JP5366940B2 - 葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体 - Google Patents

Description

本発明は葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、その製造方法及びその用途に関する。

葉酸は水溶性ビタミンの１種であり、アミノ酸や核酸の合成に必要とされる補酵素である。葉酸は体内の還元酵素でテトラヒドロ葉酸に変換された後、更に変換されてｄＴＭＰ（デオキシチミジン一リン酸）やプリン合成に使用される。葉酸誘導体には生体内での葉酸の変換を阻害し細胞分裂を停止させる作用を持つ化合物もある。これらの一群の化合物は葉酸代謝拮抗剤と呼ばれ、その代表的な化合物であるメトトレキサートは白血病、肉腫、胃癌等の治療に古くから用いられてきた。更に、メトトレキサートは免疫調節作用も持ち、関節リウマチの薬物治療には必須な薬剤となっている。
また、葉酸自身や葉酸誘導体のロイコボリン等は葉酸欠乏症やメトトレキサートの毒性を中和する薬剤としても使用されている。

このように葉酸（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ）や、葉酸誘導体、例えば、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）に代表される葉酸代謝拮抗剤は、医薬品として有用な化合物であり、その効果を改善することを目的に様々な誘導体研究が継続されている。これらの誘導体は、例えば以下に示すアミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プララトレキセート（ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ）、プレビトレキセド（ｐｌｅｖｉｔｒｅｘｅｄ）、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、ロメトレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）等がある。これらの葉酸代謝拮抗剤の作用機作は主にジヒドロフォレートリダクターゼの阻害作用であるが、新しく開発されている薬剤の中にはチミジレートシンセターゼの阻害作用を持つものもあり、更に有効な薬剤を求めて開発が進められている。例えば、ペメトレキセドは葉酸代謝系に関与している複数の酵素を阻害することを特徴としており、悪性胸膜中皮腫の治療薬として認可されている。

一方、低分子の薬剤の毒性軽減、効果増強を目的にした試みがドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）研究の一環として行われている。その方法は様々であるが、例えば、薬剤を高分子に結合させたり、ナノサイズのキャリアーに封入する等がある。葉酸誘導体を代表する化合物であるメトトレキサートにおいてもマイクロスフェアー、デンドリマー、ミセルを利用したもの等が報告されている。しかし、いずれの報告もＤＤＳ研究の最終的な目的である効果の増強、副作用の軽減を十分に満足しているとはいえない。

特許文献１、特許文献３には両親媒性高分子が形成するミセルを担体とする水溶性高分子化医薬製剤が記載されており、特許文献１には疎水性セグメントの例としてメトトレキサートが結合した高分子担体の記載があるが、メトトレキサートと両親媒性高分子はアミド結合しているものである。特許文献３には葉酸若しくは葉酸誘導体を結合した高分子結合体について記載されていない。
特許文献２には高分子化合物とカンプトテシン類をフェニルエステル結合で結合させることによって、化学的な安定性と生体内での薬剤遊離効率を同時に達成したことが報告されている。しかしながら、この方法をそのままメトトレキサートに代表される葉酸誘導体（葉酸自身も含む）のカルボキシ基に用いることはできない。

また、非特許文献１、非特許文献２には、メトトレキサートのカルボキシ基を用いて両親媒性高分子とアルキルエステル結合させた高分子結合体が記載されているが、薬剤の遊離速度が遅く、薬剤の効果が発揮されるか疑問がある。また、高分子結合体からの薬剤の遊離を生体内の酵素に依存する場合、該酵素活性は個人差があるため薬剤遊離速度にばらつきを生じ、結果として薬効がばらつく恐れがある。

特開平２−３００１３３号公報 国際公開第２００４／０３９８６９号パンフレット 国際公開第２００３／０００７７１号パンフレット

「コロイド アンド サーフェスＢ：バイオインターフェース」、１９９９年、第１６巻、２１７−２２６頁 「ファーマシューティカル リサーチ」、２０００年、第１７巻、６０７−６１１頁

特許文献１における薬剤と両親媒性高分子との結合はアミド結合であるが、アミド結合は化学的に安定であり、該高分子結合体を生体内に投与した場合、薬剤の遊離速度がかなり遅く実用的ではない。
薬剤を高分子結合体とすることで薬理効果を向上させるためには薬剤が適度な速度で高分子結合体から遊離する必要があり、単純に高分子化合物に結合させるだけでは不十分である。薬剤と高分子化合物との結合が弱い場合、高分子結合体が不安定となり製剤化が極めて難しくなるばかりではなく、薬剤の遊離が速くて高分子化合物と結合させることによる薬物動態等の改良が期待できない。また、結合が強すぎる場合、薬物動態は改良されたとしても薬剤が高分子結合体から遊離されず薬理効果の発揮が困難となる。

葉酸または葉酸誘導体のアミド結合を用いない高分子結合体であり、化学的な安定性と適度な生体内薬剤遊離効率を有する化合物が求められていた。

本発明者等は前記したような課題を解決すべく鋭意努力した結果、ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボン酸を有するポリマーからなるブロック共重合体と、葉酸または葉酸誘導体が特定のリンカー分子を介して結合した高分子結合体を見出し、本発明に到達した。

即ち、本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシ基を有するポリマーからなるブロック共重合体の該カルボキシ基に下記式（Ｉ）

［式中、Ａは単環または縮合した芳香族基を示し、Ｇは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｙは水素原子または置換基を示し、Ｅは葉酸若しくは葉酸誘導体の残基を示す］
で表される置換基が結合している葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、またはその薬理学的に許容される塩。

（２）側鎖にカルボキシ基を有するポリマーがポリ酸性アミノ酸である上記（１）に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、またはその薬理学的に許容される塩。
（３）ポリ酸性アミノ酸がポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸である上記（２）に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、またはその薬理学的に許容される塩。

（４）下記式（ＩＩ）

［式中、Ｄは水素原子または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｎの平均値は５〜１１５００であり、Ｊは（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基を示し、ｃ＋ｄ＋ｅの平均値は３〜２００であり、ｃ＋ｄは正数であり、Ｒは水酸基または式（Ｉ）で表される置換基を示し、１分子中少なくとも１個のＲは式（Ｉ）で表される置換基であり、Ｂは水素原子または（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示す］
で表される上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。

（５）Ｄが無置換の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり、ｎの平均値が５０〜１０００であり、ｃ＋ｄ＋ｅの平均値が５〜１００であり、Ｂが（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基である上記（４）記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。
（６）式（Ｉ）で表される置換基が下記式（ＩＩＩ）

［式中、Ｅは葉酸若しくは葉酸誘導体の残基を示す］
で表される置換基である上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。

（７）葉酸の誘導体がメトトレキサートである上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。
（８）葉酸の誘導体がペメトレキセドである上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。

（９）上記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
（１０）上記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩を有効成分とする炎症疾患治療薬。

（１１）葉酸若しくは葉酸誘導体と式（ＩＶ）で表される化合物のフェノール性水酸基とをエステル結合させ、アミノ基の保護基を除去し、続いて、得られた脱保護体と、ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシ基を有するポリマーからなるブロック共重合体の該カルボキシ基とを脱水縮合してアミド結合を生成することを特徴とする葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体の製造方法。

［式中、Ａは単環または縮合した芳香族基を示し、Ｇは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｐはアミノ基の保護基を示し、Ｙは水素原子または置換基を示す］

一般的に高分子化合物は分子量や組成に分散を有し、単一の分子ではないため厳密な化学分析が難しく、また、葉酸または葉酸誘導体は複数のアミノ基とカルボキシ基を有しているためその結合様式が複数存在する。しかし、本発明では、葉酸または葉酸誘導体とリンカー分子を縮合した後に分離精製を行うことができ、且つ、得られた化合物とブロック共重合体との縮合反応は比較的容易に進行することから、得られる葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体の品質を一定にすることができる。
また、本発明で得られる高分子結合体は薬剤とリンカー分子がフェニルエステル結合しているので、実用的な化学的安定性と優れた生体内薬剤遊離効率を同時に達成することが可能であり、薬理効果を増強し、副作用を軽減することが可能となる。
更に、本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体から薬剤の遊離速度をリンカー部分の置換基を変えたり、結合する薬剤のカルボキシ基を選ぶことにより制御することができる。加えて、これらの遊離速度の異なる高分子結合体を混合することでも薬剤の放出速度を調整することができるため、より広い応用が可能である。

試験例１における加水分解酵素非存在下での薬剤遊離速度を高分子結合体に結合している全薬剤量に対する比として示したものである。 試験例２のラットコラーゲン関節炎モデルを用いた抗炎症評価結果を示したものである。 試験例３のラットコラーゲン関節炎モデルを用いた抗炎症評価結果を示したものである。

本発明は、ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシ基を有するポリマーからなるブロック共重合体の該カルボキシ基に上記式（Ｉ）［式中、Ａは単環または縮合した芳香族基を示し、Ｇは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｙは水素原子または置換基を示し、Ｅは葉酸若しくは葉酸誘導体の残基を示す］で表される置換基が結合している葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、またはその薬理学的に許容される塩である。

ポリエチレングリコール類としては、両末端または片末端が修飾されたポリエチレングリコールも含まれ、両末端の該修飾基は同一でも異なっていてもよい。末端の修飾基としては置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基、ジメトキシエチル基、ジエトキエチル基、アミノメチル基、アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基等が挙げられる。
ポリエチレングリコール類部分の分子量は、通常３００〜５０００００程度であり、好ましくは５００〜１０００００程度、更に好ましくは１０００〜５００００程度である。なお、本発明における分子量とはゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）で測定したピークトップ分子量である。

側鎖にカルボキシ基を有するポリマーとしては側鎖にカルボキシ基を有する構成成分を含有するポリマーであればよく、側鎖にカルボキシ基を有する構成成分としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられ、側鎖にカルボキシ基を有するポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリンゴ酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等が挙げられ、中でもポリ酸性アミノ酸が好ましく、例えば、ポリアスパラギン酸やポリグルタミン酸等が好ましく、特にポリアスパラギン酸が好ましい。
本発明におけるブロック共重合体１分子当たりのカルボキシ基の数は、３〜２００個程度が好ましく、５〜１００個程度がより好ましい。

本発明におけるブロック共重合体としては、末端に官能基を有するポリエチレングリコール類と末端に官能基を有するポリカルボン酸類とを結合した化合物や、特許文献１や特許文献３等に記載されている末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール類で重合を開始するアミノ酸活性化物の重合反応によって得られる化合物等が挙げられる。

上記式（Ｉ）のＡは単環または縮合した芳香族基であり、特に限定されないが、異項原子を含まない（Ｃ６〜Ｃ１８）芳香族基が好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基等が挙げられ、中でもフェニル基が特に好ましい。フェノール性水酸基とアミノアルキル基の置換位置は特に限定されない。

上記式（Ｉ）のＡにおけるＹとは、単環または縮合した芳香族基に結合している水素原子または置換基であり、該置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基等の（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ基、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子、ホルミル基、アセチル基等の（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基、ニトロ基、シアノ基、水酸基等が挙げられる。
葉酸若しくは葉酸誘導体とリンカー分子の結合の強さは、リンカー分子が開裂した際のフェノール性水酸基の酸性度に大きく影響され、Ｙを変えることによりその酸性度を変化させると葉酸若しくは葉酸誘導体とリンカー分子の結合の強さも変化する。例えば、Ａがフェニル基の場合、葉酸若しくは葉酸誘導体の遊離を早めるためには電子吸引基であるシアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子等が好ましく、葉酸若しくは葉酸誘導体の遊離を遅らせるには電子供与基であるアルキル基等が好ましい。Ｙの置換数は置換可能な数であれば特に限定されない。
Ｙが置換基である場合、その置換位置は、遊離速度に対する影響を考慮する必要はあるが、特に限定されない。

上記式（Ｉ）のＧとは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基であり、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、メチルエチレン基、ジメチルエチレン基、メトキシエチレン基、エトキシエチレン基、クロロエチレン基、ブロモエチレン基、メチルトリメチレン基、ジメチルトリメチレン基、メトキシトリメチレン基、エトキシトリメチレン基、クロロトリメチレン基、ブロモトリメチレン基等が挙げられ、中でもメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等の直鎖アルキレン基が好ましく、エチレン基が特に好ましい。
上記式（Ｉ）のＥとしては、Ｅ−ＣＯ_２Ｈで葉酸若しくは葉酸誘導体を意味する葉酸若しくは葉酸誘導体の残基であり、葉酸若しくはカルボキシ基を有する葉酸誘導体であれば特に限定されず、例えば、Ｅ−ＣＯ_２Ｈとして上記の葉酸、メトトレキサート、アミノプテリン、プララトレキセート、プレビトレキセド、エダトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、ロメトレキソール等が挙げられ、中でもメトトレキサート、ペメトレキセド等が好ましい。

本発明の高分子結合体として、例えば、上記式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
式（ＩＩ）のＤにおける置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ベンジル基、ジメトキシエチル基、ジエトキエチル基、アミノメチル基、アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基等が挙げられる。Ｄとしては無置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基が好ましく、中でもメチル基が特に好ましい。
上記式（ＩＩ）中、ｎの平均値は５から１１５００程度であり、好ましくは５０〜１０００程度であり、より好ましくは１００〜３００程度である。

上記式（ＩＩ）のＪにおける（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基としては、例えば、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基等の直鎖アルキレン基が挙げられ、中でもトリメチレン基が好ましい。
上記式（ＩＩ）中、ｃ＋ｄ＋ｅは高分子結合体１分子中の全アスパラギン酸数を表し、その平均値は３〜２００程度であり、好ましくは５〜１００程度であり、より好ましくは６〜６０程度である。ポリアスパラギン酸の各構成単位はランダムに結合していてもブロックを形成して結合していてもよいが、ｃ＋ｄは正数であり、ｅは０でもよい。
また、全アスパラギン酸数（ｃ＋ｄ＋ｅ）に対するα−アミノ酸型構成単位（ｃ）の割合は好ましくは１０〜１００％であり、特に好ましくは２０〜１００％である。この割合は、例えば、特許文献１等に準じた製造方法の工程中、ポリアスパラギン酸の保護基の脱保護条件等を選ぶことにより適宜変えることが可能である。

上記式（ＩＩ）のＢにおける（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基またはヘキサノイル基等が挙げられる。Ｂとしては（Ｃ２〜Ｃ４）アシル基、例えば、アセチル基またはプロピオニル基等が好ましく、アセチル基が特に好ましい。

上記式（ＩＩ）のＲとしては水酸基または上記式（Ｉ）で表される置換基が挙げられ、１分子中少なくとも１個のＲは式（Ｉ）で表される置換基である。式（Ｉ）で表される置換基とは上記した通りであり、好ましくは上記式（ＩＩＩ）で表される置換基である。式（ＩＩＩ）におけるＥとしては上記式（Ｉ）におけるＥと同じ意味であり、好ましい化合物も同様である。

次に本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体について、葉酸誘導体がメトトレキサート、リンカー分子がチラミン（Ｔｙｒａｍｉｎｅ：４−アミノエチルフェノール）の場合にて説明するが、本発明がこの化合物に限定されることはない。
メトトレキサートはカルボキシ基を２個有していることから、チラミンとメトトレキサートがエステル結合している化合物にも２つの位置異性体が存在する。以下に示すように、メトトレキサートの部分構造であるグルタミン酸のα−カルボキシ基がチラミンと結合したものをα置換体、γ−カルボキシ基がチラミンと結合したものをγ置換体と呼ぶ。

これらの化合物の製造方法について説明する。
まず、チラミンのアミノ基をエステル結合生成後に除去可能な保護基で保護する。該保護基としては、一般的なアミノ基の保護基であれば特に問わないが、チラミンとメトトレキサートのエステル結合が安定である脱保護条件、即ち、中性若しくは酸性条件で脱保護できる保護基が望ましく、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカルボニル基等が挙げられる。

次いで、アミノ基が保護されたチラミンを、有機溶媒中メトトレキサートと脱水縮合剤を用いて脱水縮合する。
脱水縮合反応の反応温度は、通常４〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃であり、反応時間は１時間〜数日、好ましくは４〜４８時間である。
該有機溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル等のエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類、１，３−ジメチルイミダゾリジノン等のウレア類または前記溶媒の混合溶媒等が挙げられ、好ましくはアミド類またはウレア類であり、より好ましくはジメチルホルムアミドまたは１，３−ジメチルイミダゾリジノンである。

該脱水縮合剤としてはアミン類とカルボキシル基の縮合反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、クロロ蟻酸イソブチル、ピバリン酸クロリド、ＤＭＴ−ＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム クロリド）、ＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウム ヘキサフルオロホスフェート）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリノン（ＥＥＤＱ）またはＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスフォニウム ヘキサフルオロホスフェート）である。

脱水縮合反応の際、反応助剤を用いてもよい。該反応助剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、４−ジメチルアミノピリジンまたは２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン等が挙げられる。
脱水縮合反応を行った後、必要に応じて適当な精製処理を行い、チラミンのアミノ基が保護された上記のα置換体とγ置換体の混合物若しくは分離された各異性体を得る。更に、アミノ基の保護基を適当な処理を行い脱保護し、上記のメトトレキサートとチラミンの縮合体（α置換体、γ置換体、若しくはその混合体）を得る。

本発明には上記の葉酸若しくは葉酸誘導体と上記式（ＩＶ）で表される化合物のフェノール性水酸基とをエステル結合させ、アミノ基の保護基を除去し、続いて、得られた脱保護体と、ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシ基を有するポリマーからなるブロック共重合体の該カルボキシ基とを脱水縮合してアミド結合を生成することを特徴とする葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体の製造方法も含まれる。
続いて該製造方法について説明する。

上記で得られた置換体と、特許文献３等に記載の方法に準じて製造されたメトキシポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体またはメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体とを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いて脱水縮合する。
脱水縮合反応の反応温度は、通常４〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃であり、反応時間は１時間〜数日、好ましくは４〜４８時間である。

該有機溶媒としては、上記のメトトレキサートとアミノ基を保護したチラミンの縮合反応における有機溶媒と同様な有機溶媒が挙げられ、好ましい有機溶媒も同様である。
該脱水縮合剤としては、上記のメトトレキサートとアミノ基を保護したチラミンの縮合反応における脱水縮合剤と同様な脱水縮合剤が挙げられる。
脱水縮合反応の際には反応助剤を用いてもよく、該反応助剤としては、上記のメトトレキサートとアミノ基を保護したチラミンの縮合反応における反応助剤と同様な反応助剤が挙げられる。

ただし、上記で得られた置換体には遊離のカルボキシ基が残っていることから、ブロック共重合体の側鎖カルボキシ基を最初に活性化し、その後、上記置換体のアミノ基と反応させることが望ましい。
活性化の方法としては、通常ペプチド結合製造の際に用いられる方法が適用可能であり、例えば、上記の試薬を使用した方法が挙げられる。即ち、カルボン酸類とＮ−ヒドロキシスクシンイミド等の反応助剤を上記の脱水縮合剤で縮合し、活性エステル体として単離した後にアミン類を加えてアミドを得る方法等である。

本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体において、ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシ基を有するポリマーからなるブロック共重合体にリンカーを介して結合している葉酸及び葉酸誘導体の結合量は、薬効を示す量であれば特に限定されないが、通常該ポリマーの総カルボキシ基数の１〜１００％、好ましくは１０〜９０％である。
葉酸及び葉酸誘導体の結合量は、例えば、紫外線吸収スペクトルの強度から求めることができる。また、本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体をアルカリ加水分解することにより遊離する葉酸または葉酸誘導体を、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いて定量することによっても求めることができる。

本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体において、リンカー分子が結合していない側鎖カルボキシ基やエステルになっていない葉酸及び葉酸誘導体のカルボキシ基は遊離型でも塩型でもよい。遊離型で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって目的とする塩に変換することができ、塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により遊離型または目的とする他の塩に変換することができる。
該塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩またはトリエチルアンモニウム塩等が挙げられる。

本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体は、水中でポリエチレングリコール類を外殻とするミセルを形成してもよい。ミセルを形成することにより良好な水溶性，水溶液中での安定性、薬効の増強が期待される。

本発明には上記の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体を薬効成分とする抗癌剤、炎症疾患治療剤、または抗リウマチ剤も含まれる。該葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体は、そのまま投与することも、また、医薬上許容される物質と混合した薬学的組成物として投与することもできる。該薬学的組成物の剤形は注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよい。また、これらの製剤は医薬用に用いられる種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。
該製剤中における葉酸及び葉酸誘導体の高分子結合体の含量は製剤により種々異なるが、通常０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９８重量％である。

以下に、参考例、実施例及び試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１ Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅの合成
Ｔｙｒａｍｉｎｅ（５．４９ｇ）をジオキサン１１０ｍＬ、水１１０ｍＬに溶解し、（Ｂｏｃ）_２Ｏ（ジ−ｔ−ブチルジカーボネート：９．６０ｇ）を加えた。室温で４時間攪拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、目的物の画分を減圧濃縮することでＢｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ（９．０５ｇ）を得た。

参考例２ Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸの合成
ＭＴＸ（メトトレキサート：８．１８ｇ）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ（８．５４ｇ）、ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン：４．４０ｇ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド：１６４ｍＬ）に溶解した後、ジイソプロピルカルボジイミド（５．６４ｍＬ）を加えた。室温で４時間攪拌した後、酢酸エチル（１．６４Ｌ）、水（１．６４Ｌ）で抽出した。水層に２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）２．９Ｌを加え、生成した沈殿を桐山ロートでろ過した。得られた沈殿を塩化メチレン−メタノール混合溶媒（１：１）に溶解させ、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムで精製し、２種のＭＴＸモノエステル体（α−モノエステル体 １．７１１ｇ、γ−モノエステル体 １．３３２ｇ）を得た。α−モノエステル体とγ−モノエステル体はＨＰＬＣ条件１において保持時間がそれぞれ１３．３分、１３．７分であった。

ＨＰＬＣ条件１
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（５μｍ） ４．６ｘ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
溶離液：Ａ液 ０．１％リン酸水溶液、Ｂ液 アセトニトリル
グラジエント
時間（分） ０ ３０ ３５ ３５．１ ４５
Ｂ液（％） １０ ９０ ９０ １０ １０
流速：１．０ｍＬ／分
検出器：ＵＶ（２５４ｎｍ）

参考例３ Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭの合成
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，３５，ｐ４４５０−４４５４に記載されている方法で得られたペメトレキセド（ＰＥＭ：６２４ｍｇ）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ（６９３ｍｇ）、ＤＭＡＰ（３５７ｍｇ）をＤＭＦ（１２．５ｍＬ）に溶解した後、ジイソプロピルカルボジイミド（４５７μＬ）を加えた。室温で４５分攪拌した後、酢酸（３３４μＬ）を加えた。ＨＰＬＣ条件２で精製を行い、Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ（α、γ−モノエステルの混合体：約１：１）２７７ｍｇを得た。α−エステルとγ−エステルはＨＰＬＣ条件１において保持時間がそれぞれ１８．０分、１８．３分であった。
ＨＰＬＣ条件２
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（５μｍ） ２０ｘ２５０ｍｍ
カラム温度：室温
溶離液：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 アセトニトリル
グラジエント
時間（分） ０ ４．９ ５ １３ １３．１ ２０ ２０．１ ３０
Ｂ液（％） １０ １０ ２０ ２０ ４０ ４０ １０ １０
流速：２０ｍＬ／分
検出器：ＵＶ（２５４ｎｍ）

参考例４ α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸの合成
参考例２で得られたα−Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（１００ｍｇ）に酢酸エチル（１．５ｍＬ）を加え懸濁させたのち、４Ｎ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（０．５ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。沈殿を桐山ロートでろ過し、真空乾燥してα−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（１１１ｍｇ）を得た。回収率から３塩酸塩であると考えられる。

参考例５ γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸの合成
参考例２で得られたγ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（１００ｍｇ）に酢酸エチル（１．５ｍＬ）を加え懸濁させたのち、４Ｎ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（０．５ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。沈殿を桐山ロートでろ過し、真空乾燥してγ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（１０８ｍｇ）を得た。回収率から３塩酸塩であると考えられる。

参考例６ Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ（α、γ混合体）の合成
参考例３で得られたＢｏｃ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ（α、γ混合体）１００ｍｇに酢酸エチル（１．５ｍＬ）を加え懸濁させたのち、４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（０．５ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。沈殿を桐山ロートでろ過し、真空乾燥してＴｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ（α、γ混合体）９３ｍｇを得た。回収率から２塩酸塩であると考えられる。

参考例７ ＰＥＧ−Ａｓｐ３３（ＯＳｕ）−Ａｃの合成
特許文献３に記載の方法に準じて合成したＰＥＧ−Ａｓｐ３３−Ａｃ（片末端メチル片末端アミノプロピルポリエチレングリコールポリアスパラギン酸（３３ユニット）のブロック共重合体Ｎ−アセチル体：４８５ｍｇ）、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド：１１５ｍｇ）をＤＭＦ（９．７ｍＬ）に溶解し３３℃のオイルバスで加温した。ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド：２０６ｍｇ）を添加して１時間攪拌した。生成したウレアを桐山ロートでろ過し、得られたろ液に酢酸エチル（３９ｍＬ）を加え希釈した後に、ヘキサン（５８ｍＬ）を添加し結晶を析出させた。１５分攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（３：２）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ３３（ＯＳｕ）−Ａｃ（４５４ｍｇ）を得た。

実施例１ ＰＥＧ−Ａｓｐ３３（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃの合成
参考例７で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ３３（ＯＳｕ）−Ａｃ（１５０ｍｇ）と参考例４で得られたα−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（１１３ｍｇ）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６９μＬ）を添加した。室温で４時間攪拌したのち、ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）１００ｍＬ中に滴下した。１０分間攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥して目的化合物の粗結晶（２６１ｍｇ）を得た。
この粗結晶をアセトニトリル−水混合溶媒（１：１）５２ｍＬに溶解し、イオン交換樹脂 Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ｃ１００２（２．６１ｇ）、Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ａ２０３Ｔ（２．６１ｇ）（共に、ムロマチテクノス（株）製）を加え、不純物を吸着精製した。樹脂をろ過した後、ろ液を減圧濃縮、凍結乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ３３（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ（１７２ｍｇ）を得た。この高分子結合体のＭＴＸ含有率は１９．６％（ｗ／ｗ）であった。薬剤（ＭＴＸ）含有率は、得られた高分子結合体を水酸化ナトリウム水溶液で加水分解させ、遊離してきた薬剤（ＭＴＸ）をＨＰＬＣで分析することで算出した。以下の高分子結合体でも同様である。

実施例２ ＰＥＧ−Ａｓｐ３３（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃの合成
参考例７で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ３３（ＯＳｕ）−Ａｃ（１４６ｍｇ）と参考例５で得られたγ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（１１０ｍｇ）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６７μＬ）を添加した。室温で４時間攪拌したのち、ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）１００ｍＬ中に滴下した。１０分間攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥して目的化合物の粗結晶（２７０ｍｇ）を得た。
この粗結晶をアセトニトリル−水混合溶媒（１：１）５４ｍＬに溶解し、イオン交換樹脂 Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ｃ１００２（２．７０ｇ）、Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ａ２０３Ｔ（２．７０ｇ）を加え、不純物を吸着精製する。樹脂をろ過した後、ろ液を減圧濃縮、凍結乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ３３（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ（１７０ｍｇ）を得た。この高分子結合体のＭＴＸ含有率は２５．０％（ｗ／ｗ）であった。

参考例８ ＰＥＧ−Ａｓｐ４０（ＯＳｕ）−Ａｃの合成
特許文献３に記載の方法に準じて合成したＰＥＧ−Ａｓｐ４０−Ａｃ（片末端メチル片末端アミノプロピルポリエチレングリコールポリアスパラギン酸（４０ユニット）のブロック共重合体Ｎ−アセチル体：４２０ｍｇ）、ＨＯＳｕ（１１５ｍｇ）をＤＭＦ（８．４ｍＬ）に溶解し３７℃のオイルバスで加温した。ＤＣＣ（２０６ｍｇ）を添加して１時間攪拌した。生成したウレアを桐山ロートでろ過し、得られたろ液に酢酸エチル（３４ｍＬ）を加え希釈した後に、ヘキサン（５０ｍＬ）を添加し結晶を析出させた。４０分攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌する。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ４０（ＯＳｕ）−Ａｃ（４２４ｍｇ）を得た。

実施例３ ＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃの合成
参考例８で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４０（ＯＳｕ）−Ａｃ（２２０ｍｇ）と参考例４で得られたα−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（１７７ｍｇ）をＤＭＦ（２．２ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０９μＬ）を添加した。室温で４時間攪拌したのち、ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）１００ｍＬ中に滴下した。７０分間攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥して目的化合物の粗結晶（４１３ｍｇ）を得た。
この粗結晶をアセトニトリル−水混合溶媒（１：１）８３ｍＬに溶解し、イオン交換樹脂 Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ｃ１００２（４．１３ｇ）、Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ａ２０３Ｔ（４．１３ｇ）を加え、不純物を吸着精製した。樹脂をろ過した後、ろ液を減圧濃縮、凍結乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ（２６３ｍｇ）を得た。この高分子結合体のＭＴＸ含有率は２３．６％（ｗ／ｗ）であった。

実施例４ ＰＥＧ−Ａｓｐ４０（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃの合成
参考例８で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４０（ＯＳｕ）−Ａｃ（１００ｍｇ）と参考例５で得られたγ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（８１ｍｇ）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（４９μＬ）を添加した。室温で４時間攪拌したのち、ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）１００ｍＬ中に滴下した。２５分間攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥して目的化合物の粗結晶（１８９ｍｇ）を得た。
この粗結晶をアセトニトリル−水混合溶媒（１：１）３８ｍＬに溶解し、イオン交換樹脂 Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ｃ１００２（１．８９ｇ）、Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ａ２０３Ｔ（１．８９ｇ）を加え、不純物を吸着精製した。樹脂をろ過した後、減圧濃縮、凍結乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ４０（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ（１２６ｍｇ）を得た。この高分子結合体のＭＴＸ含有率は２８．６％（ｗ／ｗ）であった。

実施例５ ＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α、γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ）−Ａｃの合成
参考例８で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４０（ＯＳｕ）−Ａｃ（１２９ｍｇ）と参考例６で得られたＴｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ（α、γ混合体：９３ｍｇ）をＤＭＦ（１．３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（４２μＬ）を添加した。室温で２．５時間攪拌したのち、ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）１３０ｍＬ中に滴下した。１０分間攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥して目的化合物の粗結晶（２４６ｍｇ）を得た。
この粗結晶をアセトニトリル−水混合溶媒（１：１）５０ｍＬに溶解し、イオン交換樹脂 Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ｃ１００２（２．５ｇ）、Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ａ２０３Ｔ（２．５ｇ）を加え、不純物を吸着精製した。樹脂をろ過した後、ろ液を減圧濃縮、凍結乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α、γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ）−Ａｃ（１５０ｍｇ）を得た。この高分子結合体のＰＥＭ含有率は２２．１％（ｗ／ｗ）であった。

参考例９ ＰＥＧ−Ａｓｐ４４（ＯＳｕ）−Ａｃの合成
特許文献３に記載の方法に準じて合成したＰＥＧ−Ａｓｐ４４−Ａｃ（片末端メチル片末端アミノプロピルポリエチレングリコールポリアスパラギン酸（４４ユニット）のブロック共重合体Ｎ−アセチル体：５８２ｍｇ）、ＨＯＳｕ（１７３ｍｇ）をＤＭＦ（１１．６ｍＬ）に溶解し３７℃オイルバスで加温した。ＤＣＣ（３０９ｍｇ）を添加して１時間攪拌した。生成したウレアを桐山ロートでろ過した。得られたろ液に酢酸エチル（４６ｍＬ）を加え希釈した後に、ヘキサン（７０ｍＬ）を添加し結晶を析出させた。３０分攪拌した後に攪拌をとめて上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ４４（ＯＳｕ）−Ａｃ（５４３ｍｇ）を得た。

実施例６ ＰＥＧ−Ａｓｐ４４（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃの合成
参考例９で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４４（ＯＳｕ）−Ａｃ（１００ｍｇ）と参考例５で得られたγ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ（５７ｍｇ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３５μＬ）を添加した。室温で４時間攪拌したのち、ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）１００ｍＬ中に滴下した。１５分間攪拌した後に攪拌をとめ上澄みを除去し、更にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒（４：１）を追加し攪拌した。桐山ロートで沈殿をろ過し、真空乾燥して目的化合物の粗結晶（１５８ｍｇ）を得た。
この粗結晶をアセトニトリル−水混合溶媒（１：１）３２ｍＬに溶解し、イオン交換樹脂 Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ｃ１００２（１．５８ｇ）、Ｍｕｒｏｍａｃ（登録商標）Ａ２０３Ｔ（１．５８ｇ）を加え、不純物を吸着精製した。樹脂をろ過した後、ろ液を減圧濃縮、凍結乾燥してＰＥＧ−Ａｓｐ４４（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ（１０９ｍｇ）を得た。この高分子結合体のＭＴＸ含有率は２２．７％（ｗ／ｗ）であった。

試験例１ 薬剤遊離速度の測定（加水分解酵素非存在下における薬剤放出）
サンプル約５ｍｇを秤量し、アセトニトリル（２５０μＬ）、水（２５０μＬ）に溶解させた（溶液Ａ）。溶液Ａ（１００μＬ）に０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（９００μＬ）を加えて１時間室温で静置した。この溶液５０μＬをサンプリングし、０．１Ｎ塩酸５０μＬで中和後、ＰＢＳ溶液（４００μＬ）で希釈した。この溶液をＨＰＬＣで分析しサンプルに含まれる総薬剤量の基準とした。
一方、溶液Ａ（２００μＬ）をＰＢＳ溶液（１８００μＬ）で希釈後、３７℃の恒温槽中に靜置し、経時的にサンプリングしてＨＰＬＣで分析を行った。薬剤のピーク面積を上記総薬剤量の基準ピーク面積と比較して各経時点における薬剤放出率を計算し、得られた結果を図１に示す。

図１中、ＭＴＸ＿Ａ−３３は実施例１で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ３３（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃを、ＭＴＸ＿Ｇ−３３は実施例２で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ３３（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃを、ＭＴＸ＿Ｇ−４４は実施例６で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４４（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃを、ＭＴＸ＿Ｇ−４０は実施例４で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４０（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃを、ＭＴＸ＿Ａ−４０は実施例３で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃを、ＰＥＭ＿Ｇ−４０は実施例５で得られたＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α、γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＰＥＭ）−Ａｃを示す。

図１から明らかなように、本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体は酵素の非存在下で薬剤を遊離することができ、その薬剤遊離速度は薬剤分子のカルボン酸の酸性度に依存し、α置換体の遊離速度がγ置換体の遊離速度より早い。ＰＥＭ＿Ｇ−４０についてはα、γの混合体が結合していることから、遊離速度がα置換体、γ置換体の中間となっている。このことはα置換体、γ置換体を適当な割合で混合することにより薬剤遊離速度の制御ができることを示している。

試験例２ マウス結腸癌Ｃｏｌｏｎ２６移植マウスに対する抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下で継代したマウス結腸癌Ｃｏｌｏｎ２６を約２ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いてＣＤＦ１マウスの背側部皮下に移植した。腫瘍移植後７日目に実施例３で得られた本発明の高分子結合体ＭＴＸ＿Ａ−４０（ＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ、実施例６で得られたＭＴＸ＿Ｇ−４４（ＰＥＧ−Ａｓｐ４４（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃと比較対照物質としてのＭＴＸを尾静脈に投与した。本発明の高分子結合体は注射用水に溶解し単回投与した。対照としたＭＴＸは蒸留水で溶解・稀釈して、１日１回、５日間連日投与した。投与後、腫瘍の長径（Ｌｍｍ）及び短経（Ｗｍｍ）を定期的に測定し、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ^２）／２により算出した。投与開始日の腫瘍体積を１．０とし、投与開始後１２日目を判定日として各投与群の相対腫瘍体積を求めた。その結果を表１に示す。本発明の化合物の用量はＭＴＸ換算である。

無処置群の判定日の相対腫瘍体積は１２．３であった。
ＭＴＸの２０ｍｇ／ｋｇを５日間連日投与すると動物は全匹毒性により死亡した。１５ｍｇ／ｋｇの相対腫瘍体積は１２．２と無処置群の相対腫瘍体積とほとんど変わらず、抗腫瘍効果は見られなかった。
一方、本発明の高分子結合体ＭＴＸ＿Ａ−４０はＭＴＸとして５０ｍｇ／ｋｇでは１匹が毒性によって死亡したが、相対腫瘍体積は４．８であった。同じく２５ｍｇ／ｋｇの相対腫瘍体積は６．８であり、投与量に依存して腫瘍増殖を抑制している。ＭＴＸ＿Ｇ−４４はＭＴＸとして２５ｍｇ／ｋｇでは１匹が毒性によって死亡したが、相対腫瘍体積は２．３であった。同じく１２．５ｍｇ／ｋｇの相対腫瘍体積は８．２であり投与量に依存して腫瘍増殖を抑制している。
以上、本発明のＭＴＸの高分子結合体（ＭＴＸ＿Ａ−４０、ＭＴＸ＿Ｇ−４４）は単回投与において腫瘍の増殖を強く抑制し、その効果は連投したＭＴＸを大きく上回るものであり、抗癌剤として有用である。

試験例３ ラットコラーゲン関節炎モデルを用いた抗炎症評価
ＤＡ／Ｓｌｃラットの背部にウシＩＩ型コラーゲンＩＩとＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔとの乳濁液を背部皮内４箇所に合計０．４ｍＬ皮内投与（感作）し、関節炎を誘発した。実施例３で得られたＭＴＸ＿Ａ−４０（ＰＥＧ−Ａｓｐ４０（α−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ）と比較対照物質ＭＴＸは５ｍｇ／ｍＬ水溶液を調製し投与に用いた。陽性対象物質のレフロノミドはカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）水溶液で懸濁させて投与に用いた。ＭＴＸ＿Ａ−４０の２．５ｍｇ／ｋｇ投与群（ＭＴＸ換算；高用量群）は感作後１日目に、ＭＴＸ＿Ａ−４０の１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群（ＭＴＸ換算；低用量群）とＭＴＸの２．５ｍｇ／ｋｇ投与群は１日目と８日目に尾静脈内に投与した。また、レフロノミド（１０ｍｇ／ｋｇ）は感作日から２８日間連続して強制経口投与した。感作後、ラット左足蹠を観察し発症した関節炎をスコア化し、結果を図２に示す。スコア化には表２の関節炎スコア基準を用いた。

図２から明らかなように、ＭＴＸ投与群は対照群とほぼ同時期に炎症が発症しており抗炎症効果はみられない。
一方、ＭＴＸ＿Ａ−４０投与群はＭＴＸと比べ総投与量が１／２であるにも関わらず炎症の発症時期を遅延させており、ＭＴＸの高分子結合体はＭＴＸの抗炎症作用を増強、持続させていることが確認され、本発明の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体は炎症疾患治療薬として有用であることを示している。

試験例４ ラットコラーゲン関節炎モデルを用いた抗炎症評価２
実施例４で得られたＭＴＸ＿Ｇ−４０（ＰＥＧ−Ａｓｐ４０（γ−Ｔｙｒａｍｉｎｅ−ＭＴＸ）−Ａｃ）と比較対照物質ＭＴＸの５ｍｇ／ｍＬ水溶液を調製し投与に用い、試験例３と同様に行った。陽性対象物質のレフロノミドはカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）水溶液で懸濁させて投与に用いた。ＭＴＸ＿Ｇ−４０の１．００ｍｇ／ｋｇ（ＭＴＸ換算）、１．２５ｍｇ／ｋｇ（ＭＴＸ換算）投与群とＭＴＸの２．５ｍｇ／ｋｇ投与群は感作後１日目、８日目、１５日目、２２日目に尾静脈内に投与した。また、レフロノミド（１０ｍｇ／ｋｇ）は感作日から２８日間連続して強制経口投与した。感作後、ラット左足蹠を観察し、発症した関節炎を上記表２を用いてスコア化し、結果を図３に示す。

図３から明らかなように、本試験ではＭＴＸ投与群は対照群と比べて炎症の発症時期を遅延させた。一方、ＭＴＸ＿Ｇ−４０はＭＴＸよりも低投与量である１．００ｍｇ／ｋｇの投与で、ＭＴＸよりも更に炎症の発症時期を遅延させ、１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群では観察した２８日間炎症の発症を完全に抑制し、ＭＴＸの高分子結合体はＭＴＸの抗炎症作用を増強、持続させていることが確認された。

Claims (11)

1. ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシ基を有するポリマーからなるブロック共重合体の該カルボキシ基に下記式（Ｉ）
   

   

   ［式中、Ａは単環または縮合した芳香族基を示し、Ｇは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｙは水素原子または置換基を示し、Ｅは葉酸若しくは葉酸誘導体の残基を示す］
   で表される置換基が結合している葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、またはその薬理学的に許容される塩。
2. 側鎖にカルボキシ基を有するポリマーがポリ酸性アミノ酸である請求項１に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、またはその薬理学的に許容される塩。
3. ポリ酸性アミノ酸がポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸である請求項２に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、またはその薬理学的に許容される塩。
4. 下記式（ＩＩ）
   

   

   ［式中、Ｄは水素原子または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｎの平均値は５〜１１５００であり、Ｊは（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基を示し、ｃ＋ｄ＋ｅの平均値は３〜２００であり、ｃ＋ｄは正数であり、Ｒは水酸基または式（Ｉ）で表される置換基を示し、１分子中少なくとも１個のＲは式（Ｉ）で表される置換基であり、Ｂは水素原子または（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示す］
   で表される請求項１〜３のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。
5. Ｄが無置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり、ｎの平均値が５０〜１０００であり、ｃ＋ｄ＋ｅの平均値が５〜１００であり、Ｂが（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基である請求項４記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。
6. 式（Ｉ）で表される置換基が下記式（ＩＩＩ）
   

   

   ［式中、Ｅは葉酸若しくは葉酸誘導体の残基を示す］
   で表される置換基である請求項１〜５のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。
7. 葉酸の誘導体がメトトレキサートである請求項１〜６のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。
8. 葉酸の誘導体がペメトレキセドである請求項１〜６のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体、または薬理学的に許容される塩を有効成分とする炎症疾患治療薬。
11. 葉酸若しくは葉酸誘導体と下記式（ＩＶ）で表される化合物のフェノール性水酸基とをエステル結合させ、アミノ基の保護基を除去し、続いて、得られた脱保護体とポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシ基を有するポリマーからなるブロック共重合体の該カルボキシ基とを脱水縮合してアミド結合を生成することを特徴とする葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体の製造方法。
    

    

    ［式中、Ａは単環または縮合した芳香族基を示し、Ｇは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｐはアミノ基の保護基を示し、Ｙは水素原子または置換基を示す］

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