JPH02503515A

JPH02503515A - 標識された相補的核酸プローブを開裂する触媒反応の補因子としての活性に基づく核酸配列検出のための触媒ハイブリッド形成系

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Publication number: JPH02503515A
Application number: JP89503541A
Authority: JP
Inventors: ウォルダー，ジョセフ　エイ; ウォルダー，ロクサンヌ　ワイ
Original assignee: ユニバーシティ　オブ　アイオワ　リサーチ　ファウンデイション
Priority date: 1988-03-24
Filing date: 1989-03-13
Publication date: 1990-10-25
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: AU3294489A; AU623642B2; WO1989009284A1; EP0365627A1; JP2856804B2; DE68911648T2; EP0365627B1; EP0365627A4; DE68911648D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】標識された相補的核酸プローブを開裂する触媒反応の補因子としての活性に基づく核酸配列検出のための触媒ハイブリッド形成系助成金の参照本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）支給の助成金弟ＨＬ−３３５５５号および第ＡＭ−２５２９５号を得て実施された研究の過程でなされたものである。

関連出願本発明は、１９８７年１１月３０日に米国へ出願され、審査中の出願番号第１２６，５６４号の一部継続出願に基づくものである。

発明の背景１発明の分野本発明は、生物学的および臨床的試料中の特定の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）配列を高い感度で検出するための診断用検査方法を提供する。本発明は特に、複写数の少ない標的配列を、高度に特異的に検出することを課題を対象としている。

ＤＮＡおよびＲＮＡの検出に現在用いられている方法は、すべて、標的配列に対する標識された相補的核酸プローブの化学量論的な（１：１の）ハイブリッド形成を基本原理としている（第１図参照）。

本発明は、このような取り組み方とは著しく異なるものであって、標的配列を、触媒作用によってプローブを開裂する反応の補因子として利用する。プローブ開裂後は、標的配列は無傷で遊離し、反応を通じて反復的に再循環して、応答の大規模な増幅が起こるようになる（第２図参照）。発明者らは、このような反応様式を、触媒的ハイブリッド形成増幅反応と称している。このような検査法においては、標識プローブの開裂は、標的配列が存在する指標となる。この方法の感度は、標的配列がわずか１個のプローブ分子を捕捉するに過ぎない化学量論的、すなわち、単−的ハイブリッド形成なる様式に基づく既存のすべての方法よりも、はるかに強力である。後述で、触媒的ハイブリッド形成増幅法の実施例をいくつか記載する。

この検査法に必要な操作は、すべて単純であり、臨床的研究室で容易に実施できるものばかりである。ヒトその他の生物種における遺伝的障害、伝染病、および癌など各種疾患の診断が、本発明の用途となる。

２、従来の技術周知の通り、核酸、すなわちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）とは、すべての生物の基本的構成単位である。これらは、高分子の重合体であって、塩基（プリンまたはピリミジン）１個、糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）１個、および燐酸１分子でそれぞれ構成されるヌクレオチド単位を多数用いて形成されている。

ＤＮＡには、糖成分としてデオキシリボースが、塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン（それぞれＡＳＧ、Ｃ，Ｔと表される。）が含まれている。

ＲＮＡには、デオキシリボースの代わりにリボースが、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）が含まれている。

ＤＮＡおよびＲＮＡのヌクレオチド単位は、一定の線形の配列で集合しており、これが特定の生物学的機能を規定する。

細菌の細胞において、またすべての高等生物の種においては、ＤＮＡは自身の複製を指令し、またＲＮＡ分子合成の鋳型としても働く。このＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡによって暗号ＲＮＡ分子は、細胞内部のいくつかの異なった機能を担っている。伝令ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）は、蛋白質合成を支配する。リポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）は、リポソームの重要な構成要素であって、細胞内のこの小器官でｍＲＮＡの読み取り、すなわち翻訳を行ない、蛋白質が作られるのである。

ある生物の遺伝情報を集合的に指す場合には、ゲノムという用語が用いられる。

細菌、およびすべての高等生物種のゲノムは、ＤＮＡで構成されている。ウィルスのゲノムには、ＤＮＡあるいはＲＮＡのどちらもがなれる。いずれにせよ、いかなる特定の生物種のゲノムも、それがウィルスであろうと、細菌、あるいは高等生物であろうと、特徴的なヌクレオチド配列を有しており、これを単純化して述べると、その生物種の「指紋」のように見なすことができるのである。蛋白質をコードする、すなわち、転写されて特定の機能を有するＲＮＡ、例えばｒＲＮＡを形成するようなゲノム内の配列は、個々の遺伝子を表している。エイズウィルスなど小型のウィルスは、わずか１０個の遺伝子を有するに過ぎないが、ヒトのゲノムには、およそ５０，０００もの遺伝子が含まれている。

公知のワトソンークリックモデルによれば、ＤＮＡ分子は、軸を共有するコイル状の２本のポリヌクレオチド鎖で構成されている。ここに形成される二重らせんは、各鎖の相補的な塩基対間の水素結合によって互いに固定されている。水素結合は、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、および、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の間にのみ形成される。したがって、二重らせんの内部では、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）とは、Ａ−Ｔとして互いに結合する相補的塩基であると見なされる。

同じことが、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とに対しても、”　Ｇ−Ｃとして当てはまる。

単一のポリヌクレオチド鎖においては、どのようなヌクレオチド配列も存在可能である。しかし、あるＤＮＡ分子の一方の鎖における塩基の順序が特定されると、それとともに、上記の塩基対合の法則によって、他方の鎖の配列は厳密に決定される。したがって、ＤＮＡ分子のそれぞれの鎖は、互いに相補的である。

２本の相補的なりＮＡ鎖が互いに会合する過程は、ハイブリッド形成とよばれる。鎖を分離する過程は、通常、試料の加熱によって行われ、これは、二重鎖の融解、あるいは変性とよばれる。二重鎖には、長さ、組成、および塩濃度にもっばら依存する特徴的な融解温度（Ｔ、）がある。

次の式によって、Ｔ、の実用的な近似が与えられる。

Ｔ、＝１６．６Ｘ１ｏｇＣ汁０．４１刈妬＋Ｃ）＋８１．５−８２０／Ｌ　　　（Ｉ）（式中、Ｃ１は塩濃度、（％Ｇ＋Ｃ）はＧ−Ｃ含量の百分比、Ｌは二重鎖の長さを表す。）［シー・シルトクラウド（Ｃ，５ｃｈ−ｉｌｄｋｒａｕｔ）およびニス・リフソン（Ｓ、Ｌｉｆｓｏｎ）　　：バイオロジ−ズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）　、第３巻（１９６５年）　１９５〜２０８ページ；シー・エイ・トマス・ジュニア（Ｃ，Ａ、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｊｒ、）およびビー・エム・ダンシス（Ｂ、　Ｍ、Ｄａｎｃｉｓ）　　：ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕ１．Ｂｉｏｌ、）、第７７巻（１９７３年）４３〜５５ページ］。

二重鎖の２本の鎖の間の誤対合（例えば、Ｃ−Ｔなる塩基対）も起こり得るが、それによって、らせんの安定性は、著しく減少し、融解温度は降下する。

ＤＮＡ　：　ＤＮＡ二重鎖の他に、ＲＮＡ　：　ＲＮＡ二重鎖も形成可能であって、自然界にも出現する。ＤＮＡ　：　ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡがＲＮＡ合成の鋳型として働く転写の過程で過渡的に形成される。ＲＮＡ　：　ＲＮＡ二重鎖は、ある種のウィルスの遺伝物質として出現し、また、リポソームＲＮＡ、および転移ＲＮＡのいわゆるヘアピンループにおいても形成される。ＲＮＡ鎖が含まれる二重鎖では、ウラシル（Ｕ）がアデニン（Ａ）と対合する。また、１本のポリヌクレオチド鎖内にＲＮＡとＤＮＡの双方の配列が出現することもある。このようなＲＮＡ−ＤＮＡ共重合体は、ＤＮＡの複製の際の中間体として形成される。

ＤＮＡ　：　ＲＮＡ二重鎖、あるいはＲＮＡ　：　ＲＮＡ二重鎖の融解温度は、溶液の状態によっては同じ配列のＤＮＡ：　ＤＮＡ二重鎖のそれと多少異なることもあるが、前記の式は、Ｔｍの近似としては依然として有効である。

これら各種のポリヌクレオチドの構造、およびその生物学的機能に関する更に詳細な考察は、ベンジャミン・ルーイン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｌｅｗｉｎ）著、「遺伝子、その３　（Ｇｅｎｅｓ　ｍ）　Ｊ［ジョン・ワイリー−７ンド・サンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ）社１９８７年発行コを参照のこと。

本書は、本明細書における参照資料となるものである。

組換えＤＮＡの手法を用いた分子生物学の最近の発展によって、新しい診断および治療の構想がもたらされている。

ＤＮＡプローブによる診断の分野においては、試料中の相補的な標的核酸配列の存在を検出するのに、ＤＮＡプローブが用いられる。その適用としては、伝染病、癌、および遺伝的障害の診断がある。伝染病の場合であれば、特定の細菌あるいはウィルスに特有のＤＮＡ、あるいはＲＮＡの配列が標的となり得る。

ある種の癌細胞においては、例えば、慢性骨髄性白血病におけるｃ−ａｂｌなる癌遺伝子の転座のような、特有の検出可能な遺伝子の並び換えがある。遺伝的欠陥には、ＤＮＡの大規模な欠失または挿入、あるいは、鎌状赤血球症におけるような点突然変異が関与していることがある。後者の場合は、正常な遺伝子に見られるのと全く同じ一連の側面配列中の、たった１個の塩基対の変化を検出することが必要である。

核酸による診断用検査には常に、基本的な３段階が必要とされる。

（１）試料からのＤＮＡあるいはＲＮＡの単離、およびそれに続く調整ＤＮＡは、単離後、一般的には機械的な力を用いて剪断される。穏やかに操作すれば、最大で、約１００，０００塩基対までの断片を得ることができる。また、制限酵素とよばれる配列特異的なエンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを意図的に切断し、特定の大きさの断片を形成させることもできる。いわゆるサザンプロット分析法がこの例であって、この方法では、その後、電気泳動を用いて断片をその大きさに従って分離し、次いで、ある種のフィルター、例えば、ニトロセルロースまたはナイロンの膜に固定化する［イー・エム・サザン（Ｅ、　Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ）　　：ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第９８巻（１９７５年）５０３〜５１７ベージ］。

（２）標識された相補的核酸プロープと標的配列とのハイブリッド形成この段階では、通常、加熱によって試料を変性させ、標的配列が１本鎖となるようにする。次いで、標識されたプローブを、標的とハイブリッド形成させる。その後、試料内、あるいは、それを固定化しているフィルター内のもう一方の配列に弱く結合したプローブの分子を洗い流す。特異性を適切に発揮させるには、試料中に存在する他の配列とプローブとの間で、１個所ないしそれ以上の誤対合を含んで形成される可能性がある二重鎖のそれよりも、プローブ：標的二重鎖の融解温度が、少なくとも５〜１０℃高くなければならない。

（３）試料中のＤＮＡあるいはＲＮＡと対合している標識プロープ量の測定プローブを標識するのに用いることができる適当なリポータ−指示基としては、３Ｈ，３２Ｆ、または１２１１などの放射性同位元素、フルオレッセイン、テキサスレッド、またはフィコビリン蛋白質などの螢光色素、あるいは、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース酸化酵素またはグルコースペルオキシダーゼなどの酵素マーカーがある。

試料核酸をフィルターに固定化する診断用検査法の１例を、第１図に示す［ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）らによる米国特許第４゜３５８．５３５号明細書（１９８２年）を参照のことコ。診断用検査法のためには、フィルターの様式に加え、他にも、各種の面での方策がある。実例に関しては、ヘラ−（Ｈｅｌｌｅｒ）らによるヨーロッパ特許公開公報第００７０６８５号、およびヨーロッパ特許公開公報第０７０７６８７号（１９８３年）、エム・レンツ（Ｍ、　Ｒｅｎｔｚ）およびシー・クルツ（Ｃ，Ｋｕｒｚ）による論文［ニュークレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、第１２巻（１９８４年）　３，４３５〜３，４４４ページ］、ジェイ・エル・ルース（Ｊ、　Ｌ、　Ｒｕｔｈ）による国際公開番号ＷＯ３４１０３２８５（１９８４年）、およびディー・コーネ（Ｄ、　Ｋｏｈｎｅ）による国際公開番号ＷＯ３４１０２７２１（１９８４年）を参照されたい。

これらの方式においては、検出に用いられるリポータ−指示基は、第１図に示す通り、すべてプローブに直接結合する。

これに代えて、間接的な標識方式を用いることもできる。ピー・コラリスキー（Ｐ、　Ｋｏｕｒｌｉｓｋｙ）らによる英国特許公報第２０１９４０８号に記載の方法では、ビオチンを用いてプローブを標識している。プローブを標的配列とハイブリッド形成させた後、アビジンなる蛋白質と共有結合させたβ−ガラクトシダーゼによる酵素複合体を、試料に加えるのである。

アビジンは、プローブに結合したビオチンの標識と特異的に、かつ非常に強い親和力で結合する。次いで、β−ガラクトシダーゼに対する適当な基質を与えて加水分解すると、螢光あるいは着色生成物が形成され、これを用いて、プローブ：標的配列二重鎖を検出する。

ビオチン−アビジンによるプローブ系は、ウォード（Ｗａｒｄ）らによるヨーロッパ特許公開公報第００６３８７９号（１９８２年）、およびエンゲルハルト（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ）らによるヨーロッパ特許公開公報第００９７３７３号（１９８４年）にも記載されている。

より新しくは、キャリコー（Ｃａｒｒｉｃｏ）によるヨーロッパ特許公開公報第０２０９７０２号（１９８７年）に、ＲＮＡ　：　ＤＮＡ二重鎖に特異的に結合する抗体を用いて、ＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間にプローブ：標的配列二重鎖を形成するという間接標識の方策が記載されている。

上記の従来の技術による方法はすべて、化学量論的、すなわち単一のハイブリッド形成反応に基づいており、標的配列は、わずか１個のプローブ分子と結合し、あるいはこれを捕捉するに過ぎない。

本発明は、新規かつ改良されたハイブリッド形成による検査方法を提供するものであって、標的配列は、一連の反応を反復することによって、多数のプローブ分子を捕捉することができる。これは、プローブ：標的配列二重鎖に取り込まれた標的配列が無傷で遊離し、反応経路中を繰返し再循環できるようなプローブ開裂反応によって実行される。

発明者らは、このような方法を、触媒的ハイブリッド形成増幅（Ｃ）ＩＡ）反応と称している。ＤＮＡ法の一般的な様式を第２図に示す。このような検査法においては、検出される指標は、プローブの開裂の結果として生じる。本方法の感度は、標的配列とプローブとの間の化学量論的、すなわち１：１の会合に基づくすべての従来のハイブリッド形成様式よりも、はるかに高い。

従来の文献に記載されている方法のいくつかでは、ハイブリッド形成による検査法にプローブの開裂が含まれてはいるが、本発明に不可欠の要素である標的配列の再循環が除外されている。

例えば、アシハラ（Ａｓｈｉｈａｒａ）らによるヨーロッパ特許公開公報第０１４２２９９号（１９８５年）には、プローブと標的配列との間にＤＮＡ　：　ＤＮＡ二重鎖を形成し、制限酵素を用いて標的配列を開裂する方法が記載されている。制限酵素は、二重鎖内の、長さが通常４〜６塩基対である特定の配列を認識し、プローブと標的鎮の双方を開裂する。標的も開裂されることから、反応経路中の再循環が不可能となる。

ＤＮＡにおけるただ１個所の塩基対の変化、すなわち点突然変異を検出する手順は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）らによる論文［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第２３０巻（１９８５年）　１．２４２〜１，２４６ページ］に記載されており、これは、ＲＮＡプローブの開裂に基づいている。標識されたＲＮＡプローブは、まず、標的ＤＮＡと対合させられる。次いで、このＤＮＡとハイブリッド形成したＲＮＡプローブをリボヌクレアーゼＡなる酵素を用いて開裂する。

過剰な未結合プローブ分子は、完全に減成される。

ＤＮＡとの塩基の誤対合が１個所もな（、ＲＮＡが完全な二重鎖を形成している場合は、ハイブリッド形成したＲＮＡ鎖が切断されることはない。塩基対の誤対合が１個所あるいはそれ以上存在する場合は、ＲＮＡプローブは、酵素によって切断されることになる。

誤対合部位におけるＲＮＡプローブの開裂は、多数の異なる手段を用いて検査することができるので、ＤＮＡ配列の変化を検出するのに用いられる。リボヌクレアーゼＡは、遊離した未対合ＲＮＡ分子を開裂するのであるから、開裂された断片が、標的配列と対合したまま存在することが不可欠である。そのため、標的ＤＮＡ配列がプローブの多数の複写と繰返し反応することは不可能になってしまう。

同様な特徴をいくつか有する検査法が、ダック（Ｄｕｃｋ）らによって最近発表されている［ヨーロッパ特許公開公報第０２２７９７６号（１９８７年）］。この事例では、まず、プローブが標的配列との二重鎖として結合されている場合は、これを開裂しないある種の酵素を用い、過剰な未対合プローブを洗い流してしまう。次いで、標的配列と対合しているプローブの残存分子を検出する検査法を実施する。過剰な未対合プローブ分子を、最初に減成することが不可欠であるから、標的配列は、本発明のように反応の間に代謝回転し、反復的に反応することはできない。

ハル・ベアシー（Ｈｕｌｌ　Ｖａｒｙ）らによるヨーロッパ特許公開公報第０２０００５７号（１９８６年）には、標的配列とプローブとのハイブリッド形成によって、プローブに結合した第３のポリヌクレオチドを置換するという方式が記載されている。ハイブリッド形成反応の終了時に、置換されたポリヌクレオチドをモノヌクレオチドに減成し、これを検出するのである。

この方式においても、やはり、標的配列の分子のそれぞれが、わずか１個のプローブの複写とハイブリッド形成するに過ぎないので、標的配列の再循環は起こり得ない。

核酸のハイブリッド形成速度を高める方法が、ザボルスキ−（Ｚａｐｏｌｓｋｉ）らによる国際公開番号ＷＯ８５１０５６８５（１９８５年）に記載されている。この方法によれば、レンツＡ　（ＲｅｃＡ）なる酵素、および、１本鎖ＤＮＡに結合する蛋白質を用いて、ブ　。

ローブの標的配列とのハイブリッド形成を促進する。この方法は、ハイブリッド形成の速度を高めはするが、反応は、依然として、化学量論的であって、標的の分子とプローブ分子の１：１の結合が必要である。本発明におＪするような、プローブの多数の複写を捕捉できる標的配列の代謝回転は起こらない。

上記の従来の技術は、プローブを標識し、ハイブリッド形成反応を実行し、かつ指標の検出を促進するための多数の異なる方策の代表例に過ぎない。しかし、核酸ハイブリッド形°成による検査方式であって広汎に利用されているものは、依然として皆無である。

既存の方法は、数多くの臨床的用途に供するには適切な感度が不足しており、また、臨床的研究室で定型的に実施するには困難な、複雑な検査手順がしばしば必要となる。従来の方式には、すべて、プローブと標的配列との化学量論的な、すなわち単一のハイブリッド形成が関与しており、標的分子はそれぞれわずか１個のプローブ分子を捕捉できるに過ぎない。本発明は、このような構想とは根本的に袂を分かつものである。

本発明の主目的は、改良されたハイブリッド形成による検査方法を提供することにあり、標的配列を、標識された相補的核酸プローブの開裂における触媒的な補因子として利用するものである。反応経路中の標的配列の再循環によって、多数のプローブ分子の捕捉が可能となり、その結果、検査法の感度の大幅な増大がもたらされる。

また、本発明は、診断用試験に有用な、いわゆる触媒的ハイブリッド形成増幅（ＣＩＡ）反応に適した様式、試薬、および検査条件の提供も目的としている。

図面の簡単な説明第１図は、標的配列と標識された相補的核酸プローブとの間の化学量論的（１：　１）複合体の形成に基づく標的ＤＮＡ配列の検出に用いられる、ハイブリッド形成による標準的な検査法の模式的に示す図である。、この例では、試料ＤＮＡは、フィルター形式の支持体に固定化されている。

第２図は、特定のＤＮＡ配列の検出に用いられるＣＨＡ法の実施の説明図である。標的ＤＮＡ配列は、標識された相補的核酸プローブの開裂に対する触媒的補因子として働く。反応の際の標的配列の反復的再循環（点線の矢印）によって、プローブと標的配列との化学量論的な、すなわち単一のハイブリッド形成に基づく標準的な検査方式として、より大幅な指標の増幅、および感度の増大がもたらされる。

第３図は、支持体に取り付けられた相補的標識プローブの開裂が、リボヌクレアーゼＨを介して行われる、固形支持体によるＣＨＡ法を説明する図である。

第４Ａ図乃至第４Ｂ図は、２種類のＣＩＡ反応が連動して、指標の指数関数的な増幅を生起させるハイブリッド形成検出方式を説明する図である。

第５Ａ図乃至第５Ｃ図は、ＣＨＡ法を用いて特定のＲＮＡ配列を検出するための競合的検査法の利用の説明図である。

発明の要約本発明の触媒的ハイブリッド形成増幅（ＣＨＡ）は、診断用検査法として有用な、新規かつ改良された核酸ハイブリッド形成方法を提供する。標的配列は、従来のすべての検査方式におけるような、プローブの化学量論的（１：　１）ハイブリッド形成に基づいて検出されるのではない。

本発明は、標的とハイブリッドを形成した相補的標識プローブを開裂させる触媒反応に対する高度に特異的な補因子として働く標的核酸配列に関する。標的配列と対合していないプローブ分子は切断されない。標識プローブ：標的配列二重鎖を形成する標識プローブの開裂の際に、標的配列は無傷で遊離し、反応経路中を反復的に循環することができる。

このような検査法においては、プローブの開裂が指標を生成し、これが検出される。標的配列の各分子が、プローブの多数の複写を捕捉できることから、この方法の感度の大幅な向上がもたらされる。臨床的診断試験における使用に適した、簡単な検査手順によるＣＨＡ法の好適実施例がいくつか示されている。これらの方法の適用としては、伝染病、遺伝的欠陥、および癌の診断があげられるが、これらに限定されるわけではない。１個所の点突然変異、およびより長い独自的配列の双方が、ともに検出可能である。

発明の詳細な説明本発明の触媒的ハイブリッド形成増幅は、これが、非化学量論的なハイブリッド形成法の最初の実例であるところに独自性がある。このような方式においては、標的配列（ＤＮＡ、　ＲＮＡのいずれも）は、標識された相補的核酸プローブを開裂させる触媒反応の補因子として働く。ＣＨＡ法の一般的な様式を第２図に示す。

工程の第１段階においては、塩基対合の常套的手段を用いて、標的配列をプローブとハイブリッド形成させる。

標的配列と対合させた後で、プローブを、２本あるいはそれ以上の小さな断片に開裂する。開裂反応は、酵素を触媒として行うことも、あるいは、他の化学的手段を用いて生起させることもできる。

標的配列とハイブリッド形成したプローブの分子だけが開裂される。標的配列とハイブリッド形成しなかった過剰のプローブ分子は切断されない。開裂反応によって生成された、より低分子のプローブ断片は、親分子よりも不安定な二重鎖を標的配列とともに形成するので、ＣＨＡ反応の条件下では、標的配列から解離する。

解離を急速に生起させるには、より低分子の断片で形成された二重鎖の融解温度を、通常、反応温度よりも１０℃あるいはそれ以上低くしなければならない。約１５〜約３０ヌクレオチド長の短いオリゴヌクレオチドでは、プローブ配列中央の近傍で１回開裂した後に解離が起こる。より長いプローブは、数千ヌクレオチド長に達することもあり、何回かの開裂を行って、約３５ヌクレオチド長未満の、好ましくは約１０〜約２０ヌクレオチド長の更に短い断片を形成させる必要がある。

標的配列は、反応の際に開裂されてはならない。この配列は、プローブ：標的配列二重鎖から無傷で遊離され、反応経路中を反復的に再循環する。ＣＨＡ反応の終了時には、プローブ開裂の度合いを測定する。これには一般に、リポータ−指示基の標識を担ったプローブ断片を、無傷な分子から分離する必要がある。

標的配列の存在の指標となるのはプローブの開裂である。

標的配列の代謝回転が、分子がそれぞれプローブの多数の複写を捕捉し、かつその開裂を促進することを可能にして、この方法の感度を大幅に増大させる。以下、ＣＨＡ法の好適実施例をいくつか記述する。

ＤＮＡ配列の検出に適用される本発明の主な好適実施例においては、開裂反応は、リボヌクレアーゼＨなる酵素によって触媒され、標的ＤＮＡ配列が相補的なＲＮＡプローブと対合して、ＲＮＡ　：　ＤＮＡ二重鎖を形成している場合にのみ、これが行われる。

リボヌクレアーゼＨは非常に特異的であって、標的ＤＮＡ配列と対合していない遊離したプローブ分子を切断することはなく、標的ＤＮＡ配列を開裂することもない。

従って、プローブの開裂に際して、標的配列は無傷で遊離し、第２図に概略を示す通り、反応経路中を繰返し循環することができるのである。ＣＨＡ法のこの好適実施例に関する構成要素（プローブ、標識等々）、手順、および条件の詳細は、次の通りである。

本発明に用いることができるプローブは、約１５〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドから、それより長い、数千ヌクレオチド長に達するようなポリヌクレオチドまでの範囲のものである。

約１５ヌクレオチド残基からなるプローブは、背景となるヒ）　ＤＮＡと区別して、相補的な標的配列（例えば、独自のウィルス配列）と選択的にハイブリッドを形成させるのに用いることができる最短の配列である［シー・エイ・トーマス・ジュニア（Ｃ，Ａ、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｊｒ）　　ニブログレス・イン・ニュークレイツク・アシド・リサーチ・アンド・モレキュラー・ノくイオロジ−（Ｐｒｏｇｒ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕ１．　Ｂｉｏｌ、）、第５巻（１９６６年）３１５ページ参照コ。

高度な特異性を確保するには、少なくとも２０〜約２５ヌクレオチド長の配列を用いなければならないことの方が多い。約２５残基までの短いオリゴヌクレオチドに対しては、ただ１個のリポータ−指示基を用い、核酸鎖の５゛−あるいは３ °−末端のいずれかの近傍を標識するのが一般的である。

これより長い配列に対しては、はぼ１５ヌクレオチド残基につき、１リポータ− 指示基までの密度で標識することができる。プローブの構成は、その全体をＲＮＡとすることが可能である。これに代えて、リボヌクレアーゼＨによって開裂されない１個あるいはそれ以上の散在する配列をプローブに含有させることもできる。リボヌクレアーゼＨによって開裂されないこのような配列は、ＤＮＡ　、あるいは、この酵素による開裂を防ぐように、燐酸基または糖の部分のいずれかを修飾したＲＮＡを用いて、これを構成することが可能である。

燐酸基の適切な修飾形態としては、アルキルまたはアリール燐酸トリエステル、ホスホン酸水素塩、ホスホン酸アルキルまたはアリール、ホスホラミド酸アルキルまたはアリール、燐チオ酸塩、燐セレン酸塩などがあるが、これに限られるわけではない。リボヌクレアーゼＨによる開裂を防ぐためのリボース糖の好適な修飾は、２°−ヒドロキシル基のアルキルまたは芳香族エーテルへの転化である。

リボヌクレアーゼＨに認識されるためには、開裂可能なＲＮＡ配列は、長さが少なくとも３残基でなければならない。

リボヌクレアーゼＨによって開裂されない散在する配列を含有するプローブは、この酵素の活性を特定の領域に集中させるので、好適である。全体がＲＮＡで構成された２６残基の長さのオリゴヌクレオチドを、プローブとして用いた場合は、非生産的な開裂、すなわち、標的配列を遊離するに至らない開裂が、多くの部位で生じてしまう。

例えば、２３〜２４残基の長さのヌクレオチド鎖が開裂される結果、長さが２３残基の断片１個、および、わずか３残基の第２の断片を生じることになる。このトリヌクレオチドは、標的配列から非常に急速に解離するが、２３量体の方は、親分子が形成するのとほとんど同程度に安定な二重鎖を標的配列と形成し、それ故、遊離されることがない。

これに代えて、仮に、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ！、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ｓなる配列であるような場合、開裂は中央のＲＮＡ　４残基に限定されることになる。

このようにして生成される最長断片の長さは、１５残基となるはずである。この断片のＴ１は、親化合物である２６量体のそれよりも約２０〜２５℃低くなり（１式参照）、ＣＩＡ反応の条件下で容易に標的配列から解離する。このようにして、プローブが開裂される都度、標的配列は遊離し、反応経路中で再循環することが可能となる。

純粋なＲＮＡオリゴヌクレオチドをプローブとする場合、標的配列を遊離するには、プローブの開裂が、２回あるいはそれ以上必要となることがある。それより長いプローブにおいて、リボヌクレアーゼＨを用いた開裂によって標的配列から生じる断片を急速に遊離させるには、散在する開裂不能な配列は、約３５ヌクレオチド長未満、好ましくは１０〜２０ヌクレオチド長でなければならない。

ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡの混成オリゴヌクレオチドによるプローブは、ある種の遺伝的疾患、例えば鐘状赤血球症の診断に必要な点突然変異の検出には、特に有用である。ここで、正常な標的配列と完全な二重鎖を形成するプローブ、および、変異遺伝子を用いた１個所の塩基の誤対合を有する二重鎖について考察してみる。

ＤＮＡ側面配列が含まれるプローブ全体には、通常は、ノ１イブリッド形成によって得られる標的配列に対する特異性がある。誤対合が配列の中央付近に存在する比較的短いオリゴヌクレオチドのプローブを用いると、２本のらせん間の安定性の差を最大にすることができる。しかし、このような場合でさえ、正常配列を用いて形成される完全な二重鎖の融解温度は、誤対合が含まれる変異配列を用いて形成される二重鎖よりも、約５〜１０℃上回るに過ぎない。

このようなわずかな差異に基づき、第１図に示したような標準的なハイブリッド形成の図式を用いて、変異配列から正常な配列を識別することは不可能ではないものの、この方法の信頼性は、定型的な診断に用いるのに充分であるとは言えない。しかし、ＣＩＡ反応の様式には、これら２配列を容易に区別することを可能にする程に高い水準の特異性を発揮する余地がある。

上記の通り、リボヌクレアーゼＨによるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡなるプローブの開裂は、ＲＮＡ配列の中央部に限定されている。

ＲＮＡ配列が４〜５残基の長さであれば、リボヌクレアーゼＨによるＲＮＡ鎖の開裂を防ぐには、１個所の塩基対の誤対合がＲＮＡ：　ＤＮＡ二重鎖の構造を混乱させるだけで充分である。

したがって、プローブは、正常な標的配列と対合した場合には開裂されるが、変異配列と対合した場合には開裂されない。正常な標的配列だけが、プローブの開裂のための触媒的補因子として働くことになる。中央部のＲＮＡ配列の長さが６〜８残基である場合は、リボヌクレアーゼＨによる開裂を防ぐのに充分な程度に二重鎖構造を乱すには、二重鎖のＲＮＡ　：　ＤＮＡの部分に、２個所の誤対合が必要である。正常な配列中には、１個所に誤対合が存在し、変異配列には、２個所の誤対合が存在するような、例えば、式［式中、ｄＮ（Ｎ＝ＡＳＣＳＴまたはＧ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を、ｒＮはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を意味し、＊は不適正塩基対を表す。〕で示されるプローブを用いて、これを行うことができる。

プローブ自体は、分子生物学および合成手法の双方を用いて、これを作り出すことができる。６０ヌクレオチド長以上の長いプローブは、一般に、酵素的手法を用いて、これを合成し、かつ標識することができる。

ＳＦ３、あるいはＴ７なるＲＮＡ重合酵素のいずれかを用いれば、ＤＮＡの鋳型から長いＲＮＡ断片を合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成には、化学的方法を用いるのが一般的である。「オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ（Ｏｌｉｇｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　Ｊ　　［エム争ジエイ・ゲイト（Ｍ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ）編、イギリス国オックスフォードに所在のアイアールエル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）　１９８４年発行コを参照のこと。

現在では、ホスホラミダイト法が好適な化学的方法である。

固形支持体、例えばポリスチレンまたはガラスピーズに固着させた、あるいは溶液中に遊離したオリゴヌクレオチドの成長を利用して、その合成を行うこともできる。ＤＮＡ、　ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡなるオリゴヌクレオチドは、これらの方式を用いて調製できる。更に、Ｔ、ＲＮＡリガーゼなる酵素を用いれば、ＤＮＡ、　ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡ混在分子をいかなる組合わせで結び付けることも可能である。本発明に有用なプローブの合成には、上記の手法のいずれをも用いることができる。

放射性同位元素、螢光担体、発光担体（化学発光性、あるいは生物発光性の基質）、および酵素は、すべて、触媒的ハイブリッド形成増幅系におけるリポータ− 指示基として用いることができる。この系が、はとんどの場合、実際に検出操作を行う前に大規模な増幅応答を生起させるという事実は、用いられるリポータ− 指示基の感度の必要性を著しく減少させるものである。単に感度が最も高いからというばかりでなく、検査方式に便利であるから、すなわち、それが検査の様式（自動化器具によるか手動操作によるか）に良く適合するという理由から、リポータ−指示薬を選択することが可能となる。

例えば、ｆｉ！ｐ、＋４（，１！８１１および８Ｈなどの放射性同位元素は、分子生物学的手法を用いて、これを合成中、あるいはその完了後に、ＤＮＡプローブ、およびＲＮＡプローブに容易に組み込むことができる。化学的に合成されたプローブもまた、放射性同位元素を用いてこれを標識することができる。放射能標識化は、実験的あるいは研究的な目的にはある種の利点があるが、臨床研究室における新規の試験および検査の目的には、適切な方法であるとは思われず、好適ではない。

同位元素によらない標識として選択されるものとしては、（１）螢光担体、例えば、フルオレッセイン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）　、ルシファーイｘ　ｏ　−（Ｌｕｃｉｆｅｒ　Ｙｅｌｌｏｗ）、ピレン、ランクノイドキレート化物、およびフィコビリン蛋白質、その他多数、（２）発光担体、例えば、ルミノール、およびその誘導体、および、（３）酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびルシフェラーゼ、その他多数がある。

これらの多様な酵素を用いることによって、発色反応（アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、螢光生成物（アルカリ性ホスファターゼ）、および化学的発光（ルシフェラーゼ）を生起させることができる。

螢光担体および発光担体は、各種手法を用いて、これを四Ａ配列、およびＤＮＡ配列に共有結合で取り付けることができる。

３°−末端のヌクレオチドがリボース残基である核酸プローブの場合は、過ヨウ素酸塩を用いて、配列の３′−末端ヌクレオチドのリボースジオールを酸化して、反応性に富むジアルデヒドを形成することができる。こうすれば、還元的アルキル化反応を行うことが可能となり、ジアルデヒドは、第一アミノ基を含有する各種螢光性誘導体［ダンシルエチレンジアミン、Ｎ−（１−ピレンスルホニル）エチレンジアミン、５−［（２−アミノエチル）チオウリジルコーフルオレッセイン等々］とと導体をカップリングさせることもできる。シッフ塩基のアダクトは、水素化ホウ素ナトリウム、あるいは水素化シアノホウ素ナトリウムを用いて還元され、安定な第二アミン結合を形成することができる。

また、ヒドラジン基を含有する螢光性誘導体（フルオレッセインチオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、クマリンヒドラジド、ルシファーイエローヒドラジドＣＨ等々）を過ヨウ素酸の酸化によって生じる末端アルデヒドとカップリングさせることも可能である［オー・ダブりニー・オドム・ジュニア（０，Ｗ、　Ｏｄｏｍ、　Ｊｒ、）ら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第１９巻（１９８０年）　５，９４７〜５，９５４ページ参照コ合成オリゴヌクレオチドの場合、脂肪族第一アミノ基を、幾通りかの方法で、その５°− 末端に容易に組み込むことができる（一般に、オリゴヌクレオチドは、鎖の３° −末端から５゛−末端へと合成される。）。

最終残基として、特別に保護された５°−アミノ−５°−デオキシチミジンのホスホラミダイト誘導体を組み込むことができる［エル・エム・スミス（Ｌ、　Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ）ら：ニュークレイック・アシズ・リサーチ、第１３巻（１９８５年）　２，３９９〜２，４１２ベージ］。また、この特別なホスホラミダイト誘導体を経由して、第一アミンをオリゴヌクレオチドに組み込むこともでき、この誘導体もまた、合成手順の最後の段階で付加することができる。

このような２種類の誘導体の一つは、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）から［商品名：アミノリンク１番（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ　１．部品番号第４００４９８番コ、また、他種は、ケムジーンズ社（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、　Ｉｎｃ、）から購入可能であるが、これらにおいては、アミノ基はモノメトキシトリチル基で保護されている。

第一アミンをオリゴヌクレオチドに組み込みさえすれば、多数のアミン選択的螢光性誘導体（フルオレツヤイン−５−イソチオシアナート、テキサスレッド、スクシンイミジル−１一ビレンブチラート等々）を、穏やかな条件下で、第一アミン基にカップリングすることが容易に可能となる。螢光性ランタノイド（ユウロピウム、テルビウム等々）は、初めに第一アミンをジエチレントリアミン五酢酸無水物と反応させて、ランタノイドを結合させるためのキレート化剤を生成することによって、これをオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。

特に関心の持たれる酵素標識としては、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース酸化酵素、細菌性（ＦＭＮ／ＮＡＤＰＨ）ルシフェラーゼ、および昆虫性（ＡＴＰ）ルシフェラーゼ、その他多数がある。その他の標識としては、ミクロペルオキシダーゼ、官能化されたヘム誘導体、およびその他の触媒活性を有する金属キレートがある。

螢光性誘導体に関して上記で考察したのと同様の手順を用いて、酵素を、ＲＮＡ、　ＤＮＡ、およびＲＮＡ−ＤＮＡ混合のプローブに組み込むことができる。例えば、アルカリ性ホスファターゼは下記のようにして、５°−末端に、第一アミンを含むオリゴヌクレオチドのプローブに組み込むことができる。第一アミンを含むオリゴヌクレオチドを、過剰のスペリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ：穏やかな条件下で、第一アミンをカップリングさせるのに用いられる非常に特異的な試薬）なる二価を生成する。ＤＳＳ−オリゴヌクレオチドのモノアダクトは、容易にこれを精製することができる。

次いで、ＤＳＳ−オリゴヌクレオチドのモノアダクトを、穏やかな条件下でアルカリ性ホスファターゼと反応させる。ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて、最終生成物である「アルカリ性ホスファターゼ−ＤＳＳ−５’− オリゴヌクレオチド」を精製する。このカップリングの手順の詳細は、イー・ヤブロンスキー（Ｅ、　Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ）らの論文［二ニークレイツク・アシズ・リサーチ、第１４巻（１９８６年）　６，１１５〜６，１２８ページ］に記載されており、参照用として、本明細書に組み込まれる。

このＣＨＡ法の最初の好適実施例においては、プローブが標的配列とハイブリッド形成した後のその開裂を、リボヌクレアーゼＨに触媒させている。この酵素は非常に特異的であって、これは、ＲＮＡ　：　ＤＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖だけを開裂するＲＮＡ分解酵素なのである。この酵素は、真核細胞と細菌の双方から得られる。本実施例では大腸菌のりボヌクレアーゼＨを用いているが、　これは、分子量が約１７，５００の単一のポリペプチド鎖である。この酵素は、非常に安定であって、その蛋白質の遺伝子は、クローン化されて配列も決定されており、更に、この酵素を大量に生成する過剰産生菌株が確立されている［カナヤ（Ｋａｎａｙａ）およびアール・ジエイ・クラウチ（Ｒ，Ｊ。

Ｃｒｏｕｃｈ）　　：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、第２５８巻（１９８３年）　１，２７６〜１．２８１ベージ］。このような理由から、その使用は一般に好適である。

約５０℃以上の温度で行われるＣＨＡ反応に用いるには、この酵素の更に温度に安定な形態が望ましい。酵素のこのような変種は、これを好熱性の生物から単離し、あるいは、組換えＤＮＡの手法を用いた（例えば、適当な位置でのジスルフィド結合の架橋形成による）大腸菌リボヌクレアーゼＨに対する突然変異誘発によって生成させることができる。

ＣＩＡ反応の実行に最適の温度は、プローブ：標的二重鎖の融解温度より約り℃ 〜約２５℃下回るのが一般的である。

このようにすれば、ハイブリッド形成が急速に行われ、標的配列に対する高度の特異性が得られる。例えば、Ｇ−Ｃ断片が５０％含まれる長さ２６残基のＤＮＡ −ＲＮＡ−ＤＮＡプローブを想定すると、塩濃度が０．１モルの場合、式（Ｉ）に従って予測されるプローブ：標的二重鎖の融解温度は約５５℃である。したがって、ＱＡ反応の温度の上限は約５０℃となる。

配列中央部におけるプローブの開裂によって、それぞれ融解温度が約２５℃の２本の断片が生じる。上記の通り、これらの断片が標的配列から急速に解離するには、ＣＨＡ反応の温度は、この値よりも少なくとも１０℃高くなければならない。すなわち３５℃と等しいか、あるいはそれ以上でなければならない。したがって、これをプローブに用いるＣＨＡ反応の最適温度範囲は、約３５〜約５０℃である。

ＣＨＡ反応の継続時間は、通常、約１５分ないし約１時間である。一般的には、プローブの長さと配列、および特定の反応条件に応じて、この期間内に、１００〜１，０００回の標的配列の各分子の代謝回転が行われる（実施例１参照）。

検査試料中に存在する標的配列の複写のそれぞれに対して、標識プローブの１００〜１，０００分子が、リボヌクレアーゼＨによって開裂されることになる。このように増幅度が大きいために、化学量論的なハイブリッド形成様式に基づく検査法と比較して、はるかに高い感度がもたらされる。ＣＨＡ反応を更に長く進行させることによって、更に高い増幅度を実現することが可能である。

ＣＨＡ反応の際には、非特異的ヌクレアーゼによる、標的配列のみならず、プローブの開裂をも抑止することが必要である。このことは、標準的なハイブリッド形成様式に基づく検査法においても重要である。通常、このようなヌクレアーゼは、加熱または抽出操作によるＤＮＡの単離の間に試料から除去される。

バナジウム酸塩、インヒビット・エース［Ｉｎｈｉｂｉｔ−ＡＣＥ　：ファイブプライム・スリーブライム社（５Ｐｒｉｍｅ　−３Ｐｒｉｍｅ。

Ｉｎｃ、）製の商品名］、およびリボヌクレアジン（胎盤蛋白質の一種）など、１本鎖リボヌクレアーゼ阻害剤の多くは、リボヌクレアーゼＨ活性に影響を及ぼすことがない。更に、プローブを非特異的減成から保護するためには、ＣＨＡ反応の際にこのような阻害剤を混入させることが望ましい。

ＣＩＡ反応に続いて、プローブの開裂度の測定が必要となる。

これは通常、残存する未開裂のプローブ分子から標識を担う開裂生成物を分離することによって行われる。このような分離に用いる方法としては、（１）ＣＩ（Ａ反応生成物に電気泳動を施し、大きさに基づいて、無傷なプローブから開裂断片を分離する、（２）強酸、例えばトリクロロ酢酸を用いて、相対的に高分子の未開裂標識プローブを、より低分子の開裂断片から選択的に沈澱させる、（３）リポータ−指示基に加えて、高親和性標識をプローブに組み込み、ＣＨＡ反応後に、親和性支持体を用いて未開裂プローブの分離ができるようにする、（４）ＣＨＡ反応の実行後に、相補的なポリヌクレオチド配列を含有する支持材を用いて未開裂標識プローブを固定化し、開裂断片を溶液中に残す、などの方法があるが、これらに限定されるわけではない。

（１）の分離法においては、ゲルを基質として、ＣＨＡ反応生成物に対する電気泳動を施し、標識を有する開裂生成物を無傷なプローブから分離する。より低分子の断片は、より高分子の無傷な分子よりも急速にゲル中を移動する。約１００ヌクレオチド長までのプローブに対しては、ポリアクリルアミドのゲルが一般に用いられる。それより長いプローブに対しては、ポリアクリルアミド、アガロース、あるいはこの２成分からなる混成ゲルが概して好適である。

分離完了後は、リポータ−支持基の標識を担う断片、および本来のプローブは別々の帯域に分離され、容易にそれらを特定し、かつ定量することができる。

（２）の分離法は、強酸による沈澱が必要であり、主として、放射性同位元素または螢光物質の標識のいずれかを含む（約５０ヌクレオチドを越える長さの）長いプローブを、ＤＮＡ法を通じて多数の（１０ヌクレオチド長未満の）比較的低分子の標識断片へと開裂するような状況に用いられる。溶液中への強酸（トリクロロ酢酸など）の混入は、無傷なプローブを沈澱させるが、より低分子の開裂断片は、溶液中に残っている。

この溶液に遠心分離を施し、あるいはこれを濾過すれば、沈澱を除去することができる。このようにして、開裂された標識断片を含有する上清を定量することができる。この方法に関する更に詳細な考察は、後述の実施例１において行う。

（３）の分離方法は、高親和性の基とリポータ−支持基の双方を用いて標識されたプローブを必要とし、分離操作を行うには親和性支持体を用いる。この場合に用いられるプローブは、ＲＮＡ配列であることも、あるいは、リボヌクレアーゼＨによって開裂されない部分が散在する配列、例えばＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混合配列であることも可能である。プローブは、その一方の末端、あるいはその近傍に親和性標識（例えば、ビオチン、アビジン、レクチン、ハブテン、あるいは抗体など）が組み込まれるように設計される。反対側の末端の部位、あるいはその近傍には、リポータ−指示基による標識（酵素、螢光担体、発光担体、あるいは放射性同位元素）を組み込む。長鎖ポリヌクレオチドのプローブを用いれば、散在する多数またはすべての、リボヌクレアーゼＨによって開裂されない配列を、リポータ−支持基で標識することができる。

このようにして、プローブ配列の開裂可能な部位は、親和性の基とリポータ−指示基との間に位置することになる。２個所の標識の間には、最小限約１５ヌクレオチドが必要であり、２０〜５０ヌクレオチドであれば更に理想的である。上記に考察したリポータ−指示基の標識を、プローブに組み込むのと同じ方法が、親和性標識の取り付けにも用いられる。

この分離操作においてはまた、プローブに組み込まれた親和性標識に対応して、これと特異的かつ強力に結合する親和性の基を含有する支持材を備える必要もある。例えば、親和性標識として、ビオチンがプローブに組み込まれる場合は、適合する親和性支持材にはアビジン、あるいはストレプタビジンが含まれていなければならない。共有結合によってアビジンを含有する、例えばガラスピーズ、ラテックスビーズ、架橋結合したデキストラン（商品名：セファロース）ビーズ等々、多数の支持材が市販品として入手可能である。

ＣＨＡ反応を実行した後、支持材を試料に加える。無傷なプローブ分子は、支持体に強固に結合する。リポータ−指示基を有するが、親和性標識は含まない開裂された断片は、溶液中に残存し、これを定量することができる。

（４）の分離手段は、直前に述べた方法と大筋では酷似しているが、ＣＨＡ反応の際に開裂されなかったプローブ中の核酸配列が、親和性標識として用いられる。相補的な核酸配列を固形支持体に結合させ、捕捉用配列として働かせる。

Ｃ）ＩＡ反応の際のプローブの開裂が、リボヌクレアーゼＨを介して行われる場合は、親和性標識の役割を果たす配列を、ＤＮＡ１あるいは、リボヌクレアーゼＨによる開裂を防ぐように、糖または燐酸が修飾されたＩ’ｌＮＡ配列とすることができる。Ｃ）ＩＡ反応の際に、リボヌクレアーゼＨによって開裂されるプローブの部分、例えば、５−ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−（リポータ−指示基）によって、親和性標識配列は、リポータ−指示基から分離される。この例では、プローブの５“−末端のＤＮＡ配列、あるいはその一部が親和性標識として働くのである。

２０〜５０ヌクレオチド長の親和性標識配列が最も理想的であるが、それより長い配列を用いることもできる。１５ヌクレオチド長未満の配列は、最も有用性が少ない。親和性標識配列の一部は、標的配列と相補的であるか、プローブに固着した独立の分枝であることができる。

一般化された捕捉用配列を、その後に用いることができるので、後者の方が好適である。この場合、１組の捕捉用ビーズを、標的に特異的な多数の異なるプローブに対して用いることができる。

捕捉用配列を固形支持体に取り付けるには、多数の異なる化学的方法を用いることができる。その実例については、ビー・ティー・ジラム（Ｐ、　Ｔ、　Ｇｉｌｈａｍ）の論文［エル・グロスマン（Ｌ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ）およびケイ・モルディプ（Ｋ、　Ｍｏ１ｄａｖｅ）編、米国ニューヨークに所在のアカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｒｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　１９７１年発行のメソッズ・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、第２１巻、１９１〜１９７ページ］、エイチ・ボッザク（Ｈ，Ｐｏｔｚａｋ）およびピー・ディー・ジー・ディー２（Ｐ、　Ｄ、　Ｇ、　Ｄｅａｎ）の論文［ニュークレイツク・アシズ・リサーチ、第５巻（１９７８年）２９７〜３０３ページ］、ディー・エルーロバートソン（Ｄ、　Ｌ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）およびエヌ・デイビッドソン（Ｎ、　Ｄａｖｉｄｓｏｎ）の論文［バイオケミストリー、第１１巻（１９７２年）５３３〜５３７ページ〕、および、エル・ジー・モス（Ｌ、　Ｇ、　Ｍｏ５ｓ）らの論文［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５６巻（１９８１年）　１２．６５５〜１２．６５８ベージ］を参照のこと。

捕捉用配列を固形支持体上に直接合成し、これを、その後の検査の際に用いることも可能である。前述の通り、オリゴヌクレオチドは一般に、ヌクレオチド鎮の３°−末端から５°−末端へと合成される。固形支持体上で合成を行う場合は、一般に、３′−末端の先頭のヌクレオチドを、その３°−ヒドロキシル基におけるエステル結合によって支持体に取り付ける。ヌクレオチド塩基上の保護基を除去するのに必要な条件（濃アンモニアによる５５℃で６〜ｌＯ時間の処理）の下で、この結合は、容易に開裂される。

オリゴヌクレオチドが支持体に結合したままである場合は、３°−ヒドロキシル基との結合を、このような条件下では開裂されないものに変えなければならない。３°−ヒドロキシル基の取り付けに用いることができる適当な官能基としては、エーテル結合、燐酸トリエステル、燐酸ジエステル、および芳香族カルバミン酸エステルがある。合成を簡素化するのに好適な官能基は、β−シアノエチル燐酸トリエステルである。

取り付けは、遊離ヒドロキシル基を含有する固形支持体に対する先頭のヌクレオチドの３゛−β−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト誘導体（４種類の塩基のすべてに対して市販品が入手可能である）の反応によって行われる。

このような支持体は、ガラス、ポリスチレン、ラテックス、あるいは架橋結合したデキストラン（商品名：セファロース）のビーズ、セルロース、あるいは、ナイロンまたはテフロンの膜など、各種の材料から作成することができる。

先頭のヌクレオチドを支持体に固着させた後は、通常のホスホラミダイト法を用いて、残りのヌクレオチドを合成する。

合成が最盛期に達すると、脱ブロツク操作を用いて、β−シアノエチル燐酸トリエステルを燐酸ジエステルに転化し、この間に、オリゴヌクレオチドは支持体に結合されて残る。

上記の方法のいずれかによって支持材を作成した後、所望の場合には、多数の異なる酵素的方法を用いて、固着したオリゴヌクレオチドを伸長させることができ、これによって、支持体に結合した更に長いヌクレオチド配列が得られる。これに適した手法としては、ＤＮＡ重合酵素、または末端転移酵素を用いたヌクレオチド残基の断片への付加、および、支持体に固着した先頭配列に対するＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いたポリヌクレオチドの連結反応などがあるが、これらに限られるわけではない。

前記４種類の分離方法のいずれにおいても、最初に、溶液中でＣＩＡ反応を行う。これに代えて、標識プローブを固形支持体に取り付けることもできるが、その場合は、ＣＩＡ反応の際のプローブの開裂によって、リポータ−指示基を有する断片が溶液中に遊離される（第３図参照）。

この方式の主な利点は、ＣＩＡ反応終了後の分離段階が比較的容易なことであって、物理的手段、例えば濾過、あるいは遠心分離などを用いて、残存する無傷のプローブ分子を含む固形支持体は、試料から容易に除去され、かつ、リポータ− 指示基を有する開裂断片は溶液中に残存して、これを定量することが可能である。これに適した固形支持体の材料としては、ガラス、ポリスチレン、ラテックス、あるいは架橋結合したデキストラン（商品名：セファロース）のビーズ、セルロース、あるいは、ナイロンまたはテフロンの膜がある。磁化されたビーズを用いることもでき、その場合は、磁場を与えることによって、ビーズを溶液から分離する。

プローブは、共有結合または非共有結合（例えばビオチン−アビジン）のいずれを用いても、固形支持体に取り付けることができるが、安定性が高いことから、共有結合の方が好適である。次の段落では、化学的方法、および酵素的方法のいずれかを用いて、ヌクレオチド配列を固形支持体に共有結合させるのに適した手法を説明する。

固形支持体によるＣＨＡ法を用いる場合は、初めに、試料ＤＮＡをより低分子の断片に切断し、その結果、標的配列が容易にビーズの表面に向かって拡散し、結合されているプローブとハイブリッドを形成できるようにするのが好ましい。

これを行うには、機械的な力を用いたＤＮＡの剪断（例えば、音波処理）、あるいは、制限酵素を用いた特定の部位でのＤＮＡの開裂を用いることができる。これに代えて、試料ＤＮＡを鋳型として利用し、ＤＮＡ重合酵素を用いて、標的配列を含む低分子の断片を合成することもできる。

この手法においては、まず、ブライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドに、標的配列から遡るように（すなわち５゛−末端へと）試料ＤＮＡとのハイブリッドを形成させる。次いで、ＤＮＡ重合酵素を用いてブライマーを、標的配列を越えるように（相補的な鎖を複写しつつ）伸長させる。次いで、５°−ブライマー・標的配列なる生成物にＣＨＡ反応を行わせる。

ＤＮＡ重合酵素を用いて反応を多数回反復し、標的配列の複写数を増加させることも可能である。そのような手法は、いわゆる重合酵素連鎖反応として実施される［ケイ・ビー・マリス（Ｋ、　Ｂ、　Ｍｕｌｌｉｓ）ら：ヨーロッパ特許公開公報第０２００３６２号（１９８６年）、および、マリス：ヨーロッパ特許公開公報第０２０１１８４号（１９８６年）コ。

標的の増幅、およびＣＨＡ法は、検査方法における分離段階全体を包含するので、両者を組み合わせて用いることができる。試料中に最初から極度に少ない複写数でしか存在しない核酸配列を検出するには、このような手法が有効なことがある。しかし、はとんどの診断用途に対しては、ＣＨＡ法の感度が高いことだけで充分である。

ＣＨＡ法の利用に関する前記の考察は、すべて、ＤＮＡ標的配列の検出を主目的とし行なったが、ある場合には、ＲＮＡ標的配列、例えばリポソームＲＮＡの配列を検出する方が有利なことがある。

逆転写酵素なる酵素を用いて、本来のＲＮＡ配列に対する相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の複写を最初に合成すれば、リボヌクレアーゼＨを利用する前記のいかなるＣＨＡ反応の手法を用いても、これを行うことができる。この手法においては、初めに、オリゴデオキシヌクレオチドのブライマーを試料ＲＮＡと、標的配列から遡るように（すなわち５°の方へと）ハイブリッド形成させる。逆転写酵素、および４種類のデオキシリボヌクレオチド三燐酸（Ａ、　ＧＳＴ、およびＣ）の付加によって、ブライマーは、標的ＲＮＡのｃＤＮＡによる複写を生成しつつ伸長する。

このようにして、５°−ブライマー・ｃＤＮＡ標的配列なる生成物がＣＨＡ反応の基質を形成する。

逆転写酵素の利用に関する手法の更に詳細な記載については、ティー・マニアテイス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、イー・エフ・フリッチ（Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ）　、およびジエイ・サムプルツク（Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、「分子クローニング：研究室用マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　　［米国ニューヨークに所在のコールド・スプリング・）１−バー・ラボラトリ −（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　１９８２年発行、１２８〜１３２ページ］を参照のこと。

ここで、標的配列の燐チオ酸誘導体を基質として用い、制限酵素を用いて相補的標識ＤＮＡプローブを開裂する、ＣＨＡ法の第２の実施例について説明する。

制限酵素は、一般に、４〜６ヌクレオチド長の特異的ＤＮＡ配列を認識し、その部位で、ＤＮＡ二重鎖の鎖の双方を切断する。多数の異なる認識部位について、このような酵素が数百種類も知られている。

一般に、これらの酵素は、プローブとともに標的配列も切断してしまい、したがって、これを反応経路中で再循環させることが不可能となるので、ＣＨＡ反応にこれを用いることはできない。しかしながら、ＤＮＡ二重鎖のうち一方の鎖の燐酸基が、通常の燐酸ジエステルではなく、燐チオ酸ジエステルである場合は、制限酵素の多く（例えば、Ａｖａ　Ｔ　、Ａｖａ　Ｉ［、Ｂａｎ　Ｉ［、Ｈｉｎｄ　ＩＩ、Ｎｃｉ　ｌ５Ｐｓｔ　Ｉ、およびＰｖｕＩ）は、修飾されていない鎖だけを開裂する［ジエイ・ダブりニー・ティラー（Ｊ、　Ｗ、　Ｔａｙｌｏｒ）ら：ニュークレイツク・アシズ・リサーチ、第１３巻（１９８５年）　８，７４９〜８，７６４ページコ。

燐チオ酸の配列は切断されないので、制限酵素を用いた相補的標識プローブの開裂の対する触媒的補因子として、これを利用することができる。このような検査法に用いられる標的配列に、制限酵素の認識部位が含まれているのは当然である。

修飾されたＤＮＡ配列は、ＤＮＡ重合酵素を用いてＤＮＡの鋳型からこれを調製する。試料がＲＮＡである場合は、逆転写酵素を用いる。これらの反応も、前記のようにして行うが、正常なデオキシリボヌクレオチド三燐酸の代わりに、デオキシリボヌクレオチドα−チオ三燐酸を用いる点が異なる。４種類のデオキシリボヌクレオチドα−チオ三燐酸は、すべて市販品として入手可能である。

修飾された標的配列を調製したら、前記のいずれの検査様式を用いても、ＣＨＡ反応を行わせることができる。プローブの合成および標識化にも、同一の方法が適用可能である。修飾されたＤＮＡ配列、あるいはＲＮＡ配列は、制限酵素の認識部位の側方に位置するように、これを、プローブに組み込むことができるが、認識部位自体は、ＤＮＡで構成しなければならない。

ここに記載のＣＨＡ法の各種好適実施例、およびその様式は、そのすべてにおいて、指標の多大な線形増幅が行われる。標的配列の濃度は一定のままであるから、反応速度も不変であり、開裂される標識プローブの分子数は、時間とともに線形に増加するのである（実施例１参照）。

上述の通り、代謝回転数、すなわち１標的配列につき、１時間ごとに開裂されるプローブ分子の数は、一般的には１００〜１，０００の範囲にある。

指数関数的な増幅をもたらし、それ故、感度がはるかに高くなるような、新規な仕方でＣＨＡ反応を行わせることもまた可能である。一般に、指数関数的な応答は、２〜３種類の０Ａ反応を連動させて、標的配列の複写を余分に生成することによって得られる。

多数の異なる指数関数的ＣＨＡ反応の様式を設定することができる。

指数関数的ＣＨＡ反応様式の１形態を第４図に示す。この場合は、２組のプローブ配列が固形支持体に固定化されている。

支持体Ｉ上の第１のプローブ配列には、本来の標的配列に相補的な開裂可能な配列（Ｔ’）　、および開裂不能な配列（Ｘ）が含ま゛れている。

配列（Ｘ）は、支持体■に固定化された開裂可能な配列（Ｘｏ）と相補的である。この方法の第１段階では、試料に由来する標的ＤＮＡは、支持体■上の開裂可能な相補的配列（Ｔｏ）とノ１イブリッド形成する。標的配列とハイブリッド形成するや、（Ｔｏ）は切断されて、配列（Ｘ）をその支持体から遊離させる。次いで、（Ｘ）は支持体から拡散し、支持体■上の開裂可能な配列（Ｘｏ）とハイブリッド形成する。（Ｘ）が支持体から遊離されるまでは、これが起こることは不可能である。

配列（Ｘ）および（Ｘｏ）は、分離された２個の巨視的な支持体に固定化されている間は、互いにハイブリッド形成することは不可能である。（Ｘ）と（Ｘｏ）との間に二重鎖が形成されると、（Ｘ’）は開裂される。これによって、標的配列の第２の複写が遊離され、今度は、これが支持体Ｉと作用し合って、反応を伝播する。

このようにして、ＣＨＡ反応の１周期の間に標的配列の複写が２個生成される。

第２回目の周期の間には、４個の標的配列の複写が、また、第３回目には８個が、等々となる。

図示された配置においては、反応の際に生成された標的分子のそれぞれに対して、１個のリポータ−指示基の標識が支持体■から遊離される。支持体■から遊離される遊離標識の量は、次式％式％（）（式中、Ａは、試料中に存在する標的の開始時の複写数、ｋは、２種類の別個のＣＩＡ反応における代謝回転数の積の平方根、ｔは、時間をそれぞれ意味する。

）で与えられることが分かっている。

この式の最初の項（Ａ／２Ｘｅ”）は、急速に支配的になる。遊離した標識の量は、時間とともに指数関数的に増加し、これが、検査法の感度を極度に高めるのである。ＣＩＡ反応のそれぞれの代謝回転数が、毎分１に過ぎない場合でも、標的配列の１個の複写は、溶液に遊離される標識を、２０分以内に、２．４　ＸＩＯ”個も生起させることになる。この数は、単純な螢光性の、あるいは酵素性の標識基を用いて容易に測定することができる。毎分１を大きく上回る代謝回転数を得ることも可能である（実施例１参照）。

このように、連動するＣＩＡ検査系では、わずか数分間という反応時間で、１個の複写標的を検出する能力がもたらされる。

最後に、ＣＨＡ法に基づ＜　ＲＮＡ標的配列検出のための競合的検査法について説明する。

この場合は、ＤＮＡ分子と標識されたプローブとの双方を、分析すべき試料に加える（第５図）。プローブ配列（Ａｏ）は、全体をＲＮＡで構成することも、あるいは、リボヌクレアーゼＨで開裂し得ない散在する配列を、これに含めることもできる。

ＤＮＡ断片は、標識されたプローブに対して、相補的な配列（Ａ）をそれ自身に含んでいる。

図示した実施例においては、プローブの中央部がＲＮＡであり、その両側方にＤＮＡを配置しである。（Ａ）と（Ａｏ）とが互しアーゼＨの基質を形成する。リボヌクレアーゼＨは、標識されたプローブを開裂することができ、ＤＮＡ断片を無傷で遊離させるが、これが、反応を更に伝播するための触媒として働くのである。これは、標的ＲＮＡ配列が試料中に存在しない場合に起こることである（第５図Ｂ）。標的ＲＮＡ配列が存在する場合は、この反応は阻害されることになる（第５図Ａ）。

標的配列には配列（Ａｏ）が、ＤＮＡ断片にも相補的な隣接する配列（Ｂｏ）とともに含まれている。したがって、ＤＮＡ断片は標的配列と、プローブよりも安定な二重鎖を形成する。このようにすれば、標的分子は、ＤＮＡ断片の結合に対して非常に効果的に競合できるようになり、それによって、リボヌクレアーゼＨによる標識プローブの開裂を遮断するのである（第５図Ａ）。

このような標識プローブの開裂に対する競合阻害が、この検査法の基本原理である。標的配列との間に形成されるＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が、リボヌクレアーゼＨによって減成されるのを防ぐことによって、この方法の感度を、更に高めることができる。これは、ＤＮＡ断片を適切に修飾することによって、実行することができる。

発明者らは、ＤＮＡ鎖の燐酸骨格に対する各種の修飾が、リボヌクレアーゼＨによる相補的ＲＮＡ鎖の開裂を防ぐことを見出した。このような修飾としては、アルキルまたはアリール燐酸トリエステル、あるいは、ホスホン酸アルキルまたはアリールとの正常な燐酸ジエステルの置換があるが、これに限られるわけではない。

こうした修飾は、Ｂの領域全体、および、プローブ中央部のＲＮＡ配列とハイブリッドを形成する部分を除くＡ領域の全部において、検査に用いられるＤＮＡ分子へと組み込まれる。

Ａ領域内のこの未修飾配列が、プローブ内のＲＮＡ配列とは厳密に相補的であるが、標的配列に関しては、１個所またはそれ以上の誤対合を含む場合には、プローブだけがリボヌクレアーゼＨによって開裂されることになる。

ＤＮＡと標的分子との間に形成された二重鎖中の誤対合は、らせんを崩壊させ、それによって、リボヌクレアーゼＨによるこの領域内の標的鎖の開裂を阻害する。標的配列の他の部分の開裂は、ＤＮＡ分子の骨格となる燐酸基に施された修飾によって阻害される。

誤対合は、標的配列とＤＮＡ分子との間に形成される二重鎖の安定性を多少は低下させるが、Ｂ領域には、相補的な配列が他にもあるので、二重鎖の安定性は、標識プローブとの間に形成されるそれよりも、はるかに大きいままである。

以下の実施例は、本発明の手法、生成物、および技術を更に詳細に説明し、本発明の有用性の根底をなす独自の特徴の実証に役立てるためだけのものであり、本発明を制約するものではない。

失ｌｊす２リボヌクレアーゼＨを介して行われる触媒的ハイブリッド形成増幅の実証本実施例は、触媒的ハイブリッド形成増幅法の原理を実証するものである。本実施例での標的配列は、長さが１２〜１８ヌクレオチド残基のオリゴデオキシチミジル酸である［米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社より購入の商品名オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）ｄＴ＋　２−１８１゜プローブとして働く分子は、トリチウムで標識されたポリリボアデノシン（ポリｒＡ）である［米国アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社より入手］。研究に用いたポリｒＡＯ比活性は、１ヌクレオチド残基あたり５７４ミリキユリーで、ヌクレオチド鎖は、約４０〜１４０残基の各種の長さのもの。標的配列の存在下で、リボヌクレアーゼＨは、標識されたポリｒＡプローブの開裂を触媒する。次いで、無傷な二重鎖からオリゴ訂が遊離され、第２図に図示した通り、反応中に反復的に再循環する。

リボヌクレアーゼＨに触媒されたポリｒＡプローブの開裂状況は、３通りの条件、すなわち、オリゴｄＴの不在下、（ヌクレオチド残基を基準として）等価の濃度のオリゴｄＴの存在下、および、１，０００分の１の濃度のオリゴｄＴの存在下においてこれを比較する。

反応はすべて、（ヌクレオチドを単位として）ポリｒＡ４４ピコモル、ｐＨ８，０のトリス塩酸緩衝液５０ミリモル、塩化カリウム２０ミリモル、塩化マグネシウム９ミリモル、２−メルカプトエタノール１ミリモル、およびウシ血清アルブミン２５μｇを含有する最終体積１００μｌの溶液中で行わせる。大腸菌のりボヌクレアーゼＨ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）より入手］２．３単位の添加によって反応を開始させ、３０℃に保つ。

３０分後に、反応混合液のアリコートを取り、担体ＤＮＡ溶液（サケ精子ＤＮＡ０．５ｍｇ／　ｍｌ、ピロ燐酸ナトリウム０．１モル、およびエチレンジアミン四酢酸１ミリモル）　０．２ｍｌ、および１０％トリクロロ酢酸０　、３ｍｌを加える。トリクロロ酢酸は、約１０ヌクレオチド長よりも高分子の核酸を沈澱させる。より低分子の開裂生成物、すなわちモノヌクレオチド、および短いオリゴヌクレオチドは、溶液中に残存する。

試料を２０分間氷上に放置した後、１６．０００　Ｘ　ｇ、　１５分間の遠心分離を施して、沈殿した核酸をペレットとする。開裂された断片を含有する上清を注意深く除去し、シンチレーション用溶媒と混合して、放射能を計測する。

オリゴｄＴを用いない対照試料においては、９０分間で開裂されたポリｒＡは、０．５％未満である。等価濃度のオリゴｄＴの存在下では、３０分以内にほぼ１００％のポリｒＡが、トリクロロ酢酸に可溶な断片へと開裂された。１，０００分の１量のオリゴｄＴの存在下でのポリｒＡの開裂は、９０分を超えるまで線形に進行し、この時点では、２１％のポリｒＡがトリクロロ酢酸に可能な断片へと開裂された。オリゴｄＴは、ポリｒＡ配列のわずかに０゜１％とハイブリッド形成するに足りる濃度で存在したに過ぎないことから、反応の間にオリゴｄＴの各分子は、平均して少なくとも２１０回（毎分２．３回）は再循環したことが確実である。

ポリｒＡ鎖の開裂は、ある場合には非生産的であること、すなわち、トリクロロ酢酸の存在下で溶液中に残存できる程に低分子の標識断片を遊離させるに至らないことから、真の代謝回転数は、これよりはるかに高いことも確実である。ＣＨＡ法に基づく診断用試験においては、１時間あたり１００を上回る代謝回転数は、化学量論的ノ１イブリッド形成様式に基づく検査法と比較して、感度の多大な向上をもたらすことになる。

Ｋ嵐■）相補的な標的ＤＮＡ配列の存在下におけるリボヌクレアーゼＨを用いたβ−グロビンｍＲＮＡの部位特異的な開裂実施例２は、リボヌクレアーゼＨによるヌクレオチド鎖の開裂の特異性を明確に立証する重要な例である。α−およびβ−グロビンｍＲＮＡの混合液を用いて、このβ−グロビンｍＲＮＡの一部分と相補的な、２５残基の短い標的ＤＮＡ配列とｌ＼イブリ・ンド形成させた場合に、リボヌクレアーゼＨが特定の１部位でβ−グロビンｍＲＮＡを開裂することが明らかにされる。

ベックマン自動ＤＮＡ合成装置を用い、ホスホラミダイト法によって、５°−ＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＴ　（ＣＯＤＭＢ−２５）なるオリゴデオキシヌクレオチドを合成する。これは、マウスβ−グロビンｍＲＮＡの２５９〜２９３番目の残基と相補的なヌクレオチド配列である。

グーセンズ（Ｇｏｏｓｅｎｓ）およびカン（Ｋａｎ）の論文［イー・アントニーニ（Ｅ、　Ａｎｔｏｎｉｎｉ）　、エル・ロッジ−ベルナルディ（Ｌ、　Ｒｏｓｓｉ−Ｂｅｒｎａｒｄｉ）　、およびイー・シャンコーヌ（Ｅ、　Ｃｈｉａｎｃｏｎｅ）　ＭＡ、メソツズ・イン・エンザイモロジー、第７６巻（１９８１年）８０５〜８１７ページ］の記載に従い、フェニルヒドラジンの投与によって貧血症を誘発させたマウスより採取したの網状赤血球から、マウスβ−グロビンｍＲＮＡを単離する。このＲＮＡ　２μｇを、ｐＨ７，５のトリス塩酸緩衝液１０ミリモル、塩化マグネシウム５ミリモル、塩化ナトリウム２５ミリモル、およびジチオトレイトール１ミリモルを含有する１、０ナノモルのＣＯＤＭＢ−２５溶液に加えて、最終体積を２５μｌとする。

オリゴヌクレオチドの濃度はｍＲＮＡよりも、モル濃度でほぼ１００倍高い。大腸菌のりボヌクレアーゼＨ２単位の添加によって反応を開始させ、３７℃に３０分間保って進行させる。クロロホルムとフェノールの１：１（容積：容積）混合液を用いて反応を停止させ、試料を抽出する。次いで、リボヌクレアーゼＨを用いてＲＮＡを消化し、残存するＲＮＡ種をエタノールによって沈澱させて単離し、ノーサンプロット法で分析する。

ＲＮＡ試料を、１０ミリモルのｐＨ６，５の燐酸ナトリウムとジメチルスルホキシドの容積比で１：１の混合液に解かしたグリオキサール１モルと、５０℃で１時間反応させ、次いで、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動を施す。

ＲＮＡを、ゲルからシーンスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎＰｌｕｓ　：商品名）フィルター［デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）−ＮＥＮＩに、製造者の記載による方法に従い、毛細管を用いた吸収転移によって転移させる。

ドデシル硫酸ナトリウム１％、塩化ナトリウム１モル、硫酸デキストラン１０％、ｐＨ６，５の燐酸ナトリウム５０ミリモルの溶液中に３５℃で２時間保って、フィルターのハイブリッド形成前処理を行う。次いで、α−またはβ−グロビンのいずれかに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、フィルターのハイブリッド形成を行う。

プローブは、長さが２５残基で、反応させるべきＲＮＡのまさに５°−末端と対合する。ハイブリッド形成は、２００μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡ、および、分子の５°−末端に３２Ｐで放射性標識を施した毎分２　　Ｘ　１０’ カウントのプローブを含有するハイブリッド形成前処理用緩衝液５ｍｌ中で、３５℃に２４時間保って行われる。

ハイブリッド形成後は、下記の順序でフィルターを洗浄する。すなわち、２倍の濃度のｓｓｃ　（ｓｓｃとは、塩化ナトリウム０．１５モル、クエン酸ナトリウム０．０１５モル）を用い、室温で５分間に１回、１％のドデシル硫酸ナトリウムを加えた２倍の濃度のＳＳＣを用い、３５℃で３０分間に２回、０．１倍のＳＳＣを用い、室温で５分間に１回の順である。フィルターに吸収転移を施してから乾燥させ、コダック社製オートラジオグラフィー用ＸＡＲ−５番フィルムに感光させる。

オリゴヌクレオチドの不在下では、リボヌクレアーゼＨとの反応の際にα−またはβ−グロビンｍＲＮＡのいずれの開裂も起こらない。α−またはβ−グロビンに特異的なプローブは、それぞれ、ノーサンプロット法において完全な長さのｍＲＮＡに対応する単一の帯域とハイブリッド形成する。

ＣＯＤＭＢ−２５の存在下での反応は、β−グロビンｍＲＮＡの基本的には完全な開裂を生起させる。５゛−β−グロビンに特異的なプローブを用いて検出された開裂生成物の大きさは、ＲＮＡ　：　ＤＮＡ二重鎖の部位におけるｍＲＮＡの切断に関して予測されたもの、すなわち２８０±２０ヌクレオチド長と正確に一致する。これ以外の開裂生成物は認められなかった。更に、α−グロビンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いても、α−グロビンｍＲＮＡの開裂は証明されなかった。

したがって、リボヌクレアーゼＨには、ＣＨＡ法に基づく診断れたＲＮＡ配列は、試料中の相補的な標的ＤＮＡ配列と遭遇した場合に、かつその場合にのみ、この酵素によって開裂され、一方、標的配列とハイブリッドを形成しなかったプローブの遊離した１本鎖は、切断されないものと思われる。

犬凰ＵＣ）ＭＡ法を用いたシトメガロウイルスの検出シトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、大型の二重鎖ＤＮＡウィルスである。ＣＭＶに対する感染は、免疫抑制患者においては臨床的に重大であり、また、腎移植後の伝染性合併症として最も頻度が高く、重篤な疾患である。

次に、ＣＨＡ法を用いたＣＭＶの検出法を説明する。用いるプローブは、主要直接初期遺伝子に由来する２５ヌクレオチド長のＣＭＶ特異的配列、すなわち、５　’−ＴＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣである。中央部の６残基はＲＮＡであり、両翼の配列はＤＮＡで構成されている。プローブを配列の３゛−末端でラテックスビーズに結合させる。アルカリ性ホスファターゼを５゛−末端の位置に結合させる。患者から得た血液、尿、および略痰試料からＤＮＡを単離する。

これら試料のそれぞれにおけるＣＭＶの検査法を、第３図に示すＣＨＡ法を用いて実施する。大腸菌のりボヌクレアーゼＨ（１００μｍあたり５単位）を介して標識プローブの開裂を行わせる。ＣＨＡ反応は、温度を約４０℃として、４５分間にわたってこれを実行する。

リボヌクレアジン（１００μｍあたり５単位）を反応混合液に加えて、プローブの非特異的な開裂を抑制する。試料中にαＶが存在すれば、標的配列はプローブとハイブリッドを形成し、プローブは、リボヌクレアーゼＨによって開裂されるはずである。反応経路中の標的配列の反復的循環によって、標的配列のすべての複写が、標識されたプローブの多数の分子を捕捉し、かつその開裂を促進することが可能となる。

ＣＨＡ反応に引き続き、溶液中に遊離されたリポータ−指示基、すなわち、アルカリ性ホスファターゼの測定によって、プローブの開裂度を定量する。初めに、濾過あるいは遠心分離を用いて、試料からビーズを除去する。次いで、溶液中のプローブ断片上のアルカリ性ホスファターゼの標識を、比色定量分析または螢光発生試薬のいずれかによる検出方式を用いて測定する。

ｐＨ８，５で燐酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、これを、着色生成物であるｐ−ニトロフェノールに加水分解することによって、波長４０５ｎｍでの分光分析法を用いた酵素の検査を行うことができる。これに代えて、燐酸４−メチルウンベリフェリルを基質として、螢光測定法を用いて酵素を定量することもできる。

検査に用いる螢光の励起波長、および放出波長は、それぞれ、３６３ｎｍ、および４４７ｎｍである。最終的な着色指標、あるいは螢光指標は、最初の試料中に存在したＣＭＶＯ量の尺度とな−る。

以上を要約すると、ここに記載の実施例の結果は、特定の核酸配列の検出用手段としてのＣＨＡ法の有用性を立証するものである。このような検査方式においては、標的配列は、標識された相補的核酸プローブを開裂する触媒反応の補因子として働く。したがって、標的配列の各分子には、プローブの多数の複写を捕捉し、その開裂を促進する能力がある。

その結果、わずか１個のプローブ分子に標的配列が結合できるに過ぎない、化学量論的ハイブリッド形成反応を基本原理とする現行のすべての診断用試験法と比較すると、本方法の感度は、はるかに高い水準まで高められるのである。

記載された実施例にある通り、プローブの開裂は、標的配列とハイブリッドを形成した場合にのみ生起しなければならない。次いで、標的配列は、無傷の二重鎖から遊離され、反応経路中を反復的に再循環する。直接的検査法と競合的検査法の双方におけるＣＨＡ法の利用の様式も提供されている。総体的には、単一のＣＩＡ反応に基づく検出方式では、時間とともに指標の線形の増幅が行われる。適当な方法で、２種類またはそれ以上のＣＨＡ反応を連動させることによって、指標の指数関数的な増幅を行うことも可能であり、更に高い水準の感度を実現することができる。

したがって、本発明が前記の目的のすべてを達成していることは明らかであると言える。

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Claims

【特許請求の範囲】１．標識された相補的核酸プローブを開製し、かつこれを検出する触媒反応における補因子として核酸配列を利用する、核酸配列検出のための方法であって、標的配列を標識核酸プローブとハイブリッド形成させ、プローブ、すなわち標的配列二重鎖を形成させる段階と、該プローブ、すなわち標的配列二重鎖中の標識されたプローブを開裂させ、無傷の標的配列を遊離させる段階と、該標的配列を、反応経路中を反復的に再婚環させる段階と、標識されたプローブの開裂度を検知する段階とからなることを特徴とする核酸配列検出のための方法。２．ヒト、あるいは他の動物種における疾病または遺伝的特徴の診断に用いる請求項１記載の検出方法。３．工業的または農業的処理過程に用い際に、核酸配列を同定するのに用いる請求項１記載の検出方法。４．核酸配列プローブを、放射性、螢光性、電気化学的、発光性若しくは酵素性のマーカー又は他のリポーター指示基を用いて標識し、その検出を可能とさせる請求項１記載の検出方法。５．標識用の基を有する相対的低分子の開裂断片を、残存する無傷のプローブ分子から電気泳動を用いて分離することによって、プローブの開裂度を測定する請求項１記載の検出方法。６．強酸、例えばトリクロロ酢酸を用いて、標識を有する相対的低分子の開裂断片を溶液中に残存させつつ、相対的高分子の未開裂プローブ分子を、選択的に沈澱させることにより、プローブの開裂度を測定する請求項１記載の検出方法。７．高親和性標識およびリポーター指示基の双方を用いて、プローブを修飾し、かつ、対応する親和性の基を取り付けた固形支持体を用いて、標識を有する開裂断片を溶液中に残存させつつ、無傷のプローブ分子を吸着させる段階が含まれ、ハイブリッド形成および開裂反応に引き続いて試料に固形支持体材料を添加する段階と、プローブに固定された高親和性標識を、固形支持体上の対応する親和性の基と会合させる段階と、リポーター指示基を有するプローブの開裂断片が含まれる溶液から、固形支持体を分離する段階と、溶液中のリポーター指示基を検出する段階とを含む請求項１記載の検出方法。８．固形支持体を、ラテックス、ポリスチレン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのビーズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの膜で構成する請求項７記載の検出方法。９．固形支持体を磁化し、かつ、磁場の適用によって、その固形支持体を大量の溶液から分離する請求項７記載の検出方法。１０．親和性標識が、ハイブリッド形成、および開裂反応の際に開裂されない核酸配列であり、かつ、固形支持体に取り付けた対応する親和性の基が、相補的な核酸配列である請求項７記載の検出方法。１１．標識されたプローブを、ハイブリッド形成および開裂反応の際に固形支持体に取り付け、かつ、リポーター指示基を有する開裂断片を、溶液中に遊離させる請求項１記載の検出方法。１２．固形支持体が、ラテックス、ポリスチレン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのピーズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの膜で構成される請求項１１記載の検出方法。１３．固形支持体を磁化し、かつ、磁場の適用によって、その固形支持体を大量の溶液から隔離する請求項１１記載の検出方法。１４．ＤＮＡ配列の検出を目的とする方法であって、標識されたプローブの開裂を、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、あるいは他の触媒を用いて仲介する請求項１記載の検出方法。１５．１本鎖リボヌクレアーゼの阻害剤、例えばバナジン酸塩、リボヌクレアジン、あるいはインヒビットエース（Ｉｎｈｉｂｉｔ−ＡＣＥ）を用いることにより、標識されたプローブの非特異的な開裂を抑制する請求項１４記載の検出方法。１６．標識されたプローブを、大腸菌リボヌクレアーゼＨを用いて開製する請求項１４記載の検出方法。１７．標識されたプローブを、熱に対して安定な形態のリボヌクレアーゼＨを用いて開製する請求項１４記載の検出方法。１８．熱に対して安定なリボヌクレアーゼＨが、好熱性生物に由来し、あるいは熱に対して不安定なリボヌクレアーゼＨにおける部位指向性の突然変異誘発によって生起させたものである請求項１７記載の検出方法。１９．標識されたプローブを、約１５〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとする請求項１４記載の検出方法。２０．オリゴヌクレオチドの全体が、ＲＮＡで構成される請求項１９記載の検出方法。２１．オリゴヌクレオチドに、リボヌクレアーゼＨによって開裂不能な１あるいはそれ以上の散在する配列が含まれている請求項１９記載の検出方法。２２．プローブ内のリボヌクレアーゼＨによって開裂可能なＲＮＡ配列の長さを、約３〜約１５ヌクレオチド長の範囲で変える請求項１９記載の検出方法。２３．プローブとして、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡなる配列で構成されるオリゴヌクレオチドを用いる請求項１９記載の検出方法。２４．点突然変異、例えば鎌状赤血球疾患に出現するそれの検出を目的として、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ配列からなるプローブを用いる請求項２３記載の検出方法。２５．ＲＮＡ配列と、リボヌクレアーゼＨによって開裂不能な１あるいはそれ以上の追加的な配列とが含まれる１５〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。２６．ＲＮＡ配列の長さが、約３〜約１５ヌクレオチド長である請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。２７．放射性、螢光性、電気化学的、発光性、または酵素性のマーカーあるいは他のリポーター指示基を用いて、ヌクレオチド鎖の５′−または３′−末端、あるいはその近傍が標識されている請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。２８．ヌクレオチド鎖のリポーター指示基が取り付けられている部位と反対の末端、あるいはその近傍で、高親和性の基を用いて更に修飾されている請求項２７記載のオリゴヌクレオチド。２９．ヌクレオチド鎖のリポーター指示基が取り付けられている部位と反対の末端、あるいはその近傍で、固形支持体と共有結合を用いて結合されている請求項２７記載のオリゴヌクレオチド。３０．固形支持体が、ラテックス、ポリスチレン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのビーズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの膜で構成される請求項２９記載のオリゴヌクレオチド。３１．固形支持体が、磁化されている請求項２９記載のオリゴヌクレオチド。３２．ＲＮＡ配列が、長さ約４〜約８のヌクレオチド長であり、かつ標的ＤＮＡ配列に対して１個所あるいはそれ以上の誤対合を含んでいる請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。３３．追加的な配列が、その燐酸基または糖の部分がリボヌクレアーゼＨによる開裂を防ぐように修飾されたＲＮＡで構成されている請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。３４．燐酸基が、アルキルまたはアリール燐酸トリエステル、ホスホン酸水素塩、ホスホン酸アルキルまたはアリール、ホスホラミド酸アルキルまたはアリール、燐チオ酸塩、あるいは、燐セレン酸塩のいずれかとして修飾されている請求項３３記載のオリゴヌクレオチド。３５．リボース環の２′−ヒドロシキル基を、アルキルまたは芳香族エーテルに転化することにより、糖の部分が修飾されている請求項３３記載のオリゴヌクレオチド。３６．追加的な配列が、ＤＮＡで構成されている請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。３７．標識されたプローブが、約５０ないし数千のヌクレオチド長のポリヌクレオチドである請求項１４記載の検出方法。３８．ポリヌクレオチドの全体が、ＲＮＡで構成されている請求項３７記載の検出方法。３９．ポリヌクレオチドに、リボヌクレアーゼＨによって開裂不能な１あるいはそれ以上の散在する配列が含まれている請求項３７記載の検出方法。４０．リボヌクレアーゼＨにより、開裂可能なプローブ内のＲＮＡ配列の長さが、３ヌクレオチド長あるいはそれ以上である請求項３７記載の検出方法。４１．ＲＮＡに加えて、リボヌクレアーゼＨにより開裂不能な１回以上の散在する配列で構成される約５０ないし数千ヌクレオチド長のポリヌクレオチド。４２．ＲＮＡ配列の区間が、３ヌクレオチド長あるいはそれ以上の長さである請求項４１記載のポリヌクレオチド。４３リボヌクレアーゼＨにより開裂不能な１あるいはそれ以上の散在する配列が、放射性、螢光性、電気化学的、発光性、または酵素性のマーカー、あるいは他のリポーター指示基を用いて標識されている請求項４２記載のポリヌクレオチド。４４．ヌクレオチド鎖の５′−または３′−末端、あるいはその近傍で、高親和性の基を用いて更に修飾されている請求項４３記載のポリヌクレオチド。４５．ヌクレオチド鎖の５′−または３′−末端、あるいはその近傍で、固形支持体と共有結合により結合している請求項４３記載のポリヌクレオチド。４６．固形支持体が、ラテックス、ポリスチレン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのピーズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの膜で構成されている請求項４５記載のポリヌクレオチド。４７．形支持体が、磁化されている請求項４５記載のポリヌクレオチド。４８．散在する配列が、燐酸基または糖の部分のいずれかにおいて、リボヌクレアーゼＨによる開裂を防ぐように修飾されたＲＮＡで構成されている請求項４１記載のポリヌクレオチド。４９．燐酸基が、アルキルまたはアリール燐酸トリエステル、ホスホン酸水素塩、ホスホン酸アルキルまたはアリール、ホスホラミド酸アルキルまたはアリール、燐チオ酸塩、あるいは燐セレン酸塩のいずれかとして修飾されている請求項４８記載のポリヌクレオチド。５０．リボース環の２′−ヒドロシキル基を、アルキルまたは芳香族エーテルに転化することにより、糖の部分が修飾されている請求項４８記載のポリヌクレオチド。５１．散在する配列が、ＤＮＡで構成されている請求項４１記載のポリヌクレオチド。５２．逆転写酵素を用いて標的配列に相補的なＤＮＡによる複写を合成するための鋳型として初めに試料ＲＮＡを用いるＲＮＡ配列検出のための方法であって、ＤＭプライマーを試料ＲＮＡの標的配列に対して５′の側とハイブリッド形成させる段階と、逆転写酵素を用いて標的配列を越えるようにプライマーを伸長させて、標的配列に相補的なＤＮＡによる複写を生成させる段階と、触媒的ハイブリッド形成増幅法を用いて、この相補的ＤＮＡ複写を検出する段階とからなる請求項１記載の検出方法。５３．ハイブリッド形成および開裂の方法が、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素あるいは他の触媒による標識されたプローブの開裂に基づいている請求項５２記載の検出方法。５４．デオキシヌクレオチド−α−チオ三燐酸を反応の基質に用いた結果、合成されるＤＮＡ鎖の燐酸基が自然界で生じる燐酸ジエステルではなく燐チオ酸エステルになるようにして、逆転写酵素を用いて標的配列の相補的ＤＮＡ複写の燐チオ酸誘導体を合成する請求項５２記載の検出方法。５５．ハイブリッド形成および開裂の方法が、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、あるいは他の触媒による標識されたプローブの開裂に基づいている請求項５４記載の検出方法。５６．ハイブリッド形成および開裂の方法が、制限酵素により標識されたＤＮＡプローブの開裂に基づいていて、合成された燐チオ酸誘導体を、標識された相補的ＤＮＡプローブとハイブリッド形成させる段階と、制限酵素を用いてプローブ：燐チオ酸ＤＮＡ二重鎖中の標識されたプローブを酵素の認識部位で開裂し、無傷な燐チオ酸ＤＭ鎖を遊離させる段階と、燐チオ酸ＤＮＡ鎖を、反応経路内を反復的に再循環させる段階と、反応後のプローブの開裂度を検知する段階とからなる請求項５４記載の検出方法。５７．試料ＤＮＡを鋳型として利用してＤＮＡ重合酵素を用いて初めに標的配列の複写を合成するＤＮＡ配列検出のための方法であって、ＤＮＡ試料を変性させる段階と、ＤＮＡプライマーを試料ＤＮＡの標的配列に対して５′の側とハイブリッド形成させる段階と、逆転写酵素を用いて標的配列を越えるようにプライマーを伸長させて相補的ＤＮＡ鎖の複写を生成させる段階と、触媒的ハイブリッド形成増幅法を用いて、ＤＮＡ複写を検出する段階とからなる請求項１記載の検出方法。５８．触媒的ハイブリッド形成増幅法が、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素あるいは他の触媒により標識されたプローブの開裂に基づいている請求項５７記載の検出方法。５９．デオキシヌクレオチド−α−チオ三燐酸を反応の基質に用いた結果、合成されるＤＮＡ鎖の燐酸基が自然界で生じる燐酸ジエステルではなく燐チオ酸エステルになるようにして、逆転写酵素を用いて標的配列の複写の燐チオ酸誘導体を合成する請求項５７記載の検出方法。６０．ハイブリッド形成および開裂の方法が、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、あるいは他の触媒により標識されたプローブの開裂に基づいている請求項５９記載の検出方法。６１．ハイブリッド形成および開裂の方法が、制限酵素による標識されたＤＮＡプローブの開裂に基づいていて、合成された燐チオ酸誘導体を、標識された相補的ＤＮＡプローブとハイブリッド形成させる段階と、制限酵素を用いてプローブ：燐チオ酸ＤＮＡ二重鎖中の標識されたプローブを酵素の認識部位で開裂する段階と、無傷な燐チオ酸ＤＮＡ鎖を遊離させる段階と、燐チオ酸ＤＮＡ鎖を、反応経路内を反復的に再循環させる段階と、反応後のプローブの開裂度を検知する段階とからなる請求項５９記載の検出方法。６２．２種類あるいはそれ以上のハイブリッド形成と開裂反応とを連動させて、指標の指数関数的増幅を達成する請求項１記載の検出方法。６３．ハイブリッド形成および開裂反応のうち、１種類あるいはそれ以上が、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素あるいは他の触媒により標識されたプローブの開裂に基づいている請求項６２記載の検出方法。６４．ハイブリッド形成および開裂反応のうち、１種類あるいはそれ以上が、基質としての燐チオ酸誘導体の使用に基づき、かつ相補的ＤＮＡ配列が、制限酵素によってその認識部位で開裂される請求項６２記載の検出方法。６５．試料ＲＮＡを、標的配列に相補的なＤＮＡ分子とハイブリッド形成させる段階と、そのＤＮＡ分子に相補的な標識されたＲＮＡプローブ、およびリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、あるいは他の触媒を検査用試料に添加する段階と、検査用試料を温置して、ハイブリッド形成および開裂反応を進行させる段階と、ＲＮＡプローブの開裂度を測定する段階とからなることを特徴とする、競合的検査法を用いてＲＮＡ配列を検出するための方法。６６．標識されたプローブが、リボヌクレアーゼＨにより開裂不能な１あるいはそれ以上の散在する配列を含有する請求項６５記載の検出方法。６７．ＤＮＡ分子が、標的ＲＮＡ配列および標識されたプローブの双方に相補的な第１部分、および標的配列のみに相補的な第２部分を含有する請求項６５記載の検出方法。６８．ＤＮＡ分子が、燐酸基が修飾されていない少なくとも４ヌクレオチド長の配列を含有し、かつ残余の燐酸基が、リボヌクレアーゼＨによる相補的標的配列およびプローブＲＮＡ配列の開裂を防ぐように修飾されている請求項６７記載の検出方法。６９．燐酸基が、アルキルまたはアリール燐酸トリエステル、ホスホン酸アルキルまたはアリール、あるいはホスホラミド酸アルキルまたはアリールとして修飾されている請求項６８記載の検出方法。７０．ＤＮＡ分子が、標識されたプローブに相補的であるが、標的ＲＮＡ配列と１あるいはそれ以上の誤対合を有しつつ二重鎖を形成し、その結果、リーボヌクレァーゼＨによる標的ＲＮＡ配列の開裂が阻害される請求項６５記載の検出方法。