JPH07508275A - 医療処置で用いるトロンビン血液分画 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 医療処置で用いるトロンビン血液分画 技術分野 本発明は、動物の医療処置におけるトロンビンの使用に関する。更に詳しくは、 本発明は、トロンビンが以下に記載するトロンビン血液分画（ｂｌｏｏｄ　ｆｒ ａｃｔｉｏｎ）である上記トロンビン使用に関する。

背景技術 動物の止血、すなわち、血液損失の防止のための１つのメカニズムは、血液凝塊 （血塊）の形成である。血塊形成、すなわち、血液の凝固は復雑な多段階反応に よって起り、この場合、最終段階はトロンビン、カルシウムイオンおよびフィブ リン塩を形成する活性化第Ｘｌ１１因子による、フィブリノーゲンの変換である 。血液凝固のメカニズムおよびフィブリノーゲンの構造の再検討には、ＣＭ、ジ ャックソンのｒＡｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ（４９ニア　６５−８ １１．１９８０年）およびＢ、フリエ（Ｆｕｒｉｅ）およびＢ、Ｃフリエのｒｃ ｅｌｌＪ（５３：５０５−５１８．１９８８年）を参照。

トロンビンは、タンパク分解酵素であって、プロトロンビンから誘導される。

プロトロンビンは、カルシウムおよびプロトロンビナーゼによってトロンビンに 変換される。プロトロンビナーゼは、タンパク第又因子および第■因子で始まる 多段階反応によって形成される。

フィブリンシーラント（ｓｅａｌａｎｔ）は生物学的接着剤であって、その作用 は、最終段階の凝固をまねることにより、フィブリン塩を生成する。通常のフィ ブリンノーラントは一般に、第１成分として濃ヒトフィブリノーゲン、ウシアプ ロチニンおよび第ｘ■因子、そして第２成分としてウシトロンビンおよび塩化カ ルシウムから成る。施用は一般に、二重バレル注射器で行なわれ、該注射器によ って、フィブリン塩の形成が望まれる部位への両成分の同時施用が可能となる。

アプロチニンは、フィブリンシーラントの安定性を促進するために加えられるフ ィブリン溶解性抑制剤である。

フィブリンノーランドのフィブリノーゲン成分は、プールしたヒト血漿から製造 される。フィブリノーゲンは、各種の試薬、たとえばポリエチレングリコール、 エーテル、エタノール、硫酸アンモニウムまたはグリシジを用い、低温沈澱およ び沈澱によってヒト血漿から濃縮することができる。フィブリンシーラントの完 全す再検討には、Ｍ、ブレンチンのｒＢｌｏｏｄ　ＲｅｖｉｅｗｓＪ（５：２４ ０　２４４．１９９１年）；Ｊ、　Ｗ　ジブル（Ｇｉｂｂｌｅ）およびＰ、　Ｎ 、ネスのｒＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎＪ（３０ニア４１−７４７．１９９０年）； Ｈ，７トラスのｒＪ、０ｒａｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ　Ｓｕｒｇ、ｊ（４３： ６０５−６１１．１９８５年）およびＲラーナーおよびＮ、ビヌア（Ｂ　１ｎｕ ｒ）のｒ’Ｌ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ（４８：１６５− １８１．１９９０年）を参照。

また最近では、自己由来フィブリンを用いるフィブリンシーラントの製造１こ興 味が起っている。自己由来フィブリンシーラントは、フィブリンシーラントのフ ィブリノーゲン成分か患者自身の血液から抽出したものであるフィブリンノーラ ンドである。自己由来フィブリンシーラントの使用が好ましいが、それは、さも なければプールしたヒト血漿から抽出したフィブリノーゲン成分に存在しつる、 血液伝播感染、たとえばＢ型肝炎、非Ａ、非Ｂ型肝炎および後天性免疫不全症候 群（ＡＩＤＳ）の伝播のリスクを排除するからである。Ｌ、Ｅ、ンルノく一ステ ィンらのｒＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎＪ（２８＋３１９　３２１．１９８８年）： に、ライタカリ（１−Ｂｉｔａｋａｒｉ）およびＪ　ルオト不ン（Ｌ　ｕｏｔｏ ｎｅｎ）のｒ　ＬａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅＪ（９９：９７４−９７６．１９８９ 年）およびＡ、ドレスプールらのｒＴｈｅ　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆＴｈｏｒａｃｉ ｃ　ＳｕｒｇｅｒｙＪ（４０：３８５　３８７．１９８５年）参照。

感染はフィブリンシーラントにより、フィブリノーゲンばかりでなく、ウシアプ ロチンおよびウシトロンビン成分によっても伝播しつる。ウシトロンビンは、感 染作用物質のウシ海綿状脳炎（ＢＳＥ）および他のウィルス性病原を哺乳動物へ 運ぶことが知られている。さらにウシトロンビンは、潜在性抗原であって、ヒト の免疫反応を起こしつる。このように、ウシトロンビンの使用によって、ウシト ロンビンのレンビエントは悪影響を受ける結果になりうる。ＤＭ、ティラーのｒ Ｊ、　ｏｆ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　ＩｎｆｅｃｔｉｏｎＪ（１８（増補Ａ）＋１４ １−１４６．１９９１年）；Ｓ、Ｂ、プルシナ−ら鼾Ｃｏｒｎｅｌｌ　ＶｅｔＪ （８１、Ｎｏ、２．８５−９６．１９９１年）およびＤ　マノユーズのｒＪ　、 　Ｒａｙ、Ｓｏｃ、　ＨｅａｌｔｈＪ（３５，１９９１年２月）参照。

従って、ウィルス汚染のリスクあるいは他の悪影響もなく、患者へ分与できるト ロンビンを用いたノーランドが必要である。

発明の概要 本発明は、動物の医療処置においてトロンビンを用いる方法であって、該トロン ビンが、 （ａ）約１〜２００ＯＮＩＨユニツト／＋ｅｌのトロンビン濃度、および（ｂ） 血液タンパクｌｅｇ当り約１〜２０ＯＮＩＨユニツトのトロンビンの比活性（ｓ ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有し、かつ実質的に活性抗トロンビン■ を含まないトロンビン血液分画であることを特徴とする上記方法に関する。

また本発明は、全血からプロトロンビン血液分画を製造する方法であって、（ａ ）全血を約１００ミリモル以下のイオン濃度まで希釈し、（ｂ）該全血から血漿 を分離し、 （Ｃ）該血漿のｐＨを下げて、プロトロンビン血液分画を沈澱せしめ、次いで（ ｄ）該プロトロンビン血液分画を血漿から分離することから成る上記製造方法に も関係する。

次いでプロトロンビン血液分画を再溶解し、トロンビンに変換し、すなわち、ト ロンビン血液分画が形成し、次いでこれを動物の医療処置に、たとえばフィブリ ンノーラントの成分として用いることができる。

発明の詳細な説明 本発明は、以下に記載の如く、動物、好ましくは哺乳動物の医療処置において、 たとえばフィブリンノーランドの成分としての、トロンビン血液分画の使用に関 する。適当な哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ブタ、イヌおよびウサギ、あるい はトロンビン血液分画を製造するのに適切な血液量を有する他の哺乳動物が包含 される。トロンビン血液分画は、全血から製造することができ、そしてトロンビ ン以外の血液タンパクを含有する点て純粋ではない。しかし、トロンビン血液分 画は、極めて簡単かつ敏速に、たとえば約１または２時間以内で製造することが でき、そして高純度のトロンビン製剤としてききめがあることが認められる。

トロンビン血液分画は、全血から製造することができる。全血は、個々の単一動 物から得ることが好ましい。また、トロンビン血液分画は、全血を採取した同じ 個々の動物へ投与することが好ましい。すなわち、本発明の１つの側面は、医療 処置における自己由来トロンビン血液分画の使用である。この具体例においても 、血液伝播感染の伝播のリスクは全くなく、それは、全血を供与した同じ個々の 動物にトロンビン血液分画が投与されることになっているからである。また同じ 理由から、トロンビン血液分画に存在するトロンビン以外の血液タンパクは、抗 原性を示すものではない。

さらに、トロンビン血液分画は個々の単一動物から製造され、かつ同じ動物に使 用されることが好ましいので、一般に少量の全血が必要とされ、特にその理由は 、１回使用分のトロンビン血液分画を製造することが好ましいからでもある。

また数時間の使用時間以内で、該血液分画を製造することが好ましい。本発明の トロンビン血液分画を製造するのに、約１０〜５０■１、より好ましくは約１０ 〜３０■１、最も好ましくは約１０〜２０ｍ１の全血を用いることが好ましい。

本発明のトロンビン血液分画は、１■ｌ当り約１〜２００ＯＮＩＨユニツト、好 ましくは約１００〜８０ＯＮＩＨユニツト、最も好ましくは約１００〜５０ＯＮ ＩＨユニツトのトロンビン濃度を有する。

かかる濃度において、トロンビン血液分画は、所望の医療使用に十分なトロンビ ン濃度を有することが認められる。勿論、好ましいトロンビン濃度は、トロンビ ン血液分画の医療使用に左右される。

トロンビン血液分画のトロンビン１度は、トロンビン血液分画を適当な希釈形状 で加えた後、標準フィブリノーゲン溶液の凝固時間を測定することによって決定 することができる。対照として、２〜１５ＮＩＨユニット／ｍｌを含有する標準 トロンビン溶液を使用しつる。

本発明のトロンビン血液分画は、総血液タンパク１■ｇ当り約１〜２０ＯＮＩＨ ユニツト、好ましくは約５〜１００ＮＩＨユニツト、最も好ましくは約５〜５Ｏ ＮＩＨユニツトのトロンビンの比活性を有する。このような低い比活性のトロン ビン血液分画は、医療処置において、より純粋なトロンビン血液分画として有効 であることが認められる。しかし、かかる低比活性の）・ロンビン血液分画は、 より容易に製造することができる。

トロンビン血液分画の比活性は本質的に、トロンビン血液分画におけるトロンビ ン量／血液タンパク量の測定値である。このように、本発明のトロンビン血液分 画の比活性は、これまで製造されてきたトロンビン製剤に比してがなり低い。

たとえば、米国特許Ｎｏ、５１４３８３８に、総タンパク１１ｇ当り少な（とも ８０ＯＮ［Ｈユニットの比活性を持つトロンビン製剤が開示されている。また米 国特許Ｎｏ、５１５１３５５には、総タンパク１ｍｇ当り１００ＯＮＩＨユニツ ト以上の比活性を持つトロンビン製剤が開示されている。本発明のトロンビン血 液分画の比活性は低いが、決して少ないことはなく、該血液分画は医療処置にお いての使用にききめがあることが認められる。

本発明のトロンビン血液分画の比活性は、トロンビン濃度（ＮＩＨユニット／■ ｌ）を測定し、次いでその数を、いずれかの標準タンパク検定、たとえばＵＶ吸 光度で測定したタンパク濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることによって、計算すること ができる。

またトロンビン血液分画は、実質的に活性抗トロンビン■を含まない。本発明の 目的から、“実質的に活性抗トロンビンｍを含まない”とは、ユニット容量当り のトロンビン血液分画が、ユニット容量当りの正常な血漿中の抗トロンビン■の 活性の約５０％以下である量の活性抗トロンビンｍを含有することを意味する。

かかる百分率は、約３０％以下、より好ましくは約１０％以下、最も好ましくは 約５％以下であることが好ましい。抗トロンビン■は、トロンビン血液分画がら 除去されるか、あるいは該血液分画において不活性であることが必要不可欠であ る。さもなければ、抗トロンビンｍは、該血液分画におけるプロトロンビンのト ロンビンへの変換を妨害するかおよび／または形成するトロンビンを不活性化す るであろう。

またトロンビン血液分画は、実質的にフィブリノーゲンおよびフィブリンを含ま ないことが好ましい。本発明の目的から、“実質的にフィブリノーゲンおよびフ ィブリンを含まない″とは、ユニット容量当りのトロンビン血液分画が、ユニッ ト容量当りの正常血漿中のフィブリノーゲンの重量の約１％以下である量のフィ ブリノーゲンおよびフィブリンを含有することを意味する。フィブリノーゲンは トロンビン血液分画において存在しないことが好ましく、それは、トロンビンが フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、該フィブリンが重合してフィブリン塩 を形成することにより、トロンビン血液分画を使用不可にすることが推量される ためである。フィブリノーゲン自体は、トロンビン血液分画から除去することが でき、あるいはフィブリノーゲンはフィブリン塩として除去することができ、こ れによって、勿論、フィブリンも除去しうる。しかしながら、たとえばトロンビ ンが特許公開ＰＣＴ／ＵＳ９１１００００３に記載のように不活性化されている 場合には、フィブリノーゲンを除去する必要はない。

トロンビン血液分画は、その製造後直ちに使用することができる。該血液分画を 製造直後に使用しない場合は、これを貯蔵することができる。該血液分画の貯蔵 には、たとえば該血液分画を冷凍もしくは凍結乾燥するかまたは組成物を４℃で 保持することによって、該血液分画を保存することが必要である。冷凍もしくは 凍結乾燥状態の該血液分画は、数ケ月にわたって安定である。該血液分画を４℃ で保持すると、少なくとも数日間は安定である。

該血液分画を冷凍する場合、使用時に解凍しなければならない。該血液分画を凍 結乾燥する場合、使用時に、蒸留水を加えて元に戻すことが好ましい。

トロンビン血液分画は、実質的にいずれの形状、たとえば溶液、懸濁液、エマル ジョンまたは固体であってよく、溶液が好ましい。このようにかかる血液分画は 、たとえば液体、ゲル、ペーストまたは軟膏であってよい。さらにまた、該血液 分画はグラニユールの形状であってもよいことは勿論である。

トロンビン血液分画が固体形状である場合、トロンビン血液分画の濃度は、該血 液分画を溶液状態に溶解し、次いでトロンビン濃度を測定することによって決定 することができる。得られるトロンビン濃度が約１〜２００ＯＮＩＨユニツト／ ■１であると、そのトロンビン血液分画は、本発明の技術的範囲に属する。

１　トロンビン血液分画の製造法ニ一 本発明のトロンビン血液分画は、公知のまたは開発すべき方法のいずれかによっ て製造することができる。また、トロンビン血液分画は、特許出願ＰＣＴ／ＤＫ ９１１００１３１に記載の装置で製造することができる。

１．１゜血漿からのニーグロブリンの形成によるトロンビン血液分画の製造法ニ ー個々の動物、たとえばヒトから、好ましくは抗凝固剤の存在下で全血を抜取る ことができる。抗凝固剤としては、直接トロンビンを不活性化して作用するもの でない限り、いずれも使用できる。適当な抗凝固剤は、ヘパリン、ＥＤＴＡ、ク エン酸塩または直接的もしくは間接的にトロンビンの形成を妨害しつる他の物質 であって、クエン酸塩が好ましい。

血漿はプロトロンビンを含有し、これを全血から分離する。いずれの分離法も使 用でき、たとえば沈降法、遠心分離法または濾過法が挙げられる。遠心分離は、 約１５００〜３０００ｇ、で約１０分にわたって行うことができる。上層液は血 漿を含有し、該上層液を通常の方法で除去しうる。生長した因子を含有するトロ ンビン血液分画を得るのが望まれる場合、遠心分離の条件を約１２５ｇ、で約２ ０分または１０００ｇ、で約２〜３分とすべきである。そして本発明のトロンビ ン血液分画は生長因子を含有し、該生長因子をプロトロンビンのトロンビンへの 変換中に、血小板から放出せしめる。

次いで血漿を処理する。たとえば、蒸留水で希釈した後、酸（たとえばクエン酸 ）を加えて、イオン濃度を約１００ミリモル以下、好ましくは約５０ミリモル以 下、最も好ましくは約２０〜４０ミリモルまで下げ、かつｐＨを約４．５〜６、 好ましくは約５〜５．５に下げる。なお、乳酸あるいは酢酸も好適な酸である。

一般に、血漿：蒸留水または酸の重量比は、約１＝５〜１：５０で、１．１０が 好ましい。

この処理、すなわち、イオン濃度および血漿ｐＨの低下によって、一般に“ニー グロブリン分画゛と称せられる沈澱物が形成する。ニーグロブリン分画は、プロ トロンビン、フィブリノーゲンおよび多くの他の血液タンパクを含有するが、実 質的に抗トロンビン■を含まない。

血漿を希釈してイオン濃度を下げるよりはむしろ、血漿の酸性化前に、血漿を透 析袋へ入れ、次いで該透析袋を蒸留水につけて透析することにより、イオン濃度 を下げることができる。透析はイオンの血漿から拡散を可能にすることにより、 イオン濃度が低下する。適当な透析袋は、硝酸セルロースから成る。またイオン 濃度は、ダイヤ濾−Ａ（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または吸蔵クロマトグラ フィーによっても下げることができる。

ニーグロブリン分画は、Ａ、クイックのｒＡ＊、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｊ（１ ８３：１１４−１１８．１９５５年）、”希釈した血漿の酸性化によって得られ る沈澱物からのトロンビンの生成°、およびＲ，ピッゲスおよびＲ，Ｇ、マツク ファーランのｒＢｌａｃｋｖｅｌｌｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａ ｔｉｏｎｓＪ（３７５〜３７６頁、オックスフォード、３版、１９６２年）、“ ヒト血液凝固”の記載に従って製造することができる。

次いで過剰の液体をニーグロブリン分画から、たとえば遠心分離、濾過または沈 降によって分離することができる。遠心分離は、約１５００ｇ、で約２〜５分に わたって行うことができる。

次いで、ニーグロブリン分画のプロトロンビンを再溶解し、次いでトロンビンへ 変換することにより、本発明のトロンビン血液分画を形成する。この操作は、以 下の手順で行うことができる。すなわち、ニーグロブリン分画を、血漿の反量と 同じ量または好ましくは該反量より少ない量（約１０％）の生理的に許容しうる 溶液、たとえば食塩水に可溶化する。溶液のｐＨを約６〜８、好ましくは約６． ５〜７．５に上げる量で、アルカリ性緩衝剤を加えることができる。適当なアル カリ性緩衝剤の非制限的具体例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、 水酸化カルシウム９重炭酸ナトリウムや重炭酸カリウムなどの重炭酸塩緩衝剤、 酢酸の塩および硫酸の塩が包含される。好ましいアルカリ性緩衝剤としては、ｐ Ｈ７，０の炭酸ナトリウム／重炭酸塩、ｐＨ７，０の重炭酸ナトリウム／ＮａＯ Ｈ，ｐＨ６，５〜７．５の１．５Ｍグリノン／ＮａＯＨ％ｐＨ７，５のビスヒド ロキンエチルアミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ｐＨ７，５のヒドロキシエチ ルピペラジンプロパンスルホン酸（Ｅ　Ｐ　Ｐ　Ｓ）、ｐＨ７，５のトリシン、 ｐＨ７，０のモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ７，０のトリス ヒドロキノメチルアミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）およびｐＨ７，０のシクロ ヘキンルアミンエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）が挙げられ、ｐＨ６，５〜７，５ の炭酸ナトリウム／重炭酸塩、ｐＨ７，５のビスヒドロキノエチルアミノエタン スルホン酸（ＢＥＳ）、ｐＨ７，５のヒドロキシエチルピペラジンプロパンスル ホン酸（ＥＰＰＳ）およびｐＨ７，５のトリスヒドロキノメチルアミノエタンス ルホン酸（ＴＥＳ）が最も好ましい。

プロトロンビンをトロンビンへ変換するため、中性溶液にカルシウムを加える。

勿論、カルシウムはアルカリ性緩衝剤の一部であってもよい。カルシウムは、た とえば塩化カルシウムの形状で加えることができる。カルシウムの添加量は、一 定量のプロトロンビンをトロンビンへ変換するのに十分な、すなわち、意図され る医療使用に十分な量とすべきである。さらに反応は、十分な量のプロトロンビ ンをトロンビンへ変換するのに十分な、すなわち、意図される医療使用に十分な 時間にわたって起るのを可能にすべきである。一般に、約５〜５０ミリモルの塩 化カルシウムが十分である。

また、カルシウムイオン源を加えることよりむしろ、ヘビ毒液からのプロトロン ビン活性化酵素を用いることもできる。たとえば、エフシス・カリナタス（Ｅｃ ｃｉｓ　ｃａｒｉｎａｔｕｓ）またはオーストラリアン・タイガー・スネーク（ ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＴ　ｉｇｅｒ　５ｎａｋｅ）のヘビ毒液を使用しつる。

トロンビンは形成しながら、フィブリノーゲンをフィブリンに変換して、フィブ リン塩が形成する。フィブリン塩を除去をすることが好ましく、この除去は、た とえばフィブリン塩を撹拌棒に巻きつけるかあるいはフィブリンをガラスピーズ 上に集めることによって、行うことができる。

１．２　全血の希釈によるトロンビン血液分画の製造法・−好ましい具体例にお いて、トロンビン血液分画は、以下の手順に従って製造することができる。すな わち、初めに全血から、（ａ）全血を約１００ミリモル以下のイオン１度まで希 釈し、（ｂ）該全血から血漿を分離し、 （ｃ）該血漿のｐＨを下げて、プロトロンビン血液分画を沈澱せしめ、次いで（ ｄ）該プロトロンビン血液分画を血漿から分離することによって、プロトロンビ ン血液分画を製造する。

次に、プロトロンビン血液分画を再溶解し、トロンビンへ変換する。すなわち、 本発明のトロンビン血液分画が形成し、これを動物の医療処置に、たとえばフィ ブリンノーラントの成分として使用できる。この方法によって、本発明のトロン ビン血液分画が得られ、わずか約４５分で製造できるのである。

より詳しくは、個々の動物から全血を抜き取る。次いで、全血を直ちに（約５分 以内）、イオン濃度を約１００ミリモル以下、好ましくは約５０ミリモル以下、 最も好ましくは約２０〜４０ミリモルまで下げるため、希釈する。留意すべき点 は、全血を直ちに希釈することから、抗凝固剤の使用の必要がないことである。

イオン１度を下げるのに、生理的浸透圧のいずれの生理的に許容しつる溶液も使 用することがてき、たとえば５．５％等張グルコース水溶液などのグルコース水 溶液が挙げられる。

次いで全血から、血漿を分離する。いずれの分離法も使用でき、たとえば沈降法 、遠心分離法または濾過法が挙げられる。遠心分離は、約１５００〜３０００ｇ 。

で約５〜１０分にわたって行うことができる。上層液は血漿を含有し、該上層液 を標準方法で除去しうる。

次に血漿分画を酸性化することにより、一般に“ニーグロブリン分画“と称せら れる、沈澱物であるプロトロンビン血液分画が形成する。血漿分画を、たとえば クエン酸、乳酸または酢酸で酸性化しつる。ｐＨは約４５〜６、好ましくは約５ 〜５５まで下げるべきである。

次いでプロトロンビン血液分画から、たとえば遠心分離、濾過または沈降で過剰 の液体を分離する。遠心分離は、約１５００ｇで約２〜５分にわたって行うこと ができる。このプロトロンビン血液分画は、プロトロンビン、フィブリノーゲン および多（の他の血液タンパクを含有するが、抗トロンビンｍを含有せず。次い でプロトロンビン血液分画を再溶解し、プロトロンビンをトロンビンへ変換する 。プロトロンビン分画を再溶解するのに、いずれの生理的に許容しうる溶液、た とえば食塩水を使用できる。さらに、プロトロンビン分画を再溶解するのに、は んの少量の溶液しか必要でない。初めに約１７ｍ１の全血が抜き取られる場合、 ｌ・要な溶液はわずか約０．４〜１ｍｌでよいことが認められる。溶液のｐＨを 約６〜８、好ましくは約６．５〜７．５に上げるため、一定量のアルカリ性緩衝 剤を加えることができる。適当なアルカリ性ｌｉＩ剤の非制限的具体例としては 、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム１重炭酸ナトリウムや 重炭酸カリウムなどの重炭酸塩緩衝剤、クエン酸のトリ金属塩、酢酸の塩および 硫酸の塩が包含される。好ましいアルカリ性緩衝剤としては、ｐＨ６〜８の炭酸 ナトリウム／重炭酸塩、ｐＨ６〜８の重炭酸ナトリウム／ＮａＯＨ，ｐＨ６〜８ のグリノン／ＮａＯＨ，ｐＨ６〜８のビスヒドロキンエチルアミノエタンスルホ ン酸（ＢＥＳ）、ｐＨ６〜８のヒドロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸 （ＥＰＰＳ）、ｐＨ６〜８のトリンン、ｐＨ６〜８のモルホリノプロパンスルホ ン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ６〜８のトリスヒドロキノメチルアミノエタンスルホン 酸（ＴＥＳ）およびｐＨ６〜８のシクロヘキノルアミノエタンスルホン酸（ＣＨ ＥＳ）が挙げられ、ｐＨ６〜８の炭酸ナトリウム／重炭酸塩、ｐＨ６〜８のビス ヒドロキンエチルアミンエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ｐＨ６〜８のヒドロキシ エチルピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）およびｐＨ６〜８のトリスヒ ドロキンメチルアミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）が最も好ましい。

プロトロンビンをトロンビンへ変換するため、中性溶液にカルシウムを加える。

勿論、カルシウムはアルカリ性緩衝剤の一部であってもよい。カルシウムは、た とえば塩化カルシウムの形状で加えることができる。カルシウムの添加量は、一 定量のプロトロンビンをトロンビンへ変換するのに十分な、すなわち、意図され る医療使用に十分な量とすべきである。さらに、反応は、十分な量のプロトロン ビンを１−ロンビンへ変換するのに十分な、すなわち、意図される医療使用に十 分な時間にわたって起るのを可能にすべきである。一般に、約５〜５０ミリモル の塩化カルシウムで十分である。本発明のトロンビン血液分画のほとんどの医療 使用に対し、約２５分の反応で、十分量のトロンビンの形成が見られる。

また、カルシウムイオン源を加えることよりむしろ、ヘビ毒液からのプロトロン ビン活性化酵素を用いることもてきる。たとえば、エク７ス・カリナタスまたは オーストラリアン・タイガー・ス不−りのヘビ毒液を使用しつる。

トロンビンは形成しながら、フィブリノーゲンをフィブリンに変換して、フィブ リン塩が形成する。フィブリン塩を除去することが好ましく、この除去は、たと えばフィブリン塩を撹拌棒に巻きつけるかあるいはフィブリンをガラスピーズ上 に集めることによって、行うことができる。

１．３　血漿から抗トロンビン■を除去または不活性化によるトロンビン血液分 画の製造− 別法として、本発明のトロンビン血液分画は、個々の動物、たとえばヒトから、 好ましくは抗凝固剤の存在下で全血を抜き取ることによって製造することができ る。いずれの抗凝固剤も使用しうる。過当な抗凝固剤は、ヘパリン、ＥＤＴＡ、 クエン酸塩またはトロンビンの形成を直接または間接的に妨害しうる他の物質で あって、クエン酸塩が好ましい。

血漿はプロトロンビンを含有し、これを全血から分離する。いずれの分離法も使 用でき、たとえば沈降法、遠心分離法または濾過法が挙げられる。遠心分離は、 約３０００ｇ、で約１０分にわたって行うことができる。上層液は血漿を含有し 、該上層液を標準法で除去しうる。

次いで血漿から抗トロンビン■を除去するか、あるいは不活性化する。たとえば 、血漿のｐＨを少な（とも約５まで下げることができる。かかるｐＨの低下は、 抗トロンビン■を不活性化し、さもなければ、抗トロンビン■はプロトロンビン のトロンビンへの変換を妨害するであろう。抗トロンビン■はいずれの方法によ っても不活性化しうる。たとえば、血漿１．０社当り、５モル／１のＨＣＩを０ ０５■１添加する。約１０〜２０分の培養後、血漿を血漿１＋＊ｌ当り５モル／ １のＮａＯＨの０．０５ｍ１で中和しつる。

抗トロンビン■を不活性化することよりむしろ、抗トロンビン■に結合するカラ ム、たとえばヘパリンカラムまたは抗トロンビン■への抗体を持つカラムに、血 漿を通すことによって、血漿から抗トロンビン■を除去しつる。

血漿分画はプロトロンビンを含有し、次いで該血漿分画を処理して、プロトロン ビンをトロンビンに変換する。この処理は、たとえば、上述のカルシウムイオン 源の添加、または血漿ｌｌｌ１当り０．３６モル／ｌのＣａＣｌ２の０．１ａｌ Ａ加によって、行うことができる。また、カルシウムイオン源を添加することよ りむしろ、ヘビ毒液からのプロトロンビン活性化酵素を使用することができる。

たとえば、エクノス・カリナタスまたはオーストラリアン・タイガ町スネークの ヘビ毒液を使用しうる。

トロンビンは形成しながら、フィブリノーゲンをフィブｌルへ変換して、フィブ リン塩が形成する。フィブ１ル塊を除去することが好ましく、この除去は、たと えばフィブリン塩を撹拌棒に巻きつけるがあるいはフィブリンをガラスピーズ上 に集めることによって、行うことができる。

得られる血漿は、本発明のトロンビン血液分画である。

１．４．酸溶液で直接希釈することによるトロンビン血液分画の製造法、−血漿 からトロンビンを製造する公知の方法によって、血漿を水で１：１０の割合にて 希釈した後、ｐＨ低減酸、たとえば酢酸を加えた結果、ｐＨ値が約５．０〜５． ３となる。次いで混合物を、２０００ｇで２０分間遠心分離する。得られる沈澱 物は、とりわけプロト。ンビンおよびフィブリノーゲンなどの異なる凝固因子を 含有する。過剰液体を除去すると、沈澱物を生理的溶液、好ましくは０．９％塩 化ナトリウム１ｇ液に溶解した後、ｐＨ＠が約７．９になるまで、ｐＨ増加剤（ たとえば炭酸ナトリウム）を加える。沈澱物が溶解すると、塩化カル／ラムを加 え、Ｎｉ常のいわゆる凝固カスケードで、プロトロンビンをトロンビンへ変換せ しめる。

生成するトロンビンは、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を起こし、その 後、遠心分離でトロンビンを分離し、次いで精製（カラム精製）に付す。

本発明の他の側面は、希釈工程を直接、希釈溶液（たとえば０４％酢酸）といっ しょに行うことである。すなわち、遠心分離工程を、比較的大きいフラットな沈 澱面を持つ容器内で行い、同時に、ｐＨ増加剤を存する生理的溶液、および塩化 カルシウムを混合して、沈澱物に加えることにより、該沈澱物を溶解し、次いで ライブ１ルを形成しながら凝固せしめ、そしてトロンビンを取出す。

この結果、自己由来血液の血漿から、比較的迅速にトロンビンを製造することが でき、これは特に、比較的大きいフラットな沈澱面を持つ容器内で沈澱を行うこ とに基づく。これによって、プロトロンビンおよびフィブリノーゲンを含有する 沈澱物の、迅速がっ完全な溶解が確保される。完全な溶解は、塩化カルシウムの 存在によりプロトロンビンのトロンビンへの変換を起こす前において重要である 。あまりに早いトロンビン形成はフィブリン形成に至り、フィブリンは余分な液 体と結合することにより、液体がフィブリンから出てくるまで、沈澱物の溶解は 停止しかつ続くことはない。比較的少量で該量に対して比較的大きな表面積を持 つ沈澱物は、上記凝固カスケードによってトロンビンが形成し、フィブリンの形 成が始まる前において、ｐＨ増加剤を有する生理的溶液と、塩化カルシウムの混 合物を加えることによって、該沈澱物の完全な溶解を起す。

さらに本発明によれば、上記混合物はこれを沈澱物に加える前に、プラスミノー ゲン触媒、たとえばストレプトキナーゼと混和してもよ（、これによって、次に 行うトロンビンとフィブリンの分離を促進する効果がある。

本発明によれば、沈澱物に加える混合物は、ｐＨ値が６．５に増加するように有 利に調整することができ、これによって、得られる活性トロンビンは、酵素に関 連する場合に通常の、静置によって不活性になる傾向を有するので、最良の保存 性を具備することが認められる。加えて、溶解した沈澱物を凝固が始まる前に軟 質材（ｆｌｅｘｉｂｌｅ　ａａｔｅｒｉａｌ）へ移すことができ、該軟質材は凝 固によって生成するフィブリンが沈着しつる比較的大きな面を提供し、その後、 該軟質材を圧縮に付すことにより、フィブリンからトロンビンをしぼり出すこと ができる。フィブリンの形成前に、まさに得られた完全溶解の沈澱物は、上記フ ィブリン形成前に溶液を軟質材へ迅速に移すのを可能ならしめることがわかる。

軟質材はフィブリンが特に大きな面にわたって沈着するのを確実にし、モして該 面の圧縮はトロンビンとフィブリンの分離を容易にする。

特に好ましいのは、軟質材が連続気孔を持つスポン７の場合である。

軟質材は注射器に入れることができ、該軟質材の中に溶解沈澱物を吸収させるこ とができ、かつ軟質材から注射器のピストンの活動によって、トロンビンをしぼ り出すことができる。このようにして、トロンビンの軟質材からの特に容易な分 離が確実となる。

さらに、本発明による遠心分離は、約１５００ｇで約５分にわたって適当に行う ことができ、これもトロンビンの製造を促進する。

このように本発明は、ヒト血漿からトロンビンを製造する方法を包含し、該方法 において、血漿を水または池のイオン濃度低減液体およびｐＨを約５０〜５３に 下げる酸で、約１０〜１７％に希釈した後、混合物を遠心分離し、そして該方法 において、遠心分離で生成する沈澱物を生理的溶液および塩化カルシウムと混和 し、該生理的溶液はｐＨを約６〜８に上げ、該方法の特徴は、希釈工程を直接希 酸Ｉｓ液で行い、遠心分離工程を比較的大きいフラットな沈澱面を持つ容器内で 行い、ｐＨ増加剤を有する生理的溶液と塩化カルシウムを混合して沈澱物へ同時 に加えることにより、沈澱物を溶解し、次いでフィブリンを形成しながら沈澱物 を凝固せしめ、およびトロンビンをフィブリンから取出すことである。

２、血液凝固第Ｘおよび■因子を活性化する表面材（５ｕｒｆａｃｅ）に血液ま たは血漿を接触せしめることによるトロンビン形成の促進・一本発明の他の側面 は、血液凝固第Ｘおよび立因子を活性化する表面材に全血または血漿を接触させ る、トロンビン血液分画の製造である。ガラスあるいはカオリンなどの陰荷電表 面材（ガラスが好ましい）は上記の活性化を付与しうることが認められる。ガラ ス表面材の非制限的具体例は、ガラスピーズ、ガラスウール、ガラスフィルター およびガラス毛管である。

全血または血漿は、上記血液凝固因子を活性化するのに十分な時間にわたり、た とえば約５〜１０分間表面材と接触させるべきである。全血または血漿を抗凝固 剤で処理していない場合、該全血または血漿は約６０秒を越えない時間、好まし くは約３０秒以下、より好ましくは約１５秒で表面材と接触させるべきである。

抗凝固剤を用いず、モして全血または血漿と表面材の接触があまりに長いと、フ ィブリン塩は時機薗早に形成するだろう。

血漿は、各血漿１社当り、表面材の約４〜６０ｃｍ２、好ましくは約１０〜３０ ｃｍ２、最も好ましくは約２０ｃｍ”の面積にわたって露出することが好ましい 。また全血は、各全血１ｍｌ当り、表面材の約２〜３０ｃｍ”、好ましくは約５ 〜１５Ｃ■２、最も好ましくは約１０ｃｍ２の面積にわたって露出することが好 ましい。

血漿または全血と、策Ｘおよび■因子を活性化しうる表面材との接触は、プロト ロンビンのトロンビンへの変換時間を加速することが認められる。このように、 トロンビン血液分画を極めて短時間で製造することができる。

この第Ｘおよび■因子の活性化を用いることにより、トロンビン血液分画の作り 方並びにその純度および比活性にかかわらず、いずれのトロンビン血液分画の製 造も促進することができる。しかしながら、トロンビン血液分画は実質的に活性 抗トロンビン■を含まないことが必要不可欠である。抗トロンビン■は、プロト ロンビンをトロンビンへ変換する前に、トロンビン血液分画から除去するかある いは該血液分画中で不活性にしておくことが必要不可欠である。さもなければ、 抗トロンビン■はプロトロンビンのトロンビンへの変換を妨害するかおよび／ま たはトロンビンを不活性化するだろう。またトロンビン血液分画は、実質的にフ ィブリノーゲンおよびフィブリンを含まないことが好ましい。たとえば、活性化 に関して、トロンビン血液分画が上記文節１１．で記載したようにニーグロブリ ン分画によって製造されるとき、血漿の接触は血漿の希釈の直前に行うべきであ る。トロンビン血液分画が上記文節１．２　で記載したように全血の希釈によっ て製造されるとき、全血の接触は全血の希釈の直前に行うべきである。たとえば 、この接触工程は、たとえばガラスピーズを含有する注射器の中へ、全面を抜き 取ることによって行うことができる。約６０秒を越えない時間の後、注射器から 全血を排出し、次いで上述の如くして、本発明のトロンビン血液分画を製造する 。

３　本発明のトロンビン血液分画の使用一本発明のトロンビン血液分画は、動物 の公知または開発すべきいずれの医療処置（獣医処置を含む）においても使用す ることができる。動物のいずれの種も適当であるが、勿論、ヒトが好ましい。

トロンビン血液分画は、フィブリンノーランドの成分として使用でき、あるいは ちょうど通常のトロンビン製剤が用いられているように単独で使用することがで きる。トロンビン血液分画は、これに動物の所望部位を接触させることによって 使用される。本発明の目的から、“所望部位”とは、フィブリン塩の形成が望ま れる動物の体内外の箇所である。所望部位が何かあるいはその場所は、本発明の トロンビン血液分画の使用に左右される。

トロンビン血液分画のフィブリンノーランドの成分としての使用は、組織あるい は器官の連結、出血の停止、創傷の治癒、外科創傷の７−ルに用いることができ 、血管外科での使用として、末梢冠動脈吻合の縫合大出血；左心室縫合線、大動 脈切開およびカニユーレ挿入部位、再手術で見られる散在性上心筋出血、および 静脈出血部位からの、たとえば心房、大静脈、または右心室レベルでの浸出に対 して止血を付与することが含まれる。また本発明は、移植前のダクロン（ｄａｃ ｒｏｎ）動脈移植組織の７−ル、体外組織の７−ル：細胞生長のためのフィブリ ン浮遊物の生成、損傷した膵臓からの出血の停止（これによって該器官を守る） 、損傷した肝臓および他の実質性器官からの出血の停止、肺の気管および気管支 吻合並びに空気漏れまたは破傷のンール：気管支断端、気管支フィステルおよび 食道フィステルのンール：大脳内ＡＶＭ、肝臓ＡＶＭ、結腸の血管異形成、食道 静脈瘤、消化性潰瘍への二次的な“ボンピング（ｐｕｍｐｉｎｇ）”Ｇｌ血友病 患者等の血管放射線医学における、熱縫合ノームレス治癒（“ノソバー（Ｚ　１ ｐｐｅｒ）”法）および修復（ｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏ口）にも有用である。さ らに本発明は、角膜移植、鼻血、扁桃摘出後、抜歯および他の処置において止血 を行うのに有用である。Ｇ、Ｆ　ゲストリングおよびＲ，ラーマ−のｒＶａｓｃ ｕｌａｒ　ＳｕｒｇｅｒｙＪ（２９４−３０４，１９８３年９月／り０月）参照 。

本発明のトロンビン血液分画は、浸出する出血または中空器官の出血を止めるの に、単独で使用しうる。またトロンビン血液分画は、血小板からの物質、すなわ ち、血小板導出因子の放出を活性化するのに用いることにより、損傷した生きた 動物組織の処置にも利用でき、かかる物質は、損傷組織の治癒に利用できる（米 国特許Ｎｏ、５１６５９３８参照）。またトロンビン血液分画は、ケラチノサイ トの細胞培養生長の助成およびケラチノサイトまたは他の皮膚導出細胞、たとえ ば線維芽細胞の自己由来移植の助成にも利用できる。■　ロンファードらのｒＢ ｕｒｎｓＪ（１７：１８１−１８４．１９９１年）、Ｈ，ブロリイのカナダ特許 Ｎｏ、２０１８０２０およびＪ　ハンヤジらのＯ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｓｕｒｇ 、　０ｎｃｏ１．　Ｊ（１ニア５−７８．１９８８年）参照。またトロンビン血 液分画は、所望部位と接触される固体支持体、たとえばバンプー／、縫合材、プ ロテーゼまたはドレッノング（包帯）上に載せることができる。次いで、かかる 支持体を、たとえばフィブリン塩が形成するまで、所望部位に接触させて設！す る。

トロンビン血液分画の用量は個々の用途に左右されるが、その意図される用途を 行うのに有効な量とすべきである。一般に、約０５〜５ｍｌのトロンビン血液分 画が十分であると思われる。しかし、該用量は用途に応じて、約００５〜４０■ ｌの範囲で選定しうる。

トロンビン血液分画をフィブリンノーランドの成分として用いる場合、そのフィ ブリンノーラントを所望部位へ、たとえば二重バレル注射器で塗布することがで きる。二重バレル注射器はＹ形であってよく、これによって、接触工程の直前に 、フィブリノーゲンとトロンビン血液分画の混和を可能ならしめる。またＹ形の 二重バレル注射器よりむしろ、２つの開口を持つ二重バレル注射器を用いること ができる。これは所望部位の同時接触を可能にする。また、二重バレル注射器の 組成物を所望部位へ噴霧することができる。Ｈ，Ｂ　クラムらのｒＴｈｅ　／’ ｖｅｒｉｃａｎＳｕｒｇｅｏｎＪ（５７：３８１．１９９１年）参照。また該血 液分画をフィブリンノーラントの成分として用いる場合、自己由来フィブリノー ゲンを用いることにより、フィブリンノーラント全体を自己由来とすることがで きる。またトロンビン血液分画を単独で用いる場合、該血液分画を所望部位へ単 一バレル注射器で塗布することができる。

また注目すべき点は、本発明のトロンビン血液分画がさらにカルシウムイオン源 、たとえば塩化カルシウムを包含していることである。カルシウムイオン源は、 フィブリノーゲンのフィブリン塩への変換を助成する。カル／ラムイオンの量は 、通常のフィブリンノーラントでの使用量と同じにすべきである。しかしながら 、トロンビン血液分画は既に、プロトロンビンのトロンビンへの変換のためにカ ルシウムイオン源を含有しつるので、追加のカルシウムイオン源が要求されるこ とはない。しかし、トロンビンを形成するためより、フィブリン塩を形成するた めに多くのカルシウムが必要な場合、トロンビンの形成に要求されるものより余 分のカルシウムを用いることにより、トロンビン血液分画を医療処置において、 たとえばフィブリンノーランドの成分として用いるときに、別途カルシウムを加 える必要がないようにすることができる。

！施撚 成人ドナーの新鮮血液１７ｍ１から得られるトロンビン血液分画含有組成物の製 造− ヒトの静脈に注射針を刺し、空の３０１１１注射器へ１７ｍ１の血液を抜き取る 。血液を抜き取った後直ちに、血液を、５．５％グルコース含有溶液３４ｍ１を 有する５０■１試験管へ移す。５Ｑｉｌ試験管を遠心機に入れ、室温にて１５０ ０ｘｇで５分間遠心分離する。遠心分離後、上層の血漿／グルコース溶液４０ｍ １を注射器で取出し、新しい５０！＋１試験管に移す。

２．８％クエン酸溶液１．０７ｍ１で、血漿／グルコース溶液のｐＨを５２に下 げ、室温で１０分後、溶液を１８℃にて１５００Ｘｇで５分間の遠心分離に付す 。遠心分離後、上層液を排出し、沈澱物を１４ミリモル／ＬのＮａＨＣＯ，およ び８ｇ／ＬのＮａＣ１含有の溶液０．４２４ｍ１に溶解する。この沈澱物は、フ ィブリノーゲン、プロトロンビンおよび他の血液タンパクを含有するが、実質的 に抗トロンビンｍを含まない。この溶解したプロトロンビン含有ニーグロブリン 溶液のｐＨは７．３５である。

プロトロンビンの活性化は、０５モル／ＬのＣａＣｌ２含有溶液０．０２７ｍｌ の添加によって行う。ＣａＣ１□の添加ｉ＆１２〜１７分で、溶液中のフィブリ ノーゲンが凝固を開始し、このように形成したフィブリンを、ポリスチレンスパ チュラで取出す。異なる間隔で、少量のサンプルを取り、トロンビン濃度（Ｎ［ Ｈユニ）１−（ｕ／ｍｌ）を測定する。結果を下記表１に示す。

表１ 実施例■ 成人ドナーの新鮮なガラス活性化血液１７ｍ１から得られるトロンビン血液分画 含有組成物の製造− この実験において、ドナーおよび行った日は実施例■のそれらと同じである。

ヒトの静脈に注射針を刺し、直径約２順のガラスピーズ２０ｇを含有する３０鳳 １注射器に、２０１１の血液を抜き取る。ガラスピーズの全表面積は約２３０Ｃ １１２、従って、全血１ｍｌ当りの表面積は約１１．５ｃｍ２である。

血液の抜き取り後直ちに、注射器を１０〜１５秒間穏やかに何回かひつくり返し てから、１７ｍ１の血液を、５５％グルコース含有溶液３４■ｌを有する５Ｑｍ ｌ試験管へ移す。５０ｍ１試験管を遠心機に入れ、室温にて１５００Ｘｇで５分 間遠心分離する。遠心分離後、上層の血漿／グルコース溶液４０１１を注射器で 取出し、別の５０ｍ１試験管に移す。

２８％クエン酸溶液１．０７ｍ１で、ｐＨを５．２に下げ、室温で１０分後、溶 液を１８℃にて１５００ｘｇで５分間の遠心分離に付す。遠心分離後、上層液を 排出し、沈澱物を１４ミリモル／ＬのＮａＨＣＯｌおよび８ｇ／ＬのＮａＣ１含 有の溶液０．４２４ｍ１に溶解する。この沈澱物は、プロトロンビン、フィブリ ノーゲン、および他の血液タンパクを含有するが、実質的に抗トロンビン■を含 まない。この溶解したプロトロンビン含有ニーグロブリン溶液のｐＨは７３５で ある。

プロトロンビンの活性化は、０．５モル／ＬのＣａＣ１１含有溶液０．０２７ｍ ｌの添加によって行う。ＣａＣｌ２の添加後４〜９分で、溶液中のフィブリノー ゲンが凝固を開始し、このように形成したフィブリンを、ポリスチレンスパチュ ラで取出す。異なる間隔で、少量のサンプルを取り、トロンビン濃度を測定する 。結果を下記表Ｈに示す。

表ｎ このように表■の結果から、ガラス活性化は、プロトロンビンのトロンビンヘの 変換に必要な時間を加速することが容易にわかる。たとえば、カル／ラムイオン 源の添加後わずか１０分で、１３ＯＮＩＨユニツト／■１のトロンビン活性が測 定される。これに対して、実施例Ｉの如くガラス活性化なしでは、カル／ラムイ オン源の添加Ｕｋ１０分で、トロンビン活性を検出することができない。

実施例ｍ 低いトロンビン比活性を特徴とする、成人ドナーの新鮮血液１７ｍ１から得られ るトロンビン分画含有組成物の製造、一実施例■の記載に準じ行う４つの実験に おいて、トロンビン濃度とトロンビンの比活性を測定する。結果を下記表■およ び■に示し、ここで、ｐＨ値は溶解したニーグロブリン分画のｐＨである。

表■ 表■ このように、実施例■に記載のトロンビン血液分画の製造は、本発明の濃度およ び比活性のトロンビン血液分画をもたらす。

実施例■ ＰＣＴ／ＤＫ９１１００１３１の装置を用いる全血からのトロンビンの製造、− トロンビンの製造に、ＰＣＴ／ＤＫ９１１００１３１に記載の装置を用いる。

該装置において、チューブ（３９）に取付けたフィルター（４３）を介して、第 １室（１４）へ５５％グルコース溶液４０腸１を加えてから、血液を加える。

ヒトドナーから１０＋＋１の血液を注射器へ採取し、その後直ちに、チューブ（ ３９）を介してグルコース溶液の中に移す。装置を遠心機に入れ、１５００Ｘｇ で５分間遠心分離する。遠心分離後、血漿／グルコース溶液を、室（１４）に残 っている赤血球といっしょに、第２室（３０）に移す。チューブ（６０）の殺菌 フィルターを介して、血漿／グルコース溶液に２．８％クエン酸溶液領６社を加 える。５〜１０分後、装置を遠心機に入れ、１５００Ｘｇで５分間遠心分離する 。遠心分離後、上層液を第１室（１４）に移し、第２室（３０）に沈澱物のニー グロブリン分画が残存する。チューブ（６０）の殺菌フィルターを介して、第２ 室（３０）に７．５ｍＭのＮａＨＣＯｘ、５２＋＋ＭのＮａＣ１および３０１Ｉ ＭのＣａＣｌ２含有の溶液０．８５ｍｌを加える。ニーグロブリン沈澱物は１〜 ２分内で溶解し、これを第２室（３０）に接続した注射器（５１）に移す。注射 器は、形成したフィブリンの除去を容易にするポリウレタンスポンノを有する。

３０分〜２２時間後に、トロンビンｓＰｉを測定する。結果を下記表Ｖに示す。

実施例Ｖ ＰＣＴ／ＤＫ９１１００１３１の２つの連結装置によるデバイス・システムを用 いる、全血からのトロンビンおよびフィブリノーゲンの製造、並びにフィブリン グルーにおけるトロンビンおよびフィブリノーゲンの使用・−デバイス・システ ム（ｄｅｖｉｃｅ　ｓｙｓｔｅｍ）は、ＰＣＴ／ＤＫ９１１００１３１に記載の ２つの装置から成る。２つの装置からの２つのチューブ（３９）を、三方コネク ターで同じカニユーレ（４０）に連結する。トロンビン沈澱に用いる装置におい て、第２室（３０）に直径３■の５つのガラスピースを入れる。トロンビン装置 の注射器を、フィブリノーゲン装置の３ｍｌ注射から１ｍｌ注射器に変える。

ドナーから採血する前に、２つの装置へクエン酸塩溶液およびグルコース溶液を 充填する。チューブ（３９）に取付けたフィルター（４３）を介して、３８％ク エン酸塩溶液力１を、フィブリノーゲン装置（以下、装置−Ｆと称す）の第１室 （１４）に加える。チューブ（３９）に取付けたフィルター（４３）を介して、 ５．５％グルコース溶液３４ｍ１を、トロンビン装置（以下、装置−Ｔと称す） の第１室（１４）に加える。

クエン酸塩溶液を含有する装置−Ｆの第１室（１４）に、カニユーレで血液４５ 蕩１を収集し、グルコース溶液を含有する装置−Ｔの第１室（１４）に、血液１ ７ｍ１を収集する。血液の収Ｓ後、ドナーからセパレーター−／ステムを外し、 チューブ（３９）を入口（３８）へ密にノールする。両装置を遠心機に入れ、１ ５００Ｘｇて１０分間遠心分離する。

装置−Ｆの分離し、た血漿を第２室（３０）に移し、第２室（３０）にチューブ （６０）の殺菌フィルターを介して、９６％エタノール溶液２．５ｍｌを加える 。そこで、装置を氷水浴に２０分間入れて、血漿／エタノール溶液の温度を約０ 〜４℃に下げる。この温度で、血漿中のフィブリノーゲンの８５％が沈澱する。

そこで、装置を遠心機に入れ、１５００Ｘｇで５分間遠心分離する。上層の血清 を第１室（１４）に移し、３７℃で５分間培養して、固体フィブリノーゲンを溶 解する。溶解した溶液を、殺菌注射器（５１）に移す。フィブリノーゲンの濃度 を測定したところ、３１ｍｇ／ｍｌであった。

装置−Ｔの分離した血漿／グルコースを、第１室（１４）に残っている赤血球と いっしょに、第２室（３０）へ移す。チューブ（６０）の殺菌フィルターを介し て、血漿／グルコースの殺菌フィルターを介して、血漿／グルコース溶液に２． ８％クエン酸溶液１．２１１１１を加える。５〜１０分後、装置を遠心機に入れ 、１５００×ｇで５分間遠心分離する。遠心分離後、上層液を第１室（１４）に 移し、第２室（３０）に沈澱物のニーグロブリン分画が残存する。チューブ（６ ０）の殺菌フィルターを介して、第２室（３０）に、７．５ｍＭのＮａＨＣＯｓ 、５２ｍＭのＮａＣ１および３０ｍＭのＣａＣ１□含有の溶液０．８５ｍ１を加 える。ニーグロブリン沈澱物が１〜２分内で溶解し、プロトロンビンのトロンビ ンへの活性化中に形成したフィブリンを、第２室（３０）に入れた５つのガラス ピーズ上に収集する。１５分後、トロンビン溶液を、第２室（３０）に接続した 注射器（５１）へ移す。１５−３０−６０分後にトロンビン濃度を測定したとこ ろ、それぞれ２４８−３４０−３７２ＮＩＨｕ／■ｌであった。

二重バレル注射器として、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含有する２つの 注射器を用いた。かかる注射器から２つの溶液を押出すと、直ちに堅いフィブリ ン塩が形成した。

実施例■ ６１１１の血漿に５４ｍ１の０．０４％ＨＡｃを加える。この混合物を、上記Ｐ ＣＴ／ＤＫ９１１００１３１より公知の平底容器に入れる。容器は４．５ｃｍの 内径を持つ円形横断面を有している。ｐＨ値は５．３である。得られる混合物の ｐＨ値および比較的低いイオン濃度は、遠心分離による沈澱物として、以下に示 す凝固因子、とりわけプロトロンビンの沈澱を確保する。遠心分離は１５００ｇ で５分間行う。

このように遠心分離は比較的早く終了するが、これは比較的低い落下高さおよび 大きな沈澱面による。過剰液体の除去後、沈澱物に０．９％のＮａＣ１、鉤０３ ％（１）ＮａｔＣＯ３１６よＵ２５ｍＭのＣａＣｌ２の水溶ＭＯ，７５ｍ１を加 える。沈澱物の溶解後、溶液をポリウレタンスポンジ含有の２．５ａ＋１注射器 に吸込む。フィブリンの形成は、沈澱物が完全に溶解状態になってから約１〜２ 分まで、すなわち吸込み操作のための十分な時間を越えるまでは開始しない。注 射器中のフィブリン形成が終了した後、注射器のピストンでスポンジを絞ること により、トロンビン溶液を押し出すことができ、残ったフィブリンはスポンジの 大きな表面上に沈着する。

溶解した沈澱物は、６．５のｐＨ値を有する。別の異なる量のＮａ２ｃＯｓもし くは他の塩基または緩衝剤系を、ｐＨ値が６０〜７．５を条件として使用するこ とができるが、トロンビンの保存性と、凝固プロセスを促進するトロンビンの畦 カとの最適バランスは、ｐＨ６，５のときであることが認められる。

３０分後に注射器からトロンビンを押し出し、２５６ＮＨＩユニット／ｍｌの濃 度を得る。トロンビン濃度は時間によって増加するが、３０〜６０分後に、フィ ブリンノーラントの２Ｉ！常の使用に十分な量のトロンビンを得る。

本実施例におけるトロンビンの製造は、１２＋１１１の自己由来血液から行い、 ４５〜６０分の期間にわたって、すなわち、フィブリノーゲンの製造の終了とほ ぼ同時に終了する。トロンビンの生成量は、ＰＣＴ／ＤＫ９１１００１３１に記 載の方法で４５ｍ１の自己由来血液から生じるフィブリノーゲンとの併用使用に 対して十分である。

トロンビン製造中に形成したフィブリンは、常にトロンビンと結合する傾向を有 する。しかし、このトロンビンの放出（ｒｅｌｅａｓｅ）は、生理的溶液と任意 に混合したプラスミノーゲン触媒、たとえばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ またはｔ−ＰＡ（組織プラスミノーゲン触媒）の添加によって、促進することが できる。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年１２月１６日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９３１０１３２３ ２、発明の名称 医療処置で用いるトロンビン血液分画 ３、特許出願人 名称　イー・アール・スクイブ・アンド・サンズ・インコーホレイテッド ４、代理人　〒５４０ 住所　大阪府大阪市中央区域見１丁目３番７号請求の範囲 １、動物またはヒトの医療処置においてトロンビンを用いる方法であって、該ト ロンビンが、 （ａ）約１〜２００ＯＮＪＨユニツト／層１のトロンビン濃度、および（ｂ）血 液タンパクｌｏｇ当り約１〜２０（：ＩＮＩＨユニットのトロンビンの比活性を 有し、かつユニット容量当り正常な血漿中で約５０％活性以下の抗トロンビン■ を含有しおよび個々の動物から製造されるトロンビン血液分画であって、上記医 療処置を鎖側々の動物で行うことを特徴とするトロンビンの使用方法。

２　個々の動物またはヒトが哺乳動物である請求の範囲ｌに記載の方法。

３、′＠乳動物がヒトである請求の範囲２に記載の方法。

４、トロンビン血液分画が、実質的にフィブリノーゲンおよびフィブリンを含ま ない請求の範囲３に記載の方法。

５　トロンビン血液分画が、１０〜５０ｍ１の全血から製造される請求の範囲３ に記載の方法。

６　トロンビン濃度が、約５〜１００ＮＩＨユニツト／ｍｌである請求の範囲３ に記載の方法。

７　トロンビンの比活性が、血液タンパク１１！ｇ当り約５〜１００ＮＩＨユニ ツトである請求の範囲３に記載の方法。

８　トロンビンの比活性が、血液タンパクｌｅｇ当り約５〜５ＯＮＩ）（ユニッ トである請求の範囲７に記載の方法。

９　トロンビン血液分画が、ニーグロブリン血液分画の製造によって製造される 請求の範囲１に記載の方法。

１０トロンビン血液分画が、実質的に活性抗トロンビンｍを含まない血漿である 請求の範囲１に記載の方法。

工１　医療処！が、フィブリン塊の形成である請求の範囲１に記載の方法。

１２、フィブリン塊がフィブリンノーラントによって形成され、該フィブリンシ ーラントの１成分がトロンビン血液分画で、該フィブリンノーラントの第２成分 がフィブリノーゲンである請求の範囲１１に記載の方法。

１３、医療処置が、浸出する出血または中空器官の出血を止めることである請求 の範囲１に記載の方法。

１４、医療処置が損傷した生きた動物組織の処！であって、該損傷組織に、血小 板からの放出物質およびトロンビン血液分画から成り上記放出物質がトロンビン 血液分画によって血小板から放出される組成物を、塗布することによる処置であ る請求の範囲１に記載の方法。

１５、医療処置が、ケラチノサイトまたは繊維芽細胞の自己由来移植である請求 の範囲１に記載の方法。

１６　全血からプロト０ンビン血液分画を製造する方法であって、（ａ）全血を 約１００ミリモル以下のイオン濃度まで希釈し、（ｂ）該全血から血漿を分離し 、 （Ｃ）該血漿のｐＨを下げて、プロトロンビン血液分画を沈澱せしめ、次いで（ ｄ）該プロトロンビン血液分画を血漿から分離することから成ることを特徴とす るプロトロンビン血液分画の製造方法。

１７、全血に抗凝固剤を加えない請求の範囲１６に記載の方法。

１８、希釈工程（ａ）に先立ち、全血を約６０秒を越えない時間で、血液凝固第 Ｘおよび■因子を活性化する表面材に接触せしめる請求の範囲１７に記載の方法 。

１９、表面材が陰荷電表面材である請求の範囲１８に記載の方法。

２０、陰荷電表面材がガラスである請求の範囲４９に記載の方法。

２１、プロトロンビン血液分画のプロトロンビンをトロンビンへ変換することに より、トロンビン血液分画を形成する工程をさらに包含する請求の範囲１６に記 載の方法。

２２トロンビン血液分画からフィブリン塊を除去する工程をさらに包含する請求 の範囲２１に記載の方法。

２３、全血または血漿からのトロンビン血液分画の製造方法において、該全血ま たは血漿を、該全血または血漿の希釈の前に、第夏および■因子を活性化しつる 表面材に接触せしめることにより、該第Ｘおよび夏因子を活性化し、トロンビン 血液分画がユニット容量当り正常な血漿中で約５０％活性以下の抗トロンビン■ を含有することを特徴とするトロンビン血液分画の製造方法。

２４３表面材が陰荷電表面材である請求の範囲２３に記載の方法。

２５、表面材がガラスである請求の範囲２４に記載の方法。

２６、全血または血漿を抗凝固剤で処理せず、接触工程が約６０秒を越えない請 求の範囲２５に記載の方法。

２７、接触工程が約３０秒以下である請求の範囲２６に記載の方法。

２８、接触工程が約１５秒である請求の範囲２７に記載の方法。

２９、接触工程が、血漿をガラスに接触せしめることからなり、ガラスが血漿１ １１当り約４〜６０ｃ■２の量で存在する請求の範囲２６に記載の方法。

３０　ガラスが血漿１ｍｌ当り約２０ｃｍ”の量で存在する請求の範囲２９に記 載の方法。

３１、接触工程が、全血をガラスに接触せしめることからなり、ガラスが全血１ ■ｌ当り約２〜３０ｃｍ２の量で存在する請求の範囲２６に記載の方法。

３２、ガラスが全血１票１当り約１０ｃｍ”の量で存在する請求の範囲３１に記 載の方法。

３３トロンビンを用いる、皮膚からのケラチノサイトの細胞培養生長の方法であ って、皮膚が由来する同じ個々の動物またはヒトからトロンビンを導出すること を特徴とする方法。

３４、トロンビンが、 （ａ）約１〜２００ＯＮＩＨユニツト／＋ａｌのトロンビン濃度、および（ｂ） 血液タンパク１■ｇ当り約１〜２０ＯＮＩＨユニツトのトロンビンの比活性を有 し、かつユニット容量当り正常な血漿中で約５０％活性以下の抗トロンビン■を 含有するトロンビン血液分画である請求の範囲３３に記載の方法。

３５、トロンビンによって活性化された血小板からの放出物質を包含する組成物 の製造方法であって、血小板と同じ個々の動物またはヒトからトロンビンを導出 することを特徴とする方法。

３６、トロンビンが、 （ａ）約１〜２００ＯＮＩＨユニツト／ｍｌのトロンビン濃度、および（ｂ）血 液タンパク１ｍｇ当り約１〜２０ＯＮＩＨユニツトのトロンビンの比活性を有し 、かつユニット容量当り正常な血漿中で約５０％活性以下の抗トロンビン■を含 有するトロンビン血液分画である請求の範囲３５に記載の方法。

３７、　（ａ）約１〜２００ＯＮＩＨユニツト／■１のトロンビン濃度、および （ｂ）血液タンパク１＋＋ｇ当り約１〜２０ＯＮＩＨユニツトのトロンビンの比 活性を有し、かつユニット容量当り正常な血漿中で約５０％活性以下の抗トロン ビン■を含有するトロンビン血液分画を、血液損失の処置に用いる医薬の製造に 使用することを特徴とするトロンビン血液分画の使用。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年１２月１６日

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．動物の医療処置においてトロンビンを用いる方法であって、該トロンビンが 、 （ａ）約１〜２０００ＮＩＨユニット／ｍ１のトロンビン濃度、および（ｂ）血 液タンパク１ｍｇ当り約１〜２００ＮＩＨユニットのトロンビンの比活性を有し 、かつ実質的に活性抗トロンビンＩＩＩを含まないトロンビン血液分画であるこ とを特徴とするトロンビンの使用方法。
2. ２．トロンビン血液分画が、個々の動物から製造される請求の範囲１に記載の方 法。
3. ３．医療処置が、個々の動物において行われる請求の範囲２に記載の方法。
4. ４．個々の動物が哺乳動物である請求の範囲３に記載の方法。
5. ５．哺乳動物がヒトである請求の範囲４に記載の方法。
6. ６．トロンビン血液分画が、実質的にフィブリノーゲンおよびフィブリンを含ま ない請求の範囲５に記載の方法。
7. ７．トロンビン血液分画が、１０〜５０ｍ１の全血から製造される請求の範囲５ に記載の方法。
8. ８．トロンビン濃度が、約１００〜８００ＮＩＨユニット／ｍ１である請求の範 囲５に記載の方法。
9. ９．トロンビンの比活性が、血液タンパク１ｍｇ当り約５〜１００ＮＩＨユニッ トである請求の範囲５に記載の方法。
10. １０．トロンビンの比活性が、血液タンパク１ｍｇ当り約５〜５０ＮＩＨユニッ トである請求の範囲９に記載の方法。
11. １１．トロンビン血液分画が、ユーグロブリン血液分画の製造によって製造され る請求の範囲１に記載の方法。
12. １２．トロンビン血液分画が、実質的に活性抗トロンビンＩＩＩを含まない血漿 である請求の範囲１に記載の方法。
13. １３．医療処置が、フィブリン塊の形成である請求の範囲３に記載の方法。
14. １４．フィブリン塊がフィブリンシーラントによって形成され、該フィブリンシ ーラントの１成分がトロンビン血液分画で、該フィブリンシーラントの第２成分 がフィブリノーゲンである請求の範囲１３に記載の方法。
15. １５．医療処置が、浸出する出血または中空器官の出血を止めることである請求 の範囲３に記載の方法。
16. １６．医療処置が損傷した生きた動物組織の処置であって、該損傷組織に、血小 板からの放出物質およびトロンビン血液分画から成り上記放出物質がトロンビン 血液分画によって血小板から放出される組成物を、塗布することによる処置であ る請求の範囲３に記載の方法。
17. １７．医療処置が、ケラチノサイトまたは線維芽細胞の自己由来移植である請求 の範囲３に記載の方法。
18. １８．全血からプロトロンビン血液分画を製造する方法であって、（ａ）全血を 約１００ミリモル以下のイオン濃度まで希釈し、（ｈ）該全血から血漿を分離し 、 （ｃ）該血漿のｐＨを下げて、プロトロンビン血液分画を沈澱せしめ、次いで（ ｄ）該プロトロンビン血液分画を血漿から分離することから成ることを特徴とす るプロトロンビン血液分画の製造方法。
19. １９．全血に抗凝固剤を加えない請求の範囲１８に記載の方法。
20. ２０．希釈工程（ａ）に先立ち、全血を約６０秒を越えない時間で、血液凝固窮 ＸＩおよびＸＩＩ因子を活性化する表面材に接触せしめる請求の範囲１９に記載 の方法。
21. ２１．表面材が陰荷電表面材である請求の範囲２０に記載の方法。
22. ２２．陰荷電表面材がガラスである請求の範囲２１に記載の方法。
23. ２３．プロトロンビン血液分画のプロトロンビンをトロンビンへ変換することに より、トロンビン血液分画を形成する工程をさらに包含する請求の範囲１８に記 載の方法。
24. ２４．トロンビン血液分画からフィブリン塊を除去する工程をさらに包含する請 求の範囲２３に記載の方法。
25. ２５．全血または血漿からのトロンビン血液分画の製造方法において、該全血ま たは血漿を、第ＸＩおよびＸＩＩ因子を活性化しうる表面材に接触せしめること により、該第ＸＩおよびＸＩＩ因子を活性化し、トロンビン血液分画が実質的に 活性抗トロンビンＩＩＩを含まないことを特徴とするトロンビン血液分画の製造 方法。
26. ２６．表面材が陰荷電表面材である請求の範囲２５に記載の方法。
27. ２７．表面材がガラスである請求の範囲２６に記載の方法。
28. ２８．全血または血漿を抗凝固剤で処理せず、接触工程が約６０秒を越えない請 求の範囲２７に記載の方法。
29. ２９．接触工程が約３０秒以下である請求の範囲２８に記載の方法。
30. ３０．接触工程が約１５秒である請求の範囲２９に記載の方法。
31. ３１．接触工程が、血漿をガラスに接触せしめることからなり、ガラスが血漿１ ｍｌ当り約４〜６０ｃｍ２の量で存在する請求の範囲２８に記載の方法。
32. ３２．ガラスが血漿１ｍｌ当り約２０ｃｍ２の量で存在する請求の範囲３１に記 載の方法。
33. ３３．接触工程が、全血をガラスに接触せしめることからなり、ガラスが全血１ ｍｌ当り約２〜３０ｃｍ２の量で存在する請求の範囲２８に記載の方法。
34. ３４．ガラスが全血１ｍｌ当り約１０ｃｍ２の量で存在する請求の範囲３３に記 載の方法。
35. ３５．トロンビンを用いる、皮膚からのケラチノサイトの細胞培養生長の方法で あって、皮層が由来する同じ個々の動物からトロンビンを導出することを特徴と する方法。
36. ３６．トロンビンが、 （ａ）約１〜２０００ＮＩＨユニット／ｍ１のトロンビン濃度、および（ｂ）血 液タンパク１ｍｇ当り約１〜２００ＮＩＨユニットのトロンビンの比活性を有し 、かつ実費的に活性抗トロンビンＩＩＩを含まないトロンビン血液分画である請 求の範囲３５に記載の方法。
37. ３７．トロンビンによって活性化された血小板からの放出物質を包含する組成物 の製造方法であって、血小板と同じ個々の動物からトロンビンを導出することを 特徴とする方法。
38. ３８．トロンビンが、 （ａ）約１〜２０００ＮＩＨユニット／ｍｌのトロンビン濃度、および（ｂ）血 液タンパク１ｍｇ当り約１〜２００ＮＩＨユニットのトロンビンの比活性を有し 、かつ実質的に活性抗トロンビンＩＩＩを含まないトロンビン血液分画である請 求の範囲３７に記載の方法。