JP5507062B2 - High expression promoter - Google Patents
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Description
本発明は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の新規な高発現プロモーター、このプロモーターを含む遺伝子発現カセット、形質転換体、タンパク質の製造方法、及び遺伝子の高発現方法に関する。 The present invention relates to a novel high expression promoter derived from Aspergillus oryzae, a gene expression cassette containing this promoter, a transformant, a protein production method, and a gene high expression method.
近年の遺伝子組換え技術の発展とともに、ヒトの有用タンパク質を大腸菌や酵母等を用いて生産できるようになってきた。しかし大腸菌を宿主としてヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させる場合は、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付与しないなどの難点がある。また酵母に異種タンパク質を分泌生産させる場合は、糖鎖は結合されるものの、その分泌量が非常に少ない。
そこで、高いタンパク質分泌能を持つ糸状菌が、真核生物のタンパク質発現の宿主として注目されている。中でも黄麹菌アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）は、清酒や味噌など醸造産業において長く使用されてきた実績から、異種遺伝子発現に積極的に利用されている。
タンパク質生産において重要となるのは、プロモーターの選択と、培養条件のコントロールであり、この双方を適切にすることにより、タンパク質の生産効率を向上させることができる。
With the recent development of gene recombination technology, it has become possible to produce useful human proteins using Escherichia coli and yeast. However, when expressing genes derived from eukaryotes such as humans using Escherichia coli as a host, there are drawbacks such as normal processing is not performed and sugar chains are not added. When secreting and producing a heterologous protein in yeast, the sugar chain is bound, but the amount of secretion is very small.
Thus, filamentous fungi with high protein secretion ability have attracted attention as hosts for eukaryotic protein expression. Among them, Aspergillus oryzae is actively used for heterologous gene expression because of its long history in the brewing industry such as sake and miso.
What is important in protein production is the selection of the promoter and the control of the culture conditions, and by making both appropriate, the protein production efficiency can be improved.
本発明は、アスペルギルス・オリゼで目的遺伝子を高発現させることができるプロモーターを提供することを主な課題とする。 The main object of the present invention is to provide a promoter capable of highly expressing a target gene in Aspergillus oryzae.
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) 配列番号1に示す1500塩基の塩基配列からなるDNAはアスペルギルス・オリゼにおいてプロモーターとして機能し、タンパク質をコードする遺伝子などの目的遺伝子を高発現させることができる。
(ii) 配列番号１の中でも塩基番号501〜1500の配列からなるDNAが特に高いプロモーター活性を示す。
(iii) プロモーター活性に必須のシス因子が配列番号１の塩基番号1101〜1400の領域に存在する。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor repeated research and obtained the following knowledge.
(i) A DNA having a base sequence of 1500 bases shown in SEQ ID NO: 1 functions as a promoter in Aspergillus oryzae, and can highly express a target gene such as a gene encoding a protein.
(ii) Among SEQ ID NO: 1, DNA consisting of the sequences of base numbers 501 to 1500 shows particularly high promoter activity.
(iii) A cis factor essential for promoter activity is present in the region of base numbers 1101-1400 of SEQ ID NO: 1.
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記のプロモーター、目的遺伝子発現カセット、形質転換体、タンパク質の製造方法、及び遺伝子の高発現方法を提供する。
項１． 以下の(a)又は(b)のDNAからなるプロモーター。
(a) 配列番号1において塩基番号1101〜1500の塩基配列を含む最大1500塩基のDNA
(b) (a)のDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアスペルギルス・オリゼでプロモーターとして機能するDNA
項２． (a)が配列番号1において塩基番号801〜1500の塩基配列を含む最大1500塩基のDNAである項１に記載のプロモーター。
項３． (a)が配列番号1において塩基番号501〜1500の塩基配列を含む最大1500塩基のDNAである項１に記載のプロモーター。
項４． (a)が配列番号1において塩基番号501〜1500の塩基配列からなるDNAである項１に記載のプロモーター。
項５． (a)が配列番号1の塩基配列からなるDNAである項１に記載のプロモーター。
項６． 項１〜５のいずれかに記載のプロモーターと、目的遺伝子と、アスペルギルス・オリゼで機能するターミネーターとを含む遺伝子発現カセット。
項７． 項６に記載の遺伝子発現カセットを導入したアスペルギルス属糸状菌形質転換体。
項８． 目的遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子であり、項７に記載の形質転換体を培養する工程と、導入した遺伝子がコードするタンパク質を培養物から回収する工程とを含むタンパク質の製造方法。
項９． 項７に記載の形質転換体を培養する工程を含む目的遺伝子の高発現方法。
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following promoter, target gene expression cassette, transformant, protein production method, and gene high expression method.
(a) DNA having a maximum of 1500 bases comprising the base sequences of 1101 to 1500 in SEQ ID NO: 1
(b) DNA that hybridizes with DNA complementary to (a) under stringent conditions and functions as a promoter in Aspergillus oryzae
本発明のプロモーターは、アスペルギルス・オリゼを含むアスペルギルス属糸状菌においてプロモーターとして機能し、タンパク質をコードする遺伝子などの目的遺伝子を高発現させる。本プロモーターは特に固体培養に適しており、固体培養でのタンパク質生産に通常用いられるamyAプロモーターより著しく優れた遺伝子発現能を示す。また、液体培養でも、富栄養培地を用いれば、液体培養高発現プロモーターとして知られるsodMプロモーターと同等の遺伝子発現能を示す。
このため、目的遺伝子としてタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合は、固体培養や液体富栄養培地を用いた培養において、高いタンパク質生産能を示す。また、目的遺伝子として、特定遺伝子の発現を抑制する目的で当該特定遺伝子の部分配列を使用する場合には、当該特定遺伝子の発現を効率よく抑えることができる。また、目的遺伝子として、細胞内に存在するRNAの秩序を混乱させる目的でノンコーディングRNAやマイクロRNAなどをコードする遺伝子を使用することにより、RNA秩序を効率よく混乱させることができ、種々の効果を期待できる。
The promoter of the present invention functions as a promoter in Aspergillus oryzae including Aspergillus oryzae, and highly expresses a target gene such as a gene encoding a protein. This promoter is particularly suitable for solid culture, and exhibits a gene expression ability that is remarkably superior to the amyA promoter usually used for protein production in solid culture. Moreover, even in liquid culture, if a rich medium is used, gene expression ability equivalent to the sodM promoter known as a liquid culture high expression promoter is exhibited.
Therefore, when a gene encoding a protein is used as the target gene, high protein production ability is exhibited in solid culture or culture using a liquid rich nutrient medium. Further, when a partial sequence of the specific gene is used as the target gene for the purpose of suppressing the expression of the specific gene, the expression of the specific gene can be efficiently suppressed. In addition, by using a gene that encodes non-coding RNA or microRNA for the purpose of disrupting the order of RNA present in cells as the target gene, the RNA order can be efficiently disrupted, and various effects can be achieved. Can be expected.
本発明のプロモーターは、溶血毒タンパクであるヘモリシンと相同性の高いタンパク質のプロモーターであるため、糖加水分解酵素のプロモーターで見られるような、グルコースなどの糖加水分解物による発現抑制がないと考えられる。このため、これまで固体培養高発現プロモーターとして一般に利用されているamyAプロモーターやglaBプロモーターに代えて、糖加水分解酵素の生産に好適に用いることができる。 Since the promoter of the present invention is a promoter of a protein having a high homology with hemolysin, a hemolysin protein, it is considered that there is no suppression of expression by a sugar hydrolyzate such as glucose as seen in the promoter of sugar hydrolase. It is done. For this reason, it can replace with the amyA promoter and glaB promoter which are generally utilized as a solid culture high expression promoter until now, and can be used suitably for production of a sugar hydrolase.
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）高発現プロモーター
本発明のプロモーターは、配列番号1において塩基番号1101〜1500の塩基配列を含む最大1500塩基のDNAである。塩基番号1101〜1400の領域にはプロモーター活性発現に必須のシス因子が存在し、本プロモーターにおいて塩基番号1101〜1400の領域は必須である。配列番号１において、塩基番号1101〜1500を超えて、塩基番号501までの範囲で長くなるほどプロモーター活性は高くなる。本プロモーターは、配列番号１において、塩基番号801〜1500の領域を含むことが好ましく、塩基番号501〜1500の領域を含むことがより好ましい。塩基番号501〜1500の塩基配列からなるDNAが最も高いプロモーター活性を示す。
また、本発明のプロモーターには、上記説明した配列番号１の全部又は一部の塩基配列からなる各DNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、少なくともアスペルギルス・オリゼでプロモーターとして機能するDNAも含まれる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Highly expressed promoter The promoter of the present invention is DNA having a maximum of 1500 bases including the base sequence of base numbers 1101 to 1500 in SEQ ID NO: 1. A cis factor essential for promoter activity expression exists in the region of base numbers 1101 to 1400, and the region of base numbers 1101 to 1400 is essential in this promoter. In SEQ ID NO: 1, the promoter activity increases as the length increases from base numbers 1101 to 1500 to base number 501. This promoter preferably contains a region of base numbers 801 to 1500 in SEQ ID NO: 1, and more preferably contains a region of base numbers 501 to 1500. DNA consisting of the base sequences of base numbers 501 to 1500 shows the highest promoter activity.
The promoter of the present invention includes DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to each DNA consisting of all or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 described above, and at least Aspergillus oryzae DNA that functions as a promoter is also included.
ここで、ストリンジェントな条件とは、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、さらにより好ましくは98％以上の相同性が配列間に存在するときにハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度（Tm）より約5〜30℃、好ましくは約10〜25℃、より好ましくは、約15〜20℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、J.Sambrookら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),特に11.45節”Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。
本発明において、塩基配列間の相同性は、計算ソフトGENETYXを用いて計算した値である。
Here, stringent conditions mean that hybridization occurs when homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more exists between sequences. Means. Usually, it means a case where hybridization occurs at a temperature about 5 to 30 ° C., preferably about 10 to 25 ° C., more preferably about 15 to 20 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid. Stringent conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), especially section 11.45 “Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”. The described conditions can be used.
In the present invention, the homology between base sequences is a value calculated using calculation software GENETYX.
本発明において、「プロモーター活性を有する」とは、少なくとも、アスペルギルス・オリゼ由来のエンドグルカナーゼ遺伝子celAをアスペルギルス・オリゼの小麦フスマ固体培養で発現させ得ることをいう。コムギフスマ培養の条件としては、例えば、アスペルギルス・オリゼOSI1013株を用いた、温度37℃、散水率60％、時間64時間の培養条件が挙げられる。
上記説明した配列番号１の全部又は一部の塩基配列からなる各DNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAには、例えば、アスペルギルス・オリゼ以外の糸状菌由来のヘモリシンプロモーターの全部又は一部が含まれる。
In the present invention, “having promoter activity” means that at least the Aspergillus oryzae-derived endoglucanase gene celA can be expressed in a wheat bran solid culture of Aspergillus oryzae. Examples of the conditions for wheat culturing include culture conditions using Aspergillus oryzae OSI1013 strain at a temperature of 37 ° C., a watering rate of 60%, and a time of 64 hours.
Examples of DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to each DNA consisting of all or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 described above include, for example, hemolysin promoters derived from filamentous fungi other than Aspergillus oryzae Are included in whole or in part.
（２）遺伝子発現カセット
本発明の遺伝子発現カセットには、上記説明した本発明のプロモーター、目的遺伝子、及びアスペルギルス・オリゼで機能するターミネーターが含まれる。通常、プロモーター、目的遺伝子、ターミネーターは5’末端側からこの順でカセット内に含まれる。
目的遺伝子として、代表的にはタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。構造遺伝子は特に限定されず、アスペルギルス・オリゼなどのアスペルギルス属糸状菌を用いて生産できるタンパク質をコードする遺伝子であればよい。このような遺伝子として、例えばフィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼのようなペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α-アラビノフラノシダーゼ、β-キシロシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、キチナーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ）、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼのようなタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、及びカルボキシペプチダーゼなどが挙げられる。また、酵素以外のタンパク質としてレクチン、カルモジュリン、トランスフェリンや各種転写因子をコードする遺伝子なども挙げられる。
(2) Gene expression cassette The gene expression cassette of the present invention includes the above-described promoter of the present invention, the target gene, and a terminator that functions in Aspergillus oryzae. Usually, the promoter, target gene, and terminator are contained in the cassette in this order from the 5 ′ end.
A typical gene of interest is a gene encoding a protein. The structural gene is not particularly limited as long as it encodes a protein that can be produced using Aspergillus oryzae or other Aspergillus oryzae. Examples of such genes include pectin degrading enzymes such as phytase, lyase, and pectinase, amylase, glucoamylase, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, α-arabinofuranosidase, β-xylosidase , Mannosidase, isomerase, invertase, transferase, ribonuclease, deoxyribonuclease, chitinase, catalase, laccase, phenol oxidase, tyrosinase, oxidase, oxidoreductase, cellulase (endoglucanase, cellobiohydrase), xylanase, peroxidase, lipase, hydrolase, esterase Proteolytic enzymes such as cutinases, proteases, aminopeptidases, and Such as carboxymethyl peptidase and the like. Examples of proteins other than enzymes include lectin, calmodulin, transferrin, and genes encoding various transcription factors.
また、目的遺伝子としては、siRNAにより特定遺伝子の発現を抑制する目的で、その特定遺伝子の部分配列を用いることもできる。また、目的遺伝子としては、細胞内に存在するRNAの秩序を混乱させる目的でノンコーディングRNAやマイクロRNAをコードする遺伝子を用いてもよい。
中でも、タンパク質をコードする遺伝子が好ましく、糖質加水分解酵素の構造遺伝子がより好ましい。糖質加水分解酵素の構造遺伝子を含む遺伝子発現カセットを導入した形質転換体を、バイオマス存在下で固体培養することにより、分解産物による発現抑制を回避して効率よくバイオマスを分解させることができる。
目的遺伝子の由来は問わないが、配列番号１の全部又は一部の塩基配列で構成されるプロモーターを用いる場合は、同じアスペルギルス・オリゼ由来の構造遺伝子を用いてセルフクローニング株を作製するのが好ましい。
In addition, as a target gene, a partial sequence of the specific gene can be used for the purpose of suppressing the expression of the specific gene by siRNA. In addition, as a target gene, a gene encoding non-coding RNA or microRNA may be used for the purpose of disrupting the order of RNA present in the cell.
Among them, a gene encoding a protein is preferable, and a structural gene of carbohydrate hydrolase is more preferable. By subjecting a transformant introduced with a gene expression cassette containing a structural gene of a saccharide hydrolase to solid culture in the presence of biomass, it is possible to efficiently suppress biomass by avoiding suppression of expression due to degradation products.
The origin of the target gene does not matter, but when a promoter composed of all or part of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is used, it is preferable to prepare a self-cloning strain using the same structural gene derived from Aspergillus oryzae. .
上記のタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、麹菌ESTデータベース(https://www.nrib.go.jp/ken/EST/db/blast.html)を検索する方法で容易に入手できる。
ターミネーターは、少なくともアスペルギルス・オリゼで機能するターミネーターであればよく、制限なく使用することができる。このようなターミネーターとして、例えば、グルコアミラーゼglaBターミネーター（Gene. 207, 127-134,(1998）、特開2000-245465）、amyA（α-アミラーゼ）ターミネーター、celA(セルラーゼA)ターミネーター等が挙げられる。
遺伝子発現カセットにおいて、プロモーターの上流には任意の塩基配列が付加していてもよい。この任意の塩基配列は、約500塩基以下が好ましく、約200塩基以下がより好ましく、約100塩基以下がさらにより好ましい。付加された塩基配列とプロモーターとを含めて、通常、最大2000塩基程度まで許容される。プロモーターと構造遺伝子との間にも、約30塩基以下、好ましくは約10塩基以下、より好ましくは約6塩基以下の任意の塩基配列が存在していてもよい。構造遺伝子とターミネーターとの間にも、約30塩基以下、好ましくは約10塩基以下、より好ましくは約6塩基以下の任意の塩基配列が存在していてもよい。これらの任意の配列は、セルフクローニングを行う場合は当該生物種に由来する配列であればよい。
The gene encoding the above protein can be easily obtained by, for example, a method for searching the Neisseria gonorrhoeae EST database (https://www.nrib.go.jp/ken/EST/db/blast.html).
The terminator may be any terminator that functions at least in Aspergillus oryzae and can be used without limitation. Examples of such terminators include glucoamylase glaB terminator (Gene. 207, 127-134, (1998), JP 2000-245465), amyA (α-amylase) terminator, celA (cellulase A) terminator and the like. .
In the gene expression cassette, an arbitrary base sequence may be added upstream of the promoter. The arbitrary base sequence is preferably about 500 bases or less, more preferably about 200 bases or less, and even more preferably about 100 bases or less. Including the added base sequence and promoter, a maximum of about 2000 bases is usually allowed. An arbitrary base sequence of about 30 bases or less, preferably about 10 bases or less, more preferably about 6 bases or less may be present between the promoter and the structural gene. An arbitrary base sequence of about 30 bases or less, preferably about 10 bases or less, more preferably about 6 bases or less may be present between the structural gene and the terminator. These arbitrary sequences may be sequences derived from the organism species when performing self-cloning.
また、構造遺伝子にコードされる目的タンパク質が菌体内タンパク質として生産されるものである場合は、目的遺伝子のオープンリーディングフレームに隣接して上流に分泌タンパク質遺伝子を配置することにより、目的タンパク質とその分泌タンパク質との融合タンパク質として菌体外に分泌させることができる。
本発明のプロモーターによる目的遺伝子発現の妨げにならない範囲で、マーカー遺伝子が、遺伝子発現カセット中の任意の位置に存在していてよい。或いは、コトランスフォーメーションを行う場合は、別途用意するフラグメントあるいはプラスミド中の任意の場所にマーカー遺伝子が存在していれば良い。
In addition, when the target protein encoded by the structural gene is produced as an intracellular protein, the target protein and its secretion can be obtained by placing the secreted protein gene upstream adjacent to the open reading frame of the target gene. It can be secreted outside the cell as a fusion protein with a protein.
The marker gene may be present at any position in the gene expression cassette as long as it does not interfere with target gene expression by the promoter of the present invention. Alternatively, when co-transformation is performed, the marker gene may be present at any location in a separately prepared fragment or plasmid.
マーカー遺伝子は、宿主となるアスペルギルス属糸状菌で発現できるものであればよい。例えば、
niaD(Biosci.Biotechnol.Biochem.,59,1795-1797(1995))、argB (Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984)), sC (Gene,84,329-334, (1989))、ptrA (Biosci Biotechnol Biochem,64,1416-1421, (2000))、pyrG (Biochem Biophys Res Commun, 112, 284-289, (1983)), amdS (Gene, 26, 205-221,(1983))、オーレオバシジン耐性遺伝子 (Mol Gen Genet, 261, 290-296,(1999))、ベノミル耐性遺伝子 (Proc Natl Acad Sci USA, 83,4869-4873,(1986))及びハイグロマイシン耐性遺伝子 (Gene, 57, 21-26,(1987))、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子leuA(Acta Microbiol Pol., 29, 29-33, (1980))等を使用できる。中でも、復帰変異による要求性の喪失が少なく、薬剤耐性遺伝子よりもバックグラウンドが少ない点で、leuA、pyrGやargBが好ましい。
遺伝子発現カセットは全体として、約15,000塩基以下の大きさであればよい。
The marker gene may be any gene that can be expressed in the host Aspergillus fungus. For example,
niaD (Biosci.Biotechnol.Biochem., 59,1795-1797 (1995)), argB (Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984)), sC (Gene, 84,329-334, (1989)), ptrA (Biosci Biotechnol Biochem, 64, 1416-1421, (2000)), pyrG (Biochem Biophys Res Commun, 112, 284-289, (1983)), amdS (Gene, 26, 205-221, (1983)), Ore Ovacidin resistance gene (Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999)), benomyl resistance gene (Proc Natl Acad Sci USA, 83,4869-4873, (1986)) and hygromycin resistance gene (Gene, 57, 21-26, (1987)), isopropylmalate synthase gene leuA (Acta Microbiol Pol., 29, 29-33, (1980)) and the like can be used. Among them, leuA, pyrG, and argB are preferable in that there is little loss of requirement due to reversion and less background than drug resistance genes.
The gene expression cassette may have a size of about 15,000 bases or less as a whole.
（３）形質転換体
本発明の形質転換体は、上記説明した本発明の遺伝子発現カセットを導入したアスペルギルス属糸状菌である。
宿主としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）などが挙げられる。中でも、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・ソーヤなどが食品産業において有用な菌種である。高いタンパク質生産能及び醸造微生物としての安全性の点で、特にアスペルギルス・オリゼを宿主とすることが好ましい。
形質転換株を容易に選択できるように、導入するマーカー遺伝子が変異した変異株を用いることが好ましい。
形質転換方法は、特に限定されず、PEG−カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法を採用できる。
(3) Transformant The transformant of the present invention is an Aspergillus filamentous fungus into which the above-described gene expression cassette of the present invention has been introduced.
As the host, for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii, Aspergillus usami, Aspergillus usi, Aspergillus sojae) and Aspergillus nidulans. Among them, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachi, Aspergillus usami, Aspergillus soya and the like are useful bacterial species in the food industry. From the viewpoint of high protein production ability and safety as a brewing microorganism, it is particularly preferable to use Aspergillus oryzae as a host.
It is preferable to use a mutant strain in which a marker gene to be introduced is mutated so that a transformed strain can be easily selected.
The transformation method is not particularly limited, and a known method such as a PEG-calcium method, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, an electroporation method, a lipofection method, or a microinjection method can be employed.
（４）タンパク質の製造方法
目的遺伝子として、タンパク質をコードする遺伝子を用いた遺伝子発現カセットを導入した形質転換体を使用すれば、タンパク質を効率よく生産させることができる。このタンパク質の製造方法は、上記説明した本発明の形質転換体を培養する工程と、培養物から目的タンパク質を回収する工程とを含む方法である。
培養工程において、培地は、固体培地が好ましい。固体培地は、糸状菌の培養に使用される公知の固体培地を制限無く使用できる。固体培地はその固形の支持担体が栄養源を含むか、又は固形の支持担体に栄養源が添加されたものであり、そこに糸状菌が生育できる固形培地である。このような固体培地として主に、フスマ（小麦・米などの穀類由来）、デンプン粉末、米、小麦、大豆の生あるいは蒸したもの、Ｃｚ−ＤＯＸやポテトデキストロースやその他栄養源を含む寒天培地、更にはメンブレンや多孔質の人工物（例えば園芸に使われるバーミキュライト）等に栄養源を添加したもの等が挙げられる。特に、フスマ、デンプン粉末、米、小麦、大豆の生あるいは蒸したものが好ましい。
(4) Protein production method If a transformant into which a gene expression cassette using a gene encoding a protein is introduced as a target gene, the protein can be produced efficiently. This protein production method includes a step of culturing the above-described transformant of the present invention and a step of recovering the target protein from the culture.
In the culturing step, the medium is preferably a solid medium. As the solid medium, a known solid medium used for culturing filamentous fungi can be used without limitation. The solid medium is a solid medium in which the solid support carrier contains a nutrient source, or a nutrient source is added to the solid support carrier, on which filamentous fungi can grow. As such solid medium, mainly a bran (derived from cereals such as wheat and rice), starch powder, rice, wheat, soybean raw or steamed, agar medium containing Cz-DOX, potato dextrose and other nutrient sources, Furthermore, the thing etc. which added the nutrient source to the membrane, the porous artifact (for example, vermiculite used for gardening), etc. are mentioned. In particular, raw or steamed bran, starch powder, rice, wheat, and soybean are preferred.
固体培養時の培養温度は、約30〜42℃が好ましく、約30〜37℃がより好ましい。散水率（固体培地中の水分含有量（重量％））は、約40〜80％が好ましく、約50〜70％がより好ましい。上記温度及び散水率の範囲であれば、本発明のプロモーター活性が一層高くなりタンパク質生産量が高くなる。また、撹拌できる培地であれば、約1〜4回／日の頻度で撹拌することにより培地の均一性を保つことができ、タンパク質生産効率が向上する。培養時間は、目的遺伝子の種類などによって異なるが、通常、約40〜72時間行えばよい。 The culture temperature during solid culture is preferably about 30 to 42 ° C, more preferably about 30 to 37 ° C. The watering rate (water content (% by weight) in the solid medium) is preferably about 40 to 80%, more preferably about 50 to 70%. If it is the range of the said temperature and watering rate, the promoter activity of this invention will become still higher and protein production amount will become high. Moreover, if it is a culture medium which can be stirred, the uniformity of a culture medium can be maintained by stirring about 1 to 4 times / day, and protein production efficiency improves. The culture time varies depending on the type of the target gene and the like, but it may usually be performed for about 40 to 72 hours.
また、本発明のプロモーターは液体培養においても高いタンパク質生産能を示す。液体培養には、デキストリン−ペプトン−酵母エキス(DPY)培地、ポテト−スクロース(PS)培地、オートミール培地、麦芽エキス培地などの富栄養培地を使用できる。
液体培養時の培養温度は、約30〜42℃が好ましく、約30〜37℃がより好ましい。培養時間は、目的遺伝子の種類などによって異なるが、通常、約40〜72時間行えばよい。
In addition, the promoter of the present invention exhibits high protein production ability even in liquid culture. For liquid culture, nutrient rich media such as dextrin-peptone-yeast extract (DPY) medium, potato-sucrose (PS) medium, oatmeal medium, malt extract medium and the like can be used.
The culture temperature during liquid culture is preferably about 30 to 42 ° C, more preferably about 30 to 37 ° C. The culture time varies depending on the type of the target gene and the like, but it may usually be performed for about 40 to 72 hours.
回収工程では、目的タンパク質が分泌タンパク質である場合、又は分泌タンパク質との融合タンパク質である場合は、培養上清を回収すればよい。固体培地の場合は固体培地自体を回収すればよい。また、目的タンパク質が細胞内に生産されるものである場合は、濾紙、ガラスフィルターなどで集菌し、通常は、液体窒素で凍結して粉砕したり、海砂Ｂですり潰したり、ポリトロンやホモジナイザー等を用いて菌体を破砕すればよい。破砕物に適切な抽出緩衝液（例えば２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０）を添加し、得られた破砕液を約5000〜12000×gで約5〜20分間遠心分離し、上清を回収すればよい。これにより目的タンパク質を回収できる。
さらに、これらの上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティなどの各種クロマトグラフィーに供することにより目的タンパク質を精製してもよい。
In the recovery step, when the target protein is a secreted protein or a fusion protein with the secreted protein, the culture supernatant may be recovered. In the case of a solid medium, the solid medium itself may be recovered. In addition, when the target protein is produced intracellularly, it is collected with filter paper, glass filter, etc., usually frozen with liquid nitrogen and pulverized, ground with sea sand B, polytron or homogenizer What is necessary is just to crush a microbial cell using etc. Appropriate extraction buffer (for example, 20 mM phosphate buffer pH 7.0) is added to the crushed material, and the resulting crushed solution is centrifuged at about 5000 to 12000 × g for about 5 to 20 minutes, and the supernatant is recovered. That's fine. Thereby, the target protein can be recovered.
Furthermore, the target protein may be purified by subjecting these supernatants to various known chromatography methods such as ion exchange, hydrophobicity, gel filtration, and affinity.
（５）遺伝子の高発現方法
本発明の形質転換体を培養することにより、目的遺伝子の種類を問わず、当該遺伝子を高発現させることができる。培養条件は、タンパク質の生産方法について説明したのと同様である。例えば、目的遺伝子として特定遺伝子の部分配列を含む遺伝子発現カセットを導入した形質転換体を培養することにより、この部分配列が高発現して直接又は間接的にsiRNAが生成し、特定遺伝子の発現が抑制された培養物が得られる。
(5) High gene expression method By culturing the transformant of the present invention, the gene can be highly expressed regardless of the type of the target gene. The culture conditions are the same as described for the protein production method. For example, by culturing a transformant in which a gene expression cassette containing a partial sequence of a specific gene as a target gene is cultured, this partial sequence is highly expressed and siRNA is generated directly or indirectly, and the expression of the specific gene is An inhibited culture is obtained.
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
実施例１（各種プロモーターのエンドグルカナーゼ発現能の比較）
（１）プロモーターの取得
常法に従って、アスペルギルス・オリゼの機能未知遺伝子（AO090010000018；hly）の上流の1500塩基からなる領域の配列を新規プロモーター候補として取得した。新規プロモーター候補は、Aspergillus nidulansの機能未知遺伝子やAspergillus fumigatusの溶血毒ヘモリシン遺伝子と相同性の高い遺伝子の上流領域である。取得したプロモーター候補の塩基配列を配列番号１に示す。
また、アスペルギルス・オリゼ由来の５種の公知のプロモーターも取得した。公知プロモーターのうち、グルコアミラーゼ遺伝子(glaB)プロモーターの塩基配列を配列番号２に示し、クルシフォーム結合タンパク質のプロモーター（特開2002-320477）の塩基配列を配列番号３に示し、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子プロモーター（特開2002-320477）の塩基配列を配列番号4に示し、small v ATPase遺伝子プロモーター（特許第3792467号）の塩基配列を配列番号５に示し、ヒストンH2Aプロモーター（特許第3792467号）の塩基配列を配列番号６に示す。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples.
Example 1 (Comparison of endoglucanase expression ability of various promoters)
(1) Acquisition of promoter According to a conventional method, a sequence of a region consisting of 1500 bases upstream of an Aspergillus oryzae unknown function gene (AO090010000018; hly) was acquired as a novel promoter candidate. New promoter candidates are upstream regions of genes with high homology to Aspergillus nidulans function-unknown genes and Aspergillus fumigatus hemolytic toxin hemolysin gene. The obtained nucleotide sequence of the promoter candidate is shown in SEQ ID NO: 1.
In addition, five known promoters derived from Aspergillus oryzae were also obtained. Among the known promoters, the nucleotide sequence of the glucoamylase gene (glaB) promoter is shown in SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of the promoter of the kursiform binding protein (JP 2002-320477) is shown in SEQ ID NO: 3, and peptidyl prolyl cis-trans The nucleotide sequence of the isomerase gene promoter (JP 2002-320477) is shown in SEQ ID NO: 4, the nucleotide sequence of the small v ATPase gene promoter (Japanese Patent No. 3792467) is shown in SEQ ID NO: 5, and the histone H2A promoter (Japanese Patent No. 3792467). Is shown in SEQ ID NO: 6.
また、アスペルギルス・オリゼの、ユビキチン遺伝子に相同性が高い遺伝子(AO090003001182；ubq)の上流1500塩基からなる領域（配列番号７）、及びアスペルギルス・オリゼの、リンゴ酸脱水素酵素遺伝子に相同性が高い遺伝子(AO090701000013；mdh)の上流1000塩基の領域（配列番号８）もプロモーター候補として取得した。
これらのプロモーター及びプロモーター候補は、下記に示す各プライマーセットを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより取得した。
In addition, a region consisting of 1500 bases upstream of the gene (AO090003001182; ubq) having a high homology to the ubiquitin gene of Aspergillus oryzae and a high homology to the malate dehydrogenase gene of Aspergillus oryzae A region of 1000 bases upstream of the gene (AO090701000013; mdh) (SEQ ID NO: 8) was also obtained as a promoter candidate.
These promoters and promoter candidates were obtained by performing PCR using each of the primer sets shown below using the genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by Laurel Wreath Co., Ltd.) as a template.
機能未知遺伝子プロモーター候補：
pUC19-Phly-S1
5’-gaccatgattacgccTGAGTGAAGTTCCGGTCGGAGCAATCAGGG-3’
(配列番号9)
celA-Phly-A1
5’-caatgagagcttcatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3’
(配列番号10)
グルコアミラーゼ(glaB)プロモーター：
pUC19-PglaB-S1
5’-gaccatgattacgccGCCACTAACACCCTGTGCAGAGAGTATCTA-3’
(配列番号11)
celA-PglaB-A1
5’-caatgagagcttcatGATGGTGGTGACTTCCAAGAAACAAGAAAT-3’
(配列番号12)
クルシフォーム結合タンパク質遺伝子プロモーター：
pUC19-Pcrub-S1
5’-gaccatgattacgccGCAAATGTAGCCAGCCACCTATCCATGGAT-3’
(配列番号13)
celA-Pcrub-A1
5’-caatgagagcttcatTGTGATGGTTGTTTGTGGTTGAAGTGGTTG-3’
(配列番号14)
ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子プロモーター：
pUC19-Pfkbp-S1
5’-gaccatgattacgccCCTTTTTGACCTTGGTGGTTGATAGAACGA-3’
(配列番号15)
celA-Pfkbp-A1
5’-caatgagagcttcatTTTGAGATGCTGAATCGGATAATCAATAAA-3’
(配列番号16)
small v ATPase遺伝子プロモーター：
pUC19-Phex1-S1
5’-gaccatgattacgccAGAACCGGGTCAATTCGCTTGCAATCAGCT-3’
(配列番号17)
celA-Phex1-A1
5’-caatgagagcttcatCTTGCGAGCAGGGGGATGATCAACTACAGT-3’
(配列番号18)
ヒストンH2A遺伝子プロモーター：
pUC19-PH2A-S1
5’-gaccatgattacgccTTCTTCTCACAGCCTGGGTGCCATTTTTGA-3’
(配列番号19)
celA-PH2A-A1
5’-caatgagagcttcatTTTTGCGATTGGGAATGGTTCGACAGAAGT-3’
(配列番号20)
ユビキチン遺伝子プロモーター候補：
pUC19-Pubq-S1
5’-gaccatgattacgccACTAGTCCCGAATGGGGTGCCCGACGGTCT-3’
(配列番号21)
celA-Pubq-A1
5’-caatgagagcttcatGATGACGACGGTGAAAGTATTTCAGTTGTA-3’
(配列番号22)
リンゴ酸脱水素酵素遺伝子プロモーター候補：
pUC19-Pmdh-S1
5’-gaccatgattacgccGACGAAAGGTTTTGGGAGGATAAGCAAGCT-3’
(配列番号23)
celA-Pmdh-A1
5’-caatgagagcttcatGATGGACGAGATTCTCGAATCAAACAATTG-3’
(配列番号24)
Candidate promoters with unknown functions:
pUC19-Phly-S1
5'-gaccatgattacgccTGAGTGAAGTTCCGGTCGGAGCAATCAGGG-3 '
(SEQ ID NO: 9)
celA-Phly-A1
5'-caatgagagcttcatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3 '
(SEQ ID NO: 10)
Glucoamylase (glaB) promoter:
pUC19-PglaB-S1
5'-gaccatgattacgccGCCACTAACACCCTGTGCAGAGAGTATCTA-3 '
(SEQ ID NO: 11)
celA-PglaB-A1
5'-caatgagagcttcatGATGGTGGTGACTTCCAAGAAACAAGAAAT-3 '
(SEQ ID NO: 12)
Cruciform binding protein gene promoter:
pUC19-Pcrub-S1
5'-gaccatgattacgccGCAAATGTAGCCAGCCACCTATCCATGGAT-3 '
(SEQ ID NO: 13)
celA-Pcrub-A1
5'-caatgagagcttcatTGTGATGGTTGTTTGTGGTTGAAGTGGTTG-3 '
(SEQ ID NO: 14)
Peptidyl prolyl cis trans isomerase gene promoter:
pUC19-Pfkbp-S1
5'-gaccatgattacgccCCTTTTTGACCTTGGTGGTTGATAGAACGA-3 '
(SEQ ID NO: 15)
celA-Pfkbp-A1
5'-caatgagagcttcatTTTGAGATGCTGAATCGGATAATCAATAAA-3 '
(SEQ ID NO: 16)
small v ATPase gene promoter:
pUC19-Phex1-S1
5'-gaccatgattacgccAGAACCGGGTCAATTCGCTTGCAATCAGCT-3 '
(SEQ ID NO: 17)
celA-Phex1-A1
5'-caatgagagcttcatCTTGCGAGCAGGGGGATGATCAACTACAGT-3 '
(SEQ ID NO: 18)
Histone H2A gene promoter:
pUC19-PH2A-S1
5'-gaccatgattacgccTTCTTCTCACAGCCTGGGTGCCATTTTTGA-3 '
(SEQ ID NO: 19)
celA-PH2A-A1
5'-caatgagagcttcatTTTTGCGATTGGGAATGGTTCGACAGAAGT-3 '
(SEQ ID NO: 20)
Ubiquitin gene promoter candidates:
pUC19-Pubq-S1
5'-gaccatgattacgccACTAGTCCCGAATGGGGTGCCCGACGGTCT-3 '
(SEQ ID NO: 21)
celA-Pubq-A1
5'-caatgagagcttcatGATGACGACGGTGAAAGTATTTCAGTTGTA-3 '
(SEQ ID NO: 22)
Malate dehydrogenase gene promoter candidates:
pUC19-Pmdh-S1
5'-gaccatgattacgccGACGAAAGGTTTTGGGAGGATAAGCAAGCT-3 '
(SEQ ID NO: 23)
celA-Pmdh-A1
5'-caatgagagcttcatGATGGACGAGATTCTCGAATCAAACAATTG-3 '
(SEQ ID NO: 24)
（２）celA発現カセット取得用のプラスミドの構築
前述した各種プロモーター（候補）及びglaBターミネーターと連結したcelA発現カセットを取得するために、下記に示す各プライマーと、プライマーTglaB-celA-A1：
5’-cactggaaagtacatTTAGTTGACACTGGCAGTCCAGTTGGGAAC-3’ (配列番号25)とのプライマーセットを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより、アスペルギルス・オリゼのエンドグルカナーゼ遺伝子(celA)を取得した。celA遺伝子の塩基配列を配列番号26に示す。
機能未知遺伝子プロモーター候補連結用プライマー：
Phly-celA-S1
5’-tcacaccacaacaccATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’
(配列番号27)
glaBプロモーター連結用プライマー：
PglaB-celA-S1：5’-gaagtcaccaccatcATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’ (配列番号28)
クルシフォーム結合タンパク質遺伝子プロモーター連結用プライマー：
Pcrub-celA-S1
5’-caaacaaccatcacaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’
(配列番号29)
ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子プロモーター連結用プライマー：
Pfkbp-celA-S1
5’-attcagcatctcaaaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’
(配列番号30)
small v ATPase遺伝子プロモーター連結用プライマー：
Phex1-celA-S1
5’-ccccctgctcgcaagATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’
(配列番号31)
ヒストンH2A遺伝子プロモーター連結用プライマー：
PH2A-celA-S1
5’-ttcccaatcgcaaaaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’
(配列番号32)
ユビキチン遺伝子プロモーター候補連結用プライマー：
Pubq-celA-S1
5’-ttcaccgtcgtcatcATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’
(配列番号33)
リンゴ酸脱水素酵素遺伝子プロモーター候補連結用プライマー：
Pmdh-celA-S1
5’-agaatctcgtccatcATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’
(配列番号34)
(2) Construction of plasmid for obtaining celA expression cassette In order to obtain the celA expression cassette linked to the various promoters (candidates) and glaB terminator described above, the following primers and primer TglaB-celA-A1:
Using the primer set with 5'-cactggaaagtacatTTAGTTGACACTGGCAGTCCAGTTGGGAAC-3 '(SEQ ID NO: 25), the Aspergillus oryzae endoglucanase gene (celA) was obtained by PCR using Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by laurel wreath) as a template. I got it. The base sequence of the celA gene is shown in SEQ ID NO: 26.
Primers for linking candidate promoters of unknown genes:
Phly-celA-S1
5'-tcacaccacaacaccATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '
(SEQ ID NO: 27)
Primer for glaB promoter ligation:
PglaB-celA-S1: 5'-gaagtcaccaccatcATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '(SEQ ID NO: 28)
Primer for ligformoform-binding protein gene promoter ligation:
Pcrub-celA-S1
5'-caaacaaccatcacaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '
(SEQ ID NO: 29)
Primer for linking peptidylprolyl cis-trans isomerase gene promoter:
Pfkbp-celA-S1
5'-attcagcatctcaaaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '
(SEQ ID NO: 30)
Small v ATPase gene promoter ligation primer:
Phex1-celA-S1
5'-ccccctgctcgcaagATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '
(SEQ ID NO: 31)
Primer for linking histone H2A gene promoter:
PH2A-celA-S1
5'-ttcccaatcgcaaaaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '
(SEQ ID NO: 32)
Primers for linking ubiquitin gene promoter candidates:
Pubq-celA-S1
5'-ttcaccgtcgtcatcATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '
(SEQ ID NO: 33)
Malate dehydrogenase gene promoter candidate ligation primer:
Pmdh-celA-S1
5'-agaatctcgtccatcATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '
(SEQ ID NO: 34)
また、glaBターミネーターを、プライマーcelA-TglaB-S1：
5’-gccagtgtcaactaaATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3’ (配列番号35)と、pUC19-TglaB-A1：
5’-aaaacgacggccagtATCGGCTGAAGTTAGGAGCGGCCATTGTCT-3’ (配列番号36)とのプライマーセットを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより取得した。glaBターミネーターの塩基配列を配列番号37に示す。
Also, glaB terminator, primer celA-TglaB-S1:
5'-gccagtgtcaactaaATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3 '(SEQ ID NO: 35) and pUC19-TglaB-A1:
Using a primer set with 5′-aaaacgacggccagtATCGGCTGAAGTTAGGAGCGGCCATTGTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 36), PCR was performed using genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by laurel wreath) as a template. The base sequence of the glaB terminator is shown in SEQ ID NO: 37.
以上のPCRは、全て、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
ここで、各プロモーター（候補）の5’末端、およびglaBターミネーターの3’末端には、後のpUC19への挿入のために、pUC19のマルチクローニングサイトの両端の部分15 bpsずつと相同な配列を付与するようなプライマーを使用している。また、各プロモーター(候補)とcelA遺伝子、celA遺伝子とglaBターミネーターとをover lap PCRにより連結することを目的として、それぞれのPCR増幅断片の末端に、連結させる断片の末端15 bpsと相同な配列を付与している。各プライマーの配列において、それぞれを連結するために付与した配列は小文字で記載してある。
得られたPCR産物を電気泳動後、目的のサイズを切り出し、スピンカラム（プロメガ製、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System）により精製した。
In all the PCRs described above, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
Here, at the 5 ′ end of each promoter (candidate) and the 3 ′ end of the glaB terminator, a sequence homologous to 15 bps at both ends of the multicloning site of pUC19 for subsequent insertion into pUC19. Primers that give are used. In addition, for the purpose of linking each promoter (candidate) and celA gene, and celA gene and glaB terminator by overlap PCR, a sequence homologous to the 15 bps of the fragment to be ligated is added to the end of each PCR amplified fragment. Has been granted. In the sequence of each primer, the sequence given for linking each is shown in lower case.
The obtained PCR product was electrophoresed, and the target size was cut out and purified by a spin column (manufactured by Promega, Wizard (R) SV Gel and PCR Clean-Up System).
各プロモーター（候補）、celA遺伝子およびglaBターミネーターの3個のPCR増幅産物を鋳型として、各プロモーター（候補）の5’末端およびglaBターミネーターの3’末端にアニールするプライマーを用いてover lap PCRを行い、celA発現カセットを増幅した。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/4分のサイクルを30回繰り返した。得られたPCR産物を電気泳動後目的のサイズを切り出し、スピンカラム（プロメガ製、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System）およびエタノール沈殿により精製した。
次に、pUC19を鋳型として、pUC19-S1：
5’-ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGT-3’ (配列番号38)及びpUC19-A1：5’-GGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT-3’ (配列番号39)の２つのプライマーを用いてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/2分30秒のサイクルを30回繰り返した。得られたPCR産物を電気泳動後、目的のサイズを切り出し、スピンカラム（プロメガ社製、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System）およびエタノール沈殿により精製した。
こうして得られたcelA発現カセットおよびpUC19のPCR増幅産物をIn-Fusion CF Liquid PCR Cloning Kit（クロンテック社製）を用いて融合し、celA発現用の8種のプラスミドを得た。
Using the PCR amplification products of each promoter (candidate), celA gene and glaB terminator as a template, perform overlap PCR using primers that anneal to the 5 'end of each promoter (candidate) and the 3' end of glaB terminator The celA expression cassette was amplified. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./4 minutes was repeated 30 times. The obtained PCR product was electrophoresed and the desired size was cut out and purified by spin column (Promega, Wizard (R) SV Gel and PCR Clean-Up System) and ethanol precipitation.
Next, using pUC19 as a template, pUC19-S1:
PCR was performed using two primers, 5′-ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGT-3 ′ (SEQ ID NO: 38) and pUC19-A1: 5′-GGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 39). As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./2
The celA expression cassette thus obtained and the PCR amplification product of pUC19 were fused using an In-Fusion CF Liquid PCR Cloning Kit (Clontech) to obtain 8 types of plasmids for celA expression.
（２）形質転換
得られたプラスミドの発現カセット、及びleuA遺伝子発現カセットを、常法に従い、アスペルギルス・オリゼOSI1013株のロイシン要求性変異株(特開2006-345817号公報参照)へ導入した。
leuA遺伝子発現カセットは、Aspergillus nidulansのゲノムDNAを含むpANLAプラスミド(特開2006-345817号公報参照)を鋳型として、M13 Primer P7：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ (配列番号40)およびM13 Primer P8：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3’ (配列番号41)を用いてPCRにより増幅したものを用いた。
(2) Transformation The resulting plasmid expression cassette and leuA gene expression cassette were introduced into a leucine-requiring mutant of Aspergillus oryzae OSI1013 strain (see JP 2006-345817 A) according to a conventional method.
As the leuA gene expression cassette, M13 Primer P7: 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 40) and M13 Primer P8: pANLA plasmid containing genomic DNA of Aspergillus nidulans (see JP 2006-345817 A) as a template Amplified by PCR using 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 41) was used.
（３）エンドグルカナーゼ活性測定
AZCL-HE-Cellulose (Megazyme社製)含有のCzapek-Dox寒天培地（2% Maltose、0.2% NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% KCl、0.05% MgSO4・7H2O、0.001% FeSO4・7H2O、0.1% AZCL-HE-Cellulose、50 mM acetate-sodium acetate buffer (pH5.0)、1.5% Agar、0.1% Triton-X）に、上記のようにして得た形質転換株を植菌し、30℃で培養した。CelAによるAZCL-HE-Celluloseの分解により形成する青色のハロを確認し、エンドグルカナーゼ活性を有する形質転換株を4株ずつ選抜した。これらをPDA（potato dextrose agar、和光純薬製）寒天培地に植え、30℃で1〜2週間培養後、胞子懸濁液を作成し、これを5 gの小麦フスマへ4 ml（胞子数は5.0×108個）植菌した。これを1日に2回程度攪拌を行いながら30℃で64時間培養した。培養後、50 mlの0.5% NaCl含有10 mM 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を加え、30℃、120 rpmで30分間振とうすることで、分泌タンパク質を抽出し、得られた上清を用いてエンドグルカナーゼ活性測定およびSDS-PAGEを行った。
(3) Endoglucanase activity measurement
Czapek-Dox agar medium containing AZCL-HE-Cellulose (Megazyme) (2% Maltose, 0.2% NaNO 3 , 0.1% K 2 HPO 4 , 0.05% KCl, 0.05% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.001% FeSO 4 · 7H 2 O, 0.1% AZCL-HE-Cellulose, 50 mM acetate-sodium acetate buffer (pH 5.0), 1.5% Agar, 0.1% Triton-X) Inoculated and cultured at 30 ° C. The blue halo formed by the degradation of AZCL-HE-Cellulose by CelA was confirmed, and four transformants having endoglucanase activity were selected. These were planted in PDA (potato dextrose agar, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) agar medium, cultured at 30 ° C for 1-2 weeks, and then a spore suspension was prepared. This was then transferred to 5 g of wheat bran and 4 ml (spore count) 5.0 × 10 8 ) Inoculated. This was cultured at 30 ° C. for 64 hours with stirring twice a day. After incubation, add 50 ml of 0.5% NaCl-containing 10 mM acetic acid-sodium acetate buffer (pH 5.0), and shake for 30 minutes at 30 ° C and 120 rpm to extract the secreted protein. Endoglucanase activity measurement and SDS-PAGE were performed using Kiyo.
エンドグルカナーゼ活性は以下のようにして測定した。即ち、上記で得られたタンパク質抽出液を50 mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）を用いて適当な濃度に希釈し、この希釈液0.2 mlに基質溶液（2％ AZO-CM-Cellulose(Megazyme社）水溶液（pH5.0))を0.2 ml添加した。37℃で15分間反応させた後、反応停止液（2.4％酢酸ナトリウム、0.4％酢酸亜鉛、80％エタノール（pH5.0））1 mlを加え撹拌後、15000gで10分間遠心し、上清の590 nmにおける吸光度を測定した。1分間に590 nmにおける吸光度を1上昇させる活性を1Uとした。
SDS-PAGEについては、上記で得られたタンパク質抽出液15 μlに5 μlのサンプルバッファー（2ME+）(×4)（和光純薬製）を加え、5分間煮沸変性後、ゲルにアプライし、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルはGelCode? Blue Stain Reagent（タカラバイオ社製）により染色した。
Endoglucanase activity was measured as follows. That is, the protein extract obtained above was diluted to an appropriate concentration using 50 mM acetic acid-sodium acetate buffer (pH 5.0), and 0.2 ml of this diluted solution was diluted with a substrate solution (2% AZO-CM- 0.2 ml of Cellulose (Megazyme) aqueous solution (pH 5.0) was added. After reaction at 37 ° C for 15 minutes, add 1 ml of the reaction stop solution (2.4% sodium acetate, 0.4% zinc acetate, 80% ethanol (pH 5.0)), stir, and centrifuge at 15000g for 10 minutes. Absorbance at 590 nm was measured. The activity to increase the absorbance at 590 nm by 1 per minute was defined as 1U.
For SDS-PAGE, add 5 μl of sample buffer (2ME +) (× 4) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) to 15 μl of the protein extract obtained above, boil denatured for 5 minutes, apply to gel, Electrophoresis was performed. The gel after electrophoresis was stained with GelCode? Blue Stain Reagent (manufactured by Takara Bio Inc.).
（４）結果
結果を図１に示す。図１のレーン１はglaBプロモーター、レーン２はクルシフォーム結合タンパク質プロモーター、レーン３はペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼプロモーター、レーン４はsmall v ATPaseプロモーター、レーン５はヒストンH2Aプロモーター、レーン６はユビキチン遺伝子プロモーター候補、レーン７はリンゴ酸脱水素酵素遺伝子プロモーター候補、レーン８は機能未知遺伝子プロモーター候補を用いた場合の結果を示す。また、レーン９は、A.nidulans leuAのみ導入した場合の結果を示す。
(4) Results The results are shown in FIG. In FIG. 1,
図１のSDS-PAGEの結果から分るように、機能未知遺伝子のプロモーター候補を用いたレーン８で、celAタンパク質に相当する約30ｋDaのバンドが検出された。このことから、このプロモーター候補がプロモーターとして機能することが確認された。
また、このバンドは、レーン８の機能未知遺伝子の新規プロモーターを用いた場合が最も濃かった。さらに、タンパク質抽出液あたりのエンドグルカナーゼ活性は、この新規プロモーターを用いた場合が最も高かった。このことから、このプロモーターを用いた場合が最も多くのCelAを生産していることが明らかとなった。
As can be seen from the results of SDS-PAGE in FIG. 1, a band of about 30 kDa corresponding to the celA protein was detected in
This band was most intense when a new promoter of a gene whose function was unknown in
機能未知遺伝子プロモーターによる種々の糖加水分解酵素遺伝子発現能の検討
（１）プラスミドの構築
実施例１と同様にして、新規機能未知遺伝子（hly）プロモーター（Phly）またはα-アミラーゼ（amyA）遺伝子プロモーター（PamyA）、種々のエンドグルカナーゼ遺伝子（Aspergillus oryzae由来celAおよびcelB、Trichoderma reesei由来EGLIおよびEGLII）、glaBターミネーター（TglaB）を連結した発現カセットをpUC19へクローニングし、それぞれのエンドグルカナーゼ発現用プラスミドを構築した。それぞれのエンドグルカナーゼ遺伝子発現カセットの構築方法は以下のとおりである。
Examination of various sugar hydrolase gene expression ability by promoter of unknown function
(1) Construction of plasmid In the same manner as in Example 1, a novel function unknown gene (hly) promoter (Phly) or α-amylase (amyA) gene promoter (PamyA), various endoglucanase genes (celA and celB derived from Aspergillus oryzae) , Trichoderma reesei-derived EGLI and EGLII) and glaB terminator (TglaB) linked expression cassettes were cloned into pUC19 to construct respective endoglucanase expression plasmids. The construction method of each endoglucanase gene expression cassette is as follows.
Phly-celA-TglaB
実施例１において構築した。
PamyA-celA-TglaB
amyAプロモーターについてはpUC19-PamyA-S1：5’-gaccatgattacgccTACGCCTCCGGGTAGTAGACCGAGCAGCCG-3’(配列番号42)及びcelA-PamyA-A1：5’
-caatgagagcttcatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3’ (配列番号43)の２つのプライマーを用いて、celA遺伝子についてはPamyA-celA-S1：5’-ccacagaaggcatttATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’ (配列番号44)及びTglaB-celA-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。また、glaBターミネーターについては実施例１と同様にして取得した。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からcelA発現プラスミドを構築した。amyAプロモーターの塩基配列を配列番号45に示す。
Phly-celA-TglaB
Constructed in Example 1.
PamyA-celA-TglaB
For the amyA promoter, pUC19-PamyA-S1: 5′-gaccatgattacgccTACGCCTCCGGGTAGTAGACCGAGCAGCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 42) and celA-PamyA-A1: 5 ′
-CaatgagagcttcatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3 '(SEQ ID NO: 43), and for the celA gene, PamyA-celA-S1: 5'-ccacagaaggcatttATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3' (SEQ ID NO: 44) and TglaB-celA-A1: Example PCR was carried out using as a template the genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by Laurel Wreath Co.). The glaB terminator was obtained in the same manner as in Example 1. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In the same manner as in Example 1, a celA expression plasmid was constructed from the obtained PCR product. The nucleotide sequence of the amyA promoter is shown in SEQ ID NO: 45.
Phly-celB-TglaB
hlyプロモーターについてはpUC19-Phly-S1：実施例１に記載、及びcelB-Phly-A1：5’
-gagtgtccagatcatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3’ (配列番号46)の２つのプライマーを用いて、celB遺伝子についてはPhly-celB-S1：5’-tcacaccacaacaccATGATCTGGACACTCGCTCCCTTTGTGGCA-3’ (配列番号47)及びTglaB-celB-A1：5’
-cactggaaagtacatCTAATGCCTGTAGGTAGATCCAATATCTCC-3’ (配列番号48)の２つのプライマーを用いて、glaBターミネーターについてはcelB-TglaB-S1：5’
-acctacaggcattagATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3’ (配列番号49)及びpUC19-TglaB-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からcelB発現プラスミドを構築した。celBの塩基配列を配列番号50に示す。
Phly-celB-TglaB
For the hly promoter, pUC19-Phly-S1: described in Example 1 and celB-Phly-A1: 5 ′
-gagtgtccagatcatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3 '(SEQ ID NO: 46), for the celB gene Phly-celB-S1: 5'-tcacaccacaacaccATGATCTGGACACTCGCTCCCTTTGTGGCA-3' (SEQ ID NO: 47) and TglaB-celB-A1: 5
-CactggaaagtacatCTAATGCCTGTAGGTAGATCCAATATCTCC-3 '(SEQ ID NO: 48) using two primers, glaB terminator celB-TglaB-S1: 5'
-acctacaggcattagATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3 '(SEQ ID NO: 49) and pUC19-TglaB-A1: PCR was performed using the two primers described in Example 1 and the genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by laurel wreath) as a template . As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In the same manner as in Example 1, a celB expression plasmid was constructed from the obtained PCR product. The base sequence of celB is shown in SEQ ID NO: 50.
PamyA-celB-TglaB
amyAプロモーターについてはpUC19-PamyA-S1：上述したとおり、及びcelB-PamyA-A1：5’
-gagtgtccagatcatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3’ (配列番号51)の２つのプライマーを用いて、celB遺伝子についてはPamyA-celB-S1：5’-ccacagaaggcatttATGATCTGGACACTCGCTCCCTTTGTGGCA-3’ (配列番号52)及びTglaB-celB-A1：上述したとおりの２つのプライマーを用いて、またglaBターミネーターについてはcelB-TglaB-S1：上述したとおり及びpUC19-TglaB-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からcelB発現プラスミドを構築した。
PamyA-celB-TglaB
For the amyA promoter, pUC19-PamyA-S1: as described above, and celB-PamyA-A1: 5 ′
-gagtgtccagatcatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3 '(SEQ ID NO: 51), and for the celB gene PamyA-celB-S1: 5'-ccacagaaggcatttATGATCTGGACACTCGCTCCCTTTGTGGCA-3' (SEQ ID NO: 52) and TglaB-celB-A1: as described above As for the glaB terminator, celB-TglaB-S1: As described above and pUC19-TglaB-A1: Using the two primers described in Example 1, Aspergillus oryzae OSI1013 PCR was performed using the genomic DNA of) as a template. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In the same manner as in Example 1, a celB expression plasmid was constructed from the obtained PCR product.
Phly-EGLI-TglaB
hlyプロモーターについてはpUC19-Phly-S1：実施例１に記載、及びTrEGLI-Phly-A1：5’-aactgagggcgccatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3’ (配列番号53)の２つのプライマーを用いて、glaBターミネーターについてはTrEGLI-TglaB-S1：5’-tcacaatgcctttagATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3’ (配列番号54)及びpUC19-TglaB-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
また、EGLI遺伝子については、コドン使用頻度をA. oryzaeのものに近づけることでA. oryzaeにおいて発現しやすくするために、本遺伝子を、プライマーを用いた完全合成により調製した。具体的には、ある２つの70塩基からなるプライマーが、それぞれの3’末端20塩基で互いにアニールするように設計し、これらのプライマーを用いて鋳型DNAを加えることなくPCR反応を行うことで、プライマー由来の120塩基からなるDNA断片を得ることができた。以下にそれぞれのDNA断片を得るためのプライマーセットを示す。
Phly-EGLI-TglaB
For the hly promoter, two primers pUC19-Phly-S1: described in Example 1 and TrEGLI-Phly-A1: 5'-aactgagggcgccatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3 '(SEQ ID NO: 53) were used, and for the glaB terminator TrEGLI-TglaB -S1: 5'-tcacaatgcctttagATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3 '(SEQ ID NO: 54) and pUC19-TglaB-A1: Using the two primers described in Example 1, template of genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by laurel wreath) As a PCR. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In addition, the EGLI gene was prepared by complete synthesis using primers in order to facilitate expression in A. oryzae by bringing the codon usage closer to that of A. oryzae. Specifically, two 70-base primers are designed to anneal to each other at their 3′-
DNA断片1：
TrEGLI-S1:5’-ATGGCGCCCTCAGTTACACTGCCATTGACCACGGCCATCCTGGCTATTGCACGGCTCGTTGCCGCGCAGC-3’ (配列番号55)
TrEGLI-A14:5’-CTTGTAGGTTGTCAACTTGGGATGGACCTCTGGAGTGCTTGTACCCGGTTGCTGCGCGGCAACGAGCCGT-3’ (配列番号56)
DNA断片2：
TrEGLI-S2:5’-CCAAGTTGACAACCTACAAGTGTACAAAATCCGGGGGGTGCGTGGCTCAAGATACCTCAGTGGTCCTTGA-3’ (配列番号57)
TrEGLI-A13:5’-TGACGGTACACGAGTTGTAATTTGCATCGTGCATCCAGCGATAGTTCCAGTCAAGGACCACTGAGGTATC-3’ (配列番号58)
DNA断片3：
TrEGLI-S3:5’-TTACAACTCGTGTACCGTCAATGGCGGTGTCAACACCACGCTTTGCCCTGACGAAGCGACATGTGGCAAG-3’ (配列番号59)
TrEGLI-A12:5’-GAGGTTGTGACGCCGGAGGCTGCGTAATCGACTCCCTCGATGAAGCAGTTCTTGCCACATGTCGCTTCGT-3’ (配列番号60)
DNA断片4：
TrEGLI-S4:5’-GCCTCCGGCGTCACAACCTCGGGAAGTTCCCTCACCATGAATCAGTATATGCCCTCCAGTTCTGGTGGCT-3’ (配列番号61)
TrEGLI-A11:5’-GTATTCACCATCAGAGTCCAAGAGATACAGCCGAGGAGAGACACTGCTGTAGCCACCAGAACTGGAGGGC-3’ (配列番号62)
DNA断片5：
TrEGLI-S5:5’-TGGACTCTGATGGTGAATACGTGATGCTGAAGCTCAACGGCCAAGAGCTGTCATTTGACGTTGATCTCTC-3’ (配列番号63)
TrEGLI-A10:5’-CGTCCATTTGAGACAGATAGAGCGAACCGTTTTCTCCACACGGCAGAGCAGAGAGATCAACGTCAAATGA-3’ (配列番号64)
DNA断片6：
TrEGLI-S6:5’-CTATCTGTCTCAAATGGACGAGAACGGGGGAGCTAATCAGTATAACACTGCCGGTGCCAACTACGGGAGC-3’ (配列番号65)
TrEGLI-A9:5’-AGGGTACCATTGCGCCATGTTTGGACAGGGCACTGAGCATCACAGTAGCCGCTCCCGTAGTTGGCACCGG-3’ (配列番号66)
DNA断片7：TrEGLI-S7:5’-ACATGGCGCAATGGTACCCTCAACACTTCCCACCAGGGCTTCTGTTGCAACGAGATGGACATCCTGGAAG-3’ (配列番号67)
TrEGLI-A8:5’-GGCCGTGGCAGTGCAAGAATGAGGTGTCAAGGCATTCGCTCGGGAATTGCCTTCCAGGATGTCCATCTCG-3’ (配列番号68)
DNA断片8：TrEGLI-S8:5’-ATTCTTGCACTGCCACGGCCTGTGATTCTGCCGGTTGTGGATTCAACCCATATGGCTCTGGCTATAAATC-3’ (配列番号69)
TrEGLI-A7:5’-TGATGGTGAAGGTTTTGGAGGTGTCAACGGTATCTCCGGGACCATAGTAAGATTTATAGCCAGAGCCATA-3’ (配列番号70)
DNA断片9：TrEGLI-S9:5’-CTCCAAAACCTTCACCATCATTACCCAGTTCAATACGGATAACGGCTCGCCCTCGGGTAACCTTGTGAGT-3’ (配列番号71)
TrEGLI-A6:5’-GGCTGAGCGCTTGGGATGTCGACTCCATTTTGCTGGTACTTGCGTGTGATACTCACAAGGTTACCCGAGG-3’ (配列番号72)
DNA断片10：TrEGLI-S10:5’-GACATCCCAAGCGCTCAGCCCGGCGGAGATACCATCTCTTCCTGTCCTTCCGCATCAGCCTACGGCGGTC-3’ (配列番号73)
TrEGLI-A5:5’-GGAGAACACGAGCACCATACCTGAACTCAGGGCCTTGCCCATAGTCGCGAGACCGCCGTAGGCTGATGCG-3’ (配列番号74)
DNA断片11：TrEGLI-S11:5’-GTATGGTGCTCGTGTTCTCCATTTGGAACGACAATAGCCAATATATGAACTGGCTCGATTCCGGCAATGC-3’ (配列番号75)
TrEGLI-A4:5’-TATTGGCCAGGATGTTGGATGGGTTTCCCTCGGTGCTACTGCATGGGCCAGCATTGCCGGAATCGAGCCA-3’ (配列番号76)
DNA断片12：TrEGLI-S12:5’-ATCCAACATCCTGGCCAATAACCCCAACACACACGTTGTCTTTTCCAATATCCGCTGGGGAGATATTGGG-3’ (配列番号77)
TrEGLI-A3:5’-GTCGTACTGGATGCAGGCGGAGGCGGGGGTGCAGTTGAGTTCGTAGTAGACCCAATATCTCCCCAGCGGA-3’ (配列番号78)
DNA断片13：TrEGLI-S13:5’-CCGCCTGCATCCAGTACGACATTTTCGACTACACGGCGTAGCTCGACGACTTCAAGTAGCCCGTCGTGTA-3’ (配列番号79)
TrEGLI-A2:5’-CTTACACCCGCTGTACCCAATGCCACCGCACTGCCCCCAATGAGTCTGCGTACACGACGGGCTACTTGAA-3’ (配列番号80)
DNA断片14：TrEGLI-S14:5’-TTGGGTACAGCGGGTGTAAGACTTGCACGTCGGGCACTACGTGCCAGTATAGCAATGACTATTACTCACA-3’ (配列番号81)
TrEGLI-A1:5’-CTAAAGGCATTGTGAGTAATAGTCATTGCTATACT-3’ (配列番号82)
DNA fragment 1:
TrEGLI-S1: 5'-ATGGCGCCCTCAGTTACACTGCCATTGACCACGGCCATCCTGGCTATTGCACGGCTCGTTGCCGCGCAGC-3 '(SEQ ID NO: 55)
TrEGLI-A14: 5'-CTTGTAGGTTGTCAACTTGGGATGGACCTCTGGAGTGCTTGTACCCGGTTGCTGCGCGGCAACGAGCCGT-3 '(SEQ ID NO: 56)
DNA fragment 2:
TrEGLI-S2: 5'-CCAAGTTGACAACCTACAAGTGTACAAAATCCGGGGGGTGCGTGGCTCAAGATACCTCAGTGGTCCTTGA-3 '(SEQ ID NO: 57)
TrEGLI-A13: 5'-TGACGGTACACGAGTTGTAATTTGCATCGTGCATCCAGCGATAGTTCCAGTCAAGGACCACTGAGGTATC-3 '(SEQ ID NO: 58)
DNA fragment 3:
TrEGLI-S3: 5'-TTACAACTCGTGTACCGTCAATGGCGGTGTCAACACCACGCTTTGCCCTGACGAAGCGACATGTGGCAAG-3 '(SEQ ID NO: 59)
TrEGLI-A12: 5'-GAGGTTGTGACGCCGGAGGCTGCGTAATCGACTCCCTCGATGAAGCAGTTCTTGCCACATGTCGCTTCGT-3 '(SEQ ID NO: 60)
DNA fragment 4:
TrEGLI-S4: 5'-GCCTCCGGCGTCACAACCTCGGGAAGTTCCCTCACCATGAATCAGTATATGCCCTCCAGTTCTGGTGGCT-3 '(SEQ ID NO: 61)
TrEGLI-A11: 5'-GTATTCACCATCAGAGTCCAAGAGATACAGCCGAGGAGAGACACTGCTGTAGCCACCAGAACTGGAGGGC-3 '(SEQ ID NO: 62)
DNA fragment 5:
TrEGLI-S5: 5'-TGGACTCTGATGGTGAATACGTGATGCTGAAGCTCAACGGCCAAGAGCTGTCATTTGACGTTGATCTCTC-3 '(SEQ ID NO: 63)
TrEGLI-A10: 5'-CGTCCATTTGAGACAGATAGAGCGAACCGTTTTCTCCACACGGCAGAGCAGAGAGATCAACGTCAAATGA-3 '(SEQ ID NO: 64)
DNA fragment 6:
TrEGLI-S6: 5'-CTATCTGTCTCAAATGGACGAGAACGGGGGAGCTAATCAGTATAACACTGCCGGTGCCAACTACGGGAGC-3 '(SEQ ID NO: 65)
TrEGLI-A9: 5'-AGGGTACCATTGCGCCATGTTTGGACAGGGCACTGAGCATCACAGTAGCCGCTCCCGTAGTTGGCACCGG-3 '(SEQ ID NO: 66)
DNA fragment 7: TrEGLI-S7: 5'-ACATGGCGCAATGGTACCCTCAACACTTCCCACCAGGGCTTCTGTTGCAACGAGATGGACATCCTGGAAG-3 '(SEQ ID NO: 67)
TrEGLI-A8: 5'-GGCCGTGGCAGTGCAAGAATGAGGTGTCAAGGCATTCGCTCGGGAATTGCCTTCCAGGATGTCCATCTCG-3 '(SEQ ID NO: 68)
DNA fragment 8: TrEGLI-S8: 5'-ATTCTTGCACTGCCACGGCCTGTGATTCTGCCGGTTGTGGATTCAACCCATATGGCTCTGGCTATAAATC-3 '(SEQ ID NO: 69)
TrEGLI-A7: 5'-TGATGGTGAAGGTTTTGGAGGTGTCAACGGTATCTCCGGGACCATAGTAAGATTTATAGCCAGAGCCATA-3 '(SEQ ID NO: 70)
DNA fragment 9: TrEGLI-S9: 5'-CTCCAAAACCTTCACCATCATTACCCAGTTCAATACGGATAACGGCTCGCCCTCGGGTAACCTTGTGAGT-3 '(SEQ ID NO: 71)
TrEGLI-A6: 5'-GGCTGAGCGCTTGGGATGTCGACTCCATTTTGCTGGTACTTGCGTGTGATACTCACAAGGTTACCCGAGG-3 '(SEQ ID NO: 72)
DNA fragment 10: TrEGLI-S10: 5'-GACATCCCAAGCGCTCAGCCCGGCGGAGATACCATCTCTTCCTGTCCTTCCGCATCAGCCTACGGCGGTC-3 '(SEQ ID NO: 73)
TrEGLI-A5: 5'-GGAGAACACGAGCACCATACCTGAACTCAGGGCCTTGCCCATAGTCGCGAGACCGCCGTAGGCTGATGCG-3 '(SEQ ID NO: 74)
DNA fragment 11: TrEGLI-S11: 5'-GTATGGTGCTCGTGTTCTCCATTTGGAACGACAATAGCCAATATATGAACTGGCTCGATTCCGGCAATGC-3 '(SEQ ID NO: 75)
TrEGLI-A4: 5'-TATTGGCCAGGATGTTGGATGGGTTTCCCTCGGTGCTACTGCATGGGCCAGCATTGCCGGAATCGAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 76)
DNA fragment 12: TrEGLI-S12: 5'-ATCCAACATCCTGGCCAATAACCCCAACACACACGTTGTCTTTTCCAATATCCGCTGGGGAGATATTGGG-3 '(SEQ ID NO: 77)
TrEGLI-A3: 5'-GTCGTACTGGATGCAGGCGGAGGCGGGGGTGCAGTTGAGTTCGTAGTAGACCCAATATCTCCCCAGCGGA-3 '(SEQ ID NO: 78)
DNA fragment 13: TrEGLI-S13: 5'-CCGCCTGCATCCAGTACGACATTTTCGACTACACGGCGTAGCTCGACGACTTCAAGTAGCCCGTCGTGTA-3 '(SEQ ID NO: 79)
TrEGLI-A2: 5'-CTTACACCCGCTGTACCCAATGCCACCGCACTGCCCCCAATGAGTCTGCGTACACGACGGGCTACTTGAA-3 '(SEQ ID NO: 80)
DNA fragment 14: TrEGLI-S14: 5'-TTGGGTACAGCGGGTGTAAGACTTGCACGTCGGGCACTACGTGCCAGTATAGCAATGACTATTACTCACA-3 '(SEQ ID NO: 81)
TrEGLI-A1: 5'-CTAAAGGCATTGTGAGTAATAGTCATTGCTATACT-3 '(SEQ ID NO: 82)
このとき、120塩基からなるDNA断片の両末端20塩基ずつはそれぞれ隣り合う120塩基のDNA断片の末端20塩基と相同な配列となるようにすることで、これらの断片はover lap PCRにより結合することができた。つまり、得られた断片1〜5をover lap PCRの鋳型DNAとして用い、プライマーTrEGLI-S1とTrEGLI-A10を用いてPCRを行い、断片1から5までの領域を結合させ、断片6〜10をover lap PCRの鋳型DNAとして用い、プライマーTrEGLI-S6とTrEGLI-A5を用いてPCRを行い、断片6〜10までを結合させ、断片11〜14をover lap PCRの鋳型DNAとして用い、プライマーTrEGLI-S11とTrEGLI-A1を用いてPCRを行い、断片11〜14までを結合させた。次に、得られた３つの断片をover lap PCRの鋳型DNAとして用い、Phly-TrEGLI-S1:5’
-tcacaccacaacaccATGGCGCCCTCAGTTACACTGCCATTGACC-3’ (配列番号83)及びTglaB-TrEGLI-A1:5’
-cactggaaagtacatCTAAAGGCATTGTGAGTAATAGTCATTGCT-3’ (配列番号84)の２つのプライマーを用いてPCRを行うことにより完全合成されたEGLI遺伝子を得ることができた。なお、それぞれの120塩基からなるDNA断片を増幅するときのPCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/10秒のサイクルを30回繰り返し、over lap PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からEGLI発現プラスミドを構築した。以下にEGLI遺伝子の塩基配列を配列番号85に示す。
At this time, each of the 20 bases of the 120-base DNA fragment has a sequence homologous to the 20 bases of the adjacent 120-base DNA fragment, and these fragments are bound by overlap PCR. I was able to. That is, using the obtained fragments 1-5 as template DNA for overlap PCR, PCR was performed using primers TrEGLI-S1 and TrEGLI-A10, the regions from
-tcacaccacaacaccATGGCGCCCTCAGTTACACTGCCATTGACC-3 '(SEQ ID NO: 83) and TglaB-TrEGLI-A1: 5'
A completely synthesized EGLI gene could be obtained by PCR using two primers -cactggaaagtacatCTAAAGGCATTGTGAGTAATAGTCATTGCT-3 '(SEQ ID NO: 84). The PCR conditions for amplifying a DNA fragment consisting of 120 bases were repeated for 30 cycles of 98 ° C / 10 sec-55 ° C / 5 sec-72 ° C / 10 sec. The cycle of 98 ° C / 10 seconds-55 ° C / 5 seconds-72 ° C / 1
In the same manner as in Example 1, an EGLI expression plasmid was constructed from the obtained PCR product. The base sequence of the EGLI gene is shown in SEQ ID NO: 85 below.
PamyA-EGLI-TglaB
amyAプロモーターについてはpUC19-PamyA-S1：上述したとおり、及びTrEGLI-PamyA-A1：5’
-aactgagggcgccatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3’ (配列番号86)の２つのプライマーを用いて、glaBターミネーターについてはTrEGLI-TglaB-S1：上述したとおり及びpUC19-TglaB-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。また、EGLI遺伝子についてはPamyA-TrEGLI-S1：5’
-ccacagaaggcatttATGGCGCCCTCAGTTACACTGCCATTGACC-3’ (配列番号87)及びTglaB-TrEGLI-A1：上述したとおりの２つのプライマーを用いて、上で構築したEGLI発現プラスミドを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からEGLI発現プラスミドを構築した。
PamyA-EGLI-TglaB
For the amyA promoter, pUC19-PamyA-S1: as described above, and TrEGLI-PamyA-A1: 5 ′
-aactgagggcgccatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3 '(SEQ ID NO: 86) for the glaB terminator, TrEGLI-TglaB-S1: as described above and pUC19-TglaB-A1: using the two primers described in Example 1 PCR was performed using the genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by Laurel Wreath Co., Ltd.) as a template. For EGLI gene, PamyA-TrEGLI-S1: 5 '
-ccacagaaggcatttATGGCGCCCTCAGTTACACTGCCATTGACC-3 '(SEQ ID NO: 87) and TglaB-TrEGLI-A1: PCR was carried out using the EGLI expression plasmid constructed above as a template using the two primers as described above. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In the same manner as in Example 1, an EGLI expression plasmid was constructed from the obtained PCR product.
Phly-EGLII-TglaB
hlyプロモーターについてはpUC19-Phly-S1：実施例１に記載、及びTrEGLII-Phly-A1：5’-cacggacttgttcatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3’ (配列番号88)の２つのプライマーを用いて、glaBターミネーターについてはTrEGLII-TglaB-S1：5’-ctcgcaagaaagtagATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3’ (配列番号89)及びpUC19-TglaB-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
また、EGLII遺伝子については、EGLIと同様にして、コドン使用頻度をA. oryzaeのものに近づけるために完全合成による調製を行った。つまり、以下に示すプライマーセットにより120塩基からなるそれぞれのDNA断片を合成した。
Phly-EGLII-TglaB
For the hly promoter, two primers pUC19-Phly-S1: described in Example 1 and TrEGLII-Phly-A1: 5'-cacggacttgttcatGGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG-3 '(SEQ ID NO: 88) were used, and for the glaB terminator TrEGLII-TglaB -S1: 5'-ctcgcaagaaagtagATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT-3 '(SEQ ID NO: 89) and pUC19-TglaB-A1: Using the two primers described in Example 1, template of genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by laurel wreath) As a PCR. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In addition, the EGLII gene was prepared by complete synthesis in the same manner as EGLI in order to make the codon usage closer to that of A. oryzae. That is, each DNA fragment consisting of 120 bases was synthesized with the primer set shown below.
DNA断片1:
TrEGLII-S1:5’-ATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCTGCTTGCAGCGTCCATCCTATATGGCGGCGCCGTCGCACAGCAGA-3’ (配列番号90)
TrEGLII-A13:5’-ACAATTCGTAGGTCCGCTCCAACCAATACCTCCACACTGGCCCCAGACAGTCTGCTGTGCGACGGCGCCG-3’ (配列番号91)
DNA断片2:
TrEGLII-S2:5’-GGAGCGGACCTACGAATTGTGCTCCTGGCAGTGCTTGTTCGACCCTCAATCCTTATTATGCGCAATGTAT-3’ (配列番号92)
TrEGLII-A12:5’-TTGGACCGGATGGTGGCCGGGTCGAAGTGGTGATAGTTGTGGCTCCCGGAATACATTGCGCATAATAAGG-3’ (配列番号93)
DNA断片3:
TrEGLII-S3:5’-CCGGCCACCATCCGGTCCAACCACCACCACCAGGGCTACCTCAACAAGCTCATCAACACCACCCACGAGC-3’ (配列番号94)
TrEGLII-A11:5’-CAGCCAAAGTCAAAACCCGCGATGTTAACGCCGGCAAATCGGACCCCAGAGCTCGTGGGTGGTGTTGATG-3’ (配列番号95)
DNA断片4:
TrEGLII-S4:5’-GCGGGTTTTGACTTTGGCTGTACCACAGATGGCACTTGCGTTACCTCGAAGGTTTATCCCCCGTTGAAGA-3’ (配列番号96)
TrEGLII-A10:5’-GTGCTGCATCTGGCCGATGCCATCGGGGTAGTTGTTTGAGCCGGTGAAGTTCTTCAACGGGGGATAAACC-3’ (配列番号97)
DNA断片5:
TrEGLII-S5:5’-GCATCGGCCAGATGCAGCACTTCGTGAACGAGGACGGGATGACTATTTTCCGCCTCCCTGTCGGATGGCA-3’ (配列番号98)
TrEGLII-A9:5’-AAATGCTCGTGGAATCAAGATTGCCGCCCAAATTGTTGTTGACGAGGTACTGCCATCCGACAGGGAGGCG-3’ (配列番号99)
DNA断片6:
TrEGLII-S6:5’-TCTTGATTCCACGAGCATTTCCAAGTATGATCAGCTTGTTCAGGGGTGCCTGTCTCTGGGCGCATACTGC-3’ (配列番号100)
TrEGLII-A8:5’-TGACCAATGATCCCACCGTTCCATCGCGCATAATTGTGGATGTCGACGATGCAGTATGCGCCCAGAGACA-3’ (配列番号101)
DNA断片7:
TrEGLII-S7:5’-AACGGTGGGATCATTGGTCAGGGCGGCCCTACTAATGCTCAATTCACGAGCCTTTGGTCGCAGTTGGCAT-3’ (配列番号102)
TrEGLII-A7:5’-GGGCTCATTCATGATGCCGAACCACACCCTCGACTGAGATGCGTACTTTGATGCCAACTGCGACCAAAGG-3’ (配列番号103)
DNA断片8:
TrEGLII-S8:5’-TCGGCATCATGAATGAGCCCCACGACGTGAACATCAACACCTGGGCTGCCACGGTCCAAGAGGTTGTAAC-3’ (配列番号104)
TrEGLII-A6:5’-TTCCAGGCAAAGAGATGAATTGCGACGTAGCACCAGCGTTGCGGATTGCGGTTACAACCTCTTGGACCGT-3’ (配列番号105)
DNA断片9:
TrEGLII-S9:5’-ATTCATCTCTTTGCCTGGAAATGATTGGCAATCTGCTGGGGCTTTCATCTCCGATGGCAGTGCAGCCGCC-3’ (配列番号106)
TrEGLII-A5:5’-TCGAAAATCAGATTCGTTGTACTCCCATCCGGGTTCGTGACTTGAGACAGGGCGGCTGCACTGCCATCGG-3’ (配列番号107)
DNA断片10:
TrEGLII-S10:5’-ACAACGAATCTGATTTTCGACGTGCACAAATACTTGGACTCAGACAACTCCGGTACTCACGCCGAATGTA-3’ (配列番号108)
TrEGLII-A4:5’-TCGGAGCCAAGTGGCAAGCGGAGAAAAGGCGCCGTCAATGTTATTTGTAGTACATTCGGCGTGAGTACCG-3’ (配列番号109)
DNA断片11:
TrEGLII-S11:5’-CGCTTGCCACTTGGCTCCGACAGAACAATCGCCAGGCGATCCTGACAGAAACCGGTGGTGGCAACGTTCA-3’ (配列番号110)
TrEGLII-A3:5’-AGTTCTGGTTGAGGTATTGGATTTGCTGGCACATGTCTTGGATGCAGGACTGAACGTTGCCACCACCGGT-3’ (配列番号111)
DNA断片12:
TrEGLII-S12:5’-CCAATACCTCAACCAGAACTCAGATGTGTATCTTGGCTATGTTGGTTGGGGTGCCGGATCATTTGATAGC-3’ (配列番号112)
TrEGLII-A2:5’-TCCGTCCATGAGTTACCACTGCTAGTCGGTGTTTCCGTCAGGACGTACGTGCTATCAAATGATCCGGCAC-3’ (配列番号113)
DNA fragment 1:
TrEGLII-S1: 5'-ATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCTGCTTGCAGCGTCCATCCTATATGGCGGCGCCGTCGCACAGCAGA-3 '(SEQ ID NO: 90)
TrEGLII-A13: 5'-ACAATTCGTAGGTCCGCTCCAACCAATACCTCCACACTGGCCCCAGACAGTCTGCTGTGCGACGGCGCCG-3 '(SEQ ID NO: 91)
DNA fragment 2:
TrEGLII-S2: 5'-GGAGCGGACCTACGAATTGTGCTCCTGGCAGTGCTTGTTCGACCCTCAATCCTTATTATGCGCAATGTAT-3 '(SEQ ID NO: 92)
TrEGLII-A12: 5'-TTGGACCGGATGGTGGCCGGGTCGAAGTGGTGATAGTTGTGGCTCCCGGAATACATTGCGCATAATAAGG-3 '(SEQ ID NO: 93)
DNA fragment 3:
TrEGLII-S3: 5'-CCGGCCACCATCCGGTCCAACCACCACCACCAGGGCTACCTCAACAAGCTCATCAACACCACCCACGAGC-3 '(SEQ ID NO: 94)
TrEGLII-A11: 5'-CAGCCAAAGTCAAAACCCGCGATGTTAACGCCGGCAAATCGGACCCCAGAGCTCGTGGGTGGTGTTGATG-3 '(SEQ ID NO: 95)
DNA fragment 4:
TrEGLII-S4: 5'-GCGGGTTTTGACTTTGGCTGTACCACAGATGGCACTTGCGTTACCTCGAAGGTTTATCCCCCGTTGAAGA-3 '(SEQ ID NO: 96)
TrEGLII-A10: 5'-GTGCTGCATCTGGCCGATGCCATCGGGGTAGTTGTTTGAGCCGGTGAAGTTCTTCAACGGGGGATAAACC-3 '(SEQ ID NO: 97)
DNA fragment 5:
TrEGLII-S5: 5'-GCATCGGCCAGATGCAGCACTTCGTGAACGAGGACGGGATGACTATTTTCCGCCTCCCTGTCGGATGGCA-3 '(SEQ ID NO: 98)
TrEGLII-A9: 5'-AAATGCTCGTGGAATCAAGATTGCCGCCCAAATTGTTGTTGACGAGGTACTGCCATCCGACAGGGAGGCG-3 '(SEQ ID NO: 99)
DNA fragment 6:
TrEGLII-S6: 5'-TCTTGATTCCACGAGCATTTCCAAGTATGATCAGCTTGTTCAGGGGTGCCTGTCTCTGGGCGCATACTGC-3 '(SEQ ID NO: 100)
TrEGLII-A8: 5'-TGACCAATGATCCCACCGTTCCATCGCGCATAATTGTGGATGTCGACGATGCAGTATGCGCCCAGAGACA-3 '(SEQ ID NO: 101)
DNA fragment 7:
TrEGLII-S7: 5'-AACGGTGGGATCATTGGTCAGGGCGGCCCTACTAATGCTCAATTCACGAGCCTTTGGTCGCAGTTGGCAT-3 '(SEQ ID NO: 102)
TrEGLII-A7: 5'-GGGCTCATTCATGATGCCGAACCACACCCTCGACTGAGATGCGTACTTTGATGCCAACTGCGACCAAAGG-3 '(SEQ ID NO: 103)
DNA fragment 8:
TrEGLII-S8: 5'-TCGGCATCATGAATGAGCCCCACGACGTGAACATCAACACCTGGGCTGCCACGGTCCAAGAGGTTGTAAC-3 '(SEQ ID NO: 104)
TrEGLII-A6: 5'-TTCCAGGCAAAGAGATGAATTGCGACGTAGCACCAGCGTTGCGGATTGCGGTTACAACCTCTTGGACCGT-3 '(SEQ ID NO: 105)
DNA fragment 9:
TrEGLII-S9: 5'-ATTCATCTCTTTGCCTGGAAATGATTGGCAATCTGCTGGGGCTTTCATCTCCGATGGCAGTGCAGCCGCC-3 '(SEQ ID NO: 106)
TrEGLII-A5: 5'-TCGAAAATCAGATTCGTTGTACTCCCATCCGGGTTCGTGACTTGAGACAGGGCGGCTGCACTGCCATCGG-3 '(SEQ ID NO: 107)
DNA fragment 10:
TrEGLII-S10: 5'-ACAACGAATCTGATTTTCGACGTGCACAAATACTTGGACTCAGACAACTCCGGTACTCACGCCGAATGTA-3 '(SEQ ID NO: 108)
TrEGLII-A4: 5'-TCGGAGCCAAGTGGCAAGCGGAGAAAAGGCGCCGTCAATGTTATTTGTAGTACATTCGGCGTGAGTACCG-3 '(SEQ ID NO: 109)
DNA fragment 11:
TrEGLII-S11: 5'-CGCTTGCCACTTGGCTCCGACAGAACAATCGCCAGGCGATCCTGACAGAAACCGGTGGTGGCAACGTTCA-3 '(SEQ ID NO: 110)
TrEGLII-A3: 5'-AGTTCTGGTTGAGGTATTGGATTTGCTGGCACATGTCTTGGATGCAGGACTGAACGTTGCCACCACCGGT-3 '(SEQ ID NO: 111)
DNA fragment 12:
TrEGLII-S12: 5'-CCAATACCTCAACCAGAACTCAGATGTGTATCTTGGCTATGTTGGTTGGGGTGCCGGATCATTTGATAGC-3 '(SEQ ID NO: 112)
TrEGLII-A2: 5'-TCCGTCCATGAGTTACCACTGCTAGTCGGTGTTTCCGTCAGGACGTACGTGCTATCAAATGATCCGGCAC-3 '(SEQ ID NO: 113)
得られた断片1〜4をover lap PCRの鋳型DNAとして用い、プライマーTrEGLII-S1とTrEGLII-A10を用いてPCRを行い、断片1〜4までの領域を結合させ、断片5〜8をover lap PCRの鋳型DNAとして用い、プライマーTrEGLII-S5とTrEGLII-A6を用いてPCRを行い、断片5〜8までを結合させ、断片9〜12をover lap PCRの鋳型DNAとして用い、プライマーTrEGLII-S9と
TrEGLII-A1:5’-CTACTTTCTTGCGAGACACGAGCTGACCAAGGATGTGTCCGTCCATGAGTTACCACTGCTAGTCGGTGTT-3’ (配列番号114)を用いてPCRを行い、断片9〜12までを結合させた。次に、得られた３つの断片をover lap PCRの鋳型にして、Phly-TrEGLII-S1:5’
-tcacaccacaacaccATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCTGCTT-3’ (配列番号115)及びTglaB-TrEGLII-A1:5’
-cactggaaagtacatCTACTTTCTTGCGAGACACGAGCTGACCAA-3’ (配列番号116)の２つのプライマーを用いてover lap PCRを行った。それぞれの120塩基からなるDNA断片を増幅するときのPCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/10秒のサイクルを30回繰り返し、over lap PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からEGLII発現プラスミドを構築した。以下にEGLII遺伝子の塩基配列を配列番号(配列番号117)に示す。
Using the obtained
PCR was performed using TrEGLII-A1: 5′-CTACTTTCTTGCGAGACACGAGCTGACCAAGGATGTGTCCGTCCATGAGTTACCACTGCTAGTCGGTGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 114) to bind fragments 9-12. Next, using the obtained three fragments as a template for overlap PCR, Phly-TrEGLII-S1: 5 ′
-tcacaccacaacaccATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCTGCTT-3 '(SEQ ID NO: 115) and TglaB-TrEGLII-A1: 5'
Overlap PCR was performed using two primers -cactggaaagtacatCTACTTTCTTGCGAGACACGAGCTGACCAA-3 '(SEQ ID NO: 116). The PCR conditions for amplifying each 120 base DNA fragment were repeated 30 cycles of 98 ° C / 10 seconds-55 ° C / 5 seconds-72 ° C / 10 seconds. The cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In the same manner as in Example 1, an EGLII expression plasmid was constructed from the obtained PCR product. The base sequence of the EGLII gene is shown in SEQ ID NO (SEQ ID NO: 117) below.
PamyA-EGLII-TglaB
amyAプロモーターについてはpUC19-PamyA-S1：上述したとおり、及びTrEGLII-PamyA-A1：5’
-cacggacttgttcatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3’ (配列番号118)の２つのプライマーを用いて、glaBターミネーターについてはTrEGLII-TglaB-S1：上述したとおり及びpUC19-TglaB-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。また、EGLII遺伝子についてはPamyA-TrEGLII-S1：5’
-ccacagaaggcatttATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCTGCTT-3’ (配列番号119)及びTglaB-TrEGLII-A1：上述したとおりの２つのプライマーを用いて、上で構築したEGLII発現プラスミドを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からEGLII発現プラスミドを構築した。
PamyA-EGLII-TglaB
For the amyA promoter, pUC19-PamyA-S1: as described above, and TrEGLII-PamyA-A1: 5 ′
-cacggacttgttcatAAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3 '(SEQ ID NO: 118), glaB terminator for TrEGLII-TglaB-S1: as described above and pUC19-TglaB-A1: using the two primers described in Example 1 PCR was performed using the genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by Laurel Wreath Co., Ltd.) as a template. For EGLII gene, PamyA-TrEGLII-S1: 5 '
-ccacagaaggcatttATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCTGCTT-3 '(SEQ ID NO: 119) and TglaB-TrEGLII-A1: PCR was carried out using the EGLII expression plasmid constructed above as a template using the two primers as described above. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In the same manner as in Example 1, an EGLII expression plasmid was constructed from the obtained PCR product.
以上、何れの場合も、実施例１と同様に、プロモーターの5’末端、およびglaBターミネーターの3’末端には、後のpUC19への挿入のために、pUC19のマルチクローニングサイトの両端の部分15 bpsずつと相同な配列を付与するようなプライマーを使用している。また、各プロモーターと各エンドグルカナーゼ遺伝子、各エンドグルカナーゼ遺伝子とglaBターミネーターとをover lap PCRにより連結することを目的として、それぞれのPCR増幅断片の末端に、連結させる断片の末端15 bpsと相同な配列を付与している。各プライマーの配列において、それぞれを連結するために付与した配列は小文字で記載してある。
As described above, in each case, as in Example 1, at the 5 ′ end of the promoter and the 3 ′ end of the glaB terminator, the
（２）形質転換
実施例１と同様にして行った。
（３）エンドグルカナーゼ活性測定
実施例１と同様にして行った。
（４）結果
結果を図２に示す。図２のレーン１は、leuA発現カセットだけを導入したコントロールであり、レーン2,3はCelA生産株、レーン4,5はCelB生産株、レーン6,7はEGLI生産株、レーン8,9はEGLII生産株である。また、レーン2,4,6,8,はamyAプロモーターを用いた場合であり、レーン3,5,7,9はhlyプロモーターを用いた場合である。
図２から、タンパク質抽出液あたりのエンドグルカナーゼ活性および酵素生産量は何れもhlyプロモーターを用いた場合のほうがamyAプロモーターを用いた場合よりも優れていることが明らかとなった。
(2) Transformation Performed in the same manner as in Example 1.
(3) Measurement of endoglucanase activity The measurement was performed in the same manner as in Example 1.
(4) Results The results are shown in FIG.
From FIG. 2, it was revealed that the endoglucanase activity and the enzyme production amount per protein extract are superior when the hly promoter is used than when the amyA promoter is used.
種々の小麦フスマ固体培養条件におけるhlyプロモーターのcelA発現能の検討
（１）celA発現麹菌の培養
実施例１および２で得られた、hlyプロモーターまたはamyAプロモーター制御下においてcelAを発現している株を培養温度30、37、42℃、散水率40、60、80、100%（植菌する胞子数（3.0×108個）をそろえて、5 gの小麦フスマに加える水分量を2、3、4、5 mlとする）で実施例１と同様にして、64時間小麦フスマ培養を行った。
（２）エンドグルカナーゼ活性測定
実施例１と同様にして、分泌タンパク質の抽出、エンドグルカナーゼ活性測定およびSDS-PAGEを行った。
Examination of celA expression ability of hly promoter in various wheat bran solid culture conditions
(1) Cultivation of celA-expressing bacilli Strains expressing celA under the control of the hly promoter or amyA promoter obtained in Examples 1 and 2 were cultured at a culture temperature of 30, 37, 42 ° C and a watering rate of 40, 60, 80. , 100% (the number of spores to be inoculated (3.0 × 10 8 ), the amount of water added to 5 g of wheat bran is 2, 3, 4, 5 ml) as in Example 1, Wheat bran culture was performed for 64 hours.
(2) Measurement of endoglucanase activity In the same manner as in Example 1, extraction of secreted protein, measurement of endoglucanase activity, and SDS-PAGE were performed.
（３）結果
結果を図３に示す。図３から、タンパク質抽出液あたりのエンドグルカナーゼ活性および酵素生産量は何れの培養条件においてもhlyプロモーターを用いた場合のほうがamyAプロモーターを用いた場合よりも優れていることが明らかとなり、特に培養温度37℃、散水率60%で最も高いCelA生産性を示した。
(3) The results are shown in FIG. From FIG. 3, it is clear that the endoglucanase activity and the amount of enzyme production per protein extract are superior when the hly promoter is used in any culture condition than when the amyA promoter is used. It showed the highest CelA productivity at 37 ° C and watering rate of 60%.
小麦フスマ培養時間による機能未知遺伝子プロモーターのCelA生産能の検討
（１）プラスミドの構築
実施例１と同様にして、hlyプロモーター制御下においてcelAを発現させるためのプラスミドを構築した。
（２）形質転換
実施例１と同様にして行った。
（３）形質転換株の培養とエンドグルカナーゼ活性測定
実施例１と同様にして、形質転換株の胞子懸濁液を植菌し、これを1日に2回程度攪拌を行いながら30℃で培養した。各培養時間における小麦フスマ培養物の分泌タンパク質を抽出し、そのエンドグルカナーゼ活性を実施例１と同様にして測定した。
（４）結果
結果を図４に示す。図４から、本プロモーターは小麦フスマ培養40〜72時間で安定してCelAを生産できることが明らかとなった。
Examination of CelA production ability of promoter with unknown function by wheat bran culture time
(1) Construction of plasmid In the same manner as in Example 1, a plasmid for expressing celA under the control of the hly promoter was constructed.
(2) Transformation Performed in the same manner as in Example 1.
(3) Culture of transformant and measurement of endoglucanase activity In the same manner as in Example 1, inoculate a spore suspension of the transformant and culture at 30 ° C. with stirring twice a day. did. The secreted protein of wheat bran culture at each culture time was extracted, and its endoglucanase activity was measured in the same manner as in Example 1.
(4) Results The results are shown in FIG. FIG. 4 revealed that this promoter can stably produce CelA in 40 to 72 hours of wheat bran culture.
液体培養における機能未知遺伝子プロモーターのcelA発現能の検討
（１）プラスミドの構築
実施例１と同様にして、液体培養にて高発現するプロモーターであるスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子（sodM）プロモーター（PsodM）制御下においてcelAを発現させるためのプラスミドを構築した。具体的には、sodMプロモーターをpUC19-PsodM-S1：
5’-gaccatgattacgccTTATGTACTCCGTACTCGGTTGAATTATTA-3’ (配列番号120)及びcelA-PsodM-A1：
5’-caatgagagcttcatTTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA-3’ (配列番号121)の２つのプライマーを用いて、celA遺伝子についてはPsodM-celA-S1：
5’-accaaaccacccaaaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3’ (配列番号122)及びTglaB-celA-A1：実施例１に記載の２つのプライマーを用いて、麹菌Aspergillus oryzae OSI1013（月桂冠株式会社保有）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。また、glaBターミネーターについては実施例１と同様にして取得した。PCRの条件としては、98℃/10秒−55℃/5秒−72℃/1分30秒のサイクルを30回繰り返した。
実施例１と同様にして、得られたPCR産物からcelA発現プラスミドを構築した。sodMプロモーターの塩基配列を(配列番号123)に示す。
Examination of celA expression ability of promoter with unknown function in liquid culture
(1) Construction of plasmid In the same manner as in Example 1, a plasmid for expressing celA under the control of the superoxide dismutase gene (sodM) promoter (PsodM), which is a promoter highly expressed in liquid culture, was constructed. Specifically, the sodM promoter is pUC19-PsodM-S1:
5'-gaccatgattacgccTTATGTACTCCGTACTCGGTTGAATTATTA-3 '(SEQ ID NO: 120) and celA-PsodM-A1:
Using two
5'-accaaaccacccaaaATGAAGCTCTCATTGGCACTTGCTACGCTC-3 '(SEQ ID NO: 122) and TglaB-celA-A1: Using the two primers described in Example 1, PCR was performed using the genomic DNA of Aspergillus oryzae OSI1013 (owned by Laurel Wreath Co., Ltd.) as a template. went. The glaB terminator was obtained in the same manner as in Example 1. As PCR conditions, a cycle of 98 ° C./10 seconds-55 ° C./5 seconds-72 ° C./1
In the same manner as in Example 1, a celA expression plasmid was constructed from the obtained PCR product. The base sequence of the sodM promoter is shown in (SEQ ID NO: 123).
また、実施例１と同様に、プロモーターの5’末端、およびglaBターミネーターの3’末端には、後のpUC19への挿入のために、pUC19のマルチクローニングサイトの両端の部分15 bpsずつと相同な配列を付与するようなプライマーを使用している。また、sodMプロモーターとcelA遺伝子、celA遺伝子とglaBターミネーターとをover lap PCRにより連結することを目的として、それぞれのPCR増幅断片の末端に、連結させる断片の末端15 bpsと相同な配列を付与している。各プライマーの配列において、それぞれを連結するために付与した配列は小文字で記載してある。 Similarly to Example 1, the 5 ′ end of the promoter and the 3 ′ end of the glaB terminator are homologous to 15 bps at both ends of the multicloning site of pUC19 for subsequent insertion into pUC19. Primers that add sequence are used. In addition, for the purpose of linking the sodM promoter and the celA gene, and the celA gene and the glaB terminator by overlap PCR, a sequence homologous to the terminal 15 bps of the fragment to be ligated is added to the end of each PCR amplified fragment. Yes. In the sequence of each primer, the sequence given for linking each is shown in lower case.
（２）形質転換
実施例１と同様にして行った。
（３）形質転換麹菌の液体培養とエンドグルカナーゼ活性測定
実施例１と同様にして、エンドグルカナーゼ活性を有する形質転換株を選抜し、この株および実施例１に記載のhlyプロモーター制御celA発現株の胞子懸濁液2 ml（3.0×108個）を30 mlのCzapek-Dox培地（2% Glucose、0.2% NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% KCl、0.05% MgSO4・7H2O、0.001% FeSO4・7H2O）およびDPY培地（2% Glucose、1% polypeptone、0.5% yeast extract）へ植菌し、30℃、130 rpmで64時間培養した。実施例１と同様にして、培養後の培養液上清のエンドグルカナーゼ活性測定およびSDS-PAGEを行い、CelAの菌体外への分泌生産を確認した。
(2) Transformation Performed in the same manner as in Example 1.
(3) Liquid culture of transformed koji mold and measurement of endoglucanase activity In the same manner as in Example 1, a transformant having endoglucanase activity was selected, and the hly promoter-controlled celA expression strain described in Example 1 was selected. 2 ml of spore suspension (3.0 × 10 8 ) in 30 ml of Czapek-Dox medium (2% Glucose, 0.2% NaNO 3 , 0.1% K 2 HPO 4 , 0.05% KCl, 0.05% MgSO 4 · 7H 2 O , 0.001% FeSO 4 · 7H 2 O) and DPY medium (2% Glucose, 1% polypeptone, 0.5% yeast extract), and cultured at 30 ° C. and 130 rpm for 64 hours. In the same manner as in Example 1, measurement of endoglucanase activity and SDS-PAGE of the culture supernatant after culturing were carried out to confirm the secretory production of CelA outside the cells.
（４）結果
結果を図５に示す。図５のレーン1〜3はDPY液体培地を用いた場合であり、レーン4〜6はGlc含有Czapek-Dox培地を用いた場合である。また、レーン1,4はhlyプロモーターを使用した場合であり、レーン2,5はsodMプロモーターを使用した場合であり、レーン3,6はleuA発現カセットだけを導入したコントロールである。
図５から、培養液上清あたりのCelA生産量およびエンドグルカナーゼ活性は、Czapek-Dox培地の場合はhlyプロモーターのCelA生産能、活性ともにほとんどなく、sodMプロモーターの方が優れていたが、DPY培地の場合は何れのプロモーターも同様のCelA生産能、活性を示した。つまり、液体培養でも、富栄養培地であれば、hlyプロモーターは液体培養において高い遺伝子発現能を持つsodMプロモーターと同等の発現能を持つということが明らかとなった。
(4) Results The results are shown in FIG.
From FIG. 5, the CelA production amount and the endoglucanase activity per culture supernatant were almost the same for the Czapek-Dox medium, both of the hly promoter's CelA production ability and activity, and the sodM promoter was superior, but the DPY medium. In this case, all promoters showed similar CelA production ability and activity. That is, it was revealed that the hly promoter has the same expression ability as the sodM promoter having high gene expression ability in the liquid culture even in the liquid culture in the rich medium.
Deletion解析によるhlyプロモーターの最適な長さおよびシス因子領域の同定
（１）形質転換
実施例１に記載のhlyプロモーター制御下でcelAを発現させるためのプラスミドを鋳型として、M13 Primer P7：実施例１に記載および、プロモーター長が100、400、700、1000 bpとなるように設計したそれぞれのプライマーPhly-100-S1：
5’-CGACTTTATCAATCTTCCATTGACCATTCC-3’ (配列番号124)、 Phly-400-S1：5’-GTCAACCTCTAACAACGCGCTCGGAGGAGA-3’ (配列番号125)、 Phly-700-S1：5’-TGTCTGGGGTAGGATCACAACTAATCAGTT-3’ (配列番号126)、 およびPhly-1000-S1：5’-TACAGCATGGTCTGGATTCCAATCCACGCA-3’ (配列番号127)を用いてPCRによりそれぞれのcelA発現カセットを増幅し、これらとAspergillus nidulansのleuA遺伝子発現カセットのPCR増幅産物とともに、実施例１と同様にして形質転換を行った。
Identification of optimal length and cis-factor region of hly promoter by deletion analysis
(1) Transformation Using the plasmid for expressing celA under the control of the hly promoter described in Example 1 as a template, M13 Primer P7: described in Example 1 and promoter lengths of 100, 400, 700, 1000 bp Each primer Phly-100-S1 designed to be:
5'-CGACTTTATCAATCTTCCATTGACCATTCC-3 '(SEQ ID NO: 124), Phly-400-S1: 5'-GTCAACCTCTAACAACGCGCTCGGAGGAGA-3' (SEQ ID NO: 125), Phly-700-S1: 5'-TGTCTGGGGTAGGATCACAACTAATCAGTT-3 '(SEQ ID NO: 126) , And Phly-1000-S1: 5'-TACAGCATGGTCTGGATTCCAATCCACGCA-3 '(SEQ ID NO: 127) was used to amplify each celA expression cassette by PCR, along with PCR amplification products of these and Aspergillus nidulans leuA gene expression cassette Transformation was performed in the same manner as in Example 1.
（２）エンドグルカナーゼ活性測定
実施例１と同様にして小麦フスマ培養での酵素活性測定を行った。
（３）結果
結果を図６に示す。図６のグラフは上から順に、配列番号１の塩基番号１〜1500の領域、塩基番号501〜1500の領域、塩基番号801〜1500の領域、塩基番号1101〜1500の領域、塩基番号1401〜1500の領域をプロモーターとして用いた場合である。また、最下段は、A.nidulans leuA遺伝子のみを導入した場合である。
図６から、この機能未知遺伝子の新規プロモーターによる遺伝子発現にとって最適なプロモーター長は1000塩基であり、その発現促進に必須なシス因子は、配列番号１の塩基番号1101〜1500の領域（開始コドンの上流400bpまでの領域、特に塩基番号1101〜1400の領域に存在することが示唆された。
(2) Measurement of endoglucanase activity In the same manner as in Example 1, enzyme activity was measured in wheat bran culture.
(3) The results are shown in FIG. The graph of FIG. 6 is, in order from the top, a region of
From FIG. 6, the optimal promoter length for gene expression by a novel promoter of this unknown function gene is 1000 bases, and the cis factor essential for promoting the expression is the region of base numbers 1101-1500 (SEQ ID NO: 1) It was suggested that it exists in the region up to 400 bp upstream, particularly in the region of base numbers 1101-1400.
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