JP7489319B2 - 細胞膜透過性ペプチド - Google Patents

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Description

本発明は、細胞膜透過性に優れた細胞膜透過性ペプチドに関するものである。
近年、特定のタンパク質や遺伝子を標的として攻撃する分子標的薬が注目を集めており、細胞内タンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）は魅力的な創薬ターゲットの一つである。しかし、タンパク質間の相互作用面は広く、親水性が高いため、既存の低分子がＰＰＩを阻害することは難しい。それに対して、ペプチド等の中分子はＰＰＩを阻害することが可能であるが、その多くは細胞膜透過性を持たない。
ペプチドを細胞内に送達する方法として、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰｓ）をカーゴ分子に結合させて細胞膜透過性を付与する方法が知られている。既存のＣＰＰｓとしては、ＨＩＶ－１ウイルス由来のＴＡＴペプチド（特許文献１）、ショウジョウバエのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオドメインに由来するペネトラチンの改変型（特許文献２）、オリゴアルギニン（非特許文献１～３）などが知られており、その他、非特許文献４にも様々なＣＰＰｓが開示されている。
特開平１０－３３１８６号公報 特表２００２－５３００５９号公報
Ｆｕｔａｋｉ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６，ｐｐ．５８３６－５８４０ Ｄａｎａ Ｍａｒｉａ Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉら，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２０１４，８，ｐ．１９７２ Ｊａｍｅｓ Ｒ．Ｍａｉｏｌｏら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１７１２（２００５），ｐｐ．１６１－１７２ Ｐａｕｌ Ａ．Ｗｅｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７（２４）８，ｐｐ．１３００３－１３００８
上述したように、細胞膜透過性ペプチドは種々知られているが、実際に臨床に適用されているものは少なく、より優れた新規細胞膜透過性ペプチドが模索されている。
そこで本発明は、細胞膜透過性に優れた新規細胞膜透過性ペプチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、優れた細胞膜透過性能を有するペプチドを見出し、細胞内に送達すべき生理活性ペプチドにかかるペプチドを結合させることにより、生理活性ペプチドを細胞内へ効率的に送達することが可能になることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
［１］ 下記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される配列を有することを特徴とする細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
Ｘ－（Ａ－Ｂ－Ｃ）l－（Ｄ）m－（Ａｒｇ）n ・・・ （Ｉ）
Ｘ－（Ａｒｇ）n－（Ｄ）m－（Ａ－Ｂ－Ｃ）l ・・・ （ＩＩ）
［式中、
Ｘは生理活性ペプチドであり、
Ａ、ＢおよびＣは、独立して、アラニン、２－メチルアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択される脂肪族アミノ酸であり、
Ｄは任意のアミノ酸であり、
ｌは、１以上、４以下の整数であり、
ｍは、０以上、５以下の整数であり、
ｌが１のとき、ｎは８以上の整数であり、
ｌが２のとき、ｎは６以上の整数であり、
ｌが３のとき、ｎは４以上の整数であり、
ｌが４のとき、ｎは４以上の整数である。］
［２］ ＡおよびＢがロイシンである上記［１］に記載の細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
［３］ Ｄがグリシンである上記［１］または［２］に記載の細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
［４］ Ｃが２－メチルアラニンである上記［１］～［３］のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチド。
［５］ 生理活性ペプチドが環状化されたものである上記［１］～［４］のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
［６］ Ｃ末端がアミド化されている上記［１］～［５］のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチド。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドは、優れた細胞膜透過性能を有することから、生理活性物質を細胞内へ効率的に送達することができる。よって本発明に係る細胞膜透過性ペプチドは、優れた分子標的薬となり得ることから、産業上非常に優れている。
図１は、様々なペプチドコンジュゲートの細胞膜透過性試験によって得られた蛍光強度比の対数値を示すグラフである。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドに含まれる生理活性ペプチドは、細胞内へ送達すべきものであり、細胞内で何らかの生理的作用を示すものであれば特に制限されない。かかる生理活性ペプチドは、細胞内に送達されるべきものであることから、生理活性ペプチドを構成するアミノ酸残基数としては、４以上、２０以下が好ましい。生理活性ペプチドの中には、アミノ酸残基数が４であっても生理活性を示すものがある。また、当該アミノ酸残基数が２０以下であれば、より確実に細胞内に送達され得る。当該アミノ酸残基数としては、５以上、１５以下がより好ましい。
生理活性ペプチドは、細胞膜透過促進ペプチド、即ち（Ａ－Ｂ－Ｃ）l－（Ｄ）m－（Ａｒｇ）nまたは（Ａｒｇ）n－（Ｄ）m－（Ａ－Ｂ－Ｃ）lと結合するためのリンカーを有していてもよい。リンカーは、アミノ酸残基やペプチドの他、一般的なリンカー基であってもよい。かかるリンカー基としては、例えば、特に制限されるものではないが、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（－ＮＨ－）、イミノ基（＞Ｃ＝Ｎ－または－Ｎ＝Ｃ＜）、エーテル基（－Ｏ－）、チオエーテル基（－Ｓ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、チオニル基（－Ｃ（＝Ｓ）－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－または－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－または－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホニル基（－Ｓ（＝Ｏ）2－）、スルホニルアミド基（－ＮＨ－Ｓ（＝Ｏ）2－および－Ｓ（＝Ｏ）2－ＮＨ－）、並びにこれら基が２以上結合して形成された基を挙げることができる。上記基が２以上結合してリンカー基を形成する場合の結合数としては、１０以下または５以下が好ましく、３以下がより好ましい。上記基が２以上結合して形成されたリンカー基としては、例えば、アミノ基、イミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、スルホキシド基、スルホニル基、および／またはスルホニルアミド基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。また、リンカーがペプチドである場合、リンカーを形成するアミノ酸残基の数としては１以上、２０以下が好ましい。また、当該リンカーペプチドは、生理活性ペプチドの活性に影響を与えないものであることが好ましい。リンカーペプチドとしては、ＧＳリンカーやＧＧＳリンカーを挙げることができる。ＧＧＳリンカーは、ＧＧＳ配列が１回以上、６回以下程度繰り返される配列からなる。一方、ＧＳリンカーは、ＧＧＧＧＳ配列が１回以上、６回以下程度、特に３回繰り返される配列である。
生理活性ペプチドは、可能であれば環状化してもよい。環状化により生体内においてプロテアーゼなどによる攻撃を受け難くなり安定化する他、細胞膜透過性がより一層向上する可能性もある。環状化には、生理活性ペプチドに含まれるアミノ酸残基の側鎖反応性基を利用すればよい。側鎖反応性基としては、例えば、ＳｅｒやＴｈｒの水酸基、Ｃｙｓのチオール基、ＡｓｐやＧｌｕのカルボキシ基、Ｌｙｓのアミノ基を挙げることがでる。
生理活性ペプチドの環状化のための架橋化合物としては、上記側鎖反応性基と反応する反応性基を複数有する化合物を用いればよい。反応性基の数としては２が好ましい。当該反応性基としては、カルボキシ基、活性エステル基、酸クロライド基、酸ブロマイド基、ハロゲノ基、エポキシ基、水酸基、アミノ基などを挙げることができる。環状化の際には、反応を促進するために塩基や縮合剤などを添加してもよい。
架橋化合物における複数の反応性基を連結するリンカー基としては、生理活性ペプチドとＮ－末端側部とを結合するための上記リンカー基と同様のものを挙げることができる。当該リンカー基の長さは、環状化に利用するアミノ酸残基間の残基数や、所望の環の大きさなどにより適宜調整すればよい。
生理活性ペプチドを架橋するための架橋化合物としては、例えば、以下の化合物を挙げることができる。
Figure 0007489319000001
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドのＮ末端側は、－（Ａ－Ｂ－Ｃ）l－（Ｄ）m－（Ａｒｇ）nまたは－（Ａｒｇ）n－（Ｄ）m－（Ａ－Ｂ－Ｃ）lであり、これらペプチドは、生理活性ペプチドの細胞膜透過を促進する機能を有する。以下、これらペプチドを、便宜上、「細胞膜透過促進ペプチド」という場合がある。
細胞膜透過促進ペプチドにおいて、Ａ～Ｃは、独立して、アラニン、２－メチルアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択される脂肪族アミノ酸である。ＡおよびＢとしてはロイシンが好ましく、Ｃとしては、アラニンまたは２－メチルアラニン（２－アミノイソ酪酸）が好ましく、２－メチルアラニンがより好ましい。
［Ａｒｇ］単位は、従来、細胞膜透過性を有するものとして知られている。本発明においては、［Ａｒｇ］単位に加えて少なくとも［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位を用いることにより、［Ａｒｇ］単位単独の場合に比べて細胞膜透過性を顕著に改善している。［Ａｒｇ］単位の数、即ちｎは、［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位の数にもよるが、４以上である。［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位との関係で、［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位が少ないほど［Ａｒｇ］単位は多いことが好ましい。具体的には、［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位の数であるｌが１のときｎとしては８以上の整数が好ましく、ｌが２のときｎとしては６以上の整数が好ましく、ｌが３または４のときｎとしては４以上の整数が好ましい。［Ａｒｇ］単位の数の上限は特に制限されないが、例えば１６以下とすることができ、１４以下または１２以下が好ましく、１０以下がより好ましい。
細胞膜透過促進ペプチドにおいて［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位は、細胞膜透過性にとり極めて重要な単位である。本発明者らの実験的知見によれば、オリゴアルギニンに［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位を１つ加えたのみでも、細胞膜透過性は顕著に向上する。その理由は必ずしも明らかではないが、［Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｉｂ］の繰り返し配列はヘリックス構造をとることが知られているため、当該単位の二次構造が細胞膜透過性の向上に寄与している可能性がある。［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位の数、即ちｌは、１以上、４以下である。本発明者らによる実験的知見によれば、［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位が無い場合には、ペプチドの細胞膜透過性能は全く十分ではない。一方、［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位が過剰であると、ペプチドの水溶性が低下して取扱い難くなる可能性があり得るため、ｌとしては４以下がより好ましい。
細胞膜透過促進ペプチドにおいて［Ｄ］単位は、主に［Ａｒｇ］単位と［Ａ－Ｂ－Ｃ］単位を結合するリンカーの役割を有する。Ｄは任意のアミノ酸であり、例えば、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸；Ｐｒｏ；Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸を挙げることができ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、分枝アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、含硫アミノ酸、酸アミドアミノ酸から選択される中性アミノ酸が好ましく、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸がより好ましく、Ｇｌｙがより更に好ましい。［Ｄ］単位の数、即ちｍは、０以上、５以下である。ｍとしては１以上が好ましく、２以上がより好ましく、また、４以下が好ましく、３以下がより好ましい。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドにおいては、（Ａ－Ｂ－Ｃ）lの位置と（Ａｒｇ）nの位置は、互いに入れ替わっていてもよいが、式（Ｉ）で表される配列がより好ましい。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される配列を有する限り、例えば、Ｎ末端またはＣ末端に別のペプチドが結合していてもよい。末端に付加される別のペプチドは、本発明ペプチドの細胞膜透過性を阻害しない限り特に制限されないが、例えば、そのアミノ酸残基数としては１以上、１０以下が好ましく、５以下がより好ましい。本発明に係る細胞膜透過性ペプチドの配列は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される配列のみからなることが好ましく、式（Ｉ）で表される配列のみからなることがより好ましい。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端は、化学的に修飾されていてもよい。例えば、Ｃ末端は－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ-であってもよいし、アミド化（－ＣＯＮＨ2）、アルキルアミド化（－ＣＯＮＨＲ）、またはエステル化（－ＣＯＯＲ）されていてもよく、また、Ｎ末端は－ＮＨ2または－ＮＨ3 +であってもよいし、アシル化（－ＮＨＣＯＲ）されていてもよい。Ｒは、Ｃ1-6アルキル基を示す。特に、Ｃ末端はアミド化することが好ましい。Ｃ末端をアミド化することで、エキソプロテアーゼに対する分解耐性が向上したり、また、ペプチド合成時における分子内縮合反応や分子間縮合反応を抑制できる。
「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドは、塩の形態であってもよい。かかる塩は、薬学上許容されるものが好ましい。かかる塩を構成するカウンターカチオンとしては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン（ＮＨ4 +）、有機塩基イオン、塩基性アミノ酸イオンを挙げることができ、カウンターアニオンとしては、例えば、無機酸イオン、有機酸イオン、および酸性アミノ酸イオンを挙げることができる。
金属塩を構成する金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどのアルカリ金属イオン；カルシウムイオン、バリウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン；マグネシウムイオンなどが挙げられる。有機塩基塩を構成する有機塩基としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミンが挙げられる。塩基性アミノ酸塩を構成する塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。
無機酸塩を構成する無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などが挙げられる。有機酸塩を構成する有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などが挙げられる。酸性アミノ酸塩を構成する酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドは常法により製造することができるが、総アミノ酸残基数が比較的少ないため、例えば固相合成法により製造することができる。具体的には、細胞膜透過性ペプチドのアミノ酸配列をデザインした後、固体樹脂にアミノ基と必要に応じて側鎖反応性基が保護されたＣ末端アミノ酸残基を結合し、以後、アミノ基の脱保護と次のアミノ酸残基の結合を繰り返し、最後にペプチドの固体樹脂からの切り離しと脱保護を行う。また、各反応の後には洗浄を行う。
生理活性ペプチドを環状化する場合には、ペプチドが固体樹脂に結合された状態で環状化してもよいし、ペプチドを固体樹脂から切り離してから環状化してもよいが、製造工程数がより少ないことからペプチドを固体樹脂から切り離してから生理活性ペプチドを環状化することが好ましい。なお、細胞膜透過促進ペプチドは、側鎖に反応性基を有さないアミノ酸残基で構成されているため、原則として架橋化合物により生理活性ペプチドが環状化されると考えられる。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドにより、生理活性ペプチドが細胞膜を透過して細胞内まで送達されるため、副作用が比較的少なく且つ生理活性ペプチドの作用効果が効果的に発揮されると考えられる。本発明の細胞膜透過性ペプチドはペプチドであることから、注射投与されることが好ましい。
本発明の細胞膜透過性ペプチドを含む注射剤の溶媒としては、水が好ましい。更に、本発明ペプチドの水溶性によっては、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの水混和性有機溶媒を含んでいてもよい。その他、塩化ナトリウムなどの塩、緩衝成分、防腐剤などの添加成分を含んでいてもよい。勿論ではあるが、注射剤は等張液または略等張液である必要がある。
本発明に係る細胞膜透過性ペプチドの投与量は、投与されるべき患者の重篤度、年齢、性別、体重、症状などにより適宜調整すればよい。例えば、投与量を０．００１ｍｇ／ｋｇ／日以上、１００ｍｇ／ｋｇ／日以下、好ましくは０．００５ｍｇ／ｋｇ／日以上、５０ｍｇ／ｋｇ／日以下の範囲で調整することができる。
本願は、２０１８年９月２６日に出願された日本国特許出願第２０１８－１８０１３０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年９月２６日に出願された日本国特許出願第２０１８－１８０１３０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
実施例１～９，比較例１～６： ペプチドコンジュゲートの合成
マイクロウェーブを用いた固相合成法により、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドコンジュゲートのペプチド鎖部分を合成した。
Ｆ－Ａｈｘ－（カーゴペプチド）－（Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｉｂ）l－（Ｇｌｙ）m－（Ａｒｇ）n－ＮＨ2
［式中、Ｆは蛍光基であるフルオロセイン含有基を示し、Ａｈｘは６－アミノヘキサン酸を示し、Ａｉｂは２－アミノイソ酪酸（２－メチルアラニン）を示し、カーゴペプチドは以下の構造を有する。］
Figure 0007489319000002
Figure 0007489319000003
実施例８（配列番号１４）： Ｆ－Ａｈｘ－（カーゴペプチド）－（Ａｒｇ）9－（Ｇｌｙ）3－（Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｉｂ）－ＮＨ2
実施例９（配列番号１５）： Ｆ－Ａｈｘ－（カーゴペプチド）－（Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ）－（Ｇｌｙ）3－（Ａｒｇ）9－ＮＨ2
ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）＝９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比）の混合溶液に３時間浸漬し、ペプチドを樹脂から切り出した。
得られたペプチドをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と水の混合溶媒に溶解し、１，３－ジブロモアセトン（１．５当量）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３．０当量）で１時間処理することにより、カーゴペプチドを環状化した。
ペプチドを反応溶液から逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥した。次いで、ＤＭＦ中でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ，１．５当量）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３．０当量）で４時間処理してＮ末端を蛍光標識した後、逆相ＨＰＬＣにより精製することにより、実施例１～９および比較例１～６のペプチドコンジュゲートを合成した。
試験例１： 細胞膜透過能評価
ＨｅＬａ細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）を、実施例１～９または比較例１～６のペプチドコンジュゲート２μＭを含む培養液中、３７℃で２時間培養した。次いで、細胞を回収し、ヨウ化プロピジウム溶液で染色後、フローサイトメーターで蛍光強度を測定し、下記式によって比較例２に対する蛍光強度比を算出した。結果を図１と表２に示す。
蛍光強度比＝（Ｆn－Ｆ1）／（Ｆ2－Ｆ1）
Ｆn： 被検化合物の蛍光強度最頻値
Ｆ1： 比較例１の被検化合物の蛍光強度最頻値
Ｆ2： 比較例２の被検化合物の蛍光強度最頻値
Figure 0007489319000004
図１と表２に示される結果の通り、培養２時間後の比較例２に対する蛍光強度を比較した結果、本発明に係る実施例１～９のペプチドコンジュゲートは、従来、細胞膜透過性を有するとされている［Ａｒｇ］単位鎖を有する一方で［Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｉｂ］単位を有さない比較例２よりも、細胞膜透過性能に優れることが実証された。

Claims (6)

  1. 下記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される配列を有することを特徴とする細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
    Ｘ－（Ａ－Ｂ－Ｃ）l－（Ｄ）m－（Ａｒｇ）n ・・・ （Ｉ）
    Ｘ－（Ａｒｇ）n－（Ｄ）m－（Ａ－Ｂ－Ｃ）l ・・・ （ＩＩ）
    ［式中、
    Ｘは生理活性ペプチドであり、
    ＡおよびＢはロイシンであり、
    Ｃはアラニンまたは２－メチルアラニンであり、
    Ｄは、グリシン、アラニン、分枝アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、含硫アミノ酸、酸アミドアミノ酸から選択される中性アミノ酸であり、
    ｌは、１であり、
    ｍは、０以上、５以下の整数であり、
    ｎは８以上の整数である。］
  2. Ｄが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸である請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
  3. Ｄがグリシンである請求項１または２に記載の細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
  4. Ｃが２－メチルアラニンである請求項１～３のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチド。
  5. 生理活性ペプチドが環状化されたものである請求項１～４のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチドまたはその塩。
  6. Ｃ末端がアミド化されている請求項１～５のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチド。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006514602A (ja) 2002-06-18 2006-05-11 シーイーピーイーピー エービー 細胞侵入ペプチド
JP2013531988A (ja) 2010-06-14 2013-08-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 細胞透過性ペプチドおよびその使用
JP2015522264A (ja) 2012-06-26 2015-08-06 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 細胞透過性ペプチドおよび細胞透過性ペプチドを同定する方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0656950B1 (en) 1992-08-21 1998-11-04 Biogen, Inc. Tat-derived transport polypeptides
AU766489B2 (en) 1998-11-13 2003-10-16 Cyclacel Limited Transport vectors
JP2006169242A (ja) * 2004-11-22 2006-06-29 Kobe Univ がん細胞の細胞分裂期におけるカスパーゼの活性化と、カスパーゼ阻害物質の抗がん剤などへの利用
WO2011020188A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 University Of Waterloo Peptide sequences and peptide-mediated sirna delivery
WO2015069586A2 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Dual molecular delivery of oligonucleotides and peptide containing conjugates
JP7013626B2 (ja) * 2018-01-05 2022-02-01 国立医薬品食品衛生研究所長 細胞膜透過ペプチド、構築物、及び、カーゴ分子を細胞内に輸送する方法
CN109517071A (zh) * 2018-11-12 2019-03-26 华中科技大学 穿膜肽及其包覆疏水分子的粒子和粒子的制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006514602A (ja) 2002-06-18 2006-05-11 シーイーピーイーピー エービー 細胞侵入ペプチド
JP2013531988A (ja) 2010-06-14 2013-08-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 細胞透過性ペプチドおよびその使用
JP2015522264A (ja) 2012-06-26 2015-08-06 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 細胞透過性ペプチドおよび細胞透過性ペプチドを同定する方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MISAWA T et al.，Development of Helix-Stabilized Amphipathic Cell-Penetrating Peptides for siRNA Delivery，Journal of Peptide Science, 35th European Peptide Symposium，2018年08月31日，Vol.24, Supplement 2，p.S169 Abstract No.P247,文献全体
三澤隆史ほか，親水性分子を細胞内導入を志向した膜透過生ペプチドの開発，日本薬学会第１３７年会要旨集，2017年03月05日，Abstract No.26U-am13,文献全体

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