상의 위치를 밝히는 특정 프로브에 의한 GGTA1 유전자에 대한 형광 제자리 혼성화(FISH)를 나타낸다.
도 17A-17B는 cas9/sgRNA-매개된 GGTA1/NLCR5 파괴를 갖는 세포의 표현형 선택의 예를 나타낸다. 도 17A는 알파-갈락토시다아제를 발현하지 않는 유전적으로 변형된 세포를 나타낸다. 도 17B는 알파-갈락토시다아제를 발현하고 이소렉틴 B4(IB)-연결된 철 비드로 표지된 유전적으로 변형되지 않은 세포를 나타낸다.
도 18A-18C는 돼지 세포에서 GGTA1, CMAH, 및 NLRC5 파괴의 확인을 나타낸다. 도 18A는 돼지 세포에서 GGTA1 파괴의 확인을 나타낸다. 도 18B는 돼지 세포에서 CMAH 파괴의 확인을 나타낸다. 도 18C는 돼지 세포에서 NLRC5 파괴의 확인을 나타낸다.
도 19A-19B는 돼지 췌도-유도된 인간 CD8+ T 세포 활성화에 대한 항-SLA 항체의 억제 효과를 나타낸다. 도 19A는 항-SLA 항체의 존재(검은색 막대) 또는 부재(흰색 막대)하에 7일간 성체 돼지 췌도와의 혼합된 배양에서 CD8+ T 세포, CD4 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 증식을 나타낸다. 도 19B는 항-SLA 클래스 I 항체의 존재(검은색 막대) 또는 부재(흰색 막대)하에 7일간 고도로 정제된 림프구와 함께 또는 없이 배양된 성체 돼지 췌도의 생존력(AO/PI 염색에 의해 평가됨)을 나타낸다.
도 20A-20B는 돼지 췌도에 의해 유도된 T 세포 활성화를 나타낸다. 도 20A는 ELISPOT 분석의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 사이노몰구스 원숭이에서 IFN-γ를 분비하는 직접 및 간접 특이성을 갖는 항-공여자 T 세포의 이식후 증가의 억제를 나타낸다. 원숭이는 항-CD40 단일클론 항체, 라파마이신, sTNFR, 및 항-IL-6R 단일클론 항체를 이용한 일시적인 면역억제의 보호 하에 0일에 GT-KO 공여자 돼지로부터의 세포자멸 공여자 비장 세포 및 동일한 공여자 돼지로부터 췌도의 주변이식 융합으로 처리되었다. 도 20B는 이식 후 141일에 거부반응을 겪는 문맥내로 이식된 성체 돼지 췌도의 CD8 염색을 입증한다.
도 21A-21D는 유지 면역억제의 부재하에 원숭이에서 돼지 췌도 이식편 생존을 나타낸다. 도 21A는 혈당 수준 및 이식 전 및 후에 정상 혈당 수준을 유지하는데 필요한 외인성 인슐린을 나타낸다. 도 21B는 원숭이에서 혈청 돼지 C-펩티드 수준을 나타낸다. 도 21C는 글루코스 챌린지에 대한 반응으로 혈당 수준을 나타낸다. 도 21D는 글루코스 챌린지에 대한 반응으로 혈청 돼지 C-펩티드 수준을 나타낸다.
도 22A는 췌도로 이식되고 이식 후 14일까지 항-CD40 항체를 4회 받고 CTLA4-Ig 및 라파마이신을 이용한 유지 면역억제를 받은 원숭이에 의한 유전적으로 변형되지 않은 돼지 췌도의 거부반응을 나타낸다. 도 22B는 이식 후 14일까지 항-CD40 항체를 4회 받고 CTLA4-Ig 및 라파마이신을 이용한 유지 면역억제를 받은 원숭이에서 이식된 돼지 췌도에 의한 당뇨병의 개선을 나타낸다.
도 23A는 이식 후 매주 라파마이신 및 항-CD40 항체를 이용한 유지 면역억제를 받은 원숭이(ID #13CP7)에서 이식된 돼지 췌도에 의한 당뇨병의 개선(지속적인 정상혈당 및 인슐린 비의존성의 복원)을 나타낸다. 원숭이에게 이식일부터 21일간 항-CD40 항체 및 라파마이신을 제공하였다. 도 23B는 동일한 수용자(ID #13CP7)에서 혈청 돼지 C-펩티드 수준(공복, 무작위, 자극)을 입증한다.
도 24는 기준선과 비교하여 희생시에(추정된 거부반응 후) 2마리의 사이노몰구스 원숭이에서 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 증가 및 희생시에 간 단핵 세포에서 CD8+ T 세포 구획 내의 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 높은 우세(prevalance)를 나타낸다. 두 원숭이는 성체 돼지 췌도의 문맥내 이종이식편을 받았다. Pre Tx: 이식 전; PBL: 말초 혈액 백혈구; Sac: 희생; Lym: 림프구; LMNC: 간 단핵 세포.
도 25는 동일한 일시적인 면역억제를 받았지만 세포자멸 공여자 비장 세포를 받지 않은 대조군(MX-ECDI-대조군)과 비교하여, 세포자멸 공여자 비장 세포(MX-ECDI-백신)의 주변이식 주입에 의한 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 억제를 나타낸다. Pre Tx: 이식 전; Sac: 희생; Lym: 림프구; LMNC: 간 단핵 세포.
도 26은 세포자멸 공여자 비장 세포 및 α-CD40 항체에 의한 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 억제를 나타낸다. CM: 사이노몰구스 원숭이; Pre Tx: 이식 전; D: 일.
도 27은 세포자멸 공여자 비장 세포 및 α-CD40 항체에 의한 순환하는 CD4+CD25hi FoxP3+ CD127low 조절성 T 세포의 억제를 나타낸다. CM: 사이노몰구스 원숭이; Pre Tx: 이식 전; D: 일.
도 28은 세포자멸 공여자 비장 세포 및 α-CD40 항체에 의한 순환하는 CD8+CD122+ 천연 억제자 세포의 억제를 나타낸다. CM: 사이노몰구스 원숭이; Pre Tx: 이식 전; D: 일.
도 29A-29B는 GGTA1(서스 스크로파(Sus scrofa) 품종 혼합 염색체 1, Sscrofa10.2 NCBI 참조 서열: NC_010443.4과 비교하여) 표적 영역이 PCR 증폭된 2개의 별개의 한배(임신 1: 도 29A 또는 임신 2: 도 29B)의 태아 세포로부터 단리된 DNA의 시퀀싱을 나타내며, 수득된 앰플리콘은 1% 아가로스 겔 상에서 분리되었다. 앰플리콘을 또한 각 반응으로부터 정방향 프라이머만을 사용하여 생거 시퀀싱에 의해 분석하였다. 도 29A에, GGTA1에 대한 표적 부위 후 6개의 뉴클레오티드가 절단된 임신 1의 태아 1, 2, 4, 5, 6, 및 7로부터의 결과가 나타나 있다. 태아 3은 절단 부위 이후에 17개의 뉴클레오티드가 절단된 다음 2,511(668-3179) 뉴클레오티드 결실이 이어진 다음, 단일 염기 치환이 뒤따른다. 표적 유전자의 두 복제본으로부터의 대립유전자를 함유하는 단일 시퀀싱 실험으로부터의 절단, 결실 및 치환은 단지 유전자 변형이 일어났음을 시사할 수 있지만 각 대립유전자에 대한 정확한 서열을 밝힐 수 없다. 이 분석으로부터, 7마리의 태아 모두는 GGTA1에 대한 단일 대립유전자 변형을 갖는 것으로 보인다. 도 29B는 임신 2 태아 DNA 샘플 1, 3, 4, 및 5가 GGTA1 유전자 표적 부위로부터 3개의 뉴클레오티드가 절단되었음을 보여준다. 태아 2는 생거 시퀀싱에서 변이성을 가지고 있었는데, 이는 DNA 돌연변이의 복잡한 변이성 또는 불량한 샘플 품질을 시사한다. 그러나, 태아 DNA 주형 품질은 상기 기재된 GGTA1 유전자 스크리닝 실험의 생성에 충분하였다.
도 30A-30B는 NLRC5(공통 서열) 표적 영역이 PCR 증폭된 2개의 별개의 한배(임신 1: 도 30A 또는 임신 2: 도 30B)의 태아 세포로부터 단리된 DNA의 시퀀싱을 나타내며, 수득된 앰플리콘을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 앰플리콘을 또한 각 반응으로부터 정방향 프라이머만을 사용하여 생거 시퀀싱에 의해 분석하였다. 임신 1(도 30A)로부터의 태아에 대한 NLRC5 표적 부위의 서열 분석은 일관된 정렬을 나타낼 수 없었는데, 이는 시퀀싱 반응에서 알려지지 않은 문제 또는 생거 시퀀싱 반응 및 분석을 복잡하게 만드는 NLRC5 대립유전자 사이의 다양한 DNA 변형을 시사한다. 임신 2(도 30B)로부터의 NLRC5 유전자 앰플리콘은 모두 NLRC5 유전자 절단 부위의 다운스트림에 있는 120개의 뉴클레오티드가 절단되었다.
도 31A-31B는 뒷다리 생검으로부터 단리된 태아 DNA(wt 및 1-7(도 31A: 임신 1) 또는 1-5(도 31B: 임신 2)로부터의 데이터를 나타낸다. 표적 유전자를 PCR에 의해 증폭하였고, PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고 형광 DNA 염색에 의해 시각화하였다. wt 레인에 존재하는 앰플리콘 밴드는 변형되지 않은 DNA 서열을 나타낸다. 앰플리콘 크기의 증가 또는 감소는 앰플리콘 내에서의 삽입 또는 결실을 각각 시사한다. 하나의 샘플에서 대립유전자 간의 DNA 변형의 편차는 밴드를 더 확산되어 보이게 할 수 있다. 임신 1(도 31A)은 7마리의 태아를 야기한 반면, 임신 2(도 31B)는 45 및 43일에 각각 5마리의 태아를 야기하였다. 도 31A(하부 겔)의 태아 1, 3, 및 4에서 NLRC5 겔에서와 같이 밴드의 결핍은 표적 영역의 변형이 DNA 증폭 프라이머의 결합을 파괴하였음을 시사한다. 도 31A(상부 겔)에서 GGTA 1에서의 모든 밴드의 존재는 DNA 품질이 NLRC5를 표적으로 하는 PCR 반응에서 DNA 앰플리콘을 생성하는데 충분하였음을 시사한다. 임신 1의 태아 1 ,2, 4, 및 5(도 31A)는 WT보다 더 큰 GGTA 1 앰플리콘을 가지는데, 이는 표적 지역 내에서의 삽입을 시사한다. 임신 1의 태아 3에서(도 31A), GGTA 1 앰플리콘은 WT 대조군보다 더 빠르게 이동하였는데, 이는 표적 지역 내에서의 결실을 시사한다. 임신 1의 태아 6 및 7(도 31A) NLRC5 앰플리콘은 WT보다 더 빠르게 이동하였는데, 이는 표적 지역 내에서의 결실을 시사한다. 태아 1-5(도 31B) GGTA1 앰플리콘은 크기에 의해 해석하기 어려웠으며 WT 대조군에 비해 확산되었다. 태아 1-5(도 31B) NLRC5 앰플리콘은 야생형 대조군에 비해 크기 및 밀도가 균일하였다.
도 32A-32B는 돼지의 2개의 별개의 한배로부터의 태아의 표현형 분석을 나타낸다(도 32A: 임신 1 또는 도 32B: 임신 2). 태아를 45일(임신 1) 또는 43일(임신 2)에 채취하고 DNA 및 배양 세포 단리를 위해 가공하였다. 조직 단편 및 세포를 배양 배지에 2일간 도말하여 태아 세포를 부착시키고 성장시켰다. 야생형 세포(유전적으로 변형되지 않은 태아 세포) 및 임신 1 및 2로부터의 태아 세포를 배양 플레이트에서 제거하고 알렉사 플루오르 488에 접합된 IB4 렉틴 또는 FITC에 접합된 항-돼지 MHC 클래스 I 항체로 표지하였다. 유세포 분석은 시험된 세포의 표지 강도를 묘사하는 막대 그래프로서 표시된다. WT 세포의 막대 그래프가 태아 세포의 각 그룹의 전체 강도의 감소를 강조하기 위해 각 패널에 포함되어 있다. 피크 강도의 감소로 표시된 임신 1(도 32A)에서 알파 Gal 및 MHC 클래스 I 표지의 감소가 있다. 임신 2(도 32B)에서 태아 1 및 3은 WT 태아 세포와 비교하여 알파 gal 표지의 큰 감소 및 MHC 클래스 1 표지의 유의한 감소를 갖는다.
도 33A-33B는 유전적 클론으로부터의 야생형 태아 세포와 비교하여 태아 3(임신 1)으로부터의 세포에서 감소된 MHC 클래스 I 발현의 영향을 나타낸다. 돼지 대조군 섬유아세포 및 NLRC5 넉아웃 태아 세포에 대한 인간 CD8+ 세포 및 CD4 T 세포의 증식 반응을 측정하였다. 도 33A. 세포를 증식의 평가 전에 CD4 또는 CD8로서 게이팅(gating)하였다. 도 33B. CD8 T 세포 증식은 대조군 변형되지 않은 돼지 섬유아세포와 비교하여 돼지 태아 GGTA1/NLRC5 넉아웃 세포의 치료 자극 후 감소되었다. 인간 반응자(responder)를 1:1 비율로 돼지 태아 GGTA1/NLRC5 넉아웃 세포로 처리한 경우, CD8 T 세포 증식의 거의 55% 감소가 관찰되었다. 야생형 태아 세포는 인간 CD8 T 세포에서 17.2% 증식을 유발한 반면, 태아 3(임신 1)으로부터의 MHC 클래스 I 결핍 세포는 단지 7.6% 증식을 유도하였다. 변형되지 않은 태아 세포와 비교하여 1:5 및 1:10 비율에서 CD8 T 세포 증식 반응에서 차이가 관찰되지 않았다. 연구된 모든 비율에서 NLRC5 넉아웃 및 대조군 변형되지 않은 돼지 태아 세포에 반응한 CD4 T 세포 증식에서 변화가 관찰되지 않았다.
하기 설명 및 실시예는 본 발명의 구현예를 상세히 예시한다. 본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예에 한정되는 것이 아니라 이는 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 본 발명의 범주 내에 포함되는 본 발명의 많은 변화 및 변형이 있음을 인식할 것이다.
장기 및 조직 기능의 부전은 개체의 조기 사망을 야기할 수 있다. 이식은 잠재적으로 이 문제를 해결할 수 있고, 이는 많은 개체의 생명을 연장시킬 수 있다. 그러나, 이식에 사용될 수 있는 세포, 장기, 및/또는 조직은 부족하다.
이종이식편 또는 동종이식편(예컨대, 배아 또는 유도 만능 줄기 세포)은 이식에 사용되는 세포, 장기, 및/또는 조직을 무제한으로 공급하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 일부 이식은 면역 반응 증가를 가져와 결국 이식 거부반응을 초래할 수 있다. 동계이식편(isograft) 또는 자가이식편은 전형적으로 거부반응을 일으키지 않는다. 그러나, 동종이식 및 이종이식은 면역 반응을 일으켜 결국 이식편을 파괴시킬 수 있다. 일부 경우, 거부반응의 위험성은 면역 반응을 억제함으로써 완화될 수 있다.
전통적으로, 면역억제 약물은 이식 후에 사용되었다. 그러나, 면역억제 약물의 장기간 치료와 관련된 많은 해로운 효과가 있으며, 이는 비제한적으로 암 및 감염의 위험성 증가를 포함한다. 이식편 거부반응을 예방하고 면역 체계를 억제하는 대체 방법이 요구되었다. 면역 반응은 본원에 기재된 것을 포함한 다양한 기술을 사용하여 완화될 수 있다. 예를 들어, 최소한의 면역억제 약물 사용으로 또는 사용없이 이식 거부반응을 방지하거나 이식 거부반응 시간을 연장하기 위한 본원에 기재된 방법의 경우, 동물, 예컨대 공여자 비인간 동물은, 예컨대 유전적으로 변경될 수 있다. 이어서, 상기 변경된 동물, 예컨대, 공여자 비인간 동물의 세포, 장기, 및/또는 조직은 채취되어 동종이식편 또는 이종이식편에 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 동물, 예컨대, 인간 또는 비인간 동물로부터 추출될 수 있거나(비제한적으로 일차 세포를 포함함) 또는 세포는 이전에 추출된 동물 세포, 예컨대, 세포주일 수 있다. 이들 세포는 유전적으로 변경된 세포를 만드는데 사용될 수 있다.
이식 거부반응(예컨대, T 세포-매개된 이식 거부반응)은 만성 면역억제에 의해 예방될 수 있다. 그러나, 면역억제는 비용이 많이 들고 심각한 부작용의 위험과 연관되어 있다. 만성 면역억제의 필요성을 회피하기 위해,
i) MHC 클래스 I의 기능적 발현이 결여된 유전적으로 변형된 이식편을 이용하여, 직접적인 특이성을 갖는 CD8+ T 세포의 활성화를 방해하고 이들 CD8+ T 세포의 세포용해 이펙터 기능을 방해하며,
ii) 길항적 항-CD40 mAb(및 고갈 항-CD20 mAb 및 mTOR 억제제)를 포함하는 유도 면역요법을 사용하여 항-공여자 T 세포의 B 세포(및 다른 APC)-매개된 프라이밍 및 기억 생성을 방해하고, 및/또는
iii) 세포자멸 공여자 세포 백신의 주변이식 주입을 통해 간접적인 특이성을 갖는 항-공여자 T 세포를 결실시키는
다방면의 T 세포-표적화된 거부반응 예방이 개발되었다(도 1).
유전적으로 변형된 비인간 동물(예컨대, 비인간 영장류 또는 로라시아상목, 예컨대, 유제류의 구성원인 유전적으로 변형된 동물) 및 이로부터 단리된 장기, 조직, 또는 세포, 관용화 백신, 및 비인간 동물로부터 단리된 장기, 조직, 또는 세포의 이식에 의해 이를 필요로 하는 수용자에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 기재된다. 비인간 동물로부터 단리된 장기, 조직, 또는 세포(예컨대, 비인간 영장류 또는 로라시아상목, 예컨대, 유제류의 구성원인 유전적으로 변형된 동물)는 동일한 종(동종이식) 또는 상이한 종(이종이식)으로부터 이를 필요로 하는 수용자에게 이식될 수 있다. 수용자는 관용화 백신 및/또는 하나 이상의 면역조절제(예컨대, 항체)로 관용화될 수 있다. 이종이식을 포함하는 구현예에서, 수용자는 인간일 수 있다. 치료될 수 있는 적합한 질환은 수용자의 장기, 조직, 또는 세포가 결함이 있거나 손상된(예컨대, 심장, 폐, 간, 정맥, 피부, 또는 췌장 도세포) 어느 질환일 수 있으며, 수용자는 비인간 동물로부터 단리된 장기, 조직, 또는 세포의 이식에 의해 치료될 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같이 참조 수치 및 그의 문법적 등가물과 관련된 용어 "약"은 상기 수치 자체 및 상기 수치로부터 ± 10%의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 양 "약 10"은 10 및 9 내지 11의 임의의 양을 포함한다. 예를 들어, 참조 수치와 관련된 용어 "약"은 또한 상기 수치로부터 ± 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 값의 범위를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "비인간 동물" 및 그의 문법적 등가물은 비인간 포유동물을 포함한 인간 이외의 모든 동물 종을 포함하며, 이는 천연 동물 또는 유전적으로 변형된 비인간 동물일 수 있다. 비인간 포유동물은, 유제류, 예컨대 짝수 발굽(even-toed) 유제류(예컨대, 돼지, 페커리, 하마, 낙타, 라마, 아기사슴(chevrotain, mouse deer), 사슴, 기린, 가지뿔영양(pronghorn), 영양, 염소-영양(양, 염소 등을 포함함), 또는 소) 또는 홀수 발굽(odd-toed) 유제류(예컨대, 말, 테이퍼(tapir), 및 코뿔소), 비인간 영장류(예컨대, 원숭이, 또는 침팬지), 개과(Canidae)(예컨대, 개) 또는 고양이를 포함한다. 비인간 동물은 로라시아상목(Laurasiatheria superorder)의 구성원일 수 있다. 로라시아상목은 문헌[Waddell et al., Towards Resolving the Interordinal Relationships of Placental Mammals. Systematic Biology 48 (1): 1-5 (1999)]에 기재된 바와 같은 포유동물의 그룹을 포함할 수 있다. 로라시아상목의 구성원은 식충목(Eulipotyphla)(고슴도치, 뾰족뒤쥐(shrew), 및 두더지), 말목(Perissodactyla)(코뿔소, 말, 및 테이퍼(tapir)), 육식목(Carnivora)(육식동물), 경우제목(Cetartiodactyla)(우제류 및 고래목), 익수목(Chiroptera)(박쥐), 및 유린목(Pholidota)(천산갑(pangolin))을 포함할 수 있다. 로라시아상목의 구성원은 본원에 기재된 유제류, 예컨대, 홀수 발굽 유제류 또는 짝수 발굽 유제류일 수 있다. 유제류는 돼지일 수 있다. 구성원은 육식동물의 구성원, 예컨대 고양이, 또는 개일 수 있다. 일부 경우, 로라시아상목의 구성원은 돼지일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "돼지" 및 그의 문법적 등가물은 짝수 발굽 유제류의 수이대(Suidae) 패밀리 내의 속 서스(Sus)의 동물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 돼지는 야생 돼지, 가축용 돼지, 미니 돼지, 서스 스크로파(Sus scrofa) 돼지, 서스 스크로파 도메스티쿠스(Sus scrofa domesticus) 돼지, 또는 근친교배(inbred) 돼지일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "전이유전자(transgene)" 및 그의 문법적 등가물은 유기체 내로 전달될 수 있는 유전자 또는 유전적 물질을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 유기체 내로 도입되는 유전자를 함유하는 DNA의 구간(stretch) 또는 부분(segment)일 수 있다. 전이유전자가 유기체 내로 이식되면, 상기 유기체는 형질전환(transgenic) 유기체로 지칭될 수 있다. 전이유전자는 형질전환 유기체에서 RNA 또는 폴리펩티드(예컨대, 단백질)를 생산하는 능력을 보유할 수 있다. 전이유전자는 단백질 또는 이의 단편(예컨대, 기능적 단편)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전이유전자의 폴리뉴클레오티드는 외인성 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 단백질의 단편(예컨대, 기능적 단편)은 단백질의 아미노산 서열의 적어도 또는 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%를 포함할 수 있다. 단백질의 단편은 단백질의 기능적 단편일 수 있다. 단백질의 기능적 단편은 단백질의 기능의 일부 또는 모두를 보유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전적 변형" 및 그의 문법적 등가물은 핵산, 예컨대, 유기체의 지놈 내의 핵산의 하나 이상의 변경을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전적 변형은 유전자의 변경, 부가, 및/또는 결실을 지칭할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한 부가, 결실 및/또는 변경된 유전자를 갖는 세포를 지칭할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터의 유전적으로 변형된 세포는 이러한 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 단리된 세포일 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터의 유전적으로 변형된 세포는 이러한 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 비롯된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포
본원에 사용된 바와 같이 용어 "췌도(islet)" 또는 "췌도 세포(islet cell)" 및 이들의 문법적 등가물은 유기체의 췌장에 존재하는 내분비(예컨대, 호르몬 생산) 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 췌도 세포는, 비제한적으로, 췌장 α 세포, 췌장 β 세포, 췌장 δ 세포, 췌장 F 세포, 및/또는 췌장 ε 세포를 포함하는, 상이한 유형의 세포를 포함할 수 있다. 췌도 세포는 또한 세포의 그룹, 세포 클러스터 등을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "병태" 상태 및 그의 문법적 등가물은 질환, 사건, 또는 건강 상태의 변화를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "당뇨병" 및 그의 문법적 등가물은 연장된 기간 동안 높은 혈당 수준을 특징으로 하는 질환을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "당뇨병" 및 그의 문법적 등가물은 비제한적으로, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 낭포성 섬유증 관련(cystic fibrosis-related) 당뇨병, 수술 당뇨병, 임신 당뇨병, 및 미토콘드리아 당뇨병을 포함하는, 모든 또는 임의의 유형의 당뇨병을 지칭할 수 있다. 일부 경우, 당뇨병은 유전적 당뇨병의 한 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "표현형" 및 그의 문법적 등가물은 그의 형태, 발달, 생화학적 또는 생리학적 특성, 생물계절학(phenology), 행동, 및 행동 산물과 같이 유기체의 관찰가능한 특징 또는 형질의 복합을 지칭할 수 있다. 문맥에 따라, 용어 "표현형"은 때로는 집단의 관찰 가능한 특징 또는 형질의 복합을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "파괴하는" 및 그의 문법적 등가물은, 예컨대, 결실, 삽입, 돌연변이, 재배열, 또는 이의 임의의 조합에 의해, 유전자를 변경시키는 과정을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전자는 넉아웃(knockout)에 의해 파괴될 수 있다. 유전자를 파괴하는 것은 유전자의 발현(예컨대, mRNA 및/또는 단백질 발현)을 부분적으로 감소시키거나 완전히 억제하는 것일 수 있다. 파괴는 또한 shRNA, siRNA, microRNA, 우성 음성, 또는 유전자 또는 단백질의 기능성 또는 발현을 억제하는 임의의 다른 수단과 같은, 억제 기술을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자 편집(gene editing)" 및 그의 문법적 등가물은 하나 이상의 뉴클레오티드가 삽입되거나, 대체되거나, 또는 지놈으로부터 제거되는 유전적 조작을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집은 뉴클레아제(예컨대, 자연적으로 존재하는 뉴클레아제 또는 인공적으로 조작된 뉴클레아제)를 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "이식 거부반응(transplant rejection)" 및 그의 문법적 등가물은 이식된 물질(예컨대, 세포, 조직, 및/또는 장기)의 기능을 손상시키거나 파괴하는데 충분할 정도로 장기 이식 수용자의 면역 반응이 이식된 물질에 대해 반응을 일으키는 과정 또는 과정들을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "초급성 거부반응(hyperacute rejection)" 및 그의 문법적 등가물은 이식 후 처음 24시간 이내에 발생하거나 시작되는 이식된 물질 또는 조직의 거부반응을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 초급성 거부반응은 "급성 체액성 거부반응(acute humoral rejection)" 및 "항체 매개성된 거부반응(antibody-mediated rejection)"을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "음성 백신(negative vaccine)", "관용화 백신(tolerizing vaccine)" 및 이의 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 관용화 백신은 적절한 면역요법의 보호(cover)하에 사용되는 경우 수용자를 이식편에 대해 관용화하거나 이식편에 대한 수용자의 관용화에 기여할 수 있다. 이것은 이식 거부반응을 예방하는 것을 도울 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "수용자(recipient)", "대상체" 및 이의 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 수용자 또는 대상체는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 수용자 또는 대상체는 이식편, 관용화 백신, 및/또는 본원에 개시된 다른 조성물을 받을, 받고 있는, 또는 받은 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 수용자 또는 대상체는 또한 이식편, 관용화 백신 및/또는 본원에 개시된 다른 조성물을 필요로 할 수 있다. 일부 경우, 수용자는 이식편을 받을, 받고 있는, 또는 받은 인간 또는 비인간 동물일 수 있다.
명세서 전반에 개시된 일부 수치는, 예를 들어, "X는 적어도 또는 적어도 약 100; 또는 200[또는 임의의 숫자]이다"로서 언급된다. 이 수치는 상기 숫자 자체 및 하기 모두를 포함한다:
i) X는 적어도 100이다;
ii) X는 적어도 200이다;
iii) X는 적어도 약 100이다; 및
iv) X는 적어도 약 200이다.
이러한 상이한 조합 모두는 명세서 전반에 개시된 수치에 의해 고려된다. 개시된 모든 수치는, 달리 명시적으로 표시되지 않는 한, 그것이 치료제의 투여를 언급하든지 간에 또는 일, 월, 년, 중량, 투여량 등을 언급하든지 간에 이러한 방식으로 해석되어야 한다.
명세서 전반에 개시된 범위는 때로는, 예를 들어, "X는 1일 내지 2일, 또는 약 1일 내지 2일; 또는 2일 내지 3일, 또는 약 2일 내지 3일 [또는 임의의 수치 범위]에 투여된다"로서 언급된다. 이 범위는 상기 수 자체(예컨대, 상기 범위의 종료점) 및 하기 전부를 포함한다:
i) X는 1일 및 2일 사이에 투여됨;
ii) X는 2일 및 3일 사이에 투여됨;
iii) X는 약 1일 및 2일 사이에 투여됨;
iv) X는 약 2일 및 3일 사이에 투여됨;
v) X는 1일 및 약 2일 사이에 투여됨;
vi) X는 2일 및 약 3일 사이에 투여됨;
vii) X는 약 1일 및 약 2일 사이에 투여됨; 및
viii) X는 약 2일 및 약 3일 사이에 투여됨.
이러한 상이한 조합 모두는 명세서 전반에 개시된 범위에 의해 고려된다. 개시된 모든 범위는, 달리 명시적으로 표시되지 않는 한, 그것이 치료제의 투여를 언급하든지 간에 또는 일, 월, 년, 중량, 투여량 등을 언급하든지 간에 이러한 방식으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "및/또는" 및 "이의 임의의 조합" 및 이의 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어는 임의의 조합이 명시적으로 고려된다는 것을 의미할 수 있다. 단지 예시적인 목적으로, 하기 문구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이의 임의의 조합"은 "개별적으로 A; 개별적으로 B; 개별적으로 C; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 및 A, B, 및 C"를 의미할 수 있다.
I. 유전적으로 변형된 비인간 동물
이식용 세포, 조직, 및/또는 장기의 공여자일 수 있는 유전적으로 변형된 동물이 본원에 제공된다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 임의의 원하는 종일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물은 유전적으로 변형된 비인간 포유동물일 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 포유동물은 유전적으로 변형된 짝수 발굽 유제류(예컨대, 돼지, 페커리, 하마, 낙타, 라마, 아기사슴(chevrotain, mouse deer), 사슴, 기린, 가지뿔영양(pronghorn), 영양, 염소-영양(양, 염소 등을 포함함), 또는 소) 또는 유전적으로 변형된 홀수 발굽(odd-toed) 유제류(예컨대, 말, 테이퍼(tapir), 및 코뿔소), 유전적으로 변형된 비인간 영장류(예컨대, 원숭이, 또는 침팬지) 또는 유전적으로 변형된 개과(Canidae)(예컨대, 개)를 포함하는, 유전적으로 변형된 유제류일 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 로라시아상목의 구성원일 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이, 또는 침팬지일 수 있다. 비인간 동물이 돼지인 경우, 돼지는 적어도 또는 적어도 약 5, 50, 100, 또는 300 파운드일 수 있고, 예컨대, 돼지는 5 파운드 내지 50 파운드; 25 파운드 내지 100 파운드; 또는 75 파운드 내지 300 파운드 또는 약 5 파운드 내지 50 파운드; 25 파운드 내지 100 파운드; 또는 75 파운드 내지 300 파운드일 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물은 적어도 한 번 출산한 돼지이다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 임의의 연령일 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 태아; 1일 내지 1개월 또는 약 1일 내지 1개월; 1개월 내지 3개월 또는 약 1개월 내지 3개월; 3개월 내지 6개월 또는 약 3개월 내지 6개월; 6개월 내지 9개월 또는 약 6개월 내지 9개월; 9개월 내지 1년 또는 약 9개월 내지 1년; 1년 내지 2년 또는 약 1년 내지 2년일 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 비인간 태아 동물, 주산기(perinatal) 비인간 동물, 신생아 비인간 동물, 이유 전(preweaning) 비인간 동물, 어린 성체 비인간 동물, 또는 성체 비인간 동물일 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교하여 하나 이상의 유전자의 감소된 발현을 포함할 수 있다. 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물은 유전적으로 변형된 동물과 실질적으로 동일하지만 지놈 내에 유전적 변형이 없는 동물일 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물은 유전적으로 변형된 동물과 동일한 종의 야생형 동물일 수 있다. 비인간 동물은 이를 필요로 하는 수용자 또는 대상체에게 이식하기 위한 세포, 조직 또는 장기를 제공할 수 있다. 이를 필요로 하는 수용자 또는 대상체는 병태를 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 수용자 또는 대상일 수 있다. 병태는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료되거나, 예방되거나, 감소되거나, 제거되거나, 또는 증가될 수 있다. 수용자는 이식된 세포, 조직 또는 장기에 대해 낮은 면역반응을 나타내거나 면역반응을 나타내지 않을 수 있다. 이식된 세포, 조직 또는 장기는 수용자(예컨대, 인간 또는 또 다른 동물)의 CD8+ T 세포, NK 세포, 또는 CD4+ T 세포에 의해 인식되지 않을 수 있다. 발현이 감소된 유전자는 MHC 분자, MHC 분자 발현의 조절자, 및 공여자 비인간 동물 및 수용자(예컨대, 인간 또는 또 다른 동물) 사이에 구별하여 발현되는 유전자를 포함할 수 있다. 감소된 발현은 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 단백질 발현일 수 있다. 예를 들어, 감소된 발현은 하나 이상의 유전자의 단백질 발현일 수 있다. 감소된 발현은 또한 발현이 없는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자의 감소된 발현을 갖는 동물, 세포, 조직 또는 장기는 유전자의 발현(예컨대, mRNA 및/또는 단백질 발현)을 가지지 않을 수 있다. 유전자의 발현의 감소는 유전자의 기능을 불활성화시킬 수 있다. 일부 경우, 유전자의 발현이 유전적으로 변형된 동물에서 감소되는 경우, 유전자의 발현은 유전적으로 변형된 동물에서 존재하지 않는다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교하여 하나 이상의 MHC 분자의 감소된 발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 하나 이상의 돼지 백혈구 항원(SLA) 클래스 I 및/또는 SLA 클래스 II 분자의 감소된 발현을 갖는, 유제류, 예컨대, 돼지일 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교하여 주조직적합성 복합체(MHC) 분자(예컨대, MHC I 분자 및/또는 MHC II 분자)를 조절하는 임의의 유전자의 감소된 발현을 포함할 수 있다. 이러한 유전자의 발현 감소는 MHC 분자(예컨대, MHC I 분자 및/또는 MHC II 분자)의 감소된 발현 및/또는 기능을 야기할 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물에서 발현이 감소된 하나 이상의 유전자는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: MHC I 특이적 인핸서좀의 성분, MHC I 결합 펩티드의 수송체, 자연 살해 그룹 2D 리간드, CXC 화학물질 수용체(CXCR) 3 리간드, 보체 성분 3(C3), 및 주조직적합성 복합체 II 트랜스활성화인자(CIITA). 일부 경우, MHC I 특이적 인핸서좀의 성분은 NLRC5일 수 있다. 일부 경우, MHC I 특이적 인핸서좀의 성분은 또한 조절 인자 X(RFX)(예컨대, RFX1), 핵 전사 인자 Y(NFY), 및 cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB)을 포함할 수 있다. 일부 경우, MHC I 결합 펩티드의 수송체는 항원 프로세싱과 관련된 수송체 1(TAP1)일 수 있다. 일부 경우, 자연 살해(NK) 그룹 2D 리간드는 MICA 및 MICB를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 하기 유전자 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함할 수 있다: NOD 유사 수용체 패밀리 CARD 도메인 함유 5(NLRC5), 항원 프로세싱과 관련된 수송체 1(TAP1), C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10), MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 A(MICA), MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 B(MICB), 보체 성분 3(C3), 및 CIITA. 유전적으로 변형된 동물은 하기 유전자 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함할 수 있다: MHC I 특이적 인핸서좀의 성분(예컨대, NLRC5), MHC I 결합 펩티드의 수송체(TAP1), 및 C3.
유전적으로 변형된 비인간 동물은, 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트와 비교하여, 비인간 동물 및 비인간 동물로부터의 세포, 조직, 또는 장기를 받고 있는 수용자 사이에서 상이한 수준으로 발현되는 하나 이상의 유전자의 감소된 발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자는 비인간 동물보다 인간에서 더 낮은 수준으로 발현될 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 유전자는 비인간 동물의 내인성 유전자일 수 있다. 내인성 유전자는 일부 경우, 또 다른 종에서 발현되지 않는 유전자이다. 예를 들어, 비인간 동물의 내인성 유전자는 인간에서 발현되지 않는 유전자일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우, 하나 이상의 유전자의 동족체(예컨대, 오르소로그(ortholog))가 인간에 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 유전자의 동족체(예컨대, 오르소로그)가 인간에 존재할 수 있지만 발현되지 않는다.
일부 경우, 비인간 동물은 돼지일 수 있고, 수용자는 인간일 수 있다. 이러한 경우, 하나 이상의 유전자는 돼지에서는 발현되지만 인간에서는 발현되지 않는 임의의 유전자일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자는 당단백질 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1), 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH), 및 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(B4GALNT2)를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 B4GALNT2, GGTA1, 또는 CMAH의 감소된 발현을 포함할 수 있고, 상기 감소된 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교된다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 B4GALNT2 및 GGTA1의 감소된 발현을 포함할 수 있으며, 상기 감소된 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교된다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 B4GALNT2 및 CMAH의 감소된 발현을 포함할 수 있으며, 상기 감소된 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교된다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 B4GALNT2, GGTA1, 및 CMAH의 감소된 발현을 포함할 수 있으며, 상기 감소된 발현은 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교된다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은, 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트와 비교하여, NLRC5, TAP1, CXCL10, MICA, MICB, C3, CIITA, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2를 포함하는 본원에 개시된 어느 유전자 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함할 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 발현이 감소된, 예컨대, 유전적 발현이 감소된 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 발현이 감소된 하나 이상의 유전자는 비제한적으로 NOD 유사 수용체 패밀리 CARD 도메인 함유 5(NLRC5), 항원 프로세싱과 관련된 수송체 1(TAP1), 당단백질 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1), 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH), C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10), MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 A(MICA), MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 B(MICB), 클래스 II 주조직적합성 복합체 트랜스활성화인자(CIITA), 베타-1,4-N-아세틸-갈락토사미닐 트랜스퍼라제 2(B4GALNT2), 보체 성분 3(C3), 및/또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 발현이 파괴된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 목적을 위해, 그리고 당업자가 생각할 수 있는 다양한 조합을 제한하지 않기 위해, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 개별적으로 파괴된 NLRC5 및 TAP1을 가질 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 또한 파괴된 NLRC5 및 TAP1 모두를 가질 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 또한 NLRC5 및 TAP1, 및 하기 파괴된 GGTA1, CMAH, CXCL10, MICA, MICB, B4GALNT2, 또는 CIITA 유전자 중 하나 이상을 가질 수 있으며; 예를 들어 "NLRC5, TAP1, 및 GGTA1" 또는 "NLRC5, TAP1, 및 CMAH"가 파괴될 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 또한 파괴된 NLRC5, TAP1, GGTA1, 및 CMAH를 가질 수 있다. 대안적으로, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 또한 파괴된 NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, 및 CMAH를 가질 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 파괴된 C3 및 GGTA1을 가질 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 NLRC5, C3, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, 및 CXCL10의 감소된 발현을 가질 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 TAP1, C3, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, 및 CXCL10의 감소된 발현을 가질 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 NLRC5, TAP1, C3, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, 및 CXCL10의 감소된 발현을 가질 수 있다.
이식된 인간 세포 상에서 MHC 클래스 I 발현의 결여는 자연 살해(NK) 세포의 수동 활성화를 유발할 수 있다(Ohlen et al., 1989). MHC 클래스 I 발현의 결여는 NLRC5, TAP1, 또는 B2M 유전자 결실 때문일 수 있다. NK 세포 세포독성은 인간 MHC 클래스 1 유전자의 발현에 의해 극복될 수 있고, HLA-E는 NK 세포 상의 억제성 수용체 CD94/NKG2A를 자극하여 세포 사멸을 예방할 수 있다(Weiss et al., 2009; Lilienfeld et al., 2007; Sasaki et al., 1999). HLA-E 유전자의 성공적인 발현은 인간 B2M(베타 2 마이크로글로불린) 유전자 및 동족 펩티드의 공동-발현에 의존할 수 있다(Weiss et al., 2009; Lilienfeld et al., 2007; Sasaki et al., 1999; Pascasova et al., 1999). 줄기 세포 DNA에서 뉴클레아제 매개 절단(break)은 상동 유도 복구(homology directed repair)를 통해 하나 또는 다수의 유전자의 삽입을 가능하게 할 수 있다. 일련의 HLA-E 및 hB2M 유전자는 뉴클레아제 매개 DNA 절단의 영역에 혼입되어 전이유전자를 삽입하는 동안 표적 유전자(예를 들어, NLRC5)의 발현을 방지할 수 있다.
유전자의 발현 수준은 다양한 정도까지 감소될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 100% 또는 약 100%까지 감소될 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 유전자의 발현은 정상 발현, 예컨대, 비-변형된 대조군의 발현과 비교하여, 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 또는 약 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50%까지 감소될 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 유전자의 발현은 정상 발현, 예컨대, 비-변형된 대조군과 비교하여, 적어도 또는 적어도 약 99% 내지 90%; 89% 내지 80%, 79% 내지 70%; 69% 내지 60%; 59% 내지 50%까지 감소될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 정상 발현의 적어도 또는 적어도 약 90%까지 또는 적어도 또는 적어도 약 90% 내지 99%까지 감소될 수 있다.
발현은 비제한적으로 PCR, 실시간 PCR(예컨대, Sybr-green), 및/또는 핫(hot) PCR을 포함하는 정량적 PCR(qPCR)과 같은 임의의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 유전자의 발현은 유전자의 전사체의 수준을 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 노던 블롯팅, 뉴클레아제 보호 분석(예컨대, RNase 보호 분석), 역전사 PCR, 정량적 PCR(예컨대, 실시간 PCR, 예컨대 실시간 정량적 역전사 PCR), 제자리 혼성화(예컨대, 형광 제자리 혼성화(FISH)), 도트-블롯 분석, 차등 디스플레이(differential display), 유전자 발현의 연속 분석, 감산(subtractive) 혼성화, 마이크로어레이, 나노스트링(nanostring), 및/또는 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱)에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 유전자의 발현은 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준을 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 단백질 면역염색, 단백질 면역침전, 전기영동(예컨대, SDS-PAGE), 웨스턴 블롯팅, 비신코닌산 분석, 분광광도법, 질량 분석법, 효소 분석(예컨대, 효소결합 면역흡착 분석), 면역조직화학, 유세포분석법, 및/또는 면역세포화학에 의해 측정될 수 있다. 하나 이상의 유전자의 발현은 또한 현미경에 의해 측정될 수 있다. 현미경은 광학, 전자, 또는 주사형 탐침 현미경(scanning probe microscopy)일 수 있다. 광학 현미경은 명시야(bright field), 경사 조명(olique illumination), 교차 편광(cross-polarized light), 분산 염색(dispersion staining), 암시야(dark field), 위상차(phase contrast), 차등 간섭 대비(differential interference contrast), 간섭 반사 현미경(interference reflection microscopy), 형광(예컨대, 입자, 예컨대, 세포가 면역염색되는 경우), 공초점(confocal), 단일 평면 조명 현미경(single plane illumination microscopy), 광 시트 형광 현미경(light sheet fluorescence microscopy), 디콘볼루션(deconvolution), 또는 연속 시간 증폭 현미경(serial time-encoded amplified microscopy)의 사용을 포함할 수 있다. MHC I 분자의 발현은 또한 본원에 기재된 바와 같이 발현을 시험하는 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다.
파괴된 유전자
본 발명자들은 파괴된 유전자의 상이한 조합을 갖는 세포, 장기, 및/또는 조직이 수용자에게 이식될 때 거부반응에 덜 민감한 세포, 장기, 및/또는 조직을 야기할 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 특정 유전자, 예컨대 NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, CXCL10, MICA, MICB, C3, 및/또는 CIITA의 파괴(예컨대, 이의 발현을 감소시키는 것)가 이식편 생존 가능성을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
그러나, 파괴는 이들 유전자에만 국한되지 않는다. 파괴는 임의의 특정 유전자의 파괴일 수 있다. 본 출원 내의 유전자의 유전적 동족체(예컨대, 유전자의 임의의 포유동물 형태)가 포함된다는 것이 고려된다. 예를 들어, 파괴된 유전자는 본원에 개시된 유전자, 예컨대, NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, CXCL10, MICA, MICB, C3, 및/또는 CIITA에 대해 특정한 동일성 및/또는 상동성을 나타낼 수 있다. 따라서, 적어도 또는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 상동성(핵산 또는 단백질 수준에서)을 나타내는 유전자, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 50% 내지 60%; 60% 내지 70%; 70% 내지 80%; 80% 내지 90%; 또는 90% 내지 99% 상동성을 나타내는 유전자가 파괴될 수 있다는 것이 고려된다. 또한 적어도 또는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 99%, 또는 100% 동일성(핵산 또는 단백질 수준에서)을 나타내는 유전자, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 50% 내지 60%; 60% 내지 70%; 70% 내지 80%; 80% 내지 90%; 또는 90% 내지 99% 동일성을 나타내는 유전자가 파괴될 수 있다는 것이 고려된다. 일부 유전적 동족체는 당업계에 공지되어 있으나, 일부 경우 동족체는 공지되어 있지 않다. 그러나, 포유동물 간의 상동 유전자는 NCBI BLAST와 같은 공중이 이용가능한 데이터베이스를 사용하여 핵산(DNA 또는 RNA) 서열 또는 단백질 서열을 비교함으로써 발견될 수 있다. 예시적인 유전자의 지놈 서열, cDNA 및 단백질 서열이 표 1에 나타나 있다.
유전자 억제는 또한 많은 방법으로 이뤄질 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현은 넉아웃, 유전자의 프로모터의 변경, 및/또는 간섭 RNA(knockdown)의 투여에 의해 감소될 수 있다. 이는 유기체 수준에서 또는 조직, 장기, 및/또는 세포 수준에서 이뤄질 수 있다. 하나 이상의 유전자가 비인간 동물, 세포, 조직, 및/또는 장기에서 넉다운되는 경우, 하나 이상의 유전자는 RNA 간섭 시약, 예컨대, siRNA, shRNA, 또는 microRNA를 투여함으로써 감소될 수 있다. 예를 들어, shRNA를 발현할 수 있는 핵산이 세포 내로 안정적으로 형질감염되어 발현을 넉다운시킬 수 있다. 또한, shRNA를 발현할 수 있는 핵산이 비인간 동물의 지놈 내로 삽입되어, 비인간 동물 내의 유전자를 넉다운시킬 수 있다.
파괴 방법은 또한 우성 음성 단백질을 과발현시키는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 기능적 야생형 유전자의 전반적인 감소된 기능을 야기할 수 있다. 또한, 우성 음성 유전자를 발현하는 것은 넉아웃 및/또는 넉다운과 유사한 표현형을 야기할 수 있다.
때때로 정지 코돈이 하나 이상의 유전자에 삽입되거나 생성될 수 있고(예컨대 뉴클레오티드 치환에 의해), 이는 비기능적 전사체 또는 단백질을 야기할 수 있다(때때로 넉아웃으로 지칭됨). 예를 들어, 정지 코돈이 하나 이상의 유전자의 중간 내에서 생성되면, 생성된 전사 및/또는 단백질은 절단될 수 있고, 비기능적일 수 있다. 그러나, 일부 경우, 절단은 활성(부분적으로 또는 과도하게 활성) 단백질을 야기할 수 있다. 일부 경우, 단백질이 과도하게 활성이면, 이는 우성 음성 단백질, 예컨대, 야생형 단백질의 활성을 파괴하는 돌연변이 폴리펩티드를 초래할 수 있다.
이 우성 음성 단백질은 임의의 프로모터의 제어 내에 있는 핵산에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 및/또는 발생 특이적 프로모터일 수 있다.
우성 음성 단백질을 코딩하는 핵산은 이후에 세포 또는 비인간 동물 내로 삽입될 수 있다. 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 안정한 형질감염이 사용될 수 있다. 또한, 우성 음성 단백질을 코딩하는 핵산은 비인간 동물의 지놈 내로 삽입될 수 있다.
비인간 동물에서의 하나 이상의 유전자는 본 기술분야에서 공지된 임의의 방법을 사용하여 넉아웃될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자를 넉아웃시키는 것은 비인간 동물의 지놈으로부터 하나 이상의 유전자를 결실시키는 것을 포함할 수 있다. 넉아웃은 또한 비인간 동물로부터의 유전자 서열의 전부 또는 일부를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 넉아웃이 비인간 동물의 지놈 내의 유전자의 모두 또는 일부를 하나 이상의 뉴클레오티드로 대체하는 것을 포함할 수 있음이 또한 고려된다. 하나 이상의 유전자를 넉아웃시키는 것은 또한 하나 이상의 유전자 내에 서열을 삽입하여 하나 이상의 유전자의 발현을 파괴하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열을 삽입하는 것은 하나 이상의 유전자의 중간에 정지 코돈을 생성할 수 있다. 서열을 삽입하는 것은 하나 이상의 유전자의 오픈 리딩 프레임을 이동시킬 수 있다.
넉아웃은 임의의 비인간 동물 내의 임의의 세포, 장기, 및/또는 조직에서 이뤄질 수 있다. 예를 들어, 넉아웃은 전신 넉아웃일 수 있으며, 예컨대, 하나 이상의 유전자의 발현이 비인간 동물의 모든 세포에서 감소된다. 넉아웃은 또한 비인간 동물의 하나 이상의 세포, 조직, 및/또는 장기에 특이적일 수 있다. 이것은 하나 이상의 유전자의 발현이 하나 이상의 장기, 조직 또는 세포의 유형에서 선택적으로 감소되는 조건부 넉아웃(conditional knockout)에 의해 달성될 수 있다. 조건부 넉아웃은 cre가 세포, 조직, 및/또는 장기 특이적 프로모터의 제어 하에 발현되는 Cre-lox 시스템에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자는 하나 이상의 조직, 또는 장기에서 넉아웃될 수 있고(또는 발현이 감소될 수 있고), 상기 하나 이상의 조직 또는 장기는 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 췌장, 소장, 대장, 골격근, 평활근, 피부, 뼈, 지방 조직, 모발, 갑상선, 기도, 담낭, 신장, 요관, 방광, 대동맥, 정맥, 식도, 횡격막, 위, 직장, 부신, 기관지, 귀, 눈, 망막, 생식기, 시상하부, 후두, 코, 혀, 척수, 또는 요관, 자궁, 난소, 고환, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 유전자는 또한 하나의 유형의 세포에서 넉아웃될 수 있고(또는 발현이 감소될 수 있고), 하나 이상의 유형의 세포는 모세포(trichocyte), 케라티노사이트(keratinocyte), 성선 자극 호르몬 분비세포(gonadotrope), 코르티코트로프성세포(corticotrope), 갑상샘자극호르몬분비세포(thyrotrope), 성장호르몬분비세포(somatotrope), 프로락틴분비세포(lactotroph), 크롬친화 세포(chromaffin cell), 소포곁 세포(parafollicular cell), 사구 세포 멜라노사이트(glomus cells melanocyte), 모반 세포(nevus cell), 메르켈 세포(merkel cell), 치아모세포(odontoblast), 백악모세포(cementoblast) 각막세포(corneal keratocyte), 망막 뮬러 세포(retina muller cell), 망막 색소 상피 세포, 뉴런, 아교세포(glia)(예컨대, 희소돌기 아교세포 성상세포), 뇌실막세포(ependymocyte), 송과체세포(pinealocyte), 폐포세포(pneumocyte)(예컨대, I형 폐포세포, 및 II형 폐포세포), 클라라 세포(clara cell), 배상 세포(goblet cell), G 세포, D 세포, 장크롬친화(Enterochromaffin) 유사 세포, 위의 주세포(gastric chief cell), 벽 세포(parietal cell), 소와 세포(foveolar cell), K 세포, D 세포, I 세포, 배상 세포(goblet cell), 파네스 세포(paneth cell), 장세포(enterocyte), 미세주름(microfold cell), 간세포, 간 성상세포(hepatic stellate cell)(예컨대, 중배엽으로부터의 쿠퍼 세포(Kupffer cell)), 쓸개세포(cholecystocyte), 샘꽈리중심 세포(centroacinar cell), 췌장 성상 세포, 췌장 α 세포, 췌장 β 세포, 췌장 δ 세포, 췌장 F 세포, 췌장 ε 세포, 갑상선(예컨대, 여포 세포), 부갑상선(예컨대, 부갑상선 주 세포), 호산 세포(oxyphil cell), 요로상피 세포(urothelial cell), 골아세포(osteoblast), 골세포, 연골모세포(chondroblast), 연골세포(chondrocyte), 섬유아세포, 섬유세포, 근아세포, 근세포, 근위성 세포, 힘줄 세포, 심장 근육 세포, 지방모세포(lipoblast), 지방세포(adipocyte), 카할(cajal)의 간질 세포, 혈관모세포(angioblast), 내피 세포, 혈관사이 세포(mesangial cell)(예컨대, 사구체내 혈관사이 세포 및 사구체밖 혈관사이 세포, 사구체곁 세포(juxtaglomerular cell), 치밀반 세포(macula densa cell), 기질 세포, 간질 세포, 텔로사이트 단순 상피 세포(telocytes simple epithelial cell), 발세포(podocyte), 신장 근위 세뇨관 솔가장자리 세포(kidney proximal tubule brush border cell), 세르톨리 세포, 라이디히 세포, 과립막 세포, 페그 세포(peg cell), 생식 세포, 정자 난자(spermatozoon ovum), 림프구, 골수 세포, 내피 전구 세포, 내피 줄기 세포, 혈관모세포(angioblast), 중간혈관모세포(mesoangioblast), 혈관주위세포 벽세포(pericyte mural cell), 및/또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
조건부 넉아웃은, 예를 들어, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 발달 특이적 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 이는 어느 시점에 또는 특정 시점에 유전자/단백질의 발현을 제거하거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 테트라사이클린 유도성 프로모터의 경우, 테트라사이클린은 출산 후 어느 시점에 비인간 동물에게 제공될 수 있다. 비인간 동물이 자궁에서 발생하는 생명체이면, 임신 중에 어미에게 테트라사이클린을 제공함으로써 프로모터가 유도될 수 있다. 비인간 동물이 알에서 발생하면, 테트라사이클린을 주사하거나 테트라사이클린에서 배양함으로써 프로모터가 유도될 수 있다. 테트라사이클린이 비인간 동물에게 제공되면, 테트라사이클린은 cre의 발현을 초래할 것이며, 이는 이후에 관심있는 유전자의 절단을 초래할 것이다.
cre/lox 시스템은 또한 발달 특이적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 프로모터는 출생 후에, 또는 심지어 사춘기가 시작된 이후에 켜진다. 이러한 프로모터는 cre 발현을 제어하는 데 사용될 수 있고, 따라서 발달 특이적 넉아웃에서 사용될 수 있다.
넉아웃 기술의 임의의 조합이 조합될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 예를 들어, 조직 특이적 넉아웃은 유도성 기술과 조합되어, 조직 특이적, 유도성 넉아웃을 생성할 수 있다. 또한, 발달 특이적 프로모터와 같은 다른 시스템은 조직 특이적 프로모터, 및/또는 유도성 넉아웃과 조합하여 사용될 수 있다.
넉아웃 기술은 또한 유전자 편집을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집은 CRISPR 관련 단백질(Cas 단백질, 예컨대, Cas9), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 마가뉴클레아제를 포함하는, 뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다. 뉴클레아제는 자연적으로 존재하는 뉴클레아제, 유전적으로 변형된, 및/또는 재조합일 수 있다. 예를 들어, CRISPR/cas 시스템이 유전자 편집 시스템으로서 적합할 수 있다.
비인간 동물의 하나 이상의 유전자의 모든 대립유전자보다 적은 대립유전자가 넉아웃될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 예를 들어, 이배체(diploid) 비인간 동물에서, 2개의 대립유전자 중 하나가 넉아웃되는 것이 고려된다. 이것은 유전자의 감소된 발현 및 감소된 단백질 수준을 초래할 수 있다. 전체적인 감소된 발현은, 두 대립유전자가 기능하고 있을 때, 예를 들어 넉아웃 및/또는 넉다운되지 않을 때와 비교하여, 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20% 미만 또는 약 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20% 미만; 예컨대, 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60%; 60% 내지 50%; 50% 내지 40%; 40% 내지 30%, 또는 30% 내지 20% 또는 약 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60%; 60% 내지 50%; 50% 내지 40%; 40% 내지 30%, 또는 30% 내지 20%일 수 있다. 또한, 단백질 수준의 전체적인 감소는 전체적인 발현의 감소와 동일할 수 있다. 단백질 수준의 전체적인 감소는, 두 대립유전자가 기능할 때, 예를 들어 넉아웃 및/또는 넉다운되지 않을 때와 비교하여, 약 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 또는 20% 또는 약 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 또는 20% 미만, 예컨대, 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60%; 60% 내지 50%; 50% 내지 40%; 40% 내지 30%, 또는 30% 내지 20% 또는 약 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60%; 60% 내지 50%; 50% 내지 40%; 40% 내지 30%, 또는 30% 내지 20%일 수 있다. 그러나, 비인간 동물에서의 하나 이상의 유전자의 모든 대립유전자가 넉아웃될 수 있음이 또한 고려된다.
하나 이상의 유전자의 넉아웃은 유전자형분석에 의해 확인될 수 있다. 유전자형분석 방법은 시퀀싱, 제한 단편 길이 다형성 확인(RFLPI), 무작위 증폭된 다형성 검출(RAPD), 증폭된 단편 길이 다형성 검출(AFLPD), PCR(예컨대, 긴 범위(long range) PCR, 또는 단계적 PCR), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 프로브, 및 DNA 마이크로어레이 또는 비드에 대한 혼성화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자형분석은 시퀀싱에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우, 시퀀싱은 고충실도(high fidelity) 시퀀싱일 수 있다. 시퀀싱의 방법은 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 사슬-종결 방법(예컨대, 생거 시퀀싱), 샷건 시퀀싱, 및 브릿지 PCR을 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전자형분석은 차세대 시퀀싱에 의해 수행될 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 대용량 병렬 시그너처(massively parallel signature) 시퀀싱, 폴로니(polony) 시퀀싱, 파이로시퀀싱(예컨대, 454 Life Sciences사에 의해 개발된 파이로시퀀싱), 단일-분자 실시간 시퀀싱(예컨대, Pacific Biosciences에 의함), 이온 반도체 시퀀싱(예컨대, Ion Torrent semiconductor 시퀀싱에 의함), 합성에 의한 시퀀싱(예컨대, Illumina에 의한 Solexa 시퀀싱에 의함), 라이게이션에 의한 시퀀싱(예컨대, Applied Biosystems사에 의한 SOLiD 시퀀싱), DNA 나노볼 시퀀싱, 및 헬리스코프(heliscope) 단일 분자 시퀀싱을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에서 비인간 동물의 유전자형분석은 전체 지놈 시퀀싱 분석을 포함할 수 있다. 일부 경우, 동물에서 유전자의 넉아웃은 유전자의 일부 또는 전체 유전자를 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱)함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 돼지에서 NLRC5 유전자의 넉아웃은 전체 NLRC5의 차세대 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다. NLRC5의 차세대 시퀀싱은, 예컨대 정방향 프라이머 5'-gctgtggcatatggcagttc-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-tccatgtataagtctttta-3'(서열번호 2), 또는 정방향 프라이머 5'-ggcaatgccagatcctcaac-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-tgtctgatgtctttctcatg-3'(서열번호 4)를 사용하여 수행될 수 있다.
표 1. 예시적인 파괴된 유전자의 지놈 서열, cDNA 및 단백질
전이유전자
전이유전자는 전이유전자 없는 것보다 더 높은 수준으로 내인성 유전자를 발현시키는데 유용할 수 있다. 또한, 전이유전자는 외인성 유전자를 발현하는 데 사용될 수 있다. 전이유전자는 또한 다른 유형의 유전자, 예를 들어, 우성 음성 유전자를 포함할 수 있다.
단백질 X의 전이유전자는 단백질 X를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전이유전자를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 경우, 단백질 X를 코딩하는 전이유전자는 단백질 X의 아미노산 서열의 100% 또는 약 100%를 코딩하는 전이유전자일 수 있다. 일부 경우, 단백질 X를 코딩하는 전이유전자는 단백질 X의 전체 또는 일부 아미노 서열을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 단백질 X의 아미노산 서열의 적어도 또는 적어도 약 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5%, 예컨대, 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60%; 또는 60% 내지 50% 또는 약 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60%; 또는 60% 내지 50%를 코딩할 수 있다. 전이유전자의 발현은 궁극적으로 기능적 단백질, 예컨대, 부분적으로 또는 완전히 기능적 단백질을 초래할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 부분적 서열이 발현되는 경우, 최종 결과는 일부 경우 비기능적 단백질 또는 우성 음성 단백질일 수 있다. 비기능적 단백질 또는 우성 음성 단백질은 또한 기능적(내인성 또는 외인성) 단백질과 경쟁할 수 있다. 전이유전자는 또한 RNA(예컨대, mRNA, shRNA, siRNA, 또는 microRNA)를 코딩할 수 있다. 일부 경우, 전이유전자가 mRNA를 코딩하는 경우, 이것은 결국 폴리펩티드(예컨대, 단백질)로 번역될 수 있다. 따라서, 전이유전자가 단백질을 코딩할 수 있다는 것이 고려된다. 전이유전자는, 일부 경우, 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩할 수 있다. 또한, 단백질은 야생형 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 결실, 삽입, 아미노산 치환, 또는 재배열)를 가질 수 있다. 단백질은 천연 폴리펩티드 또는 인공 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)일 수 있다. 전이유전자는 둘 이상의 폴리펩티드에 의해 형성된 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
전이유전자는 전이유전자의 생성물을 생산하는 방식으로, 유기체, 세포, 조직, 또는 장기에 위치할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전이유전자를 포함하는 비인간 동물이 본원에 개시된다. 하나 이상의 전이유전자는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 파괴와 조합될 수 있다. 전이유전자는 세포 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 유기체의 생식세포 계열(germ line) 내로 혼입될 수 있다. 세포 내로 삽입되는 경우, 전이유전자는 메신저 RNA(mRNA)의 복제본인 상보적 DNA(cDNA) 절편, 또는 지놈 DNA(인트론을 갖거나 없음)의 원래 영역에 존재하는 유전자 자체일 수 있다.
비인간 동물은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 삽입물은 하나 또는 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩할 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물은 MHC 분자(예컨대, MHC I 분자 및/또는 MHC II 분자)의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 전이유전자는 MHC I 형성 억제자, 보체 활성화의 조절자, NK 세포에 대한 억제성 리간드, B7 패밀리 구성원, CD47, 세린 프로테아제 억제제, 갈렉틴, 및/또는 이의 임의의 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함할 수 있다. 일부 경우, MHC I 형성 억제자는 감염된 세포 단백질 47(ICP47)일 수 있다. 일부 경우, 보체 활성화의 조절자는 분화 클러스터 46(CD46), 분화 클러스터 55(CD55), 및 분화 클러스터 59(CD59)를 포함할 수 있다. 일부 경우, NK 세포에 대한 억제성 리간드는 백혈구 항원 E(HLA-E), 인간 백혈구 항원 G(HLA-G), 및 β-2-마이크로글로불린(B2M)을 포함할 수 있다. NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-G, 예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7의 아형(isoform)일 수 있다. 예를 들어, NK 세포에 대한 억제성 리간드는 HLA-G1일 수 있다. HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)의 전이유전자는 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전이유전자를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 경우, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)를 코딩하는 전이유전자는 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)의 아미노산 서열의 100% 또는 약 100%를 코딩하는 전이유전자일 수 있다. 다른 경우, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)를 코딩하는 전이유전자는 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)의 전체 또는 일부 서열을 코딩하는 전이유전자일 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)의 아미노산 서열의 적어도 또는 적어도 약 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 또는 50%를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 HLA-G 아미노산 서열의 90%를 코딩할 수 있다. 전이유전자는 기능적(예컨대, 부분적으로 또는 전체적으로 기능적) HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), 및 B2M 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함할 수 있다. HLA-G 지놈 DNA 서열은 8개의 엑손을 가질 수 있으며, 선택적 스플라이싱이 상기 8개의 엑손에 의해 7개의 아형을 생성한다. HLA-G1 아형은 엑손 7을 제외할 수 있다. HLA-G2 아형은 엑손 3 및 7을 제외할 수 있다. 인트론 2 또는 인트론 4의 번역은 막통과 도메인 발현의 손실로 인해 분비된 아형을 초래할 수 있다. HLA-G의 지놈 서열 및 cDNA의 지도가 도 14A-14B에 나타나 있다. 일부 경우, B7 패밀리 구성원은 CD80, CD86, 프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1), 프로그램된 사멸-리간드 2(PD-L2), CD275, CD276, T 세포 활성화 억제제 1(VTCN1)을 함유하는 V-세트 도메인, 혈소판 수용체 Gi24, 천연 세포독성 촉발 수용체 3 리간드 1(NR3L1), 및 HERV-H LTR-연관 2(HHLA2)를 포함할 수 있다. 예를 들어, B7 패밀리 구성원은 PD-L1 또는 PD-L2일 수 있다. 일부 경우, 세린 프로테아제 억제제는 세린 프로테아제 억제제 9(Spi9)일 수 있다. 일부 경우, 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14, 및 갈렉틴-15를 포함할 수 있다. 예를 들어, 갈렉틴은 갈렉틴-9일 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 하나 이상의 유전자의 감소된 발현 및 본원에 개시된 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 NLRC5, TAP1, CXCL10, MICA, MICB, C3, CIITA, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2 중 하나 이상의 감소된 발현, 및 ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, PD-L1, PD-L2, CD47, Spi9, 및 갈렉틴-9 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 감소된 발현 GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2, 및 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), CD47(예컨대, 인간 CD47), PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1), 및 PD-L2(예컨대, 인간 PD-L2)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 감소된 발현 GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2, 및 HLA-E, CD47(예컨대, 인간 CD47), PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1), 및 PD-L2(예컨대, 인간 PD-L2)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 감소된 발현 NLRC5, C3, CXC10, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2, 및 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), CD47(예컨대, 인간 CD47), PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1), 및 PD-L2(예컨대, 인간 PD-L2)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 감소된 발현 TAP1, C3, CXC10GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2, 및 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), CD47(예컨대, 인간 CD47), PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1), 및 PD-L2(예컨대, 인간 PD-L2)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 감소된 발현 NLRC5, C3, CXC10, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2, 및 HLA-E, CD47(예컨대, 인간 CD47), PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1), 및 PD-L2(예컨대, 인간 PD-L2)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 감소된 발현 TAP1, C3, CXC10, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2, 및 HLA-E를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 GGTA1의 감소된 발현 및 HLA-E를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 GGTA1의 감소된 발현 및 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 Rosa26 프로모터, 예컨대, 돼지 Rosa26 프로모터에 인접하여 삽입된 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 NLRC5, C3, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 및 갈렉틴-9를 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 TAP1, C3, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 및 갈렉틴-9를 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 NLRC5, TAP1, C3, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 및 갈렉틴-9를 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 NLRC5, C3, GGTA1, 및 CXCL10의 감소된 단백질 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1 또는 HLA-E를 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 TAP1, C3, GGTA1, 및 CXCL10의 감소된 단백질 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1 또는 HLA-E를 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 NLRC5, TAP1, C3, GGTA1, 및 CXCL10의 감소된 단백질 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1 또는 HLA-E를 포함한다. 일부 경우, 본원의 전이유전자에 의해 코딩된 CD47, PD-L1, 및 PD-L2는 인간 CD47, 인간 PD-L1 및 인간 PD-L2일 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 동물의 지놈 내의 유전자에 삽입된 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 전이유전자는 표적화된 유전자의 프로모터에 인접하여 또는 표적화된 유전자 내에 삽입될 수 있다. 일부 경우, 전이유전자의 삽입은 표적화된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 표적화된 유전자는 본원에 기재된 발현이 감소된 유전자일 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 NLRC5, TAP1, CXCL10, MICA, MICB, C3, CIITA, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2 중 하나 이상의 프로모터에 인접하여 또는 NLRC5, TAP1, CXCL10, MICA, MICB, C3, CIITA, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2 중 하나 이상의 내부에 삽입될 수 있다. 일부 경우, 전이유전자는 GGTA1의 프로모터에 인접하여 또는 GGTA1 내부에 삽입될 수 있다.
예를 들어, 비인간 동물은 감염된 세포 단백질 47(ICP47), 분화 클러스터 46(CD46), 분화 클러스터 55(CD55), 분화 클러스터 59(CD 59), HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 갈렉틴-9, 이의 임의의 기능적 단편, 또는 이의 임의의 조합의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), 또는 B2M를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 또는 갈렉틴-9 인간 단백질 중 하나 이상을 코딩할 수 있다. 비인간 동물은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 갈렉틴-9, 이의 임의의 기능적 단편, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 또한 ICP47를 코딩하는 단일 전이유전자를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 때때로 CD59를 코딩하는 단일 전이유전자를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 또한 때때로 HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7)를 코딩하는 단일 전이유전자를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 때때로 HLA-E를 코딩하는 단일 전이유전자를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 때때로 B2M를 코딩하는 단일 전이유전자를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 또한 둘 이상의 전이유전자를 포함할 수 있으며, 상기 둘 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, CD59, 및/또는 이의 임의의 조합이다. 예를 들어, 둘 이상의 전이유전자는 CD59 및 CD46 또는 CD59 및 CD55를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 또한 셋 이상의 전이유전자를 포함할 수 있으며, 셋 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, CD59, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 셋 이상의 전이유전자는 CD59, CD46, 및 CD55를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 또한 4개 이상의 전이유전자를 포함할 수 있으며, 상기 4개 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, 및 CD59를 포함할 수 있다. 비인간 동물은 ICP47, CD46, CD55, 및 CD59를 포함하는 4개 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다.
전이유전자 및 유전자 파괴의 조합이 사용될 수 있다. 비인간 동물은 하나 이상의 감소된 유전자 및 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현이 감소된 하나 이상의 유전자는 NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, CXCL10, MICA, MICB, C3, CIITA, 및/또는 이의 임의의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, CD 59, 이의 임의의 기능적 단편, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단지 다양한 조합을 예시하기 위하여, 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 NLRC5를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47을 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 TAP1을 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47을 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5 및 TAP1을 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47을 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5, TAP1, 및 GGTA1을 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47을 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5, TAP1, B4GALNT2, 및 CMAH를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47을 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, 및 CMAH를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47을 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 CD59를 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 TAP1을 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 CD59를 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5 및 TAP1을 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 CD59를 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5, TAP1, 및 GGTA1을 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 CD59를 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5, TAP1, B4GALNT2, 및 CMAH를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 CD59를 포함한다. 발현이 파괴된 하나 이상의 유전자는 또한 NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, 및 CMAH를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 CD59를 포함한다.
사용될 수 있고 구체적으로 고려되는 전이유전자는 본원에 개시된 유전자, 예를 들어, ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 갈렉틴-9, 이의 임의의 기능적 단편, 및/또는 이의 임의의 조합에 대해 특정 동일성 및/또는 상동성을 나타내는 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 유전자가 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 상동성, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60% 상동성(핵산 또는 단백질 수준에서)을 나타내면, 그것이 전이유전자로서 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 적어도 또는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%, 동일성 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 99% 내지 90%; 90% 내지 80%; 80% 내지 70%; 70% 내지 60% 동일성(핵산 또는 단백질 수준에서)을 나타내는 유전자가 전이유전자로서 사용될 수 있다는 것이 또한 고려된다.
비인간 동물은 또한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 우성 음성 전이유전자를 포함할 수 있다. 우성 음성 전이유전자의 발현은 우성 음성 전이유전자의 야생형 카운터파트의 발현 및/또는 기능을 억제할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 우성 음성 전이유전자 X를 포함하는 비인간 동물은 발현이 감소된 X 유전자를 포함하는 상이한 비인간 동물과 비교하여 유사한 표현형을 가질 수 있다. 하나 이상의 우성 음성 전이유전자는 우성 음성 NLRC5, 우성 음성 TAP1, 우성 음성 GGTA1, 우성 음성 CMAH, 우성 음성 B4GALNT2, 우성 음성 CXCL10, 우성 음성 MICA, 우성 음성 MICB, 우성 음성 CIITA, 우성 음성 C3, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
유전적 발현을 억제할 수 있는, 예컨대, 유전자를 넉다운할 수 있는 하나 이상의 핵산을 코딩하는 하나 이상의 전이유전자를 포함하는 비인간 동물이 또한 제공된다. 유전적 발현을 억제하는 RNA는, 비제한적으로, shRNA, siRNA, RNAi, 및 microRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, siRNA, RNAi, 및/또는 microRNA는 유전적 발현을 억제하기 위해 비인간 동물에게 제공될 수 있다. 또한, 비인간 동물은 shRNA를 코딩하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. shRNA는 특정 유전자에 특이적일 수 있다. 예를 들어, shRNA는 비제한적으로, NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, CXCL10, MICA, MICB, B4GALNT2, CIITA, C3, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 유전자에 특이적일 수 있다.
대상체에게 이식될 때, 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터의 세포, 조직, 또는 장기는 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트로부터의 세포, 조직, 또는 장기와 비교하여 대상체에서 더 낮은 면역 반응(예컨대, 이식 거부반응)을 촉발할 수 있다. 일부 경우, 면역 반응은 T 세포(예컨대, CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포) 및 NK 세포의 활성화, 증식 및 세포독성을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 유전적으로 변형된 세포의 표현형은 상기 세포를 NK 세포, T 세포(예컨대, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포)와 공동 배양하고, NK 세포 또는 T 세포의 활성화, 증식 및 세포독성을 시험함으로써 측정될 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포에 의해 유도된 T 세포 또는 NK 세포 활성화, 증식 및 세포독성은 유전적으로 변형되지 않은 세포에 의해 유도된 것보다 더 낮을 수 있다. 일부 경우, 본원의 유전적으로 변형된 세포의 표현형은 효소 결합된 면역스팟(Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT)) 분석에 의해 측정될 수 있다.
하나 이상의 전이유전자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전이유전자는 인간 유전자, 마우스 유전자, 랫트 유전자, 돼지 유전자, 소 유전자, 개 유전자, 고양이 유전자, 원숭이 유전자, 침팬지 유전자, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 인간 유전적 서열을 갖는 인간으로부터 유래될 수 있다. 하나 이상의 전이유전자는 인간 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 전이유전자는 아데노바이러스 유전자가 아니다.
전이유전자는 무작위 또는 부위 특이적 방식으로 비인간 동물의 지놈 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 비인간 동물의 지놈 내의 무작위 유전자좌에 삽입될 수 있다. 이들 전이유전자는 지놈 내의 어느 곳에나 삽입되면 완전히 기능적일 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 자체 프로모터를 코딩할 수 있거나 또는 내인성 프로모터의 제어 하에 있는 위치 내로 삽입될 수 있다. 대안적으로, 전이유전자는 유전자의 인트론 또는 유전자의 엑손, 프로모터, 또는 비코딩 영역과 같은 유전자 내로 삽입될 수 있다.
때때로, 전이유전자의 하나를 초과하는 복제본(copy)이 지놈 내의 하나를 초과하는 무작위 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 다수의 복제본이 지놈 내의 무작위 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 이것은 전이유전자가 무작위로 한 번 삽입된 경우보다 전체 발현을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 전이유전자의 하나의 복제본은 하나의 유전자 내로 삽입될 수 있고, 전이유전자의 또 다른 복제본은 상이한 유전자 내로 삽입될 수 있다. 전이유전자는 비인간 동물의 지놈 내의 특정 유전자좌로 삽입될 수 있도록 표적화될 수 있다.
전이유전자의 발현은 하나 이상의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 프로모터는 유비쿼터스, 조직 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터에 인접하여 삽입되는 전이유전자의 발현은 조절될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 유비쿼터스 프로모터에 가까이 또는 옆에 삽입되는 경우, 전이유전자는 비인간 동물의 모든 세포에서 발현될 것이다. 일부 유비쿼터스 프로모터는 CAGGS 프로모터, hCMV 프로모터, PGK 프로모터, SV40 프로모터, 또는 Rosa26 프로모터일 수 있다.
프로모터는 내인성 또는 외인성일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전이유전자는 내인성 또는 외인성 Rosa26 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다. 또한, 프로모터는 비인간 동물에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전이유전자는 돼지 Rosa26 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다.
조직 특이적 프로모터(세포 특이적 프로모터와 동의어일 수 있음)는 발현의 위치를 제어하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전이유전자는 조직 특이적 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다. 조직 특이적 프로모터는 FABP 프로모터, Lck 프로모터, CamKII 프로모터, CD19 프로모터, 케라틴 프로모터, 알부민 프로모터, aP2 프로모터, 인슐린 프로모터, MCK 프로모터, MyHC 프로모터, WAP 프로모터, 또는 Col2A 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 췌장 특이적 프로모터, 예컨대, 인슐린 프로모터일 수 있다.
유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 유도성 프로모터는 유도제를 부가하거나 제거함으로써, 원할 때 켜고 끌 수 있다. 유도성 프로모터가 Lac, tac, trc, trp, araBAD, phoA, recA, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, PL, cspA, T7, VHB, Mx, 및/또는 Trex일 수 있다는 것이 고려된다.
본원에 기재된 바와 같은 비인간 동물 또는 세포는 인슐린을 코딩하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 인슐린을 코딩하는 전이유전자는 인간 유전자, 마우스 유전자, 랫트 유전자, 돼지 유전자, 소 유전자, 개 유전자, 고양이 유전자, 원숭이 유전자, 침팬지 유전자, 또는 임의의 다른 포유동물 유전자일 수 있다. 예를 들어, 인슐린을 코딩하는 전이유전자는 인간 유전자일 수 있다. 인슐린을 코딩하는 전이유전자는 또한 키메라 유전자, 예를 들어, 부분적으로 인간 유전자일 수 있다.
전이유전자의 발현은 전이유전자의 전사체의 수준을 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자의 발현은 노던 블롯팅, 뉴클레아제 보호 분석(예컨대, RNase 보호 분석), 역전사 PCR, 정량적 PCR(예컨대, 실시간 PCR, 예컨대 실시간 정량적 역전사 PCR), 제자리 혼성화(예컨대, 형광 제자리 혼성화(FISH)), 도트-블롯 분석, 차등 디스플레이(differential display), 유전자 발현의 연속 분석, 감산(subtractive) 혼성화, 마이크로어레이, 나노스트링(nanostring), 및/또는 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱)에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우, 전이유전자의 발현은 유전자에 의해 코딩된 단백질을 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 단백질 면역염색, 단백질 면역침전, 전기영동(예컨대, SDS-PAGE), 웨스턴 블롯팅, 비신코닌산 분석, 분광광도법, 질량 분석법, 효소 분석(예컨대, 효소결합 면역흡착 분석), 면역조직화학, 유세포분석법, 및/또는 면역세포화학에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우, 전이유전자의 발현은 현미경에 의해 측정될 수 있다. 현미경은 광학, 전자, 또는 주사형 탐침 현미경(scanning probe microscopy)일 수 있다. 광학 현미경은 명시야(bright field), 경사 조명(olique illumination), 교차 편광(cross-polarized light), 분산 염색(dispersion staining), 암시야(dark field), 위상차(phase contrast), 차등 간섭 대비(differential interference contrast), 간섭 반사 현미경(interference reflection microscopy), 형광(예컨대, 입자, 예컨대, 세포가 면역염색되는 경우), 공초점(confocal), 단일 평면 조명 현미경(single plane illumination microscopy), 광 시트 형광 현미경(light sheet fluorescence microscopy), 디콘볼루션(deconvolution), 또는 연속 시간 증폭 현미경(serial time-encoded amplified microscopy)의 사용을 포함할 수 있다.
전이유전자의 삽입은 유전자형분석에 의해 확인될 수 있다. 유전자형분석 방법은 시퀀싱, 제한 단편 길이 다형성 확인(RFLPI), 무작위 증폭된 다형성 검출(RAPD), 증폭된 단편 길이 다형성 검출(AFLPD), PCR(예컨대, 긴 범위(long range) PCR, 또는 단계적 PCR), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 프로브, 및 DNA 마이크로어레이 또는 비드에 대한 혼성화를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전자형분석은 시퀀싱에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우, 시퀀싱은 고충실도(high fidelity) 시퀀싱일 수 있다. 시퀀싱의 방법은 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 사슬-종결 방법(예컨대, 생거 시퀀싱), 샷건 시퀀싱, 및 브릿지 PCR을 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전자형분석은 차세대 시퀀싱에 의해 수행될 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 대용량 병렬 시그너처(massively parallel signature) 시퀀싱, 폴로니(polony) 시퀀싱, 파이로시퀀싱(예컨대, 454 Life Sciences사에 의해 개발된 파이로시퀀싱), 단일-분자 실시간 시퀀싱(예컨대, Pacific Biosciences에 의함), 이온 반도체 시퀀싱(예컨대, Ion Torrent semiconductor 시퀀싱에 의함), 합성에 의한 시퀀싱(예컨대, Illumina에 의한 Solexa 시퀀싱에 의함), 라이게이션에 의한 시퀀싱(예컨대, Applied Biosystems사에 의한 SOLiD 시퀀싱), DNA 나노볼 시퀀싱, 및 헬리스코프 단일 분자 시퀀싱을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에서 비인간 동물의 유전자형분석은 전체 지놈 시퀀싱 분석을 포함할 수 있다.
일부 경우, 동물에서 전이유전자의 삽입은 전이유전자의 일부 또는 전체 전이유전자를 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱)함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 돼지에서 Rosa26 프로모터에 인접한 전이유전자의 삽입은, 예컨대, 정방향 프라이머 5'-cgcctagagaagaggctgtg-3'(서열번호 35), 및 역방향 프라이머 5'-ctgctgtggctgtggtgtag -3'(서열번호 36)를 사용하여, Rosa 엑손 1 내지 4의 차세대 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
표 2. 예시적인 전이유전자의 cDNA 서열
표 3. 예시적인 전이유전자에 의해 코딩된 단백질의 서열
비인간 동물의 집단
단일 비인간 동물 및 또한 비인간 동물의 집단이 본원에 제공된다. 비인간 동물의 집단은 유전적으로 동일할 수 있다. 비인간 동물의 집단은 또한 표현형이 동일할 수 있다. 비인간 동물의 집단은 표현형이 동일하고 유전적으로 동일할 수 있다.
유전적으로 변형될 수 있는 비인간 동물의 집단이 본원에 추가로 제공된다. 예를 들어, 집단은 적어도 또는 적어도 약 2, 5, 10, 50, 100, 또는 200마리의 본원에 개시된 바와 같은 비인간 동물을 포함할 수 있다. 집단의 비인간 동물은 동일한 표현형을 가질 수 있다. 예를 들어, 집단의 비인간 동물은 클론일 수 있다. 비인간 동물의 집단은 동일한 신체적 특징을 가질 수 있다. 동일한 표현형을 갖는 집단의 비인간 동물은 동일한 전이유전자(들)를 포함할 수 있다. 동일한 표현형을 갖는 집단의 비인간 동물은 또한 발현이 감소된 동일한 유전자(들)를 포함할 수 있다. 동일한 표현형을 갖는 집단의 비인간 동물은 또한 발현이 감소된 동일한 유전자(들)를 포함할 수 있고 동일한 전이유전자(들)를 포함할 수 있다. 비인간 동물의 집단은 적어도 또는 적어도 약 2, 5, 10, 50, 100, 또는 200마리의 동일한 표현형을 갖는 비인간 동물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 어느 특정 한배의 표현형은 동일한 표현형(예컨대, 하나의 예에서, 1 내지 약 20마리의 비인간 동물)을 가질 수 있다. 집단의 비인간 동물은 동일한 표현형을 갖는 돼지일 수 있다.
집단의 비인간 동물은 동일한 유전자형을 가질 수 있다. 예를 들어, 집단 내의 비인간 동물의 염색체에서의 모든 핵산 서열은 동일할 수 있다. 동일한 유전자형을 갖는 집단의 비인간 동물은 동일한 전이유전자(들)를 포함할 수 있다. 동일한 유전자형을 갖는 집단의 비인간 동물은 또한 발현이 감소된 동일한 유전자(들)를 포함할 수 있다. 동일한 유전자형을 갖는 집단의 비인간 동물은 또한 발현이 감소된 동일한 유전자(들)를 포함할 수 있고 동일한 전이유전자(들)를 포함할 수 있다. 비인간 동물의 집단은 적어도 또는 적어도 약 2, 5, 50, 100, 또는 200마리의 동일한 유전자형을 갖는 비인간 동물을 포함할 수 있다. 집단의 비인간 동물은 동일한 유전자형을 갖는 돼지일 수 있다.
동일한 유전자형 및/또는 표현형을 갖는 둘 이상의 비인간 동물로부터의 세포가 관용화 백신에서 사용될 수 있다. 일부 경우, 본원에 개시된 관용화 백신은 동일한 유전자형 및/또는 표현형을 갖는 둘 이상의 비인간 동물(예컨대, 돼지)로부터의 복수의 세포(예컨대, 유전적으로 변형된 세포)를 포함할 수 있다. 수용자를 이식편에 대해 면역관용화하는 방법은 동일한 유전자형 또는 표현형을 갖는 둘 이상의 비인간 동물로부터의 복수의 세포(예컨대, 유전적으로 변형된 세포)를 포함하는 관용화 백신을 수용자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
동일한 유전자형 및/또는 표현형을 갖는 둘 이상의 비인간 동물로부터의 세포가 이식에서 사용될 수 있다. 일부 경우, 이식편(예컨대, 이종이식편 또는 동종이식편)은 동일한 유전자형 및/또는 표현형을 갖는 둘 이상의 비인간 동물로부터의 복수의 세포를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 구현예에서, 예컨대, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 동일한 유전자형 및/또는 표현형을 갖는 둘 이상의 비인간 동물로부터의 복수의 세포(예컨대, 유전적으로 변형된 세포)를 이식하는 것을 포함할 수 있다.
비인간 동물의 집단은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물의 집단은 번식(breeding)에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 근친교배(inbreeding)는 표현형적으로 또는 유전적으로 동일한 비인간 동물 또는 비인간 동물의 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 근친교배, 예를 들어, 형제자매 대 형제자매 또는 부모 대 자녀, 또는 손자 대 조부모, 또는 증손 대 증조부가 사용될 수 있다. 근친교배의 연속적인 라운드는 결국 표현형적으로 또는 유전적으로 동일한 비인간 동물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 적어도 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50세대의 근친교배는 표현형적으로 및/또는 유전적으로 동일한 비인간 동물을 생산할 수 있다. 10-20세대의 근친교배 후, 비인간 동물의 유전적 성질은 적어도 99% 순수한 것으로 여겨진다. 지속적인 근친교배는 본질적으로 동질유전자형(isognic)인 비인간 동물을 야기할 수 있거나, 또는 비인간 동물이 일란성 쌍생아가 아닐 수 있으므로 동질유전자형과 가까운 비인간 동물을 야기할 수 있다.
번식은 동일한 유전자형을 갖는 비인간 동물을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 발현이 감소된 동일한 유전자(들)를 갖고/거나 동일한 전이유전자(들)를 갖는다. 번식은 또한 상이한 유전자형을 갖는 비인간 동물을 사용하여 수행될 수 있다. 번식은 유전적으로 변형된 비인간 동물 및 유전적으로 변형되지 않은 비인간 동물, 예를 들어, 유전적으로 변형된 암컷 돼지 및 야생형 수컷 돼지, 또는 유전적으로 변형된 수컷 돼지 및 야생형 암컷 돼지를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 번식의 모든 조합은 원하는 비인간 동물을 생산하는 데 사용될 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물의 집단은 또한 클로닝에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물 세포의 집단은 유전적으로 또는 표현형적으로 동일한 개별적인 비인간 동물의 유사한 집단을 무성적으로 생산하고 있을 수 있다. 클로닝은 쌍둥이형성(예컨대, 배아로부터 하나 이상의 세포를 분리시키고 이를 새로운 배아로 성장시키는 것), 체세포 핵 이식, 또는 인공 수정과 같은, 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 보다 상세한 설명은 본 명세서 전체에 제공된다.
II. 유전적으로 변형된 세포
질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 유전적으로 변형된 세포가 본원에 개시된다. 이러한 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 개시된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물은 하나 이상의 세포가 단리되어 단리된 유전적으로 변형된 세포를 생산하도록 처리될 수 있다. 이러한 단리된 세포는 또한 일부 경우 더 유전적으로 변형된 세포일 수 있다. 그러나, 세포는 변형된 또는 비-변형된 인간 또는 비인간 동물 세포를 사용하여, 생체외에서, 예컨대 동물 외부에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 세포(인간 및 비인간 동물 세포 포함)는 배양에서 변형될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 본원에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물을 생성하는 데 사용될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 동물로부터 단리될 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형되지 않은 동물로부터의 세포로부터 유래될 수 있다. 세포의 단리는 일차 세포 단리 및 배양의 방법을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 인간으로부터 추출되지 않는다는 것이 특히 고려된다.
따라서, 명세서 전반에 기재된 바와 같은 다양한 제조 방법을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물에 적용될 수 있는 어떤 것도 본원에 적용될 수 있다. 예를 들어, 파괴된 모든 유전자 및 과발현된 전이유전자가 본원에 사용된 유전적으로 변형된 세포를 제조하는데 적용가능하다. 또한, 명세서 전반에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물에서 유전자의 유전자형 및 발현을 시험하기 위한 임의의 방법이 세포의 유전적 변형을 시험하는 데 사용될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포는 로라시아상목의 구성원 또는 비인간 영장류로부터 유래될 수 있다. 이러한 유전적으로 변형된 세포는 로라시아상목의 구성원 또는 비인간 영장류로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 이러한 유전적으로 변형된 세포는 로라시아상목의 구성원 또는 비인간 영장류로부터 비롯될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는, 예컨대, 세포 배양 또는 유전적 변형 방법을 사용하여, 로라시아상목의 구성원 또는 비인간 영장류로부터 단리된 세포로부터 제조될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 유전적으로 변형된 동물로부터의 세포 또는 생체외에서 제조된 세포는 분석되고 분류될 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 유세포분석법, 예컨대, 형광-활성화 세포 분류에 의해 분석되고 분류될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 세포는 전이유전자에 코딩된 폴리펩티드를 인식하는 표지(예컨대, 형광 표지)에 기초한 유세포분석법을 사용하여 다른 세포로부터 검출되고 정제될 수 있다.
비인간 동물 및 인간 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포가 사용될 수 있다. 줄기 세포는 생존가능한 인간을 생성하는 능력이 없다. 예를 들어, 줄기 세포는 생존가능한 인간을 생성할 수 없도록 비가역적으로 분화될 수 있다. 줄기 세포는 생존가능한 인간을 생성할 수 없다는 경고에도 불구하고, 만능(pluripotent)일 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물에 관한 섹션에서 상기 논의된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포는 발현이 감소된 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물에 대해 상기 개시된 바와 같은 동일한 유전자가 파괴될 수 있다. 예를 들어, 발현이 파괴된, 예컨대, 감소된 하나 이상의 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 하나 이상의 유전자는 NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, CXCL10, MICA, MICB, C3, CIITA 및/또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 또한, 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는 ICP47, CD46, CD55, CD 59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 갈렉틴-9, 이의 임의의 기능적 단편, 또는 이의 임의의 조합의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 감소된 유전자 및 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현이 감소된 하나 이상의 유전자는 NLRC5, TAP1, GGTA1, B4GALNT2, CMAH, CXCL10, MICA, MICB, CIITA, 및/또는 이의 임의의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, CD 59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 갈렉틴-9, 이의 임의의 기능적 단편, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 NLRC5, C3, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 및 갈렉틴-9를 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 TAP1, C3, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 및 갈렉틴-9를 포함한다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 NLRC5, TAP1, C3, GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 및 갈렉틴-9를 포함한다. 일부 경우, 본원의 전이유전자에 의해 코딩된 CD47, PD-L1, 및 PD-L2는 인간 CD47, 인간 PD-L1 및 인간 PD0-L2일 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 그의 표면 상에 CD47로 코팅될 수 있다. 세포의 표면 상에 CD47의 코팅은, 세포 표면을 바이오티닐화한 후 상기 바이오티닐화된 세포를 스트렙타비딘-CD47 키메라 단백질과 함께 인큐베이션함으로써 달성될 수 있다. 코팅된 CD47은 인간 CD47일 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물에 관한 섹션에서 상기 논의된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 파괴된 유전자를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다.
상기에 상세히 논의된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 돼지 세포는 또한 하나 이상의 넉다운 유전자를 발현하는 우성 음성 전이유전자 및/또는 전이유전자를 포함할 수 있다. 또한 상기 논의된 바와 같이, 전이유전자의 발현은 하나 이상의 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포는 조직 또는 장기로부터의 하나 이상의 세포일 수 있고, 상기 조직 또는 장기는 뇌, 폐, 간, 심장, 비장, 췌장, 소장, 대장, 골격근, 평활근, 피부, 뼈, 지방 조직, 모발, 갑상선, 기도, 담낭, 신장, 요관, 방광, 대동맥, 정맥, 식도, 횡격막, 위, 직장, 부신, 기관지, 귀, 눈, 망막, 생식기, 시상하부, 후두, 코, 혀, 척수, 또는 요관, 자궁, 난소 및 고환을 포함한다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 돼지 세포는 뇌, 심장, 간, 피부, 장, 폐, 신장, 눈, 소장, 또는 췌장으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 세포는 췌장으로부터 유래될 수 있다. 더욱 구체적으로, 췌장 세포는 췌도 세포일 수 있다. 또한, 하나 이상의 세포는 췌장 α 세포, 췌장 β 세포, 췌장 δ 세포, 췌장 F 세포(예컨대, PP 세포), 또는 췌장 ε 세포일 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는 췌장 β 세포일 수 있다. 본원에 개시된 조직 또는 장기는 하나 이상의 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있다. 조직 또는 장기는 본원에 기재된 하나 이상의 유전적으로 변형된 동물로부터 유래될 수 있고, 예컨대, 췌도와 같은 췌장 조직은 하나 이상의 유전적으로 변형된 돼지로부터 유래될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 돼지 세포는 하나 이상의 유형의 세포를 포함할 수 있고, 하나 이상의 유형의 세포는 모세포(trichocyte), 케라티노사이트(keratinocyte), 성선 자극 호르몬 분비세포(gonadotrope), 코르티코트로프성세포(corticotrope), 갑상샘자극호르몬분비세포(thyrotrope), 성장호르몬분비세포(somatotrope), 프로락틴분비세포(lactotroph), 크롬친화 세포(chromaffin cell), 소포곁 세포(parafollicular cell), 사구 세포 멜라노사이트(glomus cells melanocyte), 모반 세포(nevus cell), 메르켈 세포(merkel cell), 치아모세포(odontoblast), 백악모세포(cementoblast) 각막세포(corneal keratocyte), 망막 뮬러 세포(retina muller cell), 망막 색소 상피 세포, 뉴런, 아교세포(glia)(예컨대, 희소돌기 아교세포 성상세포), 뇌실막세포(ependymocyte), 송과체세포(pinealocyte), 폐포세포(pneumocyte)(예컨대, I형 폐포세포, 및 II형 폐포세포), 클라라 세포(clara cell), 배상 세포(goblet cell), G 세포, D 세포, ECL 세포, 위의 주세포(gastric chief cell), 벽 세포(parietal cell), 소와 세포(foveolar cell), K 세포, D 세포, I 세포, 배상 세포(goblet cell), 파네스 세포(paneth cell), 장세포(enterocyte), 미세주름(microfold cell), 간세포, 간 성상세포(hepatic stellate cell)(예컨대, 중배엽으로부터의 쿠퍼 세포(Kupffer cell)), 쓸개세포(cholecystocyte), 샘꽈리중심 세포(centroacinar cell), 췌장 성상 세포, 췌장 α 세포, 췌장 β 세포, 췌장 δ 세포, 췌장 F 세포(예컨대, PP 세포), 췌장 ε 세포, 갑상선(예컨대, 여포 세포), 부갑상선(예컨대, 부갑상선 주 세포), 호산 세포(oxyphil cell), 요로상피 세포(urothelial cell), 골아세포(osteoblast), 골세포, 연골모세포(chondroblast), 연골세포(chondrocyte), 섬유아세포, 섬유세포, 근아세포, 근세포, 근위성 세포, 힘줄 세포, 심장 근육 세포, 지방모세포(lipoblast), 지방세포(adipocyte), 카할(cajal)의 간질 세포, 혈관모세포(angioblast), 내피 세포, 혈관사이 세포(mesangial cell)(예컨대, 사구체내 혈관사이 세포 및 사구체밖 혈관사이 세포), 사구체곁 세포(juxtaglomerular cell), 치밀반 세포(macula densa cell), 기질 세포, 간질 세포, 텔로사이트 단순 상피 세포(telocytes simple epithelial cell), 발세포(podocyte), 신장 근위 세뇨관 솔가장자리 세포(kidney proximal tubule brush border cell), 세르톨리 세포, 라이디히 세포, 과립막 세포, 페그 세포(peg cell), 생식 세포, 정자 난자(spermatozoon ovum), 림프구, 골수 세포, 내피 전구 세포, 내피 줄기 세포, 혈관모세포(angioblast), 중간혈관모세포(mesoangioblast), 및 혈관주위세포 벽세포(pericyte mural cell)를 포함한다. 유전적으로 변형된 세포는 잠재적으로 세포 요법에서 사용되는 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포 요법은 당뇨병과 같은 질환에 대한 췌장 β 세포 보충물 또는 대체물일 수 있다.
유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 돼지 세포는 비인간 동물로부터 유래(예컨대, 추출)될 수 있다. 하나 이상의 세포는 성숙한 성체 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 그러나, 하나 이상의 세포는 태아 또는 신생아 조직으로부터 유래될 수 있다.
질환에 따라, 하나 이상의 세포는 성체 공여자, 예컨대, 췌도 세포 공여자로서 유용할 충분한 크기로 성장한 형질전환 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물은 이유가 지난 연령일 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 적어도 또는 적어도 약 6개월령일 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물은 적어도 또는 적어도 약 18개월령일 수 있다. 비인간 동물은, 일부 경우, 번식 적령기에 이를 때까지 생존한다. 예를 들어, 이종이식용 췌도는 신생아(예컨대, 3-7일령) 또는 이유 전(예컨대, 14일 내지 21일령) 공여자 돼지로부터 유래될 수 있다. 하나 이상의 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 돼지 세포는 배양된 세포일 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포는 야생형 세포 또는 유전적으로 변형된 세포(본원에 기재된 바와 같음)로부터 유래될 수 있다. 더욱이, 배양된 세포는 일차 세포일 수 있다. 일차 세포는 추출되고, 예컨대, 액체 질소에서 또는 -20℃ 내지 -80℃에서 동결될 수 있다. 배양된 세포는 또한 공지된 방법에 의해 불멸화될 수 있고, 예컨대, 액체 질소에서 또는 -20℃ 내지 -80℃에서 동결되고 보관될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 돼지 세포는 야생형 유전적으로 변형되지 않은 세포가 이식될 때와 비교하여, 더 낮은 거부반응의 위험을 가질 수 있다.
ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 갈렉틴-9, 이의 임의의 기능적 단편, 또는 이의 임의의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 이러한 벡터는 세포의 지놈 내로 삽입될 수 있다(형질감염, 형질전환, 바이러스 전달, 또는 임의의 다른 공지된 방법에 의해). 이러한 벡터는 ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M Spi9, PD-L1, PD-L2, CD47, 및/또는 갈렉틴-9 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩할 수 있다.
고려되는 벡터는, 비제한적으로, 플라스미드 벡터, 인공/미니-염색체, 트랜스포존(transposon), 및 바이러스 벡터를 포함한다. RNA를 포함하는 단리된 또는 합성 핵산이 본원에 추가로 개시되며, 상기 RNA는 표 2의 임의의 서열에 의해 코딩된다. RNA는 또한 표 2의 임의의 서열에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 상동성을 나타내는 임의의 서열을 코딩할 수 있다. RNA는 또한 표 2의 임의의 서열에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 나타내는 임의의 서열을 코딩할 수 있다.
RNA는 단일쇄 가이드 RNA일 수 있다. 본 개시내용은 또한 표 1의 임의의 서열을 포함하는 단리된 또는 합성된 핵산을 제공한다. RNA는 또한 표 1의 임의의 서열에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 상동성을 나타내는 단리된 또는 합성된 핵산을 제공할 수 있다. RNA는 또한 표 1의 임의의 서열에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 나타내는 단리된 또는 합성된 핵산을 제공할 수 있다.
가이드 RNA 서열은 비인간 동물의 지놈 내의 하나 이상의 유전자를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 서열은 비인간 동물의 지놈 내의 단일 유전자를 표적화할 수 있다. 일부 경우, 가이드 RNA 서열은 비인간 동물의 지놈 내의 하나 이상의 각 유전자의 하나 이상의 표적 부위를 표적화할 수 있다.
유전적으로 변형된 세포는 또한 백혈구, 림프구, B 림프구, 또는 임의의 다른 세포, 예컨대 췌도 세포, 췌도 베타 세포, 또는 간세포일 수 있다. 이러한 세포는 본원에 개시된 임의의 방법에 의해, 예컨대, ECDI 고정에 의해, 고정되거나 세포자멸성이 될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포는 비인간 태아 동물, 주산기(perinatal) 비인간 동물, 신생아 비인간 동물, 이유 전(preweaning) 비인간 동물, 어린 성체 비인간 동물, 성체 비인간 동물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래(예컨대, 회수)될 수 있다. 일부 경우, 유전적으로 변형된 비인간 동물 세포는 배아 조직, 예컨대, 배아 췌장 조직으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는 배아 42일(E42)로부터의 배아 돼지 췌장 조직으로부터 유래(예컨대, 회수)될 수 있다.
용어 "태아 동물" 및 그의 문법적 등가물은 임의의 태어나지 않은 동물의 새끼를 지칭할 수 있다. 용어 "주산기(perinatal) 동물" 및 그의 문법적 등가물은 출산 직전 또는 직후의 동물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 주산기 기간은 임신 20주 내지 28주에 시작하여 출산 후 1 내지 4주에 끝날 수 있다. 용어 "신생아 동물" 및 그의 문법적 등가물은 임의의 새로 태어난 동물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 신생아 동물은 1개월 이내에 태어난 동물일 수 있다. 용어 "이유전(preweaning) 비인간 동물" 및 그의 문법적 등가물은 모유를 중단하기 전의 임의의 동물을 지칭할 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물 세포는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물 세포는 약학적으로 허용되는 부형제와 조합될 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 염수이다. 약학 조성물은 이식을 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포는 임의의 유전자의 감소된 발현, 및/또는 본원에 개시된 임의의 전이유전자를 포함할 수 있다. 세포의 유전적 변형은 유전적으로 변형된 동물을 제조하기 위해 본원에 기재된 것과 동일한 방법 중 어느 것을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물로부터 비롯된 유전적으로 변형된 동물을 제조하는 방법은 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 것 및/또는 하나 이상의 전이유전자를 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 유전자 발현의 감소 및/또는 전이유전자 삽입은 본원에 기재된 임의의 방법, 예컨대, 유전자 편집을 사용하여 수행될 수 있다.
줄기 세포로부터 유래된 유전적으로 변형된 세포
유전적으로 변형된 세포는 줄기 세포일 수 있다. 이러한 유전적으로 변형된 줄기 세포는 차후에 본원에 개시된 방법에 의해 고정된 또는 세포자멸성 세포로 가공될 수 있는 세포를 잠재적으로 무제한으로 공급하는 데 사용될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 줄기 세포는 생존가능한 인간을 생성할 수 없다.
인간 만능 줄기 세포로부터 수억개의 인슐린 생산, 글루코스 반응성 췌장 베타 세포의 생산은 당뇨병에서 세포 이식 요법을 위한 전례가 없는 세포 공급원을 제공한다(Pagliuca et al., 2014). 당뇨병 및 다른 질환에서 세포 이식 요법을 위한 다른 인간 줄기 세포-(배아, 만능, 태반, 유도된 만능 등) 유래의 세포 공급원이 개발되고 있다.
이러한 줄기 세포 유래의 세포 이식편은 거부반응 대상이다. 거부반응은 CD8+ T 세포에 의해 매개될 수 있다. 1형 당뇨병 수용자에서, 인간 줄기 세포 유래의 기능적 베타 세포는 거부반응 및 자가면역 재발 대상이다. 이 둘은 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 것으로 여겨진다.
이러한 동종반응성 및 자가반응성 CD8+ T 세포의 활성화 및 이펙터 기능을 방해하기 위해, CRISP/Cas9 유전자 표적화를 포함하는 유전자 변형의 확립된 분자 방법이 줄기 세포 유래의 부분적으로 또는 전체적으로 분화된 세포 이식편에서 기능적 MHC 클래스 I의 세포 표면 발현을 방지하기 위한 목적으로 인간 줄기 세포에서 NLRC5, TAP1, 및/또는 B2M 유전자를 돌연변이시키는데 사용될 수 있다. 따라서, MHC 클래스 I의 기능적 발현이 결핍된 인간 줄기 세포 유래의 세포 이식편을 이식하는 것은 거부반응 및 자가면역 재발을 예방하는데 필요한 면역억제의 필요성을 최소화할 수 있다.
그러나, 이식된 인간 세포 상의 MHC 클래스 I 발현의 결여는 자연 살해(NK) 세포의 수동적 활성화를 유발할 가능성이 있을 것이다(Ohlen et al, 1989). NK 세포 세포독성은 NK 세포 상의 억제성 수용체 CD94/NKG2A를 자극하여 세포 사멸을 예방하는 인간 MHC 클래스 1 유전자, HLA-E의 발현에 의해 극복될 수 있다(Weiss et al., 2009; Lilienfeld et al., 2007; Sasaki et al., 1999). HLA-E 유전자의 성공적인 발현은 인간 B2M(베타 2 마이크로글로불린) 유전자 및 동족 펩티드의 공동 발현에 좌우되었다(Weiss et al., 2009; Lilienfeld et al., 2007; Sasaki et al., 1999; Pascasova et al., 1999). 줄기 세포 DNA에서 뉴클레아제 매개 절단은 상동 유도 복구를 통해 하나 또는 다수의 유전자의 삽입을 가능하게 한다. 일련의 HLA-E 및 hB2M 유전자는 뉴클레아제 매개 DNA 절단의 영역에 혼입되어, 전이유전자를 삽입하면서 표적 유전자(예를 들어, NLRC5)의 발현을 예방할 수 있다.
MHC 클래스 I의 기능적 발현이 결여된 줄기 세포 유래의 세포 이식편의 수용자에서 유지 면역억제에 대한 필요성을 제거하지는 않더라도 더 최소화하기 위해, 이러한 이식편의 수용자는 또한 본원에 개시된 관용화 세포자멸 공여자 세포로 처리될 수 있다.
인슐린 생산 췌장 베타 세포의 생산 방법(Pagliuca et al., 2014)은 잠재적으로 비인간(예컨대, 돼지) 일차 단리된 만능, 배아 줄기 세포 또는 줄기 유사 세포에 적용될 수 있다(Goncalves et al., 2014; Hall et al. V. 2008). 그러나, 이러한 인슐린 생산 췌장 베타 세포의 수용자는 이식편의 성공을 위협하는 활발한 면역 반응을 가질 가능성이 있다. 항체 매개성 및 CD8+ T 세포 면역 공격을 극복하기 위해, 공여자 동물은 일차 비인간 만능, 배아 줄기 세포 또는 줄기 유사 세포의 단리 전에 유전적으로 변형되어 본원의 전반에 개시된 바와 같은 GGTA1, CMAH, B4GalNT2, 또는 MHC 클래스 I 관련 유전자의 발현을 예방할 수 있다. 이후, 유전적으로 변형된 동물로부터 단리된 만능, 배아 줄기 세포 또는 줄기 유사 세포는 수백만 개의 인슐린 생산 췌장 베타 세포로 분화될 수 있다.
이종 줄기 세포 유래의 세포 이식이 일부 경우에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포의 사용은 수용자에게 윤리적으로 부적당할 수 있다. 따라서, 인간 수용자는 배아 줄기 세포의 비인간 공급원으로부터 유래된 세포 이식편을 받는데 더 편안함을 느낄 수 있다.
비인간 줄기 세포는 돼지 줄기 세포를 포함할 수 있다. 이러한 줄기 세포는 야생형 돼지 또는 유전적으로 조작된 돼지로부터 유래될 수 있다. 야생형 돼지로부터 유래되는 경우, CRISP/Cas9 유전자 표적화를 포함하는 확립된 유전자 변형의 분자 방법을 사용한 유전적 조작이 줄기 세포 단계에서 가장 잘 수행될 수 있다. 유전적 조작은 NLRC5, TAP1, 및/또는 B2M 유전자의 발현을 파괴하여 MHC 클래스 I의 기능적 발현을 예방하도록 표적화될 수 있다. 이식편에서 NLRC5, TAP1, 및 B2M과 같은 유전자의 파괴는 췌도 베타 세포를 포함하는 이식편 세포 상의 MHC 클래스 I의 기능적 발현의 결여를 유발하여, 자가반응 CD8+ T 세포의 이식후 활성화를 방해할 수 있다. 따라서, 이는 자가반응 CD8+ T 세포의 세포용해 이펙터 기능으로부터 이식편, 예컨대 이식된 췌도 베타 세포를 보호할 수 있다.
그러나, 줄기 세포의 유전적 조작이 이들의 분화 잠재성을 변경할 수 있기 때문에, 접근법은 NLRC5, TAP1, 및/또는 B2M 유전자의 발현이 파괴된 돼지를 포함하는 유전적으로 조작된 돼지로부터 줄기 세포주를 생성하는 것일 수 있다.
GGTA1, CMAH, B4GalNT2 유전자의 발현을 방지하기 위해 유전적으로 변형되거나 또는 본원 전반에 개시된 바와 같이, 보체 조절 단백질 CD46, CD55, 또는 CD59를 코딩하는 전이유전자를 발현하기 위해 변형된 돼지로부터 줄기 세포를 생성하는 것은 인슐린 생산 췌장 베타 세포 또는 다른 세포 요법 생성물의 치료적 용도를 추가로 개선할 수 있다. 마찬가지로, 본원에 기재된 것과 동일한 전략이 명세서 전반에 기재된 다른 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
MHC 클래스 I의 기능적 발현이 결여된 인간 줄기 세포 유래의 세포 이식편의 수용자에서와 마찬가지로, 돼지 줄기 세포 유래의 이식편의 수용자에서 유지 면역억제의 필요성은 관용화 세포자멸 공여자 세포를 이용한 주변이식 처리에 의해 더 최소화될 수 있다.
III. 관용화 백신
전통적으로, 백신은 숙주에 면역을 부여하기 위해 사용된다. 예를 들어, 불활성화된 바이러스를 보조제와 함께 피부 아래에 주사하는 것은 활성 및/또는 독성 형태의 바이러스에 대해 일시적 또는 영구적 면역을 야기할 수 있다. 이것은 양성 백신으로서 지칭될 수 있다(도 3). 그러나, 정맥내로 주사되는 불활성화된 세포(예컨대, 공여자 또는 공여자와 유전적으로 상이한 동물로부터의 세포)는 공여자 세포, 또는 유사한 세포 마커를 갖는 세포의 관용을 초래할 수 있다. 이는 관용화 백신(음성 백신으로도 지칭됨)으로 지칭될 수 있다(도 3). 불활성 세포는 보조제 없이 주사될 수 있다. 대안적으로, 불활성 세포는 보조제와 함께 주사될 수 있다. 이러한 관용화 백신은 수용자를 관용화하고 거부반응을 예방함으로써, 이식에, 예를 들어, 이종이식에 유리할 수 있다. 관용화는 면역억제 요법을 사용하지 않고 수용자에게 부여될 수 있다. 그러나, 일부 경우, 관용화 백신와 조합된 다른 면역억제 요법이 이식 거부반응을 감소시킬 수 있다.
도 4는 일시적인 면역억제의 보호하에 관용화 백신접종을 위한 공여자로부터의 세포자멸성 세포의 주입(예컨대, 정맥내 주입)으로 대상(예컨대, 인간 또는 비인간 영장류)에서 이식된 이식편(예컨대, 이종이식편)의 생존을 연장시키는 예시적인 접근법을 입증한다. 공여자는 이식을 위한 이종이식편(예컨대, 췌도), 뿐만 아니라 관용화 백신으로서 세포(예컨대, 비장 세포)를 제공할 수 있다. 관용화 백신 세포는 세포자멸성 세포(예컨대, ECDI 고정에 의해)일 수 있고 수용자 이식 전(예컨대, 이식 전 7일에 1차 백신) 및 이식 후(예컨대, 이식 후 1일에 부스터 백신)에 투여될 수 있다. 관용화 백신은 이식된 이식편(예컨대, 췌도)의 생존 시간을 연장시키는 일시적인 면역억제를 제공할 수 있다.
관용화 백신은 하기 유형의 세포 중 하나 이상을 포함할 수 있다: i) GGTA1 단독, 또는 GGTA1 및 CMAH, 또는 GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 발현을 갖는 유전자형적으로 동일한 세포를 포함하는 세포자멸성 세포. 이는 세포자멸성 세포 백신 공여자 동물과 유전자형적으로 동일한 동물로부터의, 또는 추가적인 유전적 변형(예컨대, NLRC5, TAP1, MICA, MICB, CXCL10, C3, CIITA 유전자의 억제 또는 ICP47, CD46, CD55, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, CD59, 또는 이의 임의의 기능적 단편의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자의 발현)을 겪었으나 세포자멸성 세포 백신이 유래된 공여자 동물과 유전자형적으로 유사한 동물로부터의 장기, 조직, 세포, 및 세포주 이식편(예컨대, 이종이식편)에 대한 세포 매개성 면역 및 세포-의존적 항체 매개성 면역을 최소화하거나 제거할 수 있다; ii) 세포자멸성 세포 백신 공여자 동물과 유전자형적으로 동일한 동물로부터의 또는 추가적인 유전적 변형(예컨대, NLRC5, TAP1, MICA, MICB, CXCL10, C3, CIITA 유전자의 억제 또는 ICP47, CD46, CD55, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, CD59, 또는 이의 임의의 기능적 단편의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 전이유전자의 발현)을 겪었으나 세포자멸 줄기 세포 유래의 세포 백신이 유래된 공여자 동물과 유전자형적으로 유사한 동물로부터의 장기, 조직, 세포, 및 세포주 이식편(예컨대, 이종이식편)에 대해 세포 매개성 면역 및 세포-의존적 항체 매개성 면역을 최소화하거나 제거하기 위한 세포자멸 줄기 세포(예컨대, 배아, 만능, 태반, 유도된 만능 등) 유래의 공여자 세포(예컨대, 백혈구, 림프구, T 림프구, B 림프구, 적혈구 세포, 이식편 세포, 또는 임의의 다른 공여자 세포); iii) 인간 줄기 세포주와 유전적으로 동일한 장기, 조직, 세포, 및 세포 이식편(예컨대, 동종이식편)에 대한 또는 유전적 변형(예컨대, NLRC5, TAP1, MICA, MICB, CXCL10, C3, CIITA 유전자의 억제)을 겪었으나 세포자멸 인간 줄기 세포 유래의 공여자 세포 백신과 유전자형적으로 유사한 동일한 줄기 세포로부터 유래된 이식편(예컨대, 동종이식편)에 대한 세포 매개성 면역 및 세포-의존적 항체 매개성 면역을 최소화하거나 제거하기 위한 세포자멸 줄기 세포(예컨대, 배아, 만능, 태반, 유도된 만능 등) 유래의 공여자 세포(백혈구, 림프구, T 림프구, B 림프구, 적혈구 세포, 이식편 세포, 예컨대 기능적 췌도 베타 세포, 또는 임의의 다른 공여자 세포); iv) UV 조사, 감마-조사, 또는 ECDI의 존재하에서의 인큐베이션을 포함하지 않는 다른 방법에 의해 세포자멸성이 된 세포자멸 공여자 세포. 일부 경우, 관용화 백신 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있고, 예컨대, 주입될 수 있다(일부 경우 반복적으로 주입됨). 관용화 백신은 세포로부터 하나 이상의 유전자를 파괴함으로써(예컨대, 발현을 감소시킴으로써) 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 전반에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포는 관용화 백신을 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 당단백질 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1), 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH), B4GALNT2, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함하는 파괴될 수 있는(예컨대, 감소된 발현) 하나 이상의 유전자를 가질 수 있다. 예를 들어, 세포는 파괴된 GGTA1 단독, 또는 파괴된 CMAH 단독, 또는 파괴된 B4GALNT2 단독을 가질 수 있다. 세포는 또한 파괴된 GGTA1 및 CMAH, 파괴된 GGTA1 및 B4GALNT2, 또는 파괴된 CMAH 및 B4GALNT2를 가질 수 있다. 세포는 파괴된 GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2를 가질 수 있다. 일부 경우, 파괴된 유전자는 GGTA1을 포함하지 않는다. 세포는 또한 NLRC5(내인성으로 또는 외인성으로)를 발현할 수 있지만, GGTA1 및/또는 CMAH는 파괴된다. 세포는 또한 파괴된 C3을 가질 수 있다.
관용화 백신은, 예컨대 본원 전반에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 전이유전자를 부가적으로 발현하는 것을 포함하는 세포를 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 감염된 세포 단백질 47(ICP47), 분화 클러스터 46(CD46), 분화 클러스터 55(CD55), 분화 클러스터 59(CD 59), HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, PD-L1, PD-L2, CD47, 이의 임의의 기능적 단편, 또는 이의 임의의 조합의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함하는 하나 이상의 전이유전자를 포함하는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 관용화 백신은 GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 단백질 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-G1, PD-L1, PD-L2, 및 CD47을 포함한다. 일부 경우, 관용화 백신은 GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 단백질 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 HLA-E, PD-L1, PD-L2, 및 CD47을 포함한다. 일부 경우, 관용화 백신은 그의 표면 상에 CD47로 코팅된 세포를 포함할 수 있다. 세포의 표면 상에 CD47의 코팅은 세포 표면을 바이오티닐화한 후 이러한 바이오티닐화된 세포를 스트렙타비딘-CD47 키메라 단백질과 함께 배양함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 그의 표면 상에 CD47로 코팅된 세포를 포함할 수 있고, 상기 세포는 GGTA1, CMAH, 및 B4GALNT2의 감소된 단백질 발현, 및 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함하고, 상기 단백질은 HLA-G1, PD-L1, 및 PD-L2를 포함한다. CD47-코팅된 세포는 비세포자멸성 세포일 수 있다. 대안적으로, CD47 코팅된 세포는 세포자멸성 세포일 수 있다.
대상체에서 투여될 때, 관용화 백신의 세포는 순환 반감기를 가질 수 있다. 관용화 백신의 세포는 적어도 또는 적어도 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, 24, 36, 48, 60, 또는 72시간의 순환 반감기를 가질 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신의 순환 반감기는 0.1 내지 0.5; 0.5 내지 1.0; 1.0 내지 2.0; 1.0 내지 3.0; 1.0 내지 4.0; 1.0 내지 5.0; 5 내지 10; 10 내지 15; 15 내지 24; 24 내지 36; 36 내지 48; 48 내지 60; 또는 60 내지 72시간 또는 약 0.1 내지 0.5; 0.5 내지 1.0; 1.0 내지 2.0; 1.0 내지 3.0; 1.0 내지 4.0; 1.0 내지 5.0; 5 내지 10; 10 내지 15; 15 내지 24; 24 내지 36; 36 내지 48; 48 내지 60; 또는 60 내지 72시간일 수 있다. 관용화 백신 내의 세포는 그의 순환 반감기를 향상시키기 위해 처리될 수 있다. 이러한 처리는 세포를 단백질, 예컨대, CD47로 코팅하는 것을 포함할 수 있다. 그의 순환 반감기를 향상시키기 위해 처리되는 세포는 비세포자멸성 세포일 수 있다. 그의 순환 반감기를 향상시키기 위해 처리되는 세포는 세포자멸성 세포일 수 있다. 대안적으로, 관용화 백신 내의 세포는 그의 순환 반감기를 향상시키기 위해 유전적으로 변형(예컨대, 그의 지놈 내의 CD47과 같은 전이유전자의 삽입)될 수 있다. 그의 순환 반감기를 향상시키기 위해 유전적으로 변형되는 세포는 비세포자멸성 세포일 수 있다. 그의 순환 반감기를 향상시키기 위해 유전적으로 변형되는 세포는 세포자멸성 세포일 수 있다.
관용화 백신은 하나 이상의 파괴된 유전자(예컨대, 감소된 발현) 및 하나 이상의 전이유전자 모두를 가질 수 있다. 임의의 유전자 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 전이유전자가 사용될 수 있다.
하나 이상의 파괴된 유전자(예컨대, 감소된 발현)를 포함하는 세포가 관용화 백신으로서 또는 이의 일부로서 사용될 수 있다. 즉, 하나 이상의 파괴된 유전자를 포함하는 세포는 관용화 백신일 수 있거나 관용화 백신으로 제조될 수 있다.
관용화 백신은 이식에 사용된 세포, 장기, 및/또는 조직와 동일한 유전자형 및/또는 표현형을 가질 수 있다. 때때로, 관용화 백신 및 이식의 유전자형 및/또는 표현형은 상이하다. 이식 수용자를 위해 사용된 관용화 백신은 이식편 공여자로부터의 세포를 포함할 수 있다. 이식 수용자를 위해 사용된 관용화 백신은 이식편과 유전적으로 및/또는 표현형적으로 상이한 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 이식 수용자를 위해 사용된 관용화 백신은 이식편 공여자로부터의 세포 및 이식편과 유전적으로 및/또는 표현형적으로 상이한 세포를 포함할 수 있다. 이식편과 유전적으로 및/또는 표현형적으로 상이한 세포는 이식편 공여자의 동일한 종의 동물로부터 유래될 수 있다.
관용화 백신을 위한 세포의 공급원은 인간 또는 비인간 동물로부터 유래될 수 있다.
본원 전반에 개시된 바와 같은 세포는 관용화 백신으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 본원에 개시된 하나 이상의 이식된 세포로 구성될 수 있다. 대안적으로, 관용화 백신은 이식된 세포의 어느 것과 상이한 하나 이상의 세포로 구성될 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신으로 제조된 세포는 이식된 세포의 어느 것과 유전자형적으로 및/또는 표현형적으로 상이할 수 있다. 그러나 일부 경우, 관용화 백신은 NLRC5를 발현할 것이다(내인성으로 또는 외인성으로). 관용화 백신은 이식에서 세포, 장기, 및/또는 조직의 생존을 촉진할 수 있다. 관용화 백신은 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직과 유전자형적으로 동일하거나 유사한 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 공여자 돼지 세포, 장기, 및/또는 조직과 유전자형적으로 동일하거나 유사한 돼지(예컨대, 세포자멸 돼지 세포)로부터 유래된 세포일 수 있다. 이후, 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직은 동종이식편 또는 이종이식편에서 사용될 수 있다. 일부 경우, 관용화 백신을 위한 세포는 GGTA1, CMAH, 및 B4GalNT2의 감소된 발현을 갖고, HLA-G(또는 HLA-E-), 인간 CD47, 인간 PD-L1 및 인간 PD-L2를 코딩하는 전이유전자를 갖는 유전적으로 변형된 동물(예컨대, 돼지)로부터 유래될 수 있다. 이식편 공여자 동물은 관용화 백신 세포를 위해 동물(예컨대, 돼지)을 유전적으로 더 변형함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 이식편 공여자 동물은 관용화 백신 세포를 위해 상기 언급된 동물에서 부가적인 유전자(예컨대, NLRC5(또는 TAP1), C3, 및 CXCL10)를 파괴함으로써 생성될 수 있다(도 5).
관용화 백신은 비인간 동물 세포(예컨대, 비인간 포유동물 세포)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물 세포는 돼지, 고양이, 소, 사슴, 개, 흰담비(ferret), 가우어(gaur), 염소, 말, 마우스, 무플론(mouflon), 노새(mule), 토끼, 랫트, 양, 또는 영장류로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 비인간 동물 세포는 돼지 세포일 수 있다. 관용화 백신은 또한 유전적으로 변형된 비인간 동물 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물 세포는 죽은 세포(예컨대, 세포자멸성 세포)일 수 있다. 관용화 백신은 또한 본원에 개시된 임의의 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있다.
관용화 백신을 제조하기 위한 세포의 처리
관용화 백신은 화학물질로 처리된 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 처리는 세포의 세포자멸을 유도할 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 세포자멸성 세포는 숙주 항원 제시 세포(예컨대, 비장에서)에 의해 들어 올려져 비-면역원성 방식으로 숙주 면역 세포(예컨대, T 세포)에게 제시되어 면역 세포(예컨대, T 세포)에서 아네르기(anergy)의 유도를 야기할 수 있다.
관용화 백신은 세포자멸성 세포 및 비세포자멸성 세포를 포함할 수 있다. 관용화 백신 내의 세포자멸성 세포는 관용화 백신 내의 비세포자멸성 세포와 유전적으로 동일할 수 있다. 대안적으로, 관용화 백신 내의 세포자멸성 세포는 관용화 백신 내의 비세포자멸성 세포와 유전적으로 상이할 수 있다. 관용화 백신은 고정된 세포 및 비고정된 세포를 포함할 수 있다. 관용화 백신 내의 고정된 세포는 관용화 백신 내의 비고정된 세포와 유전적으로 동일할 수 있다. 대안적으로, 관용화 백신 내의 고정된 세포는 관용화 백신 내의 비고정된 세포와 유전적으로 상이할 수 있다. 일부 경우, 고정된 세포는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(ECDI)로 고정된 세포일 수 있다.
관용화 백신 내의 세포는 화학물질, 예컨대, ECDI를 사용하여 고정될 수 있다. 상기 고정은 세포를 세포자멸성으로 만들 수 있다. 본원에 개시된 관용화 백신, 세포, 키트 및 방법은 ECDI 및/또는 ECDI 처리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(ECDI)로 처리된 세포, 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포일 수 있다. 즉, 명세서 전반에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포는 ECDI로 처리되어 관용화 백신을 생성할 수 있다. 이후, 관용화 백신은 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직의 생존을 촉진하기 위해 이식에서 사용될 수 있다. ECDI 유도체, 기능화된 ECDI, 및/또는 치환된 ECDI가 또한 관용화 백신을 위한 세포를 처리하는 데 사용될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 일부 경우, 관용화 백신을 위한 세포는 임의의 적합한 카보디이미드 유도체, 예컨대, ECDI, N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 및 당업자에 의해 이해되는 다른 카보디이미드 유도체로 처리될 수 있다.
관용화 백신을 위한 세포는 또한 ECDI의 존재하에서의 인큐베이션을 포함하지 않는 방법, 예컨대, 다른 화학물질 또는 UV 조사 또는 감마-조사와 같은 조사에 의해 세포자멸성이 될 수 있다.
ECDI는 유리 아민 및 카복실 그룹을 화학적으로 가교 결합시킬 수 있고, 예컨대, 관용화 백신 및 공여자 비인간 동물 모두를 야기하는 동물로부터의 세포, 장기, 및/또는 조직에서 세포자멸을 효과적으로 유도할 수 있다. 즉, 동일한 유전적으로 변형된 동물은 이식에 사용되는 관용화 백신 및 세포, 조직 및/또는 장기를 야기할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포는 ECDI로 처리될 수 있다. 이 ECDI 고정은 관용화 백신의 생성을 야기할 수 있다.
관용화 백신을 제조하는 데 사용될 수 있는 유전적으로 변형된 세포는 비장(비장 B 세포 포함), 간, 말초 혈액(말초 혈액 B 세포 포함), 림프절, 흉선, 골수, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 세포는 비장 세포, 예컨대, 돼지 비장 세포일 수 있다. 일부 경우, 세포는 생체외에서 확장될 수 있다. 일부 경우, 세포는 태아, 주산기(perinatal), 신생아, 이유 전(preweaning), 및/또는 어린 성체, 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 세포는 비인간 동물의 배아로부터 유래될 수 있다.
관용화 백신 내의 세포는 또한 둘 이상의 파괴된(예컨대, 감소된 발현) 유전자를 포함할 수 있고, 상기 둘 이상의 파괴된 유전자는 당단백질 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1), 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH), HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, 및 B4GALNT2, 이의 임의의 기능적 단편, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우, 상기 둘 이상의 파괴된 유전자는 GGTA1을 포함하지 않는다. 상기 기재된 바와 같이, 파괴는 유전자 발현의 넉아웃 또는 억제일 수 있다. 넉아웃은 유전자 편집에 의해, 예를 들어, CRISPR/cas 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 유전자 발현의 억제는, 예를 들어, RNA 간섭, shRNA, 하나 이상의 우성 음성 전이유전자를 사용한 넉다운에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우, 세포는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 전이유전자를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전이유전자는 CD46, CD55, CD59, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
관용화 백신 내의 세포는 또한 하나 이상의 공여자 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 세포는 동일한 공여자 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 세포는 하나 이상의 수용자 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 세포는 둘 이상의 비인간 동물(예컨대, 돼지)로부터 유래될 수 있다.
관용화 백신은 예비 수용자의 체중 kg당 0.001 내지 약 5.0 또는 약 0.001 내지 약 5.0, 예컨대, 0.001 내지 1.0 또는 약 0.001 내지 1.0의 내독소 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 수용자의 체중 kg당 0.01 내지 5.0; 0.01 내지 4.5; 0.01 내지 4.0, 0.01 내지 3.5; 0.01 내지 3.0; 0.01 내지 2.5; 0.01 내지 2.0; 0.01 내지 1.5; 0.01 내지 1.0; 0.01 내지 0.9; 0.01 내지 0.8; 0.01 내지 0.7; 0.01 내지 0.6; 0.01 내지 0.5; 0.01 내지 0.4; 0.01 내지 0.3; 0.01 내지 0.2; 또는 0.01 내지 0.1 또는 약 0.01 내지 5.0; 0.01 내지 4.5; 0.01 내지 4.0, 0.01 내지 3.5; 0.01 내지 3.0; 0.01 내지 2.5; 0.01 내지 2.0; 0.01 내지 1.5; 0.01 내지 1.0; 0.01 내지 0.9; 0.01 내지 0.8; 0.01 내지 0.7; 0.01 내지 0.6; 0.01 내지 0.5; 0.01 내지 0.4; 0.01 내지 0.3; 0.01 내지 0.2; 또는 0.01 내지 0.1의 내독소 단위를 포함할 수 있다.
관용화 백신은 μl당 1 내지 100개 또는 약 1 내지 100개의 응집체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 μl당 1 내지 5; 1 내지 10, 또는 1 내지 20 또는 약 1 내지 5; 1 내지 10, 또는 1 내지 20개의 응집체를 포함할 수 있다. 관용화 백신은 적어도 또는 적어도 약 1, 5, 10, 20, 50, 또는 100개의 응집체를 포함할 수 있다.
관용화 백신은 약 50,000개의 냉동 내지 해동된 인간 말초 혈액 단핵 세포가 관용화 백신의 약 160,000개 세포(예컨대, 돼지 세포)와 함께 인큐베이션될 때, 0.001 pg/ml 내지 10.0 pg/ml 또는 약 0.001 pg/ml 내지 10.0 pg/ml, 예컨대, 0.001 pg/ml 내지 1.0 pg/ml 또는 약 0.001 pg/ml 내지 1.0 pg/ml의 IL-1 베타의 방출을 촉발할 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 약 50,000개의 냉동 내지 해동된 인간 말초 혈액 단핵 세포가 관용화 백신의 약 160,000개의 세포(예컨대, 돼지 세포)와 함께 인큐베이션될 때 0.001 내지 10.0; 0.001 내지 5.0; 0.001 내지 1.0; 0.001 내지 0.8; 0.001 내지 0.2; 또는 0.001 내지 0.1 pg/ml 또는 약 0.001 내지 10.0; 0.001 내지 5.0; 0.001 내지 1.0; 0.001 내지 0.8; 0.001 내지 0.2; 또는 0.001 내지 0.1 pg/ml IL-1 베타의 방출을 촉발한다. 관용화 백신은 약 50,000개의 냉동 내지 해동된 인간 말초 혈액 단핵 세포가 관용화 백신의 약 160,000개의 세포(예컨대, 돼지 세포)와 함께 인큐베이션될 때, 0.001 내지 2.0 pg/ml 또는 약 0.001 내지 2.0 pg/ml, 예컨대, 0.001 내지 0.2 pg/ml 또는 약 0.001 내지 0.2 pg/ml의 IL-6의 방출을 촉발할 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 약 50,000개의 냉동 내지 해동된 인간 말초 혈액 단핵 세포가 관용화 백신의 약 160,000개의 세포(예컨대, 돼지 세포)와 함께 인큐베이션될 때, 0.001 내지 2.0; 0.001 내지 1.0; 0.001 내지 0.5; 또는 0.001 내지 0.1 pg/ml 또는 약 0.001 내지 2.0; 0.001 내지 1.0; 0.001 내지 0.5; 또는 0.001 내지 0.1 pg/ml IL-6의 방출을 촉발할 수 있다.
관용화 백신은 37℃에서 4시간 또는 약 4시간 방출후 인큐베이션 이후에 60% 초과 또는 약 60% 초과, 예컨대, 85% 초과 또는 약 85% 초과의 아넥신 V 양성, 세포자멸성 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 37℃에서 약 4시간 방출후 인큐베이션 이후에 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 초과의 아넥신 V 양성, 세포자멸성 세포를 포함한다.
관용화 백신은 0.01% 내지 10% 또는 약 0.01% 내지 10%, 예컨대, 0.01% 내지 2% 또는 약 0.01% 내지 2%의 괴사성 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 0.01% 내지 10%; 0.01% 내지 7.5%, 0.01% 내지 5%; 0.01% 내지 2.5%; 또는 0.01% 내지 1% 또는 약 0.01% 내지 10%; 0.01% 내지 7.5%, 0.01% 내지 5%; 0.01% 내지 2.5%; 또는 0.01% 내지 1%의 괴사성 세포를 포함한다.
공여자 세포의 투여 전, 동안, 및/또는 후에 ECDI 처리된 세포, 장기, 및/또는 조직을 포함하는 관용화 백신을 투여하는 것은 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에서 세포, 장기, 및/또는 조직에 대한 관용을 유도할 수 있다. ECDI 처리된 세포는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다.
ECDI 처리된 비장 세포를 포함하는 관용화 백신의 주입에 의해 유도된 관용은 온전한 프로그램된 사멸 1 수용체 - 프로그램된 사멸 리간드 1 신호전달 경로 및 CD4+CD25+Foxp3+　조절 T 세포 간의 상승 효과에 의존할 가능성이 있다.
관용화 백신 내의 세포는 ECDI 고정화에 의해서 뿐만 아니라, 다른 방법을 통해 세포자멸성 세포(예컨대, 관용화 백신)가 될 수 있다. 예를 들어, 명세서 전반에 개시된 바와 같은 임의의 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 비인간 세포 동물 세포 또는 인간 세포(줄기 세포 포함)는 상기 유전적으로 변형된 세포를 UV 조사에 노출시킴으로써 세포자멸성이 될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한 이를 감마-조사에 노출시킴으로써 세포자멸성이 될 수 있다. ECDI를 포함하지 않는 다른 방법, 예를 들어 EtOH 고정에 의한 다른 방법이 또한 고려된다.
관용화 백신 내의 세포, 예컨대, ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포는 공여자 세포(예컨대, 이식편의 공여자로부터의 세포)를 포함할 수 있다. 관용화 백신 내의 세포, 예컨대, ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포는 수용자 세포(예컨대, 이식편의 수용자로부터의 세포)를 포함할 수 있다. 관용화 백신 내의 세포, 예컨대, ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포는 제3자(예컨대, 공여자나 수용자가 아님) 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 제3자 세포는 수용자 및/또는 공여자와 동일한 종의 비인간 동물 유래이다. 다른 경우, 제3자 세포는 수용자 및/또는 공여자와 상이한 종의 비인간 동물 유래이다.
세포의 ECDI 처리는 하나 이상의 항원 및/또는 에피토프의 존재하에 수행될 수 있다. ECDI 처리된 세포는 공여자, 수용자 및/또는 제3자 세포를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항원 및/또는 에피토프는 공여자, 수용자 및/또는 제3자 항원 및/또는 에피토프를 포함할 수 있다. 일부 경우, 공여자 세포는 수용자 항원 및/또는 에피토프에 결합된다(예컨대, ECDI-유도 결합). 예를 들어, 유전적으로 조작되고 유전자형적으로 동일한 공여자 세포(예컨대, 돼지 세포)로부터 유래된 가용성 공여자 항원은 ECDI를 갖는 수용자 말초 혈액 단핵 세포에 결합되고 상기 ECDI 결합된 세포는 정맥내 주입을 통해 투여된다.
일부 경우, 수용자 세포는 공여자 항원 및/또는 에피토프에 결합된다(예컨대, ECDI-유도 결합). 일부 경우, 수용자 세포는 제3자 항원 및/또는 에피토프에 결합된다(예컨대, ECDI-유도 결합). 일부 경우, 공여자 세포는 수용자 항원 및/또는 에피토프에 결합된다(예컨대, ECDI-유도 결합). 일부 경우, 공여자 세포는 제3자 항원 및/또는 에피토프에 결합된다(예컨대, ECDI-유도 결합). 일부 경우, 제3자 세포는 공여자 항원 및/또는 에피토프에 결합된다(예컨대, ECDI-유도 결합). 일부 경우, 제3자 세포는 수용자 항원 및/또는 에피토프에 결합된다(예컨대, ECDI-유도 결합). 예를 들어, 유전적으로 조작되고 유전자형적으로 동일한 공여자 세포(예컨대, 돼지 세포)로부터 유래된 가용성 공여자 항원은 ECDI를 갖는 폴리스티렌 나노입자에 결합되고, 상기 ECDI 결합된 세포는 정맥내 주입을 통해 투여된다.
이들 관용화 세포 백신 중 어느 것의 관용원성 효능(tolerogenic potency)은 하기 중 하나 이상을 세포의 표면에 결합함으로써 추가로 최적화될 수 있다: IFN-g, NF-kB 억제제(예컨대, 커큐민, 트립토리드(triptolide), Bay-117085), 비타민 D3, siCD40, 코발트 프로토포르피린(cobalt protoporphyrin), 인슐린 B9-23, 또는 숙주 항원 제시 세포 및 숙주 림프구의 기능을 변형시키는 다른 면역조절 분자.
이러한 세포자멸성 세포 백신은 또한 공여자 반응성 세포의 세포자멸 사멸을 촉발하는 이들의 표면 분자(예컨대 FasL, PD-L1, 갈렉틴-9, CD8알파) 상에 디스플레이하도록 조작된 공여자 세포에 의해 보충될 수 있다.
본원에 개시된 관용화 백신은 수용자에서 이식(예컨대, 이종이식편 또는 동종이식편 이식)의 생존 지속시간을 증가시킬 수 있다. 본원에 개시된 관용화 백신은 또한 이식 후 면역억제에 대한 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있다. 이종이식편 또는 동종이식편 이식은 장기, 조직, 세포 또는 세포주일 수 있다. 이종이식편 이식 및 관용화 백신은 또한 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이종이식편 이식 및 관용화 백신은 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 이종이식편 이식 및 관용화 백신은 실질적으로 유전적으로 동일한 개체(예컨대, 동일한 개체)로부터 유래될 수 있다.
ECDI 고정된 세포는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, ECDI 고정된 세포는 약학적으로 허용되는 부형제와 조합될 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 염수이다. 사용될 수 있는 부형제는 인산염 완충 염수(PBS)이다. 이후, 약학 조성물은 이식을 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
줄기 세포로부터 유래된 세포로부터 제조된 관용화 백신
관용화 백신을 제조하기 위한 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 세포는 줄기 세포 유래의 기능성 인슐린-분비 췌도 β 세포 또는 동일한 또는 유전자형적으로 유사한 줄기 세포주로부터 분화된 다른 세포인 관용화 세포자멸 공여자 세포를 포함할 수 있다. 이들 다른 세포는 백혈구, 림프구, T 림프구, B 림프구, 적혈구 세포, 또는 임의의 다른 공여자 세포를 포함할 수 있다.
이들 줄기 세포 유래의 관용화 세포자멸 공여자 세포는 MHC 클래스 I의 기능적 발현이 결여되도록 유전적으로 조작될 필요가 없다. 세포자멸 공여자 세포 상의 MHC 클래스 I의 기능적 발현은 이들의 관용원성 잠재성을 향상시킬 수 있다.
줄기 세포 유래 세포는 UV 방사선조사, 감마-방사선조사, 또는 ECDI의 존재하에서의 인큐베이션을 포함하지 않는 다른 방법에 의해 세포자멸성이 될 수 있다.
이러한 음성 세포 백신은 각각 비제한적으로 길항적 항-CD40 항체(예컨대, 인간화된 2C10), B 세포 고갈 또는 표적화 항체(예컨대, 리툭시맙), mTOR 억제제(예컨대, 라파마이신), 및 TNF-알파 억제제(예컨대, 에타너셉트를 포함하는 sTNFR), 및 IL-6 억제제(예컨대, 토실리주맙을 포함하는 항-IL-6R 항체)를 포함하는 일시적인 면역억제의 보호하에, 이식 전에 정맥내로 주입되거나 또는 이식 전 및 이식후에 간격을 두고 정맥내로 주입될 수 있다.
이러한 관용화 세포 백신 중 어느 것의 관용원성 효능(tolerogenic potency)은 하기 분자 중 하나 이상을 세포의 표면에 결합함으로써 추가로 최적화될 수 있다: IFN-g, NF-kB 억제제(예컨대, 커큐민, 트립토리드(triptolide), Bay-117085), 비타민 D3, siCD40, 코발트 프로토포르피린(cobalt protoporphyrin), 인슐린 B9-23, 또는 숙주 항원-제시 세포 및 숙주 림프구의 기능을 변형시키는 다른 면역조절 분자.
이러한 세포자멸성 세포 백신은 또한 공여자 반응성 세포의 세포자멸성 사멸을 촉발하는 이들의 표면 분자(예컨대, FasL, PD-L1, 갈렉틴-9, CD8알파) 상에 디스플레이하도록 조작된 공여자 세포에 의해 보충될 수 있다.
인간 줄기 세포 유래의 관용화 백신과 마찬가지로, 관용화 세포자멸 공여자 돼지 백신은 동일한 세포 공급원으로부터 유래될 수 있고, MHC 클래스 I 항원을 발현할 수 있고, 동일한 방법을 사용하여 세포자멸성이 될 수 있고, 하나 이상의 면역조절 분자를 세포의 표면에 결합함으로써 최적화될 수 있고, 수반되는 면역요법의 보호하에 이식 전에 정맥내로 주입되거나 이식 전 및 이식후에 간격을 두고 정맥내로 주입될 수 있다.
IV. 유전적으로 변형된 비인간 동물의 제조방법
상기 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하기 위해, 다양한 기술이 사용될 수 있다. 유전적으로 변형된 동물을 생성하기 위한 몇 가지 예가 본원에 개시된다. 본원에 개시된 방법은 단지 예에 불과하며, 어떤 식으로든 한정하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
유전자 파괴
유전자 파괴는 상기 기재된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 넉아웃, 넉다운, RNA 간섭, 우성 음성 등에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 상세한 설명은 유전적으로 변형된 비인간 동물에 관한 섹션에서 상기에 개시되어 있다.
CRISPR/cas 시스템
본원에 기재된 방법은 CRISPR/cas 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, CRISPR/cas 시스템, 예컨대, II형 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 이중 가닥 절단(DSB)이 생성될 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용되는 Cas 효소는 DNA 절단을 촉매하는 Cas9일 수 있다. 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 Cas9 또는 임의의 밀접하게 관련된 Cas9에 의한 효소 작용은 가이드 서열의 20개 뉴클레오티드에 혼성화하고 표적 서열의 20개 뉴클레오티드 이후에 프로토스페이서(protospacer)-인접 모티프(PAM)을 갖는 표적 부위 서열에서 이중 가닥 절단을 생성할 수 있다.
벡터는 Cas 단백질과 같은, CRISPR 효소를 코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(또한 Csn1 또는 Csx12로서 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, 이의 동족체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 변형되지 않은 CRISPR 효소는 Cas9과 같이, DNA 절단 활성을 가질 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열에서, 예컨대 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 유도할 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소는 표적 서열의 첫 번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 이상의 염기쌍 이내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 유도할 수 있다. 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 코딩하는 벡터가 사용될 수 있다.
하나 이상의 핵 위치 서열(nuclear localization sequence; NLS)을 포함하는 CRISPR 효소를 코딩하는 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 NLS 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 NLS가 사용될 수 있다. CRISPR 효소는 아미노-말단 또는 가까이에 NLS를 포함할 수 있거나, 카복시-말단 또는 가까이에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 NLS 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 초과의 NLS를 포함할 수 있거나, 또는 이들 중 임의의 조합(예컨대, 아미노-말단에 하나 이상의 NLS 및 카복시 말단에 하나 이상의 NLS)을 포함할 수 있다. 하나를 초과하는 NLS가 존재하는 경우, 각각은 다른 것과 독립적으로 선택될 수 있고, 이로써 단일 NLS가 하나를 초과하는 복제본 내에 존재할 수 있고/거나 하나 이상의 복제본 내에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 존재할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 CRISPR 효소는 최대 6개의 NLS를 포함할 수 있다. NLS는 NLS에 가장 가까운 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 사슬을 따라 약 50개 아미노산 이내, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개 아미노산 이내일 때 N- 또는 C-말단에 가까운 것으로 간주된다.
가이드 RNA
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가이드　RNA" 및 그의 문법적 등가물은 표적 DNA에 특이적일 수 있고 Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 RNA를 지칭할 수 있다. RNA/Cas 복합체는 Cas 단백질을 표적 DNA로 "가이드"하는 것을 도울 수 있다.
본원에 개시된 방법은 또한 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 핵산, 예컨대, 적어도 하나의 가이드 RNA를 코딩하는 DNA를 세포 또는 배아내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제와 상호작용하여 상기 엔도뉴클레아제를 특이적 표적 부위로 유도할 수 있고, 이 부위에서 가이드 RNA의 5' 말단이 염색체 서열 내의 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 형성한다.
가이드　RNA는　2개의　RNA, 예컨대, CRISPR　RNA(crRNA) 및 트랜스활성화(transactivating) crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 가이드　RNA는 때때로 단쇄　RNA를 포함할 수 있거나, 또는 crRNA의 의 부분(예컨대, 기능적 부분) 및 tracrRNA의 융합에 의해 형성된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함할 수 있다. 가이드　RNA는　crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 dualRNA일 수 있다. 나아가, crRNA는 표적 DNA와 혼성화할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 가이드 RNA는 발현 생성물일 수 있다. 예를 들어, 가이드　RNA를 코딩하는 DNA는 가이드　RNA를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터일 수 있다. 가이드　RNA는　세포 또는 유기체를 단리된　가이드　RNA 또는 가이드　RNA를 코딩하는 서열 및 프로모터를 포함하는 플라스미드 DNA로 형질감염시킴으로써 세포 또는 유기체에 이식될 수 있다. 가이드　RNA는 또한　다른 방식으로, 예컨대 바이러스-매개된 유전자 전달을 사용하여 세포 또는 유기체에 이식될 수 있다.
가이드 RNA는 단리될 수 있다. 예를 들어, 가이드　RNA는　단리된　RNA의 형태로 세포 또는 유기체 내로 형질감염될 수 있다. 가이드　RNA는 당업계에 공지된 임의의　시험관내　전사 시스템을 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 가이드　RNA는　가이드　RNA에 대한 코딩 서열을 포함하는 플라스미드의 형태보다는 단리된 RNA의 형태로 세포에 이식될 수 있다.
가이드 RNA는 3개의 영역을 포함할 수 있다: 염색체 서열 내의 표적 부위에 상보적일 수 있는 5' 말단에 있는 제1 영역, 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는 제2 내부 영역, 및 단일 가닥일 수 있는 제3 3' 영역. 각 가이드 RNA의 제1 영역은 또한 각 가이드 RNA가 융합 단백질을 특정한 표적 부위로 가이드하도록 상이할 수 있다. 또한, 각 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역은 모든 가이드 RNA에서 동일할 수 있다.
가이드 RNA의 제1 영역은 가이드 RNA의 제1 영역이 표적 부위와 염기쌍을 형성할 수 있도록 염색체 서열 내의 표적 부위에서의 서열에 상보적일 수 있다. 일부 경우, 가이드 RNA의 제1 영역은 10개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드 또는 약 10개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드(즉, 10 nts 내지 25 nts; 또는 약 10 nts 내지 약 25 nts; 또는 10 nts 내지 약 25 nts; 또는 약 10 nts 내지 25 nts) 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 제1 영역 및 염색체 서열 내의 표적 부위 간의 염기쌍 형성 영역은 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 22개, 23개, 24개, 25개, 또는 그 이상 또는 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 22개, 23개, 24개, 25개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 종종, 가이드 RNA의 제1 영역은 19개, 20개, 또는 21개 또는 약 19개, 20개, 또는 21개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
가이드 RNA는 또한 2차 구조를 형성하는 제2 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA에 의해 형성된 2차 구조는 줄기(또는 헤어핀) 및 루프를 포함할 수 있다. 루프 및 줄기의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 루프는 3개 내지 10개 또는 약 3개 내지 10개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있고, 줄기는 6개 내지 20개 또는 약 6개 내지 20개 염기쌍 길이의 범위일 수 있다. 줄기는 1개 내지 10개 또는 약 10개 뉴클레오티드의 하나 이상의 벌지(bulge)를 포함할 수 있다. 제2 영역의 전체 길이는 16개 내지 60개 또는 약 16개 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 예를 들어, 루프는 4개 또는 약 4개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 줄기는 12개 또는 약 12개 염기쌍일 수 있다.
가이드 RNA는 또한 본질적으로 단일 가닥일 수 있는 3'에 있는 제3 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제3 영역은 때때로 관심있는 세포의 임의의 염색체 서열에 상보적이지 않으며 때때로 가이드 RNA의 나머지에 상보적이지 않다. 또한, 제3 영역의 길이는 다양할 수 있다. 제3 영역은 4개 초과 또는 약 4개 초과 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 제3 영역의 길이는 5개 내지 60개 또는 약 5개 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다.
가이드 RNA는 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 시험관내에서 전사될 수 있고/거나 화학적으로 합성될 수 있다. RNA는 합성 DNA 분자, 예컨대, gBlocks® 유전자 단편으로부터 전사될 수 있다. 이후, 가이드 RNA는 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 또한 비-RNA 핵산 분자, 예컨대, DNA 분자의 형태로 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA를 코딩하는 DNA는 관심있는 세포 또는 배아에서 가이드 RNA의 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. RNA 코딩 서열은 RNA 중합효소 III(Pol III)에 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 가이드 RNA를 발현하는 데 사용될 수 있는 플라스미드 벡터는, 비제한적으로, px330 벡터 및 px333 벡터를 포함한다. 일부 경우, 플라스미드 벡터(예컨대, px333 벡터)는 2개의 가이드 RNA-인코딩 DNA 서열을 포함할 수 있다.
가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열은 또한 벡터의 일부일 수 있다. 또한, 벡터는 부가적인 발현 제어 서열(예컨대, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 적합한 마커 서열(예컨대, 항생제 내성 유전자), 복제 원점 등을 포함할 수 있다. 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자는 또한 선형일 수 있다. 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자는 또한 환형일 수 있다.
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 세포 내로 도입될 때, 각 DNA 서열은 별개의 분자(예컨대, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 코딩 서열을 함유하는 하나의 벡터 및 가이드 RNA 코딩 서열을 함유하는 제2 벡터)의 일부일 수 있거나 또는 둘은 동일한 분자(예컨대, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA 모두에 대한 코딩(및 조절) 서열을 함유하는 하나의 벡터)의 일부일 수 있다.
가이드 RNA는 돼지 또는 돼지 세포 내의 유전자를 표적화할 수 있다. 일부 경우, 가이드 RNA는 돼지 NLRC5 유전자, 예컨대, 표 4에 열거된 서열을 표적화할 수 있다. 일부 경우, 가이드 RNA는 돼지 NLRC5, GGTA1 또는 CMAH 유전자를 표적화하도록 설계될 수 있다. 가이드 RNA를 제조하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드가 표 5에 열거되어 있다.
표 4. 가이드 RNA에 의해 표적화될 NLRC5 유전자의 예시적인 서열
표 5. 가이드 RNA 구성체를 제조하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드
상동 재조합
상동 재조합이 또한 본원에 개시된 바와 같은 임의의 관련된 유전적 변형을 위해 사용될 수 있다. 상동 재조합은 내인성 유전자에서 부위 특이적 변형을 가능하게 할 수 있으며, 따라서 신규 변형이 지놈 내로 조작될 수 있다. 예를 들어, DNA 분자 간에 유전적 서열 정보를 전달하는 상동 재조합(유전자 전환 및 고전적 가닥 파손/재결합)의 능력은 표적화된 상동 재조합을 일으킬 수 있고 유전 공학 및 유전자 조작에서 강력한 방법일 수 있다.
상동 재조합을 겪은 세포는 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 선택 방법은, 예를 들어 인간 항-gal 항체에 의해, 세포에 대한 면역 반응의 부재를 검출할 수 있다. 선택 방법은 또한 세포 또는 조직에 노출될 때 인간 혈액에서 응고 수준을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 항생제 내성을 통한 선택이 스크리닝을 위해 사용될 수 있다.
형질전환 비인간 동물의 제조
무작위 삽입
본원에 기재된 방법의 하나 이상의 전이유전자는 세포의 지놈 내의 임의의 유전자좌에 무작위로 삽입될 수 있다. 이러한 전이유전자는 지놈 내의 어느 곳에나 삽입되면 기능적일 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 자체 프로모터를 코딩할 수 있거나 또는 내인성 프로모터의 제어하에 있는 위치 내로 삽입될 수 있다. 대안적으로, 전이유전자는 유전자, 예컨대 유전자의 인트론 또는 유전자의 엑손, 프로모터, 또는 비코딩 영역 내로 삽입될 수 있다.
전이유전자 서열을 코딩하는 DNA는 세포의 염색체 내로 무작위로 삽입될 수 있다. 무작위 혼입은 DNA를 당업자에게 공지된 세포 내로 도입하는 임의의 방법으로부터 비롯될 수 있다. 이것은 비제한적으로, 전기천공, 초음파천공(sonoporation), 유전자 건(gun)의 사용, 리포형질감염, 인산칼슘 형질감염, 덴드리머(dendrimer)의 사용, 미세주사, 아데노바이러스, AAV, 및 레트로바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터의 사용, 및/또는 그룹 II 리보자임을 포함할 수 있다.
전이유전자를 코딩하는 DNA는 또한 전이유전자 또는 그의 발현 생성물의 존재를 리포터 유전자의 활성화를 통해 검출할 수 있도록 리포터 유전자를 포함하도록 디자인될 수 있다. 상기에 개시된 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 세포 배양물에서 리포터 유전자가 활성화된 세포를 선택함으로써, 전이유전자를 함유하는 세포가 선택될 수 있다.
전이유전자를 코딩하는 DNA는 전기천공을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. DNA는 또한 리포펙션, 감염, 또는 형질전환을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 전기천공 및/또는 리포펙션이 섬유아세포 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다.
전이유전자의 발현은 발현 분석, 예를 들어, qPCR에 의해 또는 RNA의 수준을 측정함으로써 확인될 수 있다. 발현 수준은 또한 복제수(copy number)를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 발현 수준이 매우 높으면, 이것은 하나를 초과하는 전이유전자의 복제본이 지놈에 혼입되었음을 가리킬 수 있다. 대안적으로, 높은 발현은 전이유전자가 고도로 전사된 지역에, 예를 들어, 고도로 발현된 프로모터 가까이에 혼입되었음을 가리킬 수 있다. 발현은 또한 웨스턴 블롯팅을 통해서와 같이, 단백질 수준을 측정함으로써 확인될 수 있다.
부위 특이적 삽입
본원에 개시된 임의의 방법에서 하나 이상의 전이유전자를 삽입하는 것은 부위 특이적일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전이유전자는 프로모터의 인접하여, 예를 들어, Rosa26 프로모터에 인접하여 또는 가까이에 삽입될 수 있다.
세포의 표적화된 유전자좌의 변형은 표적 유전자좌에 상동성을 갖는 DNA를 세포 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. DNA는 혼입된 구성체를 포함하는 세포의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자를 포함할 수 있다. 표적 벡터 내의 상동 DNA는 표적 유전자좌에서 염색체 DNA와 재조합될 수 있다. 마커 유전자는 양쪽에 상동 DNA 서열, 3' 재조합 아암(arm), 및 5' 재조합 아암이 측접할 수 있다.
다양한 효소가 외래 DNA의 숙주 지놈 내로의 삽입을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 부위 특이적 재조합효소는 구별되는 생화학적 특성을 갖는 2개의 단백질 패밀리, 즉 티로신 재조합효소(DNA가 티로신 잔기에 공유결합됨) 및 세린 재조합효소(공유결합이 세린 잔기에서 일어남)로 분류될 수 있다. 일부 경우, 재조합효소는 Cre, fC31 인테그라아제(스트렙토마이세스 파아지 fC31로부터 유래된 세린 재조합효소), 또는 박테리오파아지 유래의 부위 특이적 재조합효소(Flp, 람다 인테그라아제, 박테리오파아지 HK022 재조합효소, 박테리오파아지 R4 인테그라아제 및 파아지 TP901-1 인테그라아제 포함)를 포함할 수 있다.
발현 제어 서열이 또한 구성체에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 제어 서열은 매우 다양한 세포 유형에서 발현되는 항시성 프로모터(constitutive promoter)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 강한 항시성 프로모터 및/또는 인핸서 중에는, DNA 바이러스(예컨대, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 폭스 바이러스, CMV, HSV 등)로부터의 발현 제어 서열 또는 레트로바이러스 LTR로부터의 발현 제어 서열이 있다. 조직 특이적 프로모터가 또한 사용될 수 있으며, 특정 세포 계통에 대해 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 하기 실시예에서 논의된 실험은 Rosa26 유전자 프로모터를 사용하여 수행될 것이지만, 당업자에게 명백한 바와 같이, 유전자 발현을 유도할 수 있는 다른　Rosa26 관련 프로모터가 유사한 결과를 얻기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원의 설명은 제한하고자 하는 것이 아니라, 많은 가능한 예 중 하나를 개시하기 위한 것이다. 일부 경우, 동일한 발현 정도를 달성할 수 있는 더 짧은 Rosa26　5'-업스트림 서열이 사용될 수 있다. 점 돌연변이, 부분 결실 또는 화학적 변형과 같은, Rosa26 프로모터의 사소한 DNA 서열 변이체가 또한 유용하다.
Rosa26　프로모터는 포유동물에서 발현가능하다. 예를 들어, 비제한적으로, 다른 종(예컨대, 인간, 소, 마우스, 양, 염소, 토끼 및 랫트)의 Rosa26　동족체의 프로모터를 포함하는, 돼지 Rosa26　유전자의 5' 플랭킹 서열과 유사한 서열이 또한 사용될 수 있다. Rosa26 유전자는 상이한 포유동물 종 간에 충분히 보존될 수 있고 다른 포유동물 Rosa26　프로모터가 또한 사용될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 부위 특이적 삽입을 수행하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지놈 내의 삽입 부위 상의 닉(nick)이 CRISPR/cas에 의해 만들어져 삽입 부위에서 전이유전자의 삽입을 용이하게 할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 DNA 또는 RNA 구성체를 숙주 세포 내로 진입시키는데 사용될 수 있는 기술을 이용할 수 있으며, 이는, 비제한적으로, 인산칼슘/DNA 공침전, DNA의 핵 내로의 미세주사, 전기천공, 온전한 세포와의 박테리아 원형질체 융합, 형질감염, 리포펙션, 감염, 입자 충격(particle bombardment), 정자 매개 유전자 이식, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 기술을 포함한다.
본원에 개시된 특정 양태는 벡터를 이용할 수 있다. 임의의 플라스미드 및 벡터가 선택된 숙주에서 복제가능하고 생존가능한 한 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 벡터 및 상업적으로 이용가능한 벡터(및 이의 변이체 또는 유도체)는 상기 방법에서 사용하기 위해 하나 이상의 재조합 부위를 포함하도록 조작될 수 있다. 사용될 수 있는 벡터는, 비제한적으로 진핵 발현 벡터, 예컨대 pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL, pSFV, 및 pTet-Splice(Invitrogen), pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pBI121, pDR2, pCMVEBNA, 및 pYACneo(Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, 및 pKK232-8(Pharmacia, Inc.), p3'SS, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, 및 pOG44(Stratagene, Inc.), 및 pYES2, pAC360, pBlueBa-cHis A, B, 및 C, pVL1392, pBlueBac111, pCDM8, pcDNA1, pZeoSV, pcDNA3, pREP4, pCEP4, 및 pEBVHis(Invitrogen, Corp.), 및 이의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
이러한 벡터는 유전자, 예컨대, 전이유전자, 또는 관심있는 유전자의 부분을 발현하는 데 사용될 수 있다. 부분 유전자 또는 유전자는 공지된 방법, 예컨대 제한 효소-기반 기술을 사용하여 삽입될 수 있다.
접합자(zygote)를 사용한 유전적으로 변형된 비인간 동물의 제조
또 다른 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터의 핵산을 사용한 유전적으로 변형된 비인간 동물의 제조는, 예를 들어, 접합자(zygote) 조작과 같이 당업계에 공지된 다양 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 접합자는 유사한 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 데 사용될 수 있다. a) 하나 이상의 유전자의 감소된 발현을 갖고/거나 본원에 개시된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 생산하는 단계, b) a)의 생성된 세포를 사용하여 배아를 형성시키는 단계; 및 c) 상기 배아를 유전적으로 변형된 비인간 동물로 성장시키는 단계를 포함하는, 유사한 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법. a)의 세포는 세포 내의 하나 이상의 유전자를 파괴함으로써(예컨대, 발현을 감소시킴으로써) 생산될 수 있다(예컨대, 유전적으로 변형된 비인간 동물에서 상기 기재된 바와 같음).
이러한 방법은 본원에 개시된 유사한 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법은: a) 본원에 개시된, 예컨대(상기 기재된 바와 같은) 하나 이상의 유전자(상기 하나 이상의 유전자는 NLRC5, TAP1, 및/또는 C3을 포함함)의 감소된 발현을 갖는 세포를 생산하는 단계; b) a)의 생성된 세포로부터 배아를 발생시키는 단계; 및 c) 상기 배아를 유전적으로 변형된 비인간 동물로 성장시키는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 방법에서 사용되는 세포는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 개시된 유전적으로 변형된 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 파괴된 유전자는 NRLC5, TAP1, 및/또는 C3에 제한되지 않는다. 유전자 파괴 및 전이유전자의 다른 조합은 본원 개시내용 전반에 발견될 수 있다. 더욱이, 유전적으로 변형된 세포는 비인간 동물(본원에 기재된 바와 같음) 또는 유전적으로 변형된 세포(본원에 기재된 바와 같음)로부터와 같이, 임의의 기원일 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 a)의 세포는 접합자(예컨대, 정자 및 난자의 결합에 의해 형성된 세포)일 수 있다. 접합자는 i) 야생형 비인간 동물의 정자 및 야생형 비인간 동물의 난자; ii) 야생형 비인간 동물의 정자 및 유전적으로 변형된 비인간 동물의 난자; iii) 유전적으로 변형된 비인간 동물의 정자 및 야생형 비인간 동물의 난자; 및/또는 iv) 유전적으로 변형된 비인간 동물의 정자 및 유전적으로 변형된 비인간 동물의 난자의 결합에 의해 형성될 수 있다. 비인간 동물은 돼지일 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 a)의 세포 내의 하나 이상의 유전자는 지놈 내의 원하는 위치에서 절단에 의해 파괴될 수 있다). 예를 들어, 절단은 이중 가닥 절단(DSB)일 수 있다. DSB는 Cas(예컨대, Cas9), ZFN, TALEN, 및 마가뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제를 사용하여 생성될 수 있다. 뉴클레아제는 자연적으로 존재하거나 변형된 뉴클레아제일 수 있다. 뉴클레아제를 코딩하는 핵산이 또한 세포에 전달될 수 있으며, 여기서 뉴클레아제가 발현된다.
DSB 후, 하나 이상의 유전자는 상동 재조합(HR) 및/또는 비상동 말단연결(NHEJ)과 같은 DNA 복구 기전에 의해 파괴될 수 있다.
방법은 하나 이상의 전이유전자를 a)의 세포의 지놈에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, 이의 임의의 기능적 단편, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 하나 이상의 전이유전자를 삽입하는 것을 포함할 수 있고, 하나 이상의 전이유전자는 본원에 개시된 임의의 비인간 동물 또는 유전적으로 변형된 세포 내의 임의의 전이유전자일 수 있다. 전이유전자는, 본원에 기재된 바와 같이, 무작위 또는 표적화된 방식으로 비인간 동물 또는 유전적으로 변형된 세포의 지놈 내로 삽입될 수 있다.
전이유전자는 또한 본원에 개시된 바와 같이 비인간 동물 또는 유전적으로 변형된 세포의 지놈 내의 특정 유전자좌에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다. 전이유전자는 프로모터 가까이에 삽입될 수 있고, 이는 프로모터로부터 적어도 또는 적어도 약 1, 10, 50, 100, 500, 또는 1000 염기쌍일 수 있다. 일부 경우 유전자는 상이한 염색체 내로 삽입될 수 있고 프로모터에 의해 여전히 제어될 수 있다. 전이유전자는 또한 프로모터로부터 센스 가닥의 3' 영역에 삽입될 수 있다(예컨대, 프로모터의 다운스트림). 대안적으로, 전이유전자는 프로모터로부터 센스 가닥의 5' 영역에 삽입될 수 있다(예컨대, 프로모터의 업스트림). 전이유전자는 돼지 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 돼지 Rosa26 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다.
본원에서 사용될 수 있는 프로모터는 본 출원 전반에 기재되어 있다. 예를 들어, 방법에서 사용될 수 있는 프로모터는 유비쿼터스, 조직 특이적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터에 인접하여 삽입되는 전이유전자의 발현은 조절될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 유비쿼터스 프로모터 가까이에 또는 옆에 삽입되는 경우, 전이유전자는 비인간 동물의 모든 세포에서 발현될 것이다. 일부 유비쿼터스 프로모터는 CAGGS 프로모터, hCMV 프로모터, PGK 프로모터, SV40 프로모터, 또는 Rosa26 프로모터일 수 있다.
프로모터는 인간 또는 비인간 동물, 예컨대 돼지, 인간, 소, 양, 염소, 토끼, 마우스 또는 랫트의 지놈 내에 존재하는 프로모터 서열과 상동일 수 있다. 프로모터는 인간 또는 비인간 동물의 지놈 내에 존재하는 프로모터 서열에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 나타낼 수 있다. 프로모터는 인간 또는 비인간 동물의 지놈 내에 존재하는 프로모터 서열에 대해 100% 상동성을 나타낼 수 있다. 프로모터는 또한 인간 또는 비인간 동물의 지놈 내에 존재하는 프로모터 서열에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 나타낼 수 있다. 프로모터는 또한 인간 또는 비인간 동물의 지놈 내에 존재하는 프로모터 서열에 대해 100% 동일성을 나타낼 수 있다.
세포 핵 이식을 사용한 유사한 유전적으로 변형된 비인간 동물의 제조
유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 대안적인 방법은 세포 핵 이식에 의할 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법은 a) 하나 이상의 유전자의 감소된 발현을 갖고/거나 본원에 개시된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 생산하는 단계; b) 제2 세포를 제공하고, a)로부터 생성된 세포의 핵을 제2 세포에 이식하여 배아를 발생시키는 배아를 발생시키는 단계; c) 상기 배아를 유전적으로 변형된 비인간 동물로 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서의 세포는 제핵된 세포일 수 있다. a)의 세포는 임의의 방법, 예컨대, 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 유전자 파괴 및/또는 삽입을 사용하여 제조될 수 있다.
이러한 방법은 본원에 개시된 유사한 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법은 a) NLRC5, TAP1 및/또는 C3의 감소된 발현을 갖는 세포를 생산하는 단계; b) 제2 세포를 제공하고, a)로부터 생성된 세포의 핵을 제2 세포에 이식하여 배아를 발생시키는 단계; 및 c) 상기 배아를 유전적으로 변형된 비인간 동물로 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서의 세포는 제핵된 세포일 수 있다.
이러한 방법에서 사용되는 세포는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 개시된 유전적으로 변형된 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 파괴된 유전자는 NRLC5, TAP1, 및/또는 C3에 제한되지 않는다. 유전자 파괴 및 전이유전자의 다른 조합은 본원의 개시내용 전반에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 방법은 본원에 개시된 임의의 비인간 동물로부터 제1 세포를 제공하는 단계; 제2 세포를 제공하는 단계; a)의 제1 세포의 핵을 b)의 제2 세포에 이식하는 단계; c)의 생성물로부터 배아를 발생시키는 단계; 및 상기 배아를 유전적으로 변형된 비인간 동물로 성장시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 a)의 세포는 접합자일 수 있다. 접합자는 i) 야생형 비인간 동물의 정자 및 야생형 비인간 동물의 난자; ii) 야생형 비인간 동물의 정자 및 유전적으로 변형된 비인간 동물의 난자; iii) 유전적으로 변형된 비인간 동물의 정자 및 야생형 비인간 동물의 난자; 및/또는 iv) 유전적으로 변형된 비인간 동물의 정자 및 유전적으로 변형된 비인간 동물의 난자의 결합에 의해 형성될 수 있다. 비인간 동물은 돼지일 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 a)의 세포 내의 하나 이상의 유전자는 지놈 내의 원하는 위치에서 절단을 생성시킴으로써 파괴될 수 있다. 예를 들어, 절단은 이중 가닥 절단(DSB)일 수 있다. DSB는 Cas(예컨대, Cas9), ZFN, TALEN, 및 마가뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제를 사용하여 생성될 수 있다. 뉴클레아제는 자연적으로 존재하거나 변형된 뉴클레아제일 수 있다. 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 세포에 전달될 수 있고, 여기서 상기 뉴클레아제는 발현된다. 세포 내의 유전자를 표적화하는 Cas9 및 가이드 RNA가 세포에 전달될 수 있다. 일부 경우, Cas9 및 가이드 RNA를 코딩하는 mRNA 분자가 세포 내로 주사될 수 있다. 일부 경우, Cas9를 코딩하는 플라스미드 및 가이드 RNA를 코딩하는 상이한 플라스미드가 세포 내로 전달될 수 있다(예컨대, 감염에 의해). 일부 경우, Cas9 및 가이드 RNA 둘 다를 코딩하는 플라스미드가 세포 내로 전달될 수 있다(예컨대, 감염에 의해).
상기 기재된 바와 같이, DSB 후, 하나 이상의 유전자는 상동 재조합(HR) 및/또는 비상동 말단연결(NHEJ)과 같은 DNA 복구 기전에 의해 파괴될 수 있다. 방법은 하나 이상의 전이유전자를 a)의 세포의 지놈에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 전이유전자는 ICP47, CD46, CD55, CD59, HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), B2M, 이의 임의의 기능적 단편, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 하나 이상의 전이유전자를 삽입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 전이유전자는 본원에 개시된 임의의 비인간 동물 또는 유전적으로 변형된 세포 내의 임의의 전이유전자일 수 있다.
유전적으로 변형된 비인간 동물로부터의 세포를 사용하여 비인간 동물을 제조하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 세포는 본원에 개시된 임의의 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래될 수 있다. 방법은: a) 유전적으로 확인된 비인간 동물로부터 세포를 제공하는 단계; b) 세포를 제공하는 단계; c) a)의 세포의 핵을 b)의 세포에게 이식하는 단계; c) c)의 생성물로부터 배아를 발생시키는 단계; 및 d) 상기 배아를 유전적으로 변형된 비인간 동물로 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법의 세포는 제핵된 세포일 수 있다.
또한, 상기 방법에서 a)의 세포는 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터의 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법에서 a)의 세포는 체세포, 예컨대 섬유아세포 또는 태아 섬유아세포일 수 있다.
상기 방법에서의 제핵된 세포는 유기체로부터의 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, 제핵된 세포는 돼지 세포이다. 제핵된 세포는 난자, 예를 들어, 제핵된 비수정된 난자일 수 있다.
본원에 개시된 유전적으로 변형된 비인간 동물은 당업계에 공지된 임의의 적합한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 기술은, 비제한적으로, 미세주사(예컨대, 전핵(pronuclei)의 미세주사), 정자-매개 유전자 이식, 난자 또는 접합자의 전기천공, 및/또는 핵 이식을 포함한다.
유사한 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법은 a) 세포 내의 하나 이상의 유전자를 파괴시키는 단계, b) a)의 생성된 세포를 사용하여 배아를 발생시키는 단계; 및 c) 상기 배아를 유전적으로 변형된 비인간 동물로 성장시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 a)의 세포는 체세포일 수 있다. 체세포의 유형 또는 공급원에는 제한이 없다. 예를 들어, 그것은 돼지 또는 배양된 세포주로부터 유래될 수 있거나 또는 임의의 다른 생존가능한 세포일 수 있다. 세포는 또한 표피　세포, 신경 세포, 난구　세포, 난관 상피 세포, 섬유아세포(예컨대, 태아 섬유아세포), 또는 간세포일 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 a)의 세포는 야생형 비인간 동물, 유전적으로 변형된 비인간 동물, 또는 유전적으로 변형된 세포로부터 유래될 수 있다. 더욱이, b)의 세포는 제핵된 난자(예컨대, 제핵된 비수정된 난자)일 수 있다.
제핵은 또한 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 중기 II 난모세포를 즉각적인 제핵을 위해, 선택적으로 밀리리터 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 당 7-10 마이크로그램 또는 약 7-10 마이크로그램을 함유하는, HECM에 두거나, 또는 적합한 배지(예컨대, CRlaa와 같은 배아 배양 배지, 및 10% 발정기 소 혈청)에 둔 다음, 제핵할 수 있다(예컨대, 24시간 이하 이후 또는 16-18시간 이후). 제핵은 또한 극체와 인접한 세포질을 제거하기 위해 마이크로피펫을 사용하여 미세수술적으로 수행될 수 있다. 이후, 성공적으로 제핵된 난모세포를 확인하기 위해 난모세포를 스크리닝할 수 있다. 난모세포를 스크리닝하는 한 가지 방법은 적합한 유지(holding) 배지에서 난모세포를 3-10 또는 약 3-10 μg/mL 33342 Hoechst 염료로 염색한 다음, 10초 미만 동안 자외선 조사하에 난모세포를 보는 것일 수 있다. 이후, 성공적으로 제핵된 난모세포를 적합한 배양 배지, 예를 들어, CRlaa 및 10% 혈청에 둘 수 있다. 난모세포의 처리는 또한 핵 이식을 위해 최적화될 수 있다.
본원에서 생성된 배아는 대리모 비인간 동물(예컨대, 돼지)에 이식되어 새끼(예컨대, 새끼 돼지)를 생산할 수 있다. 예를 들어, 배아는, 예컨대 전신 마취 하에 중앙 개복술 후, 발정일 또는 발정후 1일에 수용자 암퇘지의 난관으로 이식될 수 있다. 임신은, 예컨대, 초음파에 의해 진단될 수 있다. 임신은 이식 후 28일 또는 약 28일에 진단될 수 있다. 그리고 나서, 임신은 초음파 검사에 의해 2주 간격 또는 약 2주 간격으로 확인될 수 있다. 미세주사된 새끼(예컨대, 새끼 돼지) 모두는 자연 분만에 의해 출산될 수 있다. 임신 및 출산 정보(예컨대, 임신 시간, 임신율, 새끼수, 생존율 등)는 문서화될 수 있다. 새끼의 유전자형 및 표현형은 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱)과 같이 출원을 통해 기재된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
배양된 세포는 핵 이식(예컨대, 체세포 핵 이식), 배아 이식, 및/또는 유도 임신을 위해 즉시 사용되어, 건강한 안정한 유전적 변형으로부터 유래된 배아가 새끼(예컨대, 새끼 돼지)를 생성하게 할 수 있다. 이러한 접근법은 시간 및 비용을 감소시킬 수 있고, 예컨대, 유전적으로 변형된 세포를 생성할 수 있는 수개월의 비용이 드는 세포 스크리닝은 건강한 새끼 돼지를 생산할 수 없다.
배아 성장 및 이식은 배아 성장 및 이식 산업에서 사용되는 표준 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 대리모가 사용될 수 있다. 배아는 또한 예를 들어, 인큐베이터를 사용하여 성장하고 배양에서 이식될 수 있다. 일부 경우, 배아는 동물, 예컨대, 대리 동물에게 이식되어, 임신을 확립할 수 있다.
본원에 개시된 동일한 유전자형 및/또는 표현형을 갖는 복수의 유전적으로 변형된 비인간 동물을 복제하거나 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 번식(예컨대, 선택 번식)에 의해 복제될 수 있다. 유전적으로 변형된 비인간 동물은 핵 이식(예컨대, 체세포 핵 이식) 또는 세포(예컨대, 난모세포, 정자, 접합자 또는 배아 줄기 세포) 내로 DNA의 도입에 의해 복제될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 개시된 복수의 유전적으로 변형된 비인간 동물을 복제하거나 생성하기 위해 여러 번 재현될 수 있다. 일부 경우, 세포는 임신한 유전적으로 변형된 비인간 동물의 태아로부터 단리될 수 있다. 단리된 세포(예컨대, 태아 세포)는 임신한 동물과 유사하거나 동일한 복수의 유전적으로 변형된 비인간 동물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 태아 세포는 핵 이식(예컨대, 체세포 핵 이식)에 의해 유전적으로 변형된 동물을 생성하기 위한 공여자 핵을 제공할 수 있다.
V. 사용 방법
세포, 장기, 및/또는 조직은 본원에 기재된 바와 같은 비인간 동물로부터 추출될 수 있다. 세포, 장기, 및/또는 조직은 생체외에서 유전적으로 변경되어 이에 따라 사용될 수 있다. 이러한 세포, 장기, 및/또는 조직은 세포-기반 요법에 사용될 수 있다. 이러한 세포, 장기, 및/또는 조직은 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에서 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 놀랍게도, 본원에 기재된 바와 같은 유전적 변형은 거부반응을 예방하는데 도움을 줄 수 있다. 또한, 세포, 장기, 및/또는 조직은 또한 면역 체계를 이식에 대해 관용화하는데 도움을 주는 관용화 백신으로 제조될 수 있다. 또한, 관용화 백신은 자가면역 반응을 폐지시키는 것을 포함하여, 면역 체계를 완화시킬 수 있다.
관용화 백신을 대상체에게 투여하는 단계; T 세포 활성화를 억제하는 약학 제제를 대상체에게 투여하는 단계; 및 유전적으로 변형된 세포를 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. T 세포 활성화를 억제하는 약학 제제는 항체일 수 있다. 항체는 본원에 개시된 항-CD40 항체일 수 있다. 대상체에게 이식되는 세포는 본 출원의 전반에 기재된 임의의 유전적으로 변형된 세포일 수 있다. 대상체에게 이식되는 조직 또는 장기는 유전적으로 변형된 세포 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 B 세포 고갈 항체, mTOR 억제제, TNF-알파 억제제, IL-6 억제제, 질소 머스타드 알킬화제(예컨대, 사이클로포스파미드), 및 보체 C3 또는 C5 억제제 중 하나 이상을 수용자에게 제공하는 것을 추가로 포함하는 것과 같이, 본 출원에 기재된 하나 이상의 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
하나 이상의 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 하나 이상의 세포는 본원에 개시된 임의의 유전적으로 변형된 세포일 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 하나 이상의 세포(예컨대, 유전적으로 변형된 세포)를 포함하는 조직 또는 장기를 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 것을 포함할 수 있다.
감소된 발현을 갖는 하나 이상의 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래된 하나 이상의 세포(장기 및/또는 조직 포함)를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 이식하는 것을 포함하는 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 기재된다. 하나 이상의 세포는 명세서 전반에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래될 수 있다.
본원에 개시된 방법은, 비제한적으로, 당뇨병, 심혈관 질환, 폐 질환, 간 질환, 피부 질환, 또는 신경 장애를 포함하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 파킨슨병 또는 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 낭포성 섬유증 관련 당뇨병, 수술 당뇨병, 임신 당뇨병, 미토콘드리아 당뇨병, 또는 이의 조합을 포함하는 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 유전적 당뇨병 또는 유전적 당뇨병의 하나의 형태를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 1형 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 2형 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 당뇨병전증(pre-diabetes)을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 당뇨병을 치료할 때, 유전적으로 변형된 비장 세포는 ECDI로 고정되어 수용자에게 제공될 수 있다. 또한, 유전적으로 변형된 췌장 도세포는 인슐린을 생산하기 위하여 동일한 수용자 내로 이식될 수 있다. 유전적으로 변형된 비장 세포 및 췌장 도세포는 유전적으로 동일할 수 있고 또한 동일한 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래될 수 있다.
본원에 제공되는 것은 i) 대상체에서 병태를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 데 사용하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 또는 장기; ii) 대상을 이식편에 대해 면역관용화하는 데 사용하기 위한 관용화 백신(상기 관용화 백신은 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기를 포함함); iii) 대상체에서 T 세포 활성화, B 세포 활성화, 수지상 세포 활성화, 또는 이의 조합을 억제하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 약학 제제; 또는 iv) 이의 임의의 조합을 포함한다.
또한 본원에 제공되는 것은 대상체에서 병태를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 데 사용하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 또는 장기를 포함한다. 상기 대상체는 관용화 백신의 사용에 의해 유전적으로 변형된 세포, 조직 또는 장기에 대해 관용화되었거나 관용화될 수 있다. 또한, 상기 대상체는 T 세포 활성화, B 세포 활성화, 수지상 세포 활성화, 또는 이의 조합을 억제하는 하나 이상의 약학 제제를 투여받을 수 있다.
이식
본원에 개시된 방법은 이식을 포함할 수 있다. 이식은 자가이식, 동종이식, 이종이식, 또는 임의의 다른 이식일 수 있다. 예를 들어, 이식은 이종이식일 수 있다. 이식은 또한 동종이식일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "이종이식" 및 그의 문법적 등가물은 세포, 조직, 또는 장기를 수용자에게 이식(transplantation), 부식(implantation), 또는 주입(infusion)하는 것을 포함하는 임의의 절차를 포함할 수 있으며, 여기서 수용자와 공여자는 상이한 종이다. 본원에 기재된 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식은 인간 내로의 이종이식을 위해 사용될 수 있다. 이종이식은 비제한적으로 혈관화 이종이식(vascularized xenotransplant), 부분 혈관화 이종이식(partially vascularized xenotransplant), 비혈관화 이종이식(unvascularized xenotransplant), 이종드레싱(xenodressing), 이종밴디지(xenobandage), 및 이종구조(xenostructure)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "동종이식" 및 그의 문법적 등가물은 세포, 조직, 또는 장기를 수용자에게 이식, 부식, 또는 주입하는 것을 포함하는 임의의 절차를 포함할 수 있으며, 여기서 수용자와 공여자는 동일한 종이다. 본원에 기재된 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식은 인간 내로의 동종이식을 위해 사용될 수 있다. 동종이식은 비제한적으로 혈관화 동종이식(vascularized allotransplant), 부분 혈관화 동종이식(partially vascularized allotransplant), 비혈관화 동종이식(unvascularized allotransplant), 동종드레싱(allodressing), 동종밴디지(allobandage), 및 동종구조(allostructure)를 포함한다.
치료(예컨대, 본원에 개시된 임의의 치료) 후, 이식 거부반응이 하나 이상의 야생형 세포가 수용자 내로 이식될 때와 비교하여 개선될 수 있다. 예를 들어, 이식 거부반응은 초급성(hyperacute) 거부반응일 수 있다. 이식 거부반응은 또한 급성 거부반응일 수 있다. 거부반응의 다른 유형은 만성 거부반응을 포함할 수 있다. 이식 거부반응은 또한 세포-매개 거부반응 또는 T 세포-매개 거부반응일 수 있다. 이식 거부반응은 또한 자연 살해 세포-매개 거부반응일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "개선하는" 및 그의 문법적 등가물은 당업자에 의해 인식되는 임의의 개선을 의미할 수 있다. 예를 들어, 이식을 개선하는 것은 초급성 거부반응을 줄이는 것을 의미할 수 있고, 이는 원하지 않는 효과 또는 증상의 감소, 줄임, 또는 축소를 포함할 수 있다.
상기 개시내용은 당뇨병 또는 당뇨병전증을 치료하거나 예방하는 방법을 기술한다. 예를 들어, 상기 방법은 비제한적으로, 본원에 기재된 공여자 비인간 동물로부터의 하나 이상의 췌장 도세포(들)를 수용자, 또는 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 이식 또는, 일부 경우, 이종이식일 수 있다. 공여자 동물은 비인간 동물일 수 있다. 수용자는 영장류, 예를 들어, 비제한적으로, 원숭이를 포함하는 비인간 영장류일 수 있다. 수용자는 인간 및 일부 경우, 당뇨병 또는 당뇨병전증을 갖는 인간일 수 있다. 일부 경우, 당뇨병 또는 당뇨병전증을 갖는 환자가 이식으로 치료될 수 있는지 여부는, 예컨대 본원에 그 전체가 참고로 통합된 문헌[Diabetes Care 2015;38:1016-1029]에 기재된 바와 같은 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
상기 방법은 또한 본원에 제공된 형질전환 세포, 조직 및/또는 장기, 예컨대, 췌장 조직 또는 세포가 영장류, 예컨대, 인간 내로 이식되고, 이식 후, 영장류가 낮은 면역억제 요법을 필요로 하거나 면역억제 요법을 필요로 하지 않는 이종이식의 방법을 포함할 수 있다. 면역억제 요법이 적거나 또는 면역억제요법이 없는 것은, 비제한적으로, 다른 방법에 의해 요구되는 것과 비교하여 면역억제 약물(들)/제제(들)의 용량의 감소(또는 완전한 제거); 다른 방법에 의해 요구되는 것과 비교하여 면역억제 약물(들)/제제(들)의 유형의 수의 감소(또는 완전한 제거); 다른 방법에 의해 요구되는 것과 비교하여 면역억제 치료의 지속시간의 감소(또는 완전한 제거); 및/또는 다른 방법에 의해 요구되는 것과 비교하여 유지 면역억제의 감소(또는 완전한 제거)를 포함한다.
본원에 개시된 방법은 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에서 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 수용자는 임의의 비인간 동물 또는 인간일 수 있다. 예를 들어, 수용자는 포유동물일 수 있다. 수용자의 다른 예는 비제한적으로 영장류, 예컨대, 원숭이, 침팬지, 뱀부(bamboo), 또는 인간을 포함한다. 수용자가 인간이면, 수용자는 이를 필요로 하는 인간일 수 있다. 본원에 기재된 방법은 또한 비-영장류, 비인간 수용자에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 수용자는 비제한적으로, 개, 고양이, 말, 늑대, 토끼, 흰담비(ferret), 게르빌루스쥐(gerbil), 햄스터, 친칠라(chinchilla), 애완용 랫트(fancy rat), 기니어 피그, 카나리아(canary), 잉꼬(parakeet), 또는 앵무새를 포함하는, 애완용 동물일 수 있다. 수용자가 애완용 동물이면, 애완용 동물은 이를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 수용자는 이를 필요로 하는 개 또는 이를 필요로 하는 고양이일 수 있다.
이식은 당업계에 공지된 임의의 이식일 수 있다. 이식편은 수용자의 다양한 부위에 이식될 수 있다. 부위는, 비제한적으로, 간 피막하 공간(subcapsular space), 비장 피막하 공간, 신장 피막하 공간, 장막(omentum), 위 또는 장의 점막하조직, 소장의 혈관 분절, 정맥낭(venous sac), 고환, 뇌, 비장, 또는 각막을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이식은 피막하 이식일 수 있다. 이식은 또한 근육내 이식일 수 있다. 이식은 문맥내 이식일 수 있다.
이식은 인간 또는 비인간 동물로부터의 하나 이상의 세포, 조직, 및/또는 장기의 이식일 수 있다. 예를 들어, 조직 및/또는 장기, 또는 하나 이상의 세포는 뇌, 심장, 폐, 눈, 위, 췌장, 신장, 간, 장, 자궁, 방광, 피부, 모발, 손톱, 귀, 샘, 코, 입, 입술, 비장, 잇몸(gum), 치아, 혀, 타액선, 편도선, 인두, 식도, 대장, 소장, 직장, 항문, 갑상선 샘, 흉선 샘, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 부신 피막(suprarenal capsule), 골격근, 평활근, 혈관, 혈액, 척수, 기도, 요관, 요도, 시상하부, 뇌하수체, 유문, 부신, 난소, 난관, 자궁, 질, 젖샘, 고환, 정낭, 음경, 림프, 림프절 또는 림프관 유래일 수 있다. 하나 이상의 세포는 또한 뇌, 심장, 간, 피부, 장, 폐, 신장, 눈, 소장, 또는 췌장 유래일 수 있다. 하나 이상의 세포는 췌장, 신장, 눈, 간, 소장, 폐, 또는 심장 유래이다. 하나 이상의 세포는 췌장 유래일 수 있다. 하나 이상의 세포는 췌장 도세포, 예를 들어, 췌장 β 세포일 수 있다. 또한, 하나 이상의 세포는 췌장 도세포 및/또는 세포 클러스터 등일 수 있으며, 이는 비제한적으로 췌장 α 세포, 췌장 β 세포, 췌장 δ 세포, 췌장 F 세포(예컨대, PP 세포), 또는 췌장 ε 세포를 포함한다. 하나의 경우에, 하나 이상의 세포는 췌장 α 세포일 수 있다. 다른 경우, 하나 이상의 세포는 췌장 β 세포일 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 이종이식편(예컨대, 세포, 조직 및/또는 장기) 공여에서 사용될 수 있다. 단지 예시적 목적을 위해, 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예컨대, 돼지는, 비제한적으로, 췌도 및/또는 췌도 세포를 포함하는 췌장 조직의 공여자로서 사용될 수 있다. 췌장 조직 또는 이러한 조직으로부터 유래된 세포는 췌장 도세포, 또는 췌도, 또는 췌도-세포 클러스터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 이식될 수 있는 췌도일 수 있다. 더욱 구체적으로, 세포는 췌장 β 세포일 수 있다. 세포는 또한 인슐린을 생산할 수 있다. 대안적으로, 세포는 췌도 유사 세포일 수 있다. 췌도 세포 클러스터는 α, β, δ, PP 또는 ε 세포 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 적절하게는, 본원의 방법 및 조성물에 의해 치료되는 질환은 당뇨병일 수 있다. 적절하게는 이식가능한 이식편은 췌도 및/또는 췌도로부터의 세포일 수 있다. 적절하게는, 형질전환 동물에 대한 변형은 췌도 또는 췌도로부터의 세포에 대한 변형이다. 적절하게는, 췌도 또는 췌도로부터의 세포는 돼지의 것이다. 일부 경우, 췌도로부터의 세포는 췌장 β 세포이거나 이를 포함한다.
공여자 비인간 동물은, 비제한적으로, 태아, 신생아, 젊은이 및 성체를 포함하는, 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 예를 들어, 공여자 세포 췌도 세포는 성체 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 공여자 세포, 예컨대, 췌도 세포는 또한 태아 또는 신생아 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 공여자 비인간 동물은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년령(들) 미만일 수 있다. 예를 들어, 췌도 세포는 6년령 미만의 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 췌도 세포는 또한 3년령 미만의 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 공여자는 비인간 동물일 수 있고, 0(태아 포함) 내지 2년령; 2 내지 4년령; 4 내지 6년령; 6 내지 8년령; 또는 8 내지 10년령 또는 약 0(태아 포함) 내지 2년령; 2 내지 4년령; 4 내지 6년령; 6 내지 8년령; 또는 8 내지 10년령의 임의의 연령일 수 있다. 비인간 동물은 10년령 또는 약 10년령 초과일 수 있다. 공여자 세포는 또한 인간으로부터 유래될 수 있다.
췌도 세포는 다양한 연령의 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 췌도 세포는 신생 내지 2년령 또는 약 신생아 내지 2년령 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 췌도 세포는 또한 태아 내지 2년령 또는 약 태아 내지 2년령 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 췌도 세포는 6개월령 내지 2년령 또는 약 6개월령 내지 2년령 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 췌도 세포는 또한 7개월령 내지 1년령 또는 약 7개월령 내지 1년령 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 췌도 세포는 2-3년령 또는 약 2-3년령 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 일부 경우, 비인간 동물은 0년령 미만(예컨대, 태아 또는 배아)일 수 있다. 일부 경우, 신생아 췌도는 성체 췌도보다 단리후에 더 왕성하고 일관될 수 있고, 산화적 스트레스에 대해 더 내성일 수 있고, 유의한 성장 잠재력을 나타낼 수 있고(아마도 발생기 췌도 줄기 세포 하위집단으로부터), 이로써 이들은 이식 부위에서 이식 및 생착 후에 증식하는 능력을 가질 수 있다.
당뇨병 치료와 관련하여, 신생아 췌도는 유의미한 수준의 인슐린을 생산하도록 충분히 성숙되기까지 최대 4-6주 또는 약 4-6주가 걸릴 수 있다는 단점을 가질 수 있지만, 이는 신생아 췌도의 성숙을 위해 충분한 기간 동안 외인성 인슐린을 처리함으로써 극복될 수 있다. 이종이식편 이식에서, 비-신생아 췌도의 생존 및 기능적 생착은, 임의의 수용자 내인성 c-펩티드와 쉽게 구별되는, 공여자 특이적 c-펩티드 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 성체 세포가 단리될 수 있다. 예를 들어, 성체 비인간 동물 췌도, 예컨대, 성체 돼지 세포가 단리될 수 있다. 이후, 췌도는 오염성 외분비 조직의 제조를 고갈시키기 위해 이식 전에 1-3일 또는 약 1-3일 동안 배양될 수 있다. 치료 전에, 췌도는 계수되고, 이중 형광 칼세인-AM 및 프로피디움 요오드화물 염색에 의해 생존력이 평가될 수 있다. 췌도 세포 생존력 >75%가 사용될 수 있다. 그러나, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 초과 또는 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 초과의 세포 생존력이 사용될 수 있다. 예를 들어, 40% 내지 50%; 50% 내지 60%; 60% 내지 70%; 70% 내지 80%; 80% 내지 90%; 90% 내지 95%, 또는 90% 내지 100% 또는 약 40% 내지 50%; 50% 내지 60%; 60% 내지 70%; 70% 내지 80%; 80% 내지 90%; 90% 내지 95%, 또는 90% 내지 100%의 생존력을 나타내는 세포가 사용될 수 있다. 또한, 순도는 80% 초과 또는 약 80% 초과의 췌도/전체 조직일 수 있다. 순도는 또한 적어도 또는 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 췌도/전체 조직일 수 있다. 예를 들어, 순도는 40% 내지 50%; 50% 내지 60%; 60% 내지 70%; 70% 내지 80%; 80% 내지 90%; 90% 내지 100%; 90% 내지 95%, 또는 95% 내지 100% 또는 약 40% 내지 50%; 50% 내지 60%; 60% 내지 70%; 70% 내지 80%; 80% 내지 90%; 90% 내지 100%; 90% 내지 95%, 또는 95% 내지 100%일 수 있다.
역동적인 주변관류(perifusion) 및 생존력을 포함하는 췌도의 기능적 특성은 치료 전에 시험관내에서 결정될 수 있다(Balamurugan, 2006). 예를 들어, 비인간 동물 췌도 세포, 예컨대, 형질전환 돼지 췌도 세포는 이식에 적합하도록 시험관내에서 배양되어 확장, 성숙, 및/또는 정제될 수 있다.
췌도 세포는 또한 다진(minced) 췌장의 표준 콜라게나아제 소화에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 무균 기술을 사용하여, 샘(gland)은 조직 해리 효소(췌장의 빠른 해리 및 건강한, 온전한, 및 기능적인 랑게르한스 섬의 최대 회수를 위해 제형화된 정제된 효소의 혼합물(이들 효소에 대한 표적 기질은 완전히 확인되지 않았으나, 췌장 샘꽈리 조직의 세포간 매트릭스를 포함하는 콜라겐 및 비-콜라겐 단백질로 추정됨)(1.5 mg/ml)로 팽창되고, 여분의 지방, 혈관 및 결합 조직이 손질되고, 다져지고, 120 rpm에서 15분간 진탕 수조에서 37℃에서 소화될 수 있다. 소화는 소화 동안 세포 손상을 피하기 위해 조직 해리 효소와 혼합된 리그노카인(lignocaine)을 사용하여 달성될 수 있다. 소화 후, 세포는 멸균 50mm 내지 1000mm 메쉬, 예컨대, 100 mm, 200 mm, 300 mm, 400 mm, 500 mm, 600 mm, 700 mm, 800 mm, 900 mm, 또는 1000 mm 메쉬를 통과하여 멸균 비이커 내로 들어갈 수 있다. 또한, 임의의 소화되지 않은 조직을 위해 제2 소화 과정이 사용될 수 있다.
췌도는 또한 성체 돼지 췌장으로부터 단리될 수 있다(Brandhorst et al., 1999). 췌장은 적합한 공급원 돼지로부터 회수되고, 췌장 주변 조직이 제거되고, 췌장이 비장 엽(splenic lobe) 및 십이지장(duodenal)/연결(connecting) 엽으로 분할되고, 각 엽의 관(duct)에 캐뉼러가 삽입되고, 상기 엽이 조직 해리 효소로 팽창된다. 췌장 엽(pancreatic lobe)을 리코디 챔버(Ricordi chamber)에 넣고, 온도를 서서히 28 내지 32℃로 올리고, 췌장 엽을 효소 활성 및 기계적 힘에 의해 해리한다. 해리된 췌도를 연속적인 밀도 구배를 사용하여 샘꽈리 및 도관(ductal) 조직으로부터 분리한다. 정제된 췌도를 2 내지 7일 또는 약 2 내지 7일 동안 배양하고, 특성을 규명하고, 모든 사양을 만족하는 췌도 생성물이 이식을 위해 방출된다(Korbutt et al., 2009).
이식 전, 후, 및/또는 동안 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직은 기능적일 수 있다. 예를 들어, 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1, 5, 10, 20, 30일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30년 동안 기능적일 수 있다. 일부 경우, 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 수용자의 생애 동안 기능적일 수 있다. 이것은 이식이 성공적이었음을 가리킬 수 있다. 이것은 또한 이식된 세포, 조직, 및/또는 장기의 거부반응이 없다는 것을 가리킬 수 있다.
또한, 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 그의 정상적인 의도된 작동의 100%에서 기능할 수 있다. 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 또한 그의 정상적인 의도된 작동의 적어도 또는 적어도 약 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100%, 예컨대, 50 내지 60; 60 내지 70; 70 내지 80; 80 내지 90; 90 내지 100% 또는 약 50 내지 60; 60 내지 70; 70 내지 80; 80 내지 90; 90 내지 100%에서 기능할 수 있다. 특정 경우, 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 그의 정상적인 의도된 작동의 100% 초과로 기능할 수 있다(미국 의학 협회에 의해 결정된 바와 같이 정상적으로 기능하는 비-이식된 세포, 장기, 또는 조직과 비교할 때). 예를 들어, 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직은 그의 정상적인 의도된 작동의 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200% 이상 또는 약 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200% 이상, 예컨대, 100 내지 125; 125 내지 150; 150 내지 175; 175 내지 200% 또는 약 100 내지 125; 125 내지 150; 150 내지 175; 175 내지 200%로 기능할 수 있다.
특정 경우, 이식된 세포는 적어도 또는 적어도 약 1일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 또한 적어도 또는 적어도 약 7일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 적어도 또는 적어도 약 14일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 적어도 또는 적어도 약 21일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 적어도 또는 적어도 약 28일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 적어도 또는 적어도 약 60일 동안 기능적일 수 있다.
성공적인 이식의 또 다른 표시는 수용자가 면역억제 요법을 필요로 하지 않는 일자일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 치료(예컨대, 이식) 후, 수용자는 적어도 또는 적어도 약 1일, 5일, 10일, 100일, 365일, 500일, 800일, 1000일, 2000일, 4000일 또는 그 이상 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 이것은 이식이 성공적이었음을 나타낼 수 있다. 이것은 또한 이식된 세포, 조직, 및/또는 장기의 거부반응이 없다는 것을 나타낼 수 있다.
일부 경우, 수용자는 적어도 또는 적어도 약 1일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 7일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 14일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 21일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 28일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 60일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 수용자는 적어도 또는 적어도 약 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 15년, 20년, 30년, 40년, 또는 50년 동안, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1년 내지 2년; 2년 내지 3년; 3년 내지 4년; 4년 내지 5년; 1년 내지 5년; 5년 내지 10년; 10년 내지 15년; 15년 내지 20년; 20년 내지 25년; 25년 내지 50년 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다.
성공적인 이식의 또 다른 표시는 수용자가 감소된 면역억제 요법을 필요로 하는 일자일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 치료 후, 수용자는 적어도 또는 적어도 약 1일, 5일, 10일, 50일, 100일, 200일, 300일, 365일, 400일, 500일 동안, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1일 내지 30일; 30일 내지 120일; 120일 내지 365일; 365일 내지 500일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 이것은 이식이 성공적이었음을 나타낼 수 있다. 이것은 또한 이식된 세포, 조직, 및/또는 장기의 거부반응이 없거나 최소한의 거부반응이 있다는 것을 나타낼 수 있다.
예를 들어, 수용자는 적어도 또는 적어도 약 1일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수용자는 또한 적어도 7일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 14일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 21일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 28일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수용자는 적어도 또는 적어도 약 60일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 또한, 수용자는 적어도 또는 적어도 약 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 15년, 20년, 30년, 40년, 또는 50년 동안, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1년 내지 2년; 2년 내지 3년; 3년 내지 4년; 4년 내지 5년; 1년 내지 5년; 5년 내지 10년; 10년 내지 15년; 15년 내지 20년; 20년 내지 25년; 25년 내지 50년 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "감소된" 및 그의 문법적 등가물은 하나 이상의 야생형 세포가 수용자에게 이식될 때 요구된 면역억제 요법과 비교하여 적은 면역억제 요법을 지칭할 수 있다.
면역억제 요법
면역억제 요법은 면역 체계를 억제하는 임의의 치료를 포함할 수 있다. 면역억제 요법은 수용자에서 이식 거부반응을 완화하거나, 최소화하거나, 또는 제거하는데 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 면역억제 요법은 면역억제 약물을 포함할 수 있다. 이식 전, 동안 및/또는 후에 사용될 수 있는 면역억제 약물은 당업자에게 공지된 어느 것이며, 비제한적으로, MMF(미코페놀레이트 모페틸(Cellcept)), ATG(항-흉선세포 글로불린), 항-CD154(CD4OL), 항-CD40(2C10, ASKP1240, CCFZ533X2201), 알렘투주맙(Campath), 항-CD20(리툭시맙), 항-IL-6R 항체(토실리주맙, Actemra), 항-IL-6 항체(사릴루맙, 올로키주맙), CTLA4-Ig(아바타셉트/Orencia), 벨라타셉트(LEA29Y), 시롤리무스(Rapimune), 에베롤리무스, 타크롤리무스(Prograf), 다클리주맙(Ze-napax), 바실릭시맙(Simulect), 인플릭시맙(Remicade), 사이클로스포린, 데옥시스퍼구알린, 가용성 보체 수용체 1, 코브라 독 인자(cobra venom factor), 콤프스타틴, 항 C5 항체(에쿨리주맙/Soliris), 메틸프레드니솔론, FTY720, 에베롤리무스, 레플루노미드, 항-IL-2R-Ab, 라파마이신, 항-CXCR3 항체, 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 및 항-CD122 항체를 포함한다. 또한, 하나 또는 하나를 초과하는 면역억제제/약물이 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 하나 또는 하나를 초과하는 면역억제제/약물이 유도 요법을 위해 또는 유지 요법을 위해 사용될 수 있다. 동일하거나 상이한 약물이 유도 및 유지 단계 동안 사용될 수 있다. 일부 경우, 다클리주맙(Zenapax)이 유도 요법을 위해 사용될 수 있고, 타크롤리무스(Prograf) 및 시롤리무스(Rapimune)가 유지 요법을 위해 사용될 수 있다. 다클리주맙(Zenapax)이 또한 유도 요법을 위해 사용될 수 있고, 저용량 타크롤리무스(Prograf) 및 저용량 시롤리무스(Rapimune)가 유지 요법을 위해 사용될 수 있다. 면역억제는 또한 비제한적으로, 전신 조사(whole body irradiation), 흉선 조사(thymic irradiation), 및 전체 및/또는 부분 비장절제술을 포함하는 비-약물 레지멘(regimen)을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 기술은 하나 이상의 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다.
형질전환 췌장 도세포는, 비제한적으로, 수용자 유기체의 문맥 정맥(portal vein), 간 피막하 공간(subcapsular space), 비장 피막하 공간, 신장 피막하 공간, 장막(omentum), 위 또는 장의 점막하조직, 소장의 혈관 분절, 정맥낭(venous sac), 고환, 뇌, 각막 또는 비장을 통한 도입을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 방식을 사용하여 이식될 수 있다. 예를 들어, 이종이식의 방법은 본원에 제공된 췌장 세포, 예컨대, 돼지 췌장 세포를 영장류, 예컨대, 인간 내로 이식하는 것일 수 있으며, 여기서 췌도는 문맥내 주입(intraportal infusion)에 의해 투여된다. 이종이식의 방법은 본원에 제공된 췌장 세포를 영장류 내로 이식하기 위해 제공될 수 있으며, 여기서 췌도는 복강내 공간, 신장 피막하, 신장 피막, 장막을 통해, 또는 췌장 상(pancreatic bed) 주입을 통해 투여된다. 예를 들어, 이식은 피막하 이식, 근육내 이식, 또는 문맥내 이식일 수 있다.
동종이식 및 이종이식 모두는 때때로 재발성 자가면역의 대상일 수 있다. 예를 들어, 췌도 세포 이식과 관련하여, 췌도 β 세포는 자가반응 T 세포, 예를 들어, CD8+ 자가반응 T 세포, 및 자가반응 항체에 의해 이식후에 공격되고 파괴될 수 있다. 수용자에게 관용화 백신이 제공되는 경우, 자가면역 재발이 예방될 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신이 또한 세포자멸 캐리어 세포 또는 미세입자, 예컨대 폴리스티렌 입자의 표면 상에 인슐린 B9-23과 같은 자가항원을 제시하도록 조작되는 경우, 자가항원에 대한 관용이 회복될 수 있고, 자가면역 재발이 예방될 수 있다. 예를 들어, 당뇨병과 관련하여, 본원에 개시된 바와 같은 관용화 백신은 자가면역 1형 당뇨병의 발병을 예방하거나 이식된 췌도 β 세포에서 자가면역 재발을 예방할 수 있다.
관용화 백신은 또한 당뇨병(예컨대, 1형, 2형, 임신, 수술, 낭포성 섬유증 관련 당뇨병, 또는 미토콘드리아 당뇨병. 일부 경우, 질환은 유전적 당뇨병 또는 유전적 당뇨병의 유형일 수 있음)을 예방하거나 치료하기 위해 수용자에게 제공될 수 있다.
또한, 동종이식 및 이종이식의 경우, 이식편 내의 NLRC5, TAP1, 및 B2M과 같은 유전자를 파괴하는 것은 췌도 베타 세포를 포함하는 이식편 세포 상의 MHC 클래스 I의 기능적 발현의 결여를 유발하여, 자가반응 CD8+ T 세포의 이식후 활성화를 방해할 수 있다. 따라서, 이것은 이식, 예컨대, 이식된 췌도 베타 세포를 자가반응 CD8+ T 세포의 세포용해 이펙터 기능으로부터 보호할 수 있다.
관용화 백신을 사용한 수용자에서 이식편의 관용의 유도
ECDI 처리된 세포를 포함하는 관용화 백신은 수용자에서 공여자 특이적 관용을 유도하기 위해 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전, 후, 및/또는 동안 투여될 수 있다. 실시예가 도 4에서 나타내는 바와 같이, 돼지 췌도는 0일에 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 이식된다. 동일한 공여자 돼지로부터 유래된 세포자멸성 세포(예컨대, 관용화 백신)는 이종이식편(예컨대, 동일한 공여자로부터의 돼지 췌도)에 대한 관용을 유도하기 위해 췌도 이식 후 7일(-7일)에 최초로 투여될 수 있다. 부가적인 관용화 백신은 관용을 부스터하기 위해 췌도 이식 후 1일(1일)에 투여될 수 있다(도 4). 또한, 관용화 백신의 투여는 일시적인 면역억제의 투여를 동반할 수 있다(도 4). 일부 경우, ECDI 처리된 세포를 포함하는 관용화 백신은, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, -100일, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일 또는 약 -100일, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일, 예컨대, -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일 또는 약 -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, ECDI 처리된 세포를 포함하는 관용화 백신은 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전 7일(예컨대, -7일)에 투여될 수 있다. 일부 경우, ECDI 처리된 세포를 포함하는 관용화 백신은 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식과 같은 날(예컨대 0일)에 투여될 수 있다. 일부 경우, ECDI 처리된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, 100일, 90일, 80일, 70일, 60일, 50일, 40일, 30일, 20일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 또는 약 100일, 90일, 80일, 70일, 60일, 50일, 40일, 30일, 20일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, ECDI 처리된 세포를 포함하는 관용화 백신은 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 후 1일(예컨대, 1일)에 투여될 수 있다. 일부 경우, 관용화 백신은 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전 및 후에 투여될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포, 관용화 백신 및 항체는 이식 거부반응을 억제하기 위해 함께 사용될 수 있다. 도 5는 거부반응을 예방하고/거나 이식편(예컨대, 이종이식편)의 생존을 연장하기 위한 예시적인 접근법을 입증한다. 상기 접근법은: i) 이식편 공여자의 유전적 조작; ii) 백신 공여자의 유전적 조작, 및 iii) 일시적인 면역억제의 보호 하에 유전적으로 조작된 관용화 백신(세포자멸성 세포 단독 또는 비세포자멸성 세포를 가짐), 및 이식편의 투여를 통합할 수 있다. 이식편 공여자 및 백신 공여자는 동일한 유전자형을 가질 수 있다. 대안적으로, 이식편 공여자 및 백신 공여자는 상이한 유전자형을 가질 수 있다. 일부 경우, 이식편 공여자는 NLRC5, C3, CXCL10, 및 GGTA1의 감소된 발현, 및 HLA-G(예컨대, HLA-G1) 또는 HLA-E를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 이식편 공여자는 TAP1, C3, CXCL10, 및 GGTA1의 감소된 발현, 및 HLA-G(예컨대, HLA-G1) 또는 HLA-E를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 이식편 공여자는 NLRC5 및 TAP1, C3, CXCL10, 및 GGTA1의 감소된 발현, 및 HLA-G(예컨대, HLA-G1) 또는 HLA-E를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 백신 공여자는 GGTA1, CMAH, B4GALNT2의 감소된 발현 및/또는 HLA-G(예컨대, HLA-G1), CD47(예컨대, 인간 CD47), PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1), 및 PD-L2(예컨대, 인간 PD-L2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 가질 수 있다. 백신 공여자는 GGTA1, CMAH, B4GALNT2의 감소된 발현 및/또는 HLA-E, CD47(예컨대, 인간 CD47), PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1), 및 PD-L2(예컨대, 인간 PD-L2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자를 가질 수 있다. 일부 경우, 백신은 전(예컨대, -7일) 및/또는 후(예컨대, 1일)에 이식 수용자에게 제공될 수 있다. 다른 면역억제 시약, 예컨대, 항-CD40 항체, 항-CD20 항체, 라파마이신, 콤프스타틴, 항-IL-6R 항체, 및 sTNFR, 질소 머스타드 알킬화제(예컨대, 사이클로포스파미드) 중 하나 이상이 또한 이식 전 및/또는 이식 후에 대상체에게 제공될 수 있다.
본원에 개시된 유전적으로 변형된 세포, 조직, 장기, 관용화 백신 및 항-CD40 항체 외에도, 하나 이상의 부가적인 면역억제제가 또한 유전적으로 변형된 세포, 조직, 장기, 관용화 백신 및/또는 항-CD40 항체를 받고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 부가적인 면역억제제는, 예컨대, 대상체에서 관용화 백신의 관용원성 효능을 향상시키기 위해, 대상체에게 투여될 수 있다. 부가적인 면역억제제는 B 세포 고갈 항체, mTOR 억제제, TNF-알파 억제제, IL-6 억제제, 질소 머스타드 알킬화제(예컨대, 사이클로포스파미드), 보체 C3 또는 C5 억제제, 또는 이의 임의의 조합를 포함할 수 있다.
부가적인 면역억제제는, 예컨대, 질소 머스타드 알킬화제일 수 있다. 예를 들어, 부가적인 면역억제제는 사이클로포스파미드일 수 있다.
부가적인 면역억제제는 관용화 백신의 투여 전, 후, 및/또는 동안 투여될 수 있다. 일부 경우, 부가적인 면역억제제는, 관용화 백신의 투여 대비, -100일 내지 0일, 예컨대, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일에 투여될 수 있다. 일부 경우, 부가적인 면역억제제는, 관용화 백신의 투여 대비, -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일 또는 약 -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일에 투여될 수 있다. 일부 경우, 부가적인 면역억제제는, 관용화 백신의 투여 대비, 0일 내지 100일, 예컨대, 100일, 90일, 80일, 70일, 60일, 50일, 40일, 30일, 20일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역억제제는, 관용화 백신의 투여 대비, 100일 내지 50일; 50일 내지 40일; 40일 내지 30일; 30일 내지 20일; 20일 내지 10일; 10일 내지 5일; 7일 내지 1일 또는 약 100일 내지 50일; 50일 내지 40일; 40일 내지 30일; 30일 내지 20일; 20일 내지 10일; 10일 내지 5일; 7일 내지 1일에 투여될 수 있다. 일부 경우, 부가적인 면역억제제는 관용화 백신이 투여되는 일자에 투여될 수 있다. 다른 경우, 부가적인 면역억제는 관용화 백신의 투여 전 및 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 사이클로포스파미드는 관용화 백신의 투여 후 3일 또는 약 3일에 투여될 수 있다.
관용원성 효능 조절제(예컨대, 사이클로포스파미드)는 5 내지 100 mg/kg/일 또는 약 5 내지 100 mg/kg/일의 용량으로 투여될 수 있다. 단위 "mg/kg/일"은 1일당 대상의 체중의 kg 당 제공된 관용원성 효능 조절제의 밀리그램의 수를 지칭할 수 있다. 일부 경우, 관용원성 효능 조절제(예컨대, 사이클로포스파미드)는 20 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일; 30 mg/kg/일 내지 90 mg/kg/일; 40 mg/kg/일 내지 80 mg/kg/일; 50 mg/kg/일 내지 70 mg/kg/일; 50 mg/kg/일 내지 60 mg/kg/일; 또는 40 mg/kg/일 내지 60 mg/kg/일 또는 약 20 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일; 30 mg/kg/일 내지 90 mg/kg/일; 40 mg/kg/일 내지 80 mg/kg/일; 50 mg/kg/일 내지 70 mg/kg/일; 50 mg/kg/일 내지 60 mg/kg/일; 또는 40 mg/kg/일 내지 60 mg/kg/일의 용량으로 투여될 수 있다.
세포(예컨대, 비장 세포)는 적합한 항원(들) 및/또는 에피토프(들)(예컨대, CD4)의 존재하에 ECDI로 처리될 수 있다. ECDI 처리는 항원(들) 및/또는 에피토프(들)를 ECDI 처리된 세포에 결합시킬 수 있다. 다른 접합체, 예컨대 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 2개의 에폭시 잔기를 함유하는 프로필렌글리콜 디-글리시딜에테르, 및 에피클로로히드린이 또한 세포를 처리하고 항원(들) 및/또는 에피토프(들)를 결합시켜 관용화 백신을 위한 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다.
항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포(예컨대, ECDI-유도 결합)는 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에서 세포, 장기, 및/또는 조직에 대한 관용을 유도하기 위해 공여자 이식 세포, 장기, 및/또는 조직의 투여 전, 동안, 및/또는 후에 투여될 수 있다. 일부 경우, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, -100일, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일에 투여될 수 있다. 일부 경우, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일 또는 약 -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전 7일(예컨대 -7일)에 투여될 수 있다. 일부 경우, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식과 같은 날(예컨대, 0일)에 투여될 수 있다. 일부 경우, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, 100일, 90일, 80일, 70일, 60일, 50일, 40일, 30일, 20일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, 100일 내지 50일; 50일 내지 40일; 40일 내지 30일; 30일 내지 20일; 20일 내지 10일; 10일 내지 5일; 7일 내지 1일 또는 약 100일 내지 50일; 50일 내지 40일; 40일 내지 30일; 30일 내지 20일; 20일 내지 10일; 10일 내지 5일; 7일 내지 1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 후 1일(예컨대, 1일)에 투여될 수 있다.
ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포는 수용자에게 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직을 이식하기 전에 수용자에게 투여될 수 있다. ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포는 수용자에게 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직을 이식하기 전에 수용자에게 공동 투여될 수 있다. ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포는 수용자에게 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직을 이식한 후에 수용자에게 투여될 수 있다. 이식 전, 동안, 및/또는 후에 이식 수용자에게 ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포를 투여하는 것은 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직의 관용을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, ECDI 처리된 세포, 항원 결합된 세포, 및/또는 에피토프 결합된 세포는 이식된 세포, 장기, 및/또는 조직의 초기 관용, 장기간 관용, 및/또는 총 수용성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우, ECDI 처리된 세포(예컨대, 에피토프 결합된 세포)를 이식 수용자에게 투여하는 것은 부가적인 면역억제 또는 항 거부반응 요법 없이 이식된 물질의 관용을 야기할 수 있다.
관용화 백신은 세포, 장기, 및/또는 조직의 거부반응을 예방하는데 필요한 면역억제의 용량 또는 지속시간을 감소시킬 수 있다. 관용화 백신은 필요한 면역억제의 용량을 적어도 또는 적어도 약 5%까지 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 관용화 백신은 필요한 면역억제의 용량을 적어도 또는 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 5% 내지 25%; 25% 내지 50%; 50% 내지 75%; 75% 내지 85%; 85% 내지 90%; 90% 내지 95%; 95% 내지 100%까지 감소시킬 수 있다. 일부 경우, 이식 수용자는 관용화 백신의 투여 후 면역억제를 필요로 하지 않을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "감소시키다" 및 그의 문법적 등가물은 하나 이상의 야생형 세포, 장기, 및/또는 조직이 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물) 내로 이식될 때 필요한 면역억제 용량과 비교하여 적은 면역억제를 사용하는 것을 지칭할 수 있다. 용어 "감소시키다"는 또한 하나 이상의 야생형 세포, 장기, 및/또는 조직이 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물) 내로 이식될 때 필요한 면역억제 용량과 비교하여 적은 면역억제 약물(들) 또는 제제(들)를 사용하는 것을 지칭할 수 있다.
수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 동안, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1일 내지 5일; 5일 내지 10일; 10일 내지 20일; 20일 내지 30일; 30일 내지 60일; 60일 내지 100일 동안 감소된 용량의 면역억제를 필요로 할 수 있다. 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 동안, 예컨대, 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1개월 내지 2개월; 2개월 내지 3개월; 3개월 내지 6개월; 6개월 내지 9개월; 9개월 내지 12개월 동안 감소된 용량의 면역억제를 필요로 할 수 있다. 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 15년, 20년, 25년, 또는 30년 동안, 예컨대 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1년 내지 2년; 2년 내지 3년; 3년 내지 4년; 4년 내지 5년; 1년 내지 5년; 5년 내지 10년; 10년 내지 15년; 15년 내지 20년; 20년 내지 25년; 25년 내지 30년 동안 감소된 용량의 면역억제를 필요로 할 수 있다. 일부 경우, 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 수용자의 생애 동안 감소된 용량의 면역억제를 필요로 할 수 있다.
수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 동안, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1일 내지 5일; 5일 내지 10일; 10일 내지 20일; 20일 내지 30일; 30일 내지 60일; 60일 내지 100일 동안 면역억제를 필요로 하지 않을 수 있다. 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 동안, 예컨대, 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1개월 내지 2개월; 2개월 내지 3개월; 3개월 내지 6개월; 6개월 내지 9개월; 9개월 내지 12개월 동안 감소된 용량의 면역억제를 필요로 할 수 있다. 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 15년, 20년, 25년, 또는 30년 동안, 예컨대 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1년 내지 2년; 2년 내지 3년; 3년 내지 4년; 4년 내지 5년; 1년 내지 5년; 5년 내지 10년; 10년 내지 15년; 15년 내지 20년; 20년 내지 25년; 25년 내지 30년 동안 감소된 용량의 면역억제를 필요로 할 수 있다. 일부 경우, 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)는 수용자의 생애 동안 면역억제를 필요로 하지 않을 수 있다.
본원에 기재된 면역억제는 이식 바로 전, 후, 및/또는 동안 투여되는 면역억제를 지칭할 수 있다. 본원에 기재된 면역억제는 또한 이식 후 적어도 또는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일(예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1일 내지 5일; 5일 내지 10일; 10일 내지 20일; 20일 내지 30일; 30일 내지 60일; 60일 내지 100일 동안) 또는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 15년, 20년, 25년, 또는 30년(예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1년 내지 2년; 2년 내지 3년; 3년 내지 4년; 4년 내지 5년; 1년 내지 5년; 5년 내지 10년; 10년 내지 15년; 15년 내지 20년; 20년 내지 25년; 25년 내지 30년 동안)에 투여된 유지 면역억제를 지칭할 수 있다. 관용화 백신은 유지 면역억제를 필요로 하지 않으면서 세포, 장기, 및/또는 조직의 생존을 증가시킬 수 있다.
면역억제는 수용자에서 이식 거부반응을 억제하는 면역억제 요법에서 사용될 수 있다. 면역억제 요법은 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에서 이식 거부반응을 억제하는 임의의 치료를 포함할 수 있다. 면역억제 요법은 면역억제 약물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이식 전, 동안, 및/또는 후에 사용될 수 있는 면역억제 약물은, 비제한적으로, MMF(미코페놀레이트 모페틸(Cellcept)), ATG(항-흉선세포 글로불린), 항-CD154(CD4OL), 알렘투주맙(Campath), 항-CD20(리툭시맙), 항-IL-6R 항체(토실리주맙, Actemra), 항-IL-6 항체(사릴루맙, 올로키주맙), CTLA4-Ig(아바타셉트/Orencia), 벨라타셉트(LEA29Y), 시롤리무스(Rapimune), 타크롤리무스(Prograf), 다클리주맙(Ze-napax), 바실릭시맙(Simulect), 인플릭시맙(Remicade), 사이클로스포린, 데옥시스퍼구알린, 가용성 보체 수용체 1, 코브라 독 인자(cobra venom factor), 콤프스타틴, 항 C5 항체(에쿨리주맙/Soliris), 메틸프레드니솔론, FTY720, 에베롤리무스, 항-CD154-Ab, 레플루노미드, 항-IL-2R-Ab, 라파마이신, 항-CXCR3 항체, 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 및 항-CD122 항체, 및 인간 항-CD154 단일클론 항체를 포함한다. 하나 또는 하나를 초과하는 면역억제제/약물은 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 하나 또는 하나를 초과하는 면역억제제/약물은 유도 요법 또는 유지 요법을 위해 사용될 수 있다. 동일하거나 상이한 약물이 유도 및 유지 단계 동안 사용될 수 있다. 예를 들어, 다클리주맙(Zenapax)이 유도 요법을 위해 사용되고, 타크롤리무스(Prograf) 및 시롤리무스(Rapimune)가 유지 요법을 위해 사용된다. 또 다른 예에서, 다클리주맙(Zenapax)이 유도 요법을 위해 사용되고, 저용량 타크롤리무스(Prograf) 및 저용량 시롤리무스(Rapimune)가 유지 요법을 위해 사용된다. 면역억제는 또한, 비제한적으로, 전신 조사(whole body irradiation), 흉선 조사(thymic irradiation), 및 전체 및/또는 부분 비장절제술을 포함하는 비-약물 레지멘을 사용하여 달성될 수 있다. 이들 기술은 하나 이상의 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다.
항체 치료
전격(fulminant), 초급성(hyperacute), 및/또는 급성(acute) 혈관 거부반응을 회피하는 동종이식편 및 이종이식편 모두는 T 세포 매개 거부반응을 받는다. CD4+ 및 CD8+ T 림프구는 거부반응에 기여한다. 이들 T 세포는 T 세포에 대한 공여자 항원 제시 세포에 의한 제시를 포함하는 면역 인식의 직접적인 경로를 통해 또는 숙주 항원 제시 세포에 의한 내재된 가용성 공여자 항원의 제시를 포함하는 간접적인 경로를 통해 활성화될 수 있다. CD8+ T 세포는 거부반응의 주요 매개체이다. B 세포는 항원 제시, 사이토카인 생산, 및 공동 자극과 같은 기전에 의해 활성화된 항-공여자 CD4+ T 세포의 증식, 항-공여자 CD8+ T 세포의 생존, 및 T 세포 기억 생성을 촉진한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 공여자로부터 이식된 세포, 조직 또는 장기에 대한 수용자의 직접 면역 반응, 간접 면역 반응, 또는 둘 모두를 감소시키는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 ECDI 처리된 세포(예컨대, 관용화 백신) 및 하나 이상의 생물학적 또는 화학적 물질을 인간에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, ECDI 처리된 세포는 돼지 세포, 예컨대, 돼지 비장 세포일 수 있다.
하나 이상의 생물학적 또는 화학적 물질은 항체일 수 있다. 항체는 항-CD40 또는 항-IL-6R일 수 있다. 항-CD40 항체는 항-CD40 Ab 2C10 항체, 항-CD40 mAb ASKP1240(4D11)(예컨대, 문헌[Watanabe et al., "ASKP1240, a fully human anti-CD40 monoclonal antibody, prolongs pancreatic islet allograft survival in nonhuman primates," Am J Transplant.　13(8):1976-88 (2013)]에 기재된 바와 같음), 또는 항-CD40 mAb CFZ533 (문헌[Corodoba et al., "A　Novel,　Blocking,　Fc-Silent　Anti-CD40　Monoclonal　Antibody　Prolongs　Nonhuman　Primate　Renal　Allograft Survival　in the　Absence　of　B　Cell　Depletion," Am J Transplant, 15(11):2825-36 (2015)]에 기재된 바와 같음)일 수 있다.
이식(예컨대, 이종이식)을 위해 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)를 면역관용화하기 위한 본원에 기재된 방법은 ECDI 처리된 세포, B 세포 고갈 항체, 길항적 항-CD40 항체, mTOR 억제제, 및 TNF-알파 억제제, 및 IL-6 억제제, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 생물학적 또는 화학적 물질을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에서 이식 생존을 연장시키기 위한 본원의 방법은 ECDI 처리된 세포, 항-CD40 Ab 2C10 항체, sTNFR, 항-IL-6R 항체, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 생물학적 물질을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 본원에 개시된 ECDI 처리된 세포를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있으며, 상기 ECDI 처리된 세포는 본원에 개시되어 있다. 상기 방법은 B 세포 고갈 항체, 예를 들어, 리툭시맙을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 길항적 항-CD40 항체, 예를 들어, 인간화된 2C10을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 mTOR 억제제, 예를 들어, 라파마이신을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 TNF-알파 억제제, 예를 들어, sTNFR을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. sTNFR은 또한 토실리주맙 또는 에타너셉트일 수 있다. 상기 방법은 IL-6 억제제, 예를 들어, 항-IL-6R 항체를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 항원 제시 세포(APC) 상의 풍부하지 않은(non-redundant) 에피토프를 표적화하는 항체(예컨대, 단일클론 항체)를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 T 세포 활성화, B 세포 활성화, 수지상 세포 활성화, 또는 이의 임의의 조합을 억제하는 약학 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 하기 중 둘 이상을 포함하는 키트를 제공할 수 있다: 비장 세포; 항-CD40 Ab 2C10 항체; sTNFR; 및 항-IL-6R 항체. 예를 들어, 키트는 비장 세포 및 항-CD40 Ab 2C10 항체를 포함할 수 있다. 키트는 비장 세포 및 sTNFR을 포함할 수 있다. 키트는 비장 세포 및 항-IL-6R 항체를 포함할 수 있다. 키트는 항-CD40 Ab 2C10 항체 및 sTNFR을 포함할 수 있다. 키트는 항-CD40 Ab 2C10 항체 및 항-IL-6R 항체를 포함할 수 있다. 키트는 sTNFR 및 항-IL-6R 항체를 포함할 수 있다. 키트는 비장 세포, 항-CD40 Ab 2C10 항체 및 sTNFR을 포함할 수 있다. 키트는 비장 세포, 항-CD40 Ab 2C10 항체 및 항-IL-6R 항체를 포함할 수 있다. 키트는 비장 세포, sTNFR 및 항-IL-6R 항체를 포함할 수 있다. 키트는 항-CD40 Ab 2C10 항체, sTNFR 및 항-IL-6R 항체를 포함할 수 있다. 키트는 비장 세포; 항-CD40 Ab 2C10 항체; sTNFR; 및 항-IL-6R 항체를 포함할 수 있다. 키트는 ECDI 고정화를 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 방법은 ECDI 처리된 비장 세포와 같은 ECDI 처리된 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포 및 항-CD40 Ab 2C10 항체를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포 및 sTNFR을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포 및 항-IL-6R 항체를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 항-CD40 Ab 2C10 항체 및 sTNFR을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 항-CD40 Ab 2C10 항체 및 항-IL-6R 항체를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포, 항-CD40 Ab 2C10 항체, 및 sTNFR을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포, 항-CD40 Ab 2C10 항체, 및 항-IL-6R을 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포, sTNFR, 및 항-IL-6R 항체를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포, 항-CD40 Ab 2C10 항체, sTNFR, 및 항-IL-6R 항체를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 방법은 ECDI 처리된 비장 세포, 및 항원 제시 세포(APC) 상의 풍부하지 않은(non-redundant) 에피토프를 표적화하는 항체(예컨대, 단일클론 항체)를 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 제공하는 것을 포함할 수 있다.
공여자(예컨대, 이식편 및/또는 관용화 백신 내의 세포에 대한 공여자)는 포유동물일 수 있다. 동종이식편의 공여자는 비제한적으로 만능 줄기 세포를 포함하는, 변형되지 않은 인간 세포, 조직, 및/또는 장기일 수 있다. 이종이식편의 공여자는 비인간 동물, 예컨대 포유동물로부터의 임의의 세포, 조직, 및/또는 장기일 수 있다. 일부 경우, 포유동물은 돼지일 수 있다.
본원의 방법은 질환을 가진 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)를 진단하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 질환은, 비제한적으로, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신 당뇨병, 수술 당뇨병, 낭포성 섬유증 관련 당뇨병, 또는 미토콘드리아 당뇨병을 포함하는 당뇨병이다. 일부 경우, 질환은 유전적 당뇨병 또는 유전적 당뇨병의 하나의 유형일 수 있다.
본원의 방법은 수용자에서 공여자 특이적 관용을 유도하기 위해 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전, 후, 및/또는 동안 ECDI 처리된 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, ECDI 처리된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, -100일, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일 또는 약 -100일, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일에 투여될 수 있다. 일부 경우, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일 또는 약 -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, ECDI 처리된 세포는 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전 7일(예컨대 -7일)에 투여될 수 있다. 일부 경우, ECDI 처리된 세포는 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식과 같은 날(예컨대, 0일)에 투여될 수 있다. 일부 경우, ECDI 처리된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, 100일, 90일, 80일, 70일, 60일, 50일, 40일, 30일, 20일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 또는 약 100일, 90일, 80일, 70일, 60일, 50일, 40일, 30일, 20일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합된 및/또는 에피토프 결합된 세포는, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, 100일 내지 50일; 50일 내지 40일; 40일 내지 30일; 30일 내지 20일; 20일 내지 10일; 10일 내지 5일; 7일 내지 1일 또는 약 100일 내지 50일; 50일 내지 40일; 40일 내지 30일; 30일 내지 20일; 20일 내지 10일; 10일 내지 5일; 7일 내지 1일에 투여될 수 있다. 예를 들어, ECDI 처리된 세포는 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 후 1일(예컨대, 1일)에 투여될 수 있다.
본원의 방법은 kg 수용자 체중당 적어도 또는 적어도 약 0.25 x 109개의 ECDI 처리된 세포(예컨대, 공여자 비장 세포)를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, kg 수용자 체중당 적어도 또는 적어도 약 1 x 107, 1 x 108, 0.25 x 109, 0.50 x 109, 0.75 x 109, 1.00 x 109, 1.25 x 109, 1.50 x 109, 1.75 x 109 또는 2x 109개의 ECDI 처리된 세포(예컨대, 공여자 비장 세포) ECDI 처리된 세포가 투여될 수 있다. ECDI 처리된 세포는 또한 비장 B 세포일 수 있다. 본원의 방법은 kg 수용자 체중당 1 x 108 내지 2 x 109, 예컨대, 1 x 108 내지 2 x 108, 1 x 108 내지 3 x 108, 1 x 108 내지 4 x 108, 1 x 108 내지 5 x 108, 1 x 108 내지 1 x 109 또는 약 1 x 108 내지 2 x 109, 예컨대, 1 x 108 내지 2 x 108, 1 x 108 내지 3 x 108, 1 x 108 내지 4 x 108, 1 x 108 내지 5 x 108, 1 x 108 내지 1 x 109개의 ECDI 처리된 세포(예컨대, 공여자 비장 세포)를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
공여자 비장 세포는 신선하게 단리될 수 있다. 대안적으로, ECDI 처리된 세포는 생체외에서 확장될 수 있다. 일부 경우, 공여자 비장 세포는 적어도 또는 적어도 약 10%, 예컨대, 25%, CD21 양성 SLA 클래스 II 양성 B 세포를 포함한다. 예를 들어, 공여자 비장 세포는 적어도 또는 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% CD21 양성 SLA 클래스 II 양성 B 세포, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 10% 내지 20%; 20% 내지 30%; 30% 내지 40%; 또는 40% 내지 50%를 포함한다. 일부 경우, 비장 B 세포는 적어도 또는 적어도 약 60%, 예컨대, 90%, CD21 양성 SLA 클래스 II 양성 B 세포를 포함한다. 예를 들어, 비장 B 세포는 적어도 또는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% CD21 양성 SLA 클래스 II 양성 B 세포, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 60% 내지 70%; 70% 내지 80%; 80% 내지 90%; 또는 90% 내지 95%를 포함한다. 일부 경우, 공여자 비장 세포는 50% 내지 100% 또는 약 50% 내지 100%, 예컨대, 60% 내지 100% 또는 80% 내지 100% 또는 약 60% 내지 100% 또는 80% 내지 100%의 CD21 양성 SLA 클래스 II 양성 B 세포를 포함한다.
ECDI 처리된 세포는 정맥내로 제공될 수 있다. ECDI 처리된 세포는 정맥내로 주입된다. 일부 경우, ECDI 처리된 세포는 kg 수용자 체중당 적어도 또는 적어도 약 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml 또는 50 ml의 부피로, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 1 내지 2; 2 내지 3; 3 내지 4; 4 내지 5; 1 내지 5; 5 내지 10; 10 내지 20; 20 내지 30; 30 내지 40; 또는 40 내지 50으로 제공될 수 있다. 예를 들어, ECDI 처리된 세포는 kg 수용자 체중당 7 ml의 부피로 정맥내로 제공된다.
본원의 방법은 면역관용화된 수용자(예컨대, 인간 또는 비인간 동물)에게 하나 이상의 공여자 세포를 이식함으로써 질환을 치료하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 NOD 유사 수용체 패밀리 CARD 도메인 함유 5(NLRC5), 항원 처리 1과 관련된 수송체(TAP1), GGTA1, B4GALNT2, CMAH, C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10), MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 A(MICA), MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 B(MICB), 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체 트랜스활성화인자(CIITA)로부터 선택된 하나 이상의 파괴된 유전자를 포함하는 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다. ECDI 처리된 세포는 동일한 공여자로부터 유래될 수 있다. 더욱이, ECDI 처리된 세포는 ICP47, CD46, CD55, CD59, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 전이유전자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우, 공여자 세포는 췌도 세포일 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 파괴된 유전자는 GGTA1을 포함하지 않는다.
길항적 항-CD40 단일클론 항체 2C10은 다른 면역요법(sTNFR, 항-IL-6R, mTOR 억제제, 항-CD20 단일클론 항체를 갖거나 갖지 않음, 및 CTLA4-Ig를 갖거나 갖지 않음)과 조합되어 그리고 공여자 세포자멸성 세포의 정맥내 주입과 함께 또는 없이 제공될 수 있다. 이 치료는 영장류, 예컨대, 원숭이에서 주목할만한 전례가 없는 췌도 이종이식 및 돼지 췌도 이종이식편 생존을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 가장 주목할만한 것은, 이식후 21일 또는 약 21일에 외인성 인슐린 및 모든 면역억제의 중단에도 불구하고, 이식된 원숭이에서 우수한 혈당 제어의 유지이다. 예는 적어도 또는 적어도 약 200일 동안 4마리의 원숭이 중 3마리에서 우수한 췌도 동종이식편 기능의 유지(공여자 세포자멸성 세포의 투여 없이 2마리 및 공여자 세포자멸성 세포의 투여로 1마리) 및 적어도 또는 적어도 약 100일 동안 1마리의 원숭이 중 1마리에서 우수한 췌도 이종이식편 기능의 유지(공여자 세포자멸성 세포의 투여로)를 포함한다.
다른 사용 방법은 i) 유전적으로 변형된 이식편의 거부반응의 예방을 위해 항-CD40 단일클론 항체 2C10 또는 유사한 항체의 일시적인 또는 드문 사용, ii) 염증을 표적화하는 다른 면역요법(예컨대, 보체 억제제 및 사이토카인 및 케모카인 억제제, 예컨대 IL-8 억제제 레파락신)과 함께 이식에서 항-CD40 단일클론 항체 2C10 또는 유사한 항체의 일시적인 또는 드문 사용, 및 기능적 인간 췌도 베타 세포와 같은 줄기 세포 유래의 세포 이식편의 예방을 위해 항-CD40 단일클론 항체 2C10 또는 유사한 항체의 사용을 포함한다.
본원의 방법은 수용자에서 공여자 특이적 관용을 유도하기 위해 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전, 후, 및/또는 동안 수용자에게 항-CD40 항체의 하나 이상의 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 항-CD40 항체의 제1 용량은, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, -100일, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일 또는 약 -100일, -90일, -80일, -70일, -60일, -50일, -40일, -30일, -20일, -15일, -14일, -13일, -12일, -11일, -10일, -9일, -8일, -7일, -6일, -5일, -4일, -3일, -2일 또는 -1일에 제공될 수 있다. 일부 경우, 항-CD40 항체의 제1 용량은, 0일에 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 대비, -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일 또는 약 -100일 내지 -50일; -50일 내지 -40일; -40일 내지 -30일; -30일 내지 -20일; -20일 내지 -10일; -10일 내지 -5일; -7일 내지 -1일에 제공될 수 있다. 예를 들어, 항-CD40 항체의 제1 용량은 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전 8일(예컨대 -8일)에 제공될 수 있다.
항-CD40 항체의 상이한 용량들이 수용자에서 공여자 특이적 관용을 유도하기 위해 공여자 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식 전, 후, 및/또는 동안 수용자에게 제공질 수 있다. 일부 경우, 항-CD40 항체의 제1 용량은 kg 수용자 체중당 적어도 또는 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 또는 200 mg의 항-CD40 항체를 포함할 수 있다. 특정한 경우, 항-CD40 항체의 제1 용량은 kg 수용자 체중당 적어도 또는 적어도 약 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg의 항-CD40 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우, 항-CD40 항체의 제1 용량은 kg 수용자 체중당 1 mg 내지 200 mg 또는 약 1 mg 내지 200 mg, 예컨대, 20 mg 내지 100 mg; 30 mg 내지 80 mg; 30 mg 내지 70 mg; 40 mg 내지 70 mg; 40 mg 내지 60 mg; 50 mg 내지 70 mg; 또는 60 mg 내지 80 mg 또는 약 20 mg 내지 100 mg; 30 mg 내지 80 mg; 30 mg 내지 70 mg; 40 mg 내지 70 mg; 40 mg 내지 60 mg; 50 mg 내지 70 mg; 또는 60 mg 내지 80 mg의 항-CD40 항체를 포함할 수 있다.
도 6은 돼지에서 사이노몰구스 원숭이로의 췌도 이종이식에서 이식 거부반응 예방을 위한 예시적인 프로토콜을 나타낸다. 0일(이식일)에 25,000 췌도수/kg이 이식된 사이노몰구스 원숭이의 경우, 이식 거부반응 예방을 위한 프로토콜은 사이노몰구스 원숭이에게 -7일 및 1일에 ECDI로 고정된 세포자멸 공여자 비장 세포를 투여하는 것, -8, -1, 7, 14일에 α-CD40(예컨대, 2C10) 50 mg/kg을 투여하는 것, -10, -3, 5, 및 12일에 α-CD20 항체(예컨대, 리툭시맙) 20 mg/kg을 투여하는 것, 라파마이신(표적 최저 15-25 ng/mL)을 투여하는 것, sTNFR을 투여하는 것(-7일 및 0일에 1mg/kg, 3, 7, 10, 14, 및 21일에 0.5 mg/kg), 및 -7, 0, 7, 14, 및 21일에 α-IL-6R 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 돼지 내 GGTA1 , CMAH , NLRC5 , B4GALNT2 , 및/또는 C3 유전자를 파괴하기 위한 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드의 생성
유전적으로 변형된 돼지는 수용자에서 낮은 면역 거부반응을 유도하거나 면역 거부반응을 유도하지 않는 이식편, 및/또는 수용자에서 면역-관용화를 향상시키는 관용화 백신으로서 세포를 제공할 것이다. 이러한 돼지는 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교하여 MHC 분자(예컨대, MHC I 분자 및/또는 MHC II 분자)를 조절하는 임의의 유전자의 감소된 발현을 가질 것이다. 이러한 유전자의 발현을 감소시키는 것은 MHC 분자의 감소된 발현 및/또는 기능을 야기할 것이다. 이들 유전자는 하기 중 하나 이상일 것이다: MHC I 특이적 인핸서좀의 성분, MHC I 결합 펩티드의 수송체, 자연 살해 그룹 2D 리간드, CXCR 3 리간드, C3, 및 CIITA. 부가적으로 또는 대안적으로, 이러한 돼지는 인간에서 발현되지 않는 내인성 유전자(예컨대, CMAH, GGTA1 및/또는 B4GALNT2)의 감소된 단백질 발현을 포함할 것이다. 예를 들어, 돼지는 하기 중 하나 이상의 감소된 단백질 발현을 포함할 것이다: NLRC5, TAP1, C3, CXCL10, MICA, MICB, CIITA, CMAH, GGTA1 및/또는 B4GALNT2. 일부 경우, 돼지는 NLRC5, C3, CXCL10, CMAH, GGTA1 및/또는 B4GALNT2의 감소된 단백질 발현을 포함할 것이다.
이 실시예는 CRISPR/cas9 시스템을 사용하여 돼지 내의 GGTA1, CMAH, NLRC5, B4GALNT2, 및/또는 C3 유전자를 파괴하기 위한 플라스미드를 생성하는 예시적인 방법을 보여준다. 상기 플라스미드는 Cas9 DNA 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA를 동시에 발현한 px330 벡터를 사용하여 생성되었다.
px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(#42230) 플라스미드를 박테리아 천자 배양(stab culture) 포맷으로 Addgene로부터 수득하였다. 천자 배양물을 암피실린을 갖는 예열된 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹(streaking)하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 단일 콜로니를 선택하고 암피실린을 갖는 액체 LB 밤새 배양물에 접종하였다(미니-프렙(mini-prep)의 경우 5 mL, 또는 맥시-프렙(maxi-prep)의 경우 80-100 mL). 미니 프렙은 제조사의 지침에 따라 퀴아젠(Qiagen) 키트를 사용하여 수행하였다. 플라스미드를 뉴클레아제가 없는 물에서 용리시키고 스톡을 -20℃에서 보관하였다. GGTA1, CMAH, NLRC5, C3, 및 B4GALNT2를 표적화하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드가 표 6에 나타나 있다. 상기 올리고뉴클레오티드를 IDT에 의해 합성하였다. 도 7A-7E, 8A-8E, 9A-9E, 10A-10E, 및 11A-11E는 GGTA1(즉, px330/Gal2-1)(도 7A-7E), CMAH(즉, px330/CM1F)(도 8A-8E), NLRC5(즉, px330/NL1_First)(도 9A-9E), C3(즉, px330/C3-5)(도 10A-10E), 및 B4GALNT2(즉, px330/B41_second)(도 11A-11E)를 표적화하는 플라스미드를 클로닝하기 위한 클로닝 전략을 나타낸다. 상기 구성된 px330 플라스미드를 표 7에 나타낸 시퀀싱 프라이머를 사용하여 시퀀싱에 의해 확인하였다. 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제가 없는 물을 이용하여 100μM로 재현탁시키고 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
벡터 소화: px330 벡터를 5 μg px330 스톡, 5 μL 10X FastDigest 반응 완충액, 35 μL 뉴클레아제가 없는 물, 및 5 μL FastDigest BbsI 효소(Cut부위: GAAGAC)를 함유하는 반응 용액에서 소화시켰다. 상기 반응 용액을 37℃에서 15분간 인큐베이션하고, 65℃에서 15분간 열 불활성화시켰다. 벡터를 탈인산화하기 위해, 0.2 μL(2 U; 1 U/1 pmol DNA ends) CIP를 첨가하고, 수득된 혼합물을 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 선형화된 플라스미드를 퀴아젠(Qiagen) PCR 클린업(Cleanup) 키트를 사용하여 정제하고, 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 용리시키고, 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
올리고뉴클레오티드 어닐링 및 인산화: 1 μL 100uM 정방향 올리고뉴클레오티드, 1 μL 100uM 역방향 올리고뉴클레오티드, 1 μL 10X T4 리가아제 완충액, 6 μL 뉴클레아제가 없는 물, 1 μL 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)를 혼합하여 용액을 제조하였다. 수득된 용액을 하기 프로그램을 진행하는 열 순환기 상에서 인큐베이션하였다: 37℃에서 30분, 95℃에서 5분, 0.1℃/초로 25℃로 하강.
라이게이션 반응: 뉴클레아제가 없는 물로 1:250으로 희석된 어닐링된 올리고뉴클레오티드, 2 μL 희석된 어닐링된 올리고뉴클레오티드, 100 ng 선형화된/탈인산화된 px330 벡터, 5 μL 10X T4 리가아제 완충액, 50 μL 최종 부피로 조정하기 위한 뉴클레아제가 없는 물, 및 2.5 μL T4 DNA 리가아제를 혼합하여 용액을 제조하였다. 상기 용액을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 65℃에서 10분 동안 열 불활성화시켰다.
형질전환: TOP10 E. coli 바이알을 형질전환 전에 15분간 -80℃ 냉동고로부터 얼음 상에서 해동시켰다. 상기 라이게이션 반응 생성물 2 μL를 상기 세포에 첨가하고 튜브를 가볍게 쳐 혼합하였다. 상기 튜브를 얼음에서 5분간 인큐베이션하고, 42℃ 수조에서 30초간 열 충격을 가하고, 열 충격 후 다시 얼음에서 2분간 더 두었다. 상기 형질전환된 세포 50 μL를 암피실린을 갖는 LB 아가 플레이트 상에 도말하고 피펫 팁으로 스프레드(spread)하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
정확하게 삽입된 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하는 콜로니 PCR: 3x 콜로니를 플레이트로부터 선택하고 플레이트의 하부에 1-3으로 표시하였다. 15 μL 10X 표준 Taq 반응 완충액, 3 μL 10mM dNTP 믹스, 0.5 μL 100uM px330-F1 프라이머(표 7에서 서열번호 125), 0.5 μL 100uM px330-R1 프라이머(표 7에서 서열번호 126), 130 μL 뉴클레아제가 없는 물, 및 1 μL 표준 Taq 중합효소를 혼합하여 PCR 반응을 위한 마스터 믹스를 제조하였다. 마스터 믹스를 잠시 볼텍싱한 다음, 1-3으로 표시된 3x PCR 튜브에 50 μL를 분취하였다. 피펫 팁을 아가 플레이트 상의 콜로니 #1에 문지른 다음, PCR 튜브 #1에서 위아래로 피펫팅하였다. 각 콜로니에 대해 신선한 팁을 사용하여 스크리닝되는 각 콜로니에 대해 반복하였다. 튜브를 열 순환기에 넣고 하기 프로그램을 진행시켰다: 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 52℃에서 30초, 68℃에서 30초, 30 사이클 동안 사이클 단계 2-4, 68℃에서 5분, 사용시까지 4 ℃에서 유지. PCR Cleanup을 제조사 프로토콜에 따라 퀴아젠 PCR 클린업 키트를 사용하여 수행하였다. 생성물을 뉴클레아제가 없는 물에서 용리시켰다.
시퀀싱을 위한 샘플의 제조: 120 ng PCR 생성물, 6.4 pmol px330-F1 프라이머(1 μL의 6.4 μM 스톡), 및 뉴클레아제가 없는 물을 혼합하여 최종 부피를 12 μL로 조정하여 용액을 제조하였다. 서열 데이터를 얻은 후, 정확한 서열 삽입물을 확인하였다. 정확한 삽입물을 갖는 콜로니의 글리세롤 스톡을 제조하였다. 콜로니 PCR 동안 #1-3으로 표시된 LB 아가 플레이트 상에, 정확하게 삽입된 콜로니를 피펫 팁으로 문질러 배지의 튜브에 분사하여 암피실린을 갖는 5 mL LB 배지에 접종하였다. 액체 배양물을 OD가 1.0 내지 1.4에 도달할 때까지 성장시켰다. 500 μL의 박테리아 배양물을 저온바이알 내의 500 μL의 멸균 50% 글리세롤에 첨가하고 -80℃ 냉동고로 옮길 때까지 즉시 드라이아이스에 두었다.
표 6. GGTA1 , CMAH , NLRC5 , C3, 및 B4GALNT2를 표적화하는 가이드 RNA 구성체를 제조하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드
표 7. px330 플라스미드를 위한 예시적인 시퀀싱 프라이머
실시예 2: 돼지 내 Rosa26 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드의 생성
MHC 결손을 갖는 돼지는 수용자에서 낮은 면역 거부반응을 유도하거나 면역 거부반응을 유도하지 않는 이식편을 제공할 것이다. MHC 기능을 억제하는 외인성 단백질은 돼지에서 발현되어 MHC 결손을 유발할 것이다. 프로젝트에서 본 발명자들의 또 다른 목표는 하나 이상의 단백질의 유비쿼터스 발현을 유도할 유비쿼터스 프로모터의 제어하에 하나 이상의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것이다. 본 실시예는 이러한 유비쿼터스 프로모터 중 하나인 Rosa26를 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드의 생성을 보여준다. Rosa26 프로모터는 Rosa26 유전자좌에 있는 유전자의 유비쿼터스 발현을 유도할 것이다. 따라서, Rosa26 유전자좌에 외인성 단백질을 코딩하는 전이유전자를 삽입함으로써 형질전환 돼지가 생성될 것이고, 유전자 생성물이 상기 돼지 내의 모든 세포에서 발현될 것이다. Rosa26을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드는 Rosa26 유전자좌 내로 전이유전자의 삽입을 용이하게 하는 데 사용될 것이다. 본 실시예는 CRISPR/cas9 시스템을 사용하여 돼지 내 Rosa26 유전자좌를 표적화하기 위한 플라스미드를 생성하는 예시적인 방법을 보여준다. 상기 플라스미드는 Cas9 DNA 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA를 동시에 발현하는 데 사용된 px330 벡터를 사용하여 생성되었다.
Rosa26의 시퀀싱:
돼지 내의 Rosa26 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 디자인하기 위해, 돼지 내의 Rosa26을 시퀀싱하여 정확한 서열 정보를 제공하였다.
프라이머 디자인: 프라이머를 생성하는 데 이용된 Rosa26 참조 서열을 문헌[Kong et. al., Rosa26 Locus Supports Tissue-Specific Promoter Driving Transgene Expression Specifically in Pig. PLoS ONE 2014;9(9):e107945, Li et. al., Rosa26 -targeted swine models for stable gene over-expression and Cre -mediated lineage tracing. Cell Research 2014;24(4):501-504, and Li et. al., Identification and cloning of the porcine ROSA26 promoter and its role in transgenesis. Transplantation Technology 2014:2(1)]으로부터 얻었다. 그리고 나서, 상기 참조 서열을 돼지 지놈 데이터베이스(NCBI)를 서치하고 Ensembl 지놈 브라우저를 사용함으로써 확장시켰다. 프라이머 디자인을 용이하게 하기 위해 염기 서열을 4개의 1218 염기쌍 영역으로 분리하였다. 프라이머를 Integrated DNA Technologies의 PrimerQuest Tool을 사용하여 디자인한 다음, 표준 뉴클레오티드 BLAST를 사용하여 서스 스크로파(Sus scrofa) 참조 지놈 서열에 대해 서치하여 특이성을 확인하였다. 프라이머 길이를 200-250 염기쌍으로 제한하였다. 프라이머 어닐링 온도는 1000nM의 프라이머 농도 및 Taq DNA 중합효소 키트에 대해 New England Tm Calculator를 사용하여 계산하였다.
PCR: PCR을 표준 Taq 완충액(New England Biolabs)과 함께 Taq DNA 중합효소를 사용하여 수행하였다. PCR을 위해 사용되는 DNA 주형을 클로닝된 돼지로부터 단리된 세포로부터 추출하였다. PCR 조건은 95℃, 30초; 50℃, 30초, 51℃ 30초, 52℃ 30초, 53℃ 30초, 54℃ 30초, 55℃ 30초의 30 사이클; 및 68℃에서 30초간의 연장 단계였다. PCR 생성물을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 시퀀싱에 사용된 프라이머가 표 8에 열거되어 있다.
표 8. Rosa26을 시퀀싱하기 위한 예시적인 PCR 프라이머
시퀀싱 분석: SnapGene 소프트웨어를 사용하여 DNA 서열을 정렬하였다. DNA 서열 결과를 미네소타 대학의 바이오지놈 센터로부터 받은 후, 이들을 SnapGene 소프트웨어에 업로드하고 분석용 소프트웨어에 의해 정렬하였다. 염기쌍 치환, 결실, 및 삽입을 크로마토그램을 참조하여 결정하고 상이한 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 단편의 서열을 비교하여 확인하였다. 모든 편집 및 확인이 완료되면, 원래의 모 DNA 서열을 정렬된 것으로 대체하여 새로운 DNA 모 서열을 제조하였다(서열번호 188, 도 12에 나타난 지도). Rosa26 서열은 참조 Rosa26 서열과 상이하였다. 예를 들어, 위치 223, 420, 3927, 4029, 및 4066에 염기쌍 치환, 및 위치 2692 및 2693 사이에 염기쌍 결실이 있었다. 뉴클레오티드 치환 및 결실은 이 서열을 독특하게 만든다(도 12). 따라서, 상기 시퀀싱 데이터는 Rosa26 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 디자인하기 위한 보다 정확한 서열 정보를 제공하였다.
Rosa26을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 플라미스미드의 생성
Rosa26을 표적화하는 올리고뉴클레오티드를 디자인하고 IDT에 의해 합성하였다. 가이드 RNA의 서열이 표 9에 나타나 있다. Rosa26을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 px330 플라스미드를 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 생성하였다. 도 13A-13E는 Rosa 26을 표적화하는 플라스미드(즉, px330/ROSA 엑손 1)를 클로닝하기 위한 클로닝 전략을 나타낸다(도 13A-13E). 구성된 px330 플라스미드를 표 7에 나타낸 시퀀싱 프라이머를 사용하여 시퀀싱에 의해 확인하였다.
표 9. Rosa26을 표적화하는 가이드 RNA를 제조하기 위한 예시적인 올리고 뉴클레오티드
실시예 3: 돼지 세포 내 Rosa26 유전자좌에 HLA -G1 전이유전자의 삽입
전이유전자는 돼지 내 Rosa26 유전자좌 내로 삽입되어 돼지는 모든 세포에서 상기 전이유전자를 발현할 것이다. 본 실시예는 HLA-G1 cDNA를 돼지 세포(예컨대, 돼지 태아 섬유아세포) 내 Rosa26 유전자좌 내로 삽입하는 예시적인 방법을 보여준다. 생성된 세포는 돼지에서 HLA-G1의 유비쿼터스 발현을 유도할 Rosa26 프로모터에 의해 제어되는 HLA-G1을 발현하는 돼지를 생성하는 데 사용될 것이다.
GGTA1 또는 Rosa26에 특이적인 1000bp 상동성 아암(arm)을 갖는 HLA-G1 유전자 구성체가 생성되고 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인될 것이다. HLA-G1의 cDNA 서열이 표 2에 나타나 있으며, HLA-G의 지놈 서열이 서열번호: 191로서 나타나 있다. HLA-G의 지놈 서열 및 cDNA의 지도가 도 14A-14B에 나타나 있다. 세포 내의 GGTA1 및 Rosa26의 플랭킹 영역이 시퀀싱될 것이다. 구성체에 의한 HLA-G1의 발현이 확인될 것이다. 시퀀싱 및 발현 확인 후, 상기 유전자-표적화 구성체는 전이유전자와 조립되어 상동 도메인 복구 주형을 만들 것이고, 이는 돼지 체세포를 변형하는 데 사용될 것이다. CRISPR/Cas 기술은 플라스미드-발현된 가이드 RNA 올리고를 사용하여 GGTA1 또는 Rosa26을 표적화하는 데 사용될 것이고, 이는 효율적인 유전자 표적화 및 변형을 가능하게 한다. 가이드 RNA에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 절단(breaks)은 전이유전자를 혼입하는 DNA 복구를 유도하는 1000bp 상동성 아암을 갖는 HLA-G1 유전자 구성체의 존재하에 생성될 것이다. 프로모터 서열부터 결정된 열린 해독틀(인트론 영역 제외)까지의 50bp 이내의 삽입 부위는 부가적인 Cas9 발현 플라스미드의 존재하에 전이유전자 발현을 유도하는 PAM 서열 및 프로모터 강도의 존재에 기초하여 시험될 것이다. 형질전환 및 넉아웃 표현형은 유세포분석법(예컨대, 세포질 및 막 표면에서 전이유전자 발현의 검출), 웨스턴 블롯팅, 및 DNA/RNA 시퀀싱에 의해 평가될 것이다.
실시예 4: 2개의 가이드 RNA를 동시에 발현하는 플라스미드의 생성
2개의 가이드 RNA를 동시에 발현하는 대체 벡터(예컨대, px333)가 단일 유전자의 2개의 영역을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 데 사용될 것이다. CRISPR/cas9 시스템에 의한 단일 유전자의 2개의 영역의 표적화는 DNA가 다시 복구될 때 2개의 절단 부위 사이의 전체 유전자를 제거할 것이다. 2개의 영역을 표적화하는 것은 이중대립 넉아웃을 생성할 확률을 높여, 유전자 내의 하나의 유전자좌만을 표적화하는 것에 비해, 더 우수한 분류, 더 많은 이중대립 결실, 및 전체적으로 음성 유전자형을 갖는 돼지를 생산할 높은 가능성을 초래할 것이다.
px333 플라스미드 제작에 사용된 올리고뉴클레오티드 쌍은 px330 플라스미드에 사용된 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 더 높은 G 함량, 더 낮은 A 함량, 및 가능한 많은 GGGG 사중체(quadraplex)를 함유할 것이다. GGTA1 표적은 거의 전체 GGTA1 유전자에 걸쳐 있을 것이며, 이는 지놈으로부터 전체 유전자를 제거할 것이다. 더욱이, 이 전략을 이용하여 다수의 부위를 표적화하는 것은 전이유전자를 삽입할 때 사용될 것이며, 이는 프로젝트에서 본 발명자들의 또 다른 목표이다.
실시예 5: 유전적으로 변형된 돼지를 제조하기 위한 돼지 태아 섬유아세포의 단리, 배양 및 형질감염
유전자를 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 px330 플라스미드를 사용하여 유전적으로 변형된 돼지를 생성하기 위해, px330 플라스미드를 돼지 태아 섬유아세포 내로 형질감염시켰다. 상기 형질감염된 섬유아세포는 하나 이상의 표적 유전자의 파괴를 유발하는 가이드 RNA를 발현할 것이다. 생성된 섬유아세포를, 예컨대, 체세포 핵 이식에 의해, 유전적으로 변형된 돼지를 제조하는 데 사용하였다. 본 실시예는 돼지 태아 섬유아세포의 단리 및 배양, 및 px330 플라스미드를 이용한 섬유아세포의 형질감염을 보여준다.
세포 배양
유전적으로 변형된 돼지의 생성에 사용된 태아 섬유아세포 세포주는 하기를 포함하였다: 캐롤라인(Karoline) 태아(췌도 단리 후 높은 췌도 수율을 제공한 암컷 돼지 ponor P1101로부터 유래됨), 마리 루이즈(Marie Louise) 태아(췌도 단리 후 높은 췌도 수율을 제공한 암컷 돼지 공여자 P1102로부터 유래됨), 도축장 돼지 #41(수컷; 천연 췌장에서 많은 수의 췌도를 보였음(매우 높은 디티존(dithizone)(DTZ) 스코어에 의해 평가된 바와 같음)), 도축장 돼지 #53(높은 디티존(dithizone)(DTZ) 스코어에 의해 평가된 바와 같이 천연 췌장에서 많은 수의 췌도를 보였음).
이들 각각의 돼지로부터 얻은 근육 및 피부 조직 샘플을 해부하고 배양하여 섬유아세포 세포로 성장시켰다. 그리고 나서, 상기 세포를 채취하고 체세포 핵 이식(SCNT)에 사용하여 클론을 생산하였다. 다수의 태아(최대 8마리)를 30일에 채취하였다. 태아를 개별적으로 해부하고 150mm 디쉬에 도말하여 태아 섬유아세포 세포로 성장시켰다. 배양 내내, 태아 세포주를 분리하여 보관하고 각 튜브 또는 배양 용기에 태아 번호를 표시하였다. 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 세포를 채취하고 액체 질소 냉동 보관을 위해 10% DMSO를 갖는 FBS에서 약 1백만 세포/mL로 다시 냉동시켰다.
배양 배지 제조: 5 mL Glutamax, 5 mL pen/strep, 및 25 mL HI-FBS(표준 5% FBS 배지의 경우; 분류된 세포의 경우 10% FBS를 사용)를 DMEM 및 고 글루코스를 포함하고 글루타민 및 페놀 레드가 없는 500 mL 병에 첨가하였다. 모든 태아 섬유아세포를 회전시키기 위한 원심분리 설정은 4℃에서 0.4 rcf(1600rpm)에서 5분이었다. 세포를 수조에서 37℃로 빠르게 가온하여 액체 질소 보관으로부터 해동시켰다. 상기 해동된 세포를 약 25 mL 신선한, 예열된 배양 배지(DMSO를 충분히 희석하는데 충분함)로 빠르게 옮겼다. 그리고 나서, 세포를 회전시켰다, 상층액을 제거하고, 세포를 계수 또는 도말을 위해 1-5 mL의 신선한 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포는 예열된 배지로 3-4일마다 배지 교체를 받았고, TrypLE 익스프레스 해리 시약(TrypLE Express Dissociation Reagent)을 사용하여 90-100% 컨플루언시일 때 계대배양하였다.
부착성 섬유아세포의 채취: 배지를 세포로부터 흡인하였다. DPBS를 첨가하여 세포를 세척하였다. 예열된(37℃) TrypLE 익스프레스 시약을 세포에 첨가하였다. 최소량의 시약을 사용하여 세포층을 얇게 덮었다. 세포를 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. FBS를 함유하는 다량의 배양 배지를 TrypLE 세포 현탁액에 첨가하여 효소를 중화시켰다. 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 배양 표면으로부터 모든 세포를 제거하였다. 세포 현탁액을 얼음상에서 15 또는 50 mL 코니컬 튜브로 옮겼다. 모든 세포가 수집되었음을 보장하기 위해 플레이트/플라스크를 현미경하에 확인하였다. 때때로 배지 세척은 남겨진 세포를 수집하는데 도움을 주었다. 세포를 회전시킨 다음, 신선한 배양 배지(계수를 위해 1-5 mL 사이)로 재현탁시켰다. 계수하는 경우, 20 μL 세포 현탁액을 80 μL 0.2% 트리판 블루에 첨가하여 세포 현탁액의 1:5 희석물을 제조하였다. 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 12-14 μL의 희석물을 혈구계에 첨가하여 4개의 모서리를 계수하였다. 상기 수의 평균을 내었다. 예를 들어, 각 모서리에 대해 20, 24, 22, 22를 계수하면 평균 22가 산출되었다. 이 수에 희석 인자 5를 곱하여 110 x 104 세포/mL를 산출하였다. 상기 수를 소수 둘째 자리를 왼쪽으로 옮겨 106으로 조정하여, 1.10 x 106 세포/mL를 얻었다. 마지막으로, 상기 수에 원래의 샘플을 몇 mL 얻었는지 곱하여 세포의 총 수를 얻었다.
태아 섬유아세포의 형질감염
본 실험은 태아 섬유아세포를 형질감염시키는 것이었다. 체세포 핵 이식 기술을 사용하여 유전적으로 변형된 동물을 생성하기 위해 형질감염된 태아 섬유아세포를 사용하였다.
형질감염을 위해 사용된 GFP 플라스미드(pSpCas9(BB)-2A-GFP)는, GFP 발현 영역을 함유하였다는 점을 제외하면, px330 플라스미드의 정확한 복제본이었다.
GFP 형질감염된 대조군 세포: 형질감염은 인비트로젠(Invitrogen)사의 네온 형질감염 시스템(Neon Transfection System)을 사용하여 수행하였다. 키트는 10 μL 및 100 μL 팁 크기로 제공되었다. 실험 1일 또는 2일 전, 실험 크기 및 원하는 세포 수 및 밀도에 따라 세포를 적절한 배양 용기에 도말하였다. 형질감염일에 약 80% 컨플루언스(confluence)가 달성되었다.
실험일에, 네온 모듈 및 피펫 스탠드를 바이오후드에 설치하였다. 네온 튜브를 피펫 스탠드에 넣고, 3 mL의 완충액 E(네온 키트)를 네온 튜브에 첨가하였다. 상기 모듈을 켜고 원하는 설정(태아 돼지 섬유아세포의 경우: 1300 V, 30 ms, 1 펄스)으로 조정하였다. 세포를 TrypLE를 사용하여 채집하고 계수하여 실험 설정을 결정하였다. 필요한 양의 세포를 새로운 튜브로 옮기고, 나머지 세포를 재도말하였다. 세포를 계수한 후 회전시키고, PBS에 재현탁하여 세척하였다. 세포를 회전시키고, 세포의 수 및 팁 크기에 대해 표 10에 따라 완충액 R(네온 키트)에 재현탁시켰다.
표 10. 예시적인 네온 ® 플레이트 포맷, 부피, 및 추천 키트
표 10에 따른 적절한 양의 DNA를 세포 현탁액에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 네온 팁을 키트로부터 네온 피펫에 적용하여 세포 현탁액의 부피를 네온 팁 내로 흡인하였다. 네온 팁이 완충액 E에 잠기도록 피펫을 피펫 스탠드 내의 네온 튜브에 넣었다. "완료" 메시지가 나올 때까지 모듈 인터페이스에서 시작을 눌렀다. 피펫을 피펫 스탠드에 꺼내어 표 10에 따라 적절한 크기의 웰 내에 항생제가 없는 예열된 배양 배지의 부피 내로 세포 현탁액을 분출하였다.
상기 단계를 전체 세포 현탁액이 사용될 때까지 반복하였다. 네온 팁을 2 형질감염마다 교체하였고, 네온 튜브를 10 형질감염마다 교체하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 항생제를 함유하는 정상 배양 배지로 교체하였다. 생성된 세포를 약 5일간 배양하여 Cas9 절단, 유전자 넉아웃 후 표면 단백질의 완전한 재순환, 및 분류 전 적절한 세포 분열을 허용하였다. GFP 플라스미드로 형질감염된 세포를 도 15에 나타내었다.
실시예 6: RNA 중합효소를 사용하여 px330 플라스미드에 의한 가이드 RNA 생산의 검증
px330 플라스미드를 돼지 태아 섬유아세포에 형질감염시킨 후, px330 플라스미드에 의한 가이드 RNA의 발현을 RNA 중합효소를 사용하여 검증할 것이다.
px330 플라스미드에 의한 가이드 RNA 생산은 RNA 중합효소에 의해 정확하게 구성된 플라스미드의 시험관내 전사에 의해 확인될 것이다. 상기 실험은 표적 영역의 PCR을 통해 도입된 프로모터를 갖는 T7 RNA 중합효소를 사용할 것이다. T7 RNA 중합효소에 의한 sgRNA의 생산은 플라스미드가 전사되고 sgRNA가 세포 내에 존재한다는 것을 가리킬 것이다. 반응 생성물(예컨대, sgRNA) 크기의 겔 확인은 RNA 중합효소에 의한 sgRNA 전사를 확인하는 데 사용될 것이다.
실시예 7: GGTA1 유전자에 대한 형광 제자리 혼성화 (FISH)
CRISPR/cas9에 의한 유전자 파괴를 세포에서 FISH를 사용하여 확인하였다. 본 실시예는 형광 제자리 혼성화(FISH)를 사용하여 GGTA1 유전자를 검출하는 예시적인 방법을 보여준다. 본원의 방법은 동물(예컨대, GGTA1 넉아웃된 동물)로부터의 세포에서 GGTA1 유전자의 존재 또는 부재를 확인하는 데 사용되었다.
FISH 프로브의 제조: GGTA1 DNA를 인비트로젠 퓨어링크(Invitrogen PureLink) 키트를 사용하여 RP-44 돼지 BAC 클론(RP44-324B21)으로부터 추출하였다. DNA를 Orange - 552 dUTP(Enzo Life Science)를 사용한 닉 번역 반응(Nick Translation Kit - Abbott Molecular)에 의해 표지하였다. 닉 번역된 단편의 크기를 1% TBE 겔 상에서 전기영동에 의해 확인하였다. 표지된 DNA를 COT-1 DNA, 연어 정자 DNA, 아세트산 나트륨 및 95% 에탄올에서 침전시킨 다음, 건조시키고, 50% 포름아미드 혼성화 완충액에 재현탁시켰다.
FISH 프로브의 혼성화 : 돼지 섬유아세포(15AS27)로부터의 프로브/혼성화 완충액 믹스 및 세포유전학 슬라이드를 변성시켰다. 상기 프로브를 상기 슬라이드에 적용하고, 상기 슬라이드를 가습 챔버에서 37℃에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 사용된 프로브가 서열번호: 192로서 나타나 있다.
FISH 검출, 시각화 및 이미지 캡처: 혼성화 후, FISH 슬라이드를 2xSSC 용액에서 72℃에서 15초간 세척하고, DAPI 염색으로 반대염색하였다. 형광 신호를 DAPI 및 FITC 필터 세트를 이용하여 올림푸스 BX61 현미경 워크스테이션(Applied Spectral Imaging, Vista, CA) 상에서 시각화하였다. FISH 이미지를 간섭계-기반 CCD cooled 카메라(ASI) 및 FISHView ASI 소프트웨어를 사용하여 캡처하였다. FISH 이미지가 도 16에 나타나 있다.
실시예 8: Cas9 /가이드 RNA- 매개된 GGTA1 넉아웃을 갖는 세포의 표현형 선택
Cas9/가이드 RNA 시스템에 의한 GGTA1 유전자의 파괴를 GGTA1 유전자 생성물을 표지함으로써 확인하였다. GGTA1 넉아웃은 넉아웃 실험에서 표현형 분류를 위한 마커로서 사용될 것이다. GGTA1 유전자는, 만약 넉아웃되는 경우, 세포의 표면 상에 존재하지 않는 당단백질을 초래할 돼지 세포의 표면 상에서 발견되는 당단백질을 코딩하였다. GGTA1 음성 세포를 분류하는 데 사용된 렉틴은 이소렉틴 GS-IB4 바이오틴-XX 접합체였고, 이는 말단 알파-D-갈락토실 잔기에 선택적으로 결합하였다.
돼지 태아 섬유아세포 세포를 GGTA1을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 px330 플라스미드로 형질감염시켰다(실시예 1에서 생성됨).
형질감염 후 음성 세포를 선택하기 위해, 세포를 약 5일간 성장시켜 이들의 표면 단백질을 재생시켰다. 그리고 나서, 세포를 채집하고, IB4 렉틴으로 표지하였다. 그리고 나서, 세포를 세포 표면 상의 바이오틴-접합된 렉틴과 매우 강하게 결합된 스트렙타비딘 꼬리를 가진 2.9 마이크론 초자성 비드인 DynaBeads 바이오틴 결합제(Biotin-Binder)로 코팅하였다. 자석에 놓여지면, 표면에 렙틴/비드가 결합된 "양성" 세포는 튜브의 측면에 달라붙는 반면, "음성" 세포는 어느 비드와도 결합하지 않고 쉽게 분리되도록 현탁액에 부유된 상태로 남아 있었다.
구체적으로, 세포를 TrypLE 프로토콜을 사용하여 플레이트로부터 채취하고 단일 튜브 내로 수집하였다. 세포를 회전시키고 1 mL의 분류 배지(DMEM, 보충제 없음)에 재현탁시켜 계수하였다. 1000만개 미만의 세포인 경우, 세포를 회전시키고 상층액을 버렸다. 개별 튜브에서, IB4 렉틴(1 μg/μL)을 1 mL의 분류 배지(최종 농도 5 μg/mL)에 5 μL씩 희석하였다. 세포 펠렛을 1 mL의 희석된 렉틴으로 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 몇 분마다 서서히 휘저으면서, 얼음 위에서 약 15-20분간 인큐베이션하였다.
인큐베이션 동안 바이오틴 비드를 준비하였다. 한 병의 비드를 30초간 볼텍싱하였다. 20 μL 비드/1M 세포를 15 mL 코니컬 튜브 내의 5 mL의 분류 배지에 첨가하였다. 튜브를 볼텍싱하고, DynaMag-15 자석에 넣고 3분간 그대로 두었다. 배지를 제거하였다. 1 mL의 신선한 분류 배지를 첨가하고, 튜브를 볼텍싱하여 비드를 세척하였다. 세척된 비드를 사용시까지 얼음 위에 두었다.
세포 인큐베이션 후, 세포 현탁액의 부피를 분류 배지를 이용하여 15 mL로 조정하여 렉틴을 희석하였다. 세포를 회전시키고 1 mL의 세척된 바이오틴 비드로 재현탁시켰다. 상기 현탁액을 125 rpm으로 교반 인큐베이터에서 30분간 얼음상에서 인큐베이션하였다. 세포 현탁액을 교반 인큐베이터에서 꺼내어 검사하였다. 작은 응집체가 관찰될 수 있었다.
5 mL의 분류 배지를 세포 현탁액에 첨가하고, 튜브를 DynaMag-15에 3분간 두었다. "음성" 세포의 첫 분획을 수집하고 새로운 15 mL 코니컬 튜브로 옮겼다. 또 다른 5 mL 분류 배지를 첨가하여 여전히 자석 위에 있는 "양성" 튜브를 세척하였다. 상기 자석을 여러 번 뒤집어 세포 현탁액을 다시 혼합하였다. 튜브를 3분간 두어 세포를 분리하였다. 그 후, 두 번째 "음성" 분획을 제거하여 첫 번째 분획과 조합하였다. 10 mL 분류 배지를 "양성" 튜브에 첨가하였다. 튜브를 자석으로부터 제거하고, 사용시까지 얼음 배쓰에 두었다.
"음성" 분획의 튜브를 자석 위에 두어 2차 분리하고 첫 번째 튜브로부터 넘어왔을 수 있는 임의의 비드 결합된 세포를 제거하였다. 튜브를 4분간 자석 위에 유지시켰다. 세포를 피펫팅에 의해 자석으로부터 떼어내고 새로운 15 mL 코니컬 튜브로 옮겼다. 원래의 "양성" 튜브 및 이중 분류된 "음성" 튜브를 비교하고, 그들 내의 세포를 회전시켰다. "양성" 펠렛은 검고 녹슨 적색으로 보였다. "음성" 펠렛은 보이지 않거나, 희색으로 보였다.
각각의 펠렛을 1 mL의 신선한 배양 배지(10% FBS)에 재현탁시키고 24-웰 플레이트 상의 각각의 웰에 도말하였다. 상기 웰을 현미경하에 검사하고, 필요한 경우 더 많은 웰로 희석하였다. 상기 세포를 37℃에서 배양하였다. 유전적으로 변형된 세포, 즉, 표지되지 않은 세포는 자석에 의해 음성적으로 선택되었다(도 17A). 유전적으로 변형되지 않은 세포, 즉, 표지된 세포는 세포 표면 상에 철 비드를 축적하였다(도 17B).
실시예 9: GGTA1 / CMAH / NLRC5 삼중 넉아웃 (triple knockout) 돼지의 제조
본 실시예는 삼중 넉아웃 돼지를 생성하는 예시적인 방법을 보여준다. 삼중 넉아웃 돼지는 하기 중 3개의 감소된 단백질 발현을 가질 수 있다: NLRC5, TAP1, C3, CXCL10, MICA, MICB, CIITA, CMAH, GGTA1 및/또는 B4GALNT2. 이러한 삼중 넉아웃 돼지 중 하나는 CRISPR/cas9 시스템을 사용한 GGTA1/CMAH/NLRC5 삼중 넉아웃 돼지였다. 상기 돼지는 이식용 췌도를 제공하였다. 파괴된 GGTA1/CMAH/NLRC5를 갖는 돼지 췌도는 MHC 클래스 I 결핍을 가지고 있었고, 수용자에게 이식될 때 낮은 면역 거부반응을 유도하거나 면역 거부반응을 유도하지 않을 것이다.
태아 섬유아세포의 형질감염
실시예 1에서 생성된 GGTA1, CMAH, 및 NLRC5를 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 px330 플라스미드를 돼지 태아 섬유아세포에서 절개하였다. 돼지 태아 섬유아세포를 5-10% 혈청, 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 상기 섬유아세포를 제조사의 지침에 따라 리포펙타민 3000 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 GGTA1, CMAH 또는 NLRC5 유전자를 표적화하는 Cas9 및 sgRNA를 발현하는 2개 또는 3개의 플라스미드로 공동-형질감염시켰다.
GGTA1 KO 세포의 반대 선택
형질감염 후 4일에, 형질감염된 세포를 채집하고 이소렉틴 B4(IB4)-바이오틴으로 표지하였다. αGal을 발현하는 세포를 바이오틴 접합된 IB4로 표지하고 자기장에서 스트렙타비딘 코팅된 Dynabead(Life Technologies)에 의해 고갈시켰다. αGal 결핍 세포를 상층액으로부터 선택하였다. 상기 세포를 현미경에 의해 조사하였다. 분류 후 결합된 비드가 없거나 매우 적은 결합된 비드를 함유하는 세포를 음성 세포로서 확인하였다.
CRISPR / Cas9 표적화된 GGTA1 , CMAH 및 NLRC5 유전자의 DNA 시퀀싱 분석
IB4 반대 선택된 세포 및 클로닝된 돼지 태아로부터의 지놈 DNA를 퀴아젠 DNeasy Miniprep 키트를 사용하여 추출하였다. PCR을 표 11에 나타낸 바와 같은 GGTA1, CMAH 및 NLRC5 특이적 프라이머쌍을 이용하여 수행하였다. DNA 중합효소, dNTPack(New England Biolabs)을 사용하였고, GGTA1에 대한 PCR 조건은 상기 프라이머에 이상적인 어닐링 및 멜팅 온도에 기초하였다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 퀴아젠 겔 추출 키트에 의해 정제하고 표 7에 나타낸 특이적 시퀀싱 프라이머를 이용한 생거 방법(DNA Sequencing Core Facility, University of Minnesota)에 의해 시퀀싱하였다. 도 18A-18C는 PCR 생성물의 서열 및 아가로스 겔을 나타낸다.
표 11. 유전적으로 변형된 세포 및 동물로부터의 지놈 DNA를 증폭하기 위한 예시적인 PCR 프라이머
체세포 핵 이식( SCNT )
전체가 참고로 본원에 통합된 문헌[Whitworth et al. Biology of Reproduction 91(3):78, 1-13, (2014)]에 기재된 바와 같이 SCNT를 수행하였다. SCNT를 시험관내에서 성숙된 난모세포(DeSoto Biosciences Inc., St. Seymour, TN)를 사용하여 수행하였다. 0.1% 히알루로니다제에서 피펫팅하여 난모세포로부터 난구 세포를 제거하였다. 정상 형태 및 가시적인 극체(polar body)를 갖는 난모세포만을 SCNT를 위해 선택하였다. 난모세포를 5 μg/mL 비스벤즈이미드 및 7.5 μg/mL 사이토칼라신 B를 함유하는 조작 배지(5% FBS를 갖는 무칼슘 NCSU-23)에서 15분간 인큐베이션하였다. 난모세포를 제1 극체 및 중기 II 판을 제거함으로써 제핵하였다. 단일 세포를 각 제핵된 난모세포 내로 주사하고, 융합하고, 280mM 만니톨, 0.1 mM CaCl2, 및 0.05 mM MgCl2에서 50 μsec 동안 180 V의 2개의 DC 펄스(BTX 세포 전기천공기, Harvard Apparatus, Hollison, MA, USA)에 의해 동시에 활성화시켰다. 활성화된 배아를 0.4% 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 NCSU-23 배지에 다시 넣고 1시간 미만 동안 가습된 분위기에서 38.5 ℃, 5% CO2에서 배양하고, 대리 돼지에게 이식하였다.
실시예 10: ICP47 전이유전자를 발현하는 NLRC5 넉아웃 비인간 동물의 제조
본 실시예는 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현을 갖고 동시에 하나 이상의 전이유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 비인간 동물(예컨대, 돼지)을 생성하기 위한 예시적인 방법을 나타낸다. 그러한 유전적으로 변형된 비인간 동물(예컨대, 돼지)을 생성하는 것은 NLRC5, TAP1, C3, CXCL10, MICA, MICB, CIITA, CMAH, GGTA1 및/또는 B4GALNT2 중 하나 이상의 감소된 발현을 가지며, 동시에 하나 이상의 ICP47, CD46, CD55, CD59 HLA-E, HLA-G(예컨대, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, 또는 HLA-G7), L2, Spi9, 갈렉틴-9 CD47, B2M, PD-L1, 및/또는 PD-L2를 발현할 것이다. 이러한 동물 중 하나는 파괴된 NLRC5 유전자를 가지며 동시에 ICP47을 코딩하는 전이유전자를 과발현할 것이다. NLRC5 파괴 및 ICP47 발현은 MHC-1 조립 및 기능을 억제할 것이다. 따라서, 유전적으로 변형된 비인간 동물(예컨대, 돼지)로부터의 세포, 조직, 및/또는 장기는 수용자에게 이식될 때 낮은 면역 거부반응을 유도하거나 면역 거부반응을 유도하지 않을 것이다.
Rosa26 프로모터의 클로닝
Rosa26 프로모터 서열은 참조로서 마우스 Rosa26 프로모터 서열 및 인간 Rosa26 프로모터 서열을 사용하여 지놈 데이터베이스(NCBI)를 서치함으로써 수득될 것이다. Rosa26의 비인간 동물의 형태가 수득될 것이다. 프라이머는 주형으로서 비인간 동물의(예컨대, 가축용 돼지의) 지놈 DNA를 사용한 PCR에 의해 잠재적인 Rosa26 프로모터(예컨대, 돼지 Rosa26 프로모터)를 갖는 DNA 단편을 증폭하도록 디자인될 것이다. AscI 및 MluI 부위가 정방향 및 역방향 프라이머의 5'에 각각 부가될 것이다. Pwo SuperYield DNA 중합효소(Roche, Indianapolis, IN)가 사용될 것이고 PCR 조건은 다음과 같을 것이다: 94℃, 2분; 94℃, 15초, 55℃, 30초; 15사이클 동안 72℃ 4분; 94℃, 15초, 55℃, 30초; 25사이클 동안 각 사이클에 부가된 72℃ 4분 및 5초; 및 72℃ 8분간의 최종 연장 단계. 이후 PCR 생성물은 pCR-XL-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝되어 pCR-XL-Rosa26을 생성할 것이다. 비인간 동물의 Rosa 프로모터(예컨대, 돼지 Rosa26 프로모터)는 디자인된 프라이머를 사용하여 시퀀싱될 것이다.
형질전환 벡터의 제작
pEGFP-N1(Clontech, Palo Alto, CA)의 CMV 프로모터 및 다중 클로닝 부위(MCS)는 링커 AseI-NruI-AscI-SalI-MluI-PvuI-BamHI에 의해 대체될 것이다. 잠재적인 비인간 동물(예컨대, 돼지)의 Rosa26 프로모터를 함유하는 3.9 kb 단편이 AscI 및 MluI 소화를 이용하여 pCR-XL-Rosa26로부터 절개될 것이고 프로모터가 없는 pEGFP-N1에 AscI 및 Mlu I 부위 사이에 삽입되어, 플라스미드 pRosa26-EGFP를 생성할 것이다. 인간 ICP47 cDNA가 플라스미드 내의 EGFP를 대체하기 위해 클론될 것이다. 대조군 벡터는 ICP47 cDNA를 EcoRI 부위에 있는 쥣과 MHC 클래스 I H-2Kb 프로모터의 다운스트림에 클로닝하여 플라스미드 pH-2Kb-ICP47를 생성함으로써 제작될 것이다.
일시적인 형질감염
실시예 1 또는 실시예 2의 방법에 의해 제조된 NLRC5 넉아웃 비인간 동물(예컨대, 돼지)로부터의 NLRC5 KO 태아 섬유아세포 세포가 수득될 것이다. Rosa26, H-2Kb, 및 CMV 간의 프로모터 강도를 비교하기 위해, 태아 섬유아세포 세포는 제조사의 지침에 따라 NeonTM 형질감염 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 pRosa26-ICP47, pH-2Kb- ICP47 및 pEGFP-N1로 형질감염될 것이다. 3X105개의 세포가 1.5 μg의 각 DNA와 각각 혼합되고, 1300V, 30 ms, 1 펄스에서 전기천공될 것이다. 그리고 나서, 세포는 5% CO2 및 10% O2로 37℃에서 배양될 것이다. 48시간 후, 세포는 채집되고 ICP47 발현이 웨스턴 블롯 및/또는 유세포분석법에 의해 조사될 것이다. 형질감염되지 않은 태아 섬유아세포는 대조군으로서 사용될 것이다.
EGFP 안정한 세포주의 확립
80-90% 컨플루언스(confluence)의 NLRC5 KO 태아 섬유아세포는 트립신으로 채집되고, 칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 세척될 것이다. pRosa26-ICP47은 Asc I 소화에 의해 선형화될 것이다. 형질감염은 NeonTM 형질감염 시스템(Invitrogen)을 사용하여 수행될 것이다. 요약하면, 106개의 세포가 120 μl의 R 완충액에 현탁되고 2 μg의 선형화된 DNA가 첨가될 것이다. 세포는 1300V, 30 ms, 1 펄스에서 전기천공되고, 항생제가 없는 배양 배지에서 콜라겐 I 코팅된 플레이트(BD) 상에 도말될 것이다. 48시간 후, 배양 배지는 100 μg/ml의 G418(Invitrogen)을 함유하는 선택 배지로 대체될 것이다. G418 선택 10일 후, ICP47 양성 세포가 흐름 분류(flow sorting)에 의해 단리될 것이다. 상기 선택된 세포는 확장될 것이고, ICP47 양성 세포를 정제하고 농축하기 위해 제2 흐름 분류가 수행될 것이다.
체세포 핵 이식
SCNT는 시험관내 성숙된 난모세포(DeSoto Biosciences Inc. St Seymour, TN. 및 Minitub of America, Mount Horeb, WI.)를 사용하여 수행될 것이다. 난구 세포는 0.1% 히알루로니다제에서 피펫팅에 의해 난모세포로부터 제거될 것이다. 정상적인 형태 및 가시적인 극체(polar body)를 갖는 난모세포만이 클로닝을 위해 선택될 것이다. 난모세포는 5 mg/mL 비스벤즈이미드 및 7.5 mg/mL 사이토칼라신 B를 함유하는 조작 배지(5% FBS를 갖는 무칼슘 NCSU-23)에서 15분간 인큐베이션될 것이다. 이 인큐베이션 기간 이후, 난모세포는 제1 극체 및 중기 II 판을 제거함으로써 제핵될 것이고, 하나의 단일 세포가 각 제핵된 난모세포 내로 주사될 것이다. 전기 융합은 BTX 세포 전기천공기(Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 이용하여 유도될 것이다. 커플은 280 mM 만니톨, 0.001 mM CaCl2, 및 0.05 mM MgCl2에서 50 ms 동안 140 V의 2개의 DC 펄스에 노출될 것이다. 1시간 후, 재구성된 난모세포는 280 mM 만니톨, 0.1 mM CaCl2, 및 0.05 mM MgCl2에서 60 ms 동안 120 V의 2개의 DC 펄스에 의해 활성화될 것이다. 활성화 후, 난모세포는 0.4% 소 혈청 알부민 BSA를 갖는 NCSU-23 배지에 다시 놓여지고 수용자에게 이식되기 전에 1시간 미만 동안 가습 분위기에서 38.5℃, 5% CO2에서 배양될 것이다. 수용자는 발정 첫날에 동기화된 비인간 동물(예컨대, 서양 돼지)일 것이다.
ICP47 형질전환 태아의 유전형분석
임신은 35일에 종료되고 태아가 채취될 것이다. 지놈 DNA는 DNeasy 혈액 & 조직 키트(Qiagen)를 사용하여 추출될 것이다. PCR 프라이머는 지놈 내의 ICP47 cDNA 서열을 검출하도록 디자인될 것이다. 20 μl의 반응 혼합물은 10 μl의 2 x Go-Taq Green 마스터 믹스(Promega, Madison, WI), 5 pmol의 각 프라이머, 및 50 ng의 지놈 DNA를 함유하였다. PCR은 ICP47 삽입물의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 수행될 것이다. 정상 세포로부터 추출된 지놈 DNA는 음성 대조군으로서 사용될 것이다.
실시예 11: Cas9를 코딩하는 RNA 및 가이드 RNA의 주사에 의한 NLRC5 넉아웃 비인간 동물의 제조
CRISPR/cas를 사용하여 유전자를 표적화하는 대안적인 접근법은 Cas9를 코딩하는 RNA 분자 및 가이드 RNA(예컨대, 단일 가이드 RNA(sgRNA))를 세포 내로 직접 주사하여 CRISPR/cas9 시스템에 의해 유전자를 파괴하는 것일 것이다. 본 실시예는 Cas9를 코딩하는 RNA 및 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 주사에 의해 비인간 동물(예컨대, 돼지)에서 NLRC5를 파괴하는 예시적인 방법을 보여준다.
NLRC 유전자를 표적화하는 sgRNA가 디자인되고 합성될 것이다. Cas9 코딩 플라스미드를 제작하기 위해, Cas9 코딩 서열이 합성된 다음 Cas9의 시험관내 전사를 위해 T7 프로모터를 갖는 pEASY-T1 벡터 내로 클로닝될 것이다. SV40 폴리아데닐화 신호는 Cas9 카세트의 3' 말단에 있을 것이고, 독특한 HindIII 제한 부위는 선형화를 위해 SV40 신호의 밖에 있을 것이다. sgRNA 스캐폴드를 함유하는 T7 프로모터가 또한 배열되고, 프로모터가 없는 pUC19 벡터 내로 클론될 것이다. 2개의 BsaI 제한 부위가 스페이서 삽입을 위해 사용될 것이며, 상기 플라스미드는 시험관내 전사를 위해 PsiI에 의해 선형화될 것이다. 표적화 벡터 제작을 위해, 부위 특이적 20 nt 스페이서가 합성되고 BsaI 제한 부위 사이의 T7-sgRNA 스캐폴드 내로 클론될 것이다.
Cas9 mRNA를 제조하기 위해, T7-Cas9 발현 플라스미드는 HindIII에 의해 선형화되고, DNA Clean & ConcentratorTM-5(ZYMO Research)를 사용하여 정제될 것이다.
sgRNA를 제조하기 위해, sgRNA 벡터는 PsiI에 의해 선형화되고 DNA Clean & ConcentratorTM-5(ZYMO Research)를 사용하여 정제될 것이다.
선형화된 플라스미드 모두는 제조사의 지침에 따라 T7 High Yield RNA 합성 키트(NEB)에 의해 시험관내에서 전사될 것이다. Cas9 mRNA를 합성하기 위해, m7G(5')G RNA Cap Structure Analog(NEB)가 부가적으로 첨가되어 상기 전사된 mRNA를 안정화시킬 것이다. 제조된 RNA는 MicroElute RNA Clean-Up 키트(Omega)를 사용하여 정제되고 DEPC 물에서 회수될 것이다.
비인간 동물, 예컨대, 바마(Bama) 미니돼지로부터의 접합자는 수정 다음에 수집되고, 조작 배지로 옮겨지고 2-10 pl의 125 ng/μl Cas9 mRNA 및 12.5 ng/μl sgRNA의 단일 세포질 미세주사를 받을 것이다. 대안적으로, 비인간 동물의 수정된 난모세포가 수집될 것이다. Cas9 및 sgRNA는 수정된 난모세포 내로 주사되어 유전적으로 변형된 새끼를 생성할 것이다. RNA 주사 후 비인간 동물(예컨대, 돼지) 배아의 생존력을 시험하기 위해, 시험관내에서 생산된 단위생식형 배아가 예비 실험에 사용될 것이다. 단위생식형 배아 제조를 위해, 비인간 동물(예컨대, 돼지) 난소가 수집되고, 예열된 염수로 세척되고, 여포(follicle)가 흡인될 것이다. 난모세포는 TL-HEPES에서 세척된 후 성숙 배지에서 44시간 동안 배양될 것이다. 성숙된 MII 난모세포는 가벼운 피펫팅에 의해 주위의 난구 세포를 고갈시킨 다음, 30마이크로초 동안 1.2 kV/cm의 2개의 직접 전류 펄스(1초 간격)에 의해 전기적 활성화될 것이다. 활성화된 난모세포는 TL-HEPES 배지로 옮겨지고 125 ng/μl Cas9 mRNA 및 12.5 ng/μl sgRNA의 단일 2-10 pl 세포질 주사를 받을 것이다. 접합자 및 활성화된 난모세포는 5% CO2, 39 ℃ 하에 144시간 동안 PZM3 배지에서 배반포(blastocyst) 단계까지 배양될 것이다.
Cas9 mRNA 및 가이드 RNA는 비인간 동물 접합체(예컨대, 돼지 접합체)에 공동 주사될 것이다. Cas9 mRNA/가이드 RNA가 주사된 접합자 및 물이 주사된 접합자의 시험관내 발달 효능이 비인간 동물(예컨대, 돼지) 초기 배아 발달에 대한 Cas9 mRNA/가이드 RNA의 미세주사 조작의 효과를 결정하기 위해 측정될 것이다.
주사된 배아는 새끼(예컨대, 새끼 돼지)를 생산하기 위해 대리 비인간 동물(예컨대, 돼지) 내로 이식될 것이다. 생존한 배아는 전신 마취 하에 정중앙 개복술 후, 발정일 또는 발정후 1일에 수용자 암퇘지(gilt)의 난관 내로 이식될 것이다. 임신은 약 28일 후에 진단될 것이며, 이후 초음파 검사에 의해 2주 간격으로 정기적으로 확인될 것이다. 미세주사된 새끼(예컨대, 새끼 돼지) 모두는 자연 분만에 의해 출산될 것이다.
총 76개의 주사된 배아는 5개의 독립적 실험에서 5마리의 대리모 내로 이식될 것이다. NLRC5 유전자의 표적화 부위에서의 삽입 또는 결실은 T7 엔도뉴클레아제 I(T7EI) 분석에 의해 검출될 것이다. 새끼(예컨대, 새끼 돼지)의 유전자형은 각 개별 새끼(예컨대, 새끼 돼지)의 표적화 부위를 함유하는 PCR 생성물의 생거 시퀀싱에 의해 분석될 것이다.
실시예 12: 비인간 영장류에서 돼지 췌도 이종이식편에 반응하는 면역 세포의 확인
본 실시예는 세포 이종이식에서의 면역 개입을 위해 표적화 면역 세포를 확인하는 예시적인 방법을 나타낸다. 이를 위해, 이펙터 및 조절성 기능을 갖는 순환성 및 이식편 T 및 B 림프구 하위집합의 표현형을 돼지 췌도 이종이식편 거부반응의 예방을 위해 공여자 항원 특이적 면역요법이 없는 면역억제 또는 공여자 항원 특이적 면역요법을 갖는 면역억제를 받고 있는 사이노몰구스 마카크(CM)에서 연구하였다.
문맥내 돼지 췌도 이종이식편에 대한 세포 면역을 당뇨병 CM의 4마리의 코호트(cohort)에서 소급하여 분석하였다: α-CD40을 이용한 유도 및 CTLA4-Ig 및 라파마이신을 이용한 유지(코호트 A; n=4; 이식편 기능 77일 내지 333일); CTLA4-Ig를 이용한 유도 및 α-CD40 및 라파마이신을 이용한 유지(코호트 B; n=3; 안정적인 이식편 기능 180일 초과); α-CD40, α-CD20, 및 라파마이신을 이용한 유도, 유지 없음(코호트 C; n=2; 32 및 40일 동안 이식편 기능), 및 α-CD40, α-CD20, 및 라파마이신의 보호하에 세포자멸 공여자 백혈구의 주변이식 주입을 이용한 유도, 유지 없음(코호트 D; n=3; 81, 100, 및 113일 동안 이식편 기능). 희생시 순환하는 면역 세포 하위집합 및 간 단핵 세포(LMNC)의 빈도를 유세포분석법에 의해 결정하였다. LMNC를 또한 공여자 항원으로 생체외 자극 후 이펙터 분자에 대해 분석하였다. 통계학적 유의성을 웰치 보정(Welch's correction)을 갖거나 없는 비쌍(unpaired) t 검정을 사용하여 결정하였다.
순환하는 면역 세포 하위집합의 기저 빈도는 코호트 간에 상이하지 않았다. 코호트 A CM과 비교하여, 이식 후 100일까지, 코호트 B CM은 i) 나이브(CD3-CD20+CD21+CD27-) 대 활성화된 기억(CD3-CD20+CD21+CD27+) 및 미숙(CD3-CD19+CD27-IgM+) 대 성숙(CD3-CD19+CD27+CD38+)한 순환하는 B 세포 비율의 현저한 증가, ii) 순환하는 Breg(CD19+CD24hiCD38hi), Treg(CD4+CD25+FoxP3+CD127), 및 천연 억제자 세포(NSC; CD122+CD8+)의 유의한 증가, 및 iii) CD8+ 이펙터 기억(TEM) 세포(CD2hiCD28-CD8+)의 대등한 순환 빈도를 나타내었다. 코호트 D CM이 아닌 코호트 C CM은 이식 후 14일에 CD8+ TEM의 유의한 확장을 나타내었다. 코호트 C CM과 비교하여, 이식후 50±10일에, 코호트 D CM은 Treg 및 NSC의 순환 빈도의 유의한 증가를 나타내었다. 50일에, 코호트 D에서 또한 CD8+ TEM의 유의한 확장이 있었다. 추정된 거부반응으로 인해 종료된 CM에서, LMNC는 CXCR3+ CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 CD20+ B 세포의 실질적인 존재를 나타내었고(α-CD20 처리된 코호트 C 및 D CM을 포함함); CD8+ TEM은 LMNC 중에서 우세한 표현형이었다. 공여자 항원을 이용한 생체외 자극시, 이들 CD8+ TEM은 IFN-γ, TNF-α, 및 퍼포린에 대해 풍부한 염색을 나타내었다.
상기 결과는 돼지에서 CM으로의 췌도 이종이식에서 세포 면역에 대한 면역요법의 효과에 대한 통찰력을 제공하였고 세포 이종이식에서 면역 개입을 위한 표적으로서 B 세포 및 CD8+ TEM를 확인한다.
실시예 13: 돼지 췌도 상의 SLA를 억제하는 것은 돼지 췌도에 대한 인간 CD8+ T 세포 반응을 억제하였다
돼지 췌도에서 MHC(예컨대, SLA)의 억제가 인간 수용자에서 T 세포 활성화를 억제할 수 있는지 결정하기 위해, SLA 항체를 사용하여 돼지 췌도 상의 MHC를 억제하고, 돼지 췌도에 대한 인간 T 세포의 반응을 조사하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포를 항-SLA 클래스 I 차단 항체와 함께 또는 없이 7일간 성체 돼지 췌도와 함께 배양하였다. 고도로 정제된 인간 CD8+ T 세포(hCD8), 인간 CD4+ T 세포(hCD4), 및 인간 자연 살해 세포(hNK)의 증식을 측정하였다. 고도로 정제된 인간 CD8+ T 세포의 증식은 억제되었으나, CD4+ T 또는 NK 세포의 증식은 억제되지 않았다. 돼지 췌도 상의 MHC 클래스 I 분자의 인식은 혼합된 배양에서 7일 후 항-SLA 클래스 I 차단 항체에 의해 차단되었다(도 19A).
성체 돼지 췌도는 항-SLA 클래스 I 차단 항체의 존재 또는 부재하에 7일간 고도로 정제된 림프구와 함께 또는 없이 배양되었다. 배양된 세포의 생존력을 아크리딘 오렌지(AO) 및 프로피디움 요오드화물(PI) 염색에 의해 평가하였다. 정제된 CD8+ T 세포의 세포독성은 항-SLA I 항체의 존재하에 억제되었다(도 19B). 유의한 증식에도 불구하고, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포의 세포독성과 비교할 때 췌도를 상대적으로 손상되지 않은 상태로 두었다(도 19B).
실시예 14: 돼지 췌도로 이식된 원숭이에서 ECDI로 고정된 비장 세포 에 의한 T 세포 활성화의 억제.
이종이식편 공여자로부터의 세포자멸 비장 세포가 수용자에 의한 이종이식편의 면역 거부반응을 억제할 수 있는지 결정하기 위해, 공여자로부터의 세포자멸 비장 세포를 이식 전 및 후에 수용자에게 투여하였다. 그리고 나서, 수용자의 PBMC에서 T 세포 활성화를 조사하였다.
돼지 췌도를 당뇨병 원숭이에게 이식하였다. 췌도 공여자로부터 제조된 세포자멸 비장 세포를 이식 전 1일 및 이식 후 7일에 원숭이에게 투여하였다. 이식 전, 및 이식 후 7, 14, 28, 49, 77, 및 91일에 원숭이로부터 PBMC를 수집하였다. PBMC에서 직접적 및 간접적인 T 세포 활성화를 ELISPOT에 의해 조사하였다. ELISPOT 결과를 스팟-형성 세포(SFC)/106 PBMC로서 나타내었다(도 20A). 141일에, 원숭이로부터 췌도를 수집하고, CD8을 항-CD8 항체를 사용하여 면역조직화학에 의해 검출하였다(도 20B). 42마리의 비-이식된 원숭이로부터의 PBMC를 음성 대조군("대조군")으로서 사용하였다. 유전적으로 변형되지 않은 돼지 췌도로 이식된 10마리의 원숭이로부터의 PBMC를 양성 대조군("거부자(rejector)")으로서 사용하였다. 비장 세포의 투여는 원숭이에서 돼지 췌도에 의해 유도된 T 세포 활성화를 유의하게 감소시켰다.
실시예 15: 면역억제의 유지 없이 원숭이에서 면역-조절된 돼지 췌도의 이식 및 동일한 공여자로부터의 ECDI로 고정된 비장 세포 에 의한 당뇨병의 치료.
실시예 14에서 면역 세포에 대한 ECDI로 고정된 공여자 세포의 면역억제 효과를 시험하는 것에 추가적으로, 본 실시예에서의 실험은 생체내에서(원숭이에서) ECDI로 고정된 공여자 세포의 면역억제 효과를 조사하였다. 상기 결과는 돼지로부터의 ECDI로 고정된 비장 세포가 돼지로부터의 췌도로 이식된 원숭이에서 면역 거부반응을 감소시켰음을 보여주었다.
당뇨병 원숭이를 돼지 췌도로 이식하였다. 상기 원숭이에게 이식 전 7일 및 이식 후 1일에 ECDI로 고정된 공여자 비장 세포(정맥내 주입에 의해)를 제공하였다. 면역억제 약물을 이식일부터 이식 후 21일까지 제공하였다. 소량의 외인성 인슐린을 이식 후 21일까지 투여하였다. 정상 혈당 수준을 유지하는데 필요한 외인성 인슐린(회색 막대로 표시됨)은 이식일에 감소하였고 21일에 완전히 멈추었다. 혈당 수준(선으로 표시됨)은 이식 후 곧바로 정상이 되었고 21일에 인슐린의 중단에도 불구하고 계속 정상이었다. 혈당 수준은 이식 후 100일 동안 외인성 인슐린 없이 정상을 유지하였다(도 21A). 이식 후 피크 값, 무작위 수준, 및 공복 및 글루코스-자극 조건하에 수준을 포함하는, 혈액 C-펩티드 수준을 시험하였다(도 21B).
원숭이의 글루코스 대사를 정맥내 내당 시험(IVGTT)에 의해 조사하였다(도 21C 및 21D). IVGTT에서, 외인성 글루코스를 원숭이에게 주사하고, 혈당 수준을 주사 후 시간 동안 측정하였다. IVGTT를 이식 후 28일 및 90일에 원숭이에게 수행하였다. 스트렙토조토신으로 처리되거나 스트렙토조토신 없이 처리된 비-이식된 원숭이를 대조군으로 사용하였다. 스트렙토조토신으로 처리된 비-이식된 원숭이를 당뇨병 대조군으로 사용하였다. 혈당(도 21C) 및 C-펩티드(도 21D) 수준을 측정하고 상기 대조군과 비교하였다.
실시예 16: ECDI로 고정된 세포를 이용한 수용자 및 이식의 관용화
이식편 공여자로부터의 세포는 ECDI에 의해 고정되고 수용자에서 면역 거부반응을 억제하는 데 사용될 것이다. 본 실시예는 ECDI로 고정된 유전적으로 변형된 세포를 이용하여 이식 수용자를 관용화하는 예시적인 방법을 보여준다. 이식을 필요로 하는 인간 수용자는 수용자를 이식에 관용화하는 ECDI 고정된 세포로 처리될 것이다. ECDI 고정된 세포는 유전적으로 변형될 것이며, 예를 들어, GGTA1 및 CMAH는 넉아웃될 것이다. B4GALNT2는 또한 ECDI 고정된 세포의 일부에서 넉아웃될 것이다. ECDI 고정된 세포의 일부 또는 모두는 또한 ICP47, CD46, CD55, 또는 CD59인 하나 이상의 유전자를 발현할 것이다.
ECDI 고정된 세포는 이식 전 약 7일 및 이식 후 약 1일에 다시 수용자에게 제공될 것이다.
길항적 항-CD40 항체의 용량이 또한 이식 전 약 8일 및 이식 후 7 및 14일에 수용자에게 제공될 것이다. 상기 용량은 수용자 체중당 적어도 약 30 mg 항-CD40 항체일 것이다.
수용자는 이식을 받을 것이다. 상기 이식은 비제한적으로 유제류를 포함하는 비인간 동물로부터의 세포, 조직, 및/또는 장기일 것이다.
예를 들어, 췌도 세포는 변형되지 않은 유제류로부터 추출되어 당뇨병을 겪는 인간 수용자 내로 이식될 것이다. 수용자가 이식 전에 적절하게 관용화되었기 때문에, 인간 수용자는 이식을 거부하지 않을 것이다.
실시예 17: 항-CD40 항체 처리를 받는 원숭이에서 돼지 췌도의 이식에 의한 당뇨병의 치료.
본 실시예는 돼지 췌도가 이식된 원숭이에서 면역 거부반응에 대한 상이한 시점에 투여된 항-CD40 항체의 효과를 비교하였다.
대조군 당뇨병 원숭이에게 유전적으로 변형되지 않은 돼지 췌도를 이식하였다(도 22A). 상기 원숭이에게 이식일에 항-CD40 항체를 제공하였다. 정상 혈당 수준을 유지하는데 필요한 외인성 인슐린(회색 막대로 표시됨)은 이식일에 감소하였고 21일에 완전히 멈추었다. 혈당 수준(선으로 표시됨)은 이식 직후 정상이 되었고, 두 원숭이에서 21일에 인슐린의 중단에도 불구하고 계속 정상이다. 그러나, 혈당 수준은 100일 후 증가하였고 외인성 인슐린이 125일 후 정상 혈당 수준을 유지하는데 필요하다.
야생형 돼지로부터 수집된 돼지 췌도를 당뇨병 원숭이에게 이식하였다. 이식 후, 원숭이에게 이식 후 14일까지 항-CD40 항체 처리를 4회 제공하였다(도 22B). 정상 혈당 수준을 유지하는데 필요한 외인성 인슐린(회색 막대로 표시됨)은 이식일에 감소하였고 21일에 완전히 멈추었다. 혈당 수준(선으로 표시됨)은 이식 직후 정상이 되었고, 상기 원숭이에서 21일에 인슐린의 중단에도 불구하고 계속 정상이다. 상기 혈당 수준은 이식 후 250일에 외인성 인슐린 없이 정상을 유지하였다(도 22B).
실시예 18: 항체 및 ECDI로 고정된 비장 세포 에 의한 원숭이 췌도로 이식된 당뇨병 원숭이의 면역관용화
본 실시예는 원숭이(ID #13CP7)에서 동종이식편에 대한 면역 거부반응에 대한 항-CD40 항체 및 관용화 백신의 효과를 비교하였다. 상기 결과는 항-CD40 항체 및 관용화 백신 모두가 원숭이 췌도로 이식된 원숭이에서 면역 거부반응을 효과적으로 감소시켰음을 보여주었다.
당뇨병 원숭이에게 원숭이 췌도를 이식하였다. 상기 원숭이에게 이식일부터 시작하여 21일 동안 항-CD40 항체 및 라파마이신을 제공하였다. 상기 원숭이에게 이식 후 21일까지 외인성 인슐린을 제공하였다. 21일 후, 상기 원숭이는 아침(공복)에 정상 혈당 수준을 가지고 있었으나, 오후에 고혈당 수준을 가지고 있었다(도 23A). 도 23B는 동일한 수용자(ID #13CP7)에서 혈청 돼지 C-펩티드 수준(공복, 무작위, 및 자극됨)을 나타낸다.
실시예 19: α-CD40 항체 및 CTLA4 -Ig에 의한 돼지 췌도로 이식된 당뇨병 원숭이의 면역관용화
본 실시예의 실험은 돼지 췌도 세포가 이식된 원숭이에서 다른 약물에 의해 유도된 면역억제를 유지하는데 대한 α-CD40 항체 및 CTLA4-Ig의 효과를 비교하였다. 상기 결과는 α-CD40 항체가 췌도 이종이식편 생존을 연장하는데 있어 CTLA4-Ig보다 우수하였음을 보여주었다(표 12).
스트렙토조토신-유도된 당뇨병을 갖는 사이노몰구스 원숭이의 두 그룹(MX-LISA-A(4마리 원숭이) 및 MX-LISA-B(3마리 원숭이))에게 유전적으로 변형되지 않은 돼지 췌도를 문맥내로 이식하였다. MX-LISA-A 그룹의 원숭이의 경우, α-CD25 항체, α-CD40 항체, sTNFR, 및 α-IL-6R 항체에 의해 면역억제를 유도하였고, CTLA4-Ig 및 라파마이신에 의해 유지시켰다. MX-LISA-B 그룹의 원숭이의 경우, α-CD25 항체, CTLA4-Ig, sTNFR, 및 α-IL-6R 항체에 의해 면역억제를 유도하였고, α-CD40 항체 및 라파마이신에 의해 유지시켰다. 더 긴 췌도 이종이식편 생존은 면역억제가 MX-LISA-A 그룹과 비교하여 α-CD40 항체(MX-LISA-B 그룹)에 의해 유지되었을 때 달성되었다(표 12).
표 12. α-CD40 항체 및 CTLA4 -Ig에 의한 돼지 췌도로 이식된 당뇨병 원숭이의 면역관용화 .
실시예 20: α-CD40 항체 및 ECDI로 고정된 공여자 비장 세포 에 의한 돼지 췌도로 이식된 당뇨병 원숭이의 면역관용화
본 실시예는 돼지 췌도로 이식된 원숭이에서 면역 거부반응에 대한 세포자멸 비장 세포의 효과를 조사하였다. 상기 결과는 세포자멸 비장 세포가 췌도 이종이식편 생존을 연장하였음을 보여주었다(표 13).
스트렙토조토신-유도된 당뇨병을 갖는 사이노몰구스 원숭이의 두 그룹(MX-ECDI-대조군(2마리 원숭이) 및 MX-ECDI-백신(3마리 원숭이))에게 유전적으로 변형되지 않은 돼지 췌도를 문맥내로 이식하였다. 원숭이 모두에게 이식일부터 이식 후 21일까지 α-CD20 항체, α-CD40 항체, sTNFR, α-IL-6R 항체, 및 라파마이신을 제공하였다. MX-ECDI-백신 그룹의 원숭이에게 또한 이식 전 7일 및 이식 후 1일에 체중당 0.25X109 세포자멸 공여자 비장 세포의 주변이식 정맥내 주입을 제공하였다. 상기 비장 세포는 GGTA1 넉아웃 돼지로부터 제조된 것을 포함하며, 그 전체가 참고로 본원에 통합된 문헌[Katapodis et al., J Clin Invest.110(12):1869-187 (2002)]에 기재된 바와 같이 αGal 당접합체 GAS914의 보호하에 융합된 것을 포함한다. 연장된 췌도 이종이식 생존이 일시적인 면역억제의 보호하에 세포자멸 공여자 비장 세포가 제공된 원숭이에서 달성되었으나(MX-ECDI 백신), 일시적인 면역억제 단독(이 제공된 수용자에서 달성되지 않았다 MX-ECDI 대조군)(표 13).
표 13. α-CD40 항체 및 세포자멸 공여자 비장 세포 에 의한 돼지 췌도로 이식된 당뇨병 원숭이의 면역관용화
실시예 21: ECDI로 고정된 공여자 비장 세포 및 α-CD40 항체에 의한 순환하는 면역 세포 수준의 억제
본 실시예의 실험은 이식 후 순환하는 면역 세포의 수준에 대하여 ECDI로 고정된 세포(관용화 백신) 및 α-CD40 항체를 조사하였다. 순환하는 면역 세포의 수준은 이식 거부반응의 지표였다. 상기 결과는 ECDI로 고정된 세포(관용화 백신) 및 α-CD40 항체 모두가 이식 후 수용자에서 순환하는 면역 세포의 수준을 감소시켰음을 보여주었다.
본원에 시험된 순환하는 면역 세포는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포, CD4+CD25hi FoxP3+ CD127low 조절성 T 세포, 및 CD8+ CD122+ 천연 억제자 세포였다.
CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포
사이노몰구스 원숭이에게 돼지 췌도를 이식하였다. 관용화 백신을 원숭이에게 제공하지 않았다. 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 수준을 유세포분석법에 의해 결정하였다(도 24). 상기 결과는 이식(14GP04)을 받는 원숭이에서 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 수준이 기준 대조군(13CP04)에 비해 증가하였고, CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포는 희생 시점에 간 단핵 세포 내의 CD8+ T 세포 구획 내에서 우세하다(도 24).
실시예 24에서 돼지 췌도로 이식된 사이노몰구스 원숭이의 2개의 그룹(MX-ECDI-대조군 및 MX-ECDI-백신)에서 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포를 유세포분석법에 의해 측정하였다. MX-ECDI-백신 그룹의 원숭이는 관용화 백신으로서 세포자멸 공여자 비장 세포의 주변이식 주입을 투여받았다. 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 수준을 유세포분석법에 의해 결정하였다(도 25). 유세포분석법 결과는 세포자멸 공여자 비장 세포(MX-ECDI-백신)의 주변이식 주입이 세포자멸 공여자 비장 세포를 갖는 관용화 백신접종을 받지 않은 대조군 수용자(MX-ECDI-대조군)와 비교하여 사이노몰구스 원숭이에서 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 이식후 증가를 적어도 일시적으로 감소시켰음을 보여준다. 희생 시점에(추정된 거부반응 후), 간 단핵 세포에서 CD8+ T 세포 구획 내의 CD8+ CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 백분율은 수용자의 두 그룹에서 동등하게 높았다(도 25).
실시예 28(MX-LISA-A 및 MX-LISA-B) 및 실시예 29(MX-ECDI-대조군 및 MX-ECDI-백신)에서 돼지 췌도로 이식된 원숭이에서 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포를 이식일, 이식 후 7일, 50일, 및 100일에 유세포분석법에 의해 측정하였다. 나이브 원숭이로부터의 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 수준을 대조군으로 사용하였다.
유세포분석법 결과는 세포자멸 공여자 비장 세포(MX-ECDI 백신)의 주변이식 주입이 세포자멸 공여자 비장 세포를 갖는 관용화 백신접종을 받지 않은 대조군 수용자(MX-ECDI 대조군)와 비교하여 사이노몰구스 원숭이에서 순환하는 CD8+ CD2hi CD28- 이펙터 기억 T 세포의 이식후 증가를 적어도 일시적으로 억제한다는 것을 보여준다. MX-ECDI-백신 수용자에서 CD8+ 이펙터 기억 T 세포의 이식후 증가의 억제 수준은 돼지 췌도 이종이식 후 더 강력하고 더 연장된 면역억제를 받는 수용자(MX-LISA-A 및 MX-LISA-B 그룹)에서의 억제와 대등하였다(도 26).
CD4+ CD25hi FoxP3 + CD127low 조절성 T 세포
본 실시예의 실험은 이식 후 순환하는 CD4+CD25hi FoxP3+ CD127low 조절성 T 세포의 수준에 대하여 ECDI로 고정된 세포(관용화 백신) 및 α-CD40 항체를 조사하였다. 순환하는 CD4+CD25hi FoxP3+ CD127low 조절성 T 세포의 수준은 이식 거부반응의 지표였다.
돼지 췌도로 이식된 원숭이에서 순환하는 CD4+CD25hi FoxP3+ CD127low 조절성 T 세포(MX-LISA-A, MX-LISA-B, MX-ECDI-대조군, 및 MX-ECDI-백신)를 이식일, 이식 후 7일, 50일, 및 100일에 유세포분석법에 의해 측정하였다. 나이브 원숭이로부터의 순환하는 CD4+CD25hi FoxP3+ CD127low 조절성 T 세포의 수준을 대조군으로서 사용하였다.
유세포분석법 결과는 세포자멸 공여자 비장 세포의 주변이식 주입(MX-ECDI-백신)이 세포자멸 공여자 비장 세포를 갖는 관용화 백신접종을 받지 않은 대조군 수용자(MX-ECDI-대조군)와 비교하여 사이노몰구스 원숭이에서 순환하는 CD4+CD25hi FoxP3+ CD127low 조절성 T 세포의 증가를 촉진하였음을 보여준다. MX-ECDI-백신 수용자에서 이러한 조절성 T 세포의 이식후 증가는 돼지 췌도 이종이식 후 항-CD40 항체 및 라파마이신(MX-LISA-B)를 이용한 유지 면역억제를 받는 수용자에서의 증가와 대등하였다(도 27).
CD8+ CD122+ 천연 억제자 세포
돼지 췌도로 이식된 원숭이에서 순환하는 CD8+ CD122+ 천연 억제자 세포(MX-LISA-A, MX-LISA-B, MX-ECDI-대조군, 및 MX-ECDI-백신)를 이식일, 이식 후 7일, 50일, 및 100일에 유세포분석법에 의해 측정하였다. 나이브 원숭이로부터의 순환하는 CD8+ CD122+ 천연 억제자 세포의 수준을 대조군으로서 사용하였다.
유세포분석법 결과는 공여자 세포자멸 비장 세포의 주변이식 주입(MX-ECDI-백신)이 세포자멸 공여자 비장 세포를 갖는 관용화 백신접종을 받지 않은 대조군 수용자(MX-ECDI-대조군) 및 MX-LISA-A 수용자와 비교하여 사이노몰구스 원숭이에서 순환하는 CD8+CD122+ 천연 억제자 세포의 증가를 촉진하였음을 보여준다. MX-ECDI-백신 수용자에서 이러한 조절성 T 세포에서의 이식후 증가는 돼지 췌도 이종이식 후 항-CD40 항체 및 라파마이신(MX-LISA-B)를 이용한 유지 면역억제를 받는 수용자에서의 증가와 대등하다(도 28).
실시예 22: ECDI로 고정된 세포, 리툭시맙 , 항-CD40 Ab 2C10 항체, sTNFR , 항-IL-6R 항체, 및 라파마이신에 의한 원숭이에서 돼지 췌도 이종이식 생존의 연장.
본 실시예는 다른 면역억제 약물과 조합된 ECDI로 고정된 공여자 세포를 사용하여 면역 거부반응을 억제하기 위한 예시적인 방법을 나타낸다.
i) ECDI로 고정된 세포 상의 항원 전달, ii) 라파마이신, 리툭시맙, sTNFR, 및 항-IL-6R 항체, 및 iii) 항-CD40 Ab 2C10의 주변이식을 포함하는 신규한 3부분(tripartite) 프로토콜의 관용원성 효능은 원숭이에서 성체 돼지 췌도의 문맥내 이식의 환경에서 연구될 것이다.
ECDI로 고정된 공여자 비장 세포는 클로닝된 돼지 공여자로부터 신선하게 제조된 사이토카인-동원된(mobilized) 비장 B 세포로부터 제조될 것이다. 약 0.25 x109/kg ECDI로 고정된 공여자 비장 세포는 -7일(0일에 동일한 공여자 췌도와 비교하여)에 원숭이에게 IV를 통해 투여될 것이다. 공여자 비장은 비장절제술을 사용하여 클로닝된 돼지 공여자로부터 새롭게 수득될 것이다. 공여자 비장 B 세포는 생체외에서 확장되고 +1일에 원숭이에게 IV 주입을 통해 투여될 것이다. 7일간 배양되고 모든 방출 기준을 만족하는, 클로닝된 돼지 공여자로부터의 성체 돼지 췌도 생성물(25,000 췌도수/kg)은 문맥 정맥 혈관 접근 포트를 통해 0일에 문맥내로 주입될 것이다.
B 세포 고갈은 -10일에, 즉 췌도 이식 전 및 또한 ECDI로 고정된 공여자 세포의 첫 번째 주입 전에 리툭시맙으로 개시될 것이다. 20 mg/kg의 4개의 용량이 -10일, -3일, +5일, 및 +12일에 IV를 통해 원숭이에게 투여될 것이다. 원숭이는 12 내지 15 ng/ml 표적 최저 수준으로 -7일 내지 이식후 21일에 라파마이신이 투여될 것이다. sTNFR은 -6일 내지 +10일에 피하로 투여될 것이다. 또한, 항-IL-6R은 -7일, 0일, 7일, 14일 및 21일에 IV를 통해 투여될 것이다.
원숭이는 이종이식 동물 모델에서 ECDI로 고정된 공여자 세포와 함께 약학적으로 허용되는 활성제를 사용하는 효능을 결정하기 위해 시험될 것이다. 50 mg/kg 항-CD40 Ab 2C10의 3개의 용량이 -1일, +7일, 및 +14일에 IV를 통해 원숭에게 투여되는 반면, 50 mg/kg 항-CD40 Ab 2C10의 4개의 용량은 -8일, -1일, +7일, 및 +14일에 IV를 통해 다른 원숭이에게 투여될 것이다.
글루코스에 대한 급성 C-펩티드 반응 및 글루코스 소실률의 결정과 함께 매일 오전 혈당(AM BG) 및 오후 혈당(PM BG), 매주 C-펩티드, 매월 HbA1c, 및 2개월마다 IVGTT를 포함하는 이식편의 이식후 모니터링이 측정될 것이다. 성공적인 생착(engraftment)은 크게 감소된(기준선의 ≤33%) 외인성 인슐린 또는 외인성 인슐린에 대하여 비공복 BG < 200 mg/dL의 유지로서 정의될 것이다. 일차 효능 결과는 ≥200 mg/dL의 혈당과 함께(안정적인 저용량 인슐린에 대해 또는 인슐린의 중단 후) 첫 3일 연속으로서 정의된 췌도 이식편 실패에 대한 일자일 것이다.
이식후 췌도 이식편 기능은 IV 내당 시험(IVGTT)에서 추가로 입증될 것이다. 글루코스의 1회 용량이 IV에 의해 섭취될 것이고 혈당 수준이 간격을 두고 확인된다. 당뇨병 유도 전 및 후(STZ 전 및 후) IV 글루코스에 대한 혈청 돼지 C-펩티드 반응이 또한 측정될 것이다. +28일에 IV 글루코스에 대한 반응은 유도된 당뇨병 상태의 역전을 나타낼 것이다.
실시예 23: 유전적으로 변형된 이식편의 이식 및 ECDI로 고정된 공여자 세포의 투여에 의한 수용자에서 면역 거부반응의 감소
본 실시예는 이식이 수용자에서 낮은 면역 거부반응을 유도하거나 면역 거부반응을 유도하지 않도록 i) ECDI로 고정된 공여자 세포를 투여하고; 및 ii) 공여자를 유전적으로 변형시킴으로써, 공여자로부터 이식을 받고 있는 수용자에서 면역 거부반응을 억제하기 위한 예시적인 반응을 나타낸다.
이식을 필요로 하는 인간 수용자는 수용자를 ECDI 고정된 세포로 처리함으로써 이식편에 대해 관용화된다. 관용화 후, 수용자는 이식을 받을 것이다. 이식은 비제한적으로 유제류를 포함하는 비인간 동물로부터의 세포, 조직, 및/또는 장기일 것이다. 이러한 비인간 동물은 유전적으로 변형된 비인간 동물일 것이다. 유전적 변형은 적어도 NLRC5/TAP1 넉아웃을 포함할 것이다. 넉아웃될 다른 유전자는 표 1 및 2에 열거되어 있다. 과발현될 유전자는 표 3 및 표 4에 열거되어 있다.
예를 들어, 당뇨병을 갖는 인간 수용자는 ICP47을 과발현하는 하나 이상의 NLRC5/TAP1 넉아웃 췌도 세포로 이식된다. 이식된 췌도 세포는 인간 ICP47과 상동이거나 동일한 펩티드를 코딩하는 전이유전자를 과발현할 것이다. 췌도 세포는 돼지와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래될 것이다.
이식 후, 인간 수용자는 증가된 내인성 인슐린 수준 및 더 우수한 글루코스 내성을 가질 것이다. 야생형 췌도 세포로 이식된 인간 수용자와 비교할 때, 인간 ICP47을 과발현하는 NLRC5 넉아웃 췌도 세포로 이식된 인간 수용자는 유의하게 감소된 이식 거부반응을 가질 것이며, 따라서 면역억제 요법이 거의 또는 전혀 필요하지 않을 것이다.
실시예 24: 수용자의 만성 및 전신 면역억제의 부재하의 임상 환경에서 인간 수용자에서 돼지 췌도 이종이식편의 거부반응의 방지 또는 생존 연장
본 실시예는 이종이식편 수용자의 만성 및 전신 면역억제의 부재하의 임상 환경에서 인간 수용자에서 돼지 췌도(및/또는 다른 세포, 조직, 및 장기) 이식편의 거부반응을 방지하거나 또는 생존을 연장하기 위한 예시적인 접근법을 나타낸다. 이 접근법은 세 가지 요소를 포함하고 통합할 것이다: i) αGal, MHC 클래스 I, 보체 C3, 및 CXCL10의 결핍되고/거나 감소된 발현 뿐만 아니라 HLA-G의 형질전환 발현을 갖는 유전적으로 조작된 돼지 췌도; ii) αGal, Neu5Gc, 및 Sda/CAD의 결핍된/감소된 발현 뿐만 아니라 인간 CD47, 인간 PD-L1, 인간 PD-L2(유전적으로 조작된 백신)과 함께 또는 없이 HLA-G의 형질전환 발현을 갖는 유전적으로 조작된 공여자 세포자멸 및 비세포자멸 단핵 세포(예컨대, 비장 세포); 및 iii) 길항적 항-CD40 mAb, 항-CD20 mAb, 라파마이신 및 콤프스타틴(예컨대, 콤프스타틴 유도체 APL-2), 항-IL-6 수용체 mAb, 및 가용성 TNF 수용체를 포함하는 일시적인 항-염증 요법을 포함하는 일시적인 면역억제의 투여.
파괴된 GGTA1, CMAH, 및 B4GalNT2 및 HLA-G(또는 HLA-E), 인간 CD47, 인간 PD-L1 및 인간 PD-L2를 발현하는 전이유전자를 포함하는 백신 공여자 돼지가 생성될 것이다. 이러한 백신 공여자 돼지는 αGal-, Neu5Gc-, Sda/CAD- 결핍을 갖고 HLA-G, 인간 CD47, 인간 PD-L1, 및 인간 PD-L2를 발현하는 단핵 세포(예컨대, 비장 세포)를 제공할 것이다. 단핵 세포(예컨대, 비장 세포)의 일부는 ECDI 고정에 의해 세포자멸이 될 것이다. 세포자멸 및 비세포자멸 단핵 세포(예컨대, 비장 세포)는 관용화 백신을 제조하기 위해 혼합될 것이다. 이식편 공여자 돼지는 백신 공여자 돼지에서 NLRC5(또는 TAP1-), C3, 및 CXCL10 유전자를 추가로 파괴함으로써 제조될 것이다. 이식편 공여자 돼지는 인간 수용자에서 이식을 위한 세포, 조직 또는 장기(예컨대, 췌도)를 제공할 것이다. 백신 공여자 돼지 및 이식편 공여자 돼지의 집단은 클로닝에 의해, 예컨대, 체세포 핵 이식을 사용하여 확장될 것이다.
이식편 공여자 돼지로부터의 이식편은 수용자에게 이식될 것이다. 백신 공여자 돼지에 의해 제공된 세포로부터의 관용화 백신은 이식 전 1일 및 이식 후 7일에 인간 수용자에게 투여될 것이다. 면역억제제, 예컨대 α-CD40 항체, α-CD20 항체 및 라파마이신, 및/또는 항-염증제, 예컨대 콤프스타틴, α-IL-6R 항체, 및 sTNFR은 이식 전 시점부터 이식 후 21일까지 투여될 것이다. 이 접근법은 수용자의 만성 및 전신 면역억제의 부재하에 인간 수용자에서 돼지 이종이식편(예컨대, 돼지 췌도)의 거부반응을 예방하거나 생존을 연장시킬 것이다(도 5).
실시예 25. GGTA1 / NLRC5 넉아웃 돼지의 생성 및 특성규명
본 실시예는 넉아웃 돼지를 생성하기 위한 예시적인 방법을 나타낸다. 넉아웃 돼지는 NLRC5, TAP1, C3, CXCL10, MICA, MICB, CIITA, CMAH, GGTA1 및/또는 B4GALNT2 중 둘 이상의 감소된 단백질 발현을 가질 수 있다. 그러한 넉아웃 돼지 중 하나는 CRISPR/cas9 시스템을 사용한 GGTA1/ CMAH/NLRC5 넉아웃 돼지였다. 상기 돼지는 이식을 위한 췌도를 제공하였다. 파괴된 GGTA1/ CMAH/NLRC5를 갖는 돼지 췌도는 MHC 클래스 I 결핍을 가지고 있었고 수용자에게 이식될 때 낮은 면역 거부반응을 유도하거나 면역 거부반응을 유도하지 않을 것이다.
태아 섬유아세포의 형질감염
실시예 1에서 생성된 GGTA1, CMAH, 및 NLRC5를 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 px330 플라스미드를 돼지 태아 섬유아세포에서 절개하였다. 돼지 태아 섬유아세포를 5-10% 혈청, 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 섬유아세포를 제조사의 지침에 따라 리포펙타민 3000 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 GGTA1, CMAH 또는 NLRC5 유전자를 표적화하는 Cas9 및 sgRNA를 발현하는 2개 또는 3개의 플라스미드로 공동 형질감염시켰다.
GGTA1 KO 세포의 반대 선택
형질감염 후 4일에, 형질감염된 세포를 채취하고 이소렉틴 B4(IB4)-바이오틴으로 표지하였다. αGal을 발현하는 세포를 바이오틴 접합된 IB4로 표지하고, 자기장에서 스트렙타비딘 코팅된 Dynabeads(Life Technologies)에 의해 고갈시켰다. αGal 결핍 세포를 상층액에서 선택하였다. 세포를 현미경에 의해 검사하였다. 분류 후 결합된 비드를 함유하지 않거나 매우 적게 함유한 세포를 음성 세포로 확인하였다.
CRISPR / Cas9 표적화된 GGTA1 및 NLRC5 유전자의 DNA 시퀀싱 분석
IB4 반대 선택된 세포 및 클로닝된 돼지 태아로부터의 지놈 DNA를 퀴아젠 DNeasy Miniprep 키트를 사용하여 추출하였다. PCR을 표 11에 나타낸 바와 같이 GGTA1 및 NLRC5 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 수행하였다. DNA 중합효소, dNTPack(New Enland Biolabs)를 사용하였고, GGTA1을 위한 PCR 조건은 상기 프라이머에 이상적인 어닐링 및 멜팅 온도에 기초하였다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 퀴아젠 겔 추출 키트에 의해 정제하고, 표 7에 나타낸 바와 같이 특이적 시퀀싱 프라이머를 이용하여 생거 방법(DNA Sequencing Core Facility, University of Minnesota)에 의해 시퀀싱하였다.
체세포 핵 이식( SCNT )
SCNT를 문헌[Whitworth et al. Biology of Reproduction 91(3):78, 1-13, (2014)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. SCNT를 시험관내 성숙 난모세포(DeSoto Biosciences Inc., St. Seymour, TN)를 사용하여 수행하였다. 0.1% 히알루로니다제에서 피펫팅하여 난모세포로부터 난구 세포를 제거하였다. 정상 형태 및 가시적인 극체를 갖는 난모세포만을 SCNT를 위해 선택하였다. 난모세포를 5 μg/mL 비스벤즈이미드 및 7.5 μg/mL 사이토칼라신 B를 함유하는 조작 배지(5% FBS를 갖는 무칼슘 NCSU-23)에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 난모세포를 제1 극체 및 중기 II 판을 제거함으로써 제핵하였다. 단일 세포를 각 제핵된 난모세포 내로 주사하고, 융합하고, 280mM 만니톨, 0.1 mM CaCl2, 및 0.05 mM MgCl2에서 50 μsec 동안 180 V의 2개의 DC 펄스(BTX 세포 전기천공기, Harvard Apparatus, Hollison, MA, USA)에 의해 동시에 활성화시켰다. 활성화된 배아를 0.4% 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 NCSU-23 배지에 다시 넣고 1시간 미만 동안 가습된 분위기에서 38.5 ℃, 5% CO2에서 배양하고, 대리 돼지에게 이식하였다.
배아를 사용한 유전적으로 변형된 돼지의 생산
대리 돼지에게 이식하기 위한 배아를 배아 이식 배지가 채워진 페트리 디쉬에 첨가하였다. 세포 동결보존용 0.25 ml 멸균 빨대를 또한 사용하였다. 배아의 흡인을 25-35℃에서 수행하였다.
배아의 흡인을 이 순서에 따라 수행하였다: 배지층-공기층-배지층-공기층-배아층-공기층-배지층-공기층-배지층. EO 가스로 멸균된 빨대를 사용한 경우, 배아의 흡인 전에, 배아 이식용 배지의 흡인 및 분주를 1-3회 반복하여 내부를 세척하였다. 흡인 후, 빨대의 상단 끝을 플라스틱 마개로 밀봉하였다. 상기 흡인 및 밀봉된 빨대를 멸균으로 유지하기 위해, 플라스틱 피펫(Falcon, 2 ml)을 빨대보다 약간 더 큰 크기로 절단하여 내부에 넣고 파라핀 필름으로 밀봉하였다. 밀봉된 빨대의 온도를 사용 직전까지 휴대용 인큐베이터를 사용하여 유지시켰다.
배아 및 발정-동기화된(estrus-synchronized) 대리모를 제조하였다. 배아의 이식은 대리모의 개복술(laparotomy)을 통해 난소를 노출시킴으로써 수행될 것이다. 마취 후, 복부 영역의 중앙선을 절개하여 자궁, 난소, 난관, 및 난관채(fimbriae)를 노출시켰다. 배아를 흡인하는 빨대를 휴대용 인큐베이터로부터 무균적으로 꺼내고, 난관 입구에 삽입하였다. 상기 삽입된 빨대를 팽대부(ampullary)-협부(isthmic) 접합 영역으로 이동시켰다. 삽입 절차 후, 빨대를 가위를 사용하여 맞은 편에 있는 공기 함유 층에서 절단하였다. 1 cc 주사기를 절단 말단에 장착하고, 대략 0.3 cc의 공기를 주사하여 배아 및 배지를 빨대로부터 난관으로 방출시켰다. 이때, 0.2 ml 옐로우 팁의 상단 끝 5 mm를 절단하여 주사기와 빨대를 연결하는 데 사용하였다.
배아 이식 후, 노출된 자궁, 난소, 난관, 및 난관채(fimbriae)를 복강에 넣고, 복부 근막(abdominal fascia)을 흡수성 봉합 재료로 봉합하였다. 그리고 나서, 수술 부위를 베타딘으로 세척하고, 항생제 및 항-염증 및 진통 약물로 처리하였다. 배아가 이식된 대리모의 임신 검사를 수행한 후, 성공적으로 임신한 비인간 동물의 분만을 유도하였다.
임신 및 태아
두 배(two litters)의 돼지 태아(임신 1로부터 7마리 및 임신 2로부터 5마리)를 얻었다. 태아를 45일(임신 1) 또는 43일(임신 2)에 채취하고 가공하여 DNA 및 배양 세포를 단리하였다. 조직 단편 및 세포를 2일 동안 배양 배지에 도말하여 태아 세포를 부착시키고 성장시켰다. 야생형 세포(유전적으로 변형되지 않은 태아 세포) 및 임신 1 또는 2로부터의 태아 세포를 배양 플레이트에서 꺼내어 알렉사 플루오르(fluor) 488에 접합된 IB4 렉틴 또는 FITC에 접합된 항-돼지 MHC 클래스 I 항체로 표지하였다. 유세포 분석을 수행하고 데이터를 도 32A: 임신 1 또는 도 32B: 임신 2에 나타내었다. WT 세포의 막대 그래프가 태아 세포의 각 그룹의 전체 강도의 감소를 강조하기 위해 각 패널에 포함되어 있다. 피크 강도의 감소로서 표시된 임신 1에서 알파 Gal 및 MHC 클래스 I 표지의 감소가 특히 흥미롭다. 임신 2 태아 1 및 3은 WT 태아 세포와 비교하여 알파 gal 표지의 큰 감소 및 MHC 클래스 1 표지의 유의한 감소를 갖는다.
태아의 유전자형
태아 세포로부터의 DNA를 대상으로 GGTA1(서스 스크로파(Sus scrofa) 품종 혼합 염색체 1, Sscrofa10.2 NCBI 참조 서열: NC_010443.4과 비교하여) 또는 NLRC5(공통 서열) 표적 영역의 PCR 증폭을 수행하고, 생성된 앰플리콘을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다(도 29A, 29B, 30A, 및 30B). 또한, 앰플리콘을 각 반응으로부터 정방향 프라이머만을 사용하여 생거 시퀀싱에 의해 분석하였다. 결과가 GGTA1에 대한 표적 부위 이후 6개의 뉴클레오티드가 절단된 임신 1 태아 1, 2, 4, 5, 6, 및 7로서 나타나 있다. 태아 3은 절단 부위 이후 17개의 뉴클레오티드가 절단되었고, 이어서 2,511 (668-3179) 뉴클레오티드 결실이 이어지며, 단일 염기 치환이 뒤따른다. 표적 유전자의 두 복제본으로부터 상기 대립유전자를 함유하는 단일 시퀀싱 실험으로부터의 절단, 결실 및 치환은 단지 유전자 변형이 발생하였음을 시사할 수는 있지만 각 대립유전자에 대한 정확한 서열을 밝힐 수는 없다. 이 분석으로부터, 7마리의 모든 태아는 단일 대립유전자 변형을 함유한 것으로 보인다. 임신 1로부터의 태아에 대한 NLRC5 표적 부위의 서열 분석은 일관된 정렬을 나타낼 수 없었는데, 이는 시퀀싱 반응에서 알려지지 않은 문제 또는 생거 시퀀싱 반응 및 분석을 복잡하게 하는 NLRC5 대립유전자 사이의 다양한 DNA 변형을 시사한다. 임신 2 태아 DNA 샘플 1, 3, 4, 및 5는 GGTA1 유전자 표적 부위로부터 3개의 뉴클레오티드가 절단되었다. 태아 2는 생거 시퀀싱에서 변이성을 가지고 있었는데, 이는 DNA 돌연변이의 복잡한 변이성 또는 불량한 샘플 품질을 시사한다. 그러나, 태아 DNA 주형 품질은 상기 기재된 GGTA1 유전자 스크리닝 실험의 생성에 충분하였다. NLRC5 유전자 앰플리콘은 모두 NLRC5 유전자 절단 부위의 다운스트림에 있는 120개의 뉴클레오티드가 절단되었다.
태아 DNA(야생형(WT) 대조군, 및 임신 1로부터의 태아 1-7로부터)를 뒷다리 생검으로부터 단리하고, 표적 유전자 NLRC5 및 GGTA를 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고 형광 DNA 염색에 의해 시각화하였다. WT 레인에서의 앰플리콘 밴드는 변형되지 않은 DNA 서열을 나타낸다. 앰플리콘 크기의 증가 또는 감소는 각각 앰플리콘 내의 삽입 또는 결실을 시사하였다. 하나의 샘플에서 대립유전자 간의 DNA 변형의 편차는 밴드를 더 확산되어 보이게 할 수 있다. DNA 변형의 작은 편차는 1% 아가로스 겔에 의해 분리될 수 있었다. 상기 결과가 도 31A-31B에 나타나 있다. NLRC5 겔에서와 같이 밴드의 결여(임신 1의 태아 1, 3, 및 4; 도 31A 하부)는 표적 영역에 대한 변형이 DNA 증폭 프라이머의 결합을 파괴하였음을 시사하였다. GGTA1 표적화 실험에서 모든 밴드의 존재는 DNA 품질이 NLRC5 표적화 PCR 반응에서 DNA 앰플리콘을 생성하는데 충분하였음을 시사한다. 임신 1의 태아 1, 2, 4, 및 5(도 31A, 상부)는 더 큰 GGTA1 앰플리콘을 가지고 있었으며, 이는 표적화된 지역 내에서의 삽입을 시사한다. 임신 1의 태아 3의 경우(도 31A, 상부), GGTA1 앰플리콘은 WT 대조군보다 빠르게 이동하였으며, 이는 표적화된 지역 내에서의 결실을 시사한다. 임신 1의 태아 6 및 7의 경우(도 31A, 하부), NLRC5 앰플리콘은 WT보다 빠르게 이동하였으며, 이는 표적 지역 내에서의 결실을 시사한다. 임신 2의 태아 1-5의 경우(도 31B, 상부), GGTA1 앰플리콘은 크기에 의해 해석하기 어려웠고 WT 대조군과 비교하여 확산되었다. 태아 1-5(도 31B, 하부) NLRC5 앰플리콘은 야생형 대조군과 비교하여 크기와 밀도가 균일하였다.
알파 Gal 및 MHC 클래스 1 유세포분석 표지에 대한 표현형 결과의 편차를 고려할 때, GGTA1 및 NLRC5 유전자에서 이중대립 돌연변이의 상당한 편차가 있다. 이러한 관찰은 아가로스 겔에서의 밴드 크기의 차이, 절단된 유전자 생성물, 및 시퀀싱 도전 도 29A-29B, 30A-30B, 31A-31B, 및 32A-32B에 의해 뒷받침된다. 서열 변형을 완전히 해독하기 위해 개별적인 대립유전자의 클로닝이 수행될 것이다. 그러나, 태아의 표현형, DNA 시퀀싱, 및 기능 분석은 태아 돼지에서 이중대립 GGTA1 및 NLRC5 유전자 변형의 생성을 뒷받침한다.
인간 면역 세포의 증식에 대한 유전자 넉아웃의 영향
다음으로, 임신 1의 태아 3으로부터의 세포에 대해, 공동-배양 분석을 수행하여 인간 면역 세포의 증식에 대한 감소된 MHC 클래스 I 발현의 영향을 평가하하였다.
혼합 림프구 반응( MLR )
공동-배양을 평평한 바닥 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 카복시플루오로레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)(2.5μM/ml)로 표지된 인간 PBMC를 0.3-0.9 × 105 세포/웰에서 반응자(responder)로 사용하였다. 0.1-0.3 × 105 세포/웰의 야생형 또는 돼지 섬유아세포(야생형 돼지 또는 GGTA1/NLRC5 넉아웃 태아로부터)를 1:1, 1:5 및 1:10의 자극자-반응자 비율에서 자극자(stimulator)로서 사용하였다. MLR 공동-배양을 모든 MLR 분석에서 4일 동안 수행하였다. 또 다른 병렬 실험에서, 총 PBMC 세포를 양성 대조군으로서 피토해마글루티닌(PHA)(2ug/ml)으로 자극시켰다.
배양된 세포를 세척하고 항-CD3 항체, 항-CD4 항체 및 항-CD8 항체로 염색한 후 포름알데하이드로 고정시키고 세척하였다. BD FACS Canto II 유세포분석기를 사용하여 변형되지 않은 돼지 섬유아세포 세포와 비교하여 GGTA1/NLRC5 넉아웃 태아로부터의 섬유아세포에 대해 반응한 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 증식능을 평가하였다. 데이터를 FACS diva/Flow Jo 소프트웨어(Tri star, San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석하고, 백분율 CFSE dim/low를 미리 게이팅된(pre gated) CD8 T 세포 및 CD4 T 세포 상에서 결정하였다.
야생형 및 GGTA1/NLRC5 넉아웃 태아 세포에 대한 인간 CD8+ 세포 및 CD4+ T 세포의 증식 반응이 도 33A- 33B 에 나타나 있다. 증식의 평가 전에 세포를 CD4+ 또는 CD8+로서 게이팅하였다(도 33A). 야생형 태아 세포와 비교하여, CD8 T 세포 증식은 GGTA1/NLRC5 넉아웃 섬유아세포를 갖는 태아 세포에 의한 처리 자극 후 감소되었다. 인간 반응자가 1:1 비율로 GGTA1/NLRC5 넉아웃 태아 세포로 처리되었을 때 CD8+ T 세포 증식의 거의 55% 감소가 관찰되었다(도 33B). 야생형 태아 세포는 인간 CD8+ T 세포에서 17.2% 증식을 유발한 반면, 태아 3(임신 1)으로부터의 GGTA1/NLRC5 넉아웃 태아 세포는 단지 7.6% 증식을 유도하였다(도 33B). 야생형 태아 세포와 비교하여 1:5 및 1:10 비율에서 CD8+ T 세포 증식 반응에서 차이가 관찰되지 않았다(도 33B). 야생형 태아 세포와 비교하여 GGTA1/NLRC5 넉아웃에 대한 반응으로 CD4+ T 세포 증식에서 변화가 관찰되지 않았다(도 33B).
일부 구현예가 본원에 나타나고 설명되었지만, 그러한 구현예는 단지 예로서 제공된다. 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 다양한 변형, 변화 및 치환이 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용될 것임이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA <120> GENETICALLY MODIFIED CELLS, TISSUES, AND ORGANS FOR TREATING DISEASE <130> 47190-701.601 <140> <141> <150> 62/253,493 <151> 2015-11-10 <150> 62/090,037 <151> 2014-12-10 <160> 198 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 gctgtggcat atggcagttc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 tccatgtata agtctttta 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 ggcaatgcca gatcctcaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 tgtctgatgt ctttctcatg 20 <210> 5 <211> 2662 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> modified_base <222> (616)..(715) <223> a, c, t, g, unknown or 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Gly Thr 340 345 350 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 cgcctagaga agaggctgtg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 ctgctgtggc tgtggtgtag 20 <210> 37 <211> 1341 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 37 ggaactcgga gaggtctccg ctaggctggt gtcgggttac ctgctcatct tcccgaaaat 60 gatggcgttt tgcgcgctgc gcaaggcact tccctgccgt cccgagaatc ccttttcttc 120 gaggtgcttc gttgagattc tttgggtgtc gttggcccta gtgttcctgc ttcccatgcc 180 ctcagatgcc tgtgatgagc caccgaagtt tgaaagcatg cggccccaat ttttgaatac 240 cacttacaga cctggagacc gtgtagagta tgaatgtcgc cccgggttcc agcccatggt 300 tcctgcgctt cccacctttt ccgtctgtca ggacgataat acgtggtcac ccctccagga 360 ggcttgtcga cgaaaagcct gttcgaatct accagacccg ttaaatggcc aagttagcta 420 cccaaatggg gatatgctgt ttggttcaaa ggctcagttt acctgtaaca ctggttttta 480 cataattgga gccgagactg tgtattgtca ggtttctggg aatgttatgg cctggagtga 540 gccctccccg ctatgtgaga agattttgtg taaaccacct ggcgaaattc caaatggaaa 600 atacaccaat agccataagg atgtatttga atacaatgaa gtagtaactt acagttgtct 660 ttcttcaact ggaccggatg aattttcact tgttggagag agcagccttt tttgtattgg 720 gaaggacgag tggagtagtg acccccctga gtgtaaagtg gtcaaatgtc catatccagt 780 agtcccaaat ggagaaattg tatcaggatt tggatcaaaa ttttactaca aagcagaggt 840 tgtatttaaa tgcaatgctg gttttaccct tcatggcaga gacacaattg tctgcggtgc 900 aaacagcacg tgggagcctg agatgcccca atgtatcaaa gattccaagc ctactgatcc 960 acctgcaacc ccaggaccaa gccatccagg acctcccagt cccagtgatg catcaccacc 1020 taaagatgct gagagtttag atggaggaat catcgctgca attgttgtgg gcgtcttagc 1080 tgccattgca gtaattgctg gtggtgtata cttttttcat cataaataca acaagaaaag 1140 gtcgaagtaa aactgatgtg cttaaagtaa aagttgctga gaggacgtgg aatccagccc 1200 cttccctctc ctgtgctgct gcctgggtcc cgttttgcat gtcatgactg tgtgcttcca 1260 aaaaatgcct tttgttcgta tttttttgcc taaacgcatg attttgtctc tacttgaatt 1320 aaatcatcac tgaatccacg c 1341 <210> 38 <211> 1546 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 38 cggcacgaga tttcgtctta atcgcggagg tcgcagagtc cgggagccgc tcggggtccc 60 cgttcccgcg cgccatgagt cccctgccgc ggagcgcccc cgcggtgagg cgcctaatgg 120 gcggacagac gccgccgccg ctgctgctgc tgctgctgct gctgtgtatc ccggctgcgc 180 agggtgactg cagccttcca cccgatgtac ctaatgccca accagatttg cgaggtcttg 240 caagttttcc tgaacaaacc acaataacat acaaatgtaa caaaggcttt gtcaaagttc 300 ctggcatggc agactcagtg ctctgtctta atgataaatg gtcagaagtt gcagaatttt 360 gtaatcgtag ctgtgatgtt ccaaccaggc tacattttgc atctcttaaa aagtcttaca 420 gcaaacagaa ttatttccca gagggtttca ccgtggaata tgagtgccgt aagggctata 480 aaagggatct tactctatca gaaaaactaa cttgccttca gaattttacg tggtccaaac 540 ctgatgaatt ttgcaaaaaa aaacaatgtc cgactcctgg agaactaaaa aatggtcatg 600 tcaatataac aactgacttg ttatttggcg catccatctt tttctcatgt aacgcagggt 660 acagactagt tggtgcaact tctagttact gttttgccat agcaaatgat gttgagtgga 720 gtgatccatt gccagaatgc caagaaattt ctccaactgt caaagccata ccagctgttg 780 agaaacccat cacagtaaat tttccagcaa caaagtatcc agctattccc agggccacaa 840 cgagttttca ttcaagtaca tctaaaaatc gaggaaaccc ttcttcaggc atgagaatca 900 tgtcgtctgg taccatgcta cttattgcag gaggtgttgc tgttattata ataattgttg 960 ccctaattct agccaaaggt ttctggcact atggaaaatc aggctcttac cacactcatg 1020 agaacaacaa agccgttaat gttgcatttt ataatttacc tgcgactggc gatgccgcag 1080 atgtaagacc tggtaattaa caaaaggacg gtgcatgtgt aacactgaca gttttgctta 1140 tggtgctagt aaccattggc tagctgactt agccaaagaa gagttaagaa gaaagtgcac 1200 acaagtacac agaatatttt cagtttctta gaactttcag gtggagtgga catagtttgt 1260 ggatagtgtt cttcgttttg catgttttca ttgtctctaa ggtacatagg aatgtcacag 1320 aaccaaagag aaacaaatct atcctgaaat tacatcctca acactcctaa gactcttgaa 1380 aatagaacag ctcataagat tgagagcaat tactttccaa aaagggtgag aaaatggaga 1440 gatttgttca tggttagaat ataagaaaaa agaaaacaaa aaggtgattt ttcccaccaa 1500 atgtgtaatg ttatttttat taataaagga aaaaaaaaaa aaaaaa 1546 <210> 39 <211> 773 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 39 gaaaagacgc gcaggccggg ccgctctccc gacggggagt agcgctgcag ccggacgcag 60 ggtgcagtta gaatccatag acggtcacga 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120 cgggtcggtc accgcagttc tggccgcctc tcggtcctcc cgttcccttt tatggatctc 180 cgcgcagaca tcgccatacg tccggtgtgt gcaccgcgaa gaatccagaa acatgtccgt 240 cgttttcagg gcccaagaca t 261 <210> 41 <211> 1578 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 agtgtggtac tttgtcttga ggagatgtcc tggactcaca cggaaactta gggctacgga 60 atgaagttct cactcccatt aggtgacagg tttttagaga agccaatcag cgtcgccgcg 120 gtcctggttc taaagtcctc gctcacccac ccggactcat tctccccaga cgccaaggat 180 ggtggtcatg gcgccccgaa ccctcttcct gctgctctcg ggggccctga ccctgaccga 240 gacctgggcg ggctcccact ccatgaggta tttcagcgcc gccgtgtccc ggcccggccg 300 cggggagccc cgcttcatcg ccatgggcta cgtggacgac acgcagttcg tgcggttcga 360 cagcgactcg gcgtgtccga ggatggagcc gcgggcgccg tgggtggagc aggaggggcc 420 ggagtattgg gaagaggaga cacggaacac caaggcccac gcacagactg acagaatgaa 480 cctgcagacc ctgcgcggct actacaacca gagcgaggcc agttctcaca ccctccagtg 540 gatgattggc tgcgacctgg ggtccgacgg acgcctcctc cgcgggtatg aacagtatgc 600 ctacgatggc aaggattacc tcgccctgaa cgaggacctg cgctcctgga ccgcagcgga 660 cactgcggct cagatctcca agcgcaagtg tgaggcggcc aatgtggctg aacaaaggag 720 agcctacctg gagggcacgt gcgtggagtg gctccacaga tacctggaga acgggaagga 780 gatgctgcag cgcgcggacc cccccaagac acacgtgacc caccaccctg tctttgacta 840 tgaggccacc ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct gcggagatca tactgacctg 900 gcagcgggat ggggaggacc agacccagga cgtggagctc gtggagacca ggcctgcagg 960 ggatggaacc ttccagaagt gggcagctgt ggtggtgcct tctggagagg agcagagata 1020 cacgtgccat gtgcagcatg aggggctgcc ggagcccctc atgctgagat ggaagcagtc 1080 ttccctgccc accatcccca tcatgggtat cgttgctggc ctggttgtcc ttgcagctgt 1140 agtcactgga gctgcggtcg ctgctgtgct gtggagaaag aagagctcag attgaaaagg 1200 agggagctac tctcaggctg caatgtgaaa cagctgccct gtgtgggact gagtggcaag 1260 tccctttgtg acttcaagaa ccctgactcc tctttgtgca gagaccagcc cacccctgtg 1320 cccaccatga ccctcttcct catgctgaac tgcattcctt ccccaatcac ctttcctgtt 1380 ccagaaaagg ggctgggatg tctccgtctc tgtctcaaat ttgtggtcca ctgagctata 1440 acttacttct gtattaaaat tagaatctga gtataaattt actttttcaa attatttcca 1500 agagagattg 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oligonucleotide <400> 66 ggttccattg caagatgggc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 gtcccctcct gagtgtcgaa 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 gcctcaggta cagatcaaaa 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 ggacctgggt gccaggaacg 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 gtacccagag tcagatcacc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 gtacccagag tcagatcacc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 aaaacggtga tctgactctg ggtacg 26 <210> 97 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 acaccgtacc cagagtcaga tcaccg 26 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 aaaacggtga tctgactctg ggtacg 26 <210> 99 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 acaccgtgcc cttcgacact caggag 26 <210> 100 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 aaaactcctg agtgtcgaag ggcacg 26 <210> 101 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 acaccgtgcc cttcgacact caggag 26 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 aaaactcctg agtgtcgaag ggcacg 26 <210> 103 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 acaccgtgcc cttcgacact caggag 26 <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 aaaactcctg agtgtcgaag ggcacg 26 <210> 105 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 acaccggggg ccccaaggca gaagag 26 <210> 106 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 aaaactcttc tgccttgggg cccccg 26 <210> 107 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 acaccggcag tcttccagta cctggg 26 <210> 108 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 aaaacccagg tactggaaga ctgccg 26 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 caccgagaaa ataatgaatg tcaa 24 <210> 110 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 aaacttgaca ttcattattt tctc 24 <210> 111 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 caccgagtaa ggtacgtgat ctgt 24 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 aaacacagat cacgtacctt actc 24 <210> 113 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 acaccgcaag gggatattcg ggtttg 26 <210> 114 <211> 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 132 agtgtctctg tctccagtat ct 22 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 133 ttggtaaata gcaatcaact cagtg 25 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 134 tttctgctca agtcacactg a 21 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 135 caagcaatga caacaacctg ata 23 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 136 ttgctttctc ctgatcccat ag 22 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 137 cagtgctaat ctagagcact acc 23 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 138 cattctcctg aagagctcag aat 23 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 139 tccattgggc tttgtctata ctt 23 <210> 140 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 140 gacaaaggaa attagcagag aacc 24 <210> 141 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 141 aactggtctt tcccttggat att 23 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 142 ctggctgcag catcaatatc 20 <210> 143 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 143 gcctctatta attgcctttc cc 22 <210> 144 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 144 ccattcactt cgcatccct 19 <210> 145 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 145 cgggaagtcg ggagcata 18 <210> 146 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 146 gaggagaagc ggccaatc 18 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 147 ctgctcttct cttgtcactg att 23 <210> 148 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 148 gcgggagcca ctttcac 17 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 149 tctgattggc tgctgaagtc 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 150 cgagagcagg tagagctagt 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 157 gacctctggg ttccattggg 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 158 caaagcccaa tggaacccag 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 159 gaaggggctt tcccaacagt 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 160 gcccaagaca gggaaaacga 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 161 tgacaactct ggtcgctctg 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 162 cagagagcct cggctaggta 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 163 aatggctccg tccgtattcc 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 164 gggaagtcgg gagcatatcg 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 165 cactcccgag gctgtaactg 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 atggcgtgtt ttggttggag 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 167 ggagccactt tcactgaccc 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 168 gggagggtca gtgaaagtgg 20 <210> 169 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 169 gagggccgta ccaaagacc 19 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 170 ggtcccaaat gagcgaaacc 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 171 gggtccgaga gcaggtagag 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 172 ccgcctgaag gacgagacta 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 cagggcggtc cttaggaaaa 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 174 gggagtgccg caataccttt 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 175 gaaattgggc tcgtcctcgt 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 176 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 183 ttgcagatga ttgcttcctt tc 22 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 184 agggggtaca cattctcctg a 21 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 185 gacctctggg ttccattggg 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 186 gaaggggctt tcccaacagt 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 187 gtggcgtatg ccccagtatc 20 <210> 188 <211> 4524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 188 aagaaatttt tcccaaatag ggggtacaca ttctcctgaa gagctcagaa tactcaactc 60 agctggatcc tactcaaagt attgctaaat aacatctgcc 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<223> a, c, t, g, unknown or other <400> 192 attcctttct tatttccttt tgtgtatatc ctatagctat tttctttgga gttgtcatgg 60 ggattacatt taacatccta aaattataaa acttaaatta gaatttatac cagtttaact 120 tcaataaaac accaaaactc tgttccttta cagctgtctc cccatctctt gtagttgttg 180 atatcacaaa attgcatctt tgtacattgt gtgccccaag acataaacta ataattcttn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tttttaatta ttagcaacaa 360 attggagtac aagtataatg atctggcttt agaaaggaat ttattaaatg gttgtttgtt 420 tattantaat ttggtctttt gtcttagggg ctgcactcac ggcatatgga gttctcaagg 480 ctaggatcca atcggaactg tagccaccag cctacaccag aggcacagca acacaggatc 540 caagccacat ctgtgaccta caccacagct catggcaatg ctggatcctt aacncactga 600 gcgaggccag ggatcaaacc tgcatcctca tggttcctag ttggatttgt ttttgctgca 660 cttataggaa ctcccatatt taaattttta attttatttt taaaaaatta tttttattaa 720 agtatagttg atttacagtg ctgtgaaaat ttctgctgta cagcaaagtg attcatatat 780 atgagacatt catatatata tatacacata tatacatata 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Claims (148)

  1. 유전적으로 변형된 돼지로서, NOD 유사 수용체 패밀리 CARD 도메인 함유 5(NLRC-5)를 코딩하는 유전자의 파괴를 포함하고,
    상기 NLRC-5를 코딩하는 유전자의 파괴는 상기 유전자의 표적 서열에서 뉴클레아제 매개된 이중 가닥 절단이고, 상기 표적 서열은 프로토스페이서(protospacer)-인접 모티프(PAM) 서열의 20개 뉴클레오티드 이내에 위치하고,
    상기 유전적으로 변형된 돼지 유래의 세포가, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 공동 배양될 경우, 시험관내 혼합 림프구 반응 분석에 의해 측정할 때, 상기 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물 유래의 세포와 비교하여, 사이토카인 인터루킨 6(IL-6)의 생성 감소 및 CD8+ T 세포 면역 반응의 저감을 유도하는 것인 유전적으로 변형된 돼지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 돼지가 주조직적합성 복합체(MHC) I 분자를 발현하고, 상기 유전적으로 변형된 돼지가, 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 동물과 비교하여 상기 MHC I 분자의 감소된 발현을 갖는 것인 유전적으로 변형된 돼지.
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  5. 제1항에 있어서, 당단백질 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1)을 코딩하는 유전자, 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH)을 코딩하는 유전자, β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(B4GalNT2)를 코딩하는 유전자, 또는 이들의 조합의 파괴를 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 돼지.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 돼지가 인간에게서 발현되지 않는 내인성 유전자의 감소된 단백질 발현을 추가로 포함하고, 인간에게서 발현되지 않는 상기 내인성 유전자가 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1), β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(B4GalNT2), 또는 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH)인 유전적으로 변형된 돼지.
  7. 제1항에 있어서, 인간 백혈구 항원 G(HLA-G) 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 돼지.
  8. 제7항에 있어서, 상기 HLA-G가 HLA-G1인 유전적으로 변형된 돼지.
  9. 제1항의 유전적으로 변형된 돼지를 둘 이상 포함하는, 유전적으로 변형된 돼지의 집단.
  10. 제1항의 유전적으로 변형된 돼지로부터 단리된 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 돼지 유래의 상기 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기가 GGTA1을 코딩하는 유전자의 파괴를 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기.
  12. NOD 유사 수용체 패밀리 CARD 도메인 함유 5(NLRC-5)를 코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 유전적으로 변형된 세포로서, 상기 NLRC-5를 코딩하는 유전자의 파괴는 상기 유전자의 표적 서열에서 뉴클레아제 매개된 이중 가닥 절단이고, 상기 표적 서열은 프로토스페이서(protospacer)-인접 모티프(PAM) 서열의 20개 뉴클레오티드 이내에 위치하고,
    상기 유전적으로 변형된 세포가 인간 세포 또는 돼지 유래의 세포인 것인 유전적으로 변형된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 세포가, 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 세포와 비교하여 MHC I 분자의 감소된 발현을 가지며, 상기 유전적으로 변형된 세포가, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 공동 배양될 경우, 시험관내 혼합 림프구 반응 분석에 의해 측정할 때, 상기 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 세포와 비교하여, 사이토카인 인터루킨 6(IL-6)의 생성 감소 및 CD8+ T 세포 면역 반응의 저감을 유도하는 것인 유전적으로 변형된 세포.
  14. 제12항에 있어서, 추정상의 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유사 단백질(CMAH)을 코딩하는 유전자, β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(B4GalNT2)를 코딩하는 유전자, 갈락토실트랜스퍼라제 알파 1,3(GGTA1)을 코딩하는 유전자, 또는 이들의 조합의 파괴를 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 세포.
  15. 제12항에 있어서, 인간 백혈구 항원 G(HLA-G) 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질 또는 이의 기능성 단편을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 HLA-G가 HLA-G1 또는 이의 기능성 단편인 유전적으로 변형된 세포.
  17. 제12항에 있어서, β-2-마이크로글로불린(B2M) 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 세포.
  18. 제12항에 있어서, 인간 줄기 세포인 유전적으로 변형된 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 인간 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 또는 분화된 줄기 세포인 유전적으로 변형된 세포.
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  23. 치료를 필요로 하는 대상체의 병태를 치료하기 위한, 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 상기 병태를 치료하기 위해 상기 대상체에게 투여되며, 상기 대상체는 관용화 백신을 투여받았거나 관용화 백신이 순차적으로 또는 동시에 투여될 것이며, 상기 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기는 돼지 유래의 것이고 NLRC-5를 코딩하는 유전자의 파괴를 포함하고,
    상기 NLRC-5를 코딩하는 유전자의 파괴는 상기 유전자의 표적 서열에서 뉴클레아제 매개된 이중 가닥 절단이고, 상기 표적 서열은 프로토스페이서(protospacer)-인접 모티프(PAM) 서열의 20개 뉴클레오티드 이내에 위치하는 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기가 HMC I 분자를 발현하고, 상기 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기가 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 세포, 조직, 또는 장기와 비교하여, 상기 MHC I 분자의 감소된 발현을 가지며, 상기 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기가, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 공동 배양될 경우, 시험관내 혼합 림프구 반응 분석에 의해 측정할 때, 상기 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 세포, 조직, 또는 장기와 비교하여, 사이토카인 인터루킨 6(IL-6)의 생성 감소 및 CD8+ T 세포 면역 반응의 저감을 유도하는 것인 조성물.
  25. 제23항에 있어서, T 세포 활성화, B 세포 활성화, 수지상 세포 활성화, 또는 이들의 임의의 조합을 억제하는 1종 이상의 약학 제제가 상기 대상체에게 추가로 투여되는 것인 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 1종 이상의 약학 제제가 항-CD40 작용제 또는 항-CD40L 작용제를 포함하는 것인 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 세포, 조직, 또는 장기가 GGTA1을 코딩하는 유전자의 파괴를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  28. 유전적으로 변형된 돼지를 생산하는 방법으로서,
    a) CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 돼지 태아 섬유아세포 내의 NLRC-5를 코딩하는 유전자를 파괴하는 단계로서, 상기 NLRC-5를 코딩하는 유전자의 파괴는 상기 유전자의 표적 서열에서 뉴클레아제 매개된 이중 가닥 절단이고, 상기 표적 서열은 프로토스페이서(protospacer)-인접 모티프(PAM) 서열의 20개 뉴클레오티드 이내에 위치하는 단계;
    b) 상기 돼지 태아 섬유아세포의 핵을, 돼지의 제핵 난모세포에 이식하여 배아를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 배아를 대리모 돼지에게 착상시켜 상기 배아를 상기 대리모 돼지에서 상기 유전적으로 변형된 돼지로 성장시키는 단계로서, 상기 유전적으로 변형된 돼지는 MHC I 분자를 발현하고, 상기 유전적으로 변형된 돼지는 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 돼지와 비교하여 상기 MHC I 분자의 감소된 발현을 가지며, 상기 유전적으로 변형된 돼지 유래의 세포는, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 공동 배양될 경우, 시험관내 혼합 림프구 반응 분석에 의해 측정할 때, 상기 유전적으로 변형되지 않은 카운터파트 돼지 유래의 세포와 비교하여, 사이토카인 인터루킨 6(IL-6)의 생성 감소 및 CD8+ T 세포 면역 반응의 저감을 유도하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 돼지 태아 섬유아세포가 GGTA1을 코딩하는 유전자의 파괴를 추가로 포함하는 것인 방법.
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