JP2023554379A - 組換えｃｄ３結合タンパク質及びそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、このような結合タンパク質をコードする核酸、このような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、Ｔ細胞の疾患局所的活性化の方法における使用、並びにヒトを含む哺乳動物における感染症又は癌などの疾患の治療方法に関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国特許出願第６３／１２６，３５６号、２０２０年１２月２２日に出願された欧州特許第２０２１６７０５号、及び２０２１年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１８２，３９４号に対する優先権の利益を主張するものである。これらの特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国特許出願第６３／１２６，３５６号、２０２０年１２月２２日に出願された欧州特許第２０２１６７０５号、及び２０２１年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１８２，３９４号に対する優先権の利益を主張するものである。これらの特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、このような結合タンパク質をコードする核酸、このような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、Ｔ細胞の疾患局在化活性化の方法における使用、並びにヒトを含む哺乳動物における感染症又は癌などの疾患の治療方法に関する。
Ｔ細胞は、適応免疫応答において重要な役割を果たし、感染細胞又は癌細胞中の異種タンパク質を特異的に認識する。この認識は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される異種タンパク質抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して行われる。ＴＣＲリガンドは、典型的には、比較的弱く結合するが、少数のリガンドであっても、Ｔ細胞を完全に活性化するのに十分である（Ｂｉｒｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ；１１１（４９）：１７５７６－８１（２０１４）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ；１６：５２３－４４（１９９８））。Ｔ細胞受容体は、それ自体ではシグナル伝達しないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を集合的に形成するＣＤ３εγ及びＣＤ３εδヘテロ二量体並びにＣＤ３ζζホモ二量体を典型的に含むマルチサブユニットシグナル伝達器と非共有結合する。免疫適応応答におけるその重要な役割に起因して、この多重タンパク質ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、癌免疫療法における新しい治療ツールの開発のために顕著な注目を集めている。これらのツールの中には、Ｔ細胞エンゲージャがある。
Ｔ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）は、例えば腫瘍細胞上の標的抗原、及びＴ細胞上のＴＣＲ／ＣＤ３複合体に同時に結合し、正常なＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用を迂回することによってＴ細胞活性化を誘発するタンパク質である（Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ；１５４：１０２－１１７（２０１９））。ＴＣＥの例は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子（Ａｍｇｅｎ）である。
現在、Ｔ細胞エンゲージャは、典型的には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の定常成分（例えば、ＣＤ３）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対し指向した二重特異性抗体又は抗体フラグメントの形態を有する。しかしながら、これらのＴ細胞結合性治療ツールは、製造コストが高いこと、複数の病気関連抗原を標的とすることができないことなどのいくつかの欠点を提示する一方でまた、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ；６（１）：５６（２０１８）；Ｌａｂｒｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ；１８（８）：５８５－６０８（２０１９））及びオンターゲット／オフ腫瘍毒性（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；５５（２０）：４５８６－４５９３（１９９５）；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．；４２（３）；１４１－１５０（１９９６））などの特定の重篤な副作用を引き起こすリスクを抱えている例えば、ＥＧＦＲを標的とするＴＣＥが非ヒト霊長類において試験され、低レベルの抗原を発現する正常組織との結合に関する安全性の知見が得られた（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ；１０７（２８）：１２６０５－１０（２０１０））。更に、ＨＥＲ標的化ＴＣＥの高親和性ＣＤ３結合剤は、二次リンパ組織に優先的に分布し、全身曝露を減少させることが示された（Ｍａｎｄｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．；１７（４）：７７６ ＬＰ－７８５（２０１８））。抗体ベースのＴ細胞エンゲージャは、天然のＴＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用と比較して、ＣＤ３に対して１０００倍超高い親和性を示すことが多い（（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ；１８２：１６１－７５（２０１８）；国際公開第２０１４／１６７０２２号；Ｊｕｎｎｔｉｌａ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；１９：５５６１－７１（２０１４）；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｕｇ．；１５（１３７）：１０９７－１００（１９８６））。この高い親和性は、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅の点でより低い効率と相関している（Ｂｏｒｔｏｌｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２；１１：３１０２－３１０７（２００２）；Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ；１５４：１０２－１１７（２０１９）；Ｍａｎｄｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．；１７（４）：７７６ ＬＰ－７８５（２０１８）；Ｖａｆａ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；１０：４４６（２０２０））。
したがって、Ｔ細胞エンゲージャフォーマットにおいて使用されるのに好適な有益な特性を有する新規なＣＤ３特異的結合タンパク質、並びにＣＤ３特異的結合から利益を得る、癌及び感染症を含む疾患の治療のための治療アプローチが依然として必要とされている。
本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質を提供する。更に提供されるのは、疾患関連抗原（ＤＡＡ）、例えば感染関連抗原（ＩＡＡ）、好ましくはウイルス関連抗原（ＶＡＡ）、又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して結合特異性を有する１つ以上の結合剤、好ましくはアンキリン反復ドメイン（これらは、結合タンパク質によるＴ細胞のＤＡＡ依存性活性化を促進する）に連結されたそのような結合タンパク質である。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、及びそのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、Ｔ細胞の局在化活性化、例えば、腫瘍局在化又は感染局在化活性化のための方法における、及びヒトを含む哺乳動物における感染症、好ましくはウイルス感染症又は癌などの疾患を治療する方法における、そのような結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の使用を提供する。
本出願人は、Ｔ細胞エンゲージャ医薬において使用されるのに好適であり、有益な特性を有するＣＤ３特異的結合ドメインを設計、生成及び選択するために、ひたむきな研究を行った（下記参照）。複雑なスクリーニングプロセスとそれに続く数ラウンドの親和性成熟を合理的設計と組み合わせた結果として、４つのＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質、すなわちＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（配列番号１）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（配列番号２）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（配列番号３）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４（配列番号４）を操作した。これらの組換え結合タンパク質は全て、ＣＤ３及び／又はＴ細胞に対して異なる結合親和性を示しながら、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む。結合タンパク質は、標的化されたＴ細胞活性化を達成するのに十分に高く、同時に、有害作用（例えば、過剰なＴ細胞活性化によって引き起こされる）のリスクが低減されるように比較的低い、ＣＤ３及び／又はＴ細胞に対する結合親和性を有する。これらの組換え結合タンパク質は、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）を含む機能的ＴＣＥ分子を形成するために、１つ以上のＤＡＡ特異的結合剤に連結されるのに好適であることが見出された。したがって、本発明の結合タンパク質は、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含み得る。ＴＣＥフォーマットのそのような結合タンパク質は、腫瘍細胞又は感染細胞などの疾患関連細胞上のそれぞれのＤＡＡの存在に応じて、局在化及び標的化された様式で、免疫系、より具体的にはＴ細胞に結合することができる。ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン（配列番号１、２、３若しくは４又はそれらの変異体）を含む、本発明の結合タンパク質は、したがって、とりわけ、ＴＣＥ薬物候補の生成において、並びにＴ細胞の過剰刺激及び／又は有害作用を回避若しくは低減しながらＴ細胞の効率的な活性化を伴うヒトにおける疾患を治療する方法において使用されるＣＤ３特異的結合タンパク質の「ツールボックス」を表す。
一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供し、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む。一態様では、当該アンキリン反復モジュールは、第１のアンキリン反復モジュールであり、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む。特定の一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。更なる特定の実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。更なる特定の実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該結合タンパク質のいずれかは、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。更なる実施形態では、当該結合タンパク質のいずれかは、２～９００ｎＭ、好ましくは約５～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。更なる実施形態では、当該結合タンパク質に含まれるＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い、好ましくは７０℃より高い融解温度（Ｔm）を有する。更なる実施形態では、当該結合タンパク質に含まれるＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い、好ましくは７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。特定の一実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は２～９００ｎＭ、好ましくは約５～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。特定の一実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃より高い、好ましくは８０℃より高い融解温度（Ｔm）を有し、かつ／又は当該アンキリン反復ドメインは、７５℃より高い、好ましくは８０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有し、及び／又は当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭ、好ましくは約５～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。別の特定の実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の、好ましくは又は約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は２～９００ｎＭ、好ましくは約２５０～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。別の特定の実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、７２℃より高い、好ましくは７７℃より高い融解温度（Ｔm）を有し、かつ／又は当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い、好ましくは７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有し、及び／又は当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の、好ましくは又は約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭ、好ましくは約２５０～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。代替的な特定の実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の、好ましくは又は約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は２～９００ｎＭ、好ましくは約５０～約１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。別の特定の実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い、好ましくは７０℃より高い融解温度（Ｔm）を有し、かつ／又は当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い、好ましくは７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有し、及び／又は当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の、好ましくは又は約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭ、好ましくは約５０～約１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。別の代替実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の、好ましくは又は約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は２～９００ｎＭ、好ましくは約５～約１５０ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。別の特定の実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、７３℃より高い、好ましくは７８℃より高い融解温度（Ｔm）を有し、かつ／又は当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い、好ましくは７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有し、及び／又は当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の、好ましくは又は約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、かつ／又は当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭ、好ましくは約５～約１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。
別の態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該結合タンパク質が、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む、組換え結合タンパク質を提供する。一実施形態では、当該結合剤は、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。更なる実施形態では、当該疾患関連抗原は、感染関連抗原（ＩＡＡ）、好ましくはウイルス関連抗原（ＶＡＡ）である。別の実施形態では、当該疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。本発明の一態様では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインに共有結合又は融合される。特定の一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤は、ペプチドリンカー、好ましくは高プロリン－トレオニンペプチドリンカーを用いて、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインに共有結合される。一実施形態では、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、１～５０個のアミノ酸、好ましくは６～３８個のアミノ酸の長さを有する。好ましい一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
別の態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、組換え結合タンパク質を提供する。一実施形態では、当該半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する結合剤を含む。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該結合剤は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。特定の一実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該結合剤は、配列番号２８～３０のいずれか１つのアミノ酸配列、好ましくは配列番号２９のアミノ酸配列を含む、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該半減期延長部分は、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する、当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
別の態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに、本発明の結合タンパク質又は本発明の核酸と、任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法において使用するための、本発明の結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を提供する。一実施形態では、当該医学的状態は、感染症、好ましくはウイルス感染症である。別の実施形態では、当該医学的状態は、癌である。
別の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＴ細胞の腫瘍局在化活性化の方法であって、当該哺乳動物に本発明の結合タンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。特定の一実施形態では、そのような方法は、腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の結合タンパク質を、腫瘍を有するヒト患者を含む哺乳動物に投与して、腫瘍組織において局在化したＴ細胞活性化をもたらすことを含む。
別の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＴ細胞の感染局在化活性化の方法であって、当該哺乳動物に本発明の結合タンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。特定の一実施形態では、そのような方法は、ウイルス関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の結合タンパク質を、ウイルス感染有するヒト患者を含む哺乳動物に投与して、感染組織において局在化したＴ細胞活性化をもたらすことを含む。
別の態様では、本発明は、ヒト患者における医学的状態を治療するための方法であって、本方法は、当該患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与することを含む。特定の一実施形態では、このような方法は、当該患者に、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む治療有効量の本発明の結合タンパク質、本発明のこのような結合タンパク質をコードする核酸、又は本発明のこのような結合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む。一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。別の実施形態では、当該医学的状態は、感染症、好ましくはウイルス感染症である。
特定の一実施形態では、医学的状態は癌であり、癌又は腫瘍組織は、腫瘍関連抗原を発現又は提示する細胞を含み、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、当該細胞において発現又は提示される当該腫瘍関連抗原に結合する。特定の一実施形態では、当該疾患関連抗原は、当該癌又は腫瘍組織において発現又は過剰発現される細胞表面タンパク質の細胞外ドメインである。別の特定の実施形態では、腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合し、当該ペプチドは、腫瘍細胞において発現されるタンパク質（例えば、ＮＹ－０ＥＳＯ－１又はＭＡＧＥ－Ａ３など）に由来する。特定の一実施形態では、当該ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。一実施形態では、当該癌は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫及び混合型癌から選択される。
別の特定の一実施形態では、医学的状態は感染症、好ましくはウイルス感染症であり、感染組織は、感染関連抗原、好ましくはウイルス関連抗原を発現又は提示する細胞を含み、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、当該細胞において発現又は提示される当該感染関連抗原に結合する。特定の一実施形態では、当該疾患関連抗原は、当該感染組織において発現又は過剰発現されるウィルスタンパク質の細胞外ドメインである。別の特定の実施形態では、ウイルス関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合し、当該ペプチドは、細菌感染因子又はウイルス感染因子などの感染因子、好ましくはウイルス感染因子（例えば、ＨＢｃＡｇ又はＥＢＮＡ－１など）のタンパク質に由来する。特定の一実施形態では、当該ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。
本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を含む、キットを更に提供する。本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞（真核細胞又は原核細胞）中で発現させるステップと、（ｉｉ）当該組換え結合タンパク質を精製するステップ（例えば、クロマトグラフィーを使用して）と、を含む、方法を更に提供する。
本明細書で提供される開示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。
Ｅ１．ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む、組換え結合タンパク質。
Ｅ２．当該アンキリン反復モジュールが、第１のアンキリン反復モジュールであり、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む、Ｅ１に記載の結合タンパク質。
Ｅ３．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質。
Ｅ４．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質。
Ｅ５．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質
Ｅ６．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質
Ｅ７．当該第１のアンキリン反復モジュールが、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する、Ｅ２～Ｅ６のいずれかに記載の結合タンパク質。
Ｅ８．ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている、組換え結合タンパク質。
Ｅ９．結合タンパク質が、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１０．当該結合タンパク質が、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１１．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１２．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１３．当該結合タンパク質が、約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１２に記載の結合タンパク質。
Ｅ１４．当該結合タンパク質が、約２５０～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１２又はＥ１３に記載の結合タンパク質。
Ｅ１５．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１６．当該結合タンパク質が、約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１５に記載の結合タンパク質。
Ｅ１７．当該結合タンパク質が、約５０～約１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１５又はＥ１６に記載の結合タンパク質。
Ｅ１８．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１９．当該結合タンパク質が、約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１８に記載の結合タンパク質。
Ｅ２０．当該結合タンパク質が、約５～約１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１８又はＥ１９に記載の結合タンパク質。
Ｅ２１．当該結合タンパク質が、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む、Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２２．当該結合剤が、疾患関連抗原に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、Ｅ２１に記載の結合タンパク質。
Ｅ２３．当該疾患関連抗原が、感染関連抗原ＩＡＡ）、好ましくはウイルス関連抗原（ＶＡＡ）、又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、Ｅ２１又はＥ２２に記載の結合タンパク質。
Ｅ２４．疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤が、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する、Ｅ２１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２５．疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤が、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインに共有結合している、Ｅ２１～Ｅ２４のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２６．当該ペプチドリンカーが、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである、Ｅ２５に記載の結合タンパク質。
Ｅ２７．当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～５０個のアミノ酸、好ましくは６～３８個のアミノ酸の長さを有する、Ｅ２５又はＥ２６に記載の結合タンパク質。
Ｅ２８．当該結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、Ｅ１～Ｅ２７のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２９．当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する結合剤を含む、Ｅ２８に記載の結合タンパク質。
Ｅ３０．ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該結合剤が、配列番号２８～３０のいずれか１つのアミノ酸配列、好ましくは配列番号２９のアミノ酸配列を含むアンキリン反復ドメインである、Ｅ２９に記載の結合タンパク質。
Ｅ３１．当該半減期延長部分が、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する、Ｅ２８～Ｅ３０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ３２．Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質をコードする、核酸。
Ｅ３３．Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質又はＥ３２に記載の核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物。
Ｅ３４．医学的状態を治療する方法において使用するための、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物。
Ｅ３５．医学的状態が感染症、好ましくはウイルス感染症、又は癌である、Ｅ３４に記載の結合タンパク質。
Ｅ３６．ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の腫瘍局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ３７．ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の感染局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ３８．医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量のＥ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ３９．当該医学的状態が感染症、好ましくはウイルス感染症、又は癌である、Ｅ３８に記載の方法。
Ｅ１．ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む、組換え結合タンパク質。
Ｅ２．当該アンキリン反復モジュールが、第１のアンキリン反復モジュールであり、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む、Ｅ１に記載の結合タンパク質。
Ｅ３．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質。
Ｅ４．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質。
Ｅ５．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質
Ｅ６．当該第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｅ２に記載の結合タンパク質
Ｅ７．当該第１のアンキリン反復モジュールが、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する、Ｅ２～Ｅ６のいずれかに記載の結合タンパク質。
Ｅ８．ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている、組換え結合タンパク質。
Ｅ９．結合タンパク質が、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１０．当該結合タンパク質が、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１１．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１２．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１３．当該結合タンパク質が、約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１２に記載の結合タンパク質。
Ｅ１４．当該結合タンパク質が、約２５０～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１２又はＥ１３に記載の結合タンパク質。
Ｅ１５．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１６．当該結合タンパク質が、約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１５に記載の結合タンパク質。
Ｅ１７．当該結合タンパク質が、約５０～約１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１５又はＥ１６に記載の結合タンパク質。
Ｅ１８．ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ１９．当該結合タンパク質が、約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１８に記載の結合タンパク質。
Ｅ２０．当該結合タンパク質が、約５～約１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、Ｅ１８又はＥ１９に記載の結合タンパク質。
Ｅ２１．当該結合タンパク質が、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む、Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２２．当該結合剤が、疾患関連抗原に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、Ｅ２１に記載の結合タンパク質。
Ｅ２３．当該疾患関連抗原が、感染関連抗原ＩＡＡ）、好ましくはウイルス関連抗原（ＶＡＡ）、又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、Ｅ２１又はＥ２２に記載の結合タンパク質。
Ｅ２４．疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤が、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する、Ｅ２１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２５．疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤が、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインに共有結合している、Ｅ２１～Ｅ２４のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２６．当該ペプチドリンカーが、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである、Ｅ２５に記載の結合タンパク質。
Ｅ２７．当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～５０個のアミノ酸、好ましくは６～３８個のアミノ酸の長さを有する、Ｅ２５又はＥ２６に記載の結合タンパク質。
Ｅ２８．当該結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、Ｅ１～Ｅ２７のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ２９．当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する結合剤を含む、Ｅ２８に記載の結合タンパク質。
Ｅ３０．ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該結合剤が、配列番号２８～３０のいずれか１つのアミノ酸配列、好ましくは配列番号２９のアミノ酸配列を含むアンキリン反復ドメインである、Ｅ２９に記載の結合タンパク質。
Ｅ３１．当該半減期延長部分が、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する、Ｅ２８～Ｅ３０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。
Ｅ３２．Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質をコードする、核酸。
Ｅ３３．Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質又はＥ３２に記載の核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物。
Ｅ３４．医学的状態を治療する方法において使用するための、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物。
Ｅ３５．医学的状態が感染症、好ましくはウイルス感染症、又は癌である、Ｅ３４に記載の結合タンパク質。
Ｅ３６．ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の腫瘍局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ３７．ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の感染局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ３８．医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量のＥ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の結合タンパク質、Ｅ３２に記載の核酸、又はＥ３３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ３９．当該医学的状態が感染症、好ましくはウイルス感染症、又は癌である、Ｅ３８に記載の方法。
本明細書に開示及び例証されるように、本開示は、ＣＤ３を特異的に標的化するアンキリン反復タンパク質を提供する。設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（国際公開第２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５７５－５８２，２００４；Ｓｔｕｍｐｐｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，１３，６９５－７０１，２００８）は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異的設計アンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。次に、そのような標的特異的設計アンキリン反復ドメインを、疾患を治療するための組換え結合タンパク質の価値ある成分として使用することができる。設計アンキリンリピートタンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計アンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は同じ若しくは異なる標的特異性を有する２つ以上の設計アンキリン反復ドメインの組合せを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計アンキリン反復ドメインのみを含むアンキリンリピートタンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特性、及び２つ、３つ、４つ又はそれ以上の異なる特異性を有する結合タンパク質をもたらす、１つのタンパク質において２つ、３つ、４つ又はそれ以上の設計アンキリン反復ドメインを組み合わせ可能であることは、設計アンキリン反復タンパク質を理想的なアゴニスト、アンタゴニスト及び／又は阻害性薬物候補にし、例えば、Ｔ細胞エンゲージャ薬物分子の新規設計を含む新規薬物設計を可能にする。更に、そのようなアンキリン反復タンパク質は、様々なエフェクター機能、例えば細胞傷害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。まとめると、設計アンキリン反復タンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次世代の例である。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ所有の商標である。
一態様では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のうちいずれかにおける９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸置換の全てが、当該アンキリン反復モジュールのフレームワーク位置に生じる。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５のアミノ酸配列又は配列番号５の１個若しくは２個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６の１個若しくは２個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列又は配列番号７の１個若しくは２個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８の１個若しくは２個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号９のアミノ酸配列又は配列番号９の１個若しくは２個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含む。好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。一実施形態では、当該第１及び第２のアンキリン反復モジュールは、それぞれ、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１のアンキリン反復モジュールを含み、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む。
特定の一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
したがって、一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６における２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における６個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６における２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における５個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における４個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における３個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５の１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。更に、より好ましい実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
別の特定の実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
したがって、一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における６個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の６個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における５個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の５個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における４個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の４個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における３個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の３個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８１、７及び（２）配列番号７における１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。更に、より好ましい実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
別の特定の実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。
したがって、一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における６個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の６個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における５個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の５個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における４個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の４個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における３個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の３個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。更に、より好ましい実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号８のアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
別の特定の実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
したがって、一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の６個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の６個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の５個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の５個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の４個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の４個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の３個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の３個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の２個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７及び（２）配列番号７の３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。更に、より好ましい実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
好ましい一実施形態では、本明細書に説明及び言及されるような当該アンキリン反復モジュールの当該のアミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュールのフレームワーク位置において起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。フレームワーク位置におけるそのような置換の実施形態は、そのような置換が明示的に記載されているかどうかに関係なく、全ての実施形態に適用されるものとする。
１つの好ましい実施形態では、本明細書に説明及び言及されるような当該アンキリン反復モジュールの当該のアミノ酸置換の全ては、配列番号５～９の当該アンキリン反復モジュールのフレームワーク位置でかつ３、４、６、１４及び１５位以外の位置で、好ましくは２、３、４、５、６、１４及び１５位以外の位置で起こり、典型的には、モジュールの全体的な構造は、置換の影響を受けない。
別の態様では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている、組換え結合タンパク質に関する。
したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号４の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の結合タンパク質。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインの潜在的な相互作用残基は、配列番号１～４のアンキリン反復ドメインのいずれか１つにおける対応する位置と同一である。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、９００、７００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、又は１０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、９００ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、７００ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、５００ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、４００ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、３００ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、２００ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、１００ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、７０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、６０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、５０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、４０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、３０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、２０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞に結合し；別の態様では、当該結合タンパク質は、１５ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞に結合し；更なる態様では、当該結合タンパク質は、０ｎＭ未満のＥＣ50でＴ細胞に結合する。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約５～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。更なる実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約２５０～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；別の実施形態では、当該結合タンパク質は、約５０～約１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し；更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、約５～約１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する。
Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査イメージングサイトメトリーを使用することによる、ＣＤ３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質のＴ細胞上でのＣＤ３結合（ＥＣ50）の典型的かつ好ましい決定は、実施例５に記載されている（初代ヒトＴ細胞を用いて）。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質の当該ＣＤ結合（ＥＣ50）は、実施例５に記載されるように、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査イメージングサイトメトリーによって初代ヒトＴ細胞上で決定される。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該結合タンパク質は、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮ置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約２５０～約４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該結合タンパク質は、配列番号２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、２５０～４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、２５０～４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、２５０～４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、２５０～４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、２５０～４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、２５０～４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約２５０～４００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、配列番号２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約５０～約１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該結合タンパク質は、配列番号３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、５０～１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、５０～１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、５０～１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、５０～１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、５０～１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、５０～１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約５０～約１００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、配列番号３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約５～約１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該結合タンパク質は、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、５～１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、５～１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、５～１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、５～１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、５～１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、５～１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約５～約１５ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、配列番号４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号４の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-6Ｍ未満、又は１０-7Ｍ未満、又は５×１０-8Ｍ未満、又は２×１０-8Ｍ未満、又は１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）で、ＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、約１０-6Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。別の実施形態では、当該ポリペプチドは、約１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、更なる一実施形態では、当該結合は、２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-6Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。別の実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮ置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、約１０-7Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、約５×１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、約５×１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、約５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、約５×１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、約２×１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号３又は４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、約２×１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、約２×１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、約２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約２×１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、配列番号３又は４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号３又は４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、約１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。したがって、一実施形態では、当該結合タンパク質は、約１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該結合タンパク質は、約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該結合タンパク質は、約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該結合タンパク質は、約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該結合タンパク質は、約１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約１０-8Ｍ又はそれ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、配列番号４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
ＣＤ３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（ＫD）の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例４に説明されている。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質のＣＤ３に対する当該結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質のＣＤ３に対する当該結合特異性は、実施例４に記載のように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。
一実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、当該アンキリン反復ドメインが、６５℃より高い、６８℃より高い、７０℃より高い、７２℃より高い、７５℃より高い、７８℃より高い、８０℃より高い、約７５℃の、約８０℃の、約８２℃の、約８５℃の、６５℃～９５℃の、７０℃～９０℃の、又は７２℃～８８℃の融解温度（Ｔm）を有する。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃～９５℃の融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７２℃～８８℃の融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、６８℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７２℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７８℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃より高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７８℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃～９５℃の融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、約８５℃の融解温度（Ｔm）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、７２℃より高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７７℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃～９２℃の融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、約８２℃の融解温度（Ｔm）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、６８℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃～８５℃の融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、約７５℃の融解温度（Ｔm）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、７３℃より高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７８℃よりも高い融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７３℃～９３℃の融解温度（Ｔm）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、約８３℃の融解温度（Ｔm）を有する。
円偏光二色性（ＣＤ）分光法による、ＣＤ３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質又はアンキリン反復ドメインの融解温度（Ｔm）の典型的かつ好ましい決定は、実施例２に記載されている。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質又はアンキリン反復ドメインの当該融解温度（Ｔm）は、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ）中で円偏光二色性（ＣＤ）分光法によって決定される。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質又はアンキリン反復ドメインの当該融解温度（Ｔm）は、実施例２に記載されるように、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ）中で円偏光二色性（ＣＤ）分光法によって決定される。
一実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い、６８℃より高い、７０℃より高い、７２℃より高い、７５℃より高い、７８℃より高い、８０℃より高い、８２℃より高い、８５℃より高い、７５℃～１００℃の、７０℃～９５℃の、又は７５℃～９５℃の凝集開始温度（Ｔagg）を有する。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では当該アンキリン反復ドメインは、７５℃～１００℃の凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では当該アンキリン反復ドメインは、７０℃～９５℃の凝集開始温度（Ｔagg）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、６８℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７２℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７８℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃よりも高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃～１００℃の凝集開始温度（Ｔagg）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃～９５℃の凝集開始温度（Ｔagg）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃～９５℃の凝集開始温度（Ｔagg）を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号４の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されており、当該アンキリン反復ドメインは、６５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７５℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、８０℃より高い凝集開始温度（Ｔagg）を有する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７０℃～９５℃の凝集開始温度（Ｔagg）を有する。
動的光散乱（ＤＬＳ）分析による、ＣＤ３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質又はアンキリン反復ドメインの凝集開始温度（Ｔagg）の典型的かつ好ましい決定は、実施例２に記載されている。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質又はアンキリン反復ドメインの当該凝結温度（Ｔm）は、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ）中で動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって決定される。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質又はアンキリン反復ドメインの当該凝集開始温度（Ｔagg）は、実施例２に記載されるように、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ）中で動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって決定される。
本明細書中に開示される組換え結合タンパク質の反復ドメイン、好ましくはアンキリン反復ドメインは、好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュール（以降、キャッピング反復又はキャッピング単位とも称される）を含む。キャッピングモジュールはアンキリン反復ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端に位置し、典型的には、アンキリン反復モジュールとの間に密な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、アンキリン反復ドメインの疎水性コアを溶媒への曝露から側方で遮蔽するキャップを提供する。Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際公開第２００２／０２０５６５号及び同第２０１２／０６９６５５号、米国特許出願公開第２０１３０２９６２２１、並びにＩｎｔｅｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４に記載されている。Ｎ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピング反復）の例は、配列番号１１～１６であり、１１～１６であり、Ｃ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピング反復）の例は、配列番号１７～２６である。
例示的な実施形態では、Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列番号１０～１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１０～１５のいずれか１つの最大９、最大８、最大７、最大６、最大５個、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、場合により、任意のアミノ酸によって交換される。
例示的な実施形態では、Ｃ末端キャッピングモジュールは、配列番号１７～２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１７～２５のいずれか１つの最大９、最大８、最大７、最大６、最大５個、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、場合により、任意のアミノ酸によって交換される。
有利には、いくつかの実施形態では、本明細書の設計されたアンキリン反復ドメインのＮ末端キャッピングモジュール及び／又はＣ末端キャッピングモジュール中のある特定のアミノ酸残基を変化させることにより、設計されたアンキリン反復ドメインの、及び設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質の終末相半減期の長期化を含む、薬物動態特性の改善が得られることが発見された。変化したアミノ酸残基は、ほとんど表面に露出した残基である。好ましくは、変更されたアミノ酸残基は、Ｎ末端キャッピングモジュールの８位及び１５位におけるアミノ酸残基であり、８位におけるアミノ酸はＱであり、１５位におけるアミノ酸はＬであり、位置番号は、配列番号１０の位置、並びにＣ末端キャッピングモジュールの１４位及び１８位におけるアミノ酸残基に対応し、１４位のアミノ酸はＲであり、１８位のアミノ酸はＱであり、位置番号は配列番号１７の位置に対応する。
例えば、変化されたアミノ酸残基を有するＮ末端キャッピングモジュールは、以下の配列：ＤＬＧｘｘＬＬＱＡＡｘｘＧＱＬＤｘＶＲｘＬｘｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号１６）を含むことができ、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。
例えば、変化されたアミノ酸残基を有するＣ末端キャッピングモジュールは、以下の配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＡＤｘＡＡＲｘＧＨＱｘＩＡｘＶＬＱｘＡＡ（配列番号２６）を含むことができ、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。
したがって、一実施形態では、本発明のＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。代替的又は追加的に、本発明のＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣ末端キャッピングモジュールを含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。
特定の実施形態では、本発明のＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号、１～４のいずれか１つの８位におけるアミノ酸Ｅは、Ｑで置換されており、配列番号１～３のいずれか１つの１５位におけるアミノ酸Ｄは、Ｌで置換されている。代替的又は追加的に、本発明のＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～４のいずれか１つの１１０位におけるアミノ酸Ｋは、Ｒで置換されており、配列番号１及び２の１１４位におけるアミノ酸Ｅ、又は配列番号４のアミノ酸Ｒは、Ｑで置換されている。
更に、本発明のＣＤ３結合ドメインは、場合により、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３結合ドメインは、（ｉ）配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、そして（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。
一実施形態では、本発明の結合タンパク質は、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む。
したがって、特定の一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されるようなＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む。好ましい一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
一実施形態では、当該疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。腫瘍関連抗原の例示的な例としては、腫瘍細胞の細胞表面上に発現されるタンパク質、例えば、ＨＥＲ２（本明細書ではＴＡＡ１としても称される）、ＣＤ１２３（本明細書ではＴＡＡ２としても称される）、ＣＤ３３（本明細書ではＴＡＡ３としても称される）、及びＣＤ７０（本明細書ではＴＡＡ４としても称される）、又はペプチド－ＭＨＣ複合体が挙げられるが、これらに限定されず、当該ペプチドは腫瘍細胞において発現されるタンパク質（例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１又はＭＡＧＥ－Ａ３など）に由来し、該ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。別の実施形態では、当該疾患関連抗原は、感染関連抗原、好ましくはウイルス関連抗原（ＶＡＡ）である。ウイルス関連抗原の例示的な例としては、ペプチド－ＭＨＣＣ複合体が挙げられるが、これに限定されず、当該ペプチドは、はウイルス感染因子（例えば、ＨＢｃＡｇ又はＥＢＮＡ－１など）に由来し、当該ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインに連結、コンジュゲート、融合、又は他の方法で物理的に付着している。一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインに共有結合している。一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、ペプチドリンカーを用いて、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインに共有結合している。一実施形態では、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、１～５０個のアミノ酸、好ましくは６～３８個のアミノ酸の長さを有する。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、配列番号３１及び４２～４６のいずれか１つの高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、３１及び４２～４６のいずれか１つの高プロリン－トレオニンペプチドリンカーを用いて、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインに共有結合している。好ましい一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様又は実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されるようなＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、本明細書の態様又は実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されるような疾患関連抗原に対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。好ましい実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、半減期延長部分を更に含む。
したがって、特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されるようなＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、半減期延長部分を更に含む。一実施形態では、当該半減期延長部分は、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
一実施形態では、当該半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する結合剤を含む。
一実施形態では、当該半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン結合ドメインである。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン結合ドメインは、配列番号２８～３０のいずれか１つと、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様又は実施形態のいずれかでより具体的に記載されるようなＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、配列番号２８～３０のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン結合ドメインを更に含む。一実施形態ヒトでは、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３０のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３０のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３０のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態ヒトでは、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３０のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含み、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、当該結合タンパク質内のＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン結合ドメインは、配列番号２９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様又は実施形態のいずれかでより具体的に記載されるようなＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、配列番号２９と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン結合ドメインを更に含む。一実施形態ヒトでは、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態ヒトでは、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含み、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
一実施形態では、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインを含むが、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは含まない対応する組換え結合タンパク質と比較して、増加した終末相半減期、好ましくは少なくとも５％、好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、又は２５０％の増加した終末相半減期を示す。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様又は実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されるようなＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、本明細書の態様又は実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されるようなヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグは、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列であり、ここで、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であり、又は、当該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、当該アミノ酸配列はエフェクター機能を有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部位に、直接又はペプチドリンカーを介して接続してもよい。ポリペプチドタグは技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）等のポリペプチドであり、これらにより、当該ポリペプチド／タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等）及び／若しくはエフェクター分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーを更に含む。ペプチドリンカーは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、又はタンパク質ドメインと生物学的活性分子、タンパク質ドメインとローカライザ、又は２つの配列タグを、結合させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号の明細書に提供されている。そのようなリンカーの具体例は、グリシン－セリン－リンカー及び可変長のプロリン－トレオニン－リンカーである。グリシン－セリン－リンカーの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号４１のアミノ酸配列であり、プロリン－トレオニン－リンカーの例は、配列番号３１及び４２～４６のアミノ酸配列である。
別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で生産するために使用した。本発明の核酸の例は、配列番号３７～４０によって提供され、これは、それぞれ、配列番号１～４のアミノ酸配列をコードする。
一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリン反復ドメイン、及び／又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質、又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。
医薬組成物は、本明細書に記載のような組換え結合タンパク質、及び／又は設計されたアンキリン反復ドメイン、及び／又は核酸、好ましくは、組換え結合タンパク質及び／又は核酸、及び例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６th ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤を含む。
当業者に既知の、好適な担体、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物等の、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。
本発明の一実施形態は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、医薬組成物を製造するための血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む、本発明の組換え結合タンパク質の使用に関し、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインを含むが、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは含まない対応する組換え結合タンパク質と比較して、増加した終末相半減期、好ましくは少なくとも５％、好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、又は２５０％の増加した終末相半減期を示す。本発明の一実施形態では、組換え結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの組換え結合タンパク質、並びに非イオン性洗剤などの洗剤、リン酸塩緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖を含む。一実施形態では、このような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。
別の態様では、本発明は、哺乳動物における腫瘍細胞又は組織中のＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化の方法であって、当該哺乳動物に、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含む、本発明の組換え結合タンパク質を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、ＣＤ３とは異なる標的、好ましくはＴＡＡ又はＶＡＡに対して結合特異性を有する結合タンパク質である。一実施形態では、当該哺乳動物はヒトであり、当該ＴＡＡ発現細胞又は組織は、原発性腫瘍、転移及び／又は腫瘍間質を含む腫瘍内に位置する。
別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の腫瘍局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、本発明の結合タンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の感染局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、本発明の結合タンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、医学的状態を治療するための方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の組換え結合タンパク質、当該結合タンパク質をコードする核酸、又は当該結合タンパク質を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、医学的状態の治療を必要とする患者に、治療有効量の、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の組換え結合タンパク質を投与するステップを含み、当該結合剤は、当該結合タンパク質を標的腫瘍組織又は感染組織に局在化させるのに有効であり、当該結合タンパク質の当該局在化は、標的腫瘍又は感染組織中のＴ細胞活性化をもたらす、方法を提供する。一実施形態では、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は結合タンパク質であり、好ましくは、ＴＡＡ又はＶＡＡに対して結合特異性を有するアンキリン反復結合タンパク質である。
一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための、本発明による医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸に関する。その目的のため、本発明による医薬組成物、核酸又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。親的（parental）投与において、本発明の医薬組成物は、上で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液、又はエマルションなどの単位用量の注射可能な形態で処方される。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。
更に、上述の医薬組成物、核酸又は組換え結合タンパク質のいずれかは、障害の治療における使用のためのものとみなされる。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質又は本明細書に記載のこのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口用途のため、組換え結合タンパク質又は当該医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注入することができる。
一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与するステップを含む、方法に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一実施形態では、本発明は疾患の治療において使用するための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療において使用するための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための医薬品としての、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一実施形態では、本発明は、医薬品の製造のための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための医薬品を製造するための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための医薬品の製造のためのプロセスであって、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物が、医薬品の有効成分である、プロセスに関する。一実施形態において、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を使用する、疾患の治療方法に関する。
癌又は感染症の治療のための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の使用はまた、当技術分野において既知の１つ以上の他の療法との併用とすることができる。用語「～との併用」は、本明細書で使用する場合、所与の投与計画の下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。
一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。別の実施形態では、当該医学的状態は、感染症、好ましくはウイルス感染症である。
特定の一実施形態では、医学的状態は癌であり、癌又は腫瘍組織は、腫瘍関連抗原を発現又は提示する細胞を含み、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、当該細胞において発現又は提示される当該腫瘍関連抗原に結合する。特定の一実施形態では、当該疾患関連抗原は、当該癌又は腫瘍組織において発現又は過剰発現される細胞表面タンパク質の細胞外ドメインである。別の特定の実施形態では、腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合し、当該ペプチドは、腫瘍細胞において発現されるタンパク質（例えば、ＮＹ－０ＥＳＯ－１又はＭＡＧＥ－Ａ３など）に由来する。特定の一実施形態では、当該ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。一実施形態では、当該癌は、腺癌及び扁平上皮癌から選択される。一実施形態では、当該癌は、骨肉腫又は骨原性肉腫（骨）、軟骨肉腫（軟骨）、平滑筋肉腫（平滑筋）、横紋筋肉腫（骨格筋）、中皮肉腫又は中皮腫（体腔の内膜）、線維肉腫（線維組織）、血管肉腫又は血管内皮腫（血管）、脂肪肉腫（脂肪組織）、神経膠腫又は星状細胞腫（脳に見られる神経原性結合組織）、粘液肉腫（原始胎児性結合組織）、及び間葉性又は混合中胚葉腫瘍（混合結合組織型）から選択される。一実施形態では、当該癌は、骨髄性又は顆粒球性白血病（骨髄性及び顆粒球性白血球系列の悪性腫瘍）、リンパ性、リンパ球性、又はリンパ芽球性白血病（リンパ性及びリンパ球性血液細胞系列の悪性腫瘍）、及び真性赤血球増加症又は赤血症（様々な血液細胞産物の悪性腫瘍であるが、赤血球が優勢である）から選択される。一実施形態では、当該癌は、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫から選択される。一実施形態では、当該癌は、腺扁平上皮癌、混合型中胚葉腫瘍、癌肉腫及び奇形癌から選択される。一実施形態では、当該癌は、結腸直腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵癌、脳頭頸部扁平上皮細胞癌の転移性癌、食道扁平上皮細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚扁平上皮細胞癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌、膵臓扁平上皮細胞癌、結腸扁平上皮細胞癌、若しくは胃扁平上皮細胞癌、前立腺癌、骨肉腫、又は軟部組織肉腫及び良性腫瘍から選択される。一実施形態では、そのような癌は、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、及び乳癌、並びに骨及び軟部組織肉腫を含む、上皮悪性腫瘍（原発性及び転移性）から選択される。
別の特定の一実施形態では、医学的状態は感染症、好ましくはウイルス感染症であり、感染組織は、感染関連抗原、好ましくはウイルス関連抗原を発現又は提示する細胞を含み、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、当該細胞において発現又は提示される当該感染関連抗原に結合する。特定の一実施形態では、当該疾患関連抗原は、当該感染組織において発現又は過剰発現されるウィルスタンパク質の細胞外ドメインである。別の特定の実施形態では、ウイルス関連抗原に対して結合特異性を有する当該結合剤は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合し、当該ペプチドは、細菌感染因子又はウイルス感染因子などの感染因子、好ましくはウイルス感染因子（例えば、ＨＢｃＡｇ又はＥＢＮＡ－１など）のタンパク質に由来する。特定の一実施形態では、当該ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。一実施形態では、当該感染症は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされるウイルス感染、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって引き起こされるウイルス感染、ＨＩＶ感染、西ナイルウイルス感染症、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎、天然痘、結核、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）感染症、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、ＳＡＲＳ、インフルエンザ、エボラ出血熱、ウイルス性髄膜炎、ヘルペス、炭疽菌、ライム病、及び大腸菌感染症から選択される。一実施形態では、本発明は、上述のアンキリン反復ドメインのいずれかを含む組換え結合タンパク質に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を含む、キットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸を含む、キットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物を含む、キットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、及び／又は本発明の核酸、及び／又は本発明の医薬組成物を含む、キットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明のＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～４を含む組換え結合タンパク質、及び／又はＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～４を含む組換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又はＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～４を含む組換え結合タンパク質を含む医薬組成物を含む、キットに関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を産生するための方法に関する。一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号１～４のアミノ酸配列を含む組換え結合タンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞（例えば、細菌中）で発現させるステップと、（ｉｉ）当該組換え結合タンパク質を精製する（例えば、クロマトグラフィーを使用して）ステップと、を含む、方法に関する。当該方法は追加のステップを含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例１に記載される。
本発明は、実施例に記載の特定の実施形態に制限されない。
本明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、添付の配列表に開示されている多くのアミノ酸配列、核酸配列、及び配列番号を参照する。
定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって生産される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを生産することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。
本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。
更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。本発明の結合タンパク質は、ローカライザ分子を含んでもよい。
用語「結合ドメイン」は、標的に対して結合特異性を示すタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
用語「標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。本発明の文脈において、Ｔ細胞は、ＣＤ３０特異的結合タンパク質及びローカライザ標的タンパク質の標的であり、細胞及び組織は、ローカライザの標的である。
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。
特許出願第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２～６）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。
用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチ反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７～５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の実施例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。
設計されたリピートタンパク質、設計された反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのようなリピートタンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、反復タンパク質を設計し、これらは少なくとも１つの設計されたアンキリン反復ドメインを含む。
用語「標的相互作用残基」は、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。
用語「フレームワーク残基」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくはβ－シートに見られるポリペプチド骨格立体構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。
そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。
用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じるリピートタンパク質の反復単位に由来する、設計された反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えば、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば、実施例１に記載されるように、標的上で選択された反復ドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。
したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリンリピートタンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリンリピートタンパク質は、当業者に周知である。
反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリ内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（「非ランダム化位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリ内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含み得る。非ランダム化された位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。これらの位置は、概して、本明細書に開示される配列番号５～９のモジュール配列の変異体において置換されない。
用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。
用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての当該モチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富む変異体反復単位が挙げられる。
用語「標的に対して結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「高い特異性で標的に結合する」、「標的に対して特異的な」又は「標的特異性」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「ＫD」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０2倍、より好ましくは少なくとも１０3倍、より好ましくは少なくとも１０4倍、又はより好ましくは少なくとも１０5倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫDの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、ＫD値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。ＣＤ３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（ＫD）の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例４に説明されている。
「結合剤」という用語は、標的分子に特異的に結合することができる任意の分子を指す。用語「結合剤」は、例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：５１８２－５１９０（１９９１））、抗体模擬体、反復タンパク質、例えば、設計アニクリン反復タンパク質、受容体タンパク質、及び標的分子のいずれかの他の天然に存在する相互作用パートナーを含み、天然タンパク質と、例えば、非天然残基を含むように、及び／又は天然残基を欠いているように修飾され若しくは遺伝子操作されたタンパク質とを含むことができる。
用語「約」は、言及した値の±２０％を意味し、例えば、「約５０」は、４０～６０を意味するものとする。
用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。
用語「マウス血清アルブミン」は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０７７２４を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」（すなわちカニクイザル（macaca fascicularis））は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ２Ｖ９Ｚ４を指し、用語「ヒト血清アルブミン」はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６８を指す。
好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、実施例３に記載されるように評価され得る。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後最大４８時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、２４時間～４８時間で計算される。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注射後最大７日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目～５日目で計算する。当業者は、標的媒介クリアランスなどの効果を更に特定し、終末相半減期を計算する場合、それらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質などの薬物の用語「終末相半減期」とは、偽平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間～４８時間で計算し、又はカニクイザルでは１日目～５日目で計算する）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の用量、より好ましくは同等の用量（すなわち、同一のｍｇ／ｋｇ用量）又は等モル用量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、で行う。動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の実験的な投与量のばらつきを伴うことが、当業者には理解される。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる投与量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５～１０ｍｇ／ｋｇから選択される。
「ＣＤ３」又は「分化クラスター３」という用語は、３つの対（εγ、εδ、ζζ）として集合する４つの異なるポリペプチド鎖、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びゼータ（ζ）から構成される多量体タンパク質複合体を指す。ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞受容体と非共有結合的に会合するＴ細胞共受容体として機能する。それは、任意の形態のＣＤ３、並びにＣＤ３の活性の少なくとも一部を保持するその変異体、アイソフォーム、及び種相同体を指し得る。したがって、本明細書に定義及び開示される結合タンパク質はまた、ヒト以外の種からＣＤ３に結合してもよい。他の場合では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３に完全に特異的であってもよく、種又は他のタイプの交差反応性を示さなくてもよい。ヒトＣＤ３に対する特定の参照によってなど異なる指示が無い限り、ＣＤ３は、天然配列ＣＤ３、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの全ての哺乳動物種を含む。ヒトＣＤ３ガンマ、デルタ及びゼータのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）参照配列、それぞれＮＰ＿００００６４．１、ＮＰ＿０００７２３．１及びＮＰ＿９３２１７０．１に示されている。
本明細書で使用される用語「ＣＤ３発現細胞」は、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）などのＴ細胞を含むがこれらに限定されない、細胞表面上にＣＤ３（分化クラスター３）を発現するいずれかの細胞を指す。
用語「Ｔ細胞の腫瘍限局性活性化」は、非腫瘍組織と比較して、Ｔ細胞が腫瘍組織において優先的に活性化されることを意味する。
用語「Ｔ細胞の感染症限局性活性化」は、非感染組織と比較して、Ｔ細胞が感染組織において優先的に活性化されることを意味する。
更に、用語「ペプチド」とはまた、例えばグリコシル化によって修飾されたペプチドと、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質、４～６００アミノ酸長の長さの各々、例えばインスリン及び免疫グロブリンなどのジスルフィド結合によって架橋されたタンパク質と、を包含する。用語「化学的又は生化学的薬剤」とは、レシピエントに投与され得る任意の自然起源又は合成の化合物を含むことが意図される。
「医学的状態」（又は障害又は疾患）という用語には、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が含まれる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症、及び腫瘍性疾患を含む群から選択される障害の治療のための医薬の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、治療方法に関する。好ましい実施形態では、当該医学的状態は、腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。一実施形態では、当該医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である。一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。用語「治療有効量」は、患者において所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。
用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及び変異体も意味する。そのようなフラグメント及び変異体もまた、当技術分野において周知であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で常時使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、及び単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、キメラ抗体、抗体融合ポリペプチド、及び非従来型抗体を包含する。
用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌は、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発性及び転移性癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、明細胞腎臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、悪性中皮腫、結腸直腸癌、又は胃癌が挙げられる。
用語「感染症」及び「感染」は、特に病理学的症状を引き起こす、体組織における微生物の浸潤及び増殖を指すか又は説明するために、本明細書で使用される。感染症の例としてはとりわけ、例えば、ＨＩＶ感染症、ウェストナイル熱ウイルス感染症、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型肝炎、痘瘡、結核、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）感染症、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、ＳＡＲＳ、インフルエンザ、エボラウイルス病、ウイルス性髄膜炎、疱疹、炭疽、ライム病、及び大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）感染症などのウイルス性疾患及び細菌性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を用いて調製することができる。
材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌のＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質生産に使用した。
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌のＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質生産に使用した。
分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、（２００４年）、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号５、６、若しくは７のＮ末端キャッピングモジュール）、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５）のＮ末端キャッピングモジュール）又は配列番号１６によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号２６によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てられ得る。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有さないように組み立てられる。
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、（２００４年）、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号５、６、若しくは７のＮ末端キャッピングモジュール）、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５）のＮ末端キャッピングモジュール）又は配列番号１６によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号２６によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てられ得る。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有さないように組み立てられる。
更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリーの補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ、Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ、Ｇｏｔｏ，Ｙ．、Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入される、このアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの１つ以上のβターンに挿入された可変長（例えば、１～２０個のアミノ酸）のランダム化ループ（固定化及びランダム化位置を有する）を含有してもよい。
アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡモチーフ、ＲＩＬＬＫＡモチーフ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを有し（例えば、配列番号２９の位置２１～２６に存在）、アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮモチーフ、ＫＬＡモチーフ、又はＫＡＡモチーフを有する（例えば、配列番号１における最後の３個のアミノ酸に存在）。配列番号１０、１１、１２、１３、１４、又は１５は、ＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ又はＲＥＬＬＫＡモチーフを含むＮ末端キャッピングモジュールの例を提供し、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５は、ＫＬＮ、ＫＬＡ又はＫＡＡモチーフを含むＣ末端キャッピングモジュールの例を提供する。
そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ：ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃで設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例が説明されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚら、２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。
反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、１アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。
全てのＤＮＡ配列は配列決定によって確認され、選択されたタンパク質の計算された分子量は質量分析によって確認された。
実施例１：ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒトｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＣＤ３標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence：ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のヒトｓｃＣＤ３特異的結合タンパク質がうまく選択されたことを示した。例えば、配列番号１のアンキリン反復ドメインは、ｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインからの個々のアンキリン反復モジュール、例えば、配列番号５～９におけるものが提供される。
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒトｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＣＤ３標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence：ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のヒトｓｃＣＤ３特異的結合タンパク質がうまく選択されたことを示した。例えば、配列番号１のアンキリン反復ドメインは、ｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインからの個々のアンキリン反復モジュール、例えば、配列番号５～９におけるものが提供される。
ヒト組換えＣＤ３標的調製物
選択された標的フォーマットは、２６アミノ酸リンカー（ｓｃＣＤ３εγ）及び部位指向的ビオチン化のためのＣ末端Ａｖｉタグによって連結されたヒトＣＤ３ε及びＣＤ３γヘテロ二量体からなる単鎖フォーマットに基づく。標的タンパク質は、ＣＤ３細胞外ドメインのみを含み、Ｃ末端システイン「ノブ」並びに膜貫通領域及び細胞質領域全体を欠く。
選択された標的フォーマットは、２６アミノ酸リンカー（ｓｃＣＤ３εγ）及び部位指向的ビオチン化のためのＣ末端Ａｖｉタグによって連結されたヒトＣＤ３ε及びＣＤ３γヘテロ二量体からなる単鎖フォーマットに基づく。標的タンパク質は、ＣＤ３細胞外ドメインのみを含み、Ｃ末端システイン「ノブ」並びに膜貫通領域及び細胞質領域全体を欠く。
ヒトｓｃＣＤ３εγの細胞外ドメイン（配列番号３２＿ｓｃＣＤ３εγ＿Ａｖｉ－Ｂｉｏ）を、大腸菌において以前に記載された（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４，１０１（２０）：７６７５－７６８０）のと同様の一本鎖フォーマットで発現させ、続いて封入体からリフォールディングさせ、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。材料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で３．４ｍｇ／ｍｌに濃縮し、組換えＢｉｒＡを使用してインビトロでビオチン化した。機能的標的材料を単離するために、ＯＫＴ３充填カラム（ＧＥ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラム）を用いて材料を再精製した。最終材料はサイズ排除で単量体であり、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、１０％のグリセロール中０．３９ｍｇ／ｍｌ の最終濃度で保存した。
組換えヒトｓｃＣＤ３標的調製プロセスの概要は、Ｄｕｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ ２００４に記載されている。
リボソームディスプレイによるＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の選択
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＣＤ３の細胞外ドメインの一部（配列番号３２）を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，６９－７９，２００７参照）。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。最初の４ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ（それぞれ、４００ｎＭ、１３３ｎＭ、４５ｎＭ及び１５ｎＭ）、洗浄ストリンジェンシーを増加させて、ラウンド１からラウンド４まで選択圧力を増加させる（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４、上記引用）。ラウンド２～４において、ｍＲＮＡを、過剰のＣＤ３結合抗体ＯＫＴ３を使用する競合溶出によって回収した（各ラウンドにおいて、競合物過剰は、３５倍から３００倍まで一定に増加した）。
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＣＤ３の細胞外ドメインの一部（配列番号３２）を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，６９－７９，２００７参照）。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。最初の４ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ（それぞれ、４００ｎＭ、１３３ｎＭ、４５ｎＭ及び１５ｎＭ）、洗浄ストリンジェンシーを増加させて、ラウンド１からラウンド４まで選択圧力を増加させる（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４、上記引用）。ラウンド２～４において、ｍＲＮＡを、過剰のＣＤ３結合抗体ＯＫＴ３を使用する競合溶出によって回収した（各ラウンドにおいて、競合物過剰は、３５倍から３００倍まで一定に増加した）。
選択されたクローンは、二価フォーマットでＴ細胞を活性化する。
ＣＤ３標的に結合する個々のアンキリン反復タンパク質クローンを、リボソームディスプレイによって選択し、発現ベクターのｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）の誘導体にクローン化し、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ寒天（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）上にプレーティングし、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。発現ベクター、ＨｉｓタグとＭｙｃタグの両方とＣＤ３特異的なアンキリン反復ドメインを備えたＪｕｎロイシンジッパー構築物を、二価フォーマット（ＣＤ３特異的結合ドメインに関して）でのスクリーニングに使用し、Ｔ細胞の架橋による機能性の試験を可能にした。単一のコロニーを、１６０μＬの増殖培地（１％グルコース及びアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレート（単一ウェル内の各クローン）中に拾い上げ、３７℃で一晩インキュベートし、８００ｒｐｍで振盪した。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８．５μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去し（３２２０ｇで１５分間）、更なる使用のためにー２０℃で保存した。
ＣＤ３標的に結合する個々のアンキリン反復タンパク質クローンを、リボソームディスプレイによって選択し、発現ベクターのｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）の誘導体にクローン化し、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ寒天（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）上にプレーティングし、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。発現ベクター、ＨｉｓタグとＭｙｃタグの両方とＣＤ３特異的なアンキリン反復ドメインを備えたＪｕｎロイシンジッパー構築物を、二価フォーマット（ＣＤ３特異的結合ドメインに関して）でのスクリーニングに使用し、Ｔ細胞の架橋による機能性の試験を可能にした。単一のコロニーを、１６０μＬの増殖培地（１％グルコース及びアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレート（単一ウェル内の各クローン）中に拾い上げ、３７℃で一晩インキュベートし、８００ｒｐｍで振盪した。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８．５μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去し（３２２０ｇで１５分間）、更なる使用のためにー２０℃で保存した。
第１のステップでは、ＢＫ１１２ ＣＤ８＋モノクローナルＴ細胞を用いてＴ細胞活性化スクリーニングを行った。各溶解クローンの抽出物を、ＰＢＳＢ（１２％（ｗ／ｖ）ＦＢＳを補充したＰＢＳ ｐＨ７．４）中の１：２０希釈物（最終濃度）として、抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）コーティング９６ウェルプレートに適用し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで５回洗浄した後、ウェル当たり１００μｌの１００’０００ ＢＫ１１２ Ｔ細胞を添加し、Ｔ細胞アッセイ培地ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ－グルタミン＋１％のＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ＋２００ＩＵ ＩＬ２中で培養した。０．１μｇの１００μＬのＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐを添加し、プレートを室温で３分間、２０ｇで遠心分離した後、ＣＯ2－インキュベーター内で、３７℃で４～５時間インキュベートした。細胞を４℃で５分間、３５０ｇで遠心分離し、デカントした。細胞を表面ＣＤ８発現について染色した後、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘを用いて細胞を保存し、４℃で一晩インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳ＋２％のＦＢＳで洗浄し、Ｃｅｌｌ ｐｅｒｍ（ＢＤ）中の５０μｌのＩＦＮγ－ＡＰＣ抗体を添加し、４℃で３０分間インキュベートすることによって、細胞内ＩＦＮγについて染色した。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ＢＤからのＣｙｔｏｍｅｔｅｒ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて分析した。
選択されたクローンは、ＣＤ３への結合（ＨＴＲＦ及びＯＫＴ３競合によって示される）及び二重特異性フォーマットにおける機能性を示す。
Ｔ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）構築物を作製するために、同定された機能的な設計アンキリンリ反復ドメインヒットを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、腫瘍関連抗原１（ＴＡＡ１）特異的アンキリン反復ドメイン及びＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコールに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。２５ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン；３７℃）を使用して、５００ｍＬの培養物（ＴＢ、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ500（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理ステップの前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。
Ｔ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）構築物を作製するために、同定された機能的な設計アンキリンリ反復ドメインヒットを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、腫瘍関連抗原１（ＴＡＡ１）特異的アンキリン反復ドメイン及びＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコールに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。２５ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン；３７℃）を使用して、５００ｍＬの培養物（ＴＢ、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ500（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理ステップの前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。
第１のステップにおいて、組換えタンパク質への結合を、ＨＴＲＦアッセイを使用して試験した。ＰＢＳ－ＴＣ（０．１％（ｗ／ｖ）のカゼイン及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４）中のアンキリン反復タンパク質（５～６４０ｎＭ）の力価測定を、３８４ウェルプレートのウェル中で、４８ｎＭ（最終濃度）のヒトビオチン化ｓｃＣＤ３εγ、１：１００（最終濃度）の抗６ Ｈｉｓ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴアクセプタコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）及び１：１００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）に対して行い、室温で１２０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。いくつかの候補は用量依存的結合を示し、更なる評価のために使用した。全てのこれらの構築物について、結合シグナルは、ＣＤ３εの立体構造エピトープに結合する２０倍過剰のＣＤ３結合抗体（ヒトＦｃ領域を含有するＯＫＴ３、最終濃度２．４ｍＭ）と競合した場合にバックグラウンドレベルであった（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ、２００４，１０１（２０）：７６７５－７６８０）。用量依存的なインビトロでのＴ細胞活性化を、ＴＡＡ１発現腫瘍細胞の存在下で、ＢＫ１１２ Ｔ細胞活性化アッセイ（ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで予め活性化されたＢＫ１１２ ＣＤ８モノクローナルＴ細胞）を使用して確認した。細胞内ＩＦＮγレベルを、１～１００’０００ ｐＭの二重特異性ＴＣＥ構築物の存在下でのＢＫ１１２及びＳＫＯＶ３細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１０）の５時間のインキュベーション後に、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞上で測定した。最も強力な構築物は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞についてそれぞれ０．５ｎＭ及び０．４ｎＭのＥＣ５０値を示した。
選択されたＣＤ ３特異的アンキリン反復タンパク質の親和性成熟及び合理的設計
合理的設計と組み合わせた数ラウンドの親和性成熟を、親の低親和性結合ＣＤ ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ａと称する）に適用し、４つのより高い親和性のＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ｂ、Ｃ及びＤと称する）を得た。次いで、これらの前駆体分子を、最終的に、ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４に操作した。
合理的設計と組み合わせた数ラウンドの親和性成熟を、親の低親和性結合ＣＤ ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ａと称する）に適用し、４つのより高い親和性のＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ｂ、Ｃ及びＤと称する）を得た。次いで、これらの前駆体分子を、最終的に、ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４に操作した。
親和性成熟は、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，４：２６９－２７９に記載されているエラープローンＰＣＲ及びＤＮＡ Ｉシャッフリングを使用して多様性を導入することによって、ＣＤ３標的への十分な結合能力と、インビトロでのＴ細胞を効率的に活性化する能力の両方を考慮して選択した、親ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ａ）の１つに対して実行した。簡単に説明する。３ラウンドのリボソームディスプレイを、増加させた選択圧力（洗浄ステップはラウンド１（３×１５分）から、３×３０分（ラウンド２）まで、３×４５分（ラウンド３）まで増加）を用いて、ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質／ラウンド当たり約１～２個の変異を導入するために、異なる濃度のｄＮＴＰ類似体（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の変異誘発キット）を使用して実施したが、標的濃度は５ｎＭで一定に保った。第２のステップでは、ＤＮＡプールをＤＮＡシャッフルし、９０秒のＤＮＡｓｅ Ｉインキュベーション時間及びＤＮＡポリメラーゼＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、以前に記載されているように（Ｃａｄｗｅｌｌ＆Ｊｏｙｃｅ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ，１９９２，２：２８－３３；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４ ３７０：３８９－３９１；Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１９９６、２５５：５８９－６０３）使用して、１ラウンド又は２ラウンドのリボソームディスプレイで親クローンを使用して戻し交雑した。親和性成熟したＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質プールを、最終的にＮ末端Ｈｉｓ－Ｆｌａｇタグ、半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメイン、ＴＡＡ １結合アンキリン反復ドメイン及びＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインを含むｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングし、発現させ、前述のようにＨＴＲＦによって組換えｓｃＣＤ３εγへの結合についてスクリーニングした。リードクローンを選択した（前駆体Ｂ、全てのステップにおいて１０μＭのｄＮＴＰ類似体を使用する３ラウンドのエラープローンＰＣＲ並びに２ラウンドのＤＮＡシャッフリング及び戻し交雑を含む５ラウンドの親和性成熟後に作製した）。
同じプロセスにおいて、５位及び２０位におけるＮキャップ変異、２位及び４位における第１の内部反復変異、２位、５位及び２０位における第２の内部反復変異、並びに１位及び１８位におけるＣキャップ変異を含む、増加したＴ細胞活性化についてのいくつかの潜在的に有益な変異を、ＢＫ１１２アッセイにおけるＩＦＮγ＋Ｔ細胞の％によって同定した。熱安定性を維持するためにＮ及びＣキャップフレームワーク変異を最小限に維持しながら、これらの変異の組み合わせは、設計された変異体のセットをもたらし、これを、改善されたＴ細胞活性化について同じフォーマットで再び試験した。それによって、親及び最初に成熟したものと比較してより高いＴ細胞活性化効力を有する、新しい更に成熟した変異体（前駆体Ｃ）を生成した。
ＣＤ３親和性及びＴ細胞活性化効力を更に増加させるために、上記に記載されたものと同様に、前駆体Ｃクローンに対して第２の親和性成熟を行った。簡単に説明する。４ラウンドのリボソームディスプレイを行った。最初の３ラウンドでは、７．５μＭのｄＮＴＰ類似体を用いたエラープローンＰＣＲによって変異を導入した。ラウンド１及び３では、更に成熟したクローン自体又は競合のための非ビオチン化ＣＤ３標的タンパク質のいずれかを使用して、オフレート選択を適用した。１ｎＭの標的をラウンド１及び２で使用し、一方、５ｎＭをあまりストリンジェントでないラウンド３及び４で適用した。ＨＳＡ結合ドメイン及びＴＡＡ１結合アンキリン反復ドメインを含む三重特異性フォーマットにおいて、競合物として更に成熟したクローンの２５０倍アクセスを用いるオフレートＨＴＲＦアッセイを使用して、ＣＤ３変異体をスクリーニングした。競合後に最も高い残存ＨＴＲＦシグナルを有する合計３×９６個のクローンを配列決定した。改善された結合（Ｎキャップ１６位、第１の内部反復１、１２、１８、１９、２６、３０及び３３位、第２の内部反復２、３、７、２０、２１、２６、及び３２位、並びにＣキャップ９、１１及び１８位を含む）について、又は減少されたドメイン相互作用（Ｎキャップ１１、１８、１９、２６位、及びＣキャップ３、１９、及び２２位を含む）についての同定された有益な変異を、まず、ＢＫ１１２ Ｔ細胞活性化について、精製タンパク質変異体の個別又は対になる変異として試験した。次いで、最も有益な変異体を第２のステップにおいて組換え、変異体を最も高いＴ細胞活性化についてスクリーニングし、これにより、前駆体Ｄの同定をもたらした。
最後のステップでは、血清中半減期及び生物物理学的特性を改善するために、変異体ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃４を、それぞれＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質前駆体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに基づいて作製した。それにより、２３位及び／又は２６位のＮキャップ変異を導入し、フレームワーク変異のいくつかを除去した（１９位、１８位）。
ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する親和性成熟アンキリン反復ドメインをｐＱＥ（ＱＩＡｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ベースの発現ベクターにクローン化し、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号２７）を提供して、以下に記載するように簡単なタンパク質精製を容易にした。例えば、以下のアンキリンリピートタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（配列番号１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（配列番号２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（配列番号３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４（配列番号４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（配列番号１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（配列番号２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（配列番号３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４（配列番号４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の高レベル及び可溶性発現
詳細な分析のために、一価として、又はＴＡＡ及び／若しくはＨＳＡ結合アンキリン反復ドメインと組み合わせてのいずれかで、特異的なＣＤ３結合を示す選択されたクローンを大腸菌細胞で発現させ、Ｈｉｓタグを使用して精製し、続いて当業者に公知の標準的なプロトコール及び樹脂に従ってＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システムでサイズ排除クロマトグラフィを行った。一価構築物及び多価構築物について、それぞれ、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）又はＰＢＳ ｐＨ７．４中で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮したとき、タンパク質は単量体であり、可溶性であった。そのようなＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の代表的な例を、図１に示す。
詳細な分析のために、一価として、又はＴＡＡ及び／若しくはＨＳＡ結合アンキリン反復ドメインと組み合わせてのいずれかで、特異的なＣＤ３結合を示す選択されたクローンを大腸菌細胞で発現させ、Ｈｉｓタグを使用して精製し、続いて当業者に公知の標準的なプロトコール及び樹脂に従ってＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システムでサイズ排除クロマトグラフィを行った。一価構築物及び多価構築物について、それぞれ、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）又はＰＢＳ ｐＨ７．４中で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮したとき、タンパク質は単量体であり、可溶性であった。そのようなＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の代表的な例を、図１に示す。
実施例２：例示的なＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の安定性評価
ＵＶ分光法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いた例示的なＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の評価
４つの選択されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質を詳細に分析して、それらの生物物理学的特性を評価した。簡単に説明すると、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）中の精製されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１（配列番号１）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃２（配列番号２）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃３（配列番号３）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃４（配列番号４）を、滅菌ガラスバイアルＳｃｈｍｉｄｌｉｎ：ＬＰＰ １１ ０９ ０６２０）に小分けし、５０℃で１８日間インキュベートすることによりストレスをかけた。適用されたストレス条件は、４℃で２年間保存した後の生物物理学的特性の予測を可能にする。各ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質について、アリコートを参照としてー７０℃で保存した。参照試料及び熱ストレスを受けた試料を、分析前に同じ数の凍結解凍サイクルに曝露した。試料を、ＵＶ分光法によって凝集及び濁度（サイズ範囲＞１００μｍ）について、並びにＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び分析的ＳＥＣによって多量体化、凝集及び断片化について評価した。次いで、ストレスをかけた試料をそれぞれの参照試料と比較した（図２、図３及び図４）。
ＵＶ分光法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いた例示的なＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の評価
４つの選択されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質を詳細に分析して、それらの生物物理学的特性を評価した。簡単に説明すると、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）中の精製されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１（配列番号１）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃２（配列番号２）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃３（配列番号３）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃４（配列番号４）を、滅菌ガラスバイアルＳｃｈｍｉｄｌｉｎ：ＬＰＰ １１ ０９ ０６２０）に小分けし、５０℃で１８日間インキュベートすることによりストレスをかけた。適用されたストレス条件は、４℃で２年間保存した後の生物物理学的特性の予測を可能にする。各ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質について、アリコートを参照としてー７０℃で保存した。参照試料及び熱ストレスを受けた試料を、分析前に同じ数の凍結解凍サイクルに曝露した。試料を、ＵＶ分光法によって凝集及び濁度（サイズ範囲＞１００μｍ）について、並びにＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び分析的ＳＥＣによって多量体化、凝集及び断片化について評価した。次いで、ストレスをかけた試料をそれぞれの参照試料と比較した（図２、図３及び図４）。
円偏光二色性（ＣＤ）分光法を用いた例示的なＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の熱安定性評価
同じＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質をまた、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１５分光光度計を使用して、それらの熱安定性及びアンフォールディング／リフォールディング傾向について評価した（ストレスをかけていないタンパク質のみ）。選択されたタンパク質のＴｍ（融解温度）は、熱安定性のパラメータとしてＣＤによって決定される。簡単に説明すると、楕円率を２２２ ｎＭで記録し、２０℃～９５℃の温度範囲を適用した後、逆スキャンを行ってリフォールディング挙動を記録した。選択されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質のＴｍは、タンパク質アンフォールディングの中点である。
同じＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質をまた、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１５分光光度計を使用して、それらの熱安定性及びアンフォールディング／リフォールディング傾向について評価した（ストレスをかけていないタンパク質のみ）。選択されたタンパク質のＴｍ（融解温度）は、熱安定性のパラメータとしてＣＤによって決定される。簡単に説明すると、楕円率を２２２ ｎＭで記録し、２０℃～９５℃の温度範囲を適用した後、逆スキャンを行ってリフォールディング挙動を記録した。選択されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質のＴｍは、タンパク質アンフォールディングの中点である。
試料を、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）中２μＭの濃度で調製した（図５）。試験した４つ全てのタンパク質について、６５℃より高いＴｍが得られた。
動的光散乱（ＤＬＳ）による凝集開始温度Ｔaggの決定
同じＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質を、それらの温度依存性凝集傾向（Ｔagg）について評価した。２５℃～８５℃の温度範囲を適用し、タンパク質の流体力学半径に対してプロットした。評価のために、Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ（シリアル番号１４０－ＷＰＲ２）デバイスを使用し、測定値はＤｙｎａｍｉｃｓ７．８．１．３０ソフトウェアで処理した。アンキリン反復試料（表２）を、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）中１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、５つの複製物（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５）において測定した（図６）。
同じＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質を、それらの温度依存性凝集傾向（Ｔagg）について評価した。２５℃～８５℃の温度範囲を適用し、タンパク質の流体力学半径に対してプロットした。評価のために、Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ（シリアル番号１４０－ＷＰＲ２）デバイスを使用し、測定値はＤｙｎａｍｉｃｓ７．８．１．３０ソフトウェアで処理した。アンキリン反復試料（表２）を、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）中１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、５つの複製物（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５）において測定した（図６）。
図６に示すように、試験した４つ全てのアンキリンのアンキリン反復タンパク質は、６５℃よりもはるかに高い温度で凝集する傾向がある。
実施例３：雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析
本発明のＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインが、治療薬の開発に有用であるためにｉｎ ｖｉｖｏで適切な血清半減期を有するかどうかを決定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。そのために、ＤＡＲＰｉｎ構築物をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメイン、続いてＣＤ３特異的結合ドメインの１つを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に上記に記載されるように発現させた。２つのアンキリン反復ドメインを、配列番号３１のリンカーなどのペプチドリンカーによって互いに連結させた。
本発明のＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインが、治療薬の開発に有用であるためにｉｎ ｖｉｖｏで適切な血清半減期を有するかどうかを決定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。そのために、ＤＡＲＰｉｎ構築物をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメイン、続いてＣＤ３特異的結合ドメインの１つを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に上記に記載されるように発現させた。２つのアンキリン反復ドメインを、配列番号３１のリンカーなどのペプチドリンカーによって互いに連結させた。
例えば、以下のアンキリンリピートタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５（配列番号３３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６（配列番号３４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（配列番号３５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（配列番号３６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５（配列番号３３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６（配列番号３４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（配列番号３５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（配列番号３６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号２７）を有する）、
インビボ投与及び試料採取
ヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン（配列番号２９）でフォーマットしたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８を、各アンキリン反復融合タンパク質について、６匹のマウスの尾静脈に単回静脈内ボーラス注射として投与した。目標用量レベルは、５ｍＬ／ｋｇの適用容量で１ｍｇ／ｋｇであった。アンキリン反復融合タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に配合した。
ヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン（配列番号２９）でフォーマットしたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８を、各アンキリン反復融合タンパク質について、６匹のマウスの尾静脈に単回静脈内ボーラス注射として投与した。目標用量レベルは、５ｍＬ／ｋｇの適用容量で１ｍｇ／ｋｇであった。アンキリン反復融合タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に配合した。
マウスを、等しい数の動物を有する２つの群に分割した。各マウスから４つの血清試料を収集した。薬学的動態調査のための血液試料を、化合物投与後５分、４時間、２４時間、４８時間、７６時間、９６時間、及び１６８時間に採取した。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取した。
血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのＥＬＩＳＡによる生物分析
ＰＢＳ中の１０ｎＭのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）のウェル当たり１００μｌを、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。ウェル当たり３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００振盪器（４５０ｒｐｍ）で、０．２５％のカゼイン（ＰＢＳＴ－Ｃ）を補充した３００μｌのＰＢＳＴで、室温（ＲＴ）で１時間ウェルをブロックした。プレートを上記のように洗浄した。ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μｌの５ｎｍｏｌ／Ｌのウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。
ＰＢＳ中の１０ｎＭのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）のウェル当たり１００μｌを、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。ウェル当たり３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００振盪器（４５０ｒｐｍ）で、０．２５％のカゼイン（ＰＢＳＴ－Ｃ）を補充した３００μｌのＰＢＳＴで、室温（ＲＴ）で１時間ウェルをブロックした。プレートを上記のように洗浄した。ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μｌの５ｎｍｏｌ／Ｌのウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。
希釈した血清試料（１：５の希釈ステップで１：２０～１：３１２５００）又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料（１：３の希釈ステップで０及び５０～０．０００８ｎｍｏｌ／Ｌ）の１００μｌを、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間適用した。プレートを上記のように洗浄した。
次いで、ウェルを１００μｌのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６、ＰＢＳＴ－Ｃ中１：２０００）と共にインキュベートし、室温、４５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を５分間使用して、１ｍｏｌ／ＬのＨ2ＳＯ4を１００μｌ添加することによって停止させてＥＬＩＳＡを展開した。４５０ｎｍでの吸光度及び６２０ｎｍでの吸光度の差を計算した。試料は、２つの異なるプレートで二連で測定した。図７Ａは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８の血清濃度を、マウスへの単回静脈内投与後の時間の関数として示している。トレースは、化合物のおおよその単一指数関数的除去を示す。
薬物動態解析
薬物動態データ解析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの一部としてＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムのバージョン７．０を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで行った。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント解析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を用いて行った。以下の薬物動態パラメータを計算した。
ＡＵＣｉｎｆ、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２。
薬物動態データ解析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの一部としてＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムのバージョン７．０を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで行った。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント解析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を用いて行った。以下の薬物動態パラメータを計算した。
ＡＵＣｉｎｆ、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２。
最大血清濃度（Ｃｍａｘ）及びそれらの発生時間（Ｔｍａｘ）は、血清濃度－時間プロファイルから直接得られた。血清濃度－時間曲線の下の面積（ＡＵＣｉｎｆ）は、最後のサンプリング点（Ｔｌａｓｔ）までの線形台形公式及び終末相の単一指数関数的減少を仮定した無限大への外挿によって決定した。無限大までの外挿は、Ｃｌａｓｔ／λｚを使用して実行され、ここで、λｚは、対数線形回帰によって推定された最終速度定数を示し、Ｃｌａｓｔは、最終対数線形回帰によってＴｌａｓｔで推定された濃度を示す。総血清クリアランス（Ｃｌ＿ｐｒｅｄ）及び見かけの終末相半減期を以下のように計算した。Ｃｌ＿ｐｒｅｄ＝静脈内用量／ＡＵＣｉｎｆ及びｔ１／２＝ｌｎ２／λｚ。定常状態分布体積Ｖｓｓは、以下によって決定した。Ｖｓｓ＝ｉ．ｖ．投与量・ＡＵＭＣｉｎｆ／（ＡＵＣｉｎｆ）２。ＡＵＭＣｉｎｆは、ＡＵＣｉｎｆの計算について記載したのと同じ外挿手順を使用して、無限大に外挿された薬物濃度－時間曲線の第１の瞬間の総面積を示す。ｎｍｏｌ／Ｌで与えられた濃度に基づいてＰＫパラメータを計算するために、ｍｇ／ｋｇとして与えられた投与量値をアンキリン反復タンパク質の分子量を使用してｎｍｏｌ／ｋｇに変換した。表３は、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、試験した４つのアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８の薬物動態特性の概要を示す。
実施例４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるヒトＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数（ＫD）の決定
組替えヒトＣＤ３標的上の４つの精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、本発明のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３並びにＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４をサブクローニングし、Ｎ末端 Ｈｉｓタグ、アンキリン反復ドメインに結合する２つの異なるＴＡＡ（それぞれＴＡＡ２及びＴＡＡ３）、続いて、４つのＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質構築物の１つを含有する、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。
組替えヒトＣＤ３標的上の４つの精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、本発明のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３並びにＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４をサブクローニングし、Ｎ末端 Ｈｉｓタグ、アンキリン反復ドメインに結合する２つの異なるＴＡＡ（それぞれＴＡＡ２及びＴＡＡ３）、続いて、４つのＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質構築物の１つを含有する、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。
簡単に説明すると、ビオチン化ヒトｓｃＣＤ３εγを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有）中に希釈し、ＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に、約７００～１４００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまでコーティングした。次いで、アンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ３との相互作用を、マルチトレースＳＰＲ測定については６４ｎＭ～４ｎＭの濃度範囲を網羅する連続希釈のアンキリン反復タンパク質を含有する３００μＬの泳動用緩衝液（０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）を注入すること、続いて６０μＬ／分の一定流量で少なくとも１０分間、泳動用緩衝液流を注入すること（オフレート測定）によって測定した。再生は、３０μＬの１０ｍＭグリシンｐＨ２を用いて行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、ランニング緩衝液のみの注入）を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。親和性成熟構築物について、ＣＤ３に対する結合パラメータ（ＫD、オンレート、オフレート）を決定した。結合平衡には、最も高い試料濃度であっても適切に到達せず、オンレートに対して最適ではない適合をもたらしたので、オンレート（ｋon）及び解離定数（ＫD）は、近似としてのみ与えられる。
代表例として、図７Ｂは、ＴＡＡ２結合設計アンキリン反復ドメイン及びＴＡＡ３結合設計アンキリン反復ドメインでフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子＃３について得られたＳＰＲトレースを示す。解離定数（ＫD）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。ヒトＣＤ３による選択されたアンキリン反復タンパク質の結合相互作用のＫD値を、６～３５ｎＭの範囲にあると決定した（表４を参照）。
実施例５：ＣＤ３ Ｔ細胞結合の決定
ＣＤ３結合の決定は、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査撮像サイトメトリーを使用して、初代ヒトＴ細胞で行った。したがって、ｐａｎ－Ｔ細胞精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から初代Ｔ細胞を単離した。三重特異性フォーマット（ＴＡＡ２及びＴＡＡ３結合アンキリン反復ドメインを含む）にフォーマットされた、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４、本明細書では、それぞれ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃Ａ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｂ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｃ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｄと称するもの、又は四重特異性フォーマット（ヒト血清アルブミンに特異的に結合する追加のアンキリン反復ドメインを含む）の力価測定を、６００μＭのヒト血清アルブミン（生理的血清濃度を模倣するため）の存在下、ウェル当たり５０，０００個のｐａｎ－Ｔ細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。三重特異性ＴＣＥタンパク質を生成するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４を、それぞれ、サブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、続いて、２つの異なるＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメイン（それぞれ、ＴＡＡ２特異性及びＴＡＡ３特異性の順序で）、次いで、続いて、本発明のＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインの１つをコードするｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。四重特異性ＴＣＥタンパク質については、ヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメインを、ＨｉｓタグとＴＡＡ２特異的ドメインとの間に更に含めた。アンキリン反復ドメインを、配列番号３１のリンカーなどのペプチドリンカーによって互いに連結させた。ＴＡＡ２又はＴＡＡ３のいずれかを標的とする、２つのベンチマークＴ細胞エンゲージャを対照として適用した。洗浄後、ＣＤ３結合を、１：１００希釈した抗ペンタ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって検出した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、５μＭのＤＲＡＱ５（Ａｂｃａｍ）によって室温で１５分間対比染色した。遠赤色対比染色細胞上のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合の平均蛍光強度の中央値を、Ｃｅｌｌｉｓｔａソフトウェア（ＳＰＴ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してＭｉｒｒｏｒｂａｌｌによって測定し、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用してプロットした。
ＣＤ３結合の決定は、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査撮像サイトメトリーを使用して、初代ヒトＴ細胞で行った。したがって、ｐａｎ－Ｔ細胞精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から初代Ｔ細胞を単離した。三重特異性フォーマット（ＴＡＡ２及びＴＡＡ３結合アンキリン反復ドメインを含む）にフォーマットされた、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４、本明細書では、それぞれ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃Ａ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｂ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｃ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｄと称するもの、又は四重特異性フォーマット（ヒト血清アルブミンに特異的に結合する追加のアンキリン反復ドメインを含む）の力価測定を、６００μＭのヒト血清アルブミン（生理的血清濃度を模倣するため）の存在下、ウェル当たり５０，０００個のｐａｎ－Ｔ細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。三重特異性ＴＣＥタンパク質を生成するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４を、それぞれ、サブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、続いて、２つの異なるＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメイン（それぞれ、ＴＡＡ２特異性及びＴＡＡ３特異性の順序で）、次いで、続いて、本発明のＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインの１つをコードするｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。四重特異性ＴＣＥタンパク質については、ヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメインを、ＨｉｓタグとＴＡＡ２特異的ドメインとの間に更に含めた。アンキリン反復ドメインを、配列番号３１のリンカーなどのペプチドリンカーによって互いに連結させた。ＴＡＡ２又はＴＡＡ３のいずれかを標的とする、２つのベンチマークＴ細胞エンゲージャを対照として適用した。洗浄後、ＣＤ３結合を、１：１００希釈した抗ペンタ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって検出した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、５μＭのＤＲＡＱ５（Ａｂｃａｍ）によって室温で１５分間対比染色した。遠赤色対比染色細胞上のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合の平均蛍光強度の中央値を、Ｃｅｌｌｉｓｔａソフトウェア（ＳＰＴ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してＭｉｒｒｏｒｂａｌｌによって測定し、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用してプロットした。
図８Ａ～Ｂに示されるように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、＃Ａに対する検出可能な結合なしから、＃Ｄに対するベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャ、ＴＡＡ２に対して結合特異性を有するＴＣＥ１及びＴＡＡ３に対して結合特異性を有するＴＣＥ２）と同程度に良好な結合までの幅広い親和性を示す。Ｔ細胞へのＣＤ３結合は、ＳＰＲによって測定されるＣＤ３親和性と合致する。追加のＨＳＡ結合ドメインの存在（図８Ｂを参照されたい）は、Ｔ細胞への結合にわずかな影響しか及ぼさなかった。表５は、４つの例示的なアンキリン反復タンパク質の、それらのＥＣ50値によって表されるＣＤ３結合親和性を示す。
実施例６：ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質によって誘導される標的特異的短期腫瘍細胞死滅のＬＤＨ細胞傷害性アッセイによる評価
細胞結合について記載されたフォーマットにおける４つのＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１～＃４）の特異性及び効力を、ＬＤＨ放出によるインビトロの短期細胞傷害性アッセイによって評価した。
細胞結合について記載されたフォーマットにおける４つのＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１～＃４）の特異性及び効力を、ＬＤＨ放出によるインビトロの短期細胞傷害性アッセイによって評価した。
エフェクター細胞及び標的細胞を、６００μＭのヒト血清アルブミン（生理学的濃度を模倣するため）の存在下で、５：１のＥ：Ｔ比で９６ウェルプレート中、２連で共インキュベートした。ｐａｎ－Ｔ細胞単離キット（Miltenyi）を使用することによって、ヒトＰＢＭＣから付着していない（untouched）Ｔ細胞を単離した。１ウェル当たり１００，０００ 個の精製ｐａｎ－Ｔ細胞（エフェクター細胞）と２０，０００個のＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞（標的細胞）を、選択したＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質、対照ベンチマーク分子又は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む対照の連続希釈物と３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、１ウェル当たり１００μｌの上清及び１ウェル当たり１００μｌのＬＤＨ反応混合物（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を３０分間インキュベートした。吸光度を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００Ｐｒｏリーダーによって４９２ｎｍ～６２０ｎｍで測定した。バックグラウンド補正後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してＯＤ値をプロットした。
図９Ａに示されるように、半減期延長のないＤＡＲＰｉｎタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３は、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャー、ＴＡＡ２に対して結合特異性を有するＴＣＥ１）に匹敵する腫瘍細胞死滅を誘導したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４は、１０～１００倍低い効力を示す。図９Ｂにおいて、半減期が延長されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約４～７０倍の低下を示す。
実施例７：標的特異的短期Ｔ細胞活性化及びＩＦＮγ分泌の評価。
上述のＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（実施例５及び６）の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカーを測定するＦＡＣＳ及びＩＦＮγ分泌を測定するＥＬＩＳＡによって、インビトロの短期Ｔ細胞活性化アッセイで評価した。
上述のＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（実施例５及び６）の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカーを測定するＦＡＣＳ及びＩＦＮγ分泌を測定するＥＬＩＳＡによって、インビトロの短期Ｔ細胞活性化アッセイで評価した。
したがって、ウェル当たり１００，０００個の精製ｐａｎ－Ｔ細胞（エフェクター細胞）と１００，０００個のＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞（標的細胞）を、６００μＭのヒト血清アルブミンの存在下で、選択した結合タンパク質又は対照ベンチマーク分子の段階希釈物と２連で ３７℃で２４時間共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比１：１）。２４時間後、製造業者のプロトコルに従って、ヒトＩＦＮγ標準ＡＢＴＳ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）によるＩＦＮγ分泌の測定のために、１ウェル当たり１００μｌの上清を移した。細胞を洗浄し、１：１’０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２５０のマウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００のマウス抗ヒトＣＤ ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性のＣＤ８＋ゲートＴ細胞上、ＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。
図１０Ａに示すように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３は、半減期延長なしで、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャー、ＴＡＡ２に対して結合特異性を有するＴＣＥ１）に匹敵する特異的な短期Ｔ細胞活性化を誘導したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４は１０～１００倍低い効力を示した。図１０Ｂにおいて、半減期が延長されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約３～１００倍の低下を示した。
実施例８：ＩｎｃｕＣｙｔｅによる標的特異的長期腫瘍細胞死滅の評価
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（実施例５、６及び７に記載される）の特異性及び効力を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３プラットフォームを使用する、インビトロの長期死滅アッセイによって評価した。
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（実施例５、６及び７に記載される）の特異性及び効力を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３プラットフォームを使用する、インビトロの長期死滅アッセイによって評価した。
ＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞を最初にＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ）レンチウイルス粒子（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で形質導入し、赤色蛍光細胞を０．７μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び／又はＦＡＣＳソーティングによって選択した。次いで、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて長期腫瘍細胞死滅を評価した。エフェクター細胞及び標的細胞を、１：２００のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｇｒｅｅｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）及び６００μＭのヒト血清アルブミン（生理学的濃度を模倣するため）の存在下で、５：１のＥ：Ｔ比で０．０１％のポリ－Ｌ－オルニチンをコーティングした９６ウェルプレート上で２連で同時インキュベートした。１ウェル当たり５０’０００個の精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）ｐａｎ－Ｔ細胞（健常ドナーＰＢＭＣから単離）＋１０’０００個のＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞（ＮＬＲ形質導入）を、選択されたアンキリン反復タンパク質又は対照ベンチマーク分子の連続希釈物と一緒に３７℃で最大６日間インキュベートした。細胞増殖（ＮＬＲからの赤色蛍光）（ＮＬＲからの赤色蛍光）及び細胞死（アネキシンＶからの緑色蛍光）について評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して６日間の共培養後の曲線下面積を計算することによって、総細胞増殖及び腫瘍細胞死滅を分析した。
図１２に示すように、試験したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、＃３及び＃４は、半減期延長とは無関係に、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャ、ＴＡＡ２に対して結合特異性を有するＴＣＥ１及びＴＡＡ３に対して結合特異性を有するＴＣＥ２）に匹敵する強力かつ特異的な腫瘍細胞死滅を示す。より低い親和性のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１のみが、死滅効力の低下を示す。
実施例９：ＦＡＣＳによる標的特異的長期Ｔ細胞活性化及び増殖の評価
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（実施例５、６、７及び８に記載される）の特異性及び効力を、ＦＡＣＳベースのインビトロ長期Ｔ細胞活性化アッセイによって評価した。
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（実施例５、６、７及び８に記載される）の特異性及び効力を、ＦＡＣＳベースのインビトロ長期Ｔ細胞活性化アッセイによって評価した。
薬物及び標的特異性Ｔ細胞活性化及び増殖を評価するために、エフェクター細胞及び標的細胞を、選択した分子の連続希釈物の存在下で１：１のＥ：Ｔ比にて２連で同時インキュベートした。精製された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）ｐａｎ－Ｔ 細胞（健康なドナーＰＢＭＣから単離）を最初に５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で、３７℃で２０分間標識した。ウェル当たり５０，０００個のＣＴＶ標識ｐａｎ－Ｔ細胞＋５０，０００個のＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞を、次いで、６００μＭのヒト血清アルブミンの存在下（生理的濃度を模倣するため）、選択したＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質又は対照ベンチマーク分子 ＴＣＥ１及びＴＣＥ２）の連続希釈物と共に３７℃でインキュベートした。５日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：５’０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：１００のマウス抗ヒトＣＤ８ ＰＥ（ＢＤ）、及び１：１００のマウス抗ヒト－ＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体で、４℃で３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＣｅｌｌＦＩＸ（ＢＤ）を使用して４℃で２０分間固定し、最後に緩衝液をＰＢＳで置き換えた。染色された細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。Ｔ細胞増殖を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＴＶ陽性細胞をゲーティングすることによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。
図１３及び１４に示すように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３は、半減期の延長なしで、ベンチマーク分子（ＴＡＡ２に対して結合特異性を有する既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャＴＣＥ１、及びＴＡＡ３に対して結合特異性を有するＴＣＥ２）に匹敵する長期Ｔ細胞活性化及び増殖を誘導したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４は１０～１００倍低い効力を示した。半減期が延長されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約５～３０倍の低下を示す。
実施例１０：ＰＢＭＣヒト化マウス及びＴＡＡ発現腫瘍モデルにおける例示的な多重特異性ＴＣＥ結合タンパク質のインビボ有効性評価
実験Ａ．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４を、四重特異性ＴＣＥ分子にフォーマットし、この四重特異性ＴＣＥ分子は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３、又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４に加えて、ＴＡＡ２、ＴＡＡ３、及びヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。そのために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４をサブクローニングし、上記に記載したように、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、続いてヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン、続いて２つの異なるＴＡＡ特異性（それぞれＴＡＡ２特異性及びＴＡＡ３特異性）アンキリン反復ドメイン、続いて本発明のＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインの１つをコードするｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体で発現させた。アンキリン反復ドメインを、配列番号３１のリンカーなどのペプチドリンカーによって互いに連結させた。対応するＴＣＥタンパク質を、本明細書において、それぞれ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２を含む）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３を含む）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４を含む）と命名される。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２を、同様に三重特異性ＴＣＥ分子にフォーマットし、三重特異性ＴＣＥ分子は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２に加えて、ＴＡＡ２及びＴＡＡ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むが、ＨＳＡ特異的アンキリン反復ドメインを欠く。このＴＣＥタンパク質を本明細書ではＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅと命名する。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈを、固形皮下腫瘍としてＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞株を担持する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルで試験し、現在臨床試験で試験されている既知のＴＡＡ３標的化Ｔ細胞エンゲージャ分子と比較した。
実験Ａ．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４を、四重特異性ＴＣＥ分子にフォーマットし、この四重特異性ＴＣＥ分子は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３、又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４に加えて、ＴＡＡ２、ＴＡＡ３、及びヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。そのために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４をサブクローニングし、上記に記載したように、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、続いてヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン、続いて２つの異なるＴＡＡ特異性（それぞれＴＡＡ２特異性及びＴＡＡ３特異性）アンキリン反復ドメイン、続いて本発明のＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインの１つをコードするｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体で発現させた。アンキリン反復ドメインを、配列番号３１のリンカーなどのペプチドリンカーによって互いに連結させた。対応するＴＣＥタンパク質を、本明細書において、それぞれ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２を含む）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３を含む）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４を含む）と命名される。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２を、同様に三重特異性ＴＣＥ分子にフォーマットし、三重特異性ＴＣＥ分子は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２に加えて、ＴＡＡ２及びＴＡＡ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むが、ＨＳＡ特異的アンキリン反復ドメインを欠く。このＴＣＥタンパク質を本明細書ではＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅと命名する。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈを、固形皮下腫瘍としてＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞株を担持する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルで試験し、現在臨床試験で試験されている既知のＴＡＡ３標的化Ｔ細胞エンゲージャ分子と比較した。
材料及び方法
動物：６０匹の雌ＮＯＧマウス、試験開始時の動物の年齢６５日（提供者Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
動物：６０匹の雌ＮＯＧマウス、試験開始時の動物の年齢６５日（提供者Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
試験分子及び対照分子：ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈを、５ｍｇ／ｍｌの濃度で以前に記載されたように産生し；対照は、ベンチマークＴＡＡ３標的化ＴＣＥ ０．５９ｍｇ／ｍｌであり、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧによって提供された。
処置群：６０匹のマウスを研究に登録した。全ての動物を８つの異なる研究群に無作為に割り当てた。腫瘍細胞接種の日付を０日目として示す。
方法：実験開始の２日前に体重を記録し、各群において等しい平均体重及び同様の標準偏差を有するようにマウスを無作為化した。平均重量は１９．６ｇであった。
－２日目に、マウスに５×１０6個のＰＢＭＣを腹腔内注射した。
０日目に、マウスの右脇腹に１０6個のＴＡＡ２／ＴＡＡ３発現腫瘍細胞を皮下注射した。
５日目に、表８に従って腹腔内注射による処置を開始した。最後の処置は１６日目であった。
腫瘍測定及び秤量を、７、１０、１２、１４、１７、１９日目に実施した。腫瘍体積を以下の式に従って計算した：［長さ×（幅）２×π］／６。
腫瘍体積データを、Ａｎｏｖａによって増殖曲線を比較し、続いて多重比較（Ｄｕｎｎ検定）のために補正したノンパラメトリッククラスカル・ウォリス（Kruskal-Wallis）検定によって分析した。
処置群の腫瘍体積を、対照群の体積と比較した。２匹の異なるＰＢＭＣドナーからのデータを一緒に及び別々に分析した。
結果
腫瘍増殖阻害
試験した多特異性結合タンパク質及び既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャへの曝露時の腫瘍増殖曲線を、両方のドナーを一緒に及び別々に含めて、図１５ Ａ～Ｃに要約する。
腫瘍増殖阻害
試験した多特異性結合タンパク質及び既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャへの曝露時の腫瘍増殖曲線を、両方のドナーを一緒に及び別々に含めて、図１５ Ａ～Ｃに要約する。
ドナーＢ由来のＰＢＭＣは、マウス血液中のＣＤ８陽性リンパ球の量を低下させた。概して、抗腫瘍効果は、試験した全ての分子において観察された。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ及び既知のＴＡＡ３ Ｔ細胞エンゲージャは、治療の開始後５日目から始まる効果を示したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈの効果は、治療の開始後７日目から始まって有意かつ関連性があった。サブグループＡのみを比較した場合、統計的に有意な効果が、治療の開始後５日目から始まって全ての試験分子について観察された。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈの効果は、ベンチマークＴＡＡ３ Ｔ細胞エンゲージャ及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅの効果よりも強かった。サブグループＢを比較した場合、有意な抗腫瘍効果が、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ及びベンチマークＴＡＡ３ Ｔ細胞エンゲージャについて観察された。
ベンチマークＴＣＥで得られた結果は、使用されたモデルを確証するものであった。同時に、ドナーＢ由来のＰＢＭＣでヒト化されたマウスにおいて観察されたベンチマークのあまり顕著でない効果は、このサブグループに属するマウスの感受性がより低いことを示す。これはまた、ドナーＢ由来のＰＢＭＣでヒト化されたマウスにおける実験の終わりに見出されたヒトＣＤ８陽性リンパ球の有意に低い量によって反映される。
したがって、ドナーＡ由来のＰＢＭＣを用いてヒト化されたマウスから得られたデータは、より大きな関連性があるものとなる。
腫瘍サイズにおける高い変動性は、腫瘍が全てのマウスにおいて認識可能になる前に処置が開始されたため、マウスにおいて無作為化及び範囲選択が行われなかったという事実に起因する。この高い変動性にもかかわらず、最初の腫瘍体積に対する正規化を必要とせずに統計分析を行うことができた。
本発明者らは、試験した全ての多重特異性結合タンパク質が抗腫瘍活性を示し、半減期延長分子であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｆ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｇ及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｈが、使用した用量及び適用レジメンで、半減期延長していないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅよりも強い抗腫瘍活性を有することを確認した。理論に束縛されるものではないが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃Ｅの曝露は、この分子のより短い半減期に起因して、より低くなり得ると考えられる。
全体として、試験した４つ全ての多重特異性結合タンパク質は、ベンチマークＴ細胞エンゲージャの抗腫瘍活性に匹敵するか又はそれよりも強いインビボ抗腫瘍活性を示した。これらの結果は、本発明のＣＤ ３特異性アンキリン反復ドメインをＴＡＡ特異的結合ドメイン（及び半減期延長部分）と組み合わせて、インビボでの抗腫瘍活性を有するＴ細胞エンゲージャ分子を形成することができることを実証した。したがって、そのようなＴＣＥ分子においてフォーマットされるとき、本発明のＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインは、インビボでＣＤ３に結合し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を維持する。
実験Ｂ．同様の実験設定において、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３を、それぞれＴＡＡ２、ＴＡＡ３及びＴＡＡ４に対して結合特異性を有する３つの設計アンキリン反復ドメインと、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つの設計アンキリン反復ドメインとを更に含むヘキサ特異性ＴＣＥ分子にフォーマットした。そのために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、続いて２つのヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン、次いで続いて３つの異なるＴＡＡ特異性アンキリン反復ドメイン（それぞれＴＡＡ３特異性、ＴＡＡ２特異性及びＴＡＡ４特異性の順序で）、次いで続いて本発明のＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインの１つ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３）をコードするｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に上記のように発現させた。アンキリン反復ドメインを、配列番号３１のリンカーなどのペプチドリンカーによって互いに連結させた。この六重特異性ＴＣＥ分子は、２０２１年１２月９日に出願された米国特許仮出願第６３／２６５，１８４号により詳細に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような多重特異性ＴＣＥフォーマットでのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）プロテイン＃３を、固形皮下腫瘍としてＴＡＡ２／ＴＡＡ３／ＴＡＡ４発現腫瘍細胞株（Ｍｏｌｍ－１３）を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルにおいて試験し、臨床試験で本試験された既知のＴＡＡ３標的化Ｔ細胞エンゲージャと比較した。
簡単に説明すると、インビボ実験を、６～９週齢の雌免疫不全ＮＸＧマウス（ａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓによって提供された）において実施した。マウスを、標準的な齧歯類マイクロアイソレーターケージ（２０±１℃の室温、５０±１０％の相対湿度及び１２時間の明暗サイクル）内の標準化環境条件下で維持した。マウスに、放射線照射食品及び床敷並びに０．２２ｕｍ濾過飲料水を与えた。全ての実験は、スイス動物保護法に従って州及び連邦の獣医学当局からの認可を受けて行った。
ＮＸＧマウスにｈＰＢＭＣを腹腔内注射した後、癌細胞の異種移植を行った。ＴＡＡ２／ＴＡＡ３／ＴＡＡ４発現腫瘍細胞を、ＮＸＧマウスの右側腹部の皮下に（ｓ．ｃ．）異種移植した。２匹のｈＰＢＭＣドナーを使用した。処置は、癌細胞移植の４日後に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。大部分の腫瘍はこの時点ではまだ確立されていなかった。処置は以下のように施した：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（多重特異性ＴＣＥフォーマット）を、０．５ｍｇ／ｋｇで、２週間、週に３回静脈注射で投与した。
ベンチマークＴＡＡ３標的化Ｔ細胞エンゲージャを、０．５ｍｇ／ｋｇで２週間、毎日ｉ．ｖ．投与した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（多重特異性ＴＣＥフォーマット）を、０．５ｍｇ／ｋｇで、２週間、週に３回静脈注射で投与した。
ベンチマークＴＡＡ３標的化Ｔ細胞エンゲージャを、０．５ｍｇ／ｋｇで２週間、毎日ｉ．ｖ．投与した。
腫瘍サイズをキャリパー測定によって評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した：腫瘍体積（ｍｍ3）＝０．５×長さ×幅2。
図１６（Ａ～Ｂ）に見られるように、多重特異性ＴＣＥフォーマットでのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３は、実験の全期間にわたって（図１６Ａ）、及び最初の注射の１７日後に（図１６Ｂ）、腫瘍増殖及び腫瘍体積の阻害に関して良好な有効性を示した。この結果は、本発明のＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインをＴＡＡ特異的結合ドメイン及び半減期延長部分と組み合わせて、インビボでの抗腫瘍活性を有するＴ細胞エンゲージャ分子を形成することができることを更に実証した。したがって、そのようなＴＣＥ分子においてフォーマットされるとき、本発明のＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインは、インビボでＣＤ３に結合し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を維持する。
本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の態様は、本発明の態様の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の態様が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
Claims (15)
- ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質。
- 前記アンキリン反復モジュールが、第１のアンキリン反復モジュールであり、前記アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５～９及び（２）配列番号５～９のいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のアンキリン反復モジュールを更に含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号５及び（２）配列番号５における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号６及び（２）配列番号６の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号８及び（２）配列番号８の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７及び（２）配列番号７における９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のアンキリン反復モジュールが、（１）配列番号９及び（２）配列番号９の９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のアンキリン反復モジュールが、前記アンキリン反復ドメイン内の前記第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する、請求項２～６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１～４のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、場合によりＮによって置換されている、組換え結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、請求項８に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、２～９００ｎＭの範囲のＥＣ50でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する、請求項９又は１０に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする、核酸。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項１３に記載の核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物。
- 医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項１３に記載の核酸、又は請求項１４に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
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