JP7043425B2 - シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法 - Google Patents

シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
米国特許法施行規則１．５３（ｂ）条の下に出願されたこの正規の出願は、米国特許法１１９（ｅ）条の下、２０１６年６月６日出願の米国仮特許出願第６２／３４６０２４号の利益を主張し、その全体が参照によって組み込まれる。
本発明の分野は一般に、１つ以上のシルベストロール分子に直接コンジュゲートされた抗体を含む、抗体－薬物コンジュゲートに関する。
シルベストロール及びシルベストロール誘導体は、抗菌剤及び抗腫瘍剤のファミリーを指す（Ｌｕｃａｓ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ，１１３，４６５６－４６６６、Ａｌｉｎａｒｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８，４６００－４６１１、Ｃｅｎｃｉｃ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，４，ｅ５２２３、Ｈｗａｎｇ，Ｂ．Ｙ．ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６９：３３５０－３３５８、ＵＳ６７１００７５）。シルベストロール及び類似体は、強力かつ選択的なタンパク質合成阻害剤であり、それらの抗過剰増殖特性について研究されている（Ｌｉｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５（２０）：８８５９－８８７８、ＷＯ２０１５／０８５２２１、ＷＯ２０１３／０１６６５８、ＷＯ２００４／０４１８１２、ＵＳ８１３７５０９、ＵＳ８４０４０８８、ＷＯ２００６／００７６３４、ＵＳ７８１６５４４）。
シルベストロール（ＣＡＳ：６９７２３５－３８－４）は、メチル（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレートと称され、以下の構造を有する。
Figure 0007043425000001
ＡＤＣまたは免疫コンジュゲートとしても知られる抗体－薬物コンジュゲートは、強力な細胞毒性薬の標的を抗原発現腫瘍細胞に向け、それによりそれらの抗腫瘍活性を増強することによって、抗体と細胞毒性薬との両方の特性を組み合わせる標的化学療法分子である。所与の標的抗原のための抗体－薬物コンジュゲート開発の成功は、抗体の選択、リンカーの安定性、細胞毒性薬の効力、及びリンカー－薬物を抗体にコンジュゲートする様式を最適化することに依存する。より具体的には、選択的な抗体－薬物コンジュゲートは、（ｉ）抗体が標的抗原に対して十分な特異性を保持し、薬物の有効性が維持される、抗体－薬物コンジュゲート形成方法、（ｉｉ）血液中での薬物放出、及び非標的細胞への随伴する損傷を制限するのに十分な抗体－薬物コンジュゲートの安定性、（ｉｉｉ）治療細胞内抗体－薬物コンジュゲート濃度を達成するのに十分な細胞膜輸送効率（エンドサイトーシス）、（ｉｖ）治療薬物濃度を達成するのに十分な抗体－薬物コンジュゲートからの十分な細胞内薬物放出、ならびに（ｖ）ナノモルまたはナノモル以下の量の薬物細胞毒性のうちの少なくとも１つ以上を特徴とする。
抗体－薬物コンジュゲートによって、腫瘍に対して薬物部分の送達を標的とすることが可能となり、かついくつかの実施形態において、非コンジュゲート薬物の全身投与が、正常な細胞にとって許容できないレベルの毒性をもたらし得る場合に、腫瘍内の細胞内蓄積が可能となる（Ｐｏｌａｋｉｓ Ｐ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ５：３８２－３８７）。
抗体－薬物コンジュゲートは、強力な細胞毒性薬の標的を抗原発現腫瘍細胞に向け（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ９：９８２－１００４）、それにより有効性を最大化し、オフターゲット毒性を最小化することで治療指数を増強することによって、抗体及び細胞毒性薬の両方の特性を組み合わせる標的化学療法分子である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｅｎｔｅｒ Ｐ．Ｄ．（２００８）Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．１４（３）：１５４－１６９、Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８－１０７）。
操作されたシステインがコンジュゲーションに利用可能である部位でのシステイン置換を通して抗体への薬物の部位特異的コンジュゲーションを提供するが、免疫グロブリンの折り畳み及び組み立てを乱さないか、または抗原結合及びエフェクター機能を改変しない、抗体が開発されている（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５－９３２、Ｄｏｒｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ１１４（１３）：２７２１－２７２９、ＵＳ７５２１５４１、ＵＳ７７２３４８５、ＷＯ２００９／０５２２４９）。その後、これらのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を操作されたシステインチオール基を通して細胞毒性薬にコンジュゲートして、均質な化学量論（例えば、単一の操作されたシステイン部位を有する抗体中、１抗体当たり最大２つの薬物）を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲート（ＴＤＣ）を得ることができる。異なる抗原に対する複数の抗体での研究により、ＴＤＣが、異種移植片モデルでは従来の抗体－薬物コンジュゲートと同程度に効果的であり、関連する前臨床モデルではより高い用量で許容されることが示されている。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、抗体の異なる位置（例えば、軽鎖－Ｆａｂ、重鎖－Ｆａｂ、及び重鎖－Ｆｃ内の特定のアミノ酸位（すなわち、部位））で薬物と結合するように操作されている。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のインビトロ及びインビボでの安定性、有効性、ならびにＰＫ特性は、それらの均質性及び細胞毒性薬に対する部位特異的コンジュゲーションのために、従来の抗体－薬物コンジュゲートに勝る固有の利点を提供する。
抗体－薬物コンジュゲートの設計、調製、及び使用には、依然として他の制限または困難が存在する。例えば、いくつかのリンカーは、血流中で不安定であり、それにより、標的細胞内での内在化前に許容できない量の薬物を放出する可能性がある（Ｋｈｏｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ７（１３）：１６３３－１６４８）。他のリンカーは、血流中では安定性を提供し得るが、細胞内放出の有効性に悪影響が及ぼされ得る。所望の細胞内放出を提供するリンカーは典型的には、血流中での安定性に乏しい。換言すると、血流安定性及び細胞内放出は典型的には、反比例関係にある。第２に、標準的なコンジュゲーションプロセスにおいて、抗体担体タンパク質上に負荷された薬物部分（薬物負荷）の量、コンジュゲーション反応において形成される凝集体の量、及び得ることができる最終精製コンジュゲートの収率は、相互に関係する。例えば、凝集体の形成は一般に、担体－抗体にコンジュゲートされる薬物部分及びその誘導体の当量数に正相関する。高薬物負荷下では、形成された凝集体は、治療用途では除去されなければならない。結果として、薬物負荷媒介凝集体形成は、抗体－薬物コンジュゲートの収率を減少させ、プロセスの規模拡大を困難にする場合がある。したがって、最適化された安全性及び有効性を提供する、改善された効果的な抗体－薬物コンジュゲートに対する継続的な必要性が存在する。
本開示は一般に、コンジュゲーションによって１つ以上のシルベストロール誘導体に連結した抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートを対象とする。本開示は、離脱基を含むシルベストロール誘導体中間体組成物を更に対象とする。そのような中間体組成物は、抗体が、リンカーまたは連結部分を通してシルベストロール誘導体に共有結合され得る、抗体－薬物コンジュゲートの形成に好適な基質である。本開示は、疾病、具体的にはがんの治療における、そのような抗体－シルベストロールコンジュゲートの使用を更に対象とする。本明細書で使用される場合、別段明記されない限り、シルベストロールは、本開示によって包含されるシルベストロール誘導体化合物を指す。
本発明は、式Ｉａ及びＩｂから選択される、リンカーを通してシルベストロール薬物部分に共有結合した抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート化合物、
Figure 0007043425000002
またはその薬学的に許容される塩であって、
式中、
Ｒａは、ＣＨ３Ｏ、ＣＮ、ＮＯ２、及びＣｌから選択される基であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｐは、１～８の整数であり、
Ａｂは、１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体である、抗体－薬物コンジュゲート化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
本発明は、式Ｉａ及びＩｂから選択される抗体－薬物コンジュゲート化合物と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。
本発明は、哺乳動物におけるがんの治療のための医薬品の製造における、式Ｉａ及びＩｂから選択される抗体－薬物コンジュゲート化合物の使用を含む。
本発明は、式Ｉａ及びＩｂから選択される抗体－薬物コンジュゲート化合物を含む薬学的組成物を患者に投与することを含む、がんを治療する方法を含む。
本発明は、がんを治療するための方法における使用のための、式Ｉａ及びＩｂから選択される抗体－薬物コンジュゲート化合物を含む。
本発明は、式Ｉａ及びＩｂから選択される抗体－薬物コンジュゲート化合物を含む薬学的組成物と、容器と、薬学的組成物ががんを治療するために使用され得ることを示す製造品またはラベルとを含む。
本発明は、式ＩＩ
Figure 0007043425000003
のシルベストロール－リンカー中間体化合物であって、
式中、
Ｒａは、ＣＨ３Ｏ、ＣＮ、ＮＯ２、及びＣｌから選択される基であり、
Ｒ１は、－ＯＣＨ３及びＬ－Ｘから選択され、
Ｒ２は、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ及びＬ－Ｘから選択され、
Ｌは、リンカーであり、
Ｘは、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ－トルエンスルホン酸、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基を含む、シルベストロール－リンカー中間体化合物を含む。
本発明は、式Ｉａ及びＩｂから選択される抗体－薬物コンジュゲート化合物を作製する方法であって、抗体を、式ＩＩのシルベストロール－リンカー中間体化合物と反応させることを含む、方法を含む。
チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ：Ａ１４０Ｃアミノシルベストロール類似体（ＡＤＣ－１０５）、非標的対照、及びチオＨｕ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＨＣ：Ａ１４０Ｃアミノシルベストロール類似体（ＡＤＣ－１０６）で処理した、ＳＫ－ＢＲ－３細胞のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。 チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ：Ａ１４０Ｃアミノシルベストロール類似体（ＡＤＣ－１０５）、非標的対照、及びチオＨｕ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＨＣ：Ａ１４０Ｃアミノシルベストロール類似体（ＡＤＣ－１０６）で処理した、ＫＰＬ－４細胞のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。 チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）及びチオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度）（ＡＤＣ－１０４）で処理した、Ｂｊａｂ－ｌｕｃ細胞のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。 チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）及びチオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）（６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度）で処理した、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。 ＣＢ－１７ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスにおけるＢｊａｂ－ｌｕｃヒト異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。 １）ビヒクル（ＨｉｓＡｃ ２０ｍＭ、Ｓｕｃｒ ２４０ｍＭ、ＴＷ－２０ ０．０２％（ｐＨ５．５））、１００ｕＬ、静脈内に一度 ２）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ３）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ４）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度、 ５）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ６）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ｓｃｉｄベージュマウスにおけるＫＰＬ４ヒト乳腺異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。 １）ビヒクル（ＨｉｓＡｃ ２０ｍＭ、Ｓｕｃｒ ２４０ｍＭ、ＴＷ－２０ ０．０２％（ｐＨ５．５））、１００ｕＬ、静脈内に一度 ２）シルベストロール、０．０９ｍｇ／ｋｇ、静脈内に一度 ３）シルベストロール、１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内ｑｄＸ５で２週間 ４）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ５）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ６）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ７）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ８）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ＣＢ－１７ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスにおけるＢｊａｂ－ｌｕｃヒト異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。 １）ビヒクル（ヒスチジン緩衝液番号８）、１００μＬ、静脈内に一度 ２）チオＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ３）チオＨｅｒ２（７Ｃ２）ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ４）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ５）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ６）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ７）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ８）チオＨｅｒ２（７Ｃ２）ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０６）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ９）チオＨｅｒ２（７Ｃ２）ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０６）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ＣＢ－１７ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスにおけるＢｊａｂ－ｌｕｃヒト異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。 １）ビヒクル（ヒスチジン緩衝液番号８）、１００ｕＬ、静脈内に一度 ２）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１１０）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ３）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１１０）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ４）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１１０）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ５）チオＨｕ抗ＬＹ６Ｅ ９Ｂ１２ｖ１２ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０９）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ６）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、０．３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ７）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ８）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 ９）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度 １０）チオＨｕ抗ＬＹ６Ｅ ９Ｂ１２ｖ１２ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０７）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
これより本発明の特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の構造及び式に例証されている。本発明は、列挙される実施形態と組み合わせて説明されるが、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、全ての代替形、修正形、及び同等物を網羅することが意図されており、それらは、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る。
当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似または同等である多くの方法及び材料を理解するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されるものではない。
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有し、それらは、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋと一致する。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望される生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を具体的に網羅する（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであり得るか、または他の種に由来するものであり得る。抗体は、特定の抗原を認識し、それに結合することができる、免疫系によって生成されるタンパク質である。（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。標的抗原は一般に、複数の抗体のＣＤＲによって認識されるエピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、２つ以上の対応する抗体を有し得る。抗体は、完全長免疫グロブリン分子、または完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、対象となる標的抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を含み、そのような標的としては、自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生するがん細胞（複数可）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。しかしながら、一態様において、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、またはウサギ起源のものである。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部分、一般にはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、ミニボディ（Ｏｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌ．１７（４）：３１５－３２３）、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及びがん細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原に免疫特異的に結合する、本明細書に記載されるもののうちのいずれかのエピトープ結合断片、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向されている。更に、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体が混入することなく合成され得るという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組み換えＤＮＡ法（例えば、ＵＳ４８１６５６７、ＵＳ５８０７７１５を参照されたい）によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７に説明される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。
本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または同種である一方で、鎖（複数可）の残りが別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体の断片が特に含まれるが、これは、それらが所望される生物学的活性を呈する限りにおいてである（ＵＳ４８１６５６７、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５）。本明細書において対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が挙げられる。
本明細書における「無傷抗体」は、ＶＬ及びＶＨドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒトの天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。無傷抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得、この機能は、抗体のＦｃ定常領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、ならびにＢ細胞受容体及びＢＣＲなどの細胞表面受容体の下方制御が挙げられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、無傷抗体には、異なる「クラス」が割り当てられ得る。無傷免疫グロブリン抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。Ｉｇの形態は、ヒンジ修飾またはヒンジなしの形態を含む（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３－４０９０、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６－７２５６、ＵＳ２００５／００４８５７２、ＵＳ２００４／０２２９３１０）。
「システイン操作された抗体」または「システイン操作された抗体バリアント」は、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている抗体である。本開示に従って、システイン操作された抗体のチオール基（複数可）を、シルベストロールにコンジュゲートして、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（すなわち、本開示に従って、薬物がシルベストロール誘導体であるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲート（ＴＤＣ））を形成することができる。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の到達可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の到達可能な部位に位置付けられ、本明細書に更に記載されるように、それを使用して、抗体を薬物部分にコンジュゲートして、免疫コンジュゲートを作製することができる。例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、軽鎖内での非システイン天然残基のシステインへの単一の変異（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによるＧ６４Ｃ、Ｋ１４９Ｃ、もしくはＲ１４２Ｃ）または重鎖内でのもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによるＤ１０１ＣもしくはＶ１８４ＣもしくはＴ２０５Ｃ）を有する抗体であり得る。具体的な例において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、重鎖または軽鎖のいずれかに単一のシステイン変異を有し、そのために各完全長抗体（すなわち、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する抗体）は、２つの操作されたシステイン残基を有することになる。システイン操作された抗体及び調製方法は、ＵＳ２０１２／０１２１６１５Ａ１（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）によって開示されている。
「がん」及び「がん性」という用語は、未制御の細胞成長／増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的病態を指すか、または説明する。がんの例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、ならびに白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性骨髄増殖性障害、血小板性白血病、前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ｐｒｅ－Ｂ－ＡＬＬ）、前駆体Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ｐｒｅＴ－ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肥満細胞疾患、肥満細胞性白血病、肥満細胞肉腫、骨髄性肉腫、リンパ性白血病、及び未分化白血病が挙げられる。いくつかの実施形態において、がんは、骨髄性白血病である。いくつかの実施形態において、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。異なるクラスの免役グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投与量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。いくつかの実施形態において、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位は、ヒドロキシルラジカルフットプリント法によって決定される。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、存在しない場合もある。本明細書において別段明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）内でＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４の順序で出現する。
「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書において、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために互換的に使用される。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を所有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるような下位群である。一実施形態において、ＶＬでは、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記参照）にあるような下位群カッパＩである。一実施形態において、ＶＨでは、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記参照）にあるような下位群ＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ９１（２００７）を参照されたい。）単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入されている宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが動作可能に連結している核酸の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である、及び／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。ＨＶＲは一般に、超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有する、及び／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）において生じる。（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）。）例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４～３４、Ｌ２の５０～５６、Ｌ３の８９～９７、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～６５、及びＨ３の９５～１０２において生じる。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）。）ＶＨ内のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮－ＣＤＲ、またはａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に収容される。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基３１～３４（Ｌ１）、５０～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～５８（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい。）別段示されない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔら（上記参照）に従って番号付けされる。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
「単離された抗体」は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
「天然抗体」は、異なる構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられ得る。
「添付文書」という用語は、そのような治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症、及び／またはその使用に関する警告についての情報を含有する、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる指示書を指すために使用される。
基準ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、候補配列内のアミノ酸残基が、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一であるパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記述され、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定されており、変動しない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下、１００×分数Ｘ／Ｙのように計算され、式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへのアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡへのアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解されるだろう。別段具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「治療する」及び「治療」という用語は、治療的処置及び予防的または防止的処置の両方を指し、その目的は、所望されない生理学的変化または障害（がんの発症または伝播など）を予防または減速（緩和）することである。本発明の目的のために、有益または所望の臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の病態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患病態の緩和または緩解、及び（部分的か完全かに関わらず）寛解が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていなかった場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。治療を必要とする者としては、病態もしくは障害を既に有する者、及び病態もしくは障害を有する傾向にある者、または病態もしくは障害を予防する必要がある者が挙げられる。
「治療有効量」という用語は、哺乳動物において疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。がんの場合、治療有効量の薬物は、がん細胞の数を低下、腫瘍サイズを低下、末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）、腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）、腫瘍成長をある程度阻害、及び／またはがんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。薬物が、既存のがん細胞の成長を予防し得る、及び／またはそれらを殺滅し得る限り、この薬物は、細胞増殖抑制性及び／または細胞毒性であり得る。がん療法に関して、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）の評価及び／または奏効率（ＲＲ）の決定によって、測定することができる。
「がん」及び「がん性」という用語は、典型的に未制御の細胞成長を特徴とする哺乳動物における生理学的病態を指すか、または説明する。「腫瘍」は、１つ以上のがん性細胞を含む。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病、またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮性扁平上皮細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「離脱基」という用語は、本明細書に記載される基に関与する化学反応の過程で離れる、スルフヒドリル部分を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１～１２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ１２）の飽和した直鎖または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、アルキルラジカルは、任意で、以下に記載される１つ以上の置換基で独立して置換されていてもよい。別の実施形態において、アルキルラジカルは、１～８個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ８）、または１～６個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ６）である。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ、－ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、－ＣＨ２ＣＨ３）、１－プロピル（ｎ－Ｐｒ、ｎ－プロピル、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２－プロピル（ｉ－Ｐｒ、ｉ－プロピル、－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１－ブチル（ｎ－Ｂｕ、ｎ－ブチル、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２－メチル－１－プロピル（ｉ－Ｂｕ、ｉ－ブチル、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２－ブチル（ｓ－Ｂｕ、ｓ－ブチル、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２－メチル－２－プロピル（ｔ－Ｂｕ、ｔ－ブチル、－Ｃ（ＣＨ３）３）、１－ペンチル（ｎ－ペンチル、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２－メチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３－メチル－２－ブチル（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３－メチル－１－ブチル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２－メチル－１－ブチル（－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１－ヘキシル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２－ヘキシル（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３－ヘキシル（－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２－メチル－２－ペンチル（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３－メチル－２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４－メチル－２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３－メチル－３－ペンチル（－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２－メチル－３－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３－ジメチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３－ジメチル－２－ブチル（－ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３、１－ヘプチル、及び１－オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルキレン」という用語は、１～１２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ１２）の飽和した直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、アルキレンラジカルは、任意で、以下に記載される１つ以上の置換基で独立して置換されていてもよい。別の実施形態において、アルキレンラジカルは、１～８個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ８）、または１～６個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ６）である。アルキレン基の例としては、メチレン（－ＣＨ２－）、エチレン（－ＣＨ２ＣＨ２－）、及びプロピレン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）などが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素－炭素ｓｐ２二重結合を有する２～８個の炭素原子（Ｃ２－Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、アルケニルラジカルは、任意で、本明細書に記載される１つ以上の置換基で独立して置換されていてもよく、「シス」及び「トランス」配向、またはあるいは「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。例としては、エチレニルまたはビニル（－ＣＨ＝ＣＨ２）、及びアリル（－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）などが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルケニレン」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち炭素－炭素ｓｐ２二重結合を有する２～８個の炭素原子（Ｃ２－Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、アルケニレンラジカルは、任意で、本明細書に記載される１つ以上の置換基で独立して置換されていてもよく、「シス」及び「トランス」配向、またはあるいは「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。例としては、エチレニレンまたはビニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）、及びアリル－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－）などが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち炭素－炭素ｓｐ三重結合を有する２～８個の炭素原子（Ｃ２－Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、アルキニルラジカルは、任意で、本明細書に記載される１つ以上の置換基で独立して置換されていてもよい。例としては、エチニル（－Ｃ≡ＣＨ）、及びプロピニル（プロパルギル、－ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキニレン」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち炭素－炭素ｓｐ三重結合を有する２～８個の炭素原子（Ｃ２－Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、アルキニレンラジカルは、任意で、本明細書に記載される１つ以上の置換基で独立して置換されていてもよい。例としては、エチニレン（－Ｃ≡Ｃ－）、及びプロピニレン（プロパルギレン、－ＣＨ２Ｃ≡Ｃ－）などが挙げられるが、これらに限定されない。
「炭素環」、「カルボシクリル」、「環状炭素」、及び「シクロアルキル」という用語は、単環式環として３～１２個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ１２）または二環式環として７～１２個の炭素原子を有する一価の非芳香族の飽和環または部分的不飽和環を指す。７～１２個の原子を有する二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、もしくは［６，６］系として配置することができ、９もしくは１０個の原子を有する二環式炭素環は、ビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として、またはビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、及びビシクロ［３．２．２］ノナンなどの架橋系として配置することができる。スピロカルボシクリル部分もまた、本定義の範囲内に含まれる。スピロカルボシクリル部分の例としては、［２．２］ペンタニル、［２．３］ヘキサニル、及び［２．４］ヘプタニルが挙げられる。単環式炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１－シクロペンタ－１－エニル、１－シクロペンタ－２－エニル、１－シクロペンタ－３－エニル、シクロヘキシル、１－シクロヘキサ－１－エニル、１－シクロヘキサ－２－エニル、１－シクロヘキサ－３－エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、及びシクロドデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。カルボシクリル基は、任意で、本明細書に記載される１つ以上の置換基で独立して置換される。
本明細書で使用される場合、単独での、または別の基の一部としての「アリール」という用語は、任意で置換された同素環芳香族基、好ましくは環部分内に５～２０個の炭素、５～１０個の炭素、または５～６個の炭素を含有する単環式基または二環式基（フェニル、ビフェニル、ナフチル、置換フェニル、置換ビフェニル、または置換ナフチルを含むが、これらに限定されない）を表す。アリール部分は、任意で、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される１つ以上のヘテロ原子を含み得る。そのような複素環式芳香族は、環内に１または２個の窒素原子、１または２個の硫黄原子、１または２個の酸素原子、及びこれらの組み合わせを含み得、各ヘテロ原子は、炭素を通して分子の残りに結合する。非限定的な例示的な基としては、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、チオフェン、チオピリリウム、ピラチアジン、インドール、プリン、ベンゾイミダゾール、キノロン、及びフェノチアジンが挙げられる。非限定的な例示的な置換基としては、以下の基、アルキル、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケノキシ、アリール、アリールオキシ、アミノ、アミド、アセタール、カルバミル、カルボシクロ、シアノ、エステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロシクロ、ヒドロキシル、ケト、ケタール、ホスホ、ニトロ、及びチオのうちの１つ以上が挙げられる。
本明細書に記載される「置換」部分は、炭素以外の少なくとも１つの原子で置換されるアルキル及びアリールなどの部分であり、炭素鎖原子がヘテロ原子（窒素、酸素、ケイ素、亜リン酸、ホウ素、硫黄、またはハロゲン原子など）で置換される部分を含む。これらの置換基としては、ハロゲン、ヘテロシクロ、アルコキシ、アルケンオキシ、アルキンオキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ、ケト、アシル、アシルオキシ、ニトロ、三級アミノ、アミド、ニトロ、シアノ、チオ、スルフィネート、スルホンアミド、ケタール、アセタール、エステル、エーテルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、単独での、または別の基の一部としての「ハロゲン」という用語は、塩素、臭素、フッ素、及びヨウ素を指す。
抗体
本開示の実施形態のうちのいずれかにおいて、抗体は、ヒト化である。一実施形態において、抗体は、本開示の実施形態のいずれかにおけるようなＨＶＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを更に含む。特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、以下の変異のうちのいずれか１つを含む、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。
別の態様において、抗体は、本明細書に提供される実施形態のいずれかにおけるようなＶＨと、本明細書に提供される実施形態のいずれかにおけるようなＶＬとを含む。
本発明の更なる一態様において、本明細書の実施形態のうちのいずれかに従う抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施形態において、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、抗体は、実質的に完全長の抗体、例えば、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
更なる一態様において、本明細書の実施形態のいずれかに従う抗体は、本明細書に記載される特徴のうちのいずれかを、単独で、または組み合わせて組み込むことができる。
１．抗体親和性
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、かつ任意で、１０－１３Ｍ以上（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
一実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイによって説明されるように、対象となる抗体のＦａｂバージョン及びその抗原によって実行される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、Ｆａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、その後抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートと結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後ＰＢＳ中２重量体積％のウシ血清アルブミンで２～５時間室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］－抗原を対象となるＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ－１２の評価と一貫する）。その後、対象となるＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）継続して、平衡に達することを確実にしてもよい。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移動させる。その後、溶液を除去し、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））を用いてプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間計数する。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
別の実施形態に従うと、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－Ｔ２００、またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップによって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、供給業者の指示書に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって活性化される。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで、及び／またはＨＢＳ－Ｐ（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）で希釈した後に、５μＬ／分及び／または３０μｌ／分の流量で注入して、およそ１０の応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃、およそ２５μＬ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２版）を使用して、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時に適合することによって、計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１）。本明細書に記載される表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ－１ ｓ－１を超える場合、会合速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗－抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用して決定することができる。
２．抗体断片
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに本明細書に記載される他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたく、またＷＯ１９９３／１６１８５、ならびにＵＳ５５７１８９４及びＵＳ５５８７，５８もまた参照されたい。エピトープ残基に結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、ＵＳ５８６９０４６を参照されたい。
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む、抗体断片である。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、ＵＳ６２４８５１６を参照されたい）。
抗体断片は、本明細書に記載されるように、無傷抗体のタンパク質消化及び組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって作製され得る。
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、ＵＳ４８１６５６７及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類（サルなど）に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる一例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含み、そのＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）は、非ヒト抗体に由来し、そのＦＲ（またはそれらの部分）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むだろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体内のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ７５２７７９１、ＵＳ６９８２３２１、ＵＳ７０８７４０９、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）移植を説明）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を説明）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を説明）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを説明）に更に記載されている。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、「最良適合」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６（１９９３））、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異型）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞株フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８））、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
４．ヒト抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知である様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法に関する概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を説明）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を説明）、ＵＳ７０４１８７０（Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を説明）、ならびにＵＳ２００７／００６１９００（ＶＥＬＯＣＩＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を説明）もまた、参照されたい。そのような動物によって生成された無傷抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって更に修飾され得る。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、記載されている。（例えば、ＫｏｚｂｏｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法としては、例えば、ＵＳ７１８９８２６（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を説明）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを説明）に記載される方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージ提示ライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望されるヒト定常ドメインと組み合わされ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術が、本明細書に記載される。
５．ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、所望される活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリを生成し、所望される結合特性を保有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野において既知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）に更に記載されている。
特定のファージ提示法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローニングされ、ファージライブラリ内で無作為に組み換えられ、これがその後、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されるように抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化源に由来するライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブレパートリーは、（例えば、ヒトから）クローニングされて、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原及びまた自己抗原に対する抗体の単一源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、かつインビトロで再配置を達成することによって、合成的にも作製され得る。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
６．多重特異性抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つもしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つもしくはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。そのような多重特異性抗体としては、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなど）、共有結合的または非共有結合的に連結されている抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖可変領域の少なくとも一部分及び／または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を更に含むＶＨ／ＶＬ単位はまた、「アーム」または「ヘミマー」または「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、第２のヘミマーとの分子内ジスルフィド結合が形成されることを可能にするのに十分な重鎖可変領域の一部分を含む。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、例えば、相補的ホール変異またはノブ変異を含む第２のヘミマーまたは半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ変異またはホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、本明細書において更に考察される。
特定の実施形態において、本明細書に提供される多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり得る。「二重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体を網羅する。二重特異性抗体はまた、本明細書において、「二重特異性」を有するもの、または「二重特異性」であるとも称される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。本明細書で使用される場合、「二重パラトピック抗体」という用語は、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインが、同じ抗原分子上の２つの異なるエピトープに結合する二重特異性抗体を指すか、またはそれは、２つの異なる抗原分子上のエピトープに結合してもよい。
いくつかの実施形態において、二重パラトピック抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、１つかつ同じ抗原分子内の２つのエピトープに結合してもよい（分子内結合）。例えば、二重パラトピック抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、同じ抗体分子上の２つの異なるエピトープに結合してもよい。特定の実施形態において、二重パラトピック抗体が結合する２つの異なるエピトープは、通常１つの単一特異性抗体（例えば、従来の抗体など）または１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインに同時には結合しないエピトープである。
いくつかの実施形態において、二重パラトピック抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、２つの別個の抗原分子内に位置するエピトープに結合してもよい。
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、ならびに「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号）、ＷＯ２００９／０８９００４、ＵＳ２００９／０１８２１２７、ＵＳ２０１１／０２８７００９、Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．（２００５）２６（６）：６４９－６５８、及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２６：１－９を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ノブイントゥホール」または「ＫｎＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面で一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによって、インビトロまたはインビボでの対合を指向する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ６：７８１－７８８を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＫｎＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の対合が駆動される。例えば、それらのＦｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含み得るか、または類似のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含み得る。ＫｎＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインをともに、または異なる標的認識配列を含む（例えば、アフィボディ、ペプチボディ、及び他のＦｃ融合を含む）任意の他のポリペプチド配列を対合させることもできる。
本明細書で使用される場合、「ノブ変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で隆起（ノブ）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ホール変異を有する。
「隆起」は、第１のポリペプチドの界面から突出し、したがって、隣接界面（すなわち、第２のポリペプチドの界面）の補償空洞内に位置付け可能となることで、例えば、ヘテロ多量体を安定させ、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成が好都合になる、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。隆起は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、隆起をコードするように改変される。これを達成するために、第１のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸で置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解されるだろう。様々なアミノ残基の側鎖体積は、例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９の表１に示される。「隆起」を導入する変異は、「ノブ変異」と称され得る。
いくつかの実施形態において、隆起の形成のための移入残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される天然に存在するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、移入残基は、トリプトファンまたはチロシンである。いくつかの実施形態において、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンなどの隆起の形成のための元の残基は、小さい側鎖体積を有する。
「空洞」は、第２のポリペプチドの界面から凹んでおり、したがって、隣接する第１のポリペプチドの界面上の対応する隆起を収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするように改変される。これを達成するために、第２のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、空洞の形成のための移入残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される天然に存在するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、移入残基は、セリン、アラニン、またはトレオニンである。いくつかの実施形態において、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの空洞の形成のための元の残基は、大きい側鎖体積を有する。「空洞」を導入する変異は、「ホール変異」と称され得る。
隆起は、空洞内で「位置付け可能」であり、これは、それぞれ、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの界面上の隆起及び空洞の空間的位置、ならびに隆起及び空洞のサイズが、界面での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの正常な会合を著しく乱すことなく隆起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐなどの隆起は典型的には、界面の軸から垂直には延びず、好ましい立体構造を有さず、隆起と対応する空洞との整列は、場合によっては、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるものなどの三次元構造に基づいて隆起／空洞の対をモデル化することに依存し得る。これは、当該技術分野で広く受け入れられている技術を使用して達成され得る。
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。
多重特異性抗体はまた、静電ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、ＵＳ４６７６９８０及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３））、ならびに一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４））、ならびに例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載される三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。
「オクトパス抗体」または「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１、及びＷｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域内に導入され得、それによりＦｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
特定の実施形態において、本発明は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を所有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、更に特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要であるか、または有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体バリアントを企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞毒性アッセイを実行して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低下／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約される。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、ＵＳ５５００３６２（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９－１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイが実行されてもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５－１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定もまた、当該技術分野において既知である方法を使用して実行することができる（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６））。
低下したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体を含む（ＵＳ７３３２５８１）。
特定の実施形態において、野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９が、グリシンもしくはアルギニン、または、Ｆｃのプロリン３２９とＦｃｇＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチを破壊するのに十分に大きなアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ４０６，２６７－２７３（２０Ｊｕｌｙ２０００））。更なる一実施形態において、Ｆｃバリアント内の少なくとも１つの更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、更に別の実施形態において、該少なくとも１つの更なるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅである（その全体が参照によって組み込まれる、ＵＳ８９６９５２６）。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、このポリペプチドは、グリシンで置換されたヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＰｒｏ３２９を有し、Ｆｃバリアントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅで少なくとも２つの更なるアミノ酸置換を含み、残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる（その全体が参照によって組み込まれる、ＵＳ８９６９５２６）。特定の実施形態において、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％のＡＤＣＣへの下方調節のため、及び／またはＡＤＣＰの下方調節のために、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの置換を含むポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の低下を呈する（その全体が参照によって組み込まれる、ＵＳ８９６９５２６）。
特定の一実施形態において、野生型ヒトＦｃポリペプチドのＦｃバリアントを含むポリペプチドは、三重変異、つまり、Ｐｒｏ３２９位におけるアミノ酸置換、Ｌ２３４Ａ変異、及びＬ２３５Ａ変異（Ｐ３２９／ＬＡＬＡ）を含む（その全体が参照によって組み込まれる、米国特許第８，９６９，５２６号）。特定の実施形態において、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換、つまり、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む。
ＦｃＲへの改善または縮小した結合を有する特定の抗体バリアントが、記載されている。（例えば、ＵＳ６７３７０５６、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４を参照されたい）。
特定の実施形態において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、例えば、ＵＳ６１９４５５１、ＷＯ１９９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載される、改変（すなわち、改善または縮小のいずれか）したＣ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域内で行われる。
増加した半減期と、母体ＩｇＧの胎児への導入に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合とを有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（ＵＳ７３７１８２６）。
Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８－４０（１９８８）、ＵＳ５６４８２６０、ＵＳ５６２４８２１、及びＷＯ１９９４／２９３５１もまた参照されたい。
７．システイン操作された抗体バリアント
特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の到達可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の到達可能な部位に位置付けられ、本明細書に更に記載されるように、それを使用して、抗体を薬物部分にコンジュゲートして、免疫コンジュゲートを作製することができる。特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、軽鎖のＫ１４９（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のいずれか１つ以上が、システインで置換され得る。システイン操作された抗体は、例えば、ＵＳ７５２１５４１、Ｓｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（２）：１８４－１８９、Ｓｕｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ３２：１８８４－１８９３に記載されるように生成され得る。
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ、免疫コンジュゲート）は、１つ以上の抗体のシステインチオール基を、薬物に結合した１つ以上のリンカー部分にコンジュゲートし、それにより抗体－リンカー－薬物複合体を形成することにより形成され得る。ｐＨ７付近でプロトン化され、求核性が低いほとんどのアミンとは異なり、システインチオールは中性ｐＨで反応性求核剤である。遊離チオール（ＲＳＨ、スルフヒドリル）基は比較的反応性が高いため、システイン残基を有するタンパク質は、ジスルフィド結合したオリゴマーとしてその酸化形態で存在するか、またはジスルフィド基が内部架橋していることが多い。抗体システインチオール基は一般に、抗体のアミンまたはヒドロキシル基よりも求電子性コンジュゲーション試薬に対する反応性が高く、すなわち、求核性が高い。タンパク質の様々なアミノ酸残基をシステインアミノ酸に変異させることによるシステインチオール基の操作には、特に、不対（遊離Ｃｙｓ）残基または反応もしくは酸化が比較的起こりやすい残基の場合に、問題が生じる潜在性がある。Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質中、培養上清中、または部分的もしくは完全に精製されたタンパク質中のいずれにせよ、タンパク質の濃縮溶液中では、タンパク質の表面上の不対Ｃｙｓ残基が対合し、酸化して、分子間ジスルフィドを形成し、故にタンパク質二量体または多量体を形成することができる。ジスルフィド二量体の形成により、新たなＣｙｓは、薬物、リガンド、または他の標識に対するコンジュゲーションについて非反応性となる。更に、タンパク質が、酸化により新たに操作されたＣｙｓ残基と既存のＣｙｓ残基との間で分子間ジスルフィド結合を形成した場合、いずれのＣｙｓ基も、活性部位の関与及び相互作用に利用することができない。更に、このタンパク質は、誤った折り畳みまたは三次構造の喪失により不活性または非特異的となり得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１－９）。
いくつかの態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、以下の表１に列挙される重鎖または軽鎖システイン置換のうちの１つを含む。
表１ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体中の軽鎖システイン変異部位
Figure 0007043425000004
他の態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表２に列挙される重鎖システイン置換のうちの１つを含む。
表２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体中の重鎖システイン変異部位
Figure 0007043425000005
いくつかの他の態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表３に列挙される軽鎖システイン置換のうちの１つを含む
表３ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体中の軽鎖システイン変異部位
Figure 0007043425000006
いくつかの他の態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表４に列挙される重鎖または軽鎖システイン置換のうちの１つを含む。
表４ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体中の重鎖システイン変異部位
Figure 0007043425000007
がんの治療における本発明の抗体－薬物コンジュゲートに有用であり得るシステイン操作された抗体としては、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原は、当該技術分野において既知であり、当該技術分野において周知の方法及び情報を使用して抗体を生成する上で使用するために調製され得る。がんの診断及び療法のための有効な細胞標的を発見する試みの中で、研究者らは、１つ以上の正常な非がん性細胞（複数可）と比較して、１つ以上の特定の種類（複数可）のがん細胞の表面上で特異的に発現される膜貫通ポリペプチドまたは他の様式で腫瘍に関連するポリペプチドを特定しようとした。そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非がん性細胞の表面上と比較して、がん細胞の表面上でより豊富に発現されることが多い。そのような腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの特定により、抗体に基づく療法を介してがん細胞の破壊のために特異的に標的とする能力が生じた。
腫瘍関連抗原ＴＡＡの例としては、本明細書に列挙されるＴＡＡ（１）～（５３）が挙げられるが、これらに限定されない。便宜上、これらの抗原（全て当技術分野において既知である）に関する情報を本明細書に列挙し、この情報は、名称、別称、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主な参考文献（複数可）に続き、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質配列を特定する慣例を含む。ＴＡＡ（１）～（５３）に対応する核酸及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて入手可能である。抗体によって標的とされる腫瘍関連抗原としては、引用される参考文献において特定されている配列と比較して、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を保有する全てのアミノ酸配列バリアント及びアイソフォーム、または引用される参考文献中に見出される配列を有するＴＡＡと実質的に同じ生物学的特性もしくは特徴を呈するものが挙げられる。例えば、バリアント配列を有するＴＡＡは一般に、列挙されている対応する配列を有するＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に引用される参考文献中の配列及び開示は、参照により明示的に組み込まれる。
腫瘍関連抗原
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４（５１５５）：１０１－１０４（１９９４）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４（１１）：１３７７－１３８２（１９９７））、ＷＯ２００４０６３３６２（請求項２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３１３４７９０－Ａ１（３８～３９頁）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、２９６頁）、ＷＯ２００３０５５４４３（９１～９２頁）、ＷＯ２００２９９１２２（実施例２、５２８～５３頁）、ＷＯ２００３０２９４２１（請求項６）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図１１２）、ＷＯ２００２９８３５８（請求項１、１８３頁）、ＷＯ２００２５４９４０（１００～１０１頁）、ＷＯ２００２５９３７７（３４９～３５０頁）、ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７、３７６頁）、ＷＯ２００１４８２０４（実施例、図４）ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質受容体、ＩＢ型／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１－相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８、ＮＰ＿００１１９４．１、ＡＹ０６５９９４。
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５（２），２８３－２８８（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ３９５（６６９９）：２８８－２９１（１９９８）、Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１６）：１１２６７－１１２７３）、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＷＯ２００２９９０７４（請求項１９、１２７～１２９頁）、ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７、２２２、３９３頁）、ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０、２９３頁）、ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３、９３～９５頁）、ＷＯ２０００１４２２８（請求項５、１３３～１３６頁）、ＵＳ２００３２２４４５４（図３）、ＷＯ２００３０２５１３８（請求項１２、１５０頁）、ＮＰ＿００３４７７溶質担体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体、ｙ＋システム）、メンバー５／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３－Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、相互参照：ＭＩＭ：６００１８２、ＮＰ＿００３４７７．３、ＮＭ＿０１５９２３、ＮＭ＿００３４８６＿１。
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（１５），５８５７－５８６０（２００１）、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２５）：１４５２３－１４５２８）、ＷＯ２００４０６５５７７（請求項６）、ＷＯ２００４０２７０４９（図１Ｌ）、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３１５７０８９（実施例５）、ＵＳ２００３１８５８３０（実施例５）、ＵＳ２００３０６４３９７（図２）、ＷＯ２００２８９７４７（実施例５、６１８～６１９頁）、ＷＯ２００３０２２９９５（実施例９；図１３Ａ、実施例５３；１７３頁、実施例２；図２Ａ）、ＮＰ＿０３６５８１前立腺の６回膜貫通上皮抗原、相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５、ＮＰ＿０３６５８１．１、ＮＭ＿０１２４４９＿１。
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２９）：２７３７１－２７３７５（２００１））、ＷＯ２００４０４５５５３（請求項１４）、ＷＯ２００２９２８３６（請求項６、図１２）、ＷＯ２００２８３８６６（請求項１５、１１６～１２１頁）、ＵＳ２００３１２４１４０（実施例１６）、ＵＳ７９８９５９。相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７、ＡＡＫ７４１２０．３、ＡＦ３６１４８６＿１。
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２），８０５－８０８（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２０）：１１５３１－１１５３６（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（１）：１３６－１４０（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３７）：２１９８４－２１９９０（１９９５））、ＷＯ２００３１０１２８３（請求項１４）、（ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、２８７～２８８頁）、ＷＯ２００２１０１０７５（請求項４、３０８～３０９頁）、ＷＯ２００２７１９２８（３２０～３２１頁）、ＷＯ９４１０３１２（５２～５７頁）、相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１、ＮＰ＿００５８１４．２、ＮＭ＿００５８２３＿１。
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２２）：１９６６５－１９６７２（２００２）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６２（２）：２８１－２８４（１９９９）、Ｆｅｉｌｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８（３）：５７８－５８２）、ＷＯ２００４０２２７７８（請求項２）、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、３２６頁）、ＥＰ８７５５６９（請求項１、１７～１９頁）、ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０、３２９頁）、ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）、ＷＯ２００１７５１７７（請求項２４、１３９～１４０頁）、相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７、ＮＰ＿００６４１５．１、ＮＭ＿００６４２４＿１。
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＢ０４０８７８）Ｎａｇａｓｅ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）ＤＮＡ Ｒｅｓ．７（２）：１４３－１５０）、ＷＯ２００４０００９９７（請求項１）、ＷＯ２００３００３９８４（請求項１）、ＷＯ２００２０６３３９（請求項１、５０頁）、ＷＯ２００１８８１３３（請求項１、４１～４３頁、４８～５８頁）、ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）、ＷＯ２００３１０１４００（請求項１１）、受託番号：Ｑ９Ｐ２８３、ＥＭＢＬ、ＡＢ０４０８７８、ＢＡＡ９５９６９．１． Ｇｅｎｅｗ；ＨＧＮＣ：１０７３７。
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：２５４６－２５５３、ＵＳ２００３１２９１９２（請求項２）、ＵＳ２００４０４４１８０（請求項１２）、ＵＳ２００４０４４１７９（請求項１１）、ＵＳ２００３０９６９６１（請求項１１）、ＵＳ２００３２３２０５６（実施例５）、ＷＯ２００３１０５７５８（請求項１２）、ＵＳ２００３２０６９１８（実施例５）、ＥＰ１３４７０４６（請求項１）、ＷＯ２００３０２５１４８（請求項２０）、相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８、ＡＡＱ８８９９１．１、ＡＹ３５８６２８＿１。
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）、Ｎａｋａｍｕｔａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７，３４－３９，１９９１、Ｏｇａｗａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，２４８－２５５，１９９１、Ａｒａｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｐｎ．Ｃｉｒｃ．Ｊ．５６，１３０３－１３０７，１９９２、Ａｒａｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，３４６３－３４７０，１９９３、Ｓａｋａｍｏｔｏ Ａ．，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，６５６－６６３，１９９１、Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，３８７３－３８７９，１９９３、Ｈａｅｎｄｌｅｒ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０，ｓ１－Ｓ４，１９９２、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ２２８，４３－４９，１９９９、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９－１６９０３，２００２、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８２，３１１６－３１２３，１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２１５８９－２１５９６，１９９７、Ｖｅｒｈｅｉｊ Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１０８，２２３－２２５，２００２、Ｈｏｆｓｔｒａ Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５，１８０－１８５，１９９７、Ｐｕｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ７９，１２５７－１２６６，１９９４、Ａｔｔｉｅ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４，２４０７－２４０９，１９９５、Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：３５１－３５４，１９９６、Ａｍｉｅｌ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ． ５，３５５－３５７，１９９６、Ｈｏｆｓｔｒａ Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２，４４５－４４７，１９９６、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０３，１４５－１４８，１９９８、Ｆｕｃｈｓ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７，１１５－１２４，２００１、Ｐｉｎｇａｕｌｔ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１１，１９８－２０６、ＷＯ２００４０４５５１６（請求項１）、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０４００００（請求項１５１）、ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２６１０８７（図１）、ＷＯ２００３０１６４９４（図６）、ＷＯ２００３０２５１３８（請求項１２、１４４頁）、ＷＯ２００１９８３５１（請求項１、１２４～１２５頁）、ＥＰ５２２８６８（請求項８、図２）、ＷＯ２００１７７１７２（請求項１、２９７～２９９頁）、ＵＳ２００３１０９６７６、ＵＳ６５１８４０４（図３）、ＵＳ５７７３２２３（請求項１ａ、３１～３４欄）、ＷＯ２００４００１００４。
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）、ＷＯ２００３１０４２７５（請求項１）、ＷＯ２００４０４６３４２（実施例２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００３０８３０７４（請求項１４、６１頁）、ＷＯ２００３０１８６２１（請求項１）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図９３）、ＷＯ２００１６６６８９（実施例６）、相互参照：遺伝子座ＩＤ：５４８９４、ＮＰ＿０６０２３３．２、ＮＭ＿０１７７６３＿１。
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２（１１）：１５７３－１５８２（２００２））、ＷＯ２００３０８７３０６、ＵＳ２００３０６４３９７（請求項１、図１）、ＷＯ２００２７２５９６（請求項１３、５４～５５頁）、ＷＯ２００１７２９６２（請求項１、図４Ｂ）、ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１１）、ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１６）、ＵＳ２００４００５５９８（請求項２２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３０６０６１２（請求項１２、図１０）、ＷＯ２００２２６８２２（請求項２３、図２）、ＷＯ２００２１６４２９（請求項１２、図１０）、相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８、ＡＡＮ０４０８０．１、ＡＦ４５５１３８＿１。
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）Ｘｕ，Ｘ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１９）：１０６９２－１０６９７（２００１）、Ｃｅｌｌ１０９（３）：３９７－４０７（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３３）：３０８１３－３０８２０（２００３））、ＵＳ２００３１４３５５７（請求項４）、ＷＯ２０００４０６１４（請求項１４、１００～１０３頁）、ＷＯ２００２１０３８２（請求項１、図９Ａ）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７、３９１頁）、ＵＳ２００３２１９８０６（請求項４）、ＷＯ２００１６２７９４（請求項１４、図１Ａ～Ｄ）、相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６、ＮＰ＿０６０１０６．２、ＮＭ＿０１７６３６＿１。
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌種由来の成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯＪ．８（７）：１９８７－１９９１（１９８９），Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９（３）：５５５－５６５（１９９１））、ＵＳ２００３２２４４１１（請求項１）、ＷＯ２００３０８３０４１（実施例１）、ＷＯ２００３０３４９８４（請求項１２）、ＷＯ２００２８８１７０（請求項２、５２～５３頁）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図５８）、ＷＯ２００２１６４１３（請求項１、９４～９５、１０５頁）、ＷＯ２００２２２８０８（請求項２、図１）、ＵＳ５８５４３９９（実施例２、１７～１８欄）、ＵＳ５７９２６１６（図２）、相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５、ＮＰ＿００３２０３．１、ＮＭ＿００３２１２＿１。
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）もしくはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）Ｆｕｊｉｓａｋｕ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４（４）：２１１８－２１２５）、Ｗｅｉｓ Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７，１０４７－１０６６，１９８８、Ｍｏｏｒｅ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，９１９４－９１９８，１９８７、Ｂａｒｅｌ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，１０２５－１０３１，１９９８、Ｗｅｉｓ Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，５６３９－５６４３，１９８６、Ｓｉｎｈａ Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，５３１１－５３２０、ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）、ＵＳ２００４００５５３８（実施例１）、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）、ＷＯ９１０２５３６（図９．１～９．９）、ＷＯ２００４０２０５９５（請求項１）、受託番号：Ｐ２００２３、Ｑ１３８６６、Ｑ１４２１２、ＥＭＢＬ、Ｍ２６００４、ＡＡＡ３５７８６．１。
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、Ｉｇｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６２６または１１０３８６７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３）１００（７）：４１２６－４１３１，Ｂｌｏｏｄ（２００２）１００（９）：３０６８－３０７６，Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（６）：１６２１－１６２５）、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２、図１４０）、ＷＯ２００３０８７７６８、ＵＳ２００４１０１８７４（請求項１、１０２頁）、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＵＳ２００２１５０５７３（請求項５、１５頁）、ＵＳ５６４４０３３、ＷＯ２００３０４８２０２（請求項１、３０６及び３０９頁）、ＷＯ９９／５５８６５８、ＵＳ６５３４４８２（請求項１３、図１７Ａ／Ｂ）、ＷＯ２０００５５３５１（請求項１１、１１４５～１１４６頁）、相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５、ＮＰ＿０００６１７．１、ＮＭ＿０００６２６＿１。
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４，ＡＹ３５８１３０）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５－２２７０（２００３）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５４（２）：８７－９５（２００２）、Ｂｌｏｏｄ９９（８）：２６６２－２６６９（２００２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１７）：９７７２－９７７７（２００１）、Ｘｕ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０（３）：７６８－７７５、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項５、図１８Ｄ－１～１８Ｄ－２）、ＷＯ２００３０９７８０３（請求項１２）、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項２５）、相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９、ＮＰ＿１１０３９１．２、ＮＭ＿０３０７６４＿１。
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）Ｃｏｕｓｓｅｎｓ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０（４７３０）：１１３２－１１３９）、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３１９，２３０－２３４，１９８６、Ｓｅｍｂａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，６４９７－６５０１，１９８５、Ｓｗｉｅｒｃｚ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６５，８６９－８８０，２００４、Ｋｕｈｎｓ Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３６４２２－３６４２７，１９９９、Ｃｈｏ Ｈ．－Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４２１，７５６－７６０，２００３、Ｅｈｓａｎｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１５，４２６－４２９、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０２７０４９（図１Ｉ）、ＷＯ２００４００９６２２、ＷＯ２００３０８１２１０、ＷＯ２００３０８９９０４（請求項９）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＵＳ２００３１１８５９２、ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）、ＷＯ２００３０５５４３９（請求項２９、図１Ａ～Ｂ）、ＷＯ２００３０２５２２８（請求項３７、図５Ｃ）、ＷＯ２００２２２６３６（実施例１３、９５～１０７頁）、ＷＯ２００２１２３４１（請求項６８、図７）、ＷＯ２００２１３８４７（７１～７４頁）、ＷＯ２００２１４５０３（１１４～１１７頁）、ＷＯ２００１５３４６３（請求項２、４１～４６頁）、ＷＯ２００１４１７８７（１５頁）、ＷＯ２０００４４８９９（請求項５２、図７）、ＷＯ２０００２０５７９（請求項３、図２）、ＵＳ５８６９４４５（請求項３、３１～３８欄）、ＷＯ９６３０５１４（請求項２、５６～６１頁）、ＥＰ１４３９３９３（請求項７）、ＷＯ２００４０４３３６１（請求項７）、ＷＯ２００４０２２７０９、ＷＯ２００１００２４４（実施例３、図４）、受託番号：Ｐ０４６２６、ＥＭＢＬ、Ｍ１１７６７、ＡＡＡ３５８０８．１．ＥＭＢＬ、Ｍ１１７６１、ＡＡＡ３５８０８．１。
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）；Ｂａｒｎｅｔｔ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３，５９－６６，１９８８、Ｔａｗａｒａｇｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １５０，８９－９６，１９８８、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１６８９９－１６９０３，２００２、ＷＯ２００４０６３７０９、ＥＰ１４３９３９３（請求項７）、ＷＯ２００４０４４１７８（実施例４）、ＷＯ２００４０３１２３８、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７、４２７頁）、ＷＯ２００２６０３１７（請求項２）、受託番号：Ｐ４０１９９、Ｑ１４９２０、ＥＭＢＬ、Ｍ２９５４１、ＡＡＡ５９９１５．１．ＥＭＢＬ、Ｍ１８７２８。
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６）：１６８９９－１６９０３（２００２））、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３、８５～８７頁）、ＪＰ０５００３７９０（図６～８）、ＷＯ９９４６２８４（図９）、相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０、ＡＡＨ１７０２３．１、ＢＣ０１７０２３＿１。
（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）、Ｃｌａｒｋ Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，２２６５－２２７０，２００３、Ｍｕｎｇａｌｌ Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４２５，８０５－８１１，２００３、Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ１０４，９－１９，２００１、Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７，３５４５－３５４９，２００１、Ｐａｒｒｉｓｈ－Ｎｏｖａｋ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４７５１７－４７５２３，２００２、Ｐｌｅｔｎｅｖ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２：１２６１７－１２６２４、Ｓｈｅｉｋｈ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，２００６－２０１０、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＵＳ２００４００５３２０（実施例５）、ＷＯ２００３０２９２６２（７４～７５頁）、ＷＯ２００３００２７１７（請求項２、６３頁）、ＷＯ２００２２２１５３（４５～４７頁）、ＵＳ２００２０４２３６６（２０～２１頁）、ＷＯ２００１４６２６１（５７～５９頁）、ＷＯ２００１４６２３２（６３～６５頁）、ＷＯ９８３７１９３（請求項１、５５～５９頁）、受託番号：Ｑ９ＵＨＦ４、Ｑ６ＵＷＡ９、Ｑ９６ＳＨ８、ＥＭＢＬ、ＡＦ１８４９７１、ＡＡＦ０１３２０．１。
（２１）ブレビカン（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）Ｇａｒｙ Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ２５６，１３９－１４７，２０００、Ｃｌａｒｋ Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，２２６５－２２７０，２００３、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９－１６９０３，２００２、ＵＳ２００３１８６３７２（請求項１１）、ＵＳ２００３１８６３７３（請求項１１）、ＵＳ２００３１１９１３１（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２２（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２６（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１２１（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２９（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１３０（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１２８（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２５（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２０２６３４（請求項１）。
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）Ｃｈａｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｗａｔｔ，Ｖ．Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６（６），１０５７－１０６１（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１０（５）：８９７－９０５（１９９５），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３０９－３４５（１９９８），Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９６：１７７－２４４（２０００））、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２０００５３２１６（請求項１、４１頁）、ＷＯ２００４０６５５７６（請求項１）、ＷＯ２００４０２０５８３（請求項９）、ＷＯ２００３００４５２９（１２８～１３２頁）、ＷＯ２０００５３２１６（請求項１、４２頁）、相互参照：ＭＩＭ：６００９９７、ＮＰ＿００４４３３．２、ＮＭ＿００４４４２＿１。
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）ＵＳ２００４０１０１８９９（請求項２）、ＷＯ２００３１０４３９９（請求項１１）、ＷＯ２００４０００２２１（図３）、ＵＳ２００３１６５５０４（請求項１）、ＵＳ２００３１２４１４０（実施例２）、ＵＳ２００３０６５１４３（図６０）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、２９９頁）、ＵＳ２００３０９１５８０（実施例２）、ＷＯ２００２１０１８７（請求項６、図１０）、ＷＯ２００１９４６４１（請求項１２、図７ｂ）、ＷＯ２００２０２６２４（請求項１３、図１Ａ～１Ｂ）、ＵＳ２００２０３４７４９（請求項５４、４５～４６頁）、ＷＯ２００２０６３１７（実施例２；３２０～３２１頁、請求項３４；３２１～３２２頁）、ＷＯ２００２７１９２８（４６８～４６９頁）、ＷＯ２００２０２５８７（実施例１、図１）、ＷＯ２００１４０２６９（実施例３、１９０～１９２頁）、ＷＯ２０００３６１０７（実施例２、２０５～２０７頁）、ＷＯ２００４０５３０７９（請求項１２）、ＷＯ２００３００４９８９（請求項１）、ＷＯ２００２７１９２８（２３３～２３４、４５２～４５３頁）、ＷＯ０１１６３１８。
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）Ｒｅｉｔｅｒ Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１７３５－１７４０，１９９８、Ｇｕ Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９，１２８８－１２９６，２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２７５（３）：７８３－７８８、ＷＯ２００４０２２７０９、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＵＳ２００４０１８５５３（請求項１７）、ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）、ＷＯ２００２８１６４６（請求項１、１６４頁）、ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０、２８８頁）、ＷＯ２００１４０３０９（実施例１、図１７）、ＵＳ２００１０５５７５１（実施例１、図１ｂ）、ＷＯ２０００３２７５２（請求項１８、図１）、ＷＯ１９９８／５１８０５（請求項１７、９７頁）、ＷＯ１９９８／５１８２４（請求項１０、９４頁）、ＷＯ１９９８／４０４０３（請求項２、図１Ｂ）、受託番号：Ｏ４３６５３、ＥＭＢＬ、ＡＦ０４３４９８、ＡＡＣ３９６０７．１。
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）、ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１－Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ種：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）、ＷＯ２００３０００８４２（請求項１）、ＷＯ２００３０２３０１３（実施例３、請求項２０）、ＵＳ２００３１９４７０４（請求項４５）、相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９、ＡＡＰ１４９５４．１、ＡＹ２６０７６３＿１。
（２６）ＢＡＦＦ－Ｒ（細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）、ＢＡＦＦ受容体／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１－Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９３（５５３７），２１０８－２１１１（２００１）、ＷＯ２００４０５８３０９、ＷＯ２００４０１１６１１、ＷＯ２００３０４５４２２（実施例、３２～３３頁）、ＷＯ２００３０１４２９４（請求項３５、図６Ｂ）、ＷＯ２００３０３５８４６（請求項７０、６１５～６１６頁）、ＷＯ２００２９４８５２（１３６～１３７欄）、ＷＯ２００２３８７６６（請求項３、１３３頁）、ＷＯ２００２２４９０９（実施例３、図３）、相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９、ＮＰ＿４４３１７７．１、ＮＭ＿０５２９４５＿１、ＡＦ１３２６００。
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム、ＢＬ－ＣＡＭ、Ｌｙｂ－８、Ｌｙｂ８、ＳＩＧＬＥＣ－２、ＦＬＪ２２８１４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１３７－１４６、ＷＯ２００３０７２０３６（請求項１、図１）、相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６、ＮＰ＿００１７６２．１、ＮＭ＿００１７７１＿１。
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合により相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質）、ｐＩ：４．８４、ＭＷ：２５０２８、ＴＭ：２［Ｐ］遺伝子染色体：１９ｑ１３．２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７４．１０）ＷＯ２００３０８８８０８、ＵＳ２００３０２２８３１９、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＵＳ２００２１５０５７３（請求項４、１３～１４頁）、ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１６）、ＷＯ９２０７５７４（図１）、ＵＳ５６４４０３３、Ｈａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５２６－１５３１、Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：１６２１－１６２５、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４０（４）：２８７－２９５、Ｐｒｅｕｄ’ｈｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０（１）：１４１－１４６、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（２）６３３－６３７、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７（１１）：３４５７－３４６４。
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球移動及び体液性免疫において機能し、ＨＩＶ－２感染症、ならびに恐らく、ＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たすＧタンパク質共役型受容体）、３７２ａａ、ｐＩ：８．５４、ＭＷ：４１９５９、ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：１１ｑ２３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７０７．１）ＷＯ２００４０４００００、ＷＯ２００４／０１５４２６、ＵＳ２００３１０５２９２（実施例２）、ＵＳ６５５５３３９（実施例２）、ＷＯ２００２／６１０８７（図１）、ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０、２６９頁）、ＷＯ２００１７２８３０（１２～１３頁）、ＷＯ２０００／２２１２９（実施例１、１５２～１５３頁、実施例２、２５４～２５６頁）、ＷＯ１９９９２８４６８（請求項１、３８頁）、ＵＳ５４４００２１（実施例２、４９～５２欄）、ＷＯ９４２８９３１（５６～５８頁）、ＷＯ１９９２／１７４９７（請求項７、図５）、Ｄｏｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２７９５－２７９９、Ｂａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０９：７７３－７７９。
（３０）ＨＬＡ－ＤＯＢ（ペプチドに結合し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球にそれらを提示する、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、２７３ａａ、ｐＩ：６．５６、ＭＷ：３０８２０、ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１１．１）Ｔｏｎｎｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４（１１）：２８３９－２８４７、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ２９（６）：４１１－４１３、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：４３３－４４１、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９９：１６８９９－１６９０３、Ｓｅｒｖｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８７５９－８７６６、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：１－１３、Ｎａｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ５９：５１２－５１９、ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１５）、ＵＳ６１５３４０８（３５～３８欄）、ＵＳ５９７６５５１（１６８～１７０欄）、ＵＳ６０１１１４６（１４５～１４６欄）、Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３０（１）：６６－６８、Ｌａｒｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２６）：１４１１１－１４１１９。
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５、シナプス伝達及び神経発生に関与し得る、細胞外ＡＴＰによって開閉されるイオンチャネル、欠損すると特発性の排尿筋不安定の病態生理に寄与し得る）、４２２ａａ）、ｐＩ：７．６３、ＭＷ：４７２０６、ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１７ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５５２．２）Ｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１８（１－２）：１９５－１９９、ＷＯ２００４０４７７４９、ＷＯ２００３０７２０３５（請求項１０）、Ｔｏｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：１６５－１７３、ＷＯ２００２２２６６０（請求項２０）、ＷＯ２００３０９３４４４（請求項１）、ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）、ＷＯ２００３０２９２７７（８２頁）。
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）、ｐＩ：８．６６、ＭＷ：４０２２５、ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）ＷＯ２００４０４２３４６（請求項６５）、ＷＯ２００３／０２６４９３（５１～５２、５７～５８頁）、ＷＯ２０００／７５６５５（１０５～１０６頁）、Ｖｏｎ Ｈｏｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４（１２）：４８７０－４８７７、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９９：１６８９９－１６９０３。
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能喪失は、全身性エリテマトーデスを有する患者における疾患活性の増加に関連する）、６６１ａａ、ｐＩ：６．２０、ＭＷ：７４１４７、ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：５ｑ１２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５７３．１）ＵＳ２００２１９３５６７、ＷＯ９７０７１９８（請求項１１、３９～４２頁）、Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３８（３）：２９９－３０４、Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ９２：２８１５－２８２２、ＷＯ２００３０８３０４７、ＷＯ９７４４４５２（請求項８、５７～６１頁）、ＷＯ２０００１２１３０（２４～２６頁）。
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含有する免疫グロブリンＦｃドメインの推定上の受容体は、Ｂ－リンパ球分化において役割を有し得る）、４２９ａａ、ｐＩ：５．２８、ＭＷ：４６９２５、ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１－１ｑ２２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７０．１）ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項６、図１８Ｅ－１～１８－Ｅ－２）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９８（１７）：９７７２－９７７７、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項８）、ＥＰ１３４７０４６（請求項１）、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項７）。
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２、Ｂ細胞発達及びリンパ腫形成に可能性のある役割を有する推定上の免疫受容体、転位による遺伝子の制御解除がいくつかのＢ細胞悪性腫瘍で生じる）、９７７ａａ、ｐＩ：６．８８、ＭＷ：１０６４６８、ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ヒト：ＡＦ３４３６６２、ＡＦ３４３６６３、ＡＦ３４３６６４、ＡＦ３４３６６５、ＡＦ３６９７９４、ＡＦ３９７４５３、ＡＫ０９０４２３、ＡＫ０９０４７５、ＡＬ８３４１８７、ＡＹ３５８０８５、Ｍｏｕｓｅ：ＡＫ０８９７５６、ＡＹ１５８０９０、ＡＹ５０６５５８、ＮＰ＿１１２５７１．１。ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図９７）、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７（１）：１２４－１２７、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項３、図１８Ｂ－１～１８Ｂ－２）。
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２、トモレグリン、ＴＰＥＦ、ＨＰＰ１、ＴＲ、推定上の膜貫通プロテオグリカン、成長因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチンに関連する）、３７４ａａ、ＮＣＢＩ受託番号：ＡＡＤ５５７７６、ＡＡＦ９１３９７、ＡＡＧ４９４５１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５７２７６、ＮＣＢＩ遺伝子：２３６７１、ＯＭＩＭ：６０５７３４、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＵＩＫ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１７９２７４、ＡＹ３５８９０７、ＣＡＦ８５７２３、ＣＱ７８２４３６、ＷＯ２００４０７４３２０、ＪＰ２００４１１３１５１、ＷＯ２００３０４２６６１、ＷＯ２００３００９８１４、ＥＰ１２９５９４４（６９～７０頁）、ＷＯ２００２３０２６８（３２９頁）、ＷＯ２００１９０３０４、ＵＳ２００４２４９１３０、ＵＳ２００４０２２７２７、ＷＯ２００４０６３３５５、ＵＳ２００４１９７３２５、ＵＳ２００３２３２３５０、ＵＳ２００４００５５６３、ＵＳ２００３１２４５７９、Ｈｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６７：１４６－１５２、Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６６：５９３－６０２、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：４９０７－１２、Ｇｌｙｎｎｅ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．Ｏｃｔ１５；９４（２）：１７８－８４。
（３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、ＭＥ２０、ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４、ＢＴ００７２０２、Ｍ３２２９５、Ｍ７７３４８、ＮＭ＿００６９２８、ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６（３３），１３７３１－１３７３６、Ｋｕｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８４（４），２２９６－２３０６。
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメイン１を有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン－１）、Ｈ７３６５、Ｃ９ｏｒｆ２、Ｃ９ＯＲＦ２、Ｕ１９８７８、Ｘ８３９６１、ＮＭ＿０８０６５５、ＮＭ＿００３６９２、Ｈａｒｍｓ，Ｐ．Ｗ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７（２１），２６２４－２６２９、Ｇｅｒｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２（１８）：２７２３－２７２７。
（３９）ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ－アルファ１、ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）、Ｕ９５８４７、ＢＣ０１４９６２、ＮＭ＿１４５７９３ ＮＭ＿００５２６４、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９（８），２２６４－２２７７、Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８２（６５８６）：８０－８３。
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）、ＮＰ＿００２３３７．１、ＮＭ＿００２３４６．２、ｄｅ Ｎｏｏｉｊ－ｖａｎ Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０３（６），７６８－７７４、Ｚａｍｍｉｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（３）：９４６－９５２。
（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、ＳＨＩＳＡ２）、ＮＰ＿００１００７５３９．１、ＮＭ＿００１００７５３８．１、Ｆｕｒｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０６（２），４８０－４９２、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５－２２７０。
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）、ＮＰ＿０６７０７９．２、ＮＭ＿０２１２４６．２、Ｍａｌｌｙａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８０（１）：１１３－１２３、Ｒｉｂａｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１）：２７８－２８７。
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質共役型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、ＮＰ＿００３６５８．１、ＮＭ＿００３６６７．２、Ｓａｌａｎｔｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１７０（５）：５３７－５４５、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３７（３）：５２８－５３３。
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ－ＥＬＥ１）、ＮＰ＿０６６１２４．１、ＮＭ＿０２０９７５．４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．１００（１０）：１８９５－１９０１、Ｎａｒｉｔａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２８（３４）：３０５８－３０６８。
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、ＮＰ＿０５９９９７．３、ＮＭ＿０１７５２７．３、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７（２４）：１１６０１－１１６１１、ｄｅ Ｎｏｏｉｊ－ｖａｎ Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０３（６）：７６８－７７４。
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、ＮＰ＿００６１３４．１、ＮＭ＿００６１４３．２、Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ，Ａ．ａｎｄ Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｄ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０５（１－２）：１６２－１６４、Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３９４（３）：３２５－３２９。
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、ＮＰ＿１１５９４０．２、ＮＭ＿０３２５５１．４、Ｎａｖｅｎｏｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５（６）：１３００－１３０６、Ｈａｔａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２９（２）：６１７－６２３。
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、ＮＰ＿８５９０６９．２、ＮＭ＿１８１７１８．３、Ｇｅｒｈａｒｄ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４（１０Ｂ）：２１２１－２１２７。
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、ＮＰ＿０００３６３．１、ＮＭ＿０００３７２．４、Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４１（８）：９２０－９２５、Ｎａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２５（４）：９０９－９１７。
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、ＮＰ＿００１１０３３７３．１、ＮＭ＿００１１０９９０３．１、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５－２２７０、Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４０（７０８２）：３４６－３５１。
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、ＮＰ＿０７８８０７．１、ＮＭ＿０２４５３１．３、Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１１）：６７５９－６７６４、Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５２０（１－３）：９７－１０１。
（５２）シアル酸に結合する免疫グロブリン様レクチンファミリーのメンバーであるＣＤ３３は、６７ｋＤａのグリコシル化膜貫通タンパク質である。ＣＤ３３は、拘束された骨髄単球性前駆細胞及び赤血球前駆細胞に加えて、ほとんどの骨髄性白血病細胞及び単球性白血病細胞上で発現される。これは、最初期の多能性幹細胞、成熟顆粒球、リンパ系細胞、または非造血系細胞には見られない（Ｓａｂｂａｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：７５６－５６、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ６８：１０３０－５）。ＣＤ３３は、その細胞質尾部に２つのチロシン残基を含有し、これらの各々に、多くの阻害性受容体に見られる免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に類似する疎水性残基が続いている。
（５３）ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）は、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、共通のタンパク質折り畳みを共有し、細胞接着、細胞間シグナル伝達、糖タンパク質代謝回転、ならびに炎症及び免疫応答における役割などの多様な機能を有する。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、顆粒球及び単球の機能の負の制御因子である。この遺伝子のいくつかの代替的なスプライス転写物バリアントが記載されているが、これらのバリアントのうちのいくつかに関しては完全長の性質が決定されていない。この遺伝子は、染色体１２ｐ１３上のナチュラルキラー遺伝子複合体領域内の他のＣＴＬ／ＣＴＬＤスーパーファミリーメンバーに緊密に連結している（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．９（５）：５８５－９０、ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ１１０（７）：２６５９－６６、Ｃｈｅｎ ＣＨ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ１０７（４）：１４５９－６７、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＡＳ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６（８）：２１５９－６９、Ｂａｋｋｅｒ ＡＢ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４（２２）：８４４３－５０、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＡＳ，，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１５）：１４７９２－８０２）。ＣＬＬ－１は、単一のＣ型レクチン様ドメイン（カルシウムまたは糖類のいずれにも結合することが予測されていない）、ストーク領域、膜貫通ドメイン、及びＩＴＩＭモチーフを含有する短い細胞質尾部を含む、ＩＩ型膜貫通受容体であることが示されている。
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造する上で有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、２つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で療法に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない、考慮すべき要因に基づいて決定され得る。
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１１６００－１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであり得、通常の細胞を傷つけないが、抗体－非タンパク質性部分に近位の細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
抗体は、例えば、ＵＳ４８１６５６７に記載されるように、組み換え法及び組成物を用いて産生され得る。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。更なる一実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる一実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核生物のもの、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
抗体の組み換え産生のために、例えば、本明細書に記載される抗体をコードする核酸が単離され、１つ以上のベクター内に挿入されて、宿主細胞内で更にクローニング及び／または発現される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローン化または発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核生物細胞または真核生物細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、ＵＳ５６４８２３７、ＵＳ５７８９１９９、及びＵＳ５８４０５２３を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について説明している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい。）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターにとって好適なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と組み合わせて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。例えば、ＵＳ５９５９１７７、ＵＳ６０４０４９８、ＵＳ６４２０５４８、ＵＳ７１２５９７８、ＵＳ６４１７４２９（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を説明）を参照されたい。
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）Error! Bookmark not defined.に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肺細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるもの）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞が挙げられる。他の有用な哺乳類宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
リンカー
「リンカー」（Ｌ）は、１つ以上のシルベストロール薬物部分を抗体（Ａｂ）に連結して、式ＩＩａ及びＩＩｂの抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために使用することができる、二官能性または多官能性部分である。いくつかの実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物に及び抗体に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して調製することができる。例えば、いくつかの実施形態において、抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカーの反応性官能基または薬物－リンカー中間体と結合を形成して、ＡＤＣを作製することができる。
一態様において、リンカーは、抗体上に存在する遊離システインと反応して、共有結合を形成することできる官能性を有する。非限定的な例示的なそのような反応性官能基としては、マレイミド、ハロアセトアミド、α－ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、活性化エステル（スクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、４－ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステルなど）、無水物、酸クロリド、塩化スルホニル、イソシアン酸、及びイソチオシアン酸が挙げられる。例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５（４）：７６５－７７３の７６６頁におけるコンジュゲーション方法、及び本明細書の実施形態を参照されたい。
いくつかの実施形態において、リンカーは、抗体上に存在する求電子性基と反応することができる官能性を有する。例示的なそのような求電子性基としては、アルデヒド及びケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子が、抗体上の求電子性基と反応し、抗体単位への共有結合を形成することができる。非限定的な例示的なそのような反応性官能基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジン、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。
リンカーは、ストレッチャー単位、ペプチドミメティック単位、ペプチド単位、及びスペーサー単位を含むが、これらに限定されない、１つ以上のリンカー構成成分を含み得る。例示的なリンカー構成成分としては、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン－シトルリン（「ｖａｌ－ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン－フェニルアラニン（「ａｌａ－ｐｈｅ」）、フェニルアラニン－リジン（ｐｈｅ－ｌｙｓ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）吉草酸（「ＳＰＰ」）、及び４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（「ＭＣＣ」）が挙げられる。様々なリンカー構成成分が当該技術分野で既知であり、このうちのいくつかが以下に記載される。
リンカーは、薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。非限定的な例示的な切断可能リンカーとしては、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、感光性リンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１（１９９２）、ＵＳ５２０８０２０）が挙げられる。
リンカーの例示的な実施形態は、ＵＳ７４９８２９８に記載され、これは参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
シルベストロール薬物－リンカー中間体化合物
シルベストロール（ＣＡＳ登録番号６９７２３５－３８－４）（メチル（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレートと称される）（化合物１６、実施例１ａ）は、Ａｇｌａｉａ ｆｏｖｅｏｌａｔａから単離されたロカグレート誘導体であり（Ｐａｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．３１：９２４－９３９）、ｐ５３活性とは独立してＧ２／Ｍチェックポイント遺伝子を制御する（Ｍｉ，Ｑ．ｅｔ ａｌ（２００６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２６（５Ａ）：３３４９－５６）。シルベストロール及び類似体は、強力かつ選択的なタンパク質合成阻害剤であり、それらの抗過剰増殖特性について研究されている（Ｌｉｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５（２０）：８８５９－８８７８、ＷＯ２０１５／０８５２２１、ＷＯ２０１３０１６６５８、ＷＯ２００４０４１８１２、ＵＳ８１３７５０９、ＵＳ８４０４０８８、ＷＯ２００６００７６３４、ＵＳ７８１６５４４）。シルベストロールは、以下の構造を有する。
Figure 0007043425000008
式ＩＩのシルベストロール－リンカー中間体は、実施例の手順に従って調製される。
Figure 0007043425000009
式中、
Ｒａは、ＣＨ３Ｏ、ＣＮ、ＮＯ２、及びＣｌから選択される基であり、
Ｒ１は、－ＯＣＨ３及びＬ－Ｘから選択され、
Ｒ２は、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ及びＬ－Ｘから選択され、
Ｌは、リンカーであり、
Ｘは、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ－トルエンスルホン酸、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基を含む。
例示的な一実施形態において、Ｌ－Ｘは、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｘ、－ＣＨ２ＣＲ２－Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＣＨ２－Ｘ、－ＣＨ２Ｏ－Ｘ、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）（Ｃ１－Ｃ１２アルキレン）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）（Ｃ２-Ｃ８アルケニレン）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）（Ｃ２－Ｃ８アルキニレン）－Ｘ、及び－Ｎ（Ｒ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｘから選択され、
ｎは、１～６であり、
Ｒは独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、及びＣ６－Ｃ２０アリールから選択されるか、または２つのＲが、Ｃ３－Ｃ７炭素環状環を形成し、
アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、及びアリールは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＯ２、及びＯＣＨ３から選択される１つ以上の基で任意で置換される。
例示的な一実施形態において、アルキレンは、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、及び－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－から選択される。
例示的な一実施形態において、Ｘは、
Figure 0007043425000010
から選択され、式中、波線は、Ｌへの結合を示し、
Ｒ３は、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、またはＢｒであり、ｑは、０、１、または２である。
例示的な一実施形態において、Ｒ１は、－ＯＣＨ３であり、Ｒ２は、Ｌ－Ｘである。
例示的な一実施形態において、Ｒ１は、Ｌ－Ｘであり、Ｒ２は、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨである。
例示的な一実施形態において、Ｌは、式、
－Ｓｔｒ－ＰＭ－Ｙ－
を有する、プロテアーゼ－切断可能な非ペプチドリンカーであり、式中、Ｓｔｒは、Ｘに共有結合したストレッチャー単位であり、ＰＭは、ペプチドミメティック単位であり、Ｙは、シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である。
ペプチドミメティックリンカーは、ＷＯ２０１５／０９５２２７、ＷＯ２０１５／０９５１２４、またはＷＯ２０１５／０９５２２に記載され、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
例示的な一実施形態において、Ｓｔｒは、（ＣＨ２）５である。
例示的な一実施形態において、ＰＭは、式、
Figure 0007043425000011
を有し、式中、Ｒ７及びＲ８は一緒になって、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
ＡＡは、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である。
例示的な一実施形態において、Ｒ７及びＲ８は一緒になって、シクロブチルを形成する。
例示的な一実施形態において、Ｙは、パラ－アミノベンジルまたはパラ－アミノベンジルオキシカルボニルを含む。
例示的な一実施形態において、Ｌは、式、
－Ｓｔｒ－Ｐｅｐ－Ｙ－
を有するペプチドリンカーであり、式中、Ｓｔｒは、抗体に共有結合したストレッチャー単位であり、Ｐｅｐは、２～１２個のアミノ酸残基のペプチドであり、Ｙは、シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である。
例示的な一実施形態において、Ｓｔｒは、（ＣＨ２）５である。
いくつかの実施形態において、Ｓｔｒは、以下を含み、式中、波線は、抗体、薬物、または追加のリンカー構成成分への共有結合の部位を示す。
Figure 0007043425000012
例示的な一実施形態において、Ｐｅｐは、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、バリン、及びシトルリンから独立して選択される２個のアミノ酸残基を含む。
例示的な一実施形態において、シルベストロール－リンカー中間体化合物は、表５の化合物から選択される。
シルベストロール－リンカー中間体化合物（ＬＤ）は、従来の方法及び実施例１～３に従って精製及び単離され得る。精製及び単離方法は、当技術分野で既知であり、沈殿、結晶化、濾過、遠心分離、限外濾過、及び様々なクロマトグラフ技術を含む。クロマトグラフィーは、例えば、逆位相及び順相、サイズ排除、イオン交換、高、中、及び低圧液体クロマトグラフィー方法及び装置、小規模分析、擬似移動床（ＳＭＢ）及び分取薄層または厚層クロマトグラフィー、ならびに小規模薄層及びフラッシュクロマトグラフィーの技術を含む、任意の数の方法を伴い得る。いくつかのそのような態様において、完成した反応混合物は、乾燥するまで蒸発させ、続いて、極性非プロトン性溶媒中で再溶解され得る。この溶液は濾過され、その後、例えば、ヘキサンまたはシクロヘキサンなどの無極性貧溶媒と、溶液を組み合わせることによって沈殿され得る。その後、沈殿物は、濾過によって採取され、任意で洗浄され、その後、乾燥され得る。
表５ シルベストロール－リンカー中間体
Figure 0007043425000013
Figure 0007043425000014
抗体－薬物コンジュゲート
本発明は、式Ｉａ及びＩｂから選択される、リンカーを通してシルベストロール薬物部分に共有結合した抗体を有する抗体－薬物コンジュゲート化合物、
Figure 0007043425000015
またはその薬学的に許容される塩であって、
式中、
Ｒａは、ＣＨ３Ｏ、ＣＮ、ＮＯ２、及びＣｌから選択される基であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｐは、１～８の整数であり、
Ａｂは、１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体である、抗体－薬物コンジュゲート化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
例示的な一実施形態において、抗体は、（１）～（５３）、
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、
（４）ＭＵＣ１６（０７７２Ｐ、ＣＡ１２５）、
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、
（６）Ｎａｐｉ２ｂ（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、ならびに短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌種由来の成長因子）、
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ７３７９２）、
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、
（１７）ＨＥＲ２、
（１８）ＮＣＡ、
（１９）ＭＤＰ、
（２０）ＩＬ２０Ｒα、
（２１）ブレビカン、
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、
（２３）ＡＳＬＧ６５９、
（２４）ＰＳＣＡ、
（２５）ＧＥＤＡ、
（２６）ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３）、
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）、
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ）、
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１）、
（３０）ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）、
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）、
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、
（３５）ＦｃＲＨ５（ＩＲＴＡ２、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２）、
（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）、
（３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン－１）、
（３９）ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ－アルファ１、ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）、
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）、
（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、ＳＨＩＳＡ２）、
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）、
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ－ＥＬＥ１）、
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータ－ヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、
（５２）ＣＤ３３、ならびに
（５３）ＣＬＬ－１から選択される１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する。
例示的な一実施形態において、Ａｂは、抗ＨＥＲ２ ４Ｄ５、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３３、抗Ｌｙ６Ｅ、抗Ｎａｐｉ３ｂ、抗ＨＥＲ２ ７Ｃ２、及び抗ＣＬＬ－１から選択される。
例示的な一実施形態において、Ａｂは、システイン操作された抗体である。
例示的な一実施形態において、システイン操作された抗体は、ＨＣ Ａ１１８Ｃ、ＬＣ Ｋ１４９Ｃ、ＨＣ Ａ１４０Ｃ、ＬＣ Ｖ２０５Ｃ、ＬＣ Ｓ１２１Ｃ、及びＨＣ Ｌ１７７Ｃから選択される変異体である。
例示的な一実施形態において、Ｌは、式、
－Ｓｔｒ－ＰＭ－Ｙ－
を有する、プロテアーゼ－切断可能な非ペプチドリンカーであり、式中、Ｓｔｒは、抗体に共有結合したストレッチャー単位であり、ＰＭは、ペプチドミメティック単位であり、Ｙは、シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である。
例示的な一実施形態において、Ｓｔｒは、式、
Figure 0007043425000016
を有し、式中、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２、及びＣ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン－３－イル）からなる群から選択され、ｒは、１～１０の範囲の整数である。
例示的な一実施形態において、Ｒ６は、（ＣＨ２）５である。
例示的な一実施形態において、ＰＭは、式、
Figure 0007043425000017
を有し、式中、Ｒ７及びＲ８は一緒になって、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
ＡＡは、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である。
例示的な一実施形態において、Ｙは、パラ－アミノベンジルまたはパラ－アミノベンジルオキシカルボニルを含む。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000018
を有し、式中、Ｄは、シルベストロール薬物部分である。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、以下の式を有する。
Figure 0007043425000019
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、以下の式を有する。
Figure 0007043425000020
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、以下の式を有する。
Figure 0007043425000021
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000022
から選択される。
例示的な一実施形態において、Ｌは、式、
－Ｓｔｒ－Ｐｅｐ－Ｙ－
を有するペプチドリンカーであり、式中、Ｓｔｒは、抗体に共有結合したストレッチャー単位であり、Ｐｅｐは、２～１２個のアミノ酸残基のペプチドであり、Ｙは、シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である。
例示的な一実施形態において、Ｓｔｒは、式、
Figure 0007043425000023
を有し、式中、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２、及びＣ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン－３－イル）からなる群から選択され、ｒは、１～１０の範囲の整数である。
例示的な一実施形態において、Ｒ６は、（ＣＨ２）５である。
例示的な一実施形態において、Ｐｅｐは、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、バリン、及びシトルリンから独立して選択される２～１２個のアミノ酸残基を含む。
例示的な一実施形態において、Ｐｅｐは、バリン－シトルリン、アラニン－フェニルアラニン、及びフェニルアラニン－リジンから選択される。
例示的な一実施形態において、Ｙは、パラ－アミノベンジルまたはパラ－アミノベンジルオキシカルボニルを含む。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000024
を有し、式中、ＡＡ１及びＡＡ２は独立して、アミノ酸側鎖から選択される。
例示的な一実施形態において、アミノ酸側鎖は独立して、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択される。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000025
を有する。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000026
を有する。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000027
を有する。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000028
を有する。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000029
を有する。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000030
を有する。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、式、
Figure 0007043425000031
を有する。
例示的な一実施形態において、Ｌは、ジスルフィド基を含む。
例示的な一実施形態において、ｐは、１、２、３、または４である。
例示的な一実施形態において、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、抗体－薬物コンジュゲート化合物の混合物を含み、抗体－薬物コンジュゲート化合物の混合物中の１抗体当たりの平均薬物負荷は、約２～約５である。
本発明の抗体－薬物コンジュゲート化合物は、抗がん活性を有するものを含む。本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、有効用量の薬物を腫瘍組織に選択的に送達し、それによって治療指数（「治療濃度域」）を増加させながら、より高い選択性（すなわち、より低い効果的用量）が達成され得る。
薬物負荷は、式Ｉの分子内の１抗体当たりのシルベストロール薬物部分の数である、ｐによって表される。薬物負荷は、１抗体当たり１～約８個の薬物部分（Ｄ）の範囲であり得る。式Ｉの抗体－薬物コンジュゲートは、１～約８個の範囲の薬物部分にコンジュゲートされた抗体の混合物または集団を含む。いくつかの実施形態において、抗体にコンジュゲートされ得る薬物部分の数は、遊離システイン残基の数によって限定される。いくつかの実施形態において、遊離システイン残基は、本明細書に記載される方法によって抗体アミノ酸配列内に導入される。そのような態様において、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８、及びこれらの範囲（１～８または２～５など）であり得る。任意のそのような態様において、ｐ及びｎは等しい（すなわち、ｐ＝ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、もしくは８、またはそれらの間のいくつかの範囲）。式Ｉの例示的な抗体－薬物コンジュゲートとしては、１、２、３、または４つの操作されたシステインアミノ酸を有する抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｙｏｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．５０２：１２３－１３８）。いくつかの実施形態において、１つ以上の遊離システイン残基が、操作を使用することなく抗体内に既に存在しており、その場合、既存の遊離システイン残基を使用して、抗体を薬物にコンジュゲートしてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、１つ以上の遊離システイン残基を生成するために、抗体のコンジュゲーション前に還元条件に曝露される。コンジュゲーション反応から抗体－薬物コンジュゲートを調製する上での１抗体当たりの薬物部分の平均数（ＤＡＲ）は、質量分析法、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けることができる。ｐの点から抗体－薬物コンジュゲートの定量的分布もまた、決定することができる。場合によっては、ｐが特定の値である同種の抗体－薬物コンジュゲートを、他の薬物負荷を有する抗体－薬物コンジュゲートから分離し、精製し、かつ特徴付けることは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動法などの手段によって達成され得る。
いくつかの抗体－薬物コンジュゲートでは、ｐは、抗体上の結合部位の数によって限定され得る。例えば、本明細書に記載される特定の例示的な実施形態におけるように、結合がシステインチオールである場合、抗体は、１個のみもしくは限定された数のシステインチオール基を有し得るか、または１個のみもしくは限定された数の反応性が十分なチオール基を有し得、それに、薬物が結合され得る。特定の実施形態において、薬物負荷がより高くなると、例えば、ｐが５を超えると、特定の抗体－薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の喪失が引き起こされ得る。特定の実施形態において、抗体－薬物コンジュゲートの平均薬物負荷は、１～約８、約２～約６、または約３～約５の範囲である。実際、特定の抗体－薬物コンジュゲートでは、１抗体当たりの薬物部分の最適な比率は、８未満であり得、約２～約５でもあり得ることが示されている（例えば、ＵＳ７４９８２９８を参照されたい）。
特定の実施形態において、理論上の最大数よりも少ないシルベストロール薬物部分が、コンジュゲーション反応中に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、本明細書において考察されるように、薬物と反応しないシステイン残基を含有し得る。一般に、抗体は、薬物部分に連結され得る多くの遊離及び反応性システインチオール基を含有せず、実際、抗体内のほとんどの天然システインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。特定の実施形態において、抗体は、部分または完全還元条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤によって還元されて、反応性システインチオール基が生成され得る。特定の実施形態において、抗体は、リジンまたはシステインなどの反応性求核性基を明らかにするために、変性条件に供される。
抗体－薬物コンジュゲートの負荷（薬物／抗体比）は、異なる方式で、ならびに例えば、（ｉ）抗体と比較してモル過剰のシルベストロール－リンカー中間体化合物を制限すること、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度を制限すること、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的または制限的還元条件によって制御され得る。
２つ以上の求核性基が薬物と反応する場合、結果として生じる産生物は、抗体に結合した１つ以上の薬物部分が分布する抗体－薬物コンジュゲート化合物の混合物であることを理解されたい。１抗体当たりの薬物の平均数は、抗体及び薬物に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって混合物から計算され得る。個々の抗体－薬物コンジュゲート分子は、質量分析法によって混合物中で特定され、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、分離され得る（例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ１９（７）：２９９－３０７、Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３－７０７０、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３０ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ２７－３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４、Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ２７－３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ４５，Ｍａｒｃｈ２００４を参照されたい）。特定の実施形態において、単一の負荷値を有する同種の抗体－薬物コンジュゲートが、電気泳動法またはクロマトグラフィーによってコンジュゲーション混合物から単離され得る。
いくつかの態様において、抗体は、本明細書の別の箇所に記載されるシステイン操作された抗体であり得る、及び／またはコンジュゲーション反応における反応性のために還元剤で処理され得る。Ａｂは、抗体の安定性または抗原結合特異性に悪影響を及ぼさない、当該技術分野で既知である生理学的緩衝液系に溶解される。いくつかの態様において、リン酸緩衝生理食塩水が使用される。シルベストロール－リンカー中間体化合物は、本明細書の別の箇所に記載される少なくとも１つの極性非プロトン性溶媒を含む溶媒系に溶解される。いくつかのそのような態様において、シルベストロール－リンカー中間体は、ｐＨ８のトリス緩衝液（例えば、５０ｍＭのトリス）中に、約５ｍＭ、１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭ、及びこれらの範囲、例えば、約５０ｍＭ～約５０ｍＭまたは約１０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度になるまで溶解される。いくつかの態様において、シルベストロール－リンカー中間体は、ＤＭＳＯもしくはアセトニトリル中、またはＤＭＳＯ中に溶解される。コンジュゲーション反応において、当量過剰のシルベストロール－リンカー中間体溶液は、希釈され、冷却された抗体溶液（例えば、約１℃～約１０℃）と組み合わされる。シルベストロール－リンカー中間体溶液は、少なくとも１つの極性非プロトン性溶媒及び少なくとも１つの極性プロトン性溶媒で好適に希釈され得、これらの例としては、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、及び酢酸が挙げられる。いくつかの特定の態様において、シルベストロール－リンカー中間体は、ＤＭＳＯ中に溶解され、抗体溶液との混合前に、アセトニトリル及び水で希釈される。シルベストロールの抗体に対する当量は、好適に、約１．５：１、約３：１、約５：１、約１０：１、約１５：１または約２０：１、及びこれらの範囲内、例えば、約１．５：１～約２０：１、約１．５：１～約１５：１、約１．５：１～約１０：１、約３：１～約１５：１、約３：１～約１０：１、約５：１～約１５：１、または約５：１～約１０：１であり得る。反応は、（本明細書の別の箇所に記載される）ＬＣ－ＭＳなどの当該技術分野で既知の方法によって完了について好適に監視され得、反応は典型的には、約１時間～約２４時間で完了する。反応が完了した後、試薬を反応混合物に添加して、反応を停止させ、未反応の抗体チオール基をキャッピングする。好適な試薬の一例は、エチルマレイミドである。
実施例５に従うコンジュゲーション後に、抗体－シルベストロールコンジュゲートは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、限外濾過、遠心限外濾過、及びこれらの組み合わせなどであるが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の精製方法によって、精製され、非コンジュゲート反応体及び／またはコンジュゲート凝集体から分離され得る。例えば、精製の前には、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）中などでの抗体－シルベストロールコンジュゲートの希釈が行われ得る。希釈した溶液は、カチオン交換カラムに適用され、続いて、例えば、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄される。コンジュゲートは、ＰＢＳで好適に溶出され得る。
表６ 抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
Figure 0007043425000032
Figure 0007043425000033
ＤＡＲ＝薬物／抗体比平均
Ａ１１８Ｃ（ＥＵ番号付け）＝Ａ１２１Ｃ（連続的番号付け）＝Ａ１１４Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）
野生型（「ＷＴ」）、システイン操作された変異抗体（「チオ」）、軽鎖（「ＬＣ」）、重鎖（「ＨＣ」）、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン－シトルリン（「ｖａｌ－ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン－フェニルアラニン（「ａｌａ－ｐｈｅ」）、ｐ－アミノベンジル（「ＰＡＢ」）、及びｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢＣ」）
インビトロ細胞増殖アッセイ
一般に、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞毒性または細胞増殖抑制性活性は、受容体タンパク質（例えば、ＨＥＲ２）を有する哺乳動物細胞を細胞培養培地中でＡＤＣの抗体に曝露し、細胞を約６時間～約５日間の期間培養し、細胞生存率を測定することによって測定される。細胞に基づくインビトロアッセイを使用して、本発明のＡＤＣの生存率（増殖）、細胞毒性、及びアポトーシス（カスパーゼ活性化）の誘導を測定した。
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のインビトロでの効力を、細胞増殖アッセイによって測定した（実施例６）。本発明のＡＤＣは、腫瘍細胞増殖を阻害する上で驚くべきかつ予想外の効力を示した。ＡＤＣの効力は、細胞の標的抗原発現と相関した。試験したコンジュゲートは、細胞の表面上で発現される特定の抗原に結合し、インビトロでそれらの細胞の死を引き起こすことができる。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイは、甲虫目ルシフェラーゼの組み換え発現に基づく市販（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の同種アッセイ法である（ＵＳ５５８３０２４、ＵＳ５６７４７１３、ＵＳ５７００６７０）。この細胞増殖アッセイは、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量化に基づいて、培養物中の生細胞の数を決定する（Ｃｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１－８８、ＵＳ６６０２６７７）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは９６ウェル形式で実行し、自動化高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）にとって扱いやすくした（Ｃｒｅｅ ｅｔ ａｌ（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ６：３９８－４０４）。同種アッセイ手順は、単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を、血清補充培地で培養した細胞に直接添加することを伴う。細胞の洗浄、培地の除去、及び複数回のピペッティングステップは必要ない。このシステムは、３８４ウェル形式で、試薬の添加及び混合の後、１０分間で１５個の細胞／ウェルほどの少量の細胞を検出する。細胞をＡＤＣで継続的に処理してもよく、またはそれらを処理し、ＡＤＣから分離してもよい。一般に、短時間（すなわち、３時間）処理した細胞は、継続的に処理した細胞と同じ効力の作用を示した。
インビトロでの細胞増殖の阻害は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存率アッセイを使用してアッセイすることができ、その一実施形態を実施例６に詳述する。そのようなアッセイは、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量化に基づいて、培養物中の生細胞の数を決定する（Ｃｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１－８８、ＵＳ６６０２６７７）。アッセイは９６ウェルまたは３８４ウェル形式で実行して、自動化高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）にとって扱いやすくしてもよい。Ｃｒｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ６：３９８－４０４を参照されたい。アッセイ手順は、単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を培養細胞に直接添加することを伴う。これにより、細胞溶解及びルシフェラーゼ反応によって産生される発光シグナルの生成がもたらされる。発光シグナルは存在するＡＴＰの量に比例し、これは培養物中に存在する生細胞の数に直接比例する。データは、ルミノメーターまたはＣＣＤカメラ画像化デバイスによって記録することができる。発光出力は、相対発光単位（ＲＬＵ）として表される。
この同種「添加－混合－測定」形式は、細胞溶解、及び存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルの生成をもたらす。ＡＴＰの量は、培養物中に存在する細胞数に直接正比例する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、ルシフェラーゼ反応により産生される「グロー型」発光シグナルを生成し、これは、使用される細胞型及び培地に応じて半減期が通常５時間を超える。生細胞は、相対発光単位（ＲＬＵ）で反映される。甲虫ルシフェリンという基質は、組み換えホタルルシフェラーゼによって酸化により脱炭酸され、同時にＡＴＰからＡＭＰへの変換及び光子の生成が起こる。
細胞に基づくインビトロアッセイを使用して、本発明のＡＤＣの生存率（増殖）、細胞毒性、及びアポトーシス（カスパーゼ活性化）の誘導を測定する。一般に、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞毒性または細胞増殖抑制性活性は、Ｈｅｒ２またはＭＵＣ１６ポリペプチドなどの抗原を発現する哺乳動物細胞を細胞培養培地中でＡＤＣに曝露し、細胞を約６時間～約５日間の期間培養し、細胞生存率を測定することによって測定される。抗ＭＵＣ１６ＡＤＣの細胞増殖アッセイに有用な哺乳動物細胞としては、（１）ＭＵＣ１６ポリペプチド発現細胞株ＯＶＣＡＲ－３、（２）その細胞表面上にＭＵＣ１６ポリペプチドの一部分を安定して発現するように操作されたＰＣ３由来細胞株（ＰＣ３／ＭＵＣ１６）、（３）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しない親ＰＣ３細胞株、及び（４）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しないが、外因性ＭＵＣ１６発現を駆動するために使用されるベクターを担持するＰＣ３細胞株（ＰＣ３／ネオ）が挙げられ得る。
図１Ａ及び１Ｂは、ＳＫ－ＢＲ－３（図１Ａ）細胞及びＫＰＬ－４（図１Ｂ）細胞中のＡＤＣの濃度（μｇ／ｍｌ）に対する、５日でのインビトロ細胞生存率のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。細胞を９６ウェルプレートにプレーティング（ＳＫ－ＢＲ－３は５０００個の細胞／ウェル、ＫＰＬ－４は１５００個の細胞／ウェル）し、一晩接着させた（実施例６に従って実行した）。その後、培地を除去し、異なる濃度のコンジュゲートを含有する新鮮な培養培地で置き換えた。薬物投与の５日後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを使用して細胞生存率を測定した。ＳＫ－ＢＲ－３（図１Ａ）及びＫＰＬ－４（図１Ｂ）の両方の細胞株中、チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミンであるＡＤＣ－１０３は、チオＨｕ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＨＣ：Ａ１４０Ｃアミノシルベストロール類似体であるＡＤＣ－１０６よりも強力であった。オフターゲット対照、チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ：Ａ１４０Ｃアミノシルベストロール類似体であるＡＤＣ－１０５は、活性ではなかった。
遊離薬物シルベストロールアミン（以下）は、その不透過性のために不活性である一方で、遊離薬物アミノシルベストロール類似体は、活性である（表７）。７Ｃ２アミノシルベストロール類似体（ＡＤＣ－１０６）は、７Ｃ２シルベストロールアミン（ＡＤＣ－１０３）よりも効力が低い。７Ｃ２アミノシルベストロール類似体（ＡＤＣ－１０６）では、二相性用量応答曲線が観察される。遊離薬物アミノシルベストロール類似体は、ｐＭまたは低ｎＭのＩＣ５０を有する一方で、シルベストロールアミン遊離薬物は、その不透過性のためにいかなる活性も示さない。したがって、２つのコンジュゲート間の効力の差異が遊離薬物の効力の差異によって引き起こされるかを決定することは困難である。遊離薬物アミノシルベストロール類似体はＳＫ－ＢＲ－３細胞（１．６ｎＭ）及びＫＰＬ－４細胞（１．２ｎＭ）中で類似のＩＣ５０値を有するものの、７Ｃ２アミノシルベストロール類似体（ＡＤＣ－１０６）は、ＫＰＬ－４細胞中でよりもＳＫ－ＢＲ－３細胞中で低い効力を呈する。
Figure 0007043425000034
表７ 遊離薬物シルベストロール化合物のインビトロ有効性
Figure 0007043425000035
インビボ有効性
本発明の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のインビボ有効性は、マウスにおける腫瘍異種移植片研究によって測定され得る（実施例７～１０）。本発明のＡＤＣは、腫瘍増殖を阻害する上で驚くべきかつ予想外の標的依存性及び用量依存性効力を示した。ＡＤＣの効力は、腫瘍細胞の標的抗原発現と相関した。
齧歯類にがん細胞の同種移植片または異種移植片を埋め込み、腫瘍をＡＤＣで治療することによって、抗体－薬物コンジュゲートの有効性をインビボで測定した。細胞株、がん細胞上に存在する受容体へのＡＤＣの抗体結合の特異性、投薬レジメン、及び他の要因に応じて、可変的な結果が予想される。中～高レベルの腫瘍関連抗原（Ｈｅｒ２発現ＫＰＬ４及びＣＤ２２発現ＢＪＡＢを含む）を発現するトランスジェニック外植マウスモデルを使用して、ＡＤＣのインビボ有効性を測定した。対象はＡＤＣで一度治療し、３～６週間にわたって監視して、腫瘍倍増、ログ細胞殺滅、及び腫瘍収縮までの時間を測定した。経過観察の用量応答実験及び複数回用量実験を実行した。
例えば、本発明の抗ＨＥＲ２ ＡＤＣのインビボ有効性は、高発現ＨＥＲ２トランスジェニック外植マウスモデルによって測定され得る（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：９２８０－９０）。同種移植片を、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）療法に応答しないか、または応答が不良であるＦｏ５ ｍｍｔｖトランスジェニックマウスから増殖させる。対象は、特定の用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）のＡＤＣ及びプラセボ緩衝液対照（ビヒクル）で一度以上治療し、２週間以上にわたって監視して、腫瘍倍増、ログ細胞殺滅、及び腫瘍収縮までの時間を測定する（実施例７に従って実行する）。
図２は、
１）ビヒクル（ＨｉｓＡｃ ２０ｍＭ、Ｓｕｃｒ ２４０ｍＭ、ＴＷ－２０ ０．０２％（ｐＨ５．５））、１００ｕＬ、静脈内に一度
２）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度、
３）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度、
４）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度、
５）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度、
６）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度、を静脈内に一度投薬した後に実施例９に従って実行される、ＣＢ－１７ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスにおけるＣＤ２２発現Ｂｊａｂ－ｌｕｃヒト異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。
ビヒクル群と比較して、ＣＤ２２シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）の試験した全ての用量レベルについて活性が見られる。１及び３ｍｇ／ｋｇで投薬したＡＤＣ－１０４は中程度の活性を示し、６及び１０ｍｇ／ｋｇはおよそ静止状態である。３ｍｇ／ｋｇで投薬したＨｅｒ２対照シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）では、いくらかの成長遅延が存在する。安全信号として、体重減少は見られない。腫瘍阻害の証拠を観察したが、腫瘍体積は高度に可変的であったため、決定的ではなかった。
図３は、実施例１０に従って実行される、ｓｃｉｄベージュマウスにおけるＨＥＲ２発現ＫＰＬ４ヒト乳腺異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。
１）ビヒクル（ＨｉｓＡｃ ２０ｍＭ、Ｓｕｃｒ ２４０ｍＭ、ＴＷ－２０ ０．０２％（ｐＨ５．５））、１００ｕＬ、静脈内に一度
２）シルベストロール、０．０９ｍｇ／ｋｇ、静脈内に一度
３）シルベストロール、１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内ｑｄ×５で２週間
４）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
５）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
６）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
７）チオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
８）チオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
ビヒクル及びオフターゲット対照ＡＤＣ－１０４と比較して、抗ＨＥＲ２ ７Ｃ２シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）の試験した全ての用量レベルについて活性が見られる。１及び３ｍｇ／ｋｇで投薬したＡＤＣ－１０３は中程度の活性を示し、６及び１０ｍｇ／ｋｇはおよそ静止状態である。３ｍｇ／ｋｇで投薬したＣＤ２２対照シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）では、いくらかの成長遅延は存在しない。安全信号として、体重減少は見られない。
図４は、ＣＢ－１７ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスにおけるＣＤ－２２発現Ｂｊａｂ－ｌｕｃヒト異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。
１）ビヒクル（ヒスチジン緩衝液番号８）、１００μＬ、静脈内に一度
２）チオＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０４）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
３）チオＨｅｒ２（７Ｃ２）ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０３）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
４）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
５）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
６）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
７）チオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
８）チオＨｅｒ２（７Ｃ２）ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０６）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
９）チオＨｅｒ２（７Ｃ２）ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０６）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
２つの用量レベルのＨｅｒ２（７Ｃ２）ＨＣ Ａ１４０Ｃ ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノシルベストロール（ＡＤＣ－１０６）、及びＨｅｒ２（７Ｃ２）ＬＣ Ｋ１４９Ｃ ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロールアミン（ＡＤＣ－１０３）が対照として存在する。安定性分析のための血漿を、１、３、及び７日目に群７（１０ｍｇ／ｋｇの用量のチオＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０５））から採取した。１０ｍｇ／ｋｇで投薬したＣＤ２２ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロールアミン（ＡＤＣ－１０４）は、腫瘍静止状態（１０２％のＴＧＩ）をもたらす。図２の結果と比較して、動物が治療に対して良好に応答するか、または全く応答しないかのいずれかだった場合、これらの結果により、腫瘍の静的応答が確認されているようである（５匹中５匹の動物が腫瘍静止状態であるが、退縮に向かう傾向がある）。１０ｍｇ／ｋｇで投薬した対照Ｈｅｒ２（７Ｃ２）ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロールアミン（ＡＤＣ－１０３）は、３２％のＴＧＩをもたらす。１～１０ｍｇ／ｋｇで投薬したＣＤ２２ ＨＣ－Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＣＮＪ３５９２、Ｇ０３０６３１９４）は、１ｍｇ／ｋｇで中程度のＴＧＩ（８１％）、及びそれより高い用量で退縮をもたらす。また、２つの１０ｍｇ／ｋｇ用量（群２対群７）を比較すると、アミノ－シルベストロールは、シルベストロール－アミンよりも強力であるようであるが、それらは２つの異なる結合部位にあることが警告される。対照Ｈｅｒ２（７Ｃ２）ＨＣ Ａ１４０Ｃ－ＭＣ－ｖｃＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＣＮＪ３５９３、Ｇ０３０６３１９４）：３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量は、類似の中程度の応答（３０～４０％のＴＧＩ）をもたらす。全ての用量群において体重減少は観察されない。
図５は、ＣＢ－１７ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスにおけるＣＤ－２２発現Ｂｊａｂ－ｌｕｃヒト異種移植片モデルでの、経時的なインビボ適合腫瘍体積変化のプロットにおける抗体－薬物コンジュゲートの有効性を示す。
１）ビヒクル（ヒスチジン緩衝液番号８）、１００ｕＬ、静脈内に一度
２）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１１０）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
３）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１１０）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
４）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１１０）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
５）チオＨｕ抗ＬＹ６Ｅ ９Ｂ１２ｖ１２ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミン（ＡＤＣ－１０９）、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
６）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、０．３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
７）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
８）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、３ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
９）チオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０８）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
１０）チオＨｕ抗ＬＹ６Ｅ ９Ｂ１２ｖ１２ ＬＣ Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｓｑ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－アミノ－シルベストロール（ＡＤＣ－１０７）、６ｍｇ／ｋｇで静脈内に一度
シルベストロールアミン（ＡＤＣ－１１０）は、１０ｍｇ／ｋｇ（群４）で中程度の応答をもたらし、２０日目に８１％の腫瘍成長阻害をもたらした。アミノシルベストロール（ＡＤＣ－１０８）は、３ｍｇ／ｋｇ（群８）で完全な腫瘍退縮をもたらした。いずれの場合も、有効性は用量依存性であり、より低い用量はより低い応答をもたらした。ＣＤ２２ ＡＤＣ（ＡＤＣ－１０８及びＡＤＣ－１１０）と、非標的（ＬＹ６Ｅ）対照ＡＤＣであるＡＤＣ－１０９（群５）及びＡＤＣ－１０７（群１０）の両方との間には分離が存在したため、有効性はまた標的特異的でもあった。
薬学的製剤
本発明の治療抗体－薬物コンジュゲートの薬学的製剤は典型的には、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望される程度の純度を有し、かつ１つ以上の任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／またはビヒクルを有する単位投薬量の注射可能な形態で、非経口投与、すなわち、ボーラス、静脈内、腫瘍内注射のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。薬学的に許容される担体は一般に、レシピエントに対し、用いられる投薬量及び濃度で無毒であり、緩衝液（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／または非イオン性界面活性剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）など）などの介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体または免疫コンジュゲート製剤が、ＵＳ６２６７９５８に記載されている。水性抗体製剤または免疫コンジュゲート製剤としては、ＵＳ６１７１５８６及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが挙げられ、後者の製剤にはヒスチジン－酢酸緩衝液が含まれる。
本明細書における製剤はまた、治療されている特定の適応症に必要とされる２つ以上の活性成分、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、またはマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体または免疫コンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。
インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成され得る。
治療方法
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、例えば、腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする様々な疾患または障害を治療するために使用され得ることが企図される。例示的な病態または過剰増殖性障害としては、良性または悪性の固形腫瘍、ならびに血液疾患（白血病及びリンパ系腫瘍など）が挙げられる。他には、ニューロン性、膠細胞性、星状細胞性、視床下部性、腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性、炎症性、血管新生性、及び免疫性（自己免疫性を含む）障害が挙げられる。
一態様において、本明細書に提供される抗体－薬物コンジュゲートは、がん細胞の増殖を阻害する方法において使用され、この方法は、抗体または抗体－薬物コンジュゲートが細胞の表面上の腫瘍関連抗原に結合することを許容する条件下で、細胞を抗体－薬物コンジュゲートに曝露し、それにより細胞の増殖を阻害することを含む。特定の実施形態において、この方法は、インビトロ方法またはインビボ方法である。更なる実施形態において、細胞は、リンパ球、リンパ芽球、単球、または骨髄単球細胞である。
別の態様において、医薬品としての使用のための抗体－薬物コンジュゲートが提供される。更なる態様において、治療方法における使用のための抗体－薬物コンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、がんの治療における使用のための抗体－薬物コンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、本発明は、有効量の抗体－薬物コンジュゲートを個体に投与することを含む、個体を治療する方法における使用のための抗体－薬物コンジュゲートを提供する。そのような一実施形態において、この方法は、例えば、本明細書に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる一態様において、本発明は、医薬品の製造または調製における抗体－薬物コンジュゲートの使用を提供する。一実施形態において、医薬品は、がんの治療のためのものであり、その方法は、がんを有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。そのような一実施形態において、この方法は、例えば、本明細書に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる一態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施形態において、この方法は、腫瘍関連発現抗原の検出を特徴とする、そのようながんを有する個体に、本発明の有効量の抗体－薬物コンジュゲートを投与することを含む。そのような一実施形態において、この方法は、本明細書に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、治療において、単独で、または他の薬剤との組み合わせでのいずれかで使用され得る。例えば、本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、化学療法剤などの少なくとも１つの追加の治療剤とともに同時投与され得る。
本明細書に記載されるそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別個の製剤中に含まれる場合）、ならびに本発明の抗体－薬物コンジュゲートの投与が、追加の治療剤及び／またはアジュバントの投与の前、それと同時、及び／またはそれに続いて生じ得る、別個投与を包含する。本発明の抗体－薬物コンジュゲートはまた、放射線療法と組み合わせても使用することができる。
本発明の抗体－薬物コンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所治療で所望される場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、部分的には、投与が短時間であるか、または慢性的であるかに応じて、例えば、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるものであり得る。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない、様々な投薬スケジュールが本明細書において企図される。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、良好な医療慣例と一致する様式で、製剤化、投薬、及び投与されるだろう。この文脈において考慮すべき要因としては、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に既知である他の要因が挙げられる。抗体－薬物コンジュゲートは、任意で、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化されるが、その必要はない。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体－薬物コンジュゲートの量、障害または治療の種類、ならびに本明細書に考察される他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同じ投薬量及び投与経路で使用されるか、または本明細書に記載される投薬量の約１～９９％、もしくは経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体－薬物コンジュゲートの適切な投薬量（単独で、または１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体または免疫コンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、抗体－薬物コンジュゲートが予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体－薬物コンジュゲートへの応答、ならびに主治医の裁量に依存するだろう。抗体－薬物コンジュゲートは、一度に、または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるものであれ、継続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体－薬物コンジュゲートが、患者への投与のための初回候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、本明細書において言及される要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に応じて数日間以上にわたる反復投与の場合、治療は一般に、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続されるだろう。抗体－薬物コンジュゲートの一例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であるだろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、または例えば、約６回の用量の抗体を受けるように）投与されてもよい。より高い初回負荷用量に続いて、１回以上のより低い用量が投与されてもよい。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
標的細胞内での抗体－シルベストロールコンジュゲートからのシルベストロールの細胞内放出は、活性シルベストロール部分を放出するためのリンカー単位の切断（ペプチドまたはペプチドミメティック単位のグルタチオンまたはプロテアーゼ切断によるジスルフィドリンカー結合の還元的切断など）から生じると考えられている。グルタチオン媒介放出は、酸不安定性ヒドラジンリンカーなどの先行技術において既知の特定のリンカーと比較して、利点を提供する。より具体的には、グルタチオンの血液濃度は、非常に低い（マイクロモル範囲内など）ことが知られている一方で、細胞内グルタチオン濃度は典型的には、最大３桁より大きい（ミリモル範囲内など）。がん細胞内のグルタチオン濃度は、還元酵素の活性の増加のために、更により大きいと更に考えられる。したがって、本開示のシルベストロール－抗体コンジュゲートは、血流中の改善された安定性及び改善された細胞内放出速度を提供すると考えられている。
製造品
本発明の別の態様において、本明細書に記載される障害の治療、予防、及び／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のもしくは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静脈注射用溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の組成物との組み合わせで、障害の治療、予防、及び／または診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択される病態を治療するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体－薬物コンジュゲートを含む組成物を内部に収容した第１の容器と、（ｂ）更なる細胞毒性剤またはさもなければ治療剤を含む組成物を内部に収容した第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、または加えて、製造品は、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器を更に含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書に提供される概要を考慮して、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
実施例１ａシルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５１（表５）。（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（４Ｒ）－２－（４－（（Ｓ）－２－（１－（（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）カルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）－５－ウレイドペンタンアミド）フェニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレートＬＤ－５１の合成
ステップ１：１－（５－アミノペンチル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオンヒドロクロリド１０ａの調製
Figure 0007043425000036
無水マレイン酸、フラン－２，５－ジオン（１５０ｇ、１．５３ｍｏｌ）を、６－アミノヘキサン酸（２０１ｇ、１．５３ｍｏｌ）のＨＯＡｃ撹拌溶液（１０００ｍＬ）に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した後、それを還流で８時間加熱した。有機溶媒を減圧下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ×３回）で抽出し、Ｈ２Ｏで洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、粗産生物を得た。それを石油エーテルで洗浄して、６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサン酸を白色固体（２５０ｇ、７７．４％）として得た。ＤＰＰＡ（１３０ｇ、４７３ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４７．９ｇ、４７３ｍｍｏｌ）を、６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサン酸（１００ｇ、４７３ｍｍｏｌ）のｔ－ＢｕＯＨ溶液（２００ｍＬ）に添加した。混合物を、Ｎ２下、還流で８時間加熱した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲル（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１）上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチルカルバメート（１３ｇ、１０％）を得た。ｔｅｒｔ－ブチル５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチルカルバメート（２８ｇ、９９２ｍｍｏｌ）の無水ＥｔＯＡｃ溶液（３０ｍＬ）に、ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を滴加した。混合物を室温で５時間撹拌した後、それを濾過し、固体を乾燥させて、１－（５－アミノペンチル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオンヒドロクロリド１０ａ（１６ｇ、７３．７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．０２（ｓ，２Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），３．３７－３．３４（ｍ，２Ｈ），２．７１－２．６４（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．４３（ｍ，４Ｈ），１．２３－１．２０（ｍ，２Ｈ）．
ステップ２：（Ｓ）－１－（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂの調製
Figure 0007043425000037
ジオキサンとＨ２Ｏとの混合物（５０ｍＬ／７５ｍＬ）中、（Ｓ）－２－アミノ－５－ウレイドペンタン酸１０ｇ（１７．５０ｇ、０．１０ｍｏｌ）の混合物に、Ｋ２ＣＯ３（３４．５５ｇ、０．２５ｍｏｌ）を添加した。Ｆｍｏｃ－Ｃｌ（３０．９６ｇ、０．１２ｍｏｌ）を０℃で緩徐に添加した。反応混合物を２時間かけて室温まで温めた。有機溶媒を減圧下で除去し、水スラリーを６ＭのＨＣｌ溶液でｐＨ＝３に調整し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３回）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－５－ウレイドペンタン酸１０ｆ（３８．０ｇ、９５．６％）を得た。１０ｆは、市販されている。
ＤＣＭとＭｅＯＨとの混合物（１００ｍＬ／５０ｍＬ）中１０ｆ（４ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、（４－アミノフェニル）メタノール（１．６ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．３当量）及び２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ登録番号１６３５７－５９－８（３．２ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．３当量））を添加した。混合物を、Ｎ２下、室温で１６時間撹拌した後、それを濃縮して、褐色固体を得た。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）を添加し、それを１５℃で２時間撹拌した。固体を濾過によって採取し、ＭＴＢＥ（５０ｍＬ×２回）で洗浄して、（Ｓ）－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）カルバメート１０ｅを橙色固体（４．２ｇ、８４％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ５０３．０［Ｍ＋１］．
１０ｅ（４．２ｇ、８．３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）撹拌溶液に、ピペリジン（１．６５ｍＬ、１７ｍｍｏｌ、２当量）を室温で滴加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、固体沈殿物が形成された。乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加すると、混合物は直ちに透明になった。混合物を室温で更に３０分間撹拌すると、ＬＣＭＳは１０ｅが消費されたことを示した。それを減圧下で乾燥するまで濃縮し（ピペリジンが残留しないことを確実にし）、残渣を、ＥｔＯＡｃとＨ２Ｏとに分割（５０ｍＬ／２０ｍＬ）した。水相をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×２回）で洗浄し、濃縮して、（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）－５－ウレイドペンタンアミド１０ｄ（少量のＤＭＦを含有）を油性残渣（２．２ｇ、９４％）として得た。
市販の１，１－シクロブタンジカルボン酸、１，１－ジエチルエステル（ＣＡＳ登録番号３７７９－２９－１）を、水性塩基での制限けん化によって半酸／エステル１，１－シクロブタンジカルボン酸、１－エチルエステル（ＣＡＳ登録番号５４４５０－８４－９）へと、ならびにカップリング試薬（ＴＢＴＵ（Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（（ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムテトラフルオロホウ酸とも呼ばれる）、ＣＡＳ番号１２５７００－６７－６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ－２９０３）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドでの活性化によってＮＨＳエステル、１－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）１－エチルシクロブタン－１，１－ジカルボキシレートなど）へと変換した。
１－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）１－エチルシクロブタン－１，１－ジカルボキシレート（８ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）のＤＭＥ溶液（５０ｍＬ）に、１０ｄ（６．０ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（７．４８ｇ、８９．０ｍｍｏｌ）の水溶液（３０ｍＬ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した後、それを減圧下で乾燥するまで濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によって精製して、（Ｓ）－エチル１－（（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）－２－オキソ－６－ウレイドヘキサン－３－イル）カルバモイル）シクロブタンカルボキシレート１０ｃを白色固体（６．４ｇ、６８．７％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４３５．０［Ｍ＋１］
１０ｃ（６．４ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ及びＭｅＯＨ（２０ｍＬ／１０ｍＬ）撹拌溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１．２ｇ、２８．６ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２０ｍＬ）溶液を室温で添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＨＰＬＣによって精製して、（Ｓ）－１－（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂ（３．５ｇ、収率：５８．５％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４０６．９［Ｍ＋１］．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ８．８６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．８８－５．８５（ｍ，１Ｈ），５．７８（ｓ，２Ｈ），４．５４－４．４９（ｍ，３Ｈ），４．３８－４．３２（ｍ，１Ｈ），３．８６－３．７５（ｍ，１Ｈ），３．８４－３．８０（ｍ，２Ｈ），３．２８－３．２１（ｍ，１Ｈ），３．３０－３．２４（ｍ，１Ｈ），３．００－２．８０（ｍ，１Ｈ），２．３７－２．２８（ｍ，２Ｈ）．
ステップ３：Ｓ）－Ｎ－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）－Ｎ－（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）シクロブタン－１，１－ジカルボキサミド１０の調製
Figure 0007043425000038
ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ（１．５９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）及びビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド、ＢＯＰ－Ｃｌ（ＣＡＳ登録番号６８６４１－４９－６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、６９２ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を、（Ｓ）－１－（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂ（１ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に０℃で添加し、その後、１－（５－アミノペンチル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオンヒドロクロリド１０ａ（５９２ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で０．５時間撹拌した。反応混合物の反応をクエン酸溶液（１０ｍＬ）で停止させ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）で抽出した。有機層を乾燥させ、濃縮し、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、Ｓ）－Ｎ－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）－Ｎ－（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）シクロブタン－１，１－ジカルボキサミド１０（１．０ｇ、７１％）（ＭＣ－ＣＢＤＫ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＯＨとも称される）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝５７１．２８．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１０．００（ｓ，１Ｈ），７．８２－７．７７（ｍ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，２Ｈ），５．９５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｓ，２Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４０－４．３５（ｍ，３Ｈ），４．０９（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０５－２．７２（ｍ，４Ｈ），２．６８－２．５８（ｍ，３Ｈ），２．４０－２．３６（ｍ，４Ｈ），１．７２－１．７０（ｍ，３Ｈ），１．４４－１．４２（ｍ，１Ｈ），１．４０－１．２３（ｍ，６Ｈ），１．２１－１．１６（ｍ，４Ｈ）．
ステップ４：（Ｓ）－Ｎ－（１－（４－（クロロメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）－Ｎ－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）シクロブタン－１，１－ジカルボキサミド１１の調製
Figure 0007043425000039
（Ｓ）－Ｎ－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）－Ｎ－（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）シクロブタン－１，１－ジカルボキサミド１０（２．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（５０ｍＬ）溶液を、０℃、液滴で、塩化チオニル（ＳＯＣｌ２）（１．２５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）で少量ずつ処理した。反応物は、黄色のままであった。反応物を、９０％を超える変換を示すＬＣ／ＭＳによって監視した。反応混合物を２０℃で３０分間または数時間撹拌した後、それを水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３回）で抽出した。有機層を乾燥させ、濃縮し、フラッシュカラム（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２０：１）によって精製して、ＭＣ－ＣＢＤＫ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－Ｃｌとも称される、１１を灰色固体として形成した。ＬＣＭＳ：（５－９５、ＡＢ、１．５分）、０．６９６分、ｍ／ｚ＝５８９．０［Ｍ＋１］＋．
ステップ５：（Ｓ）－４－（２－（１－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル４－ニトロフェニルカルボネート１２の調製
Figure 0007043425000040
（Ｓ）－Ｎ－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）－Ｎ－（１－（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）シクロブタン－１，１－ジカルボキサミド１０の無水ＤＭＦ溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加し、その後、ＰＮＰカルボネート（ビス（４－ニトロフェニル）カルボネート）を添加した。反応溶液を室温（ｒ．ｔ．）で４時間撹拌し、混合物を分取ＨＰＬＣによって精製して、１２を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝７３６．２９．
ステップ６：ＬＤ－５１の調製
Figure 0007043425000041
（Ｓ）－４－（２－（１－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル４－ニトロフェニルカルボネート１２及び（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（４Ｒ）－２－（４－アミノフェニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート１３の溶液を反応させて、ＬＤ－５１を得た。
あるいは、以下のステップ７～１２によって、シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５１（表５）を調製した。
ステップ７：２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）カルバモイル）シクロブタンカルボキシレート１５の調製
Figure 0007043425000042
１－（（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）カルバモイル）シクロブタンカルボン酸１４（１００ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ撹拌溶液（１０ｍＬ）に、１－ヒドロキシピロリジン－２，５－ジオン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（３９ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を添加し、その後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（７０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を２０℃で添加した。混合物を、窒素ガス（Ｎ２）下、２０℃で１６時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を濃縮して、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）カルバモイル）シクロブタンカルボキシレート１５を無色油（１３１ｍｇ、１００％）として得た。
ステップ８：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（４Ｒ）－２－（４－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート１７の調製
Figure 0007043425000043
シルベストロール、（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート１６（５０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）、及び（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（４－（ジメトキシメチル）フェニル）カルバメート（１４９ｍｇ、０．３８２ｍｍｏｌ）を無水トルエン（５．０ｍＬ）中に溶解させた。結果として生じる混合物を、１００～１２０℃で２時間加熱した。それが室温まで冷却された後、混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝３０／１）によって精製して、１７を白色固体（４３ｍｇ、５７％）として得た。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．９２８分、ｍ／ｚ＝１００２．２［Ｍ＋Ｎａ］＋．
ステップ９：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（４Ｒ）－２－（４－アミノフェニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート１３の調製
１７（３０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）に、ピペリジン（５．２ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を２０℃で添加した。混合物を２０℃で２時間撹拌した。混合物を濃縮して、粗１３（２４ｍｇ、１００％）を得、これを更に精製することなく次のステップで使用した。
ステップ１０：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（４Ｒ）－２－（４－（（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－５－ウレイドペンタンアミド）フェニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート１８の調製
Figure 0007043425000044
１３（２４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－５－ウレイドペンタン酸（１８．５ｍｇ、０．０４６５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ／ＭｅＯＨ（３．０ｍＬ／０．５ｍＬ）撹拌溶液に、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（ＣＡＳ登録番号１６３５７－５９－８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）を２０℃で添加した。混合物を、Ｎ２下、２０℃で１６時間撹拌した。混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝３０／１）によって精製して、１８（３０ｍｇ、８６％）を得た。
ステップ１１：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（４Ｒ）－２－（４－（（Ｓ）－２－アミノ－５－ウレイドペンタンアミド）フェニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート１９の調製
Figure 0007043425000045
１８（３０ｍｇ、０．０２６４ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（４．５ｍｍｏｌ、０．０５２８ｍｍｏｌ）を２０℃で添加した。混合物を２０℃で２時間撹拌した。混合物を濃縮して、粗１９を得、これを更に精製することなく次のステップで使用した（２４ｍｇ、１００％）。
ステップ１２：シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５１の調製
中間体１９（２４ｍｇ、０．０２６４ｍｍｏｌ）及び１５（２２ｍｇ、０．０５２８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中に溶解させた。混合物を２０℃で２時間撹拌させ、混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１）によって精製して、ＬＤ－５１（１３ｍｇ、４１％）を得た。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．８８９分、ｍ／ｚ＝１２２７．５［Ｍ＋Ｎａ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ９．８６（ｓ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６１－７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．０５－７．００（ｍ，５Ｈ），６．９２－６．７０（ｍ，４Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．４１－６．３５（ｍ，２Ｈ），５．８４（ｓ，１Ｈ），５．６９（ｓ，１Ｈ），５．３２（ｓ，１Ｈ），５．１８（ｓ，２Ｈ），４．８６（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｓ，１Ｈ），４．５１－４．３８（ｍ，１Ｈ），４．３７－４．２０（ｍ，２Ｈ），４．１８－３．９８（ｍ，１Ｈ），３．９８－３．９１（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｓ，１Ｈ），３．５９（ｍ，７Ｈ），３．４３－３．３８（ｍ，５Ｈ），２．６１（ｓ，２Ｈ），２．４４（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，４Ｈ），１．８０－１．５５（ｍ，４Ｈ），１．５３－１．４５（ｍ，６Ｈ），１．２７－１．２２（ｍ，４Ｈ）．
実施例１ｂ シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５２（表５）。４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２－（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミド）エチル）カルバメートＬＤ－５２の合成
ステップ１：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボン酸２０の調製
Figure 0007043425000046
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中シルベストロール１６（４０．０ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）の混合物に、水（１．０ｍＬ）中ＬｉＯＨ（１１．７１ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を１５℃で２４時間撹拌した。混合物を水（３．０ｍＬ）で希釈し、ｐＨ３に調整し、ＤＣＭ（５．０ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ、濃縮して、２０（３９ｍｇ、０．０５９７ｍｍｏｌ、９７．６％の収率）を白色固体として得、これを更に精製することなく次のステップに直接使用した。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．７９８分、［Ｍ＋Ｎａ］＋６６３．１
ステップ２：（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－アミノエチル）カルバメートの調製
Figure 0007043425000047
ＴＨＦ（５．０ｍＬ）及び水（５．０ｍＬ）中、ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート（２００．０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、重炭酸ナトリウム（１５７ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）の混合物に、９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド、９－フルオレニルメチルクロロホルメート（Ｆｍｏｃ－Ｃｌ）（４８４ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を１５℃で１時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＰＥ中０～４０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルｔｅｒｔ－ブチルエタン－１，２－ジイルジカルバメート（２５０ｍｇ、０．５９５ｍｍｏｌ、４７．７％の収率）を黄色油として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．９３１分、［Ｍ＋Ｎａ］＋４０５．１．
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルｔｅｒｔ－ブチルエタン－１，２－ジイルジカルバメート（１００．０ｍｇ、０．２６０ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＡｃ（２．０ｍＬ）の混合物に、ＨＣｌ（１．０ｍＬ、ＥｔＯＡｃ中４ｍｏｌ／Ｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した後、それを濃縮して、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－アミノエチル）カルバメート（７３ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ、７６．１％の収率）を白色固体として得、これを更に精製することなく次のステップに直接使用した。
ステップ３：（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミド）エチル）カルバメート２１の調製
Figure 0007043425000048
ＤＣＭ（５．０ｍＬ）中、化合物２０（３１．４２ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２２．１５ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）、及び（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－アミノエチル）カルバメート（４６．２５ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）の混合物を０℃で５分間撹拌した。過剰のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（７０．５７ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。反応混合物を１５℃で１時間撹拌した。混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、ブライン（１０ｍＬ×２回）で洗浄した。有機層を乾燥させ、残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）によって精製して、２１（４０ｍｇ、０．０４３８ｍｍｏｌ、８０．１％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８９８分、［Ｍ＋Ｈ］＋９０５．３．
ステップ４：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－Ｎ－（２－アミノエチル）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミド２１ａの調製
Figure 0007043425000049
ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中２１（４０．０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）の混合物に、ピペリジン（１５．０５ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５℃で１時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル２０～５０％／１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３－ＡＣＮ）によって精製して、２１ａ（５．６ｍｇ、０．００８１ｍｍｏｌ、１８．４％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．５９９分、［Ｍ＋Ｈ］＋６８３．１．
ステップ５：シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５２の調製
ＷＯ２０１２／１１３８４７、ＷＯ２０１４／１９４２４７、ＵＳ７６５９２４１、ＵＳ７４９８２９８、ＵＳ２００９／０１１１７５６、ＵＳ２００９／００１８０８６、ＵＳ６２１４３４５、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ（２００２）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１３（４）：８５５－８６９に記載される方法によって調製した４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル４－ニトロフェニルカルボネート（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＰＮＰ）（１３．９１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（８．１２ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、２１ａ（０．０２０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３５－６５／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、ＬＤ－５２を白色固体として得た。ＬＣＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋１３０３．６．
実施例１ｃ シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５３（表５）。（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（（（（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレートＬＤ－５３の合成
ステップ１：（３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（ベンジルオキシ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－オール２３ｂの調製
Figure 0007043425000050
（（ブタ－３－エン－１－イルオキシ）メチル）ベンゼン（１５．０ｇ、９２．４６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２００ｍＬ）に、メタ－クロロ過安息香酸（ｍ－ＣＰＢＡ）（３７．５４ｇ、１８４．９２ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物の反応をＮａ２ＳＯ３水溶液（１００ｍＬ）で停止させ、水層をＤＣＭ（１００ｍＬ×３回）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ×３回）で洗浄し、乾燥させ、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ中０－５％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２－（２－（ベンジルオキシ）エチル）オキシラン（１０．５ｇ、５９．３％）を無色油として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．６４６分、［Ｍ＋ＣＨ３ＣＮ］＋２１９．８．
あるいは、ＮａＨ（３．０５ｇ、６０％、７６．２７ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中に０℃で懸濁させ、ブタ－３－エン－１－オール（５．０ｇ、６９．３４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、その後、臭化ベンジル（ＢｎＢｒ、９．９５ｍＬ、８３．２１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応を、０℃で、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１５ｍＬ）で停止させ、水（５０ｍＬ）で希釈した。混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×２回）で抽出し、合わせた有機層を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中０－２％のＥｔＯＡｃ）で精製して、（（ブタ－３－エン－１－イルオキシ）メチル）ベンゼン（７．１５ｇ、６３．６％の収率）を無色油として得た。（（ブタ－３－エン－１－イルオキシ）メチル）ベンゼン（１５．０ｇ、９２．４６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２００ｍＬ）に、メタ－クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ、３７．５４ｇ、１８４．９２ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物の反応を冷Ｎａ２ＳＯ３水溶液（１００ｍＬ）で停止させ、その後、水層をＤＣＭ（１００ｍＬ×３回）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ×３回）で洗浄し、乾燥させ、濃縮した（注意：濃縮前に全ての過酸化物が除去される必要がある）。それをフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中０－５％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２－（２－（ベンジルオキシ）エチル）オキシラン（１０．５ｇ、５９．３％）を無色油として得た。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．６４６分、［Ｍ＋ＣＨ３ＣＮ＋Ｈ］＋２１９．８．
トルエン（１０ｍＬ）中ＨＯＡｃ（０．０３ｍＬ、０．４５０ｍｍｏｌ）を充填した丸底フラスコに、（Ｒ，Ｒ）－（－）－Ｎ，Ｎ’－ビス（３，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルサリチリデン）－１，２－シクロヘキサンジアミノコバルト（ＩＩ）（１３５．５ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、酸素を吸収するようにフラスコが空気に対して開いた状態で、結果として生じる溶液を２０℃で０．５時間撹拌した。揮発物を減圧下で除去した。未希釈の２－（２－（ベンジルオキシ）エチル）オキシラン（８．０ｇ、４４．８９ｍｍｏｌ）を添加し、その後、蒸留水（０．４５ｍＬ、２５．１４ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。結果として生じる反応混合物を２０℃まで緩徐に温め、２０℃で２時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、反応物を水（５０ｍＬ×３回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０－５％のＭｅＯＨ）で精製して、（Ｓ）－４－（ベンジルオキシ）ブタン－１，２－ジオール（３．８０ｇ、４３．１％）を灰色油として得、これを他のバッチと組み合わせ（合計６．５ｇ）、ＳＦＣ（ＯＤ５０ｍｍ＊３０ｍｍ、５ｕｍ；１５％Ｂａｓｅ－ＥｔＯＨ；流量：６０ｍＬ／分）によって分離して、（Ｓ）－４－（ベンジルオキシ）ブタン－１，２－ジオール（５．３０ｇ、８１．５％）を、９６％のＥＥを有する褐色油として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．５８５分、［Ｍ＋Ｎａ］＋２１８．８．
メチル２－メトキシアセテート（１０．００ｇ、９６．０６ｍｍｏｌ）の四塩化炭素溶液（２００ｍＬ）に、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、７８．８７ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）及びＮ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ、１８．８０ｇ、１０５．６７ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。反応混合物を８５℃で２時間撹拌した。混合物を２０℃まで冷却し、濾過し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾液を減圧下で濃縮して、メチル２－ブロモ－２－メトキシアセテート（１５．００ｇ、８５．３％）を黄色油として得、これを更に精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．９９（ｓ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．５５（ｓ，３Ｈ）．
（Ｓ）－４－（ベンジルオキシ）ブタン－１，２－ジオール（１．００ｇ、５．１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（１５ｍＬ）に、ジブチルスズオキシド（１．５２ｇ、６．１１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６５℃で１２時間撹拌した。それが室温まで冷却された後、溶媒を真空中で除去し、白色固体を高真空下で３０分間乾燥させた。その後、結果として生じる残渣をトルエン（１５ｍＬ）中に溶解させた。その後、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（４７１ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）及びメチル２－ブロモ－２－メトキシアセテート（２．０５ｇ、１１．２１ｍｍｏｌ）を添加し、結果として生じた反応混合物を１２０℃で更に２時間撹拌した。混合物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＰＥ１０％－２０％）によって精製して、（３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（ベンジルオキシ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－オン２２ｂ（６００ｍｇ、４４．２％）及び（３Ｓ，６Ｓ）－６－（２－（ベンジルオキシ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－オン２２ａ（５８０ｍｇ、４２．７％）を無色油として得た。
２２ｂ：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３６－７．２８（ｍ，５Ｈ），４．９０（ｓ，１Ｈ），４．８３－４．８２（ｍ，１Ｈ），４．５０－４．４９（ｍ，２Ｈ），３．９３－３．９０（ｍ，１Ｈ），３．７６－３．７５（ｍ，１Ｈ），３．６３－３．６０（ｍ，２Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），１．８９－１．８７（ｍ，２Ｈ）．
２２ａ：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３７－７．２９（ｍ，５Ｈ），４．９４－４．９１（ｍ，２Ｈ），４．５１－４．５０（ｍ，２Ｈ），４．１４－４．１０（ｍ，１Ｈ），３．６９－３．６１（ｍ，３Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ），２．０５－１．９０（ｍ，２Ｈ）．
２２ｂ（５８０．０ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）のトルエン（１５ｍＬ）溶液に、水素化ジイソブチルアルミニウム、ＤＩＢＡＬ－Ｈのトルエン溶液（ＣＡＳ登録番号１１９１－１５－７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１．０Ｍ、６１９．５３ｍｇ、４．３６ｍｍｏｌ）を、－７８℃、Ｎ２下で添加した。混合物を－７８℃で１時間撹拌した。－２５℃で、０．５ｍＬメタノールで反応を停止させ、混合物を２分間撹拌した。ロッシェル塩溶液（１５ｍＬ、２０重量％）を添加し、室温で更に１時間撹拌した。残渣をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ×２回）で抽出した。合わせた有機層を水（１０ｍＬ×２回）、ブライン（１０ｍＬ×２回）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させて、粗化合物２３ｂ（５８０ｍｇ、９９．２％）を無色油として得、これを更に精製することなく直接使用した。
ステップ２：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（ベンジルオキシ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２５の調製
Figure 0007043425000051
（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル１，６，８ｂ－トリヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２４（４００．０ｍｇ、０．８４０ｍｍｏｌ）及び２３ｂ（５７６ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０ｍＬ）に、トリフェニルホスフィン、ＰＰｈ３（５７０．０９ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で３０分間撹拌した。上記の溶液に、ＤＭＥＡＤ（５０９．０６ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２．０ｍＬ）を添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。混合物を濃縮し、分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル６０－８０／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、白色固体として２５（ＨＰＬＣ上のピーク２、２４２ｍｇ、ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）ＲＴ＝０．８３６分、［Ｍ＋Ｎａ］＋７５１．１、３８．９％）、異性体（ＨＰＬＣ上のピーク１、１３０ｍｇ、ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８０９分、［Ｍ＋Ｎａ］＋７５１．０、２０．７％の収率）を含む、２つの異性体を得た。
２５、ピーク２：ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．８３６分、［Ｍ＋Ｎａ］＋７５１．１．１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３３－７．２９（ｍ，１Ｈ），７．１３－７．０９（ｍ，８Ｈ），７．０７－７．０３（ｍ，３Ｈ），６．８１－６．６８（ｍ，２Ｈ），６．５１－６．５０（ｍ，１Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），５．２９（ｓ，１Ｈ），４．９８－４．９６（ｍ，１Ｈ），４．６１（ｓ，１Ｈ），４．３３－４．２０（ｍ，４Ｈ），３．８４－３．５０（ｍ，１７Ｈ），１．７８－１．７３（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｓ，１Ｈ）．
異性体、ピーク１：ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．８０９分、［Ｍ＋Ｎａ］＋７５１．１．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３２－７．３０（ｍ，４Ｈ），７．０５－７．００（ｍ，５Ｈ），６．８１－６．８０（ｍ，２Ｈ），６．６１－６．５９（ｍ，２Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），５．２７（ｓ，１Ｈ），５．０２－５．０１（ｍ，１Ｈ），４．６６－４．６２（ｍ，２Ｈ），４．４８－４．４５（ｍ，１Ｈ），４．２８－４．２５（ｍ，２Ｈ），３．８３－３．５５（ｍ，１９Ｈ），１．８２－１．７７（ｍ，３Ｈ）．
ステップ３：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル１，８ｂ－ジヒドロキシ－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－ヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２６の調製
Figure 0007043425000052
２５（２４２．０ｍｇ、０．３３０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（２．０ｍＬ）に、Ｐｄ／Ｃ（３５４ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、３０℃、水素ガス（Ｈ２（１気圧））下で２時間撹拌した後、それを濾過し、濃縮して、２６（２０９ｍｇ、０．３２１ｍｍｏｌ、９６．６％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．７１７分、［Ｍ＋Ｎａ］＋６６１．０．
ステップ４：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－３－メトキシ－６－（２－（（メチルスルホニル）オキシ）エチル）－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２７の調製
Figure 0007043425000053
２６（２００．０ｍｇ、０．３１０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）に、トリエチルアミン（０．２２ｍＬ、１．５７ｍｍｏｌ）及びメタンスルホニルクロリド（０．５４ｍＬ、６．９９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５℃で３０分間撹拌した。混合物をＤＣＭ（２５ｍＬ）で希釈し、水（２５ｍＬ×３回）で洗浄した。有機層を濃縮して、粗２７（２２４ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ、９９．８％の収率）を黄色油として得た。粗物質を更に精製することなく直接使用した。
ステップ５：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－アジドエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２８の調製
Figure 0007043425000054
２７（２００．０ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ撹拌溶液（１０ｍＬ）に、アジ化ナトリウム（６０．０９ｍｇ、０．９２０ｍｍｏｌ）を１５℃で添加した。混合物を６０℃で１時間撹拌した。混合物にＮａ２ＣＯ３水溶液（５ｍＬ）を添加し、５分間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、水（３０ｍＬ×３回）及びブライン（１０ｍＬ×３回）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、２８（４０ｍｇ、０．０５５４ｍｍｏｌ、２０．３％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．７９９分、［Ｍ＋Ｎａ］＋６８６．１．
ステップ６：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－アミノエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２９の調製
Figure 0007043425000055
２８（４０．０ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（５．０ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチルアミン（４．４１ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）及びＰｄ／Ｃ（６４．１９ｍｇ）を添加した。混合物を、３０℃、Ｈ２（１気圧）下で１時間撹拌した。混合物を濾過し、濃縮し、分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル１０－４０／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、２９（８．０ｍｇ、０．０１２５ｍｍｏｌ、２０．８％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．６６１分、［Ｍ＋Ｈ］＋６３８．１．ＨＰＬＣ（１０－８０ＡＢ．ｍｅｔ／８分）：ＲＴ＝４．０９分．
ステップ７：シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５３の調製
Figure 0007043425000056
ＷＯ２０１２／１１３８４７、ＷＯ２０１４／１９４２４７、ＵＳ７６５９２４１、ＵＳ７４９８２９８、ＵＳ２００９／０１１１７５６、ＵＳ２００９／００１８０８６、ＵＳ６２１４３４５、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３（４）：８５５－８６９に記載される方法によって調製した４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル４－ニトロフェニルカルボネート（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＰＮＰ）（１３．９１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（８．１２ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、２９（１０．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３５－６５／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、ＬＤ－５３（２．０ｍｇ、０．００１５ｍｍｏｌ、９．８％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５＿１．５分）：ＲＴ（２２０／２５４ｎｍ）＝０．７５９分、［Ｍ＋Ｎａ］＋１２５８．２．ＨＰＬＣ（１０－８０ＡＢ／８分）：ＲＴ＝４．８９分．
実施例１ｄ シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５４（表５）。（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－３－メトキシ－６－（２－（（５－ニトロピリジン－２－イル）ジスルファニル）エチル）－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレートＬＤ－５４の合成
ステップ１：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（アセチルチオ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート３０の調製
Figure 0007043425000057
（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－３－メトキシ－６－（２－（（メチルスルホニル）オキシ）エチル）－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２７（３４．０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）に、エタンチオンＳ酸、チオール酢酸（ＫＳＡｃ）（５４．１８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３５℃で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中４％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、３０（１５ｍｇ、０．０２１３ｍｍｏｌ、４４．９％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．９３９分、［Ｍ＋Ｎａ］＋７１９．１
ステップ２：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル１，８ｂ－ジヒドロキシ－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－メルカプトエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート３１の調製
Figure 0007043425000058
３０（１２．０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（２．０ｍＬ）に、Ｋ２ＣＯ３（７．１４ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３５℃で１時間撹拌した。混合物を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中４％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製し、分取ＨＰＬＣ（ＦＡ）によって精製して、３１（６．０ｍｇ、０．００９１ｍｍｏｌ、５２．７％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８０５分、［Ｍ＋Ｎａ］＋６７７．１．ＨＰＬＣ（１０－８０ＡＢ／８分）：ＲＴ＝５．２３分．
ステップ３：シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５４の調製
１，２－ビス（５－ニトロピリジン－２－イル）ジスルファン及び３１の無水ＤＣＭ：ＣＨ３ＯＨ／（１：１）溶液を、Ｎ２下、室温で２４時間撹拌した。混合物を真空下で濃縮した後、残渣をＤＣＭで希釈した。酸化マンガン（ＭｎＯ２）を添加し、混合物を室温で更に０．５時間撹拌した。混合物をＬＣＭＳによって精製して、ＬＤ－５５を得た。
実施例１ｅ シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５５（表５）。（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－（２－（（５－ニトロピリジン－２－イル）ジスルファニル）エチル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミドＬＤ－５５の合成
ステップ１：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－２，５－ジオキソピロリジン－１－イル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート３２の調製
Figure 0007043425000059
ＴＨＦ（４．０ｍＬ）中、（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボン酸２０（２０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシピロリジン－２，５－ジオン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、ＨＯＳｕ）（３．５９ｍｇ、０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（６．４４ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５℃で１６時間撹拌して、３２を生成させ、これを次のステップで直接使用した。
ステップ２：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－Ｎ－（２－メルカプトエチル）－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミド３３の調製
Figure 0007043425000060
３２を含有する反応混合物に、２－アミノエタンチオール及びＴＥＡ（８．２３ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５℃で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中に溶解させ、分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３０－６０％／１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３－ＡＣＮ）によって精製して、３３（１．７４ｍｇ、０．００２４ｍｍｏｌ、９％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８２８分、［Ｍ＋Ｈ］＋７００．２及びＲＴ＝０．８９８分、［Ｍ＋Ｎａ］＋１４２０．０（１７％のジスルフィドを有する）。
ステップ３：シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５５の調製
Figure 0007043425000061
１，２－ビス（５－ニトロピリジン－２－イル）ジスルファン及び３３の無水ＤＣＭ：ＣＨ３ＯＨ／（１：１）溶液を、Ｎ２下、室温で２４時間撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、残渣をＤＣＭで希釈した。酸化マンガン（ＭｎＯ２）を添加し、混合物を室温で更に０．５時間撹拌した。混合物をＬＣＭＳによって精製して、ＬＤ－５５を得た。
実施例１ｆ シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５８（表５）。メチル（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（（（（４－（（Ｓ）－２－（１－（（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）カルバモイル）シクロブタン－１－カルボキサミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレートＬＤ－５８の合成
（Ｓ）－４－（２－（１－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル４－ニトロフェニルカルボネート１２（１７．３１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３．０ｍＬ）に、（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）－６－（２－アミノエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート２９（１０．０ｍｇ、０．０２００ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３５－６５／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、ＬＤ－５８（４．８ｍｇ、２４．５％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．７５０分、ｍ／ｚ＝１２５６．６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
実施例１ｇ シルベストロール－リンカー中間体ＬＤ－５９（表５）。４－（（Ｓ）－２－（１－（（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチル）カルバモイル）シクロブタン－１－カルボキサミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２－（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｒ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミド）エチル）カルバメートＬＤ－５９の合成
ステップ１：メチル（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－１－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート３５の調製
Figure 0007043425000062
２４（３００．０ｍｇ、０．６３００ｍｍｏｌ）及び（１Ｒ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－１－（（２Ｒ，５Ｒ）－６－ヒドロキシ－５－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）エチル（４－ニトロフェニル）カルボネート３４（４４５．４ｍｇ、０．９４０ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１５ｍＬ）に、Ｐｈ３Ｐ（４２７．６ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で１０分間撹拌した。上記の溶液に、ジ－２－メトキシエチルアゾジカルボキシレート（ＤＭＥＡＤ）（３８１．８ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（５．０ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。混合物を濾過し、濃縮し、分取－ＨＰＬＣ（８５－９０（水中０．２２５％のＦＡ－ＡＣＮ）、２５ｍＬ／分）によって精製して、３５（２００ｍｇ、２３．２％）を白色固体として得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２４－８．２１（ｍ，４Ｈ），７．１４－７．１１（ｍ，２Ｈ），７．０７－７．０５（ｍ，３Ｈ），６．８７－６．８６（ｍ，２Ｈ），６．７１－６．６９（ｍ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｓ，１Ｈ），５．２５－５．２３（ｍ，１Ｈ），５．０４－５．０２（ｍ，１Ｈ），４．６５－４．６３（ｍ，２Ｈ），４．３６－４．３２（ｍ，１Ｈ），４．０９－３．８９（ｍ，５Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．５８（ｓ，１Ｈ），３．５１（ｓ，３Ｈ），０．８３（ｓ，９Ｈ），０．０２（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，６Ｈ）．ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝１．０１２分、［Ｍ＋７］＋９４０．３．
ステップ２：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－メチル６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキシレート１６の調製
Figure 0007043425000063
３５（１５０．０ｍｇ、０．１６００ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ、１２５．９７ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物の反応を水（２０ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×２回）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。粗産生物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０－１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）によって精製して、シルベストロール１６（９５ｍｇ、９０．４％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．７２４分、［Ｍ＋Ｎａ］＋６７７．１．
ステップ３：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボン酸２０の調製
Figure 0007043425000064
１６（５０．０ｍｇ、０．０８００ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６．０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２．０ｍＬ）溶液に、水（２．０ｍＬ）中ＬｉＯＨ（９．１５ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。混合物の反応を水（１０ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×２回）で抽出した。水層を１．０ＭのＨＣｌでｐＨ＝４～５まで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×２回）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、２０（４１ｍｇ、６８．７％）を白色固体として得た。粗物質を更に精製することなく直接使用した。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．６６９分、［Ｍ＋Ｎａ］＋６６３．１．
ステップ４：（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミド）エチル）カルバメート２１の調製
Figure 0007043425000065
２０（４０．０ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５．０ｍＬ）に、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－アミノエチル）カルバメート（２６．４４ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１２．６６ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１９．３２ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．０３ｍＬ、０．１９０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。混合物を濃縮し、分取－ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．３）によって精製して、２１（３０ｍｇ、５１．５％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．７８５分、［Ｍ＋Ｈ］＋９０５．４．
ステップ５：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－Ｎ－（２－アミノエチル）－６－（（（２Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）－６－（（Ｒ）－１，２－ジヒドロキシエチル）－３－メトキシ－１，４－ジオキサン－２－イル）オキシ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－３－フェニル－２，３，３ａ，８ｂ－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］ベンゾフラン－２－カルボキサミド２１ａの調製
Figure 0007043425000066
２１（１５．０ｍｇ、０．０２００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）に、ピペリジン（０．０２ｍＬ、０．０５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、出発材料が消費され、所望の産生物が見出されたことを示した。混合物を濃縮して、化合物７（１１ｍｇ、９７．２％）を白色固体として得、これを更に精製することなく直接使用した。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．６０７分、［Ｍ＋Ｈ］＋６８３．２．
ステップ６：ＬＤ－５９の調製
（Ｓ）－４－（２－（１－（５－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル４－ニトロフェニルカルボネート１２（１７．７８ｍｇ、０．０２００ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．０１０ｍＬ、０．０６００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、２１ａ（１１．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、出発材料が消費され、所望の生成物が見出されたことを示した。混合物を分取－ＨＰＬＣ（アセトニトリル３５－５０／水中０．２２５％のＦＡ、２５ｍＬ／分）によって精製して、ＬＤ－５９（１０．１ｍｇ、４８．５％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５－９５、ＡＢ、１．５分）：ＲＴ＝０．６８８分、［Ｍ／２＋Ｈ］＋６４０．５．
実施例２ システイン操作された抗体の調製
抗体を大量に産生する場合、抗体は、ＣＨＯ細胞内で産生された。ＶＬ及びＶＨをコードするベクターを、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし、ＩｇＧを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養培地から精製した。
最初に単離されるため、抗体中の操作されたシステイン残基は、細胞チオール（例えば、グルタチオン）との混合ジスルフィドとして存在するため、コンジュゲーションには利用することができない。これらの抗体の（例えば、ＤＴＴでの）部分還元、精製、及びデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）での再酸化により、例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５－９３２及びＵＳ２０１１／０３０１３３４において以前に説明されるように、コンジュゲーションに利用可能な遊離システインスルフィドリル基を有する抗体がもたらされる。簡潔には、抗体を活性化シルベストロール薬物部分と組み合わせて、抗体の遊離システイン残基にコンジュゲートすることを可能にした。数時間後、抗体－薬物コンジュゲートを精製した。
特定の条件下で、システイン操作された抗体を、２ｍＭのＥＤＴＡを有する５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５中）で、３７℃で３時間、または室温で一晩、ＤＴＴ（クリーランド試薬、ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、Ｇｅｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ２７３：７３－８０、Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの還元剤での処理によって、薬物とのコンジュゲーションに対して反応性にした。ＣＨＯ細胞中で発現された完全長のシステイン操作されたモノクローナル抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標））（Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（４）：７４８－７６０、Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２６：１４３８－１４４５）を、例えば、新たに導入したシステイン残基と培養培地中に存在するシステインとの間に形成され得るジスルフィド結合を還元するように、約５０倍過剰のＤＴＴで、室温で一晩還元した。還元したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）を希釈し、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中でＨｉＴｒａｐ Ｓカラムに載せ、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含有するＰＢＳで溶出させた。あるいは、１／２０体積の１０％酢酸を添加することによって抗体を酸性化し、１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５）で希釈し、カラムに載せ、その後、１０カラム体積のコハク酸緩衝液で洗浄した。カラムを、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＤＴＡで溶出させた。
軽鎖アミノ酸は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（１９９１）５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。重鎖アミノ酸は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｏｆ Ｓｃｉ．６３（１）：７８－８５）が、Ｋａｂａｔシステムとして記載される場合を除く。一文字アミノ酸略号が使用される。
ＣＨＯ細胞中で発現された完全長のシステイン操作されたモノクローナル抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標））は、システイン付加物（シスチン）を有するか、または細胞培養条件のために、操作されたシステイン上でグルタチオン付加される。操作されたシステインの反応性チオール基を遊離させるために、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）を、約ｐＨ８．０の５００ｍＭのホウ酸ナトリウム及び５００ｍＭの塩化ナトリウムに溶解させ、約５０～１００倍過剰量の１ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（Ｇｅｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ ２７３：７３－８０、Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で、３７℃で約１～２時間還元した。あるいは、ＤＴＴを還元剤として使用した。鎖間ジスルフィド結合の形成を、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたは変性逆相ＨＰＬＣ ＰＬＲＰカラムクロマトグラフィーのいずれかによって監視した。還元されたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）を希釈し、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラムに充填し、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含有するＰＢＳ、または１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス－Ｃｌ（ｐＨ７．５）で溶出させた。
再酸化を実行することによって、親Ｍａｂ内に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合を再度確立した。溶出され、還元されたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）を、１５×もしくは２ｍＭのデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）（ｐＨ７）で約３時間または５０ｍＭのトリス－Ｃｌ（ｐＨ７．５）中で約３時間、あるいは２００ｎＭ～２ｍＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液により室温で一晩処理した。当該技術分野において既知である他の酸化体（すなわち、酸化剤）及び酸化条件が使用され得る。周囲空気酸化もまた、効果的であり得る。この穏やかな部分的再酸化ステップにより、高い忠実度で鎖内ジスルフィドが効率的に形成された。緩衝液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂での溶出によって交換し、１ｍＭのＤＴＰＡを有するＰＢＳで溶出させた。チオール／抗体値を、溶液の２８０ｎｍでの吸光度からの還元抗体濃度、及びＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）との反応によるチオール濃度を決定することによって、ならびに４１２ｎｍでの吸光度の決定によって確認した。
液体クロマトグラフィー／質量分析を、拡大質量範囲を有するＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行した。７５℃に加熱したＰＲＬＰ－Ｓ（登録商標）、１０００Ａ、ミクロボアカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で、試料をクロマトグラフィーに供した。３０－４０％のＢの直線勾配（溶媒Ａ：水中０．０５％のＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．０４％のＴＦＡ）を使用し、溶出剤をエレクトロスプレー源を使用して直接イオン化した。データを、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）データシステムによって収集し、ＰｒｏＭａｓｓ（登録商標）（Ｎｏｖａｔｉａ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して逆重畳積分を実行した。ＬＣ／ＭＳ分析前に、抗体または薬物コンジュゲート（５０マイクログラム）を、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（２単位／ｍｌ、ＰＲＯｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）で３７°Ｃで２時間処理して、Ｎ結合型炭水化物を除去した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）試料を、ブチルＨＩＣ ＮＰＲカラム（２．５ミクロンの粒径、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ）（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に注入し、０．８ｍｌ／分で０－７０％のＢの直線勾配で溶出した（Ａ：５０ｍＭのリン酸カリウム中１．５Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ７）、Ｂ：５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７）、２０％のイソプロパノール）。多波長検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズのＨＰＬＣシステム及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、１抗体当たりの薬物を異なる割合で有する抗体種を分解及び定量化した。
実施例３ シルベストロール－リンカー中間体の抗体へのコンジュゲーション
実施例１の還元及び再酸化の手順後に、システイン操作された抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標））を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液に溶解させ、氷上で冷却する。過剰な、約１．５モル～２０当量の、チオール反応性基（ピリジルジスルフィド、マレイミド、またはブロモアセトアミドなど）で活性化したシルベストロール－リンカー中間体を、ＤＭＳＯ中に溶解させ、アセトニトリル及び水中で希釈し、ＰＢＳ中の冷却、還元、再酸化された抗体に添加する。典型的には、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中の約２０ｍＭの濃度でＤＭＳＯストックからの薬物を抗体に添加し、反応混合物のＬＣ－ＭＳ分析により決定される、反応が完了するまで約１～約２４時間監視する。反応が完了したとき、過剰のエチルマレイミドなどのキャッピング試薬を添加して、反応を停止させ、いかなる未反応の抗体チオール基もキャッピングする。コンジュゲーション混合物を充填し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラムを通して溶出させて、過剰な薬物及び他の不純物を除去した。反応混合物を、遠心限外濾過によって濃縮し、システイン操作された抗体－薬物コンジュゲートを精製し、ＰＢＳ中Ｇ２５樹脂による溶出によって脱塩し、滅菌条件下で０．２μｍのフィルターを通して濾過し、貯蔵のために凍結する。
例えば、粗抗体－薬物コンジュゲートを、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）で希釈した後にカチオン交換カラムに適用する。カラムを少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄し、抗体をＰＢＳで溶出させた。抗体－薬物コンジュゲートを、ゲル濾過カラムを使用して、２０ｍＭのＨｉｓ／酢酸（ｐＨ５）に、２４０ｍＭのスクロースとともに製剤化した。抗体－薬物コンジュゲートは、タンパク質濃度を決定するためのＵＶ分光法、凝集分析のための分析ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、及びＬＣ－ＭＳによって、リジンＣエンドペプチダーゼでの処理の前後に特徴付けた。
サイズ排除クロマトグラフィーは、０．２５ｍＭの塩化カリウム及び１５％のＩＰＡを有する０．２Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．２）中、０．７５ｍｌ／分の流量でＳｈｏｄｅｘ ＫＷ８０２．５カラムを使用して実行した。コンジュゲートの凝集状態は、２８０ｎｍでの溶出ピーク面積吸光度の積分によって決定した。
ＬＣ－ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＱＴＯＦ ６５２０ ＥＳＩ装置を使用して実行してもよい。一例として、抗体－薬物コンジュゲートを、トリス（ｐＨ７．５）中１：５００重量のエンドプロテイナーゼＬｙｓ Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃で３０分間処理する。結果として生じる切断断片を、８０℃に加熱した１０００Å（オングストローム）、８μｍ（ミクロン）のＰＬＲＰ－Ｓ（高度に架橋されたポリスチレン）カラムに充填し、５分間で３０％のＢ～４０％のＢまでの勾配で溶出させる。移動相Ａは、０．０５％のＴＦＡを有するＨ２Ｏであり、移動相Ｂは、０．０４％のＴＦＡを有するアセトニトリルであった。流量は、０．５ｍｌ／分であった。タンパク質溶出を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出によって、エレクトロスプレーイオン化及びＭＳ分析の前に監視した。非コンジュゲートＦｃ断片、残渣非コンジュゲートＦａｂ、及び薬物化Ｆａｂのクロマトグラフィー分解が、通常達成された。得られたｍ／ｚスペクトルを、Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆重畳積分して、抗体断片の質量を計算した。
実施例４ インビトロ細胞増殖アッセイ
抗体－薬物コンジュゲートのチオＨｕ抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＬＣ Ｋ１４９Ｃシルベストロール及びチオＨｕ抗Ｌｙ６Ｅ ９Ｂ１２．ｖ１２ ＬＣ Ｋ１４９Ｃシルベストロールの有効性を、以下のプロトコルを用いる細胞増殖アッセイによって測定した（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８、Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５４８５－５４８８）：
１．培地中約４０００個の細胞（ＨＥＲ発現ＳＫ－ＢＲ－３及びＫＰＬ－４、ＣＤ２２陽性ＢＪＡＢ、ＣＤ２２陽性ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、またはＪｕｒｋａｔ）を含有する４０μｌの細胞培養物のアリコートを、３８４ウェルの不透明ウェルプレートの各ウェルに堆積させた。
２．培地を含有するが細胞は有さない対照ウェルを調製した。
３．抗体－薬物コンジュゲート（ｎ＝３）を実験ウェルに添加し、３～５日間インキュベートした。
４．プレートは、およそ３０分間室温で平衡化した。
５．各ウェル内に存在する細胞培養培地の量と等しい量のＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（商標）試薬を添加した。
６．軌道振盪機で内容物を１５分間混合して、細胞溶解を誘導した。
７．プレートを室温で５分間インキュベートして、発光シグナルを安定化した。
８．発光を記録し、活性％としてグラフで報告し、ＲＬＵ（相対発光単位）は対照に対して正規化した（抗体なし対照マイナス細胞なし対照）。
データをプロットし、図１Ａ及び１Ｂに、各抗体の各複写物（ｎ＝３）の個々の点として例証した。プロトコルは、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（商標）発光細胞を修正したものである。培地：ＢＪＡＢ、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、及びＪｕｒｋａｔは、ＲＰＭＩ－１６４０、２０％のＨＩ－ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含む培地中で成長され得る。
実施例５ 高度発現ＨＥＲ２トランスジェニック外植マウスにおける、腫瘍成長阻害、インビボ有効性
腫瘍を確立させ、０日目の単一治療前に、（カリパスを使用して測定される）１５０～２００ｍｍ３の体積まで成長させた。腫瘍体積を、式、Ｖ（ｍｍ３）＝０．５Ａ×Ｂ２（式中、Ａ及びＢはそれぞれ、長径及び短径である）に従って、カリパスを使用して測定する。腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達する前、または腫瘍が間近に迫った潰瘍形成の徴候を示したときに、マウスを安楽死させる。各実験群（１群当たり１０匹のマウス）から収集したデータを、平均＋標準誤差として表す。
Ｆｏ５マウス乳腺腫瘍モデルを用いて、単回用量の静脈内注射後に、かつ以前に記載されているように（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＧＤＬ，Ｌｉ ＧＭ，Ｄｕｇｇｅｒ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＨＥＲ２－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＤＭ１，ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：９２８０－９０）（参照によって本明細書に組み込まれる）、本発明の抗体－薬物コンジュゲートのインビボ有効性を評価する。抗Ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲートは、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ－ＨＥＲ２）の転写制御下、乳腺上皮内でヒトＨＥＲ２遺伝子が過剰発現されているトランスジェニックマウスモデルである、Ｆｏ５モデルで試験され得る。ＨＥＲ２過剰発現は、乳腺腫瘍の自然発症を引き起こす。これらの創始者動物のうちの１匹の乳腺腫瘍（創始者番号５［Ｆｏ５］）を、腫瘍断片（サイズ約２×２ｍｍ）の段階移植によってＦＶＢマウスの後続世代において増殖させる。全ての研究を、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って実行する。各抗体－薬物コンジュゲート（単回用量）を、研究開始時及び移植の１４日後に、９匹の動物に静脈内に投薬した。初期腫瘍サイズは、約２００ｍｍ３の体積である。
他の乳腺脂肪体移植片有効性モデルは、記載される通りに用いられ得（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６７：４９２４－４９３２）、単回静脈内用量後に腫瘍体積を評価し、腹腔内腫瘍を有するマウスから切除した腫瘍を使用し、その後、レシピエントマウスの乳腺脂肪体に段階的に継代される。
この方法で試験され得る他の細胞株としては、ＡＵ５６５、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ１００８、ＨＣＣ２１５７、ＨＣＣ２０２、ＨＣＣ１４１９、ＨＣＣ２２１８、及びＨＣＣ１５６９が挙げられる。
実施例６シルベストロール抗体－薬物コンジュゲートの有効性
乳癌細胞株ＨＣＣ１５６９（ＣＲＬ－２３３０）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＨＣＣ１５６９Ｘ２細胞株は、インビボでの成長のために最適化された親ＨＣＣ１５６９細胞株（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２３３０）の誘導体である。親ＨＣＣ１５６９細胞を、雌のＳＣＩＤ ベージュマウスの右側腹部に皮下注射し、１つの腫瘍を回収し、刻み、インビトロで成長させて、ＨＣＣ１５６９ ＸＩ細胞株をもたらした。ＨＣＣ１５６９ ＸＩ株を、細胞株の成長を改善する試みの中で、雌のＳＣＩＤ ベージュマウスの右側腹部に再度皮下注射した。この研究からの腫瘍を採取し、インビトロでの成長のために再度適合させて、ＨＣＣ１５６９ Ｘ２細胞株を生成した。この株に由来するこの細胞株及び腫瘍は、Ｌｙ６Ｅを発現する。
ＳＣＩＤ ベージュマウスに、ヒスチジン緩衝液番号８ビヒクル中、約２００万個の細胞を植え付けた。腫瘍体積が、およそ８０～２００ｍｍ３に達したとき（０日目）、動物を各々約６～１０匹のマウスの群にランダムに分け、以下の用量、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ／、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ビヒクル対照または抗体－薬物コンジュゲートのいずれかの単回静脈内（ＩＶ）注射を投与した。２１日目の研究終了まで、腫瘍体積を週２回測定した。腫瘍体積を、カリパスを使用して測定した２つの寸法に基づいて測定し、計算し、式、Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂはそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である）に従ってｍｍ３で表した。同じ動物からの経時的な腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデル化アプローチを使用した（例えば、Ｐｉｎｈｅｉｒｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ｎｌｍｅ：ｌｉｎｅａｒ ａｎｄ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｍｉｘｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｍｏｄｅｌｓ．２００９、Ｒ ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ３．１－９６）。このアプローチは、反復測定、及び研究終了前の治療とは無関係の動物の除去によるわずかな脱落率の両方に対処することができる。３次回帰スプラインを使用して、非線形プロファイルを、各用量レベルでのｌｏｇ２腫瘍体積の時間経過に当てはめた。その後、これらの非線形プロファイルを、混合モード内で用量に関連付けた。全ての動物プロトコルは、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
実施例７ ＣＢ－１７ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスにおける、Ｂｊａｂ－ｌｕｃヒト異種移植片モデルにおけるチオ抗ＣＤ２２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミンの有効性
５５匹のＣ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹部に、１匹のマウス当たり０．２ｍＬの体積で、２０００万個のＢｊａｂ－ｌｕｃ細胞を皮下に植え付ける。腫瘍が１５０～２５０ｍｍ３の平均腫瘍体積に達したとき、それらを６つに群分けした（各５匹）。０日目に単一治療を投与する。体積は０．２ｍＬを超えず、針径は２８または２９ゲージである。
実施例８ ｓｃｉｄベージュマウスにおける、ＫＰＬ４ヒト乳腺異種移植片モデルにおけるチオ抗Ｈｅｒ２ ７Ｃ２ ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－シルベストロール－アミンの有効性。
ｎ＝６０匹のマウスに、１匹のマウス当たり３００万個の細胞で、ＨＢＳＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁させたＫＰＬ－４細胞を、０．２ｍＬの体積の胸部２／３乳腺脂肪体に植え付ける。腫瘍が１５０～２５０ｍｍ３の平均腫瘍体積に達したとき、それらを８つに群分けする（各５匹）。０日目に単一治療を投与する。体積は０．２ｍＬを超えず、針径は２８または２９ゲージである。
前述の発明は、明確な理解のために例証及び実施例によって多少詳細に記載されているが、これらの説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
本開示の要素またはその好ましい実施形態（複数可）を導入するとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その」、及び「該」という冠詞は、１つ以上の要素が存在することを意味することが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する」という用語は、包括的であることが意図され、列挙される要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
この明細書は、最良の様式を含む本発明を開示するため、かつ任意の当業者による任意のデバイスまたはシステムの作製及び使用、ならびに任意の組み込まれる方法の実行を含む、本発明の実施を可能にするために、実施例を使用する。本発明の特許取得の対象となる範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者に想起される他の実施例を含み得る。そのような他の実施例は、それらが特許請求の範囲の文言と異ならない構造的要素を有する場合、またはそれらが特許請求の範囲の文言と実質的な差異を有さない同等の構造的要素を含む場合、特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (52)

  1. 式Ｉａ及びＩｂから選択される、リンカーを通してシルベストロール薬物部分に共有結合した抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート化合物、
    Figure 0007043425000067
    またはその薬学的に許容される塩であって、
    式中、
    Ｒａが、ＣＨ３Ｏ、ＣＮ、ＮＯ２、及びＣｌから選択される基であり、
    Ｌが、リンカーであり、
    ｐが、１～８の整数であり、
    Ａｂが、１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体である、抗体－薬物コンジュゲート化合物またはその薬学的に許容される塩。
  2. １つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体が、（１）～（５３）、
    （１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、
    （２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、
    （３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、
    （４）ＭＵＣ１６（０７７２Ｐ、ＣＡ１２５）、
    （５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、
    （６）Ｎａｐｉ２ｂ（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、
    （７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、ならびに短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、
    （８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、
    （９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、
    （１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、
    （１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、
    （１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、
    （１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌種由来の成長因子）、
    （１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ７３７９２）、
    （１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、
    （１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、
    （１７）ＨＥＲ２、
    （１８）ＮＣＡ、
    （１９）ＭＤＰ、
    （２０）ＩＬ２０Ｒα、
    （２１）ブレビカン、
    （２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、
    （２３）ＡＳＬＧ６５９、
    （２４）ＰＳＣＡ、
    （２５）ＧＥＤＡ、
    （２６）ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３）、
    （２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）、
    （２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ）、
    （２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１）、
    （３０）ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、
    （３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）、
    （３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）、
    （３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、
    （３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、
    （３５）ＦｃＲＨ５（ＩＲＴＡ２、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２）、
    （３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）、
    （３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、
    （３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン－１）、
    （３９）ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ－アルファ１、ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）、
    （４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）、
    （４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、ＳＨＩＳＡ２）、
    （４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）、
    （４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、
    （４４）ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ－ＥＬＥ１）、
    （４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、
    （４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、
    （４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、
    （４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータ－ヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、
    （４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、
    （５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、
    （５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、
    （５２）ＣＤ３３、ならびに
    （５３）ＣＬＬ－１から選択される、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  3. Ａｂが、抗ＨＥＲ２ ４Ｄ５、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３３、抗Ｌｙ６Ｅ、抗Ｎａｐｉ３ｂ、抗ＨＥＲ２ ７Ｃ２、及び抗ＣＬＬ－１から選択される、請求項２に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  4. Ａｂが、システイン操作された抗体である、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  5. 前記システイン操作された抗体が、ＨＣ Ａ１１８Ｃ、ＬＣ Ｋ１４９Ｃ、ＨＣ Ａ１４０Ｃ、ＬＣ Ｖ２０５Ｃ、ＬＣ Ｓ１２１Ｃ、及びＨＣ Ｌ１７７Ｃから選択される変異体である、請求項４に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  6. Ｌが、式、
    －Ｓｔｒ－ＰＭ－Ｙ－
    を有する、プロテアーゼ－切断可能な非ペプチドリンカーであり、
    式中、Ｓｔｒが、前記抗体に共有結合したストレッチャー単位であり、ＰＭが、ペプチドミメティック単位であり、Ｙが、前記シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  7. Ｓｔｒが、式、
    Figure 0007043425000068
    を有し、
    式中、Ｒ６が、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２、及びＣ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン－３－イル）からなる群から選択され、ｒが、１～１０の範囲の整数である、請求項６に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  8. Ｒ６が、（ＣＨ２）５である、請求項７に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  9. ＰＭが、式、
    Figure 0007043425000069
    を有し、
    式中、Ｒ７及びＲ８が一緒になって、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
    ＡＡが、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である、請求項６に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  10. Ｙが、パラ－アミノベンジルまたはパラ－アミノベンジルオキシカルボニルを含む、請求項６に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  11. 式、
    Figure 0007043425000070
    を有し、
    式中、Ｄが、前記シルベストロール薬物部分である、請求項９に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  12. 式、
    Figure 0007043425000071
    を有する、請求項１１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  13. 式、
    Figure 0007043425000072
    を有する、請求項１１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  14. 式、
    Figure 0007043425000073
    を有する、請求項１３に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  15. 式、
    Figure 0007043425000074
    から選択される、請求項１３に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  16. Ｌが、式、
    －Ｓｔｒ－Ｐｅｐ－Ｙ－
    を有するペプチドリンカーであり、
    式中、Ｓｔｒが、前記抗体に共有結合したストレッチャー単位であり、Ｐｅｐが、２～１２個のアミノ酸残基のペプチドであり、Ｙが、前記シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  17. Ｓｔｒが、式、
    Figure 0007043425000075
    を有し、
    式中、Ｒ６が、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２、及びＣ１－Ｃ１２アルキレン－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン－３－イル）からなる群から選択され、ｒが、１～１０の範囲の整数である、請求項１６に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  18. Ｒ６が、（ＣＨ２）５である、請求項１７に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  19. Ｐｅｐが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、バリン、及びシトルリンから独立して選択される２～１２個のアミノ酸残基を含む、請求項１６に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  20. Ｐｅｐが、バリン－シトルリン、アラニン－フェニルアラニン、及びフェニルアラニン－リジンから選択される、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  21. Ｙが、パラ－アミノベンジルまたはパラ－アミノベンジルオキシカルボニルを含む、請求項１６に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  22. 式、
    Figure 0007043425000076
    を有し、ＡＡ１及びＡＡ２が各々、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から独立して選択されるアミノ酸側鎖である、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  23. 式、
    Figure 0007043425000077
    を有する、請求項２２に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  24. 式、
    Figure 0007043425000078
    を有する、請求項２２に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  25. 式、
    Figure 0007043425000079
    を有する、請求項２４に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  26. 式、
    Figure 0007043425000080
    を有する、請求項２２に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  27. 式、
    Figure 0007043425000081
    を有する、請求項２６に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  28. 式、
    Figure 0007043425000082
    を有する、請求項２２に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  29. 式、
    Figure 0007043425000083
    を有する、請求項２８に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  30. Ｌが、ジスルフィド基を含む、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  31. ｐが、１、２、３、または４である、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  32. 前記抗体－薬物コンジュゲート化合物の混合物を含み、前記抗体－薬物コンジュゲート化合物の混合物中の１抗体当たりの平均薬物負荷が、約２～約５である、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物。
  33. 請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  34. 哺乳動物におけるがんの治療のための医薬品の製造における、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物の使用。
  35. 請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物を含む、がんを治療するための医薬。
  36. 式ＩＩ、
    Figure 0007043425000084
    のシルベストロール－リンカー中間体化合物であって、
    式中、
    Ｒａが、ＣＨ３Ｏ、ＣＮ、ＮＯ２、及びＣｌから選択される基であり、
    Ｒ１が、－ＯＣＨ３及びＬ－Ｘから選択され、
    Ｒ２が、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ及びＬ－Ｘから選択され、
    Ｌが、リンカーであり、
    Ｘが、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ－トルエンスルホン酸、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドから成る群から選択される反応性官能基を含む、前記シルベストロール－リンカー中間体化合物。
  37. Ｌ－Ｘが、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｘ、－ＣＨ２ＣＲ２－Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＣＨ２－Ｘ、－ＣＨ２Ｏ－Ｘ、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）（Ｃ１－Ｃ１２アルキレン）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）（Ｃ２－Ｃ８アルケニレン）－Ｘ、－Ｎ（Ｒ）（Ｃ２－Ｃ８アルキニレン）－Ｘ、及び－Ｎ（Ｒ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｘから選択され、
    ｎが、１～６であり、
    Ｒが独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、及びＣ６－Ｃ２０アリールから選択されるか、または２つのＲが、Ｃ３－Ｃ７炭素環状環を形成し、
    アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、及びアリールが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＯ２、及びＯＣＨ３から選択される１つ以上の基で任意で置換される、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  38. アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、及び－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－から選択される、請求項３７に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  39. Ｘが、
    Figure 0007043425000085
    から選択され、
    式中、波線が、Ｌへの結合を示し、
    Ｒ３が、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、またはＢｒであり、ｑが、０、１、または２である、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  40. Ｒａが、－ＯＣＨ３である、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  41. Ｒ１が、－ＯＣＨ３であり、Ｒ２が、Ｌ－Ｘである、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  42. Ｒ１が、Ｌ－Ｘであり、Ｒ２が、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨである、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  43. Ｌが、式、
    －Ｓｔｒ－ＰＭ－Ｙ－
    を有する、プロテアーゼ－切断可能な非ペプチドリンカーであり、
    式中、Ｓｔｒが、Ｘに共有結合したストレッチャー単位であり、ＰＭが、ペプチドミメティック単位であり、Ｙが、前記シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  44. Ｓｔｒが、（ＣＨ２）５である、請求項４３に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  45. ＰＭが、式、
    Figure 0007043425000086
    を有し、
    式中、Ｒ７及びＲ８が一緒になって、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
    ＡＡが、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である、請求項４３に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  46. Ｒ７及びＲ８が一緒になって、シクロブチルを形成する、請求項４５に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  47. Ｙが、パラ－アミノベンジルまたはパラ－アミノベンジルオキシカルボニルを含む、請求項４３に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  48. Ｌが、式、
    －Ｓｔｒ－Ｐｅｐ－Ｙ－
    を有するペプチドリンカーであり、
    式中、Ｓｔｒが、前記抗体に共有結合したストレッチャー単位であり、Ｐｅｐが、２～１２個のアミノ酸残基のペプチドであり、Ｙが、前記シルベストロール薬物部分に共有結合したスペーサー単位である、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  49. Ｓｔｒが、（ＣＨ２）５である、請求項４８に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  50. Ｐｅｐが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、バリン、及びシトルリンから独立して選択される２個のアミノ酸残基を含む、請求項４８に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  51. Figure 0007043425000087
    Figure 0007043425000088
    から選択される、請求項３６に記載のシルベストロール－リンカー中間体化合物。
  52. 請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート化合物を作製する方法であって、抗体を、請求項３６に記載の式ＩＩのシルベストロール－リンカー中間体化合物と反応させることを含む、前記方法。
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