KR101834830B1 - 생물활성 신장 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물활성 신장 세포군, 신장 세포 구조물 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

생물활성 신장 세포{Bioactive renal cells}
본 발명은 건강한 개체와 비교하여 세포 성분은 결여되나 치료적 특성은 보유하는 생물활성 신장 세포군 또는 분획물, 이를 분리하고 배양하는 방법 및 이 세포군을 사용하여 치료가 필요한 피험자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물활성 신장 세포군을 사용하여 고유 (native) 신장에 대해 재생 효과를 제공하는 방법에 관한 것이다.
만성 신장 질환 (CKD)은 미국에서 19,000,000명이 앓고 있으며, 이 질환은 흔히 비만, 당뇨병 및 고혈압을 포함하는 대사 질환의 결과이다. 자료 조사에 따르면, 이런 증가율은 세계적으로 증가세에 있는 두 질환, 즉 고혈압 및 비-인슐린 의존적 진성 당뇨병 (NIDDM)에 부차적으로 신부전이 발생하기 때문이다 [참조: United States Renal Data System: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2007 pp 223-238]. 비만, 고혈압 및 불충분한 혈당 조절 모두 신장 손상의 개별적인 위험 인자로 알려져 있고, 사구체 및 세뇨관 손상의 원인이 되며, 단백뇨 및 신장 여과 기능에서 다른 전신적으로-검출가능한 변화를 일으킨다 [참조: Aboushwareb, et al ., World J Urol, 26: 295-300, 2008; Amann, K. et al., Nephrol Dial Transplant, 13: 1958-66, 1998]. 1 내지 3의 진행 단계에 있는 CKD 환자들은 근원적인 질병 상태(들)를 조절하기 위하여 생활 양식의 변화 및 약리학적 중재를 받고 있으며, 단계 4 내지 5의 환자들은 투석 및 일반적으로 항-고혈압제, 적혈구생성 자극 물질 (ESA), 철 및 비타민 D 보충제를 포함하는 약물 요법을 받는다. 재생 의약 기술은 CKD에 대한 차세대 치료 선택을 제공할 수 있다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328]은 세뇨관 및 에리트로포에틴 (EPO)-생성 신장 세포군을 포함하는 분리된 신장 세포, 이를 분리하고 배양하는 방법, 및 이 세포군을 사용하여 치료가 필요한 피험자를 치료하는 방법을 기술하고 있다. 이러한 환자군에서 진행을 늦추고 삶의 질을 개선하기 위해 신장 기능을 실질적으로 오랫동안 증대시키는 새로운 치료 패러다임이 필요하다.
발명의 요지
하나의 양상에서, 본 발명은 고유 신장에 대해 재생 효과를 제공하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 고유 신장을 농축 (enriched) 신장 세포군에 의해 분비되는 생성물과 생체내에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 생성물은, 본원에서 기술되는 바와 같이, 구조물 (construct)의 일부가 아닌 농축 신장 세포군에 의해 분비된다. 즉, 상기 세포군은 스캐폴드 (scaffold) 상에 씨딩되지 않는다. 또 다른 양태에서, 상기 생성물은 스캐폴드 상에 또는 내에 직접적으로 씨딩된 농축 신장 세포군을 포함하는 신장 세포 구조물로부터 분비된다. 또 다른 양태에서, 생성물의 분비는 산소 수준에 대해 생물반응적이다. 분비는 대기 산소 수준보다 낮은 산소 수준에 의해 유도될 수 있다. 또 다른 양태에서, 낮은 산소 수준은 약 5% 미만의 산소이다.
하나의 양태에서, 재생 효과는 상피-중간엽 이행 (epithelial-mesenchymal transition: EMT)의 감소이다. EMT의 감소는 TGF-β 시그널링의 약화 및/또는 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1) 시그널링의 약화를 통해 달성될 수 있다. 또 다른 양태에서, 재생 효과는 신장 섬유증의 감소 및/또는 신장 염증의 감소이다. 일부 양태에서, 염증의 감소는 NFκB에 의해 매개될 수 있다. 또 다른 양태에서, 재생 효과는 고유 신장에서 줄기 세포 마커의 차등 발현 (differential expression)으로 특징지어진다. 상기 발현은, 비-접촉 고유 신장에서의 발현에 비해, 생체내 접촉된 고유 신장에서 마커 발현이 상향조절되는 것일 수 있다.
하나의 양상에서, 농축 신장 세포군은 하나 이상의 세포군, 즉 본원에 기술되는 바와 같은 혼합물을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 세포군은 농축 세뇨관 세포군을 포함하는 제1 세포군인 B2을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 세포군은 제1 세포군인 B2와 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포 중 하나 이상을 포함하는 제2 세포군을 갖는 인간 신장 세포의 혼합물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 제2 세포군은 B4 세포군이다. 또 다른 양태에서, 상기 제2 세포군은 B3 세포군이다.
하나의 양태에서, 상기 혼합물은 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포 중 하나 이상을 갖는 제3 세포군을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 제3 세포군은 B4 세포군이다. 또 다른 양태에서, 제3 세포군은 B3 세포군이다.
모든 양태에서, 상기한 B2 세포군은 약 1.045 g/mL 내지 약 1.052 g/mL의 밀도를 갖는다. 모든 양태에서, 상기한 B4 세포군은 약 1.063 g/mL 내지 약 1.091 g/mL의 밀도를 갖는다. 모든 양태에서, 상기한 B3 세포군은 약 1.052 g/ml 내지 약 1.063 g/ml의 밀도를 갖는다.
모든 양태에서, 상기한 농축 신장 세포군은 고유 신장에 대해 비-자가 (non-autologous)일 수 있다. 모든 양태에서, 상기한 농축 신장 세포군은 고유 신장에 대해 자가일 수 있다.
모든 양태에서, 상기한 생성물은 측분비 인자 (paracrine factor), 내분비 인자 (endocrine factor), 곁분비 인자 (juxtacrine factor), RNA, 소포 (vesicle), 미세소포 (microvesicle), 엑소솜 (exosome) 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기한 소포는 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자 및 RNA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 분비 생성물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기한 생성물은 스캐폴드 상에 또는 내에 직접적으로 씨딩된 농축 신장 세포군을 포함하는 신장 세포 구조물로부터 분비된다.
모든 양태에서, 상기한 스캐폴드는 생체적합 (biocompatible) 물질을 포함할 수 있다. 모든 양태에서, 상기한 생체적합 물질은 하이드로겔일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 신장 질환 (KD) 환자가 치료제로의 처리에 반응적인지의 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 상기한 방법은 대조군 시료의 소포 또는 이의 내강 내용물 (luminal content)의 양과 비교하거나 상대적인 양으로 치료제로 처리된 KD 환자로부터 수득된 시험 시료의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양을 측정 또는 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 대조군 시료의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 시험 시료의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 치료제로의 처리에 대한 처리된 환자 반응성을 나타낸다. 상기한 소포는 신장 유래된 소포일 수 있다. 상기한 시험 시료은 소변을 포함할 수 있다. 상기한 소포는 miRNA일 수 있는 바이오마커를 포함할 수 있다. 상기한 치료제는 농축 신장 세포군을 포함할 수 있다.
도 1은 다층 단계 구배 기술 (A- 좌측 패널) 또는 단층 혼합 구배 기술 (B-우측 패널)을 이용한 새로이 분해된 신장 조직으로부터의 epo-생성 세포 분획물의 농축을 나타낸다. 2가지 방법 모두에 의해 1.025 g/mL과 1.035 g/mL 사이에서 보이는 epo 밴드로부터 비 epo-생성 세포 성분 (주로 세뇨관 세포)이 부분적으로 고갈되었다.
도 2는 개별적으로 수거된 후 동일한 단계 구배물에 나란히 적용된 "표준산소" (21% 산소) 및 "저산소" (2% 산소) 설치류 배양물의 단계 구배를 나타낸다.
도 3은 개별적으로 수거된 후 동일한 단계 구배물에 나란히 적용된 "표준산소" (21% 산소) 및 "저산소" (2% 산소) 개 배양물의 단계 구배를 나타낸다.
도 4는 HK17 및 HK19 시료의 조직병리학 특징을 나타낸다.
도 5는 관심 영역 (ROI)을 규정하는 인간 NKA 세포에서의 알부민 수송에 대한 고함량 분석 (HCA)을 나타낸다.
도 6은 비-CKD 및 CKD 신장으로부터 유래된 NKA 세포에서의 알부민 수송의 정량적 비교를 나타낸다.
도 7은 세뇨관-농축된 B2와 세뇨관 세포-고갈된 B4 아분획물 (subfraction) 간의 마커 발현에 대한 비교 분석을 나타낸다.
도 8은 세뇨관-농축된 B2와 세뇨관 세포-고갈된 B4 아분획물 사이의 알부민 수송에 대한 비교 기능 분석을 나타낸다.
도 9는 5/6 Nx 래트 처리 후의 숙주 조직에서의 SOX2 mRNA 발현을 나타낸다.
도 10은 CD24, CD133, UTF1, SOX2, NODAL 및 LEFTY의 시간 경과에 따른 발현을 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 11는 시간 경과에 따른 재생 반응 지수 (RRI)를 도시한다.
도 12는 UNFX 적응용 배지의 제조 및 분석을 위한 도식도를 제공한다.
도 13A-C는 UNFX 배양물로부터의 적응용 배지가, 잠재적으로 재생 결과와 연관되는, 시험관내에서의 다수의 세포 과정에 영향을 끼친다는 것을 나타낸다. 도 13A는 UNFX-적응용 배지가 NF-kB의 TNF-a 매개된 활성화를 약화시킨다는 것을 나타낸다. 도 13B는 UNFX-적응용 배지가 HUVEC 세포 배양물의 프로혈관형성 (proangiogenic) 거동을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 도 13C는 UNFX-적응용 배지가 상피 세포에서 섬유증 경로를 약화시킨다는 것을 도시한다. 도 13D는 TGFβ1 및 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1)에 의해 확립되는 양성 피드백 루프를 도시한다
도 14A-B는 혈관사이 세포에서 섬유증 경로의 약화를 입증하는 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 15A-C는 UNFX로부터의 적응용 배지가 분비되는 소포를 포함한다는 것을 도시한다. 도 15A는 세포질-유래된 내부 성분 (녹색)을 포함하는 이중지질 (bilipid) 구조물 (적색)인 분비되는 소포를 도시한다. 도 15B-C는 FACS 분류를 도시한다.
도 16A는 총 단백질이 제조되고 PAI-1 및 b액틴에 대해 검정되는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 16B는 microRNA인 miR-30b-5p를 도시한다.
도 17A-C는 신장 절제를 겪은 후 생물활성 신장 세포가 전달된 루이스 래트 신장에서의 PAI-1의 대표적인 면역조직화학 영상을 도시한다. 도 17D는 비처리된 신장 절제된 래트 (적색 네모), 처리된 신장 절제된 래트 (청색 다이아몬드) 및 대조군 동물 (녹색 세모)에서의 PAI-1 발현 비교를 나타낸다. 도 17E는 처리 후 3개월 및 6개월에 채취한 신장 시료에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 17F는 NKA 적응용 배지에 대한 2시간 노출이 NFkB p65 핵 국소화를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 17G는 TNFα에 의한 NFkB 경로의 표준 활성화를 도시한다.
도 18A-B는 (A) 5/6 신장 절제에 의해 개시되는 진행성 CKD를 갖는 동물 및 (B) 일측 신장 절제에 의해 개시되는 비-진행성 신부전을 갖는 동물에서의 NFkB p65 아단위 (subunit)의 핵 국소화를 도시한다. 도 18C-D는 (C) 5/6 신장 절제를 겪은 루이스 래트 신장 조직의 추출물 중 NFkB p65에 대한 웨스턴 블롯 분석; 및 (D) 추출물에 대한 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)를 나타낸다. 도 18E는 NKA (패널 A) 또는 비-생물활성 신장 세포 (패널 B)가 신장내 주사된 확립된 CKD를 갖는 루이스 래트로부터 수득된 조직에서의 NFκB p65 아단위의 면역조직화학 검출을 나타낸다.
도 19A-C는 이식후 1주 및 4주에 생체물질을 생체내 평가한 것을 도시한다.
도 20A-D는 NKA 구조물의 생/사 (live/dead) 염색을 나타낸다. 도 20E-G는 NKA 구조물의 전사체 프로파일링을 도시한다.
도 21A-B는 NKA 구조물의 분비체 프로파일링을 도시한다.
도 22A-B는 NKA 구조물의 단백질체 프로파일링을 나타낸다.
도 23A-C는 NKA 구조물의 공초점 현미경 검사를 나타낸다.
도 24A-B는 이식후 1주 및 4주에 NKA 구조물을 생체내 평가한 것을 나타낸다.
도 25A-D는 이식후 8주에 NKA 구조물을 생체내 평가한 것을 나타낸다.
도 26은 NKA 구조물로부터의 적응용 배지가 시험관내에서 HK2 세포에서의 TGF-β 유도된 EMT를 약화시킨다는 것을 나타낸다.
도 27은 프로세싱 동안 세포를 저산소에 노출시키는 절차를 도시한다.
도 28은 2% 산소 노출시 밀도 구배에 걸친 세포 분포가 변화되고 구배후 총 수율이 개선된다는 관측을 도시한다.
도 29A는 시험관내에서의 세뇨관 단층 복구를 관측하기 위해 개발된 검정을 도시한다. 도 29B는 정량적 영상 분석 (BD Pathway 855 BioImager) 결과를 도시한다. 도 29C는 2% 산소로 유도된 세포가 세뇨관 상피 단층 복구에 더욱 능숙하다는 것을 나타낸다.
도 30A는 시험관내에서의 세뇨관 단층의 복구를 관측하기 위해 개발된 검정을 도시한다. 도 30B는 2% 산소로의 세포 유도가 비-유도에 비해 (21% 산소) 이동 및 상처 복구를 증진시킨다는 것을 도시한다. 도 30C는 이동 시간에 대한 이동 세포의 비율 (%)을 플로팅한다.
도 31A는 오스테오폰틴이 세뇨관 세포에 의해 분비되고 손상에 반응하여 상향조절된다는 것을 나타낸다 (오스테오폰틴 면역세포화학: 훽스트 (Hoechst) 핵 염색 (청색), 오스테오폰틴 (적색), 10x). 오스테오폰틴은 면역형광 (도 31A) 및 ELISA (도 31B)에 의해 도시되는 바와 같이 확립된 세뇨관 세포 단층에서 손상에 의해 상향조절된다.
도 32A는 세포의 이동 반응이 오스테오폰틴에 의해 부분적으로 매개된다는 것을 나타낸다 (녹색 = 이동된 세포 (5x)). 도 32B는 오스테오폰틴에 대한 중화 항체 (NAb)가 신장 세포 이동 반응을 50% 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 33은 세포의 저-산소 유도가 조직 리모델링 유전자의 발현을 조절한다는 것을 도시한다.
도 34는 신장 재생을 이끄는 세포의 생물활성의 저산소 증대에 대한 추정적 기작을 도시한다.
도 35는 웨스턴 블롯을 통한 미세소포의 검출을 도시한다.
본 발명은 생물활성 신장 세포 (BRC)의 이질 (heterogenous) 혼합물 또는 분획물, 이들을 분리하고 배양하는 방법, 및 본원에서 기술되는 바와 같은 BRC 및/또는 RBC로 씨딩된 스캐폴드로부터 형성되는 BRC-함유 구조물로 치료가 필요한 피험자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기한 생물활성 신장 세포는 세뇨관 및 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 신장 세포를 포함하는 분리된 신장 세포일 수 있다. 상기한 BRC 세포군은 농축 세뇨관 및 EPO-생성 세포군을 포함할 수 있다. 상기한 BRC는 건강한 개체로부터의 그 자신의 신장 세포 분획물일 수 있다. 또한, 본 발명은 건강한 개체의 상응하는 신장 세포군과 비교하여 특정 세포 성분은 결여될 수 있으나 여전히 치료적 특성은 보유하는 비건강한 개체로부터 수득되는 신장 세포 분획물을 제공한다. 또한, 본 발명은 건강한 개체와 비교하여 세포 성분이 결여되는 치료학적-활성 세포군을 제공하며, 이때 상기 세포군은, 하나의 양태에서, 다양한 질환 상태의 자가 공급원으로부터 분리되고 증대될 수 있다.
또한, 본 발명은 고유 신장을 신장 세포에 의해 분비되는 생성물과 생체내 접촉시켜 고유 신장에 재생 효과를 제공하는 방법 및 분비 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에서 기술되는 방법으로 처리한 후 신장 재생의 존재를 측정하기 위한 마커의 용도에 관한 것이다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 문헌 [참조: Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007]은 본원에 사용되는 많은 용어들에 대해 전반적인 지침을 당업자에게 제공한다. 당업자는 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 본원에서 기술되는 것과 유사한 또는 등가의 많은 방법 및 물질들을 인지할 수 있을 것이다. 사실, 본 발명은 결코 본원에 기술된 방법 및 물질들에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "세포군"은 직접적으로 적합한 조직 공급원, 통상 포유동물로부터 분리에 의해 수득되는 다수의 세포를 일컫는다. 분리된 세포군은 후속적으로 시험관내에서 배양될 수 있다. 당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 세포 세포군을 분리하고 배양하는 다양한 방법과, 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포군의 다양한 세포를 인식할 것이다. 상기한 세포군은 신장으로부터 유래된 비분할된 (unfractionated) 이질성 (heterogeneous) 세포군일 수 있다. 예를 들어, 이질성 세포군은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 이질성 세포군은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 확립된 포유동물 세포의 시험관내 배양물로부터 유래될 수 있다. 비분할된 이질성 세포군은 또한 비-농축 세포군으로 불릴 수 있다.
용어 "고유 신장 (native kidney)"은 살아있는 피험자의 신장을 의미한다. 피험자는 건강하거나 건강하지 않을 수 있다. 건강하지 않은 피험자는 신장 질환을 가질 수 있다.
용어 "재생 효과"는 고유 신장에 이점을 제공하는 효과를 의미한다. 상기한 효과는, 이로 제한됨이 없이, 고유 신장에 대한 손상의 정도를 감소시키는 것 또는 고유 신장 기능의 개선, 회복 또는 안정화를 포함할 수 있다. 신장 손상은 섬유증, 염증, 사구체 비대 등의 형태이고 피험자의 신장 질환과 연관될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "혼합물"은 비분할된 이질성 세포군으로부터 유래된 2개 이상의 분리되고 농축된 세포군의 조합을 말한다. 특정 양태에 따르면, 본 발명의 세포군은 신장 세포군이다.
"농축 (enriched)" 세포군 또는 제제는, 특정 세포 유형을 초기 세포군에서의 비율 (%)보다 더 큰 비율로 포함하는, 초기 신장 세포군 (예를 들어, 비분할된 이질성 세포군)으로부터 유래된 세포군을 말한다. 예를 들어, 초기 신장 세포군은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 등의 관심 세포군에 대해 농축될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "세포군", "세포 제제" 및 "세포 원형 (prototype)"은 교환가능하게 사용된다.
하나의 양상에서, 본원에서 사용되는 용어 "농축" 세포군은, EPO를 생성할 수 있는 세포의 비율 (%)이 초기 세포군에서 EPO를 생성할 수 있는 세포 비율보다 큰, 초기 신장 세포군으로부터 유래된 세포군 (예를 들어, 신장 생검 또는 배양된 포유동물 신장 세포로부터의 세포 현탁액)을 말한다. 예를 들어, 용어 "B4"는, 초기 세포군과 비교하여, EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포를 큰 비율 (%)로 포함하는, 초기 신장 세포군으로부터 유래된 세포군이다. 본 발명의 세포군은 하나 이상의 세포 유형에 대해 농축되며, 하나 이상의 다른 세포 유형은 고갈될 수 있다. 예를 들어, 농축 EPO 생성-세포군은, 비-농축 세포군, 즉 농축 세포군이 유래되는 초기 세포군에 있는 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포에 비해, 간질 섬유모세포는 농축되고 세뇨관 세포 및 집합관 상피 세포는 고갈될 수 있다. EPO 농축 또는 "B4" 세포군을 언급하는 모든 양태에서, 농축 세포군은, 내생성의 고유 EPO 유전자로부터 산소-조정가능한 EPO 발현으로 입증되는 바와 같이, 산소-조절된 방식으로 EPO를 생성할 수 있는 세포를 함유하는 이질성 세포군이다.
또 다른 양상에서, 초기 세포군에서의 세포 유형의 비율 (%) 보다 특정 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포의 비율이 높은 농축 세포군은 또한, 건강한 개체 또는 피험자로부터 유래되는 초기 신장 세포군과 비교하여, 하나 이상의 특정 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 결여되거나 결핍될 수 있다. 예를 들어, 용어 "B4'" 또는 "B4 프라임"은, 하나의 양상에서, 건강한 개체와 비교하여, 출발 시료의 질환 상태에 따라, 하나 이상의 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 결여되거나 결핍된 초기 신장 세포군으로부터 유래되는 세포이다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 만성 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래된다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 초점 분절 사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis: FSGS)을 갖는 피험자로부터 유래된다. 또 다른 양태에서, B4’세포군은 자가면역 사구체신염을 갖는 피험자로부터 유래된다. 또 다른 양상에서, B4'는, 후에 하나 이상의 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 고갈되거나 결핍되는, 모든 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포를 포함하는 초기 세포군으로부터 유래되는 세포이다. 또 다른 양상에서, B4'는, 후에 하나 이상의 특정 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 농축되는, 모든 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포를 포함하는 초기 세포군으로부터 유래되는 세포군이다. 예를 들어, 하나의 양태에서, B4' 세포군은 혈관 세포는 농축되나 사구체 및/또는 내분비 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 사구체 세포는 농축되나 혈관 및/또는 내분비 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 내분비 세포는 농축되나 혈관 및/또는 사구체 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 혈관 및 내분비 세포는 농축되나 사구체 세포는 고갈될 수 있다. 바람직한 양태에서, B4' 세포군은 단독으로 또는 또 다른 농축 세포군, 예를 들어 B2 및/또는 B3와 혼합 상태로 치료 특성을 보유한다. 예를들어, B4' 세포군은 실시예, 예를 들어 실시예 7 내지 9에 기술된다.
또 다른 양상에서, 농축 세포군은 또한, 초기 세포군에서의 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포의 비율 (%) 보다 큰 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포 비율 (%)을 포함하는, 상술된 바와 같은 초기 신장 세포군으로부터 유래되는 세포군을 말한다. 예를 들어, 용어 "B2"는, 초기 세포군과 비교하였을 때, 큰 비율 (%)의 세뇨관 세포를 포함하는, 초기 신장 세포군으로부터 유래되는 세포군을 지칭한다. 또한, 하나 이상의 세뇨관 세포 마커 (또는 "B2")를 발현하는 세포가 농축된 세포군은 집합관 시스템으로부터의 일부 상피 세포를 포함할 수 있다. 비록 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포 (또는 "B2")가 농축된 세포군은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포가 상대적으로 고갈되어 있지만, 농축 세포군은, 초기 세포군과 비교하였을 때, 적은 비율 (%)의 이들 세포 (EPO-생성, 사구체 및 혈관)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이질 세포군은, 고갈된 세포군이 고갈되기 전 이질 세포군에 포함된 해당 세포 유형(들)의 비율과 비교하여 더 적은 비율의 세포 유형(들)을 포함하도록, 하나 이상의 세포 유형이 고갈된다. 고갈될 수 있는 세포 유형은 임의 유형의 신장 세포일 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 고갈될 수 있는 세포 유형은 밀도가 약 1.045 g/㎖ 미만인 큰 입도의 집합관 및 세뇨관 시스템을 갖는 세포 ("B1"이라고 칭함)을 포함한다. 특정한 다른 양태에서, 고갈될 수 있는 세포 유형은 밀도가 약 1.095 g/㎖ 초과인 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포 ("B5"라고 칭함)을 포함한다. 일부 양태에서, 세뇨관 세포가 농축된 세포군은 "B1", "B5", 산소-조정가능한 EPO-발현 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포 모두가 상대적으로 고갈된다.
본원에서 사용되는 용어 "저산소 (hypoxic)" 배양 조건은, 대기 산소 수준 (약 21%)에서 세포를 배양하는 표준 배양 조건과 비교하여, 배양 시스템에서 세포가 이용가능한 산소 수준을 감소시킨 배양 조건을 지칭한다. 비-저산소 상태는 정상 또는 표준 산소 배양 조건을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "산소-조정가능한"은 세포가 이용가능한 산소량에 근거하여 유전자 발현을 조절 (상향 또는 하향)하는 세포의 능력을 말한다. "저산소-유도성"이란 산소 분압의 감소에 반응하여 (사전-유도 또는 초기 산소 분압과 무관하게) 유전자 발현을 상향조절하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "생체물질"은 살아있는 조직으로 이입시키기에 적합한 천연 또는 합성의 생체적합 물질을 말한다. 천연 생체물질은 생물계에 의해 만들어진 물질이다. 합성 생체물질은 생물계에 의해 만들어지지 않는 물질이다. 본원에서 기술되는 생체물질은 천연 생체적합 물질과 합성 생체적합 물질의 조합일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 생체물질은, 예를 들어 폴리머 매트릭스 및 스캐폴드를 포함한다. 당업자는 생체물질(들)이 다양한 형태, 예를 들어 액체 하이드로겔 현탁액, 다공성 포움으로 형성될 수 있으며, 하나 이상의 천연 또는 합성 생체적합 물질을 포함할 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "빈혈증"은, 피험자의 EPO-생성 세포에 의한 기능성 EPO 단백질의 부적절한 생성 및/또는 EPO 단백질의 전신 순환계로의 부적절한 방출 및/또는 골수 적아세포의 EPO 단백질에 대한 무능력한 반응으로 인한, 적혈구 세포의 수 및/또는 헤모글로빈 수준의 결핍을 말한다. 빈혈증이 있는 피험자는 적혈구 항상성을 유지할 수 없다. 일반적으로, 빈혈증은 신장 기능의 감퇴 또는 상실 (예를 들어, 만성 신부전), 상대적인 EPO 결핍과 연관된 빈혈증, 충혈성 심부전과 연관된 빈혈증, 화학요법 또는 항-바이러스 요법 (예를 들어, AZT)과 같은 골수-억제성 요법과 연관된 빈혈증, 비-골수성 암과 연관된 빈혈증, HIV와 같은 바이러스 감염과 연관된 빈혈증, 및 자가면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염), 간질환, 및 다발성-기관계부전과 같은 만성 질환들의 빈혈증으로 발생될 수 있다.
용어 "EPO-결핍"은 에리트로포에틴 수용체 아고니스트 (예를 들어, 재조합 EPO 또는 EPO 동족체)로 치료가능한, 빈혈증을 포함하는 임의의 상태 또는 장애를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "신장 질환"은 혈액을 여과하고 과량의 유체, 전해질, 폐기물을 혈액으로부터 제거하는 신장의 능력이 상실되는 결과를 초래하는 급성 또는 만성 신부전의 임의의 단계 또는 수준과 연관된 장애를 말한다. 신장 질환은 또한 빈혈증과 같은 내분비 기능이상 (에리트로포에틴-결핍), 및 무기물 불균형 (비타민 D 결핍)을 포함한다. 신장 질환은 신장에서 유래하거나 심부전, 고혈압, 당뇨병, 자가면역 질환 또는 간질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 상태에 부차적일 수 있다. 신장 질환은 신장의 급성 손상 후 발병하는 만성 신부전 상태일 수 있다. 예를 들어, 허혈 및/또는 유독물 노출에 의한 신장 손상은 급성 신부전을 일으킬 수 있으며, 급성 신장 손상 후 불완전한 회복이 만성 신부전을 발병시킬 수 있다.
용어 "치료"는 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍의 치료, 예방 또는 방지 수단 모두를 말하며, 이들의 목적은 표적 질환을 역전, 방지 또는 지연 (경감)시키는 것이다. 이와 같은 치료를 요하는 사람은 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 이미 가지고 있는 사람, 및 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 가질 경향이 있거나 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 전달 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 예방해야 할 사람들을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료"는 신장 기능의 안정화 및/또는 개선을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "생체내 접촉"은 농축 신장 세포군 (또는 혼합물 또는 신장 세포/신장 세포 분획물을 포함하는 구조물)에 의해 분비되는 생성물과 고유 신장 간의 생체내에서의 직접적 접촉을 말한다. 직접적 생체내 접촉은 실제로 측분비, 내분비 또는 곁분비일 수 있다. 분비 생성물은 본원에서 기술되는 상이한 생성물의 이질군일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "리보핵산" 또는 "RNA"는 각각의 단위가 질소 염기, 리보스 슈가 및 포스페이트로 이루어진 뉴클레오타이드 단위의 쇄를 일컫는다. RNA는 단일 또는 이중 스트랜드 형태일 수 있다. RNA는 소포의 일부이거나, 이에 포함되거나 이와 결합될 수 있다. 소포는 엑소솜일 수 있다. RNA는, 이로 제한됨이 없이, mRNA, rRNA, 작은 RNA, snRNA, snoRNA, microRNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 비암호화 RNA를 포함한다. RNA는 바람직하게는 인간 RNA이다.
용어 "구조물"는 하나 이상의 합성 또는 천연적으로 생성되는 생체적합 물질로 제조된 스캐폴드 또는 매트릭스의 표면 상에 또는 내에 침착된 하나 이상의 세포군을 지칭한다. 하나 이상의 세포군은 하나 이상의 합성 또는 천연적으로 생성되는 생체적합 폴리머, 단백질 또는 펩타이드로 제조되 생체물질로 코팅, 침착, 포매, 부착 또는 씨딩될 수 있다. 하나 이상의 세포군은 시험관내 또는 생체내에서 생체물질 또는 스캐폴드 또는 매트릭스와 조합될 수 있다. 일반적으로, 스캐폴드/생체물질을 형성하는데 사용되는 하나 이상의 생체적합 물질은 그 위에 침착되는 최소한 하나의 세포군의 다세포적 3차원 구조 형성을 지시하거나 촉진하거나 허용하도록 선택된다. 구조물을 생성하는데 사용되는 하나 이상의 생체물질은 또한 구조물 또는 구조물의 세포 성분의 내생성 숙주 조직과의 분산 및/또는 통합을 지시, 촉진 또는 허용하거나, 구조물 또는 구조물의 세포 성분의 생존, 접목, 내성 또는 기능 수행을 지시, 촉진 또는 허용하도록 선택될 수 있다.
용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 일반적으로 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물 또는 당지질-기반 분자 마커를 말하며, 배양 세포군에서 이의 발현 또는 존재는 표준 방법 (또는 본원에 기술된 방법)에 의해 검출될 수 있고, 특정 세포 유형인 배양 세포군 중의 하나 이상의 세포와 일치한다. 마커는 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드 또는 염색체 상의 확인가능한 물리적 위치, 예를 들어 유전자, 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위 또는 고유 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 (예를 들어, mRNA)일 수 있다. 마커는 "유전자 발현 마커"로 불리는 유전자의 발현 영역 또는 미지의 암호화 기능을 갖는 DNA의 일부 절편일 수 있다. 바이오마커는 세포-유래되는, 예를 들어 분비되는 생성물일 수 있다.
호환적으로 사용되는 용어 "차등적으로 발현되는 유전자", "차등적 유전자 발현" 및 이들의 동의어는, 제2 세포 또는 세포군에서의 발현에 비해, 제1 세포 또는 세포군에서 높거나 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 말한다. 이 용어는 또한 배양 중 제1 또는 제2 세포의 계대 동안 시간 경과에 따라 상이한 단계에서 높거나 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 포함한다. 또한, 차등 발현 유전자는 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화되거나 억제될 수 있고, 또는 폴리펩타이드 생성물이 상이하도록 택일적으로 스플라이싱될 수 있다고 믿어진다. 이러한 차이는, 예를 들어 mRNA 수준, 표면 발현, 분비 또는 폴리펩타이드의 다른 구분의 변화에 의해 입증될 수 있다. 차등 유전자 발현은 2개 이상의 유전자 또는 이들 유전자의 생성물 간의 발현 비교 또는 2개 이상의 유전자 또는 이들 유전자 생성물 간의 발현 비율의 비교 또는 심지어, 제1 세포와 제2 세포 간에 상이한, 동일 유전자의 2개의 상이하게 프로세싱된 생성물의 비교를 포함할 수 있다. 차등 발현을, 예를 들어 제1 세포 및 제2 세포 사이에서, 유전자 또는 이의 발현 생성물의 시간적 (temporal) 또는 세포적 발현 패턴의 정량적 및 정성적 차이 모두를 포함한다. 본 발명의 목적상, 제1 세포와 제2 세포에서 주어진 유전자의 발현 사이에 차이가 있는 경우, "차등 유전자 발현"이 존재하는 것으로 간주된다. 마커의 차등 발현은, (제2 세포) 투여 후 환자로부터의 세포에서의 발현과 비교하여, (제1 세포) 세포군, 혼합물 또는 구조물의 투여 전 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "억제하다", "하향-조절하다","하향-발현하다" 및 "감소하다"는 호환적으로 사용되며, 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 암호화하는 RNA 분자 또는 등가 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성이 하나 이상의 대조군, 예를 들어 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하여 감소되는 것을 의미한다. 하향-발현은, 투여 후 환자로부터의 세포와 비교하여, 세포군, 혼합물 또는 구조물 투여 후 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "상향-조절하다" 또는 "과다-발현하다"는, 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 암호화하는 RNA 분자 또는 등가 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성이 하나 이상의 대조군, 예를 들어 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하여 증가되는 것을 의미한다. 과다-발현은, 투여 전 환자로부터의 세포와 비교하여, 세포군, 혼합물 또는 구조물 투여 후 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "피험자"는 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍에 대한 하나 이상의 신호, 증상 또는 다른 표시를 겪거나 겪은 경험이 있는 치료받을 수 있는 환자를 포함한 임의의 단일 인간 주체를 의미한다. 이러한 피험자는, 원인에 관계없이, 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍으로 새로 진단받은 또는 이미 진단받은, 및 재발을 경험한 또는 이들 질환에 걸릴 위험에 처한 피험자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 피험자는 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍에 대해 이미 치료를 받았거나, 치료를 받지 않았을 수도 있다.
용어 "환자"는 치료를 바라는 임의의 단일 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물 (예를 들어, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류를 포함한 비-인간 동물을 포함)을 말한다. 가장 바람직하게는, 환자는 인간이다.
용어 "시료" 또는 "환자 시료" 또는 "생물학적 시료"는 피험자 또는 환자 체액, 체조직, 세포주, 조직 배양물 또는 다른 공급원으로부터 수득한 임의의 생물학적 시료를 의미한다. 이 용어는, 예를 들어 신장 생검과 같은 조직 생검을 포함한다. 이 용어는, 예를 들어 배양된 포유동물 신장 세포와 같은 배양된 세포를 포함한다. 포유동물로부터의 조직 생검 및 배양된 세포를 수득하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. "시료"가 단독으로 사용되는 경우, "시료"는 "생물학적 시료" 또는 "환자 시료"를 의미한다. 즉, 이들 용어는 호환적으로 사용된다.
용어 "시험 시료"는 본 발명의 방법으로 처리된 피험자로부터의 시료를 지칭한다. 시험 시료는 혈액, 정액, 혈청, 소변, 골수, 점막, 조직 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물 피험자의 다양한 공급원으로부터 유래할 수 있다.
용어 "대조군" 또는 "대조군 시료"는 시험 시료의 결과의 연관성을 보이는데 도움이 되는 음성 또는 양성 결과가 예상되는 음성 또는 양성 대조군을 말한다. 본 발명에 적합한 대조군은 정상적인 적혈구 항상성의 특징적 지표를 나타내는 것으로 알려진 시료, 빈혈증의 특징적 지표를 나타내는 것으로 알려진 시료, 빈혈증이 아닌 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시료, 및 빈혈증인 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 추가 대조군은 적혈구생성을 조절하는 것으로 알려진 약리학적 물질 (예를 들어, 재조합 EPO 또는 EPO 동족체)로 처리된 피험자로부터 유래되는 시료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 대조군은 본 발명의 방법으로 처리되기 전 피험자로부터 수득되는 시료일 수 있다. 추가의 적합한 대조군은 임의 유형 또는 단계의 신장 질환을 갖는 것으로 알려진 피험자로부터 수득되는 시험 시료, 및 임의의 유형 또는 단계의 신장 질환을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자로부터 수득되는 시험 시료일 수 있다. 대조군은 정상적인 건강한 비교되는 대조군일 수 있다. 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 대조군을 알 수 있을 것이다.
"재생 예후", "재생적 예후" 또는 "재생에 대한 예후"는 일반적으로 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 투여 또는 이식으로부터의 유망한 재생 과정 또는 결과에 대한 예측 또는 예견을 말한다. 재생 예후에 있어, 예측 또는 예견은 하기 중 하나 이상에 알려질 수 있다: 이식 또는 투여 후 기능성 신장의 개선, 이식 또는 투여 후 기능성 신장의 발달, 이식 또는 투여 후 개선된 신장 기능 또는 수용력의 발달 및 이식 또는 투여 후 고유 신장에 의한 특정 마커의 발현.
"재생된 신장"은 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물 이식 또는 투여 후의 고유 신장을 말한다. 재생된 신장은 고유 신장의 기능 또는 수용력의 발달, 고유 신장의 기능 또는 수용력의 개선 및 고유 신장의 특정 마커의 발현을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 지표로 특징지어진다. 당업자는 다른 지표도 재생 신장을 특징짓는데 적합할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
세포군
신장 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 즉 신장 기능을 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생하기 위한, 특정 생물활성 성분 또는 세포 유형이 농축되고/되거나 특정한 불활성 또는 목적하지 않는 성분 또는 세포 유형이 고갈된, 분리된 이질적 신장 세포군 및 이의 혼합물이 문헌 [참조: 미국 출원 번호 12/617,721 (출원일: 2009.11.12), 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨]에 이미 기술되어 있다. 본 발명은 건강한 개체와 비교하여 세포 성분은 결여되나 치료 특성을 보유하는, 즉 신장 기능을 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생하는 분리된 신장 세포 분획물을 제공한다. 본원에서 기술되는 세포군, 세포 분획물 및/또는 세포 혼합물은 건강한 개체, 신장 질환을 갖는 개체 또는 본원에 기술된 피험자로부터 유래될 수 있다.
생물활성 세포군
하나의 양상에서, 본 발명은 생물활성 성분들은 농축되고 비활성 또는 바람직하지 못한 성분들은 고갈된, 이질성 신장 세포군의 특정 아분획물이 초기 세포군 보다 우수한 치료 및 재생적 결과를 제공한다는 놀라운 발견에 근거한다. 예를 들어, 비활성 또는 바람직하지 못한 성분, 예를 들어, B1 및 B5는 고갈된, 본 발명의 생물활성 성분, 예를 들어, B2, B4 및 B3는 단독으로 또는 혼합되었을 때, 신장 기능의 예상치못한 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 세포 유형, 예를 들어 혈관, 내분비 또는 내피, 즉 B4'가 고갈되거나 결핍된, 특정 아분획물 B4'가, 단독으로 또는 다른 생물활성 아분획물, 예를 들어 B2 및/또는 B3와 혼합되었을 때, 치료 특성을 보유, 예를 들어 신장 기능을 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생한다는 놀라운 발견에 기초한다. 바람직한 양태에서, 생물활성 세포군은 B2이다. 특정 양태에서, B2 세포군은 B4 또는 B4'와 혼합된다. 특정 양태에서, B2 세포군은 B3와 혼합된다. 다른 양태에서, B2 세포군은 B3 및 B4 모두 또는 B3 및/또는 B4의 특정 세포 성분과 혼합된다.
B2 세포군은 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8), 및 집합관 마커 아쿠아포린-4 (Aqp4) 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 세뇨관 세포 마커의 발현으로 특징지어진다. B2는 B3 및/또는 B4보다 크고 더욱 많이 과립화되어, 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ (설치류), 약 1.045 g/㎖ 내지 1.052 g/㎖ (인간) 및 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.058 g/㎖ (개)의 부력 밀도를 갖는다.
B3 세포군은 일부 EPO-생성 세포와 함께 혈관, 사구체 및 근위 세뇨관 마커의 발현으로 특징지어지며, B2 및 B4와 비교하여 중간 정도의 크기 및 입도를 가져 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.073 g/㎖ (설치류), 약 1.052 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ (인간) 및 약 1.058 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ (개)의 부력 밀도를 갖는다. B3는 아쿠아포린 7 (Aqp7), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 2 (Fxyd2), 용질 캐리어 패밀리 17 (인산나트륨), 멤버 3 (Slc17a3), 용질 캐리어 패밀리 3, 멤버 1 (Slc3a1), 클라우딘 2 (Cldn2), 냅신 A 아스파틱 펩티다제 (Napsa), 용질 캐리어 패밀리 2 (촉진된 글루코즈 수송자), 멤버 2 (Slc2a2), 알라닐 (막) 아미노펩티다제 (Anpep), 막통과 단백질 27 (Tmem27), 아실-CoA 신쎄타제 중쇄 패밀리 멤버 2 (Acsm2), 글루타티온퍼옥시다제 3 (Gpx3), 푸럭토즈-1,6-비포스파타제 1 (Fbp1) 및 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스페라제 2 (Agxt2) 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커의 발현으로 특징지어진다. B3는 또한 혈관 발현 마커 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 사구체 발현 마커 포도신 (Podn)을 특징지어진다.
B4 세포군은 PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146 중 하나 이상을 포함하는 혈관 마커 세트; 포도신 (Podn) 및 네프린 (Neph) 중 하나 이상을 포함하는 사구체 마커 세트; 및 비-분할된 (UNFX) B2 및 B3와 비교되는 산소-조정가능한 EPO 농축 세포군의 발현으로 특징지어진다. B4는 또한 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4 (Cxcr4), 엔도텔린 수용체 타입 B (Ednrb), 콜라겐, 타입 V, 알파 2 (Col5a2), 카드헤린 5 (Cdh5), 플라스미노겐 활성자, 조직 (Plat), 안지오포이에틴 2 (Angpt2), 키나제 삽입 도메인 단백질 수용체 (Kdr), 분비 단백질, 산성의 시스테인-농축 (오스테오넥틴) (Sparc), 세르글리신 (Srgn), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 3 (Timp3), 윌름즈 (Wilms) 종양 1 (Wt1), 날개없는-타입 MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 4 (Wnt4), G-단백질 시그널링 4 (Rgs4)의 조절자, 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 에리트로포이에틴 (Epo) 중 하나 이상의 마커의 발현으로 특징지어진다. B4는 또한 부력 밀도가 약 1.073 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ (설치류), 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ (인간 및 개)이고 B2 또는 B3와 비교하여 더 작고 덜 과립화된 세포로 특징지어진다.
B4' 세포군은 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 부력 밀도를 갖고 PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, 포도신, 네프린EPO, CK7, CK8/18/19 중 하나 이상의 마커를 발현하는 것으로 정의된다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146 중 하나 이상을 포함하는 혈관 마커 세트의 발현으로 특징지어진다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 내분비 마커 EPO의 발현으로 특징지어진다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 포도신 (Podn) 및 네프린 (Neph) 중 하나 이상을 포함하는 사구체 마커 세트의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, B4' 세포군은 PECAM, vEGF, KDR, HIF1a 중 하나 이상을 포함하는 혈관 마커 세트의 발현 및 내분비 마커 EPO의 발현으로 특징지어진다. 또 다른 양태에서, B4'는 또한 부력 밀도가 약 1.073 g/ml 내지 약 1.091 g/ml (설치류), 약 1.063 g/ml 내지 약 1.091 g/mL (인간 및 개)이고 B2 또는 B3와 비교하여 더 작고 덜 과립화된 세포로 특징지어진다.
하나의 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 혈관 세포 및 사구체 세포 중 하나 이상을 포함하는 인간 신장 세포의 분리된 농축 B4' 세포군을 제공한다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, B4' 세포군은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 일부 양태에서, B4' 세포군은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다.
하나의 양태에서, B4' 세포군은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포군을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포군을 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, B4' 세포군은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포군; 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군; 및 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포군을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, B4' 세포군은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포군을 포함하는 제1 세포군인 B2 및 밀도가 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포군인 B4'를 포함하는 인간 신장 세포의 혼합물을 제공하며, 이 혼합물은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존력을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포는 포함하지 않는다. 특정 양태에서, B4' 세포군은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정 양태에서, B2는 추가로 집합관 상피 세포를 포함한다. 하나의 양태에서, 세포의 혼합물은 수용체-매개된 알부민 흡수를 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 하나의 양태에서, 혼합물은 시험관내 및 생체내 모두에서 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생성하고/하거나 생성을 자극할 수 있는 HAS-2-발현 세포를 포함한다. 모든 양태에서, 제1 및 제2 세포군은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 혼합물은 생체내 전달시 재생 자극을 제공할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 혼합물은 생체내 전달시 사구체 여과, 세뇨관 재흡수, 소변 생성 및/또는 내분비 기능의 감퇴를 감소시키거나 안정화시키거나 개선할 수 있다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 밀도가 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 혈관 세포 및 사구체 세포 중 하나 이상을 포함하는 인간 신장 세포의 분리된 농축 B4' 세포군을 제공한다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, B4' 세포군은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 발현되지 않는 사구체 마커는 포도신일 수 있다 (실시예 7). 일부 양태에서, B4' 세포군은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다.
하나의 양태에서, Br' 세포군은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포군을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, B4' 세포군은 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포군을 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, B4' 세포군은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 세뇨관 세포를 포함하는 B2 세포군; 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군; 및 밀도가 1.091 g/ml를 초과하는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포군을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, B4' 세포군은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포군을 포함하는 제1 세포군인 B2 및 밀도가 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포군인 B4'를 포함하는 인간 신장 세포의 혼합물을 제공하며, 이 혼합물은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존력을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포는 포함하지 않는다. 특정 양태에서, B4' 세포군은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정 양태에서, B2는 추가로 집합관 상피 세포를 포함한다. 하나의 양태에서, 세포의 혼합물은 수용체-매개된 알부민 흡수를 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 하나의 양태에서, 세포의 혼합물은 시험관내 및 생체내 모두에서 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생성하고/하거나 생성을 자극할 수 있는 HAS-2-발현 세포를 포함한다. 모든 양태에서, 제1 및 제2 세포군은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 혼합물은 생체내 전달시 재생 자극을 제공할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 혼합물은 생체내 전달시 사구체 여과, 세뇨관 재흡수, 소변 생성 및/또는 내분비 기능의 감퇴를 감소시키거나 안정화시키거나 개선할 수 있다. 하나의 양태에서, B4' 세포군은 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래된다.
바람직한 양태에서, 상기 혼합물은 B3 및/또는 B4와 배합된 B2를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 상기 혼합물은 B3 및/또는 B4'와 배합된 B2를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 혼합물은 (i) B3 및/또는 B4와 배합된 B2 또는 (ii) B3 및/또는 B4'와 배합된 B2로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
B4' 세포군을 포함하는 혼합물은 건강하지 않는 피험자로부터도 수득되는 B2 및/또는 B3 세포군을 포함할 수 있다. 건강하지 않은 피험자는 B4' 분획물이 수득되는 동일한 피험자일 수 있다. B4' 세포군과는 대조적으로, 건강하지 않은 피험자로부터 수득된 B2 및 B3 세포군은, 건강한 개체로부터 유래되는 초기 신장 세포군과 비교하여, 통상적으로 하나 이상의 특정 세포 유형이 결핍되지 않는다.
B2 및 B4에 의한 히알루론산 생성
히알루로난 (Hyaluronan) (또한, 히알루론산 또는 히알루로네이트라고 지칭)은 글리코사미노글리칸 (GAG)이며, 비황산화된 디사카라이드 단위, 특히, N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산의 규칙적인 반복 연속물로 구성된다. 이의 분자량은 400 달톤 (디사카라이드)에서 백만 달톤에 걸친 범위일 수 있다. 피부, 연골, 눈과 같은 모든 조직, 및 성체 동물의 모든 유체는 아니지만 대부분의 유체에서 다양한 양으로 발견된다. 초기 배아에 특히 풍부하다. 히알루로난에 의해, 실제로 GAG에 의해 일반적으로 생기는 공간은 세포 이동, 세포 부착, 상처 치료 동안, 기관형성, 면역 세포 부착, 세포내 시그널링의 활성화 및 종양 전이에서 역할을 하게 한다. 이와 같은 역할들은 히알루로난에 대한 특정 단백질 및 프로테오글리칸 결합에 의해 매개된다. 세포 운동성 및 면역 세포 부착은 세포 표면 수용체 RHAMM (히알루로난 매개된 운동성을 위한 수용체) [참조: Hardwick et al, 1992] 및 CD44 [참조: Jalkenan et al, 1987; Miyake et al, 1990]에 의해 매개된다. 히알루로난은 세포 표면의 내부 막에서 직접적으로 합성되며, 성장하는 폴리머는 합성됨에 따라 막을 통하여 세포 외부로 돌출된다. 합성은, 유전자 패밀리가 최소한 3개 멤버로 구성된, 단일 단백질 효소인 히알루로난 신쎄타제 (HAS)에 의해 매개된다.
최근에, 히알루론산은 CD44와 상호작용하며, 이와 같은 상호작용은 다른 작용중에서도 손상된 신장 조직으로 비-내재 (non-resident) 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포 (MSC))를 모집하고, 신장 재생을 증진시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 [참조: Kidney International (2007) 72, 430-441].
뜻밖으로, B2 및 B4 세포 제제가 히알루론산 신타제-2 (HAS-2) (특히 B2세포군에 농축되는 마커)의 작용을 통하여 더욱 큰 분자량의 히알루론산 (HA) 종을 시험관내 및 생체 모두에서 발현할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 5/6 Nx 모델을 B2로 처리함으로써 섬유증이 감소되었고, 동시에 생체내에서 HAS-2가 강력한 발현되고 처리된 조직내에 고분자량의 HA가 예상되어 생성되었다. 특히, 처리되지 않은 5/6 Nx 모델에서는 HAS-2의 제한적인 검출과 함께 섬유증이 초래되고, 고분자량의 HA가 거의 생성되지 않았다. 이론에 구애됨이 없이, B2 (및 어느 정도는 B4)에 의해 주로 생성되는 항-염증성 고분자량 HA 종이 신장 섬유증 감소 및 신장 재생을 돕는데 있어 세포 제제과 함께 상승적으로 작용하는 것으로 가정된다. 따라서, 본 발명은 히알루론산을 포함하는 생체물질에의 본 발명의 세포 원형의 전달을 포함한다. 이식된 세포에 의한 직접 생성 또는 생성의 자극을 통한 재생 자극 생체물질 성분의 제공 또한 본 발명에서 고려된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 및/또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자에서 이를 치료하는데 사용하기 위한 EPO-생성 신장 세포의 분리된 이질성 세포군을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포군은 신장 생검으로부터 유래된다. 또 다른 양태에서, 상기 세포군은 전체 신장 조직으로부터 유래된다. 또 다른 양태에서, 상기 세포군은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 확립된 포유동물 신장 세포의 시험관내 배양물로부터 유래된다. 모든 양태에서, 이들 세포군은 비분할된 세포군이며, 본원에서는 비-농축 세포군이라고도 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 농축 아세포군 (subpopulation)에 있는 EPO-생성 세포의 비율이 초기 또는 최초 세포군에서의 EPO-생성 세포의 비율보다 크도록 추가 농축된, 에리트로포에틴 (EPO)-생성 신장 세포의 분리된 세포군을 제공한다. 하나의 양태에서, 농축 EPO-생성 세포 분획물은 비농축 초기 세포군에 포함된 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포과 비교하여 더 큰 비율의 간질 섬유모세포와 더 적은 비율의 세뇨관 세포를 포함한다. 특정 양태에서, 농축 EPO-생성 세포 분획물은 비농축 초기 세포군에 포함된 사구체 세포, 혈관 세포 및 집합관 세포와 비교하여 더 큰 비율의 사구체 세포 및 혈관 세포와 더 적은 비율의 집합관 세포를 포함한다. 이와 같은 양태에서, 이들 세포군은 본원에서 "B4" 세포군이라고 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 추가 신장 세포군과 혼합된 EPO-생성 신장 세포군을 제공한다. 하나의 양태에서, EPO-생성 세포군은 EPO-생성 세포가 농축된 제1 세포군, 예를 들어 B4이다. 또 다른 양태에서, EPO-생성 세포군은 EPO-생성 세포가 농축되지 않은 제1 세포군, 예를 들어 B2이다. 또 다른 양태에서, 제1 세포군은 제2 신장 세포군과 혼합된다. 일부 양태에서, 제2 세포군은 세뇨관 세포가 농축되며, 이는 세뇨관 세포 표현형의 존재로 입증될 수 있다. 또 다른 양태에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나의 세뇨관 세포 마커의 존재로 표시될 수 있다. 또 다른 양태에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나 이상의 세뇨관 세포 마커의 존재로 표시될 수 있다. 세뇨관 세포 마커는 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 양태에서, 제1 세포군은 간질-유래된 세포, 세뇨관 세포, 집합관-유래 세포, 사구체-유래 세포 및/또는 혈액 또는 혈관구조로부터 유래된 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 수개의 신장 세포 유형 중 최소한 하나와 혼합된다. EPO-생성 신장 세포군은 B2 및/또는 B3와의 혼합물의 형태 또는 농축 세포군, 예를 들어 B2+B3+B4/B4'의 형태로 B4 또는 B4'를 포함할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 EPO-생성 신장 세포군은 EPO 발현 및 산소에 대한 생물반응성으로 특징지어지며, 배양 시스템에서 산소 분압의 감소로 EPO 발현이 유도된다. 하나의 양태에서, EPO-생성 세포군은 EPO-생성 세포가 농축된다. 하나의 양태에서, EPO 발현은, 세포가 정상적인 대기 수준 (약 21%)의 이용가능한 산소 수준에서 배양된 세포군과 비교하여 배양 시스템에서 이용가능한 산소 수준이 감소되는 조건에서 세포군이 배양되었을 때 유도된다. 하나의 양태에서, 낮은 산소 조건에서 배양된 EPO-생성 세포가 정상적인 산소 조건에서 배양된 EPO-생성 세포와 비교하여 높은 수준의 EPO를 발현한다. 일반적으로, 이용가능한 산소 수준의 감소 상태 (또한 저산소 배양 조건이라고 함)에서 세포를 배양한다는 것은 이용가능한 산소의 수준이 정상적인 대기 수준 (정상 또는 표준 산소 배양 조건이라고 부르기도 함)에서 세포를 배양한 것과 비교하여 산소 수준이 감소되었다는 것을 의미한다. 하나의 양태에서, 저산소 세포 배양 조건은 약 1% 미만의 산소, 약 2% 미만의 산소, 약 3% 미만의 산소, 약 4% 미만의 산소 또는 약 5% 미만의 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 정상 또는 표준 산소 배양 조건은 약 10% 산소, 약 12% 산소, 약 13% 산소, 약 14% 산소, 약 15% 산소, 약 16% 산소, 약 17% 산소, 약 18% 산소, 약 19% 산소, 약 20% 산소 또는 약 21% 산소에서의 세포 배양을 포함한다.
또 다른 양태에서, EPO의 유도된 또는 증가된 발현은, 약 5% 미만의 이용가능한 산소에서 세포를 배양하고 대기 (약 21%) 산소에서 배양된 세포와 EPO 수준을 비교함으로써 수득되고 관측될 수 있다. 또 다른 양태에서, EPO의 유도는, 세포를 대기 산소 (약 21%)에서 얼마간의 시간 동안 배양하는 제1 배양 단계 및 이용가능한 산소 수준을 감소시키고 약 5% 미만의 이용가능한 산소에서 동일한 세포를 배양하는 제2 배양 단계를 포함하는 방법에 의해 EPO를 발현할 수 있는 세포를 배양함으로써 수득된다. 또 다른 양태에서, 저산소 상태에 반응적인 EPO 발현은 HIF1α에 의해 조절된다. 당업자는 본원에 기술된 세포에 대해 당업계에 공지된 다른 산소 조절 배양 조건을 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
하나의 양상에서, EPO-생성 포유동물 세포의 농축 세포군은 관류 (perfusion) 조건에 대한 생물-반응성 (예를 들어, EPO 발현)으로 특징지어진다. 하나의 양태에서, 관류 조건은 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 유동 (관류)을 포함한다. 하나의 양태에서, EPO 발현은 동력이 유동을 통해 세포에 전달되도록 세포가 배양되는 배지를 간헐적으로 또는 연속적으로 순환시키거나 교반시켰을 때 기계적으로 유도된다. 하나의 양태에서, 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 흐름을 겪는 세포는, 이들이 3차원 구조로 존재하거나 이와 같은 3차원 구조를 형성하기 위한 골격 및/또는 공간을 제공하는 물질 내에 또는 물질 상에 존재하도록 배양된다. 하나의 양태에서, 세포는 다공성 비드 상에서 배양되거, 흔들리는 플랫폼, 궤도를 선회하는 플랫폼 또는 스피너 플라스크를 통하여 간헐적 또는 연속적 유체 흐름을 받게 된다. 또 다른 양태에서, 세포는 3차원 스캐폴딩에서 배양되며, 스캐폴드는 고정되고 유체는 스캐폴딩를 통하여 또는 가로질러 방향성 있게 흐르도록 한 장치에 놓인다. 당업자는 당업계에 공지된 다른 관류 배양 조건이 본원에서 기술되는 세포에 대해 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
비활성 세포군
본원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명은 생물활성 성분이 농축되고 비활성 또는 바람직하지 못한 성분은 고갈된, 이질성 신장 세포군의 특정 아분획물이 초기 세포군 보다 우수한 치료 및 재생 결과를 제공한다는 놀라운 발견에 일부 근거한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 세포군은 B1 및/또는 B5 세포군이 고갈되어 있다. 예를 들어, 하기 세포군은 B1 및/또는 B5: B2, B3 및 B4' 중 2개 이상의 혼합물; B2, B3 및 B4의 농축 세포군이 고갈될 수 있다.
B1 세포군은 부력 밀도가 약 1.045 g/㎖ 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한다. B5 세포군은 부력 밀도가 약 1.091 g/㎖ 초과인 낮은 입도와 생존력의 파편 및 소세포를 포함한다.
세포군의 분리 및 배양 방법
본 발명은, 하나의 양상에서, 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍, 및 사구체 여과 결핍 치료를 포함하는 치료 목적으로 신장 세포 성분, 예를 들어 농축 세포군을 분리 및 단리하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포군은 새로 분해된, 예를 들어 기계적으로 또는 효소로 분해된 신장 조직으로부터 단리되거나 포유동물 신장 세포의 이질성 시험관내 배양물으로부터 단리된다.
뜻밖에도, 이질성 신장 세포 혼합물을 밀도 구배물 상에서 분리하기 전 저산소 배양 조건에서 배양하면 B4'를 포함한 B4, 및 B2 및/또는 B3 분획물 모두에서 세포 분포 및 조성이 향상된다는 것이 밝혀졌다. 질환이 있는 신장 및 질환이 없는 신장으로부터 단리된 신장 세포에 대해 B2로부터 B4에서 산소-의존적 세포 농축이 관측되었다. 이론에 구속되지 않고, 이는 다음 중 하나의 현상 때문일 수 있다: 1) 저산소 배양 기간 동안 특정 세포 성분들의 선택적 생존, 사멸 또는 증식; 2) 저산소 배양에 반응하여 세포 입도 및/또는 크기의 변화 (이에 의해 부력 밀도 변화 및 후속적으로 밀도 구배 분리 동안 국소화에 영향을 줌); 및 3) 저산소 배양 기간에 반응하여 세포 유전자/단백질 발현의 변화 (이에 의해 구배물의 임의의 소정 분획물 내에서 세포의 차등적 특징을 초래함). 따라서, 하나의 양태에서, 세뇨관 세포가 농축된 세포군, 예를 들어 B2는 저산소-저항성이다.
본 발명의 세포군을 분리 및 단리하기 위한 예시적인 기술은 관심 세포군에 포함된 상이한 세포 유형의 상이한 근거하여 밀도 구배물 상에서 분리하는 것을 포함한다. 임의의 소정의 세포 유형의 비중은 세포내 입도, 세포내 물의 용적 및 기타 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 하나의 양상에서, 본 발명은 인간, 개 및 설치류를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수 종에 걸쳐 본 발명의 세포 제제, 예를 들어 B4'를 포함하여 B2 및 B4의 분리를 위한 최적의 구배 조건을 제공한다. 바람직한 하나의 양태에서, 밀도 구배를 이용하여 이질성 신장 세포군으로부터 유래된 세뇨관 세포 분획물의 새로운 농축 세포군, 즉 B2 세포군을 수득한다. 하나의 양태에서, 밀도 구배를 이용하여 이질성 신장 세포군으로부터 유래된 새로운 EPO-생성 농축 세포군, 즉 B4 세포군을 수득한다. 다른 양태에서, 밀도 구배를 이용하여 신장의 세뇨관 세포, 사구체 세포 및 내피 세포의 농축 아세포군을 수득한다. 하나의 양태에서, EPO-생성 세포 및 세뇨관 세포 모두가 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리된다. 하나의 양태에서, EPO-생성, 사구체 및 혈관 세포가 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리되며, 동시에 세뇨관 세포 및 집합관 세포의 아세포군이 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리된다. 하나의 양태에서, 내분비, 사구체 및/또는 혈관 세포가 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리되며, 동시에 세뇨관 세포 및 집합관 세포의 아세포군이 다른 세포 유형 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리된다.
본 발명은, 물 중 60% 비이온성 요오드처리된 화합물인 요오딕사놀을 포함하는 OPTIPREP® (Axis-Shield) 밀도 구배 매질을 부분적으로 사용하여, 하기에서 설명되는 특정한 주요 특징에 근거하여, 새로운 세포군을 생성하였다. 그러나, 당업자는 본 발명의 세포군을 분리하는데 필수적인 특징을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 세포 표면 마커를 사용하는 임의의 밀도 구배 또는 면역학적 분리와 같은 다른 수단이 본 발명에 따라 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 밀도 구배를 통하여 아세포군을 분리하는데 기여하는 동일한 세포 특징 (크기 및 입도)을 개발하여 유세포분석을 통하여 세포의 아세포군을 분리할 수 있다는 것 또한 인식해야 한다 (전방 산란 = 유세포분석을 통한 크기 반영, 측면 산란 = 입도 반영). 중요한 것은, 밀도 구배 매질은 특정 관심 세포에 대해 독성이 낮아야 한다. 밀도 구배 매질은 특정 관심 세포에 대해 독성이 낮아야 하고, 본 발명은 관심 세포의 선별 과정에서 역할을 하는 구배 매질의 사용을 고려한다. 이론에 구속되지 않고, 로딩과 회수 단계 사이에서 상당한 세포 손상이 있기 때문에, 요오딕사놀을 포함하는 구배에 의해 회수되는 본 발명의 세포군은 요오딕사놀-저항성으로 보이며, 이는 구배 조건하에서 요오딕사놀에의 노출로 특정 세포가 제거된다는 것을 제시한다. 요오딕사놀 구배 후에 특정 밴드에 나타나는 세포는 요오딕사놀 및/또는 밀도 구배 노출의 임의의 부적당한 효과에 저항성이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 세포군의 분리 및/또는 선별에서 약하거나 중간 정도의 신장독소인 추가 대비 매질의 사용도 고려한다. 또한, 밀도 구배 매질은 인간 혈장에 있는 단백질에 결합하지 않아야 하거나 관심 세포의 주요 기능에 역효과를 주지 않아야 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 신장 세포 유형을 농축 및/또는 고갈시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 신장 세포 유형은 BD FACSAria™ 또는 등가물을 이용하여 농축 및/또는 고갈될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 자기 세포 분류를 이용하여 신장 세포 유형을 농축 및/또는 고갈시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 신장 세포 유형은 Miltenyi autoMACS® 시스템 또는 등가물을 이용하여 농축 및/또는 고갈될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 신장 세포군의 3차원 배양 방법을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 연속적 관류를 통하여 상기 세포군을 배양하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 3차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양된 세포군은 정적으로 배양된 세포군과 비교하였을 때, 더윽 큰 세포충실성 및 상호연결성을 나타낸다. 또 다른 양태에서, 3차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양된 세포군은, 이러한 세포군의 정치 배양과 비교하였을 때, 더욱 큰 EPO 발현과 e-카드헤린과 같은 신장 세뇨관-연관된 유전자의 증진된 발현을 나타낸다.
추가적인 또 다른 양태에서, 연속적 관류를 통하여 배양된 세포군은, 정적으로 배양된 세포군과 비교하였을 때, 더욱 높은 수준의 글루코즈 및 글루타민 소비를 나타낸다.
(실시예 3을 포함하여) 본원에서 기술되는 바와 같이, 저산소 조건을 본 발명의 세포군을 제조하는 방법에 이용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법은 낮은 산소 조건화 단계 없이도 이용될 수 있다. 하나의 양태에서, 표준산소 조건이 이용될 수 있다.
당업자는 당업계에 공지된 기타 분리 및 배양 방법을 본원에서 기술되는 세포에 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
생체물질 ( 폴리머 매트릭스 또는 스캐폴드 )
문헌 [참조: Bertram et al ., 미국 공개 출원 20070276507, 본원에 전체가 참조로 삽입된다]에서 기술하고 있는 바와 같이, 폴리머 매트릭스 또는 스캐폴드는 다수의 전체 시스템, 기하학 또는 공간 제약을 만족시키는 다수의 바람직한 배치로 성형될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 매트릭스 또는 스캐폴드는 3차원이며 기관 또는 조직 구조의 크기 및 모양에 맞도록 성형될 수 있다. 예를 들어, 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍 치료용 폴리머 스캐폴드를 사용할 때, 3차원 (3-D) 매트릭스가 사용될 수 있다. 상이한 형태의 다양한 3-D 스캐폴드가 사용될 수 있다. 당연히, 폴리머 매트릭스는 상이한 체격의 환자에 맞도록 상이한 크기 및 형태로 성형될 수 있다. 또한, 폴리머 매트릭스는 환자의 특별 요구를 수용하도록 다른 방법으로 성형될 수 있다. 또 다른 양태에서, 폴리머 매트릭스 또는 스캐폴드는 생체적합성의 다공성 폴리머 스캐폴드일 수 있다. 스캐폴드는 개방-셀 폴리락트산 (OPLA®), 셀룰로오즈 에테르, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 에스테르, 불소 처리된 폴리에틸렌, 페놀, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤조옥사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오르올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리술폰, 폴리테트라플루오르에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 불화물, 재생 셀룰로오즈, 실리콘, 우레아-포름알데하이드, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 실크, 엘라스틴, 알기네이트, 히알루론산, 아가로즈 또는 코폴리머 또는 이의 물리적 블렌드를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 합성 또는 천연-발생 물질로부터 형성될 수 있다. 스캐폴딩 배치는 액상 하이드로겔 현탁액부터 부드러운 다공성 스캐폴드, 딱딱한 모양을 가진 다공성 스캐폴드까지 다양하다.
하이드로겔은 다양한 폴리머 물질로부터 형성될 수 있고, 다양한 생의학적 용도에 유용하다. 하이드로겔은 친수성 폴리머의 3차원적 네트워크로서 물리적으로 설명될 수 있다. 하이드로겔 유형에 따라, 비록 물에 용해되지는 않지만, 다양한 비율의 물을 포함한다. 하이드로겔은 높은 수분 함량에도 불구하고 친수성 잔기의 존재로 인하여 추가적으로 큰 용적의 액체를 결합할 수 있다. 하이드로겔은 이들의 젤라틴성 구조의 변화 없이 상당히 팽창된다. 하이드로겔의 기본적인 물리적 특징은 이용되는 폴리머의 성질 및 생성물에 대한 추가적인 특정 장비에 따라 특정하게 변형될 수 있다.
바람직하게는, 하이드로겔은 생물학적 비활성이고 포유동물 조직과 생리학적으로 양립가능한, 폴리머, 생물학적으로 유도된 물질, 합성에 의해 유도된 물질 또는 이의 조합으로 제조된다. 하이드로겔 물질은 바람직하게는 염증 반응을 유도하지 않는다. 하이드로겔을 형성하는데 사용될 수 있는 다른 물질의 예는 (a) 개질된 알기네이트, (b) 일가 양이온에의 노출로 겔화되는 폴리사카라이드 (즉, 겔란 검 및 카라지난), (c) 매우 점성이 큰 용액이거나 틱소트로픽 (thixotropic)이며 구조의 느린 발달에 의해 시간을 두고 겔을 형성하는 폴리사카라이드 (예를 들어, 히알루론산) 및 (d) 폴리머 하이드로겔 전구물질 (예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 코폴리머 및 단백질)을 포함한다. 미국 특허 6,224,893 B1은 본 발명에 따른 하이드로겔을 제조하는데 적합한 다양한 폴리머 및 이와 같은 폴리머의 화학적 특성에 대한 상세한 설명을 제공한다.
스캐폴딩 또는 생체물질 특성은 세포가 스캐폴딩 또는 생체물질 물질에 부착되어 이와 상호작용할 수 있고/있거나 세포가 포착될 수 있는 다공성 공간을 제공할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 다공성 스캐폴드 또는 생체물질은 다공성 스캐폴드로 설계된 생체물질 상 (예를 들어, 세포의 부착에 의해) 및/또는 스캐폴드의 세공 내에 (예를 들어, 세포의 포착에 의해) 하나 이상의 세포군 또는 혼합물의 첨가 또는 침착을 허용한다. 또 다른 양태에서, 스캐폴드 또는 생체물질은 본원에서 기술되는 바와 같은 구조물을 형성하기 위하여 스캐폴드 내에서 세포:세포 및/또는 세포:생체물질 상호작용을 허용하거나 촉진시킨다.
하나의 양태에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 생체물질은 5.1 kDA부터 > 2 x 106 kDa까지의 크기를 갖는 HA 분자를 포함하는 하이드로겔 형태의 히알루론산 (HA)으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 생체물질은 5.1 kDA부터 > 2 x 106 kDa까지의 크기를 갖는 HA 분자를 포함하는 다공성 포움 형태의 히알루론산 (HA)으로 구성된다. 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 생체물질은 약 50 미크론 내지 약 300 미크론의 세공 크기와 개방-셀 구조를 갖는 폴리-락트산 (PLA)-기반 포움으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 특정 세포군, 바람직하게는 B2 및 B4는, 특히 신장내 이식 후, 히알루론산 신타제-2 (HAS-2)를 통하여 고분자량 히알루론산의 합성을 직접적으로 제공하고/하거나 촉진한다.
당업자는 당업계에 공지된 다른 타입의 합성 또는 천연 생성 물질이 본원에서 기술되는 것과 같은 스캐폴드를 형성하는데 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 상기 언급된 스캐폴드 또는 생체물질로부터 제조된 본원에서 기술되는 것과 같은 구조물을 제공한다.
구조물
하나의 양상에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자의 치료를 위한 본원에서 기술되는 하나 이상의 세포군을 갖는 이식가능한 구조물을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 구조물은 하나 이상의 합성 또는 천연-발생 생체적합 물질로 구성된 스캐폴드 또는 매트릭스인 생체적합 물질 또는 생체물질, 및 부착 및/또는 포착에 의해 스캐폴드 표면상에 침착되거나 표면 내에 포매된 하나 이상의 세포군 또는 세포 혼합물로 구성된다. 특정 양태에서, 구조물은 생체물질 및 생체물질 성분으로 코팅된, 생체물질 및 생체물질 성분상에 침착된, 생체물질 및 생체물질 성분 내에 침착된, 생체물질 및 생체물질 성분에 부착된, 생체물질 및 생체물질 성분 내에 포착된, 생체물질 및 생체물질 성분 내에 포매된 또는 생체물질 및 생체물질 성분과 조합된 본원에서 기술되는 하나 이상의 세포군 또는 세포 혼합물로 구성된다. 농축 세포군 또는 이의 혼합물을 포함한 본원에서 기술되는 어떠한 세포군도 구조물을 형성하기 위해 매트릭스와 조합하여 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 구조물에 침착된 세포군 또는 세포 성분은 산소-조정가능 EPO-생성 세포가 농축된 제1 신장 세포군이다. 또 다른 양태에서, 제1 신장 세포군은 산소-조정가능 EPO-생성 세포에 추가하여 사구체 및 혈관 세포를 포함한다. 하나의 양태에서, 제1 신장 세포군은 B4' 세포군이다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물에 침착된 세포군 또는 세포 성분은 제1 농축 신장 세포군 및 제2 신장 세포군 모두를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 세포군은 산소-조정가능 EPO 생성 세포가 농축되지 않는다. 또 다른 양태에서, 제2 세포군은 신장 세뇨관 세포가 농축된다. 또 다른 양태에서, 제2 세포군은 신장 세뇨관 세포가 농축되고 집합관 상피 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 신장 세뇨관 세포는 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-포함 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 세뇨관 세포 마커의 발현으로 특징지어진다.
하나의 양태에서, 본 발명의 구조물을 형성을 위한 생체물질 또는 스캐폴드 상에 침착되거나 이와 조합되는 세포군은 다양한 공급원, 예를 들어 자가 공급원으로부터 유래된다. 또한, 동종이계 또는 동계 (자가유전자형 또는 동종유전자형) 공급원을 포함하나 이로 제한되지 않는 비-자가 공급원도 사용에 적합하다.
당업자는 구조물을 형성하기 위하여 세포군을 생체물질에 침착시키거나 생체물질과 조합하는 수 가지의 적합한 방법이 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명의 구조물은 본원에서 기술되는 이용 방법에 사용하기에 적합하다. 하나의 양태에서, 상기 구조물은 임의 병인의 신장 질환, 빈혈증 또는 임의 병인의 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자에게 투여하기에 적합하다. 다른 양태에서, 상기 구조물은 적혈구 항상성의 개선 또는 회복을 요하는 피험자에게 투여하기에 적합하다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 신장 기능을 개선시킬 필요가 있는 피험자에게 투여하기에 적합하다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 a) 하나 이상의 생체적합 합성 폴리머 또는 천연-발생 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 생체물질; 및
b) 생체물질로 코팅되고/되거나, 생체물질 상에 침착되고/되거나, 생체물질 내에 포착되고/되거나, 생체물질 중에 현탁되고/되거나, 생체물질 내에 포매되고/되거나, 달리 생체물질과 조합되는, 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포군을 포함하는 제1 세포군인 B2 및 밀도가 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포군인 B4'를 포함하는 신장 질환을 갖는 피험자로부터 유래되는 포유동물 신장 세포의 혼합물를 포함하는, 신장 기능의 개선이 필요한 피험자에게 이식하기 위한 구조물을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 혼합물은 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존력을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포는 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, 상기 구조물은 혈관 마커의 발현으로 특징지어지는 B4' 세포군을 포함한다. 일부 양태에서, B4' 세포군은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정 양태에서, 상기 혼합물은 산소-조정가능 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 모든 양태에서, 상기 혼합물은 포유동물 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 구조물은 상기 혼합물의 포착 및/또는 부착에 적합한 3차원 (3-D)의 다공성 생체물질로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 포유동물 세포를 포매, 부착, 현탁 또는 코팅하기에 적합한 액체 또는 반-액체 겔로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 하이드로겔 형태의 고분자량 히알루론산 (HA) 종으로 주로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 다공성 포움 형태의 고분자량 히알루론산 종으로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 약 50 마이크론 내지 약 300 마이크론의 세공을 갖는 폴리-락트산-기반 포움으로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 구조물은 개선된 신장 기능이 필요한 피험자에 대해 자가인 신장 시료로부터 유래될 수 있는 하나 이상의 세포군을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 시료는 신장 생검이다. 일부 양태에서, 피험자는 신장 질환을 갖는다. 추가의 다른 양태에서, 상기 세포군은 비-자가 신장 시료로부터 유래된다. 하나의 양태에서, 상기 구조물은 적혈구 항상성을 제공한다.
분비 생성물
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같이, 농축 신장 세포군 또는 농축 신장 세포군의 혼합물로부터 분비되는 생성물에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 상기 생성물은 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자 및 소포 중 하나 이상을 포함한다. 소포는 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자, 미세소포, 엑소솜 및 RNA 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 분비 생성물은 또한 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자 및 RNA를 포함하나 이로 제한되지 않는 미세소포 내에 있지 않는 생성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포외 miRNA는 소포 외적으로 검출되었다 [참조: Wang et al., Nuc Acids Res 2010, 1-12 doi:10.1093/nar/gkq601, July 7, 2010]. 분비 생성물은 또한 세포-유래 생성물, 예를 들어 세포-유래 소포로 불릴 수 있다.
또 다른 양태에서, 분비 생성물은 신장 세포로부터 유래되는 소포의 일부일 수 있다. 상기 소포는 상기 인자들은 다른 목적지로 전달할 수 있다. 하나의 양태에서, 소포는 분비 소포이다. 엑소솜, 미세소포, 엑토솜, 막 입자, 엑소솜-유사 소포 및 아폽토시스 소포를 포함하나 이로 제한되지 않는 다양한 유형의 분비 소포가 고려된다 [참조: Thery et al ., 2010. Nat. Rev. Immunol. 9:581-593]. 하나의 양태에서, 분비 소포는 엑소솜이다. 또 다른 양태에서, 분비소포는 미세소포이다. 또 다른 양태에서, 분비 소포는 하나 이상의 세포 성분을 포함한다. 상기 성분은 막 지질, RNA, 단백질, 대사산물, 세포질 성분 및 이의 임의의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 바람직한 양태에서, 분비 소포는 microRNA를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다. 바람직하게는, miRNA는 인간 miRNA이다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택된다: miR-30b-5p, miR-449a, miR-146a, miR-130a, miR-23b, miR-21, miR-124 및 miR-151. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다: let-7a-1; let-7a-2; let-7a-3; let-7b; let-7c; let-7d; let-7e; let-7f-1; let-7f-2; let-7g; let-7i; mir-1-1; mir-1-2; mir-7-1; mir-7-2; mir-7-3; mir-9-1; mir-9-2; mir-9-3; mir-10a; mir-10b; mir-15a; mir-15b; mir-16-1; mir-16-2; mir-17; mir-18a; mir-18b; mir-19a; mir-19b-1; mir-19b-2; mir-20a; mir-20b; mir-21; mir-22; mir-23a; mir-23b; mir-23c; mir-24-1; mir-24-2; mir-25; mir-26a-1; mir-26a-2; mir-26b; mir-27a; mir-27b; mir-28; mir-29a; mir-29b-1; mir-29b-2; mir-29c; mir-30a; mir-30b; mir-30c-1; mir-30c-2; mir-30d; mir-30e; mir-31; mir-32; mir-33a; mir-33b; mir-34a; mir-34b; mir-34c; mir-92a-1; mir-92a-2; mir-92b; mir-93; mir-95; mir-96; mir-98; mir-99a mir-99b; mir-100; mir-101-1; mir-101-2; mir-103-1; mir-103-1-as; mir-103-2; mir-103-2-as; mir-105-1; mir-105-2; mir-106a; mir-106b; mir-107; mir-122; mir-124-1; mir-124-2; mir-124-3; mir-125a; mir-125b-1; mir-125b-2; mir-126; mir-127; mir-128-1; mir-128-2; mir-129-1; mir-129-2; mir-130a; mir-130b; mir-132; mir-132; mir-133a-1; mir-133a-2; mir-133b; mir-134; mir-135a-1; mir-135a-2; mir-135b; mir-136 MI101351120; mir-137; mir-138-1; mir-138-2; mir-139; mir-140; mir-141; mir-142; mir-143; mir-144; mir-145; mir-146a; mir-146b; mir-147; mir-147b; mir-148a; mir-148b; mir-149; mir-150; mir-151; mir-152; mir-153-1; mir-153-2; mir-154; mir-155; mir-181a-1; mir-181a-2; mir-181b-1; mir-181b-2; mir-181c; mir-181d; mir-182; mir-183; mir-184; mir-185; mir-186; mir-187; mir-188; mir-190; mir-190b; mir-191; mir-192; mir-193a; mir-193b; mir-194-1; mir-194-2; mir-195; mir-196a-1; mir-196a-2; mir-196b; mir-197; mir-198; 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mir-424; mir-425; mir-429; mir-431; mir-432; mir-433; mir-448; mir-449a; mir-449b; mir-449c; mir-450a-1; mir-450a-2; mir-450b; mir-451; mir-452; mir-454; mir-455; mir-466; mir-483; mir-484; mir-485; mir-486; mir-487a; mir-487b; mir-488; mir-489; mir-490; mir-491; mir-492; mir-493; mir-494; mir-495; mir-496; mir-497; mir-498; mir-499; mir-500a; mir-500b; mir-501; mir-502; mir-503; mir-504; mir-505; mir-506; mir-507; mir-508; mir-509-1; mir-509-2; mir-509-3; mir-510; mir-511-1; mir-511-2; mir-512-1; mir-512-2; mir-513a-1; mir-513a-2; mir-513b; mir-513c; mir-514-1; mir-514-2; mir-514-3; mir-514b; mir-515-1; mir-515-2; mir-516a-1; mir-516a-2; mir-516b-1; mir-516b-2; mir-517a; mir-517b; mir-517c; mir-518a-1; mir-518a-2; mir-518b; mir-518c; mir-518d; mir-518e; mir-518f; mir-519a-1; mir-519a-2; mir-519b; mir-519c; mir-519d; mir-519e; mir-520a; mir-520b; mir-520c; mir-520d; mir-520e; mir-520f; mir-520g; mir-520h; mir-521-1; mir-521-2; mir-522; mir-523; mir-524; mir-525; mir-526a-1; mir-526a-2; mir-526b; mir-527; mir-532; mir-539; mir-541; mir-542; mir-543; mir-544; mir-544b; mir-545; mir-548a-1; mir-548a-2; mir-548a-3; mir-548aa-1; mir-548aa-2; mir-548b; mir-548c; mir-548d-1; mir-548d-2; mir-548e; mir-548f-1; mir-548f-2; mir-548f-3; mir-548f-4; mir-548f-5; mir-548g; mir-548h-1; mir-548h-2; mir-548h-3; mir-548h-4; mir-548i-1; mir-548i-2; mir-548i-3; mir-548i-4; mir-548j; mir-548k; mir-548l; mir-548m; mir-548n; mir-548o; mir-548p; mir-548s; mir-548t; mir-548u; mir-548v; mir-548w; mir-548x; mir-548y; mir-548z; mir-549; mir-550a-1; mir-550a-2; mir-550b-1; mir-550b-2; mir-551a; mir-551b; mir-552; mir-553; mir-554; mir-555; mir-556; mir-557; mir-558; mir-559; mir-561; mir-562; mir-563; mir-564; mir-566; mir-567; mir-568; mir-569; mir-570; mir-571; mir-572; mir-573; mir-574; mir-575; mir-576; mir-577; mir-578; mir-579; mir-580; mir-581; mir-582; mir-583; mir-584; mir-585; mir-586; mir-587; mir-588; mir-589; mir-590; mir-591; mir-592; mir-593; mir-595; mir-596; mir-597; mir-598; mir-599; mir-600; mir-601; mir-602; mir-603; mir-604; mir-605; mir-606; mir-607; mir-608; mir-609; mir-610; mir-611; mir-612; mir-613; mir-614; mir-615; mir-616; mir-617; mir-618; mir-619; mir-620; mir-621; mir-622; mir-623; mir-624; mir-625; mir-626; mir-627; mir-628; mir-629; mir-630; mir-631; mir-632; mir-633; mir-634; mir-635; mir-636; mir-637; mir-638; mir-639; mir-640; mir-641; mir-642a; mir-642b; mir-643; mir-644; mir-645; mir-646; mir-647; mir-648; mir-649; mir-650; mir-651; mir-652; mir-653; mir-654; mir-655; mir-656; mir-657; mir-658; mir-659; mir-660; mir-661; mir-662; mir-663; mir-663b; mir-664; mir-665; mir-668; mir-670; mir-671; mir-675; mir-676; mir-708; mir-711; mir-718; mir-720; mir-744; mir-758; mir-759; mir-760; mir-761; mir-762; mir-764; mir-765; mir-766; mir-767; mir-769; mir-770; mir-802; mir-873; mir-874; mir-875; mir-876; mir-877; mir-885; mir-887; mir-888; mir-889; mir-890; mir-891a; mir-891b; mir-892a; mir-892b; mir-920; mir-921; mir-922; mir-924; mir-933; mir-934; mir-935; mir-936; mir-937; mir-938; mir-939; mir-940; mir-941-1; mir-941-2; mir-941-3; mir-941-4; mir-942; mir-942; mir-943; mir-944; mir-1178; mir-1179; mir-1180; mir-1181; mir-1182; mir-1183; mir-1184-1; mir-1184-2; mir-1184-3; mir-1185-1; mir-1185-2; mir-1193; mir-1197; mir-1200; mir-1202; mir-1203; mir-1204; mir-1205; mir-1206; mir-1207; mir-1208; mir-1224; mir-1225; mir-1226; mir-1227; mir-1228; mir-1229; mir-1231; mir-1233-1; mir-1233-2; mir-1234; mir-1236; mir-1237; mir-1238; mir-1243; mir-1244-1; mir-1244-2; mir-1244-3; mir-1245; mir-1246; mir-1247; mir-1248; mir-1249; mir-1250; mir-1251; mir-1252; mir-1253; mir-1254; mir-1255a; mir-1255b-1; mir-1255b-2; mir-1256; mir-1257; mir-1258; mir-1260; mir-1260b; mir-1261; mir-1262; mir-1263; mir-1264; mir-1265; mir-1266; mir-1267; mir-1268; mir-1269; mir-1270-1; mir-1270-2; mir-1271; mir-1272; mir-1273; mir-1273c; mir-1273d; mir-1273e; mir-1274a; mir-1274b; mir-1275; mir-1276; mir-1277; mir-1278; mir-1279; mir-1280; mir-1281; mir-1282; mir-1283-1; mir-1283-2; mir-1284; mir-1285-1; mir-1285-2; mir-1286; mir-1287; mir-1288; mir-1289-1; mir-1289-2; mir-1290; mir-1291; mir-1292; mir-1293; mir-1294; mir-1295; mir-1296; mir-1297; mir-1298; mir-1299; mir-1301; mir-1302-1; mir-1302-10; mir-1302-11; mir-1302-2; mir-1302-3; mir-1302-4; mir-1302-5; mir-1302-6; mir-1302-7; mir-1302-8; mir-1302-9; mir-1303; mir-1304; mir-1305; mir-1306; mir-1307; mir-1321; mir-1322; mir-1323; mir-1324; mir-1468; mir-1469; mir-1470; mir-1471; mir-1537; mir-1538; mir-1539; mir-1825; mir-1827; mir-1908; mir-1909; mir-1910; mir-1911; mir-1912; mir-1913; mir-1914; mir-1915; mir-1972-1; mir-1972-2; mir-1973; mir-1976; mir-2052; mir-2053; mir-2054; mir-2110; mir-2113; mir-2114; mir-2115; mir-2116; mir-2117; mir-2276; mir-2277; mir-2278; mir-2355; mir-2861; mir-2909; mir-3065; mir-3074; mir-3115; mir-3116-1; mir-3116-2; mir-3117; mir-3118-1; mir-3118-2; mir-3118-3; mir-3118-4; mir-3118-5; mir-3118-6; mir-3119-1;mir-3119-2; mir-3120; mir-3121; mir-3122; mir-3123; mir-3124; mir-3125; mir-3126; mir-3127; mir-3128; mir-3129; mir-3130-1; mir-3130-2; mir-3131; mir-3132; mir-3133; mir-3134; mir-3135; mir-3136; mir-3137; mir-3138; mir-3139; mir-3140; mir-3141; mir-3142; mir-3143; mir-3144; mir-3145; mir-3146; mir-3147; mir-3148; mir-3149; mir-3150; mir-3151; mir-3152; mir-3153; mir-3154; mir-3155; mir-3156-1; mir-3156-2; mir-3156-3; mir-3157; mir-3158-1; mir-3158-2; mir-3159; mir-3160-1; mir-3160-2; mir-3161; mir-3162; mir-3163; mir-3164; mir-3165; mir-3166; mir-3167; mir-3168; mir-3169; mir-3170; mir-3171; mir-3173; mir-3174; mir-3175; mir-3176; mir-3177; mir-3178; mir-3179-1; mir-3179-2; mir-3179-3; mir-3180-1; mir-3180-2; mir-3180-3; mir-3180-4; mir-3180-5; mir-3181; mir-3182; mir-3183; mir-3184; mir-3185; mir-3186; mir-3187; mir-3188; mir-3189; mir-3190; mir-3191; mir-3192; mir-3193; mir-3194; mir-3195; mir-3196; mir-3197; mir-3198; mir-3199-1; mir-3199-2; mir-3200; mir-3201; mir-3202-1; mir-3202-2; mir-3605; mir-3606; mir-3607; mir-3609; mir-3610; mir-3611; 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본 발명은 본원에 기술된 세포군 또는 구조물로부터 수득가능한 세포-유래되거나 분비되는 miRNA에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 각각의 miRNA 하나 이상을 사용하여 고유 신장에 대해 재생 효과를 제공할 수 있다. 각각의 miRNA의 조합이 이러한 효과를 제공하는데 적합할 수 있다. 예시적 조합은 하기 중 2개 이상을 포함한다: miR-21; miR-23a; miR-30c; miR-1224; miR-23b; miR-92a; miR-100; miR-125b-5p; miR-195; miR-10a-5p; 및 이의 임의의 조합. 또 다른 예시적 조합은 하기 중 2개 이상을 포함한다: miR-30b-5p, miR-449a, miR-146a, miR-130a, miR-23b, miR-21, miR-124, miR-151 및 이의 임의의 조합. 하나의 양태에서, miRNA의 조합은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 각각의 miRNA를 포함할 수 있다. 당업자는 다른 miRNA 및 miRNA의 조합이 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 추가의 miRNA의 공급원은 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지하는 https://mirbase.org에서의 miRBase를 포함한다.
하나의 양태에서, 분비 생성물은 측분비 인자를 포함한다. 일반적으로, 측분비 인자는 이웃 세포의 변화, 즉 측분비 상호작용을 유도하거나 초래하기 위해 짧은 거리에 걸쳐 확산할 수 있는 세포에 의해 합성되는 분자이다. 확산가능한 분자를 측분비 인자라 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 분리된 신장-세포 유래의 분비 소포의 조성물에 관한 것이다. 당업자는 분비 소포를 포함하는 다양한 유형의 조성물이 적합할 것이라는 것을 알 수 있을 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 신장 세포 분비 생성물, 예를 들어 소포를 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 양상에서, 상기 방법은 하나 이상의 농축 신장 세포군의 혼합물을 포함하는 신장 세포군을 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 적합한 조건 하에서 세포군을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 조건은 낮은 산소 상태일 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 신장 세포군으로부터의 분비 생성물을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 분비 소포는 세포군의 세포 배양 배지로부터 수득될 수 있다. 또 다른 양태에서, 신장 세포는 배양 시스템의 산소 분압 감소가 소포 생성 및/또는 분비를 유도하도록 산소 수준에 생물반응성인 소포 생성 및/또는 분비로 특징지어진다. 하나의 양태에서, 소포 생성 및/또는 분비는, 세포군이 정상적인 대기 수준 (~21%)의 이용가능한 산소 수준에서 배양된 세포군과 비교하여 배양 시스템에서 이용가능한 산소 수준이 감소되는 조건에서 배양되었을 때 유도된다. 하나의 양태에서, 낮은 산소 조건에서 배양된 세포군은 정상 산소 조건에서 배양된 세포군에 비해 높은 수준의 소포를 생성 및/또는 분비한다. 일반적으로, 감소된 수준의 이용가능한 산소 (또한 저산소 배양 조건이라고도 함)에서 세포를 배양한다는 것은 감소된 산소 수준이 정상 대기 수준의 이용가능한 산소 (또한 정상 또는 표준산소 배양 조건이라고도 함)에서 세포를 배양하는 것에 비해 감소된다는 것을 의미한다. 하나의 양태에서, 저산소 세포 배양 조건은 세포를 약 1% 미만의 산소, 약 2% 미만의 산소, 약 3% 미만의 산소, 약 4% 미만의 산소 또는 약 5% 미만의 산소에서 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 정상 또는 표준 산소 배양 조건은 세포를 약 10% 산소, 약 12% 산소, 약 13% 산소, 약 14% 산소, 약 15% 산소, 약 16% 산소, 약 17% 산소, 약 18% 산소, 약 19% 산소, 약 20% 산소 또는 약 21% 산소에서 배양하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 신장 세포로부터의 엑소솜 및/또는 미세소포의 분리를 위한 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 상기 생성물은 신장 세포로부터 분비된다. 상기 생성물은 스캐폴드 상에 있지 않은 신장 세포, 예를 들어 본원에서 기술되는 바와 같은 구조물의 일부가 아닌 신장 세포로부터 분비될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 생성물은 스캐폴드, 예를 들어 구조물 상에 씨딩된 신장 세포에 의해 분비된다. 상기 구조물은 스캐폴드 상에 또는 스캐폴드 내에 직접적으로 씨딩된 하나 이상의 농축 신장 세포군 또는 이의 혼합물을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 농축 신장 세포군 및 이를 포함하는 혼합물 또는 구조물의 생물치료 효과를 스크리닝/최적화/모니터링하는 시험관내 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 시험군, 시험 혼합물 또는 시험 구조물 ("시험 물품")을 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은 적합한 조건 하에서 시험 물품을 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 배양된 시험 물품으로부터 세포 배양 배지를 수집하는 단계를 포함한다. 이러한 배지를 "적응용 배지 (conditioned medium)"라 할 수 있고, 시험 물품의 신장 세포에 의해 분비된 생성물을 포함할 것으로 예상된다.
하나의 다른 양태에서, 상기 적응용 배지는 시험 물품의 생물치료 효과를 시험하기 위해 하나 이상의 시험관내 검정을 수행하는데 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 적응용 배지에 대해 상피-중간엽 이행 (EMT) 검정이 수행된다. 이 검정은 TGFβ1에 위해 유도되는 EMT을 시험할 수 있다. 실시예 15는 이러한 검정의 예시적 프로토콜을 제공한다.
또 다른 양태에서, 상기 적응용 배지에 대해, 예를 들어 PCR-기반 검정을 통한, RNA를 검출 및/또는, 예를 들어 FACS를 통한, 소포 또는 엑소솜 검출이 수행된다. 또 다른 양태에서, 상기 적응용 배지에 대해 시그널링 경로 검정, 예를 들어 면역 반응 (예를 들어, NFκB), 섬유증 반응 (PAI-1) 및 혈관형성 검정이 수행된다. 실시예 12 내지 14는 이들 검정의 예시적 프로토콜을 제공한다.
이용 방법
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 신장 세포군 또는 신장 세포의 혼합물로 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 EPO-생성 세포가 농축된 제1 신장 세포군을 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 세포군은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포가 농축된다. 하나의 양태에서, 제1 신장 세포군은 B4' 세포군이다. 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가의 신장 세포군을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 추가 세포군은 EPO-생성 세포가 비농축된 제2 세포군이다. 또 다른 양태에서, 추가 세포군은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 또는 혈관 세포가 비농축된 제2 세포군이다. 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 또한 본원에서 기술되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 이식가능한 구조물을 형성하기 위하여 생체물질 내에 침착되거나, 생체물질 상에 침착되거나, 생체물질 내에 포매되거나, 생체물질로 코팅되거나 생체물질 내에 포착된 신장 세포군 또는 신장 세포의 혼합물을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 세포군은 단독으로 사용되거나, 또는 급성 또는 만성 질환 상태에서 재생을 자극하기 위한 다른 세포 또는 생체물질, 예를 들어 하이드로겔, 다공성 스캐폴드, 또는 천연 또는 합성 펩타이드 또는 단백질과 병용하여 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 방법에 의한 피험자에서의 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 효과적인 치료는 적혈구생성 및/또는 신장 기능의 다양한 지표들을 통하여 관측될 수 있다. 하나의 양태에서, 적혈구 항상성의 지표는 헤마토크릿 (HCT), 헤모글로빈 (HB), 평균 소체 (corpuscular) 헤모글로빈 (MCH), 적혈구 카운트 (RBC), 망상적혈구 수, 망상적혈구 %, 평균 소체 용적 (MCV) 및 적혈구 분포 폭 (RDW)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 하나의 다른 양태에서, 신장 기능의 지표는 혈청 알부민, 알부민/글로불린 비율 (A/G 비율), 혈청 인, 혈청 나트륨, 신장 크기 (초음파에 의해 측정가능), 혈청 칼슘, 인:칼슘 비율, 혈청 칼륨, 단백뇨, 소변 크레아티닌, 혈청 크레아티닌, 혈액 질소 우레아 (BUN), 콜레스테롤 수준, 트리글리세라이드 수준 및 사구체 여과율 (GFR)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 전반적인 건강 및 웰빙에 대한 몇 가지 지표는 체중 증감, 생존, 혈압 (평균 전신 혈압, 확장기 혈압 또는 수축기 혈압) 및 신체 지구 능력을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 효율적인 치료는 하나 이상의 신장 기능 지표의 안정화로 증명된다. 신장 기능의 안정화는 본 발명의 방법으로 치료를 받지 않은 피험자에서의 동일한 지표와 비교하여 본 발명의 방법에 의해 치료를 받은 피험자의 지표 변화의 관측으로 입증된다. 대안으로, 신장 기능의 안정화는 치료를 받기 전 피험자에서 동일한 지표와 비교하여 본 발명의 방법에 의해 치료를 받은 동일 피험자의 동일 지표의 변화의 관측으로 입증될 수 있다. 제1 지표의 변화는 값의 증가 또는 감소일 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 치료는 피험자에서 혈액 우레아 질소 (BUN) 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관측된 BUN 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 낮다. 하나의 다른 양태에서, 치료는 피험자에서 혈청 크레아티닌 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관측된 혈청 크레아티닌 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 낮다. 또 다른 양태에서, 치료는 피험자에서 헤마토크릿 (HCT) 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관측된 헤마토크릿 (HCT) 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 높다. 또 다른 양태에서, 치료는 피험자에서 적혈구 (RBC) 수준의 안정화를 포함할 수 있으며, 여기서 피험자에서 관측된 RBC 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 높다. 당업자는 피험자에서 신장 질환의 효과적인 치료를 결정하기 위하여 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 하나 이상의 추가 지표들을 측정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 적혈구 항상성을 요하는 피험자에게 적혈구 항성성을 제공하는 방법에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 (a) 신장 세포군, 예를 들어 본원에서 기술되는, B2 또는 B4' 또는 신장 세포의 혼합물, 예를 들어 B2/B4' 및/또는 B2/B3을 피험자에게 투여하는 단계; 및 (b) 피험자로부터의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계(들)에 반응성이 있음을 나타내거나 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 (a) 본원에서 기술되는 신장 세포군 또는 신장 세포의 혼합물을 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및 (b) 피험자로부터의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (a)에 반응성이 있음을 나타내거나 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 (a) 생체물질 또는 생체적합성 폴리머 스캐폴드를 제공하는 단계; (b) 본 발명의 신장 세포군 또는 신장 세포 혼합물을 본원에서 기술되는 방법으로 생체물질 또는 스캐폴드 위에 또는 안에 침착시켜 이식가능한 구조물을 형성하는 단계; (c) 피험자에게 구조물을 이식하는 단계; 및 (d) 피험자로부터의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (a)에 반응성이 있음을 나타내거나 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 신장 기능의 안정화 및 적혈구 항상성의 회복을 요하는 피험자에게 이를 제공하는 방법에 관한 것으로, 여기서 피험자는 신장 기능의 결핍 및 빈혈증 및/또는 EPO-결핍을 모두 가지고 있다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 세뇨관-유래 세포, 사구체-유래 세포, 간질-유래 세포, 집합관-유래 세포, 간질 조직-유래 세포 또는 혈관구조로부터 유래된 세포 중 최소한 하나를 포함하는 신장 세포군 또는 신장 세포의 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 세포군 또는 혼합물은 EPO-생성 세포 및 세뇨관 상피 세포를 모두 포함하며, 여기서 세뇨관 세포는 다음 중 최소한 하나의 마커에 의해 확인된다: 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 포함하는 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8). 이러한 양태에서, 피험자의 치료는 치료를 받지 않은 피험자의 지표 또는 피험자의 치료전 지표들과 비교하여 적혈구생성에 대한 최소한 하나의 지표의 개선과 함께 신장 기능에 대한 최소한 하나의 지표 개선으로 증명될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같은 EPO-생성 세포가 농축된 신장 세포군 또는 EPO-생성 세포가 농축된 세포군을 포함하는 신장 세포 혼합물을 투여함으로써, (i) 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 회복 또는 (iv) 이의 임의의 조합 방법을 제공하며, 투여의 유익한 효과는 EPO-생성 세포가 비농축된 세포군을 투여할 때의 효과보다 크다. 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 개선된 수준의 혈청 혈액 우레아 질소 (BUN)를 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 혈청에서 개선된 단백질 정체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 개선된 수준의 혈청 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 개선된 수준의 비타민 D를 제공한다. 하나의 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 인:칼슘 비율을 제공한다. 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 추가 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 수준의 혈청 크레아티닌을 제공한다. 추가의 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 수준의 헤마토크릿을 제공한다. 추가 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 수준의 적혈구 수 (RBC#)를 제공한다. 하나의 양태에서, 헤마토크릿의 개선된 수준은 정상적인 건강한 수준의 95%로 회복하는 것이다. 추가 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 망상적혈구 수를 제공한다. 다른 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 망상적혈구 비율 (%)을 제공한다. 추가의 다른 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 수준의 적혈구 용적 분포 폭 (RDW)을 제공한다. 추가의 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 비-농축 세포군과 비교하여 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 추가의 또 다른 양태에서, 농축 세포군은 골수에서 조혈 반응을 제공하며, 골수 세포질은 거의-정상이며, 골수:적혈구 비율도 거의 정상적이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 농축 세포군을 투여함으로써 (i) 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 회복 또는 (iv) 이의 임의의 조합 방법을 제공하며, 여기서, 본원에서 기술되는 신장 세포군 또는 신장 세포군 혼합물의 투여의 유익한 효과는 재조합 EPO (rEPO)를 투여하여 제공되는 유익한 효과들과 비교하여 개선된 적혈구 항상성을 특징으로 한다. 하나의 양태에서, 상기 세포군 또는 혼합물을 필요한 피험자로 투여하였을 때 재조합 EPO 단백질을 투여하였을 때와 비교하여, 개선된 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#으로 측정)을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포군 또는 혼합물은, 투여시, 재조합 EPO와 비교하였을 때 개선된 수준의 헤마토크릿, RBC 또는 헤모글로빈을 제공하며, 대조군에서의 헤마토크릿보다 약 10% 이하로 낮거나 높다. 추가 양태에서, 상기 세포군 또는 혼합물의 단일 투여량 또는 전달은, 투여시, 재조합 EPO 단백질의 단일 투여량 또는 전달이 적혈구 항상성의 개선을 제공하는 기간을 상당히 초과한 기간 동안 치료된 피험자에서 적혈구 항성성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#의 증가로 측정)의 개선을 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 세포군 또는 혼합물은 본원에서 기술되는 투여량으로 투여시 헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#이 필적하는 건강한 대조군에서의 정상 수준의 약 110%를 초과하지 않는다. 추가 양태에서, 세포군 또는 혼합물은, 본원에서 기술되는 투여량으로 투여되었을 때, 본원에서 기술되는 투여량으로 전달된 재조합 EPO 단백질과 비교하여 더 우수한 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#에 의해 결정됨)을 제공한다. 또 다른 양태에서, 재조합 EPO는 약 100 IU/kg, 약 200 IU/kg, 약 300 IU/kg, 약 400 IU/kg 또는 약 500 IU/kg의 투여량으로 전달된다. 당업자는 당업계에서 공지된 재조합 EPO의 다른 투여량이 적합할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술되는 농축 세포군 및 이의 혼합물을 포함한 하나 이상의 세포군, 또는 본원에서 기술되는 이식가능한 구조물, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 분비 생성물의 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하는데 유용한 약물의 제조를 위한, 적혈구 항상성이 필요한 피험자에서 이를 제공하기 위한, 신장 기능의 개선이 필요한 피험자에서 이의 개선을 위한 또는 고유 신장에 재생 효과를 제공하기 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 특정한 입증된 치료적 특성에 기초한 특정 세포 아군(들)의 선별에 기초하여 특정 병인의 신장 질환을 치료하기 위한 (본원에서 기술되는) 특정 농축 세포군(들)의 이용에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL인 분리된 농축 세뇨관 세포군을 포함하는 제1 세포군인 B2 및 밀도가 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL인 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하나 사구체 세포는 고갈된 제2 세포군인 B4'를 포함하나, 밀도가 1.045 g/ml 미만인 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하는 B1 세포군 또는 밀도가 1.091 g/ml 초과인 낮은 입도 및 생존력을 갖는 파편 및 소세포를 포함하는 B5 세포는 포함하지 않는 포유동물 신장 세포의 혼합물을 포함하는 조성물을 피험자에게 투여함을 포함하여, 신장 질환의 치료가 필요한 피험자에서 이를 치료하는 방법을 제공 제공한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 피험자로부터의 시험 시료에서 신장 기능 지표의 수준이 대조군에서의 지표 수준과 비교하여 상이한가를 측정하는 것을 포함하며,이때 지표 수준의 차이는 피험자에서 하나 이상의 신장 기능의 감퇴 감소, 안정화 또는 개선을 나타낸다. 하나의 양태에서, 상기 방법에 사용되는 B4' 세포군은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정 양태에서, 상기 방법에 사용되는 B4' 세포군은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 하나의 양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 치료될 신장 질환은 에리트로포이에틴 (EPO) 결핍을 수반한다. 특정 양태에서, EPO 결핍은 빈혈증이다. 일부 양태에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 피험자의 신부전에 대해 부차적으로 발생한다. 일부 다른 양태에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 만성 신부전, 원발성 EPO 결핍, 화학요법 또는 항-바이러스 요법, 비-골수성 암, HIV 감염, 간질환, 심부전, 류마티스 관절염 또는 다발성 기관계부전으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 질환에 대해 부차적으로 발생한다. 특정 양태에서, 상기 방법에 사용되는 조성물은 하나 이상의 생체적합 합성 폴리머 및/또는 천연-발생 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 생체물질을 추가로 포함하며, 이때 혼합물은 생체물질로 코팅, 생체물질 상에 침착, 생체물질 내에 침착, 생체물질 내에 포착, 생체물질 내에 현탁, 생체물질 내에 포매 및/또는 생체물질과 조합된다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 혼합물은 포유동물 신장 조직 또는 배양된 포유동물 신장 조직으로부터 유래된다. 다른 양태에서, 상기 혼합물은 치료가 필요한 피험자에 대해 자가인 신장 시료로부터 유래된다. 하나의 양태에서, 상기 시료는 신장 생검이다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 혼합물은 비-자가 신장 시료로부터 유래된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료가 필요한 피험자에서 이를 치료하는데 유용한 약물을 제조하기 위한 본 발명의 세포 제제 및 이의 혼합물 또는 이식가능한 구조물의 용도를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 고유 신장의 재생이 필요한 피험자에서 이를 위한 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 피험자에게 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물을 투여 또는 이식하는 단계를 포함한다. 재생된 고유 신장은 고유 신장의 기능 또는 수용력의 발달, 고유 신장의 기능 또는 수용력의 개선 및 고유 신장의 특정 마커의 발현을 포함하고 이로 제한되지 않는 다수의 지표로 특징지어질 수 있다. 하나의 양태에서, 발달되거나 개선된 기능 또는 수용력은 상술된 적혈구 항상성 및 신장 기능의 다양한 지표에 기초하여 관측될 수 있다. 또 다른 양태에서, 재생 신장은 하나 이상의 줄기 세포 마커의 차등 발현으로 특징지어진다. 줄기 세포 마커는 하기 중 하나 이상일 수 있다. SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 (Sox2); 미분환된 배아 세포 전사 인자 (UTF1); 마우스로부터의 결절 동족체 (NODAL); 프로미닌 1 (PROM1) 또는 CD133 (CD133); CD24; 및 이의 임의의 조합. 또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커의 발현은 대조군에 비해 상향조절된다.
농축 세포군 및 이의 혼합물을 포함한 본원에서 기술되는 세포군 및 이를 포함하는 구조물을 사용하여 고유 신장에 대한 재생 효과를 제공할 수 있다. 재생 효과는 세포 자체에 의해 및/또는 세포에 의해 분비되는 생성물에 의해 제공될 수 있다. 재생 효과는 하기 중 하나 이상으로 특징지어진다: (TGF-β 시그널링의 약화를 통해 이루어질 수 있는) 상피-중간엽 이행의 감소; 신장 섬유증의 감소; 신장 염증의 감소; 고유 신장에서 줄기 세포 마커의 차등 발현; 신장 손상, 예를 들어 세뇨관 손상 부위로 이식 세포 및/또는 고유 세포의 이동; 신장 손상, 예를 들어 세뇨관 손상 부위에 이식 세포의 접목; (본원에서 기술되는 바와 같은) 신장 기능에 대한 하나 이상의 지표의 안정화; (본원에서 기술되는 바와 같은) 적혈구 항상성의 회복; 및 이의 임의의 조합.
재생 모니터링 방법
또 다른 양상에서, 본 발명은 피험자에게 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물을 투여 또는 이식한 후 고유 신장의 재생을 모니터링하는 예후 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 피험자 및 대조군 시료로부터 수득된 시험 시료에서 마커 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 이때 시험 시료에서 대조군 시료와 비교하여 높은 수준의 마커 발현은 피험자의 고유 신장의 재생을 예후한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 시료 중 하나 이상의 줄기 세포 마커의 발현을 검출하는 것을 포함한다. 상기 줄기 세포 마커는 Sox2; UTF1; NODAL; CD133; CD24; 및 이의 임의의 조합 중에서 선택될 수 있다. 상기 검출 단계는 줄기 세포 마커(들)의 발현이 시험 시료에서 대조군 시료에 비해 상향조절되거나 높은지를 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 높은 수준의 발현은 피험자의 고유 신장의 재생을 예후한다. 또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커(들)의 mRNA 발현이 검출된다. 다른 양태에서, mRNA 발현의 검출은 PCR-기반 방법, 예를 들어 qRT-PCR을 통할 수 있다. 또한, 제자리 (In situ) 하이브리브리드화도 mRNA 발현의 검출에 이용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커(들)의 폴리펩타이드 발현이 검출된다. 또 다른 양태에서, 폴리펩타이드 발현은 항-줄기 세포 마커 제제를 사용하여 검출된다. 또 다른 양태에서, 상기 제제는 마커에 대한 항체이다. 또 다른 양태에서, 줄기 세포 마커 폴리펩타이드 발현은 면역조직학 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 검출된다.
당업자는 마커의 mRNA 및/또는 폴리펩타이드를 검출하기 위한 다른 방법을 알 수 있을 것이다.
하나의 양태에서, 상기 검출 단계에 앞서 피험자로부터의 시험 시료를 얻는 단계가 선행된다. 또 다른 양태에서, 시험 시료는 신장 조직이다.
하나의 다른 양상에서, 본 발명은 고유 신장의 재생에 대한 대용 마커로서 줄기 세포 마커와 같은 마커의 용도를 제공한다. 이러한 마커는 기능 또는 수용력 (예를 들어 적혈구 항상성 및 신장 기능의 지표)의 발달 또는 개선 여부에 기초하여 독립적으로 사용되거나 재생 평가와 병용하여 사용될 수 있다. 또한, 시간 경과에 따른 재생에 대한 대용 마커의 모니터링도 재생의 예후적 지표로서 이용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 이식 또는 투여 후 환자의 예후를 평가하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 피험자로부터 수득되는 시험 시료에서 마커 발현 수준을 검출하는 단계; (b) 대조군 시료의 마커 발현 수준 (또는 대조군 참조 값)과 비교하여 시험 시료에서 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 마커 발현 수준 측정에 기초하여 환자의 재생 예후를 예측하는 단계를 포함하며, 이때 시험 시료에서 대조군 시료 (또는 대조군 참조 값)와 비교하여 높은 수준의 마커 발현은 피험자에서 재생을 예후한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 이식 또는 투여 후 환자의 예후 평가 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 (a) 환자의 생물학적 시료를 수득하고; (b) 생물학적 시료에서 줄기 세포 마커 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 이때 줄기 세포 마커 발현이 환자에서 고유 신장의 재생을 예후한다. 일부 양태에서, 환자의 생물학적 시료에서 대조군 시료 (또는 대조군 참조 값)과 비교하여 증가된 줄기 세포 마커 발현이 피험자에서 재생을 예후한다. 일부 양태에서, 환자 시료에서 대조군 시료 (또는 대조군 참조 값)과 비교하여 감소된 줄기 세포 마커 발현은 피험자에서 재생을 예후하지 않는다. 상기 환자 시료는 생검을 포함하는 시험 시료일 수 있다. 상기 환자 시료는 체액, 예를 들어 혈액 또는 소변일 수 있다.
하나의 다른 양상에서, 본 발명은 피험자에게 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 투여 또는 이식 후 고유 신장의 재생을 모니터링하는 예후적 방법을 제공하며, 이때 비-침습적 방법이 이용된다. 조직 생검에 대한 대안으로서, 치료를 받는 피험자의 재생 결과는 체액, 예를 들어 소변 검사로 평가될 수 있다. 피험자-유래 소변으로부터 수득되는 미세소포가 궁극적으로는 본 발명의 세포군으로의 처리에 의해 영향을 받은 신장 세포군으로부터 유래되는 특정 단백질 및 miRNA를 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 성분을 포함한다는 것이 밝혀졌다. 이들 성분은 줄기 세포 복제 및 분화, 아폽토시스 및 염증 및 면역-조절에 수반되는 인자들을 포함할 수 있다. 미세소포-관련 miRNA/단백질 발현 패턴의 시간적 (temporal) 분석은 본 발명의 세포군, 혼합물 또는 구조물을 수령하는 피험자의 신장에서의 재생 결과를 연속적으로 모니터링하는 것을 가능하게 한다. 실시예 17은 피험자의 소변 분석을 위한 예시적인 프로토콜을 기술한다.
이들 신장-유래된 소포 및/또는 피험자의 소변으로 나오는 신장 유래된 소포의 내강 내용물을 재생 결과를 나타내는 바이오마커에 대해 분석할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 신장 질환 (KD) 환자가 치료제로의 처리에 반응하는지의 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료제로 처리된 KD 환자로부터 수득되는 시험 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양을 대조군 시료 중의 소포 양과 비교하여 또는 상대적으로 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 시험 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 치료제로의 처리에 대한 처리된 환자 반응성을 나타내는 것이다.
또한, 본 발명은 KD 환자에서 치료제로의 처리 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 치료제로 처리된 KD 환자로부터 수득된 시험 시료 중의 소포의 양을 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 또는 상대적으로 측정 또는 검출하는 단계를 포함하며, 이때 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 시험 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 KD 환자에서 치료제로의 처리 효능을 나타내는 것이다.
또한, 본 발명은 환자 아군에서 신장 질환 (KD)를 치료하기에 효과적인 치료제로서의 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 제제의 효능과, 대조군 시료로부터 수득되는 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 환자 아군으로부터의 시료 중 소포 양의 존재 간의 상관관계를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 환자 아군으로부터의 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 제제가 환자 아군에서 KD를 치료하는데 효과적이라는 것을 나타내는 것이다.
본 발명은 제제가 신장 질환 (KD)를 치료하기에 효과적인 환자 아군을 동정하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 제제의 효능과, 대조군 시료로부터 수득되는 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 환자 아군으로부터의 시료 중 소포 또는 이의 내강 내용물의 양의 존재 간의 상관관계를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 대조군 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 양과 비교하여 환자 아군으로부터의 시료 중의 소포 또는 이의 내강 내용물의 많거나 적은 양은 제제가 환자 아군에서 KD를 치료하는데 효과적이라는 것을 나타내는 것이다.
측정 또는 검출 단계는 시험 시료에 존재할 수 있는 miRNA 또는 다른 분비 생성물의 양을 분석하는 것을 포함할 수 있다 (실시예 17 참조).
비-침습적 예후적 방법은 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 투여 또는 이식 전 및/또는 후 피험자로부터 소변 시료를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 소포 및 다른 분비 생성물은 원치않는 파편을 제거하기 위한 원심분리를 포함하나 이로 제한되지 않는 표준 기술을 이용하여 소변 시료로부터 분리될 수 있다 [참조: Zhou et al., 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al., 미국 공개 특허 출원 번호 20110053157, 각각 전체가 참조로 본원에 삽입됨].
본 발명은 치료 후 피험자에서 재생 결과를 검정하는 비-침습적 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료된 피험자로부터의 소변에서 소포 또는 이의 내강 내용물을 검정하는 것을 포함한다. 상기 내강 내용물은 하나 이상의 miRNA일 수 있다. 각각의 miRNA의 조합 또는 패널의 검출이 이러한 예후적 방법에 적합할 수 있다. 예시적 조합은 하기 중 2개 이상을 포함한다: miR-24; miR-195; miR-871; miR-30b-5p; miR-19b; miR-99a; miR-429; let-7f; miR-200a; miR-324-5p; miR-10a-5p; 및 이의 임의의 조합. 하나의 양태에서, miRNA의 조합은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 이상의 각각의 miRNA를 포함할 수 있다. 당업자는 다른 miRNA 및 miRNA의 조합이 이러한 예후적 방법에 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 추가의 miRNA의 공급원은 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지하는 https://mirbase.org에서의 miRBase를 포함한다.
당업자는 재생을 검정하는 예후적 방법이 본원에서 기술되는 세포군 및 구조물과는 별개로 당해 기술 분야에 공지된 다른 치료제로 치료되는 피험자에게 적합할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
일부 양태에서, 상기 측정 단계는 (i) 시험 시료 및 대조군에서 마커 (또는 소포/소포 내용물)의 차등 발현 수준을 측정하고/하거나; (ii) 시험 시료 및 대조군에서 마커의 차등 발현 수준 측정으로부터 수득된 자료를 분석하기 위해 적합한 프로세서에 의해 실행되는 소프트웨어 프로그램의 이용을 포함한다. 적합한 소프트웨어 및 프로세서는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있고 시판되고 있다. 상기 프로그램은 CD-ROM, 플로피 디스크, 하드 디스크, DVD 또는 프로세서와 연관된 메모리와 같은 실재하는 매질에 저장되는 소프트웨어에 수록될 수 있으나, 당업자는 전체 프로그램 또는 이의 일부가 대안적으로 프로세서 이외의 장치에 의해 실행되고/되거나 널리 알려진 방식으로 펌웨어 및/또는 전용 하드웨어에 수록될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다.
측정 단계 이후, 측정 결과, 발견, 진단, 예측 및/또는 치료 권장사항이 통상적으로 기록되며, 예를 들어 기술자, 의사 및/또는 환자에게 전해진다. 특정 양태에서, 컴퓨터를 이용하여 이러한 정보를 관심자, 예를 들어 환자 및/또는 담당 의사에게 전달할 수 있다. 일부 양태에서, 검정은 결과 또는 진단이 전달되는 나라 또는 관할구와는 다른 나라 또는 관할구에서 수행되거나 검정 결과가 분석될 것이다.
바람직한 양태에서, 차등 마커 발현 수준을 갖는 시험 피험자에서 측정된 마커 발현 수준에 기초하는 예후, 예측 및/또는 치료 권장사항은 검정이 완결되고 예후 및/또는 예측이 나온 후 즉시 피험자에게 전달된다. 결과 및/또는 관련 정보는 피험자의 주치의에 의해 피험자에게 전달될 수 있다. 달리, 결과는 편지, 전자 형태의 교류, 예를 들어 이메일 또는 전화를 포함하는 임의의 통신 수단을 통해 시험 피험자에게 직접적으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 이메일 전달의 경우, 컴퓨터의 사용으로 전달이 수월해질 수 있다. 특정 양태에서, 예후적 시험 결과 및/또는 이로부터의 결론 및/또는 시험에 기초한 치료 권장 사항을 포함하는 정보는 원격통신 기술자에게 익숙할 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 이용하여 만들어지고 피험자에게 자동적으로 전달될 수 있다. 건강관리-지향 통신 시스템에 대한 하나의 예가 문헌 [참조: 미국 특허 번호 6,283,761]에 기재되어 있으나, 본 발명은 이러한 특정 통신 시스템을 이용하는 방법에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법의 특정 양태에서, 시료 검정, 재생 예후 및/또는 예측 및 검정 결과 또는 예후의 전달을 포함하는 상기 방법의 단계 모두 또는 일부는 다양한 (예를 들어, 해외) 관할권에서 수행될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본원에서 기술되는 예후적 방법은 이식 또는 투여의 재생 성공에 대해 관심이 있는 자에게 정보를 제공한다.
모든 양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 치료가 필요한 피험자에게 재생 신장을 제공하는 방법은 상술되는 바와 같이 재생의 예후적 평가에 대한 이식후 단계를 포함할 수 있다.
투여 방법 및 경로
본 발명의 세포 제제 및/또는 구조물은 단독으로 또는 다른 생물활성 성분과 병용하여 투여될 수 있다.
본원에서 기술되는 신장 세포군 또는 신장 세포군 혼합물의 치료 유효량은 피험자에 의해 안전하게 수용되는 세포의 최대 수부터, 예를 들어 안정화, 감퇴율의 감소, 또는 하나 이상의 신장 기능의 개선과 같은 신장 질환의 치료에 필수적인 세포의 최소 수의 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법은 본원에서 기술되는 신장 세포군 또는 신장 세포군의 혼합물을 약 10,000개 세포/kg, 약 20,000개 세포/kg, 약 30,000개 세포/kg, 약 40,000개 세포/kg, 약 50,000개 세포/kg, 약 100,000개 세포/kg, 약 200,000개 세포/kg, 약 300,000개 세포/kg, 약 400,000개 세포/kg, 약 500,000개 세포/kg, 약 600,000개 세포/kg, 약 700,000개 세포/kg, 약 800,000개 세포/kg, 약 900,000개 세포/kg, 약 1.1×106개 세포/kg, 약 1.2×106개 세포/kg, 약 1.3×106개 세포/kg, 약 1.4×106개 세포/kg, 약 1.5×106개 세포/kg, 약 1.6×106개 세포/kg, 약 1.7×106개 세포/kg, 약 1.8×106개 세포/kg, 약 1.9×106개 세포/kg, 약 2.0×106개 세포/kg, 약 2.1×106개 세포/kg, 약 2.2×106개 세포/kg, 약 2.3×106개 세포/kg, 약 2.4×106개 세포/kg, 약 2.5×106개 세포/kg, 약 2.6×106개 세포/kg, 약 2.7×106개 세포/kg, 약 2.8×106개 세포/kg, 약 2.9×106개 세포/kg, 약 3×106개 세포/kg, 약 3.1×106개 세포/kg, 약 3.2×106개 세포/kg, 약 3.3×106개 세포/kg, 약 3.4×106개 세포/kg, 약 3.5×106개 세포/kg, 약 3.6×106개 세포/kg, 약 3.7×106개 세포/kg, 약 3.8×106개 세포/kg, 약 3.9×106개 세포/kg, 약 4×106개 세포/kg, 약 4.1×106개 세포/kg, 약 4.2×106개 세포/kg, 약 4.3×106개 세포/kg, 약 4.4×106개 세포/kg, 약 4.5×106개 세포/kg, 약 4.6×106개 세포/kg, 약 4.7×106개 세포/kg, 약 4.8×106개 세포/kg, 약 4.9×106개 세포/kg 또는 약 5×106개 세포/kg의 투여량으로 투여하는 것을 제공한다. 또 다른 양태에서, 피험자에게 투여되는 세포의 투여량은 단일 투여량 또는 단일 투여량에 추가 투여량을 더한 것이 될 수 있다. 다른 양태에서, 투여량은 본원에서 기술되는 구조물에 의해 제공될 수 있다. 다른 양태에서, 피험자에게 투여되는 세포의 투여량은 평가되는 신장 매쓰 또는 기능성 신장 매쓰에 기초하여 계산될 수 있다.
본원에서 기술되는 신장 세포군 또는 이의 혼합물의 치료학적 유효량은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제에 현탁될 수 있다. 이와 같은 담체는 기초 배양 배지 + 1% 혈청 알부민, 식염수, 완충된 식염수, 덱스트로즈, 물, 콜라겐, 알기네이트, 히알루론산, 피브린 글루, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 카복시메틸셀룰로오즈 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 제형은 투여 방식에 맞아야 한다. 따라서, 본 발명은 피험자에서 신장 질환 치료를 위한 약물 제조용의, 예를 들어 B2 세포군 단독 또는 B3 및/또는 B4 또는 B4' 세포군과의 혼합물과 같은 신장 세포군 또는 이의 혼합물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 약물은 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어 성장 인자, 케모킨 또는 사이토킨을 추가로 포함한다. 추가 양태에서, 상기 약물은 인간 신장-유래 세포군을 포함한다. 약물 제조에 사용되는 세포는 본원에서 기술되는 방법에 의해 제공되는 임의의 변형을 이용하여 분리되거나, 유도되거나 또는 농축될 수 있다.
신장 세포 제제(들) 또는 이의 혼합물 또는 조성물은 통상적 절차에 따라 인간에 투여하는데 적합한 약제학적 조성물로 제형화된다. 전형적으로, 정맥 투여, 동맥내 투여 또는 신장 캡슐내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 주사 부위에서 임의의 통증을 개선하기 위하여 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 별도로 공급되거나 또는, 예를 들어 활성 물질의 양을 표시하는 앰플과 같은 밀봉된 용기에 저온보관된 농축물로서 단일 투여형으로 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 식염수을 포함하는 주입액 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여될 때, 주입용 멸균수 또는 식염수의 앰플은 투여전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물 및 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 약제학적 조성물에 적합한 광범위한 다양한 제형이 있다 [참조: Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, formerly Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, 2003, 전체가 본원에 참조로 삽입됨]. 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균된 실질적으로 등장성인 조성물로 제형화되며, 미국식품의약국의 의약품 제조 품질 관리 기준 (GMP) 규정에 완전히 따른다.
본 발명의 하나의 양상은 본 발명의 신장 세포 제제, 예를 들어 B2 세포 제제 단독 또는 B3 및/또는 B4 또는 B4' 세포 제제와 병용된 B2 세포 제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 제형은 104 내지 109개의 포유동물 신장-유래 세포를 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 혼합물을 포함한 하나 이상의 세포군을 이를 필요로 하는 피험자에게 제공하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 세포군의 공급원은 자가, 동종이계 또는 동계 (자가유전자형 또는 동종유전자형) 공급원 및 이의 임의의 조합이 될 수 있다. 자가 공급원이 아닌 경우, 상기 방법은 면역억제제의 투여를 포함할 수 있다. 적합한 면역억제 약물은 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 미조르빈, 사이클로스포린, 타크롤리무스 하이드레이트, 클로람부실, 로벤자리트 이나트륨, 아우라노핀, 알프로스타딜, 구스페리무스 하이드로클로라이드, 바이오신소르브, 무로모나브, 알레파셉트, 펜토스타틴, 다클리주마브, 시롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 레플로노미드, 바실릭시마브, 도르나제 α, 빈다리드, 클라드리빈, 피메크롤리무스, 일로데카킨, 세델리주마브, 에팔리주마브, 에베롤리무스, 아니스페리무스, 가빌리모마브, 파랄리모마브, 클로파라빈, 라파마이신, 시플리주마브, 사이레이토, LDP-03, CD4, SR-43551, SK&F-106615, IDEC-114, IDEC-131, FTY-720, TSK-204, LF-080299, A-86281, A-802715, GVH-313, HMR-1279, ZD-7349, IPL-423323, CBP-1011, MT-1345, CNI-1493, CBP-2011, J-695, LJP-920, L-732531, ABX-RB2, AP-1903, IDPS, BMS-205820, BMS-224818, CTLA4-1g, ER-49890, ER-38925, ISAtx-247, RDP-58, PNU-156804, LJP-1082, TMC-95A, TV-4710, PTR-262-MG 및 AGI-1096 [참조: 미국 특허 번호 7,563,822]을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당업자는 다른 적합한 면역억제 약물을 인식할 것이다.
본 발명의 치료 방법은 분리된 신장 세포군 또는 이의 혼합물을 피험자로 전달하는 것을 포함한다. 하나의 양태에서, 의도된 부위로 세포를 직접 투여하는 것이 바람직하다. 하나의 양태에서, 본 발명의 세포 제제 또는 이의 혼합물은 전달 비히클로 개체에게 전달된다.
상기 피험자는 고유 신장을 하나 이상의 농축 신장 세포군 및/또는 이를 포함하는 혼합물 또는 구조물로부터 분비되는 생성물과 생체내에서 접촉시킴으로써 치료될 수 있다. 고유 신장을 분비 생성물과 생체내 접촉시키는 단계는 세포 배양 배지, 예를 들어 적응용 배지로부터의 일군의 분비 생성물의 사용/투여를 통해 또는 생체내에서 생성물을 분비할 수 있는 농축된 세포군 및 혼합물 또는 구조물의 이식에 의해 달성될 수 있다. 생체내 접촉 단계는 고유 신장에 대해 재생 효과를 제공한다.
피험자에게 세포 및/또는 분비 생성물을 투여하는 다양한 수단은 이러한 설명을 고려할 때 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 방법은 피험자의 표적 부위에 세포를 주사하는 것을 포함한다. 세포 및/또는 분비 생성물은 피험자에게 주입 또는 이식에 의한 도입을 가능하게 하는 전달 장치 또는 비히클로 삽입된다. 특정 양태에서, 전달 비히클은 천연 물질을 포함할 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 전달 비히클은 합성 물질을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 전달 비히클은 기관의 구조와 유사한 또는 적절하게 맞는 구조를 제공한다. 다른 양태에서, 전달 비히클은 사실상 유체와 유사하다. 이와 같은 전달 장치는 수용 피험자의 체내로 세포 및 유체를 주입하기 위한 튜브, 예를 들어 카테터를 포함한다. 바람직한 양태에서, 튜브는 추가로 바늘, 예를 들어 주사기를 가지며, 주사기를 통해 피험자의 원하는 위치에 본 발명의 세포가 도입된다. 일부 양태에서, 포유동물 신장-유래 세포군은 카테터를 통하여 혈관으로 투여되도록 제형화된다 (용어 "카테터"는 혈관으로 물질을 전달하기 위한 임의의 다양한 튜브형 시스템을 포함하고자 한다). 대안으로, 세포는 피륙, 니트, 메쉬, 부직포와 같은 직물, 및 비-편직, 천공된 필름, 스폰지 및 포움, 고체 또는 다공성 비드, 미소입자, 나노입자 등 (예를 들어, 쿨티스터-S (Cultispher-S) 젤라틴 비드 - 시그마(Sigma))을 포함하나 이에 한정되지 않는 생체물질 또는 스캐폴드 내에 또는 상에 삽입될 수 있다. 상기 세포는 다양한 상이한 형태로 전달되도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포를 용액 또는 겔에 현탁시킬 수 있다. 세포를 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합할 수 있으며, 이때 세포는 여전히 살아있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 식염수, 완충 수용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이와 같은 담체 및 희석제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 용액은 바람직하게는 멸균되고, 유체이며, 종종 등장액이 될 수 있다. 바람직하게는, 용액은 제조 및 보관 조건하에 안정하며, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로잘 등의 사용을 통하여 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염으로부터 보호된다. 당업자는 본 발명의 세포군 및 이의 혼합물의 전달에 사용되는 전달 비히클이 상기-언급된 특징들의 조합을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
분리된 신장 세포군(들), 예를 들어 B2 세포군 단독 또는 B4' 및/또는 B3와 혼합된 세포군의 투여 방식은 전신, 신장내 (예를 들어, 실질), 정맥 또는 동맥내 주사, 및 의도된 활성 부위의 조직으로의 직접 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 추가의 투여 방식은 직접적인 개복을 통하여, 직접적인 복강경을 통하여, 복막을 통하여 또는 피하를 통하여 단일 또는 다중 주사(들)을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 추가의 투여 방식은, 예를 들어 역행 (retrograde) 및 요관신우 주입 (ureteropelvic infusion)을 포함한다. 외과적 투여 수단은 부분적인 신적출 및 구조물 이식, 부분적인 신적출, 부분적인 신우개구 (pyelectomy), 장막 ± 복막과의 혈관화, 다초점 생검 니들 트랙, 콘 또는 피라미드형 내지 실린더 및 신장 막대형 교체를 포함하나 이에 한정되지 않는 일-단계 시술뿐만 아니라, 예를 들어 재이식을 위한 기관양-내부 생물반응기를 포함한 2-단계 시술도 포함한다. 하나의 양태에서, 세포 혼합물은 동일한 시간에 동일한 경로를 통하여 전달된다. 또 다른 양태에서, 조절된 혼합물을 포함하는 각 세포 조성물은 특정 위치로 별도로 전달되거나 특정 방법을 통하여 동시에 또는 시간-조절 (temporally-controlled) 방식으로 본원에서 기술되는 하나 이상의 방법에 의해 전달된다.
인간에서 적합한 세포 이식 용량은 세포의 활성, 예를 들어 EPO 생성과 관련된 기존 정보로부터 결정되거나 전임상 조사에서 수행된 투여량 조사로부터 외삽될 수 있다. 세포의 양은 시험관내 배양 및 생체내 동물 실험으로부터 정량되고 이식 물질의 적합한 용량을 계산하는데 이용될 수 있다. 또한, 상기 환자는 추가의 이식이 수행될 수 있는지 또는 이에 맞게 이식 물질이 감소되어야 하는지를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다.
당업계에 공지된 하나 이상의 유형의 콜라겐 또는 히알루론산과 같은 선택된 세포외 매트릭스 성분, 및/또는 성장 인자, 혈소판-농축 혈장 및 약물을 포함한 하나 이상의 다른 성분이 본 발명의 세포군 및 이의 혼합물에 첨가될 수 있다.
당업자는 본원에 기술되는 분비 생성물에 적합한 다양한 제형 및 투여 방법을 알 수 있을 것이다.
키트
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리머 매트릭스 및 스캐폴드 및 관련 물질, 및/또는 세포 배양 배지 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 포함한다. 사용 설명서는, 예를 들어 세포 배양을 위한 설명 또는 세포 및/또는 세포 생성물의 투여를 위한 설명을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 스캐폴드 및 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 키트는 마커 발현의 검출을 위한 제제, 이러한 제제의 사용을 위한 시약 및 사용 설명서를 포함한다. 상기 키트는 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 이식 또는 투여 후 피험자에서 고유 신장의 재생 예후를 측정하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 키트는 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 생체치료 효능을 측정하는데 사용될 수 있다.
리포트
본 발명의 방법은, 상업 목적으로 실시되는 경우, 일반적으로 재생 예후에 대한 리포트 또는 개괄을 제공한다. 본 발명의 방법은 본원에서 기술되는 세포군, 혼합물 또는 구조물의 임의의 투여 또는 이식 전후 재생에 대한 예상되는 전개 또는 결과의 예측을 포함하는 리포트를 제공할 것이다. 상기 리포트는 예후에 관계가 있는 임의의 지표에 대한 정보를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 방법 및 리포트는 또한 데이터베이스에 리포트를 저장하는 것을 포함한다. 달리, 상기 방법은 피험자에 대한 데이터베이스에 기록을 만들고 데이터와 함께 기록을 덧붙인다. 하나의 양태에서 리포트는 페이퍼 리포트이고, 다른 양태에서 리포트는 청각 리포트이며, 또 다른 양태에서 리포트는 전자 기록이다. 리포트는 의사 및/또는 환자에게 제공되는 것으로 의도된다. 리포트의 수신은 데이터 및 리포트를 포함하는 서버 컴퓨터에 네트워크 연결을 설정하고 서버 컴퓨터로부터 데이터 및 리포트를 요청하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 전체 또는 부분적으로 자동화될 수 있다.
본원에 인용되는 모든 특허, 특허원 및 문헌 참조는 전체가 참조로 본원에 삽입된다.
하기 실시예는 단지 설명 목적으로 제공되는 것으로서, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1 - 생물반응 신장 세포의 분리 & 특성화
빈혈증과 함께 특발적 진행성 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 수컷 돼지 성체 (Sus scrofa)가, 연령이 대등한 정상 돼지 신장 조직과 직접 비교하여 세포 성분을 평가하고 특징을 분석하기 위한 미가공의 (fresh) 병든 신장 조직을 제공하였다. 수거시의 신장 조직에 대한 조직학적 조사 결과, 신장 조직은 다병소 섬유증과 함께 중증의 광범위 만성 간질 섬유증 및 반월상 사구체신염으로 특징지어졌다. 임상 화학은 질소혈증 (혈중 우레아 질소 및 혈청 크레아티닌의 증가) 및 약한 빈혈증 (약간의 헤마토크릿 감소 및 떨어진 헤모글로빈 수준)을 확인시켜 주었다. 세포를 분리하고, 증대시키고, 병든 신장 조직 및 정상 신장 조직 모두로부터 특성화되었다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전부 참조로 본원에 삽입됨]의 도 1에 도시되는 바와 같이, 고모리 (Gomori) 트리크롬 염색은 정상 신장 조직과 비교하여 병든 신장 조직에서 섬유증 (화살표로 나타내는 청색 염색)을 강조한다. 쿠불린:메갈린을 발현하고 수용체-매개된 알부민 수송을 할 수 있는 기능성 세뇨관 세포가 정상 및 병든 신장 조직 모두로부터 증식되었다. 또한, 에리트로포이에틴 (EPO)-발현 세포가 배양물 중에 존재하고, 다수의 계대 및 동결/해동 사이클을 통해 유지되었다. 또한, 분자 분석은 정상 및 병든 조직 모두로부터의 EPO-발현 세포가, EPO 및 vEGF를 포함한 다른 저산소-조절되는 유전자 표적물의 HIF1α-유도된 유도와 함께, 시험관내에서 저산소 상태에 반응한다는 것을 확인시켜 주었다. 세포는 콜라게나제 + 디스파제를 사용한 효소적 분해를 통해 돼지 신장 조직으로부터 분리되었으며, 또한 단순 기계적 분해 및 체외이식 실험을 수행함으로써 별도의 실험에서 분리되었다. 계대 2에서, epo-발현 세포를 포함하는 체외이식-유래된 세포 배양물을 대기 (21%) 및 가변 저산소 (< 5%) 배양 조건 모두에서 배양함으로써 저산소 노출이 EPO 유전자 발현을 상향조절하는가를 측정하였다. 설치류 배양물로 주목되는 바와 같이 (실시예 3 참조), 정상 돼지는 산소-의존적 발현 및 EPO 유전자 조절을 보였다. 놀랍게도, 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전부 참조로 본원에 삽입됨]의 도 2에 도시되는 바와 같이, CKD 돼지의 요독/빈혈 상태에도 불구하고 (헤마토크릿 < 34, 크레아티닌 > 9.0), EPO 발현 세포는 조직으로부터 용이하게 분리 및 증식되었으며, EPO 유전자의 발현이 여전히 저산소 상태로 조절되었다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전부 참조로 본원에 삽입됨]의 도 3에 도시되는 바와 같이, 증식된 배양물 중의 세포는 세뇨관-유사 구조물로의 자가-형성 능력을 나타내었다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전부 참조로 본원에 삽입됨]의 도 4에 도시되는 바와 같이, 배양물 (계대 3) 중 기능성 세뇨관 세포의 존재가 배양된 세포에 의한 FITC-컨주게이션된 알부민의 수용체-매개된 흡수를 관측함으로써 확인되었다. 녹색 도트 (가는 백색 화살표로 표시됨)는 세뇨관 세포-특이적 수용체인 메갈린 및 쿠빌린에 의해 매개되는 세포내이입된 플루오레세인-컨주게이션된 알부민을 나타내며, 이는 기능성 세뇨관 세포에 의한 단백질 재흡수를 나타낸다. 청색 염색 (굵은 백색 화살표로 표시됨)은 훽스트 (Hoescht)-염색된 핵이다. 종합하면, 이들 데이터는 기능성 세뇨관 및 내분비 세포가 돼지 신장 조직으로부터, 심지어 CKD로 심각하게 손상된 신장 조직에서도 분리되고 증식될 수 있다는 것을 제시한다. 또한, 이들 발견은 CKD를 치료하기 위한 자가 세포-기반 치료 생성물의 진전을 지지한다.
또한, EPO-생성 세포가 (실시예 1에서 기술되는 바와 같이) 정상 성인 인간 신장으로부터 효소적으로 분리되었다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 참조로 본원에 삽입됨]의 도 5에 도시되는 바와 같이, 분리 절차는 초기 조직에서보다 분리 후 더욱 많은 상대적 EPO 발현을 초래하였다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 참조로 본원에 삽입됨]의 도 6에 도시되는 바와 같이, 인간 EPO 생성 세포를 EPO 유전자 발현 보유와 함께 배양물에 유지시킬 수 있다. 인간 세포를 단순한 조직-배양 처리된 플라스틱 또는 예를 들어 피브로넥틴 또는 콜라겔과 같은 일부 세포외 매트릭스로 코팅된 플라스틱 상에서 배양/증식시켰으며, 모두가 시간 경과에 따른 EPO 발현을 지지하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2 - 특정 생물반응성 신장 세포의 분리 & 농축
신장 세포 분리 : 간단히, 10개의 2주령 수컷 루이스 (Lewis) 래트 신장의 배치를 시판자 (Hilltop Lab Animals Inc.)로부터 구입하고, 약 4℃의 비아스판 (Viaspan) 보존 배지에서 밤새 운반하였다. 본원에서 기술되는 모든 단계를 멸균 유지를 위해 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)에서 수행하였다. 신장을 행크 (Hank) 균형 염 용액 (HBSS)에 3회 세척하여 비아스판 보전 배지를 세척하였다. 3회 세척한 후, 잔류 신장 캡슐 및 모든 잔류 간질 조직을 제거하였다. 또한, 대신배를 마이크로 박리 기술을 이용하여 제거하였다. 이어서, 신장을 멸균 메스를 사용하여 슬러리로 세분하였다. 이어서, 슬러리를 50 ml 원추형 원심분리 튜브에 옮기고 무게를 재었다. 소규모의 시료를 RNA를 위해 수집하고, RNAse-비함유 멸균 1.5 ml 마이크로-원심분리 튜브에 놓고, 액체 질소에서 빠르게 냉동시켰다. 냉동시킨 후 분석할 때까지 -80℃ 냉동기로 옮겼다. 10개의 어린 (juvenile) 신장의 조직 중량은 약 1 g이었다. 배치의 중량에 기초하여, 분해 배지를 조직 1 g 당 분해 배지 20 ml가 되도록 조절하였다. 이러한 절차를 위한 분해 완충액은 HBSS 중의 4 단위의 디스파제 1 (Stem Cell Tech), 300 단위/ml의 콜라게나제 타입 IV (Worthington) 및 5 mM CaCl2 (Sigma)를 포함하였다.
적합한 용적의 미리-가온된 분해 완충액을 튜브에 가한 후, 밀폐시키고, 20분 동안 37℃의 록커에 놓았다. 이러한 첫 번째 분해 단계는 적혈구 세포를 제거하고, 잔류 조직의 분해를 증진시킨다. 20분 후, 튜브를 꺼내어 BSC에 놓았다. 조직을 튜브의 바닥에 가라앉히고, 상등액을 제거하였다. 이어서, 잔류 조직을 출발 용적과 같은 새로운 분해 완충액으로 보충하였다. 튜브를 다시 추가의 30분 동안 37℃의 록커 상에 놓았다.
30분 후, 분해 혼합물을 70 μm 세포 여과기 (BD Falcon)를 통해 동일 용적의 중화 완충액 (DMEM w/10% FBS)으로 피펫팅하여 분해 반응을 정지시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세척하였다. 원심분리 후, 펠렛을 20 ml KSFM 배지에 재현탁시키고, 트리판 블루 배제를 이용한 세포 계수 및 생존력 평가를 위한 시료를 수득하였다. 세포 계수 후, 1 x 106개의 세포를 RNA를 위해 수집하고, PBS로 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다. 나머지 세포 현탁액을 KSFM 배지로 50 ml이 되게 한 후, 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 재차 세척하였다. 세척 후, 세포 펠렛을 KSFM ml 당 1.5 x 107개 세포의 농도로 재현탁시켰다.
이어서, 5 ml의 신장 세포 현탁액을 15 ml 원추형 원심분리 튜브 (BD Falcon)에서 5 ml의 30% (w/v) Optiprep®에 가하고, 6번 역위시켜 혼합하였다. 이로써 15% (w/v) Optiprep®의 최종 혼합물을 형성하였다. 역위 후, 튜브를 1 mL PBS로 조심스럽게 층지게 하였다. 튜브를 브레이크 없이 15분 동안 800 xg에서 원심분리시켰다. 원심분리 후, 튜브를 꺼내고, 혼합 구배물의 상단에 세포 밴드를 형성하였다. 여기에는 또한 적혈구, 죽은 세포, 및 얼마간의 소과립 세포, 얼마간의 epo-생성 세포, 얼마간의 세뇨관 세포 및 얼마간의 내피 세포를 포함하는 소수의 생존 세포군을 포함하는 펠렛이 존재하였다. 밴드를 피펫을 사용하여 조심스럽게 꺼내어 또 다른 15 ml 원추형 튜브로 옮겼다. 구배 매질을 흡인시켜 제거하고, 펠렛을 1 ml KSFM에 재현탁시켰다. 이어서, 밴드 세포 및 펠렛 세포를 다시 합하고, KSFM을 사용하여 수집된 밴드 용적의 적어도 3배 희석물에 재현탁시킨 후, 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세척하였다. 세척 후, 세포를 20 ml의 KSFM에 재현탁시키고, 세포 계수를 위한 시료를 수집하였다. 트리판 블루 배제로 세포를 계수한 후, 1 x 106개의 세포를 RNA 시료를 위해 수집하고, PBS로 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다.
밀도 구배 분리를 이용한 특정한 생물활성 신장 세포의 생존력 및 배양 성능을 증진시키기 위한 전-배양물 ( pre - culture ) '정화 ( clean - up )' : 배양을 위한 순수한 생존 세포군을 수득하기 위해서, 먼저 세포 현탁액을 "신장 세포 분리"에서 상술된 바와 같이 생성하였다. 임의 단계로서 또한 초기 제제를 정화하기 위한 수단으로서, 멸균 등장 완충액에 현탁된 총 1 x 108개 이하의 세포를, 스톡 60% 요오딕산올로부터 실온에서 제조된 동일 용적의 30% Optiprep®과 1:1로 철저히 혼합하고 (이로써 최종 15% Optiprep®를 수득함), 6번 역위시켜 철저히 혼합하였다. 혼합 후, 1 ml PBS 완충액을 혼합된 세포 현탁액 상단에 조심스럽게 층지게 하였다. 이어서, 구배 튜브를 원심분리기에 조심스럽게 로딩하여 적절히 균형을 맞추었다. 구배 튜브를 브레이크 없이 25℃에서 15분 동안 800 xg에서 원심분리하였다. 정화된 세포군 (생존 및 기능성 집합관, 세뇨관, 내분비, 사구체 및 혈관 세포를 포함)은 6%와 8% (w/v) Optiprep® 사이에 분할되며, 이는 1.025 내지 1.045 g/mL의 밀도에 상응한다. 다른 세포 및 파편은 튜브의 바닥에 펠렛화되었다.
신장 세포 배양 : 이어서, 합한 세포 밴드 및 펠렛을 항생제/항진균제와 함께 5% (v/v) FBS, 2.5 μg EGF, 25 mg BPE, 1X ITS (인슐린/트랜스페린/나트륨 셀레나이트 배지 보충물)를 포함하는 DMEM (높은 글루코즈)/KSFM의 50:50 혼합물 150 ml에서 30,000개 세포/cm2의 세포 농도로 조직 배양 처리된 삼중 플라스크 (Nunc T500) 또는 등가물에 플레이팅하였다. 세포를 세포에 대해 21% 대기 산소 수준을 제공하면서 2 내지 3일 동안 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 2일 후, 배지를 교환하고, 배양물을 24시간 동안 CO2/질소 가스 멀티가스 가습 인큐베이터 (Sanyo)에 의해 제공되는 2% 산소-수준 환경에 놓았다. 24시간 인큐베이션한 후, 세포를 1X PBS 60 ml로 세척한 후, 0.25% (w/v) 트립신/EDTA (Gibco) 40 ml를 사용하여 떼어내었다. 떼어낸 후, 세포 현탁액을 10% FBS를 포함하는 동일 용적의 KSFM으로 중화시켰다. 이어서, 세포를 10분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세척하였다. 세척 후, 세포를 KSFM 20 ml에 재현탁시키고, 50 ml 원추형 튜브로 옮긴 후, 세포 계수를 위해 시료를 수집하였다. 트리판 블루 배제로 생존 세포를 계수한 후, RNA 시료를 위해 1 x 106개 세포를 수집하고, PBS로 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다. 세포를 PBS로 다시 세척하고, 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 수집하였다. 세척된 세포 펠렛을 3.75 x 107개 세포/ml의 농도로 KSFM에 재현탁시켰다.
밀도 단계 구배 분리를 이용한 특정한 생물활성 신장 세포의 농축 : 주로 신장 세뇨관 세포로 구성되나 소수 아군의 다른 세포 유형 (집합관, 사구체, 혈관 및 내분비 세포)을 포함하는 배양된 신장 세포를 다중 농도 (w/v)의 요오딕산올 (Optiprep)로 제조된 밀도 단계 구배를 이용하여 이들의 성분 아군으로 분리하였다. 배양물을 수거하고 구배물에 적용하기 최대 24시간 전 동안 저산소 환경에 놓았다. 4개의 상이한 밀도 매질을 멸균된 15 mL 원추형 튜브에서 각각의 상단에 층을 이루게 하되, 바닥에는 가장 밀도가 높은 용액을 놓고 상단에는 가장 밀도가 낮은 용액이 층을 이루게 함으로써 단계적 구배물을 제조하였다. 세포를 단계 구배물의 상단에 적용하고, 원심분리시켜, 세포군을 크기 및 입도에 기초하여 다수의 밴드로 분리시켰다.
간단히, 희석제로서 KFSM 배지를 사용하면서 7, 11, 13 및 16% Optiprep® (60% w/v 요오딕산올) 밀도를 만들었다. 예를 들어, 7%(w/v) Optiprep® 50 ml에 대해 스톡 60% (w/v) 요오딕산올 5.83 ml를 KSFM 배지 44.17 ml에 가하고, 역위시켜 잘 혼합하였다. 멸균 모세관에 연결된 멸균 L/S 16 타이곤 (Tygon) 튜빙이 로딩된 연동 펌프 (Master Flex L/S)를 2 ml/min의 유속으로 설정하고, 2 ml의 4개의 용액 각각을 멸균 원추형 15 mL 튜브로 로딩하되, 16% 용액을 사용하여 개시한 후, 13% 용액, 11% 용액 및 7% 용액으로 이어졌다. 마지막으로, 7.5 x 107개 배양된 설치류 신장 세포를 포함하는 세포 현탁액 2 mL를 단계 구배물의 상단에 로딩하였다 (현탁액은 '신장 세포 배양'에서 상술된 바와 같이 생성하였다). 중요한 것으로서, 펌프가 구배 용액을 튜브로 전달하는 것을 개시할 때, 적절한 계면이 각각의 구배층 간에 형성되도록 유체를 45°각도에서 튜브의 측면 아래로 서서히 유동시키는 주의가 필요하다. 이어서, 세포가 로딩된 단계 구배물을 브레이크 없이 20분 동안 800 xG에서 원심분리시켰다. 원심분리 후, 각각의 계면이 방해되지 않도록 튜브를 조심스럽게 이동시켰다. 5개의 상이한 세포 분획물이 생겼다 (4개의 밴드 및 펠렛) (B1-B4 + 펠렛) (참조: 도 1A, 좌측 원추형 튜브). 각각의 분획물을 멸균된 1회용 망울 (bulb) 피펫 또는 5 ml 피펫을 사용하여 수집하고, 표현형 및 기능을 특징지었다 (문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 참조로 본원에 삽입됨]의 실시예 10 참조). 설치류 신장 세포 현탁액을 분리한 직후 단계-구배 분획화시키는 경우, 분획물은 1.062 내지 1.088 g/mL의 밀도로 세뇨관 세포 (및 집합관으로부터의 일부 세포를 포함) 절편을 농축시켰다. 이와는 대조적으로, 밀도 구배 분리를 생체외 배양한 후 수행하는 경우, 분획물은 1.051 내지 1.062 g/mL의 밀도로 세뇨관 세포 (및 집합관으로부터의 일부 세포를 포함) 절편을 농축시켰다. 유사하게, 설치류 신장 세포 현탁액을 분리한 직후 단계-구배 분획화하는 경우, 분획물은 1.025 내지 1.035 g/mL의 밀도에서 epo-생성 세포, 사구체 족세포 및 혈관 세포 ("B4") 분리물을 농축시켰다. 이와는 대조적으로, 밀도 구배 분리를 생체외 배양 후 수행하는 경우, 분획물은 1.073 내지 1.091 g/mL의 밀도에서 epo-생성 세포, 사구체 족세포 및 혈관 세포 ("B4") 분리물을 농축시켰다. 중요한 것으로서, 세포의 "B2" 및 "B4" 분획물로의 배양후 (post-culture) 분포는 배양물을 저산소 배양 환경 (저산소는 수거 및 단계-구배 절차 전 21% (대기) 미만의 산소 수준으로 정의됨)에 (약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안) 노출시킴으로써 증진되었다 (밴드 분포에 대한 저산소-효과에 관한 추가의 상세한 사항은 실시예 3에 제공된다).
각각의 밴드를 3배 용적의 KSFM으로 희석시켜 제척하고, 잘 혼합한 후, 300 xg에서 5분 동안 원심분리시켰다. 펠렛을 KSFM 2 ml에 재현탁시키고, 생존 세포를 트리판 블루 배제 및 혈구계를 사용하여 계수하였다. RNA 시료를 위해 1 x 106개 세포를 수집하고, PBS에 세척한 후, 액체 질소에 급속 냉동시켰다. B2 및 B4로부터의 세포를, 챨스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories)에서 2-단계 5/6 신장 절제 시술을 통해 만들어진 요독 및 빈혈 암컷 래트로의 이식 조사에 사용하였다. 에리트로포이에틴 및 vEGF의 산소-조절된 발현, 사구체 마커 (네프린, 포도신)의 발현 및 혈관 마커 (PECAM)의 발현을 포함한 B4의 특징을 정량적 실시간 PCR로 확인하였다. 'B2' 분획물의 표현형을 E-카드헤린, N-카드헤린 및 아쿠아포린-2의 발현을 통해 확인하였다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328]의 도 49a 및 49b를 참조한다.
따라서, 단계 구배 방법이 이용은 희박한 epo-생성 세포군 (B4)의 농축뿐만 아니라 상대적으로 농축된 기능성 세뇨관 세포 분획물 (B2)을 생성하는 수단을 제공한다 (문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 참조로 본원에 삽입됨]의 도 50 & 51 참조). 또한, 단계 구배 방법은 EPO-생성 및 세뇨관 세포를 적혈구, 세포 파편 및 다른 잠재적으로 바람직하지 못한 세포 유형, 예를 들어 큰 세포 응집체 및 특정 유형의 면역 세포로부터 분리시킨다.
단계 구배 절차는 세포 성분의 우수한 분리를 제공하기 위해 이용되는 특정 밀도와 관련하여 조정이 필요할 수 있다. 구배를 조정하는 바람직한 접근은 1) 구배물의 바닥에서는 최고 밀도 (예를 들어, 16 내지 21% Optiprep)이고 구배물의 상단에서는 상대적으로 저밀도 (예를 들어, 5 내지 10% Optiprep)인 연속 밀도 구배를 수행하는 것을 포함한다. 표준 방법에 따라 (Axis Shield) 임의의 표준 밀도 구배 용액 (피콜, 퍼콜, 슈크로즈, 요오딕산올)을 사용하는 연속 구배물이 제조될 수 있다. 관심 세포를 연속 구배물에 로딩하고, 브레이크 없이 20분 동안 800 xg에서 원심분리한다. 유사한 크기 및 입도의 세포가 구배물에서 함께 분리되는 경향이 있으므로, 구배물에서의 상대적 위치가 측정될 수 있고 또한 그 위치의 용액의 비중이 측정될 수 있다. 따라서, 그 후에 특정 조건 하에서 밀도 구배물을 가로지르는 능력에 기초하여 특정 세포군을 분리하는 것에 초점을 맞춘 규정된 단계 구배가 유도될 수 있다. 이러한 최적화는 건강한 조직과 대비하여 비건강 조직으로부터 세포를 분리하는 경우 또는 상이한 종으로부터 특정 세포를 분리하는 경우에 이용하기 위해 필요할 수 있다. 예를 들어, 최적화는 래트에서 확인된 특정 B2 및 B4 아군이 다른 종으로부터 분리가능하다는 것을 확실히 하기 위해 개 및 인간 신장 세포 배양물 모두에 대해 수행되었다. 설치류 B2 및 B4 아군의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 11%, 13% 및 16% Optiprep (w/v)으로 이루어진다. 개 B2 및 B4 아군의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 10%, 11% 및 16% Optiprep (w/v)으로 이루어진다. 인간 B2 및 B4 아군의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 9%, 11%, 16% (w/v)로 이루어진다. 따라서, 배양된 설치류, 개 및 인간 신장 세포로부터의 B2 및 B4의 국소화 밀도 범위가 표 2.1에 제공된다.
<표 2.1>
종 밀도 범위
Figure 112012102755333-pct00001
실시예 3 - 구배 전 저-산소 배양이 밴드 분포, 조성 및 유전자 발현에 영향을 준다
원형 B2 및 B4의 분포 및 조성에 대한 산소 조건의 영향을 측정하기 위해서, 상이한 종으로부터의 neo-신장 세포군을 구배 단계 전에 상이한 산소 조건에 노출시켰다. 설치류 neo-신장 증대 (NKA) 세포 제제 (RK069)를 상술된 바와 같이 래트 세포 분리 및 배양 개시를 위한 표준 절차를 이용하여 확립하였다. 모든 플라스크를 21% (대기) 산소 조건에서 2 내지 3일 동안 배양하였다. 배지를 교환한 후, 절반의 플라스크를 2% 산소로 설정된 산조-조절 인큐베이터로 옮기고 나머지 플라스크는 추가의 24시간 동안 21% 산소 조건에서 유지시켰다. 이어서, 상술된 표준 효소적 수거 절차를 이용하여 세포를 각 세트의 조건으로부터 수거하였다. 표준 절차에 따라 단계 구배물을 제조하고, "표준산소" (21% 산소) 및 "저산소" (2% 산소) 배양물을 개별적으로 수거한 후, 동일한 단계 구배물에 나란히 적용하였다 (도 2). 구배물을 통한 세포의 분포는 21% 및 2% 산소-배양된 배치에서 상이하였다 (표 1). 구체적으로, B2의 수율이 저산소 조건에서 증가하고, 동시에 B3는 감소하였다. 또한, B4-특이적 유전자 (예를 들어, 에리트로포이에틴)의 발현은 저산소-배양된 세포로부터 생성되는 구배물에서 향상되었다 (문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참조로 삽입됨]의 도 73 참조).
개 세포 분리 및 배양에 대한 표준 절차 (설치류 분리 및 배양 절차와 유사)를 이용하여 상술된 바와 같이 개 NKA 세포군 (DK008)을 확립하였다. 모든 플라스크를 21% (대기) 산소 조건에서 4일 동안 배양한 후, 일 서브세트의 플라스크는 24시간 동안 저산소 (2%) 조건으로 옮기고 일 서브세트의 플라스크는 21%의 산소 조건에 유지시켰다. 이어서, 각 세트의 플라스크를 수거하고 동일한 단계 구배물에 적용시켰다 (도 3). 래트 결과 (실시예 1)과 유사하게, 저산소-배양된 개 세포는 대기 산소-배양된 개 세포와는 상이하게 구배물을 통해 분포되었다 (표 3.1). 또한, B2의 수율은 구배 전 저산소 노출로 증가하였고, 동시에 B3로의 분포는 감소되었다.
<표 3.1>
Figure 112012102755333-pct00002
상기 자료는 저산소로의 구배전 (pre-gradient) 노출이 B2의 조성 및 B4로의 특정한 특수 세포 (에리트로포이에틴-생성 세포, 혈관 세포 및 사구체 세포)의 분포를 증진시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 저산소 배양 및 이어지는 상술된 바와 같은 밀도-구배 분리가 종 전체에 걸쳐서 ‘B2’ 및 ‘B4’ 세포군을 생성하는데 효과적인 방법이다.
실시예 4 - 인간 신장으로부터 세뇨관/사구체 세포의 분리
상술된 바와 같은 효소적 분리 방법에 의해 정상 인간 신장 조직으로부터 세뇨관 및 사구체 세포를 분리하고 증대시켰다. 상술된 구배 방법으로 세뇨관 세포 분획물을 생체외에서 배양 후 농축시켰다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참조로 삽입됨]의 도 68에 도시되는 바와 같이, 표현형적 특성은 분리 및 증대시 유지되었다. 표지된 알부민의 흡수로 평가되는 세뇨관 세포 기능도 반복적 계대 및 저온보관 후 유지되었다. 문헌 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참조로 삽입됨]의 도 69는, 세뇨관-농축된 세포군 및 세뇨관-고갈된 세포군을 3D 동적 배양으로 배양하는 경우 세뇨관 마커인 카드헤린이 세뇨관-농축된 세포군에서 현저히 증가하였다. 이는 세뇨관 세포의 농축이 세포를 3D 동적 환경에서 배양하는 경우 초기 농축도 이상으로 유지될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 5 - 유동 세포 분석을 통한 EPO -생성 세포의 추가 분리
실시예 2에서 상술된 바와 같은, 동일하게 배양된 신장 세포군을 유동 세포 분석하여 전방 산란 및 측면 산란을 조사하였다. 작고 덜 과립형인 EPO-생성 세포군이 인식가능했으며 (8.15%), 유동 세포 분석기의 분류능을 이용하여 작고 덜 과립형인 세포군의 양성 선별을 통해 분리하였다 (문헌 (참조: Presnell et al ., WO/2010/056328, 전체가 본원에 참조로 삽입됨]의 도 70 참조).
실시예 6 - 자가면역 사구체신염 피험자 시료로부터 분리된 비분할된 신장 세포 혼합물의 특성화
비분할된 신장 세포 혼합물을 상술된 바와 같이 자가면역 사구체신염 피험자 시료로부터 분리하였다. 신장 조직으로부터 분리되고 증대된 특정 신장 세포 아군의 무작위 유전자형 조성을 측정하기 위해서, 정량적 실시간 PCR (qrtpcr) 분석 [참조: Brunskill et al ., supra 2008]을 이용하여 세포 아분획물 사이에서 차등적 세포-유형-특이적 및 경로-특이적 유전자 발현 패턴을 확인하였다. 표 6.1에 나타난 바와 같이, HK20은 자가면역 사구체신염 피험자 시료이다. 표 6.2는 HK20 세포로부터 생성된 세포가 qRTPCR로 측정되는 바와 같이 사구체 세포가 결여된다는 것을 나타낸다.
실시예 7 - 초점 분절 사구체경화증 피험자로부터 분리된 치료학적으로 관련된 신장 생물활성 세포군의 유전적 프로파일링
신장 조직으로부터 분리되고 증대된 특정한 신장 세포 아군의 무작위 유전자형 조성을 측정하기 위해서, 정량적 실시간 PCR (qrtpcr) 분석 [참조: Brunskill et al ., supra 2008]를 이용하여 세포 아분획물 사이에서 차등적 세포-유형-특이적 및 경로-특이적 유전자 발현 패턴을 확인하였다. 사구체 대부분이 파괴된 초점 분절 사구체경화증 (FSGS) 피험자로부터 유래된 인간 제제 HK023을 수거 시의 B4 분획 중 사구체 세포의 존재에 대해 평가하였다. 간단히, 비분할된 (UNFX) 배양물을 생성하고 [참조: Aboushwareb et al., supra 2008], 표준 생검 절차를 이용하여 신장으로부터 취한 (4) 코어 생검 각각으로부터 독립적으로 유지시켰다. 생체외에서 UNFX를 (2) 계대한 후, 세포를 수거하고, (실시예 8에 기술되는 바와 같이) 밀도 구배 방법을 수행하여, 설치류, 개 및 기타 인간 시료에서 수행된 작업에 기초하여 내분비, 혈관 및 사구체 세포가 농축된 것으로 알려진, 아분획물 B4를 포함하는 아분획물을 생성하였다.
<표 6.1>
Figure 112012102755333-pct00003
Figure 112012102755333-pct00004
Figure 112012102755333-pct00005
Figure 112012102755333-pct00006
Figure 112012102755333-pct00007
<표 6.2>
Figure 112012102755333-pct00008

B4 분획물을, 부력 밀도가 1.063 내지 1.091 g/mL인 선명한 밴드의 세포로 보이는, HK023의 각각의 독립적인 UNFX 시료로부터 분리하여 수집하였다. 각각의 시료로부터 RNA를 분리하고 정량적 실시간 PCR에 의해 포도신 (사구체 세포 마커) 및 PECAM (내피 세포 마커)의 발현에 대해 조사하였다. 중증의 FSGS 피험자로부터의 생검-유래 시료로부터 예상되는 바와 같이, B4 분획물에서 포도신(+) 사구체 세포의 존재가 일치하지 않았으며, 시료의 2/4에서 포도신이 검출되지 않았다. 이와는 대조적으로, PECAM+ 혈관 세포는 생검-개시된 배양물의 4/4의 B4 분획물에 일관되게 존재하였다. 따라서, B4 분획물은, 심지어 중증 질환 상태의 인간 신장으로부터도, 1.063 내지 1.091 g/mL의 밀도 범위에서 분리될 수 있다.
<표 7.1>
FSGS 피험자로부터 분리된 아분획물 B4에서 사구체 및 혈관 세포의 검출을 위한 포도신 및 PECAM의 발현.
Figure 112012102755333-pct00009
또한, 표 7.2에 나타난 바와 같이, 인간 시료 (HK018)는 밀도 구배 원심분리 후 qRTPCR에 의해 포도신 (사구체 마커)이 검출되지 않음을 보여주었다.
<표 7.2>
B2 & B4’에 대한 HK018의 구배후 유전자 발현 특성화
Figure 112012102755333-pct00010
실시예 8 - 형광 활성호된 세포 분류 ( FACS )를 이용한 생존 신장 세포 유형의 농축/고갈
하나 이상의 분리된 신장 세포를 농축시키고/시키거나 하나 이상의 특정한 신장 세포 유형을 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 분리된 일차 신장 조직으로부터 고갈시킬 수 있다.
시약: 70% 에탄올; 세척 완충액 (PBS); 50:50 신장 세포 배지 (50% DMEM 높은 글루코즈): 50% 각질세포-SFM; 트리판 블루 0.4%; 표적 신장 세포군에 대한 일차 항체, 예를 들어 신장 내피 세포에 대한 CD31 및 신장 사구체 세포에 대한 네프린. 짝지은 이소형 특이적 형광 이차 항체; 염색 완충액 (0.05% BSA, PBS 중)
절차: 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)를 세척하기 위한 표준 절차 후, 일차 분리 또는 배양된 세포로부터의 신장 세포의 단일 세포 현탁액을 T500 T/C 처리된 플라스크로부터 수득하고, 신장 세포 배지에 재현탁한 후, 얼음 상에 놓을 수 있다. 이어서, 세포수 및 생존력을 트리판 블루 배제 방법을 이용하여 측정한다. 예를 들어 이질 세포군으로부터의 사구체 세포 또는 내피 세포의 신장 세포 농축/고갈을 위해 적어도 70%의 생존력을 갖는 10 내지 50e6의 생존 세포를 수득한다. 이어서, 이질 신장 세포군을 출발 농도 1 ug/0.1 ml 염색 완충액/1 x 106 세포 (필요한 경우, 규정농도)의 표적 세포 유형에 특이적인 일차 항체로 염색한다. 표적 항체를 CD31 PE (신장 내피 세포에 특이적)와 같은 항체와 컨주게이션되거나 네프린 (신장 사구체 세포에 특이적)과 같은 항체와 컨쥬게이션되지 않을 수 있다.
이어서, 세포를 얼음 상에서 또는 빛으로부터 보호된 4℃에서 30분 동안 염색한다. 30분 인큐베이션한 후, 세포를 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세척한다. 이어서, 펠렛을 컨주게이션된 이소유형 특이적 이차 항체가 필요한지의 여부에 따라 PBS 또는 염색 완충액에 재현탁시킨다. 세포가 형광색소 컨주게이션된 일차 항체로 표지되는 경우, 세포를 10e7 세포 당 2 ml의 PBS에 재현탁시키고, FACS Aria 또는 동등한 세포 분류기에서 분류를 수행한다. 세포가 형광색소 컨주게이션된 항체로 표지되지 않는 경우, 세포를 개시 농도 1 μg/0.1 ml/1e6 세포로 이소유형 특이적 형광염색 컨주게이션된 이차 항체로 표지한다.
이어서, 세포를 얼음 상에서 또는 빛으로부터 보호된 4℃에서 30분 동안 염색한다. 30분 인큐베이션한 후, 세포를 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세척한다. 원심분리후, 펠렛을 5e6/ml PBS의 농도로 PBS에 재현탁시킨 후, 4 ml/12x75mm를 멸균 튜브에 옮긴다.
FACS Aria는 제조자의 교시 (BD FACs Aria User Manual)에 따라 생존 세포 멸균 분류를 위해 준비된다. 시료 튜브를 FACs Aria에 로딩하고, 수집이 개시된 후 PMT 전압을 조절한다. 특정 파장을 이용하여 형광 강도로 신장 특이적 세포 유형을 선별하도록 게이트를 드로잉한다. 또 다른 게이트를 음성군을 선별하도록 드로잉한다. 양성 표적군 및 음성군을 캡슐화하도록 목적하는 게이트를 드로잉하자마자, 세포를 제작자의 교시에 따라 분류한다.
양성 표적군을 하나의 15 ml 원추형 튜브에 수집하고, 음성군을 1 ml의 신장 세포 배지로 채워진 또 다른 15 ml 원추형 튜브에 수집한다. 수집 후, 각각의 튜브로부터의 시료를 유동 세포 분석하여 순도를 측정한다. 수집된 세포를 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세척하고, 펠렛을 추가 분석 및 실험을 위해 신장 세포 배지에 재현탁시킨다.
실시예 9 - 자기적 세포 분류를 이용한 신장 세포 유형의 농축/고갈
하나 이상의 분리된 신장 세포를 농축시키고/시키거나 하나 이상의 특정한 신장 세포 유형을 분리된 일차 신장 조직으로부터 고갈시킬 수 있다.
시약: 70% 에탄올; 세척 완충액 (PBS); 50:50 신장 세포 배지 (50% DMEM 높은 글루코즈): 50% 각질세포-SFM; 트리판 블루 0.4%; 러닝 완충액 (PBS, 2 mM EDTA, 0.5% BSA), 세정 완충액 (PBS, 2 mM EDTA), 세척 용액 (70% v/v 에탄올), Miltenyi FCR 차단 시약, IgG 이소유형에 특이적인 Miltenyi 마이크로비드, 표적 항체, 예를 들어 CD31(PECAM) 또는 네프린 또는 이차 항체.
절차: 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)를 세척하기 위한 표준 절차 후, 일차 분리 또는 배양된 세포로부터의 신장 세포의 단일 세포 현탁액을 수득하고, 신장 세포 배지에 재현탁한다. 세포수 및 생존력을 트리판 블루 배제 방법을 이용하여 측정한다.
예를 들어 이질 세포군으로부터의 사구체 세포 또는 내피 세포의 신장 세포 농축/고갈을 위해 적어도 70%의 생존력을 갖는 10e6 내지 4e9의 생존 세포를 수득한다.
농축/고갈 접근을 위한 최적 분리를 관심 표적 세포에 기초하여 측정한다. 네프린 항체를 사용한 표적 빈도 10% 미만의, 예를 들어 사구체 세포의 농축을 위해, Miltenyi autoMACS 또는 등가 장치 프로그램 POSSELDS (민감 모드에서 이중 양성 선별)을 이용한다. 표적 빈도 10% 초과 세포의 고갈을 위해, Miltenyi autoMACS 또는 등가 장치 프로그램 DEPLETES (민감 모드에서 고갈)을 이용한다.
생존 세포를 15 ml 원추형 원심분리 튜브에 0.05% BSA와 함께 1 μg/10e6 세포/0.1 ml PBS를 가함으로써 표적물 특이적 일차 항체, 예를 들어 네프린 rb 폴리클로날 항체로 표지한 후, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
표지 후, 1 내지 2 ml 완충액/10e7 세포를 가하고 5분 동안 300 xg에서 원심분리하여 세포를 세척함으로써 결합되지 않은 일차 항체를 제거하였다. 세척 후, 0.05% BSA를 갖는 1 μg/10e6/0.1 ml PBS의 이소유형 특이적 이차 항체, 예를 들어 치킨 항-래비트 PE를 가한 후, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 1 내지 2 ml 완충액/10e7 세포를 가한 후 5분 동안 300 xg에서 원심분리시켜 세포를 세척함으로써 결합되지 않는 이차 항체를 제거한다. 상등액을 제거하고, 세포 펠렛을 60 μl 완충액/10e7 총세포에 재현탁시킨 후, 20 μl FCR 차단 시약/10e7 총세포를 가하고, 이어서 잘 혼합한다.
20 μl의 직접적 MACS 마이크로비드 (예를 들어, 항-PE 마이크로비드)를 가하고, 혼합한 후, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 10 내지 20배 표지물 용적의 완충액을 가하고 5분 동안 300 xg에서 세포 현탁액을 원심분리하여 세포를 세척하고, 세포 펠렛을 500 μl 내지 2 ml 완충액/10e8 세포로 재현탁시킨다.
제작자의 교시에 따라, autoMACS 시스템을 세척하고, autoMACS를 사용하는 자기 세포 분리를 준비한다. 새로운 멸균 수집관을 배출구 포트 아래에 놓는다. autoMACS 세포 분리 프로그램을 선택한다. 선별을 위해서는 POSSELDS 프로그램을 선택하고, 고갈을 위해서는 DEPLETES 프로그램을 선택한다.
표지된 세포를 수집 포트 (uptake port)에 삽입하고, 이어서 프로그램을 시작한다.
세포 선택 또는 고갈 후, 시료를 수집하고 사용시까지 얼음에 놓는다. 고갈되거나 선택된 시료의 순도를 유동 세포 분석으로 확인한다.
실시예 10 - 치료 가능성을 갖는 세포를 정상 및 만성-질환 신장 조직으로부터 분리하고 증대시킬 수 있다
본 조사의 목적은 고함량 분석 (HCA)을 통해 인간 NKA 세포의 기능 특성을 측정하는 것이다. 고함량 영상화 (HCI)는 다수의 시료에 걸쳐 2개 이상의 형광 프로브 (다중처리)를 사용하여 다수의 아세포 이벤트를 동시에 영상화하는 것을 제공한다. 고함량 분석 (HCA)는 고함량 영상화에 포착된 다수의 세포 파라미터를 동시에 정량적으로 측정하는 것을 제공한다. 간단히, 표준 생검 절차를 이용하여 진행된 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 5개의 인간 신장 및 3개의 비-CKD 인장 신장으로부터 취한 코어 생검으로부터의 비분할된 (UNFX) 배양물을 생성하고 [참조: Aboushwareb et al., supra 2008] 독립적으로 유지시킨다. 생체외에서 UNFX를 (2) 계대한 후, 세포를 수거하고, (도 2에서와 같이) 밀도 구배 방법을 수행하여 아분획물 B2, B3 및/또는 B4를 포함한 아분획물을 생성하였다.
인간 신장 조직을 표 10.1에 요약되어 있는 바와 같이 비-CKD 및 CKD 인간 공여자로부터 생성하였다. 도 4는 HK17 및 HK19 시료의 조직병리학 특징을 나타낸다. 생체외 배양물을 모든 비-CKD (3/3) 및 CKD (5/5) 신장으로부터 확립하였다. 관심 영역 (ROI)를 규정하는 인간 NKA에서의 알부민 수송에 대한 고함량 분석 (HCA)이 도 5 (인간 NKA 세포에서 알부민 수송에 대한 HCA)에 나타나 있다. 비-CKD 및 CKD 신장으로부터 유래된 NKA 세포에서의 알부민 수송의 정량 비교가 도 6에 나타나 있다. 도 6에 도시되는 바와 같이, 알부민 수송은 CKD-유래된 NKA 배양물에서 약화되지 않는다. 세뇨관-농축된 B2와 세뇨관 세포-고갈된 B4 아분획물 사이의 마커 발현에 대한 비교 분석이 도 7 (CK8/18/19)에 도시된다.
<표 10.1>
Figure 112012102755333-pct00011

세뇨관-농축된 B2와 세뇨관 세포-고갈 B4 아분획물 사이의 알부민 수송에 대한 비교 기능 분석이 도 8에 도시되어 있다. 아분획물 B2는 근위 세뇨관 세포에 농축되므로 증가된 알부민-수송 기능을 나타낸다.
알부민 흡수: 24-웰 콜라겐 IV 플레이트 (BD Biocoat™)에서 컨플루언시 (confluency) 상태로 성장된 세포의 배양 배지를 18 내지 24시간 동안 1X 항진균제/항생제 및 2 mM 글루타민을 포함하는 페놀 레드-비함유, 혈청-비함유, 저-글루코즈 DMEM (pr-/s-/lg DMEM)으로 대체하였다. 검정 직전, 세포를 세척하고, 30분 동안 pr-/s-/lg DMEM + 10 mM HEPES, 2 mM 글루타민, 1.8 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 30분 동안 25 μg/mL 로다민-컨주게이션된 소 알부민 (Invitrogen)에 노출시킨 후, 빙냉각된 PBS로 세척하여 세포내이입을 정지시키고, 25 μg/mL 훽스트 핵 염료를 포함하는 2% 파라포름알데하이드로 즉시 고정시켰다. 억제 실험을 위해, 1 μM 수용체-연관 단백질 (RAP) (Ray Biotech, Inc., Norcross GA)을 알부민 첨가 10분에 첨가하였다. 현미경적 영상화 및 분석을 BD Pathway™ 855 고함량 바이오영상촬영기 (Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다 [참조: Kelley et al ., Am J Physiol Renal Physiol. 2010 Nov;299(5):F1026-39. Epub Sep 8, 2010]
결론적으로, HCA는 세포 수준 자료를 제공하고 다른 검정에 의해서는 검출될 수 없는 세포군 동태, 즉 유전자 또는 단백질 발현을 밝힐 수 있다. 알부민 수송 (HCA-AT) 기능을 측정하기 위한 정량가능한 생체외 HCA 검정을 이용하여 인간 신장 세뇨관 세포를 인간 NKA 원형의 성분으로서의 특징지을 수 있다. HCA-AT는 세포 기능의 비교 평가를 가능하게 하였으며, 알부민 수송-적격 (competent) 세포가 인간 CKD 신장으로부터 유래된 NKA 배양물에 보유된다는 것을 보였다. 또한, NKA 배양물의 특정 아분획물인 B2 및 B4가 표현형 및 기능 면에서 다르고, B2는 증진된 알부민 수송 활성을 갖는 세뇨관 세포-농축 분획물에 해당한다. 인간 CKD로부터의 B2 세포 아군은 (상기에 나타낸 바와 같이) 생체내에서 효능을 나타낸 설치류 B2 세포와 표현형적으로 및 기능적으로 유사하다.
실시예 11 - 신장 재생 예측자로서의 마커 발현
본 조사는 치료학적 생물활성 일차 신장 세포 아군으로 처리된 5/6 신장 절제된 래트에서 신장 재생의 예측자로서의 줄기 및 전구세포 마커 발현에 관한 것이다. NKA 처리가 신장 기능을 개선하는 기본 기작이 특징지어진다. NKA 처리의 작용 기작에 대한 조사는 세포-세포 시그널링, 접목 (engraftment) 및 섬유증 경로에 관한 것이다. 본 작업은 NKA 처리가 기관의 내재적 재생 능력을 어떻게 (아마도 신장 줄기 세포를 유동시킴으로써) 증가시키는가에 초점을 맞추었다. 본 발명자들은 NKA-처리된 5/6 Nx 래트에서 관측된 연장된 생존 및 신장 기능의 개선이 특정 줄기 세포 마커의 분자 발현과 연관된다고 가정한다.
본 조사는 CKD에 대한 래트 5/6 신장 절제 모델을 사용하면서 분자 검정을 이용하여, 규정된 치료학적 생물활성 일차 신장 세포군의 직접 주사에 반응한 래트 5/6 신장-절제된 신장 내의 내재적 줄기 및 전구세포의 이동을 평가한다. 이러한 세포-기반 치료가 전사물 및 단백질 수준 모두에서 주요 줄기 세포 마커 CD24, CD133, UTF1, SOX2, LEFTY1 및 NODAL의 상향 조절과 특이적으로 연관되는 것으로 관측되었다. 상향-조절은 주사한 지 1주일 후에 검출되고 주사한 지 12주 후에 피크에 달하였다. 줄기 및 전구세포 마커의 활성화는 비처리된 신장 절제된 대조군과 비교하여 증가된 생존 및 혈청 바이오마커의 상당한 개선과 연관되었다.
재료 및 방법
래트로부터 일차 신장 세포군의 분리. 래트로부터의 일차 신장 세포군의 분리를 문헌 [참조: Aboushwareb et al ., supra 2008; Presnell et al ., 2009 FASEB J 23: LB143]에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다.
생체내 연구 디자인 및 분석. 일차 신장 세포군의 분리에 대한 상세한 기술 [참조: Presnell et al., Tissue Eng Part C Methods. 2010 Oct 27. (Epub ahead of print)] 및 CKD의 5/6 신장 절제된 설치류 모델에서의 일차 신장 세포 아군의 생물활성을 평가하는 생체내 연구 [참조: Kelley et al., supra 2010]. 세뇨관 세포-농축된 일차 신장 세포 아군이 설치류 만성 신장 질환 모델에서 생존을 개선하고 신장 기능을 증가시킨다는 것은 다른 문헌에 기재되어 있다. 본 연구는, 조직을 B2 (NKA #1) 또는 B2+B4 혼합물 (NKA #2)로 처리된 래트로부터 부검시 분리하고, 신장 절제된 래트 (Nx) 및 모의-수술된 비-신장 절제된 래트 (대조군)과 비교하였다. 도 9 및 11 및 표 11.1에, NKA #1 및 NKA #2 처리된 래트로부터의 자료가 모여 있다. 조사되는 래트로부터 매주 및 부검전 (pre-necropsy) 체혈한 혈액을 분석하여 체계적인 자료를 수득하였다.
표 11.1은 모의 처리된 동물 (대조군), n=3; nx 대조군 (Nx), n+3; B2 세포 (NKA#1)로 처리된 동물 , n= 7; B2+B4 세포 (NKA#2)로 처리된 동물, n= 7에 대한 생존 자료를 나타낸다. 연구의 말기에 (23 내지 24주), 어떠한 Nx 동물은 남아 있지 않았다. NKA 처리된 동물은 비처리된 Nx 대조군과 비교하여 뛰어난 생존율을 나타내었다.
<표 11.1>
Figure 112012102755333-pct00012
* 조직을 위해 예정된 시점에서 희생된 1마리 동물
** 조직을 위해 예정된 시점에서 희생된 2마리 동물
RNA 분리, cDNA 합성 및 qRT - PCR . RNA를 하기와 같이 최적 커팅 시간 (OCT) 냉동 매질에 포매된 조직으로부터 분리하였다: 조직 블럭을 실온에 놓고, 과도한 OCT를 제거한 후, 조직을 PBS에 두어 잔류 OCT를 완전히 해동시키고 제거한 후, 조직을 PBS 중에 3회 세척하고, 이어서 거칠게 자른 후, 마이크로퓨지 튜브로 나누었다. 이어서, 분취된 조직을 막자를 사용해 분쇄시키고, RNeasy 플러스 미니 키트 (Qiagen, Valencia CA)를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA 온전성을 분광광도로 측정하고, cDNA를 SuperScript® VILO™ cDNA 합성 키트 (Invitrogen, Carlsbad CA)를 사용하여 1.4 μg에 필적하는 RNA 용적으로부터 생성하였다. cDNA 합성 후, 최종 용적이 240 μl이 되도록 200 μl의 diH2O를 가해 각각의 시료를 1:6으로 희석시켰다. 표적 전사물의 발현 수준을 ABI 및 ABI-프리즘 7300 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City CA)으로부터의 카달로그 프라이머 및 프로브를 사용하면서 정량적 실시간 PCR (qRT-PCT)을 통해 조사하였다. TaqMan® 유전자 발현 마스터 믹스 (ABI, Cat# 4369016)를 사용하여 증폭시키고, 펩티딜프롤릴 이소머라제 B (PPIB)를 내인성 대조군으로 사용하였다. qRT-PCR 반응: 10 μl 마스터 믹스 (2X), 1 μl 프라이머 및 프로브 (20X), 9 μl cDNA, 20 μl 총 용적/반응. 각각의 반응은 TaqMan® 프라이머 및 프로브를 사용하여 하기와 같이 구축하였다.
Figure 112012102755333-pct00013
웨스턴 블롯 . OCT 냉동 매질에 포매된 냉동된 전체 신장 조직을 단백질 시료 수집에 사용하였다. OCT를 상술된 바와 같이 제거하고, 모든 조직을 50 mM 트리스 (pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.5% NP40 및 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche Applied Science, Indianapolis IN)로 이루어진 완충액에서 용해시켰다. 15분 동안 실온에서 흔들면서 용해시킨 후, 10분 동안 13,000 RPM에서 원심분리시켰다. 모든 상등액을 수집하고, 브래드포드 검정으로 단백질 농도를 측정하였다. 30 μg 단백질/시료를 NuPAGE® Novex 10% 비스-트리스 겔 (Invitrogen)의 각각의 웰에 가하여 SDS PAGE 겔을 수행하였다. 겔을 MES 러닝 완충액 (Invitrogen) 중 200 V에서 40분 동안 전기영동시켰다. 이어서, 단백질을 I-Blot 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 니트로셀룰로즈 막에 옮기고, 2시간 동안 실온에서 0.1% 트윈-20 (TBS-T) (Sigma, St. Louis, MO)을 갖는 트리스 완충 식염수에 용해된 4% w/v 저지방 우유 15 mL로 차단하였다. 막을 하기 항체 (각각 2% w/v 저지방 우유를 갖는 5 mL TBS-T에 희석됨)를 사용하여 실온에서 밤새 탐침하였다: 항-인간 Lefty-A Long & Short 이소형태 (R&D systems MAB7461); 항-인간, 마우스 & 래트 CD133 (Abcam AB19898); 항-인간 & 마우스 UTF1 (Millipore MAB4337); 항-인간 NODAL (Abcam AB55676); 항-인간 & 래트 CDH11 (OB Cadherin) (Thermo Scientific MA1-06306); 항-래트 CD24 (Becton Dickinson). 막을 TBS-T를 사용하여 각각 10분 동안 3회 세척한 후, 1.5시간 동안 실온에서 2% w/v 저지방 우유를 갖는 TBS-T로 희석된 (1:60,000) 적합한 HRP-컨주게이션된 이차 항체 (Vector Labs PI-2000; PI-1000)로 탐침하였다. 막을 TBS-T 중에서 각각 10분 동안 3회 세척한 후, diH2O에 2회의 10분 세척을 수행하였다. 블롯을 ECL 어드밴스 화학발광 시약 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway NJ)을 사용하여 현상하고, ChemiDoc™ XRS 분자 영상촬영기 및 Quantity One® 소프트웨어 (BioRad, Hercules CA)를 사용하여 가시화하였다.
결과. 5/6 NX 래트의 내재적 줄기 및 전구 세포를 평가하기 위한 분자 검정을 개발하여 NKA 처리에 대한 이들 마커의 시간적 반응을 조사하는데 이용하였다. NKA 처리가 mRNA 전사물 및 단백질 수준에서 주요 줄기 세포 마커 CD24, CD133, UTF-1, SOX-2, LEFTY 및 NODAL의 상향 조절과 특이적으로 연관되는 것으로 관측되었다. 상향 조절은 주사한 지 1주일 후에 검출되고 주사한 지 12주 후에 피크에 달하였다. 줄기 및 전구세포 마커의 활성화는 비처리된 5/6 NX 대조군 동물과 비교하여 증가된 생존 및 혈청 바이오마커의 상당한 개선 (즉, 신장 여과의 개선)과 연관되었다.
도 9는 NKA로 5/6 NX 래트를 처리한 후 숙주 조직에서의 SOX2 mRNA 발현을 나타낸다. SOX2 mRNA 발현의 시간적 분석 결과, 이식후 12주에 Nx 대조군에 비해 NKA 처리 그룹에서 SOX2 mRNA가 1.8배 증가하였다. 이식후 24주에 Nx 대조군에 비해 NKA 처리 그룹에서 2.7배의 SOX2 mRNA 발현 증가가 관측되었다. (1주, 대조군 (모의), Nx (대조군) 및 NKA-처리군에 대해 각각 n=3) (12주, 대조군 (모의) 및 Nx (대조군)에 대해 각각 n=1; NKA-처리군에 대해 n=4) (24주, 대조군 (모의) 및 Nx (대조군)에 대해 각각 n=1; NKA-처리군에 대해 n=4). * p-값 = 0.023 또는 < 0.05임을 나타낸다.
도 10은 처리 후 1, 12, 24주에 모의 대조군 (대조군), Nx 대조군 (Nx) 및 NKA #1 및 NKA #2 처리된 래트에서 CD24, CD133, UTF1, SOX2, NODAL 및 LEFTY의 시간 경과에 따른 발현을 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. OCT 냉동 매질에 포매된 냉동된 전체 신장 조직 (각각의 시료에 대해 N=1)을 단백질 시료 수집에 사용하였다. 레인을 로딩된 총 매쓰 단백질로 표준화시켰다. NKA-처리된 조직에서의 CD133, UTF1, NODAL, LEFTY 및 SOX2 단백질 수준은 모든 시점에서 대조군 또는 Nx 래트에 비해 증가하였다.
도 11은 시간 경과에 따른 재생 반응 지수 (RRI)를 도시한다. 각각의 단백질 발현에 대한 밀도측정 분석 (도 10)을 이용하여 재생 마커 단백질 발현의 정량 지수 또는 재생 반응 지수 (RRI)를 구하였다. 밴드 강도는 각각의 웨스턴 블롯으로부터 이미지 J v1.4 소프트웨어 (NIH)를 이용하여 계산하고, 그 값을 각각의 단백질에 대한 단위 면적에 대해 표준화하였다. 평균 강도는 각각의 시점에 대해 웨스턴 블롯 분석에 사용된 5개의 마커를 컴파일링함으로써 모의, Nx, 및 NKA 처리에 대해 측정하였다. 플롯은 1주, 12주 및 24주 시점에 발생된 매끄러운 라인 피트를 이용한 XY 산란을 나타낸다. 각각의 그룹에 대한 평균 강도를 시간 경과에 따라 플로팅하여 줄기 세포 마커 단백질 발현에 대한 숙주 조직 반응 경향을 강조하였다. 각각의 시료에 대한 변수가 동일하다는 가정하에 표준 투 테일드 스튜던츠 t-시험 (standard two tailed Student's t-test)을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 95%의 신뢰 구간 (p-값 < 0.05)을 이용하여 통계학적 유의성을 측정하였다. (NKA 처리 그룹 n=2; 대조군 (모의) n=1; Nx (대조군) n=1). 모의 대조군 동물에서 단지, RRI는 처리 후 1주 시점에서의 90.47로부터 처리 후 24주에 81.89로 약간의 감소를 나타낸다. 이와는 대조적으로, 5/6 Nx 대조군으로부터의 신장은, RRI가 처리 후 1주 시점에서의 82.26으로부터 처리 후 18주 (동물이 죽는 시점)에 140.56으로 증가하는, 본질적으로 반대되는 반응을 나타낸다. NKA-처리된 동물에서, RRI는 처리 후 1주에서의 62.89로부터 처리 후 12주에 135.61로 가파르게 증가하고, 처리 후 24주에 112.61로 떨어졌다.
NKA 처리가 숙주 조직에서 전사물 및 단백질 수준 모두에서 줄기 세포 마커 CD24, CD133, UTF-1, SOX-2 및 NODAL의 상향 조절과 관련이 있는 것으로 관측되었다. 상향 조절은 처리한 후 1주에 검출되고 처리한 후 12주에 피크에 달했다. 숙주 조직에서 줄기 및 전구 세포 마커의 전반적인 활성화는 비처리된 신장 절제된 대조군에 비해 증가된 생존 (1) 및 임상적으로 관련된 혈청 바이오마커의 증진과 연관되었다.
NKA 처리에 반응한 내재적 줄기 및 전구 세포 세포군의 동원은 손상된 신장 조직 및 기관 구조를 재생시킴으로써 5/6 NX 동물에서 신장 기능을 회복하는데 기여할 수 있다. 따라서, 본 연구에서 사용된 분자적 검정은 CKD에 대한 조직 엔지니어링 및 재생 의약을 평가하기 위한 신속하고, 간단하고 예측적인 재생 결과 검정을 제공할 수 있다.
실시예 12 - 일차 신장 세포로부터 유래된 엑소솜은 microRNA 를 포함한다
본 발명자들은 재생 결과를 제공하는 기작을 설명하기 위한 생체내 조사에 대한 디자인을 특징짓기 위해 특정 엑소솜-유래된 miRNA를 표적 세포에서의 기능적으로 연관된 결과와 서로 연관시키고자 했다.
방법: 재생 복구 반응과 관련된 시그널링 경로에 대한 적응용 배지의 효과를 시판 세포: HK-2 (인간 근위 세뇨관 세포주), 일차 인간 신장 혈관사이 세포 (HRMC) 및 인간 제대 내피 세포 (HUVEC)를 사용하여 조사하였다. 인간 및 래트 일차 신장 세포 배양물 (UNFX)로부터의 적응용 배지 중의 엑소솜의 RNA 내용물을 공지된 miRNA를 검출하도록 디자인된 PCR-기반 어레이에 의해 스크리닝하였다. 저산소는 엑소솜 방출에 영향에 끼치는 것으로 보고되었다; 따라서, 일 그룹의 배양물을 배지 수집 전 24시간 동안 저산소 (2% O2)에 노출시켰다. 엑소솜을 FACS에 의해 세포 파편으로부터 분리하였다.
도 12는 UNFX 적응용 배지의 제조 및 분석을 위한 도식도를 제공한다.
결과: UNFX-적응용 배지가 재생 복구 반응과 연관된 시그널링 경로에 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다; 이들 반응은 비-적응용 배지를 사용하는 대조군에서는 관측되지 않았다. 구체적으로, NFκB (면역 반응) 및 상피-내지-중간엽 이행 (섬유증 반응)은 HK-2 세포에서 약화되었으며, PAI-1 (섬유증 반응)은 HRMC 세포에서 약화되었으며, 혈관형성은 HUVEC에서 증진되었다. UNFX-적응용 배지로부터의 엑소솜 내용물에 대한 PCR 어레이 스크리닝으로부터의 예비 자료는 UNFX이, UNFX-적응용 배지에 대해 관측된 결과와 일치하는, miRNA 서열을 포함하는 엑소솜을 생성한다는 것을 나타낸다.
도 13A-C는 UNFX 배양물로부터의 적응용 배지가, 잠재적으로 재생 결과와 연관되는, 시험관내에서의 다수의 세포 과정에 영향을 끼친다는 것을 나타낸다. NFκB 시그널링은 신장 질환에서 염증 과정의 주요 매개자로서 제시되며 [참조: Rangan et al ., 2009. Front Biosci 12:3496-3522; Sanz et al ., 2010. J Am Soc Nephrol 21:1254-1262], 종양 괴사 인자 (TNF)에 의해 활성화될 수 있다. HK-2 세포를 37℃에서 1시간 동안 비적응용 배지 (좌측) 또는 UNFX 적응용 배지 (우측)와 함께 프리인큐베이션한 후, 10 ng/ml TNFa와 함께 또는 부재 하에 활성화시켰다.
도 13A는 UNFX-적응용 배지가 NF-κB의 TNF-a 매개된 활성화를 약화시킨다는 것을 나타낸다. NFκB 활성화는 RelA/p65 면역형광 염색 (녹색)으로 측정되었다. 훽스트-대조-염색된 핵 (청색) 및 팔로이딘-염색된 필라멘트형 액틴 (적색)은 RelA/p65 핵 국소화 (백색 화살표) 평가를 용이하게 한다.
도 13B는 UNFX-적응용 배지가 HUVEC 세포 배양물의 프로혈관형성 (proangiogenic) 거동을 증가시킨다는 것을 나타낸다. HUVEC 세포 (100,000개/웰)를 배지 200 + 0.5% BSA 중의 폴리머화된 마트리겔 (Matrigel) 상에 놓았다. 비적응용 배지 (좌측) 또는 UNFX-적응용 배지 (우측)를 가하고, 세포 조직적 반응을 영상 포착과 함께 3 내지 6시간 동안 시각적으로 모니터링하였다. 세포 조직화를 세포 이동 (백색 화살촉), 정렬 (검은색 화살촉), 세뇨관 형성 (적색 화살촉) 및 폐다각형의 형성 (별표)으로 평가하였다. UNFX 적응용 배지는 비적응용 배지에 비해 더욱 많은 세뇨관 및 폐다각형을 유도하였으며, 이는 프로혈관형성 인자가 배지에 존재한다는 것을 나타낸다.
도 13C는 UNFX-적응용 배지가 상피 세포에서 섬유증 경로를 약화시킨다는 것을 도시한다. HK-2 세포는 상피 특성을 상실하고, 시험관내에서 전환 성장 인자 (TGF)에 노출시 중간엽 표현형을 획득하며, 이는 신장 섬유증의 진행과 관련이 있는 상피-내지-중간엽 이행 (EMT)를 모사한다 [참조: Zeisberg et al ., 2003 Nat Med 9:964-968]. HK-2 세포를 72시간 동안 비적응용 배지 (CTRL), 10 ng/ml TGFβ1을 포함하는 비적응용 배지 (TGFβ1) 또는 10 ng/ml TGFβ1을 포함하는 UNFX 적응용 배지 (TGFβ1+CM)에서 배양하였다. 세포를 정량적 RT-PCR로 CDH1 (상피 마커), CNN1 (중간엽 마커) 및 MYH11 (중간엽 마커)에 검정하였다. 적응용 배지는, CDH1, CNN1 및 MYH11 유전자 발현으로 측정시, TGFβ1-유도된 EMT의 수준을 저하시킨다. 에러 바는 3개 실험 반복의 평균에 대한 표준 에러 (SEM)을 나타낸다.
도 13D는, 비점검시 세포외 매트릭스 단백질의 점진적 축적을 이끌 수 있는, TGFβ1 및 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1)에 의해 구축되는 양성 피드백 루프를 도시한다 [참조: Seo et al ., 2009. Am J Nephrol 30:481-490].
도 14A-B는 혈관사이 세포에서 섬유증 경로의 약화를 나타낸다. HRMC를 5 ng/ml TGFβ1의 첨가 (+) 또는 부재 (-) 하에 대조군 (CTRL) 또는 UNFX 적응용 배지 (UNFX CM)에서 24시간 동안 배양하였다. PAI-1에 대한 웨스턴 블롯 분석은 UNFX CM이 TGFβ1-유도된 PAI-1 단백질 수준의 증가를 약화시킨다는 것을 입증한다. b액틴은 로딩 대조군으로서 표시된다. 인간 신장 혈관사이 세포 (HRMC)는 5 ng/ml TGFb1의 존재 (+) 하에서 PAI-1의 증가된 수준을 나타낸다. 인간 생물활성 신장 세포로부터 유래된 적응용 배지 (CM)와의 공동배양은 TGFb1-유도된 PAI-1 단백질 발현을 약화시킨다. mRNA 수준에서의 PAI-1 발현은 CM에 의해 바뀌지 않았다 (자료 도시되지 않음).
도 14B는 래트 생물활성 신장 세포로부터의 CM이 TGFb1로 유도된 (+) 및 비유도된 (-) 배양된 HRMC에 대해 유사한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 원심분리후 수집된 CM 상등액 (래트 CM을 고갈시킴)은 PAI-1 발현을 약화시키는데 덜 효과적이었으며, 이는 관측된 PAI-1 단백질의 약화에 책임이 있는 CM 성분이 래트 생물활성 신장 세포에 의해 분비되는 소포와 관련될 수 있다는 것을 제시한다.
도 15는 UNFX로부터의 적응용 배지가 분비되는 소포를 포함한다는 것을 도시한다. 도 145A는 세포질-유래된 내부 성분 (녹색)을 포함하는 이중지질 (bilipid) 구조물 (적색)인 분비되는 소포 (엑소솜 포함)을 도시한다. 포스파티딜세린 (청색 삼각형)은 소포 생합성 동안 세포외 공간에 노출되는 막의 성분이다 [참조: Thery et al ., 2010. Nat Rev Immunol 9:581-593].
PKH26 및 CFSE는 각각 분비되는 소포의 지질막 및 세포질을 표지하며 [참조: Aliotta et al ., 2010. Exp Hematol 38:233-245], 아넥신 V는 포스파티딜세린을 결합한다.
도 15B-C는 FACS 분류를 도시한다. UNFX 적응용 배지를 PKH26, CFSE 및 APC-컨주게이션된 아넥신 V로 표지한 후, 형광-조력된 세포 분류 (FACS)로 분류하였다. 분비된 소포를 나타내는 삼중-양성 입자를 수집하고, TRIZol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. microRNA 내용물을 시판되는 RT-PCT-기반 어레이를 사용하여 공지된 서열에 대해 스크리닝하였다.
표 12.1은 분비된 소포가 예측된 치료 결과를 갖는 microRNA를 포함한다는 것을 나타낸다. UNFX 세포는 공지된 miRNA 서열을 포함하는 엑소솜을 방출하였다. UNFX-적응용 배지는 인간 세포주에서 기능적으로 관련된 재생 반응에 영향을 끼친다. 검출된 miRNA와 관측된 재생 반응 사이의 원인 및 효과 관계가 활발한 연구 하에 있다; 그러나, 지금까지 수득된 결과는 UNFX 세포가 표적 세포 및 조직으로 엑소솜-매개된 전달을 통해 치료학적으로 관련된 측분비 효과를 갖는 잠재력을 갖는다는 것을 지지한다.
<표 12.1>
Figure 112012102755333-pct00014
* 문헌 [참조: Taganov et al, 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103:12481-12486]
** 문헌 [참조: Chen and Gorski, 2008. Blood 111:1217-1226]
*** 문헌 [참조: Rogler et al ., 2009. Hepatology 50:575-584]
상기 자료는 생물활성 신장 세포 배양무로부터 분비된 소포가 TGFb1/PAI-1 피드백 루프에 의해 유도되는 PAI-1을 약화시키는 성분을 포함한다는 것을 지지한다.
마크로어레이 및 RT - PCR 분석. 루이스 래트로부터의 비분할된 (UNFX) 생물활성 신장 세포를 저산소 조건 (2% O2)의 조건 하에 24시간 동안 기초 배지 (혈청 또는 보충물이 없는 DMEM과 KSFM의 50:50 혼합물)에서 배양하였다. 적응용 배지를 수집하고, 4℃에서 2시간 동안 100,000 xg로 초원심분리하여 분비된 소포 (예: 미세소포, 엑소솜)을 펠렛화시켰다. 총 RNA를 생성된 펠렛으로부터 추출하고, 실시간 RT-PCT (Rat MicroRNA Genome V2.0 PCR Array; Qiagen #MAR-100A)로 공지된 microRNA 종을 검정하였다. 하기 miRNA가 검출가능하였다.
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Figure 112012102755333-pct00017
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실시예 13 - 생물활성 신장 세포로부터 유래된 측분비 인자
본 연구에서, 본 발명자들은 생물활성 신장 세포가 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1)과 같은 매개자를 통해 섬유증을 조절할 수 있는 잠재적인 측분비 기작(들)을 조사하기 위해 시험관내 세포-기반 검정을 이용하였다.
재료 및 방법: 적응용 배지를 혈청- 및 보충물-비함유 조건 하에 생물활성 신장 세포의 래트 및 인간 배양물 [참조: Aboushwareb et al ., World J Urol 26, 295, 2008; Presnell et al ., 2010 supra]로부터 수집하고, 시험관내 검정에 사용하였다. 혈관사이 세포는 손상되거나 병에 걸린 신장에서 PAI-1 생성의 공급원이므로 [참조: Rerolle et al ., 신장 Int 58, 1841, 2000], 시판되는 래트- 및 인간-유래된 혈관사이 세포를 시험관내 검정에서 숙주-반응 조직의 대용물로 사용하였다. PAI-1 유전자 및 단백질 발현을 각각 정량 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 검정하였다. 세포에 의해 배양 배지로 방출되는 소포 입자 (예를 들어, 엑소솜)를 고속 원심분리로 수집하고 [참조: Wang et al ., Nuc Acids Res 2010, 1-12 doi:10.1093/nar/gkq601, July 7, 2010], 총 RNA를 TRIzol 시약 (Invirogen)을 사용하여 펠렛으로부터 추출하였다. 소포의 RNA 내용물을 공지된 microRNA 서열의 PCR-기반 어레이 (Qiagen)를 사용하여 스크리닝하였다.
결과: 생물활성 신장 세포 배양물로부터의 적응용 배지는 혈관사이 세포에서 PAI-1 정상 상태 단백질 수준의 TGFβ1-유도된 증가를 약화시켰으나, 정상 상태 mRNA 수준에는 영향을 끼치지 않았으며, 이러한 관측은 microRNA가 표적 유전자를 조절하는 기작과 일치한다. microRNA가 세포외 소포 트래피킹 (trafficking)을 통해 세포 사이에 전달될 수 있다는 가설에 기초하여 [참조: Wang et al ., supra 2010], 본 발명자들은 microRNA에 대해 적응용 배지를 분석하고, PAI-1의 추정적 억제제인 microRNA 30b-5p (miR-30b-5p)의 존재를 확인하였다.
본원에 제시되는 자료는 생물활성 신장 세포가 엑소솜을 통한 혈관사이 세포 표적을 위해 miR-30b-5p의 세포-대-세포 전달을 통해 직접적으로 섬유증을 조절할 수 있다는 것을 제시한다. 혈관사이 세포에 의한 miR-30b-5p 흡수의 결과로서, 궁극적으로 사구체 공간 내 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 수 있는 신장 조직에서의 반응인, 정상 상태 PAI-1 단백질 수준의 TGFβ1-유도된 증가가 약화된다. PAI-1이 실제로 miR-30b-5p의 직접적 표적물인지를 확인하는 작업이 진행중이다.
도 14A-B는 배양 배지 중 TGFβ1의 첨가 (+) 또는 부재(-) 하에 대조군 (CTRL) 또는 생물활성 신장 세포 적응용 배지 (CM)에서 24시간 동안 배양된 사람 혈관사이 세포에서의 PAI-1 및 α-액틴 (대조군) 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. CTRL 배양에서, TGFβ1은 PAI-1 단백질 발현을 증가시켰다. CM 배양에서, TGFβ1-유도된 반응이 약화되었다.
PAI-1에 대한 추정의 억제제일 수 있는 microRNA에 대해 분비되는 소포를 분석하였다. 사람 및 래트 생물활성 신장 세포 CM으로부터 분비되는 소포를 고속 원심분리로 수집하고, 공지된 서열의 PCR-기반 어레이를 사용하여 microRNA에 대해 검정하였다. PAI-1 (6)에 대한 추정의 조절자인 miR-449a가 확인되었다. HRMC를 miR-449a로 또는 없이 (CTRL) 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨 지 24시간 후, 세포를 추가의 24시간 동안 5 ng/ml TGFb1에 노출 (+) 또는 비노출 (-)시켰다.
도 16A는 총 단백질이 제조되고 PAI-1 및 b액틴에 대해 검정되는 웨스턴 블롯을 나타낸다. miR-449a는 정상 상태 PAI-1 단백질 수준을 감소시켰으며 (레인 1 및 3을 비교), 또한 유도된 PAI-1 단백질 수준이 miR-449a 트랜스펙션된 배양물에서 낮았다 (레인 2 및 4를 비교). 상기 자료는 분비된 소포가 miR-449a를 포함하고 miR-449a의 혈관사이 세포로의 흡수가 PAI-1 발현을 감소시킨다는 결론을 지지한다.
도 16B는, PCR-기반 어레이에서도 확인되고 예측 알로리즘 (https://mirbase.org - miRBase는 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지한다)에 기초한 PAI-1의 추정적 조절자인, microRNA인 miR-30b-5p를 도시한다.
사구체에서의 PAI-1 단백질 수준을 5/6 신장 절제에 의해 유도된 CKD를 생물활성 신장 세포로 처리한 후 생체내에서 조사하였다.
도 17A-C는 일측 신장 절제를 겪은 루이스 래트 신장 (A), 5/6 신장 절제를 겪은 루이스 래트 신장 (B) 또는 생물활성 신장 세포의 신장내 전달을 갖는 5/6 신장 절제를 겪은 루이스 래트 신장 (C)에서의 PAI-1 (A-C)의 대표적인 면역조직화학 영상이다. 5/6 신장 절제 시술 (B) 결과로서의 사구체에서의 PAI-1 축적 (화살표)이 처리 (C)에 의해 감소되었다.
별도의 연구에서, qRT-PCR을 부검시 수거된 신장 조직에 대해 수행하였으며, 상대적 유전자 발현값을 조사일에 대해 플로팅하였다.
도 17D는 5/6 신장 절제된 래트 (적색 네모)가 생물활성 신장 세포 (청색 다이아몬드) 및 모의-시술된 대조군 (녹색 세모)으로 처리된 래트에 비해 더욱 풍부한 PAI-1 발현을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 17E는 처리 후 3개월 및 6개월에 채취한 신장 시료에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 5/6 신장 절제된 래트 (Nx)의 처리된 조직 (Nx+Tx)은 PAI-1 및 피브로넥틴 (FN) 단백질 축적이 감소되었다 [참조: Kelley et al ., 2010 supra].
상기 자료는 사구체에서의 생체내 PAI-1 단백질 수준이 5/6 신장 절제에 의해 유도된 CKD를 생물활성 신장 세포로 처리한 후 감소된다는 것을 지지한다.
종합하면, 실시예 12 및 13은, 생물활성 신장 세포의 신장내 전달이 신장 기능을 증진시키는 하나의 기작이 내재적 신장 세포에서 섬유증 경로를 조절하는 성분의 세포-세포 전달을 통해 이루어질 수 있다는 것을 지지한다.
실시예 14 - 생물활성 신장 세포로부터의 분비 인자가 NF κB 시그널링 경로를 약화시킨다
본 연구에서 본 발명자들은 5/6 신장 절제 모델의 NKA-매개된 질환 진행 약화에서 NFκB 경로의 역할을 조사하고, NFκB 활성화의 직접적 조절을 통한 재생 결과에 기여할 수 있는 생물활성 신장 세포의 특성을 확인하였다. 도 17G는 TNFα에 의한 NFκB 경로의 표준 활성화를 도시한다.
재료 및 방법: PBS 중의 B2 + B4로 처리하기 6주 전에 2-단계 5/6 신장 절제 시술을 받은 루이스 래트로부터 잔류 신장을 수거하였다 (NKA 원형). NKA-처리된 (TX) 또는 비처리된 (UNTX) 조직을 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯 분석 및 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)으로 NFκB 활성화를 검정하였다. 혈청- 및 보충물-비함유 배지에서 성장된 생체외 NKA 세포 배양물로부터 수집된 적응용 배지 (CM)를 시험관내 기능 검정에 사용하였다. 인간 근위 세뇨관 세포주 (HK-2)를 분자 및 면역형광-기반 검정 판독을 위한 표적 세포 유형으로 사용하였다. 세포에 의해 배양 배지로 분비되는 소포 입자 (엑소솜)을 고속 원심분리로 수집하였다. 엑소솜으로부터 분리되는 총 RNA를 공지된 microRNA 서열의 PCR-기반 어레이 (Qiagen)를 사용하여 스크리닝하였다.
결과: NFκB 아단위인 RelA/p65의 핵 국소화가 5/6 신장 절제된 래트로부터의 잔존 신장에서 관측되었으며, 이는 UNTX 조직에서 염증 경로의 활성화를 제시한다. RT-PCR에 의한 TX 조직과의 예비적 비교는 RelA 유전자 발현의 감소를 나타내었으며, 이는 NKA 처리가 RelA/p65 발현 억제를 통해 NFκB 경로 활성화에 영향을 줄 수 있다는 것을 제시한다. 이러한 가설은, 종양 괴사 인자-α (TNFα)에 대한 반응에서 나타난 것과 비교하여 CM-노출된 HK-2 세포에서 RelA/p65의 핵 국소화가 감소하는 것으로 입증되는 바와 같이 (도 17F), CM이 시험관내에서의 TNFα-유도된 NFκB 활성화를 약화시킨다는 관측에 의해 지지된다. NKA 엑소솜 microRNA의 진행식 RT-PCR (ongoing RT-PCR) 분석은 NFκB 경로에 영향을 끼치는 것으로 공지된 서열이 존재하는 지의 여부를 조사한다.
도 17F는 NKA CM에 대한 2시간 노출이 면역형광 검정에서 TNFα로 전처리된 대조군 배양물에서 관측되는 NFκB p65의 핵 국소화와 비교하여 HK-2에서 NFκB p65 (녹색)의 핵 국소화를 감소시킨다는 것을 나타낸다. HK-2에서, NFκB p65 (녹색)은 TNFα (대조군 배지)에 30분 노출 후 핵으로 국소화된다. 그러나, TNFα 첨가 2시간 전 NKA 적응용 배지로 HK-2 세포를 전처리함으로써 NFκB p65 핵 국소화 반응이 약화되었다. 핵은 DAPI (청색)으로 염색되고, 필라멘트형 액틴은 알렉사594 (Alexa594)-팔로이딘 (적색)으로 염색되며 NFκB 핵 국소화의 건장함을 정량적으로 평가하는 것을 돕는다 (하부 열의 합쳐진 패널 중 TNFα-처리된 대조군 세포에서 약간 감소된 팔로이딘 경계를 주목). 대조염색은 합쳐진 영상에서 NFkB 국소화에 대한 참조를 제공한다.
루이스 래트의 신장 조직 중의 NFkB p65 아단위에 대한 면역화학염색은, 5/6 신장 절제에 의해 개시되는 진행성 CKD를 갖는 동물 (패널 B)이 대조군 동물에서 일측 신장 절제에 의해 개시되는 비-진행성 신부전 동물 (패널 A)에 비해, 특히 세뇨관 상피 세포 (검은색 화살촉)에서 NFkB p65 아단위의 더욱 풍부한 핵 국소화를 갖는다는 것을 보인다. 확대율: 200X.
패널 C: 5/6 신장 절제를 겪은 루이스 래트 신장 조직의 세포질 ('C') 및 핵 ('N') 단백질 추출물 중 NFκB p65에 대한 웨스턴 블롯 분석. g튜불린 수준 (로딩 대조군)이 비교적 일정한 1주 및 13주째를 비교시, 핵 NFkB p65가 시간이 경과함에 따라 증가하였으며, 이는 면역조직화학 결과와 일치한다.
패널 D: 핵 추출물에 대한 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)은 5/6 신장 절제 후 핵으로 국소화되는 NFkB 가 DNA 결합에 대해 활성화된다는 것을 확인시켜 준다. 레인은 각각의 시점에서 2마리의 동물로부터 제조된 핵 추출물을 나타낸다.
NFkB 경로는 만성 신장 질환의 5/6 신장 절제 모델에서 서서히 활성화된다. 루이스 래트의 신장 조직 중 NFkB p65 아단위에 대한 면역조직화학을 수행하였다.
도 18A-D는 5/6 신장 절제에 의해 개시되는 진행성 CKD를 갖는 동물 (패널 B)이 대조군 동물에서 일측 신장 절제에 의해 개시되는 비-진행성 신부전 동물 (패널 A)에 비해, 특히 세뇨관 상피 세포 (검은색 화살촉)에서 NFkB p65 아단위의 더욱 풍부한 핵 국소화를 갖는다는 것을 도시한다. 조직은 신장 절제 후 6주에 회수하였다. 확대율: 200X.
18C는 5/6 신장 절제를 겪은 루이스 래트 신장 조직의 세포질 ('C') 및 핵 ('N') 단백질 추출물 중 NFkB p65에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. g튜불린 수준 (로딩 대조군)이 비교적 일정한 1주 및 13주째를 비교시, 핵 NFkB p65가 시간이 경과함에 따라 증가하였으며, 이는 면역조직화학 결과와 일치한다.
도 18D는 핵 추출물에 대한 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)를 나타내며, 5/6 신장 절제 후 핵으로 국소화되는 NFkB 가 DNA 결합에 대해 활성화된다는 것을 확인시켜 준다. 레인은 각각의 시점에서 2마리의 동물로부터 제조된 핵 추출물을 나타낸다. 1 mg의 핵 단백질을 5 ng의 NFkB DNA 결합 부위와 함께 인큐베이션하고, 6% DNA 지연 겔 상에서 전기영동한 후, 에티듐 브로마이드로 염색하였다.
NKA 세포의 신장내 전달은 NFkB 핵 국소화를 감소시킨다. 다수의 규정된 신장 세포 아군을 분리하고, CKD의 5/6 신자 절제 모델에서 신장 기능을 개선하는 생물활성에 대해 생체내에서 검정하였다 [참조: Presnell et al., 2010 supra]. NKA 세포는 생물활성을 나타내나, 다른 아군은 그렇지 아니하였다 [참조: Kelley et al., 2010 supra].
도 18E는 NKA (A) 또는 비-생물활성 신장 세포 (B)가 신장내 주사된 확립된 CKD를 갖는 루이스 래트를 나타낸다. NKA (A) 또는 비-생물활성 신장 세포 (B)가 신장내 주사된 확립된 CKD를 갖는 루이스 래트. 처리 후 6개월에, 조직을 수거하고, NFkB p65 아단위에 대해 면역조직화학으로 검정하였다. NKA-처리된 동물로부터의 조직은 비-생물활성 신장 세포로 처리된 동물로부터의 조직과 비교하여, 특히 근위 세뇨관에서 NFkB p65의 약한 핵 국소화를 나타내었으며, 이는 NKA 처리가 생체내에서 NFkB 경로 활성을 약화시키는데 관여한다는 것을 제시한다.
인간 및 래트 NKA 적응용 배지로부터 고속 원심분리에 의해 분리되는 분비된 소포의 microRNA 내용물을 공지된 서열의 PCR-기반 에레이를 사용하여 분석함으로써, 문헌 [참조: Marquez RT et al ., (2010) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 298:G535; Taganov KD et al ., (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:12481] 또는 예측 알고리즘 (https://mirbase.org - miRBase는 맨체스터 대학의 생명과학부에서 관리하고 유지한다)에 기초하여, NFkB를 통해 면역 반응에 영향을 끼칠 수 있는 수개의 microRNA 종을 확인하였다.
Figure 112012102755333-pct00019
생체내 및 시험관내 발견은 생물활성 신장 세포 (NKA)가 NFκB 활성화에 의해 영향을 받는 면역 반응 경로와 같은 면역 반응 경로를 조절함으로써 만성-질환 신장에서 신장 기능을 개선시킬 수 있는 방법에 대한 통찰을 제공한다. 활성화된 NFkB (p65 핵 국소화, 특히 근위 세뇨관 세포에서의 p65 핵 국소화)는 5/6 신장 절제 설치류 모델에서 만성 신장 질환의 확립과 연관이 있으며, NKA 처리에 의해 약화되었다. 근위 세뇨관 세포 (HK-2)의 NKA 적응용 배지에 대한 시험관내 반응은 NKA 처리에 반응하는 NFkB 핵 국소화의 생체내 약화를 모방한다. NFkB 활성화의 세포-세포 억제에 대한 추정의 매개자 (microRNA)가 NKA 적응용 배지에서 확인되었다. 종합하면, 이들 자료는 생물활성 신장 세포의 신장내 전달이 신장 기능을 증진시키는 하나의 기작이 내재적 신장 세포에서 면역 반응을 조절하는 성분의 세포-세포 전달을 통해 이루어질 수 있다는 것을 지지한다.
실시예 15 - NKA 구조물의 기능 평가
젤라틴 또는 HA-기반 하이드로겔에 씨딩된 신장 세포군은 생존가능하였으며, 전사체 (transcriptomic) 검정, 단백질체 (proteomic) 검정, 분비체 (secretomic) 검정 및 공초점 면역형광 검정으로 측정시 3일의 시험관내 성숙 동안 세뇨관 상피 기능 표현형을 유지하였다. NKA 구조물이 질환 상태에 영향을 줄 수 있었던 가능한 기작을 조사하기 위해서, CKD 진행과 관련된 세뇨관-간질 섬유증에 대한 TGF-β 시그널링 경로에 대한 적응용 배지의 효과를 평가하였다. 적응용 배지는 인간 근위 세뇨관 세포주 (HK2)에서 시험관내에서의 TGF-β-유도된 상피-중간엽 이행 (EMT)을 약화시키는 것으로 관측되었다.
재료 및 방법.
생체물질. 생체물질을 비드 (균질, 구형 형상) 또는 입자 (톱니모양 가장자리를 갖는 이질군)로 제조하였다. 퍼셀 바이올리티카 (Percell Biolytica, Åstrorp, Sweden)에 의해 제작된 젤라틴 비드 (컬티스퍼 S 및 컬티스퍼 GL)를 각각 시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)으로부터 구입하였다. 가교된 HA 및 HA/젤라틴 [글리칸 바이오시스템스 (Glycosan BioSystems, Salt Lake City, UT)로부터의 HyStem™ 및 Extracel™] 입자를 제작자의 교시에 따라 동결건조된 스폰지로부터 형성하였다. 젤라틴 (Sigma) 입자글 가교된 동결건조 스폰지로부터 형성하였다.
PCL을 시그마-알드리히 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. PLGA 50:50을 두렉트 코포레이션 (Durect Corp., Pelham, AL)로부터 구입하였다. PCL 및 PLGA 비드를 변형된 이중 에멀젼 (W/O/W) 용매 추출 방법을 이용하여 제조하였다. PLGA 입자를 용매 캐스팅 포로겐 침출 기술 (solvent casting porogen leaching technique)을 이용하여 제조하였다. 모든 비드 및 입자는 건조 상태에서 측정시 65 내지 355 마이크론이었다.
세포 분리, 제조 및 배양. 사체의 인간 신장을 연구 목적용의 인간 조직 사용을 규제하는 모든 NIH 지침에 따라 국립 질병 연구소 (National Disease Research Institute: NDRI)를 통해 입수하였다. 개 신장은 계약 연구 기관 (Integra)로부터 구입하였다. 래트 신장 (21일령 루이스)은 찰스 리버 랩 (Charles River Labs, MI)으로부터 얻었다. 일차 신장 세포군 (UNFX) 및 비손상 래트, 개 및 인간 신장으로부터의 규정된 아군 (B2)의 제조는 이미 문헌 [참조: Aboushwareb et al ., World J Urol 26(4):295-300; 2008; Kelley et al., supra 2010; Presnell et al ., WO/2010/056328]에 기재되어 있다. 간단히, 신장 조직을 4.0 단위/mL 디스파제 (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver BC, Canada) 및 300 단위/ml 콜라게나제 IV (Worthington Biochemical, Lakewood NJ)를 포함하는 완충액 중에서 효소적으로 분해시킨 후, 적혈구 세포 및 파편을 15% 요오딕산올 (Optiprep®, Axis Shield, Norton, MA)을 통해 원심분리시켜 제거함으로써 UNFX를 수득하였다. UNFX 세포를 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플레이트 (NUNC, Rochester NY) 상에 씨딩하고, 5% FBS, 2.5 μg EGF, 25 mg BPE, 1X ITS (인슐린/트랜스페린/나트륨 셀레나이트 배지 보충물) 및 항생제/항진균제 (모두 인비트로겐 (Invitrogen, Carlsbad CA)으로부터 구입)를 포함하는 높은 글루코즈 DMEM:각질세포 혈청 비함유 배지 (KSFM)의 1:1 혼합물인 50:50 배지에서 배양하였다. B2 세포를 특히 설치류 (16%, 13%, 11% 및 7%), 소 (16%, 11%, 10% 및 7%) 또는 인간 (16%, 11%, 9% 및 7%)을 위해 층을 이룬 4-단계 요오딕산올 (OptiPrep; 비보충된 KSFM 중 60% w/v) 밀도 구배를 통해 원심분리함으로써 UNFX 배양물로부터 분리하였다 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328; Kelley et al., supra 2010]. 구배물을 (브레이크 없이) 실온에서 20분 동안 800 xg에서 원심분리하였다. 관심 밴드를 피펫으로 꺼내고, 멸균 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 2회 세척하였다.
세포/생체물질 복합물 ( NKA 구조물). 생체물질에 대한 세포 기능성을 시험관내에서 분석하기 위해, (상술된 바와 같이 제조된) 생체물질의 균일층을 6-웰의 약한 부착 플레이트 (Costar #3471, Corning)의 하나의 웰 상에 만들었다. 인간 UNFX 또는 B2 세포 (2.5 x 105개/웰)를 직접적으로 생체물질 상에 씨딩하였다. 개 세포의 생체물질에 대한 부착을 조사하기 위해, 2.5 x 106개의 UNFX 세포를 비-부착 24-웰 플레이트 (Costar #3473, Corning))에서 50 μl의 포장된 용적의 생체물질과 함께 씨딩하였다. 흔들리는 플랫폼 상에서의 4시간 후, 개 NKA 구조물을 5% CO2 인큐베이터 중 37℃에서 밤새 성숙시켰다. 다음날, 제작장의 지시에 따라 생/사 염색 검정 키트 (Invitrogen)을 사용하여 생/사 염색을 수행하였다. 래트 NKA 구조물을 1 RPM의 회전 속도를 갖는 회전 병 기구 상의 60 cc 주사기에서 제조하였다.
후술되는 전사체, 분비체 및 단백질체 분석을 위해, NKA 구조물을 3일 동안 성숙시켰다. 이어서, 세포를 전사체 또는 단백질체 분석을 위해 수거하고, 적응용 배지를 전사체 프로파일링을 위해 수집하였다.
세뇨관 세포 관련된 효소 활성의 기능 분석. 24-웰 플레이트 내의 개 NKA 구조물 (10 μl의 느슨하게 포장된 용적)을 이전에 공개된 방법 [참조: Tate et al., Methods Enzymol 113:400-419; 1985]으로부터 개조된 루이신 아미노펩티다제 (LAP) 활성 검정을 이용하여 평가하였다. 간단히, PBS 중의 0.5 ml의 0.3mM L-루이신 p-니트로아날라이드 (Sigma)를 실온에서 1시간 동안 NKA 구조물에 가하였다. 웰을 이중으로 샘플링하고, 405 nm에서의 흡광도를 LAP 활성의 수단으로서 기록하였다. LLC-PK1 세포 용해물 (American Type Culture Collection 또는 ATCC)을 양성 대조군으로 사용하였다.
전사체 프로파일링 ( transcriptomic profiling ). RNeasy 플러스 미니 키트 (Qiagen, CA)를 사용하여 폴리-아데닐화된 RNA를 추출하였다. 농도 및 온전성을 UV 분광광도법으로 측정하였다. cDNA를 슈퍼스크립트 VILO cDNA 합성 키트 (Invitrogen)를 사용하여 1.4 μg의 분리된 RNA로부터 생성하였다. 표적 전사체의 발현 수준을 시판 프라이머 및 프로브 (표 15.1) 및 ABI-프리즘 7300 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, CA)을 사용하여 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)로 조사하였다. TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 (ABI, Cat# 4369016)를 사용하여 증폭을 수행하고, TATA 박스 결합 단백질 유전자 (TBP)를 내생성 대조군으로 사용하였다. 각각의 반응물은 10 μl 마스터 믹스 (2X), 1 μl 프라이머 및 프로브 (20X) 및 9 μl cDNA로 이루어진다. 시료는 삼중으로 진행하였다.
<표 15.1>
Figure 112012102755333-pct00020
분비체 프로파일링 ( Secretomic profiling ). 인간 NKA 구조물로부터의 적응용 배지를 수집하고, -80℃에서 냉동시켰다. 시료를 바이오마커 농도 정량화에 대해 평가하였다. 적응용 배지 중의 소정의 바이오마커의 농도에 대한 결과를 대조군 배양물(생체물질 없는 2D 배양물)로부터의 적응용 배지 중 동일한 바이오마커의 농도에 대해 표준화하고, 단위 없는 비율로 나타내었다.
단백질체 프로파일링 ( Proteomic profiling ). 3개의 독립적 복사체로부터의 단백질을 세포/생체물질 복합물로부터 추출하고, 분석을 위해 2D 겔 전기영동으로 푸우링하였다. 모든 시약은 인비트로겐 (Invitrogen)의 것이다. pH 4-7 ZOOM IEF 스트립 (Cat# ZM0012)에 200 μl의 ZOOM 2D 단백질 가용화제 #1 (Cat# ZS10001), ZOOM 캐리어 양성전해질 pH 4-7 (Cat# ZM0022) 및 2M DTT (Cat# 15508-013)에서 재부유시킨 30μg의 단백질을 가함으로써 등전점 포커싱 (IEF)을 수행하였다. 500V에서 18시간 동안 전기영동한 후, IEF 스트립을 SDS-PAGE 분리를 위해 NuPAGE Novex 4-12% 비스-트리스 ZOOM IPG 웰 겔 (Cat# NP0330BOX) 상에 로딩하고, MES 완충액 (Cat# NP0002) 중 200V에서 45분 동안 전기영동하였다. 단백질을 제작자의 교시에 따라 SYPRO 루비 단백질 겔 염색 (Cat# S-12000)을 이용하여 가시화하였다.
공초점 현미경. 인간 또는 래트 UNFX 또는 B2 세포로부터 제조된 NKA 구조물을 3일 동안 성숙시킨 후, 30분 동안 2% 파라포름알데하이드 중에 고정시켰다. 고정된 NKA 구조물을 차단하고, 실온 (RT)에서 1시간 동안 D-PBS (Invitrogen) + 0.2% 트리톤 X-100 (Sigma) 중의 10% 염소 혈청 (Invitrogen) 중에서 인큐베이션하여 투과성이 되게 하였다. 면역형광을 위해, NKA 구조물을 RT에서 밤새 5 μg/ml의 최종 농도에서 일차 항체 (표 15.2)로 표지하였다. 표지된 NKA 구조물을 2% 염소 혈청/D-PBS + 0/2% 트리톤 X-100으로 2회 세척하고, 5 μg/ml의 염소 또는 토끼 TRITC 컨주게이션된 항-마우스 IgG2A (Invitrogen) 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. DBA (돌리초스 비플로루스 아글루티닌: Dolichos biflorus agglutinin)로 이중 표지하기 위해, NKA 구조물 후보물을 RT에서 2시간 동안 2% 염소 혈청/D-PBS + 0.2% 트리톤 X-100 중에 2 mg/ml로 희석된 FITC 컨주게이션된 DBA (Vector Labs)와 함께 추가로 인큐베이션하였다.
<표 15.2>
Figure 112012102755333-pct00021
시료를 D-PBS로 2회 세척하고, LSM 영상 소프트웨어 (Zeiss)로 움직이는 차이스 (Zeiss) LSM510 레이저 스캐닝 공초점 시스템 (Cellular Imaging Core, Wake Forest Baptist Medical Center)을 사용하거나 패스웨이 855 공초점 현미경 (Pathway 855 confocal microscope, BD Biosciences)을 사용하여 광학적으로 절단하였다.
HK2 세포에서 TGF -β 매개된 EMT 의 분석. HK2 세포 (ATCC)를 피브리넥틴 또는 콜라겐 (IV) 코팅된 배양 접시 (BD Biosciences) 중 50:50 배지에서 배양하였다. EMT 검정을 위해, HK2 세포를 24-웰 콜라겐 (IV) 코팅 플레이트에 50:50 배지 또는 2차원 (2D) 인간 UNFX 배양물 또는 배지 수집 전 3일 동안 성숙된 인간 UNFX로 제조된 NKA 구조물로부터 수집된 적응용 배지와 함께 70 내지 80% 컨플루언시로 씨딩하였다. EMT 검정을 위해 세포로부터 RNA를 분리하기 3일 전에 배양 배지에 10 ng/ml의 TGF-β를 가함으로써 TGF-β 유도를 개시하였다. EMT를 3일의 인큐베이션 기간 말기에 E-카드헤린 (상피 마커) 및 칼포닌 (중간엽 마커)의 상대적 발현을 분석함으로서 qRT-PCR로 모니터링하였다. RNA를 상술된 바와 같이 TaqMan qRT-PCR 분석을 위해 수거된 HK2 세포로부터 제조하였다. 각각의 시료에 대한 변수가 동일하다는 가정하에 표준 투 테일드 스튜던츠 t-시험 (standard two tailed Student's t-test)을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 95%의 신뢰 구간 (p-값 < 0.05) 및 99% (p-값 < 0.01)을 이용하여 통계학적 유의성을 측정하였다.
비세포 생체물질 및 NKA 구조물의 생체내 이식. 루이스 래트 (6주 내지 8주령)를 챨스 리버 (Charles River. Kalamazoo, MI)로부터 구입하였다. 모든 실험 절차는 PHS 하에 카롤리나스 메디칼 센터 (Carolinas Medical Center)의 IACUC 지침에 따라 수행하였다. 이소플루란 마취 하에, 암컷 루이스 래트 (약 2 내지 3월령)를 중심선 절개로 절개하여 좌측 신장을 노출시켰다. 35 μl의 포장된 생체물질 (비세포 생체물질 또는 NKA 구조물)을 신장 실질로 마이크로주사하여 도입하였다. 2가지의 주사 궤적을 이용하였다: (i) 각각의 극으로부터 피질을 향해 주사 (피질 주사로도 언급됨), 또는 (ii) 신장 중심선으로부터 골반으로 향해 주사 (수질 주사로도 언급됨). 래트를 주사 후 1주, 4주 또는 8주에 희생시켰다. 어떠한 조기 죽음도 발생하지 않았다. 비세포 이식 조사를 위한 연구 고안이 표 15.3에 나타나 있다 (ND = 비수행).
신장 조직학. 대표적인 신장 시료를 수집하고, 24시간 동안 10% 완충 포르말린에 두었다. 절편을 압상 경사의 에탄올에서 탈수시키고, 파라핀에 포매시켰다. 절편 (5 μm)을 자르고, 하전된 슬라이드에 올려놓은 후, 표준 염색 프로토콜 [참조: Prophet et al., Armed Forces Institute of Pathology: Laboratory methods in histotechnology. Washington, DC: American Registry of Pathology; 1992]에 따라 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), 매슨의 트리크롬 및 과요오드산 쉬프 (PAS) 염색을 수행하였다. 디지탈 마이크로사진을 디지탈 조준기 (DA-U1) 카메라가 장착된 니콘 이클립스 50i 현미경 (Nikon Eclipse 50i microscope)을 사용하여 총 x40, x100 및 x400 배율로 포착하였다. 신장 형태학 변화는 일반적으로 사용되는 [참조: Shackelford et al., Toxicol Pathol 30(1):93-96; 2002] 경중도 등급 계획 (등급 1, 2, 3, 4)에 의해 평가되었으며, 상기 등급에 대해 관측된 사구체경화증, 세뇨관 비대 및 확장, 세뇨관 캐스트, 및 간질 섬유증, 및 염증의 정도를 기술하기 위해 설명적 용어 (최소, 경미, 중등도, 현저/심각)가 적용된다.
<표 15.3>
Figure 112012102755333-pct00022
결과
신장 실질로의 생체물질 주사에 대한 포유동물 신장 조직의 반응. 생체물질을 건강한 래트 신장으로의 직접 주사에 의한 신장 세포/생체물질 복합물에서의 잠재적 이용에 대해 분석하였다 (표 15.3). 조직 반응을 주사후 1주 및 4주에 조직병리학 변수 (염증, 섬유증, 괴사, 석회화/무기질침착) 및 생물적합성 변수 (생체물질 분해, 신생-혈관화 및 신생-조직 형성)의 정도를 측정하여 평가하였다.
도 19A-B는 이식후 1주에 생체물질을 생체내 평가한 것을 도시한다. 트리크롬 X10: 생체물질 응집체를 보이는 신장 단면의 저배율 영상. 트리크롬 X40: 생체물질 응집체의 클로즈-업. H&E X400: 세포/조직 침윤 정도를 평가하기 위한 생체물질 응집체의 고배율 영상. 각각의 신장이 재료 및 방법에서 상술된 바와 같이 2개의 위치에서 주사되었다. 이식후 1주에, 시험된 각각의 생체물질에 의해 유도되는 숙주 조직 반응은 전반적으로 유사하였다; 그러나, 젤라틴 하이드로겔은 덜 강한 조직병리학적 반응 및 더 큰 생체적합한 반응을 보였다.
도 19C는 이식후 4주에 생체물질을 생체내 평가한 것을 나타낸다. 이식후 4주에, HA 또는 젤라틴 입자가 주사된 조직에서의 조직병리학적 변수의 경중도는 이식후 1주와 비교하여 정성적으로 감소되었다. 젤라틴 입자는 거의 완전히 재흡수되고, HA 입자가 주사된 조직에서보다 덜 큰 세포 반응이 관측되었다. 생체물질이 수질 주사 궤적을 통해 주사되는 대부분의 경우 (예를 들어, 수질/골반으로 보다 깊숙이 주사되는 경우)에서, 수신증, 더욱 높은 중증도의 염증 반응 및 경색을 이끄는 신장 세동맥 및 모세관 마이크로-폐색을 포함한 바람직하지 않은 결과가 관측되었다 (자료 제시되지 않음).
생체물질을 갖는 치료학적으로 관련된 신장 세포군의 기능적 표현형 평가. 신장 실질로의 직접 주사 후 만성 신장 질환의 설치류 모델에서 생존을 연장시키고 신장 기능을 증가시킨 치료학적 관련 신장 세포군 (UNFX)이 특징지어지고 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328; Kelley et al., supra 2010], 이들의 분리 방법, 특성화 및 증대가 개발되고, 다수의 종에 걸쳐 설명되었다 [참조: Presnell et al., 2010 supra]. UNFX 세포가 주로 세뇨관 세포에 부착하고 생존가능하며 이에 보유되는 지의 여부를 평가하기 위해서, NKA 구조물로 삽입시의 상피 표현형, 전사체, 분비체, 단백질체 및 공초점 면역형광 현미경 검사 분석을 UNFX 세포 및 다양한 생체물질로부터 생성되는 NKA 구조물 상에서 수행하였다.
부착 및 생존력. 개-유도된 UNFX 세포를 기술되는 바와 같이 젤라틴 비드, PCL 비드, PLGA 비드, HA 입자 및 HA/젤라틴 입자에 씨딩하였다 (3개의 NKA 구조물/생체물질). 세포 분포 및 생존력을 생/사 염색에 의해 씨딩한지 1일 후 평가하였다.
도 20A-D는 개 UNFX 세포로 씨딩된 NKA 구조물의 생/사 염색을 나타낸다 (A = 젤라틴 비드; B = PCL 비드; C = HA/젤라틴 입자; D = HA 입자). 녹색은 살아있는 세포를 나타내고; 적색은 죽은 세포를 나타낸다. (A) 젤라틴 비드; (B) PCL 비드; (C) HA/젤라틴 입자; 및 (D) HA 입자. 생존 세포를 모든 하이드로겔-기반 NKA 구조물에서 관측할 수 있었다.
UNFX 세포는 천연적으로 유도된 하이드로겔-기반 생체물질, 예를 들어 젤라틴 비드 및 HA/젤라틴 입자에 강하게 부착하였으나 (A, D에서의 검은색 화살표), 합성 PCL (B) 또는 PLGA 비드 (도시되지 않음)에 대해서는 최소한의 부착을 나타내었다. 세포는 HA 입자 (C)에는 부착하지 않았으나, 생물반응의 징후 (즉, 구상체 형성)는 나타내었다. 씨딩된 UNFX 세포의 하이드로겔-기반 NKA 구조물 상에서의 기능적 생존력은 루이신 아미노펩티다제, 근위 세뇨관-관련 하이드롤라제에 대해 검정함으로써 확인되었다 (자료 도시되지 않음).
전사체 프로파일링. 하이드로겔-기반 NKA 구조물 내의 인간 UNFX 세포 (3개의 NKA 구조물/생체물질) 및 대응하는 UNFX의 2D 배양물에 대한 유전자 발현 프로파일을 정량적 전사체 분석으로 비교하였다.
도 20E-G는 NKA 구조물의 전사체적 프로파일링을 도시한다. TC: 2D로 배양된 일차 인간 UNFX 세포. 젤라틴: 인간 UNFX 세포 및 젤라틴 하이드로겔로 구성된 NKA 구조물. HA-Gel: 인간 UNFX 세포 및 HA/젤라틴 입자로 구성된 NKA 구조물. qRT-PCR 자료는 그래프 및 표 형식을 제시된다. 조사된 전사체는 4개의 주요 범주에 속하였다: (i) 세뇨관 : 아쿠아포린 2(AQ2), E-카드헤린 (ECAD), 에리트로포이에틴 (EPO), N-카드헤린 (NCAD), 시토크롬 P450, 패밀리 24, 서브패밀리 A, 폴리펩타이드 1 - aka 비타민 D 24-하이드록실라제 (CYP), 쿠빌린, 네프린; (ii) 중간엽: 칼포닌(CNN1), 평활근 미오신 중쇄 (SMMHC); (iii) 내피: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 혈소판 내피 세포 부착 분자 (PECAM); 및 (iv) 사구체 : 포도신. 종합적으로, 세뇨관 마커 발현은 하이드로겔-기반 NKA 구조물과 2D UNFX 배양물 간에 유사하였다. 마찬가지로, 내피 마커 (VEGF 및 PECAM)도 유사하였다. 이와는 대조적으로, 사구체 마커 포도신은 NKA 구조물 간에 상당한 차이를 나타내었다. HA/젤라틴-기반 NKA 구조물에서의 포도신 수준은 2D UNFX 배양물에서 관측된 것과 대부분 유사하였다. 흥미롭게도, 중간엽 마커 (CNN1 및 SMMHC) 발현은 2D UNFX 배양물에 비해 하이드로겔-기반 NKA 구조물에서 상당히 하향-조절되었으며 (p < 0.05), 이는 UNFX의 섬유모세포 아군이 마찬가지로 신장 배지 제형 중의 하이드로겔-기반 NKA 구조물에서 증식할 수 없다는 것을 제시한다.
분비체 프로파일링. NKA 구조물을 인간 UNFX 및 B2 세포 및 젤라틴 또는 HA/젤라틴 하이드로겔 (1개의 NKA 구조물/생체물질/세포유형 = 총 4개의 NKA 구조물)을 사용하여 제조하였다.
도 21A-B는 NKA 구조물의 분비체 프로파일링을 도시한다. 자료는 3D:2D 비율로 제시된다. NKA 구조물을 재료 및 방법에서 상술된 바와 같이 인간 UNFX 또는 B2 세포 및 젤라틴 (하이드로겔 1) 또는 HA/젤라틴 (하이드로겔 2) 하이드로겔로부터 제조하였다. 분비체 프로파일링을 3일 동안 성숙된 NKA 구조물로부터의 적응용 배지 상에서 수행하고, NKA 구조물 (3차원 또는 3D, 배양) 대 2D 배양물의 분석물 발현 비율 (3D:2D 비율)을 계산함으로써 인간 UNFX 또는 B2 세포의 대응하는 2D 배양물과 비교하였다. UNFX 세포로 씨딩된 3개의 NKA 구조물 각각에 대해, 3D:2D 비율은 1이거나 이에 가까웠으며, 이는 이들 생체물질에 대한 씨딩 과정 및 3일의 성숙이 UNFX 세포의 분비체 프로파일에 대해 영향이 적다는 것을 제시한다. B2 세포로 씨딩된 NKA 구조물에 대해, 1 또는 이에 가까운 3D:2D 비율의 유사한 결과가 관측되었으며, 이는 이들 생체물질에 대한 씨딩 과정 및 3일의 성숙이 치료학적 관련 신장 세포의 분비체 프로파일에 대해 영향이 적다는 추가의 증거를 제공한다.
단백질체 프로파일링. 2D 겔 전기영동으로 전체 세포 단백질을 분리시킴으로써 소정의 세포 또는 조직에 대한 단백질체 프로파일을 제조하였으며, 신장 질환과 연관된 특정 바이오마커를 확인하는데 사용하였다 [참조: Vidal et al., Clin Sci (Lond) 109(5):421-430; 2005].
도 22A-B는 NKA 구조물의 단백질체 프로파일링을 나타낸다. NKA 구조물을 지시되는 바와 같은 인간 UNFX 세포 및 생체물질을 사용하여 제조하였다. 전체 단백질 추출물 중의 단백질을 재료 및 방법에서 상술된 바와 같은 2D 겔 전기영동으로 분리하였다. 이러한 실험에서, 단백질체 프로파일링을 이용하여 NKA 구조물 (젤라틴 또는 HA/젤라틴 하이드로겔-기반, 3개의 NKA 구조물/생체물질) 및 2D 조직 배양물에서의 인간 UNFX 세포의 단백질 발현을 비교하였다. NKA 구조물 또는 UNFX 세포의 2D 배양물로부터 분리된 전체 단백질의 단백질체 프로파일은 본질적으로 동일하였으며, 씨딩 과정 및 이들 생체물질 상에서의 3일 성숙이 UNFX 세포에 의해 발현되는 단백질체에 대해 영향이 적다는 것을 추가로 입증한다.
공초점 현미경. NKA 구조물에서 래트 및 인간 B2 세포 [참조: Presnell et al., 2010 supra]의 세뇨관 상피 표현형 보유를 확립된 바이오마커의 공초점 영상화로 평가하였다; 도 23A-C는 NKA 구조물의 공초점 현미경 검사를 도시한다. NKA 구조물의 공초점 현미경 검사는 인간 (A) 또는 래트 (B, C) B2 세포 및 젤라틴 하이드로겔을 사용하여 결과를 얻었다. (A) E-카드헤린 (적색 - 연속된 백색 화살표), DBA (녹색 - 대시 기호로 된 녹색 화살표) 및 젤라틴 하이드로겔 비드는 DIC 광학으로 알아볼 수 있다. (B) DNA는 DAPI 염색 (청색 - 연속된 백색 화살표) 및 녹색의 하기 마커 각각 (대시 기호로 된 백색 화살표)으로 알아볼 수 있다: IgG 대조군, N-카드헤린, E-카드헤린, 시토케라틴 8/18/19, DBA. (C) 표시되는 바와 같은 마커 및 색상의 이중-표지 영상. 인간 NKA 구조물에서의 E-카드헤린 및 래트 NKA 구조물에서의 E-카드헤린, DBA, N-카드헤린, 시토케라틴 8/18/19, 감마 글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT-1) 및 메갈린. 공초점 영상의 광학 절편법은 씨딩 및 성숙 3일 후 생체물질로의 세포 침윤 정도 평가를 가능하게 한다. 인간 및 래트 NKA 구조물에서의 B2 세포는 다수의 세뇨관 상피 마커 발현을 나타내었다. 광학 절편법은 하이드로겔 구조물의 최소한의 세포 침윤을 나타내었으며, 세포는 일반적으로 생체물질의 표면으로 국한되었다.
NKA 구조물 원형의 이식에 대한 생체내 반응: 신장 실질로의 생체물질의 주사에 대한 생체내 반응 및 상술된 NKA 구조물 내의 UNFX 및 B2 세포의 기능 특성화에 기초하여, 젤라틴 하이드로겔을 선택하여 건강한 루이스 래트의 신장 실질내로의 NKA 구조물 주사에 대한 생체내 반응을 평가하였다. NKA 구조물은 동계 B2 세포로부터 생성하였으며, 이식후 1주, 4주 및 8주에 희생된 2가지 동물에 이식되었다. 신장 조직 절편을 수거하고, 절단하고, 트리크롬, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 과요오드산 쉬프 (PAS)로 염색하는 예정된 부검까지 모든 동물은 생존하였다.
도 24A-B는 이식후 1주 및 4주에 NKA 구조물을 생체내 평가한 것을 나타낸다. 트리크롬 X10: 생체물질 응집체를 보이는 신장 단면의 저배율 영상. 트리크롬 X40: 생체물질 응집체의 클로즈-업. H&E/PAS X400: 세포/조직 침윤 정도를 평가하기 위한 생체물질 응집체의 고배율 영상. 각각의 신장이 재료 및 방법에서 상술된 바와 같이 2개의 위치에서 주사되었다.
도 24A는 이식후 1주에 NKA 구조물을 생체내 평가한 것을 나타낸다. 이식후 1주에 젤라틴 비드는 구형인 다공성 물질의 국소 응집체 (좌측 패널, 동그라미 친 부분)로서 존재하고, 호염기 염색시, 두드러진 섬유-혈관 조직 및 포식 및 다핵 대식세포 및 거대 세포에 의해 둘러싸여 있었다. 섬유혈관 조직은 비드 내로 통합되고 신생-혈관 조직 형성을 지시하는 세뇨관 상피 성분을 나타내었다. 또한, 세뇨관 및 혈관사구체 구조가 형태학에 의해 확인되었다 (PAS 패널).
도 24B는 이식후 4주에 NKA 구조물을 생체내 평가한 것을 도시한다. 이식후 4주까지 하이드로겔은 완전히 재흡수되고 공간은 최소한의 섬유증을 갖는 진행성 신장 재생 및 복구에 의해 대체되었다 (4주 트리크롬 패널의 동그라미 친 부분 내의 다수의 기능성 세뇨관을 주목한다).
도 25A-D는 이식후 8주에 NKA 구조물을 생체내 평가한 것을 나타낸다. 신장 단면의 크리크롬 X10 저배율 영상은 생체물질 응집체를 나타낸다. 트리크롬 X40: 생체물질 응집체의 클로즈-업. H&E/PAS X400: 세포/조직 침윤을 평가하기 위한 생체물질 응집체의 고배율 영상. (A) 중등도의 만성 염증 (대식구, 혈장 세포 및 림프구), 두드러진 섬유혈관 반응 (매쓴 트리크롬으로 청색 염색됨 - 검은색 화살표)을 갖는 헤모시데린-적재된 대식구 (주사에 의한 만성 출현)의 적당한 수; (B) 신생-혈관 조직 형성과 일치하는 재생 반응 유도를 나타내는 (A)의 네모 부위의 고배율 영상 (트리크롬 염색됨, x400); (C) 전형의 피질 사구체 형태를 보이는 인접한 (정상) 신장 실질의 대표적 영상 HE, x400); (D) 도 154C와 대비하여 처리 부위에서 관측되는 새로운 사구체 형태를 비교하는 HE 염색된 절편, x400.
도 25A-D는 이식후 8주에 NKA 구조물을 생체내 평가한 것을 나타낸다. 이식후 8주에, 신생-신장 유사 조직 형성의 징후가 관측되었으며, 이는 신장형성시의 초기 사건 유도와 일치한다. 재생 유도 부위 (B, D)를 인접한 피질의 실질 (C)과 비교한 결과, 다수의 S-형 바디 및 새로이 형성된 사구체의 존재가 나타났다.
HK2 세포에서 TGF -β 유도된 EMT 에 대한 NKA 구조물로부터의 적응용 배지의 효과. CKD의 진행 동안 세뇨관-간질 섬유증의 발병은 세뇨관 상피 세포의 TGF-β 매개된 EMT와 연관된다 [참조: Zeisberg et al ., Am J Pathol 160(6):2001-2008; 2002]. 또한, TGF-β 경로의 약화가 진행성 CKD의 설치류 모델에서 생체내에서 관측되었으며, 이때 생존은 연장되고 신장 기능이 UNFX 및 B2 세포로의 처리로 개선되었다 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328]. 인간 근위 세뇨관 세포주 HK2는 소분자 또는 단백질의 TGF-β 유도된 EMT에 대한 자극 또는 억제 효과를 시험하기 위해 시험관내 모델 시스템으로 잘 확립되어 있다 [참조: Dudas et al., Nephrol Dial Transplant 24(5):1406-1416; 2009; Hills et al., Am J Physiol Renal Physiol 296(3):F614-621; 2009]. NKA 구조물이 이식후 신장 조직 반응에 영향을 끼칠 수 있는 잠재적 기작을 조사하기 위해서, UNFX 세포 및 하이드로겔을 사용하여 생성된 NKA 구조물로부터 수집되는 적응용 배지를 HK2 EMT 검정 시스템으로 평가하였다.
도 26은 NKA 구조물로부터의 적응용 배지가 시험관내에서 HK2 세포에서의 TGF-β 유도된 EMT를 약화시킨다는 것을 나타낸다. EMT는 ECAD (상피) 및 CNN1 (중간엽) 마커의 상대적 발현을 정량함으로써 모니터링된다. HK2 세포를 50:50 배지 (대조군 및 TGFB 대조군 시료) 또는 인간 UNFX 세포 (TC)의 2D 배양물 또는 인간 UNFX 세포 및 상술된 바와 같은 젤라틴 또는 HA/젤라틴으로부터 생성된 NKA 구조물로부터의 적응용 배지 (CM)에서 배양하였다. EMT를 유도하기 위해서, 10 ng/ml TGF-β를 검정 전 3일 동안 각각의 시료 (대조군 제외)에 가하였다. HK2 세포를 50:50 배지 (대조군)에서 배양하는 경우, ECAD (상피 마커)가 CNN1 (중간엽 마커)보다 높은 수준으로 발현되었다. TGF-β를 3일 동안 배지에 가하는 경우 (TGFB 대조군), ECAD 발현이 상당히 하향-조절되고 동시에 CNN1이 상향조절되었으며, 이는 EMT 사건의 유도와 일치한다. 2D UNFX 세포 배양물로부터의 적응용 배지는 TGF-β에 대한 HK2 세포의 EMT 반응을 상당히 (ECAD 및 CNN1 모두에 대해 p < 0.05) 약화시켰다 (TC CM). 또한, NKA 구조물 (젤라틴 CM 및 HA/젤라틴 CM)으로부터의 적응용 배지도 TGF-β에 대한 EMT 반응을 약화시켰다; 그러나, 전체 효과는 2D UNFX 세포 배양으로부터의 적응용 배지를 사용하여 관측된 효과보다 더하였다 (유의도 - p < 0.05 - 2개의 NKA 구조물 모두를 사용한 ECAD에 대한 유의도, 비록 CNN1에 대한 통계학적 유의성은 없지만 대조군에 가까운 동향). 추가의 중간엽 마커를 스크리닝하여 유사한 결과를 얻었다 (자료 제시되지 않음). 이들 자료는 NKA 구조물이 세포-기반 처리로 관측되는 것과 유사한 방식으로 생체내에서 세뇨관-간질 섬유증과 연관된 TGF-β 경로에 잠재적으로 영향을 끼칠 수 있다는 것을 제시한다 [참조: Presnell et al ., WO/2010/056328]. 또한, 이들 자료는, 생체내 반응이 시험관내 EMT 반응과 통계학적으로 유의한 관계를 갖는 것으로 입증될 수 있다면, 시험관내 EMT 검정이 NKA 구조물의 생물치료 효능을 스크닝/최적화/모니터링하기 위한 잠재적 적용을 가지므로, 잠재적으로 시간 소모적이고 고비용인 생체내 검정에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다는 것을 제시한다.
본 연구는 비세포 및 생물활성 신장 세포/생체물질 복합물 (즉, NKA 구조물)로서의 합성 및 천연 생체물질의 이식에 대한 포유동물 신장 실질의 반응을 조사하였다. 시험관내 기능 검정 및 생체내 재생 결과를 조합하여 NKA 구조물 원형으로의 잠재적 삽입을 위한 후보 생체물질을 기능적으로 스크리닝하였다. 비세포 하이드로겔-기반 생체물질의 신장 실질로의 이식 (도 19)은 일반적으로 아주 적은 섬유증 또는 만성 염증과 관련되었으며 이식 후 4주에 어떠한 괴사의 징후도 없었다. 최소한의 잔류 생체물질과 함께 중등도의 세포/조직 내성장 및 신생-혈관화가 관측되었다. 이들 생체내 자료에 기초하여, 하이드로겔-기반 생체물질을 선택하여 시험관내 생물기능성 및 생체내 재생 잠재력을 평가하기 위한 NKA 구조물을 생성하였다. NKA 구조물의 생/사 (live/dead) 분석을 통해 물질의 생물적합성을 시험관내에서 확인하였다 (도 20). 젤라틴-포함 하이드로겔은 일차 신장 세포군의 강한 부착과 연관되었다. 생물활성 일차 신장 세포군 (UNFX 또는 B2) 및 하이드로겔 생체물질로부터 생성된 NKA 구조물의 표현형 및 기능 분석은 세뇨관 상피 세포 표현형의 지속적 유지와 일치하였다. NKA 구조물의 전사체, 분비체, 단백질체 및 공초점 현미경 분석은 2D 배양으로 씨딩된 일차 신장 세포에 비해 유의한 차이가 없음을 확인시켜 주었다. 마지막으로, 하이드로겔-기반 NKA 구조물의 건강한 성체 설치류의 신장 실질로의 이식은 이식후 8주까지 아주 적은 염증 및 섬유증 반응 및 신생-신장 유사 조직의 재생과 연관되었다.
결론적으로, 이들 자료는 재생 반응이 NKA 구조물에 의해 생체내에서 유도되었다는 것을 제시하는 증거를 제공한다. 이들 조사는 치료학적-관련 일차 신장 세포/생체물질 복합물의 이식에 대한 포유동물 신장의 생물학적 반응을 나타낸 최초의 생체내 신장내 조사를 나타낸다. 관측된 결과는 NKA 구조물이 신생-신장 조직의 재생을 촉진시키고 비-재생 (예를 들어, 수복적 치유) 반응을 약화시키는 잠재력을 갖는다는 것을 제시한다.
폴리머 물질의 이식에 대한 포유동물 신장의 생물반응. 또 다른 연구에서, 생물활성 신장 세포군과 함께 세포/생체물질 복합물을 형성하기 위한 후보 생체물질을 평가하기 위해 설치류 신장에서 천연 및 합성 생체물질의 신장내 주사에 대한 숙주 조직 반응을 조사하였다 [참조: Presnell et al ., supra 2010]. 방법: 천연 생체물질은 젤라틴 및 히알루론산 (HA)를 포함하였다. 합성 생체물질은 폴리카프롤락톤 (PCL) 및 폴리-락트산-코-글리콜산 (PLGA)를 포함하였다. 후보 생체물질을 2개의 상이한 물리적 입체형태로 평가하였다: 구형 비드 또는 이질의 비균질 입자. PCL 및 PLGA 비드는 개질된 이중 에멀젼 (물/오일/물) 용매 추출 방법으로 제조하였다. 젤라틴 비드는 구입하였다 (Cultispher-S®, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). PLGA 입자는 용매 캐스팅 포로겐 침출 기술을 이용하여 제조하였다; 젤라틴 및 HA 입자는 가교된 동결건조 포움으로부터 제조하였다. 35 μl의 느슨하게 포장된 생체물질의 2회 주사를 3월령 루이스 래트의 좌측 신장 실질에 전달하였다. 염증, 조직/세포 내-성장 (in-growth), 신생-혈관화, 물질 분해 및 섬유-세포 반응에 대한 0 (부재함)부터 4 (현저함)까지의 준정량적 경중도 등급화를 이용하여, 주사후 1주 및 4주에 포르말린-고정된 신장 조직 절편에 대한 조직병리학 평가를 수행하였다. 총 스코어는 음성 반응율 (%)에 대한 양성 반응율 (%)의 비율로서 계산되었다 (총 스코어가 클수록 더욱 우수한 결과를 나타낸다).
결과. 생체물질 후보물에 대해 수행된 조직병리학 평가 - 이식 후 1주에 수거된 신장에 대한 대표적 40X 영상, 매쓴 트리크롬 (Masson's Trichrome)으로 염색된 절편 (자료 제시되지 않음). 젤라틴 및 HA와 같은 천연 기원의 폴리머로 구성된 물질은, PLGA 및 PCL과 같은 합성 생체물질 (조직화된 섬유 캡슐화)과 비교하여, 약한 섬유-세포 반응 및 만성 염증, 및 큰 세포 내-성장, 신생-혈관화, 생체물질 분해, 및 조직 치유 및 통합에 필요한 필수적인 염증과 연관되었다. 조직병리학 평가 스코어링의 요약. 스코어는 물질 조성으로 평균하였다 (평균±SD). 합성 물질 (PLGA 및 PCL)은 최저 스코어였고, 젤라틴 물질은 일반적으로 HA 물질보다 높은 스코어였다. 이러한 경향은 4주 시점에서 가장 두드러졌다. 물질 주사와 비관련된 요인 때문에, 반드시는 아니지만, 1주에 시험된 시료는 4주에 분석에 이용가능했다. 젤라틴, HA 및 합성 그룹에 포함되는 시료수는 1주에 각각 3개, 4개, 3개이고, 4주에 각각 2개, 3개, 1개이다.
건강한 신장 실질 유도된 조직 반응을 위해 주사에 의해 전달된 천연 기원의 생체물질 (예를 들어, 젤라틴 또는 HA)은, 준정량적 조직병리학 평가에 의해 측정시, 합성 기원의 생체물질보다 주사후 4주에 덜 병적이었다.
실시예 16 - 배양된 인간 신장 세포의 저산소 노출은 시험관내에서 세포 이동 및 부착 매개자를 유도하고 세뇨관 세포 단층 복구를 촉진시킨다
만성 신장 질환 (CKD) 모델에서 입증된 치료학적 기능을 갖는 선택된 신장 상피 세포군 (B2)의 분리 및 기능에서의 산소 분압의 역할을 조사하였다. 본 연구는 프로세싱 동안의 저산소 노출이 인간의 선택된 신장 세포 (SRC) 또는 생물활성 신장 세포 (BRC)의 조성 및 기능을 변화시키는 지의 여부를 조사한다. 2% 산소 노출시, 하기 사항이 관측되었다: 밀도 구배물에 걸친 세포 분포의 변화 [참조: Presnell et al ., WO 10/056328, 전부 참조로 본원에 삽입됨], 구배후 총 수율의 개선, 산소-조절되는 유전자 발현의 조절 (문헌 [참조: Kelley et al ., supra (2010)]에 이미 보고됨), 에리트로포이에틴, VEGF, HIF1-알파 및 KDR(VEGFR2)의 증가된 발현. 저산소의 진행중 노출은 선택된 생물활성 신장 세포가 손상된 신장 세뇨관을 복구/재생하는 능력을 증진시킨다.
도 27은 프로세싱 동안 세포를 저산소에 노출시키는 절차를 도시한다. 도 28은 2% 산소 노출시 밀도 구배에 걸친 세포 분포가 변화되고 구배후 총 수율이 개선된다는 관측을 도시한다. 저산소 노출 (<3%)은 대기 산소 분압 (21%)가 비교하여 요오딕산올-기반 밀도 구배로부터의 배양된 CKD-유래된 신장 세포의 회수율을 증가시키고 (96% 대 74%), 선택된 세포 (B2)의 고밀도 (>9% 요오딕산올) 분획으로의 상대적 분포를 증가시켰다 (21.6% 대 11.2%).
경쟁적 시험관내 검정은 저산소 조건에 24시간 동안 사전노출된 B2 세포가 21% 산소 분압에서 배양된 B2 세포보다 손상된 신장 근위 세뇨관을 복구하는데 있어서 더욱 능숙하여 58.6% ± 3%의 복구가 손상 2시간 내에 일어난다는 것을 입증하였다.
도 29A는 시험관내에서의 세뇨관 단층 복구를 관측하기 위해 개발된 검정을 도시한다. 1. 세포를 형광 염료로 표지한다 (2% 산소, 21% 산소 및 HK2 세뇨관 세포). 2. 세뇨관 세포 단층을 확립하고, 상처를 내었다. 3. 산소-노출된 표지 세포를 가하였다 (2% 및 21% 노출된 세포). 이들을 20,000/cm2로 균일하게 씨딩하였다. 24시간 동안 5% O2에서 혈청-비함유 배지에서 배양하였다. 4. 상처를 복구하는 세포를 정량하였다. 도 29B - 정량적 영상 분석 (BD Pathway 855 BioImager) -적색 원 = 2% O2에서 배양된 세포, 청색 원 = 21% O2. 도 29C - 2% 산소-유도된 세포가 더욱 신속하게 (2시간) 부착되고 24시간 동안 온건한 이점이 지속되었다. 2% 산소로 유도된 세포는 세뇨관 상피 단층 복구에 더욱 능숙하였다.
도 30A는 시험관내에서의 세뇨관 단층의 복구를 관측하기 위해 개발된 검정을 도시한다. 1. 세포를 형광 염료로 표지하였다. 2. 세뇨관 세포 단층을 8 μm 세공 크기의 트랜스웰 삽입물의 바닥에 확립하고 상처를 내었다. 3. 삽입물을 뒤집고 산소-노출된 표지 세포를 가하였다 (2% 및 21% 노출된 세포). 이들을 50,000/cm2로 균일하게 씨딩하였다. 24시간 동안 5% O2 하에 혈청-비함유 배지에서 배양하였다. 4. 상처를 복구하는 세포를 정량하였다.
도 30B는 2% 산소로의 세포 유도가 비-유도 (21% 산소)에 비해 이동 및 상처 복구를 증진시킨다는 것을 도시한다. 도 30C는 이동 시간에 대한 이동 세포의 비율 (%)을 플로팅한다. 세포의 평균수 및 세포의 평균 비율 (%)이 표 16.1에 제공된다.
또한, 저산소는 CXCR4, MMP9, ICAM1 및 디스트로글리칸 (세포 이동 및 부착을 매개하는 유전자)의 mRNA 발현을 유도하였다. 세포 혈장 막 상의 MMP9의 구소 축적 및 코넥신 43 응집체의 증가가 면역세포화학으로 확인되었다.
도 31A는 오스테오폰틴이 세뇨관 세포에 의해 분비되고 손상에 반응하여 상향조절된다는 것을 나타낸다 (오스테오폰틴 면역세포화학: 훽스트 핵 염색 (청색), 오스테오폰틴 (적색), 10x). 오스테오폰틴은 분비되는 포스포릴화된 당단백질이다 [참조: Kelly et al ., J Am Soc Soc Nephrol, 1999]. 오스테오폰틴은 신장 세뇨관에서 발현되며, 부착 및 이동에 관여된다. 오스테오폰틴은 면역형광 (도 31A) 및 ELISA (도 31B)에 의해 도시되는 바와 같이 확립된 세뇨관 세포 단층에서 손상에 의해 상향조절된다.
<표 16.1>
Figure 112012102755333-pct00023
도 32A는 세포의 이동 반응이 오스테오폰틴에 의해 부분적으로 매개된다는 것을 나타낸다 (녹색 = 이동된 세포 (5x)). 도 32B는 오스테오폰틴에 대한 중화 항체 (NAb)가 신장 세포 이동 반응을 50% 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 33은 세포의 저-산소 유도가 조직 리모델링 유전자의 발현을 조절한다는 것을 도시한다. 카베올린 1은 인테그린 시그널링의 조절에 수반되는 스캐폴딩 단백질이다. MMP9는 세포외 매트릭스 분해를 통해 이동을 촉진하는 메탈로프로테이나제이다. ICAM1은 상피 세포 운동과 연관된 세포간 부착 분자이다. CXCR4는 세포 이동을 매개하는 케모카인 표면 수용체이다.
도 34는 신장 재생을 이끄는 세포의 생물활성의 저산소 증대에 대한 추정적 기작을 도시한다.
결론적으로, 이들 결과는 저산소 노출이 시험관내에서 세뇨관 손상 복구에 대해 입증된 생물활성을 갖는 특정 신장 세포 아군의 분리를 용이하게 하므로, 잠재적으로 생체내 전달 후 이들 세포의 병든 조직으로의 이동 및 주입 능력을 증진시킬 수 있다는 것을 제시한다. SRC는 진행성 CKD의 설치류 모델에서 신장 기능을 안정화시키고 생존을 증진시키는 능력을 나타내었다. 저산소 수준 (2% O2)은 선택된 재생 세포의 배양후 회수를 증진시키고; 세뇨관 손상에 반응하여 세포 부착 및 단층 복구를 증진시키고; 세뇨관 손상에 반응하여 세포 이동을 자극하였다. 또한, 세포 이동 및 부착은 부분적으로 시험관내에서의 오스테오폰틴, 저-산소 상향조절 인테그린, 분비 단백질, 및 조직 리모델링, 이동 및 세포-세포 교류를 매개하는 세포 부착 분자에 의해 매개되었다.
실시예 17 - 소변- 유래된 미세소포
소변으로 방출되는 신장 유도된 미세소포의 내강 내용물에 포함된 miRNA 및 단백질이 재생 결과를 평가하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 이에 대한 분석을 수행하였다. 과량의 미세소포가 세포외 공간으로 방출되기 때문에, 일부는 이웃 세포와 융합되고, 다른 일부는 소변으로 배출된다 [참조: Zhou et al., 2008. Kidney Int. 74(5):613-621]. 이러한 소변 미세소포가 처리 결과를 더욱 잘 이해하기 위한 검정 개발용의 우수한 바이오마커가 된다.
만성 진행성 신부전을 갖는 대사 질환의 ZSF1 설치류 모델을 사용하였다. B2+B4 세포를 ZSF1 동물의 신장 실질에 주사하였다. 건강한 동물 및 PBS 비히클을 대조군으로 사용하였다. 소변-유래된 소포를 하기에 요약되는 바와 같이 상이한 시점에서 분석하였다.
1: ZSF1 동물 - PBS 비히클 주사; 주사한 지 197일 후에 수집된 소변
2: ZSF1 동물 - PBS 비히클 주사; 주사한 지 253일 후에 수집된 소변
3: ZSF1 동물 - B2 + B4 분획물 주사; 주사한 지 197일 후에 수집된 소변
4: ZSF1 동물 - B2 + B4 분획물 주사; 주사한 지 253일 후에 수집된 소변
5. ZSF1 동물 - 비주사; 연구한 지 197일에 수집된 소변
6. ZSF1 동물 - 비주사; 연구한 지 253일에 수집된 소변
7. 건강한 동물 - 비주사; 연구한 지 197일에 수집된 소변
8. 건강한 동물 - 비주사; 연구한 지 253일에 수집된 소변
소변을 처리한 지 197일 및 약 253일 후에 시험 동물로부터 수집하였다. 미세소포를 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법에 의해 [참조: Zhou et al ., Kindey Int. 2008 September; 74(5): 613-621]에 의해 회수하였다. 도 35의 표준 웨스턴 블롯팅에 의해 보여지는 바와 같이, 처리된 동물의 소변으로부터 회수된 미세소포 (레인 3-4)는, 비히클 처리되거나 (레인 1-2) 비처리된 (레인 5-8)대조군과 비교하여, 전구 세포 (CD133 & WNT7A)와 관련된 단백질의 증가를 나타내었다. 사실, 미세소포 특이 단백질 CD63의 발현으로 나타나는 바와 같이 (도 35), 미세소포는 단지 질환을 갖는 동물 (레인 1-6)의 소변으로부터만 회수되고, 건강한 대조군 (레인 7-8)에서는 회수되지 않았다. CD133-포함 미세소포는 신장 세포로부터 방출되는 프로미노솜인 것으로 보인다. CD133 및 WNT7A는 모두 재생 및 줄기 세포 분열과 연관되어 있다 [참조: Romagnani P and Kalluri R. 2009. Fibrogenesis Tissue Repair. 2(1):3; Lie et al ., 2005. Nature. 437(7063):1370-5; Willert et al ., 2003. Nature. 423(6938):448-52; Li et al ., 2009. Am J Physiol Renal Physiol. 297(6):F1526-33]. 종합하면, 상기한 바는 재생을 모니터링하기 위해 고안되는 검정 개발용의 바이오마커로서 미세소포에서 발현되는 표적 단백질을 지지한다.
miRNA 마이크로어레이 및 RT - PCR . 소변-유래된 소포로부터의 miRNA의 마이크로어레이 및 RT-PCR 분석을 당해 기술 분야에 공지된 표준 기술 [참조: Wang et al., supra 2010]로 수행하였다. 단백질에 추가하여, miRNA가 분리된 미세소포의 내용물에서 발견되었다. 표 17.1은 처리에 의해 증가되는 것으로 밝혀진 miRNA의 예를 제공한다.
<표 17.1>
Figure 112012102755333-pct00024
miRNA 변화를 시간 경과에 따라 (197일 및 253일) B2+B4로 처리된 ZSF1 동물에서 분석하였다. 하기 miRNA에 대한 폴드 (fold) 변화를 관측하였다:
Figure 112012102755333-pct00025
Figure 112012102755333-pct00026
Figure 112012102755333-pct00027

miRNA 수준을 B2+B4로 처리된 (253일) ZSF1 동물에서 분석하였으며, PBS 비히클로 처리된 (253일) ZSF1 동물에서의 miRNA 수준과 비교하였다. 하기 miRNA에 대한 폴드 (fold) 변화를 관측하였다:
Figure 112012102755333-pct00028
Figure 112012102755333-pct00029
Figure 112012102755333-pct00030
Figure 112012102755333-pct00031
miRNA 수준을 B2+B4로 처리된 (197일) ZSF1 동물에서 분석하였으며, PBS 비히클로 처리된 (197일) ZSF1 동물에서의 miRNA 수준과 비교하였다. 하기 miRNA에 대한 폴드 변화를 관측하였다:
Figure 112012102755333-pct00032
Figure 112012102755333-pct00033
Figure 112012102755333-pct00034

표 17.1에 열거된 miRNA는 조직 재생에 관한 과정과 관련된 miRNA의 예를 제공한다. miR-15b는 BCL-2 및 카스파제 조절을 통한 아폽토시스 [참조: Guo et al., 2009. J Hepatol. 50(4):766-78] 및 사이클린의 조절을 통한 세포 주기 진행 [참조: Xia et al ., 2009. Biochem Biophys Res Commun. 380(2):205-10]의 조절과 관련되었다. miR-21은 생존 경로 MAPK/ERK를 조절함으로써 아폽토시스를 억제하는 것으로 밝혀졌다. miRNA의 miR-30은 발세포 구조 및 기능에 중요하며, 이의 증가가 사구체형성에 필수적일 수 있다는 것을 제시한다. miR-141, 200a, 200c 및 429는 모두 TGF-β 시그널링에 반응하여 상피-중간엽 이행 (EMT)을 조절하는데 수반되며 가능하게는 섬유증을 감소시킨다 [참조: Saal et al ., 2009. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 18:317-323]. miR-146a 및 151은 NFκB 조절에 관련되었으므로 잠재적으로 생체내에서 염증 반응을 감소시킨다 [참조: Taganov et al ., 2006. Proc Natl Acad Sci U S A. 103(33):12481-6; Griffiths-Jones et al ., 2006. NAR. 34 Database Issue: D140-D144]. 종합하면, 이들 miRNA는 성공적인 재생 결과와 관련된 과정을 조절하므로, 이들은 검정 개발을 위한 후보 바이오마커이다. 결론적으로, 이러한 자료는 소변의 미세소포 및/또는 이의 내강 내용물이 의사에게 치료를 모니터링하는 비-침습적 수단을 제공할 뿐만 아니라 TGF β-1, NFκB, 아폽토시스, 세포 분열 및 전분화능을 포함한 다수의 과정을 조절할 수 있는 단백질 및 miRNA를 포함하므로 재생 검정을 위한 유망한 표적물이라는 것을 지지한다.

Claims (34)

  1. 인간 피험자에게 생체내 투여되어 신장 섬유증을 감소시킴으로써 인간 피험자에서 신장 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1)을 억제하는 miRNA를 포함하며 농축 신장 세포군에 의해 생성된 인간-분비 소포를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 소포가 미세소포 및/또는 엑소솜을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, miRNA가 소포 외부에 있는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 세포군이
    (a) 농축 세뇨관 세포군을 포함하는 제1 세포군인 B2; 또는
    (b) 농축 세뇨관 세포군을 포함하는 제1 세포군인 B2와, 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포 중 하나 이상을 포함하는 제2 세포군을 포함하는 인간 신장 세포의 혼합물
    을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) B2 세포군이 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖거나;
    (b) 제2 세포군이 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 B4 세포군이거나;
    (c) 제2 세포군이 1.052 g/ml 내지 1.063 g/ml의 밀도를 갖는 B3 세포군인 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 혼합물이 제3 세포군을 추가로 포함하고, 상기 제3 세포군이 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 제3 세포군이
    (a) 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 B4 세포군; 또는
    (b) 1.052 g/ml 내지 1.063 g/ml의 밀도를 갖는 B3 세포군
    인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 농축 신장 세포군이 고유 (native) 신장에 대해 비-자가인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 농축 신장 세포군이 고유 신장에 대해 자가인 조성물.
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