JP2020183393A - 胆汁酸粒子の組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】患者に経口投与して腸肝循環により吸収させることができる治療用組成物の提供。【解決手段】治療剤を含み、外面にｐＨ５で正味の正電荷をもつコア複合体と；アニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体を含有する治療用組成物であって；前記アニオン性ポリマーが中性ｐＨで正味の負電荷をもち、前記アニオン性ポリマーが前記外面と静電結合している前記組成物。【選択図】図１Ａ

Description

本開示は胆汁酸を含有しており、患者に経口投与して腸肝循環により吸収させることができる治療用組成物に関する。前記組成物は静電相互作用により結合しているカチオン性部分とアニオン性部分を含む。前記組成物は遺伝子、タンパク質又は小分子等の治療剤を含有する。

所定の治療剤の経口送達は腸管透過性不良によるバイオアベイラビリティの低下、ｐＨ又は温度に対する不安定による治療剤の分解、及びタンパク質分解酵素による分解等の多数の因子により制限される。治療剤のバイオアベイラビリティを改善することができ、その結果、患者コンプライアンスを高め、患者集団間の再現性を高め、用量を減らし、治療濃度域が広く、種々の疾患又は障害の総治療費を低減する組成物と送達方法が必要とされている。

本開示は治療剤から成り、外面にｐＨ５で正味の正電荷をもつコア複合体を含有しており、更にアニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体を含有する治療用組成物を提供する。前記アニオン性ポリマーは中性ｐＨで正味の負電荷をもち、前記アニオン性ポリマーは更に前記コア複合体の外面と静電結合している。

本開示は治療剤から成り、外面にｐＨ５で正味の正電荷をもつコア複合体を含有しており、更にアニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体を含有する治療用組成物の経口投与により、治療剤を細胞に送達する方法も提供する。前記アニオン性ポリマーは中性ｐＨで正味の負電荷をもち、前記アニオン性ポリマーは更に前記コア複合体の外面と静電結合している。

前記治療剤は消化管内の胆汁酸トランスポーターを介して対象又は患者に吸収させることができ、腸肝循環系に入る。前記治療用組成物は抗癌剤を含有することができ、癌を治療するために使用することができる。前記治療用組成物は代謝性疾患又は障害を治療するために使用することもできる。

本開示の他の態様は詳細な説明と添付図面を参酌することにより明確に理解されよう。

本特許又は特許出願書類にはカラー図面を少なくとも１枚添付する。カラー図面を添付した本特許又は特許出願公開公報の写しは必要な手数料を納付して申請後に特許庁により交付される。

本願に記載する詳細な説明と実施例を理解し易くするために以下の図面を添付する。

代表的な治療用組成物の模式図である。 代表的な治療用組成物の模式図である。 代表的な治療用組成物の模式図である。 代表的な複合体（左）と代表的な組成物（右）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。 ２種類のｐＨ条件下における代表的な複合体と代表的な組成物の粒径の経時変化を示すグラフである。 代表的な組成物の複合体と抱合体の比の変動（図４Ａ）及び時間経過（図４Ｂ）に伴う粒径とゼータ電位のグラフである。 代表的な組成物の複合体と抱合体の比の変動（図４Ａ）及び時間経過（図４Ｂ）に伴う粒径とゼータ電位のグラフである。 ＥａＨｙ９２６細胞（図５Ａ）とＨｅｐＧ２細胞（図５Ｂ）における種々の複合体対抱合体比の代表的な複合体と組成物の毒性のグラフである。 ＥａＨｙ９２６細胞（図５Ａ）とＨｅｐＧ２細胞（図５Ｂ）における種々の複合体対抱合体比の代表的な複合体と組成物の毒性のグラフである。 ＨｅｐＧ２細胞（図６Ａ）とＥａＨｙ９２６細胞（図６Ｂ）におけるｅＧＦＰの遺伝子を含有する代表的な複合体及び組成物中のｅＧＦＰの発現を示す蛍光画像である。目盛線は２０μｍである。 ＨｅｐＧ２細胞（図６Ａ）とＥａＨｙ９２６細胞（図６Ｂ）におけるｅＧＦＰの遺伝子を含有する代表的な複合体及び組成物中のｅＧＦＰの発現を示す蛍光画像である。目盛線は２０μｍである。 タウロコール酸と結合した量子ドット（ＱＤ−ＴＣＡ）の模式図であり、ＴＣＡが量子ドットの外側にどのように結合しているかを示す。 ＱＤ−ＴＣＡを投与後の種々のマウス臓器のエクスビボ光学イメージングプロファイルである。 マウスにＱＤ−ＴＣＡを投与後の種々の組織におけるＱＤ−ＴＣＡの存在を示す一連のＴＥＭ画像である。ＱＤ−ＴＣＡを矢印で示す。上段画像は胃、十二指腸及び空腸に由来する組織を示し、下段画像は回腸、肝臓及び脾臓に由来する組織を示す。 代表的な組成物をＩＶ及び経口投与後の所定のマウス臓器でｅＧＦＰから発生する相対蛍光量を示す棒グラフである。 代表的な組成物をマウスにＩＶ（上段）及び経口（下段）投与後の所定の臓器に存在するｅＧＦＰの量を示す。 ５種類の代表的な製剤を投与後の種々のマウス臓器に存在するｅＧＦＰの量を示す一連の共焦点画像を示す。 図１１の画像の１段の拡大図である。 代表的な製剤を投与後の種々のマウス臓器における相対蛍光のグラフである。 代表的な組成物をマウスにＩＶ及び経口投与後の血漿中エキセンジン−４濃度を示すグラフである。 代表的な組成物を投与した動物の血糖値のグラフを示す。図１５Ｄ〜１５Ｅは代表的な組成物を投与した動物の体重のグラフを示す。 代表的な組成物を投与した動物の血糖値のグラフを示す 代表的な組成物を投与した動物の血糖値のグラフを示す。 代表的な組成物を投与した動物の体重のグラフを示す。 代表的な組成物を投与した動物の体重のグラフを示す。 代表的な組成物を投与した動物の飼料消費量の経時変化のグラフを示す。 代表的な組成物を投与後の種々の動物臓器中に存在するＧＬＰ−１の量を示す一連の画像である。 コンドロイチン硫酸（１６Ａ）及びタウロコール酸と共有結合させたコンドロイチン硫酸（１６Ｂ）のプロトンＮＭＲスペクトルである。 コンドロイチン硫酸（１６Ａ）及びタウロコール酸と共有結合させたコンドロイチン硫酸（１６Ｂ）のプロトンＮＭＲスペクトルである。 代表的な製剤の粒径とゼータ電位のグラフである。 種々の代表的な製剤のＵＶ−ＶＩＳスペクトルである。 種々の代表的な製剤のＵＶ−ＶＩＳスペクトルである。 代表的な製剤の時間経過（図１９Ａ）及びｐＨ値の変動（図１９Ｂ）に伴う粒径のグラフである。 代表的な製剤の時間経過（図１９Ａ）及びｐＨ値の変動（図１９Ｂ）に伴う粒径のグラフである。 代表的な製剤のｐＨ７．４（図２０Ａ）とｐＨ５．０（図２０Ｂ）における薬物放出の経時変化を示すグラフである。 代表的な製剤のｐＨ７．４（図２０Ａ）とｐＨ５．０（図２０Ｂ）における薬物放出の経時変化を示すグラフである。 ＨｅｐＧ２細胞における代表的な胆汁酸と多糖の結合体の毒性を示すグラフである。 ＨｅｐＧ２細胞における代表的な製剤の毒性を示すグラフである。 ＨｅｐＧ２細胞における代表的な製剤の毒性を示すグラフである。 ＨｅｐＧ２細胞における代表的な製剤の毒性を示すグラフである。 代表的な製剤の効果のグラフである。 代表的な製剤の効果のグラフである。 代表的な製剤の効果のグラフである。 代表的な組成物を投与後の腫瘍をもつマウスにおけるドキソルビシンの生体内分布を示すグラフである。 Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの４成分から成る代表的な治療用リポソーム組成物の一般構造の模式図である。 リポソームに治療剤を充填した後に、閉鎖したリポソームをアニオン性ポリマーと共有結合させた胆汁酸又は胆汁酸抱合体で被覆する工程の模式図である。 部分的に開口したリポソームの形成を示す模式図である。 ３種類の代表的なリポソーム組成物の平均粒径とゼータ電位を示すグラフである。 ３種類の代表的なリポソーム組成物からｐＨ７．４及びｐＨ１．２で放出されるインスリン量の経時変化を示すグラフである。 代表的なリポソーム組成物に暴露後の細胞に存在するＣｅ６標識インスリンの量を示す一連の画像である。 代表的なリポソーム組成物を経口投与した動物の蛍光カウント数と細胞数を示すグラフである。 代表的なリポソーム組成物を経口投与後の生きたマウスに存在するＣｅ６標識インスリンの量と局在を示す一連の画像である。 代表的なリポソーム組成物を経口投与後のマウスの種々の臓器に存在するＣｅ６標識インスリンの量を示す一連の画像である。 図３３に示した各臓器に存在するインスリンのグラフである。各項目の臓器毎に、棒は（左から右に向かって）遊離インスリン投与、ＤＤ０投与、ＤＤ１−ＣＳ投与及びＤＤ１−ＣＳＴ投与を表す。 代表的なリポソーム組成物を経口投与後の動物の血漿中インスリン濃度の経時変化を示すグラフである。 代表的なリポソーム組成物を経口投与後の動物の血清中濃度の経時変化を示すグラフである。 代表的なリポソーム組成物を投与した動物における腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 代表的なリポソーム組成物を投与した動物における相対体重の経時変化を示すグラフである。

治療用組成物の使用は腸管透過性不良、ｐＨ又は温度に対する不安定による治療剤の分解、及びタンパク質分解酵素による分解等の多数の課題により制限される可能性があり、経口送達するにはこれらの課題に対処する必要がある。経口製剤の開発には治療剤のバイオアベイラビリティに影響を与える多数の要因を考慮する必要があり、このような要因としては、その溶解度、安定性、溶解速度及び消化（ＧＩ）管透過性が挙げられる。一般に、治療剤の経口製剤は消化管における治療剤の半減期と代謝を低下させてそのバイオアベイラビリティを最大にするために、溶解速度を速くし、吸収速度を高める必要がある。経口バイオアベイラビリティの高い治療剤はバイオアベイラビリティの低い治療剤に比較して患者コンプライアンスが高く、患者集団間の再現性が高く、用量が少なく、治療濃度域が広くなるため、疾患又は障害の総治療費の低減に繋がる。

治療剤の効果を妨げる一因は消化管壁の上皮層からの腸管吸収を制限するバリアにある。肝臓から分泌される胆汁酸は腸管上皮細胞を通って回腸末端から再吸収され、門脈を通って肝臓に戻るので、胆汁酸トランスポーターは治療剤送達の魅力的なターゲットである。即ち、胆汁酸リサイクル比が高いと、胆汁酸の腸肝循環が非常に効率的なプロセスとなり、肝臓と回腸末端で主に発現される胆汁酸トランスポーターに有益である。

タウロコール酸（ＴＣＡ）は多量に存在する胆汁酸であり、ヒト腸液の約４５％を占めると推定される。ＴＣＡは回腸末端に主に存在する頂端側ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーター（ＡＳＢＴ）を介する腸管細胞を通る吸収を最大にすることにより治療剤の担体として使用することができる。即ち、回腸末端から門脈を経て全身循環に至る治療剤の輸送はＴＣＡ等の胆汁酸担体により助長することができる。

本願は、治療剤とカチオン性部分の複合体を含有しており、アニオン性部分と共有結合した胆汁酸と静電結合させた治療用組成物を開示する。前記組成物は消化管（ＧＩＴ）、主に回腸から血液中に吸収される直径約２０ｎｍ〜約５０００ｎｍの粒子を形成する。実施形態によっては、前記粒子の直径は約２０ｎｍ〜５０００ｎｍ、約５０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、少なくとも粒径約２０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍであり、約５０００ｎｍ以下又は約１０００ｎｍ以下である。前記治療用組成物は少なくとも１種の胆汁酸と共有結合したアニオン性部分と、前記アニオン性部分と静電相互作用するカチオン性部分を含有しており、更に少なくとも１種の治療剤を含有する。所定の実施形態において、前記組成物は２種類以上の治療剤又は少なくとも２種類の治療剤を含有していてもよい。

理論に拘泥するものではないが、経口投与後に組成物がＧＩＴに吸収される主要なメカニズムは消化液である胆汁酸をＧＩＴから肝臓へとリサイクルさせる胆汁酸腸肝循環系を介すると考えられている。胆汁酸を結合させた組成物は胆汁酸リサイクル経路を利用し、治療剤を血流中に輸送することができる。アニオン性部分は生体適合性を提供し、粒子を凝集とＧＩＴからの非特異的な吸収から防止する。

本願に記載する治療用組成物は胆汁酸を結合せずに治療剤を提供した場合よりも高い経口バイオアベイラビリティで治療剤を対象に提供することができる。胆汁酸を結合すると、治療剤を患者に経口投与することが可能になる。前記組成物はドキソルビシンを含む抗癌剤等の現在経口投与されている治療剤のバイオアベイラビリティを改善するのみならず、経口投与されるとは一般に考えられていない治療剤の投与も可能にする。このような治療剤としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子又はオリゴヌクレオチド治療薬に加え、タンパク質及びポリペプチド、ワクチン、ベクター又はウイルスが挙げられる。本発明の組成物は腸管透過性不良、ｐＨ又は温度に対する不安定による治療剤の分解、及び酵素分解に起因する経口送達の課題を解決できる基盤技術を提供する。

具体的に、治療剤から成り、外面にｐＨ５で正味の正電荷をもつコア複合体を含有する治療用組成物について記載する。前記組成物は更にアニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体を含有する。前記アニオン性ポリマーは中性ｐＨで正味の負電荷をもち、前記アニオン性ポリマーは更にコア複合体の外面と静電結合している。これらの治療用組成物のデザインの模式図を図１に示すが、治療剤（ＴＡ）を含み且つカチオン性表面をもつ複合体がアニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体（ＢＡ）から形成される部分と結合している。得られた組成物はコア複合体がＢＡ−ポリアニオン部分で被覆されており、前記コア複合体のカチオン性表面はアニオン性ポリマーと静電結合し、安定した不連続粒状組成物を形成する。

前記治療剤は一般にどのような種類でもよく、核酸、遺伝子、タンパク質、ペプチド、ウイルス、ワクチン又は小分子薬が挙げられる。所定の実施形態において、前記治療剤は遺伝子、線状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はｍＲＮＡ（例えばＧＬＰ−１又はエキセンジン−４をコードする遺伝子）である。前記治療剤はインスリン、成長ホルモン又はエリスロポエチン等のタンパク質又はペプチドでもよいし、カルシトニンやＬＨＲＨ等のペプチドでもよい。前記治療剤は抗癌剤等の小分子薬でもよく、ドキソルビシン、シスプラチン又はパクリタキセルが挙げられる。更に、インフルエンザウイルスや腫瘍溶解性アデノウイルス等のウイルスでもよい。

前記コア複合体は１種のみのカチオン性治療剤を含んでいてもよいし、複数のカチオン性治療剤を含んでいてもよく、外面にｐＨ５で正味の正電荷をもつように会合する２部分以上を含んでいてもよい。所定の実施形態において、前記外面は約１〜約８の任意のｐＨで正味の正電荷をもち、又は中性ｐＨで正味の正電荷をもつ。前記コア複合体はポリエチレンイミン、プロタミン又はポリ（リジン）等のカチオン性ポリマーを含むことができる。前記カチオン性ポリマーはｐＨ５で正味の正電荷をもつ核酸又はＤＮＡ部分でもよい。実施形態によっては、前記コア複合体はカチオン性リポソーム、又はカチオン性脂質もしくは脂質混合物を含む。

前記ポリアニオン又はアニオン性ポリマーは中性ｐＨで正味の負電荷をもつポリマーであり、例えば少なくとも１個のスルホン酸基、カルボン酸基、リン酸基又はスルホンアミド基を含むポリマーが挙げられる。前記ポリアニオンのｐＫａは１０未満の値とすることができ、又は８未満とすることができる。前記ポリアニオンは天然ポリマーとすることができ、例えばデキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸もしくはアルギン酸を含む多糖；ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びＯＤＮを含む核酸もしくはＤＮＡ部分；又はアルブミン等のタンパク質が挙げられる。前記ポリアニオンは合成ポリマーでもよく、例えばポリビニルスルホン、ポリ（２−アシルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）（ポリＡＭＰＳ）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（エチルアクリル酸）、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（スチレンスルホン酸塩）、ポリ（スルホンアミド）、ポリ（リン酸）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、又は上記ポリマーのいずれかの任意混合物もしくはコポリマーが挙げられる。前記ポリマーはランダムポリマー、ブロックポリマー、グラフトポリマー又は交互ポリマーのいずれでもよい。前記ポリアニオンは天然又は合成ポリマーの混合物でもよいし、任意型の２種類以上のポリマーの混合物でもよい。

前記ＢＡ部分は胆汁酸もしくは胆汁酸抱合体、コール酸もしくはケノコール酸等の一次胆汁酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸もしくはケノデオキシコール酸等の二次胆汁酸、又は任意種の胆汁酸塩とすることができる。所定の実施形態において、前記胆汁酸又は胆汁酸抱合体はタウロコール酸、グリココール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、又はＡＳＢＴ等の胆汁酸輸送に関与するタンパク質と結合する任意の修飾胆汁酸である。前記ＢＡ部分は上記に挙げた代表的な成分のいずれかの混合物でもよいし、単体でもよい。

図１Ａの一般スキームの他の実施形態を図１Ｂ及び１Ｃに示す。図１Ｂは例えばプラスミドＤＮＡであるＡ部分がカチオン性ポリマー等のＢ部分と会合してカチオン性外面をもつコア複合体を形成する様子を模式的に示す。前記コア複合体はＢＡ部分と共有結合したアニオン性ポリマーと静電結合し、外面にＢＡをもつ治療用組成物を形成する。１実施形態において、前記Ｂ部分はｂＰＥＩであり、前記Ａ部分はｐＥｅＧＦＰ−Ｎ１、ｐＧＬＰ−１又はｐエキセンジン−４等のプラスミドＤＮＡであり、前記ポリアニオン−胆汁酸抱合体部分はヘパリン−ＴＣＡである。図１Ｃには製剤の種々の成分を詳細に記載しており、コア複合体はアニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体で包囲されている。

前記胆汁酸又は胆汁酸抱合体と前記アニオン性ポリマーの結合は共有結合を介する。この結合体を形成するために使用される胆汁酸とアニオン性ポリマーの１例はアニオン性ポリマーとしてコンドロイチン硫酸と、胆汁酸としてタウロコール酸である。これらの化合物を共有結合させ、本願に開示する組成物で使用されるアニオン性ポリマー−胆汁酸部分を形成するため使用することができる一般的な合成経路をＣＳ−ＴＣＡの合成について下記スキーム１に示す。

本願で使用する「胆汁酸抱合体」なる用語は胆汁酸塩を意味し、タウリン又はグリシンを含む胆汁酸塩が挙げられる。特に指定しない限り、「胆汁酸」なる用語は胆汁酸抱合体を包含する。

本願で使用する「複合体」なる用語は少なくとも１個の部分を意味し、相互に会合する２部分以上を含むことができる。複合体が２部分以上からなる実施形態において、前記部分は静電相互作用、イオン相互作用、水素結合、π結合又はその任意組合わせを含めて共有結合又は非共有結合により相互に会合することができる。

本願で使用する「小分子」なる用語は生体分子とみなされない分子量約１０００ダルトン以下の化合物を意味する。この用語は一般にこの種の治療剤をタンパク質又は核酸含有剤から区別するために使用する。

本願に開示する組成物を使用すると、複数の疾患を治療し、用量低減と治療濃度域拡大により薬物治療の安全性を潜在的に改善するために、そのバイオアベイラビリティを改善することにより広範な治療剤の経口送達が可能になる。これらの改善は治療レジメン及び効果を改善することにより患者に有益であり、従来では経口投与できないと考えられていた治療剤の送達に新しい道を開くことができる。

本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は以下の説明に記載又は図面に例示する構成の詳細及び構成要素の配置にその適用を制限されないことに留意されたい。本発明は他の実施形態も可能であり、種々の方法で実施又は実現することが可能である。また、本願で使用する術語及び用語は説明の目的であり、限定的とみなすべきでないことにも留意されたい。本願で使用する「包含する」、「含む」又は「有する」及びその変形は具体的に挙げる事項とその等価物に加え、他の事項も包含するものとする。

本願に明記する全ての数値範囲は下限値から上限値までの全数値を含むことにも留意されたい。例えば、濃度範囲が１％〜５０％であると記載する場合には、２％〜４０％、１０％〜３０％、又は１％〜３％等の値が本明細書中に明記されているものとみなす。これらは具体的に意味するものの例に過ぎず、記載する最低値以上最高値以下の数値の可能な全ての組合わせが本願に明記されているものとみなす。

本願で使用する「約」なる用語は「概数で」と同義であることに留意されたい。例えば、「約」なる用語の使用は記載値の若干外側の数値を含むことを示す。実験誤差、製造上の交差及び平衡条件の変動等の条件により変動が生じる場合がある。実施形態によっては、「約」なる用語は記載値±１０％を含む。ある数値を表すために「約」なる用語を使用している全ての場合において、当然のことながら、本開示はその厳密な数値にも対応する。

本明細書の全文を通して「ある実施形態」、「１実施形態」、「１態様」等の文言を用いる場合には、この実施形態に関連して記載する特定の特徴、構造又は特性が本願に記載する発明の少なくとも１種の実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書の全文を通して「ある実施形態において」、「１実施形態において」、「１態様において」等の文言が出現する場合には必ずしもそうでなくてもよいが、これらの全てが同一の実施形態を意味する場合がある。

更に、本願に記載する方法及び組成物について記載する特徴、構造又は特性は１以上の実施形態において任意の適切な方法で組合わせることができる。以下の記載では、実施形態を十分に理解できるように多くの具体的な内容を提示する。しかし、当業者に自明の通り、これらの具体的な内容の１以上を用いずにこれらの実施形態を実施してもよいし、他の方法、成分又は材料を用いて実施してもよい。他の例では、実施形態の諸側面を曖昧にしないように周知構造、材料又は操作については詳細に図示又は記載しない。

以下の実施例では本開示の代表的な実施形態について記載する。以下の実施例は本願に開示する発明を例証し、通常の知識をもつ者がこの発明を実施及び使用し易くするために提示するものである。これらは例示に過ぎず、本願に開示する発明の範囲を如何なる点でも制限するものではない。

［実施例１］．遺伝子送達。

治療用遺伝子又はプラスミドＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ等の特殊な核酸の送達は、異常遺伝子又は疾患原因遺伝子を永久的又は一時的に修復又は置換する可能性や、特定の細胞を標的としてダウンレギュレートされた遺伝子を供給する可能性により、既存の治療アプローチに勝る多くの利点がある。エイズ、肝炎、癌、線維症及び糖尿病等の疾患の治療はタンパク質発現を改変させるか又は異常な遺伝子をサイレンシングさせる治療用核酸を送達して疾患を予防又はその重症度を抑制することにより可能になると思われる。研究者らは疾患を治療するために細胞に核酸を輸送するように非ウイルスベクターの使用を最適化することが可能になっているが、数種類の非ウイルス送達ストラテジーで有効であることが証明されているものの、臨床試験は進展していない。

種々の異なる生理的及び生物学的条件下で安定であり、優れた経口吸収プロファイルをもつ非ウイルス担体を使用した経口遺伝子送達は難題である。このような遺伝子送達は非侵襲性の送達であることや患者に好都合である等の多くの利点がある。しかし、強酸性の胃液が遺伝子を分解する恐れや、粘液が遺伝子に結合し、消化管膜との直接相互作用を妨げる恐れや、遺伝子が吸収されずに消化管を通過する恐れがある。従って、消化管吸収による効果を得るためにはヒト生理的システムに適合可能な最適化されたデザインが必要である。また、遮蔽又は包囲ストラテジーにより遺伝子を保護すると共に小腸粘膜を通る吸収を強化し、更に頂端側ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーター（ＡＳＢＴ）等の胆汁酸トランスポーターとＯｓｔα／β受容体を介する吸収を助長することが望ましい。

毒性を最小限にしながら効果を得るために、消化管に標的特異的に送達するように修飾された表面と、最適化されたベクター／担体システムを有するカチオン性複合体がデザインされている。即ち、電荷−電荷相互作用を使用してアニオン性遺伝子とカチオン性ポリマーの複合体を作製し、複合体を遮蔽する生体適合性且つ生分解性の多糖で複合体を包囲し、消化管から保護している。

本実施例に記載するのはポリエチレンイミン及びヘパリンと複合体化させた遺伝子を含有する治療用組成物である。前記組成物の外面をヘパリンと共有結合させたタウロコール酸で修飾し、小腸の回腸のＡＳＢＴとＯｓｔα／βトランスポーターを含む胆汁酸トランスポーターを介して経口吸収を強化させた。

材料。小分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ，平均ＭＷ５，０００ｋＤａ）はＭｅｄｉｐｌｅｘ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（韓国，ソウル）から入手した。タウロコール酸ナトリウム塩（ＴＣＡ）、分岐鎖ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、クロロギ酸４−ニトロフェニル（４−ＮＰＣ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、４−メチルモルホリン（ＭＭＰ）、１，４−ジオキサン、２％ニンヒドリン試薬及びトリプシン−ＥＤＴＡはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エチレンジアミン、ホルムアミド、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びアセトンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。

３種類の遺伝子、即ち主試験のプルーフ用としてｅＧＦＰのレポータープラスミド遺伝子と、市販の２型糖尿病治療用ペプチドであり、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の作動薬であるエキセンジン−４をコードする遺伝子と、ＧＬＰ−１をコードする遺伝子の２種類の治療用遺伝子の経口投与を試験した。エキセンジン−４遺伝子で追加試験を実施し、尾静脈及び経口投与後のその血漿中濃度を測定した。

ｐＨ５で正味の正電荷をもつ分岐鎖ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）と上記遺伝子を複合体化させた。ある試験では、複合体を（対照サンプルとして）キトサン又はヘパリン−タウロコール酸（ＴＣＡ）部分（Ｈ−ＴＣＡないしＨＴＣＡ）で被覆した。ヘパリン−ＴＣＡで包囲された複合体（カチオン性ポリマーと遺伝子の複合体）の模式図である図１Ｂ及び１Ｃにこの一般スキームを示すが、ＴＣＡはその親水性により組成物の外面に局在する。図１Ｂ中、ｂＰＥＩはＢ部分であり、遺伝子はＡ部分である。ＢはＤＮＡ縮合剤とすることができ、ｐＨ５で正電荷をもつことができる。ＡはｐＥｅＧＦＰ−Ｎ１、ｐＧＬＰ−１又はｐＥｘ−４等のプラスミドＤＮＡとすることができる。ポリアニオン−胆汁酸抱合体部分はヘパリン−ＴＣＡとすることができ、ＢＡ部分は例えばコール酸やデオキシコール酸等の胆汁酸とすることができ、タウロコール酸やグリココール酸等の胆汁酸抱合体でもよい。図１Ｃには製剤の種々の成分を詳細に記載しており、コア複合体はアニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体で包囲されている（この場合、アニオン性ポリマーはヘパリンであり、胆汁酸抱合体はタウロコール酸である）。

緑色蛍光タンパク質プラスミド（ｐＡｃＧＦＰ１−Ｎ１，４．７ｋｂ）ベクターはＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＣＡ，米国）から入手した。エキセンジン−４遺伝子はＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＣＡ，米国）から入手し、メーカーから提供されているプロトコールに従って増幅した。

グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１ｃＤＮＡ）を化学的に合成し、ｐβベクターのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した。分泌型ＳＰをコードするＤＮＡフラグメントを化学的に合成し、ｐβ−ＧＬＰ−１のＫｐｎＩ部位に挿入し、ｐβ−ＳＰ−ＧＬＰ−１を作製した。ＧＬＰ−１をコードするプラスミドに使用したＧＬＰ−１遺伝子構造の地図を以下に示す。

活性化ＴＣＡを得るために、タウロコール酸（ＴＣＡ）ナトリウム塩１ｍｏｌを０℃のＤＭＦ（４．６ｍＬ）に溶解させた後、ＴＥＡ（６ｍｏｌ）と４−ＮＰＣ（５ｍｏｌ）をフラスコに加えた。この溶液を同一条件下で１時間反応させた後、室温で６時間撹拌した。次に溶液を遠心し、分液漏斗にて無水エタノール（ＥｔＯＨ）（２０ｍＬ）と脱イオン水（２０ｍＬ）で抽出し、このプロセスを３回繰返した。分離した溶液をロータリーエバポレーターにセットして有機溶媒を蒸発させ、最後に４８時間フリーズドライし、ＴＣＡ−ＮＰＣ粉末を得た。このＴＣＡ−ＮＰＣ粉末（１ｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、４−ＭＭＰ（２ｍｏｌ）を加えた。この反応を５０℃で１時間続けた。１時間後にＥＤＡ（１００ｍｏｌ）を溶液に滴下し、室温で１６時間撹拌を続けた。結晶化した部分を濾過し、真空乾燥機で乾燥させた。ＨＴＡ抱合体を合成するために、緩和な加熱下にヘパリン１ｍｏｌを蒸留水に溶解させ、０．１Ｍ ＨＣｌを加え、ｐＨを５．５〜６の範囲に維持した。ＥＤＣ（５ｍｏｌ）をヘパリン溶液に加え、５分間撹拌後、ＮＨＳ（７ｍｏｌ）を加え、再び３０分間撹拌した。

このように、ＴＣＡの末端ヒドロキシ基の修飾によりヘパリンとＴＣＡを共有結合させてアミン基を導入し、アミド結合によりヘパリンのカルボキシル基と結合させた。供給モル比と反応条件を最適化・制御することにより、結合比をヘパリン１モルに対してＴＣＡ４モルに最適化した。ヘパリン−ＴＣＡ部分を透析により精製し、Ｈ−ＮＭＲとＦＴ−ＩＲにより特性解析し、共有結合を確認した。ＮＭＲ分析により７．２ｐｐｍに新たなプロトンピークが認められたことから、ＴＣＡとヘパリンの結合が確認された。

（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ）複合体と胆汁酸コーティングを以下のように作製した。分岐鎖ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ，２５Ｋ，１０ｍＭ）をＨＥＰＥＳ緩衝液１００ｍＬに溶解させ、溶液が清澄透明になるまでボルテックスした。別のバイアルで必要量のｐＤＮＡをＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ）と混合し、濃度を１ｍｇ／ｍＬとした。遺伝子を含有する溶液を穏和なボルテックス下に１／１、２／１、５／１及び１０／１のＮ／Ｐ比でｂＰＥＩ溶液に滴下した（なお、Ｎはポリマー中のカチオン性のイオン性基を表し、Ｐは遺伝子中のリン酸基を表す）。混合物を室温に３０分間維持し、電荷−電荷相互作用により複合体を形成させた。Ｎ／Ｐ比が５／１の場合に複合体のゼータ電位値を測定した処、約＋１０ｍＶであった。別のファルコンチューブで負電荷をもつヘパリン−ＴＣＡ部分をＨＥＰＥＳ（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた。先に作製したカチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ）複合体を１：１（ｖ／ｖ）の比のヘパリン−ＴＣＡ溶液に滴下した。最終製剤を室温に３０分間維持し、ヘパリン−ＴＣＡで被覆された複合体を形成した。最終組成物を２日間かけてフリーズドライにより凍結乾燥した。

カチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ）複合体とヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物の形態と寸法を夫々ＴＥＭとＤＬＳにより調べた。ゼータ電位測定を実施して表面特性を観測し、カチオン性ポリマー、遺伝子及びヘパリン−ＴＣＡの比を最適化した。ＤＬＳ及びゼータ電位測定装置による測定前に製剤をボルテックス下で蒸留水（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた。

図２は２種類のサンプルの寸法と形態に関する情報を提供する透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。カチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ−Ｎ１）複合体のサンプルを図２の左画像に示し、ヘパリン−ＴＣＡで包囲したカチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ−Ｎ１）複合体のサンプルを図２の右画像に示し、囲み枠はＨＴＣＡコーティング付きナノ粒子の拡大図を示す。図面から明らかなように、複合体の粒径は約１００ｎｍであり、包囲した組成物の粒径は約２００ｎｍである。

負電荷をもつｅＧＦＰ遺伝子と正電荷をもつｂＰＥＩをＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解させると相互に接触し、カチオン性ポリマーとアニオン性遺伝子の静電吸引により電荷−電荷相互作用を介して複合体を形成する。複合体の寸法は遺伝子（Ｎ）とｂＰＥＩ（Ｐ）のＮ／Ｐ比に依存する。遺伝子とポリマーの複合体の形成は粒径分布解析とゲル電気泳動により確認した。

カチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ−Ｎ１）複合体の特性解析によると、Ｎ／Ｐ比が５／１と１０／１の複合体はカチオン性表面をもち、ＤＬＳとＴＥＭにより測定したゼータ値と粒径が同等であり、約＋１２ｍＶと約１００ｎｍである。Ｎ／Ｐ比が５／１複合体をアニオン性ヘパリン−ＴＣＡによる被覆用に選択した。

中性電荷と最小寸法という点で最適な組成物を製剤化するためにカチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ）複合体とヘパリン−ＴＣＡの５種類の異なる重量比を試験した。分岐鎖ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ，２５Ｋ，１０ｍＭ）をＨＥＰＥＳ緩衝液１００ｍＬに溶解させ、透明な溶液が認められるまでボルテックスした。別のバイアルで適当な体積のｐＤＮＡを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈し、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるようにした。希釈した遺伝子製剤を穏和なボルテックス下でｂＰＥＩに加えることによりＮ／Ｐ比が１：１、１：２、１：５及び１：１０の遺伝子製剤を合成した。サンプルを室温で３０分間弱く撹拌し、静電結合したｂＰＥＩ−遺伝子複合体を安定化させた。先に形成した複合体に１：１の体積比のヘパリン−ＴＣＡ抱合体（１ｍｇ／ｍＬ）を滴下し、室温に３０分間維持し、ヘパリン−ＴＣＡで被覆された安定な組成物を得た。組成物を２日間凍結乾燥した。

図３は２種類のｐＨ値の緩衝液中における経時的な粒径の安定性を示す。データは平均±ＳＤ，ｎ＝５である。ｐＤＮＡ−Ｎ１を用いて製剤を調製し、２日間凍結乾燥した。粉末をリン酸緩衝液に再分散させ、ＨＣｌ（１Ｎ）を加えることによりｐＨを調整した（ｐＨ３）。室温で製剤調製と製剤の分析を行った。水溶液中で粒径値とゼータ電位値を６日間まで測定することによりカチオン性複合体とヘパリン−ＴＣＡで包囲した複合体の両者の安定性を観測した。ゼータ電位測定値は約−２０〜約１０ｍＶの範囲であった。粒径変化は有意ではなく、ゼータ値は最適範囲に維持されたので、このデータは粒子が安定していることを裏付けている。

図４Ａはカチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ−Ｎ１）複合体と胆汁酸とヘパリンの結合体の量の比を変動させた場合の粒径とゼータ電位のグラフである。試験したＨＴＣＡ／カチオン性複合体の比（いずれも重量比）は０．２、０．４、０．６、０．８及び１とした。データは平均±ＳＤ，ｎ＝５である。ヘパリン−ＴＣＡで包囲した複合体（０．２ｗ／ｗ比）の粒径とゼータの安定性をｐＨ３で１６時間観測し、結果を図４Ｂに示す。

試験したうちでヘパリン−ＴＣＡ比が最大（１／１）のものは広い粒径分布プロファイルと大きい負のゼータ電位値（−３５ｍＶ超）を示す。図４Ａに示すデータから明らかなように、ヘパリン−ＴＣＡで包囲した複合体粒子は粒径約２５０〜６００ｎｍであるが、複合体は約１００ｎｍであるので、複合体／胆汁酸粒子の寸法は粒径が約１５０〜５００ｎｍ増加している。同一時間の間にゼータ電位は負の値となったことから、カチオン性複合体の表面はアニオン性ヘパリン−ＴＣＡで包囲されたと判断される。ヘパリン−ＴＣＡで包囲した複合体粒子のゼータ電位を分析した処、顕著な負の値であった（−２０〜２５ｍＶ）。

インビトロ毒性試験、発現試験。カチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ−Ｎ１）複合体とヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物の細胞毒性を調べるために、これらをＥａＨｙ９２６細胞及びＨｅｐＧ２細胞と２４時間共培養した。ヘパリン−ＴＣＡコーティングの存在下と不在下で種々のＮ／Ｐ比（２／１、５／１、１０／１、２０／１及び３０／１）のカチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ−Ｎ１）複合体をＥａＨｙ９２６細胞株及びＨｅｐＧ２細胞株と共に２４時間インキュベートし、インビトロ細胞毒性を観測した。細胞生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。図５ＡのグラフはＥａＨｙ９２６細胞における細胞毒性結果を示し、図５ＢのグラフはＨｅｐＧ２細胞における結果を示す。データは平均±ＳＤ，ｎ＝５である。

図５Ａ及び５Ｂに示す結果によると、ＥａＨｙ９２６細胞株とＨｅｐＧ２細胞株では細胞生存率プロファイルに相違がある。一般に、製剤はＨｅｐＧ２細胞よりもＥａＨｙ９２６細胞に対して若干毒性が強い。一方、どちらの細胞株でもカチオン性（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ）複合体のほうがヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物よりも一般に低い細胞生存率（即ち強い毒性）が認められた。これは外側のヘパリン−ＴＣＡによる包囲が所定期間にわたってｂＰＥＩの放出を防ぐことにより細胞をｂＰＥＩの毒性から保護するためであると思われる。Ｎ／Ｐ比が５／１の製剤はヘパリン−ＴＣＡコーティングの有無に拘わらずどちらの細胞株でもさほど毒性を示さない。一方、Ｎ／Ｐ比が１０／１、２０／１及び３０／１の製剤はＨｅｐＧ２に比較してＥａＨｙ９２６細胞株で強い毒性を示すが、生体適合性胆汁酸で包囲した後には、全製剤の細胞生存率が増加した。

生理食塩水、遊離ｅＧＦＰ遺伝子、カチオン性複合体及びヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物のサンプルと共にＥａＨｙ９２６細胞株及びＨｅｐＧ２細胞株の各々をインキュベートし、ｅＧＦＰの比較発現プロファイルを調べた。細胞を２μｇ／ウェルの濃度のｅＧＦＰと共に２４時間インキュベートし、核をＤＡＰＩで染色し、細胞内レベルで発現量を判定した。ＨｅｐＧ２細胞株をｅＧＦＰ２μｇ／ウェルと共に２４時間インキュベートした結果を図６Ａに示し、ＥａＨｙ９２６細胞株の結果を図６Ｂに示す。ＥＧＦＰは遊離遺伝子を表し、ＰＰはカチオン性複合体を表し、ＨＴＣＡ／ＰＰはヘパリン−ＴＣＡで包囲したカチオン性組成物を表す。ヘパリン−ＴＣＡで包囲したカチオン性組成物は細胞毒性が低く、ＩＶ又は経口投与後に動物に急性問題を生じなかった。

２４時間インキュベーション後にＧＦＰ発現を共焦点顕微鏡により直接観測した。細胞の共焦点顕微鏡画像から明らかなように、ヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物は最大の発現を示し、カチオン性複合体はヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物よりも発現が少なく且つ遊離ｅＧＦＰよりも発現が多い。直接イメージングで明示される通り、遊離ｅＧＦＰの発現は細胞に蓄積している少量の遊離遺伝子に起因すると考えられる。

胆汁酸経口吸収及び生体内分布のリアルタイム観測。遺伝子製剤の経口送達を試験する前に、光造影剤として量子ドット（ＱＤ）をタウロコール酸（ＴＣＡ）と結合させて実験を行い、マウスにおける経口吸収プロファイルをリアルタイムで調べた。カップリング剤としてＥＤＣとＮＨＳの存在下でカルボキシル化ＱＤをＴＣＡ−ＮＨ_２と結合させた。プロトンＮＭＲスペクトルに確認ピークが出現したので、ＱＤとＴＣＡがアミド結合により結合していることが特性解析により確認された。化合物を水で透析（ＭＷＣＯ１０００）して未結合のＴＣＡを除去し、凍結乾燥のためにフリーズドライした。得られた粉末を緩衝液に分散させ、経口強制飼養により動物に投与した。投与前に１２時間マウスを絶食させ、各群５匹ずつ２．５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与を行った。ＴＣＡと結合したＱＤを投与したマウスについて、光学イメージング計測システムを使用して数時間撮像した。

図７ＡはＴＣＡと結合したＱＤの構造の模式図である。図７ＢはＱＤ−ＴＣＡを投与したマウスの５種類の臓器のエクスビボ光学イメージングプロファイルを示す。図７Ｂに示すように、ＱＤ−ＴＣＡは主に肝臓と空腸に局在する。生体内分布と臓器局在に関するこの定量的リアルタイム観測には、ＱＤ技術を使用した。ＱＤ−ＴＣＡ製剤の経口投与から２４時間後にマウスを屠殺し、解剖した。選択した臓器を厚さ１５μｍに切断し、定量的及び定性的な比較分析におけるＱＤの観測と局在用にＴＥＭグリッド上にマウントした。

図８は胃、十二指腸及び空腸（上段画像）と、回腸、肝臓及び脾臓（下段画像）のＴＥＭ画像であり、ＱＤ−ＴＣＡの経口投与後のマウスの回腸と肝臓に有意数のＱＤが存在することが分かる。

経口送達、生体内分布及び光学イメージング。カチオン性複合体（ｂＰＥＩ／ｐＤＮＡ−Ｎ１，５／１）とヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物（複合体／ＨＴＣＡ１／０．２）の経口吸収実現可能性試験をマウス（Ｃ５７ＢＬ６）で実施した。各々平均体重１７ｇの約６週齢のマウス５匹をＳｉｍｏｎｓｏｎ Ｂｉｏ（ＵＴ，米国）から購入した。製剤の経口投与の前に動物を一晩絶食させた。２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ（２００μＬ）の用量で製剤を投与した。経口投与から２４時間後と４８時間後に動物を解剖し、臓器を摘出した。

特定の臓器、即ち小腸（空腸、十二指腸及び回腸）、肺、肝臓、心臓、腎臓及び脾臓を採取し、これらの臓器を凍結切断に備えて準備した。摘出後、マウスからの臓器をバラフィン包埋前にパラホルムアルデヒド溶液（４％）で固定した。（観測を行う前に真空オーブンで乾燥した）スライドガラスにパラフィンブロックからの厚さ１５μｍの組織を載せ、分析した。共焦点顕微鏡で画像を撮影し、４８８ｎｍ励起フィルターによる走査下にｅＧＦＰの発現を観測した。

光学イメージング試験用に、各々平均体重２５ｇの約６週齢のヌードマウス５匹をＤａｅ Ｈａｎ Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ（韓国）から購入した。カチオン性複合体とヘパリン−ＴＣＡで包囲した組成物の経口投与の前にマウスを２４時間絶食させた。光の定量的分析として、蛍光（ＦＬ）分析装置（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，米国）により光子も測定した。摘出した臓器を緩衝液で洗浄し、すぐに液体窒素で凍結させた。翌日、臓器を解凍し、氷上保存した。計量後、組織ホモジナイザーを使用して全臓器を氷上にてレポーター溶解用緩衝液０．５ｍＬ中で２０秒間ホモジナイズした。次に、得られた組織ホモジネートを氷上に１時間放置した。組織溶液を２０秒間ボルテックスした後、１３，０００ｇで１０分間遠心した。投与から２４時間後に、マウスを解剖し、臓器を摘出した。臓器をパラフィンブロッキングにより薄切し、共焦点顕微鏡で画像を撮影し、ｅＧＦＰの発現を観測した。スキャン用レーザーの励起フィルターと発光フィルターは夫々４８８ｎｍ及び５１０ｎｍとした。

４種類の製剤を調製及び試験し、マウスに投与してから２４時間後にｅＧＦＰ ｐＤＮＡの比較生体内分布プロファイルを観測した。製剤を５群に分け、（１）胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えないカチオン性（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体（経口投与）；（２）胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えずにキトサンで包囲したアニオン性ｅＧＦＰ製剤（経口投与）；（３）胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えずにヘパリンで包囲したカチオン性（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体（経口投与）；及び（４）ヘパリン−ＴＣＡで包囲した（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体（ＩＶ及び経口投与）とし、複合体／キトサン、ヘパリン及びＨＴＣＡの比はいずれも１／０．２（ｗ／ｗ）とした。

図９はヘパリン−ＴＣＡで遮蔽したｅＧＦＰ−プラスミドＤＮＡ（製剤４）を経口及び静脈内投与した場合の相対生体内分布分析の棒グラフを示す。データは平均±ＳＤ，ｎ＝４を表す。マウスにＩＶ（白棒）及び経口（黒棒）投与後に所定の臓器に存在するｅＧＦＰから発生する蛍光の相対量を分析した。

図１０はヘパリン−ＴＣＡで遮蔽したｅＧＦＰ−プラスミドＤＮＡ（製剤４）のＩＶ（上段）及び経口（下段）投与後にＧＦＰ発現を直接観測した場合のマウスの種々の臓器の光学イメージングを示す。

図１１は指定した４種類の製剤の投与後の８種類の臓器の共焦点画像を示す。１列目の画像は胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えないカチオン性（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体の経口投与後（製剤１，「ポリプレックス」）であり、２列目の画像は胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えないキトサンｅＧＦＰ製剤の経口投与後（製剤２，「キトサン−ｐｐ」）であり、３列目の画像は胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えずにヘパリンで包囲したカチオン性（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体の経口投与後（製剤３，「ヘパリン−ｐｐ」）であり、４列目の画像はヘパリン−ＴＣＡで包囲した（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体の経口投与後（製剤４，「ｈｔｃａ−ｐｐ（経口）」）であり、５列目の画像はヘパリン−ＴＣＡで包囲した（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体の静脈内（ＩＶ）投与後（製剤４，「ｈｔｃａ−ｐｐ（ｉｖ）」）である。１段目の画像は胃における蛍光を示し、２段目は十二指腸であり、３段目は空腸であり、４段目は回腸であり、５段目は肝臓であり、６段目は肺であり、７段目は脾臓であり、８段目は腎臓である。

図１２は図１１の肝臓の５個の画像（５段目）の拡大図である。赤い線は１００ｎｍに対応する。図１３は９種類の臓器における各製剤の相対蛍光のグラフであり、図１１及び１２に示す画像の定量値を示す。

画像から明らかなように、胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えずにヘパリンで包囲したカチオン性（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体（製剤３）は直接イメージング又はＦＬ分析によりｅＧＦＰ発現の形跡が殆ど認められなかった（図１１の３列目）ことから、動物に有意に吸収されなかった。即ち、この製剤ではどの臓器にもｅＧＦＰ発現が確認されなかった。図１１から明らかなように、製剤１（胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えないカチオン性（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体）の一部と、製剤２（胆汁酸又は胆汁酸抱合体を加えないキトサンｅＧＦＰ製剤）の相当量は胃と小腸、特に十二指腸を通って非特異的に吸収された。

ヘパリン−ＴＣＡで包囲した（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）複合体（製剤４）は直接イメージングとＦＬ分析の両方で回腸にｅＧＦＰの発現が強く観測されたことから、回腸を通って特異的に吸収された。回腸は消化管の他の部分よりも有意に多量の胆汁酸とＯｓｔα／βトランスポーターを含んでおり、他の製剤に比較して胆汁酸を結合させた製剤の吸収が多いと考えられる。

ヘパリン−ＴＣＡで包囲した（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）組成物（製剤４）のＩＶ投与は肝臓で最高のバイオアベイラビリティと蓄積を示す。ヘパリン−ＴＣＡ担体は胆汁酸トランスポーターを介する特異的吸収により種々の臓器で有意な発現を示す。

以上の定量的及び定性的な比較発現データから明らかなように、ｅＧＦＰの発現は担体と投与経路により異なり、発現度は臓器毎に異なる。特に、ヘパリン−ＴＣＡで包囲した（ｂＰＥＩ／ｅＧＦＰ）組成物（製剤４）の経口送達の結果、肝臓組織で高レベルの緑色強度により示されるように肝臓にｅＧＦＰの最大の蓄積が認められたことから、この結果は回腸と肝臓で胆汁酸トランスポーターとＯｓｔα／βトランスポーターを介して行われる吸収に一致する。

マウス（Ｃ５７ＢＬ６）におけるエキセンジン−４のインビボ放出。上記手順に従い、マウスを１２時間絶食させた後にヘパリン−ＴＣＡで包囲したエキセンジン４−ｐＤＮＡを種々の用量（２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。製剤の調製に当たっては、エキセンジン−４をｂＰＥＩに５／１の比で加え、３０分間インキュベートして複合体を形成させた。次に複合体を１／０．２の比でヘパリン−ＴＣＡで包囲した。製剤をゼータとＤＬＳにより特性解析し、夫々ゼータ電位値と流体力学的粒径分布を測定した。室温で３０分間インキュベーション後、製剤を２日間凍結乾燥した。計算量の粉末を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（２００μＬ）に溶解させ、室温で３０分間インキュベートして均質な分散液とした。ＩＶ投与したマウスは注射前に絶食させなかった。経口及びＩＶ投与から１２時間後、２４時間後及び３６時間後に尾静脈から採血した。エキセンジン−４アッセイキット（エキセンジン−４（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）−ＥＩＡキット，Ｐｈｏｅｎｉｘ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＩＮＣ．ＣＡ，米国）により血液中のエキセンジン−４の発現／放出を分析／測定した。

マウス（Ｃ５７ＢＬ６）におけるエキセンジン−４放出。図１４はヘパリン−ＴＣＡで包囲したエキセンジン−４−ｐＤＮＡ組成物を２種類の投与量（エキセンジン−４−プラスミドＤＮＡ ５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）でマウスにＩＶ及び経口投与後の血漿中エキセンジン−４濃度の経時変化を示すグラフである。データは平均±ＳＤ，ｎ＝５を表す。

図１４から明らかなように、エキセンジン４の放出は組成物の経口及びＩＶ投与のどちらでも投与量と正比例する。ＩＶ投与後のエキセンジン４の発現と放出は当初では同一用量で経口投与後よりも多い。しかし、投与から３６時間後にＩＶ群は血漿中濃度の低下を示し、経口群の血漿中濃度は上昇した。グラフによると、経口投与群でＴｍａｘ及びＣｍａｘ値を得るためには長い観測時間が必要である。一方、１０ｍｇ／ｋｇのＩＶでは２４時間で最高濃度が観測された（Ｔｍａｘ＝約２４時間及びＣｍａｘ＝約６５００ｎｇ／ｍＬ）。

ｐＧＬＰ−１製剤の投与後のＩＩ型糖尿病モデルにおけるグルコース値計測。６週齢の雌性Ｚｕｃｋｅｒ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｆａｔｔｙ（ＺＤＦ）ラットを金属ケージに収容し、飼料と水を自由に摂取させた。ＺＤＦラットは若年で肥満症とインスリン抵抗性を発症し、加齢と共に徐々に高血糖症を発症する。ＺＤＦラットの高血糖症は膵β細胞機能障害、膵β細胞質量低下並びにインスリンとグルコースの作用に対する肝及び肝外組織の反応性の低下を伴う。携帯用血糖値測定器（Ａｃｃｕ−ｃｈｅｋ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，スイス）により測定した場合にＺＤＦラットの血糖値は＞３００ｍｇ／ｄＬであった。ラットを２群に分け、一方の群には遺伝子のみを含有するｐＧＬＰ−１遺伝子製剤、即ち遊離ｐＧＬＰ−１を投与し（３匹）、他方の群にはヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤を投与した（５匹）。製剤の調製に当たっては、ＧＬＰ−１遺伝子を（５／１のＮ／Ｐ比で）ｂＰＥＩと混合し、３０分間インキュベートし、静電相互作用により複合体を形成させた。化合物をＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解させて室温で３０分間インキュベートすることにより複合体をアニオン性ヘパリン−ＴＣＡで包囲した。次に製剤を２日間かけてフリーズドライにより凍結乾燥し、経口及びＩＶ送達用にＨＥＰＥＳ緩衝液に再分散させた。

遊離ｐＧＬＰ−１遺伝子製剤群とヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤群の両方のラットを一晩（１２時間）絶食させた後、遊離ｐＧＬＰ−１遺伝子１００μｇ又はｐＧＬＰ−１遺伝子１００μｇを提供する量のヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤を夫々経口強制飼養により送達した。（ＧＬＰ−１遺伝子１００μｇに等価の）計算量の乾燥製剤をＨＥＰＥＳ緩衝液１００μＬに溶解させ、経口／ＩＶ投与前にセルインキュベーター（３７℃）で３０分間インキュベートした。

別の試験で、ＢＡＬＢ／ｃマウスにストレプトキナーゼを投与し、その膵臓のβ細胞を損傷させ、膵臓に炎症を起こした。マウスを金属ケージに収容し、飼料と水を自由に摂取させ、連続的に計測した。その血糖値はストレプトキナーゼ投与後２週間で約３００μｇ／ｄＬまで上昇した。マウスを経口群（７匹）とＩＶ群（７匹）の２群に分け、（ｐＧＬＰ−１遺伝子１００μｇを提供する量の）ヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１製剤を経口及び静脈内投与した。

動物の体重を定期的に計測した。（ＧＬＰ−１遺伝子１００μｇに等価の）計算量の乾燥製剤をＨＥＰＥＳ緩衝液１００μＬに溶解させ、経口／ＩＶ投与前にセルインキュベーター（３７℃）で３０分間インキュベートした。

組織化学試験。２１日間観測後に、ラットの特定の臓器（十二指腸、空腸、回腸、腎臓及び肝臓）を摘出し、免疫組織化学染色によりＧＬＰ−１発現を観測した。その血糖値の観測後にラットを解剖し、選択した臓器を摘出した。組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、組織を厚さ１５μｍの切片に薄切した。切片を間接免疫組織化学法で免疫染色した。マウスモノクローナル（８Ｇ９）一次抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ２６２７８）をＧＬＰ−１の解析に使用し、メーカーから提供されている組織化学アッセイキットの説明書に従って処理を行った。

共焦点顕微鏡によりＧＬＰ−１発現を直接観測し（図１５Ｇの緑色部分）、細胞核をＤＡＰＩで染色した（図１５Ｇの青色部分）。組織を分離し、ステンレス鋼製の包埋皿で小部分をパラフィン包埋した。組織を厚さ１５μｍの切片として切断し、スライドガラスにマウントし、夫々核と細胞におけるＧＬＰ−１の発現を目視観測するためにＤＡＰＩとＡｂｃａｍ ａｂ２６２７８の両方で染色した。

（ＧＬＰ−１遺伝子１００μｇに等価量の）ヘパリン−ＴＣＡで包囲した凍結乾燥ｐＧＬＰ−１製剤をＨＥＰＥＳ緩衝液１００μＬに溶解させ、一晩絶食させたＩＩ型糖尿病モデルＺＤＦラットに経口投与した。対照試験として別の動物群に遊離ＧＬＰ−１遺伝子製剤も送達した。血糖値を計測した処、約６０ｍｇ／ｄＬと低値であった。製剤と飼料の相互作用は消化管への吸収を妨げる恐れがあるので、これを避けるために製剤の経口投与から６時間後に動物に飼料を与えた。

図１５Ａ〜１５Ｃはヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１製剤を投与した動物の血糖値のグラフである。図１５Ａから明らかなように、遊離ＧＬＰ−１遺伝子製剤を投与したＺＤＦラット（白四角）の血糖値は経口投与当日には短時間低値であったが、試験した２１日間にわたって約３００〜３５０ｍｇ／ｄＬであった。他方、ヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤を投与したＺＤＦラット（黒丸）は経口投与後の血糖値が約１００〜１５０ｍｇ／ｄＬであり、試験した２１日間維持された。

図１５Ｂはヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤を投与後２週間の経口投与群の各ＢＡＬＢ／ｃマウスの非空腹時血糖値を示す。一般に、血糖値は約１００〜約１５０ｍｇ／ｄＬであった。図１５Ｃはヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤を投与後２週間のＩＶ投与群の各ＢＡＬＢ／ｃマウスの非空腹時血糖値を示す。一般に、血糖値は約１００〜約１５０ｍｇ／ｄＬであった。

図１５Ｄ〜１５Ｅはヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤を投与した各ＢＡＬＢ／ｃマウスの体重のグラフを示す。図１５Ｄは経口投与群のデータを示し、図１５ＥはＩＶ投与群のデータを示す。

図１５Ｆはヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物製剤の投与後２週間の経口投与群（黒丸）とＩＶ群（白丸）の飼料消費量のグラフを示す。経口投与群は約１週間後に一般にＩＶ群よりもマウス１匹当たり多量の飼料を消費し、ＩＶ群の飼料消費量は約３日後に約４ｇ／匹で比較的安定していたが、経口投与群の飼料消費量は約７日後に約６ｇ／匹となるまで安定しなかった。

図１５Ｇはヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物を投与後の種々のラット臓器に存在するＧＬＰ−１の量を示す一連の画像である。画像から明らかなように、ＧＬＰ−１発現は腎臓で最高であったが、ＤＡＰＩで染色した組織の共焦点画像に示すように十二指腸、空腸、回腸及び肝臓でもＧＬＰ−１発現が観測された。

データ（図１５Ａ）から明らかなように、製剤の経口投与から６時間後にラットに飼料を摂取させると、その血糖値は上昇し始めた。遊離ＧＬＰ−１製剤を投与した動物では、投与後１日以内に血糖値は約６０ｍｇ／ｄＬから約３００〜３５０ｍｇ／ｄＬに戻った。一方、ヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１製剤を投与したラットの血糖値はヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１製剤１００μｇを単回経口投与後２１日間まで約１００〜１５０ｍｇ／ｄＬに維持された。

これらの結果はヘパリン−ＴＣＡで包囲したＧＬＰ−１製剤を投与したラットにおける有意な血糖値低下効果を実証するものであり、この効果は単回経口投与後長期間維持される。Ｉ型糖尿病モデルにおいて、ヘパリン−ＴＣＡで包囲したＧＬＰ−１遺伝子製剤を同一の遺伝子用量でマウスに経口及び静脈内投与した。１４日間の血糖値計測期間中、ストレプトキナーゼにより膵臓細胞を損傷させたマウスで調査した処、経口送達とＩＶ送達は同等の血糖値のプロファイルを示した。血糖値計測の総合結果から判断すると、ヘパリン−ＴＣＡで包囲したｐＧＬＰ−１組成物の製剤は血糖値を低下させて正常なグルコース範囲内に維持するために十分に経口吸収された。驚くべきことに、単回経口投与しただけで血糖値は正常な範囲に２週間維持された。

結論。インビトロ細胞毒性及び細胞トランスフェクション試験において、ＨｅｐＧ２（肝細胞）細胞株とＥａＨｙ９２６（上皮）細胞株を種々の時間間隔で計測した処、ｅＧＦＰは細胞質と細胞核の周囲に局在することがデータから明らかである。ヘパリン−ＴＣＡで包囲したｅＧＦＰ組成物をマウスに投与して経口吸収試験と薬物動態試験を実施した処、肝臓での発現が目視及び定量により観測された。遺伝子とカチオン性部分の複合体（胆汁酸コーティングなし）は胃、十二指腸、空腸及び他の内臓で腸細胞に非特異的に導入されたが、胆汁酸で被覆した複合体は胆汁酸を高度に取込む遠位小腸及び回腸に導入され、肝臓、肺及び腎臓で顕著なｅＧＦＰ発現が認められた。

ヘパリン−ＴＣＡで包囲したエキセンジン−４組成物を投与したマウスの血漿中エキセンジン−４濃度は、遺伝子５〜１０ｍｇ／ｋｇを投与後に数百ｎｇ／ｍＬのオーダーである治療用エキセンジン−４の濃度の約１０，０００倍であった。ヘパリン−ＴＣＡで包囲したＧＬＰ−１組成物ではＩ型及びＩＩ型糖尿病モデルでも夫々２週間及び３週間にわたって治療効果が認められ、どちらも正常範囲内までの血糖値の低下を示す。

つまり、３種類の異なる遺伝子による実験結果はそれらの経口吸収強化の概念を裏付けている。特筆すべき点として、試験した遺伝子のうちの２種類は糖尿病の潜在的な治療薬（エキセンジン−４及びＧＬＰ−１）であり、ヒト疾患のマウスモデルとラットモデルの両方で検証されている。本実施例ではこれらの遺伝子の経口吸収メカニズム、臓器発現及び治療効果に関するインビトロ及びインビボの両面の定量的及び定性的データを提示するが、これらのデータは胆汁酸を結合させたアニオン性ポリマーが遺伝子複合体の安定性を強化できると共に、胆汁酸及びＯｓｔα−Ｏｓｔβトランスポーターを介する小腸への経口吸収を模倣できるという概念を裏付けている。また、これらの遺伝子の肝臓での蓄積及び発現レベルが高いことからも、これらの組成物は肝細胞で過剰発現されるこれらの受容体と強く結合すると判断される。

［実施例２］．タンパク質送達。

それ自体カチオン性の治療用タンパク質からカチオン性粒子を形成することもできるし、タンパク質をプロタミン等のカチオン性ポリマーと複合体化することもできる。代表的な治療用タンパク質はインスリンである。そして、アニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体から構成される部分でカチオン性複合体を被覆することができる。このような部分の１例はヘパリン−ＴＣＡである。得られた治療用組成物は約１０ｎｍ〜約１０μｍの寸法であると予想される。得られた組成物はアニオン性であり、血糖値を下げるために動物又はヒト対象に経口投与できると考えられる。

［実施例３］．小分子送達用胆汁酸及び胆汁酸抱合体。

ドキソルビシン（ＤＯＸ）を含む多くの薬物は腸管透過性不良により経口バイオアベイラビリティが低いため、その経口投与が課題となっている。薬物の経口製剤はいずれもその経口バイオアベイラビリティに影響を与える要因である薬物の溶解度、安定性、溶解速度及び消化（ＧＩ）管透過性を考慮する必要がある。これらの薬物の経口製剤は消化管における半減期と代謝を低下させて経口バイオアベイラビリティを最大にするために、溶解速度を速くし、吸収速度を高める必要がある。薬物、特に抗癌剤の効果を改善するために、経口製剤は消化管壁の上皮層からの吸収を妨げるバリアを解消する必要がある。

ＤＯＸはリンパ腫、肉腫、乳癌、卵巣癌及び肺癌を治療するために広く使用されている抗癌剤である。ＤＯＸはＤＮＡの塩基間にインターカレートすることによりＤＮＡを損傷させ、トポイソメラーゼＩＩ酵素活性を阻害し、ＤＮＡ転写を妨害する。ＤＯＸはＢＣＳ分類ＩＩＩの薬物であり、溶解度は良好であるが、透過性が不良であり、経口バイオアベイラビリティが低い（約５％）。一方、ＤＯＸには酸化ストレス発生に起因するその心臓毒性と、腎毒性、骨髄抑制及び多剤耐性の発生を含む他の副作用があり、いずれも治療指数の狭さに繋がり、その使用を阻む重大な臨床上の制約要因となっている。従って、その腸管透過性及び経口バイオアベイラビリティの不良を改善するために新規な製剤ストラテジーが必要である。

肝臓から分泌される胆汁酸は腸管上皮細胞を通って回腸末端から再吸収され、門脈を通って肝臓に戻るので、胆汁酸トランスポーターは薬物送達の魅力的なターゲットである。胆汁酸リサイクル比が高いと、胆汁酸の腸肝循環が非常に効率的なプロセスとなり、肝臓と回腸末端で主に発現される胆汁酸トランスポーターに有益である。タウロコール酸（ＴＣＡ）は多量に存在する胆汁酸であり、ヒト腸液の約４５％を占める。

ＴＣＡはアニオン性ポリマーと共有結合させることにより薬物担体として使用することができ、経口投与により送達することができる。ポリマーの表面に存在するＴＣＡは小腸内で胆汁酸トランスポーターと相互作用し、薬物の腸管透過性とそのバイオアベイラビリティを改善することができる。ＤＯＸの場合には、親水性でカチオン性であるため、主に傍細胞経路を介して腸管上皮細胞を通過することができる。一方、ＤＯＸ表面のＴＣＡコーティングは回腸末端に主に存在するＮａ^＋依存性の頂端側胆汁酸トランスポーター（ＡＳＢＴ）を介する腸管細胞を通る吸収を最大にし、回腸末端から門脈へのＤＯＸ輸送を助長し、ＤＯＸを全身循環に導入すると思われる。

本実施例ではＴＣＡと共有結合させるための代表的なアニオン性ポリマー主鎖として、生体適合性、水溶解度及び生分解性が高いことからヘパリン（Ｈ）とコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を選択した。これらの多糖は天然ポリマーであり、生体適合性が高い。Ｈ−ＴＣＡとＣＳ−ＴＣＡはＤＯＸの表面を被覆し、消化（ＧＩ）管内におけるその安定性を強化し、ＤＯＸをＧＩ環境から保護することができる。更に、Ｈ−ＴＣＡとＣＳ−ＴＣＡはＤＯＸと複合体化し、ミクロンサイズの粒子よりも効率的に吸収させることが可能な微小粒子を形成することができる。本願に開示する粒子は約１０ｎｍ〜約１０μｍの範囲である。この製剤ストラテジーは非特異的吸着量を減らし、特異的な腸管吸収を改善し、ＤＯＸのバイオアベイラビリティを改善することができる。更に、腸肝循環による効率的なＴＣＡリサイクルは肝臓癌を標的とする抗癌化学療法に有益であると思われる。

材料。ドキソルビシン塩酸塩、断片化サケ精子ＤＮＡ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，ＭＤ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、Ｄ−グルコース、重炭酸ナトリウム、組換えヒトインスリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２，ＲＰＭＩ １６４０培地、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は特に指定しない限り、販売業者から購入し、購入したままの状態で使用した。

ＤＯＸ充填粒子の作製と特性解析。ＤＯＸ等のバイオアベイラビリティの低い薬物の透過性を強化する可能性を評価するために、胆汁酸又は胆汁酸抱合体（本実施例ではタウロコール酸、即ちＴＣＡ）をアニオン性ポリマー（本実施例では多糖であるヘパリンとコンドロイチン硫酸を試験する）と結合させ、経口送達に適した組成物とする。

ＴＣＡナトリウム塩１ｍｏｌを０℃のＤＭＦに溶解させた後にトリエチルアミン６ｍｏｌとクロロギ酸４−ニトロフェニル（ＮＰＣ）５ｍｏｌを加えることにより、ヘパリンと結合したタウロコール酸（Ｈ−ＴＣＡ）を調製した。次に溶液をエタノールと脱イオン水で３回抽出した。ロータリーエバポレーターを使用して有機溶媒を除去し、サンプルをフリーズドライし、ＴＣＡ−ＮＰＣを得た。４−メチルモルホリン２ｍｏｌを添加したＤＭＦにＴＣＡ−ＮＰＣ１モルを溶解させ、エチレンジアミン１００ｍｏｌを滴下し、生成物を乾燥してＴＣＡ−ＮＨ_２を得た。

ＴＣＡをヘパリン（Ｈ）又はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）と結合させるために、多糖１ｍｏｌを脱イオン水に溶解させ、ＥＤＣ（５ｍｏｌ）とＮＨＳ（５ｍｏｌ）を溶液に加え、室温で１２時間撹拌した。同一モル比のＴＣＡ−ＮＨ_２をヘパリン及びコンドロイチン硫酸の各々に加え、１：４（多糖１モル対ＴＣＡ４ｍｏｌ）の同一結合量のＴＣＡを得た。１日後に溶液をＭＷＣＯ１０００透析膜に加え、水で透析した。最終生成物を凍結乾燥し、Ｄ_２Ｏ中でその^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより確認した。

図１６ＡはＴＣＡ−ＮＨ_２との反応前のコンドロイチン硫酸のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。図１６Ｂはコンドロイチン硫酸をＴＣＡ−ＮＨ_２と結合させた生成物の透析後のプロトンスペクトルを示し、共有結合が確認される。

ＤＯＸ充填粒子の形成と再構成。カチオン性ＤＯＸとアニオン性ＴＣＡ複合体ＣＳ−ＴＣＡ及びＨ−ＴＣＡとの静電結合によりＤＯＸ充填粒子を形成した。経口投与に備え、ＤＯＸを静電相互作用によりＣＳ−ＴＣＡ又はＨ−ＴＣＡで被覆した。

ＣＳ−ＴＣＡをＤＯＸと１：２（ｗ／ｗ）の比で直接混合した。ボルテックスを使用して溶液を混合し、２０の振幅で１０秒間超音波処理した後、室温で３０分間インキュベートした。

Ｈ−ＴＣＡ複合体の場合には、ＤＯＸを先ず断片化サケ精子ＤＮＡと混合し、ＤＮＡ／ＤＯＸ複合体に負の表面電荷を付与した。次にＤＯＸ／ＤＮＡ複合体をε−ポリ−Ｌ−リジン（ε−ＰＬＬ）と混合し、正に帯電した表面をもつ複合体を得た。即ち、断片化ＤＮＡを使用してＤＯＸと結合させ、アニオン性ＤＮＡ／薬物（「ＤＤ」）複合体を形成した後、ε−ＰＬＬを使用してＤＮＡ／薬物複合体に被覆し、カチオン性表面をもつＤＮＡ／薬物／ポリマー複合体（「ＤＤＰ」）を得た。最後に、Ｈ−ＴＣＡを使用してカチオン性ＤＤＰ複合体に被覆し、最終的な治療用組成物を得た。

所定の実施形態では、前記小分子治療剤をそれ自体カチオン性とすることができ、従って、コア複合体を形成するために（ＤＮＡ及び／又はポリリジン等の）他の成分を加えなくてもよい。従って、実施形態によっては、前記コア複合体はカチオン性小分子治療剤を含む。

製剤毎にボルテックスを使用して溶液を混合し、２０の振幅で１０秒間超音波処理した後、室温で３０分間インキュベートした。ＤＤＰ対Ｈ−ＴＣＡの比が２．８：２．４となるようにＤＤＰをＨ−ＴＣＡで被覆した最終的な製剤を調製した。ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ組成物では、ＤＯＸ：ＤＮＡの比を１：１とし、（ＤＯＸ／ＤＮＡ）部分：ε−ＰＬＬの比を２：０．８とし、ＤＤＰ：Ｈ−ＴＣＡの比を２．８：２．４とし、全ての比は重量に基づいて計算した（ｗ／ｗ）。

薬物対胆汁酸−ポリマーの比を変え、１：２ｗ／ｗ比のＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡと、２．８：２．４ｗ／ｗ比のＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡの２種類のＤＯＸ製剤を調製した。

最終的な組成物により形成された粒子を更に評価した。具体的には、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．４）で希釈することによりＤＯＸ粒子の粒径と表面電荷を評価した後、室温（２５℃）にて波長６７７ｎｍ及び９０°の一定角度でゼータサイザー３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，英国）を使用して動的光散乱法（ＤＬＳ）により粒子の流体力学的粒子径とゼータ電位を計測した。

サンプルをフリーズドライ後、粒子を脱イオン水で再構成し、サンプルをＤＬＳ測定の直前に２０の振幅で約１０秒間超音波処理した。凍結乾燥粉末を使用時まで−２０℃で保存した。

カチオン性ＤＯＸとアニオン性ＴＣＡ複合体の静電相互作用の分析によると、ＤＯＸ−ＴＣＡ粒子が形成された。図１７は調製時のＤＯＸ−ＴＣＡ粒子と再構成後のＤＯＸ−ＴＣＡ粒子のサンプルの粒径とゼータ電位のグラフである。データは平均±ＳＤ，ｎ＝１０として表す。

室温でインキュベーション前に、粒子を２０の振幅で約１０秒間超音波処理すると、粒径減少と狭い多分散指数（ＰＤＩ）が認められた。超音波処理は音響キャビテーションを誘導し、溶液中に強い力で衝撃波を生じる。その結果、粒子は相互に衝突し、凝集物が分解し、その結果、粒径とＰＤＩが全体的に減少する。

図１７に示すように、調製時のＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ粒子とＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子の流体力学的粒子径は夫々約２００ｎｍと約２３０ｎｍであった。ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡの場合には、胆汁酸で包囲した複合体における多層成分により粒径が増加した。調製時のＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ粒子のゼータ電位は−４２．７ｍＶであり、調製時のＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子では−３０．２ｍＶであった。いずれも多糖主鎖にカルボン酸基が存在するために負に帯電していた。

ＤＯＸ充填粒子の粒径はフリーズドライ前のサンプルの粒径に比較して再構成後に僅かに増加した。再構成後のＤＯＸ充填粒子はＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡで約２０１ｎｍ、ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡで約３１２ｎｍの粒径を示したが、それらのゼータ電位に有意な変化はなかった。

ＤＤＰ複合体をＨ−ＴＣＡで被覆すると、粒径が比較的大きくなり、多分散指数（ＰＤＩ）が広くなることが判明した。他方、ＣＳ−ＴＣＡで単層被覆すると、１：２（ｗ／ｗ）比で調製した場合に粒径が小さく、ＰＤＩが狭くなった。ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ粒子とＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子はフリーズドライ後に脱イオン水で再構成することができ、一般にその粒径とゼータ電位を維持した。

ＤＯＸ封入のスペクトル測定。紫外可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）分光法（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，米国）を使用し、遊離ＤＯＸと比較してＤＯＸ充填粒子の吸光度の変化を計測した。ＤＯＸのサンプル（１サンプル当たりＤＯＸ２５μｇを含有する０．１ｍＬサンプル）を調製し、脱イオン水０．９ｍＬで希釈して総体積１．０ｍＬとし、石英キュベットに加えた。遊離ＤＯＸのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルは２３２ｎｍと４９０ｎｍにピークを示すが、ＤＯＸ充填胆汁酸粒子のスペクトルを遊離ＤＯＸ対照サンプルのスペクトルと比較した。

図１８Ａ及び１８ＢはこれらのサンプルのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。図１８Ａは遊離ＤＯＸ（実線）、ＤＯＸ／ＤＮＡ（点線）、ＤＯＸ／ＤＮＡ／ε−ＰＬＬ（一点鎖線）及びＤＤＰ／ＨＴＣＡ組成物（破線）のスペクトルを示す。図１８Ｂは遊離ＤＯＸ（実線）とＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ組成物（破線）のスペクトルを示す。

図１８Ａから明らかなように、担体なしのＤＯＸは２３２ｎｍと４９０ｎｍに２つの主要なピークを示した。多糖であるヘパリン及びコンドロイチン硫酸とＴＣＡの結合体にＤＯＸを結合させると、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのこれらの２つのピークは有意に低下した。ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡサンプルとＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡサンプルはいずれもＣＳ−ＴＣＡ粒子の単層被覆又はＨ−ＴＣＡ粒子の多層被覆後にこれらの２つのＤＯＸピークが完全に消滅し、ＤＯＸとＴＣＡ−多糖−結合体の間で相互作用が生じたと判断される。スペクトルの変化は両製剤がＤＯＸの充填に成功したことも示す。粒子の内側にＤＯＸを高い充填効率で封入することができる。

これらのＤＯＸ含有製剤の長期保存の可能性を評価し、このような保存後にその特性を維持できるか否かを判定した。図１９Ａに示すように、ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ組成物とＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ組成物の粒径を７日間測定した。

図面に示すように、７日間保存後に、ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤は寸法が僅かに変化しただけでほぼ安定しており、約１９０ｎｍの粒径を維持した。ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡの場合には、粒径は時間の経過と共に約２７０ｎｍから約３４０ｎｍまで若干増加した。粒径の漸増は単層被覆よりも多層被覆のほうが不安定であることを示唆しており、従って、ＣＳ−ＴＣＡ粒子の単層被覆は多層ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子よりも粒径の点で良好な安定性を提供すると思われる。

インビトロ安定性試験。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液中で３種類の異なるｐＨ値（ｐＨ１．５、５及び７）にてＤＯＸ充填粒子の安定性を試験した。図１９Ｂ（平均±ＳＤ，ｎ＝３）に示すように、７日間まで毎日動的光散乱法により粒子の平均粒径を計測した。

１．５の酸性ｐＨでは、高ｐＨ値での粒子の粒径に比較してどちらの多糖組成物も粒径が減少し、減少度はＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子のほうがＤＯＸ−ＣＳ−ＴＣＡ粒子よりも大きかった。ＤＯＸはｐＫａが約７．２〜８．０であるため、ｐＨ７．４でアミノ基のプロトン化により部分的にイオン化される。即ち、ＤＯＸはｐＨが低いほどプロトン化され易く、その結果、ＤＯＸとアニオン性ＣＳ−ＴＣＡ及び短い断片ＤＮＡとの間により強い静電相互作用を生じることができ、粒径減少に寄与すると思われる。ｐＨが低いほど粒径が小さくなることはＤＯＸ充填粒子が胃の中のｐＨ値で安定であり、ＤＯＸを分解から保護できることも示唆している。ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ粒子の粒径はｐＨ１．５の約２００ｎｍからｐＨ７の約２２０ｎｍまでであり、ｐＨ値の変動による差が小さく、単層被覆粒子のほうがＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子に比較して一般に安定しており、試験した広い範囲のｐＨ値で同等の粒径を維持すると判断された。ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子の粒径はｐＨの上昇に伴ってｐＨ１．５の約２６０ｎｍからｐＨ７の約３００ｎｍまで若干増加した。

ＤＯＸ充填及び封入試験。４９０ｎｍのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを使用して各製剤の薬物充填量と充填効率を測定し、標準化曲線から計算した。ｐＨ７．４とｐＨ５のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で透析法を使用して粒子からのＤＯＸ放出を試験した。

各ｐＨについて、ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ粒子又はＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子１ｍＬ（１サンプル当たりＤＯＸ２５０μｇ）を調製し、透析膜（ＭＷＣＯ３５００ｇ／ｍｏｌ）に加えた。透析バッグを緩衝液２０ｍＬに投入し、緩衝液を３７℃にて１３０ｒｐｍで撹拌した。所定時点で外相緩衝液１ｍＬを排出し、同一体積の新鮮な緩衝液を加えた。

外相緩衝液サンプルに存在するＤＯＸの量はＤＯＸ放出量に相当するので、４９０ｎｍにおけるサンプルの吸光度を測定し、数値を標準較正曲線と比較することによりこの量を計算した。次に下式を使用して薬物充填百分率と効率を計算した。

ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡとＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡの充填効率を計算した処、夫々約６１．６％と約７７．８％であった。ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡとＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡの充填率を求めた処、夫々約３０．８％と約１８．５％であった。ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ製剤に存在する多層はＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤と比較して高い薬物充填能と高い充填効率を提供するようである。しかし、どちらの製剤でも、薬物の高い充填レベルと高い充填効率が達成された。

これらの２種類の粒状製剤からの薬物放出データを図２０Ａ及び２０Ｂに示す。データは平均±ＳＤ、ｎ＝３として表す。図２０ＡはＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤（四角いマーカーを付けた上側の線）と、ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ製剤（丸いマーカーを付けた下側の線）のｐＨ７．４におけるＤＯＸ放出の経時変化を示すデータである。図２０ＢはＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤（四角いマーカーを付けた上側の線）とＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ製剤（丸いマーカーを付けた下側の線）のｐＨ５におけるＤＯＸ放出の経時変化を示すデータである。

これらのデータによると、ｐＨ７．４のＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤では２４時間以内に比較的迅速なＤＯＸの放出が認められ、この時間内に薬物の約７５％が放出された。ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ製剤からのＤＯＸの放出のほうが遅く、４８時間でＤＯＸの約５０％が放出された。このことから、単層被覆は粒子からより迅速な薬物放出を誘導できると判断される。多層ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子はＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ単層被覆粒子に比較して遅い放出速度を示したことから、ＤＯＸ放出を遅らせることができる拡散バリアを含んでいるように挙動すると思われる。ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡの放出プロファイルによると、ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ組成物よりも迅速にＤＯＸを放出することが分かった。

ｐＨ５では、製剤からのＤＯＸ放出速度はｐＨ７での放出速度に比較して遅くなった。ｐＨ５では、ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤は４８時間で約６５％のＤＯＸ放出率を示し、ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡは４８時間でＤＯＸの約４０％を放出した。この結果は酸性環境ではＤＯＸのダウノサミン基のプロトン化度が高いためであると思われる。従って、ＤＯＸ充填製剤は（リソソーム内のｐＨに対応する）ｐＨ５ではＤＯＸのプロトン化度が高く、放出が遅いが、ｐＨ７．４ではＤＯＸ放出速度が加速したと思われる。ＤＯＸの標的部位である核ではｐＨが７．４であるため、ＤＯＸは迅速に放出され、核内のＤＮＡとインターカレートするのに利用できると考えられる。これらの結果によると、ＤＯＸ充填製剤からのＤＯＸ放出は部分的にｐＨにより制御されると判断される。

ＤＯＸ充填粒子のインビトロ細胞毒性。ポリマーとＤＯＸ充填粒子の細胞毒性を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞を使用してサンプルを用量依存的にトランスフェクトし、ＭＴＴによる細胞生存率アッセイにより評価した。細胞培養：１０％ ＦＢＳとＤ−グルコース（４．５ｇ／Ｌ）を添加したＤＭＥＭでＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）を培養した。３７℃で５％ＣＯ_２の加湿空気下にて細胞を増殖させ、維持した。細胞生存率：ＭＴＴアッセイを使用し、胆汁酸を結合させたポリマーとＤＯＸ充填粒子の細胞生存率を評価した。培地１００μＬ中、５×１０^３個／ウェルの細胞密度でＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後に、種々の濃度範囲（０．０１〜１００μｇ／ｍＬ）のＤＯＸ及びＤＯＸ充填製剤を加え、更に２４時間細胞に暴露した。次にＭＴＴ（１０μＬ；５ｍｇ／ｍＬ）溶液をウェルに加え、４時間インキュベートした。残留する培地を完全に吸引し、ＤＭＳＯ（１００μＬ）を加え、３７℃で１０分間インキュベーション後に生細胞から生成されたホルマザン結晶を溶解させた。細胞の吸光度を５７０ｎｍで測定し、その細胞生存率を計算した。

図２１はＨ−ＴＣＡ複合体（四角いマーカーを付けた上側の線）とＣＳ−ＴＣＡ複合体（丸いマーカーを付けた下側の線）に暴露後のＨｅｐＧ２細胞生存率を示す。データは平均±ＳＤ，ｎ＝６として表す。これらのサンプルにはＤＯＸを加えていない。胆汁酸を結合させたポリマーのＭＴＴアッセイによると、前記細胞をＣＳ−ＴＣＡ又はＨ−ＴＣＡと共にインキュベーション後に、０．０１μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの濃度で夫々元の細胞生存率の約９０％及び６０％が維持されることが判明した。従って、これらのポリマーは細胞毒性が極低いと判断された。

２４時間、４８時間及び７２時間インキュベーション後にＨｅｐＧ２細胞で遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ粒子及びＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子の細胞生存率も調べた。結果を図２２Ａ〜２２Ｃに示す。データは平均±ＳＤ，ｎ＝６として表す。図２２Ａは２４時間後、４８時間後及び７２時間後の５種類の濃度（０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）の遊離ＤＯＸの細胞生存率を示す。図２２Ｂは同じく２４時間後、４８時間後及び７２時間後の上記と同一の５種類の濃度のＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤の細胞生存率を示す。図２２Ｃは同じく２４時間後、４８時間後及び７２時間後の上記と同一の５種類の濃度のＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ多層製剤の細胞生存率を示す。

データによると、遊離ＤＯＸが最大の用量依存的細胞毒性を示したが、これはＤＯＸがカチオン性であり、細胞に対する毒性が強いためであると思われる。ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤とＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ製剤については、ＤＯＸ充填粒子のほうが遊離ＤＯＸに比較して毒性が弱く、ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤はＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ製剤よりもやや弱い毒性を示した。ＣＳ−ＴＣＡ又はＨ−ＴＣＡアニオン性ポリマーコーティングはＤＯＸによる細胞毒性を改善し（即ち細胞生存率を上げ）、従って、ＤＯＸ充填製剤で観測される細胞毒性は低くなった。一方、多層被覆ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ複合体は単層被覆ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ製剤よりも若干高い毒性を示した。これらの結果はＤＯＸを被覆する３種類までの異なるポリマーの存在に起因すると思われる。

腫瘍をもつ動物モデルにおけるインビボ効果。遊離ＤＯＸとＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ組成物のインビボ抗癌効果をＨｅｐＧ２異種移植マウスモデルで評価した。経口及びＩＶ投与により遊離ＤＯＸを投与した動物を対照群として使用し、ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ組成物をＤＯＸ４ｍｇ／ｋｇの用量で３日毎に１８日間まで経口投与した。

ＨｅｐＧ２細胞（５×１０^６個／ｍＬ）をＰＢＳ１００μＬに加えて各マウスの背中に皮下注射した。腫瘍サイズが約１００〜１５０ｍｍ^３に達したら、ＰＢＳ、ＤＯＸ４ｍｇ／ｋｇ、又はＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ組成物としてＤＯＸ４ｍｇ／ｋｇを各マウスに３日毎に１回経口投与した。更に、等量のドキソルビシンを対照群に静脈内（ＩＶ）投与した。３日毎に腫瘍をデジタルキャリパーで測定し、下式を使用して腫瘍体積を計算した。

比較的高濃度にするために、インビボ投与の直前にＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子の凍結乾燥粉末を脱イオン水で再構成した。先ず、胆汁酸で被覆したＤＯＸ充填粒子の腫瘍増殖抑制効果をマウス異種移植モデルで調べた。用量４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（ＤＯＸ）又はＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ粒子として製剤化した等価量のＤＯＸを調製し、１８日間まで３日毎にＩＶ又は経口投与により送達し、腫瘍進行をモニターした。胆汁酸なし（即ちＴＣＡなし）のＤＯＸ充填粒子も非標的対照製剤として試験し、ＴＣＡの腫瘍抑制効果を評価した。ＰＢＳ対照群の腫瘍は非常に活発であり、１８日付近で動物の体重の１０％超に達したので、全投与を停止し、１８日目に全マウスを屠殺した。

統計解析。２群の比較にはスチューデントのｔ検定を使用し、３群以上の比較には一元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニの事後解析を使用し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。

図２３Ａ〜２３Ｃは製剤の抗腫瘍効果を示す。全投与群は経時的に腫瘍体積の増加を示した。しかし、投与に使用した製剤に応じて腫瘍増殖速度と総腫瘍体積変化に有意な差があった。データは平均±ＳＥＭ，ｎ＝３として表す。

図２３Ａは試験に使用した７種類の製剤、即ちＰＢＳ対照、遊離ＤＯＸのＩＶ投与、遊離ＤＯＸの経口投与、ＤＤＰ／ヘパリン複合体（胆汁酸なし）、ＤＯＸ／コンドロイチン硫酸複合体（胆汁酸なし）、及び胆汁酸で包囲した２種類のＤＯＸ組成物（ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ及びＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ）についてマウスにおける腫瘍体積の経時変化百分率を示す。

図２３Ａに示すように、遊離ＤＯＸ ＩＶ群（逆三角形のマーカーを付けた破線）の腫瘍体積は腫瘍増殖の最大の抑制を示した。一方、胆汁酸で包囲したＤＯＸ粒子を投与したマウス（四角いマーカーを付けた点線及び白抜き菱形のマーカーを付けた長破線）では他の経口対照群に比較して大きな腫瘍増殖抑制量が認められた。胆汁酸で包囲したＤＯＸ群の腫瘍体積は遊離ＤＯＸを経口投与したマウス（黒い菱形のマーカーを付けた長破線）の腫瘍体積よりも有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。遊離ＤＯＸ経口群の腫瘍は体積がほぼ１４００％増加したが、ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ群とＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ群の腫瘍は夫々４００％と６００％の体積増加を示すに止まった。ＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ群の腫瘍はＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ群の腫瘍よりも若干大きな腫瘍体積増加を示したが、この結果はＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ複合体と比較してＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡ複合体からのＤＯＸの放出のほうが速いことに起因すると思われる。他方、胆汁酸なしのＤＯＸ−多糖複合体を投与した腫瘍（三角形のマーカーを付けた短破線及び丸いマーカーを付けた一点破線）は腫瘍増殖が有意に抑制されず、一般に遊離ＤＯＸ経口群と比較して腫瘍増殖率に顕著な変化を示さなかった。遊離ＤＯＸ経口群と非ＴＣＡ群の腫瘍体積に有意な差はなかった。

図２３Ｂは投与した動物における腫瘍量の変化百分率を示す。星印を付けた値（右端の棒のａとｂ）により示す差は遊離ＤＯＸ経口群と比較してｐ＜０．０５である。胆汁酸で包囲した２種類のＤＯＸ組成物（即ち項目名ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ及びＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡの棒）はＴＣＡなしのＤＯＸ複合体を投与したマウス（即ち項目名ＤＤＰ／Ｈ及びＤＯＸ／ＣＳの棒）と比較して腫瘍増殖抑制効果が高かった。胆汁酸で包囲した２種類のＤＯＸ群で認められた腫瘍退縮は、胆汁酸で包囲した２種類のＤＯＸ製剤がＨｅｐＧ２異種移植癌モデルで強い抗腫瘍効果をもつことを示唆している。図２３Ｂに示すように、１８日目に測定した腫瘍量によると、ＤＯＸ−ＴＣＡ粒子を投与した動物群における腫瘍量は遊離ＤＯＸ経口群の腫瘍量に比較して著しく減少していた。

投与期間を通してマウスの体重も測定し、投与による毒性を評価した。投与群の相対体重百分率の経時変化を示すグラフである図２３Ｃにこのデータを示す。

図２３Ｃから明らかなように、ＰＢＳ群と２種類のＤＯＸ対照群と非ＴＣＡ投与群（即ちＤＤＰ／Ｈ群とＤＯＸ／ＣＳ群）は投与開始時に有意な体重減少を示さず、時間の経過と共にマウスの若干の体重増加が認められたので、投与による重大な毒性はないと判断された。一方、ＤＤＰ／Ｈ−ＴＣＡ群の動物には多少の体重減少が認められたが、試験の終了に向かってゆっくりとした体重増加が認められた。

生体内分布。ＨｅｐＧ２腫瘍をもつＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで生体内分布試験を行った。製剤の投与から４時間後に各マウスの主要臓器と腸管を採取した。各マウスの肝臓、腎臓、心臓、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸を含む）及び腫瘍を採取し、０．３Ｎ ＨＣｌを添加した７０％エタノールに懸濁した。次にサンプルをホモジナイズしてドキソルビシンを抽出した後、サンプルを２４時間冷蔵し、遠心して上清を採取した。分析に備え、上清２００μＬを黒色不透明プレートに添加し、励起波長及び発光波長を夫々４７０ｎｍ及び５９０ｎｍとしてプレートリーダーを使用してＤＯＸ蛍光を測定した。

生体内分布試験の結果を図２４に示す。データは平均±ＳＥＭ，ｎ＝３として表す。ＤＯＸ蛍光強度を測定することにより各マウスの主要臓器と腸におけるＤＯＸの濃度を測定し、組織１ｇ当たりのＤＯＸμｇとして結果を報告する。特筆すべき点として、遊離ＤＯＸのＩＶ注射後にどの経口投与群よりも高濃度のＤＯＸが心臓及び肝臓組織に認められた。

データによると、胆汁酸で包囲した２種類のＤＯＸ組成物を投与したサンプル（即ち凡例名ＤＤＰ−ＨＴＣＡ及びＤＯＸ／ＣＳ−ＴＣＡの棒）の回腸において経口製剤で最大量のＤＯＸが認められた。これらの２種類の組成物を投与したマウスの回腸におけるＤＯＸ含有量は遊離ＤＯＸ経口群又は非ＴＣＡ群の約３〜４倍であった。回腸におけるＤＯＸ蓄積量は胆汁酸で包囲したＤＯＸ組成物の標的吸収の指標であり、胆汁酸で包囲したＤＯＸ組成物が回腸に存在する胆汁酸トランスポーターにより有効に取込まれたことを示唆している。更に、腫瘍部位における蓄積の改善も認められた。これらの結果は胆汁酸を介するＤＯＸの経口吸収が遊離ＤＯＸの経口投与後の濃度に比較して血流中のＤＯＸ濃度を増加させることを示唆している。その結果、血流中の蓄積量が比較的多くなり、遊離ＤＯＸ経口投与に比較して腫瘍進行の遅延（優れたＤＯＸ効果）に寄与すると思われる。

結論として、胆汁酸で包囲したドキソルビシン組成物を投与した動物では体重が著しく減少することなしに腫瘍増殖の統計的に有意な抑制が認められた。更に、生体内分布分析の結果、胆汁酸で包囲したドキソルビシン組成物を経口投与した動物は遊離ドキソルビシンを経口投与した動物よりも回腸からのドキソルビシン吸収が増加することが示唆された。動物データによると、胆汁酸コーティングはドキソルビシンの毒性を低下させるだけでなく、腸、特に回腸におけるその吸収を増加させることが判明した。これらの結果から、胆汁酸で包囲したドキソルビシン組成物の腸肝循環は全身ＤＯＸ濃度を上昇させ、血漿中ＤＯＸ濃度を上昇させるようであり、経口バイオアベイラビリティ増加と腫瘍増殖抑制に繋がると考えられる。

胆汁酸で包囲したドキソルビシン粒子はフリーズドライ後に安定性が変化せず、長期保存の可能性を示した。更に胆汁酸コーティングは遊離ＤＯＸに比較して毒性が極低く、高い薬物充填効率とｐＨ依存的薬物放出が得られた。重要な点として、インビボ結果によると、胆汁酸で包囲したドキソルビシン組成物は腫瘍増殖を有意に遅らせることが判明した。胆汁酸で包囲したドキソルビシン粒子によりドキソルビシンの回腸吸収が改善されることは生体内分布試験でも実証された。全体として、胆汁酸を含有する製剤を経口投与すると、遊離ＤＯＸ及び胆汁酸を含有しない製剤よりも固形腫瘍に対して高い治療効果を示した。従って、胆汁酸を介する標的送達は胆汁酸トランスポーターを利用することによりドキソルビシンの治療性能を強化し、その経口吸収の増加に繋がると考えられる。即ち、胆汁酸はドキソルビシンの経口送達に有効な担体であることが証明された。更に、これらの新規製剤は所定の抗癌剤又は化学療法剤の静脈内から経口への投与経路の転換を実現可能にすると思われる。

［実施例４］．胆汁酸及び／又は胆汁酸抱合体、リポソーム並びに治療剤を含有する治療用組成物。

本願に開示する治療用組成物はその表面に胆汁酸又は胆汁酸抱合体を有するコア複合体を含有するものであるが、更に脂質又はリポソーム等の脂質層を含有していてもよい。前記リポソームはコア複合体の外面を形成することができ、カチオン性とすることができる。従って、本発明の組成物の所定のものはカチオン性表面を有するリポソームの内側に治療剤を完全又は部分的に内包してコア複合体を形成することができる。このようなリポソームコア複合体は胆汁酸又は胆汁酸抱合体と共有結合したアニオン性ポリマーと静電相互作用することができる。このようなリポソーム組成物の１実施形態を図２５に示し、図中、Ａはカチオン性リポソーム組成物（リン脂質二重層として示す）であり、単一のカチオン性脂質を含有するものでもよいし、中性脂質とカチオン性脂質の混合物を含有するものでもよいが、ｐＨ５で正味の正電荷を表面にもち；Ｂはタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、遺伝子又は小分子薬を含む治療剤であり；Ｃはヘパリン、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸等の生分解性及び／又は注射可能であり得るアニオン性ポリマーであり、中性ｐＨで正味の負電荷をもち；Ｄはアニオン性ポリマーＣと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体（ＢＡ）である。

図２５に示す組成物は球形として示し、各層が内側のコアを完全に包囲している。所定の実施形態において、各層はコア及び／又は内側層を完全に包囲せず、組成物は球形ではない。

ＤＮＡベース、タンパク質及び従来の小分子薬を含む種々多様な治療剤に使用することができる送達アプローチのデザインの成功例としては、機能化リポソームの使用が挙げられる。このようなアプローチは所望の特性を達成するためにマイクロメーターサイズの構造の集合体を精巧に制御する必要がある。本実施例では、胆汁酸又は胆汁酸抱合体と共有結合したアニオン性ポリマーで包囲した薬物充填リポソームの使用について検討した。

治療剤をリポソームに充填するためには、多数のスキームを想定することができる。あるスキームでは治療剤の存在下でリポソーム二重層を作製することにより治療剤を完全又は部分的に内包させた二重層を形成することができる。別のスキームによると、治療剤はリポソームの内側に完全に内包され、リン脂質二重層とさほど相互作用しない。このスキームで治療剤をリポソームに充填するためには、治療剤の存在下でリポソームを作製し、リポソーム二重層を治療剤の周囲に自己集合させることが考えられる。あるいは、治療剤とは別にリポソームを形成し、リポソームに開けた一過性の小孔を通して治療剤を添加し、リン脂質の側方拡散によりリポソームを自然に閉鎖させることもできる。本実施例に記載する実験ではこのアプローチを使用し、その模式図を図２６に示す。

即ち、高密度超常磁性Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子をリポソームに分散させ、リポソーム膜に特定の方向で高い荷重を加え、脂質二重層に小孔を開ける。計画的な実験条件により、リポソーム膜に１又は複数の開口小孔部位を形成することができた。リポソーム膜に開けた脂質二重層の小孔を入口として使用し、脂質二重層の小孔が自然回復（即ち閉鎖）する前に（遺伝子、タンパク質又は小分子薬を含む）治療剤をリポソームに挿入した。

適切な親水性／親油性をもつ脂質は水溶液中で自己集合し、小胞状の脂質二重層を形成することができる。親水性又は親油性の生物活性物質を夫々親水性の内側コア又は脂質二重層シェルに収容することができる。化学的又は生物学的分子候補のリポソーム送達システムは生物医療及び他の分野で種々の可能性を提供する。

融合、分裂及び形状変形を含む脂質二重層の動的特性は種々の実験条件により変えることができる。従来の脂質二重層構造から進化させた構造改変型リポソームの作製は非常に効率的なリポソーム薬物担体をデザインするための手段である。本願では、高密度の超常磁性Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子と特注磁石を組込んだマグネチックスターラーを使用して脂質二重層に小孔を開けたリポソーム（以下、部分的に開口したリポソームないし「ＵＣＬ」と言う）を形成する方法を開示する。磁気剪断応力下で、リポソーム内に分散されたＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子は強磁場を介して脂質膜の特定位置に応力を加え、その結果、磁気剪断応力によりリポソーム表面を圧迫して引き裂き、脂質二重層に小孔を開ける。これを図２７に模式的に示す。

この方法を使用し、アニオン性ポリマー（コンドロイチン硫酸）と共有結合させた胆汁酸又は胆汁酸抱合体で被覆し、インスリンとドキソルビシンを充填したリポソームを作製した。

材料及び方法。化学薬品と溶媒は特に指定しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から入手した。（アセチルアセトン酸鉄（ＩＩＩ）、１，２−ヘキサデカンジオール、オレイン酸及びオレイルアミンをベンジルエーテル中にて２００℃で２時間及び３００℃で１時間反化学応後に生成される平均粒径７ｎｍの）Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子はＬｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４７１，（２０１４），１６６−１７２に記載されているように合成した。

（Ｉ）リポソームインスリン。

３群のリポソームを作製し、標識インスリンを挿入した。１群はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）で被覆し、別の１群は実施例１で記載したように調製したタウロコール酸と共有結合させたコンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＴＣＡ）で被覆した。結合に使用したＣＳ：ＴＣＡのモル比は１：４であり、その製法はスキーム１に示す通りである。

タンパク質治療剤試験用リポソーム作製。リポソームは一般にＫｗａｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，１３５（２０１５），１４３−１４９に記載されているように作製した。ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（「ＤＤ」）（２０ｍｇ）、デオキシコール酸（「ＤＯＣＡ」）（５ｍｇ）及びＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子（０．５ｍｇ）をクロロホルム（５ｍＬ）に溶解させ、丸底フラスコに加えた。丸底フラスコ内の溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、フラスコの表面に薄膜を形成した。超音波発生器（６０Ｈｚで５分間）を使用して薄膜を２５℃にて１５０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４，２０ｍＬ）で再水和させた。図２７に示すような２個の四分円（半径３０ｍｍ及び厚さ２ｍｍ）から形成される特注磁石を組込んだマグネチックスターラーを使用し、得られたリポソームをゆっくりと混合した。磁石に付着したリポソームを再び特注磁石を組込んだマグネチックスターラーで２５℃にて１５００ｒｐｍで１分間撹拌した。リポソーム溶液を磁気撹拌後、すぐにリング型ネオジム希土類磁石（半径１０ｍｍ及び厚さ１０ｍｍ）をフラスコの底に固定し、リポソームから漏出した遊離Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子を除去した。

上記と同一比のジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドとデオキシコール酸を使用して従来の膜再水和法に従い、Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子を加えずに対照ないし「ブランク」群のリポソームを作製した。

デオキシコール酸（「ＤＯＣＡ」）を溶液に加えずに、上記と同様に別の群のリポソームを作製した。即ち、これらのリポソームはリポソーム二重層にジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（「ＤＤ」）のみを含むものとした。

Ｃｅ６−インスリン調製及び充填。ＮＩＲ蛍光分光法で検出できるようにインスリンをＣｅ６で標識した。Ｃｅ６のカルボン酸基を使用してインスリンに結合した。脱イオン水１０ｍＬ中でＥＤＣ（５ｍＭ）とＮＨＳ（５ｍＭ）の存在下にＣｅ６（０．１ｍＭ）を過剰のインスリン（１０ｍＭ）と室温で３日間反応させ、Ｃｅ６を結合したインスリンを得た。次にＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ＭＷＣＯ ３．５Ｋ膜を使用し、得られた溶液を新鮮な脱イオン水で透析（２日間）により精製し、未結合の試薬を除去した。次に溶液を２日間フリーズドライした。

ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（「ＤＤ」）のみから作製したリポソームと、ＤＤとＤＯＣＡから作製したリポソームに標識インスリンを充填し、「ブランク」リポソームにも同様に充填した。適量のリポソーム（２０ｍｇ）を１５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４，２０ｍＬ）に分散させ、インスリン（１０ｍｇ）を加えて２５℃で２時間ゆっくりと撹拌（３０ｒｐｍ）すると、ＵＣＬに開いた小孔からタンパク質を容易に封入することができた。

ＤＤとＤＯＣＡを併用して作製したインスリン充填リポソームの一部をコンドロイチン硫酸（２０ｍｇ／ｍＬ）と１４，０００ｒｐｍで３０秒間混合し、コンドロイチン硫酸で被覆したインスリン充填リポソームを得た。

ＤＤとＤＯＣＡを併用して作製したインスリン充填リポソームの一部を実施例１に記載したようにタウロコール酸と共有結合させておいたコンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＴＣＡ，２０ｍｇ／ｍＬ）と１４，０００ｒｐｍで３０秒間混合し、ＣＳ−ＴＣＡで被覆したインスリン充填リポソームを得た。

３群のリポソームサンプルの概要を下表１に示す。

リポソーム溶液を２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた上清中でＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して遊離インスリン濃度を測定した後に、タンパク質充填リポソームのタンパク質充填効率を求めた。インスリン充填効率は初期インスリン供給量に対してリポソーム内に封入されたインスリンの重量百分率と定義した。

ＣＳ又はＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソームのインスリン充填効率は２時間処理後に４０％超であり、ブランクリポソームのインスリン充填効率は４時間処理後に５％未満であった。リポソームのインスリン充填量をリポソーム内のインスリンの重量百分率比により計算した処、各リポソームで約８重量％であることが分かった。

粒径分布及びゼータ電位分析。Ｈｅ−Ｎｅレーザーを搭載したゼータサイザー３０００機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，米国）を使用し、波長６３３ｎｍで散乱角を９０°に固定してリポソーム（１ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）の粒径分布を測定した。ゼータサイザー３０００機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，米国）を使用してリポソーム溶液（１ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）のゼータ電位電荷を測定した。分析前に、リポソーム溶液を室温で２時間安定化させた。

タンパク質を充填したリポソームの粒径とゼータ電位を図２８に示し、下表２にまとめる。

タンパク質放出。リポソームをＰＢＳ（１ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ７．４，０．０１％アジ化ナトリウム添加）に分散させ、透析膜バッグ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐａｒ（Ｒ）ＭＷＣＯ ３．５ＫＤａ）に加えた。透析膜バッグを密閉後、新鮮なＰＢＳ（１０ｍＬ，１５０ｍＭ）を入れたバイアルに浸漬させた。３７℃で機械的振盪（１００ｒｐｍ）によりリポソームからインスリン放出を誘導した。所定の時間間隔（０〜２４時間）で透析膜バッグの外相を抽出し、新鮮な緩衝液に交換した。ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して抽出溶液中のインスリン濃度を計算した。更に、４時間インキュベーション後にＪ−８１５ ＣＤ分光光度計（Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，英国）を使用して抽出溶液中のインスリンの円二色性（ＣＤ）分析を行い、インスリン安定性を評価した（ｎ＝３）。

タンパク質を充填した３種類のリポソームのｐＨ７．４におけるインスリン放出量の経時変化を図２９に示す。ｐＨ１．２の単一データ点（２時間後）も示す。図２９のグラフから明らかなように、ｐＨ７．４でリポソームから放出される合計（累積）インスリン量は異なり、２４時間後に無被覆のリポソームで放出される合計量は約７５％であり、ＣＳで被覆したリポソーム（胆汁酸なし）で同一時間内に放出される量は約７０％であり、ＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソームで放出される量は約５５％まで低下した。全リポソームは８時間以内にインスリンの大半を放出した。ｐＨ１．２のデータによると、全リポソームはインスリン充填量のうちの少量（約５〜１５％）しか放出していないことから、胃の中のような低ｐＨ環境に暴露された場合にリポソームが一般に安定しており、保持しているタンパク質治療剤の有意量を失わないと判断される。

インビトロ細胞取込み。５％ＣＯ_２雰囲気下で３７℃の加湿標準インキュベーターにて１％ペニシリン−ストレプトマイシンと１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でヒト上皮大腸腺癌細胞（ｃａｃｏ−２細胞）を培養した。試験前に、単層として増殖させた細胞（１×１０^５個／ｍＬ）を０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリプシン／０．０３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＥＤＴＡ溶液でトリプシン処理により回収した。ＤＭＥＭに懸濁したＣａｃｏ−２細胞を各ウェルプレートに播種し、インビトロ細胞試験前に２４時間培養した。（１０μｇ／ｍＬのインスリン−Ｃｅ６濃度に等価の量で提供し、４時間処理した）リポソームの細胞取込みをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国）により計測した。更に、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用してインスリン−Ｃｅ６充填リポソームの蛍光によりリポソームの局在を試験した。

リポソームに暴露後の染色細胞の一連の顕微鏡写真である図３０にこの試験の結果を示し、１段目は染色されたリポソームを示し、２段目はＣｅ６標識インスリンからの蛍光シグナルを示し、最下段は１段目と２段目のオーバーレイを示す。最下段から明らかなように、対照サンプル（インスリンをリポソームに充填せずに投与した細胞）とＤＤ０リポソームを投与した細胞には標識インスリンが殆ど存在しない。他方、コンドロイチン硫酸とＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソームを投与した細胞には標識インスリンが存在している。リポソームを取込んだ細胞の解析を図３１に示す。

インビボ臓器蓄積。６〜８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスでインビボ試験を実施した。Ｃｅ６で標識したインスリンを充填した３種類のリポソームをインスリン５０ＩＵ／ｋｇに等価の用量でマウスに経口投与した。別の群のマウスに遊離インスリン（リポソームなし）を同一用量で投与した。Ｃマウントレンズと長波発光フィルター（６００〜７００ｎｍ）を搭載した１２ビットＣＣＤカメラ（Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４０００ＭＭ；Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，米国）を使用し、投与時点（ｔ＝０）から２４時間までのマウスのライブフォトルミネッセンス画像を得た。

生きたマウスに遊離インスリン（１列目）又は上記３種類のリポソームインスリン製剤（２〜４列目に指定）を投与してから１時間後、２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後の顕微鏡写真を図３２に示す。これらの写真から明らかなように、ＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソームを投与したマウスは最も強い蛍光シグナルを示し、この動物群に最大量の標識インスリンが存在すると判断され、ＣＳで被覆したリポソームではシグナルが弱く、他の２群では著しく弱かった。

エクスビボ蛍光試験。注射から４時間後に一部のマウス（ｎ＝５）を屠殺し、摘出した臓器を調べた（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、十二指腸、空腸及び回腸）。これらの臓器の顕微鏡写真を図３３に示す。臓器を回収し、０．３Ｎ ＨＣｌを添加した７０％エタノールに懸濁後、ホモジナイズし、標識インスリンを抽出した。遠心後、蛍光プレートリーダーを使用して上清中のＣｅ６蛍光（４１０ｎｍ励起、６７０ｎｍ発光）を測定した。蛍光の強度を図３４に示す。

図３３に示すように、標識インスリンはＣＳ及びＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソームを投与したマウスの十二指腸と空腸に主に存在する。図３４は分布をまとめたものであり、ＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソーム（各セットの一番右の棒）を投与したマウスにはＣＳで被覆したリポソーム（各セットの左から３番目の棒）よりも有意に多量の標識インスリンが存在することが明らかである。

血漿中濃度。心臓穿刺によりＥＤＴＡ入り微量採血管に採血し、遠心して血漿を得た。血漿サンプルをフリーズドライ後、０．３Ｎ ＨＣｌを添加した７０％エタノールに溶解させ、Ｃｅ６標識を抽出した。上清中のＣｅ６蛍光の強度を上記のように測定した（ｎ＝５）。Ｃｅ６蛍光は無傷のインスリン又はＣｅ６標識を含む（消化後の）インスリン断片に由来すると思われる。

血漿データを図３５に示す。ＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソーム（四角いマーカーを付けた一番上の線）を投与したマウスに由来する血漿は最高のインスリン濃度を示し、投与から約８時間後にピークが現れる。データによると、ＣＳで被覆したリポソーム（逆三角形のマーカーを付けた上から２番目の線）を投与したマウスには無被覆のリポソーム（丸いマーカーのＤＤ０と白いマーカーの遊離インスリン）のどちらを投与したマウスよりも多量の標識インスリンが存在する。

未修飾リポソームインスリンの薬理活性も試験した。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ，ｐＨ４．５の１０ｍＭクエン酸緩衝液に溶解）を７５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で３日間毎日腹腔内注射することにより雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（各々約２０〜３０ｇ）を糖尿病にした。ＳＴＺ投与から約１週間後に空腹時血糖値が３５０ｍｇ／ｄＬよりも高くなった時点でマウスが糖尿病になったとみなした。インスリンの投与前と投与後の種々の時間間隔でマウスの尾静脈から血液サンプルを採取した。すぐに血糖値測定器（ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ ａｃｔｉｖｅ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して血糖値を測定した（ｎ＝５）。

マウスに体重１ｋｇ当たり５０ＩＵ即ち２０ｇ当たり１ＩＵの正規インスリンを経口投与した。マウスの血清中グルコース濃度の経時変化を図３６に示す。ＣＳ−ＴＣＡで被覆したリポソーム（四角いマーカーを付けた一番下の線）を投与したマウスで最低且つ最も安定した濃度が認められ、投与後１時間以内に約１００ｍｇ／ｄＬまで低下し、一般に２４時間維持された。ＣＳで被覆したリポソーム（逆三角形のマーカーを付けた真ん中の線）を投与したマウスは血清中グルコース濃度が最初の１時間で先ず約１５０ｍｇ／ｄＬまで低下したが、次の３時間で３００ｍｇ／ｄＬ付近まで上昇した後、再び約１５０ｍｇ／ｄＬまで低下し、２４時間までに約２００ｍｇ／ｄＬまで漸増した。ＤＤ０（丸いマーカーを付けた一番上の線）を投与したマウスは血清中グルコース濃度が約２５０ｍｇ／ｄＬまで若干低下し、ＣＳで被覆したリポソームと同様に変動し、約２５０〜３００ｍｇ／ｄＬに維持された。

（ＩＩ）リポソームドキソルビシン。

小分子治療剤試験用リポソーム製剤。ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（「ＤＤ」）をクロロホルムに溶解させ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、フラスコの表面に薄膜を形成した。膜を１２０ｍＭ硫酸アンモニウムで再水和させ、３０分間超音波処理した。遊離硫酸アンモニウムを純水で透析（ＭＷＣＯ１０００）することにより除去した。

ＤＤリポソームにドキソルビシン（ＤＯＸ）を充填するために、以下に模式的に示すように硫化アンモニウム勾配を形成した。

勾配の形成後、リポソーム溶液とドキソルビシン（ＤＯＸ）溶液を混合し、６０℃でインキュベートした。過剰の遊離ＤＯＸを水で透析（ＭＷＣＯ１０００）することにより除去した。最終的なＤＯＸ充填リポソームを凍結乾燥した。４９０ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓによる測定に基づいてＤＯＸ濃度を計算し、下式：

を使用して充填効率を計算した。

経口製剤用として、ポロキサマー（４０ｍｇ／ｍＬ）を添加したＰＢＳに６０℃にてＤＯＸ充填リポソームを溶解させた。１００ｎｍ膜からリポソームを押出す前に押出機を６０℃に自動温度調節した。サンプルを膜から１０回押出した。押出後、経口投与用にリポソームをＣＳ−ＴＣＡ（１：１．５ｗ／ｗ％）で被覆した。

コンドロイチン硫酸と胆汁酸の共有結合体で被覆する前後に、リポソームインスリン製剤について記載したように粒径及びゼータ電位分析によりリポソームＤＯＸ粒子を特性解析した。データを表３に示す。

腫瘍をもつ動物モデルにおけるインビボ治療効果。遊離ＤＯＸ、胆汁酸コーティングなしのカチオン性ＤＯＸ充填リポソーム（「ＤＯＸリポソーム」）、及びＣＳ−ＴＣＡコーティング付きアニオン性ＤＯＸ充填リポソーム（「ＤＬ／ＣＳ−ＴＣＡ」）のインビボ抗癌効果を異種移植マウスモデルで評価した。ＨＴ−２９細胞（マウス１匹当たり１×１０^７個）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝３）の背中に皮下注射した。腫瘍サイズが約１００〜１５０ｍｍ^３に達したら、ＰＢＳ、遊離ＤＯＸ１０ｍｇ／ｋｇ、ＤＯＸリポソーム組成物としてのＤＯＸ１０ｍｇ／ｋｇ、又はＤＬ／ＣＳ−ＴＣＡ組成物としてのＤＯＸ１０ｍｇ／ｋｇを２日毎に１回各マウスに経口投与した。２日毎に腫瘍サイズと体重を測定した。腫瘍体積をデジタルキャリパーで測定し、下式を使用して腫瘍体積を計算した。

腫瘍体積＝（長さ×幅^２）／２。各投与群の腫瘍体積の変化を図３７に示す。１２日目の一番上の線（黒丸）はＰＢＳ対照である。１２日目の上から２番目の線（四角いマーカー）は遊離ＤＯＸである。これらの結果によると、遊離経口ＤＯＸは腫瘍体積減少に関して緩衝液よりも統計的に良好ではない。一番下の線（グレー丸）はＣＳ−ＴＣＡコーティング付きアニオン性ＤＯＸ充填リポソーム（「ＤＬ／ＣＳ−ＴＣＡ」）を投与した動物の腫瘍体積の変化百分率であり、単回経口投与後１２日間にわたってほぼ腫瘍体積の変化を示さない。下から２番目の線（菱形）は胆汁酸コーティングなしのカチオン性ＤＯＸ充填リポソーム（「ＤＯＸリポソーム」）を投与した動物の腫瘍体積の変化百分率であり、これらの腫瘍は１２日間で約２００％増加する。

図３８は投与群の動物の相対体重の変化を示す。遊離ＤＯＸ群の体重は１２日間で若干減少するようであるが、その他の投与群はこの期間にわたって自己の体重を維持するか又は若干増加する。

本願に開示する実験は高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、エキセンジン−４及びＧＬＰ−１をコードするプラスミドＤＮＡの経口投与によるマウスへの送達を含む。先ずプラスミドＤＮＡをカチオン性分岐鎖ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）と複合体化させ、カチオン性複合体とした。次にヘパリンと共有結合させたタウロコール酸（ＴＣＡ）で前記複合体を被覆し、粒径約１００〜約２００ｎｍの粒子とした。ＤＮＡを内包させた粒子を経口投与すると、動物で前記ＤＮＡの産物が発現することが分かった。

ＤＮＡ以外に、インスリン等のタンパク質をプロタミン等のカチオン性ポリマーと結合してカチオン性粒子を形成することもできる。前記カチオン性粒子をヘパリン−ＴＣＡで被覆し、数ミクロンのオーダーの寸法の粒子とすることができる。このような粒子はアニオン性となり、血糖値を下げるために使用することができる。

経口投与後のバイオアベイラビリティが不良な小分子薬であるドキソルビシンを胆汁酸で包囲した粒子として製剤化して送達することに成功した。ドキソルビシンをコンドロイチン硫酸と複合体化することにより形成されたアニオン性粒子をε−ポリ（Ｌ−リジン）で被覆し、カチオン性複合体とした。次に前記粒子をヘパリン−ＴＣＡで被覆した。これらの粒子を経口投与すると、正常なマウスで有意な血漿中ドキソルビシン濃度を示した。２種類の代表的な治療剤である小分子薬（ドキソルビシン）とタンパク質（インスリン）により、胆汁酸を含有する製剤におけるリポソームの使用も実証された。

参考文献

本発明の種々の特徴と利点を以下の特許請求の範囲に記載する。

Claims (20)

1. 治療剤を含み、外面にｐＨ５で正味の正電荷をもつコア複合体と；
   アニオン性ポリマーと共有結合した胆汁酸又は胆汁酸抱合体
   を含有する治療用組成物であって；
   前記アニオン性ポリマーが中性ｐＨで正味の負電荷をもち、前記アニオン性ポリマーが前記外面と静電結合している前記組成物。
2. 前記治療剤が核酸を含む請求項１に記載の組成物。
3. 前記核酸が遺伝子を含む請求項２に記載の組成物。
4. 前記遺伝子がＧＬＰ−１又はエキセンジン４をコードする請求項３に記載の組成物。
5. 前記治療剤がペプチドを含む請求項１に記載の組成物。
6. 前記ペプチドがインスリンである請求項５に記載の組成物。
7. 前記治療剤が小分子である請求項１に記載の組成物。
8. 前記小分子がドキソルビシンである請求項６に記載の組成物。
9. 前記治療剤がワクチン又はウイルスを含む請求項１に記載の組成物。
10. 前記コア複合体がカチオン性ポリマーを含む請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン、プロタミン又はポリ（リジン）の少なくとも１種から選択される請求項１０に記載の組成物。
12. 前記コア複合体がカチオン性リポソームを含む請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記カチオン性リポソームがカチオン性脂質を含む請求項１２に記載の組成物。
14. 前記アニオン性ポリマーがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸又はヘパリンを含む請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記胆汁酸又は胆汁酸抱合体がコール酸を含む請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記コール酸がタウロコール酸である請求項１５に記載の組成物。
17. 治療剤を細胞に送達するための方法であって、前記方法が請求項１から１６のいずれか一項に記載の治療用組成物を対象に経口投与することを含む前記方法。
18. 前記治療用組成物が前記対象の消化管における胆汁酸トランスポーターを介して前記対象に吸収され、前記治療用組成物が前記対象の腸肝循環系に入る請求項１７に記載の方法。
19. 癌の治療方法であって、前記方法が請求項１から３、５、又は７から１６のいずれか一項に記載の治療用組成物を対象に経口投与することを含み、前記治療剤が抗癌剤である前記方法。
20. 代謝障害の治療方法であって、前記方法が請求項１から６、又は９から１６のいずれか一項に記載の治療用組成物を対象に投与することを含み、前記治療剤がＧＬＰ−１、エキセンジン４又はインスリンの少なくとも１種から選択される前記方法。

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