JPH03172174A - コーヒー植物と、その製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はコーヒー植物と、 るものである。

その調製方法に関す 従来の技術 コヒア属（ｇｅｎｕｓ　Ｃｏｆｆｅａ）は約７０の種か
らなり、その中で経済的に最も重要な種はコヒア　アラ
ビカ（（：．ａｒａｂｉｃａ）である。このコヒア　ア
ラビカ種は年間売上高である約１５０億ドルの市場の約
７０％を占めている。コヒア属の他の種の中には潜在的
に好ましい遺伝特性、例えばカフェインが存在しない、
あるいは、病気の対する耐久性がある等の好ましい遺伝
特性を持っているものがあるが、これらの種は一般にコ
ーヒー豆の産出高が低い、あるいはコーヒ豆から製造さ
れるコーヒーの品質が低い等の好ましくない他の性質を
持っている。これらの遺伝特性をコヒア　アラビカを組
込むことは好ましいことであるが、コヒア　アラピ力は
四倍体で、他の種は二倍体であるため、従来の植物育種
技術では組込みは戒功しなかった。非アラビカ種は自家
不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であ
るため、この属の野性異系交配種から栽培されたコヒア
　アラビカ栽培変種植物へ遺伝特性を伝達するのは極め
て困難である。さらに、コヒアの果実は実るまでの生育
期間が長く、豆から豆までの世代時間は２〜４年である
ため、従来の育種技術ではコストと時間がかかるという
問題がある。

最近では、コヒア属に属する種を遺伝的に改質させるた
めに、インビトロでの細胞培養技術と遺伝子組換え技術
に関心が向けられている。コーヒー栽培の分野では、イ
ンビトロ細胞培養技術が種々の面で古くから利用されて
いる。スタリッヰイ（Ｓｔａｒｉｔｓｋｙ）はコヒア　
カネ７オラ（Ｃ，　Ｃａｎｅｐｈｏｒａ）コヒア　アラ
ビ力（Ｃ，　ａｒａｂｉｃａ）およびコヒア　リベリ力
（Ｃ，　ｌｉｂｅｒｉｃａ）の直向性新芽からカルス組
織を誘導したが、体細胞不定胚と苗木が得られたのはコ
ヒア　カネフォラのみであった（＾ｃｔａ，　Ｈｏｔ．
Ｎｅｅｒｌ，　　第１９号、５０９頁、１９７０年〉。

ケラー（Ｋｅ−１　１ｅｒ）達は、カフェイン合成研究
の目的のためにコヒア　アラビカの内胚乳組織からカル
スを誘導している（　Ｐｌａｎｔａ，第１０８号、３３
９頁、１９７２年）。

シャープ（Ｓｈａｒｐ）達は、コヒア　アラビカの体細
胞と一倍体組織を培養してカルス戊長（茎、葉、緑色果
実〉と、前胚形戒（朽〉と、新芽生育（直向性新芽）と
に戊功している（　Ｐｈｙｔｏｎ、第３１号、６７頁、
１９７３年）。タウンズレ４　（Ｔｏｗｎｓｌｅｙ）は
懸濁液培養によってコーヒーアロマを作る目的でコヒア
　アラビ力の直向性新芽由来のカルスからのコーヒー細
胞液体培養を行っている（　Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．Ｆｏｏ
ｄ　Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，　　第７号、７９頁、１
９７４年〉。

ソンダール（Ｓｏｎｄａｈｏｌ）達はコヒア　アラビカ
［バーボン（Ｂｕｒｂｏｎ）栽培変種植物］の戊熟した
葉の培養移植片からの体細胞胚の誘導頻度を大小を報告
している（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒ
ｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｉｎ　　
Ｐｌａｎｔｓ，Ｈａｌｌｅ，　１８０　　頁、■９７７
年）。さらに、コヒア　アラピカ〔バーボン（Ｂｏｕｒ
ｂｏｎ）栽培変種植物Ｊの葉から誘導されたカルス組織
からプロトプラストが単離され、培養物の約３０％でカ
ルスが再生されている［スタリッキイ（Ｓｔａｒｉｔｓ
ｋｙ），″′＾ｅｔａ，　ＢａｔＮｅｅｒｌ．’第ｌ９
号、５０９頁、１９７０年１。しかし、このカルスから
の苗木が再生したという報告はない。

最近、ショーブク（Ｓｈｏｐｋｅ）達はコヒア　カネフ
ォラの体細胞不定胚（ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ
）をプロトプラスト培養して体細胞不定胚形戒し、苗木
を再生したと報告している（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　
　”Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄＯｒｇａｎ　　Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ″第８号、２４３頁、１９８７年〉。

コヒア属の種々の種の遺伝子組戊を無性生殖的に変える
ための研究はかなり行われてきたが、現在まで、プロト
プラストから遺伝的に変性された植物全体を安定して再
生する試みは戒功していない。従って、遺伝的変更が子
孫に安定して伝達できるように遺伝子的に変性されたコ
ヒア属植物を開発することが強く望まれている。

発明が解決しようとする課題 本発明は、完全な植物を再生することが可能なコヒア属
の遺伝的に変性したプロトプラストが製造可能であり、
このプロトプラスト中で生じた遺伝的変化は安定である
という発見に基づいて威されたものである。このプロト
プラストを遺伝的に変化させるためのＤＮＡを導入する
手段はエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）である。

課題を解決するための手段 従って、本発明は下記のものを提供する：（１〕　　完
全な植物を再生可能な遺伝子的に改質されたコヒア属の
プロトプラスト （２）このプロトプラスト中に誘導された遺伝子的変化
を安定に有する上記プロトプラストから再生された植物 （３）この植物またはその子孫によって産生された種子 （４）　　この植物またはその子孫に由来する組織。

本発明では、遺伝子的変化を子孫に遺伝子的に伝達する
遺伝子的に改質されたプロトプラストの単離、特性化（
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、生育に細胞培養
技術を利用する。

作用 本発明の上記以外の目的、特徴および利点は、以下の詳
細な説明および実施例からより明らかとなろう。

本発明の最も基本的なレベルは、完全な植物を再生する
に使用可能な遺伝子的変化を安定して保持した遺伝子的
に改質されたコヒア属のプロトプラストである。さらに
、上記植物の産生した種子も上記の遺伝子的変化を安定
して保持し、この種子から発芽・戒長して得られた植物
も同様に上記の遺伝子的変化を安定して保持する。従っ
て、その子孫は上記の遺伝子的変化を安定してコヒアの
未来世代に伝達する。

以下で説明するコヒア属のプロトプラストはカナマイシ
ン（Ｋａｎａｍｙｃ　ｉ　ｎ）耐性遺伝子を用いて遺伝
子的に改質したものである。驚くべきことに、このプロ
トプラストからカナマイシン耐性遺伝子が安定して存在
する細胞と完全な植物が再生できた。

これは、遺伝子的に改質したプロトプラストから安定し
た外来遺伝子特性を持つコヒア属の完全な植物を再生し
た最初の例である。この遺伝子安定性の結果、この外来
遺伝子特性はプロトプラストの子孫とそれから再生され
た植物とを介して伝達することができる。

本発明のプロトプラストは突然変異誘発化（ｍｕ−ｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）または調節遺伝子機構または構造遺伝
子機構をコード化する外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）　
　Ｄ　Ｎ　Ａの導入によって遺伝子的に改質できる。こ
の外因性ＤＮＡは中間デバイス〔例えば、ウィルス、バ
クテリア、細胞融合、ＤＮＡ被覆粒子または細胞小器官
（オルガネラ）〕を用いるか、直接法（例えば、ＰＥＧ
Ｓ　ＣａＣＩ２またはその他のＤＮＡ縮合技術、膜開裂
技術、エレクトロポレーションまたはマイクロ注入）に
よって導入できる。

個々の染色体、核またはＤＮＡ構造体に存在する種々の
原核細胞または真核細胞起源の調節遺伝子および構造遺
伝子とその他のＤＮＡをプロトプラストに導入すること
によって植物ゲノム中に組み込むことができる。このＤ
ＮＡは「裸」でも、ベクター系〔例えば、Ｔｉプラスミ
ドまたはカウリモウィルス（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ）　）中に組込んでもよい。導入された構造遺伝子
は極めて種々の改質をもたらす。植物の機能は各機能を
制御する遺伝子を導入することによって広範囲に変える
ことができ、例えば、植物の戒長を抑制または促進した
り、栄養分の要求量を変化させたり、各種植物の生底物
の生産量を増加または減少させたり、タンパクおよび／
またはサツカライドの含有量が増加させたりすることが
できる。また、不利な環境、例えば光量の減少、温度の
低下、水質の低下等の環境下でも植物が生存できるよう
にすることができ、微生物または害虫の感染から保護す
ることができる。また、殺虫剤に対する耐性を細胞に付
与することもできる。これらの改質は、これらの特性に
対応した特定のタンパクを生戊する構造遺伝子または発
現型を変えるための調節遺伝子を与えることによって行
うことができる。

コヒア属の場合に特に重要な遺伝子的改質は、プリンア
ルカロイド（例えば、カフェイン〉の含有量を変えて、
農業経済および嗜好に関係する固形分く炭水化物〉の量
を増加させ、しかも、害虫に対する抵抗力を高めること
である。

プリンアルカロイド含有量の改質に関しては、ボーマン
（Ｂａｕｎ＋ａｎ）達がｒＢｉｏｔｈｅｃｎｏｌｏｇｙ
　ｉｎ　Ａｇｒｉ−ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅ
ｓｔｒｙ，第４号、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ａｎｄ＾ｒｏ
ｍａｔｉｃ　Ｐｌａｎｔｓ　［，　Ｂａｊａｊ，　Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，　１９８
８年」に、テオブ０　７　（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）　（
：］コア）．　カメリア（Ｃａｍｅｌｌｉａ）　（茶〉
およびコヒア（Ｃｏｆｆｅａ）に対するカフェイン合威
用生化学的経路の一部を記載している。すなわち、カフ
ェイン濃度を高くするためには、例えばカフェイン合成
をフィードバック調節系から切り離せばよい。逆に、カ
フェイン濃度を減す場合には、カフェインが生成する際
にカフェインを減らす遺伝子を導入するのではなく、カ
フェイン合成を阻止する遺伝子を新たに導入するのが好
ましい〈ウールフォーク（ｌｌｏｏｌｆｏｒｋ）、Ｊ．
Ｂａｃｔ，　１２３号、１０８８頁、１９７５年〉。

カフェイン合或の第１段階（カフェイン合戒の分岐点）
はキサントシンから７−メチルキサントシンへのメチル
化であると考えられる。また、カフェイン合戒を阻止す
るために、例えば、キサントシンから７−メチルキサン
トシンへのメチル化に関与するメチル転移酵素遺伝子用
のｍＲＮＡ　［ハスｏ　７　（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）達「
ネーチャア（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ　、第３３４号、５８
５頁、１９８８年］または逆転移ＲＮＡ［エッカー（Ｂ
ｃｋｅｒ）達ｒＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｒｅａｄ，　Ｓｃ
ｉ．Ｊアメリカ合衆国、第８３号、５３７２頁、ｌ９８
６年；スミス（Ｓｍｉｔｈ）達「ネーチャア（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　Ｊ　　３３４号，７２４頁、１９８８年］とし
てのりボザイム［ハセロフ達の「ネーチャア（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　Ｊ第３３４号、５８５頁、１９８８年］を発現
する遺伝子の調節されたコピーを植物に与えることもで
きる。

嗜好に関係する固形分く炭水化物〉の量に関しては、コ
ーヒーの高品位抽出物中に見出される抽出可能な固体の
大部分は豆の炭水化物であるという点を指摘することが
できる［アマリム（＾ｍａｒｉｍ）達「トユリアルバ（
Ｔｕｒｒｉａｌｂａ）　Ｊ第２４号（２）、２１４頁、
１９７４年；　タレー（Ｔｈａ１ｅｒ）「フィールドオ
ブ　ケミストリイ（Ｆｄ，　Ｃｈｅｍ．）第４号、１３
頁、１９７９年；　スト口ベル（Ｓｔｒｏｂｅｌ）　　
ｒバンハリーレボー｝　（Ｂａｎｂｕｒｙ　Ｒｅｐｏｒ
ｔ）　」第１７号、“コーヒーと健康（Ｃｏｆｆｅｅ　
ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ）”、マクマホン（Ｍａｃｍａ−
ｈｏｎ）達ｍ、コールド　スプリング　ハーバー　ラボ
ラトリ４　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　
Ｌａｂｏ−　ｒａｔｏｒｙ　）、コールド　スプリング
　ハーバー（　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ｝１ａｒｂａｒ
）　二ｓ−ヨーク、１９８４年］。抽出率を高くすると
、品質を低下させる化合物も同時に抽出されてしまう。

品質を維持した状態でコーヒーの抽出率を高くするため
には、豆の簡単に抽出可能な炭水化物（その大部分はガ
ラクトマンナンである〉の含有量を増加させることであ
る。そのためには、ガラクトマンナン合戒に関与する遺
伝子量を増加させるか、その遺伝子構造の遺伝子調節機
構を変化させるか、抽出可能な他の炭水化物を生戒する
遺伝子を導入すればよい（例えば、澱粉合成を増加させ
るように適切に調節されたＡＤＰグルコースビロホスホ
リラーゼ遺伝子を導入する）。

炭水化物は、植物成長期にコーヒー植物の木の部分に貯
蔵され（果実成長期の逆である）で、植物の果実の結実
能力を決定する上で大きな役割を果たす［カンネル（Ｃ
ａｎｎｅｌｌ）達「アナル　オブアプライド　バイオロ
ジイ（＾ｎｎ，＾ρｐｌ，　Ｂｉｏｌ，　）　Ｊ第６４
号、３４５頁、１９６９年；　カンネル（Ｃａｎｎｅｌ
ｌ）達「アナル　オブ　アプライド　パイオロジイ（Ａ
ｎｎ，＾ｐｐｌ，　Ｂｉｏ１．）Ｊ第６７号、９９頁、
１９６９年；ヨナルダン（Ｊａｎａｒｄｈａｎ）達「イ
ンディアン　コーヒー（Ｉｎｄｉａｎ　Ｃｏｆｆｅｅ）
　　Ｊ第３　５　（４）号、１４５頁、１９７１年１。

澱粉の形で貯蔵された炭水化物は、果実が実る季節には
減って、種子を発育させるための補足の炭素源として使
用される。光合戒量と炭水化物貯蔵量に比較して種子が
多くなり過ぎた場合には、いわゆる「なり過ぎ」になり
、種子が落下することになり、その結果、植物の木の部
分から澱粉量が大幅に減少すると、植物は致命的なダメ
ッジを受ける。植物の光合成能力およびその他のファク
ターを考慮して、植物の戊長期に適切に調節されＡＤＰ
グルコース　ビロホスホリラーゼ活性因子を植物に追加
して導入することによって、木の組織中での澱粉貯蔵量
を増加させることができる。これによって結実期に種子
により多くの炭素を与えることができ、従って、植物の
保持能力を大きくすることができる。

遺伝子改質の他の重要な点は遺伝子を導入して害虫に対
する抵抗力を強くできる点にある。この遺伝子としては
以下用のものを挙げることができル：ハシリウス　サリ
ンジイエンシスｂｔ　　｝クシン（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ
　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｂｔ　ｔｏｘｉｎ）　　
［バエク（Ｖａｅｃｋ）達「ネーチャア（Ｎａｔｕｒｅ
）　Ｊ第３２８号、３３頁、１９８７年］、カウピイ　
トリブシン抑制剤（ＣＯＷ−ｐｅａ　ｔｒｙｐｓｉｎ　
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）　［ヒルグー（Ｈｉｌｄｅｒ）達
「ネーチャア」第３３０号、１６０頁、ｌ９８７年］、
グリフォセート抵抗（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ　ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｃｅ）　［デッラ　キ１１バ（ｄｅｌ　Ｉａ−
Ｃｉｏｐｐａ）達「バイオ／テクノロジ４（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　５号、５７９頁、１９８７
年］、プロモキシニル耐性体（　ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）　［スタルカー（Ｓｔａｌｋｅ
ｒ）達「サイエンス」第２４２号、４１３頁、１９８８
年］、ホスフィノトリシン耐性体（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏ
ｔｈｒｉｃ，ｉｎｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）［デブロ
ック（Ｄｅｂｌｏｃｋ）達「エンボ　ジャーナル（ＥＭ
ＢＯ　Ｊ．）　Ｊ第６（９）号、２５１３頁、１９８７
年］、ウィルス被覆蛋白クロス保護（ｖｉｒａｌ　ｃｏ
ａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ｒｏｓｓ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ）　　［レジスター（Ｒｅｇｉｓｔｅｒ）達の「バイ
ｏｏジイ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　Ｊ第１６６号、５２４
頁、１９８８年」。

以上、コヒＴのプロトプラストの遺伝子的改質法の一つ
の特殊な具体例を説明したが、本発明では、以上に説明
した方法と均等な多くの技術を用いることができる。本
明細書で用いられる「遺伝子的に改良された」という用
語は無性生殖によるゲノミック変化または修飾を示すの
に用いられ、このゲノミック変化は、例えばコヒアの本
因性遺伝子リストを無性生殖的に変更するか、外因性Ｄ
ＮＡすなわち外来ＤＮＡまたはプロトプラストの変種と
同一な変種またはそれと異なるコヒアの変種からのＤＮ
Ａを加えることによって起こすことができる。このゲノ
ミック変化は調節遺伝子または構造遺伝子に対して行う
ことができる。

上記の内因性遺伝子機能の変更は、例えば突然変異誘発
（ｍｕｔａｔｉｏｎ）　によって起すことができる。

この突然変異誘発は、種々の公知方法を用いて意図的に
起こすことができるということは周知であり、例えば化
学薬品、放射線、遺伝子組み換え技術によって起こすこ
とができる。第１表に示すように、化学的突然変異誘発
剤（ミュータゲン）は活性によって４つの群に分けるこ
とができる。

第１表 放射能誘起による突然変異は紫外線、Ｘ線等によって起
すことができる。この突然変異誘発機構は基本的に励起
または組み換えによる複製後修復によって行われる。

遺伝子の改質または修飾は「形質転換」によって行うこ
ともできる。この「形質転換」という用語は、通常の有
性生殖的な再生方法以外の方法によって、コヒアの一つ
の種または変種のゲノム地図（リスト）に任意のＤＮＡ
を加えるプロセスを表すのに用いている。「外来ＤＮＡ
Ｊという用語は、形質転換されている種以外の種に由来
するＤＮＡを示す。コヒアヘＤＮＡを導入する方法とし
ては公知の各種の技術を用いることができ、例えばＣａ
″“を沈着させた裸のＤＮＡを用いた形質転換、ブラス
ミドを用いた形質転換、または、ミクロソームニを用い
た形質転換（これらでは、ＤＮＡが複製されて構造遺伝
子が宿主に発現される〉、あるいは、例えばミクロピペ
ットを直接挿入して構造遺伝子とフランキング領域とを
宿主に直接導入することによって、非生殖的手段によっ
て宿主ゲノムにＤＮＡを組み込む形質転換を用いること
ができる。

単離された遺伝子または遺伝子群をコヒア　ゲノム中に
無性生殖で導入する場合には、一般に効率的な宿主遺伝
子ベクター系を用いる。導入された外因性の遺伝子は形
質変換された植物細胞中で発現され且つ次世代の細胞に
（体細胞的および有性生殖的に）安定して伝達されなけ
ればならない。

ベクターは、コヒア細胞中の遺伝子の導入、保持および
発現が可能な細菌、黴、酵母、ウィルスを含む各種の植
物、動物源から選択される。コヒアゲノム中に新規な遺
伝子が位置していることは、形質変換された植物が効果
的に遺伝子を発現する上で重要であり、また、効果的で
あるためには、通常の育種によって遺伝子修飾が子孫に
伝えられなければならない。

双子葉植物における無性生殖的な遺伝子修飾と外因性遺
伝子の発現はアグロバクテリウム　チュメファシエンズ
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド（ｔｕｍａｒ−ｉｎ
ｄｕｃｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ）のＴ−ＤＮＡを用いて
可能であるということは知られている。このアグロバク
テリウム（＾ｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）のＴ−Ｄ
ＮＡには、ＤＮＡ組み換え技術とバクテリア遺伝子学と
を用いてＤＮＡの任意の外因性段片を挿入することがで
きる。この細菌で感染させた後、宿主植物ゲノムに外因
性ＤＮＡを挿入して、遺伝子揉作された細胞、場合によ
っては遺伝子操作さ，れた植物を作ることができる。

第２の方法は、遺伝子ベクターとしてのルー｝１％導（
Ｒｉ）プラスミド（ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｐｌ
ａｓｍｉｄ）を導入する方法である。

上記のＴ１プラスミドＤＮＡまたはその他の遊離ＤＮＡ
は人工的な方法、例えばマイクロ注入またはプロトプラ
ストと遺伝子ベクターを含んだ細菌性スフエロプラスト
とを融合した後に遺伝子ベクターをコヒアの核ＤＮＡ中
に組み込む方法によって無性生殖的にコヒアに導入する
ことができる。

コヒアの遺伝子工学は、種々の形態および起源のＤＮＡ
分子を用いて所望の機能遺伝子を含む所望のＤＮＡを導
入することによっても実施できると考えられる。このＤ
ＮＡ分子としては以下のものを挙げることができるニカ
リフラワーモザイクウィルス（ＣＡＭＶ）または双子ウ
ィルスのようなＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルスおよび
ウィロイド（νｉｒｏｉｄｓ）等の植物病原体、オルガ
ネル中の染色体外リボユームのＤＮＡ要素（例えば、ク
ロロプラストまたはハトコンドリア〉またはコード化さ
れた核の制御要素のような不安定な植物ゲノム戒分由来
のＤＮＡ分子、安定した植物ゲノム戒分からのＤＮＡ分
子（例えば、導入されたＤＮＡがオルガネラーまたは核
ゲノムに組み込・まれ、正常に複製され、植物の細胞分
裂と有性生殖による生産時に正常に分割され、しかも、
コヒアの後世代に遺伝的に受け継がれるような複製の起
源およびその他のＤＮＡ配列）。特に重要なのものは、
再生機能を有し且つ他の機能（発癌性、有毒性等）を欠
いた断片である。また、コヒアＤＮＡ中に外来遺伝子を
運ぶのにトランスボゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ）を
用いることもできる。

既に述べたように、ＤＮＡはプラスミド、例えばＴ１プ
ラスミド、ウィルスまたはアグロノバクテリウム　チュ
メファシエンズ（＾．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のよう
な微生物を介して直接プロトプラスト中に導入すること
ができる。あるいは、リポゾーム、物理的注射によるマ
イクロ注入またはレーザービーム法、ＤＮＡ被覆粒子、
完全な染色体または染色体断片、完全核の融合等による
ミクロ注入等の非ベクター技術を用いて外来ＤＮＡを導
入することもできる。

本発明のコヒア　ブロトブラストを得るのに用いること
が可能な２つの形質変換法は、燐酸カルシウム法とエレ
クトロポレーションである。燐酸カルシウム法では、プ
ロトプラストの表面にＤＮＡが付着する化学的環境を作
る。ＤＮＡはその後エンドシトーズ（ｅｎｄｏｃｙｔｏ
ｓｅ）される（具体的な経路は未知である）。公知の他
のＤＮＡ取入れ方法には、ＰＥＧを使用するもの［シリ
トー（Ｓｈｉｌｌｉ−ｔｏ）達「メンツズ　イン　エン
ジモロジイ（Ｍｅｔｈ−ｏｃｌｓ　ｉｎ　Ｅａｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）　Ｊ第１５３号、Ｄ１第１９章、ワウ（ｌ１
ｕ）達“アカデミック　プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃｐｒ
ｅｓｓ）”ニューヨーク、１９８７年］、ＰＶＡを使用
するもの［パワー（ｐＯｗｅｒ）達「メソッズ　インエ
ンジモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅａｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）　　Ｊ　　１１３号、第４ｌ章、ワイスバ７　
／’　（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）達“アカデミック　プレ
ス（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）”二ｘ　−　Ｅ＋
　−ク、ｌ９８６年］、ポリアミンを使用するもの［パ
ワー（Ｐｏｗｅｒ）違、同上］がある。

エレクトロポレーションは、通常電流を通すことのでき
ないプロトプラスト膜が電気コンデンサとして働くとい
う事実を利用したものである。プロトプラスト膜に高圧
電界を加えると、膜が一時的にブレークダウンして、高
分子が細胞中に出入りできるだけの寸法の孔が形成され
ると考えられている。孔が開いている間、核酸は細胞に
入り、最後には核に入る。鎖状ＤＮＡは両端が開いてい
るので、再結合可能であり且つ宿主染色体と一体化し易
く、従って、恒久的または安定に形質転化したプロトプ
ラストを得ることができる。

外来ＤＮＡを含む本発明の形質転換したコヒアプロトプ
ラストは直接選択または間接選択することができる。直
接選択の場合には、形質転換したプロトプラストを外来
ＤＮＡの実際の機能に基づいて選択した圧力に曝す。例
えば、外来ＤＮＡがグルタミン　シンテターゼを過剰量
出すコードを有する場合には、それから再生さ・れてこ
のＤＮＡを有するプロトプラストおよび細胞を選択する
のに、ホスフィノトリシン（ＰＰＩ）をプロトプラスト
戊長媒体に添加すればよい。多量のＰＰＴの存在下で生
存することができるのはＤＮＡを発現するグルタミンシ
ンテターゼを有するプロトプラストだけであるので、時
間の経過につれて、これらのプロトプラストまたは細胞
だけが生存することになる。

安定に形質転換したコヒア細胞を間接的に選択するのに
好ましい単離技術は、選択可能なマーカーを用いる方法
である。この方法では、所望の形質転換特性（例えば、
耐除草剤特性、害虫抵抗力、固体産出量の増大特性また
はカフェイン生産量の抑制特性）用の外来ＤＮＡと一緒
に選択可能なマーカーを発現する遺伝子で形質転換し、
次いで、選択可能なマーカーを有する細胞のみが増殖し
得るような選択剤の存在下で戊長させる。この方法を用
いると、選択可能なマーカーと所望の外来ＤＮＡとを獲
得したプロトプラストを一定比率で得ることができる。

選択可能なマーカーと所望の遺伝子特性との両方の遺伝
子配列を有するブラスミドのような遺伝子構造体を作る
こともできるが、各遺伝子ごとに異なる遺伝子構造体を
用いて細胞を安定して形質転換することもできる。後者
の場合には、所望の遺伝子特性を有する遺伝子構造体に
対する選択構造体の比率を通常は１未満（例えば１：５
）にしてプロトプラストが処理される。場合によっては
、選択構造体を多量が形質転換して、上記の比率が実用
的でない高い比率にしなければならない場合もある。こ
の場合には、両方の遺伝子を有する単一の構造体を用い
て形質転換しなければならない。

使用可能な選択可能なマーカーおよびそれと組合せ可能
な選択剤の例は下記の文献に記載されている：カフマン
（Ｋａｕｆｍａｎ）達［ナチュラル　アカデミック　サ
イエンス、ユー，エス，エー，予稿集（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ，＾ｃａｄ，　Ｓｃｉ，　Ｕ，　Ｓ，Ａ．　）　Ｊ
第８３号、３１３６頁、１９８６年（アデノシン　デア
ミナーゼ）］：　サザ−　７　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）達
〔ジャーナル　オブ　モレヰユラー　アプライド　ジェ
ネテイックス（Ｊ，　Ｍｏｌ，＾ｐｐｌ。（；ｅｎ，）
　Ｊ第１号、３２７頁、１９８２年（アミノグリコシド
　ホスホトランスフェラーゼ〉］：　　シモンセン（Ｓ
ｉｍｏｎｃｅｎ）達［ナチュラル　アカデミックサイエ
ンス、ユー，エス，エー．予稿集（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ
．＾ｃａｄ，　Ｓｃｉ．［１，Ｓ，＾．）、第８０号、
２４９５頁、１９８３年（デヒトロフォラート　リダク
ターゼ）１；パルマー（Ｐａｌｍｅｒ）達Ｃナチュラル
　アカデミックサイエンス、ユー．エス．二一．予稿集
（　ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，＾ｃａｄ．Ｓｃｉ，υ．Ｓ．
＾．、第８４号、１０５５頁、１９８７年（ヒグロマイ
シンーβ−ホスホトランスフェラーゼ）］；　　リトル
フィールド（Ｌｉｔｔｌｅ−ｆｉｅｌｄ）　　［サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１４５号、７０９頁、１９
６４年（チミジン　キナーゼ）］；　　ミュリガン（Ｍ
ｕｌｌｉｇａｎ）達［ナチュラル　アカデミック　サイ
エンス、ユ−，エス，Ｘ−．予稿集（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．＾ｃａｄ，　Ｓｃｉ．１１，Ｓ，Ａ．）　、第７８
号、２０７２頁、１９８１年（キサンチンーグアニンー
ホスホーリボシルトランスフェラーゼンＪ０ 上記の燐酸カルシウム法、ＰＥＧ｝ランスフェクション
法、アグロバクテリウム法およびエレクトロポレーショ
ン法の４つの技術は、充分な量のＤＮＡを多数の植物細
胞またはプロトプラストに導入できるので、、安定した
形質転換体を調製するのに適している。従って、いくつ
かの細胞またはプロトプラストが外来ＤＮＡをゲノム中
に安定して組込ませる可能性が大きくなる。

選択は、選択剤の存在下で細胞または組織が回収され、
良好に戊長ずるまで実施する。次に、得られた“細胞株
”を選択剤の存在下で二次培養して特性付け（ｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）する。得られた選択剤耐性
物の量を、これら細胞株の成長度と、各種濃度の選択剤
の存在下で選択されなかった細胞または組織の戒長度と
を比較して決定する。常習化した細胞を選択しないよう
にするために、培養された細胞の特性の安定性を、選択
剤の非存在下で選択された細胞株を種々の期間で戒長さ
せた後、組織を選択剤に再度曝して戒長度を測定して評
価する。

選択剤に対する耐性を十分示した細胞株を植物再生手順
に従って処理することによって、耐性特性を発現する或
熟した植物と種子とが得られる。

この植物再生手順によって苗木を戒長させることができ
る。器官形戊（ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓ　ｉｓ）による
戊長の場合にはカルスか新芽（ｓｈｏｏｔｓ）が誘導さ
れ、新芽から根が誘導される。

上記の選択可能なマーカーのテストと、その発現生或物
のテストの他に、植物細胞中の好ましい遺伝子の存在量
のテストを、遺伝子の種類に応じた種々の方法で行うこ
とができる。外因性生成物を生戒する遺伝子が存在する
か否かは、植物細胞を単離・溶解して、外因性底物用の
シトプラスム（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）分析または外来遺
伝子用の核分析によって検出できる。外因性生成物は電
気泳動、クロマトグラフィ、免疫測定、その他によって
検出することもできる。遺伝子はハイブリド化によって
検出するのが便利である（例えば、サザーンブロッティ
ング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）　法）。

上記細胞は、フィトホルモンを含む培地を用いて無菌環
境下で培養することによってカルスに再生することがで
きる。このカルスをホルモンまたは戊長調節剤で処理（
例えば、シトキニン、オーキシン、または、ホルモン完
全無し〉することによって、苗木に直接再生するか、先
ず、体細胞胚を形威し、次いで苗木へと発芽させるかす
ることができる。こうして得られた遺伝子的に改質また
は修飾された苗木を無菌の植木用ミックスに植え、成長
させる。

戒熟した植物から得られる細胞株が改質または修飾され
た遺伝子を伝達するということは公知である。再生植物
は自己受粉性であるのが好ましい。

そうで無い場合には、再生植物から得られた花粉を農芸
学的に同系の交配株から種子成長させた植物と異花受精
させるが、同系交配株の植物の花粉で再生植物を受粉さ
せる。特性が遺伝したか否かの評価は第１世代と第２世
代の子孫の特性の軍離度から判断する。組織培養で選択
したコヒア植物の遺伝特性の持続性と発現は、この特性
が商業的に重要なものであるほど重要になる。

上記、本発明を概略的に説明した。本発明のさらに詳細
な理解は以下の実施例の説明から明らかになるであろう
。しかし、以下の実施例は本発明の一例を示するもので
あって、本発明を何ら限定するものではない。

実施例１ コヒア　アラビ力（Ｃｏｆｆｅａ　Ａｒａｂｉｃａ）植
物の若し１葉の表面を１％リッキノツクス溶液で５分間
洗浄し、１５０　ｒ．　ｐ．　ｍ．で振盪しながら７％
次亜塩素酸カルシウムで３０分間洗浄し、殺菌水で３回
濯ぐことによって殺菌した。約１　ｃｄの葉の一部をコ
ヒアカルス培地（ＣＯＦ，第２表）上で上側表面を下に
して培養した。移植片を暗闇中または薄暗い明かりの下
で２８〜３０℃で培養した。

笈ヱ老 ＣＯＰ培地ａ ＣＢ 培地６ εＢ　培地 培地媒は全てｐＨ５．６に調節されており、量は明記し
たものを除き全てｍｇ／　ｊ！表示である。

ムラシゲ達［フィジオロジー　オブ　プラント（Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ，Ｐｌａｎｔ）　１５、４７３、１９６２］ガ
ンボルグ達［エクスプレス　オブ　セル　リサーチ（ε
ｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ，）　５０、１５１，　１９６
８］酵素溶液は１％中和活性炭１時間処理し、濾過し、
殺菌し、冷凍貯蔵した。

不定胚の懸濁培養 増殖中の葉のカルスを容量２５０−のディロング（ｄｅ
ｌｏｎｇ）　７ラスコ中の細胞培養液（ＣＭ、第３表）
中に移して、濃いシトブラスムを有する白色からクリー
ム色に着色された小細胞が見えるようになるまで、２７
±２℃、１５０　ｒ．ρ．ｍ，でジャイレートリ（ｇｙ
ｒａｔｏｒｙ）振盪器で培養した。これらの小細胞は小
細胞の安定した懸濁液が得られるまで、繰り返して二次
培養した。以後、５０−のＣＭ媒地中で７〜１０日の移
送スケジュールで培養を続けた。６つの細胞株が得られ
た。以下に説明する実験では、その１つであるＣＡ−２
を用いた。

第３表 ＣＭ培地１ ＣＰ培地 プロトプラストの単離と培養 ５〜７日の移転培養物を振盪してから数秒間待って沈降
させてから、小細胞のアリコート１０−を取り出した。

５０〜ＩＯＯＸ　ｇで５分間遠心分離して、細胞を回収
し、酵素溶液（ＣＥ，第２表”）　３０ｍｌ中に再懸濁
させ、ジャイレートリ（ｇｙｒａｔｏｒｙ）振盪器で５
Ｏ　ｒ．ｐ．ｍ．　　で２７〜３０℃で一晩培養した。

７４ミクロンメッシュのステンレス鋼スクリーンで濾過
した後、ブロトブラストを遠心分離によって回収し、プ
ロトプラスト洗浄溶液（ＲＩ＝酵素と牛の血清アルブミ
ンを含まないＧＥ培地）で洗浄し、次に、浸透圧を４ｌ
％（Ｖ／Ｖ）に調節したべルコール（Ｐｅｒｃｏｌ　Ｉ
）／　Ｒ　］クッション上でＩＯＯＸ　ｇで５分間遠心
分離した。クッションに付いたブロトブラストを集め、
Ｒ！で洗浄し、所定の容積のエレクトロポレーション緩
衝液（ＥＢ，第２表）またプロトプラスト培地（ＣＰ，
第３表〉で希釈し、カウントした。エレクトロポレーシ
ョン実験用のプロトプラストはＥＢを用いて最終濃度を
２〜４　ＸＩＯ”／−へ希釈し、使用するまで氷上で培
養する。再生研究用に単離したプロトプラストはＣＰを
用いて直接２　ＸＩＯ’　／　ｒＲｌに希釈した後、培
地から硫酸カナマイシンを除く点以外はエレクトロポレ
ーション後のエレクトロポレーションを受けたプロトプ
ラストと同様に処理した（実施例３を参照）。

アリコー｝１０一当たりの１０〜３０Ｘ１０’　ＣＡ−
２プロトプラスト値を定期的に得た。

一時的発現エレクトロポレーション実験に続いて、プロ
トプラストをＣＰで２Ｘ１０’／一に希釈し、暗闇で２
８℃で２〜３日間培養してアッセー分析した。安定した
形質変換実験を行うため、エレクトロポレーションの４
日後にブロトプラストをＣＰで１：１に希釈し、３週間
後に再度ＣＭ十カナマイシン（１０ｆ）■／！ｌ〉で希
釈した。連続的にカナマイシン．選択剤を添加すること
を除いて、懸濁培養と同じ培養状態に維持した。

実施例２ コヒア体細胞不定胚の誘導による植物再生不定胚形戊（
ｅｎ＋ｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）をＣＡ−２細胞をＭＳ
塩（ホルモンを含まず）、ビタミンＢ，および３％スク
ロースで構威される培地に移転して予備誘発させた。完
全な誘発は液体誘発培地（ＬＩＭ　　３８＋ｒ＋Ｍに増
加させたＫ　Ｎ　Ｏ　ｓを含む０．５ＸＭＳ塩、ビタミ
ンＢ，および２％サッカロース）に移した後、ＬＩＭ＋
０．８％ディフコノーブル（ロｉｆｃｏＮｏｂｌｅ）寒
天培養基に移して行った。次に、得られた不定胚培地か
ら単胚を取り出し、同じ培地で二次培養した。発芽し、
根を形威した胚をホーグランド（ｌｏａｇｌａｎｄ）溶
液［ホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ）とアルノン（＾
ｒｎｏｎ）“Ｃａ　Ｉ　ｉ　ｆ．＾ｇｒｉｃ．ＢＸＩ）
．Ｓｔｎ，Ｃｉｒｃ，　　３４７、ｌ頁、１９５０年］
を用いて湿らされた無菌バーミキュライト（ｖｅｒｍｉ
ｃｕｌｉｔｅ）を入れたＧＡ−７容器［マジｘ’／ダ社
（Ｍａｇｅｎｄａ　Ｃｏｒｐ．）コに移して植物を形威
した。風土馴化の期間が過ぎた後、植物を土壌に移し、
戊長室（２８℃、感光時間ｌ２時間／日）で或長させた
。

実施例３ コヒアのプロトプラストのエレクトロポレーションの最
適条件を決定するために、先ず、タバコの葉、懸濁細胞
培養液およびトマトの葉からのブロトプラストでの一時
的発現と安定した形質転換用のエレクトロポレーション
条件を確立し、そのデータをＣＡ−２プロトプラストに
適用した。エレクトロポレーションは、フロム（Ｆｒｏ
ｍｍ）　によって開発された方法［フロム（Ｆｒｏｒｎ
ｍ）達の「ナチュラル　アカデミック　サイエンス　二
一．エス．エー　予稿集（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ，　Ｓｃｉ，　Ｕ．Ｓ．＾．）」第８２号、５８２４
頁、１９８５年コ、フロム（Ｆｒｏｍｒｎ）達「ネーチ
ャア（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ第３１９号、７９１頁、１９
８６年］を変形して用いた。ＥＢＩｄ中の２〜４Ｘ１０
’プロトプラスト±ＤＮＡを１０〜１２分間氷で冷却し
たサイズＱ，４Ｘｌｃ＠の使い捨てプラスチックキュベ
ット中で培養した。このキュペットの０．４ｃｍの内側
横表面には、電極としてアルミニウム熱伝導テ一ブ（３
ｍ〉が付着されている。エレクトロポレーションは、こ
の電極を介して３３０　Ｖ　Ｘ３５０μＦのコンデンサ
で放電することによって行った（最終抵抗は８００〜１
０５０Ωであり、ＲＣは２１５〜２５０ミリ秒）。使用
したＤＮＡはカナマイシン耐性の安定した形質転換体を
製造するためのハインド■（Ｈａｎｄ　ＩＩＩ）で消化
されたプラスミドｐＧＡ４７２［アン（Ａｎ）達「エン
ボジャーナル（ＢＭＢＯ　ＪＯＵＲＮＡＬ）第４号（２
）、２７７頁、１９５８年］か、一時的発現実験用のク
ローズド　サーキュラーｐＵＣ８−ＣａＭＶ　Ｃ　Ａ　
Ｔ　（ｐＣａＭＶＣＡＴの誘導体〉［フロム（Ｆｒｏｍ
ｍ）達「ナチコラル　アカデミック　サイエンス　ユー
エス．エー　予稿集（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ
，　Ｓｃｉ，Ｕ，Ｓ．＾．）」第８２号、５８２４頁、
１９８５年］のいずれかの２０〜４０μｇｌｍｌである
。全ての実験で、無菌の子牛胸線ＤＮＡ　（シグマ〉ま
たはｐＴＺ１９Ｕ　［ミード（Ｍｅａｄ）達「ヌクレイ
ック　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃ．＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ
ｓ，）　Ｊ第１３号（４）、１１０３頁、１９８５年］
にクローン化された線状化されたｐｓｈ２　−１０９（
８Ｂ分的なとうもろこしシュランケン（Ｓｈｒｕｎｋｅ
ｎ−２遺伝子）［バートン（Ｂａｒｔｏｎ）達「レギュ
レーション　オブ　カーボン　アンド　ニトロゲン　レ
ダクションアッドユティリイゼーション　インメーズ（
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｎ　ａｎｄ　
ＮｌｔｒｏｇｅｎＲｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍａｉｚ
ｅ）　Ｊアメリカンソサエテイオブ　プラント　フィジ
オロジスツ（＾ｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｏｅｔｙ　ｏｆＰ
１ａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｉｌｏｇｉｓｔｓ　）、ｏ−７
クビイル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）　、ＭＤ，　　３６３
頁、１９８６年］の２０〜４０μｇ／一がＤＮＡ担体と
して含まれている。

エレクトロポレーションに続いて、１０〜２０分間、氷
上でプロトプラストを培養した後、上記のようにして培
養した。

ブラスミドＤＮＡはＣｓＣ１／臭化エチジウム遠心分離
によって精製した［ザロウィッツ（２ａｒｏｗｉｔｚ）
博士論文、ユニバーシティ　オプ　ミズーリー（Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、コロンビ
ア、１９８３年；ビルンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）達
「ヌクレイック　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃ，＾ｃｉ
ｄｓ　Ｒｅｓ，）　Ｊ　７号、１５１３頁、１９７９年
］。標準的な浄化方法に続いて、ＤＮＡを７０％エタノ
ールで殺菌し、殺菌水中に再懸濁させた。

エレクトロポレーションしたプロトプラストを２〜３日
間培養し、Ｃ−クロラムフェニコル［６０ｍＣ　１／ｍ
ｍｏ　Ｉ　、ニュー　イングランド　ヌークリア（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）］を用いてクロ
ラムフェニコルアセチルトランスフエラーゼ（ＣＡＴ）
１を分析した［フロム（Ｐｒｏｍｍ）達「ナチュラル　
アカデミックサイエンス　ユー．エス．エー．予稿集（
Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ，＾ｃａｄ．Ｓｃｉ，　Ｕ，　Ｓ
，　Ａ，　）　Ｊ第８２号、５８２４頁、１９８５年コ
。その結果、かなり多量のアセチル化されたクロラムフ
ェニコル点が見られた。

タバコとトマトのブロトブラストにおけるＣＡＴ遺伝子
の一時的発現は１６０〜１７０Ｖ／ｃＩｌの１パルスで
観察され、印加する電圧〈ｌパルス〉を約２３０　Ｖ／
ｃｍまで増加させると、増加する。その後、発現量は、
２７０〜２８０Ｖ／ｃＩＩ１まで一定であり、こ゛れを
越えるとアセチル化されたクロラムフェニコルに関連す
るスポットの強さが急激に低下する。

処理されたプロトプラストの物理的一体性、細胞壁形或
能、分割能力を観察した結果、発現の高い高平部分はプ
ロトプラストの分割能力が無いことと相関関係があり、
発現の急激な降下部分はエレクトロポレーション時のプ
ロトプラストの物理的崩壊に相関関係があった。発現の
高い高平部分を形戊する電圧は、細胞を分割不能にする
が、ＣＡＴ酵素分子を合成できると考えられる。ＣＡＴ
酵素の安定性によって、これらのプロトプラストは高い
レベルのＣＡＴ活性を示す。

次に、安定した形質転換実験を行って、各電圧で生産さ
れるカナマイシン耐性カルス（トマトとびタバコ）およ
び／または苗木（タバコ）の数を測定した。カナマイシ
ン耐性はネオマイシン　ホスホトランスフェラーゼー１
１（ＮＰＴ−１１）の遺伝子の発現によって形威される
。最大の一時的発現のために必要な最小電圧（Ｖｍｔ）
　とタバコおよびトマトのプロトプラストのための安定
した形質転換（Ｖｍｓ）との間の関係を計算し、コヒア
プロトプラストのＶｍｔを実験的に演縄して、タバコと
トマトのプロトプラストの実験的なＶｍｔ　−　Ｖｍｓ
の差をコヒアのＶｒｎｔに当てはめて、コヒアのＶｍｓ
を予想した。

続く安定した形質転換実験によって、ｐＧ＾４７２の存
在下で、１６０〜１９０　Ｖ／ｃＩＩ１の電圧範囲で形
質変換されたカナマイシンー耐性タバコ／トマトカルス
を形威した。発現の高い高平部分で電圧を使用したり、
「無ＤＮＡＪ制御をすると、安定した形質転換体は得ら
れなかった。これらの結果から、タバコとトマトのプロ
トプラスト用のＶａｔ　とＶｍｓは各々２３０Ｖ／ｃａ
＋と１７０〜１９０　Ｖ／ｃｓとした。ＣＡ−２プロト
プラストを用いた類似の一時的発現実験では、約２４０
Ｖ／ｃｍのＶｍｔが得られた。ＣＡ−２プロトプラスト
での電圧効果は、タバコとトマトのプロトプラストで観
察された効果と同様である。従って、ＣＡ−２プロトプ
ラストの安定したエレクトロポレーションは約１９０〜
２００　Ｖ／ｃｍで起きると予想された。

ＣＡ−２プロトプラストを１５０〜２４０　Ｖ／ｃｍの
範囲でエレクトロポレーションした。カナマイシン選択
の３〜４カ月後、極めて小さい細胞群がＣＡ４７７−２
と、ＣＡ４７７　−３／４のサンプル中に観察された。

これらは各々電圧２２０Ｖ／ｃｍと２００Ｖ　／　ｃｍ
の処理に対応している。さらに３カ月後にＣＡ４７７−
２から十分な量の不定胚発生が誘発さされ、ｐＧ＾４７
２　ＮＰＴ−ＩＩ遺伝構造体の存在をテストすることが
できる量となった。ＣＡ４７７−３／４はさらに２カ月
間の培養を必要とした。カナマイシン耐性組織は、「無
ＤＮＡＪ制御からは全く得ることができなかった。特定
の形質変換比率は不明であるが、コヒアの形質転換は、
エレクトロポレーションを受けたプロトプラスト当たり
約Ｉ×１０６であると計算された。これは、タバコの安
定したエレクトロポレーションの形質転換（固体培地に
おいて実施された選択〉でエレクトロポレーションを受
けたプロトプラスト当たり約ＩＸＩＯ’と同様な高さで
あった。

植物組織の分子分析 凍結したＣＡ−２細胞懸濁液組織から得られたＤＮＡ２
０，ｕｇ　［デッラポルタ（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ）達
「モレヰユラー　バイオロジイ　オブ　プランツーラボ
ラトリ４　　？二５アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　ｏｆＰｌａｎｔｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　ｍｌ−ルド　スブリング　ハーバ
ー　ラボラトリ４　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
−ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、コールド　スプ
リング　ハーハー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ）　　二ｘ−ヨーク、３５〜３６頁、１９８４年］
を種々の制限酵素で消化させ、Ｐ−放射化ラベルした［
フエインベルグ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）達「アナリティカ
ルバイオケミストリイ（Ａｎａｌｙｔ−ｉｃａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｊ第１３２号、６〜１３頁、
１９８３年］　ｐＰＫ６５からの１．２　ｋｂｐ　Ｂａ
ｍ　Ｈｌ　ｘ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　ＮＰＴ−１１遺伝子
断片プローブ［コジエル（Ｋｏｚｉｅｌ）達の「ジャー
ナル　オブ　モレキュラー　アンド　アプライド　ジェ
ネティックス（Ｊ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ＾ｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　Ｊ第２号、５４９頁
、１９８４年］を用いて、サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
）分析処理した［マニイアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
達「モレキュラー　クローニングーア　ラボラトリイ　
マニュアル（Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
−＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　：］
　−ルド　スプリング　ハーバー　ラボラトリイ（Ｃｏ
ｌｄ−ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、コールド　スプリング　ハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　　二５　−　Ｅｌ　−ク
、３８２〜３８９頁、１９８２年コ。正および負の制御
ＤＮＡとしては、同様に消化されたｐＧ＾４７２ＤＮＡ
と形質転換していないコヒア植物組織からのＤＮＡとを
各々用いた。

カナマイシン耐性コヒア組織のサザーン分析ＣＡ４７７
−２のサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）分析を上記の方法
で実施した。カナマイシンブローブの形質転換されてい
ない制御ＤＮＡへのハイブリッド化は全く観察されなか
った。Ｐｓｔ　Ｉ　　Ｘ　Ｓｓｔ　ＩＩ　　Ｘ　Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩで消化されたＤＮＡは、ＮＰＴ　−ＩＩ遺伝
子プローブへのハイブリッド化の１．８κｂｐおよび４
００　ｂｐの大きなバンドと１つの＝２．８　ｋｂｐの
小さいバンドが形或される。４００ｂｐ断片はプロモー
タとＮＰＴ−ＩＩ遺伝子の５・　の部分を示す。一方、
サイズと信号の強さから、１．８ｋｂｐバンドは入力構
造体の鎖状体（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｓ）から生じたも
のである（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−消化されたｐＧ＾４７２
〉。２．８ｋｂｐバンドは恐らく植物染色体中への挿入
時にｐＧ＾４７２Ｈｉｎｄ　ＩＩＩのサイトが失なわれ
て生じる融合断片からの信号である。ＣＡ４７７　−３
／４は、ＮＰＴ　−ＩＩ遺伝子ブローブへのハイブリッ
ド化の３つのバンド、すなわち、４００　ｂｐプロモー
ター５゜　断片と、１．６および５．５ｋｂｐバンドを
作る。この１．６と、５．５ｋｂｐバンドは、挿入時に
ｐｃ＾４７２配列の約２００ｂｐが失われて、恐らく再
び融合断片となるであろう。しかし、知られているρＧ
Ａ４７２地図［アン（Ａｎ）「エンボジャーナル（ＥＭ
ＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ）　Ｊ第４（２）号、２７７頁、
１９８５年］によると、１．６ｋｂｐ断片は完全なＮＰ
Ｔ　−ＩＩ遺伝子を形或するのに十分な長さである。こ
れらの信号はｐＧ＾４７２　ＮＰＴ−４１遺伝子からで
あることは、ＢａｍＨＩＸＣ＾４７７−２と、Ｃ＾４７
７−３／４　０ＮＡの旧ｎｄ　ＩＩＩ消化物のサザーン
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）分析結果によって確認された。４
００ｂｐ信号は、これらの消化物と共に消え、他のバン
ドは全部予想された２００　ｂｐだけサイズが大きくな
る。

ＣＡ４７２　−　２からｐｃ＾４７２の天然の完全な長
さの分子を放出するための旧ｎｄＩ［Ｉの能力は、鎮状
体の存在を示し、従って、多数のｐＧ＾４７２のコピー
の存在を示している。予備的再構成実験によって、一倍
体のＣ＾４７７−２ゲノム当たり５〜ＩＯ個のコピーが
示唆される。また、一倍体コヒア　ゲノム当たりｐＧ＾
４７２の１〜２個のコピーでＣ＾４７７−３／４へのｐ
Ｇ＾４７２の挿入は２種類が存在するものと考えられる
。ＣＡ４７７−２培養は、ＣＡ４７７−３／４の培養よ
りカナマイシン選択下でより早く戒長ずるという事実は
、ＣＡ４７７−２のＮＰＴ−Ｉ＋コピー数が大きいこと
と矛盾しない。

ＣＡ４７７−３／４中で部分的に消去されたｌ，　６ｋ
ｂｐバンドの存在は、エレクトロポレーションで実施さ
れた形質転換によって観察されたＤＮＡの再配置と矛盾
しない［Ｆｒｏｍｍ　　（フロム）その他「ネーチャア
（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ第３１９号、７９１〜７９３頁、
１９８６年］。

コヒア　アラビカ（Ｃ，　ａｒａｂｉｃａ）の葉の懸濁
液細胞株Ｃ＾−２は、小さい細胞質の密度の濃い細胞（
直径、２０〜３０μｍ）によって構威されている。通常
、高い割合で不定胚を発生させるためには、５回または
それ以上の誘発媒体（ＬＩＭ）への移転が必要である。

始めの数回のＬＩＭへの移転の後、大きな茶色の細胞群
が形戊され、それから、砕けやすい組織が生じ、次に、
白色の小球形胚発生構造が形成される。液体中で、少量
の小球形構造からの砕けやすい組織と大きな細胞群をＬ
ＩＭ寒天培養プレートに移す。１つのカルス塊から５０
個以上の体細胞不定胚が発生するが、不定胚をさらに成
長させるために、周囲を囲むカルス仮皮から分離させる
。多くの体細胞不定胚は正常な植物へと発育するが、１
つまたは３つの子葉を融合させたり、戊長させたりする
胚もある。一般に、戊長様式は、高周波体細胞不定胚発
生（ＨＦＳＥ）法に従って行われる［ソンダール（Ｓｏ
ｎｄａｈｌ）達「エル．ゼット．プフランゼンフィジオ
ロジイ　ビーデ−（Ｌ，Ｚ，　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙ
ｓｉｏｌ，　ａｄ，　）　」第８１８号、３９５頁、ｌ
９７７年；ソンダール（Ｓｏｎｄａｈ　１）達「テ４’
／シュカルチャア−　アンド　イッツ　アプリケーシａ
ン（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）　Ｊ　　｝　ｏープ（Ｔ，　
Ｔｈｒｏｐｅ）編、アカデミック　プレス（＾ｃａｄｅ
−ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、二ｘ−ヨーク、３２５　〜３
５８頁、１９８１年；　ソンダール（Ｓｏｎｄａｈｌ）
　　ｒノ＼ンドブツク　オブ　プラント　セル　カルチ
ャア（　｝Ｉａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｃｅｌ
ｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）　Ｊ第３巻、アンミラト（Ａｍ−
ｍｉｒａｔｏ）達編、マツクミラン（Ｍａｃｍ　ｉ　ｌ
　Ｊａｎ）、ニューヨーク、５６４〜５９０頁、１９８
４年］。

新たに単離されたＣＡ−２プロトプラストは、２４時間
以内に楕円形を取り、急速に細胞壁が形威される。プロ
トプラスト単離の４〜６日内に、細胞分割が観察され、
培養の２週間後には細胞群を裸眼で見ることができる。

プロトプラスト単離の１カ月以内に、培養物は前駆体の
細胞株と類似し、体細胞不定胚を形或するように誘導さ
れる。エレクトロポレーションしたプロトプラストは、
細胞再生またはコロニー形威を全く後らせずに、エレク
トロポレーションしなかったプロトプラストと類似の方
法で戊長ずる。

安定した形質転換実験のプロトプラストの大部分は、カ
ナマイシンを含む培地に移すと直ちに死ぬが、いくつか
の細胞群は、連続したカナマイシン選択の数カ月後に出
現した。カナマイシンを含む新鮮な培地に移した後、２
つのポジティブ処理をすることによって、ＣＡ−２に外
観が類似した懸濁培養物が得られる。これらの２つの形
質変換した細胞株Ｃ　Ａ４７７−２と、Ｃ　Ａ　４７７
−３／４は現在でも、ＣＡ−２と同じ手順（プロトコル
〉、同じ培地（カナマイシンの添加を含む〉、移転スケ
ジュールおよび移転接種材料で保持されている。ＣＡ４
７７−２とＣ　Ａ４７７−３／４は、上記のプロトプラ
スト再生実験よりも多数回の誘導培地への移転を必要と
する。これらの培養物は、連続したカナマイシン選択（
１００　ｍｇ／　ｌ＞　の存在下で、不定胚が再生され
、そのいくつかは発芽して子葉を形戊した。

本発明は、本発明の１つの観点をを示すために説明した
上記の実施例に限定されるものではなく、機能的に均等
なコヒア植物、プロトプラスト、細胞株または種子は全
て本発明の範囲内である。実際、以上説明した本発明を
種々変更をすることが可能であるのは上記の説明および
表から当業者には明らかであろう。これらの変更は本発
明の請求の範囲に入るものである。

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物を再生可能な安定した無性生殖的且つ遺伝子
   的に改質されたコヒア（Ｃｏｆｆｅａ）属のプロトプラ
   スト。
2. （２）外来ＤＮＡを用いた形質転換によって遺伝子的に
   改質されたものであることを特徴とする請求項１に記載
   のプロトプラスト。
3. （３）真核細胞のＤＮＡを用いて形質転換されたもので
   あることを特徴とする請求項２に記載のプロトプラスト
   。
4. （４）真核細胞のＤＮＡが、プロトプラストのコヒア種
   とは異なるコヒア属からのものであることを特徴とする
   請求項３に記載のプロトプラスト。
5. （５）真核細胞のＤＮＡが、プロトプラストのコヒア属
   とは異なる属からからのものであることを特徴とする請
   求項３に記載のプロトプラスト。
6. （６）プロトプラストの変種とは異なる変種からのＤＮ
   Ａを用いた形質転換によって遺伝子的に改質されている
   ことを特徴とする請求項１に記載のプロトプラスト。
7. （７）プロトプラストの変種と同じ変種からのＤＮＡを
   用いた形質転換によって遺伝子的に改質されていること
   を特徴とする請求項１に記載のプロトプラスト。
8. （８）形質変換ＤＮＡが遺伝子マーカーを含むことを特
   徴とする請求項６または７に記載のプロトプラスト。
9. （９）コヒアアラビカ（Ｃｏｆｆｅａａｒａｂｉｃａ）
   から由来することを特徴とする請求項１に記載のプロト
   プラスト。
10. （１０）原核細胞のＤＮＡを用いて形質転換されたもの
    であることを特徴とする請求項２に記載のプロトプラス
    ト。
11. （１１）外来ＤＮＡが遺伝子マーカーを含むことを特徴
    とする請求項２に記載のプロトプラスト。
12. （１２）遺伝子の改質が耐害虫特性、耐除草剤特性、炭
    水化物合成特性およびカフェイン合成特性によって構成
    される群の中から選択された特性を目的としたものであ
    ることを特徴とする請求項２、６または７のいずれ一項
    に記載のプロトプラスト。
13. （１３）請求項１または２に記載のプロトプラストから
    再生された植物細胞。
14. （１４）請求項１３に記載の植物細胞を含む植物および
    植物部分。
15. （１５）請求項１４に記載の植物の表現型特性を備えた
    植物および植物部分。
16. （１６）請求項１４に記載の植物由来の植物組織。
17. （１７）請求項１４に記載の植物の産生した種子。
18. （１８）発芽して植物となり、種子を産生できることを
    特徴とする請求項１７に記載の種子。
19. （１９）請求項１７に記載の種子から生じた植物の表現
    型特性を備えた植物。
20. （２０） （ａ）コヒア（Ｃｏｆｆｅａ）の移植片組織培養によっ
    てカルスを作り、 （ｂ）このカルスから細胞懸濁物を単離し、（ｃ）この
    細胞懸濁物を処理してプロトプラストを取り出し、 （ｄ）このプロトプラストを形質転換する ことによって得られるような、植物を再生可能な安定し
    た無性生殖的且つ遺伝子的に改質されたコヒア（Ｃｏｆ
    ｆｅａ）属のプロトプラスト。
21. （２１）上記（ｄ）段階でのプロトプラストの形質転換
    がエレクトロポレーションを用いて行われたものである
    ような請求項２０に記載のプロトプラスト。