JPH01137994A

JPH01137994A - ｒｅｇ蛋白質

Info

Publication number: JPH01137994A
Application number: JP63195727A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Okamoto; 宏岡本; Yoshiko Itou; 誉子伊藤; Hiroshi Teraoka; 寺岡　宏; Hiroshige Tsuzuki; 続木　博茂; Nobuo Yoshida; 信男吉田
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1987-08-10
Filing date: 1988-08-04
Publication date: 1989-05-30
Also published as: HUT47640A; EP0303233A2; NZ225738A; DK444288A; KR890003801A; AU2066188A; KR940000199B1; EP0303233A3; AU604147B2; CA1339758C; DK174067B1; DK444288D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はｒｅｇ蛋白質およびその製造法に関する。さら
に詳細には、第１図に示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ
末端から１番目のＡ、ｌａ、２１番目のＧｌｙ、２２番
目のＧｌｎ、２３番目のＧＩＵ、２４番目のＡｌａ、２
５番目のＧｉｎ、３０番目のＧｌｎ、３１番目のＡｌａ
、または３３番目のＩｌｅから始まり１６５番目のＡｓ
ｎで終わるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のＮ末
端にさらにＭｅ　ｔを有するアミノ酸配列を有するヒト
ｒｅ（蛋白質に関し、妨らに該ヒトｒｅｄ蛋白質をコー
ドする遺伝子を有する発現ベクターを導入した宿主、好
ましくは酵母、を培養し、該培養物からヒトｒｅｇ蛋白
質を採取することを特徴とするヒトｒｅｇ蛋白質の製造
法に関する。

従来の技術従来、インスリンを産生する膵うンゲルハンス島Ｂｍ胞
は極めて再性能に乏しく、これが、−旦Ｂ細胞が傷害さ
れ壊死に陥ことインスリン不足から糖尿病が発症するこ
との主要因と考えられてきた。１９８４年、岡本らは９
０％膵切除ラットにニコチン酸アミドなどのポリＡＤＰ
−リボース合成酵素阻害物質を連日投与することにより
膵うンゲルハンス島Ｂ細胞の再生を誘導することに初め
て成功した（　Ｙｏｎｅｍｕｒａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ３３、４０１　（１９８４））
。また、最近ニコチン酸アミドの大量経口投与によりヒ
トインスリン依存性糖尿病の寛解期が延長されることも
報告されてきている（　Ｐｈ、　Ｖａｇｕｅ、　ｅｔ　
ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　Ｖｏｌ、　ＩＮｏ、　８５３３
．６１９−６２０．１９８７）。

本発明で用いるデイファレンシ〜ルハイブリダイゼイシ
ョンに必要な技術はＴａｋａｓａｕらによって既に確立
されている（　Ｉａｋａｓａｗａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３５．１１７８．１９８６）。

即ち、ラット膵Ｂ細胞腫から作成したｃＤＮＡライブラ
リーを、膵Ｂ細胞腫ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡと正常群ランゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ）”
ＲＮＡから調製したｃＤＮＡをプローブとしたディファ
レンシ〜ルハイプリダイゼイションによりスクリーニン
グし、％Ｂ細胞腫で特異的に発現する遺伝子の単離に成
功している。

本発明者は先にディファレンシ〜ルハイブリダイゼイシ
ョン法を用いてラット再生膵うンゲルハンス島Ｂ細胞で
特異的に発現される遺伝子を見出し、さらに該遺伝子を
プローブとして用いて、ヒト膵臓由来ｃＤＮＡライブラ
リーから該遺伝子と相同性を有する遺伝子を見出し、こ
れらをｒｅｇ遺伝子（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　　ｚ
ｅｎｅ）と命名した（　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　２６３．２１１１−２１１４゜１９８８　）。

発明が解決しようとする問題点従来、糖尿病の治療法としては、インスリン投与という
対症的療法しかく、−時有効性が期待されたスルホニル
ウレアなどの経口糖尿病薬は長期投与によりかえって膵
Ｂ細胞のインスリン産生能を障害し、冠動脈硬化症を誘
発するなどの副作用があった。

上記の通りニコチン酸アミドなどのポリＡＤＰ−リポー
ス合成酵素阻害物質を連日投与することによりラット膵
うンゲルハンス島Ｂ細胞が再生することが知られており
、本発明者により、ラット再生膵うンゲルハンス島Ｂ細
胞に特異的に発現され該再生に深く関与すると思われる
ラットｒｅｇ遺伝子が見出されていたが、ヒトにおける
そのような遺伝子の存在は全く知られていなかった。

問題点を解決するための手段先に本発明者は、膵うンゲルハンス島Ｂ細胞の再生増殖
機構を遺伝子レベルで解明するため、ラット再生膵うン
ゲルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現される遺伝子を探索
し、ラツｌ−ｒｅｇ遺伝子を見出した。さらに本発明者
は該ラットｒｅｇ遺伝子をプローブとしてヒトにおける
ｒｅｇ遺伝子を探索し、ヒト膵ｃＤＮＡライブラリーか
らヒトｒｅｇ遺伝子を見出した。

本発明者らは、さらに、該ヒトｒｅｇ遺伝子を微生物宿
主中で発現許せ、ヒトｒｅｇ蛋白質を得るへく鋭意研究
を行なった結果、酸Ｎ中にて該ヒトｒｅｇ遺伝子を発現
許せることに成功し、得られたヒトｒｅｇ蛋白質を精製
しアミノ酸組成・配列を検討したところ、ＤＮＡ配列か
ら推定きれるものと一致し、発明を完成するに至った。

プローブとして用いるラットｒｅｇ遺伝子は以下の様に
調製される。

■、ラット再生膵ランゲルハンス島の分離（１）９０％
膵切除体重２００−３００ｇのＷ　ｉ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ系雄ラ
ットをエーテル麻酔下に開腹後、帝胆管分節（ｐａｒａ
ｂｉｌｉａｒｙ　ｓｅｇｍｅｎｔ）を除く膵（群全体の
９０％に相当）を切除して開腹した。この９０％膵切除
術は、Ｆｏｇｌｉａ、　Ｖ、　Ｇ、　（Ｒｅｖ、　Ｓｏ
ｃ、　Ａｒｇｅｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　２０、２１−３７
．１９４４）により確立され、インスリン依存性糖尿病
モデルの作製に広く用いられている。

９０％膵切除をうけたラットは１ケ月以内に糖尿病状態
に陥る。

（２）　　ニコチン酸アミドの投与９０％膵切除７日前より術後３ケ月まで、０゜５ｇ／ｋ
ｇ体重のニコチン酸アミド（５０ｍｇ／ｍ！生理食塩水
）を−日一回腹腔内に投与した。

このニコチン酸アミド投与により９０％膵切除ランドの
糖尿病状態が予防改善される。

０）　再生ランゲルハンス島の分離上記（１）、（りにより、残存群中でランゲルハンス島
の再生が誘導され、群単位体積あたりの数、ランゲルハ
ンス島１個あたりのサイズとも増加する。増加した細胞
の大部分はインスリン産生Ｂ細胞であり、グルカゴン産
生Ａ細胞およびソマトスタチン産生り細胞の数は不変で
ある（　Ｙｏｎｅｍｕｒａ＋Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｉ
ａｂｅｔｅｓ　３３．４０１　（１９１１１４））。術
後３ケ月目に、９０％膵切除・ニコチン酸アミド投与ラ
ットを、ネンプタール麻酔下に開腹し、残存群をハンク
ス液で膨化させた後摘出した。摘出群を、２残存膵当り
５ｍｌのハンクス液中で細切後、１５０ｍｇの牛血清ア
ルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｉｙｐｅ　Ｖ　）および４０　
ｍ　ｇのコラゲナーゼ（Ｔｙｐｅ■、和光紬薬製）を加
え、３７°Ｃで３〜５分間振とうして消化した。消化後
５０　ｍ　ｌのハンクス液中で懸濁し、５分間静置させ
てランゲルハンス島を沈降させた後、上層の半量を捨て
、新たに２５ｍ１のハンクス液を加え再懸濁した。この
懸濁・静置操作を８回繰り返した後、実体顕微鏡下で再
生ランゲルハンス島を採取した。３２匹の９０％膵切除
・ニコチン酸アミド投与ラットから１３５５個の再生ラ
ンゲルハンス島が回収された。上記の方法は、基本的に
Ｏｋａｍｏｔｏの方法（Ｈ。

Ｏｋａｍｏｔｏ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ
１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７、４３−
６１．１９８１）に従う。

■、ラット再生膵ラうゲルハンス島ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｒｙ　ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）ライブラリーの作製（
１）　　ＲＮＡの分離分離再生ランゲルハンス島を４Ｍチオシアン酸グアニジ
ン、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７０）、０．５
％ラウリルサルロジンナトリウム、０．１Ｍ２−メツし
カプトエタノール、１％Ａｎｔｉｆｏａｍ　Ａ　（Ｓｉ
ｇｍａ）中で超音波によりホモシネ、−ト後、密度１．
６４のセシウムトリフルオロ酢酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
　）上に重層し、２５℃、４４．００Ｏｒｐｍで１４〜
１６時間遠心した。遠心後、ＲＮＡ沈殿を回収した。１
３５５個の再生ランゲルハンス島から８８５μｇのＲＮ
Ａが得られた（Ｃｈａｒｇｗｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、ら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９；　１８：５２９４
−９９参照）。

（２）　　Ｐｏ１ｙ（Ａ）”ＲＮＡの分離（１）で得ら
れたＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマ
トグラフィーにより１７．２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）”Ｒ
ＮＡを分離した（　Ｈ，Ａｖｉｖ　＆　Ｐ、　Ｌｅｄｅ
ｒ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　６９
．１４０８−１４１２．１９７２参照）。

（３）　　ｃＤＮＡライブラリーの作製２μｇの再生ラ
ンゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ＞”ＲＮＡを鋳型とし、オ
リゴ（ｄＴ）をブライマーとして、４０単位の逆転写酵
素と４２℃、１時間反応させて１８２ｎｇのｃＤＮＡ　
（ｆｉｒｓｔ　５ｔｒａｎｄ）を合成した。得られたｃ
ＤＮＡ−ＲＮＡ　ハイブリッドを０．７５単位のＲＮａ
ｓｅＨ１４６単位のＤＮＡポリメラーゼＩ、４単位のＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、２８４ｎｇの２本鎖Ｃ
ＤＮＡを得た。上記のｃＤＮＡの合成は基本的に１Ｇｕ
ｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２６９　
（１９８３））による。

ｃＤＮＡ　（’２本鎖）を１５単位のＥｃｏＲＩメチラ
ーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で処
理後、ＥｃｏＲＩリンカ−（４５０ｎｇ）と１７５単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で１３°Ｃ４５時間反
応させ連結した。

上記産物を７６単位のＥｃｏＲＩ　（宝酒造）で３７℃
２時間消化後、セファクリルＳ−１００５−１Ｏ００（
Ｐｈａｒ　）にかけ、ｃＤＮＡと消化リンカ−とを分離
した。ここまでのステップで２１４ｎｇのＥｃｏＲＩメ
チラーゼ処理ＥｃｏＲＩ断片・２本鎖ＣＤＮＡが回収さ
れた。

上記のｃＤＮＡのうち２０ｎｇを１．２３μｇのλｇｔ
ｌｏ　ａｒｍｓ　（ＥｃｏＲＩ消化後ア消化リアルカリ
フォスファターゼを脱リン酸化したもの、Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社製）とＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、１１６
単位）で、１３°Ｃ１５時間で連結許せた。連結したλ
ｇｔｌＯ−再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡを、Ｇｉｇａ
ｐａｃｋ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてバッ
キング後、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来のＹ１０８９　（
ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｖｏｌ、　１．４９−７８
．１９８５、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）に感染させ、総計
２．８Ｘ１０’の形質転換体を得た。

■、再生ラうゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーのディ
ファレンシャルスクリーニング：再生ランゲルハンス島
で特異的に発現される遺伝子の単離上記■で作製したラ
ット再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーのうち
任意に選んだ５０００個の独立プラークから、個々にフ
ァージをマイクロタイタープレート（９６穴）中の０　
、５０　Ｄ　ｓ。。相当のＹ１０８９を含むＮＺＹ−０
，２％マルトース培地（１％ＮＺアミン、０．５％バク
トイ−ストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、
０．２％マルトース）につまようじを用いて接種し、３
７℃で１夜インキユヘートして増殖させた。

得られたファージ液を２μｍずつニトロセルロー　スフ
　（ルター（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕ
ｅ１社、ＢＡ８５）にスポットし、ニックトランスレー
ション法によりＳＲｐで標識したラットインスリンＩ［
ｃＤＮＡトハイブリダイス許せた。この結果、１６％の
クローンがインスリンｃＤＮＡクローンとして同定され
、残る８４％の非インスリンｃＤＮＡクローンを以下の
スクリーニングに供した。

ラット再生ランゲルハンス島または無処置ラット正常ラ
ンゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ）′″ＲＮＡ（１５０ｎ＆
）を４１ｎｇのオリ：’（ｄ丁＞＋＋−＋ｓ、２０ｍＭ
ｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２μ
ＭｄＣＴＰ、６０μＣｉ　［α−”Ｐ］ｄＣＴＰ（アマ
ルシャム）の存在下に１５単位の逆転写酵素（生化学工
業）と、３７°Ｃで２時間インキュベートする。０．３
Ｎ＊、酸化ナトリウムでＲＮＡ鎖を分解（１００℃、２
分）後、生成されたＳａＰ標識１本鎖ｃＤＮＡをエタノ
ール沈殿法で回収した。この方法により１−２　Ｘ　１
０　”ｃｐｍ／ＩＩ　ｇ　ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡの比
活性を有するプローブが得られた。

非インスリンｃＤＮＡクローンのファージ液を２μｍず
つ２組のニトロセルロースフィルターにスボントし、フ
ィルターを０．５Ｍ水酸化ナトリウム＝１１− ／１５Ｍ塩化ナトリウム、次いで０．５Ｍトリス塩酸（
ｐＨ８，０）／１．５Ｍ塩化ナトリウムで、室温で各５
分間処理後、２ＸＳＳＣ（ｌＸ５ＳＣ：０．１５Ｍ塩化
ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に浸し
た後、８０°Ｃで２時間固定化した。

固定化したニトロセルロースフィルターを３×ＳＳＣ中
で６５℃３０分、３×ＳＳＣおよび１×Ｆ　Ｂ　Ｐ　（
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓ’ｏｌｕｔｉｏｎ、０．０２
％Ｆｉｃｏｌ１４００．００２％牛血清アルブミン、０
．０２％ポリビニルピロリドン）中で６５℃１時間反応
させた後、１Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ）リス塩酸（
ｐＨ７，４）、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、Ｉ
ＸＦＢＰ、１０μｇ　／　ｍ　Ｉサケ重大ＤＮＡ。

２５０　Ｂ　ｇ／ｍ　ｌ　　ｐｏｌｙ（Ｕ）　（ファル
マシア）中で、６５”Ｃ１時間プレハイブリダイゼーシ
ョンさせた。１組のフィルターはラット再生ランゲルハ
ンス島９０１）’（Ａ）”ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
　（１，５Ｘ　１０’ｃｐｍ）をプローブ（前記）とし
、他の１組は無処置ラットから分離した正常ランゲルハ
ンス島ｐｏｂ’（Ａ）”ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ　
（１，５Ｘ　１０’ｃｐｍ）をプローブ（前記）として
、１Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，
４）、１０　ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、０．１％Ｓ
ＤＳ。

２５０　μｇ／ｍ　ｌ　　ｐｏｌｙ（Ｕ）中で、６５℃
で１６時間ハイブリダイズさせた。

ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×ＳＳＣで
室温で１〜２分間２回洗浄し、０．１×５ＳＣ１０，１
％ＳＤＳ中で６５℃、４０分、４回洗浄後、８０℃で１
時間乾燥させた後、−８０℃で１夜オートラジオグラフ
イーを行なった。

その結果、再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡと特異的にハ
イブリダイズする１種類のクローンが得られた。

本発明を追試する時には、このスクリーニングは第２図
に示される塩基配列を参照してプローブを作成し使用す
れば、容易に行ない得る。

■、再再生ランゲルハンス島側細胞特異的に発現される
遺伝子の構造決定上記■で得られた再生ランゲルハンス島で特異的に発現
きれる遺伝子のｃＤＮＡ　／７０−ンからファージＤＮ
Ａを精製後（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）参照）、Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でｃＤ
ＮＡ挿入物をファージａｒｍｓがら分離した。

分離したｃＤＮＡの塩基配列をＭ１３　（ｍｐ１８、ｍ
ｐ１９、ファルマシア）を用いたサンガー法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１．２０−７
８．１９８３）により決定した。

その結果、再生ランゲルハンス島で特異的に発現される
転写物は、ポリ（Ａ）部分を除き、全長７４９ヌクレオ
チドで、メチオニンに始まりアラニンに終わる１６５ア
ミノ酸残基からなる蛋白質をフードしていた。塩基配列
および推定されるアミノ酸配列を第２図に示す。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ）　
、ＧｅｎＢａｎｋ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）　、Ｎａｔｔｏｎａｌ　
ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ　（ｌＪａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ）の核酸
・蛋白質データヘースのコンピューター探索（Ｗｉｂｕ
ｒ、　　Ｗ、　　Ｊ、　　＆　　Ｌｉｐｍａｎ、　　Ｄ
、　　Ｊ、、　　Ｐｒｏｃ、　　ＮａｔｌＡｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　１９８３．８０，７２６−７３０の
方法による）の結果、今回クローン化きれたｃＤＮＡの
塩基配列および推定きれたアミノ酸配列はいずれの既知
の遺伝子・遺伝子産物とも異なっており、５０％以上の
ｈｏｍｏｌｏｇｙを示す遺伝子・遺伝子産物はデータヘ
ース中に見出されなかった。

従って、再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーか
らクローン化きれたｒｅｇ遺伝子は、従来報告されてい
ない全く新しい遺伝子と対応するものと考えられた。

以上の様にして得られた塩基配列の一部を用いてヒト膵
ｃＤＮＡライブラリーからヒトｒｅｇ遺伝子を分離する
。

ａ）ヒトで再生ランゲルハンス島を調製することは困難
であるため、ヒト手術摘出群からｃＤＮＡライブラリー
を作製した。うシトでは膵組織中にｒｅｇ　　ｍＲＮＡ
が検出きれている。

ｂ）ＲＮＡの分離手術摘出群を４Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．５％ラウリルサ
ルコシンナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプトエタノー
ル、１％Ａｎｔｉｆｏａｍ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ）中でポ
リトロンによりホモジネート後、密度１．６４のセンラ
ムトリフルオロ酢酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に重層し
、２５℃、４４．００　Ｏｒ　ｐｍで１４〜１６時間遠
心した。遠心後、ＲＮＡ沈殿を回収した。５００ｍｇの
膵組織から２．５２６ｍｇのＲＮＡが得られた（　Ｃｈ
ａｒｇｗｉｎ、　Ｊ、　Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　１９７９；　１８：５２９４−９９参照）。

ｃ　）　Ｐｏ１ｙ（Ａ）”ＲＮＡの分離ｂ）で得られた
ＲＮＡからオリコ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグ
ラフィーにより１７．５６μｇのｐｏｌｙ（ＡνＲＮＡ
を分離した（　Ｈ，Ａｖｉｖ　＆　Ｐ、Ｌｅｄｅｒ。

ｄ　）　ｅＤＮＡライブラリーの作製１μｇのヒトｐｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡを鋳型とし、オ
リコ（ｄＴ）をブライマーとして、４０単位の逆転写酵
素と４２℃、１時間反応させて約１００ｎ１００ｎ♂Ｎ
Ａ　（ｆｉｒｓｔ　５ｔｒａｎｄ）を合成した。得られ
たｃＤＮＡ　−ＲＮＡハイプリントを０７５単位のＲＮ
ａｓｅ）ｌ、４６単位のＤＮＡポリメラーゼエ、４単位
の’ｒ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、約１５０ｎｇの
２末鎖ｃＤＮＡを得た。上記のｃＤＮＡの合成は基本的
にＵ、　Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ　２５．２６
３−２６９　（１９８３））による。

ｃＤＮＡ（２本鎖）を１５単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ＞で処理後
、ＥｃｏＲＩリンカ−（４５０ｎｇ）と１７５単位の１
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で１３°Ｃ４５時間反応さ
せ連結した。

上記産物を７６単位のＥｃｏＲＩ　（宝酒造）で３７’
Ｃ２時間消化後、セファクリルＳ−１００５−１Ｏ００
（Ｐｈａｒ　）にかけ、ｃＤＮＡと消化リンカ−とを分
離した。ここまでのステップで１７．６ｎｇのＥｃｏＲ
Ｉメチラーゼ処理ＥｃｏＲＩ断片・２末鎖ｃＤＮＡが回
収いれた。

上記のｃＤＮＡを１０μｇのλｇｔｌｏ　ａｒｍｓ　（
ＥｃｏＲＩ消化後アルカリフォスファターゼで５°端を
脱リン酸化したもの、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、１１６車位）で、１３℃１
５時間で連結許せた。連結したλｇｔｌｏ−ヒト膵ｃＤ
ＮＡを、Ｇｉｇａｐａｃｋ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製）を用いてバッキング後、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来
のＹ１０８９　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

ｖｏｌ、　１．４９−７８．１９８５．　ＩＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ）に感染きせ、総計５ｘｔｏ’の形質転換体を得
た。

ａ）ヒト膵ｃＤＮＡライブラリーを０．５０Ｄ、、。

相当の大腸菌Ｙ１０８９を含むマルトース培地（０２％
マルトース、１％ＮＺアミン、０５％バクトイ−ストエ
キストラクト、０．５％塩化ナトリウム）中で３７℃に
て１晩増殖させた後、直径１５０ｍｍの寒天培地に１０
’個のプラークを発育させニトロセルロースフィルター
に移した。

ｂ）ラットｒｅｇの塩基番号７６−１３５（第２図参照
）に相当する６０塩基のオリフ′デオキシリボヌクレオ
チドをアブライドバイオシステムダモデル３８０ＢＤＮ
Ａ合成機で人工合成し、その５′末端を［７−”ＰコＡ
ＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてｊ１ｐｇ
識した。

Ｃ）ａ）のフィルターを、０．５Ｎ水酸化ナトリウム／
１５Ｍ塩化ナトリウム、０５Ｍトリス−塩酸（＋）Ｈ８
，Ｏ）／１．５Ｍ塩化ナトリウムで室温で各５分間処理
後、２ＸＳＳＣ（ｌＸ５ＳＣ；０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に浸した後、８
０°Ｃで２時間焼結した。このフィルターを６ＸＳＳＣ
１５ｘＦＢＰ（ＩＸＦＢＰ；０．０２％フィコール４０
０．００２％牛血清アルブミン、００２％ポリビニルピ
ロリドン）、０１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍ１大腸菌ｔ
ＲＮＡ溶液中で５０℃で４時間プレハイブリダイズさせ
た後、２　ｎ　ｇ　／　ｍ　ＩのｓＩｐ標識オリゴデオ
キシリボヌクレオチドを含む６ＸＳ　５Ｃ１ＩＸＦＢＰ
、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍ１大腸菌ｔＲＮＡ溶
液中で５０℃で１２〜１６時間ハイブリダイス許せ、６
ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで５０℃にて３０分間４回洗
浄した。

ｄ）その結果、１０’個のヒト膵ｃＤＮＡクローン中５
８個のクローンが６０塩基のラットｒｅｇプローブとハ
イブリダイズした。

ｅ）これら陽性クローンのうち最長のｃＤＮＡｉｎｓｅ
ｒｔ（約９００ヌクレオチド）を有するクローンからＤ
ＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩで消化後、ｐＢｓベクター（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃ。

ＲＩサイトにサブクローニングした。このｃＤＮＡは、
内部にＥｃｏＲＩサイトを持つため、その前半部分と後
半部分に分かれてサブクローニングされた。

ｌ−」」二ｆｆ１−虹聾凡ＡｊｌＧ［ＪｌｌΔ扱笈ａ）
ｐＢｓベクターにサブクローニングしたＣＤＮＡの塩基
配列をＳａｎｇｅｒ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　１０１．２０−７８．１９８３）により
決定した。

ｂ）その結果、ヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡはポリ（Ａ）を
除き、全長７４９ヌクレオチドで、メチオニンにはしま
りアスパラギンで終わる１６６アミノ酸残基からなる蛋
白質をコードしていた。

２Ｏ− Ｃ）ヒトｒｅｇ遺伝子がコードする蛋白質はラットｒｅ
ｇ遺伝子がコードする１６５アミノ酸残基の蛋白質より
１アミノ＃歿基分長く、コード域のホモロシーは塩基配
列で７５％、アミノ酸配列で６８％であった。

ｄ）ヒトｒｅｇ蛋白質のＮ末端には、疎水性アミノ酸に
富む配列が存在しており、これは分泌蛋白質にみられる
シグナルペプチドに特徴的なものである。即ち、ヒトｒ
ｅｇ蛋白質に於ては、Ｍ　ｅ　ｔ（−１）に始まりＧｉ
ｎ（２０）、Ｇｌｙ（２１）、Ｇｌｎ（２２）、Ｇｌｕ
（２３）、Ａｌａ（２４）、Ｐｒｏ（２９）、Ｇｌｎ（
３０）、Ａｒｇ（３２）までの配列がシグナルペプチド
であると推定された。

得られたｃＤＮＡは、公知の方法により発現できる。例
えば、該ｃＤＮＡを適切なプロモーター（１ａ”、Ｔａ
ｃ、Ｉｒｐ、ＰＬなと）の制御下に適切な発現ベクター
（ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｓ、ｐＤＲ５４０、ｐＤＲ７
２０、ｐＰＬ−１μｍｂｄａなど）に挿入し、宿主（Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｋ（２ＡＧ−１、ＭＭ２９４、ＤＨＩ、Ｈ
ＢＩＯＩ、Ｃ６００など）に導入して発現させればよい
。ｒｅｇ遺伝子にコードきれるｒｅｇ蛋白質を、酵母や
猿細胞などの真核細胞を宿主として用いて発現・分泌さ
せれば、後の採取精製が容易になる。例えば、酵母を用
いる場合には、発現ベクターとしてｐＧＰＤ−１、ｐＭ
Ｆα８、ＡＡＲ６、ＡＢａｄｅ８、ＡＨ５、ＹＥｐ５２
、ｐＡｃＦ３０１、ｐＡＭ８２など様々な公知のベクタ
ーが使用可能である。ＣＯ５Ｏ５脳細胞用する場合には
、ｐＫＳＶ−１０などの発現ベクターが使用できる。上
記の宿主−ベクター基に限らず公知の宿主−ベクター系
はほとんどｒｅｇ蛋白質の発現に適応できるものと考え
られる。

発現されたｒｅｇ蛋白質は、従来の精製法に従い、遠心
分離、クロマトグラフィー、透析、塩析などを適当に組
み合わせて精製すれば良い。

ヒトｒｅｇ遺伝子から推定されるアミノ酸配列は、その
Ｎ末端付近が疎水性アミノ酸に富み、シグナルシーケン
スであると推定される。よって、成熟ヒトｒｅｇ蛋白質
は、第１図に示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から
２１番目のＧｌｙ、２２番目のＧｌｎ、２３番目のＧｌ
ｕ、２４番目のＡｌａ、２５番目のＧｌｎ、３０番目の
Ｇ１ｎ１３１番目のＡｌａ、または３３番目のＩｌｅか
らは−しまるものであると考えられる。従って、本発明
はこれら成熟蛋白質をも提供するものである。またこれ
らの蛋白質を遺伝子組換技術を用いて製造する場合、そ
のＮ末端に開始コドン由来のＭ　ｅ　ｔが付随すること
がある。よって本発明はきらに上記蛋白質のＮ末端にＭ
　ｅ　ｔを有する蛋白質を包含する。

以下の実施例から明らかなように、第１図に示す遺伝子
を酵母中で発現・分泌させた場合、産生されるｒｅｇ蛋
白質のＮ末端は、２２番目のＧ１ｎ１２３番目のＧｌｕ
、または３３番目のＩｌｅであると推定された。

Ｘ貫迩酵母におけるヒトｒｅ　　の発現監土葡発現ベクター構築のための宿主としては、Ｅ５ｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２（Ｆ−１ｈｓｄＲ”、
ｈｓｄＭ”、ｒｅｃＡ′″、ｔｈｒ、ｌｅｕ、　ｔｈｉ
、１ａｃＹ、５ｕｐＥ、　ｔｏｎＡ）が用いられた。

発現ベクターの宿主としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２（ａ　１ｅｕ２、
ｈｉｓ４、ｃａｎｌ、ａｉｒ”）（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５．１９２９
−１９３３　（１９７Ｂ）　：特公昭６１−５５９５１
：微工研条寄第３１２号）を用いた。この酵母は予めＹ
ＰＤＡ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％
グルコース、２０　ｍｇ／ｌアデニン〉中で培養してお
いた。

１５　ｇ／ｌのＫｌ　、ＰＯ□を含むＰｉ添加培地（以
下Ｐｉ（＋）培地と略記）および、上記Ｐｉの代わりに
１．５ｇ／ｌのＫＣＩを含むＰｉ欠損培地（以下Ｐｉ（
−）培地と略記）の調製には、ハークホルダー最小培地
（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｍｅｄ
ｉｕｍ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、４
５０４−４５０８　（１９８０））を用いた。

酵素およびリンカ− 制限酵素、１４ＤＮＡリガーゼ、クレノーフラグメント
は宝バイオケミカルズから購入し、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−
はファルマシアから購入した。

プラスミド発現ベクターとしては、酵母−大腸菌シャトルベクター
ｐＡＭ８２　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０、１−５　（１９８３）、特公昭
６１−５５９５１：微工研条寄第３１３号）を用いた。

これは、ＡＲ５Ｉ、２μｍ　ｏｒｉとｌｅｕ２を有する
５、５ＫｂのＬｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＮＡ断片およ
びＡｐ　Ｒマーカーと　ｏｒｉを有する３、７Ｋｂのｐ
ＢＲ３２２断片からなり、さらに、ＰＨ０５プロモータ
ーを有する２、７Ｋｂの酵母［）ＮＡ断片を有する。

発現ベクターの構築に用いたｐＧＥＭ４は、プロメガバ
イオチク　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ　（Ｕ、Ｓ
、Ａ、　））から購入した。

ヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡには、その構造遺伝子内にＥｃ
ｏＲ’［サイトがあり、従って、ｐＢＳヘクターのＥ（
！ＯＲＩサイトに挿入する際には、２つのＥｃｏＲＩ断
片に分かれて挿入されている。

形質転換形質転換はＫｉｍｕｒａらの方法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ。

出、　１６３−１６８　（１９８３））に従って行なわ
れた。

ｌｅｕ”株は、２に寒天を含むハークホルダー最小培地
上で選択した。

＠養と誘導プロモータＰＨ０５は培地中のＰｉｆｉ度により制御で
きる（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　！、　６７５
−６８０　（１９８２））。最初に、酵母を、ヒスチジ
ン（２０μｇ／ｍｌ＞　ヲ加えたＰｉ（＋）培地中で、
３０°Ｃ２日間、好気的に培養した。そのうちの２００
μｌを、ヒスチジン（２０μｇ／ｍｌ）を加えたＰｉ（
−）培地１０　ｍｌに移した。これを同様に培養したと
ころ、３〜５日後に、ヒトｒｅｇ蛋白質が培地中に検出
きれた。

発現ベクターの構築発現ベクターの構築は、第３図に示される通り常法に従
ってなきれた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）参照）
。

ｐＢＳベクターに挿入されたヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡは
、５°末端断片および３゛末端断片の、２つの断片（前
半と後半）に分かれてそれぞれ挿入されている。

まず、５゛末端断片（前半）を有するｐＢＳヘクターを
Ａｆｌ　Ｉ［で消化し、クレノーフラグメントで処理し
、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−を付加してＥｃｏＲＩで消化した
。３′末端断片（後半）を有するｐＢＳベクターは、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＸｂａ　Ｉで消化した。ｐＧＥＭ４のＳ
ａｃ　ＩをＸｈｏ　Ｉリンカ−を用いてＸｈｏ　Ｉサイ
トとし、コ（７）　ｐＧＥＭ４（Ｘｈｏ　Ｉ　）に、上
記で得られた２つのヒｈｒｅｇ　　ｃＤＮＡ断片を挿入
した。得られた１）ＧＥＭ４（Ｘｈｏ　Ｉ　）　ｈｕ　
ｒｅｇをＸｈｏ　Ｉおよび）ｌｉｎｅ　Ｉ［で消化し、
Ｘｈｏ　ＩとＰｖｕ　Ｉ［で消化したｐＡＭ８２に挿入
した。このプラスミドを、ｐＡＭ８２−ｈｕｍａｎ　ｒ
ｅｇと命名した。

それぞれの制限酵素は、３単位／μｇＤＮＡの濃度で使
用し、３７℃で１時間インキュベートした。

旦エエ±工棄頁１匁羞進上記で構築きれたヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡ発現ベクター
を１蝦に−１２Ｃ６００に導入し、アンピシリン耐性コ
ロニーを選択した。これらの形質転換株を用いて、プラ
スミドＤＮＡを大量に調製した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ中で増殖した組換えプラスミドを、酵母
宿主Ｓ、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ）１２２に常法に
従って導入し、Ｌｅｕ”コロニーを選択した。

形質転換株は、２日間Ｐｉ（＋）培地中で培養した後、
Ｐｉ（−）培地に移すことにより誘導した。

酵母は、Ｐｉ（＋）およびＰｉ（−）両培地において３
０°Ｃで激しく振とうしながら培養した。

Ｐｉ（）培地における培養の３．４．５日後に、培地の
一部を取り、遠心して細胞を除去した。

こうして得られた培養液を、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０
（Ａｍｉｃｏｎ　）およびＮ、ガスを通すことにより約
１００分の１に濃縮した。

濃縮サンプル（培養液の０．７５　ｍｌに相当）は、１
６Ｘ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　５
８．２５４−２５８　（１９７５）、　Ｎａｔｕｒｅ　
（Ｌｏｎｄｏｎ＞　２２７．６８０　（１９７０））に
付し、クマシーブリリアントブルーＲ染色により分析し
た。

第４図に示すとおり、ヒトｒｅｇ蛋白質は、明らかに、
細胞から分泌産生された。主に、ヒトｒｅｇ蛋白質が検
出きれたが、多少の夾雑蛋白質も検出きれた。

ヒトｒｅ　　蛋白質の　疫検出上記培養液を、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏ
ｎ）およびＮ、ガスを通すことにより約１００分の１に
濃縮した。

濃縮した培地を１６％　５ＤＳ−Ｆ’ＡＧＥに付し、ヒ
トｒｅｇ蛋白質に反応性を有する抗体を用いて、ウェス
タンプロット分析（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　　籾、　２１１
　（１９７２））を行なった。

第４図に示すとおり、約１５にダルトンと１６にダルト
ンの２つのバンドが確認され、これらをｒｅｇ蛋白質と
命名した。

見上」」」３１℃」Δ板上ｒｅｇ蛋白質を含む培養液を、ＩＮ塩酸でｐＨ３，４に
調整し、最終導電率０．３　ｍｍｈｏとなるように蒸留
水で希釈した。この溶液に、５　ｍＭ酢酸すトリウム緩
衝液（ｐ）ｌ　３．４）　（緩衝液Ａ）で平衡化した１
００　ｍｌの　Ｓ−セファロース（ファストフロータイ
ブ）を加え、４°Ｃで１６時時間中かに攪拌した。この
ｒｅｇ蛋白質を吸着したＳ−セファロースをカラム（５
Ｘ　８　ｃｍ）にパックし、０．３ＭＮａＣ１を含む緩
衝液Ａで洗浄し、０．６　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａ
で溶出シタ。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１５％ゲル）上で約
１５．０００と約１６．０００の分子量を示すｒｅｇ蛋
白質画分をプールし、４℃で１６時間緩衝液Ａに対して
透析した。これを、緩衝液Ａで平衡化したＳ−セファロ
ースカラム（０，７Ｘ２５ｃｍ）に付し、０．３　Ｍ　
ＮａＣ１を含む緩衝液Ａで洗浄した。ｒｅｇ蛋白質は、
カラムの１０倍量の０３〜０．６　Ｍ　ＮａＣ１を含む
緩衝液Ａの線状勾配により溶出した。１５にのｒｅｇ蛋
白質は０．４７　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａで、１６
にのｒｅｇ蛋白質は０゜４４　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝
液Ａで溶出された。それぞれ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１５
ｘゲル）上で均一であった。精製ｒｅｇ蛋白質は、Ａｍ
１ｃｏｎ　ＹＭ−１０ｍｅｍｂｒａｎｅを用いる限外濾
過により脱塩後、１０ｍＭの酢酸中に０．１　ｍｇ／ｍ
ｌとなるように保存した。

ＩＰの培養液から約２００μｇのｒｅ＆蛋白質が得られ
た。

ヒトｒｅ　　蛋白質の特性・分子量１５にと１６にの精製ｒｅｇ蛋白質の分子量は５ＤＳ−
ＰＡＧＥにより決定し、それぞれ、約１４．５００およ
び約１６．０００であった。これは、ｃＤＮＡ配列から
推定きれるアミノ酸配列から計算した理論値１５．０２
３および１６．２７５とよく一致したく１５に−ｒｅｇ
および１６に−ｒｅｇのＮ末端はそれぞれ３３番目のＩ
ｌｅおよび２２番目のＧｌｎと推定した）。

・アミノ酸組成１６に−ｒｅｇ蛋白質をＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｂｒｏｗｎｌｅ
ｅ。

ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ−３００ｃｏｌｕｍｎ）で脱塩
し、４Ｍメタンスルホンｍ　（０，２％　３−（２−ア
ミノエチル）インドールを含む〉を用いて１１０°Ｃで
２４時間加水分解した。アミノ酸分析は、日立アミノ酸
分析機（Ｍｏｄｅｌ　８３５）を用いて行なった。

表１に示すとおり、１６に−ｒｅｇ蛋白質のアミノ酸組
成は理論値とほぼ一致した。

・Ｎ末端配列１６に−ｒｅｇ蛋白質のＮ末端配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　
５ｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて分析しようとしたが、Ｎ末
端およびそれに続くアミノ酸は全く検出きれなかった。

そこで、ピログルタメイトアミノペプチダーゼで処理し
た後、上記と同様に分析した。酵素処理した１６に−ｒ
ｅｇ蛋白質のＮ末端２９個のアミノ酸が、表２に示すよ
うに、決定きれた。この酵素処理蛋白質のＮ末端はグル
タミン酸であり、アミノ酸配列（Ｇｌｕ−２からＧｌｕ
−３０＞はｃＤＮＡから推定される配列と一致した。

従って、１６に−ｒｅｇ蛋白質のＮ末端は、２２番目の
Ｇｌｎまたは２３番目のＧｌｕであると推定跡れた。ラ
ットｒｅｇ蛋白質においては、そのＮ末端アミノ酸は、
ヒトｒｅｇ蛋白質の２３番目のＧｌｕに対応するＧｌｕ
であった。

１５に−ｒｅｇ蛋白質については、１６に−ｒ＝３２− ｅｇ蛋白質が分泌きれた後トリプシン様の酵素の作用に
より１５に−ｒｅｇ蛋白質となると推定された。よっ工
、１５に−ｒｅｇ蛋白質のＮ末端は、３２番目のＡｒｇ
に続く、３３番目のＩｌｅであると推定された。

表１Ａｓｐ　　　　１７．１　　　１７Ｔｈｒ　　　　　６．９　　　　７Ｓｅｒ　　　　１５．７　　　１７Ｇｌｕ　　　　１４．８　　　’　　１４Ｐｒｏ　　　
　　６．４　　　　６ｃｔｙ　　　　１０．２　　　１ＯＡｌａ　　　　　８．０　　　　８１／２Ｃｙｓ　　　　　５．５　　　　６Ｖａｌ　　　
　　９．９　　　１０Ｍｅｔ　　　　　１．０　　　　１１１ｅ　　　　　３．９　　　　４Ｌｅｕ　　　　　８．１　　　　８Ｔｙｒ　　　　　７．１　　　　７Ｐｈｅ　　　　　７．０　　　　７Ｌｙｓ　　　　　９．１　　　　９旧ｓ　　　２．２　　２Ａｒｇ　　　　　４．８　　　　５表２分解段階　　ｒｅｇ蛋白質残基　　収率Ｃ％）１　　　
　　　（Ｇｌｎ）” ２　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　１７．３３　　　　　
　Ａｌａ　　　　　１８．１４　　　　　　ＧＩｎ　　
　　　２０．６５　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　１１．
９６　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　１４．９７　　　　
　　Ｌｅｕ　　　　　１６．８８　　　　　　Ｐｒｏ　
　　　　１５．２９　　　　　　ＧＩｎ　　　　　１４
．７１０　　　　　　Ａｌａ　　　　　１４．２１１　
　　　　　Ａｒｇ　　　　　　７．９１２　　　　　　
Ｉｌｅ　　　　　　９．８１３　　　　　　Ｓｅｒ　　
　　　３５．６１４　　　　　（Ｃｙｓ）” １５　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　７．５１６　　　
　　　Ｇｌｕ　　　　　　５．７１７　　　　　　Ｇｌ
ｙ　　　　’　　８．６１８　　　　　　Ｔｈｒ　　　
　　１２．２１９　　　　　　Ａｓｎ　　　　　　５．
９２０　　　　　　Ａｌａ　　　　　　６．８２１　　
　　　　Ｔｙｒ　　　　　　５．６２２　　　　　　Ａ
ｒｇ　　　　　　３．５２３　　　　　　Ｓｅｒ　　　
　　２２．０２６　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　４．
８２７　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　６．４２８　　
　　　　Ｐｈｅ　　　　　　４．４２９　　　　　　Ａ
ｓｎ　　　　　　４．１３０　　　　　　Ｇｌｕ　　　
　　　２．７＊２未同定残基：ｃＤＮＡからＣｙｓと推
定発明の効果ヒトｒｅｇ遺伝子はインスリン産生群Ｂ細胞の再生に密
接に関与すると考えられ、この遺伝子によりコードされ
る本発明のｒｅｇ蛋白質を投与可能な医薬として開発す
ることにより、糠床病患者自身の膵Ｂ細胞の再生賦活と
いう、従来のインスリン投与法に優る糖尿病治療の断方
向が開かれる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列および該
塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。第２図は
ラットｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列および該塩基配
列から推定されるアミノ酸配列を示す。第３図はヒトｒ
ｅｇの発現ベクターの構築の概略図である。第４図はヒ
トｒｅｇ発現ベクターを有する酵母を３〜５日培養した
後の５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真。第３図および
第４図において、ヒトｒｅｇを’ｈｕ　　ｒｅｇＪと略
しである。３６一０−　　ｏ＜ロ　　ロ←仁　　ロＥ−４ａヒ０−　ロく
一ロ　へくψロ　Ｑく０口くΣ１　０Ｃ：）ｃＶｌ−（
（寸　−０く口Ｏ＆−Ｑ−く関Ｑｕ　　　　（）、５　　　　Ｑ− ＜ｃ／）　　　＜ｈ　　　　ａ＜Ｏｅｔ　　　　ＯｈＨら＜　−ａ−＜切ｏｔ、ｂ　　　　ａｏ　　　　ｏ＜トー＜コ　　　トーロ○υ　　ロく−ロトークＨの　　−００ｈＱ＞Ｏ：＋　　９−４＜ロ　　−〇１トυ　　　０１＋ＣＩ＋０−　　０氏　　　←← Ｅ−ＩＱ　　　Ｏψ　　　ＱｔｌＩ−＠Ａ　　　　Ｏｈ　　　　Ｑρ Ｅ−４出　　　Ｈ○　　　くト０−　　　Ｑｋ　　　　Ｑクトυ　　　（ｊａ＋　　　　（− 〇＜Σ　　ロ＜の　　ロｃｂ。４Ｃ：）：Ｉ口ＯＣＣｏ上− Ｆ−＋＠Ｊ　　　、−ＩＦ−１−ｍ（ｊＩ＋Ｏ，−ａ＜
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ｗ　φ＜ｗ　寸Ｃ− Ｑａ　　、ｓ＜＜　　ｖ＋！＜　　へＣ０Ｑｌ−ｏｔ＋
　　　＜Ｃ６（り：５０υ　　Ｑυ　　Ｏ−く− ＜Ｃ／）　　　ヒＣ／）　　　ａ＜　　　ａａくｏ　　
←−０り　←ｄＱｋ　　　（ｊ　−＜　−〇− ○ｏ＠（り（り　　　（５Ｃり　　　ａ＜（−ｓ　Ｉ−
＜：　：Ｉ９ｓ　ｃ６　　　（り　Ｇｌ口Ｑυ　ロく−
ロ〇−ロく− Ｌｒ）Ｅ−４ｃ／）　　−ｓＣ：）０　　ｂＱ（ｍ（Ｊ
Ｃ：）Ｈシ　−＜０−Ｏへ　へＯ− ←ｖ　　○１＋０１＋ＯａＪ ○−０Ｏ４Ｅ−４Ｅ−１＜のＱ−←ｖＩ　　　←−〇− ［Ｉｃ６　０＋１−１　　Ｏυ　　トυ０＞　　←Ｑ　
　←ω　　〇− 〇−←＋−＜＝５　　Ｏ− ←υ　　Ｑ、ｌ：！　　　ヒｕＥ−４ｃａ口＜Σ　ロく
←　ロ←−ロＯ＞寸Ｉ＋ｌ＋ｐ　　ロＱｖ　　ｃｏ（−Ｉｖｒ　　ｃｑ＜
ｋ←υ−Ｅ−１−−＜・−へ０００１−２　　＜−〇〇ニドのＯｍ　　　ＱｉｉｏＩＪＱ　　　Ｑｍａｈ　　Ｑ＋−＜ψ　　ヒｄヒＯ＜＜　　　ａ＜　　　ａ＞口Ｑ−ロ〇−ロＥ−１＆＋　ｏ〇− ロ０−　ロく−へ○Ａ　　ＯＯＥ＋− 曽００　のＨ←　寸くＨ寸Ｏ（［−＋ａ＋　　　　ＱＨｃ）−”　　　　Ｅ−１υＦ−
１＋　　　　［＋υ　　　Ｅ＋−ト１＝（−（ＩＪ　　
　（り＞　　　Ｅ−’良（ｊ　Ｗ　　　ｔ−ｓ　４＋　
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　○０Ｅ−［−Ｉ［−−Ｈの　　←のＱ−ｏｐ＜−＜＝ｚ口１−１−　ロトυ　ロＥ−＠−ロト０［Ｆ］Ｃ＞　り
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Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１図に示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端か
ら１番目のＡｌａ、２１番目のＧｌｙ、２２番目のＧｌ
ｎ、２３番目のＧｌｕ、２４番目のＡｌａ、２５番目の
Ｇｌｎ、３０番目のＧｌｎ、３１番目のＡｌａ、または
３３番目のＩｌｅから始まり１６５番目のＡｓｎで終わ
るアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のＮ末端にさら
にＭｅｔを有するアミノ酸配列を有するｒｅｇ蛋白質。
（２）第１図に示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端か
ら２２番目のＧｌｎ、２３番目のＧｌｕ、または３３番
目のＩｌｅから始まり１６５番目のＡｓｎで終わるアミ
ノ酸配列を有する請求項１に記載のｒｅｇ蛋白質。
（３）請求項１に記載のｒｅｇ蛋白質をコードする遺伝
子を有する発現ベクターを導入した宿主を培養し、該培
養物から該ｒｅｇ蛋白質を採取することを特徴とする該
ｒｅｇ蛋白質の製造法。
（４）該宿主が酵母である請求項３に記載の製造法。