KR102348985B1 - 알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도 Download PDF

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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트
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Abstract

알파-1 안티트립신(AAT) 융합 단백질 또는 이의 펩티드 유도체를 제조 및 사용하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 상기 조성물 및 방법은 AAT 요법 또는 치료를 필요로 하는 개체를 치료하기 위한 약학적으로 허용가능한 조성물로의 용도로 AAT 융합 분자를 생성하는 것에 관련된다. 본 발명에 개시된 조성물 및 방법은 면역 단편에 AAT 또는 이의 유도체를 연결하는 것에 관한 것이다.

Description

알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도{COMPOSITIONS, METHODS AND USES FOR ALPHA-1 ANTITRYPSIN FUSION MOLECULES}
우선권
본 출원은 2012년 1월 10일자로 출원된 미국 가출원 61/585,182, 및 2012년 1월 12일에 출원된 미국 가출원 61/586,038, 및 2012년 3월 22일에 출원된 미국 가출원 61/614,391에 대하여 우선권을 주장하고, 상기 출원은 모든 목적을 위하여 그것의 전체에 있어서 참조로서 본 발명에 포함된다.
분야
본 명세서에 있어서 구현예는 재조합 알파-1 안티트립신(α-1 안티트립신, AAT)에 대한 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 재조합 AAT는 AAT의 다른 형태보다 더 용이하게 단리될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 재조합 AAT는 자연적으로 발생하는 AAT 또는 AAT의 다른 상업적 제형(formulation)에 비해 향상된 항염증 및 항면역 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에 있어서, 10배, 100배 또는 심지어 1000배 더 적은 재조합 AAT(rAAT) 또는 AAT 융합 분자는 개체에서 증상 또는 질환의 예방 또는 치료용 AAT의 임의의 및 모든 현재 형태를 대신해서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, AAT 융합 분자는 감염 또는 다른 건강 상태와 같은 증상을 갖는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 보고된 또 다른 구현예는 심근 징후(myocardial indication), 당뇨, 염증성 장질환, 이식 거부 또는 다른 알려진 AAT-반응성 증상 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
AAT
알파-1 안티트립신(AAT)의 정상 혈장 농도는 1.3 이상 3.5㎎/㎖ 이하의 범위이다. 어떤 조건하에서, AAT는 조직 공간으로 쉽게 확산되고 표적 프로테아제, 특히 호중구 엘라스타제와 1:1 복합체를 형성한다. 트립신, 키모트립신, 카텝신 G, 플라스민, 트롬빈, 조직 칼리크레인, 및 인자 Xa와 같은 다른 효소들은 또한 기질로서 작용할 수 있다. 그런 다음 상기 효소/억제제 복합체는 세르핀-효소 복합체(serpin-enzyme complex, SEC) 수용체에 결합함으로써 혈액순환에서 제거되고 간 및 비장에 의해 대사된다.
본 명세서에 있어서 구현예는 상업적으로 입수가능한 AAT 조성물보다 뛰어난 특성을 갖는 알파-1 안티트립신(AAT)의 재조합 구조체(construct)의 생성 및 용도를 제시한다. 다른 구현예는 치료학적 용도를 위한 재조합 AAT 산물의 정제 및 스케일링 업(scaling-up) 방법을 제시한다. 이러한 구현예에 따르면, 재조합 AAT는 임의의 AAT 관련 활성, 예를 들어, 항염증제, 면역조절제 및/또는 세린 프로테아제 억제제로서의 용도를 위해 단리될 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 재조합 AAT는 본 기술분야에 공지된 임의의 재조합 기술에 의해 생성된 전장 분자 또는 이의 카르복시 말단 펩티드 유도체를 포함한다. 일부 구현예는, 예를 들어, AAT의 신속한 정제 및 활성 보존을 위한 용도를 위하여 또는 AAT 또는 그것의 펩티드의 활성을 증가시키기 위하여, AAT와 연결된 면역학적 요소를 갖는 AAT 또는 이의 카르복시 말단 유도체를 포함하는 구조체에 관한 것이다. 다른 구현예는 면역학적 요소(예를 들어, Fc 단편)와 각각 연결된 AAT 분자를 갖고 하나의 단위로서 함께 정제된 하나 이상의 구조체의 동시 합성에 관한 것이다. 다른 구현예는, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물용 구조체를 형성하기 위한 하나 이상의 면역 분자와 연결된 분자의 마지막 80개 아미노산의 단편 또는 이의 하위 단편(예를 들어, 약 40개, 약 30개, 약 20개 또는 약 10개 아미노산, 또는 약 5개 아미노산)을 포함하는, AAT의 하나 이상의 카르복시 말단 유도체(들) 또는 단편(들)의 구조체 생성, 방법 및 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 고려되는 구조체의 AAT 분자는 자연적으로 발생하는 알파-1 안티트립신(예를 들어, 인간) 또는 AAT의 가장 풍부한 형태 또는 이의 다른 자연적으로 발생하는 형태, 또는 이의 단편, 또는 유도체, 또는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 AAT의 돌연변이 형태, 또는 이의 대립유전자(예를 들어, 약 100개의 자연적으로 발생하는 AAT 변이체가 있고, 임의의 이러한 변이체는 본 명세서에 개시된 구조체에 사용될 수 있다), 또는 이의 유사체 또는 이의 융합 단백질(예를 들어, 인간 IgG 또는 인간 IgG의 단편)에 관한 것일 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 최종 구조체는 면역학적 단편(예를 들어, Fc 단편)과 각각 연결된 2개의 AAT 구조체를 포함할 수 있고, 상기 AAT-면역 단편 구조체는 이황화 결합에 의해 함께 결합되어 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결된 이중 AAT 면역 단편 구조체를 형성한다(예를 들어, 도 1 및 도 2 참조). 본 명세서에 개시된 어떤 방법에서, 면역 분자에 결합된 AAT- 또는 AAT-펩티드의 신속한 정제는 AAT 활성의 비활성화를 상당히 감소시키고, 정제하는 시간을 감소시켰다. 신속한 정제는 상기 구조체의 중요한 활성을 보존하면서 다수의 정제 과정을 생략한다. 예를 들어, 이러한 신속하게 정제된 융합 분자는 대조군 혈장 유래 AAT(예를 들어, 자연적으로 발생한 AAT의 일반적인 정제 및 상업적으로 입수가능한 방식의 정제)에 비해 사이토카인 저해 기능의 유지가 가능하고, 면역 및 염증성 분자 생산을 조절한다. 상당히 감소된 농도의 융합 분자가 동일하거나 개선된 조절 기능을 달성하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 융합 분자가 Fc-AAT의 Fc 영역이 절단된(truncated) 힌지(hinge) 또는 결실된 힌지 영역을 가지는 경우, 혈장 유래 AAT 또는 온전한 Fc가 있는 Fc-AAT의 융합 분자와 비교할 때 뛰어난 활성을 갖는다.
이러한 구현예에 따르면, 두 개 이상의 AAT-Fc(힌지 결실/절단) 구조체(또는 카르복시 말단 AAT 펩티드 단편)를 포함하는 단위가 정제될 수 있고, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에 이용될 수 있다. Fc-huAAT(힌지 결실)의 이러한 구현예의 일부는 본 명세서에서 고려된 임의의 방법 또는 조성물에 사용될 수 있다. 다른 구현예는 상기 AAT 분자의 활성을 보존하기 위하여 신속 정제 방법에 의해 정제된 AAT 분자에 결합된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 단편(힌지가 절단되거나 결실된)을 이용하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 어떤 구현예는 혈장 AAT 정제에서 사용된 것과 같은 다른 방법의 유해한 효과 및 다수의 단계를 방지하기 위하여 Fc 융합 구조체의 최소 단계(예를 들어, 한 단계) 정제를 위해 단백질 A를 이용하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에서 일부 구현예는 상업적으로 입수가능한 제품(예를 들어, Aralast™, Prolastin™)에 사용되는 표준 정제에 비해 및/또는 혈액 혈장에서 발견되는 자연적으로 발생하는 AAT에 비해 상기 융합 분자의 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 AAT의 항염증 활성을 보존하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 출원의 융합 분자는 상업적으로 입수가능한 제형에 비해 염증을 감소시키거나 증상을 치료하는 활성이 100배 내지 1000배로 나타났다. 다른 구현예에서, 상기 Fc 부분이 절단되거나 결실된 힌지 영역을 가지는 AAT-Fc는 온전한 Fc를 갖는 Fc-AAT 보다 체내에서 뛰어난 활성을 나타냈다.
본 명세서에 있어서, 혈장 유래 AAT와 유사하고 어떤 구현예에 있어서는 이보다 더 뛰어난 활성을 갖는 구조체를 제조 및 회수하는 방법이 개시된다. AAT에 대해 관심있는 것으로 알려진 어떤 활성은 면역조절 또는 염증 조절 활성을 포함한다. 기재된 구조체는 단리되고, 세린 프로테아제 억제제 활성이 아닌 활성에 대해 평가되는 것이 본 명세서에서 고려된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 구조체는 상업적으로 입수가능한 조성물에 비해 IL-1 수용체 길항제 활성을 증가시키고, IL-1β 생성뿐만 아니라 다른 전-염증성 사이토카인을 감소시킨다.
어떤 구현예에 있어서, 조성물(예를 들어, 구조체 조성물) 및 방법은 개체에 대한 방사선의 부작용을 조절하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 조성물 및 방법은, 예를 들어, 암에 걸렸거나 악성 종양이 발생한 것으로 의심되는 개체에게 또는 조절되지 않는 세포 성장에 대해 투여될 경우, 방사선 치료 또는 방사선을 받은 개체의 치료에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 다른 구현예는, 예를 들어, 사고에 의해 또는 목적 있는 행동에 의해, 방사선에 노출된 개체의 치료에 관한 것이다.
일부 구현예는 AAT 치료를 필요로 하는 개체에게 재조합 기술을 사용하여 생성된 AAT의 투여에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 개체는 AAT 결핍, 염증 또는 면역 증상 또는 본 기술분야에 공지된 다른 AAT 관련 증상을 가질 수 있다. 본 명세서에 있어서 어떤 구현예는 적어도 하나의 구조체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 갖는 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 개체에 투여된 용량(dose)은 상업적으로 입수가능한 제형에 비해 상기 개체에 대한(예를 들어, Fc-AAT3 구조체의) 용량에 있어서 10배, 100배 또는 1,000배 감소를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 용량은 10 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏(Aralast™ 또는 Prolastin C™와 같이 주로 사용되는 상업적으로 입수가능한 AAT의 농도)에 비해 개체에 대하여 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 허혈 재관류의 부작용의 감소에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 본 명세서의 조성물은 심근경색증 또는 신부전증 또는 다른 증상의 결과로서 허혈 재관류 손상의 영향을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 보고된 융합 구조체는 심장 조직 리모델링(예를 들어, 심장 조직의 확장 및 괴사), 예를 들어, 좌 또는 우심실(left or right venticular, LV) 리모델링의 개시 또는 진행을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 본 발명은 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물을 투여함으로써, 심근 손상을 야기할 수 있는 심장 사건의 전, 동안, 또는 후에 개시, 중증도(예를 들어, 손상) 또는 진행을 조절할 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 초기 또는 후기 심근경색 크기를 감소시키기 위하여 심장 증상을 갖는 개체에 투여될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 초기 심근경색은 수술 또는 다른 심장 사건 전(예를 들어, 기준치), 동안 또는 그 후 48시간 이내에 측정된 것일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 후기 심근경색은 수술 또는 다른 심장 사건 뒤 48시간 후 또는 수일 또는 수주일까지, 예를 들어 심장 사건 뒤 7일 후일 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은, 심장 사건의 결과로서 심장 확장 및 기능장애를 조절하기 위하여 이러한 조성물로 치료되지 않은 개체에 비해 약 5%, 또는 약 10%, 또는 약 15%, 또는 약 20% 또는 약 25%, 또는 약 30% 이상 또는 그 이상으로 심장 사건(예를 들어, 심근경색증)을 갖는 개체의 치료에 사용될 수 있다.
어떤 구현예는 심장 사건에 걸린 개체의 치료용 조성물에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 조성물은 AAT-Fc(힌지 결실 또는 절단)(예를 들어, 인간 AAT 또는 이의 단편), 또는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 이의 돌연변이체, 또는 이의 대립유전자(예를 들어, 약 100개의 자연적으로 발생하는 AAT 변이체가 있음), 또는 이의 유사체 또는 이의 융합 단백질(예를 들어, 인간 IgG 또는 인간 IgG의 단편(Fc))을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 LV 리모델링을 조절하기 위하여 자연적으로 발생하는 AAT를 심장 사건에 걸렸거나 걸린 적이 있는 개체에 투여하는 것에 관한 것이다. 다른 구현예는 예를 들어, 394 AA의 자연적으로 발생하는 AAT(서열번호 1 및 33)의 마지막 80개 아미노산 단편을 포함하는 AAT의 하나 이상의 카르복시 말단 유도체(들) 또는 단편(들)의 조성물을 투여하는 것에 관할 것일 수 있다. 일부 구현예는 심장 사건을 개선하기 위하여 심장 사건에 걸린 개체를 본 명세서에 개시된 재조합으로 제조된 AAT 융합 펩티드로 치료하는 것에 관한 것이다.
다른 구현예는 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하여 감염(예를 들어 세균 또는 바이러스 감염)에 걸린 개체를 치료하거나 또는 개체가 감염되는 것을 예방하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 바이러스 감염은 HIV 또는 인플루엔자(예를 들어, H1N1, 인플루엔자 A 또는 B)로 인한 감염일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 세균 감염은 세균성 폐렴, 미코세균성 감염, 바실리스 앤쓰라키스(bacillis anthracis) 또는 다른 세균성 감염에 대한 노출을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 이식 거부를 감소시키거나 또는 예방하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물에 관한 것이다. 다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 이식편대숙주병(Graft versus Host disease, GVHD)의 발생 정도를 감소시키고 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 기관, 조직 또는 세포 이식의 전, 동안 또는 후에 개체를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 기관, 조직 또는 세포 배양은 이식 전 및 동안에 상기 기관, 조직 또는 세포 배양을 보존하기 위하여 Fc-AAT(힌지 결실 또는 절단) 융합 분자를 갖는 조성물에 노출될 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 투여용 조성물은 상기 제형 ㎖ 또는 ㎎ 당 약 0.1 ng과 약 10 ㎎ 사이의 범위일 수 있다. AAT 또는 펩티드로서 유사한 활성을 갖는 AAT 펩티드 또는 구조체의 치료학적 유효량은 몰농도로 측정될 수 있고 약 1 nM과 약 10 mM 사이의 범위일 수 있다. 또한 상기 제형은 약학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체와 결합하여 고려될 수 있다. 정확한 용량은 과도한 실험 없이 잘 공지된 통상적인 임상 실험에 의해 규명될 수 있다. 한 구현예에 있어서, 개체는 활성제(예를 들어, AAT 구조체 또는 이의 AAT 펩티드 유도체)의 단일 용량(예를 들어, 대조군에 비해 상기 구조체 조성물의 효능에 따라 IV 투여로 0.6 ㎎/㎏ 내지 0.8 ㎎/㎏)으로 증상이 치료될 수 있다. 이 구현예에 따르면, 상기 개체는 의료 종사자의 판단에 따라 속행(follow-on) 치료(예를 들어, 단일 용량 또는 그 이상 후의 5 내지 10일)로 치료될 수 있다. 다른 구현예는 위약(placebo)(예를 들어, 인간 혈청 알부민 투여 또는 다른 비슷한 위약)을 투여한 대조군 개체군의 사용 및 본 명세서에 개시된 조성물을 투여받은 개체군에 대한 위약 효과의 비교를 포함할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 개체가 방사선 및/또는 화학요법을 받을 때마다 개체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 일부 구현예는 암 치료를 받는 개체의 치료에 관한 것이다. 암 치료는, 이에 한정되지 않으나, 방광, 유방, 신장, 백혈병, 폐, 골수종, 지방육종, 림프종, 혀, 전립선, 위, 결장, 자궁암, 흑색종, 췌장, 눈 및 다른 공지의 암에 대한 치료를 포함한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 전립선암에 걸린 개체의 치료에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 전립선암에 걸린 남성 개체는 발기불능 또는 발기부전의 발생, 전립선암 치료의 흔한 부작용을 감소시키기 위하여 방사선 및/또는 화학요법 전, 동안 또는 후에 본 명세서에 개시된 조성물로 치료될 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 상기 개체는 포유동물이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 포유동물은 인간이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 개체는 임신한 여성 또는 영아이다. 다른 구현예에 있어서, 상기 개체는 애완동물, 집에서 길러지는 동물 또는 가축이다.
다른 구현예에 있어서, 상기 개체 또는 포유동물은 포획되거나 풀려있는 야생 동물과 같이 집에서 길러지지 않는 포유동물일 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 인간 AAT 돌연변이체를 포함하는 조성물은 제시된 방법에 사용되기 위하여 본 명세서에 개시된 구조체에 사용될 수 있다(예를 들어, AAT 융합 펩티드 유도체 또는 반응 중심 루프(Reactive Center Loop) 관련 돌연변이체 융합 폴리펩티드). 이러한 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 재조합 분자 또는 융합 단백질 구조체는 현저한 세린 프로테아제 억제 활성을 갖지 않는다. 이러한 구조체는 면역 분자(예를 들어, Fc)와 연결되어 생성될 수 있다. 상기 면역 분자와의 결합은 상기 구조체의 신속한 정제를 위하여 사용될 수 있고, 그렇게 함으로써 정제 단계를 줄여서 상기 AAT 또는 이의 카르복시 말단의 활성을 보존할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 정제 단계는 친화성 방법(예를 들어, 단백질 A)을 사용한 단일 단계이다. 이러한 방법은 다른 상업적으로 입수가능한 제형(예를 들어, Aralast™, Zemaira™, Prolastin C™, 및 Glassia™)에 사용되는 유해한 정제 단계를 감소시킴으로써 본 명세서에 개시된 상기 구조체의 형태를 보존한다. 다른 구현예는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 것으로 조정된 AAT 유래 단편 구조체에 관한 것이다. 본 명세서에 있어서 구조체는, 이에 한정되지 않으나, AAT에 대응하는 카르복시 말단 펩티드 또는 아미노 말단 펩티드, 이의 유사체, 세르핀-효소 복합체(SEC) 수용체에 결합하는 AAT 카르복시 말단의 임의의 유도체 또는 면역 분자(예를 들어, IgG 분자)와 연결된 이의 조합을 포함하는 구조체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 약학적 조성물은 항염증제, 면역억제제, 면역조절제, 항바이러스제, 항병원성제, 항균제, 프로테아제 억제제, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약제는, 이에 한정되지 않으나, 하나 이상의 인터페론, 베타세론, 베타-인터페론을 포함한 인터페론 유도체, 일로프로스트, 시카프로스트를 포함한 프로스탄 유도체; 코르티솔, 프레드니솔론, 메틸-프레드니솔론, 덱사메타손을 포함한 글루코코르티코이드; 사이클로스포린 A, FK-506, 메톡살렌, 탈리도마이드, 설파살라진, 아자티오프린, 메토트렉세이트를 포함한 면역억제제; 질레우톤, MK-886, WY-50295, SC-45662, SC-41661A, BI-L-357을 포함한 리폭시게나아제 억제제; 류코트리엔 길항제; ACTH 및 이의 유사체를 포함한 펩티드 유도체; 가용성 TNF-수용체; TNF-항체; 인터루킨, 다른 사이토카인, T-세포-단백질의 가용성 수용체; 인터루킨, T-세포-단백질 수용체에 대한 항체; 및 칼시포트리올; 셀셉트®, 마이코페놀레이트 모페틸, 및 이의 유사체를 단독 또는 조합으로 포함한다.
다른 구현예는 암 관련 치료를 받은 개체의 치료를 위한 병용 요법에 관한 것으로, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물은 개체에서 종양을 줄어들게 하거나 제거하는 것 또는 종양의 전이를 감소시키는 것 또는 개체에서 암의 다른 측면을 치료하는 것으로 알려진 임의의 다른 약제와 병용할 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 정상 세포 손상을 조절하기 위하여 본 명세서에 포함된 조성물을 이용한 개체의 치료는 상기 조성물로 치료받지 않은 개체에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20% 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%일 수 있다.
이와 같이, 본 기술분야의 기술자들은 이러한 개시에 기초한 사상이 본 발명의 구현예의 여러 특성 및 장점을 수행하기 위하여 다른 방법들을 설계하기 위한 기초로서 용이하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고 본 명세서에 개시된 어떤 구현예를 추가로 설명하기 위하여 포함된다. 구현예는 본 명세서에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이러한 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 어떤 구현예인 재조합 AAT의 생산을 위해 본 명세서에 개시된 일부 구현예에 대한 용도로 고려되는 AAT 구조체의 개략도를 나타낸다. 또한 AAT 펩티드 단편은 본 발명의 어떤 구현예를 사용하여 생산될 수 있다.
도 2는 본 명세서에 개시된 일부 구현예에 대한 용도로 고려되는 면역 분자와 연결된 인간 AAT 구조체의 개략도를 나타낸다.
도 3은 본 명세서에 개시된 어떤 구현예에 의해 생성되는 일부 융합 분자의 이동을 예시한 SDS-PAGE 젤을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 상업적으로 입수가능한 AAT 제형(4b)에 비해 본 발명에 개시된 어떤 AAT 융합 분자(4a)에 노출된 실험관 내 세포 모델에서 사이토카인(예를 들어, 종양 괴사 인자-알파(TNFα, tumor necrosis factor-alpha)) 생산을 히스토그램 그래프로 설명한다.
도 5a 및 5b는 AAT 융합 분자(rAAT 또는 재조합 AAT)가 있거나 없이, LPS의 존재 또는 부재시 다양한 전-염증성 사이토카인의 발현의 감소(5a) 및 AAT 융합 분자(rec AAT-Fc; 재조합 Fc-AAT)의 감소량을 사용하여 IL-IRa의 발현의 감소(5b)를 나타낸다.
도 6a 내지 6c는 AAT 융합 분자인 Fc-AAT2와 혈장 유래 AAT의 존재시 CDllb/CD45 양성 세포의 발현 백분율 및 TLR4 및 TLR2 발현의 백분율을 나타낸 것이고, 약 100배 내지 약 1000배 적은 재조합 AAT(Fc-AAT2)가 이러한 유해한 분자에 동일한 저해 효과를 가지는 것으로 나타났다. 예를 들어, 톨-유사 수용체 4(Toll-like Receptor 4)는 500 또는 100ng에서 혈장 유래 AAT의 500㎍만큼 효과가 있다(도 6a 참조).
도 7a 내지 7d는 본 명세서에 개시된 일부 구현예의 융합 분자의 관절 부종(joint swelling)에 대한 영향에 관한 마우스의 체내에서 통풍성 관절염(Gouty arthritis) 분석을 나타낸 히스토그램 데이터(7a는 두 개의 Fc AAT 융합 분자의 비교, 7c는 Fc AAT 융합 분자 대 대조군) 및 동일한 모델에서 IL-6 생산(7b)뿐만 아니라 Fc AAT 융합 분자에 노출 및 IL-1β 초과 시간의 저해의 영향(7d, 24 내지 72시간)을 나타낸다.
도 8은 허혈 재관류를 받은 심근경색증이 유도된 마우스 모델을 사용하여 심장 사건 후에 Fc-AAT2(2가지 농도의 재조합 AAT)의 존재 또는 부재시 경색의 크기를 나타내는 히스토그램 그래프를 나타낸다.
도 9는 허혈 재관류를 받은 심근경색증이 유도된 마우스 모델을 사용하여 심장 사건 후에 각각 온전한 Fc에 연결된 온전한 AAT 분자를 갖는 2개의 Fc-AAT 구조체의 존재 또는 부재시(동일한 농도에서) 경색의 크기를 나타낸 히스토그램 데이터를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 어떤 구현예의 Fc-AAT 융합 분자의 개략도를 예시한다.
정의:
본 명세서에 사용된 바와 같이, "한" 또는 "하나"는 하나 또는 하나 이상의 항목을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약"은 10% 안팎을 의미할 수 있고, 예를 들어, 약 10분은 9분 내지 11분을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "Fc-AAT" 또는 "AAT-Fc"는 AAT 폴리펩티드의 카르복시 말단 또는 아미노 말단에서 AAT 또는 AAT 카르복시 말단 단편에 연결된 Fc 단편을 의미할 수 있다.
하기 부분에 있어서, 본 발명의 상세하고 다양한 구현예를 위하여 다양하고 예시적인 조성물 및 방법이 제시된다. 다양한 구현예의 실시는 본 명세서에 개략적으로 나타낸 특정한 상세한 설명의 모든 또는 일부의 구현예를 요구하는 것이 아니라 농도, 시간 및 다른 특정 상세한 설명이 통상적인 실험을 통해 변형될 수 있다는 것은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 경우에 있어서, 잘 공지된 방법, 또는 구성요소는 본 설명에 포함되지 않는다.
AAT(알파-1 안티트립신) 항염증 활성이 세린 프로테아제, 특히 호중구 엘라스타제를 억제하는 그것의 능력에 기여한다는 것은 통상적으로 여겨지고 있었다. 이는 AAT 결핍을 갖는 인간에 대한 대체 요법에 있어서 그것의 용도에 기초한다. 인간에 대한 용도로 현재 상업적으로 입수가능한 AAT는 다른 AAT 관련 활성이 아닌 그것의 항엘라스타제 단위에 의해 표준화된다. 이러한 상업적으로 입수가능한 제형은 혼합 인간 혈장으로부터 정제되나, 그것은 다른 인간 혈청 단백질들을 포함하기 때문에 순수하지 않다(비록 일부는 다른 것들보다 더욱 순수할 수 있다). 생체 내 모델뿐만 아니라 시험관내에서도 인간 AAT에 대한 연구의 대다수는 세린 프로테아제 억제 활성이 있고, 각각 인간에게 사용이 허용된, 이러한 상업적으로 입수가능한 약제의 사용에 의존한다. 비록 다양한 AAT 결핍 상태를 갖는 인간에 있어서 AAT의 투여가 안전한 것으로 여겨지나, 오염 단백질의 역할에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 명세서에 있어서 어떤 구현예는 함께 정제된 오염 혈장 단백질들의 문제를 극복하기 위하여 고순도 및 고활성의 AAT 재조합 형태의 신속한 제조를 제시한다.
본 명세서에 개시된 어떤 구현예에 있어서 시도는 호중구 엘라스타제의 저해가 AAT로 인한 증가 요법(augmentation therapy)의 치료적 이익을 위한 유일한 메카니즘인 오래된 개념에 대해 제시된다. 본 명세서에 있어서 하나의 명확한 기여는 AAT의 정제를 도울뿐만 아니라 천연, 상업적으로 입수가능한 조성물보다 더 강화된 활성이 있는 Fc 융합과 같은 AAT 융합 분자의 새로운 형태의 제조를 생성하는 것이다. 수십 년간 과학자들은 유사하거나 동등한 AAT의 유익한 영향을 유지하는 AAT의 재조합 형태를 생산하려고 시도하였으나, 크게 성공적이지 않았다. Fc 융합 단백질은 안정성 있는 긴 역사를 가지며, 많은 것들이 다수에 의해 치료적으로 사용된다(예를 들어, 류마티스성 관절염 치료에 대한 사용하기 위한, 예를 들어, Enbrel™ 및 Alabacept™). 본 명세서에 제시된 Fc-AAT 융합 단백질은 쉽게 제조될 수 있고, 많은 양으로 정제될 수 있으며, 다른 구조체의 부작용을 감소시킨다. 게다가, 본 발명에 제시된 융합 구조체는 항염증 및 항면역 활성과 같은 AAT 활성에 관하여 상업적으로 입수가능한 제형(예를 들어, Zemaira™, Aralast™, Prolastin™ 등)에 비해 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 내지 100배까지 및 어떤 경우에는 1,000배까지 더 효능을 갖는다. 어떤 측면에서, 상기 상업적으로 정제된 혈장 유래 AAT 제형은 정제 동안에 항염증성 도메인이 파괴될 수 있기 때문에 부분적으로는 상업적으로 입수가능한 제형보다 뛰어난 것으로 여겨진다. 어떤 방법에서, 혈장 유래 AAT를 정제하는 초기 단계 중 하나는 상당히 산화적인 냉-알코올 침전이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 제조법은 비록 AAT 활성이 전체적으로 다른 제형에서 보존되지만, 부분적으로 엘라스타제 저해보다도 AAT의 항염증성 도메인의 유지에 초점을 맞추므로, 본 명세서에 제공된 융합 분자는 AAT 결핍 환자의 COPD에 대해, 이식 거부의 영향을 줄이는 것에 대해, 염증 증상의 치료에 대한 뛰어난 치료와 같은 임의의 임상 지표용 AAT에 대해 뛰어난 대체재를 제공한다.
본 명세서에 개시된 다른 구현예는 AAT의 다양한 형태와 연결된 변형된 Fc 분자에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, AAT 또는 AAT의 펩티드 단편에 융합된 면역글로불린 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4일 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, AAT의 융합 분자는 AAT에 융합되기 전에 12개 아미노산 힌지 영역이 돌연변이되거나, 절단되거나 또는 제거된 IgG2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 한 융합 분자는 AAT에 융합된 힌지 제거(또한 클론 3 또는 Fc3로 불림)된 IgG2에 관한 것이다. IgG2의 힌지 영역의 절단, 돌연변이 또는 제거는 상기 융합 분자의 체내에서 부작용을 감소시킨다. 일부 구현예는 보체를 활성화시키는 능력 및 다른 활성의 감소를 포함한다. 본 명세서에 개시된 융합 분자는 천연 AAT인 혈장 유래 조성물(예를 들어, Aralast™와 같은 상업적으로 입수가능한 조성물)보다 뛰어난 활성을 유지한다.
과다 염증 또는 염증 활성은 몇몇의 만성 질환, 예를 들어 만성 파괴성 또는 소모성 질환의 개시, 진행 및 파괴성 특성을 일으킬 수 있다. 이는, 이에 한정되지 않으나, 류마티스성 관절염, 루푸스(전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus)), 인슐린 생산 베타 세포가 면역 공격에 의해 파괴될 수 있는 1형 당뇨병과 같은, 자가면역 질환을 포함한다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 다른 증상은 2형 당뇨병을 포함한다. 자가면역 질환과 더불어, 관상 동맥의 만성 염증은 심근경색 또는 뇌졸중의 위험을 증가시킬 수 있다. 만성 염증은 또한 장에서의 염증(예를 들어, 크론병, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD) 또는 궤양성 대장염)에 기여한다. 개체에서 염증을 조절하는 몇몇의 자연적으로 발생하는 단백질들은 개체에서 매일 생성된다. AAT는 이러한 단백질 중 하나이다. AAT에 의한 치료의 하나의 문제점은 상업적으로 입수가능한 AAT가 인간 혈액 공여자의 혈장으로부터 단리되므로 사용가능한 혈장에 대한 공급이 제한적이라는 것이다. 그것의 적용이 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 및 AAT 대체 요법과 같은 현재의 용도에 제한적이지 않기 때문에 치료학적 AAT의 용도는 증가하고 있다.
본 명세서에 있어서 어떤 구현예는 혈장 유래 AAT와 유사하고, 어떤 측면에서 더 유효한, AAT 결핍 증상 또는 AAT-반응성 증상의 치료에 기능적인 인간 알파 1 안티트립신의 효과적인 재조합 형태를 나타낸다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 면역 분자 또는 이의 단편(예를 들어, IgG1, IgG2)에 융합된 AAT(예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물)에 관한 것이다. 다른 구현예에 있어서, 융합 단백질은 AAT의 절단 버전을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 어떤 융합 폴리펩티드는 AAT 또는 이의 단편의 아미노 말단을 통해 연결될 수 있다. 일부 구현예는 Fc와 같은 면역글로불린 분자에 융합된 AAT의 구조체에 관한 것이다. 어떤 구현예에 있어서, AAT 또는 이의 카르복시 말단 펩티드 단편은 IgG1 또는 IgG2 유래 Fc에 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 IgG1의 Fc가 골수세포의 보체 수용체에 결합하고, 어떤 조성물 및 방법에서 IgG2가 더 뛰어난 것이 확인되었기 때문에 IgG2 유래 Fc가 사용될 수 있다.
3가지 별개 유형의 Fc-감마(γ) 수용체가 발생한다: FcγRI, FcγRⅡ, 및 FcγRⅢ로 표기된 것은 인간 백혈구에서 확인된다. FcγRI(CD64)은 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수 전구세포 및 수지상 세포에 발현된 고친화성 수용체이다. FcγRI은 단량체성 인간 IgG1 및 IgG3에 대해서는 높은 친화성을 가지지만 IgG2에는 결합하지 않는다. FcγR에 대한 IgG의 Fc 부분의 결합은 염증 매개자의 분비를 포함하여 상기 세포의 효과기(effector) 기능의 도입에 중요한 것으로 알려져 있다.
4개의 IgG 서브클래스는 그들의 효과기 기능에 대하여 서로 다르며, 예를 들어 힌지 영역의 길이 및 유연성이 다른 것으로 알려져 왔다. 상기 힌지 영역의 유연성은 IgG3>IgG1>IgG4>IgG2 순으로 감소한다. 상기 Fc IgG2는 상기 힌지 영역에서 12개 아미노산을 가지며, Fc IgG1 보다 유연성이 적다. Fc 단편의 임의의 힌지 영역이, 이에 한정하지 않으나, 보체 활성화를 포함하는 융합 분자의 추가적인 체내에서의 부작용을 감소시키 위하여 상기 힌지 영역을 결실하거나 변형하도록 조작될 수 있는 것이 고려된다. 하나 이상의 아미노산은 변형되지 않은 대조군에 비해 AAT 활성이 증가한 융합 분자를 생성시키기 위하여 상기 영역으로부터 변형되거나 제거될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 힌지 영역은 본 명세서에서 고려된 Fc-AAT 구조체에서 상기 구조체에서 유연성을 조절하기 위하여, 상기 Fc에 대한 체내에서의 부반응을 감소시키기 위하여, 또는 AAT 활성을 증가시키기 위해 3차 구조를 바꾸기 위하여 짧아질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 Fc-AAT 구조체는 혈장 유래 AAT 제형에 비해 반감기가 증가된다.
게다가, 상기 Fc IgG2는 프로테아제에 내성이 있고, 이미 기술된 바와 같이 상기 높은 친화성 FcγRI에 결합하지 않을 뿐만 아니라, 보체를 활성화시키는 능력이 약하다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 고려된 융합 단백질에 사용된 Fc는 IgG1 또는 IgG2 또는 IgG3 또는 IgG4 유래일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, Fc는 수용체에 결합하지 않는 돌연변이 분자일 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, Fc는 AAT 또는 이의 카르복시 말단 펩티드에 연결된 IgG2 유래 야생형 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, Fc 분자는 예를 들어, 이황화 결합에 의해 연결된, Fc-AAT 이량체를 만들기 위하여 AAT 분자와 연결될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, Fc-AAT의 단량체 분자가 생성될 수 있고, 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 개시된 어떤 구조체는 Fc-AAT에 관한 것으로서, 상기 구조체의 Fc는 상기 힌지 영역에서 유연성을 더 감소시키기 위하여, 예를 들어 이 영역에서 추가적인 아미노산을 제거함으로써 변형된다. 본 명세서에 기재된 임의의 상기 분자는 활성을 보존하기 위한 신속한 분리를 위하여, 예를 들어, 단백질 A 컬럼 또는 매트릭스 또는 다른 신속한 정제 또는 농축 방법을 사용하여 신속하게 정제될 수 있다.
본 명세서에 있어서 구현예는 현재 상업적으로 입수가능한 AAT 조성물에 대해 뛰어난 특성을 갖는 알파-1 안티트립신(AAT) 또는 이의 카르복시 말단 단편의 구조체 생성을 나타낸다. 다른 구현예는 융합 단백질 또는 펩티드의 정제 방법 및 이어서 본 명세서에 개시된 정제된 AAT 융합 분자에 대한 용도를 나타낸다. 혈액 혈장으로부터 유래된 상업적으로 입수가능한 AAT는 공급이 부족하고, AAT의 중요한 특성을 파괴하는 방법에 의해 현재 정제되고 있으며, AAT의 천연 형태 또는 AAT 유래 펩티드보다 좋지 않다면 합성적으로 제조된 AAT도 실시될 수 있는 이러한 분자의 합성 버전 또는 최신의 정제 방법에 대한 필요성이 존재한다.
세린 프로테아제 억제 외의 AAT 활성에 관하여, AAT는 몇몇의 메커니즘에 의해 항염증 특성을 나타낸다. 항프로테아제 부위의 돌연변이(예를 들어, 유의하지 않은 수준까지 항프로테아제 활성을 감소시키기 위하여)를 사용한 예비 데이터는 일부 AAT의 활성이 AAT의 항프로테아제 특성을 필요로 하지 않는다는 개념을 뒷받침한다. 어떤 구현예에 있어서, 자연적으로 발생하는 인간 AAT의 상이한 재조합형의 절단된 돌연변이의 형태(예를 들어, 394개 아미노산, Mr 약 51,000)가 상기 분자의 항염증 특성을 평가하기 위하여 생성된다. 이러한 접근법은 다양한 조성물의 AAT 분자를 제조하게 하는데, 이는 혈장 유래 AAT의 표준 방법을 사용할 때는 매우 어렵고 거의 불가능한 것이다. AAT의 항염증 특성은 상업적으로 입수가능한 조성물의 현재 사용되는 정제 과정에 의해 산화될 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 개시된 방법은 개시된 융합 분자 및 구조체에서 이러한 활성을 보존하기 위한 뛰어난 정제 방법을 제공한다.
이미 개시된 어떤 방법에 있어서, AAT는 마우스 모델 및 인간 췌도 세포에서 IL-1β의 독성 활성을 막는 것으로 알려져 왔다. 본 명세서에 일부 구현예는 이러한 활성을 모방할 수 있는 AAT 융합 분자의 재조합 생산에 관한 것이다. 어떤 구현예에 있어서, 인간 AAT의 카르복시 말단 영역의 재조합으로 제조된 융합 펩티드는 IL-1β의 독성 활성 또는 생산을 방지하고 카스파제-1 활성을 감소시키기 위하여 생성된다(실시예 부분 참조). 이러한 융합 펩티드는 전염증성 분자의 생산 또는 활성을 방지하거나 감소시키는데 유용하고, 따라서 많은 건강 증상의 치료 및 예방에 유용하다.
알파 1-안티트립신 또는 α1-안티트립신(AAT)는 세르핀 수퍼패밀리에 속하는 프로테아제 억제제로서 최초로 분류되었다. 그것은 일반적으로 혈청 트립신 억제제로서 알려져 있다. 또한 AAT는 그것이 다양한 종류의 프로테아제를 억제할 수 있기 때문에 알파-1 프로티나제 억제제(A1PI)로서 불릴 수 있다. AAT는 염증성 세포, 특히 호중구 엘라스타제의 효소로부터 조직을 보호하고, 약 1.5 내지 3.5 g/ℓ의 혈액 내 범위를 전형적으로 갖지만, 상기 농도는 급성 염증시 몇배 증가할 수 있다. α1-안티트립신의 100개 이상의 상이한 변이체가 다양한 개체군에 있어서 설명된 바 있다. AAT의 가장 흔한 종류는 IEF 겔에서 그것의 이동에 근거하여, M으로 일컫는다. 다른 변이체는 그들이 상기 M 밴드에 근접하거나 또는 멀리 움직이는지에 따라, A-L 및 N-Z로 일컫는다. IEF 상에서 벗어나는 밴드의 존재는 AAT 결핍이 있음을 의미할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, M 유형 AAT는 여러 서브타입을 갖고 이러한 모든 서브타입은 본 명세서에서의 용도로 고려된다.
AAT의 치료학적 농도를 수득하기 위한 현재의 경향은 혈액 공여자의 혈액 혈장으로부터 AAT를 제조하는 것이다. 이는 제한적인 재료이고 시장성 있는 제품을 얻기 위해서 대규모의 정제 단계가 요구된다. 지금까지, 미국 식품의약품안전청은 인간 혈장으로부터 유래된 몇몇의 상업적인 제품의 사용을 승인하고 있다: 예를 들어, 이러한 제품으로는 프로라스틴®(Prolastin®), 프로라스틴 C®(Talecris (지금은 Grifols, Raleigh, N.C.), 제마이라®(Zemaira®), 및 아랄래스트(Aralast®)(Baxter) 및 에어로졸과 정맥주사 제품을 모두 갖는 카마다(Kamada)(Kamada, Israel)를 포함한다. 이러한 제형의 대부분은 AAT 결핍 환자에 있어서 AAT 치료를 위해 정맥주사로 투여되고 환자당 1년에 $100,000까지 비용이 들 수 있다. 혈장에서 단리된 AAT는 혈액으로부터 유래된 AAT에 비해 감소된 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 혈장 유래 AAT가 아닌 혈액의 것과 유사한 증가된 항염증 활성; 및 항프로테아제 활성에 기초한 활성을 갖는 상업적으로 입수가능한 제형보다 높은 활성을 갖는다.
한 연구는 그것의 1차 구조 및 글리코실화에 대하여 세 개의 FDA 허가 제품을 분석 및 비교하였다. 제품 중 몇몇은 정상 인간 혈장 AAT에 비해 정제 과정 동안 도입될 수 있다는 차이점을 나타냈다. 게다가, 어떤 연구에서는 상업적인 제형의 비교가 세린 프로테아제 억제 활성 및 AAT 순도에 관한 큰 변동성을 갖는다는 것을 이미 나타낸 바 있다. 최근에, 최종 제품에 있어서 항프로테아제 활성(예를 들어, 세린 프로테아제 억제 활성)을 증가시키기 위하여, 표준적인 상업적으로 입수가능한 제형 중 하나인, 프로라스틴®이 평가되었고 새로운 제형인 프로라스틴C®가 프로라스틴®과 상이하게 정제되었다. 이러한 제품들에 대해 보고된 모든 활성은 항염증 또는 면역 조절 활성 또는 대체적인 AAT 관련 활성이 아닌 세린 프로테아제 억제 활성에 관한 것이다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에서 생성된 조성물은 부분적으로는 정맥주사 방법보다 그것의 하기도(lower respiratory tract)까지의 도달때문에 다른 형태보다 에어로졸 제형이 유용할 수 있다. 임의의 상기 구조체 제형이 약학적으로 허용가능한 제형으로 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 개체에 도입될 수 있는 것이 본 발명에서 고려된다.
혈장 유래 AAT 제형을 향상시키는 노력에도 불구하고, AAT가 유래되는 사용가능한 혈장의 공급이 한정적이고, 생산하는 것이 비싸다. 따라서 재조합 AAT 분자가 추구되고 있었다. 재조합 AAT 분자를 개발하는 연구자들에 의해 대면된 문제들 중 하나는 혈장 유래 제형에 비해 이러한 분자의 활성이 감소되는 것이다. 이전에 생성된 재조합 분자들은 세린 프로테아제 억제제 분석에 의해 분석할 경우 이미 알려진 상업적으로 입수가능한 제형에 비해 대개는 덜 활성적이었다. 따라서, 과거의 혈장의 제한된 공급과 질 낮은 재조합 AAT 분자는 과거에 그리고 최근에 발견된 방법론에 대한 AAT의 충분한 공급을 일으키는데 허점으로 남아있다.
본 명세서에 있어서 일부 구현예는 본 기술분야에서 공지된 임의의 AAT 방법 또는 치료에서의 용도를 위하여 상업적으로 입수가능한 제형과 관련하여 매우 활성적이고, 매우 기능적인 재조합 AAT 구조체 생성에 관한 것이다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 재조합 AAT는 전장 분자 또는 이의 카르복시 말단 펩티드 유도체를 포함한다. 일부 구현예는 면역학적 요소(예를 들어, Fc 단편 또는 다른 단편)와 각각 연결된 AAT 분자를 갖는 하나 이상의 구조체의 동시 합성 및 공동-정제에 관한 것이다. 다른 구현예는, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법 및 용도를 위한 구조체를 형성하기 위하여 하나 이상의 면역 분자(들)와 연결된 분자의 카르복시 말단의 마지막 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개 아미노산의 단편 또는 다른 단편을 포함하는, AAT의 하나 이상의 카르복시 말단 유도체(들) 또는 단편(들)의 구조체 생성에 관한 것일 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 구조체의 AAT 분자는 자연적으로 발생하는 알파-1 안티트립신(예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물), 또는 단편, 또는 이의 유도체, 또는 현저한 세린 프로테아제 억제 활성을 가지지 않는 임의의 AAT 분자인 AAT의 돌연변이 형태, 또는 이의 대립유전자(예를 들어, 약 100개의 자연적으로 발생하는 AAT 변이체) 또는 이의 유사체 또는 이의 융합 단백질(예를 들어, 인간 IgG 또는 인간 IgG의 단편)에 관한 것일 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 구조체는 면역학적 단편(예를 들어, 두 분자의 AAT와 연결된 Fc 단편)과 각각 연결된 이량체의 AAT 구조체를 포함할 수 있고 상기 Fc-AAT 구조체는 하나 이상의 이황화 결합(들)에 의해 함께 연결된다. 본 명세서에 개시된 실시예, 도 1, 도 2를 참조한다. 어떤 방법에 있어서, 재조합 AAT 또는 AAT 펩티드 및 면역 분자 복합체의 정제는 AAT 또는 AAT 펩티드의 현저히 감소한 정제 단계 및 현저히 증가한 효능에 의해 상기 AAT 또는 AAT-펩티드의 활성을 증가시킨다. 이러한 구현예에 따르면, 본 명세서에서 고려되는 재조합 AAT 분자는 융합 폴리펩티드(이량체 또는 단량체 형태)로서 사용될 수 있거나 또는 정제 후 그것의 면역 분자로부터 절단되어 상업적으로 입수가능한 제형에 비해 감소된 농도로 사용될 수 있다. 일부 구현예는 상업적으로 입수가능한 제형에 비해 1/100, 1/1000까지 농도를 사용하는 것에 관한 것이다. 어떤 실시예에 있어서, 이러한 분자는 대조군(예를 들어, 자연적으로 발생하는 AAT의 전형적인 정제 및 상업적으로 입수가능한 제형의 정제)에 비해 사이토카인을 억제하고 면역 또는 염증 작용을 조절하기 위한 조성물에 사용될 수 있다. 한 구현예에 있어서, 본 출원의 재조합 분자는 상업적으로 입수가능한 약제보다 100배 내지 1000배 더 활성적인 것으로 나타났다. 본 발명의 AAT 구조체에 대해 관심있는 것으로 알려진 어떤 활성은 면역조절 또는 염증 조절 활성을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 구조체는 상업적으로 입수가능한 조성물에 비해 증가된 IL-1β 수용체 길항제 활성을 갖는다.
건강 상태의 치료에 있어서 재조합 AAT에 대한 일부 용도
본 명세서에 제시된 일부 구현예는 AAT 요법을 필요로 하는 개체를 치료하기 위해, AAT 대체물 또는 AAT 보충물인 재조합 AAT 또는 이의 융합 단백질 또는 카르복시 말단 단편 융합 분자의 용도에 관한 것이다. AAT 치료는 이에 한정되지 않으나, 세포사멸 관련 증상, 일산화질소 관련 증상, 허혈 재관류 기능장애로 유도된 증상, 이식 거부 및 세포 거부, 당뇨병, 폐기종, 다른 폐 증상을 포함하는 다양한 증상, 세균성 감염의 치료 및 예방, 바이러스성 감염의 치료 및 예방, 방사선으로 유도된 상처 등에 있어서의 용도를 나타낸다.
본 명세서에 있어서 일부 구현예는 염증 장애(예를 들어, IBD, 크론병, 관절염)를 치료하기 위한 용도의 본 명세서에 개시된 융합 분자의 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 융합 분자는 상업적으로 입수가능한 AAT 조성물에 비해 항염증 활성이 강화되어 있다. 일부 구현예는 합성적으로 생성된 AAT 또는 이의 카르복시 말단이 절단된 버전(예를 들어, AAT의 마지막 36개 내지 80개 아미노산)에 융합된 힌지 결실된; 절단된 또는 돌연변이된 IgG2 Fc에 관한 것이다. 한 구현예에 있어서, Fc-AAT는 어떤 경우에 있어서 클론 3으로 불려지는 것을 만들기 위해 온전한 합성적으로 생성된 AAT 분자에 부착된 2개 아미노산 링커(linker)가 있는 힌지 결실된 IgG2를 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 개체에서 염증성 장 장애의 개시를 감소하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 개체에 있어서 IBS와 연관된 증상에서의 감소는 약 10-20%, 또는 약 30-40%, 또는 약 50-60%, 또는 약 75-100% 감소 또는 억제를 따를 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 조성물을 투여받지 않은 대조군 개체에 비해 소모를 줄이거나 또는 손실을 줄이거나 또는 장벽 기능을 회복하기 위하여 IBS 또는 IBD에 걸린 개체는 AAT의 재조합체 또는 융합 단백질 또는 AAT 카르복시 말단 펩티드(힌지 결실 또는 힌지 절단이 있는 Fc-AAT)의 약학적으로 허용가능한 조성물로 치료될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 염증성 장 장애의 개시를 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 있어서 일부 구현예는 급성 또는 만성 증상에 걸린 개체에서 창자 또는 장 과투과성의 회복에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 창자 또는 장 과투과성 또는 장벽 기능의 손실은 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 염증성 장 질환, 1형 당뇨병, 알레르기, 및 천식과 같은 만성 질환 때문일 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 창자 또는 장 과투과성을 갖는 개체는 매일 1회, 매주 2회, 매주 1회와 같이 미리 결정된 요법에 의해 또는 다른 미리 결정된 요법에 의해 의료 종사자에 의해 치료될 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 이에 한정되지 않으나, 당뇨병(예를 들어, 1형 및 2형), 자가면역 질환과 같은 면역 질환, 염증 질환, 심장 장애, 감염성 질환 및 다른 것들을 포함하는 어떤 징후를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 일부 질환들은 감염성 질환, 자가면역 질환 또는 폐질환 또는 다른 것들로 여겨질 수 있는 천식과 같이 하나 이상의 카테고리에 해당될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 이에 한정되지 않으나, 류마티스 관절염과 같은 류머티즘성 질환, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 1형 당뇨병, 및 갑상선, 소화관, 및 중추신경계의 자가면역 질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 경피증, 혼합 결합 조직병, 피부근염, 다발성근염, 라이터증후군, 및 베체트병); 중추신경계의 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 중증근무력증, 또는 뇌척수염); 위장계의 자가면역 질환(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 셀리악병, 스푸루우); 갑상선의 자가면역 질환(예를 들어, 하시모토 갑상선염, 또는 그레이브스병); 및 눈의 자가면역 질환(예를 들어, 포도막염)을 포함하는 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 자가면역 장애는, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 부신의 자가면역 질환, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 자가면역성 난소염 및 고환염, 자가면역성 혈소판감소, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(chronic fatigue immune 기능장애 syndrome, CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 처그 스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 크론병, 원판성 루프스, 본태성 복합 한냉글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근육염, 사구체신염, 길랑바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소증 자반증(idiopathic thrombocytopenia purpura, ITP), 과민성 장질환(irritable bowel disease, IBD), IgA 신경병증, 청소년 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 1형 또는 면역 매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다연골염, 다분비선 증후군, 다발성 류마티스, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이놀드 증상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 근육강직 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 포진성 피부염 혈관염과 같은 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, T 세포 매개 자가면역 질환, 류마티스 질환, 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스에 관한 것일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은, 이에 한정되지 않으나, 알레르기 장애 또는, 예를 들어, 관절염, 염증성 골용해, 만성 염증(예를 들어, 만성 바이러스성 또는 세균성 감염), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 뇌염, 염증성 장질환(IBD), 건선(예를 들어, 플라크 건선, 농포성 건선, 홍포성 건선, 적상건선 또는 간찰부 건선), 폐섬유증, 미분화 관절증, 미분화 척추관절증을 포함하는 염증 증상과 같은 증상의 치료를 포함할 수 있다. 다른 증상은, 이에 한정되지 않으나, 예를 들어, 천식, COPD, 폐기종과 같은 호흡기 증상을 포함한다. 어떤 구현예는 재조합으로 제조된 융합 분자의 형태의 AAT를 10배 내지 100배 적게 사용하여 염증의 유해한 효과를 감소시키기기 위하여 매달 1회, 매주 1회, 2주 1회, 매일 1회, 매일 2회 또는 다른 요법으로 개체를 치료하는 것에 관한 것으로서, 상기 융합 분자는 Fc-AAT(힌지가 결실되거나 힌지가 절단된 형태)를 포함한다. 어떤 실시예에 있어서, Fc-AAT3 또는 Fc-AAT4는 이러한 장애의 유해한 영향을 억제하고, 이와 연관된 증상을 개선시키기 위한 조성물에 사용될 수 있다.
방사선 방호 및 암
어떤 구현예에 있어서, 조성물(예를 들어, 구조체 조성물) 및 방법은 개체에 대한 방사선의 부작용 조절에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 조성물 및 방법은 예를 들어, 암에 걸렸거나 또는 악성종양이 발생한 것으로 의심되는 개체에게 또는 조절되지 않는 세포 성장을 위해 투여될 경우, 방사선 치료 또는 방사선을 받은 개체의 치료에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 다른 구현예는 방사선 치료의 해로운 부작용을 감소시키기 위하여 예를 들어, 부분적으로 사고에 의해 또는 목적있는 행동에 의해, 방사선에 노출된 적이 있는 개체의 치료에 관한 것이다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 암 치료를 받은 개체의 치료에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따라서, 암 치료를 받은 개체는 상기 치료의 해로운 영향(예를 들어, 방사선 및/또는 화학요법으로부터)을 감소 또는 예방하기 위하여 본 명세서에 개시된 조성물로 치료될 수 있다. 암 치료는, 이에 한정되지 않으나, 방광암, 유방암, 신장암, 백혈병, 폐암, 골수종, 지방육종, 림프종, 혀암, 전립선암, 위암, 결장암, 자궁암, 흑색종, 췌장암, 뇌암, 안암, 피부암 및 다른 공지된 암에 대한 치료를 포함한다.
다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 암에 걸린 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 구현예를 위해 고려되는 암들은, 이에 한정되지 않으나, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 카포시 육종, 림프관혈관내피육종, 활액막종, 중피종, 유잉 종양, 평할근육종, 횡문근육종, 횡문육종, 대장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 흑색종, 편평 상피 세포암, 기저 세포암, 선암, 땀샘암, 피지샘암, 유두 암, 유두상선암, 낭종암, 수질암, 기관지암, 신세포암, 간암, 담도암, 융모막암, 정상피종, 배아암종, 빌름스종, 자궁경부암, 고환 종양, 난소암, 폐암, 소세포 폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 뇌수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 골수종, 림프종, 백혈병, 또는 다른 공지된 암을 포함할 수 있다.
다른 구현예는 방사선 방호에 관한 것을 포함하고 본 명세서에 개시된 조성물은, 호르몬 요법과 병용함에 있어서, 및/또는 면역치료 조합으로서, 화학요법 동안에, 삼차 신경통의 치료, 중증 갑상선 안구 질환의 치료, 익상편의 치료, 색소 융모 결절성 활막염의 치료, 켈로이드 상처 성장의 예방, 이소성 골화증의 예방, 미용 또는 재건의 외과적 적용 수술(예를 들어, 상처 형성의 감소)에 관한 것일 수 있다.
어떤 부작용은 방사선 노출시에도 방사선 치료 또는 화학요법의 부작용으로 발생할 수 있다. 본 명세서에 있어서 일부 구현예는 본 명세서에 개시된 조성물로 개체를 치료함에 따라 개체에서 이러한 부작용의 감소 또는 예방에 관한 것이다. 조성물은 AAT, AAT 카르복시 말단 펩티드(예를 들어, 80머, 36머 등), AAT의 재조합/융합 형태 및/또는 AAT 카르복시 말단 펩티드의 재조합/융합 형태를 포함할 수 있다. 방사선 치료의 부작용은, 이에 한정되지 않으나, 세포 손상, 통증, 부종, 국소 자극, 섬유증, 놀람, 조직 온전성의 손실, 증가된 조직 파쇄, 연하에 있어서 어려움, 방사선 치료 또는 노출과 연관된 다른 증상을 포함할 수 있다. 감소시키거나 예방할 수 있는 다른 부작용은 예를 들어 골수 이식과 같은, 전신 방사선 치료(total body irradiation, TBI)에서의 부작용에 관한 것이다. 이러한 부작용은 상기와 더불어, 급성 또는 만성 면역결핍 및 기회감염을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 전립선암에 걸렸거나 발생한 것으로 의심되는 환자의 치료에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 전립선암에 걸렸거나 발생한 것으로 의심되는 남성 개체는 이러한 치료에 의한 부작용을 감소시키기 위하여 방사선 및/또는 화학요법 치료 전, 동안 또는 후에 본 명세서에 개시된 조성물로 치료될 수 있다. 예를 들어, 부작용은, 이에 한정되지 않으나, 발기불능 또는 발기부전의 발생일 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 다른 증상은 전신성 홍반성 루푸스(SLE 또는 루푸스), 류마티스 관절염, 패혈증, 전신성 홍반성 루푸스(SLE 또는 루푸스), 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 패혈증, 자가면역 질환, 동맥경화증, 알츠하이머병, 관절염, 근육 영양 장애, 다운 증후군, 다발성 경화증, 뇌졸중, 퇴행성 신경 질환, 다른 염증성 질환 또는 증상 및 혈청 음성 척추 관절증을 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 패혈증 쇼크(이러한 확인 연구에 대한 동물 모델 참조: Doi 등., The Journal of Clinical Investigation, 119권 10호, 2009년 10월; 패혈증 및 패혈증으로 유도된 신부전의 동물 모델에 대하여)의 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 혈장 유래 AAT는 마우스 모델 및 인간 코호트 연구에 있어서 바이러스 및 세균 감염 모두를 치료하기 위해 전신적으로(systemically) 사용될 수 있는 것이 알려져 왔고, 따라서 혈장 유래 AAT에 비해 향상된 것으로 알려져 왔던 Fc-AAT(Fc의 힌지 제거 또는 힌지 절단, 예를 들어 FcAAT3)는 패혈증 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 감염 또는 다른 원인때문에 패혈증에 걸린 개체는 개체에서 상기 증상을 개선하고 잠재적으로 사망을 예방하기 위해 본 발명에 개시된 조성물로 치료될 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 상기 개체는 포유동물이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 포유동물은 인간이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 개체는 남성, 여성, 임신한 여성, 어린이 또는 청소년이다.
이식 거부 및 이식 생존율
다른 구현예에 있어서, 본 명세서에서 고려되는 재조합 또는 융합 폴리펩티드(예를 들어, Fc-AAT 또는 Fc-AAT 단편)는 기관 또는 비기관(예를 들어, 세포) 이식과 같은, 이식을 받은 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 세포 이식은 골수, 췌도 세포(예를 들어, 췌도 동종이식), 각막 세포, 줄기 세포, 피부(예를 들어, 세포 또는 그 이상), 피부의 임시 사체 이식(예를 들어, 연조직, 얼굴 등) 또는 이식편대숙주질환(GVHD)과 같은 세포 이식 거부와 관련된 증상을 포함할 수 있다. 본 발명의 구현예는 이식을 받거나 필요로 하는 개체에 의해 경험된 증상 또는 징후를 개선하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 구현예에 따르면, 증상 또는 징후는 이식편대숙주질환(GVHD), 또는 이식 거부와 연관된 증상을 포함할 수 있다. 한 실시예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 골수 이식을 받은 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 줄기 세포 또는 다른 세포 이식을 받은 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 개체는 이식 거부를 감소시키고, 이식된 세포를 보존하고 및/또는 이식된 세포(이식편) 생존을 연장시키기 위해 치료될 수 있다. 다른 구현예는 심장, 폐, 장, 간, 췌장, 신장 또는 다른 장기 이식과 같은 장기 이식을 받은 개체의 치료를 포함할 수 있다.
한 실시예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 골수 이식을 받은 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 개체에 있어서 이식 거부 및/또는 GVHD를 감소시키기 위하여 개체는 골수 이식 전, 동안 또는 후에 치료될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 조직 이식 거부의 발생의 예방 또는 감소에 관한 것이다. 다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 기관 이식의 연장에 관한 것이다. 본 발명에서 고려되는 이식은 신장, 심장, 간, 연조직의 이식, 얼굴 구성요소 이식, 장 이식, 및 췌장 이식에 관한 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 조성물은 기관 또는 비기관의 이식과 연관된 증상의 감소 또는 예방에 관한 것일 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물로 이식을 받은 개체를 치료함으로써 감소시키거나 또는 예방할 수 있는 증상은, 이식 거부, 신부전증, 폐부전증, 심부전증, 점막 궤양, 감소된 췌도 기능(증가된 포도당, 당뇨병), 이식편대숙주질환(GVHD), 위장관질환(GI), 궤양, 폐부전증, 피부 궤양, 응고장애, CNS 기능장애, 및 혼수상태를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 이식 전에 기관 또는 세포 보존에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 조성물에 대해 운반 동안의 동결보존 또는 보존 또는 다른 보존 방법이 기관, 조직 또는 세포를 노출시킴으로써 강화될 수 있다. 본 발명에 있어서 어떤 구현예는 이식 또는 동결보존을 위해 제조된 기관, 조직 또는 세포를 보존하기 위한 본 발명에 개시된 조성물의 용도에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 기관, 조직 또는 세포는, 예를 들어, 췌도 세포, 줄기 세포, 골수 세포, 신장, 간, 폐, 및 다른 기관 또는 세포 이식과 같이, 본 발명에 개시된 임의의 것들을 포함한다.
본 발명의 구현예는 재조합 AAT 또는 이의 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 부형제 물질을 포함하는 약학적으로 유효한 양의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 연장된 이식 생존 및 기능을 증진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 추가로 병용 요법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 하나 이상의 인터페론, 베타세론, 베타-인터페론을 포함한 인터페론 유도체, 일로프로스트, 시카프로스트를 포함한 프로스탄 유도체; 코르티솔, 프레드니솔론, 메틸-프레드니솔론, 덱사메타손을 포함한 글루코코르티코이드; 사이클로스포린 A, FK-506, 메톡살렌, 탈리도마이드, 설파살라진, 아자티오프린, 메토트렉세이트를 포함한 면역억제제; 질레우톤, MK-886, WY-50295, SC-45662, SC-41661A, BI-L-357을 포함한 리폭시게나아제 억제제; 류코트리엔 길항제; ACTH 및 이의 유사체를 포함한 펩티드 유도체; 가용성 TNF-수용체; TNF-항체; 인터루킨, 다른 사이토카인, T-세포-단백질의 가용성 수용체; 인터루킨, 다른 사이토카인, T-세포-단백질의 수용체에 대한 항체; 및 칼시포트리올; 셀셉트®, 마이코페놀레이트 모페틸, 및 이의 유사체를 단독 또는 조합으로 포함할 수 있다.
성형 수술 및 흉터의 감소/예방
본 발명에 개시된 다른 측면은 부작용의 감소 및 재건 수술 후 회복, 강화 또는 미용 수술의 강화(예를 들어, elective, 미용, 화상 피해 또는 방사선과 같은 치료로 인한)에 관한 것이다. 재건의 성형 수술은, 예를 들어, 화상; 안면 골절 및 뼈 절단과 같은 외상적 손상; 구개 파열 또는 구순구개열과 같은 선천적 기형; 발달상 기형; 바이러스 또는 세균 감염 및 질환; 및 암 또는 종양으로 인한 기능적 장애를 고치기 위해 수행될 수 있다. 재건의 성형 수술은 기능을 향상시키기 위해 수행될 수 있으나, 개체를 정상 외모로 개선하기 위해 된 것일 수 있다.
가장 일반적인 재건 과정 중 하나는 종양 제거, 열상 복구, 흉터 복구, 손 수술 및 유방 제거이다. 일부 다른 일반적인 재건 수술 과정은 유방 절제술 후 유방 재건, 구순구개열 및 구개 파열 수술, 화상 생존자들에 대한 구축 수술 및 하나가 선천적으로 부재하는 경우 새로운 외부 귀를 만드는 것을 포함한다. 의료 종사자들은 대개 일부 조직이 사용가능하지 못한 경우 결함의 적용범위에 대한 조직을 이식하기 위하여 현미경을 이용한 수술을 사용한다. 피부의 덮개(flap), 근육, 뼈, 지방 또는 이의 조합이 개체 자신의 신체로부터 제거될 수 있고, 상기 신체상의 다른 부위로 옮겨질 수 있으며, 혈액 공급 등과 재연결될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 조성물은 가능하다면 흉터를 줄이고, 조직 이식 및 리텐션(retension)(예를 들어, 이식 거부 및 흉터의 감소)을 강화하기 위하여 재건 또는 미용 수술 전, 동안 또는 후에 사용될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, Fc-AAT(힌지 결실 또는 온전한 힌지 영역)와 같은 AAT 융합 분자를 포함하는 치료 조성물은 부종 및 조직 손상을 야기할 수 있는 이러한 수술들의 일반적인 부작용인 염증을 예방하거나 감소시키는 것과 같은 미용 및 재건 과정의 부작용을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구현예는 이러한 과정을 겪고 있는 개체에 있어서 염증 및 면역 반응을 증가시키거나 개선시키기 위하여 회복 시간을 줄이고 본 발명에 개시된 조성물을 사용하여 상기 재건 과정을 강화시키기 위한 재건 과정을 겪거나 겪고 있는 개체의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 조성물은 의료 종사자에 의해 결정될 때 필요에 따라 개체를 조직적으로 또는 영향을 받는 부위(예를 들어, 연고 또는 로션 또는 다른 유형으로 도포된)에 직접적인 도포에 의해 치료하는 것에 사용될 수 있다.
당뇨병
일부 구현예는 당뇨병에 걸린 또는 당뇨병이 발생할 것으로 의심되는 개체의 치료에 대한 본 명세서에 개시된 조성물의 용도에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 개체는 개체에서 상기 질환을 치료하기 위하여 당뇨병에 걸린 임의의 개체에 본 명세서에 개시된 조성물이 투여될 수 있다. 1형 또는 2형 당뇨병에 걸린 개체는 본 명세서에 개시된 조성물로 치료될 수 있다. 이러한 치료는 본 기술분야에 공지된 당뇨병에 대한 임의의 치료와 병용할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 당뇨병에 걸린 개체를 치료하기 위하여 현재 사용가능한 상업적인 제형에 비해 감소된 수준(예를 들어, 농도)으로 개체에 투여될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 당뇨병에 걸린 개체는 예를 들어, 검출가능한 c-펩티드 수준, 및/또는 검출가능한 인슐린 생산, 및/또는 잔류 췌도 세포 기능을 갖는 5년 내에 진단된 것과 같이 초기 시작된 1형 당뇨병에 걸린 개체일 수 있다.
다른 구현예는 생체 내에서(예를 들어, 췌도 세포 기능을 보존 또는 회복하기 위하여) 또는 시험관내에서(예를 들어, 이식을 위한 운반 동안에) 췌도 세포를 보호하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물의 용도에 관한 것일 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 일부 췌도 세포 기능이 남아있는 당뇨병에 걸린 개체의 치료 및/또는 췌도 세포 무결성 및 기능 보존을 위하여 개체로 그들을 이식 전에 췌도 세포의 처리에 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 개체가 췌도 세포 이식 전, 동안 또는 후에 치료될 수 있는 것이 고려된다. 다른 구현예에 있어서, 당뇨병 치료는 I형 및 Ⅱ형, 인슐린 저항성 당뇨병에 걸린 개체의 치료를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 Fc-AAT 융합 분자는 상당히 감소된 농도만으로 혈장 유래 AAT에 대해 관찰된 전-염증성 사이토카인의 생산을 조절할 수 있는 것으로 나타났다. Fc-AAT 융합 분자(힌지 결실 또는 힌지 절단)를 포함한 조성물은 필요로 하는 개체에 있어서 췌도 세포 개체군을 보존하기 위하여 사용될 수 있다.
심장 증상
본 발명의 일부 구현예는 심장 증상에 걸렸거나 또는 관상동맥 중재술(예를 들어, 수술, 예방 치료)을 받은 개체의 치료를 포함한다. 이러한 구현예에 따르면, 심장 증상에 걸린 개체는, 이에 한정되지 않으나, 심근경색, 심근 허혈, 만성 전신성 동맥 및 정맥 고혈압, 폐동맥 및 정맥 고혈압, 선천성 심장질환(심장 내의 션팅이 있거나 없는), 심장 판막증, 특발성 확장성 심근증, 감염성 및 비감염성 심근염, 스트레스성 심근증(중요한 치료 질병, 신체적, 및 정서적 스트레스, 및 두개내 출혈 및 뇌졸중과 연관된 것과 같은), 패혈성 심근증, 심방 및 심실 부정맥, 심장내막염, 심낭염, 심장 근육의 손상, 심장마비, 심장 정지, 급성 심근경색(acute myocardial infarction, AMI), 심근의 재관류 허혈 손상, 심실 리모델링, 구심성 비대, 편심성 좌심실 비대 및 임의의 다른 공지된 심장 증상을 포함하는 하나 이상의 하기 증상을 가질 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 심근경색에 걸렸거나 걸린 것으로 의심되는 개체는 상기 심장 증상의 증상 또는 부작용과 같은 상기 증상을 개선하기 위하여 본 명세서에 개시된 조성물을 투여할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, Fc-AAT 융합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 본 명세서에 개시된 조성물은 심실 리모델링 또는 허혈 재관류의 효과를 감소시키거나 예방하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 심장 증상 치료 방법은 심장 사건 전, 동안 또는 후에 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 개체에서 발생한 심장 사건 후에 최적 효용성을 가지기 위하여 조성물은 의료 종사자에 의해 결정된 기간 동안 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 개체는 사건 후 1주일까지, 2주일 또는 그 이상까지 조성물로 치료될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 제시된 개체에 투여되는 조성물은 용량당 0.001 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏의 재조합체 또는 Fc-AAT 융합 단백질과 같이, 상업적으로 입수가능한 AAT 제형(예를 들어, Aralast™, Zemaira™, Prolastin C™)의 사용보다 5배, 10배, 100배 또는 1,000배 더 적을 수 있다.
위장 장애
본 발명의 일부 구현예에 있어서, 위장 질환 또는 증상(예를 들어, 간헐적인, 단독 또는 만성 상태)또는 염증성 장 장애를 갖는 개체의 치료를 포함한다. 이러한 구현예에 따르면, 위장 증상을 갖는 개체는, 이에 한정되지 않으나, 염증성 장질환(예를 들어, IBS 또는 IBD), 궤양성 대장염(UC), 크론병(CD), 전신성 염증성 반응 증후군(SIRS), 알레르기와 연관된 장질환, 1형 당뇨병과 연관된 장질환, 다른 대장염 유형(예를 들면, 교원성 대장염, 허혈성 대장염, 전환성 대장염, 불확정성 대장염), 장의 염증과 연관된 베체트병 및 다른 장 장애를 포함하는 하나 이상의 증상을 가질 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 장 장애의 증상 또는 부작용은 본 명세서에 개시된 조성물로 치료될 수 있다. 예를 들어, 장 장애의 부작용은, 이에 한정되지 않으나, 피부 증상, 체중 감소, 대장 단축, 장 점막, 창자 또는 장 과투과성을 포함하고, Fc-AAT 융합 구조체(예를 들어 힌지 결실 또는 힌지 절단) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 갖는 조성물로 개선될 수 있다. 어떤 구현예는 상기 장애를 갖는 개체에 있어서 체중 감소를 감소시키거나 예방하기 위하여 본 명세서에 개시된 조성물에 의한 장 장애를 갖는 개체의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 조성물은 위장 마우스 모델에서 확인된 Fc-AAT(IgG1)가 혈장 유래 AAT보다 뛰어난 항염증 활성을 가지고, Fc-AAT3(IgG1 유래 Fc의 힌지 결실)가 Fc-AAT(IgG1)와 필적하는 항염증 활성을 갖는 이전의 관찰에 의해 지지된다.
세균성 증상
본 발명의 일부 구현예는 세균성 감염에 걸린 개체의 치료를 포함한다. 다른 구현예는 개체에 있어서 세균성 감염을 예방하기 위하여 본 발명에서 개시된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 세균성 감염은, 이에 한정되지 않으나, 그람음성 또는 그람양성 세균 또는 마이코세균 생물체를 포함할 수 있다. 그람음성세균은, 이에 한정되지 않으나, N. gonorrhoeae, N. men ingitidi, M. catarrhalis, H. injiuenzae, E. coli, 모든 Klebsiela spp., 모든 Enterobacter spp., 모든 Serratia spp, 모든 Salmonella spp., Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, 모든 Providencia spp., 모든 Morganella spp., Pseudomonas aeruginosa, 모든 Citrobacter spp., 모든 Pasteurella spp., 모든 Aeromonas spp., Pseudomonas cepacia, 모든 Shigella spp, Stenotrophomonas maltophilia, 모든 Acinetobacter spp., 모든 Legionella spp., Y. enterocolitica, 다른 Yersinoiiosis, H. ducreyeii, 모든 Chlamyidia spp., Mycoplasma pneumonia, Mycoplasma hominis, Bacteroides fragilis, P. melaninogenica, 모든 Moraxella spp., 모든 Bortedella spp., 및 P. multocida를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 마이코세균는, 이에 한정되지 않으나, M. bovis, M. tuberculosis, Mycobacterium avium complex (MAC) 생물체, M. intracellular, M. avium, M. paratuberculosis, leprosy causing (M. leprae, M. flavascens, M. lepraemurium, M. microti, M. chelonei, M. africanum, M. marinium, M. buruli, M. fortuitum, M. haemophilum, M. kansasii, M. littorale, M. malmoense, M. marianum, M. simiae, M. szulgai, M. ulcerans, M. gordonae, M. gastri, M. phlei, M. nonchromogenicum, M. smegmatis, M. terrae, M. trivial, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. gordonae, M. haemophilum, M. genavense, M. simiae, M. vaccae를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 그람양성세균은, 이에 한정되지 않으나, C. tetani, C. botulinum, C. difficile, Group A, B, C, 및 G Streptococcus, Streptococcus pneumonia, Streptococcus milleri group, Viridans streptococcus, 모든 Listeria spp., 모든 Staphylococcus spp, S. aureus ( MSSA ), S. aureus (MRS A), S epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, 모든 Clostridium spp., C. diptheriea, C. jeikium, 모든 Rhodococcus spp., 모든 Leukonostoc spp. 및 Bacillus anthracis(예를 들어, 탄저병을 일으키는 것)를 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 세균성 증상을 갖는 개체의 치료, 세균성 연관 증상의 감소 또는 개시의 예방에 사용될 수 있다.
또 다른 구현예는 개체에 있어서 패혈증 쇼크를 치료하거나 감소시키는 것에 관한 것이다. 패혈증 쇼크는 개체의 전신 세균성 감염, 예를 들어 그람 음성 지질다당류와 같은 세균성 내독소에 의해 발생될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 산화 질소 과생산이 패혈증에 기여하는 것으로 생각된다. NO 생산 감소는 패혈증 쇼크의 증상을 감소시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 방법은 Fc-AAT와 같은 AAT 융합 분자를 투여함으로써 패혈증 쇼크를 치료하는 것에 관련된다. 일부 구현예는 다른 치료, 예를 들어 전염증성 사이토카인 등에 대한 항체와 함께 AAT 융합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 또는 지질다당류를 감소시키는 약제는 종양 괴사 인자 또는 인터루킨-1 발현, 또는 인터루킨-1 수용체 길항제 발현, 또는 수용성 TNF 또는 IL-1 수용체를 감소시킨다. 어떤 구현예에 있어서, 대식세포 및 내피세포는 산화 질소 활성의 저해에 대한 세포적 표적일 수 있다. 지금까지 패혈증은 성공적인 치료가 이루어지지 않았다.
바이러스 증상
본 발명의 일부 구현예는 바이러스성 감염에 걸린 개체의 치료를 포함한다. 본 명세서에서 다른 구현예는 바이러스에 노출된 개체에 있어서 발생하는 것으로부터 바이러스성 감염을 예방하기 위하여 본 발명에 개시된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 바이러스성 감염은, 이에 한정되지 않으나, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 에이즈, 인플루엔자 바이러스(예를 들어, A형, B, C, 인플루엔자 A H1N1, H1N2, H3N2, H9N2, H7N2, H10N7), 대상포진, 단순포진, 인유두종 바이러스, 천연두 주요 바이러스(작은 수두), 라사열 바이러스, 조류 독감, 에이즈 관련 합병증, 수두(Varicella), 거대세포 바이러스(CMV), 콜로라도 진드기 열, 뎅기열, 에볼라 출혈열, 수족구병, 간염, 인유두종 바이러스, 전염성 단핵구증, 유행성 이하선염, 소아마비, 진행성 다소성 백질뇌증, 광견병, 풍진, SARS, 바이러스성 뇌염, 바이러스성 위장염, 바이러스성 뇌막염, 웨스트 나일 질환, 황열병, 마르부르그 출혈열, 홍역 및 다른 바이러스 관련 장애를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 다른 구현예는 개체에서 본 발명에 개시된 조성물을 사용하여 바이러스 복제 및/또는 감염을 억제함으로써 바이러스에 의한 감염에 의해 발생하는 암의 감소 또는 예방에 관한 것이다. 바이러스들에 의해 유도되는 암은, 이에 한정되지 않으나, 라우스 육종에 의한 암, 인유두종 바이러스(HPV)에 의한 암(예를 들어, 자궁경부암), 폴리오마에 의한 암, B형 간염 바이러스에 의한 암, 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 혈관 육종, 척삭종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프혈관내피 육종, 중피종, 활액막종, 유잉 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 횡문육종, 대장암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 전립선암, 난소암, 편평 상피 세포암, 기저 세포암, 피지샘암, 선암, 땀샘암, 유두암, 간암, 낭종암, 유두상선암, 기관지암, 수질암, 신세포암, 정상피종, 담도암, 자궁경부암, 윌름스 종양, 배아암, 폐암, 융모막암, 고환 종양, 방광암, 상피암, 소세포 폐암, 두개인두종, 수모세포종, 성상세포종, 신경교종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 뇌수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 골수종, 림프종 및 백혈병을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예는 바이러스성 폐렴 및 기관지 폐렴에 관한 것이다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시되는 조성물은 바이러스성 감염에 걸린 개체의 치료, 바이러스 연관 증상의 감소 또는 개시 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물은 개체에서 바이러스의 전염을 감소시키고 바이러스 복제를 감소시키기 위하여(예를 들어, 인플루엔자 또는 개체로부터 개체로 전염되는 다른 질환), 바이러스성 감염에 걸린 개체를 치료하는데 이용될 수 있고, 그렇게 함으로써 개체 전염에 대한 개체를 감소시킬 수 있다.
다양한 펩티드들의 구조체
본 명세서에 있어서 구현예는 전장 AAT 또는 AAT 유래 카르복시 말단 펩티드(예를 들어, AAT의 마지막 80개 아미노산에서 발견되는 AAT의 카르복시 말단 펩티드 또는 AAT의 마지막 36개 아미노산에서 발견되는 AAT의 카르복시 말단 펩티드) 중 어느 하나인 AAT 융합 분자를 신속하게 생성하는 것 및 용도를 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 조성물은 예를 들어, AAT에 대응하는 카르복시 말단 아미노산 펩티드를 포함하는 일련의 펩티드 및 이의 유도체와 같은 AAT 요법을 필요로 하는 개체(예를 들어, 포유동물 유래 AAT)의 치료용 구조체를 포함할 수 있다. 이러한 펩티드들은, FVFLM(서열번호 2), FVFAM(서열번호 3), FVALM(서열번호 4), FVFLA(서열번호 5), FLVFI(서열번호 6), FLMII(서열번호 7), FLFVL(서열번호 8), FLFVV(서열번호 9), FLFLI(서열번호 10), FLFFI(서열번호 11), FLMFI(서열번호 12), FMLLI(서열번호 13), FIIMI(서열번호 14), FLFCI(서열번호 15), FLFAV(서열번호 16), FVYLI(서열번호 17), FAFLM(서열번호 18), AVFLM(서열번호 19), 및 이의 임의의 조합을 포함하는, 다섯 개의 펩티드(pentapeptides)를 포함할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 구조체, 약학적 조성물 및 방법에 있어서의 용도로 고려되는 AAT 펩티드들은 또한 상기 카르복시 말단의 아미노산과 연결된 서열번호 1 내지 서열번호 33의 임의의 및 모든 특정 AAT 펩티드들(394개 아미노산인 자연적으로 발생하는 AAT, 가장 흔한 형태는 Ml, M2, M3 등의 아형을 갖는 M형이고, 이는 또한 본 명세서에서 고려된다)을 포함하는 것을 의미한다. 항염증 활성 및/또는 면역 조절 활성을 소유하는, 모든 AAT 폴리펩티드들은 본 명세서에 개시된 방법에서의 용도로 고려된다. 315-394 범위의 아미노산, 325-384, 358-394, 340-380 등 범위의 아미노산과 같은, AAT 또는 AAT 유사 활성을 자극하는 연속적인 아미노산의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 또한, 카르복시 말단의 5-머(mer), 10-머, 15-머, 20-머, 25-머, 30-머, 35-머 등과 같은 연속적인 아미노산의 조합이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 314-394로부터의 5-머, 10-머, 15-머, 20-머의 연속적인 아미노산의 임의의 조합이 본 명세서에서 고려되는 구조체의 생성 또는 정제에 사용될 수 있다.
어떤 구현예는, IgG(예를 들어, Fc 또는 돌연변이 Fc, 예를 들어, 상기 힌지 영역이 감소된) 또는 이의 단편에 대한, 전체 AAT 분자(예를 들어, 서열번호 1 내지 33) 또는 AAT의 카르복시 말단 아미노산 부위로부터 유래된 펩티드 분자의 연결을 포함하는 재조합 융합 단백질의 제조에 관한 것이다. AAT의 하나의 흔한 형태는 서열번호 33으로 나타낸다. 본 명세서에서 고려되는 하나의 구조체는 서열번호 32(예를 들어, 전장 AAT, 면역글로불린 분자의 리더 서열 및 Fc 부분/단편으로서 참조된다. 이러한 구조체는 본 명세서에 개시된 조성물에서 이량체 형태 또는 단량체 형태로 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 약학적으로 허용가능한 조성물은 Fc-AAT의 이량체 또는 Fc-AAT의 단량체 또는 Fc로부터 절단된 AAT 또는 이의 조합, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 힌지 영역(hinge region)의 유연성을 감소시키고 신규한 Fc-AAT 분자를 제조하기 위하여 점돌연변이가 상기 Fc 영역에서 만들어질 수 있다. 다른 구현예에 있어서, IgG1 , IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래 상기 Fc의 힌지 영역은 AAT 또는 AAT 펩티드에 Fc가 연결되기 전에 결실되거나 절단될 수 있다. Fc는 수용체 상호작용을 감소시키고 Fc-AAT 구조체 활성을 강화시키기 위하여 상기 부위를 변형하기 위해 추가로 조작될 수 있다. 예를 들면, 점돌연변이는 상기 힌지 영역의 유연성을 감소시키기 위해 상기 Fc 영역에 만들어질 수 있고, 상기 영역에 대한 제거 또는 첨가는 상기 영역에 대한 2차 상호작용에 영향을 미치기 위해 또는 새로운 Fc-AAT 분자를 생성하기 위하여 상기 융합 분자의 3차 구조로 바꾸기 위해 만들어질 수 있다.
서열번호 33: EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAK QINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQATTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDⅡTKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMG KVVNPTQK
다른 구현예에 있어서, AAT 프로테아제 결합 도메인은 상기 분자의 프로테아제 기능을 감소 또는 제거하고 엘라스타제 활성을 억제하지 않기 위하여 돌연변이될 수 있고; 이러한 분자들은 본 명세서에 고려된 Fc-AAT 돌연변이체와 같은 임의의 구조체에 사용될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 돌연변이된 AAT는 본 명세서에 개시된 방법들에 의해 AAT 구조체를 제조하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 돌연변이된 분자(예를 들어, 감소 되었거나 또는 근본적으로 프로테아제 활성이 없는)는 그것의 항염증 효과 및/또는 면역조절 효과를 유지하고 AAT 요법을 필요로 하는 개체에 있어서 항염증 분자로서 사용될 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 자연적으로 발생하는 AAT의 카르복시 말단의 마지막 80개 아미노산으로 일컫는 것뿐만 아니라 AAT의 비프로테아제 결합 부위도 인지할 것이다.
상기 언급된 각각의 방법에 있어서, α1-안티트립신 또는 이의 카르복시 말단 펩티드 유도체는 본 발명에 조성물에서의 용도가 고려된다. 이러한 펩티드 유도체들은 이에 한정되지 않으나 AAT의 마지막 80개 카르복시 말단 유래 아미노산을 포함하는 아미노산 펩티드, GITKVFSNGA(서열번호 20), DLSGVTEEAP(서열번호 21), LKLSKAVHKA(서열번호 22), VLTIDEKGTE(서열번호 23), AAGAMFLEAI(서열번호 24), PMSIPPEVKF(서열번호 25), NKPFVFLMIE(서열번호 26), QNTKSPLFMG(서열번호 27), KVVNPTQK(서열번호 28), LEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLM(서열번호 29); 및 LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF(서열번호 30), GADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK(서열번호 31), 서열번호 34 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 AAT의 카르복시 말단 펩티드는 서열번호 33으로 확인되는 자연적으로 발생하는 M형 아미노산 서열과 80%, 또는 85%, 또는 90% 이상, 또는 95%, 또는 99% 동일하다. 어떤 구현예에 있어서, 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5개 아미노산이 M형 서열의 카르복시 말단으로부터의 80머와 다를 수 있다(예를 들어, 점돌연변이).
어떤 구현예는 상기 융합 분자 서열번호 32 또는 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 IgD으로부터도 유래한 Fc 힌지 영역이 있거나 없는 다른 Fc-AAT 융합 분자의 조성물을 포함한다. 이러한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, SEC 수용체에 결합할 수 있는 재조합 AAT 또는 AAT 유래 카르복시 말단 펩티드의 조성물 또는 AAT 유사 활성을 갖는 조성물이 이를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이 상기 AAT의 카르복시 말단 부위는 마지막 80개 아미노산(서열번호 31) 또는 다른 인간 AAT 분자 또는 다른 자연적으로 발생하는 AAT 분자를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, AAT로부터 유래된 펩티드는 AAT 분자의 5-머, 10-머, 20-머, 25-머, 30-,머 35-머, 40-머, 50-머, 및 80-머까지 포함할 수 있고 상기 고려되는 임의의 펩티드는 현저한 세린 프로테아제 억제 활성이 없고, AAT의 카르복시 말단으로부터 유래되며 사고 또는 다른 이유에 의해 방사선을 받거나 많은 양의 방사선에 노출된 개체의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 구조체는 SEC 수용체와 맞물리거나 연결된 화합물을 포함할 수 있다. 상기 언급된 일부 방법에 있어서, 본 발명의 방법 내에서의 용도에 대해 고려된 현저한 세린 프로테아제 저해제 활성이 없는 AAT-돌연변이체 또는 AAT 유래 펩티드(예를 들어 포유동물 유래)는 AAT에 대응하는 카르복시 말단 아미노산 펩티드를 포함하는 일련의 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 5-머 또는 10-머 또는 20-머 또는 30-머 또는 그 이상의 아미노산의 조합이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 5-머 또는 10-머 또는 20-머 등은 서열번호 1로서 나타낸 자연적으로 발생하는 AAT의 315 아미노산에서 시작하여 394 아미노산에서 끝나는 연속적인 아미노산을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 것과 같이, 카르복시 끝에 대한 서열의 뒤쪽 절반을 카르복시 말단이라고 나타낸다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 카르복시 말단으로부터 뒤로 향하는 상기 AAT의 카르복시 도메인은 상이한 종간에서 가장 보존된 아미노산이고 AAT의 프로테아제 결합 도메인에 참여하지 않는 것으로 확인된다. 또한, 다른 구현예에 있어서, AAT 프로테아제 결합 도메인은 상기 분자의 프로테아제 기능을 감소 또는 제거하기 위하여 돌연변이될 수 있고, 이 분자는 본 명세서에서 고려되는 임의의 조성물에 사용될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 돌연변이된 분자는 그것의 항염증 및/또는 면역조절 효과가 유지될 수 있다. 또한 상기 카르복시 도메인은 비프로테아제 결합 도메인이라는 것이 본 명세서에서 고려된다. 본 기술분야의 기술자는 AAT의 비프로테아제 결합 도메인을 인지할 것이다.
상기 언급된 각각의 방법에 있어서, 본 명세서에 조성물은 AAT의 카르복시 말단으로부터 유래된 펩티드를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 상기 방법 및 조성물에서 사용되는 AAT 관련 분자는, 이에 한정되지 않으나, 서열번호 1, 자연적으로 발생하는 AAT(혈청으로부터 단리된 AAT의 약 90%를 구성하는 394 아미노산 길이의 분자), 다른 AAT M형 또는 다른 AAT 분자의 조성물을 포함할 수 있다.
그리드:
밑줄= 제한 부위
표시되지 않은 부분= 인간 AAT 분자
Fc= 음영
힌지 영역= 이탤릭체 및 진하게(Lucida console)
서열번호 47
AAT-Fc2 (pCAG.neo-hAAT-hlgGl Fc)(서열번호 32에 대한 핵산 서열)
(인공 서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG1의 Fc 단편 유래)
< DNA 서열 > dsDNA 1977 bp
Figure 112020005750889-pat00001
Figure 112020005750889-pat00002
서열번호 32
AAT-Fc2 < 아미노산 서열 >
652 아미노산
Figure 112020005750889-pat00003
서열번호 48
AAT-Fc3 (pCAG.neo-hAAT-hlgGl Fc; 힌지 결실)
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG1 힌지 결실의 Fc 단편 유래)
< DNA 서열 > dsDNA 1950 bp
Figure 112020005750889-pat00004
Figure 112020005750889-pat00005
서열번호 49
AAT-Fc3 < 아미노산 서열 > 새로운 서열 49
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG1의 Fc 단편 유래)
643 아미노산
Figure 112020005750889-pat00006
서열번호 50
AAT-Fc4 (pCAG.neo-hAAT-hIgG2 Fc, 온전함)
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG2의 Fc 단편 유래)
< DNA 서열 > dsDNA 1962 bp
Figure 112020005750889-pat00007
Figure 112020005750889-pat00008
서열번호 51
AAT-Fc4 < 아미노산 서열 >
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG2의 Fc 단편 유래)
647 아미노산
Figure 112020005750889-pat00009
Figure 112020005750889-pat00010
서열번호 52
AAT-Fc5 (pCAG.neo-hAAT-hIgG3 Fc, 온전함)
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG3의 Fc 단편 유래)
< DNA 서열 > dsDNA 1995 bp
Figure 112020005750889-pat00011
Figure 112020005750889-pat00012
서열번호 53
AAT-Fc5 < 아미노산 서열 >
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG3의 Fc 단편 유래)
658 아미노산
Figure 112020005750889-pat00013
서열번호 54
AAT-Fc6 (pCAG.neo-hAAT-hIgG4 Fc, 온전함)
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG4의 Fc 단편 유래)
< DNA 서열 > dsDNA 1965 bp
Figure 112020005750889-pat00014
Figure 112020005750889-pat00015
서열번호 55
AAT-Fc6 < 아미노산 서열 >
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG4의 Fc 단편 유래)
648 아미노산
Figure 112020005750889-pat00016
서열번호 56
AAT-Fc7 < 아미노산 서열 >
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG2의 힌지 결실된 Fc 단편 유래)
634 아미노산
Figure 112020005750889-pat00017
Figure 112020005750889-pat00018
서열번호 57
AAT-Fc7 < 아미노산 서열 >
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG2의 힌지 결실된 Fc 단편 유래)
634 아미노산
Figure 112020005750889-pat00019
서열번호 58
AAT-Fc9 < 아미노산 서열 >
(인공서열: 인간 알파-1 안티트립신 및 인간 IgG4의 힌지 결실된 Fc 단편 유래)
632 아미노산
Figure 112020005750889-pat00020
Figure 112020005750889-pat00021
본 명세서에 개시된 재조합체 또는 융합 분자와 비교 및/또는 조정을 위한 상업적으로 입수가능한 제형은 Aralast™(Baxter), Zemaira™(Aventis Behring), Prolastin™ 또는 ProlastinC™(Talecris), Aprotonin™ 또는 Trasylol™(Bayer Pharmaceutical Corporation), Ulinistatin™(Ono Pharmaceuticals, Inc.)의 상업적으로 입수가능한 제형에서 혈장 유래 AAT, 및 흡입 및/또는 주사용 AAT인 Glassia™ (Kamada, Ltd., Israel), 또는 임의의 다른 상업적으로 입수가능한 AAT 조성물 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
다른 구현예는 인간 AAT의 돌연변이체에 관한 것으로서, 상기 돌연변이체는 현저한 세린 프로테아제 저해제 활성을 갖지 않도록 생성된다. 돌연변이체 제조를 위해 본 기술분야에 공지된 임의의 방법이 고려된다. 일부 구현예는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 hAAT를 제조하기 위해 위치 선택적 돌연변이의 사용을 포함한다(실시예 부분 및 pEF-hAAT 참조). 일부 구현예에 있어서, 조성물은 돌연변이된 인간 알파-1 안티트립신(hAAT)을 갖는 약학적 조성물일 수 있고 상기 AAT는 AAT의 반응 중심루프(RCL) 내 AAT의 프로테아제 결합 부위에 하나 이상의 점돌연변이를 갖는 AAT를 포함한다. 이러한 하나 이상의 점돌연변이는 대조군 인간 AAT에 비해 상기 AAT의 세린 프로테아제 억제제 활성을 현저하게 감소 또는 제거할 수 있다. 다른 방법은 세린 프로테아제 억제 활성 또는 화학적으로 변형된 AAT(예를 들어, 인간 AAT)를 제거하거나 급격하게 감소시키기 위하여 hAAT의 가열, 또는 상기 RCL내 357 부위에 프롤린이 시스테인 잔기로 변형된 RCL 돌연변이체와 같은 돌연변이체의 제조와 같이 다른 파괴 방법에 의한 hAAT의 세린 프로테아제 억제 부위의 파괴를 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 융합 분자는 상기 RCL내 하나 이상의 아미노산에서(예를 들어, 천연 AAT의 355-363 아미노산) 하나 이상의 점돌연변이를 갖는 AAT 돌연변이체에 대한 조작된 Fc(예를 들어, IgG1, 2, 3 또는 4) 또는 FAB의 연결을 포함할 수 있고, 상기 AAT 돌연변이체는 현저한 세린 프로테아제 억제 활성을 갖지 않고 상기 RCL은 온전하게 남아있다.
약학적 조성물
본 명세서에 있어서 구현예는 생물학적으로 호환가능하고 생체 내 약학적 투여에 적합한 형태로 개체에 대한 조성물의 투여를 제공한다. "생물학적으로 호환가능하고 생체 내 투여에 적합한 형태"는 활성제의 치료학적 효과가 임의의 독성 효과를 능가하는 것에 대해 투여되는 활성제의 형태(예를 들어, 상기 구현예의 약학적 화학물질, 단백질, 유전자, 항체 등)를 의미한다. 상기 치료학적 조성물의 치료학적 유효량의 투여는 원하는 결과를 얻기 위해 필요한 시간의 기간 동안 용량에 있어서, 효과적인 양으로서 결정된다. 예를 들어, 화합물의 치료학적 유효량은 개인의 질환 상태, 나이, 성별 및 체중, 및 개인에 있어서 원하는 반응을 유도하기 위한 항체의 능력과 같은 인자들에 따라 다를 수 있다. 용량 체계는 최적 치료학적 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다.
AAT 또는 이의 펩티드 단편, 또는 이의 유사체, 또는 이의 돌연변이체, 또는 이의 기능적 유도체(예를 들어, 일부 구현예의 약학적 화학물질, 단백질, 펩티드)를 포함하는 약학적 조성물은, 예를 들어, 피하내, 정맥내, 심장내, 동맥내, 근육내, 경구 투여에 의해, 흡입에 의해, 경피 투여, 질내 투여, 국소 투여, 비강내 또는 직장 투여에 의해, 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 효소, 산 및 화합물을 비활성 시키는 다른 자연적 조건에 의해 분해되는 것으로부터 화합물을 보호하기 위하여 물질 내에 코팅될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 화합물은 경구로 투여될 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 화합물은 정맥내로 투여될 수 있다. 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 조성물은 흡입과 같이, 비강내로 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 암에 걸렸거나 또는 치료된 것으로 의심되는 개체에 하나 이상의 화학 치료제(예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물과 함께)를 전달하기 위한 스텐트 또는 카테터의 용도에 관한 것이다. 하나 이상의 약제를 종양 부위로 직접 전달할 수 있는 임의의 스텐트 또는 본 기술분야에 공지된 다른 전달 방법이 고려된다. 이러한 전달 기술은 단독으로 또는 다른 전달 방법과 병용하여 사용될 수 있다.
화합물(예를 들어, 펩티드, 단백질 또는 이의 혼합물)은 적합한 담체 또는 희석제 내에서, 효소 억제제와 함께 투여되거나 또는 리포솜과 같은 적합한 담체 내에서 개체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 식염수 및 수성 완충액와 같은 희석제를 포함하는 것을 의미한다. 상기 화합물의 비활성화를 방지하기 위한 물질로 상기 화합물을 코팅하거나, 또는 상기 화합물과 함께 투여하는 것이 필요할 것이다. 또한 활성제가 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 또한 분산제가 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜액, 및 이의 혼합물 및 오일내에서 제조될 수 있다. 보관 및 사용의 통상적인 조건하에서, 이러한 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 포함할 수 있다.
주사적 용도에 적절한 약학적 조성물은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 살균 주사가능액 또는 분산제의 즉석 제조를 위하여 살균 수용액(수용성) 또는 분산제 및 살균 분말이 사용될 수 있다.
살균 주사가능액은 필요에 따라, 상기에 열거된 성분 중의 하나 또는 조합을 갖는 적합한 용매 내에서 필요한 양으로 활성 화합물(예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 감소시키는 화합물)을 혼입함으로써 제조될 수 있고, 그 다음 여과 살균한다.
수성 조성물은 유효한 양의 치료학적 화합물, 펩티드, 에피토픽 코어 부위(epitopic core region), 자극제, 억제제 등을 포함할 수 있고, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매질에서 용해되거나 분산된다. 본 명세서에 개시된 화합물 및 생물학적 물질들은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다. 유리 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 상기 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은, 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다.
제형에 따라, 용액은 투여 제형과 호환가능한 방식으로 그리고 치료학적 유효량으로 투여될 것이다. 상기 제형은 상기 기재된 주사가능액의 형태와 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다. 또한 서방형 캡슐, 점진적으로 방출되는 미세입자 등이 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적절하다.
상기 활성 치료제는 용량당 약 0.0001 내지 1.0 ㎎, 또는 약 0.001 내지 0.1 ㎎, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 약 1 내지 10 g으로 포함하기 위하여 혼합물 내에 제형화될 수 있다. 또한 단일 투여 또는 다중 투여가 매일, 격주, 매주, 격월 등과 같이 미리 결정된 조건에 대하여 적합한 일정에 따라 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 부작용을 조절하는데 효과적인, 양 및 빈도로, 투여될 수 있다. 정확한 용량 및 치료기간은 공지된 검사 프로토콜을 사용하거나 또는 본 기술분야에 공지된 모델 시스템에서 상기 조성물을 검사하고 그것으로부터 추정함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 또한 용량은 증상의 중증도에 따라 다를 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 매일 또는 매주 개체에 도입되는 상기 조성물 범위는 1.0과 75 ㎎/㎏ 사이일 수 있다. 또한 α1-안티트립신 또는 펩티드와 유사한 활성들을 갖는 치료학적 유효량의 α1-안티트립신, 펩티드, 또는 약제는 몰농도로 측정될 수 있고 약 1 nM에서 약 2 mM 사이의 범위일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 비강액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제는 상기 관심 화합물을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 방식의 투여를 위해 적절한 추가적인 제형은 좌제 및 페서리를 포함할 수 있다. 또한 직장 페서리 또는 좌제가 사용될 수 있다. 일반적으로, 좌제에 대하여, 통상적인 결합제 및 담체는, 예를 들면, 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있으며, 이러한 좌제는 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1%-2%의 범위로 활성 성분을 포함하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
리포좀 또는 미세입자는 치료학적 전달계로서 사용될 수 있고 공지된 실험 기술에 따라 제조될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 제조된 건조된 지질 또는 동결건조된 리포솜은 활성제(예를 들어, 핵산, 펩티드, 단백질 또는 화학제)의 용액, 및 본 기술분야의 기술자에게 공지된 적절한 용매를 사용하여 적절한 농도로 희석된 용액에서 재구성될 수 있다. 캡슐화된 활성제의 양은 표준 방법에 따라 결정될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 약학적 구조체 조성물은 개체를 치료하기 위한 단일 치료 용량, 급성 방법 또는 만성 방법에 사용될 수 있는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않지만 다른 α1-안티트립신 활성을 갖는 AAT 분자 또는 이의 유사체로부터 유래된 구조체에 관한 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 고려되는 상기 융합 폴리펩티드는 현저한 프로테아제 억제 활성을 갖지 않는 융합 폴리펩티드일 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 조성물은 경구로, 전신적으로, 이식을 통해, 점진적으로 방출되는 또는 서방형 조성물(예를 들어, 겔, 미세입자 등), 정맥내, 국소, 경막내, 피하, 흡입에 의해, 비강, 또는 본 기술분야에 공지된 다른 방법 또는 이들의 조합에 의하여 투여될 수 있다.
단백질 및 구조체 발현
표적 유전자 또는 유전자의 부분이 결정되면, 상기 유전자는 적합한 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다. 상기 유전자는 폴리펩티드 산물의 대량 생성을 위하여 임의의 개수의 상이한 재조합 DNA 발현 시스템으로 발현될 수 있고, 그런 다음 정제되고 본 명세서에 개시되는 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
본 기술분야의 기술자에게 공지된 발현 시스템의 예로는 E. coli와 같은 세균, Pichia pastoris와 같은 효모, 바큘로바이러스, 및 Cos 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 발현 시스템을 포함한다. 완전한 유전자가 발현될 수 있거나, 대안적으로는, 폴리펩티드의 유전자 암호화 부분의 단편이 제조될 수 있다.
폴리펩타이드를 암호화하는 상기 AAT 유전자 또는 유전자 단편이 표준 서브클로닝 기술에 의해 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. E. coli 발현 벡터는 단백질의 신속한 친화성 정제를 할 수 있는, 융합 단백질로서 재조합 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 융합 단백질 발현 시스템의 예로는 글루타치온 S-트랜스퍼라제 시스템(Pharmacia, Piscataway, NJ), 말토스 결합 단백질 시스템(NEB, Beverley, MA), FLAG 시스템(IBI, New Haven, CT), 및 6xHis 시스템(Qiagen, Chats worth, CA)이다.
또한 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 제조될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 집단 내 자연적 변이 때문에 발생하거나 다른 종에서 발견되는 동족체일 수 있는 상기 폴리펩티드의 소수 서열 변이체일 수 있다. 또한 그들은 자연적으로 발생하지 않으나 상기 폴리펩티드의 천연 형태와 상호작용하는 면역 반응과 유사하게 기능 및/또는 유도하는 충분히 유사한 서열일 수 있다. 서열 변이체는 막관통 서열을 제거하기 위하여 본 명세서에 기재된 것들과 같은 위치 선택적 돌연변이의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입 또는 결실 변이체일 수 있다. 결실 변이체는 기능 또는 면역원성 활성에 필수적이지 않은 천연 단백질 중의 하나 이상의 잔기가 결여되고, 막관통 서열이 결여된 변이체에 의해 예시된다.
원핵 또는 진핵 시스템에서의 발현을 위한 DNA 분절(들)의 조작은 재조합 발현에 있어서 본 기술분야의 기술자에게 일반적으로 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 이는 사실상 임의의 발현 시스템이 청구된 핵산 서열의 발현에 이용될 수 있다고 여겨진다.
본 명세서에서 사용되는 상기 용어 "조작" 및 "재조합" 세포는 인간의 손을 통해 도입된 AAT 전장 cDNA 또는 유전자와 같이, 외인성 DNA 분절 또는 유전자가 유입된 세포를 의미한다. 따라서, 조작된 세포는 재조합으로 도입된 외인성 DNA 분절 또는 유전자를 포함하지 않는 자연적으로 발생하는 세포와 구별된다. 재조합 세포는 cDNA 또는 게놈 유전자를 갖는 것들을 포함하고, 또한 특별히 도입된 유전자와 자연적으로 연결되지 않은 이종 프로모터에 인접하여 위치한 유전자들을 포함한다.
단백질 및 펩티드를 암호화하는 재조합체를 발현하기 위하여, 전장 AAT 돌연변이체 또는 야생형 또는 이의 카르복시 말단 펩티드 중 하나가, 본 명세서에 구현예에 따라 본 기술분야에 공지된 하나 이상의 프로모터의 조절하에서, 또는 본 기술 분야에 공지된 하나 이상의 프로모터에 동작가능하게 연결된 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 많은 표준 기술은 다양한 숙주 발현 시스템의 단백질 또는 펩티드 발현을 달성하기 위하여 적합한 핵산 및 전사/번역 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 발현 가능한 세포 유형은, 이에 한정되지 않으나, 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 E. coli 및 B. subtilis와 같은, 세균를 포함한다.
원핵세포 숙주의 어떤 예로는 E. coli W3110(F-, 람다-, 독립영양, ATCC No. 273325)뿐만 아니라 E. coli 스트레인 RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776(ATCC No. 31537); Bacillus subtilis와 같은 바실러스들; 및 다른 Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, 및 다양한 Pseudomonas 종과 같은 다른 장내세균이다.
일반적으로, 숙주세포와 호환가능한 종들로부터 유래된 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 이러한 숙주와 관련되어 사용된다. 상기 벡터는 대개는 형질전환된 세포에서 표현형적 선별을 제공할 수 있는 표시 서열뿐만 아니라 복제 부위를 갖는다.
또한, 숙주 미생물과 호환가능한 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 파아지 벡터는 이러한 숙주와 관련되어 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 파아지 람다 GEM™-11은 E. coli LE392와 같은, 숙주세포를 형질전환하는데 사용될 수 있는 재조합 파아지 벡터를 만드는데 이용될 수 있다.
추가로 유용한 벡터는, 추후 정제 및 분리 또는 절단을 위한 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST) 가용성 융합 단백질 생성에 사용하기 위하여, pIN 벡터(Inouye et al, 1985); 및 pGEX 벡터를 포함한다. 다른 적절한 융합 단백질은 β-갈락토시다제, 유비퀴틴 등을 갖는 것들이다.
재조합 DNA 구조에서 가장 흔히 사용되는 프로모터는 β-락타마제(페니실리나제), 락토스 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 이들이 가장 흔히 사용되지만, 다른 미생물 프로모터가 발견되고 이용되고 있고, 그들의 뉴클레오티드 서열에 관한 세부 사항이 공개되고 있으며, 본 기술분야의 기술자는 플라스미드 벡터와 그들을 기능적으로 연결할 수 있게 한다.
Saccharomyces에서 발현을 위하여, 예를 들어, 플라스미드 YRp7이 흔히 사용된다. 이 플라스미드는, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, 1977)와 같은, 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 스트레인에 대한 선별 마커를 제공하는 trp1 유전자를 이미 포함한다. 효모 숙주 세포 게놈의 특성으로서 trp1 손상의 존재는 트립토판의 부재하에서 성장에 의한 형질전환 검출을 위한 유효한 환경을 제공한다. 효모 벡터의 적절한 촉진 서열은 본 기술분야에 공지되어 있다. 구조화하는데 적절한 발현 플라스미드에 있어서, mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공하기 위하여 이러한 유전자에 연결된 종결 서열은 발현되기를 원하는 서열의 발현 벡터 3'으로 또한 연결될 수 있다. 성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가적 장점을 가지는 다른 적절한 프로모터는 또한 본 명세서에 있어서 용도로 고려된다.
미생물과 더불어, 다세포 생물로부터 유래된 세포의 배양은 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 원칙적으로, 임의의 이러한 세포 배양은, 척추동물 또는 무척추동물로부터 실시 가능하다. 포유동물 세포와 더불어, 이들은 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV); 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus, TMV) 또는 다른 식물)로 감염된 식물 세포 시스템 또는 하나 이상의 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 것을 포함한다. 또한 곤충 시스템도 고려된다.
유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 VERO 및 헬라세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주이다. 또한, 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하고, 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형하고 처리하는 것이 선택될 수 있다. 이러한 단백질 산물의 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 절단)는 암호화된 단백질의 기능에 중요할 수 있다.
상이한 숙주 세포는 단백질의 번역후 처리 및 변형을 위한 특성 및 특정 메커니즘을 갖는다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 처리를 위해 선택될 수 있다. 포유동물 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 대개 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열과 함께, 하나의 복제원점(필요에 따라), 발현되는 유전자의 앞쪽에 위치한 프로모터를 포함한다. 상기 복제원점은, SV40 또는 다른 바이러스성(예를 들어, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV) 재료로부터 유리될 수 있는 것과 같은, 외인성 원점을 포함하기 위한 벡터의 구조에 의해, 또는 숙주세포 염색체 복제 메커니즘에 의해 제공될 수 있는 것을 제공할 수 있다. 상기 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 삽입된다면, 후자가 대체로 충분하다. 상기 프로모터는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 또한, 원하는 유전자 서열과 정상적으로 연결된 프로모터 또는 조절 서열을 이용하는 것 또한 가능하고, 필요할 수 있으며, 이러한 조절 서열은 숙주 세포 시스템과 호환가능하다.
아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우에 있어서, 상기 암호 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 셋으로 나뉘어진 리더 서열에 연결될 수 있다. 이 키메라 유전자는 시험관내에서 또는 생체 내에서의 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈(예를 들어, 부위 E1 또는 E3)의 비필수 부위의 삽입은 감염된 숙주에서 생존하고, 단백질 발현을 할 수 있는 재조합 바이러스를 야기할 것이다.
또한 특정 개시 서열이 청구된 단리된 핵산 암호 서열의 효과적인 번역을 위해 필요할 것이다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는, 외인성 번역 조절 신호가 추가로 제공될 필요가 있다. 본 기술분야의 기술자는 용이하게 이를 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 전체 삽입의 번역을 보장하기 위하여 개시 코돈은 필요한 암호 서열의 리딩 프레임과 같이 프레임(또는 같은 위상에서) 해야 한다는 것이 잘 공지되어 있다. 이러한 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두, 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율은 적합한 전사 인핸서 요소 또는 전사 종결자의 포함에 의해 향상될 수 있다(Bittner et al, 1987).
진핵 세포 발현에 있어서, 원래의 복제된 분절 내에 포함되지 않은 경우, 하나는 전사 단위 적합한 폴리아데닐화 부위(예를 들어, 5'-AATAAA-3') 내로 도입하는 것이 전형적으로 필요할 것이다. 전형적으로는, 폴리 A 삽입 부위는 전사 종결 전 위치에서 단백질의 종결 부위의 약 30 내지 2,000 뉴클레오티드 "하류"에 위치한다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위하여, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 단백질을 암호화하는 구조체를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제원점을 포함하는 발현 벡터를 사용하기보다, 숙주 세포를 적합한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결, 폴리아데닐화 부위, 등) 및 선별 마커로 조절되는 벡터로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장하도록 할 수 있고, 그런 다음 선별 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드에서 선별 마커는 선별에 대한 저항력을 부여하고 세포가 안정적으로 자신의 염색체에 플라스미드를 삽입하고 세포주로 차례로 복제 및 확장될 수 있도록 하는 지점을 형성하기 위해 성장하도록 한다.
많은 선별 시스템은, 이에 한정되지 않으나, 각각 tk, hgprt 또는 aprt 세포에, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 포함한다. 또한, 항 대사물질 저항성은 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는, dhfr; 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는, gpt; 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 하이그로에 대한 선별 또는 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 기초하여 사용될 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산은, 즉 인간 전립선, 방광 또는 유방 세포에서 그것의 자연적 발현과 관련하여 또는 심지어 재조합 숙주 세포에서 다른 단백질의 발현과 관련하여 증가된 수준으로 발현되는, "과발현"될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 과발현은 방사선-표지 및/또는 단백질 정제를 포함하는, 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 단순하고 직접적인 방법은, 예를 들어, SDS/PAGE 관련된 것 및 단백질 염색 또는 웨스턴 블랏팅, 그 다음 그 결과로 생긴 겔 또는 블랏의 농도계 스캐닝과 같은, 정량 분석이 바람직하다. 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 다른 단백질과 관련하여 상기 특정한 단백질의 상대적인 존재도이고, 예를 들어, 겔 상에서 볼 수 있는 것과 같이, 자연적인 인간 전립선, 방광 또는 유방 세포에서의 수준과 비교하여 상기 재조합 단백질 또는 펩티드의 수준에 특정한 증가는 과발현을 나타낸다.
면역 분자(예를 들어, Fc 부분)를 사용하여 생성된 구조체가 다양한 친화성 컬럼을 사용하여 단리될 수 있는 것이 본 발명에서 고려된다. 게다가, Fc 단편은 또한 힌지 영역을 제거하는 것과 같이 추가로 조작될 수 있다. 이러한 Fc 단편은 임의의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgD를 포함할 수 있다. 상기 힌지 영역은 AAT 표적 분자에 면역 단편이 연결되기 전에 제거되거나 절단되거나 돌연변이될 수 있다.
단리된 단백질
한 구현예는 단리된 단백질, 및 생물학적으로 유효한 이의 펩티드와 관계가 있다. 한 구현예에 있어서, 상기 천연 폴리펩티드는 표준 단백질 정제 기술을 사용한 적합한 정제 방식에 따라 세포 또는 조직 재료로부터 단리될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 천연 폴리펩티드는 세린 프로테아제 억제제 활성을 감소 또는 제거하기 위하여 가열되거나 그렇지 않으면 처리될 수 있다. 어떤 특정 구현예에 있어서, 세린 프로테아제 억제제 활성은 현저한 활성이 남아 있지 않은 것으로 감소된다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 재조합 발현에 대한 대체로, 폴리펩티드는 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물에서의 용도로 고려되는 임의의 상기 펩티드 또는 단백질 분자는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 조성물일 수 있다. 예를 들어, AAT 조성물은 세린 프로테아제 억제제 활성을 감소 또는 제거하기 위하여 돌연변이 또는 절단될 수 있거나 또는 AAT 폴리펩티드는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성이 감소되거나 또는 없는 폴리펩티드로 단리될 수 있다.
"단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성적인 부분은 세포로부터 세포 물질 또는 다른 오염 단백질들이 또는 이로부터 조직 재료들이 상당히 제거된 것이고 화학적으로 합성된 경우 상기 단백질이 유래되거나, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 상당히 제거된다. 따라서, 세포 물질이 상당히 제거된 단백질은 이형 단백질(또한 본 명세서에서 "오염 단백질"로 나타낸다)을 약 30%, 20%, 10% 이상, 또는 5%(건조중량에 대하여) 미만으로 갖는 단백질의 제조를 포함한다. 상기 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성적인 부분이 재조합으로 제조된 경우, 배양 배지의 상당한 제거도 바람직하다. 상기 단백질이 화학적 합성에 의해 제조된 경우, 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질의 상당한 제거가 바람직하다. 예를 들어, 상기 단백질의 이러한 제조물은 관심 폴리펩티드보다 약 30%, 20%, 10% 이상, 5% 이상(건조중량에 대하여) 미만의 화학적 전구체 또는 화합물을 갖는다.
어떤 구현예에 있어서, 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드는 펩티드 또는 단백질을 제조하기 위하여 본 기술분야에 공지된 임의의 구조체에 삽입될 수 있다. 이러한 펩티드는 AAT 또는 AAT 대립 유전자의 카르복시 말단의 마지막 80 아미노산의 일부 또는 전부에 대응하는 연속된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 유용한 단백질은 천연 대립 유전자 변이 또는 돌연변이 때문에 아미노산 서열에 차이는 있으나 카르복시 말단의 임의의 부분과 상당히 동일하고, 세린 프로테아제 저해제 활성 이외에 대응하는 자연적으로 발생하는 단백질의 펩티드의 기능적 활성을 유지한다.
어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 Fc-AAT 구조체의 정제는 단백질 A 컬럼 또는 단백질 A 매트릭스 또는 이와 같은 종류의 것(Pierce 또는 다른 IgG 정제 키트)을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 구조체의 정제는 표적 AAT 단백질 또는 펩티드의 항염증 또는 면역 조절 활성을 보존하기 위하여 최소 단계를 사용함으로써 될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 본 발명에 고려된 구조체의 정제는 단일 단계로 될 수 있다(예를 들어, Fc-AAT 분자의 단백질 A 컬럼 정제)(예를 들어, Kin-Ming et al. Protein Engineering vol.11 no.6 pp.495-500, 1998; expression/Fc/Fc-X/fusion protein; 및 이중체 기술(diabody technologies) 참조).
그것에 가역적으로 결합할 수 있는(예를 들어, 이황화 또는 다른 결합을 통해) 임의의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 핵산이 본 명세서에 개시되는 AAT 구조체를 제조하기 위해 사용될 수 있다는 것이 본 명세서에서 고려된다. 이러한 구조체는 감소된 기능 손실과 함께 증가된 정제를 위해 AAT 더블릿으로 사용될 수 있고, 또한 치료학적 응용 용도 또는 연구 목적에 대해 이합체 분자로 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, AAT 또는 상기 카르복시 말단 단편에 연결된 상기 부분은 증가된 면역원성이 요구되지 않는 한 불활성 또는 실질적으로 비면역원성일 수 있다. 또한, Fc는 보체 상호작용 또는 활성화를 감소시키거나 제거하기 위하여 본 명세서에 개시된 구조체에서 조작된다(예를 들어, 힌지가 결실됨). 상기 AAT의 카르복시 말단 부위에서 Fc 위치 결정은 항염증 및 엘라스타제 저해와 같은 어떤 AAT 활성을 방해하지 않는 것으로 확인되었다.
다른 용도
본 명세서에 개시되는 일부 조성물은 과도한 세린 프로테아제 활성에 의하여 전체 또는 부분적으로 야기된 생리적 증상의 치료에 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 생리학적 증상은 전체 또는 부분적으로 억제될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 펩티드는 이의 유리 펩티드 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 조성물로 투여될 수 있다. 펩티드는 약학적 조성물로서 개체에 투여될 수 있고, 이는 대부분 경우에, 상기 융합 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 제형을 포함할 것이다.
AAT 또는 이의 펩티드 유도체의 생물학적으로 활성적인 부분은 상기 단백질과 충분히 동일하거나 또는 단백질의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 포함할 수 있다(예를 들면, 대응하는 전장 단백질의 적어도 하나의 활성을 나타내는 서열 번호 2 내지 32, 34, 49 또는 51 중 임의의 것으로 획득된 상기 아미노산 서열). 본 발명의 단백질의 생물학적으로 활성적인 부분은, 예를 들어, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 그 이상의 길이의 아미노산인, 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 단백질의 다른 영역이 삭제된 것에 있어서 현저한 세린 프로테아제 저해제 활성을 갖지 않는 다른 생물학적으로 활성적인 부분은, 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고 본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 천연 형태의 기능적 활동 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 상기 서열번호 2 내지 32, 34, 49 또는 51의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 유용한 단백질은 임의의 서열번호 1 내지 34, 49 및 51, 및 서열번호 49, 56, 57, 58로 나타내는 Fc 또는 Fc 힌지 영역 조작이 있거나 없는 다른 구조체에 연결된 AAT와 실질적으로 동일하다(예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%).
현저한 세린 프로테아제 활성을 갖지 않는 AAT 분자의 변이체는 예를 들어, 불연속 점돌연변이 또는 절단과 같은, 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 점돌연변이는 AAT 또는 펩티드와 세린 프로테아제 결합 능력을 방해 또는 방지하지만 방사선 부작용을 조절하는 능력을 유지하는 여전히 반응 중심 루프(RCL)가 남아있는 AAT 또는 이의 펩티드 유도체에서 생성될 수 있다. 작용제는 상당히 동일하게 유지할 수 있거나, 또는 현저하지 않은 세린 프로테아제 활성을 제외한 단백질의 자연적으로 발생하는 형태의 생물학적 활성의 일부가 남아있다. 단백질의 길항제는 예를 들어, 관심 단백질을 포함하는 세포 신호 캐스케이드의 하류 또는 상류 구성원에 경쟁적으로 결합하는 것에 의하여 단백질의 자연적으로 발생하는 형태의 활성 중 하나 이상을 억제할 수 있다. 따라서, 특정 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이를 이용한 치료에 의해 유도될 수 있다. 단백질의 자연적으로 발생하는 형태의 생물학적 활성의 일부를 갖는 변이체를 이용한 개체의 치료는 단백질의 자연적으로 발생하는 형태를 이용한 치료와 관련하여 개체에서 더 적은 부작용을 가질 수 있다.
융합 폴리펩티드
다른 구현예에 있어서, AAT 및/또는 이의 유사체, 또는 펩티드 유도체 또는 이의 단편과 같은 약제는 융합 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 한 실시예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 AAT(예를 들어, 인간과 같은 포유동물에서 자연적으로 발생하는 α1-안티트립신) 또는 이의 유사체 또는 이의 단편 및 IgG 단편(예를 들어, Fc 힌지 결실 또는 힌지 절단 또는 이의 돌연변이)과 같은 면역 단편일 수 있는 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시되는 융합 폴리펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 융합 단백질 또는 융합 펩티드를 제조하기 위한 임의의 공지된 방법은 본 명세서에서 고려된다.
또 다른 구현예에 있어서, AAT 폴리펩티드 또는 펩티드 융합 단백질은 GST 서열의 C-말단에 융합된 GST 융합 단백질일 수 있다. 융합 발현 벡터 및 정제 및 검출 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 원핵생물(예를 들어, E. coli) 또는 진핵 세포(예를 들어, 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터를 사용한), 효모세포 또는 포유동물 세포)에서 본 발명의 융합 폴리펩티드의 발현을 위해 통상적으로 설계될 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산은 본 기술분야에 설명된 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다.
본 발명에 개시된 융합 분자와 비교하여 시스템으로 혈장 유래 AAT 제형의 효과를 검사할 경우, 본 명세서에 개시된 Fc-AAT는 2개의 Fc-AAT 단일 분자를 생성하는 그들이 절단되거나 감소되지 않는 한, 2 AAT 분자의 더블릿으로서 발생하기 때문에 단백질 농도가 고려된다. 본 발명에 개시된 조성물에서 Fc-AAT 융합 분자의 사용은 본 명세서에 제공한 바와 같이 또는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 혈장 유래 AAT 치료에 대응하는 염증 증상 또는 다른 증상을 갖는 개체를 치료하기 위하여 서열번호 32, 49, 51, 53, 또는 55-58 중 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 조성물을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 돌연변이 AAT 형태 또는 AAT 펩티드 단편인 AAT에 연결된 Fc는 체내에서 상기 AAT의 반감기를 증가시킬 수 있거나, 체내에서 상기 구조체의 세포 흡수 및 운반을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 새로운 분자가 만들어지고, 여기서 혈장 유래 AAT 및 다른 재조합체에 비해 AAT의 재조합 형태의 생성뿐만 아니라 Fc-AAT(IgG1, Fc-AAT2)에 비해 체내에서 향상에 대해서 다수의 향상이 관찰된다.
병용 요법
본 명세서에 기재된 상기 임의의 구현예는 본 명세서에 개시된 조성물과 병용하는 하나 이상의 다른 치료학적으로 효과적인 약제를 추가로 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 이러한 대체 약제는 상기 암 치료에서 암 관련 약물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 치료는, 이에 한정되지 않으나, 아스피린 및 예를 들어, 클로피도그렐 , 프라수그렐, 티카그렐러, 압식시맙, 엡티피바타이드, 티로피반을 포함하는 다른 항혈소판 요법; 헤파린 및 유도체; 직접적 트롬빈 억제제 또는 Xa 억제제; 와파린, 안지오텐신 전환 효소 저해제 또는 안지오텐신 수용체 차단제; 베타- 및 알파-아드레날린 수용체 차단제; 칼슘 채널 차단제; HMGCoA 환원효소 억제제(예를 들어, 스타틴); 니아신 및 이의 유도체; 페노피브레이트; 생선 기름; 알도스테론 차단제; 하이드랄라진 및 질소 유도체; 포스포디에스테라제 억제제; 직접적 구아닐릴사이클라제 활성제, 항균성 약물, 항염증제, 면역조절제 또는 면역억제제 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
항균제의 예로는, 이에 한정되지 않으나, 페니실린, 퀴놀론, 아미노글리코시드, 반코마이신, 모노박탐, 세팔로스포린, 카바세펨, 세파마이신, 카바페넴, 및 모노박탐 및 그들의 다양한 염, 산, 염기, 및 다른 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용에 고려되는 항진균제는, 이에 한정되지 않으나, 캐스포펀진, 테르비나핀 하이드로클로라이드, 니스타틴, 암포테리신 B, 그리세오풀빈, 케토코나졸, 미코나졸, 질산, 플루시토신, 플루코나졸, 이트라코나졸, 클로트리마졸, 벤조산, 살리실산, 및 셀레늄 설파이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용에 고려되는 항바이러스제는, 이에 한정되지 않으나, 발간시클로비어, 아만타딘 하이드로클로라이드, 리만타딘, 아시클로비어, 팜 시클로비어, 포스카넷, 간시클로비어 소듐, 이독수리딘, 리바비린, 소리부딘, 트리플루리딘, 발라시클로비어, 비다라빈, 디다노신, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘, 인터페론 알파, 및 에독수딘을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용에 고려되는 항기생충제는, 이에 한정되지 않으나, 피레트린/피페로닐 부톡시드, 퍼메스린, 이오도퀴놀, 메트로니다졸, 디에틸카바마진 시트레이트, 피페라진, 피란텔 파모에이트, 메벤다졸, 티아벤다졸, 프라지콴텔, 알벤다졸, 프로구아닐, 퀴니딘 글루코네이트 주입, 퀴닌 설페이트, 클로로퀸 포스페이트, 메플로퀸 하이드로클로라이드, 프리마퀸 포스페이트, 아토바쿠온, 코-트리목사졸(설파메톡사졸/트리메토프림), 및 펜타미딘 이세티오네이트를 포함할 수 있다.
면역조절제는 예를 들어, 면역계에서 세포의 세포 활성을 자극 또는 억제함으로써(예를 들어, T-세포, B-세포, 대식세포, 또는 항원제시세포(APC)), 또는 차례로, 면역계를 자극, 억제, 또는 조절하는 면역계 외부 구성요소(예를 들어, 호르몬, 수용체 작용제 또는 길항제, 및 신경전달물질)에 작용함으로써, 직접 또는 간접적으로, 면역계에 작용하는 약제를 포함할 수 있고; 다른 면역조절제는 면역억제제 또는 면역자극제를 포함할 수 있다. 항염제는, 예를 들어, 염증 반응, 상처에 대한 조직 반응을 치료하는 약제, 면역, 혈관, 또는 림프계를 치료하는 약제 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용에 고려되는 항염증 또는 면역조절 약물 또는 약제는, 이에 한정되지 않으나, 인터페론 유도체, 예를 들어, 베타세론, β-인터페론; 프로스탄 유도체, 일로프로스트, 시카프로스트; 코르티솔, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드; 사이클로스포린 A, FK-506, 메톡살렌, 탈리도마이드, 설파살라진, 아자티오프린, 메토트렉세이트와 같은 면역억제제; 리폭시게나제 억제제, 예를 들어, 질루톤, MK-886, WY-50295, SC-45662, SC-41661A, BI-L-357; 펩티드 유도체 예를 들어 ACTH 및 유사체; 가용성 TNF(종양 괴사 인자)-수용체; TNF-항체; 인터루킨의 가용성 수용체, 다른 사이토카인, T-세포 단백질; 인터루킨의 수용체에 대한 항체, 다른 사이토카인, 및 T-세포-단백질을 포함한다.
본 명세서에 조성물과 조합하여 사용하는 다른 약제는 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖는 분자일 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 사용이 고려되는 다른 세린 프로테아제 억제제는, 이에 한정되지 않으나, 백혈구 엘라스타제, 트롬빈, 카텝신 G, 키모트립신, 플라스미노겐 활성제 및 플라스민을 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에 개시된 방법의 다른 조합 조성물은 어떤 항체 기반 요법을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로는, 폴리클로날 항림프구 항체, T-세포 항원 수용체 복합체에 대한 단일클론 항체(OKT3, TIOB9), 인터루킨-2 수용체 알파를 포함하는 추가적 세포 표면 항원에 대한 단일클론 항체를 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 항체 기반 요법은 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법과 조합하여 유도 요법으로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 개체는 인간 개체, 남성 또는 여성, 성인 또는 어린이, 유아, 또는 태아, 또는 이에 한정되지 않지만, 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 기니피그, 새 및 설치류를 포함하는 비인간 개체와 같은 다른 개체를 포함할 수 있다.
AAT
인간의 AAT는 내부 이황화 결합을 갖지 않고 시스테인 또는 글루타티온 중 하나에 일반적으로 분자간 이황화 결합된 단일 시스테인 잔기를 가진 단일 폴리펩티드 사슬이다. AAT의 하나의 반응 부위는 메티오닌 잔기를 포함하고, 이는 담배 연기 또는 다른 산화 오염물질에 대한 노출로 산화에 대해 불안정하다. 이러한 산화는 AAT의 엘라스타제 억제 활성을 감소시킬 수 있으므로; 그 위치에 또 다른 아미노산으로, 예를 들어, 알라닌, 발린, 글리신, 페닐알라닌, 아르기닌 또는 리신의 치환이 더욱 안정한 AAT의 형태를 생산한다. 천연 AAT는 서열번호 1 내지 33의 화학식으로 표시될 수 있거나 또는 다른 공지된 자연적으로 발생하는 AAT 분자일 수 있다.
본 명세서에 개시된 융합 분자들을 제조 또는 정제하기 위하여 임의의 공지된 방법이 고려된다(예를 들어, 포유동물 세포에서, 세균에 의해, 균류에 의해 또는 다른 생물체 또는 식물에서 제조되는 것에 의해).
키트
또 다른 구현예에 있어서, 상기 기재된 조성물, 구조체(예를 들어, 재조합 및/또는 융합 분자) 및 방법과 함께 사용하기 위한 키트가 고려된다. 키트는 AAT 융합 또는 재조합 구조체(예를 들어, Fc-AAT; Fc-돌연변이체 AAT, AAT와 연결된 IgG2 돌연변이체 또는 AAT의 카르복시 말단 유도체 또는 서열번호 32, 49-58의 힌지 결실된 구조체인 Fc), AAT로부터 유래된 하나 이상의 펩티드의 구조체, 돌연변이체 AAT 구조체 조성물, 유전자 치료 전달계와 연결된 돌연변이체 AAT 분자 또는 다른 조합을 포함할 수 있다. 소분자, 단백질 또는 펩티드는 임의의 상기 개시된 방법의 용도를 위해 이용될 수 있다. 게다가, 항균제, 면역억제제, 항염증제와 같은 다른 약제가 상기 키트에 제공될 수 있다. 상기 키트는 적절한 용기 수단, 단백질 또는 펩티드 또는 유사체 약제 및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 약제를 포함할 수 있다.
상기 키트는 암호화되는 단백질 또는 폴리펩티드 항원의 적절히 분주된 구조체 조성물을 추가로 포함할 수 있고, 표지 또는 표지되지 않은, 검출 분석을 위한 표준곡선을 만들기 위하여 또는 기재된 치료학적 적용을 위하여 사용될 수 있다.
상기 키트의 용기는 일반적으로 적어도 하나의 유리병, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단 또는 다른 전달 장치(예를 들면, 스텐트 또는 카테터)를 포함할 것이다. 또한 키트는 일반적으로 그 안에 다른 조합제가 있을 수 있는 두 번째, 세 번째 또는 다른 추가적인 용기가 포함될 것이다. 이러한 용기는 원하는 유리병이 안에 유지되는 주사 또는 블로우형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 키트는, 이에 한정되지 않으나, AAT, AAT 단편, 또는 AAT 유사체 또는 폴리펩티드의 구조체를 포함하는, 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 키트는 현저한 세린 프로테아제 억제제 활성을 갖지 않는 AAT 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 다양한 구현예를 설명하기 위하여 포함되어 있다. 이는 청구된 방법, 조성물 및 장치의 실시에 있어서 잘 기능하도록 확인된 기술을 나타내는 실시예에 개시된 기술들은 본 기술분야의 기술자에게 이해되어야 한다. 그러나, 본 기술분야의 기술자는 본 개시 내용을 고려하여, 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 같거나 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있는 개시된 일부 구현예들에서 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1
재조합 인간 AAT의 제조용 발현 플라스미드의 생성
한 예시적인 방법에 있어서, Fc-AAT 구조체가 생성될 수 있다. 재조합 AAT는 도 1에 나타낸 바와 같이 융합 분자에 대해 생성될 수 있다. 인간 AAT(또는 카르복시 말단 펩티드와 같은 AAT 펩티드)서열은 발현 벡터인 pCAGGS로 삽입된다. 1260 염기쌍의 인간 전장 AAT cDNA는 인간의 간 라이브러리로부터 단리되었고, 도 1에 예시한 바와 같이 pCAGGS로 삽입되었다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 발현을 위해 상기 플라스미드로 형질감염시켰다. 한계희석을 사용하여, AAT-양성 클론을 선별하였고, 무혈청 배지에서 성장시켰다. 상등액을 수득하고 모았다. 인간 AAT에 대한 항체를 사용하여, AAT를 입증하는 약 55 kDa의 밴드가 웨스턴 블랏에서 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 상기 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4(힌지 영역 결실, 돌연변이 및 전체 힌지 영역 결실까지가 있거나 없는) Fc 수용체를 갖는 융합 단백질이 재조합 AAT 또는 이의 융합 분자를 생성하기 위하여 사용되었다. 이러한 구조체는 정제되었다. 어떤 예시적 방법에 있어서, 이러한 구조체는 Fc에 결합하는 단백질 A(컬럼 또는 매트릭스 등으로)를 사용하여 정제되었고, 용액으로부터 표적 융합 분자를 신속하게 단리하였다. 본 명세서에 있어서 제조된 융합 분자의 대표적인 SDS-PAGE 젤 분리(예를 들어, Fc-AAT2/AAT-Fc2 및 Fc-AAT-6/AAT-Fc6)에 대해서는 도 3을 참조.
실시예 2
또 다른 예시적인 방법에 있어서, 본 명세서에 개시된 융합 구조체는 정제될 수 있고 상업적으로 입수가능한 AAT 조성물에 의해 치료되는 것으로 공지된 임의의 증상 또는 다른 염증 증상에 대한 방법 또는 치료법에 사용될 수 있다.
인간 Fc IgG 플라스미드는 Qiagen에서 구입할 수 있다(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 등). 인간 cDNA를 잘라내어 PCR 복제를 통해 인간 Fc 벡터에 삽입했다. 인-프레임 서열은 확인이 수행되었다. 상기 플라스미드는 CHO 세포 내로 형질감염되었고 단일 클론을 얻기 위해 한계희석한 후, 몇몇 안정적인 클론이 단리되었다. 상기 안정적인 클론은 증식되고 무혈청 배지를 사용하여 추가로 선별되었다. 대량 세포 배양을 수행하였고 상등액을 수집하고 모았다.
Fc-AAT 융합 분자를 함유하는 상등액은 매트릭스로서 단백질 A를 사용하여 젤 또는 컬럼에서 정제될 수 있다. 어떤 방법에 있어서, 본 명세서에서 생성된 인간 Fc-AAT는 글리신(약 pH 2.4)를 사용하여 상기 단백질 A로부터 용출된 후, 약 pH 7.4인 생리적인 pH로 신속하게 중화되었다. 이러한 방법은 환원 조건 하에서 SDS-PAGE 젤 상에 단일 밴드로 나타났다. 그런 다음 정제된 Fc-AAT 융합 구조체는 엘라스타제 저해 분석, 항염증 분석(예를 들어, 사이토카인 수준 등에 대한 영향)과 같은 AAT 관련 활성에 대하여 Aralast™, Glassia™, ProlastinC™와 같은 상업적으로 입수가능한 제형과 쉽게 비교될 수 있다.
인간 AAT Fc의 정제: 웨스턴 블랏은 IgG1 유래 Fc에 대한 조작이 없는 2개의 Fc-AAT 전장 분자의 온전한 이량체를 나타내는 밴드(약 170kDa)를 나타냈다. 상기 웨스턴 블랏 상에서 다른 래인은 모든 이황화 결합이 깨어져 Fc-AAT의 2개의 단일 분자를 형성한 때를 나타냈다. 비환원 젤뿐만 아니라 환원 젤 모두 상기 AAT 구조체의 정제의 수준을 나타냈다. Fc-AAT는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 포유동물 세포 배양 상등액으로부터 단일 단계로 정제될 수 있고, 따라서 AAT 활성에 유해한 정제의 부작용을 급격하게 감소시킨다. 다음 클론들이 생성되었다: 클론 2: IgG1 및 상기 AAT의 카르복시 말단에 대한 링커를 사용한 Fc-AAT, 클론 3: Fc의 힌지 영역이 제거된 IgG1 및 상기 AAT의 카르복시 말단에 다시 연결된 링커를 사용한 Fc-AAT. 다른 클론들은 힌지 영역 결실이 있거나, 없는 IgG2, IgG3 및 IgG4 유래 Fc를 포함하는 것으로 생성된다. Fc-AAT2 및 Fc-AAT3은 엘라스타제 저해 활성을 보유하는 것으로 언급되지만, 체내에서 및 시험관내에서 모두 비교할 경우 어떤 조건 하에서 다르게 행동하므로, 이는 상기 세린 프로테아제 저해 활성 영역이외의 AAT의 다른 활성적인 영역이 AAT의 항염증 및 항면역 활성적인 영역에 관여되고 제안되는 것을 의미한다.
실시예 3
마우스 RAW 대식세포로부터 사이토카인 유도된 TNFα에 대한 Fc-AAT(또는 마우스 AAT Fc)의 영향이 부분적으로는 신속한 정제 및 상기 클론의 보존된 AAT 활성때문에 천연 AAT(예를 들어, 상업적으로 입수가능한 제형)의 것보다 TNFα를 감소시키는 것에 더 강할 것이다라는 가설이 제시되었다. 또한, 완전한 힌지 결실이 있는 클론 3이 감소된 2차 활성 문제(예를 들어, 감소된 보체 활성 등)때문에 시험관내에서 시험된 어떤 활성에 있어서 뿐만 아니라 체내에서 사용을 위해 개선된 제형에 더 강할 수 있다는 가설이 제시된다: 한 예시적 방법에 있어서, ATT-Fc2/Fc-AAT2(클론 2, 온전한 IgG1 힌지) 및 AAT-Fc3/Fc-AAT(클론 3, 결실된 IgG1 힌지)가 원하지 않는 면역 활성을 검사하기 위하여 면역 자극 활성의 자연적인 생산인 마우스 TNFα 생산에 대한 영향에 대하여 검사하였다.
AAT 융합 분자에 대한 사이토카인 분석: 시험관내에서 사이토카인 생산에 대한 세포 배양물에 대한 분석. RAW 대식세포가 하기 실험에 사용되었다. 96웰 플레이트 내에 RAW 264.7 세포(웰당 세포: 3×105)가 사용되었다. 증가된 농도의 AAT-Fc2 및 AAT-Fc3가 도면에 나타낸 바와 같이 상기 마우스 RAW 세포를 자극하기 위하여 적용되었다. 상기 AAT-Fc에 의한 마우스 TNFα 생산의 평균 ± SEM는 제조업자의 지시에 따라 표준 ELISA 키트로 측정되었다(R&D Systems, Minneapolis MN). 여기에 2개의 상이한 AAT-Fc 분자에 의한 마우스 TNFα의 자연 유도의 차이점이 검사되었다. 이러한 결과는 AAT-Fc3(힌지 결실)이 이러한 시험관내 모델에서조차도 전-염증성 사이토카인 마커인 TNFα 생산의 감소에 더 효과적임을 지지한다. 도 4a는 2개의 융합 분자인, Fc-AAT2 및 FcAAT3의 비교와 시험관내 시스템에서 TNFα 생산의 영향을 나타낸다. 도 4b는 상업적으로 입수가능한 혈장 유래 AAT 제형(Aralast™)과, 2개의 융합 분자인 Fc-AAT2 및 Fc-AAT3의 비교를 나타낸다. Fc-AAT3는 혈장 유래 AAT(Aralast™)에 필적하는 뛰어난 결과를 나타낸다. 주목하게는, 종양 괴사 인자(TNF), 카켁신 또는 카켁틴 및 이전에 공지된 종양 괴사 인자-알파 또는 TNF-α는 전신 염증에 관련된 사이토카인이고, 급성 단계 반응을 자극하는 사이토카인 군 중 한 구성원이다. 비록 그것은 CD4+ 림프구, NK 세포 및 신경세포와 같은 많은 다른 세포 유형에 의해 서로 생산될 수 있지만, 그것은 활성화된 대식세포(M1)에 의해 주로 생산된다. 이러한 시험관내 연구는 힌지 영역이 결실되거나 변형된 Fc-AAT가 온전한 Fc 힌지 영역이 있는 Fc-AAT보다 확실히 뛰어난 품질을 가지고, 혈장 유래 제형만큼 TNF 생산 저해에 대해 활성적임을 지지한다.
이러한 실험은 AAT-Fc2(IgG1, 클론 2) 및 AAT-Fc3(힌지 결실, IgG2, 클론 3)의 관찰된 결과가 상업적으로 입수가능한 제형에 필적하고 그와 비교하여 이들의 효능을 정확하게 반영한다는 것을 확실히 하기 위하여 3회 수행되었다(예를 들어, 도 4a 및 4b 참조). 여기서, AAT-Fc2(IgG1) 및 AAT-Fc3(힌지 결실)(도 4a)에 의한 마우스 TNFα의 자연 생산에서 현저한 차이점이 있고, AAT-Fc3 유도된 TNFα가 AAT-Fc2에 비해 급격하게 감소된 것이 관찰되었다. 또한, AAT-Fc2(클론 2) 및 AAT-Fc3(클론 3)을 상업적으로 입수가능한 제형(예를 들어, Aralast)과 비교할 경우 현저한 차이가 있었다.
유사한 데이터는 자극제로서 인간 IL-33을 사용하여 관찰되었다. 또한 재조합 마우스 IL-33이 시험되었고, 100 및 500ng/㎖ 수준의 Fc-AAT(AAT 전장과 온전한 IgG1 Fc)에 의한 TNFα의 저해가 일관되게 나타났다.
실시예 4
IL-1 수용체 길항제 유도 및 IL-8 유도
이러한 예시적인 방법에 있어서, IL-8의 생산이 평가되었다. IL-8은 염증성 분자이고, 그것의 생산은 유도된 염증 반응의 지표이다. 본 실시예에 있어서, 인간 혈액 호중구(3×106 세포/㎖)는 단독으로 또는 LPS(10ng/㎖)의 존재하에, 재조합 AAT(클론 2)(10㎍/㎖) 또는 이 둘의 조합으로 6시간 동안 배양되었다. IL-8의 생산은 상기 세포 배양 상등액에서 측정되었다(N=3). 재조합 AAT가 상기 자극제 LPS의 존재시 IL-8 발현을 급격하게 감소시키는 것으로 확인되었다. 상기 Fc가 조작된 반면 이러한 클론의 상기 AAT 부분이 온전하기 때문에, 클론 3(힌지 결실된 IgG1)이 이 실험에서 반영된 것과 같이 유사한 활성을 가질 것으로 제안된다(도 5a 참조). 이 데이터는 혈장 유래 AAT를 사용한 이전의 데이터에 의해 지지된다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, 이러한 분자는 염증을 저해할 수 있다.
다른 예시적인 방법에 있어서, 다른 염증 마커에 대한 재조합 분자 제형의 영향을 평가하기 위하여 IL-1 수용체 길항제(IL-lRa)가 분석되었다. 이 실시예에 있어서, 인간 호중구 세포로부터 IL-1 수용체 길항제의 생산이 재조합 AAT(Fc-AAT2, 클론 2: 도 Y2 참조, 상기 분자의 유도가 없는 음성 대조군과 동등하다)의 다양한 농도에서 측정되었다. 이러한 실험은 매우 낮은 수준에서 재조합 AAT가 IL-1Ra 생산을 급격하게 저해할 수 있음을 밝혔다. 이 클론에서 발견된 상기 AAT의 영역이 Fc-AAT3(힌지 없는)과 동일하기 때문에, 이 데이터는 Fc-AAT3에서 유사한 활성이 여기에서 확인된 Fc-AAT2와 필적할 만큼 수득될 것임을 지지한다(도 5b 참조).
실시예 5
Fc-AAT(클론 2)의 영향이 분석된 다른 사이토카인의 발현(IL-1beta, IFNgamma, IL-17 등)이 검사되었고, 이러한 결과의 일부를 하기 표 1에 나타낸다. Fc 융합이 있는 재조합 AAT가 유해한 사이토카인 생산을 차단할 수 있음이 확인되었다.
Figure 112020005750889-pat00022
Figure 112020005750889-pat00023
도 6a 내지 6c는 혈장 유래 AAT와 Fc-AAT2의 존재시 CD11b/CD45 양성 세포의 백분율 발현 및 백분율 TLR4 및 TLR2 발현을 나타내고, 약 100배 내지 약 1000배 적은 재조합 AAT(Fc-AAT2)가 이러한 유해한 분자에 대해 동일한 저해 효과를 갖는 것이 확인되었다. 예를 들어, 500 또는 100ng 모두에서 톨 유사 수용체 4(Toll-like Receptor 4)는 500㎍의 혈장 유래 AAT만큼 효과적이었다(도 6a 참조).
실시예 6
통풍 모델
통풍 관절염에 대한 모델인 모노나트륨 유레이트 결정으로 자극된 PBMC에서 IL-1β 생산에 대한 재조합 Fc-AAT의 영향. 종래 공지된 통풍 모델을 사용하여 C-18(C18) 지방산과 함께 모노나트륨 유레이트 결정(MSU)으로 자극된 PBMC에서 Fc-AAT 유도된 IL-1β 생산의 효과를 분석하였다.
생체 내 염증 연구에서 IL-1β의 생산
실험은 체내에서 Fc-AAT2(IgG1)와 Fc-AAT3(힌지 결실)의 영향을 비교하기 위해 마우스 통풍(통풍 관절염)모델을 이용하여 수행되었다(도 7a 참조). Fc-AAT3(및 결실된 힌지를 가지는 다른 Fc)가 Fc-AAT2(IgG1의 온전한 힌지)보다 체내에서 뛰어난 결과를 가질 것이라는 가설이 제시되었다. 우선, AAT-Fc-2 및 AAT-Fc-3의 단백질 농도가 확인되었다. 마우스의 무게를 측정하고, 투여량을 2.0mg/kg으로 조정하였다. 2시간 후, MSU C16.0이 관절 내로 주입되었다. 4시간 후, 마우스를 안락사시키고 관절에 점수를 주었다. 활막 조직은 사이토카인 수준을 위해 균질화되었다(예를 들어, 144,000g/L = 1mole; 144,000mg/㎖ = 1M:144mg/㎖ = 1mM:144㎍/㎖ = 1μΜ:14㎍/㎖ = 100nM). 혈장 유래 AAT의 분자량 = 42,000(적은 글리코실화), 혈장 유래 AAT의 42㎍/㎖은 240nM이고, 상기 AAT-Fc의 분자량 = 144,000(적은 글리코실화), 14㎍/㎖ AAT-Fc는 7nM이다. 추가적인 연구는 AAT의 존재 또는 부재시 IL-6의 평가에 관한 것으로서, 상업적 제형(Zemaira™)이 Fc-AAT2 및 Fc-AAT3과 비교되었다(도 7b). 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 유도된 인간 혈액 단핵구 세포의 시험관내 모델을 사용하여 IL-6 발현이 급격하게 감소된 것이 언급되었다. 재조합 제형은 모두 천연 AAT 제형(Zemaira™)을 능가하였다(도 7b 참조). 상기 상업적인 제형은 상기 Fc-AAT2 및 Fc-AAT3에 비해 IL-6 발현을 크게 저해하지 않았다.
다른 실험이 통풍 마우스 모델을 사용하여 전체 IL-1 수용체 차단을 관찰하기 위해 수행되었다(도 7c 참조). 또 다른 예시적인 방법에 있어서, IL-Iβ의 수준에 대한 Fc-AAT2(클론 2) 영향의 시간 경과 분석이 평가되었다. 상기 시간 경과는 다양한 양의 재조합 AAT에 노출된 후 0 내지 72 시간 사이이다. Fc-AAT2의 시간 경과 분석이 수행되었고, 여기서 상기 융합 분자를 상기 무릎 관절로 모노나트륨 유레이트(NSU) 결정을 적하하기 전에 복강내로 전처리로서 넣었다. 적하 후 약 4 시간에 상기 마우스를 희생시켰고, 상기 무릎 관절을 잘라내었으며, 배양하였다. 약 2 시간 배양 후, IL-1β이 상기 배양물의 상등액에서 측정되었다(그룹당 N=10). 상기 데이터는 도 7d에 예시되고, FcAAT2를 전처리하면, IL-1β가 48시간 이상 저해되었으며, 따라서 IL-1β 부작용의 저해 및 통풍 환자에서의 잠재적인 치료에서 새로운 재조합체에 대한 역할을 지지한다. 예를 들어, Joosten et al, Arthritis Rheum. 2010 November; 62(11): 3237-3248의 실험 과정을 참조.
방법 요약: 관절 염증은 미처리(naive) 마우스의 오른쪽 무릎 관절 내로 10㎕ PBS 내의 용량-범위가 매우 순수한 MSU(30-300μg), 200μΜ C18.0, MSU/C18.0(300μg/200μΜ) 또는 25㎍ SCW(람노오스 함량)의 관절내 주입(i.a.)으로 유도될 수 있다. i.a. 주입 후 4 시간, 관절 부종이 확인되었고, 활막 조직이 단리되었으며, 무릎 관절이 조직 검사를 위해서 제거되었다. 관절 부종 측정은 육안 평점에 의해 또는 99mTc 흡수 방법에 의해 측정될 수 있다. 육안으로 보이는 관절 부종은 0-3의 범위 규모로 점수가 주어진다. 피부가 제거된 후 상기 무릎 관절에, 0 = 부종 없음 및 3 = 심각한 부종으로 점수가 주어졌다. 99mTc 흡수 방법이 종래 공지된(21, 22) 것과 같이 수행되었다. 관절 부종은 대조군 관절(왼쪽 무릎 관절)에 걸쳐서 생긴 염증에서 상기 99mTc 흡수의 비율로 나타낸다. 1.10을 초과하는 모든 값은 관절 부종으로 정해진다.
실시예 7
심근경색증 모델
다른 예시적인 방법에 있어서, 심근경색증 마우스 모델이 혈장 유래 AAT 모델에 대해 이미 확인된 바와 같이 심장 리모델링을 저해하고, 경색의 크기를 감소시키는 Fc-AAT 융합 분자의 능력을 평가하기 위해 사용되었다(데이터는 나타내지 않음). 일시적인 심근 허혈(30분)로 인한 급성 심근경색증(AMI)의 상기 실험적 모델은 재관류된 AMI가 있는 환자의 임상적 설정을 모방한다. 상기 마우스는 허혈 손상에 뒤이어 재관류 손상을 겪는다. 경색 크기의 평균은 좌심실의 15-20%이다. 상기 마우스는 상기 좌심실의 확장 및 기능 장애가 있는 확장된 심근증의 가벼운 형태가 발생한다. 이러한 AMI의 모델에 있어서, 7일에 LVEDD 및 LVESD의 증가 및 LVFS(모든 비교에 대해 p<0.05 대 샴군)의 감소가 관찰되었다. Fc-AAT 융합 분자의 10 또는 50㎍의 증가된 농도에서, 경색 크기를 경색으로 영향을 받은 좌심실의 백분율로서 측정하고, 모든 농도에서 상당히 감소된 것으로 확인되었다(도 8). 이 농도는 혈장 유래 AAT 제형에 비해 급격하게 감소된다(비교 연구에서 약 100배 더 많이 사용됨, 2mg 복강내로)(데이터는 나타내지 않음).
영구적인 관상 동맥 폐색으로 인한 AMI의 다른 실험적 모델은 비-재관류된 광범위한 AMI가 있는 환자의 임상적 설정을 모방한다. 상기 마우스는 심각한 허혈 손상을 겪는다. 상기 심근경색 크기의 평균은 상기 좌심실의 25-35%이다. 상기 마우스는 상기 좌심실의 확장 및 기능 장애가 있는 확장된 심근증의 심각한 형태 및 높은 사망율이 발생한다. 또한 이 모델은 혈장 유래 AAT가 상기 급성 심근경색증의 영향을 감소시키는데 효과적임을 나타냈다.
또한, 심장 마비를 모방하는 다른 마우스 모델을 사용하여 도 9에 예시한 바와 같이, 엘라스타제 활성을 갖지 않는 것으로 확인된 Fc-AAT1(클론 1) 및 엘라스타제 저해를 갖는 것으로 나타난 Fc-AAT2(클론 2)는 경색 크기로 측정된 심장 리모델링 감소에서 동등하게 효과적이었다. 모든 재조합 분자는 다른 약제(IVIG)의 2mg/마우스의 5일에 비해 단일 용량(50㎍/마우스)으로 활성이 있었다. Fc-AAT3(클론 3, IgG1의 힌지 없음)가 이러한 체내 모델에서 심장 리모델링 및 허혈 재관류의 다른 영향을 감소시키는데 훨씬 더 효과적일 것임이 제안된다. 따라서, 이러한 실험은 본 명세서에 개시된 융합 분자가 상기 허혈-재관류 손상 및 부정적인 심장 증상의 유해한 효과의 감소에 효과적임을 지지한다.
Fc-AAT 융합 분자는 허혈-재관류 손상을 제한하고, 경색 크기를 감소시킨다.
Fc-AAT 융합 분자는 허혈-재관류 후 사이토카인의 방출을 제한한다.
혈장 유래 AAT는 비-재관류된 AMI에서 경색의 크기를 감소시키지 못하는데, 이는 AAT가 재관류 손상과 관련된 염증 성분에 영향을 미치는 것을 시사하고(데이터는 나타내지 않음), 따라서 부정적인 심장 증상의 치료에 대한 Fc-AAT 융합 분자의 역할을 지지한다.
4) Fc-AAT 융합 분자는 모든 AMI 모델에서 부정적인 심장 리모델링을 제한한다.
실시예 8
도 10은 상기 힌지 영역이 결실되거나, 절단되거나 또는 돌연변이된 본 명세서에서 고려된 일부 Fc-AAT 융합 분자를 예시한다.
실시예 9
대장염/ IBD 모델
상기에 나타낸 바와 같이, Fc-AAT3는 체내에서 및 시험관내에서 사이토카인의 생산을 저해하고, 따라서 전-염증성 사이토카인의 유해한 영향을 조절한다. 대장염/IBD 모델에서의 혈장 유래 AAT의 이러한 데이터 및 이전 연구 모두는 염증성 장 질환에 대한 치료 또는 예방에서 Fc-AAT(힌지 결실)의 역할을 지지하는 것으로 생각된다.
혈장 유래 AAT 치료는 이러한 모델에서 염증성 장 질환의 가장 신뢰할 수 있는 지표 중 하나인 마우스의 DSS 대장염 모델에서의 체중의 손실을 약화시키는 것으로 알려져 왔다. 게다가, 결장 외식편의 상등액으로 분비된 사이토카인이 현저히 감소된다.
마우스는 상기 DSS 모델에서 비히클(vehicle) 처리된 마우스 및 대조군 혈장 유래 AAT 제형(2mg/일)에 비해 Fc-AAT(2㎍ 내지 2mg/일 i.p)을 가질 수 있다. 마우스는 다양한 시간에서 체중이 측정될 수 있고, 그런 다음 희생시켜 체중을 평가하고 천연 AAT에 대해 관찰된 바와 같이 결장 수축의 감소를 평가할 수 있다. 본 명세서에 나타낸 지지 증거가 상기 융합 분자 처리된 DSS 대장염 마우스에서 감소된 체중 손실 및 결장 수축의 관찰로 추가에 의해 입증될 것이라는 가설이 제시된다. 또한, 상기 농도는 혈장 유래 AAT(양성 대조군)으로 상기 동일한 또는 유사한 결과를 확인하기 위하여 상기 융합 분자에 대해 약 10배 및 1000배까지 더 적을 것이라는 것이 예상된다. 게다가 결장 외식편에 의한 사이토카인 생산(예를 들어, IL-1, IL-6, MCP-1 및 KC)이 상기 대조군 마우스에 대해 평가 및 비교될 것이다.
실시예 10
독성 유도된 췌도 세포 시나리오에서 글루코스 조절을 평가하기 위한 마우스 모델이 세포 이식 거부를 감소시키고, 예를 들어, 혈장 유래 AAT가 췌도 세포를 악화로부터 보호할 수 있는 이전의 관찰에 의해 추가로 지지되는 바와 같이 췌도 세포 악화를 감소시키는 Fc-AAT 융합 분자의 능력을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 어떤 방법에 있어서, 표준 독소인 스트렙토조토신(streptozotozin, STZ)이 췌도 베타 세포 독성 분석 마우스 모델에 사용될 수 있다. 이미 예시한 바와 같이, 상업적으로 입수가능한 공급원인 AAT(Aralast™)는 췌도 세포를 보호하기 위하여 STZ 유도된 당뇨병에서 보호를 나타냈다. 상기 이전 연구는 베타 세포 사멸을 유도하기 위해 단일 용량의 STZ를 사용하였다. STZ의 2회 주입 후, 마우스는 당뇨병이 걸린다(혈당이 400mg/dL 이상으로 증가함). 이러한 2회 용량이 상기 베타 세포의 면역 파괴의 허용가능한 모델로 사용된다. Fc-AAT 융합 분자는 상기 췌도에 대한 보호 효과를 평가하기 위하여 혈장 유래 AAT와 비교될 것이다. 대조군(PBS), 혈장 유래 AAT(상업적으로 입수가능함) 또는 Fc-AAT(마우스 당 약 1㎍ 또는 10배 이하로, 온전한 힌지 및 결실된 힌지) 각각이 매일 주입될 것이다. 상업적으로 입수가능한 AAT의 제형이 상기 부작용을 되돌리고, 췌도 세포 기능을 보존하는 것이 이미 관찰되었다. Fc-AAT(힌지 결실)이 혈장 유래 AAT에 비해 뛰어난 효과를 가질 것이고, 힌지 결실이 없는 Fc-AAT보다 더 적은 부작용을 나타낼 것으로 예상되고, 따라서 세포 및 기관 이식에서 기관 거부를 감소시키고, 이식을 보존하는 것을 돕기 위한 본 명세서에 개시된 조성물의 상기 용도를 지지한다.
이식 전, 동안 및/또는 후의 본 명세서에 개시된 융합 분자의 용도는 지지된다. 어떤 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 Fc-AAT 융합 분자는 이식을 유지하거나 및/또는 GVHD와 같은 이식 거부의 부정적인 영향을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
또한 예비 데이터는 Fc-AAT(힌지 결실)의 융합 분자가, 예를 들어 염증 및 면역 반응의 부작용으로부터 개체 내의 췌도 세포를 보호함으로써 당뇨병의 개시를 감소시키거나 예방하기 위하여 사용될 수 있음을 지지한다.
실시예 11
Fc - AAT의 절단된 변이체의 구축. 어떤 예시적인 구현예에 있어서, AAT의 프로테아제 절단은 AAT의 서열 내에서, 예를 들면 담배 모자이크 바이러스 프로테아제의 프로테아제 부위의 단순 삽입이 될 수 있다. 상기 프로테아제 인식 부위의 삽입은 AAT의 절단된 카르복시 말단을 생성한다. 이 부위는 자연적으로 발생하는 AAT의 카르복시-36-말단 펩티드로부터 상류이다(예를 들어, 도 5 참조):
SIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK(서열번호 34)
이러한 절단된 AAT 분자는 LPS에 의해 유도된 IL-1β, IL-6 및 TNFα를 억제할 수 있다. 2가 절단된 융합 분자는 증가된 혈장 반감기의 측면에서 펩티드 자체가 뛰어날 것이다. 천연 AAT는 세포막의 지질 뗏목에서 발견될 가능성이 있다면, 삽입이 N-말단이 아니라 C-말단일 가능성은 없다. 따라서, 2가 구조를 위하여 Fc에 연결된 C-말단 36개 아미노산을 갖는 것은 지질 뗏목에서 더욱 효과적일 것이다.
Fc 도메인의 절단. 상기 다른 절단 부위는 Fc 단편을 제거하기 위하여, Fc 자체의 것이다. 이 부위는 단량체 AAT 또는 절단된 AAT를 생성한다. 그러나, Fc-IgG1에 대한 효소는 Fc-IgG2의 것과 상이하다.
N-말단의 융합 단백질. 상기 N-말단 AAT의 구조체는 AAT의 항염증 특성이 엘라스타제 저해 특성과 무관하다는 것을 나타내는 데이터를 기반으로 하는 신규한 개념이다. 따라서, 인프레임 구조체에 대한 N-말단을 사용하여 2가의 C-말단과 분자의 형성을 촉진한다. 각 구조체에 대하여, 글리코실화가 분자의 중요한 구성 요소로서 CHO에서의 발현은 필수적이다. 따라서, CHO 세포는 절단된 AAT-Fc뿐만 아니라 야생형의 발현에 사용될 것이다. 다른 실시예는 상기 카르복시 말단에 연결된 구조체(예를 들어, Fc-AAT2 및 Fc-AAT3)를 포함한다.
절단된 AAT - Fc의 정제 및 분석. 상기 프로테아제 삽입 부위의 경우에 있어서, 분자를 절단하는 프로테아제가 먼저 도입될 수 있고 그런 다음 단편만을 단리하기 위하여 단백질 A를 사용할 수 있다. 이는 산물의 거의 순수한 형태를 얻을 것이다. 어떤 방법에 있어서, Fc 절단 부위의 경우와 같이, 상기 분자는 단백질 A상에서 가장 뛰어나게 정제될 것이고, Fc 절단 프로테아제를 첨가하고 그런 다음 잔여 단백질이 거의 순수하게 남아있는 단백질 A 상에서 상기 Fc 단편을 제거한다.
실시예 12
2형 당뇨병( T2D )에서 IL-l 유도된 IL-17에 대한 Fc - AAT의 영향. 증거는 면역계 세포, 특히 PBMC 분획의 단핵구가 2형 당뇨병(T2D)에서 전-염증 역할을 수행함을 나타낸다. T2D 환자 유래 단핵구는 IL-1β를 포함하는 주요 전-염증성 사이토카인을 과생산한다. T2D 환자 유래 T 세포에 의한 상기 전-염증 IL-17 생산(비-당뇨병 공여자와 비교하여)에 대한 인간 T 세포의 왜곡과 연관된 IL-1β가 구성적으로(constitutively) 자극에 대한 반응시 증가된다. Fc-AAT(rec-AAT, rAAT)의 영향이 모델로서 PBMC에서 IL-1β 유도된 IL-17의 생산에 대하여 시험될 것이다.
AAT Tg wt 마우스의 생성. AAT Tg 스트레인(strain)과 상이한 이러한 마우스의 구별되는 측면은 그 프로모터이다. 상기 새로운 스트레인은 닭 베타-액틴 글로벌 프로모터를 가질 것이고, 2형 폐 상피 내에서 발현하는 AAT의 혈액 수준은 상기 AAT Tg 마우스의 것보다 더 높을 것이다. 생성이 되면, 이형 접합체 마우스(야생형 AAT의 한 카피를 발현하는)는 체내에서 챌린지(challenge) 분석을 받을 것이다. a. AAT Tg wt 마우스의 특성분석. DNA 분석에 의해 이형접합체가 확인되면, 다양한 조직을 이용하여 웨스턴 블랏 평가를 수행하여 지속적인 발현 상태를 검사할 것이다. 이것은 상기 조직의 조직학적 검사를 포함한다. b. 시험관내에서 사이토카인 생산에 대한 초기 세포(primary cell)의 분석. 인간과 유사하게, 마우스의 PBMC로부터 사이토카인의 연구가 가능하다. 상기 자극제는 모든 톨 유사 수용체(TLR) 작용제, 및 상기 IL-18 및 IL-12의 조합을 포함한다. c. 체내에서 하기 다양한 챌린지 이후의 사이토카인 반응. LPS 또는 열로 사멸된 Staphylococcus epidermidis가 복강내로 주입될 것이고, 순환하는 사이토카인이 특정한 시간 간격에서 측정될 것이다. IL-18 및 IL-2의 모델도 또한 시험될 것이다. 이 모델에 있어서, 마우스는 저체온증, 대장염 및 저혈당증이 있는 소모성 증후군이 발생한다. 예비 데이터에 있어서, 상기 AAT Tg 마우스는 이러한 모델에 내성이 있다. d. 췌도 동종이식 거부에 대한 영향. TLR 챌린지에 내성이 있는 상기 AAT Tgwt 마우스가 확인되면, 상기 마우스를 췌도 동종이식 거부 및 마우스 췌도에 대해 관련된 연구에 대해 평가할 것이다.
세린 프로테아제 저해 활성이 없는 AAT(AAT Tg mu )의 돌연변이 및 클로닝 . 이미 확인된 바와 같이, 인간 AAT에서의 시스테인 돌연변이는 프로테아제를 저해하는 능력이 없는 분자를 야기하였다(하기 표에 비-기능적임으로 열거됨). 상기에 나타낸 AAT 플라스미드는 표준 PCR 방법에 의해 돌연변이될 것이고, Cys이 Ala로 교체될 것이다. 그 서열이 확인될 것이다. 인간 AAT 내의 Cys가 EBV-유전자 발현 벡터로 삽입되면 이것이 이미 돌연변이 되어 있다. 야생형 마우스의 꼬리 정맥으로 높은 압력 볼러스(bolus)를 사용하여 상기 야생형 AAT EBV-유전자 발현 백터가 주입되면, 상기 DNA가 간세포로 들어가고, AAT가 상기 간에서 발현되며, AAT의 혈청 수준이 증가한다.
Figure 112020005750889-pat00024
본 명세서에 개시된 청구되는 모든 조성물 및 방법은 본 공개를 고려하여 과도한 실험없이 실행될 수 있다. 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 사상, 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법 및 방법의 단계 또는 일련의 단계에 있어서 변화가 적용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 보다 구체적으로는, 동일하거나 유사한 결과를 획득할 수 있지만 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 어떤 약제가 본 명세서에 기재된 약제를 대체할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 기술분야의 기술자에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 규정된 본 발명의 정신, 범위 및 사상 내에 있는 것으로 간주된다.
<110> The Regents of the University of Colorado, a Body Corporate Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITIONS, METHODS AND USES FOR ALPHA-1 ANTITRYPSIN FUSION MOLECULES <130> 2020-FPA-9819D <150> 61/585,182 <151> 2012-01-10 <150> 61/586,038 <151> 2012-01-12 <150> 61/614,391 <151> 2012-03-22 <160> 126 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 394 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 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Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu 195 200 205 Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val 210 215 220 Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Ala Thr Thr Val 225 230 235 240 Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys 245 250 255 Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala 260 265 270 Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu 275 280 285 Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp 290 295 300 Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr 305 310 315 320 Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe 325 330 335 Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys 340 345 350 Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly 355 360 365 Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile 370 375 380 Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu 385 390 395 400 Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr 405 410 415 Gln Lys Thr Arg Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 420 425 430 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 435 440 445 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 450 455 460 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 465 470 475 480 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 485 490 495 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 500 505 510 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 515 520 525 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 530 535 540 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 545 550 555 560 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 565 570 575 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 580 585 590 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 595 600 605 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 610 615 620 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 625 630 635 <210> 123 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc <400> 123 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 124 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG2 Fc <400> 124 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 65 70 75 80 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 85 90 95 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 100 105 110 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 165 170 175 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 125 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG3 Fc <400> 125 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 126 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Fc <400> 126 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215

Claims (35)

  1. 서열번호 32, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56 또는 서열번호 58로 표시되는 알파-1 안티트립신-Fc(AAT-Fc)를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  2. 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72 또는 서열번호 74로 표시되고 IgG1 Fc를 포함하는 AAT-Fc를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  3. 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 88 또는 서열번호 90으로 표시되고 IgG2 Fc를 포함하는 AAT-Fc를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  4. 서열번호 92, 서열번호 94, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 100, 서열번호 102, 서열번호 104 또는 서열번호 106으로 표시되고 IgG3 Fc를 포함하는 AAT-Fc를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  5. 서열번호 108, 서열번호 110, 서열번호 112, 서열번호 114, 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 또는 서열번호 122로 표시되고 IgG4 Fc를 포함하는 AAT-Fc를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 구조체(construct).
  7. 청구항 6에 따른 핵산 구조체를 포함하는 벡터.
  8. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 융합 폴리펩티드; 및 약학적으로 허용가능한 부형제;를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은 AAT-결핍, 류마티스성 관절염, 루푸스, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 관상 동맥의 만성 염증, 크론병, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염, 셀리악병, 스프루, 셀리악 스프루-피부염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐기종, 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 당뇨병, 천식, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 청소년 관절염, 염증성 골용해, 만성 염증, 병원체 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 기생충 감염 또는 세균 감염으로 인한 염증, 뇌염, 건선, 플라크 건선, 농포성 건선, 홍포성 건선, 적상건선 또는 간찰부 건선, GVHD의 예방 또는 치료, 성형, 미용 수술 또는 재건 수술, 화상, 외상적 손상, 유방절제술, 유방 이식, 선천적 기형에 대한 수술, 구개 파열 또는 구순구개열에 대한 수술, 발달상 기형에 대한 수술의 이전, 동안, 또는 이후에 심장, 폐, 장, 간, 췌장, 신장, 연조직, 얼굴 구성요소, 췌장 섬세포, 줄기 세포, 골수 세포, 또는 각막 상피 이식을 포함하는 기관 또는 비-기관 이식을 받은 개체의 치료, 허혈 재관류 손상, 감염성 및 비감염성 심근염, 심실 리모델링, 통풍, 또는 상기 증상들의 조합 중 하나 이상의 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 경구, 피하, 진피내, 심장내, 동맥내, 근육내, 직장내, 경막내, 정맥내, 비강내, 질내, 국소 중 어느 하나에 의해, 또는 비강내 투여용으로 개체에 운반하기 위해 제형화되는 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 점진적-방출 또는 서방형으로 추가로 제형화되는 약학적 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서,
    당뇨병의 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서,
    허혈 재관류 손상의 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  13. 청구항 8에 있어서,
    기관 또는 비-기관 이식 거부의 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  14. 청구항 8에 있어서,
    이식편대숙주질환(GvHD)의 예방 또는 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  15. 청구항 8에 있어서,
    감염과 연관된 염증의 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 감염은 세균성, 바이러스성, 진균성 또는 기생충성 감염을 포함하는 약학적 조성물.
  17. 청구항 8에 있어서,
    알파-1 안티트립신(AAT) 결핍의 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  18. 청구항 8에 있어서,
    통풍의 치료용으로 사용되는 약학적 조성물.
  19. 청구항 8에 있어서,
    개체에 투여되는 약학적 조성물의 용량은 융합 폴리펩티드가 아닌 혈장-유래 AAT 또는 상업적으로 시판되는 AAT보다 10 내지 100배 적은 AAT-Fc를 포함하고, 0.1 ng/㎖ 내지 10 ㎎/㎖을 포함하는 약학적 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 약학적 조성물의 투여는 상기 개체에 매일, 주 2회, 매주, 2주마다, 매월, 또는 2월마다 투여를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드를 포함하는 발현된 봉입체(inclusion body)의 단리된 제조물.
  22. 청구항 8에 따른 약학적 조성물; 및 AAT 치료법을 필요로 하는 증상의 치료에 사용하기 위한 적어도 하나의 용기;를 포함하며,
    상기 약학적 조성물은 AAT-결핍, 류마티스성 관절염, 루푸스, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 관상 동맥의 만성 염증, 크론병, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염, 셀리악병, 스프루, 셀리악 스프루-피부염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐기종, 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 당뇨병, 천식, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 청소년 관절염, 염증성 골용해, 만성 염증, 병원체 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 기생충 감염 또는 세균 감염으로 인한 염증, 뇌염, 건선, 플라크 건선, 농포성 건선, 홍포성 건선, 적상건선 또는 간찰부 건선, GVHD의 예방 또는 치료, 성형, 미용 수술 또는 재건 수술, 화상, 외상적 손상, 유방절제술, 유방 이식, 선천적 기형에 대한 수술, 구개 파열 또는 구순구개열에 대한 수술, 발달상 기형에 대한 수술의 이전, 동안, 또는 이후에 심장, 폐, 장, 간, 췌장, 신장, 연조직, 얼굴 구성요소, 췌장 섬세포, 줄기 세포, 골수 세포, 또는 각막 상피 이식을 포함하는 기관 또는 비-기관 이식을 받은 개체의 치료, 허혈 재관류 손상, 감염성 및 비감염성 심근염, 심실 리모델링, 통풍, 또는 상기 증상들의 조합 중 하나 이상의 치료용으로 사용되는 키트.
  23. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드; 및 AAT 치료법을 필요로 하는 증상의 치료에 사용하기 위한 적어도 하나의 용기;를 포함하며,
    상기 융합 폴리펩티드는 AAT-결핍, 류마티스성 관절염, 루푸스, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 관상 동맥의 만성 염증, 크론병, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염, 셀리악병, 스프루, 셀리악 스프루-피부염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐기종, 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 당뇨병, 천식, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 청소년 관절염, 염증성 골용해, 만성 염증, 병원체 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 기생충 감염 또는 세균 감염으로 인한 염증, 뇌염, 건선, 플라크 건선, 농포성 건선, 홍포성 건선, 적상건선 또는 간찰부 건선, GVHD의 예방 또는 치료, 성형, 미용 수술 또는 재건 수술, 화상, 외상적 손상, 유방절제술, 유방 이식, 선천적 기형에 대한 수술, 구개 파열 또는 구순구개열에 대한 수술, 발달상 기형에 대한 수술의 이전, 동안, 또는 이후에 심장, 폐, 장, 간, 췌장, 신장, 연조직, 얼굴 구성요소, 췌장 섬세포, 줄기 세포, 골수 세포, 또는 각막 상피 이식을 포함하는 기관 또는 비-기관 이식을 받은 개체의 치료, 허혈 재관류 손상, 감염성 및 비감염성 심근염, 심실 리모델링, 통풍, 또는 상기 증상들의 조합 중 하나 이상의 치료용으로 사용되는 키트.
  24. 이식 또는 보관을 위하여 단리된 기관, 단리된 조직 또는 단리된 세포를 보존하기에 효과적인 양으로 청구항 8에 따른 약학적 조성물에 상기 단리된 기관, 단리된 조직 또는 단리된 세포를 노출시키는 단계;를 포함하는 개체 내로 이식하기 위한 기관, 조직 또는 세포의 생체외(ex vivo) 보존 방법.
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