JP3131222B2 - ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、RNase Hを始動させるオリゴヌクレオチド
および高分子を合成し、反対鎖の鎖開裂に使用すること
に関するものである。本発明は、オリゴヌクレオチドの
少なくとも若干のヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性とな
るように官能化され、オリゴヌクレオチドの少なくとも
若干のヌクレオチドが相補鎖への該オリゴヌクレオチド
のハイブリッド形成を高める置換基を含み、かつオリゴ
ヌクレオチドの少なくとも若干のヌクレオチドが２′−
デオキシ−erythro−ペントフラノシル糖部分を含む、
オリゴヌクレオチドを包含する。これらのオリゴヌクレ
オチドおよび高分子は、療法、診断に、および研究試薬
として有用である。
発明の背景 大部分の疾病状態を含めて、哺乳動物の大部分の身体
状態が蛋白質により影響されることは周知である。これ
らの蛋白質は、直接に作用して、またはそれらの酵素機
能によって、動物およびヒトの多くの疾病に大幅に関与
している。古典的な療法は一般にそれらの蛋白質との相
互作用に注目し、それらが疾病を引き起こす機能または
疾病を増強する機能を緩和する努力を行ってきた。しか
し最近では、蛋白質合成を指示するメッセンジャーRNA
（mRNA）または他の細胞内RNAとの相互作用によって、
それらの蛋白質の実際の産生を緩和する試みがなされて
いる。一般にこのような療法の目的は、望ましくない蛋
白質産生に導く遺伝子発現を阻害するか、または他の形
で調節することである。
アンチセンス法は、比較的短いオリゴヌクレオチドを
一本鎖RNAまたは一本鎖DNAと相補的ハイブリッド形成さ
せ、これによりこれらの細胞内核酸の正常な本質的機能
を混乱させるものである。ハイブリッド形成は、ワトソ
ン−クリック塩基対を介した、RNAまたはDNAへのオリゴ
ヌクレオチドの複素環式塩基の配列特異的水素結合であ
る。このような塩基対は、互いに相補的であると言われ
る。
核酸の機能を混乱させる自然の事象は、コーエン（Co
hen）がOligonucleotides:Antisense Inhibitors of Ge
ne Expression,CRCプレス社、フロリダ州ボカレイトン
（1989）、に述べているように、２種類のものであると
考えられる。第１はハイブリッド形成の阻害である。こ
れは、オリゴヌクレオチド系の阻害剤が標的核酸に結合
し、従って単純な立体障害によって必須蛋白質（大部分
の場合リボソーム）が核酸に結合するのを阻害する、終
結事象を意味する。メチルホスホネートオリゴヌクレオ
チド（参照：たとえばミラー（Miller）ら,Anti−Cance
r Drug Design1987,2,117）およびα−アノマーオリゴ
ヌクレオチドは、ハイブリッド形成阻害により核酸の機
能を混乱させると考えられる２種類の最も広範に研究さ
れているアンチセンス剤である。
オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成阻害の程度を
判定する際には、個々のハイブリッド形成したコンプレ
ックスの融解温度を測定することにより、オリゴヌクレ
オチドが相補的核酸に結合する相対的能力を比較するこ
とができる。二重らせんの特徴的な物理的特性である融
解温度（Tm）は、コイル形（ハイブリッド形成していな
いもの）に対してらせん形（ハイブリッド形成したも
の）が50％存在する温度（℃）を表す。TmはUVスペクト
ルを用いてハイブリッドの形成および破壊（融解）を判
定することにより測定される。ハイブリッド形成に際し
て起こる塩基の重なりに伴って、UV吸収の減少（淡色効
果）が生じる。従って、UV吸収の減少はTmがより高いを
示す。Tmが高いほど、鎖の結合強度は大きい。非ワトソ
ン−クリック塩基対合、すなわち不適性塩基対合は、Tm
に対して強い不安定化作用をもつ。
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する第２の種類
の終結事象は、細胞内RNase Hによる標的RNAの酵素開裂
を伴うものである。このようなRNase H開裂のメカニズ
ムは、２′−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチ
ドが標的RNAにハイブリッド形成することを必要とす
る。生じたDNA−RNA二重らせんはRNase H酵素を活性化
し；この活性化された酵素がRNA鎖を開裂させる。RNA鎖
の開裂は、RNAの正常な機能を破壊する。ホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドは、この種類の終結事象によ
り作動するアンチセンス剤の顕著な一例である。DNAオ
リゴヌクレオチドがRNase Hの活性化に有用であるに
は、RNase H活性化に十分な期間、細胞内で耐えるため
に、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して妥当な
程度に安定でなければならない。
ワルダー（Walder）らの幾つかの最近の文献が、さら
にRNase Hとオリゴヌクレオチドの相互作用につき述べ
ている。特に興味深いのは下記のものである：（１）ダ
グレ（Dagle）ら,Nucleic Acids Research1990,18,475
1;（２）ダグレ（Dagle）ら,Antisense Research And D
evelopment1991,1,11;（３）エダー（Eder）ら,J.Biol.
Chem.1991,266,6472;および（４）ダグレ（Dagle）ら,N
ucleic Acids Research1991,19,1805。これらの報文中
でワルダーらは、非修飾ホスホジエステル−ヌクレオチ
ド間結合および修飾ホスホロチオエート−ヌクレオチド
間結合の両方を含むDNAオリゴヌクレオチドは細胞性RNa
se Hの基質であると述べている。それらは基質であるの
で、RNase Hによる標的RNAの開裂を活性化する。しかし
彼らはさらに、アフリカツメガエル（Xenopus）の胚に
おいてはホスホジエステル結合およびホスホロチオエー
ト結合は両方ともエキソヌクレアーゼ分解をも受けると
述べている。このようなヌクレアーゼ分解はRNase H活
性化に用いられるオリゴヌクレオチドを急速に減少させ
るので、不利である。
文献（１）、（２）および（４）に記載されるよう
に、それらのオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解に
対して安定化し、なおかつRNase H活性化をもたらすた
めに、ワルダーらはホスホルアミデート、アルキルホス
ホネートまたはホスホトリエステル結合のセクション間
に位置する短いホスホジエステル結合ヌクレオチドのセ
クションを含む２′−デオキシオリゴヌクレオチドを作
成した。ホスホルアミデートを含むオリゴヌクレオチド
はエキソヌクレアーゼに対しては安定化されたが、文献
（４）中で彼らは、各ホスホルアミデートがホスホルア
ミデートを含むオリゴヌクレオチドのTm測定値を1.6℃
低下させると述べている。このようなTm値の低下は、オ
リゴヌクレオチドとその標的鎖間のハイブリッド形成が
望ましくない減少を生じることを示唆する。
他の文献著者らは、このようなアンチセンスオリゴヌ
クレオチドとその標的鎖間のハイブリッド形成の減損が
及ぼす可能性のある作用について解説している。サイソ
ン−ベーモアラス（Saison−Behmoaras）ら,EMBO Journ
al1991,10,1111は、オリゴヌクレオチドが細胞性RNase
Hの基質であったとしても、mRNAへのハイブリッド形成
は弱いのでRNase Hによる開裂効率は低いということを
観察している。彼らは、オリゴヌクレオチドの３′末端
にアクリジン置換基を導入することによりオリゴヌクレ
オチドがエキソヌクレアーゼから保護されるとも述べて
いる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびRNase Hによ
る標的RNA鎖の開裂は有用であることは認められている
が、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性およびハイ
ブリッド形成の忠実度も極めて重要である。これまで、
RNase Hを活性化し、一方では同時にハイブリッド形成
性を維持または向上させ、かつヌクレアーゼ耐性を付与
しうる方法または材料については、このような方法およ
び材料が以前から要望されていたにもかかわらず当技術
分野において示唆されていない。従ってこのような方法
および材料に対する以前からの要望が残されている。
発明の目的 本発明の目的は、標的鎖とのハイブリッド形成に際し
てRNase Hを活性化し、かつヌクレアーゼ分解に抵抗す
るオリゴヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は、RNase Hを活性化し、ヌクレア
ーゼ分解を阻害し、かつオリゴヌクレオチドと標的鎖と
の間の向上した結合親和性を備えたオリゴヌクレオチド
を提供することである。
さらに他の目的は、特に疾病状態の動物の身体状態を
アッセイするための研究および診断の方法および材料を
提供することである。
他の目的は、DNAおよびRNAの活性を調節することによ
り疾病を治療するための療法ならびに研究の方法および
材料を提供することである。
発明の簡単な説明 本発明の１形態によれば、ヌクレオチド単位の配列か
ら形成されるオリゴヌクレオチドが提供される。これら
のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌクレ
アーゼ耐性を増大させるように官能化されたヌクレオチ
ド単位少なくとも１個を含む。さらにオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも若干のヌクレオチド単位は標的RNAへの
オリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるために置換基
で官能化されており、かつ少なくとも若干のヌクレオチ
ド単位は２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル
糖部分を有する。
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドにおいては、結
合親和性を高めるために置換基が官能化されたヌクレオ
チド単位は、２′−置換基を含むように官能化される。
より好ましい形態においては、２′−置換基がフルオ
ロ、C1−９アルコキシ、C1−９アミノアルコキシであ
り、これにはアミノプロポキシ、アリルオキシ、C1−C9
−アルキル−イミダゾールおよびポリエチレングリコー
ルが含まれる。好ましいアルコキシ置換基にはメトキ
シ、エトキシおよびプロポキシが含まれる。好ましいア
ミノアルコキシ単位はアミノプロポキシである。好まし
いアルキル−イミダゾールは１−プロピル−３−（イミ
ダゾリル）である。
増大したヌクレアーゼ耐性をもつ本発明のある種の好
ましいオリゴヌクレオチドにおいては、オリゴヌクレオ
チドの各ヌクレオチド単位がホスホロチオエートまたは
ホスホロジチオエート−ヌクレオチドである。他の好ま
しいオリゴヌクレオチドにおいては、３′末端ヌクレオ
チド単位が２′もしくは３′置換基またはこれら両者で
官能化されている。
オリゴヌクレオチドには、相補的核酸鎖へのオリゴヌ
クレオチドの結合親和性を高める置換基を保有する、複
数のヌクレオチド単位が含まれる。ある種の好ましい形
態においては、それらの置換基を保有するヌクレオチド
単位を第１ヌクレオチド単位サブ配列および第２ヌクレ
オチド単位サブ配列に分けることができ、２′−デオキ
シ−erythro−ペントフラノシル構造が第１ヌクレオチ
ド単位サブ配列と第２ヌクレオチド単位サブ配列の間の
オリゴヌクレオチド内に位置する。それらの介在ヌクレ
オチド単位がすべて２′−デオキシ−erythro−ペント
フラノシル単位であることが好ましい。
本発明の他の好ましいオリゴヌクレオチドにおいて
は、結合親和性を高める置換基を保有するヌクレオチド
単位は、オリゴヌクレオチドの３′または５′末端のう
ち一方または両方に位置する。置換基で置換されたヌク
レオチド単位が１−約８個あってもよい。好ましくは少
なくとも５個の連続したヌクレオチド単位が２′−デオ
キシ−erythro−ペントフラノシル糖部分である。
本発明は、α−ヌクレオシド、β−ヌクレオシド
（２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル β−
ヌクレオシドを含む）、４′−チオヌクレオシド、およ
び炭素環式ヌクレオシドから選ばれる複数の結合ヌクレ
オシドから形成された高分子をも提供する。これらのヌ
クシオシドは相補的核酸にハイブリッド形成しうる配列
の結合により連結されている。これらの結合は帯電リン
結合、中性リン結合、および非リン結合から選ばれる。
結合したヌクシオシドの配列は少なくとも２領域に分け
られる。第１ヌクシオシド領域には下記の種類のヌクシ
オシドが含まれる：帯電および中性３′−５′リン結合
により結合したα−ヌクレオシド；帯電および中性２′
−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシド；非リ
ン結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電および中
性３′−５′リン結合により結合した４′−チオヌクレ
オシド；帯電および中性２′−５′リン結合により結合
した４′−チオヌクレオシド；非リン結合により結合し
た４′−チオヌクレオシド；帯電および中性３′−５′
リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；帯電お
よび中性２′−５′リン結合により結合した炭素環式ヌ
クレオシド；非リン結合により結合した炭素環式ヌクレ
オシド；帯電および中性２′−５′リン結合により結合
したβ−ヌクレオシド；非リン結合により結合したβ−
ヌクレオシド。第２ヌクシオシド領域は、生理的pHにお
いて負の電荷をもつ帯電３′−５′リン結合により結合
した２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル β
−ヌクレオシドからなる。好ましい形態においては、高
分子はこの２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシ
ル β−ヌクレオシドを少なくとも３個、好ましくはこ
の２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル β−
ヌクレオシドを少なくとも５個含む。他の好ましい形態
においては、第３ヌクシオシド領域であり、そのヌクシ
オシドは第１領域につき選ばれるものから選ばれる。好
ましい形態においては、第２領域が第１領域と第３領域
の間に位置する。
好ましい帯電リン結合には、ホスホジエステル、ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレ
ネートおよびホスホロジセレネート結合が含まれる；ホ
スホジエステルおよびホスホロチオエート結合が特に好
ましい。好ましい中性リン結合には、アルキルおよびア
リールホスホネート、アルキルおよびアリールホスホロ
アミダイト、アルキルおよびアリールホスホトリエステ
ル、ハイドロジェンホスホネート、ならびにボラノホス
フェート結合が含まれる。好ましい非リン結合には、ペ
プチド結合、ヒドラジン結合、ヒドロキシアミン結合、
カルバメート結合、モルホリン結合、カーボネート結
合、アミド結合、オキシメチレンイミン結合、ヒドラジ
ド結合、シリル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結
合、スルホン結合、スルホキシド結合、スルホネート結
合、スルホンアミド結合、ホルムアセタール結合、チオ
ホルムアセタール結合、オキシム結合、およびエチレン
グリコール結合が含まれる。
本発明は、それぞれヌクシオシドおよび核酸塩基から
選ばれる複数の結合した単位から形成される高分子をも
提供する。ヌクシオシドには、α−ヌクレオシド、β−
ヌクレオシド（２′−デオキシ−erythro−ペントフラ
ノシル β−ヌクレオシドを含む）、４′−チオヌクレ
オシド、および炭素環式ヌクレオシドが含まれる。核酸
塩基には、プリン−９−イルおよりピリミジン−１−イ
ル複素環式塩基が含まれる。これらの単位のヌクシオシ
ドおよび核酸塩基は、その配列が相補的核酸にハイブリ
ッド形成しうる配列の結合により互いに連結されてお
り、結合した単位の配列は少なくとも２領域に分けられ
る。これらの結合は帯電３′−５′リン結合、中性３′
−５′リン結合、帯電２′−５′リン結合、中性２′−
５′リン結合、および非リン結合から選ばれる。第１領
域には、非リン結合により結合した核酸塩基、および非
糖−締結基（tethering group）を介してリン酸結合に
結合した核酸塩基、ならびに下記より選ばれるヌクシオ
シドが含まれる：帯電および中性３′−５′リン結合に
より結合したα−ヌクレオシド；帯電および中性２′−
５′リン結合により結合したα−ヌクレオシド；非リン
結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電および中性
３′−５′リン結合により結合した４′−チオヌクレオ
シド；帯電および中性２′−５′リン結合により結合し
た４′−チオヌクレオシド；非リン結合により結合した
４′−チオヌクレオシド；帯電および中性３′−５′リ
ン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；帯電およ
び中性２′−５′リン結合により結合した炭素環式ヌク
レオシド；非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオ
シド；帯電および中性２′−５′結合により結合したβ
−ヌクレオシド；非リン結合により結合したβ−ヌクレ
オシド。第２領域には、３′−５′リン結合が生理的pH
において負の電荷をもつ帯電３′−５′リン結合により
結合した２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル
β−ヌクレオシドのみが含まれる。
ある種の好ましい形態においては、第１領域は非リン
酸結合、たとえばペプチド結合により結合した、少なく
とも２個の核酸塩基を含む。好ましい形態においては、
高分子は第１領域につき上記に述べたものと同じ基から
選ばれる第３領域を含む。好ましい形態においては、第
２領域が第１領域と第３領域の間に位置する。
本発明は、それぞれヌクシオシドおよび核酸塩基から
選ばれる複数の結合した単位を含む高分子をも提供す
る。ヌクシオシドはα−ヌクレオシド、β−ヌクレオシ
ド、４′−チオヌクレオシド、および炭素環式ヌクレオ
シドから選ばれ、核酸塩基はプリン−９−イルおよびピ
リミジン−１−イル複素環式塩基から選ばれる。これら
の単位のヌクシオシドおよび核酸塩基は、その配列が相
補的核酸にハイブリッド形成しうる配列の結合により互
いに連結されている。結合した単位の配列は少なくとも
２領域に分けられる。これらの結合は帯電リン結合、中
性リン結合、または非リン結合から選ばれる。第１領域
には下記のものが含まれる：帯電および中性３′−５′
リン結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電および
中性２′−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシ
ド；非リン結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電
および中性３′−５′リン結合により結合した４′−チ
オヌクレオシド；帯電および中性２′−５′リン結合に
より結合した４′−チオヌクレオシド；非リン結合によ
り結合した４′−チオヌクレオシド；帯電および中性リ
ン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；非リン結
合により結合した炭素環式ヌクレオシド；帯電および中
性３′−５′リン結合により結合したβ−ヌクレオシ
ド；帯電および中性２′−５′リン結合により結合した
β−ヌクレオシド；非リン結合により結合したβ−ヌク
レオシド。第２領域には、非リン結合により結合した核
酸塩基、および非糖−締結部分を介してリン酸結合に結
合した核酸塩基が含まれる。
本発明の好ましい核酸塩基には下記のものが含まれ
る：アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミ
ン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニ
ン、６−メチルおよび他のアルキルアデニン、２−プロ
ピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、
５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシ
ンおよび６−アザチミン、５−ウラシル（プソイドウラ
シル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−ア
ミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールア
ルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の
８置換アデニン、ならびに８−ハログアニン、８−アミ
ノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアル
キルグアニン、８−ヒドトキシルグアニン、および他の
８置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、他の
アザおよびデアザチミジン、他のアザおよびデアザシト
シン、他のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよび
デアザグアニン、または５−トリフルオロメチルウラシ
ル、および５−トリフルオロシトシン。
本発明は、望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病
を伴う生物の治療方法をも提供する。これらの方法は、
相補的核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるヌクレ
オチドの配列を有し、かつ少なくとも１個のヌクレオチ
ドがヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドのヌクレ
アーゼ耐性を高めるために官能化され、かつ相補的核酸
鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるた
めにそれに配置された置換基を有し、かつ複数のヌクレ
オチドが２′−デオキシ−erythro領域；−ペントフラ
ノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと、該生物を
接触させることを含む。
さらに本発明によれば、相補的核酸鎖に特異的にハイ
ブリッド形成しうるヌクレオチドの配列を有し、かつ少
なくとも１個のヌクレオチドがヌクレアーゼに対するオ
リゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官
能化され、かつ複数のヌクレオチドが相補的核酸鎖に対
するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるためにそ
れに配置された置換基を有し、かつ複数のヌクレオチド
が２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル糖部分
を有するオリゴヌクレオチドを薬剤学的に有効な量で含
有する組成物が提供される。この組成物はさらに薬剤学
的に許容しうる希釈剤またはキャリヤーを含有する。
さらに本発明によれば、配列特異性核酸のインビトロ
修飾方向であって、相補的核酸鎖に特異的にハイブリッ
ド形成しうるヌクレオチドの配列を有し、かつ少なくと
も１個のヌクレオチドがヌクレアーゼに対するオリゴヌ
クレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官能化さ
れ、かつ複数のヌクレオチドが相補的核酸鎖に対するオ
リゴヌクレオチドの結合親和性を高めるためにそれに配
置された置換基を有し、かつ複数のヌクレオチドが２′
−デオキシ−erythro−ペントフラノシル糖部分を有す
るオリゴヌクレオチドと、RNase H酵素および上記核酸
を含有する被験溶液を接触させることを含む方法が提供
される。
また、生物においてハイブリッド形成およびRNase H
酵素活性化を同時に増大させる方法であって、相補的核
酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるヌクレオチドの
配列を有し、かつ少なくとも１個のヌクレオチドがヌク
レアーゼに対するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐
性を高めるために官能化され、かつ複数のヌクレオチド
が相補的核酸鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和
性を高めるためにそれに配置された置換基を有し、かつ
複数のヌクレオチドが２′−デオキシ−erythro−ペン
トフラノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと、該
生物を接触させることを含む方法も提供される。
図面の簡単な説明 本発明は図面と関連づけるとより良く理解されるであ
ろう。
第１図は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび対照化
合物の用量応答活性を示すグラフであり； 第２図は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび対照化
合物の用量応答活性を示す棒グラフである。
発明の詳細な説明 本発明の目的に従って、増大したヌクレアーゼ耐性、
相補鎖に対する増大した結合親和性を兼ね備え、かつRN
ase Hに対する基質である、新規なオリゴヌクレオチド
および高分子が提供される。本発明のオリゴヌクレオチ
ドおよび高分子は複数のヌクレオチド、ヌクレオシドま
たは核酸塩基サブユニットから組み立てられる。本発明
のオリゴヌクレオチドおよび高分子は、オリゴヌクレオ
チドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官能化されたヌ
クレオチド、ヌクレオシドまたは核酸塩基単位を少なく
とも１個含む。さらに本発明の特定の形態においては、
少なくとも若干のヌクレオチドまたはヌクレオシド単位
が、相補的核酸鎖に対するオリゴヌクレオチドまたは高
分子の結合親和性を高める置換基を保有する。さらに少
なくとも若干のヌクレオチド単位が２′−デオキシ−er
ythro−ペントフラノシル基をそれらの糖部分として含
む。
上記のガイドラインに関連して、本発明のオリゴヌク
レオチドのヌクレオチド単位、あるいはサブユニットと
呼ばれるものはそれぞれ、“天然”または“合成”部分
のいずれであってもよい。従って本発明に関してまずた
とえば“オリゴヌクレオチド”という語は、複数の結合
したヌクレオチド単位から形成されるポリヌクレオチド
を意味する。ヌクレオチド単位は固有のヌクレオシド間
ホスホジエステル結合により互いに結合する。ヌクレオ
チド単位は天然の塩基およびペントフラノシル糖基から
形成される。従って“オリゴヌクレオチド”という語は
事実上、天然種または天然のヌクレオチド単位から形成
される合成種を包含する。
本発明のオリゴヌクレオチドは修飾されたサブユニッ
トをも含むことができる。修飾は、ヌクレオチドの塩基
部分、ヌクレオチドの糖部分、または１つのヌクレオチ
ドを次のものに連結する結合に行うことができる。さら
にヌクレオシド単位はヌクレオシド間リン酸結合に代わ
る連結基を介して結合することもできる。この種類の高
分子はオリゴヌクレオチドとして認識されている。これ
らのオリゴヌクレオチドにおいて、結合には−Ｏ−CH2
−CH2−Ｏ−結合（すなわちエチレングリコール結
合）、および下記の米国特許出願明細書に示される他の
新規な結合が含まれる：出願番号566,836、1990年８月1
3日出願、名称：新規なヌクレオシド類似体；出願番号7
03,619、1991年５月21日出願、名称：主鎖修飾されたオ
リゴヌクレオチド類似体；および出願番号903,160、199
2年６月24日出願、名称：異種原子によるオリゴヌクレ
オチド結合。他の修飾は糖に、塩基に、またはヌクレオ
チドのリン酸塩に行うことができる。代表的な修飾は下
記に示されている：米国特許出願明細書：出願番号463,
358、1990年１月11日出願、名称:RNA活性を検出および
調節するための組成物および方法；出願番号566,977、1
990年８月13日出願、名称：遺伝子発現を検出および調
節する糖修飾されたオリゴヌクレオチド；出願番号558,
663、1990年７月27日出願、名称：新規なポリアミン結
合オリゴヌクレオチド；出願番号558,806、1991年７月2
7日出願、名称：遺伝子発現を検出および調節する、ヌ
クレアーゼ耐性のピリミジン修飾オリゴヌクレオチド；
ならびに国際特許出願US91/00243号明細書、1991年１月
11日出願、名称:RNA活性を検出および調節するための組
成物および方法。これらはすべて本出願と同一出願人に
よるものである。上記特許出願明細書それぞれを記載を
本明細書に参考として引用する。
従ってオリゴヌクレオチドという語は、天然の構造
体、ならびに天然の塩基、天然の糖および天然のホスホ
ジエステル結合と同様に機能する、非天然または“修飾
された”構造体−−修飾された糖部分、修飾された塩基
部分、または修飾された糖結合部分を含む−−を包含す
るものとする。従ってオリゴヌクレオチドは、変化した
塩基部分、変化した糖部分、または変化した糖間結合を
有しうる。これらの例には下記のものが含まれる：ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホ
ネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホ
スホロセレネート、およびホスホロジセレネート型のヌ
クレオシド間結合など、ホスホジエステル型のヌクレオ
シド間結合の代わりに用いられるもの；デアザまたはア
ザプリンおよびピリミジンなど、天然のプリンおよびピ
リミジン塩基の代わりに用いられるもの;5位または６位
に置換基をもつピリミジン塩基;2、６または８位に、変
化した、または置き換えた置換基をもつプリン塩基；あ
るいは２′位に置換気をもつ糖、糖の水素原子１個もし
くは２個以上の置換体、または炭素環式もしくは非環式
の糖類似体。それらは本発明の精神と一致する他の修飾
を含んでもよい。それらのオリゴヌクレオチドは、天然
のオリゴヌクレオチド（または天然の系列に沿った合成
オリゴヌクレオチド）と機能的に互換性であるが、天然
構造体との相異点を１または２以上もつものであると述
べるのが最も良い。これらのオリゴヌクレオチドはすべ
て、それらが目的とするRNAまたはDNA鎖の構造を効果的
に模倣する機能をもつ限り、本発明に包含される。
本発明の好ましい１形態においては、ヌクレアーゼ耐
性はホスホロチオエート型のヌクレオシド間結合を用い
ることにより達成される。本発明者らはワルダー（Wald
er）ら（前掲）の報告と異なり、ホスホジエステル結合
からホスホロチオエート結合へのヌクレオシド間結合の
修飾が種々の３′−エキソヌクレアーゼを含有するウシ
胎仔血清などの系中でヌクレアーゼ耐性をもつことを見
出した。
ブリル（Brill）ら,J.Am.Chem.Soc.1991,113,3972
は、ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドもヌクレ
アーゼ耐性を示すことを最近報告している。彼らは、ホ
スホロジチオエートオリゴヌクレオチドが相補的デオキ
シオリゴヌクレオチドと結合し、RNase Hを刺激し、か
つlacリプレッサーおよびcroリプレッサーの結合を刺激
することも報告している。これらの特性からみて、ホス
ホロジチオエート結合も本発明のオリゴヌクレオチドの
ヌクレアーゼ耐性を高めるのに有用であろう。
ヌクレアーゼ耐性はさらに、オリゴヌクレオチドの
３′末端にドデカノール基を結合させるサイソン−ベー
モララス（saison−Behmoraras）ら（前掲）の方法によ
り、オリゴヌクレオチドの３′末端に基を導入すること
によって達成することができる。増大したヌクレアーゼ
耐性を付与するための他の適切な基には下記のものが含
まれる：ステロイド分子および他の脂質、リポーター分
子、コンジュゲート、および非芳香族親油性分子：非環
式炭化水素、飽和および不飽和脂肪酸、ろう、テルペン
を含む、ならびに脂肪族多環式炭化水素：アダマンタン
およびバックミンスターフラーレン類（buckminsterful
lerrenes）を含む。ステロイド分子SDWその目的に特に
有用なものは、コール酸、デオキシコール酸およびデヒ
ドロコール酸を含む胆汁酸である。他のステロイドに
は、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、お
よびコレステロール、さらにカチオン性ステロイド、た
とえばコルチゾン環の３位に二重結合を介して結合した
トリメチルアミノメチルヒドラジド基をもつコルチゾン
が含まれる。特に有用なレポーター分子は、ビオチンお
よびフルオレセイン染料である。これらの基を３′末端
ヌクレオチドの２′ヒドロキシ基または３′ヒドロキシ
基に直接に、または適宜なコネクターを用いて、下記に
記載の方法で結合させることができる：米国特許出願第
782,374号明細書、1991年10月24日出願、名称：改良さ
れた取り込み特性その他の特性を備えたオリゴヌクレオ
チド誘導体、本出願と同一の出願人、その内容全体を本
明細書に参考として引用する。
本発明化合物の５′末端に官能基を結合させること
も、ヌクレアーゼ耐性に寄与しうる。それらの基には、
有益な薬力学的または薬動力学的特性を示すアクリジン
基（これはインターカレーター（挿入剤）としても作用
する）または他の基が含まれる。本発明に関して薬力学
的特性を示す基には、オリゴヌクレオチドの取り込みを
向上させ、分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を高
め、および／またはRNAとの配列特異性ハイブリッド形
成を増強する基が含まれる。本発明に関して薬動力学的
特性を示す基には、オリゴヌクレオチドの取り込み、分
布、代謝または分泌を向上させる基が含まれる。
さらにヌクレアーゼ耐性は、前記の−Ｏ−CH2−CH2−
Ｏ−結合、および同様な米国特許出願第566,836、703,6
19および903,160号明細書に示される結合を用いた場合
に付与されると予想される。これらの種類の結合はヌク
レアーゼの天然の基質である天然のリン酸エステルを含
む主鎖を用いないからである。ホスホロチオエートその
他のヌクレアーゼ耐性−ヌクレオチド間結合を用いるこ
とにより本発明のオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐
性が付与された場合、それらの結合はそれぞれのヌクレ
オチド間部位にあるであろう。他の形態においては、す
べてではないヌクレオチド間結合が修飾されてホスホロ
チオエートその他のヌクレアーゼ耐性結合になるであろ
う。
本発明者は、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオ
チドサブユニット上に置換基を導入することにより本発
明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めうることを
見出した。好ましい置換基は２′置換基、すなわち本発
明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットの
糖部分の２′位に位置する置換基である。現在好ましい
置換基には、２′−フルオロ、２′−アルコキシ、２′
−アミノアルコキシ、２′−アリルオキシ、２′−イミ
ダゾール−アルコキシ、および２′−ポリ（エチレンオ
キシド）が含まれるが、これらに限定されない。アルコ
キシおよびアミノアルコキシ基は、一般に低級アルキル
基、特にC1−C9アルキルを含む。ポリ（エチレングリコ
ール）は構造式（Ｏ−CH2−CH2）ｎ−Ｏ−アルキルのも
のである。特に好ましい置換基は、２′−フルオロ、
２′−メトキシ、２′−エトキシ、２′−プロポキシ、
２′−アミノプロポキシ、２′−イミダゾールプロポキ
シ、２′−イミダゾールブトキシ、および２′−アリル
オキシ基である。
結合親和性は、本発明のオリゴヌクレオチドを構成す
るヌクレオチド単位中に特定の修飾された塩基を用いる
ことによって高めることもできる。このような修飾され
た塩基には、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６
およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン
が含まれる）が含まれる。他の修飾されたピリミジンお
よびプリン塩基が、相補的核酸鎖へのオリゴヌクレオチ
ドの結合親和性を高めるものと期待される。
２′−置換基の使用は、本発明の置換オリゴヌクレオ
チドの結合親和性を高める。公表された研究：カワサキ
およびクック（Kawasaki,Cook）ら、２′−dRIBO−Ｆ修
飾オリゴヌクレオチドの合成および生物物理学的研究、
核酸療法に関する会議、フロリダ州クリアウォーター、
1991年１月13日、において、本発明者はオリゴヌクレオ
チドの置換されたヌクレオチド単位当たり1.6℃の結合
親和性増大を報告した。これはオリゴヌクレオチドのヌ
クレオチド５個上に置換基として２′−デオキシ−２′
−フルオロ基をもつ15mer ホスホジエステルオリゴヌ
クレオチドについては、非置換オリゴヌクレオチドに匹
敵する。11個のオリゴヌクレオチドがこの２′−デオキ
シ−２′−フルオロ基をもつ場合、結合親和性は置換ヌ
クレオチド単位当たり1.8℃増大した。
この同じ研究において、15mer ホスホジエステルオ
リゴヌクレオチドを対応するホスホロチオエート類似体
に誘導した。15mer ホスホジエステルオリゴヌクレオ
チドをそのホスホロチオエート類似体と比較すると、ホ
スホロチオエート類似体は15mer ホスホジエステルオ
リゴヌクレオチドの結合親和性の約66％の結合親和性を
もつにつぎなかった。言い換えると、オリゴヌクレオチ
ドをそのホスホロチオエート類似体に誘導した際に結合
親和性が失われた。しかし２′−デオキシ−２′−フル
オロ置換基が15mer ホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドのヌクレオチドのうち11個に導入されると、15me
r ホスホジエステルオリゴヌクレオチドをそのホスホ
ロチオエート類似体に誘導することにより見られた低下
が大幅に克服された。この化合物、すなわち11個のヌク
レオチドが２′−デオキシ−２′−フルオロ基で置換さ
れた15mer ホスホジエステルオリゴヌクレオチドにお
いては、結合親和性は置換基当たり2.5℃増大した。こ
の研究においては、被験オリゴヌクレオチドに対して相
補的なRNA標的のRNase H酵素開裂を始動させる２′−デ
オキシ−erythro−ペントフラノシル糖を有するヌクレ
オチドの連続した配列を含有させる試みは行わなかっ
た。
標的RNAのRNase H酵素開裂を始動させるためには、本
発明のオリゴヌクレオチドはDNAタイプのセグメントで
あるセグメントまたはサブ配列を保有しなければならな
い。言い換えると、本発明のオリゴヌクレオチドのヌク
レオチドサブユニットのうち少なくとも若干が２′−デ
オキシ−erythro−ペントフラノシル糖部分をもたなけ
ればならない。本発明者は、本発明のオリゴヌクレオチ
ドが標的RNAとハイブリッド形成する際にRNase H活性を
始動させるためには、３個以上の連続した結合２′−デ
オキシ−erythro−ペントフラノシル含有ヌクレオチド
サブユニットを含むサブ配列が必要であるらしいという
ことを見出した。現在では、本発明のオリゴヌクレオチ
ド中に５個以上の連続した２′−デオキシ−erythro−
ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブユニットを含む
ことが好ましい。少なくとも７個の連続した２′−デオ
キシ−erythro−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサ
ブユニットの使用が特に好ましい。
RNase Hの作用メカニズムは、DNA−RNA二重らせんの
認識、およびこれに続くこの二重らせんのRNAの開裂で
ある。前記の背景の章で述べたように、他の当業者はDN
A鎖にヌクレアーゼ安定性を付与するために、修飾され
たDNA鎖を用いた。これを行うために彼らは、向上した
ヌクレアーゼ安定性を付与するが、ハイブリッド形成性
を損なう修飾リン酸結合を用いた。理論に拘束されなく
はないが、本発明者はオリゴヌクレオチド、オリゴヌク
レオシドまたは他の高分子にスイッチング安定性を付与
し、特定の場合には相補鎖への結合の増大をも付与する
特定のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を確認し
た。これらには下記のものが含まれる：帯電および中性
３′−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシド；
帯電および中性２′−５′リン結合により結合したα−
ヌクレオシド；非リン結合により結合したα−ヌクレオ
シド；帯電および中性３′−５′リン結合により結合し
た４′−チオヌクレオシド；帯電および中性２′−５′
リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド；非リ
ン結合により結合した４′−チオヌクレオシド；帯電お
よび中性リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシ
ド；非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；
帯電および中性３′−５′リン結合により結合したβ−
ヌクレオシド；帯電および中性２′−５′リン結合によ
り結合したβ−ヌクレオシド；ならびに非リン結合によ
り結合したβ−ヌクレオシド。それらにはさらに、リン
酸結合に非糖−締結基を介して結合するか、または非リ
ン酸結合に結合した核酸塩基が含まれる。
この場合も特定の理論に拘束されなくはないが、本発
明者はRNase HがRNA鎖を認識し、かつ開裂させるために
満たさなければならない基準を見出した。これらのうち
第１は、開裂部位のRNA鎖はそのヌクレオシドが負の電
荷を保有するリン酸結合を介して結合していなければな
らないということである。さらに開裂部位の糖はβ−ペ
ントフラノシル糖でなければならず、かつ２′エンド配
座でなければならない。この基準に適合する唯一のヌク
レオシド（ヌクレオチド）は、２′−デオキシ−erythr
o−ペントフラノシル β−ヌクレオシドのホスホジエ
ステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、
ホスホロセレネートおよびホスホロジセレネート−ヌク
レオチドである。
上記の基準からみて、２′エンド配座であることが示
された特定のヌクレオシド（たとえばシクロペンチルヌ
クレオシド）ですら、それらはペントフラノシル糖を含
まないのでRNase H活性を始動させないであろう。モデ
ル作成によって、オリゴヌクレオチド ４′−チオヌク
レオシドはエンベロープ形配座ではあるが、２′エンド
配座ではないので、それらもRNase H活性を始動させな
いであろうということが示された。さらにα−ヌクレオ
シドはβ−ペントフラノシル糖と反対の配置をもつの
で、それらもRNase H活性を始動させないであろう。
リン酸結合に非糖−締結基を介して、または非リン酸
結合を介して結合した核酸塩基も、２′エンド配座のβ
−ペントフラノシル糖をもつという基準を満たさない。
従ってそれらはRNase H活性を始動させないと思われ
る。
ここで用いるαおよびβヌクレオシドには、リボフラ
ノシル、デオキシリボフラノシル（２′−デオキシ−er
ythro−ペントフラノシル）、およびアラビノフラノシ
ル−ヌクレオシドが含まれる。４′−チオヌクレオシド
は、ペントフラノシル環の４′環酸素原子がイオウで置
換されたヌクレオシドである。炭素環式ヌクレオシド
は、環酸素が炭素原子で置換されたヌクレオシドであ
る。炭素環式ヌクレオシドには、適宜な核酸塩基が結合
したシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルお
よびシクロヘキシル環（C3−C6−炭素環式）が含まれ
る。上記のαおよびβヌクレオシド、４′−チオヌクレ
オシドおよび炭素環式ヌクレオシドは、それらの複素環
式塩基部分にさらに官能基を、また本発明の高分子中の
ヌクレオシドの結合に用いられていない糖または炭素環
部分の炭素原子上にさらに官能基を含むことができる。
たとえば置換基をプリン複素環の１、２、３、６、７ま
たは８位、ピリミジン複素環の２、３、４、５、または
６位に置くことができる。プリンおよびピリミジン複素
環のデアザおよびアザ類似体を選ぶことができ、または
２′置換された糖誘導体を選ぶことができる。これらの
種類の置換基はすべてヌクレオシドの技術分野で知られ
ている。
α−ヌクレオシドがオリゴヌクレオチドに導入され
た；ガグノー（Gagnor）ら,Nucleic Acids Research198
7,15,10419により報告されるように、それらはRNase H
分解を支持しない。炭素環により修飾されたオリゴヌク
レオチドが多数の研究者により合成され、それにはパー
ボスト（Perbost）ら,Biochemical and Biophysical Re
search Communications1988,165,742;サジ（Sagi）ら,N
ucleic Acids Research 1990,18,2133;およびゼムゾ（S
zemzo）ら,Tetrahedron Letters 1990,31,1463が含まれ
る。４′−チオヌクレオシドは少なくとも25年前から知
られている。最近、４′−チオリボフラノースを経由す
る改良された合成法がセクリスト（Secrist）らにより
報告されている：第10回国際ラウンドテーブル；ヌクレ
オシド、ヌクレオチドおよびそれらの生物学的評価、19
92年９月16−20日、報文のアブストラクト、アブストラ
クト21、ならびに国際特許出願公開US91/02732号明細
書。
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−シュ
ゴレート（suggorate）に導入するためには、αおよび
βヌクレオシド、４′−チオヌクレオシドおよび炭素環
式ヌクレオシドを５′位において（または炭素環式ヌク
レオシドについては５′位に相当する位置）ジメトキシ
トリチル基でブロックし、次いで３′位においてトリチ
ル兼およびホスフィチル化法によりホスフィチル化す
る:9Oligonucleotides and Analogs,A Practical Appro
ach,エックスタイン（Eckstein,F.）編;The Practical
Approach Series,IRLプレス，ニューヨーク,1991に報
告。オリゴヌクレオチドへの導入はDNA合成装置、たと
えばABI 380 Ｂ型合成装置を用い、エックスタイン
（Eckstein）（前掲）に示される合成プロトコールによ
り、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエート、またはメチルホスホネートの形成に適し
た化学を採用して行われるであろう。
ボラノホスフェート結合したオリゴヌクレオチドは、
国際特許出願公開US/06949号明細書に記載の方法により
製造される。ホスホロセレネートおよびホスホロジセレ
ネート結合したオリゴヌクレオチドは、セレノ部分を導
入するための試薬3H−1,2−ベンゾチアセレノ−３−オ
ールを用いて、それらのチオ相当物質と同様な方法で製
造される。この試薬は、セレノチオホスフェートを対応
するＨ−ホスホノチエートジエステルから、ストウィン
スキー（Stawinski）らの報告に従って製造するために
も有用である：第10回国際ラウンドテーブル：ヌクレオ
シド、ヌクレオチドおよびそれらの生物学的評価、1992
年９月16−20日、報文のアブストラクト、アブストラク
ト80。ホスホン酸水素結合したオリゴヌクレオチド−−
ならびにアルキルおよびアリールホスホネート、アルキ
ルおよびアリールホスホトリエステル、ならびにアルキ
ルおよびアリールホスホルアミデート結合したオリゴヌ
クレオチド−−は、国際特許出願公開US88/03842号明細
書に記載の方法により製造される。この特許出願明細書
は、ホスホロチオエートおよびホスホロセレネート結合
したオリゴヌクレオチドの製造についても述べている。
非リン酸主鎖には、カーボネート、カルバメート、シ
リル、スルフィド、スルホン、スルホキシド、スルホネ
ート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルム
アセタール、オキシム、ヒドロキシルアミン、ヒドラジ
ン、ヒドラジド、ジスルフィド、アミド、尿素およびペ
プチド結合が含まれる。ヌクレオシドがカーボネート結
合により連結されたオリゴヌクレオシドは、たとえばマ
ーテス（Mertes）ら,J.Med.Chem.1969,12,154、および
後に他の人々が記載したものに従って製造される。ヌク
レオシドがカルバメート結合により連結されたオリゴヌ
クレオシドは、最初にゲイト（Gait）ら,J.Chem.Soc.Pe
rkin1 1974,1684、および後に他の人々が記載したもの
に従って製造される。ヌクレオシドがシリル結合により
連結されたオリゴヌクレオシドは、オジルビー（Ogilvi
e）ら,Tetrahedron Letters1985,26,4159、およびNucle
ic Acids Research1988,16,4583の記載に従って製造さ
れる。ヌクレオシドがスルフィド結合ならびに付随する
スルホキシドおよびスルホン結合により連結されたオリ
ゴヌクレオシドは、シュナイダー（Schneider）ら,Tetr
ahedron Letters1990,31,335、および他の刊行物、たと
えば国際特許出願公開US89/02323号明細書の記載に従っ
て製造される。
ヌクレオシドがスルホネート結合により連結されたオ
リゴヌクレオシドは、ミュージッキ（Musicki）ら,Org,
Chem.1991,55,4231、およびTetrahedron Letters1991,3
2,2385の記載に従って製造される。ヌクレオシドがスル
ホンアミド結合により連結されたオリゴヌクレオシド
は、キルシェンバウム（Kirschenbaum）ら，第５回サン
ディエゴ会議：核酸：最先端業績、ポスターアブストラ
クト28、1990年11月14−16日の記載に従って製造され
る。ヌクレオシドがホルムアセタールにより連結された
オリゴヌクレオシドは、マッツゥーシ（Matteucci）,Te
trahedron Letters 1990,31,2385、およびベーネマン
（Veeneman）ら,Recueil des Trav.Chim.1990,109,44
9、ならびに国際特許出願公開US90/06110号明細書の記
載に従って製造される。ヌクレオシドがチオホルムアセ
タールにより連結されたオリゴヌクレオシドは、マッツ
ゥーシ（Matteucci）ら,J.Am.Chem.Soc,1991,113,7767;
マッツゥーシ（Metteucci）ら,Nuclesieds ＆ Nucleoti
des1991,10,231、および上記の国際特許出願公開US90/0
6110号明細書の記載に従って製造される。
ヌクレオシドがオキシム、ヒドロキシルアミン、ヒド
ラジンおよびアミド結合により連結されたオリゴヌクレ
オシドは、米国特許出願第703,619号明細書、1991年５
月21日出願、ならびに関連の国際特許出願US92/04292お
よびUS92/04305号明細書、ならびに本発明者自身および
共同研究者により発表された対応する方法：バッスール
（Vasseur）ら,J.Am.Chem.Soc.1992,114,4006、および
デバート（Debart）ら,Tetrahedron Letters1992,33,26
45に記載に従って製造される。ヌクレオシドがモルホリ
ン結合により連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特
許第5,034,506号明細書の記載に従って製造される。
本発明に用いるのに適した他の非リン酸結合には、２
個の隣接異種原子を１個または２個のメチレン部分と共
に含む結合が含まれる。ヌクレオシドがこのような結合
により連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許出願
第903,160号明細書、1992年６月24日出願、の記載に従
って製造される。その記載全体を本明細書に参考として
引用する。
核酸塩基が非リン酸結合により連結され、この非リン
酸結合がペプチド結合である構造単位は、国際特許出願
EP/01219号明細書の方法により製造される。それらの構
造単位を製造する際に用いるのに適した核酸塩基には下
記のものが含まれる：アデニン、グアニン、シトシン、
ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−
アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル
および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの
２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロ−ウ
ラシルおよびシトシン、６−アザ−ウラシル、シトシン
およびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４
−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオー
ルアルキル、ヒドロキシおよび他の８置換されたアデニ
ンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の
５置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグア
ニンならびに他の核酸塩基、たとえば米国特許第3,687,
808号明細書の記載のもの。
ペプチド結合には、アミド結合により連結した５、６
および７原子の長さは主鎖が含まれる。エステル、アミ
ドおよびヒドラジド結合を含む他の同様な非リン酸主鎖
は、国際特許出願公開US86/00544およびUS86/00545号明
細書の方法により製造される。
前記の核酸塩基に関して示した複素環式塩基を含む他
のαおよびβヌクレオシド、４′−チオヌクレオシド、
ならびに炭素環式ヌクレオシドを製造し、そしてそれぞ
れのαおよびβヌクレオシド、４′−チオヌクレオシ
ド、ならびに炭素環式ヌクレオシドに導入することがで
きる。
非糖−締結基には、3,4−ジヒドロキシブチル（参
照：オーガスチンズ（Augustyns）ら,Nucleic Acids Re
search1991,19,2587）およびジヒドロキシプロポキシメ
チル（シュナイダー（Schneider）ら,J.Am.Chem.Soc,19
90,112,453）、ならびに他の直鎖、たとえばC1−C10ア
ルキル、アルケニルおよびアルキニルが含まれる。3,4
−ジヒドロキシブチルおよびジヒドロキシプロピルメチ
ル型の非糖−締結基は、β−ペントフラノシル糖の非環
式フラグメントであるが、それらはRNase H活性化を始
動する作用をもたないであろう。非糖−締結基として好
ましいものは、3,4−ジヒドロキシブチル基である。ジ
ヒドロキシプロピルメチルはハイブリッド形成に際して
オリゴヌクレオチド類似体中に用いた場合、それと相補
的核酸鎖との間の融解温度の抑制を示したからである。
天然核酸の正常な３′−５′ホスホジエステル結合
は、隣接ヌクレオシドのそれぞれの糖間に３個の異種原
子（−Ｏ−Ｐ−Ｏ−）をもつ。５′メチレン基（隣接ヌ
クレオシドの３′側ヌクレオシドの５′CH2）も含める
と、これらのホスホジエステル結合した核酸は４原子の
長さの結合を介して連結していると見ることができる。
２本のβ−オリゴヌクレオチド鎖は互いに逆平行極性
でハイブリッド形成し、一方α−オリゴヌクレオチド鎖
はβ−オリゴヌクレオチド鎖と平行極性でハイブリッド
形成するであろう。ある形態においては、本発明のオリ
ゴヌクレオチドはα−ヌクレオチドから形成された領
域、およびβ−ヌクレオチドから形成された他の領域を
もつであろう。これら２領域が領域間結合を介して連結
する。これらのオリゴヌクレオチドが対応する核酸の相
補的β鎖に結合し、かつα領域の平行極性をβ領域の逆
平行極性と同時に維持するためには、本発明のオリゴヌ
クレオチドのαおよびβ領域間に３′−３′連結または
５′−５′連結が形成されなければならない。３′−
３′連結（５′メチレン部分を含まない）は３原子の長
さの結合を与え、一方５′−５′連結（２個の５′メチ
レン部分を含む）は５原子の長さの結合を与える。
隣接するαおよびβ領域間に４原子の長さの結合が望
まれる本発明の形態については、対称結合性のヌクレオ
シドまたはヌクレオシドスロゲートを用いると、それぞ
れの隣接ヌクレオシド対間に４原子の長さの結合が得ら
れるであろう。このような対称結合性のヌクレオシドス
ロゲートの例は3,3−ビス−ヒドロキシメチルシクロブ
チルヌクレオシドである：本出願人の米国特許出願第80
8,201号明細書、1991年12月13日出願、名称：シクロブ
チルオリゴヌクレオチドスロゲート；その記載全体を本
明細書に参考として引用する。
４原子間隔を達成するための他の適切な結合には、核
酸塩基がω（オメガすなわち最後）位に連結した一群の
１−ヒドロキシル−２−ヒドロキシルメチル−アルカ−
ω−イル型の部分が含まれるであろう。この型の結合の
例は９−（１−ヒドロキシル−２−メチルヒドロキシル
−ペンタ−５−イル）アデニン、９−（１−ヒドロキシ
ル−２−メチルヒドロキシル−ペンタ−５−イル）グア
ニン、１−（１−ヒドロキシル−２−メチルヒドロキシ
ル−ペンタ−５−イル）ウリジン、１−（１−ヒドロキ
シル−２−メチルヒドロキシル−ペンタ−５−イル）シ
トシン、ならびに対応する３、４および７原子類似体で
あり、この場合はペンチル基の代わりにプロピル、ブチ
ルまたはヘキシル基が用いられる。他の例には、４′−
ヒドロキシルメチル基で置換されたペントフラノシル糖
を有するヌクレオシドが含まれる。この場合、５′ヌク
レオシドへの結合は正常な５′−ヒドロキシル部分を介
して正常な結合であり、これに対し３′ヌクレオシドへ
の結合は正常な３′−ヒドロキシル基によるものではな
く、４′−ヒドロキシルメチル部分によるものである。
シクロブチルヌクレオシドと同様に、脂環式部分または
４′−置換ヌクレオシド部分についても、本発明のオリ
ゴヌクレオチドの隣接領域間に４原子の長さの結合が達
成される。
上記の場合と同様に、異なる型の部分から形成された
高分子の隣接領域を含む本発明の形態において、高分子
の２隣接領域それぞれの間に目的とする長さの連結を形
成することができる。対称連結は、隣接領域を形成する
異なる型の部分の両方に対して共有結合を形成しうる連
結部分を選ぶことにより達成される。この連結部分は、
連結部分と異なる型の部分との間に得られる原子の鎖が
同じ長さであるように選ばれる。
本発明のオリゴヌクレオチドまたは高分子は、好まし
くは約10−約30のヌクレオチドまたは核酸塩基サブユニ
ットからなる。これらのオリゴヌクレオチドまたは高分
子が約15−約25のサブユニットからなることが、より好
ましい。自明のとおり、サブユニットは隣接サブユニッ
トにホスホロチオエートその他の結合により適宜結合し
た塩基と糖の組み合わせ、または隣接サブユニットにリ
ンもしくは非リン結合により適宜結合した核酸塩基と適
宜な締結部である。この語は“単位という”語と互換性
をもって用いることができる。先に詳述したように、RN
ase H活性化を始動させるためには、オリゴヌクレオチ
ドまたは高分子の配列全長内に３以上、好ましくは５以
上連続した２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシ
ル含有ヌクレオチドサブユニットのサブ配列がある。
現在好ましいのは、オリゴヌクレオチドまたは高分子
内で２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル含有
ヌクレオチドサブ配列のいずれの側にもオリゴヌクレオ
チドまたは高分子の他のヌクレオシドサブユニットが位
置する状態で、２′−デオキシ−erythro−ペントフラ
ノシル含有ヌクレオチドサブユニットをオリゴヌクレオ
チドまたは高分子の主配列内に導入することである。
本発明のある形態においては、残りのヌクレオチドサ
ブユニットがそれぞれ結合親和性の増大のために２′−
置換基を含む場合、２′−デオキシ−erythro−ペント
フラノシル含有ヌクレオチドサブ配列は、２′−置換基
を含む第１サブ配列のヌクレオチドサブユニットと２′
−置換基を含む第２サブ配列のヌクレオチドサブユニッ
トとの間に位置するであろう。他の構造も可能であり、
これには本発明のオリゴヌクレオチドの３′または５′
末端のいずれにも２′−デオキシ−erythro−ペントフ
ラノシル含有ヌクレオチドサブ配列が位置するものが含
まれる。
本発明の化合物は診断、療法に、ならびに研究用試薬
およびキットとして用いることができる。それらは、有
効量の本発明オリゴヌクレオチドを薬剤学的に許容しう
る適宜な希釈剤またはキャリヤーと混合することによ
り、薬剤組成物中に用いることができる。それらはさら
に、望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病を伴う生
物を治療するために使用しうる。望ましくない蛋白質を
コードする核酸と特異的にハイブリッド形成しうる配列
を含む本発明のオリゴヌクレオチドと、その生物を接触
させることができる。
このような療法処置は、単細胞性の原核生物および真
核生物から多細胞性の真核生物に及ぶ多様な生物に実施
することができる。その遺伝、代謝または細胞性制御の
基本的部分としてDNA−RNA転写またはRNA−蛋白質翻訳
を利用する生物はいずれも、このような療法および／ま
たは予防処置に対して感受性である。多様な生物、たと
えば細菌、酵母、原生動物、藻類、すべての植物、およ
び温血動物を含めたすべての高等動物形態を、この療法
で治療することができる。さらに、多細胞性真核生物の
それぞれの細胞もそれらの細胞活性の内在部分としてDN
A−RNA転写およびRNA−蛋白質翻訳を含むので、このよ
うな療法および／または診断法はそれらの細胞集団に対
しても実施することができる。さらに真核細胞の多くの
細胞小器官、たとえばミトコンドリアおよび葉緑体も、
転写および翻訳のメカニズムを含む。従って単細胞、細
胞集団または細胞小器官も本発明の療法または診断用オ
リゴヌクレオチドで治療しうる生物の定義に包含させる
ことができる。本明細書中で用いる療法とは、疾病状態
の完治、生物、たとえば細菌性、原生動物性もしくは他
の感染生物の死滅、または異常型の、もしくは有害な細
胞増殖もしくは発現の制御を包含するものとする。
例示のために、本発明の化合物をras−ルシフェラー
ゼのトランス活性化によるras−ルシフェラーゼ融合系
に用いた。米国特許出願第07/715,196号明細書（1991年
６月14日出願、名称:RAS癌遺伝子のアンチセンス阻害、
本出願と同一出願人、その内容全体を本明細書に参考と
して引用する）に記載されるように、ras癌遺伝子は原
形質膜の内面に位置する関連蛋白質をコードする遺伝子
群の員子である。ras蛋白質はアミノ酸レベルで高度に
保存され、GTPに高い親和性および特異性で結合し、か
つGTPase活性をもつことが示されている。ras遺伝子産
物の細胞機能は分かっていないが、それらの生化学的特
性、およびそれらとGTP結合蛋白質、またはＧ蛋白質と
して知られている一群のシグナル形質導入性蛋白質との
著しい配列相同性は、ras遺伝子産物が原形質膜を越え
る細胞外シグナルの形質導入に関連する基本的な細胞性
制御機能において基礎的な役割を果たすことを示唆す
る。
Ｈ−ras、Ｋ−rasおよびＮ−rasと表示される３種類
のras遺伝子が哺乳動物ゲノム内に確認されている。哺
乳動物ras遺伝子はそれらのコード配列内の単一点突然
変異によりトランスフォーメーション誘導性を獲得す
る。天然のras癌遺伝子内の突然変異は、コドン12、13
および61に局在する。ヒト腫瘍において最も一般的に検
出される活性化ras突然変異はＨ−ras遺伝子のコドン12
内にあり、その場合GGCからGTCへの塩基の変化がras蛋
白質産物のGTPase制御ドメインにおけるグリシンからバ
リンへの置換を生じる。１個のアミノ酸の変化が正常な
ras蛋白質機能の制御を失わせ、正常に制御された細胞
蛋白質を継続的に活性なものに変換すると考えられる。
このような正常なras蛋白質機能の制御解除が正常な増
殖から悪性増殖へのトランスフォーメーションに関与す
ると思われる。
以下の実施例および方法は本発明の例示であり、本発
明を限定するためのものではない。
実施例１ オリゴヌクレオチドの合成： 非置換および置換オリゴヌクレオチドを、自動DNA合
成装置（アプライド・バイオシステムズ、モデル380B）
でヨウ素による酸化を伴う標準ホスホルアミデート化学
により合成した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドについては、ホスファイト結合の段階的チエーション
（thiation）のために、標準酸化ボトルの代わりにアセ
トニトリル中における3H−1,2−ベンゾジチオール−３
−オン 1,1−ジオキシドの0.2Μ溶液を用いた。チエー
ション待ち段階を68秒に延長し、次いでキャッピング段
階を行った。CPGカラムから開裂させ、濃水酸化アンモ
ニウム中で55℃（18時間）において脱ブロッキングした
のち、オリゴヌクレオチドを0.5M NaCl溶液から2.5容
量のエタノールで２回沈殿させることにより精製した。
20％アクリルアミド、８Μ尿素、454mΜトリス−硼酸緩
衝液、pH＝7.0、中で分析用ゲル電気泳動を行った。オ
リゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートは、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動から80％以上が全長物質であ
ると判定された。
実施例２ 中心βオリゴヌクレオチド領域をフランキングするαオ
リゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチド A.非対称３′−３′および５′−５′結合を含むα−β
混合オリゴヌクレオチド 15merの製造のために、第１領域である４ヌクレオチ
ド長さのαオリゴヌクレオチドを、DNA合成装置でガグ
ノー（Gagnor）ら,Nucleic Acids Research1987,15,104
19の方法により、また、DNA合成装置で実施例１の一般
的プロトコールを用いて製造する。製造は５′方向から
３′方向へ行われる。末端３′ヒドロキシル基を脱保護
する。７ヌクレオチド長さのDNAオリゴヌクレオチドの
正常β領域を、遊離ヒドロキシル基を末端にして３′か
ら５′方向に付加する。次いでさらに４ヌクレオチド長
さのαヌクレオチド領域を３′から３′方向に付加す
る。得られた15merである混合α−β−αオリゴヌクレ
オチドは第１α領域とβ領域の間に３原子３′−３′結
合を含み、かつ第２α領域とβ領域の間に５原子５′−
５′結合を含む。
B.非対称３′−３′および５′−５′結合を含むα−β
混合オリゴヌクレオチド 実施例２−Ａの方法を反復し、ただし中間β領域を普
通の酸化段階の代わりにチエーション段階によるホスホ
ロチオエート領域として付加する。チエーションはビュ
ーケージ試薬（Beaucage Reagent）、すなわち実施例
１の1,2−ベンゾジチオール−３−オン 1,1−ジオキシ
ドを用いて行われる。
C.対称４原子結合を含むα−β混合オリゴヌクレオチド 17merの製造のために、第１領域である４ヌクレオチ
ド長さのαオリゴヌクレオチドをガグノー（Gagnor）
ら,Nucleic Acids Research1987,15,10419の方法により
製造する。製造は５′方向から３′方向へ行われる。末
端３′ヒドロキシル基を脱保護する。単一ヌクレオシド
スロゲート単位である１α−チミジル−３β−ヒドロキ
シメチル−３α−メトキシトリチルオキシメチル−シク
ロブタンアミダイト（前記の米国特許出願808,201号明
細書に従って製造）を、普通の様式で実施例１によりα
−オリゴヌクレオチド領域の末端３′ヒドロキシル基上
に縮合させる。このシクロブチルチミジンヌクレオシド
スロゲートのトリチル（trityl）−ヒドロキシル基ブロ
ッキング基を脱ブロッキングする。７ヌクレオチド領域
のホスホロチオエート、２′−デオキシ−β−ヌクレオ
チド配列を合成装置で付加する。高分子のDNA領域が完
成した時点で、２−ヒドロキシ上の正常ホスホルアミダ
イトとして活性化された１α−チミジル−２β−ヒドロ
キシ−３α−メトキシトリチルオキシメチルシクロブタ
ン単位を、成長しつつある高分子に上記１α−チミジル
−３β−ヒドロキシメチル−３α−メトキシトリチルオ
キシメチル−シクロブタン部分の場合と同じ様式で縮合
させる。ヌクレオチドスロゲート単位のトリチル−ブロ
ッキング基の脱ブロッキング後に、さらに４ヌクレオチ
ド長さのαヌクレオチド領域を付加して高分子を完成さ
せる。得られた高分子の脱ブロッキング、支持体からの
分離、および精製を普通の様式で行う。
実施例３ 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングする２′−置換オリゴヌクレ
オチド領域を含むオリゴヌクレオチド 配列５′GCG TTT TTT TTT TGC G3′の15mer RN
A標的を、普通の方法でRNAプロトコールを用いてDNA合
成装置により製造した。２′−デオキシ領域をフランキ
ングする領域に２′−Ｏ−置換ヌクレオチドを含む一連
のホスホロチオエート−相補的オリゴヌクレオチドを、
文献から既知の製法により製造された２′−Ｏ−置換ヌ
クレオチド前駆物質、すなわち２′−Ｏ−メチル体を用
いて、あるいは国際特許出願US91/05720号または米国特
許出願第566,977もしくは918,362号明細書の方法により
製造する。２′−Ｏ−置換ヌクレオチドはそれらの５′
−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−ホスホルアミダイト
として、普通の方法でDNA合成装置により付加される。
相補的オリゴヌクレオチドは５′CGC AAA AAA AAA
AAA ACG C3′の配列をもつ。２′−Ｏ−置換基はこれ
らのオリゴヌクレオチドのCGCおよびCG領域内に位置し
ていた。以下の２′−Ｏ−置換基を用いる:2′−フルオ
ロ;2′−Ｏ−メチル;2′−Ｏ−プロピル;2′−Ｏ−アリ
ル;2′−Ｏ−アミノプロポキシ;2′−Ｏ−（メトキシエ
トキシエチル）;2′−Ｏ−イミダゾールブトキシ；およ
び２′−Ｏ−イミダゾールプロポキシ。さらに、同じ配
列をホスホジエステルおよびホスホロチオエートの両方
で製造する。合成後に、被験化合物および標的化合物を
融解分析に用いて、それらのTmおよびヌクレアーゼ耐性
を上記で引用した国際特許出願US91/05720号明細書中の
プロトコールにより測定する。被験化合物はRNase Hの
基質ではないのに対し、対応する標的配列は基質である
ことが認められた。これらの被験配列はホスホジエステ
ル型類似体と比較してヌクレアーゼ安定性であり、かつ
標的に対する増大した結合親和性をもつ。
実施例４ 中心２′−デオキシ ３′−５′ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド領域をフランキングする２′−５′
ホスホジエステル オリゴヌクレオチド領域を含むオリ
ゴヌクレオチド 20merオリゴヌクレオチドの製造のために、２′−
５′結合を含むRNAヌクレオチド６個の第１領域を、キ
ールゼク（Kierzek）ら,Nucleic Acids Research1992,2
0,1685の方法で、この文献の一般的プロトコールを用い
てDNA合成装置により製造する。２′−５′結合領域が
完成した時点で、８ヌクレオチド長さの２′−デオキシ
ホスホロチオエート ３′−５′結合DNAオリゴヌクレ
オチドの領域を付加する。次いでさらに６ヌクレオチド
長さの２′−５′結合領域を付加して、混合２′−５′
および３′−５′結合を含むオリゴヌクレオチドを完成
させる。
実施例５ 中心２′−デオキシ ３′−５′ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド領域をフランキングする、ホスホジ
エステル結合により結合したシクロブチルスロゲート
ヌクレオシド領域を含む高分子 20merオリゴヌクレオチドの製造のために、ホスホジ
エステル結合により結合したシクロブチルスロゲートヌ
クレオチド６個の第１領域を、米国特許出願第808,201
号明細書の例38の方法で、この明細書の一般的プロトコ
ールを用いてDNA合成装置により製造する。この領域が
完成した時点で、８ヌクレオチド長さの２′−デオキシ
ホスホロチオエート ３′−５′結合DNAオリゴヌクレ
オチド領域を付加する。次いでさらにシクロブチルスロ
ゲート ヌクレオチド６個の領域を付加して、高分子を
完成させる。
実施例６ 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングする、ホスホジエステル結合
により結合した炭素環式スロゲートヌクレオシド領域を
含む高分子 炭素環式ヌクレオシドをボルトヴィッヒ（Bortwick）
ら,Tetrahedron1992,48,571に引用された総説文献法に
より製造する。得られた炭素環式ヌクレオシドをジメト
キシトリチル−ブロッキング基により普通の方法でブロ
ッキングする。対応するホスホルアミダイトが、米国特
許出願第808,201号明細書の例38の方法で、シクロブチ
ルスロゲートの代わりに炭素環式ヌクレオシドを用いて
製造される。18merオリゴヌクレオチドの製造のため
に、ホスホジエステル結合により結合した炭素環式ヌク
レオシド４個の第１領域を、実施例１のプロトコールに
よりDNA合成装置で製造する。この領域が完成した時点
で、８ヌクレオチド長さの２′−デオキシホスホロチオ
エート ３′−５′結合DNAオリゴヌクレオチドを付加
する。さらに炭素環式ヌクレオチド４個の領域を付加し
て、高分子を完成させる。
実施例７ 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングする４′−チオヌクレオチド
領域を含むオリゴヌクレオチド 実施例６の様式で、４′−チオヌクレオチドの領域を
国際特許出願US91/02732号明細書の方法により製造す
る。次いで正常２′−デオキシホスホロチオエートヌク
レオチドの領域を付加したのち、さらに４′−チオヌク
レオチドの領域を付加する。
実施例８ 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングする、ペプチド核酸領域を含
む高分子 ペプチド核酸の第１領域を国際特許出願EP/01219号明
細書の方法により製造する。ペプチド核酸はＣ末端から
Ｎ末端の方向に、アミン基が保護されたモノマーを用い
て製造される。第１ペプチド領域が完成したのち、末端
アミンのブロッキング基を除去し、得られたアミンをバ
ッスール（Vasseur）ら,J.Am.Ches.Soc.1992,114,4006
の方法により製造された３′−Ｃ−（ホルミル）−
２′,3′−ジデオキシ−５′−トリチルヌクレオチドと
反応させる。このアミンとＣ−ホルミルヌクレオシドの
縮合はバッスール（Vasseur）（前掲）の条件で行わ
れ、中間体オキシム結合が得られる。オキシム結合をバ
ッスール（Vasseur）（前掲）のアルキル化条件でHCHO/
NaBH3CN/AcOHによる還元条件下に還元して、ペプチド核
酸にメチルアルキル化アミン結合を介して結合したヌク
レオシドを得る。次いでこのヌクレオシドから実施例１
のプロトコールにより内部２′−デオキシホスホロチオ
エートヌクレオチド領域を続ける。第２ペプチド領域の
ペプチド合成は、この第２領域の第１ペプチド核酸のカ
ルボキシル末端とDNA領域の最後のヌクレオシドの５′
ヒドロキシとを反応させ、次いでそのヌクレオトド上の
ジメトキシトリチル−ブロッキング基を除去することに
より行われる。結合はピリジン中でDEAを介して行わ
れ、ペプチドとヌクレオシドの間にエステル結合が形成
される。次いで国際特許出願EP/01219号明細書の方法に
よりペプチド合成を続けて、第２ペプチド核酸領域を完
成させる。
実施例９ 中心２′−デオキシホスホロセレネート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングする２′−置換オリゴヌクレ
オチド領域を含むオリゴヌクレオチド 実施例３により２′−Ｏ−メチル置換ヌクレオチドを
用いてフランキング領域を製造し、中心領域にセレノ部
分を導入するために3H−1,2−ベンゾチアセレノ−３−
オールで酸化することにより、オリゴヌクレオチドを製
造する：ストウィンスキー（Stawinski）ら、第10回国
際ラウンドテーブル：ヌクレオシド、ヌクレオチドおよ
びそれらの生物学的評価、1992年９月16−20日、報文の
アブストラクト、アブストラクト20。
実施例10 中心２′−デオキシホスホロジチオエート オリゴヌク
レオチド領域をフランキングする２′−置換オリゴヌク
レオチド領域を含むオリゴヌクレオチド 実施例３により２′−Ｏ−アミノプロポキシ置換ヌク
レオチドを用いてフランキング領域を製造し、ビートン
（Beaton）ら、第５章、オリゴヌクレオチドホスホロジ
チオエートの合成、109頁、Oligonucleotides and Anal
ogs,A Practical Approach、エックスタイン（Eckstei
n,F.）編;The Practical Approach Series、IRLプレ
ス、ニューヨーク、1991、の方法により内部ホスホロジ
チオエート領域を製造して、オリゴヌクレオチドを製造
する。
実施例11 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするボラノホスフェート結合
オリゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチド 実施例３により、国際特許出願公開US/06969号明細書
の方法でフランキングボラノホスフェート領域を製造
し、実施例１の方法で中心２′−デオキシホスホロチオ
エート領域を製造して、オリゴヌクレオチドを製造す
る。
実施例12 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングする、２′−置換メチルホス
ホネート結合したオリゴヌクレオチド領域を含むオリゴ
ヌクレオチド メチルホスホネート結合のフランキングの製造のため
に、実施例３により２−フルオロヌクレオシドを製造
し、次いでヌクレオチドに変換する：ミラー（Miller）
ら、第６章、オリゴ−２′−デオキシリボヌクレオシド
メチルホスホネートの合成、137頁、Oligonucleotides
and Analogs,A Practical Approach、エックスタイン
（Eckstein,F.）編;The Practical Approach Series、I
RLプレス、ニューヨーク、1991、の方法による。中心の
内部ホスホロチオエート領域を実施例１により製造し、
次いでさらに２′−Ｏ−置換メチルホスホネート領域を
付加する。
実施例13 中心２′−デオキシホスホジエステルチミジン オリゴ
ヌクレオチド領域をフランキングする、２′−置換メチ
ルホスホトリエステル結合したオリゴヌクレオチド領域
を含むオリゴヌクレオチド メチルホスホトリエステル結合のフランキング領域の
製造のために、実施例３により２−フルオロヌクレオシ
ドを製造し、次いでミラー（Miller）ら、Biochemistry
1977,16,1988の方法によりヌクレオチドに変換する。
７個の連続チミジンヌクレオチド残基を含む中心の内部
ホスホジエステル領域を実施例１により製造し、次いで
さらに２′−Ｏ−置換メチルホスホトリエステル領域を
付加する。
実施例14 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするヒドロキシルアミン オ
リゴヌクレオシド領域を含む高分子 メチルヒドロキシルアミン結合およびホスホジエステ
ル結合により交互に結合したヌクレオシドの第１フラン
キング領域をバッスール（Vasseur）（前掲）の方法で
製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加
し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキン
グ領域を付加して、高分子を完成させる。
実施例15 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするヒドラジン結合オリゴヌ
クレオシド領域を含む高分子 メチルヒドラジン結合により結合したヌクレオシドの
第１フランキング領域を国際特許出願US92/04294号明細
書の例の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホス
ホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３の
方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を
含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ
る。
実施例16 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするメチルスルフェニル結合
オリゴヌクレオシド領域を含む高分子 メチルスルフェニル結合により結合したヌクレオシド
の第１フランキング領域を国際特許出願US92/04294号明
細書の例の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホ
スホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３
の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合
を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ
る。
実施例17 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするエタンジイルイミノ結合
オリゴヌクレオシド領域を含む高分子 1,2−エタンジイルイミノ結合により結合したヌクレ
オシドの第１フランキング領域を国際特許出願US92/042
94号明細書の例の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオ
キシホスホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実
施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同
じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完
成させる。
実施例18 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするメチレンホスホネート結
合オリゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチド メチレンホスホネート結合により結合したヌクレオシ
ドの第１フランキング領域を国際特許出願US92/04294号
明細書の例の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシ
ホスホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例
３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結
合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成さ
せる。
実施例19 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするニトリロメチリジン結合
オリゴヌクレオシド領域を含む高分子 ニトリロメチリジン結合により結合したヌクレオシド
の第１フランキング領域を米国特許出願第903,160号明
細書の例の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホ
スホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３
の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合
を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ
る。
実施例20 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするカーボネート結合オリゴ
ヌクレオシド領域を含む高分子 カーボネート結合により結合したヌクレオシドの第１
フランキング領域をメルテス（Mertes）ら,J.Med.Chem.
1969,12,154の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキ
シホスホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施
例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ
結合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成
させる。
実施例21 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするカルバメート結合オリゴ
ヌクレオシド領域を含む高分子 カルバメート結合により結合したヌクレオシドの第１
フランキング領域をゲイト（Gait）ら,J.Chem.Soc.Perk
in 1 1974,1684の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオ
キシホスホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実
施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同
じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完
成させる。
実施例22 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするシリル結合オリゴヌクレ
オシド領域を含む高分子 シリル結合により結合したヌクレオシドの第１フラン
キング領域をオジルビー（Ogilvie）ら,Nucleic Acids
Research 1988,16,4583の方法で製造する。中心２′−
Ｏ−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレオチド
領域を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１
領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高
分子を完成させる。
実施例23 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするスルフィド、スルホキシ
ドおよびスルホン結合オリゴヌクレオシド領域を含む高
分子 スルフィド、スルホキシドおよびスルホン結合により
結合したヌクレオシドの第１フランキング領域をシュナ
イダー（Schneider）ら,Tetrahedron Letters 1990,3
1,335の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホス
ホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３の
方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を
含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ
る。
実施例24 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするスルホネート結合オリゴ
ヌクレオシド領域を含む高分子 スルホネート結合により結合したヌクレオシドの第１
フランキング領域をミュージッキ（Musicki）ら,J.Org.
Chem.1991,55,4231の方法で製造する。中心２′−Ｏ−
デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレオチド領域
を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域
と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子
を完成させる。
実施例24 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするスルホンアミド結合オリ
ゴヌクレオシド領域を含む高分子 スルホンアミド結合により結合したヌクレオシドの第
１フランキング領域をキルシェンバウム（Kirschenbau
m）ら，第５回サンディエゴ会議：核酸：最先端業績、
ポスターアブストラクト28、1990年11月14−16日の方法
で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホスホロチオエー
ト オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付
加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキ
ング領域を付加して、高分子を完成させる。
実施例25 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするホルムアセタール結合オ
リゴヌクレオシド領域を含む高分子 ホルムアセタール結合により結合したヌクレオシドの
第１フランキング領域をマッツゥーシ（Matteucci）,Te
trahedron Letters 1990,31,2385、またはベーネマン
（Veeneman）ら,Recueil des Trav.Chim.1990,109,449
の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホスホロチ
オエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法に
より付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフ
ランキング領域を付加して、高分子を完成させる。
実施例26 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするチオホルムアセタール結
合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子 チオホルムアセタール結合により結合したヌクレオシ
ドの第１フランキング領域をマッツゥーシ（Matteucc
i），ら,J.Am.Chem.Soc.1991,113,7767;マッツゥーシ
（Matteucci）ら,Nuclesieds ＆ Nucleotides 1991,1
0,231の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホス
ホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３の
方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を
含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ
る。
実施例27 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするモルホリン結合オリゴヌ
クレオシド領域を含む高分子 モルホリン結合により結合したヌクレオシドの第１フ
ランキング領域を米国特許第5,034,506号明細書の方法
で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホスホロチオエー
ト オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付
加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキ
ング領域を付加して、高分子を完成させる。
実施例28 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするアミド結合オリゴヌクレ
オシド領域を含む高分子 アミド結合により結合したヌクレオシドの第１フラン
キング領域を米国特許出願第703,619号明細書、1991年
５月21日出願、および関連の国際特許出願US92/04305号
明細書の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホス
ホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３の
方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を
含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ
る。
実施例29 中心２′−デオキシホスホジエステル オリゴヌクレオ
チド領域をフランキングするエチレンオキシド結合オリ
ゴヌクレオシド領域を含む高分子 エチレンオキシド結合により結合したヌクレオシドの
第１フランキング領域を国際特許出願US91/05713号明細
書の方法で製造する。３ヌクレオチド長さの中心２′−
Ｏ−デオキシホスホジエステル オリゴヌクレオチド領
域を実施例１の方法により付加し、次いでさらに第１領
域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分
子を完成させる。
実施例30 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングする3,4−ジヒドロキシブチ
ル結合核酸塩基領域を含む高分子 3,4−ジヒドロキシブチル結合により結合した核酸塩
基の第１フランキング領域をオーガスチンズ（Augustyn
s）ら,Nucleic Acids Research 1991,19,2587の方法で
製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加
し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキン
グ領域を付加して、高分子を完成させる。
実施例31 中心２′−デオキシホスホロチオエート オリゴヌクレ
オチド領域をフランキングするジヒドロキシプロポキシ
メチル結合核酸塩基領域を含む高分子 ジヒドロキシプロポキシメチル結合により結合した核
酸塩基の第１フランキング領域をシュナイダー（Schnei
der）ら,J.Am.Chem.Soc.1990,112,453の方法で製造す
る。９ヌクレオチド長さの中心２′−Ｏ−デオキシホス
ホロチオエート オリゴヌクレオチド領域を実施例３の
方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を
含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ
る。
処理１ Ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の組み立て この研究で述べたras−ルシフェラーゼレポーター遺
伝子をPCR法により組み立てた。オリゴヌクレオチドプ
ライマーが、突然変異（コドン12）および非突然変異
（野生型）ヒトＨ−ras遺伝子双方のエキソン１の５
−′領域をPCRクローン化するためのプライマーとして
用いるために合成された。Ｈ−ras遺伝子鋳型はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC No.4
1000および41001）、マリーランド州ベテスダ、から入
手された。オリゴヌクレオチドPCRプライマー が、突然変異および非突然変異Ｈ−ras遺伝子を鋳型と
して用いる標準PCR反応に使用された。これらのプライ
マーは、Nhe IおよびHind III制限エンドヌクレアーゼ
部位によりフランキングされた、正常および突然変異Ｈ
−rasの配列−53から＋65まで（翻訳開始部位に対し
て）に相当する145塩基対のDNA産物を産生すると予想さ
れる。PCR産物を標準法によりゲル精製し、沈殿させ、
洗浄し、そして水に再懸濁した。
ハエ（P.pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子のクローン
化に用いられるPCRプライマーは、PCR産物がアミノ末端
メチオニン残基−−これらは２個のアミノ酸、すなわち
アミノ末端リシン残基、およびこれに続くロイシン残基
で置き換えられる−−以外の全長蛋白質をコードするよ
うに設計された。ルシフェラーゼ遺伝子のクローン化に
用いたオリゴヌクレオチドPCRプライマーは であり、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を含む市販の
プラスミド（pT3/T7−Luc）（クローンテク）を鋳型と
して用いる標準PCR反応に使用された。これらのプライ
マーは、Hind IIIおよびBssH II制限エンドヌクレアー
ゼ部位によりフランキングされたルシフェラーゼ遺伝子
に相当する約1.9kbの産物を産生すると予想された。こ
のフラグメントを標準法によりゲル精製し、沈殿させ、
洗浄し、そして水に再懸濁した。
ras−ルシフェラーゼ融合リポーター遺伝子のアセン
ブリーを完成させるために、rasおよびルシフェラーゼP
CR産物を適宜な制限エンドヌクレアーゼにより消化し、
ステロイド誘導性マウス乳癌ウイルスプロモーターMMTV
を含む発現ベクター内へ、制限エンドヌクレアーゼNhe
I、Hind III、およびBssH IIを用いて３部リゲーション
によりクローン化した。得られたクローンには、ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子とインフレームで融合したＨ−ra
s5′側配列（−53から＋65まで）が挿入されている。得
られた発現ベクターは、ステロイド誘導性MMTVプロモー
ターの制御下で発現されるras−ルシフェラーゼ融合生
成物をコードする。
処理２ プラスミドDNAによる細胞のトランスフェクション： トランスフェクションは、グリーンバーグ（Grrenber
g,M.E.）,Current Protocols in Molecular Biology
（アウスユーベル（Ausubel）ら編）、ジョン・ワイリ
ー・アンド・サンズ、ニューヨーク、の記載に従って、
下記の点を変更して行われた。HeLa細胞を60mmの皿に５
×105細胞／皿で接種した。合計10μｇのDNAをそれぞれ
の皿に添加し、このうち９μｇはras−ルシフェラーゼ
リポータープラスミドであり、１μｇは構成性ラウス肉
腫ウイルス（RSV）プロモーターの制御下でラットグル
ココルチコイドレセプターを発現するベクターであっ
た。16−20時間後に、3mM EGTAを含有するトリス緩衝
−生理的食塩水［50mMトリス−Cl（pH7.5）,150mM NaC
l］で洗浄することにより、リン酸カルシウム−DNA共沈
物を除去した。次いで10％ウシ胎仔血清を補充した新鮮
な培地を細胞に添加した。この時点で、デキサメタゾン
によるリポーター遺伝子発現の活性化の前に、細胞をア
ンチセンスオリゴヌクレオチドで予備処理した。
処理３ 細胞のオリゴヌクレオチド処理： プラスミドトランスフェクションの直後に、37℃に予
熱したオプチ（Opti）−MEM（ジブコ）で細胞を数回洗
浄した。10μg/mlのＮ［１−（2,3−ジオレイルオキ
シ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロ
リド（DOTMA）（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ、マリーランド州ガイザースバーグ）を含有するオプ
チ−MEM 2mlをそれぞれの皿に添加し、オリゴヌクレオ
チドを直接に添加し、37℃で４時間インキュベートし
た。次いでオプチ−MEMを除去し、オリゴヌクレオチド
を含有する適宜な増殖培地と交換した。この時点で、細
胞を最終濃度0.2μＭのデキサメタゾンで処理すること
により、リポーター遺伝子発現を活性化した。ステロイ
ド処理の12−16時間後に細胞を採取した。
処理４ ルシフェラーゼのアッセイ グリーンバーグ（Grrenberg,M.E.）,Current Protoco
ls in Molecular Biology（アウスユーベル（Ausubel）
ら編）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨ
ーク、の記載に従って、ルシフェラーゼを細胞から界面
活性剤トリトン（Triton）Ｘ−100で細胞溶解すること
により抽出した。ダイナテク（Dynatech）ML1000ルミノ
メーターを用いて、ルシフェリン（シグマ）を625μＭ
になるように添加した際のビークルミネセンスを測定し
た。それぞれの抽出につき、データがアッセイの直線範
囲内で採集されることを保証するために種々の量の抽出
物を用いて多数回、ルシフェラーゼアッセイを実施し
た。
処理５ ras−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドによる阻害 活性Ｈ−rasのコドン−12点の突然変異を標的とする
一連のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チド類似体を、上記の例に記載したras−ルシフェラー
ゼリポーター遺伝子系を用いて試験した。これらは基本
配列およびその基本配列の類似体からなる。基本配列
は、前記米国特許出願07/715,196号明細書に報告された
既知の活性のものである。この基本配列およびその類似
体の両方において、ヌクレアーゼ耐性を付与するために
ヌクレオチドサブユニットはそれぞれホスホロチオエー
ト結合を含んでいた。類似体にはそれぞれ、２′−Ｏ−
メチル置換基および２′−デオキシ−erythro−ペント
フラノシル糖を含むヌクレオチドサブユニットが導入さ
れていた。これらの類似体において、２′−デオキシ−
erythro−ペントフラノシル糖を含むサブユニットのサ
ブ配列は、２′−Ｏ−メチル置換されたサブユニットの
サブ配列により両側をフランクされていた。これらの類
似体は２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシル糖
を含むヌクレオチドのサブ配列の長さに関して互いに異
なっていた。これらのサブ配列の長さは、全ヌクレオチ
ド１−９個でヌクレオチド２個ずつ異なっていた。２′
−デオキシ−erythro−ペントフラノシルヌクレオチド
サブ配列は、活性rasのコドン−12点突然変異の点突然
変異を中心としていた。
これらのオリゴヌクレオチド（すべてホスホロチオエ
ート類似体）の塩基配列、配列参照番号および配列番号
を第１表に示す。この表中で“M"で確認されるヌクレオ
チドは２′−Ｏ−メチル置換基を含み、“d"で確認され
る残りのヌクレオチドは２′−デオキシ−erythro−ペ
ントフラノシルヌクレオチドである。
第１図は、細胞を第１表のホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドで処理した場合の用量応用データを示す。
オリゴヌクレオチド2570は突然変異体（活性）Ｈ−ras
RNAのコドン−12点突然変異を標的とする。他のヌク
レオチドは種々の長さの内部２′−デオキシ−erythro
−ペントフラノシルヌクレオチドとの結合親和性を高め
るために２′−Ｏ−メチル置換基を含む。対照オリゴヌ
クレオチドは20塩基の長さのランダムなホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチド類似体である。結果はオリゴヌ
クレオチドで処理されていないトランスフェクションし
た細胞におけるルシフェラーゼ活性に対する％として表
される。この図が示すように、細胞を漸増濃度をオリゴ
ヌクレオチド2570で処理すると、突然変異形のras−ル
シフェラーゼを発現する細胞におけるras−ルシフェラ
ーゼ活性の用量依存性阻害が生じた。オリゴヌクレオチ
ド2570は、正常形と比較して突然変異体形のras−ルシ
フェラーゼに対して約３倍の選択性を示す。
第１図にさらに見られるように、オリゴヌクレオチド
3980、3985および3984はオリゴヌクレオチド2570が示し
たより大きなras−ルシフェラーゼ活性阻害を示した。
最大の阻害は、７ヌクレオチド長さの２′−デオキシ−
erythro−ペントフラノシルヌクレオチドのサブ配列を
含むオリゴヌクレオチド3985により示された。５ヌクレ
オチド長さの２′−デオキシ−erythro−ペントフラノ
シルヌクレオチドのサブ配列を含むオリゴヌクレオチド
3980がその次に大きな阻害を示し、９ヌクレオチド長さ
の２′−デオキシ−erythro−ペントフラノシルヌクレ
オチドのサブ配列を含むオリゴヌクレオチド3984がそれ
に続いた。
第２図は、棒グラフの形であること以外は第１図と同
様な結果を示す。第２図にはさらにオリゴヌクレオチド
3975およびオリゴヌクレオチド3979の活性が示される。
これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ１および３ヌ
クレオチド長さの２′−デオキシ−erythro−ペントフ
ラノシルヌクレオチドのサブ配列を含む。第２図から明
らかなように、２′−デオキシ−erythro−ペントフラ
ノシルヌクレオチド１個または３個のサブ配列はいずれ
も有意の活性を示さなかった。３ヌクレオチドのサブ配
列オリゴヌクレオチド3979については、最高濃度の用量
において測定可能な活性が示された。
オリゴヌクレオチド2570と比較したオリゴヌクレオチ
ド3980、3985および3984の活性の増大は、それらの化合
物上に位置する２′−Ｏ−メチル置換基によりこれらの
化合物に付与された結合親和性の増大、および２′−デ
オキシ−erythro−ペントフラノシルヌクレオチドのサ
ブ配列がヌクレオチドの主配列内に導入されたことによ
りこれらの化合物に付与されたRNaseH活性化に起因す
る。本発明の活性化合物と対称的に、活性オリゴヌクレ
オチド2570、3980、3985および3984のものと等しいが、
本発明の活性オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート
結合の代わりにホスホジエステル結合を含む配列が活性
を示さなかった点に注目すると興味深い。これは、これ
らのホスホジエステル化合物がそれらのホスホジエステ
ル化合物を分解するヌクレアーゼに対する基質であり、
従ってそれらが潜在的にRNase Hを活性化するのを阻止
することに起因する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ (72)発明者 モニア，ブレット・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，グラナダ・ウェイ 2412 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうる
    ヌクレオチド単位の配列を含むオリゴヌクレオチドであ
    って： 少なくとも１個の前記ヌクレオチド単位が前記オリゴヌ
    クレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官能化さ
    れており； 少なくとも１個の前記ヌクレオチド単位が、フルオロ、
    C2−C9アルコキシ、C1−C9アミノアルコキシ、アリルオ
    キシ、イミダゾールアルコキシまたはポリ（エチレング
    リコール）である２′−置換基を保有し、前記置換基保
    有ヌクレオチドは前記ヌクレオチド単位の配列内に連続
    して位置して第１のヌクレオチド単位サブ配列を形成
    し；かつ 前記ヌクレオチド単位の少なくとも４個が２′−デオキ
    シ−エリトロ−ペントフラノシル糖部分を有し、前記
    ２′−デオキシ−エリトロ−ペントフラノシルヌクレオ
    チド単位がヌクレオチド単位の前記配列内に連続して位
    置して前記第１のヌクレオチドサブ配列に隣接するヌク
    レオチドサブ配列を形成する； ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】１−約８個の前記ヌクレオチド単位が前記
    相補鎖への前記オリゴヌクレオチドの結合親和性を高め
    る置換基を保有し、前記置換基を保有するヌクレオチド
    単位がヌクレオチド単位の前記配列内に連続して位置
    し；かつ 少なくとも５個の前記ヌクレオチド単位が２′−デオキ
    シ−エリトロ−ペントフラノシル糖部分を有し、前記少
    なくとも５個の２′−デオキシ−エリトロ−ペントフラ
    ノシル−ヌクレオチド単位がヌクレオチド単位の前記配
    列内に連続して位置する、請求の範囲第１項に記載のオ
    リゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうる
    ホスホロチオエートヌクレオチドの配列を含むオリゴヌ
    クレオチドであって： 複数の前記ヌクレオチドがフルオロ、C2−C9アルコキ
    シ、C1−C9アミノアルコキシ、アリルオキシ、イミダゾ
    ールアルコキシまたはポリ（エチレングリコール）であ
    る２′−置換基を保有し、前記置換基保有ヌクレオチド
    はヌクレオチド単位の前記配列内に連続して位置して第
    １のヌクレオチド単位サブ配列を形成し；かつ 前記ヌクレオチドの少なくとも４個が２′−デオキシ−
    エリトロ−ペントフラノシル糖部分を有し、前記２′−
    デオキシ−エリトロ−ペントフラノシルヌクレオチド単
    位がヌクレオチド単位の前記配列内に連続して位置して
    前記第１のヌクレオチドサブ配列に隣接するヌクレオチ
    ドサブ配列を形成する； ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】前記２′−置換基がフルオロ、C2−C9アル
    コキシ、C1−C9アミノアルコキシまたはアリルオキシで
    ある、請求の範囲第３項に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】さらに複数の、２′−置換基を保有する前
    記ヌクレオチドを含み；かつ前記２′−デオキシ−エリ
    トロ−ペントフラノシルヌクレオチドが前記オリゴヌク
    レオチド内で前記２′−置換基を保有するヌクレオチド
    基の群の間に位置する、請求の範囲第３項に記載のオリ
    ゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】前記置換基を保有するヌクレオチドが前記
    オリゴヌクレオチドの３′末端または５′末端のいずれ
    か一方に位置する、請求の範囲第３項に記載のオリゴヌ
    クレオチド。
  7. 【請求項７】核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうる
    ホスホロチオエートヌクレオチドの配列を含むオリゴヌ
    クレオチドであって： 前記ヌクレオチドの第１の部分が２′−デオキシ−２′
    −フルオロ、２′−エトキシ、２′−プロポキシ、２′
    −アミノプロポキシ、または２′−アリルオキシ−ペン
    トフラノシル糖部分を有し；かつ 前記ヌクレオチドの他の部分が前記第１の部分に隣接し
    ており、少なくとも４個の２′−デオキシ−エリトロ−
    ペントフラノシル糖部分を有する； ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】前記ヌクレオチドの前記第１の部分が前記
    オリゴヌクレオチドの３′末端または５′末端のいずれ
    かに位置する、請求の範囲第７項に記載のオリゴヌクレ
    オチド。
  9. 【請求項９】２′−デオキシ−２′−フルオロ、２′−
    エトキシ、２′−プロポキシ、２′−アミノプロポキ
    シ、または２′−アリルオキシ−ペントフラノシル糖部
    分を有する前記ヌクレオチドの追加部分を含み；かつ 前記ヌクレオチドの前記他の部分が前記オリゴヌクレオ
    チド内で前記ヌクレオチドの前記第１の部分と前記ヌク
    レオチドの前記追加部分との間に位置する、 請求の範囲第８項に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】望ましくない蛋白質産生を特色とする疾
    病を伴うヒトを除く生物の治療方法であって、前記生物
    を請求項１記載のオリゴヌクレオチドと接触させること
    を含む方法。
  11. 【請求項１１】薬剤学的に有効な量の請求項１記載のオ
    リゴヌクレオチド、および薬剤学的に許容しうる希釈剤
    またはキャリヤーを含む薬剤組成物。
  12. 【請求項１２】配列特異性核酸のインビトロ修飾方法で
    あって、RNaseHおよび前記核酸を含有する被験溶液を請
    求項１記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含
    む方法。
  13. 【請求項１３】ヒトを除く生物においてハイブリッド形
    成およびRNaseH活性化を同時に増大させる方法であっ
    て、前記生物を請求項１記載のオリゴヌクレオチドと接
    触させることを含む方法。
  14. 【請求項１４】前記第１の領域または第２の領域のヌク
    レオチド単位がホスホロチオエート結合により結合され
    ている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】前記ポリ（エチレングリコール）が式：
    （Ｏ−CH2−CH2）−Ｏ−アルキルを有する、請求項１ま
    たは３に記載のオリゴヌクレオチド。
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