JPH02100699A - 生体試料の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体試料の測定法に関し、さらに詳しくは、
生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質の含有
率の測定法に係わる。

〔従来の技術〕

生化学的検査や病理学的研究において血清や尿などの生
体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれぞ
れの含有率の測定を行う際に、脱水素酵素の作用により
生成された還元型ニコチンを測定することによる生体試
料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれぞれの
含有率の測定用されている。すなわち、 （１）ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの持つ紫外部吸収（３４０ｎｍ
）を測定する方法。

および 作用させ、ニトロブルーテトラゾリウムなどのテトラゾ
リウム類からホルマザンを生成させ、ホルマザンの吸収
帯である５７０ｎｍ付近の吸光度の増加を測定する方法
。

などがあるがこれらにはそれぞれ大きな問題がある。

前記（１）の方法では、試料中の紫外部吸収を持つ他の
成分により３４０　ｎｍにおける吸光度の盲検値が高く
なり測定誤差が増加し、また測定が不可能となる場合が
あり、かつ、試料自身の濁度により大きく影響を受ける
。また、前記（２）の方法では、生成されたホルマザン
の水に対する溶解度が低く沈澱が析出し、セル部分やチ
ューブなど測定機器に染着して測定の妨げとなる。

さらに前記（１）、（２）の方法のほかに、ＮＡＤ　（
Ｐ）Ｈに電子伝達体を作用させて、生成された過酸化水
素を測定する方法が近年知られているが、電子伝達体と
して一般に利用されるＰＭＳは、光およびアルカリ性溶
液中において極めて不安定である。なお、一般に、脱水
素酵素の脱水素反応においては、その至適ｐＨがアルカ
リ性側に偏っている場合が多く、これが測定操作上の制
限測定する方法も実用化されていない。

〔発明が解決しようとする問題点−与再〕本発明は、前
記の従来の方法のもつ問題点を解決するものであり、試
料中の紫外部吸収を持つ他の成分により影響を受けず、
また測定器具を汚染することなく、アルカリ性において
は勿論のこと酸性または中性においてさえも脱水素酵素
および脱水素酵素の基質のそれぞれの含有率を短時間で
本発明者らは、生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵
素の基質のそれぞれの含有率を再現性よく、しかも高感
度に測定できる方法を種々検討したところ、脱水素酵素
により生成されたＮＡＤ　（を作用させることにより過
酸化水素が生じ、その生成量はＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの竜に
比例し、かつ、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈが微意でも測定できる
ことを見出した。この知見に基づいて本発明に到達した
。

すなわち、本発明は、生体試料中の脱水素酵素および脱
水素酵素の基質のそれぞれの含有率の測定に際して、脱
水素反応により生成された還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリん酸に１−（３−カルボキシプロピロ
キシ）−５−エチルフェナジン類を作用させて生成する
過酸化水素の量を測定することにより、生体試料中の脱
水素酵素および脱水素酵素の基質のそれぞれの含有率を
知ることを特徴とする生体試料の測定法である。

本発明において使用される生体試料としては、動物、植
物あるいは微生物などに由来する試料などがあり、代表
例として、血清および尿など、並びに各生物体の抽出物
、微生物及び細胞の培養液などがある。

本発明に用いられる脱水素酵素はＮＡＤ　（Ｐ）Ｈな生
成させる反応を触媒する酵素であれば良い。

代表例として第１表に示す脱水素酵素およびその基質が
挙げられる。

第１表 測定の対象と 望五土亙基質 アルコール 胆汁酸 グリセリン グリセリン−３− りん酸 グルコース グルコース−６− りん酸 アルデヒド ホルムアルデヒド 素 アルコール脱水素酵素 胆汁酸脱水素酵素 グリセリン脱水素酵素 グリセリン−３−りん酸脱 水素酵素 グルコース脱水素酵素 グルコース−６−りん酸脱 水素酵素 アルデヒド脱水素酵素 ホルムアルデヒド脱水素酵 素 乳酸脱水素酵素 リンゴ酸脱水素酵素 イソクエン酸脱水素酵素 乳酸 リンゴ酸 イソクエン酸 ギ酸 α−ヒドロキシ 酪酸 テトラヒドロ葉酸 その他 各種コレステロール 各種アルコール 各種糖 各種アミノ酸 ギ酸脱水素酵素 α−ヒドロキシ酪酸脱水素 酵素 テトラヒドロ葉酸脱水素酵 素 各種コレステロールの脱水 素酵素 各種アルコールの脱水黍酵 素 各種糖の脱水素酵素 各種アミノ酸の脱水素酵素 ことができる。

本発明において利用されるＣＰＥＰとは、−形式 ％式％） チルフェナジンまたは１−（３−カルボキシプロピロキ
シ）−５−エチルツェナジニウム塩を指す。

１−（３−カルボキシプロピロキシ）−５−エチルツェ
ナジニウム塩とは、たとえば、１−（３−カルボキシプ
ロピロキシ）−５−エチルフエナジニウムアルキルサル
フエイトあるいは１−（３−カルボキシプロピロキシ）
−５−エチルツェナジニウムクロリドなどである。

ＣＰＥＰは、１−ヒドロキシフェナジンより１−（３−
エトキシカルボニルプロピロキシ）フェナジンを合成し
、さらにジエチル硫酸により５位をエチル化した後、酸
加水分解することにより得ることができる。−”　　　
’　　”’　　−ＣＰＥＰは赤紫色の粉体であり、通常
の使用濃度における水溶液は、中性付近では、淡いピン
ク色から淡い赤紫色である。ｐＨ７の水溶液中ては２７
８ｎｍ、３８６ｎｍ、５１０ｎｍに吸収の極大値があり
、２７３ｎｍにおける分子吸光係数は４７ｍＭ−１ｃｍ
−’である。

またＣＰＥＰは光およびアルカリ性溶液中において安定
となった電子伝達体である。ＣＰＥＰは、その安定性が
比較的大きく、たとえば０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４，０）中において室温で１月間散乱光を照射し
ても電子伝達の活性およびスペクトルは全く変化しない
。また、ＣＰＥＰを２２μ門の濃度で、ｐＨ４から９ま
での緩衝溶液中、３０℃、３日間保存しても全く失活せ
ず、また、ｐＨ１０でも９２％の残存活性があり、ｐＨ
４から１０の範囲で使用できる。

本発明のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの定量法は、通常、脱水素酵
素により生じたＮＡＤ　（Ｐ）ＨとＣＰＥＰとを反応さ
せて過酸化水素を生成させる段階と、生成した過酸化水
素を既知法にて測定する段階との２つに分けて行われる
。

ＣＰＥＰとＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとの反応はカップリング反
応てあり、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈは酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ”と略す）または酸
化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリん酸（以
下ＮＡＤＰ”　と略す）に再変換されるので、添加する
ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ”は少量ですむ。ＣＰＥＰとＮ
ＡＤ　（Ｐ）Ｈとの反応は、通常、りん酸緩衝液、トリ
ス塩酸緩脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれぞれ
の含有率を測定する際に、脱水素反応の至適ｐＨである
アルカリ性においても効率よ＜ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを生成
させることができる。反応液中におけるＣＰＥＰの濃度
範囲は、特に制限されず、試料の種類、反応条件や測定
時間によって適宜設定される。通常は０．０１〜１０ｍ
Ｍの濃度範囲が好ましい。ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ，ＮＡＤ”
またはＮＡＤＰ”の濃度範囲も特に制限されず、通常は
０．０１〜１０ｍＭの濃度範囲で使用される。反応温度
も特に制限はないが、通常は２０−４０℃の範囲で行わ
れ、この範囲にある限りにおいて加熱、冷却する必要は
ないが、加熱、冷却することを妨げない。

ＣＰＥＰには１位のカルボキシプロビロキシ基にカルボ
キシル基が存在するので、カルボジイミド類などの架橋
試薬を用いて、酵素、補酵素あるいは樹脂担体などと、
直接またはポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと略す
）頚などのスペーサーを介して結合させることが可能で
ある。ＣＰＥＰを前記のような他の物質と結合させるこ
とにより様々な利点が生まれてくる。たとえば、ＣＰＥ
Ｐを樹脂担体などと結合させてカラムなどに充填すると
、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈな過酸化水素に変換する反応器とな
る。また、酵素あるいは補酵素と結合させれば反応は分
子内で行われることになるので、反応の相手の濃度雰囲
気が高まり反応が迅速に進行するだけでなく、酵素、補
酵素あるいはＣＰＥＰを大過剰に使用する必要がなくな
る。さらに脱水素酵素にＣＰＥＰとＮＡＤ＋またはＮＡ
ＤＰ”を結合させると、分子内において酸素が消費され
過酸化水素が生成されるので、脱水素酵素を酸化酵素に
人工的に作り替えることができる。またＣＰＥＰを他の
物質と結合させ高分子化すると反応系中に閉じ込めた形
の反応器を作製することができ、回収および再利用が可
能となる。

ＣＰＥＰとＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとの反応において生成され
た過酸化水素の定量法は、特に制限はない。

実用上、代表的な方法としては電極法、発色法、発光法
などがある。電極法としては、過酸化水素電極を用いる
方法がある。発色法としては、ペルオキシダーゼを作用
させて、フェノールなどのフェノール類やＯ−フェニレ
ンジアミンなどの芳香族アミン類による発色を測定する
方法、あるいはペルオキシダーゼを作用させて、４−ア
ミノアンチピリン（以下４−ＡＡと略す）とアニリン類
の酸化縮合による発色を測定する方法、あるいはカタラ
ーゼを作用させる方法がよく用いられる。発光法として
は、ルミノールと錯体類とを作用させて、発生する化学
発光を検出する方法があり、高感度測定が可能である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。

実施例　Ｉ ＮＡＤ　（Ｐ）ＨとＣＰＥＰとの反応により生成された
過酸化水素を測定することによりＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの定
量を行った。

第１液 ０．５ｍＭ　ＣＰ　Ｅ　Ｐ　　　　　　　　　　　　０
．１３ｍＱ２０ｍＭ　　グリシン−ＮａＯＨ緩マ行ン夜
（ｐＨ９，０）　０．８７ｙｎＱ蒸留純水　　　　　　
　　　　　　　」副健［２，００蝦 第２を夜 １０ｍＭ　　４−　Ａ　Ａ　　　　　　　　　　　Ｏ，
２致１０ｍＭ　　Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ
−３−スルホプロピル）−ｍ−）ルイジン（以下Ｔ。

Ｏ８と略す）０．２致 １００ｔＪ／叡ペルオキシダーゼ　　　　　０．２媛Ｉ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ緩衝Ｍ　　（ｐｔ１７．５）　
　　　−魅Ａ威−１，０致 反応は３７℃の恒温装置中で行った。第１液を３７℃に
て予備加熱した。２０ｍＭグリシン・Ｎａ０１１緩衝液
（ｐＨ９，０）に溶解したＮＡＤ　、（Ｐ）Ｈ（０〜２
ｍＭ）を０．０５ｍＱ添加し５分間反応させた。これに
第２液を添加し、添加１分後の５５０ｎｍにおける吸光
度を測定した。

その結果を第１図に示す。

第１図は添加されたＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの濃度と吸光度と
の関係が直線関係でありＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを精度よく定
量できることを示している。この方法によりＮＡＤ　（
Ｐ）Ｈの濃度は１０ｍＭまで定量が可能である。

実施例　２ 補酵素−酵素−ＣＰＥＰ三者結合体における過酸化水素
の生成反応を調べた。

アミノ化ＰＥＧとＣＰＥＰを結合させたＰＥＧ−ＣＰＥ
Ｐおよびアミノ化ＰＥＧとＮＡＤ＋を結合させたＰＥＧ
−ＮＡＤ”″を調製した。

ＰＥＧ−ＣＰＥＰおよびＰＥＧ−ＮＡＤ”の末端アミノ
基を３．３’　−（１，６−シオキソー１．６−ヘキサ
ンジイル）−ビス−２−チアゾリジンチオンにて活性化
し、乳酸デヒドロゲナーゼ（以下ＬＤＨと略す）と反応
させ、ＮＡＤ”　−ＬＤＨ−ＣＰＥＰ三者結合体を得た
。

この三者結合体と、以下に示す発色液とを混合し、反応
させた。

発色液 １ｍＭ　３−メチル−２−ペンゾチアゾリノンヒドラゴ
○ シン塩酸塩（以下ＭＢＴＨと略す）０．３叙ｂ ３００ｍＭ　Ｌ−乳酸　　　　　　　　　　　０．５ｍ
Ｑ１０ｍＭ　　エチレンジアミン四酢酸　　　０．３致
ＩＵ／致ペルオキシダーゼ　　　　　　０．４較２５０
ｒｎＭりん酸ナトリウム緩衝ｔ＆　（ｐＨ７，５）」ぶ
価［ ３，０致 生成された過酸化水素によるＭＢＴＨとプリマキンの酸
化縮合物の発色を、５１０ｎｍの吸光度で測定した。

酸素濃度と色素の生成速度を第２表に示す。

第２表 この結果より、乳酸脱水素酵素は、ＮＡＤ”ＬＤＨ−Ｃ
ＰＥＰ三者結合体にすることにより、乳酸酸化酵素に人
工的に作り替えられたことが解る。

実施例　３ ＬＤＨの脱水素反応により生成され一’Ｓ　Ｎ　Ａ　Ｄ
　ＨをＣＰＥＰと反応させ、生じた過酸化水素を測定す
ることにより血清ＬＤＨの定量を行った。

第１液 ７０％Ｄし一乳酸ナトリウム　　　１３．３ｍｇ４．４
ｍＭ　ＮＡＤ”　　　　　　　　　０．４ｍＱ２ｍＭ　
ＣＰＥＰ　　　　　　　　　　０．２致０．１Ｍ　　り
ん酸カリウム緩衝を夜　（ｐＨ７，０）１．４致 ２．０致 第２液 １０ｍＭ　　４−ＡＡ　　　　　　　　　　　　０．１
致１０ｍＭ　　ＴＯＯ５０，１ｍＱ １００Ｕ／致ペルオキシダーゼ　　　０．１致０．１Ｍ
　　りん酸カリウム緩衝液　（ｐＨ７，０）０．７較 １．０較 反応は３７°Ｃの恒温装置中で行った。第１液を応させ
た。これに第２液を添加し、添加後直ちに５５０ｎｍに
おける吸光度を測定した。

その結果を第２図に示す。

第２図は添加した血清ＬＤＨの濃度を５５０　ｎｍにお
ける吸光度により定量てきることを示している。

実施例　４ ＬＤＨの脱水素反応の基質である乳酸の定型性について
調べた。

第１ン夜 ５０１Ｊ／＋ｙ＋Ｑ　　　ＬＤＨ０，１ｙｎＱ２ｍＭ　
　ＮＡＤ”　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
２ｍＱ０．５ｍＭ　　ＣＰ　Ｅ　Ｐ　　　　　　　　　
　　　　　　Ｏ，ＩＴＩＬＱ蒸留純水　　　　　　　　
　　　０．６ｍ！Ｑ２０ｍＭ　　グリシン・Ｎａ０ｆｌ
緩？Ｉ？夜　（ｐＨ９，０）１　、０ｒｒｌ−Ｑ− ２、ＯａＱ 第２液 １０ｍＭ　　４−ＡＡ ０．２鮫 １０ｍＭ　　Ｔ　ＯＯＳ　　　　　　　　　　　　０．
２ｍＱ１００１Ｊ／政ペルオキシダーゼ　　　０．２較
ＩＭ　Ｔｒｉｓ・ＩｔＣＩ　Ｆ５ｊ？”３液（ｐＨ７，
５）　　」ノ頃［１，０致 反応は３７℃の恒温装置中で行った。第」液を３７℃に
て予備加熱した。０し一乳酸すチウム水溶？ａ　（０〜
５０ｍＭ）を０．０５ｍＱ添加し５分間反応させた。こ
れに第２液を添加し、添加１分後の５５０ｎｍにおける
吸光度を測定した。

その結果を第３図に示す。

第３図は添加したＤし一乳酸リチウムの濃度を５５０ｎ
ｍにおける吸光度により定量できることを示している。

この方法によりＤし一乳酸リチウムの濃度は５０ｍＭま
で定量が可能である。

〔発明の効果〕

このように、本発明方法によれば、生体試料中の脱水素
酵素含有率または、脱水素酵素の基質の含有率を従来よ
りも高感度に、かつ、再現性よく知ることが測定できる
ので、各種の臨床検査に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は添加したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度と吸光度との関
係を示している。第２図は添加したＬＤＨの活性と吸光
度との関係を示している。第３図は添加したＤし一乳酸
リチウムの濃度と吸光度との関係を示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれ
   ぞれの含有率の測定に際して、脱水素反応により生成さ
   れた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまた
   は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリん酸
   に１−（３−カルボキシプロピロキシ）−５−エチルフ
   ェナジン類を作用させて生成する過酸化水素の量を測定
   することにより、生体試料中の脱水素酵素および脱水素
   酵素の基質のそれぞれの含有率を知ることを特徴とする
   生体試料の測定法。