JP2019011331A - Ｎｏｔｃｈ３に対する抗体 - Google Patents

Ｎｏｔｃｈ３に対する抗体 Download PDF

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Deplazes-Lauber Joelle
フライヤー，クリスティ
Fryer Christy
フ，チアンセン
Tiancen Hu
ジェンキンス，デイビッド
Jenkins David
ペトロプーロス，コンスタンティン
Petropoulos Konstantin
ティール，フィリップ
Philippe Thiel
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Abstract

【課題】Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達など、他のＮｏｔｃｈ受容体によるシグナル伝達を変化させる方法および組成物の提供。【解決手段】Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを含む単離ポリペプチドであって、前記コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ：heterodimerization）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、前記ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択され、前記ＨＤドメインが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、前記リンカー領域が、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−ＨＤリンカーからなる群から選択される、単離ポリペプチド。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、それらの内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、
２０１３年３月１４日に出願された、米国仮出願第６１／７８１，４２１号に対する優先
権を主張する。
本発明は一般に、Ｎｏｔｃｈ３と相互作用する、抗体またはそれらの断片に関する。特
に、本発明は、ＮＲＲドメインの、ＬＮＲ領域およびＨＤに由来する、連続アミノ酸残基
および非連続アミノ酸残基を含む、Ｎｏｔｃｈ３または突然変異Ｎｏｔｃｈ３の少なくと
も１つのコンフォメーショナルエピトープを認識する、抗体またはそれらの断片に関する
。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達とは、胎児の発生および成体組織の両方における、幹細胞の維
持、細胞の分化および増殖を含む生物学的機能の多様なセットを調節する、進化において
保存的な経路である（Kopan et al., (2009) Cell 137: 216-233；Guruharsha et al., (
2012) Nat Rev Genet. 13: 654-66；およびAndersson et al., (2001) Development 138:
3593-3612）。哺乳動物では、４つのＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１〜４）が記載され
ており、これらは、保存的なドメインアーキテクチャーを有する。細胞外ドメイン（ＥＣ
Ｄ）は、一連のＥＧＦ様リピートに後続する、３つのＬＮＲリピートとヘテロ二量体化ド
メインとを含有するＮＲＲ（negative regulatory region）からなる。カノニカルのＮｏ
ｔｃｈシグナル伝達は、１つの細胞上のＮｏｔｃｈ受容体が、近傍の細胞上のリガンドと
相互作用すると、活性化する。哺乳動物には、５つの膜貫通型リガンド、３つのＤｅｌｔ
ａ様リガンド（ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、およびＤＬＬ３）、および２つのＪａｇｇｅｄリガ
ンド（Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２）が存在する。リガンドの結合は、ＮＲＲドメイ
ン内のＳ２部位における、ＡＤＡＭプロテアーゼによるＮｏｔｃｈの切断を結果としても
たらす。この初期の切断により、Ｓ３部位における、γ−セクレターゼ複合体による、後
続のＮｏｔｃｈ受容体の切断のための基質が作り出される。γ−セクレターゼによる切断
の後、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＩＣＤ：intracellular domain）は、核へと移行し
、そこで、ＣＳＬ転写因子（哺乳動物では、ＣＢＦ−１／ＲＢＰ−Ｊκ）および共活性化
因子であるｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ（ＭＡＭＬ１）と相互作用して、標的遺伝子の転写を活
性化させる。転写因子のＨＥＳ／ＨＥＹファミリーは、十分に特徴付けられた、Ｎｏｔｃ
ｈ標的遺伝子であるが、大多数の転写標的は、細胞型特異的である。
現在、がんにおけるＮｏｔｃｈ受容体についての証拠は主に、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝
達における変化に焦点を当てているが、他のＮｏｔｃｈ受容体に対してはほとんど焦点が
当てられていない。したがって、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達など、他のＮｏｔｃｈ受容体
によるシグナル伝達を変化させる方法および組成物について研究し、これらを同定する必
要が存在する。
本開示は、Ｎｏｔｃｈ３内または突然変異Ｎｏｔｃｈ３内の、多数の顕著に異なるコン
フォメーショナルエピトープに関する。本開示はまた、ＮＲＲドメインの、ＬＮＲ領域お
よびＨＤに由来する、連続アミノ酸残基および非連続アミノ酸残基を含む、Ｎｏｔｃｈ３
または突然変異Ｎｏｔｃｈ３の、少なくとも１つのコンフォメーショナルエピトープを認
識する、抗体またはそれらの断片にも関する。
したがって、一態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピ
トープを含む単離ポリペプチドであって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（
ＨＤ：heterodimerization）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列お
よび非連続アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃ、
およびこれらのＬＮＲの間の対応するリンカーからなる群から選択され、ＨＤドメインが
、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、リンカー領域が、ＬＮＲ−Ａ／
Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−ＨＤリンカーからなる群から選択される
、単離ポリペプチドに関する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを含
む単離ポリペプチドであって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体
のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメ
イン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、
ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリックスであり、リンカ
ー領域が、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−ＨＤリンカーか
らなる群から選択される、単離ポリペプチドに関する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを含
む単離ポリペプチドであって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体
のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメ
イン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、
ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリックスであり、リンカ
ー領域が、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−ＨＤリンカーか
らなる群から選択される、単離ポリペプチドに関する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを認
識する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（
ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配
列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択され
、ＨＤドメインが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、抗体またはそ
の断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻
害状態で安定化させる。一実施形態では、本開示は、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが、
少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体を提
示する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３突然変異体は、Ｓ１５８０Ｌ、およびＧ１４８７
Ｄ、またはこれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに特
異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが、
Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二
量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続ア
ミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリッ
クスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗体
またはその断片に関する。
一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ａ／Ｂリ
ンカー内のアミノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、コンフォメーショナルエピトー
プは、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内のアミノ酸残基をさらに含む。一実施形態
では、コンフォメーショナルエピトープは、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−ＨＤリンカー内のアミ
ノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、ＨＤβ４
−α３ループ内のアミノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、コンフォメーショナルエ
ピトープは、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー内、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内、ＬＮＲ−ＨＤリン
カー内、およびＨＤβ４−α３ループ内のアミノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、
抗体またはその断片は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させ
る。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３受容体は、突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体であり、ＬＮ
Ｒ領域またはＨＤドメインは、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する。一
実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３突然変異体は、Ｓ１５８０Ｌ Ｄ１５８７Ｎ、Ｒ１５８９Ｑ
、Ｙ１６２４Ｈ、Ａ１６０８Ｔ、Ｌ１５１８Ｍ、Ａ１５３７Ｔ、Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４
７Ｖ、Ｒ１５２６Ｃ（ＨＤ）およびＧ１４８７Ｄ、Ａ１４７６Ｔ（ＬＮＲ−Ｃ）、または
これらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む。一実施形態では、コンフォメ
ーショナルエピトープは、アミノ酸残基１４２７〜１４２９（ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーの
）、１４４２、１４４４〜１４４５、１４４７〜１４５０、１４５３、１４５８（ＬＮＲ
−Ｂの）、１４６１〜１４６２、１４６４（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１５０７〜１
５０８、１５１０（ＬＮＲ−ＨＤリンカーの）、１５９２、１５９４〜１５９９、１６０
２（ＨＤβ４−α３ループの）、および１６０６（ＨＤα３へリックスの）、またはこれ
らのサブセットを含む。一実施形態では、抗体またはその断片のＶＨは、以下のＮｏｔｃ
ｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ
１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ
１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ
１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、およびＨｉｓ１５９９のうちの少なくとも
１つに結合する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３受容体は、突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体
であり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインは、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異
を有する。一実施形態では、抗体またはその断片のＶＬは、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｇ
ｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、Ｓ
ｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、Ｌ
ｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、お
よびＳｅｒ１６０６のうちの少なくとも１つに結合する。一実施形態では、抗体は、モノ
クローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および合成抗体からな
る群から選択される。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに特
異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが、
Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二
量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ
酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリックス
であり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗体また
はその断片に関する。
一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ内のア
ミノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、ＮＲＲ
領域のＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内のアミノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、コンフ
ォメーショナルエピトープは、ＨＤα３−β５ループ内のアミノ酸残基をさらに含む。一
実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、ＬＮＲ−Ｂ内、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリン
カー内、およびＨＤα３−β５ループ内のアミノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、
抗体またはその断片は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させ
る。一実施形態では、突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体は、Ｓ１５８０Ｌ、Ｒ１５１０Ｈ
、Ｄ１５８７Ｎ、Ｒ１５８９Ｑ、Ｙ１６２４Ｈ、Ｌ１５１８Ｍ、Ａ１５３７Ｔ、Ｎ１５９
７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、Ｒ１５２６Ｃ（ＨＤ）、およびＡ１４７６Ｔ（ＬＮＲ−Ｃ）、また
はこれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む。一実施形態では、コンフォ
メーショナルエピトープは、アミノ酸残基：１４４０（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６３、１４
６５〜１４６８（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２、１４７４、１４８
６〜１４８７、（ＬＮＲ−Ｃの）、１５３４（ＨＤα２へリックスの）、ならびに１６１
８、１６１９、および１６２１（α３−β５ループの）、またはこれらのサブセットを含
む。一実施形態では、抗体またはその断片のＶＨは、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１
４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１
４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、およびＧｌｙ１４８７のうちの少なくとも１
つに結合する。一実施形態では、抗体またはその断片のＶＬは、以下のＮｏｔｃｈ３残基
：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９
、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４７２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９
、およびＡｓｐ１６２１のうちの少なくとも１つに結合する。一実施形態では、抗体は、
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および合成抗体か
らなる群から選択される。一実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎｏｔｃｈ３リガン
ド駆動レポーター遺伝子アッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、Ｎｏｔｃｈ３標的遺伝子ｍＲＮＡ
の定量化、ＴＡＬＬ−１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖、およびＮｏｔｃｈ３細胞
内ドメイン（ＩＣＤ）のガンマセクレターゼ切断形態の検出からなる群から選択されるア
ッセイにより評価される、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻害する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体に対する単離抗体またはその断片であっ
て、解離速度定数（ＫＤ）を、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−
１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１とし、抗体また
はその断片が、Ｎｏｔｃｈ３リガンド駆動レポーター遺伝子アッセイ、ＦＡＣＳアッセイ
、Ｎｏｔｃｈ３標的遺伝子ｍＲＮＡの定量化、ＴＡＬＬ−１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにお
ける増殖、およびＮｏｔｃｈ３細胞内ドメイン（ＩＣＤ）のガンマセクレターゼ切断形態
の検出からなる群から選択されるアッセイにより評価される、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達
を阻害する、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載された抗体と同じコンフォメーシ
ョナルエピトープに結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載され
た抗体と交差競合する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体に対する単離抗体またはその断片であっ
て、配列番号９、配列番号２９、配列番号４９、配列番号６９、配列番号８９、配列番号
１０９、配列番号１２９、配列番号１４９、配列番号１６９、配列番号１８９、配列番号
２０９、および配列番号２２９；からなる群から選択されるＶＨ、ならびに配列番号１９
、配列番号３９、配列番号５９、配列番号７９、配列番号９９、配列番号１１９、配列番
号１３９、配列番号１５９、配列番号１７９、配列番号１９９、配列番号２１９、および
配列番号２３９からなる群から選択されるＶＬ、またはこれらに対する同一性が９７〜９
９％であるアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその断片に関する。
別の態様では、本開示は、配列番号９を有する可変重鎖および配列番号１９を有する可
変軽鎖配列、配列番号２９を有する可変重鎖配列および配列番号３９を有する可変軽鎖配
列、配列番号４９を有する可変重鎖配列および配列番号５９を有する可変軽鎖配列、配列
番号６９を有する可変重鎖配列および配列番号７９を有する可変軽鎖配列、配列番号８９
を有する可変重鎖配列および配列番号９９を有する可変軽鎖配列、配列番号１０９を有す
る可変重鎖配列および配列番号１１９を有する可変軽鎖配列、配列番号１２９を有する可
変重鎖配列および配列番号１３９を有する可変軽鎖配列、配列番号１４９を有する可変重
鎖配列および配列番号１５９を有する可変軽鎖配列、配列番号１６９を有する可変重鎖配
列および配列番号１７９を有する可変軽鎖配列、配列番号１８９を有する可変重鎖配列お
よび配列番号１９９を有する可変軽鎖配列、配列番号２０９を有する可変重鎖配列および
配列番号２１９を有する可変軽鎖配列、ならびに配列番号２２９を有する可変重鎖配列お
よび配列番号２３９を有する可変軽鎖配列からなる群から選択される、可変重鎖配列およ
び可変軽鎖配列を含む、単鎖抗体またはその断片に関する。
別の態様では、本開示は、配列番号９を有する可変重鎖および配列番号１９を有する可
変軽鎖配列、配列番号２９を有する可変重鎖配列および配列番号３９を有する可変軽鎖配
列、配列番号４９を有する可変重鎖配列および配列番号５９を有する可変軽鎖配列、配列
番号６９を有する可変重鎖配列および配列番号７９を有する可変軽鎖配列、配列番号８９
を有する可変重鎖配列および配列番号９９を有する可変軽鎖配列、配列番号１０９を有す
る可変重鎖配列および配列番号１１９を有する可変軽鎖配列、配列番号１２９を有する可
変重鎖配列および配列番号１３９を有する可変軽鎖配列、配列番号１４９を有する可変重
鎖配列および配列番号１５９を有する可変軽鎖配列、配列番号１６９を有する可変重鎖配
列および配列番号１７９を有する可変軽鎖配列、配列番号１８９を有する可変重鎖配列お
よび配列番号１９９を有する可変軽鎖配列、配列番号２０９を有する可変重鎖配列および
配列番号２１９を有する可変軽鎖配列、ならびに配列番号２２９を有する可変重鎖配列お
よび配列番号２３９を有する可変軽鎖配列からなる群から選択される、可変重鎖配列およ
び可変軽鎖配列を含む、単離抗体またはその断片に関する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体に対する単離抗体またはその断片であっ
て、配列番号５、配列番号２５、配列番号４５、配列番号６５、配列番号８５、配列番号
１０５、配列番号１２５、配列番号１４５、配列番号１６５、配列番号１８５、配列番号
２０５、および配列番号２２５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む、単離抗体
またはその断片に関する。
別の態様では、本開示は、配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４の重鎖可変
領域ＣＤＲ２、配列番号５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ
１、配列番号１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３
、配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番
号２５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４の
軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４３の重
鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号４５の重鎖可変領
域ＣＤＲ３、配列番号５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号５５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ１
、配列番号６４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号６５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番
号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号
７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号８３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８４の重
鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号８５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号９３の軽鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号９４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号９５の軽鎖可変領域
ＣＤＲ３、配列番号１０３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０４の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ２、配列番号１０５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１
、配列番号１１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ
３、配列番号１２３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、
配列番号１２５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列
番号１３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配
列番号１４３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番
号１４５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１
５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１５５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号
１６３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１６
５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７４の
軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１８３
の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８５の重
鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９４の軽鎖可
変領域ＣＤＲ２、および配列番号１９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２０３の重鎖
可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２０５の重鎖可変
領域ＣＤＲ３、配列番号２１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１４の軽鎖可変領域
ＣＤＲ２、および配列番号２１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２２３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号２２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２２５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号２３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号２３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３からなる群から選択される、重鎖可変
領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、単離抗体または
その断片に関する。
別の態様では、本開示は、抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む、
医薬組成物に関する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路により媒介されるがんであっ
て、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝がん、胃がん、膵臓が
ん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リ
ンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ユーイング肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性
白血病、リンパ腫、骨肉腫、有棘細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頸部がん
、膀胱がん、食道がん、神経膠芽腫、軟組織明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎
がん、および黒色腫からなる群から選択されるがんの処置における使用のための、抗体ま
たはその断片に関する。
一実施形態では、抗体またはその断片を、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路により媒介さ
れるがんであって、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（ＴＡＬＬ：T-cell acute lymphob
lastic leukemia）であるがんの処置のために使用する。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路により媒介されるがんであっ
て、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝がん、胃がん、膵臓が
ん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リ
ンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ユーイング肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性
白血病、リンパ腫、骨肉腫、有棘細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頸部がん
、膀胱がん、食道がん、神経膠芽腫、軟組織明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎
がん、および黒色腫からなる群から選択されるがんを処置するための医薬としての使用の
ための抗体またはその断片に関する。一実施形態では、抗体またはその断片を、Ｎｏｔｃ
ｈ３シグナル伝達経路により媒介されるがんであって、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病
（ＴＡＬＬ）であるがんを処置するための医薬として使用する。
Ｎｏｔｃｈ３のドメイン構造を示す図である。 各領域のアミノ酸位置を有するＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲのドメイン構造を示す図である。 ヒト、カニクイザルおよびマウス組換えタンパク質に結合するＮｏｔｃｈ３抗体のＥＬＩＳＡデータを示す図である。 ヒト、カニクイザルおよびマウス組換えタンパク質に結合するＮｏｔｃｈ３抗体のＥＬＩＳＡデータを示す図である。 ヒト、カニクイザルおよびマウス組換えタンパク質に結合するＮｏｔｃｈ３抗体のＥＬＩＳＡデータを示す図である。 ヒト、カニクイザルおよびマウス組換えタンパク質に結合するＮｏｔｃｈ３抗体のＢｉａｃｏｒｅデータを示す図である。 種々のＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 種々のＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 種々のＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 ＨＣＣ１１４３ Ｎｏｔｃｈ増幅細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 ＨＣＣ１１４３ Ｎｏｔｃｈ増幅細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 ＨＣＣ１１４３ Ｎｏｔｃｈ増幅細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 ＨＣＣ１１４３ Ｎｏｔｃｈ増幅細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 ＨＣＣ１１４３ Ｎｏｔｃｈ増幅細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 ＨＣＣ１１４３ Ｎｏｔｃｈ増幅細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３レポーター遺伝子アッセイにおけるＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ１およびＤｅｌｔａ１）の存在下でのＮｏｔｃｈ３抗体の阻害パーセントおよびＩＣ５０値を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３レポーター遺伝子アッセイにおけるＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ１およびＤｅｌｔａ１）の存在下でのＮｏｔｃｈ３抗体の阻害パーセントおよびＩＣ５０値を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３レポーター遺伝子アッセイにおけるＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ１およびＤｅｌｔａ１）の存在下でのＮｏｔｃｈ３抗体の阻害パーセントおよびＩＣ５０値を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３レポーター遺伝子アッセイにおけるＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ１およびＤｅｌｔａ１）の存在下でのＮｏｔｃｈ３抗体の阻害パーセントおよびＩＣ５０値を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３標的遺伝子ｍＲＮＡ定量を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ（上側）およびＰＥＳＴ（下側）突然変異を示す図である。 ＰＥＳＴ突然変異を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ突然変異の特性を示すグラフである。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ突然変異の特性を示すグラフである。 Ｎｏｔｃｈ３抗体の存在下でのＴＡＬＬ−１ ｍＲＮＡおよび増殖の阻害を示すグラフである。 Ｎｏｔｃｈ３抗体の存在下でのＴＡＬＬ−１ ｍＲＮＡおよび増殖の阻害を示すグラフである。 ＴＡＬＬ−１細胞のみにおいてネオエピトープＩＣＤ３抗体の存在を示すウェスタンブロットの写真である。 ＴＡＬＬ−１細胞のみにおいてネオエピトープＩＣＤ３抗体の存在を示すウェスタンブロットの写真である。 ＴＡＬＬ−１細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体処置により減少したＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を示すウェスタンブロットの写真である。 ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体処置により減少したＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を示すウェスタンブロットの写真である。 Ｉｓｈｉｋａｗａｈｅｒａｋｌｉｏ０２＿ＥＲ細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体処置による減少したＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を示すウェスタンブロットの写真である。 ＴＥ−１１細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体処置による減少したＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を示すウェスタンブロットの写真である。 Ａ５４９細胞におけるＮｏｔｃｈ３抗体処置による減少したＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を示すウェスタンブロットの写真である。 Ｎｏｔｃｈ３増幅細胞株、ＨＣＣ１１４３におけるＮｏｔｃｈ３抗体処置による減少したＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を示すウェスタンブロットの写真である。 ＴＡＬＬ−１異種移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＤ研究のウェスタンブロットの写真である。 ＴＡＬＬ−１異種移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＤ研究のＩＨＣの写真である。 ＭＤＡ−ＭＢ４６８異種移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＤ研究のウェスタンブロットの写真である。 ＭＤＡ−ＭＢ４６８異種移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＤ研究のウェスタンブロットの写真である。 （図１７Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ４６８異種移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＤ研究のウェスタンブロットの写真である。 ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＤ ＨＬＵＸ１８２３モデル異種移植片におけるウェスタンブロットの写真である。 ｉｎ ｖｉｖｏ有効性におけるＴＡＬＬ−１を示すマウスの写真である。 ｉｎ ｖｉｖｏ有効性におけるＴＡＬＬ−１を示すマウスの写真である。 ＮＲＲ−Ａ、ＮＲＲ−Ｂ、ＮＲＲ−ＣおよびＮＲＲ−Ｄと指定した、Ｎｏｔｃｈ３のＮＲＲドメインにおける４つの異なるエピトープを識別するＮｏｔｃｈ３抗体のエピトープビニングを示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ Ｘ線結晶構造の表面およびリボンの図；１）タンパク質のＮおよびＣ末端；２）３つのＬＮＲリピートおよび配位Ｃａ２＋イオン；３）Ｌ１４１９、自己阻害栓；４）Ｓ１およびＳ２部位；５）ＨＤドメイン内の二次構造；ならびに６）Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２とは顕著に異なる立体構造を有するＮｏｔｃｈ３における２つの領域（ＬＮＲ−Ｂ／ＣリンカーならびにＬＮＲ−Ｃの前半およびＨＤドメインにおけるβ４−α３ループ）が標識される。 ヒトＮｏｔｃｈ１、２および３の配列アラインメントを示す図である。破線のボックスにおいて、Ｎｏｔｃｈ１またはＮｏｔｃｈ２と顕著に異なる構造を有するＮｏｔｃｈ３の領域を示す。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲへの２０３５０Ｆａｂ結合の全体構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲについての詳細な相互作用（右パネル）を有する、３．２Åにおいて決定したＮｏｔｃｈ３／２０３５０Ｆａｂ複合体のＸ線結晶構造を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲへの２０３５８Ｆａｂ結合の全体構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲについての詳細な相互作用（右パネル）を有する、２．１Åにおいて決定したＮｏｔｃｈ３／２０３５８Ｆａｂ複合体のＸ線結晶構造を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲにおける２０３５０および２０３５８エピトープの比較を示す図である。２つの抗体がＮｏｔｃｈ３ ＮＲにおける異なるエピトープに結合することを示すＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲに重ね合わせたＮｏｔｃｈ３／２０３５０Ｆａｂ複合体およびＮｏｔｃｈ３／２０３５８Ｆａｂ複合体のＸ線結晶構造を示す図である。 ２０３５０、２０３５８、およびＡ４のコンフォメーショナルエピトープにおけるアミノ酸残基を示す図である。 未結合状態におけるＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの平均重水素吸収を示すＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ＋Ｃａ２＋のＨＤｘ−ＭＳエピトープマッピングを示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲに結合する２０３５０、２０３５８抗体と共に絶対保護量を示すＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ＋Ｃａ２＋の差異プロットを示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲに結合する２０３５０および２０３５８における保護される領域（黒色）を示す構造を示す図である。 ＨＤｘ−ＭＳにおける検出された保護領域に対する埋もれたＸ線アミノ酸残基の比較を示す図である。 ２００３７および２０３５８についてのＣａ２＋を有しないＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲについての相違プロットならびにＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ構造上にマッピングした保護領域（黒色）を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ表面上にマッピングした抗体２０３７７、２０３５０、２０３５８およびＡ４のコンフォメーショナルエピトープを示す図である。 抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８およびＡ４により覆われていないままのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ上の表面を示す図である。 抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８およびＡ４により覆われていないままのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの表面上の潜在的コンフォメーショナルエピトープを示す図である。
詳細な説明
定義
本発明がよりたやすく理解されうるために、ある種の用語についてまず定義する。詳細
な説明を通して、さらなる定義も提示する。
本明細書で使用される「シグナル伝達」または「シグナル伝達活性」という語句は、細
胞の１つの部分から、細胞の別の部分への、シグナルの伝送を結果としてもたらす、増殖
因子の受容体への結合などのタンパク質間相互作用により一般に誘発される、生化学的因
果関係を指す。Ｎｏｔｃｈ３では、リガンドの結合は、ＮＲＲドメイン内のＳ２部位にお
ける、ＡＤＡＭプロテアーゼによる、Ｎｏｔｃｈ３の切断を結果としてもたらす。この初
期の切断により、Ｓ３部位における、γ−セクレターゼ複合体による、後続のＮｏｔｃｈ
受容体の切断のための基質が作り出される。γ−セクレターゼによる切断の後、Ｎｏｔｃ
ｈの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、核へと移行し、そこで、ＣＳＬ転写因子（哺乳動物で
は、ＣＢＦ−１／ＲＢＰ−Ｊκ）および共活性化因子であるｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ（ＭＡ
ＭＬ１）と相互作用して、標的遺伝子の転写を活性化させる。
本明細書で使用される「Ｎｏｔｃｈ３」または「Ｎｏｔｃｈ３受容体」という用語は、
哺乳動物ヒトＮｏｔｃｈ３タンパク質を指す。Ｎｏｔｃｈ３のドメイン構造を、図１に描
示するが、これにより、リガンド結合性ドメイン（ＬＢＤ）、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat
）とＮ末端ヘテロ二量体化ドメインおよびＣ末端ヘテロ二量体化ドメイン（それぞれ、Ｈ
Ｄ−ＮおよびＨＤ−Ｃ）とを含むＮＲＲ（negative regulatory region）のほか、アンキ
リンドメイン（ＡＮＫ）およびＰＥＳＴドメインが示される。図２は、Ｎｏｔｃｈ３ Ｎ
ＲＲの全体構造および対応するアミノ酸残基を示す：ＬＮＲ−Ａは、アミノ酸残基Ｅ１３
８３〜Ｇ１４２２を有し、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーは、アミノ酸残基Ａｓｐ１４２３〜Ｌ
ｅｕ１４３１を有し、ＬＮＲ−Ｂは、アミノ酸残基Ｇｌｎ１４３２〜Ａｌａ１４６０を有
し、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーは、アミノ酸残基Ｇｌｙ１４６１〜Ａｓｎ１４６８を有し、
ＬＮＲ−Ｃは、アミノ酸残基Ｐｒｏ１４６９〜Ｓｅｒ１５０２を有し、ＬＮＲ−ＨＤリン
カーは、アミノ酸残基Ｇｌｕ１５０３〜Ａｒｇ１５１０を有し、ＨＤ−Ｎは、アミノ酸残
基Ｇｌｙ１５１１〜Ａｒｇ１５７１を有し、ＨＤ−Ｃは、アミノ酸残基１５７２〜Ｓｅｒ
１６４０を有する。
ヒトＮｏｔｃｈ３を、下記の配列番号１として表す。

カニクイザルＮｏｔｃｈ３を、下記の配列番号２として表す。


本明細書で使用される「Ｎｏｔｃｈリガンド」という用語は、Ｎｏｔｃｈ３受容体に結
合し、これを活性化させるポリペプチドを指す。Ｎｏｔｃｈ３リガンドの例は、Ｄｅｌｔ
ａ様リガンド（例えば、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、およびＤＬＬ４）およびＪａｇｇｅｄリガ
ンド（例えば、Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２）を含むがこれらに限定されない。
Ｎｏｔｃｈ３の文脈で使用される「安定化」または「安定化させた」という用語は、Ｎ
ｏｔｃｈ３受容体の自己阻害コンフォメーションまたは自己阻害状態を直接維持する（こ
れをロックする、これをつなぎとめる、これを保持する、これに優先的に結合する、これ
を選好する）抗体またはその断片を指す。実施例で記載されるアッセイ、例えば、本明細
書で開示されるＩＣＤ３抗体を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを使用して、安
定化させたＮｏｔｃｈ３受容体のシグナル伝達を測定することができる。
本明細書で使用される「リガンド依存性シグナル伝達」という用語は、リガンド（例え
ば、ＤｅｌｔａリガンドまたはＪａｇｇｅｄリガンド）を介するＮｏｔｃｈ３の活性化を
指す。リガンドの結合は、Ｎｏｔｃｈ３のタンパク質分解性切断イベントを結果としても
たらし、これにより、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達がもたらされる。抗体またはその断片は
、実施例で記載されるアッセイを使用して測定される通り、抗体またはその断片へと曝露
された細胞のＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を、非処置（対照）細胞と比べて阻害しうる。Ｎ
ｏｔｃｈ３を発現させる細胞は、自然発生の細胞系の場合もあり、Ｎｏｔｃｈ３タンパク
質をコードする核酸を、宿主細胞へと導入することを介して、組換えにより作製される場
合もある。
本明細書で使用される「リガンド非依存性シグナル伝達」という用語は、細胞内のＮｏ
ｔｃｈ３活性（例えば、ＮＲＲドメイン内のＳ２で切断され、その後、リガンドの結合に
対する要請の非存在下において、Ｓ３部位で切断されるＮｏｔｃｈ３）を指す。例えば、
リガンド非依存性Ｎｏｔｃｈ３の活性化は、Ｎｏｔｃｈ３の過剰発現／増幅またはＮｏｔ
ｃｈ３内の突然変異の活性化の結果でありうる。抗体またはその断片は、実施例で記載さ
れるアッセイを使用して測定される通り、抗体またはその断片へと曝露された細胞のＮｏ
ｔｃｈ３シグナル伝達を、突然変異させていない（対照）細胞と比べて阻害しうる。Ｎｏ
ｔｃｈ３を過剰発現させる細胞は、自然発生の細胞系（例えば、ＨＣＣ１１４３、ＴＡＬ
Ｌ−１）の場合もあり、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質をコードする核酸を、宿主細胞へと導入
することを介して、組換えにより作製される場合もある。別の例では、細胞は、リガンド
依存性Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達およびリガンド非依存性Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の両
方を示しうる。
本明細書で使用される「〜を遮断する」という用語は、相互作用または過程を停止させ
るかまたは防止すること、例えば、リガンド依存性シグナル伝達またはリガンド非依存性
シグナル伝達を停止させることを指す。
本明細書で使用される「〜を認識する」という用語は、そのコンフォメーショナルエピ
トープを見出し、これと相互作用する（例えば、これと結合する）、抗体またはその断片
を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、Ｎｏｔｃｈ３エピトープと相互作用し（
例えば、結合、立体障害、空間的分布の安定化により）、シグナル伝達を阻害する、全抗
体を指す。自然発生の「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互接続された、少なくと
も２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖
可変領域（本明細書では、ＶＨと略記される）と、重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域
は、３つのドメインである、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変
領域（本明細書では、ＶＬと略記される）と、軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、
１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（Ｆ
Ｒ：framework region）と称する、より保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ：complementarity determining region）と称する、超可変領域へとさらに細分する
ことができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序：
ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された、３つの
ＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結
合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の多様な細胞（
例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組
織または因子への結合を媒介しうる。「抗体」という用語は、例えば、モノクローナル抗
体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：single-c
hain Fv）、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片
、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を
含む）、ならびに上記のうちのいずれかのエピトープ結合性断片を含む。抗体は、任意の
アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、ク
ラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）
、またはサブクラスの抗体でありうる。
軽鎖および重鎖のいずれも、構造的および機能的な相同性の領域へと分けられる。「定
常」という用語および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点では、軽（Ｖ
Ｌ）鎖部分および重（ＶＨ）鎖部分のいずれの可変ドメインも、抗原認識および抗原特異
性を決定することが察知されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖
の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体
の結合、補体の結合など、重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメイ
ンの番号付けは、それらが抗体の抗原結合性部位またはアミノ末端から遠位となるにつれ
て、大きくなる。Ｎ末端は、可変領域であり、Ｃ末端には、定常領域がある。ＣＨ３ドメ
インおよびＣＬドメインは実際、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端のそれぞれを含む。
本明細書で使用される「抗体断片」という語句は、Ｎｏｔｃｈ３エピトープと特異的に
相互作用し（例えば、結合、立体障害、空間的分布の安定化により）、シグナル伝達を阻
害する能力を保持する、抗体の１または複数の部分を指す。結合性断片の例は、ＶＬドメ
イン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆ
ａｂ断片；ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含
む二価断片である、Ｆ（ａｂ）２断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄ断片；
抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；ＶＨドメインからな
る、ｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；ならびに単離相補性決定
領域（ＣＤＲ）を含むがこれらに限定されない。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインである、ＶＬとＶＨとは、個別の遺伝子によりコー
ドされるが、それらが、単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；
例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al., (1988) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）であって、その中でＶＬ領域とＶＨ
領域とが対合して、一価分子を形成する、単一のタンパク質鎖として作製されることを可
能とする、合成リンカーを介する組換え法を使用して、ＶＬとＶＨとを接合することがで
きる。このような単鎖抗体もまた、「抗体断片」という用語の中に包摂されることを意図
する。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、無傷抗体と同
じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
抗体断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディー、ミニボディー、イントラボディ
ー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓ
ｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136を
参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体断片は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆ
ｎ３：Fibronectin type III）（フィブロネクチンポリペプチドによるモノボディーにつ
いて記載する、米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）などのポリペプチドに
基づく足場へとグラフトすることもできる。
抗体断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて、抗原結合性領域の対を形成する、タ
ンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込む
ことができる（Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062；および米国特許第５
，６４１，８７０号）。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」と
いう語句は、実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝子供給源から導出
される、抗体、抗体断片、二特異性抗体などを含むポリペプチドを指す。この用語はまた
、単一の分子組成を有する抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定
のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを表示する。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という語句は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領
域のいずれもが、ヒト由来の配列から導出された、可変領域を有する抗体を含む。さらに
、抗体が、定常領域を含有する場合はまた、定常領域も、このようなヒト配列、例えば、
ヒト生殖細胞系列配列、もしくはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させた変化形、または
例えば、Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86において記載されている通り、
ヒトフレームワーク配列の解析から導出される、コンセンサスのフレームワーク配列を含
有する抗体から導出される。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および
位置は、周知の番号付けスキーム、例えば、Ｋａｂａｔによる番号付けスキーム、Ｃｈｏ
ｔｈｉａによる番号付けスキーム、またはＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの組合せ（例え
ば、Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health a
nd Human Services (1991), eds. Kabat et al.；Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio
. 273:927-948；Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Inter
est, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human
Services；Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia et al., (198
9) Nature 342:877-883；およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-94
8を参照されたい）を使用して、定義することができる。
本明細書で開示されるヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例え
ば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発に
より導入される突然変異、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入され
る突然変異、あるいは安定性または製造を促進する保存的置換）を含みうる。
本明細書で使用される「ヒトモノクローナル抗体」という語句は、フレームワーク領域
およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト配列から導出された可変領域を有する、単一の結合
特異性を表示する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞
へと融合させた、ヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有す
る、トランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られた
Ｂ細胞を含む、ハイブリドーマにより作製される。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という語句は、組換え手段により調製された
か、発現させたか、創出されたか、または単離された全てのヒト抗体であって、ヒト免疫
グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックであるかもしくはトランスクロモソーマル
である動物（例えば、マウス）またはこれから調製されたハイブリドーマから単離された
抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクト
ーマから単離された抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離され
た抗体などのヒト抗体と、ヒト免疫グロブリン遺伝子、ヒト免疫グロブリン配列の全部ま
たは一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の任意の手段により調製された
か、発現させたか、創出されたか、または単離された抗体とを含む。このような組換えヒ
ト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン
配列から導出された可変領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、このような組換
えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対して
トランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変
異誘発）にかけることができるので、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配
列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列から導出され、これらと類縁ではある
が、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内に天然では存在しえない配
列である。
２つの実体の間の特異的結合とは、平衡定数（ＫＡ）（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を、少なく
とも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも
５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも
１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×
１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０
８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０
９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０
１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５
×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なく
とも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、また
は少なくとも５×１０１５Ｍ−１とする結合を意味する。
抗体（例えば、Ｎｏｔｃｈ３結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」
という語句は、タンパク質および他の生物学的物質の異種集団内の、コグネイト抗原（例
えば、ヒトＮｏｔｃｈ３）の存在を決定する、結合反応を指す。上記で言及した平衡定数
（ＫＡ）に加え、本明細書で開示されるＮｏｔｃｈ３結合性抗体はまた、解離速度定数（
ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ
未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１
０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ
未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５
×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５
×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５
×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、もしくは１０−１５Ｍ
未満とするか、またはこれを下回り、Ｎｏｔｃｈ３に、非特異的抗原（例えば、ＨＳＡ）
への結合についてのそのアフィニティーの、少なくとも２倍のアフィニティーで結合する
ことも典型的である。
一実施形態では、抗体またはその断片は、本明細書で記載されるか、または当業者に公
知の方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ）（Ｂｉａ
ｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用
して評価される通り、解離定数（Ｋｄ）を、３０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、２０
００ｐＭ未満、１５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満
、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、
１０ｐＭ未満、１ｐＭ未満とする。本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ
」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すのに対し、本明細書で使
用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離
速度を指す。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、Ｋｄの、Ｋａに対する比（す
なわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指し、モル濃度（Ｍ）として表される。抗
体についてのＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することがで
きる。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴の使用を介するか、また
はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど、バイオセンサーシステムの使用を介する。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における、
抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変
領域は、弱い非共有結合的な力を介して、多数の部位において、抗原と相互作用するので
、相互作用が多いほど、アフィニティーも大きい。
本明細書で使用される「アビディティー」という用語は、抗体−抗原複合体の全体的安
定性または強度についての有用な尺度を指す。アビディティーは、３つの主要な因子：抗
体のエピトープに対するアフィニティー、抗原および抗体を合わせた価数、ならびに相互
作用する部分の構造的配置により統御されている。最終的に、これらの因子は、抗体の特
異性、すなわち、特定の抗体が、正確な抗原エピトープに結合する可能性を規定する。
本明細書で使用される「価数」という用語は、ポリペプチド内の、潜在的な標的結合性
部位の数を指す。各標的結合性部位は、標的分子上の１つの標的分子または特異的部位（
すなわち、エピトープ）に特異的に結合する。ポリペプチドが、複数の標的結合性部位を
含む場合、各標的結合性部位は、同じ分子に特異的に結合する場合もあり、異なる分子に
特異的に結合する場合もある（例えば、異なる分子、例えば、異なる抗原に結合する場合
もあり、同じ分子上の異なるエピトープに結合する場合もある）。
本明細書で使用される「アンタゴニスト抗体」という語句は、本明細書で記載されるア
ッセイ、例えば、ＩＣＤ３アッセイにより決定される通り、Ｎｏｔｃｈ３と結合し、Ｎｏ
ｔｃｈ３シグナル伝達を阻害する抗体を指す。したがって、本明細書で記載されるアッセ
イに従い決定される通り、Ｎｏｔｃｈ３の機能的特性（例えば、生化学的特性、免疫化学
的特性、細胞内特性、生理学的特性、または他の生物学的活性など）のうちの１または複
数を「阻害する」抗体は、特定の活性の、抗体の非存在下（例えば、または非関与的な特
異性を有する対照抗体が存在する場合）に認められる活性と比べた、統計学的に有意な減
殺に関することが理解されるであろう。Ｎｏｔｃｈ３活性を阻害する抗体は、測定された
パラメータの、このような統計学的に有意な減殺を、少なくとも１０％、少なくとも５０
％、８０％、または９０％でもたらし、ある種の実施形態では、本明細書で開示される抗
体は、Ｎｏｔｃｈ３の機能的活性のうちの９５％、９８％、または９９％超を阻害しうる
。
「単離抗体」という語句は、異なる抗原特異性を有する、他の抗体を実質的に含まない
抗体を指す（例えば、Ｎｏｔｃｈ３に特異的に結合する単離抗体は、Ｎｏｔｃｈ３以外の
抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、Ｎｏｔｃｈ３に特異的に結
合する単離抗体は、他の抗原との交差反応性を有する場合がある。さらに、単離抗体は、
他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンへの特異的結合または分子との他の形で
の相互作用が可能な、任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は一般に、アミ
ノ酸または炭水化物または糖側鎖など、化学的に活性の表面分子群からなり、特異的な三
次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有しうる。エピトープは、「直鎖状」エピトー
プの場合もあり、「コンフォメーショナル」エピトープの場合もある。
「直鎖状エピトープ」という用語は、タンパク質と相互作用分子（抗体またはその断片
など）との間の相互作用点であって、タンパク質の一次アミノ酸配列（連続）に沿って直
鎖状に生じる、相互作用点の全てを伴うエピトープを指す。抗原上の所望のエピトープを
決定したら、例えば、本明細書で記載される技法を使用して、そのエピトープに対する抗
体を作り出すことが可能である。代替的に、発見過程において、抗体またはその断片の作
製および特徴付けにより、所望のエピトープについての情報が解明される場合もある。次
いで、この情報から、同じエピトープへの結合について、抗体を競合的にスクリーニング
することが可能である。これを達成する手法は、交差競合研究を実行して、互いと競合的
に結合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見出すことである。それ
らの交差競合に基づき、抗体を「ビニングする」ためのハイスループット工程は、国際特
許出願第ＷＯ２００３／４８７３号において記載されている。
「コンフォメーショナルエピトープ」という用語は、非連続アミノ酸残基が、三次元形
状で一体となる、エピトープを指す。コンフォメーショナルエピトープでは、相互作用点
は、互いから少なくとも１つのアミノ酸残基隔てられたアミノ酸残基（非連続）にわたり
生じる、すなわち、接触点は、ＬＮＲ領域、ＨＤのほか、リンカー領域など、ＮＲＲの、
顕著に異なる個別の領域上で生じる。例示だけを目的として述べると、コンフォメーショ
ナルエピトープはまた、ＮＲＲの個別の顕著に異なる領域上の連続的接触、例えば、ＬＮ
Ｒ領域内の少なくとも２つのアミノ酸、ＨＤ領域内の少なくとも２つのアミノ酸、および
リンカー領域（例えば、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−Ｈ
Ｄリンカー）内の少なくとも１つのアミノ酸残基を伴う連続的接触も含みうる。一実施形
態では、コンフォメーショナルエピトープは、本明細書の実施例で記載されるコンフォメ
ーショナルエピトープである。一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、Ｌ
ＮＲ領域（ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃ）内、およびＨＤ（例えば、α３へリッ
クス）内のアミノ酸残基の間の相互作用の非連続点を含む。一実施形態では、コンフォメ
ーショナルエピトープは、ＬＮＲ領域（ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃ）内、およ
びＨＤ内、およびＬＮＲ領域（例えば、α３へリックス）とＨＤとの間の少なくとも１つ
のリンカー（例えば、ＬＮＲ−ＨＤリンカー）内のアミノ酸残基の間の相互作用の非連続
点を含む。一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、ＬＮＲ領域（ＬＮＲ−
Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃ）内、およびＨＤ（例えば、α３へリックス）内、およびＨ
Ｄ内の少なくとも１つのリンカー（例えば、β４−α３ループ）内のアミノ酸残基の間の
相互作用の非連続点を含む。一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、ＬＮ
Ｒ領域（ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃ）内、およびＨＤ（例えば、α２へリック
ス）内、およびＨＤ内の少なくとも１つのリンカー（例えば、α３−β５ループ）内のア
ミノ酸残基の間の相互作用の非連続点を含む。一実施形態では、コンフォメーショナルエ
ピトープは、Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸残基：配列番号１の１４２７〜１４２９（ＬＮＲ−
Ａ／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜１４４５、１４４７〜１４５０、１４５３、
１４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４６２、１４６４（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの
）、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ−ＨＤリンカーの）、１５９２、１５９４〜
１５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループの）、および１６０６（ＨＤα３へリックス
の）、またはこれらのサブセットにより規定される。一実施形態では、コンフォメーショ
ナルエピトープは、Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸残基：配列番号１の１４４０（ＬＮＲ−Ｂの
）、１４６３、１４６５〜１４６８（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２
、１４７４、１４８６〜１４８７（ＬＮＲ−Ｃの）、１５３４（ＨＤα２へリックスの）
、ならびに１６１８、１６１９、および１６２１（α３−β５ループの）、またはこれら
のサブセットにより規定される。一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、
Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸残基：１４８９〜１４９８（ＬＮＲ−Ｃ）、１５００〜１５０６
（ＬＮＲ−ＨＤリンカー）、１５３８〜１５６８（ＨＤ）、および１５７１〜１５９１（
ＨＤ）により規定される。当業者により察知される通り、分子の形状を創出する残基また
は側鎖により占有される空間は、エピトープがどのようであるのかを決定する一助となる
。
一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混
合物中の、標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
エピトープを含む、所与のポリペプチドの領域は、当技術分野で周知の、任意の数のエ
ピトープマッピング法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Prot
ocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Human
a Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、
多数のペプチドであって、タンパク質分子の部分に対応するペプチドを、固体支持体上で
共時的に合成し、ペプチドを支持体へとやはり接合させながら、ペプチドを抗体と反応さ
せることにより決定することができる。このような技法は、当技術分野で公知であり、例
えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 8:3998-4002；Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182；
Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715において記載されている。同様に、コ
ンフォメーショナルエピトープは、例えば、水素／重水素交換、Ｘ線結晶構造解析、およ
び二次元核磁気共鳴を介するなど、アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定すること
により、たやすく同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols, supraを参照された
い。タンパク質の抗原性領域はまた、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒ
ｏｕｐから市販されている、Ｏｍｉｇａ ｖｅｒｓｉｏｎ１．０ソフトウェアプログラム
を使用して計算された抗原性疎水性プロットなど、標準的な抗原性疎水性プロットを使用
して同定することもできる。このコンピュータプログラムでは、抗原性プロファイル決定
するために、ホップ／ウッズ法（Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3
824-3828）を援用し、疎水性プロットのために、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法（Kyte
et al., (1982) J.Mol. Biol. 157:105-132）を援用する。
本明細書で使用される「パラトープ」という用語は、エピトープへの結合を決定する、
結合性領域の一般的構造を指す。この構造は、結合性領域はエピトープに結合しうるのか
どうか、および結合性領域はどのような様式でエピトープに結合しうるのかに影響を及ぼ
す。「パラトープ」という用語は、抗体またはその断片の抗原性決定基への結合の一因と
なる、抗体またはその断片の抗原性部位を指す場合がある。パラトープはまた、抗体のイ
ディオトープ、およびエピトープに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）も指す。
一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸残基：
配列番号１の１４２７〜１４２９（ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜
１４４５、１４４７〜１４５０、１４５３、１４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４
６２、１４６４（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ
−ＨＤリンカーの）、１５９２、１５９４〜１５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループ
の）、および１６０６（ＨＤα３へリックスの）、またはこれらのサブセットにより規定
される。一実施形態では、パラトープとは、ＣＤＲ配列を含む抗体の領域である。一実施
形態では、パラトープは、表２に列挙された配列を含む。一実施形態では、パラトープは
、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４
７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６
１、Ｇｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９
５、Ｇｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、およびＨｉｓ１５９９と結合す
る、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。一実施形態では、パラトープは、Ｎｏｔｃｈ
３残基：Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１
４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１
５０７、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１
６０２、およびＳｅｒ１６０６と結合する、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸残基：
配列番号１の１４４０（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６３、１４６５〜１４６８（ＬＮＲ−Ｂ／
Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２、１４７４、１４８６〜１４８７（ＬＮＲ−Ｃの）
、１５３４（ＨＤα２へリックスの）、ならびに１６１８、１６１９、および１６２１（
α３−β５ループの）、またはこれらのサブセットにより規定される。一実施形態では、
パラトープは、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、
Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、
およびＧｌｙ１４８７と結合する、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。一実施形態で
は、パラトープは、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６５、Ｔｈｒ１４６
６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４７２、Ａｒｇ１４３
４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１と結合する、少なくとも１
つのアミノ酸残基を含む。
当業者により察知される通り、任意の抗体またはその変異体のパラトープは、本出願に
より示される様式で決定することができる。
本明細書では、「交差競合する」という用語および「交差競合すること」という用語を
、標準的な競合的結合アッセイにおいて、他の抗体または断片の、Ｎｏｔｃｈ３への結合
に干渉する、抗体またはその断片の能力を意味するように互換的に使用する。一実施形態
では、「交差競合する」という用語は、他の抗体またはその断片の、Ｎｏｔｃｈ３の少な
くとも１つのコンフォメーショナルエピトープへの結合に干渉する、抗体またはその断片
を指す。
抗体または他の結合剤が、別の抗体またはその断片の、Ｎｏｔｃｈ３への結合に干渉す
る能力または干渉することが可能な程度、したがって、本発明に従い、交差競合すると言
いうるのかどうかは、標準的な競合的結合アッセイを使用して決定することができる。１
つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を使用して、相互作用の程度を測定しう
る、Ｂｉａｃｏｒｅ技術の使用を伴う（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００測定器（Ｂｉ
ａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の使用を介する）。交差競合を測定するた
めの別のアッセイでは、ＥＬＩＳＡベースの手法を使用する。
本明細書では、「ポリペプチド」という用語および「タンパク質」という用語を、アミ
ノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用する。用語は、１または複数のアミノ酸残
基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほ
か、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。
別段に指し示されない限り、特定のポリペプチド配列はまた暗黙に、保存的に修飾された
その変異体も包摂する。
「保存的に修飾された変異体」という語句は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれに
も適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一であるか
もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または、核酸がアミノ酸配列を
コードするのでない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために
、大多数の機能的に同一な核酸は、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コド
ンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵが全て、アミノ酸であるアラニンをコー
ドする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるあらゆる位置では、コードされ
るポリペプチドを変化させずに、コドンを、記載される対応するコドンのうちのいずれか
へと変化させることができる。このような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の一種
である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸
配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸
内の各コドン（通常、メチオニンに対応する唯一のコドンであるＡＵＧ、および、通常、
トリプトファンに対応する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一
な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、
ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、化学的に類似するアミノ酸
によるアミノ酸の置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個々の置換、欠失、
または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表
が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本明細書で開示される、多型変
異体、種間相同体、および対立遺伝子に加えた変異体であり、これらを除外しない。以下
の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタ
ミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リ
シン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ
）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン
（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに
対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参
照されたい）。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配
列を含有する抗体の結合特徴に、著明に影響を及ぼしたり、これを変化させたりしないア
ミノ酸修飾を指すのに使用する。
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、産生細胞または産生生物、一般
に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属の細胞、トリコデルマ（Trichoderma）属の
細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において優先される
コドンを使用するアミノ酸配列をコードするように変化させたヌクレオチド配列を指す。
最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の、出発ヌクレオチド配
列により元来はコードされるアミノ酸配列を、完全にまたは可能な限り多く保持するよう
に操作されている。
当技術分野では、多様な種のＮｏｔｃｈ３に対する抗体の結合能を査定する標準的なア
ッセイであって、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、およびＲＩＡを含むアッセ
イが公知である。適切なアッセイについては、実施例において詳細に記載する。また、抗
体の結合反応速度（例えば、結合アフィニティー）も、Ｂｉａｃｏｒｅ解析、またはＦＡ
ＣＳ相対アフィニティー（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）など、当技術分野で公知の標準的なアッ
セイにより評価することができる。Ｎｏｔｃｈ３の機能的特性に対する抗体の効果を査定
するアッセイ（例えば、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路のモジュレーティングする受容体
結合アッセイ）についても、実施例においてさらに詳細に記載する。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「〜パーセント同一な」ま
たは「同一性パーセント」という語句は、同じである、２つ以上の配列または部分配列を
指す。下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業によるアライ
メントおよび目視を介して測定される通り、比較域または指定された領域にわたる最大の
対応について比較および配列決定されるときの、２つの配列の、指定された百分率のアミ
ノ酸残基またはヌクレオチドが同じである（すなわち、指定された領域にわたり、または
、指定されない場合、配列全体にわたり、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）場合、２つの配列
は、「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（
または１０アミノ酸）の長さである領域にわたり、またはより好ましくは１００〜５００
もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）の長
さである領域にわたり存在する。
配列比較では、１つの配列が、被験配列がそれに照らして比較される基準配列として作
用することが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準
配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズ
ムのプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用するこ
ともでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズム
により、プログラムパラメータに基づき、被験配列についての、基準配列に照らした配列
同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される「比較域」は、２０〜６００、通例では約５０〜約２００、より
通例では約１００〜約１５０からなる群から選択される、連続的な位置の数のうちのいず
れか１つによるセグメントであって、配列を、２つの配列を最適に配列決定した後におけ
る、同じ連続的な位置の数による基準配列と比較しうるセグメントへの言及を含む。当技
術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列ア
ライメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局
所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443による
相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sc
i. USA 85:2444による類似性検索法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩによる、ＧＡ
Ｐ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装、
または手作業によるアライメントおよび目視（例えば、Brent et al., (2003) Current P
rotocols in Molecular Biologyを参照されたい）を介して実行することができる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適する、アルゴリズ
ムの２つの例は、Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAlts
chul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のそれぞれにおいて記載されている、
ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を
実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公開されている。このアルゴリズムは
まず、クエリー配列内の長さＷの短いワードであって、データベース配列内の同じ長さの
ワードにより配列決定する場合、何らかの正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこ
れを満たすワードを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ：high scoring seque
nce pair）を同定することを伴う。Ｔを、近傍ワードスコア閾値（Altschul et al., sup
ra）と称する。これらの初期の近傍ワードヒットは、それらを含有する、より長いＨＳＰ
を見出す検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アライメン
トスコアを増大させうる限りにおいて、各配列に沿って、いずれの方向にも拡張させる。
累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータであるＭ（マッチする残基の対につい
てのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティ
ースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリック
スを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、その最大達成値から
量Ｘだけ降下する場合、１もしくは複数の負のスコアリング残基アライメントの累積に起
因して、累積スコアがゼロ以下となる場合、または一方の配列の末端に到達する場合、各
方向におけるワードヒットの拡張を中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであ
るＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮ
プログラム（ヌクレオチド配列のための）では、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１
、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配
列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとして、ワード長３、および期待値
（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikof
f, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい）アライメント（Ｂ）
５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムではまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（
例えば、Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参
照されたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提示される類似性の１つの尺度
は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に生じる確率についての
指標をもたらす、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照ら
して比較したときの最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満であ
り、最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は、基準配列と類似すると考えられ
る。
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、ギ
ャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用する、ＡＬＩＧＮプロ
グラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）へと組み込まれた、E. Meyers and W. Miller, (1988)
Comput. Appl. Biosci. 4:11-17によるアルゴリズムを使用して決定することもできる。
加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリック
スまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびにギャップ重みづけとして１６、１４、１２
、１０、８、６、または４、および長さ重みづけとして１、２、３、４、５、または６を
使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）
内の、ＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch（(1970) J. Mol. Bio
l. 48:444-453)）によるアルゴリズムを使用して決定することができる。
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的
に同一であることの別の指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、下記で
記載される第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反
応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的置換だけで異な
る場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一であることが典型的である
。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子またはそれらの相
補体が、下記で記載される厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つ
の核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して、
配列を増幅しうることである。
本明細書では、「核酸」という語句を、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使
用し、一本鎖形態または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチ
ドおよびこれらのポリマーを指す。用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された
骨格残基もしくは連結を含有する核酸であって、合成であり、自然発生であり、非自然発
生であり、基準核酸と類似する結合特性を有し、基準ヌクレオチドと類似する様式で代謝
される核酸を包摂する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエ
ート、ホスホルアミデート、ホスホン酸メチル、キラルホスホン酸メチル、２−Ｏ−メチ
ルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
別段に指し示されない限り、特定の核酸配列はまた暗黙に、保存的に修飾されたその変
異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列のほか、明示的に指し示される配列も
包摂する。具体的に、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１または複数の選択さ
れた（または全ての）コドンのうちの第３の位置を、混合ベースの残基および／またはデ
オキシイノシン残基で置換した配列を作り出すことにより達成することができる（Batzer
et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081；Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem.
260:2605-2608；およびRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
「作動可能に連結した」という語句は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ
）セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結した」という語句は、転写調節
配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモ
ーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内の
コード配列の転写を刺激またはモジュレートする場合、コード配列に作動可能に連結する
。一般に、転写される配列に作動可能に連結した、プロモーターの転写調節配列は、転写
される配列と物理的に連続する、すなわち、それらはシス作用型である。しかし、エンハ
ンサーなど、いくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列と、物理的
に連続するか、またはこれに近接して配置される必要がない。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物
、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など
の哺乳動物および非哺乳動物を含む。本明細書では、注記される場合を除き、「患者」ま
たは「対象」という用語は、互換的に使用される。
以下の節および小節では、本開示の多様な態様について、さらに詳細に記載する。
Ｎｏｔｃｈ３受容体
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達とは、胎児の発生および成体組織の両方における、幹細胞の維
持、細胞の分化および増殖を含む生物学的機能の多様なセットを調節する、進化において
保存的な経路である（Kopan et al., (2009) Cell 137: 216-233；Guruharsha et al., (
2012) Nat Rev Genet. 13: 654-66；およびAndersson et al., (2001) Development 138:
3593-3612）。哺乳動物では、４つのＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１〜４）が記載され
ており、これらは、保存的なドメインアーキテクチャーを有する。細胞外ドメイン（ＥＣ
Ｄ）は、図１において示される通り、一連のＥＧＦ様リピートに後続する、３つのＬＮＲ
リピートとヘテロ二量体化ドメインとを含有するＮＲＲ（negative regulatory region）
からなる。
充実性腫瘍では、腫瘍の誘発および進行におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割は、十
分には理解されていない（Ranganathan et al., (2011) Nat Rev Cancer 11:338-51）。
上皮細胞の形質転換におけるＮｏｔｃｈ受容体についての初期の証拠は、マウス乳がんウ
イルス（ＭＭＴＶ：mouse mammary tumor virus）による挿入突然変異誘発研究から得ら
れた。例えば、ＭＭＴＶにより、Ｎｏｔｃｈ４（当初はＩｎｔ３として公知であった）を
活性化させる結果として、乳がん形成がもたらされた（Gallahan et al., (1987) J Viro
l 61:218-220、Gallahan et al., (1997) Oncogene 14: 1883-1890）。２０１１年には、
エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性乳がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ１またはＮｏｔｃｈ２の再
配列が同定された（Robinson et al., (2011) Nat Med 17:1646-51）。Ｎｏｔｃｈ受容体
のこれらの再配列は、無傷のＮＲＲドメインまたはＩＣＤ様タンパク質を欠く受容体の膜
結合型形態の産生を結果としてもたらす。
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲは、全体的フォールディングが、Ｎｏｔｃｈ１（Gordan et al.,
(2009) Blood 113:4381-4390；Gordon et al., (2009) 4:e6613；Wu et al., (2010) Na
ture 464:1052-1057）およびＮｏｔｃｈ２（Gordon et al., (2007) Nat Struct Mol Bio
l 14:295-300）のフォールディングと類似している。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲは、３つのＬ
ＮＲ（Lin12/Notch repeat）、すなわち、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、およびＬＮＲ−Ｃと
、Ｓ１部位（Ｒ１５７１とＥ１５７２との間の）におけるフリン切断により、Ｎ末端部分
（ＨＤ−Ｎ）およびＣ末端部分（ＨＤ−Ｃ）へと分けられる、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ド
メインとからなる（図２を参照されたい）。
ＮＲＲドメインは、３つのタンパク質分解ステップを伴う、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化
を調節する。フリン様コンベルターゼは、Ｎｏｔｃｈ前駆体の成熟時に、ＮＲＲ内のＳ１
部位で切断して、活性化をプライミングする。ＡＤＡＭプロテアーゼは、これもまたＮＲ
Ｒ内のＳ２部位で切断して、Ｓ３部位における、ガンマセクレターゼによる膜内タンパク
質分解のための基質を創出する。次いで、Ｓ３が切断された後、Ｎｏｔｃｈの細胞内部分
が核に入って、転写を活性化させる。Ｓ２の切断は、この活性化の連鎖の鍵となるステッ
プであり、ＮＲＲドメインにより負に調節される。このいわゆる自己阻害の機構は、下記
のＮＲＲ構造により説明することができる。
理論を提示することに束縛されるわけではないが、作用機構についての１つの可能なモ
デルは、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲが典型的に、各々がＣａ２＋イオンを配位結合させる３つ
のＬＮＲが、ＨＤを包み込んで、Ｓ２部位をＡＤＡＭプロテアーゼによる接近から保護す
る、自己阻害コンフォメーションで存在するということである。ＬＮＲとＨＤとの間の相
互作用の安定性のほか、これらの領域内の相互作用の安定性も、ＮＲＲの自己阻害コンフ
ォメーションを維持するのに極めて重要である。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ内の突然変異は、
自己阻害コンフォメーションを変化させ、これにより、Ｓ２部位が、プロテアーゼによる
切断に供され、その後、Ｓ３部位が、プロテアーゼによる切断に供され、これにより、下
流のＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を活性化させるように、ＨＤドメインを露出させる。した
がって、関与性のがん（本明細書で開示される）において見出される突然変異と同様、Ｎ
ＲＲを不安定化させる突然変異であれば、Ｎｏｔｃｈ３の活性化を増強しうるであろう。
他方、ＬＮＲ−ＨＤ間相互作用を安定化させうる抗体またはそれらの断片などの試薬は、
Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を潜在的に阻害しうる。２０３５０および２０３５８などの抗
体またはそれらの断片は、Ｎｏｔｃｈ３の自己阻害コンフォメーションに結合し、自己阻
害コンフォメーションを安定化させ（これを直接維持し、保持し、ロックし）、これによ
り、Ｓ２部位のプロテアーゼによる切断への曝露と、その後における下流のＮｏｔｃｈ３
シグナル伝達を防止する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＬＮＲ領域（ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−
Ｂ、ＬＮＲ−Ｃのほか、ＬＮＲドメインの間の対応するリンカー）の、ＨＤに照らした可
動性を制限し、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲを自己阻害コンフォメーションで安定化させるよう
に、コンフォメーショナルエピトープに結合する。活性の（阻害されていない、オープン
の）コンフォメーションを形成できなければ、その結果として、シグナル伝達は活性化さ
れなくなる。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＮＲＲ内のＨＤの露出を
防止し、これにより、Ｓ２部位および／またはＳ３部位における、プロテアーゼによる切
断に供されなくするように、コンフォメーショナルエピトープに結合する。Ｓ２部位を切
断できなければ、その結果として、シグナル伝達は活性化されなくなる。
Ｎｏｔｃｈ３突然変異体
一態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３受容体内の突然変異に関する。Ｔ−ＡＬＬ患者の
うちの＞５０％において、Ｎｏｔｃｈ１内の突然変異の活性化が、受容体の２つの一般的
な領域内で同定された（Weng et al., (2004) Science 306:269-71）。突然変異の１つの
クラスは、ＮＲＲのＨＤドメインの疎水性コア内でクラスター化していることが見出され
た。ＬＮＲドメイン内ではまた、希少な突然変異も同定されている（Gordon et al., (20
09) Blood 113:4381-4390）。ＮＲＲの突然変異は、ＨＤドメインのフォールディングを
部分的または完全に解除し、Ｓ２部位を保護するポケットを変化させ、ＬＮＲとの相互作
用を破壊することにより作用する可能性が高い。この仮説は、白血病に関連する突然変異
を伴うＨＤドメインの安定性は小さいという生化学データにより裏付けられている（Male
cki et al., (2006) Mol. Cell Biol. 26:4642-4651）。
突然変異はまた、タンパク質のＣ末端におけるＰＥＳＴ（proline-glutamate-serine-t
hreonine-rich）ドメイン内でも同定された。ＩＣＤレベルは、緊密に調節されており、
ＰＥＳＴドメインのリン酸化および後続のユビキチン化は、ＩＣＤを、Ｆｂｗ７など、Ｅ
３リガーゼによる分解のためにターゲティングする。突然変異は、ＰＥＳＴドメインの欠
失を結果としてもたらし、ＩＣＤの安定性を結果として増大させ、ＩＣＤのタンパク質半
減期を結果として延長する、ナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異である。
現在、がんにおけるＮｏｔｃｈ受容体についての証拠は主に、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝
達における変化に焦点を当てている。しかし、漿液性卵巣がんについてのＴＣＧＡ解析を
含む複数の研究では、Ｎｏｔｃｈ３が、患者試料のうちの１１〜２５％において増幅され
ることが示されている（Nakayama et al., (2007) Int J Cancer 120:2613-17、Etemadmo
ghadam et al., (2009) Clin Can Res 15: 1417-27、Bell et al., (2011) Nature 474:6
09-615）。ＣＡＤＡＳＩＬ（Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcorti
cal Infarcts and Leukoencephalopathy）症候群では、Ｎｏｔｃｈ３内の突然変異が報告
されているが、これらの突然変異は一般に、天然でもミスセンスであり、Ｎｏｔｃｈ３機
能の変化および疾患の病理との連関は、明らかでない（Ayata, (2010), Stroke 41:S129-
S134を参照されたい）。多様ながん型における遺伝子突然変異についての包括的な解析が
、ＴＣＧＡおよび他の機構により実施されている。使用される標準的な技法は、エクソン
捕捉である。これらの研究の一部として、Ｎｏｔｃｈ３突然変異は、頭頸部有棘細胞癌、
卵巣がん、および肺腺癌のうちの約１％において報告されている。しかし、Ｎｏｔｃｈ３
のエクソン２５および３３に対する十分なエクソンカバレージの欠如により、当業者がＮ
ｏｔｃｈ３遺伝子内の突然変異を探索することは困難となっている。さらに、Ｎｏｔｃｈ
３遺伝子内のＧＣ含量が高いことも、当業者が突然変異を検討することを難しくしている
。加えて、有棘細胞肺がんにおいて同定された突然変異は、機能喪失突然変異であること
が示唆されている（Egloff & Grandis (2012) Clin Can Res 18:5188-519を参照されたい
）。これに対し、先行研究とは対照的に、本明細書の開示は、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達
を活性化させ、がんの発症機序に関与する、多数の突然変異（「活性化突然変異」）を示
す。
Ｎｏｔｃｈ３突然変異を同定するために、９４７例のヒトがん細胞系を特徴付け、＞１
６００の遺伝子について、実施例５で記載される、液相ＨＣ（hybrid capture）技術を使
用する、ＭＰＳ（massively parallel sequencing）により、突然変異情報を得た。加え
て、原発性腫瘍試料も、ＲＮＡｓｅｑによりシークエンシングした（Wang et al. (2009)
Nature Reviews Genetics 10:57-63）。表１において示される通り、複数の細胞系内お
よび腫瘍試料中のＮＲＲドメインおよびＰＥＳＴドメインの両方において、突然変異が同
定された。
Ｎｏｔｃｈ３の機能に干渉する活性化突然変異は、がんの発症機序に関与する。機能を
喪失させるか、機能を獲得させるか、または機能を変化させる、Ｎｏｔｃｈ３の変化の存
在は、がんの危険性を直接的に増大させるので、このような突然変異の検出は、診断法お
よび予後診断法に役立つ。次いで、同定された、このような活性化突然変異を、突然変異
Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体またはその断片で処置することができる。
異なる細胞系に由来するＮＲＲドメインに由来する２つの突然変異：（ｉ）Ｓ１５８０
Ｌ突然変異を伴うＴ細胞性急性リンパ芽球性白血病細胞系であるＴＡＬＬ−１細胞、およ
び（ｉｉ）Ｇ１４８７Ｄ突然変異を伴う乳がん（Ｘ−１００４）を、特徴付けのために選
択した。実施例は、Ｓ１５８０Ｌ突然変異またはＧ１４８７Ｄ突然変異を、Ｎｏｔｃｈ３
受容体へと導入する結果として、受容体からの基本的シグナル伝達が、野生型対照と比べ
て、約１０倍増大することを示す。この系では、ＦＡＣＳアッセイにより決定される通り
、野生型の受容体および突然変異受容体を、ほぼ同等のレベルで発現させた。このデータ
は、これらの突然変異が、これらの突然変異および他の類似する突然変異を発現させる細
胞系および腫瘍におけるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を活性化させることを示す。このＮｏ
ｔｃｈ３シグナル伝達の活性化は、Ｎｏｔｃｈ３抗体またはそれらの断片により阻害され
る。
Ｎｏｔｃｈ３突然変異体を検出するために、生体試料を調製し、突然変異Ｎｏｔｃｈ３
を含有すると考えられる被験試料の配列と、野生型Ｎｏｔｃｈ３の配列との間の差違につ
いて解析する。突然変異Ｎｏｔｃｈ３は、本明細書で記載される技法のうちのいずれかに
より同定することができる。突然変異Ｎｏｔｃｈ３をシークエンシングして、特異的突然
変異（Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を増大させる活性化突然変異）を同定することができる
。次いで、突然変異、とりわけ、タンパク質の機能を変化させる突然変異を、本発明の診
断法および予後診断法のために使用する。
さらなる解析のために、Ｎｏｔｃｈ３突然変異体のがん突然変異を、Ｎｏｔｃｈ３ Ｎ
ＲＲのＸ線結晶構造へとマップした。構造解析は、これらの突然変異のうちのいくつかが
、ドメイン内相互作用およびドメイン間相互作用を破壊し、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの自己
阻害コンフォメーションを不安定化させ、Ｎｏｔｃｈ３の活性化およびシグナル伝達を引
き起こしうることを示す。
これらの突然変異の、２０３５０エピトープおよび２０３５８エピトープ（下記で記載
される）との比較は、それらの大半がエピトープ内に存在しないことを示し、これにより
、２０３５０抗体断片および２０３５８抗体断片は、その自己阻害コンフォメーション内
の野生型Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲおよび突然変異体Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのいずれにも結合
し、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻害しうることが指し示される。
いくつかの実施形態では、突然変異を、野生型Ｎｏｔｃｈ３（配列番号１）へと導入し
て、抗体の結合に対する効果について探索することができる。アラニン走査など、公知の
技法を使用する突然変異誘発は、関与性のエピトープを機能的に規定する一助となりうる
。また、アルギニン／グルタミン酸走査プロトコールを活用する突然変異誘発も援用する
ことができる（例えば、Nanevicz et al., (1995), J. Biol. Chem. 270(37):21619-2162
5およびZupnick et al., (2006), J. Biol. Chem. 281(29):20464-20473を参照されたい
）。一般に、これらのアミノ酸は、帯電しており、バルクであり、したがって、突然変異
を導入する抗原領域内の、抗原結合性タンパク質と抗原との間の結合を破壊する潜在的可
能性を有するため、アルギニンおよびグルタミン酸で、野生型ポリペプチド内のアミノ酸
を置換する（典型的には個別に）。野生型抗原内に存在するアルギニンは、グルタミン酸
で置きかえる。様々な、このような個々の突然変異体を得、集積された結合結果を解析し
て、どの残基が結合に影響を及ぼすのかを決定することができる。各突然変異体Ｎｏｔｃ
ｈ３が、単一の突然変異を有する、一連の突然変異体Ｎｏｔｃｈ３を創出することができ
る。各突然変異体Ｎｏｔｃｈ３の、多様なＮｏｔｃｈ３抗体またはそれらの断片との結合
を、測定し、選択された抗体またはその断片の、野生型Ｎｏｔｃｈ３（配列番号１）に結
合する能力と比較することができる。
本明細書で使用される、抗体またはその断片と、突然変異体または変異体のＮｏｔｃｈ
３との間の結合の変化（例えば、低減または増大）とは、結合アフィニティーの変化（例
えば、下記の実施例で記載されるＢｉａｃｏｒｅ試験またはビーズベースのアッセイなど
、公知の方法により測定される）、ＥＣ５０の変化、および／または抗原結合性タンパク
質の全結合能の変化（例えば、低減）（例えば、抗原結合性タンパク質濃度を抗原濃度と
対比させたプロットにおけるＢｍａｘの減殺により証拠立てられる）が認められることを
意味する。結合の著名な変化は、突然変異させた残基が、抗体またはその断片への結合に
関与することを指し示す。
いくつかの実施形態では、結合の有意な低減とは、抗体またはその断片と突然変異Ｎｏ
ｔｃｈ３抗原との間の結合アフィニティー、ＥＣ５０、および／または結合能が、抗体ま
たはその断片と野生型Ｎｏｔｃｈ３（例えば、配列番号１）との間の結合と比べて、１０
％を超えて、２０％を超えて、４０％を超えて、５０％を超えて、５５％を超えて、６０
％を超えて、６５％を超えて、７０％を超えて、７５％を超えて、８０％を超えて、８５
％を超えて、９０％を超えて、または９５％を超えて低減されることを意味する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片の結合は、１カ所または複数カ所（例え
ば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所以上）の突然変異を有する突然変異
Ｎｏｔｃｈ３では、野生型Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、
著明に低減されるかまたは増大する。
変異体形態は、配列番号１において示される野生型配列に照らして言及されるが、Ｎｏ
ｔｃｈ３の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体では、アミノ酸が異なりうることが
察知されるであろう。また、Ｎｏｔｃｈ３のこのような対立遺伝子形態について、著明な
結合の変化（例えば、弱い結合または強い結合）を示す抗体またはそれらの断片も想定さ
れる。当業者は、表１に記載される突然変異のうちのいずれか１つを、表１の他の突然変
異のうちの、他の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０
、１１、または１２と組み合わせて、対象を同定するか、診断するか、またはモニタリン
グするのに使用しうる、「発現パターン」または「発現署名」をもたらしうることを察知
するであろう。
いくつかの実施形態では、発現署名は、１カ所または複数カ所の群１の突然変異、例え
ば、Ｓ１５８０Ｌ、Ｒ１５１０Ｈ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｒ１５８０Ｑ、およびＹ１６２４Ｈの
組合せを含む。いくつかの実施形態では、発現署名は、１カ所または複数カ所の群２の突
然変異、例えば、Ｇ１４８７Ｄ、Ａ１４７６Ｔ、Ａ１６０９Ｔ、Ｌ１５１８Ｍ、およびＡ
１５３７Ｔの組合せを含む。いくつかの実施形態では、発現署名は、１カ所または複数カ
所の群３の突然変異、例えば、Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、およびＲ１５２６Ｃの組合
せを含む。
いくつかの実施形態では、発現署名は、１カ所または複数カ所の群１の突然変異、例え
ば、Ｓ１５８０Ｌ、Ｒ１５１０Ｈ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｒ１５８０Ｑ、およびＹ１６２４Ｈの
組合せ；ならびに１カ所または複数カ所の群２の突然変異、例えば、Ｇ１４８７Ｄ、Ａ１
４７６Ｔ、Ａ１６０９Ｔ、Ｌ１５１８Ｍ、およびＡ１５３７Ｔの組合せを含む。いくつか
の実施形態では、発現署名は、１カ所または複数カ所の群１の突然変異、例えば、Ｓ１５
８０Ｌ、Ｒ１５１０Ｈ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｒ１５８０Ｑ、およびＹ１６２４Ｈの組合せ；な
らびに１カ所または複数カ所の群３の突然変異、例えば、Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、
およびＲ１５２６Ｃの組合せを含む。いくつかの実施形態では、発現署名は、１カ所また
は複数カ所の群２の突然変異、例えば、Ｇ１４８７Ｄ、Ａ１４７６Ｔ、Ａ１６０９Ｔ、Ｌ
１５１８Ｍ、およびＡ１５３７Ｔの組合せ；ならびに１カ所または複数カ所の群３の突然
変異、例えば、Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、およびＲ１５２６Ｃの組合せを含む。
Ｎｏｔｃｈ３の構造およびコンフォメーショナルエピトープ
一態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３内の、多数の顕著に異なるコンフォメーショナル
エピトープの同定に関する。多数の抗体のうちの１つの抗体またはその断片と複合体化し
た、Ｎｏｔｃｈ３のＮＲＲドメイン（残基１３７９〜１６４０）の三次元構造が示された
のは、初めてのことである。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０ Ｆａｂ複合体およびＮ
ｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８ Ｆａｂは、それぞれ、３．２オングストローム（Å）
および２．１Åの分解能で決定されており、これらを図２３および２４に示す。本開示は
また、ＮＲＲ内には複数のコンフォメーショナルエピトープが見られ、図２５に示す通り
、抗体断片が、互いから隔てられた、固有のコンフォメーショナルエピトープに結合する
ことも初めて示す。抗体またはそれらの断片は、Ｎｏｔｃｈ３の自己阻害状態に結合し、
Ｎｏｔｃｈ３を、この自己阻害状態で安定化させる。
本明細書の開示は、ＮＲＲには、異なるクラスのＮｏｔｃｈ３抗体またはそれらの断片
が結合する、多数の顕著に異なるコンフォメーショナルエピトープが見られることを示す
。一実施形態では、第１のクラスの抗体（例えば、２０３５０）は、ＮＲＲドメイン内の
第１のコンフォメーショナルエピトープに結合し、第２のクラスの抗体（例えば、２０３
５８）は、ＮＲＲドメイン内の第２のコンフォメーショナルエピトープに結合し、第３の
クラスの抗体は、ＮＲＲドメイン内の第３のコンフォメーショナルエピトープに結合する
。一実施形態では、ＮＲＲの第１のコンフォメーショナルエピトープと、第２のコンフォ
メーショナルエピトープと、第３のコンフォメーショナルエピトープとは、重複せず、第
１のクラスの抗体と、第２のクラスの抗体と、第３のクラスの抗体とは、ＮＲＲの顕著に
異なる領域に結合する。一実施形態では、ＮＲＲの第１のコンフォメーショナルエピトー
プと、第２のコンフォメーショナルエピトープとは、重複せず、第１のクラスの抗体と、
第２のクラスの抗体とは、ＮＲＲの顕著に異なる領域に結合する。一実施形態では、ＮＲ
Ｒの第１のコンフォメーショナルエピトープと、第３のコンフォメーショナルエピトープ
とは、重複せず、第１のクラスの抗体と、第３のクラスの抗体とは、ＮＲＲの顕著に異な
る領域に結合する。一実施形態では、ＮＲＲの第２のコンフォメーショナルエピトープと
、第３のコンフォメーショナルエピトープとは、重複せず、第２のクラスの抗体と、第３
のクラスの抗体とは、ＮＲＲの顕著に異なる領域に結合する。
一実施形態では、ＮＲＲの第１のコンフォメーショナルエピトープと、第２のコンフォ
メーショナルエピトープと、第３のコンフォメーショナルエピトープとは、少なくとも１
つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸残基で互
いと重複し、第１のクラスの抗体と、第２のクラスの抗体と、第３のクラスの抗体とは、
少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の重複
するアミノ酸残基に結合する。一実施形態では、ＮＲＲの第１のコンフォメーショナルエ
ピトープと、第２のコンフォメーショナルエピトープとは、少なくとも１つ、２つ、３つ
、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸残基で互いと重複し、第
１のクラスの抗体と、第２のクラスの抗体とは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５
つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の重複するアミノ酸残基に結合する。一実施形
態では、ＮＲＲの第１のコンフォメーショナルエピトープと、第３のコンフォメーショナ
ルエピトープとは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ
、または１０のアミノ酸残基で互いと重複し、第１のクラスの抗体と、第３のクラスの抗
体とは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１
０の重複するアミノ酸残基に結合する。一実施形態では、ＮＲＲの第２のコンフォメーシ
ョナルエピトープと、第３のコンフォメーショナルエピトープとは、少なくとも１つ、２
つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸残基で互いと重
複し、第２のクラスの抗体と、第３のクラスの抗体とは、少なくとも１つ、２つ、３つ、
４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の重複するアミノ酸残基に結合する。
ＮＲＲ内の異なるコンフォメーショナルエピトープを解析するために、実験節において
詳細に記載されている通りに、Ｘ線結晶構造解析実験および水素−重水素交換実験を実行
した。Ｎｏｔｃｈ３の結晶は、Ｎｏｔｃｈ３またはその変異体をコードするヌクレオチド
配列を、適切な宿主細胞内で発現させ、次いで、精製されたタンパク質を、関与性のＮｏ
ｔｃｈ３をターゲティングするＦａｂの存在下で結晶化させることにより調製することが
できる。
Ｎｏｔｃｈ３ポリペプチドはまた、例えば、抽出および精製の一助となるように、融合
タンパク質として作製することもできる。融合タンパク質パートナーの例は、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン（ＨＩＳ：histidine）、ヘキサヒ
スチジン（６ＨＩＳ）、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合性ドメインおよび／または転写活性化ドメ
イン）、およびベータ−ガラクトシダーゼを含む。また、融合タンパク質配列の除去を可
能とするように、融合タンパク質パートナーと、対象のタンパク質配列との間に、タンパ
ク質分解性切断部位を含むことも好都合でありうる。
発現させた後、タンパク質は、例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、および／またはゲル濾過により、精製および／または
濃縮することができる。
タンパク質は、本明細書で記載される技法を使用して、結晶化させることができる。一
般に、結晶化過程では、タンパク質溶液を含有する液滴を、結晶化緩衝液と混合し、密封
容器内で平衡化させる。平衡化は、「ハンギングドロップ」法または「シッティングドロ
ップ」法など、公知の技法により達成することができる。これらの方法では、液滴を、結
晶化緩衝液のはるかに大量のレザバーの上方で懸垂させるか、またはこの傍らに静置し、
蒸気拡散を介して平衡化に到達する。代替的に、平衡化は、他の方法によって、例えば、
油下において、半透膜を介して、または自由界面拡散によっても生じうる（例えば、Chay
en et al., (2008) Nature Methods 5, 147-153を参照されたい）。
結晶が得られたら、公知のＸ線回折法により、構造を解くことができる。多くの技法で
は、重原子誘導体化により修飾された結晶など、化学修飾された結晶を使用して、フェー
ズを近似する。実際には、結晶中を拡散し、タンパク質の表面に結合しうる、重金属原子
塩または有機金属化合物、例えば、塩化鉛、金チオリンゴ酸、チメロサール、または酢酸
ウラニルを含有する溶液中に、結晶を浸漬する。次いで、結合した重金属原子の位置を、
浸漬された結晶についてのＸ線回折解析により決定することができる。Ｘ線の単色ビーム
が、結晶の原子（散乱中心）により回折されるときに得られるパターンを、数学的式で解
いて、数学的座標をもたらすことができる。回折データを使用して、結晶の反復単位につ
いての電子密度マップを算出する。フェーズ情報を得る別の方法は、分子置換として公知
の技法を使用することである。この方法では、回転アルゴリズムおよび並進アルゴリズム
を、類縁構造から導出された検索モデルへと適用する結果として、対象のタンパク質につ
いての近似的配向性がもたらされる（Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73-82を参
照されたい）。電子密度マップを使用して、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確立
する（Blundel et al., (1976) Protein Crystallography, Academic Press）。
本開示は、Ｎｏｔｃｈ３の複数の三次元構造およびＮｏｔｃｈ３抗体のＦａｂについて
初めて記載し、ＮＲＲ内には、複数のコンフォメーショナルエピトープが認められること
を示す。Ｎｏｔｃｈ３の細胞外ＮＲＲドメインを、図２に示す。近似的なドメイン境界は
、以下の通りである：ＬＮＲ−Ａは、アミノ酸残基Ｅ１３８３〜Ｇ１４２２を有し、ＬＮ
Ｒ−Ａ／Ｂリンカーは、アミノ酸残基Ａｓｐ１４２３〜Ｌｅｕ１４３１を有し、ＬＮＲ−
Ｂは、アミノ酸残基Ｇｌｎ１４３２〜Ａｌａ１４６０を有し、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーは
、アミノ酸残基Ｇｌｙ１４６１〜Ａｓｎ１４６８を有し、ＬＮＲ−Ｃは、アミノ酸残基Ｐ
ｒｏ１４６９〜Ｓｅｒ１５０２を有し、ＬＮＲ−ＨＤリンカーは、アミノ酸残基Ｇｌｕ１
５０３〜Ａｒｇ１５１０を有し、ＨＤ−Ｎは、アミノ酸残基Ｇｌｙ１５１１〜Ａｒｇ１５
７１を有し、ＨＤ−Ｃは、アミノ酸残基１５７２〜Ｓｅｒ１６４０を有する。ヒトＮｏｔ
ｃｈ３は、受託番号：ＮＰ＿０００４２６（ヒト）を有し、下記では、配列番号１として
表される。
Ｎｏｔｃｈ３および抗体またはその断片の三次元構造は、潜在的なＮｏｔｃｈ３受容体
モジュレーターの標的結合性部位の同定を可能とする。好ましい標的結合性部位は、Ｎｏ
ｔｃｈ３の活性化に関与する部位である。一実施形態では、標的結合性部位は、Ｎｏｔｃ
ｈ３のＬＮＲドメイン内およびＨＤドメイン内に位置する。したがって、ＬＮＲまたはＨ
Ｄに結合し、好ましくはＬＮＲドメインおよびＨＤドメインの両方に結合する抗体または
その断片は、ドメインが互いから解離し、Ｓ２切断部位が露出され、その後、Ｓ３切断部
位が露出されるように、ＨＤドメインを露出させることを防止することにより、Ｎｏｔｃ
ｈ３の活性化をモジュレートしうる。したがって、これらのドメイン内のアミノ酸残基に
結合する抗体またはその断片は、Ｎｏｔｃｈ３に、活性化および下流のシグナル伝達を防
止する自己阻害コンフォメーションを維持させる。
一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸残基：
配列番号１の１４２７〜１４２９（ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜
１４４５、１４４７〜１４５０、１４５３、１４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４
６２、１４６４（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ
−ＨＤリンカーの）、１５９２、１５９４〜１５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループ
の）、および１６０６（ＨＤα３へリックスの）、またはこれらのサブセットにより規定
される。一実施形態では、パラトープとは、ＣＤＲ配列を含む抗体の領域である。一実施
形態では、パラトープは、表１に列挙された配列を含む。一実施形態では、パラトープは
、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４
７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６
１、Ｇｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９
５、Ｇｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、およびＨｉｓ１５９９と結合す
る、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。一実施形態では、パラトープは、Ｎｏｔｃｈ
３残基：Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１
４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１
５０７、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１
６０２、およびＳｅｒ１６０６と結合する、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アミノ酸残基：配列番号１の１４２
７〜１４２９（ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜１４４５、１４４７
〜１４５０、１４５３、１４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４６２、１４６４（Ｌ
ＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ−ＨＤリンカーの）
、１５９２、１５９４〜１５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループの）、および１６０
６（ＨＤα３へリックスの）、またはこれらのサブセットを含む、コンフォメーショナル
エピトープを有する、ヒトＮｏｔｃｈ３タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では
、抗体またはその断片は、アミノ酸残基：配列番号１の１４２７〜１４２９（ＬＮＲ−Ａ
／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜１４４５、１４４７〜１４５０、１４５３、１
４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４６２、１４６４（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）
、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ−ＨＤリンカーの）、１５９２、１５９４〜１
５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループの）、および１６０６（ＨＤα３へリックスの
）、もしくはこれらのサブセット内のアミノ酸またはこれらと重複するアミノ酸に結合す
る。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アミノ酸残基：配列番号１の１４
２７〜１４２９（ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜１４４５、１４４
７〜１４５０、１４５３、１４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４６２、１４６４（
ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ−ＨＤリンカーの
）、１５９２、１５９４〜１５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループの）、および１６
０６（ＨＤα３へリックスの）、またはこれらのサブセット内のアミノ酸（および／また
はこれらからなるアミノ酸配列）に結合する。
一実施形態では、コンフォメーショナルエピトープは、Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸残基：
配列番号１の１４４０（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６３、１４６５〜１４６８（ＬＮＲ−Ｂ／
Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２、１４７４、１４８６〜１４８７（ＬＮＲ−Ｃの）
、１５３４（ＨＤα２へリックスの）、ならびに１６１８、１６１９、および１６２１（
α３−β５ループの）、またはこれらのサブセットにより規定される。一実施形態では、
パラトープは、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、
Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、
およびＧｌｙ１４８７と結合する、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。一実施形態で
は、パラトープは、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６５、Ｔｈｒ１４６
６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４７２、Ａｒｇ１４３
４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１と結合する、少なくとも１
つのアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アミノ酸残基：配列番号１の１４４
０（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６３、１４６５〜１４６８（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１
４６９〜１４７２、１４７４、１４８６〜１４８７（ＬＮＲ−Ｃの）、１５３４（ＨＤα
２へリックスの）、および１６１８、１６１９、および１６２１（α３−β５ループの）
、またはこれらのサブセットを含む、コンフォメーショナルエピトープを有する、ヒトＮ
ｏｔｃｈ３タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ア
ミノ酸残基：配列番号１の１４４０（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６３、１４６５〜１４６８（
ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２、１４７４、１４８６〜１４８７（Ｌ
ＮＲ−Ｃの）、１５３４（ＨＤα２へリックスの）、ならびに１６１８、１６１９、およ
び１６２１（α３−β５ループの）、もしくはこれらのサブセット内のアミノ酸またはこ
れらと重複するアミノ酸に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、
アミノ酸残基：配列番号１の１４４０（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６３、１４６５〜１４６８
（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２、１４７４、１４８６〜１４８７（
ＬＮＲ−Ｃの）、１５３４（ＨＤα２へリックスの）、ならびに１６１８、１６１９、お
よび１６２１（α３−β５ループの）、またはこれらのサブセット内のアミノ酸（および
／またはこれらからなるアミノ酸配列）に結合する。いくつかの実施形態では、抗体また
はその断片は、ＬＮＲ領域（ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃ）の可動性を制限し、
それを自己阻害コンフォメーションで安定化させるように、コンフォメーショナルエピト
ープに結合する。活性の（阻害されていない、オープンの）コンフォメーションを形成で
きなければ、その結果として、シグナル伝達は活性化されなくなる。いくつかの実施形態
では、抗体またはその断片は、ＮＲＲ内のＨＤの露出を防止し、これにより、Ｓ２部位お
よび／またはＳ３部位における、プロテアーゼによる切断に供されなくするように、コン
フォメーショナルエピトープに結合する。ＨＤを切断できなければ、その結果として、シ
グナル伝達は活性化されなくなる。
描示される構造はまた、抗体またはその断片（例えば、２０３５０および２０３５８）
の、Ｎｏｔｃｈ３との相互作用界面に特異的な、コアのＮｏｔｃｈ３アミノ酸残基を同定
することも可能とする。２０３５０では、これらは、２０３５０のＶＨ鎖から５Å以内の
残基として定義された。コア残基は、以下：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１
４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１
４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１
５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、およびＨ
ｉｓ１５９９の通りである。ＶＬ鎖では、コア残基は、以下：Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１
４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１
４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１
５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、およびＳｅｒ１６０６の通
りである。
２０３５８では、これらの残基は、２０３５８のＶＨ鎖から５Å以内の残基として定義
された。コア残基は、以下：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ
１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、および
Ｇｌｙ１４８７の通りである。ＶＬ鎖では、コア残基は、以下：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ
１４６５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ
１４７２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１の
通りである。
図２５に示す通り、実験節は、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０複合体およびＮｏｔ
ｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８複合体の結晶構造を、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ上に重ね合わせ
ることにより決定される、２０３５０のコンフォメーショナルエピトープと、２０３５８
のコンフォメーショナルエピトープとが、重複しないことを示す。２０３５０と２０３５
８とは、重複しない、顕著に異なる個別のコンフォメーショナルエピトープに結合する。
最も近接する領域（Ｅ１４６４−Ｒ５４間における、２０３５０との水素結合、およびＲ
１４６３−Ｄ１００間における、２０３５８との塩架橋）であってもなお、完全に隔てら
れている。これは、２つの抗体が、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲに同時に結合することが可能で
あり、交差競合しないことを指し示す。この観察は、これらの抗体が、異なるビン内にあ
り、Ｎｏｔｃｈ３への結合において、互いと競合しないことを示す、ビニング実験とも符
合する。
本明細書で開示される教示を使用して、当業者は、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗原結合性
タンパク質の能力に不適切に干渉することなく、抗原結合性タンパク質のどの残基および
領域を変化させうるのかを予測することができる。
相互作用界面のアミノ酸は、Ｎｏｔｃｈ３パートナータンパク質から５Å以内に少なく
とも１つの原子を伴う、全てのアミノ酸残基として決定した。５Åは、水により媒介され
る可能な水素結合を加えた、ファンデルワールス半径内の原子を許容するカットオフ距離
として選択した。
いくつかの実施形態では、上記の残基のうちのいずれかに結合するか、これを覆うか、
または２０３５０が上記の残基のうちのいずれかと相互作用することを防止する、任意の
抗原結合性タンパク質を援用して、Ｎｏｔｃｈ３に結合させるかまたはこれを阻害するこ
とができる。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの断片は、以下のＮｏｔｃｈ３
残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４
４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ１４
６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ１５
９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、およびＨｉｓ１５９９のうちの少なくとも１つ
に結合するか、またはこれらと相互作用する。いくつかの実施形態では、抗体およびそれ
らの断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２
９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４
９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９
２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、およびＳｅｒ１６０６のうちの少なくとも１つに
結合するか、またはこれらと相互作用する。いくつかの実施形態では、抗体またはそれら
の断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５
、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８
、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４
、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、Ｈｉｓ１５９９
、Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５
、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７
、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２
、およびＳｅｒ１６０６のうちの少なくとも１つに結合するか、またはこれらと相互作用
する。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：
Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、
Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ１４６２、
Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ１５９６、
Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、Ｈｉｓ１５９９、Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、
Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、
Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、
Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、およびＳｅｒ１６０６の組合せに結
合するか、またはこれらと相互作用する。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの
断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、
Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、
Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、
Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、Ｈｉｓ１５９９、
Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、
Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、
Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、
およびＳｅｒ１６０６の全てに結合するか、またはこれらと相互作用する。
いくつかの実施形態では、上記の残基のうちのいずれかに結合するか、これを覆うか、
または２０３５８が上記の残基のうちのいずれかと相互作用することを防止する、任意の
抗原結合性タンパク質を援用して、Ｎｏｔｃｈ３に結合させるかまたはこれを阻害するこ
とができる。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの断片は、以下のＮｏｔｃｈ３
残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４
７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、およびＧｌｙ１４８７のうち
の少なくとも１つに結合するか、またはこれらと相互作用する。いくつかの実施形態では
、抗体またはそれらの断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６
５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４７
２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１のうちの
少なくとも１つに結合するか、またはこれらと相互作用する。いくつかの実施形態では、
抗体またはそれらの断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６
、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４
、Ｇｌｎ１４８６、Ｇｌｙ１４８７、Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６５、Ｔｈｒ１４６６
、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、ｇｌｕ１４７２、Ａｒｇ１４３４
、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１のうちの少なくとも１つに結
合するか、またはこれらと相互作用する。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの
断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、
Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、
Ｇｌｙ１４８７、Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、
Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４７２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、
Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１の組合せに結合するか、またはこれらと相互作用
する。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの断片は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：
Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、
Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、Ｇｌｙ１４８７、Ｓｅｒ１４４０、
Ａｒｇ１４６５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、
Ｇｌｕ１４７２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６
２１の全てに結合するか、またはこれらと相互作用する。
一実施形態では、本明細書で開示される抗体は、２０３５０と同じコンフォメーショナ
ルエピトープに結合する。一実施形態では、本明細書で開示される抗体は、２０３５８と
同じコンフォメーショナルエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、表１に列挙
した抗体のうちのいずれかが結合するコンフォメーショナルエピトープが、とりわけ、有
用である。ある種の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３のコンフォメーショナルエピトープを活
用して、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体またはそれらの断片を単離することができる。ある
種の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３のコンフォメーショナルエピトープを活用して、Ｎｏｔ
ｃｈ３に結合する抗体またはそれらの断片を作り出すことができる。ある種の実施形態で
は、Ｎｏｔｃｈ３のコンフォメーショナルエピトープを、免疫原として活用して、Ｎｏｔ
ｃｈ３のコンフォメーショナルエピトープに結合する抗体またはそれらの断片を作り出す
ことができる。ある種の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３のコンフォメーショナルエピトープ
を動物へと投与し、その後、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体を、動物から得ることができる
。
本明細書で開示され、実施例で開示される方法を使用して、２０３３７、２０３５０、
および２０３５８について同定されたコンフォメーショナルエピトープに加え、また、Ｎ
ｏｔｃｈ３ ＮＲＲ上のさらなるコンフォメーショナルエピトープも見出すことができる
。特に、ＬＮＲとＨＤとを架橋するコンフォメーショナルエピトープ、およびＳ２プラグ
（Ｌ１４１９）がエピトープの一部をなすコンフォメーショナルエピトープ。
本明細書で開示され、実施例で開示される方法を使用して、２０３３７、２０３５０、
および２０３５８について同定されたコンフォメーショナルエピトープに加え、また、Ｎ
ｏｔｃｈ３ ＮＲＲ上のさらなるコンフォメーショナルエピトープも見出すことができる
。特に、ＬＮＲとＨＤとを架橋するコンフォメーショナルエピトープ、およびＳ２プラグ
（Ｌ１４１９）がエピトープの一部をなすコンフォメーショナルエピトープ。
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲならびに複合体であるＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０および
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８についての３Ｄ構造が利用可能であれば、他のＮｏｔ
ｃｈ３抗体をより詳細に探索するフレームワークがもたらされる。いくつかのモノクロー
ナル抗体は、細胞成長を阻害し、いくつかのモノクローナル抗体は、細胞成長を刺激し、
他のモノクローナル抗体は、細胞成長に対する効果を有さないので、Ｎｏｔｃｈ３の３Ｄ
構造は、モノクローナル抗体のエピトープをマップし、それらの作用方式を推定すること
を可能とする。Ｎｏｔｃｈ３のコンフォメーショナルエピトープは、ＮＲＲのＬＮＲ領域
およびＨＤに由来する非連続アミノ酸残基を含む。Ｎｏｔｃｈ３の３Ｄ構造が利用可能で
あれば、これらの阻害剤の正確な作用機構の決定およびＮｏｔｃｈ３の機能に干渉するた
めの新たな手法のデザインが容易となるであろう。
抗体の一般的構造的側面に加え、パラトープとエピトープとの間のより特異的な相互作
用は、構造的手法により検討することができる。一実施形態では、ＣＤＲの構造は、それ
を介して、抗体が、エピトープに結合することが可能な、パラトープに寄与する。このよ
うなパラトープの形状は、多数の様式で決定することができる。ＮＭＲまたはｘ線結晶構
造解析など、従来の構造的検討法を使用することができる。これらの手法により、パラト
ープ単独の形状を検討することもでき、それがエピトープに結合しているときのパラトー
プ単独の形状を検討することもできる。
一実施形態では、パラトープとは、ＣＤＲ配列を含む抗体の領域である。一実施形態で
は、パラトープは、表１に列挙された配列を含む。一実施形態では、パラトープは、Ｎｏ
ｔｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓ
ｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇ
ｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇ
ｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、およびＨｉｓ１５９９と結合する、少
なくとも１つのアミノ酸残基を含む。一実施形態では、パラトープは、Ｎｏｔｃｈ３残基
：Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５
、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７
、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２
、およびＳｅｒ１６０６と結合する、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
一実施形態では、パラトープは、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６
、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４
、Ｇｌｎ１４８６、およびＧｌｙ１４８７と結合する、少なくとも１つのアミノ酸残基を
含む。一実施形態では、パラトープは、Ｎｏｔｃｈ３残基：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４
６５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４
７２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１と結合
する、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
代替的に、分子モデルは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作り出すこともできる。構造は、Ａｃ
ｃｅｌｒｙｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）製のＩｎｓｉｇｈｔＩＩモデリング
パッケージなど、市販のパッケージを一助とするホモロジーモデリングにより作り出すこ
とができる。略述すると、検討される抗体の配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎ
ｋなど、公知の構造についてのタンパク質データベースに照らして検索するのに使用する
ことができる。公知の構造を伴う相同なタンパク質を同定した後で、これらの相同なタン
パク質を、モデリング鋳型として使用する。可能な鋳型の各々を配列決定することができ
、したがって、鋳型間の、構造ベースの配列アライメントをもたらすことができる。次い
で、未知の構造を伴う抗体の配列を、これらの鋳型により配列決定して、未知の構造を伴
う抗体についての分子モデルを作り出すことができる。当業者により察知される通り、こ
のような構造をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作り出すための、多くの代替的な方法であって、そ
れらのうちのいずれかを使用しうる代替的な方法が存在する。例えば、Ｈａｒｄｍａｎら
に交付された米国特許第５，９５８，７０８号において記載されている工程であって、Ｑ
ＵＡＮＴＡ（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）およびＣＨＡ
ＲＭ（Brooks et al., (1983), J. Comp. Chem. 4:187）を援用する工程と類似する工程
を使用することができる（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）。
パラトープの形状は、可能なパラトープがエピトープに結合するのかどうか、および可
能なパラトープがエピトープにどのくらい強く結合するのかを決定するのに重要であるだ
けでなく、エピトープとパラトープとの間の相互作用自体、変異体抗体のデザインにおけ
る貴重な情報の供給源である。当業者により察知される通り、この相互作用は、様々な方
途により研究しうる。１つの方途は、おそらく上記で記載した通りに作り出された構造モ
デルを使用し、次いで、とりわけ、パラトープとそのエピトープとの間のコンフォメーシ
ョナル空間および配向空間についての、モンテカルロ探索を実施することが可能なドッキ
ングモジュールを有する、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
、Ｃａｌｉｆ．）などのプログラムを使用することである。結果として、エピトープは、
パラトープと、どこでどのように相互作用するのかを推定することが可能となる。一実施
形態では、エピトープの断片または変異体だけを使用して、関与性の相互作用を決定する
一助とする。一実施形態では、エピトープの全体を、パラトープとエピトープとの間の相
互作用のモデリングに使用する。
これらのモデリングされた構造を使用することにより、どの残基がエピトープとパラト
ープとの間の相互作用において最も重要であるのかを予測することが可能である。したが
って、一実施形態では、抗体の結合特徴を変化させるために、どの残基を変化させるのか
を、たやすく選択することが可能である。例えば、パラトープ内のある種の残基の側鎖が
、エピトープの結合に立体障害をもたらすことが可能であり、したがって、これらの残基
を、小型の側鎖を伴う残基へと変化させることが有益でありうることが、ドッキングモデ
ルから明らかとなりうる。これは、多くの方途により決定することができる。例えば、２
つのモデルを単に目視し、官能基および近接性に基づく相互作用を推定することができる
。代替的に、より好適なエネルギー相互作用を得るために、上記で記載した通り、エピト
ープとパラトープとの反復的な対合を実施することもできる。また、これらの相互作用を
、抗体の様々な変異体について決定して、抗体がエピトープに結合しうる、代替的な様式
を決定することもできる。また、多様なモデルを組み合わせて、抗体の構造をどのように
変化させて、所望される特定の特徴を伴う抗体を得るべきなのかを決定することもできる
。
上記で決定されたモデルは、多様な技法により調べることができる。例えば、どの変異
体をさらに検討すべきかを決定するために、相互作用エネルギーを、上記で論じられたプ
ログラムにより決定することができる。また、静電相互作用およびファンデルワールス相
互作用を使用して、エピトープと変異体パラトープとの相互作用エネルギーを決定するこ
ともできる。また、部位指向突然変異誘発を使用して、予測された抗体構造の変化が、実
際に、結合特徴の所望される変化を結果としてもたらすのかどうかを検討することもでき
る。代替的に、エピトープに変化を施して、モデルが適正であることを検証するか、また
はパラトープとエピトープとの間で生じうる一般的な結合テーマを決定することもできる
。
当業者により察知される通り、これらのモデルは、本実施形態の抗体およびそれらの変
異体を作製するのに必要な指針をもたらすが、おそらくｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を介して、
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのモデルの日常的な試験を実施することがやはり所望されうる。加え
て、当業者に明らかな通り、任意の修飾はまた、抗体の活性に対してさらなる副作用も及
ぼしうる。例えば、より強力な結合を結果としてもたらすことが予測される任意の変化は
、より強力な結合を誘導しうるが、また、抗体の活性を低減するかまたは変化させうる、
他の構造的変化も引き起こしうる。当技術分野では、これが当てはまるのかどうかの決定
が日常的であり、多くの方途により達成することができる。例えば、活性は、ＥＬＩＳＡ
試験により調べることができる。代替的に、試料は、表面プラズモン共鳴デバイスを使用
することにより調べることができる。
Ｎｏｔｃｈ３抗体
本開示は、Ｎｏｔｃｈ３の少なくとも１つのコンフォメーショナルエピトープを認識す
る抗体を提示する。本開示は、Ｎｏｔｃｈ３に対するあるクラスの抗体が、表２に開示さ
れる、Ｎｏｔｃｈ３の特定のコンフォメーションエピトープに結合するという知見に基づ
く。



















本開示は、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニク
イザルＮｏｔｃｈ３）に特異的に結合する抗体またはそれらの断片であって、抗体が、配
列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、および
２０９のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、抗体またはそれらの断片を提示する
。本開示は、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニク
イザルＮｏｔｃｈ３）に特異的に結合する抗体またはそれらの断片であって、前記抗体が
、配列番号１９、３９、５９、７９、９９、１１９、１３９、１５９、１７９、１９９、
および２１９のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、抗体またはそれらの断片を提
示する。本開示はまた、Ｎｏｔｃｈ３に特異的に結合する（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３お
よび／またはカニクイザルＮｏｔｃｈ３）抗体またはそれらの断片であって、前記抗体が
、下記の表１に列挙されたＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＤＲを
含む、抗体またはそれらの断片も提示する。特に、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（
例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニクイザルＮｏｔｃｈ３）に特異的に結合す
る抗体であって、表２に列挙されたＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１
つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のＣＤＲを含む（または代替的に、これらからなる）、
抗体を提示する。
他の抗体またはそれらの断片は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異
させているが、表２に記載される配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９
５、９６、９７、９８、および９９パーセントの同一性を有する、抗体またはそれらの断
片を含む。いくつかの実施形態では、他の抗体またはそれらの断片は、表２に記載される
配列により描示される可変領域と比較して、可変領域内の、１つ、２つ、３つ、４つ、ま
たは５つ以下のアミノ酸を突然変異させているが、実質的に同じ治療活性を保持する、突
然変異体のアミノ酸配列を含む。
これらの抗体またはそれらの断片の各々は、Ｎｏｔｃｈ３に結合しうるので、ＶＨ、Ｖ
Ｌ、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列）は、「混合し、マッチさせ」て、他のＮｏｔｃｈ３結合性抗体を創出
することができる。このような「混合し、マッチさせた」Ｎｏｔｃｈ３結合性抗体は、当
技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例節で記載される他の
アッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせると、特定
のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列は、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえられるこ
とになる。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列は、構造的に
類似する全長重鎖配列で置きかえられることになる。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由
来するＶＬ配列は、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえられることになる。同様に、特
定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列は、構造的に類似する全長軽鎖配列
で置きかえられることになる。
したがって、一態様では、本開示は、配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、
１２９、１４９、１６９、１８９、および２０９からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む、重鎖可変領域と、配列番号１９、３９、５９、７９、９９、１１９、１３９、１
５９、１７９、１９９、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽
鎖可変領域とを有する、単離モノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、Ｎｏ
ｔｃｈ３（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザル）に特異的に結合する、単離モノク
ローナル抗体またはその断片を提示する。
別の態様では、本開示は、表２に記載される、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重
鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３とを含む、Ｎｏｔｃｈ
３抗体またはこれらの組合せを提示する。抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
を、配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、
および２０３に示す。抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号４、２
４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、および２０４に示す
。抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号５、２５、４５、６５、８
５、１０５、１２５、１４５、１６５、１８５、および２０５に示す。抗体の軽鎖可変領
域のＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３、１３
３、１５３、１７３、１９３、および２１３に示す。抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のア
ミノ酸配列を、配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７
４、１９４、および２１４に示す。抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配
列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５５、１７５、１９５、およ
び２１５に示す。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Kabat et al., (1991) Sequences
of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health
and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Chothia et al., (1987) J. Mol.
Biol. 196:901-917；Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883；およびAl-Lazikan
i et al., (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948）を使用して画定する。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、重鎖可変領域の配列番号３の
ＣＤＲ１；配列番号４のＣＤＲ２；配列番号５のＣＤＲ３；軽鎖可変領域の配列番号１３
のＣＤＲ１；配列番号１４のＣＤＲ２；および配列番号１５のＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号９のＶＨと、配列番
号１９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号２３の重鎖可変領域
ＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２５の重鎖可変領域ＣＤＲ３
、配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
配列番号３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号２９のＶＨと、配列
番号３９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号４３の重鎖可変領域
ＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号４５の重鎖可変領域ＣＤＲ３
、配列番号５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
配列番号５５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号４９のＶＨと、配列
番号５９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号６３の重鎖可変領域
ＣＤＲ１、配列番号６４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号６５の重鎖可変領域ＣＤＲ３
、配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
配列番号７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号６９のＶＨと、配列
番号７９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号８３の重鎖可変領域
ＣＤＲ１、配列番号８４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号８５の重鎖可変領域ＣＤＲ３
、配列番号９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
配列番号９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号８９のＶＨと、配列
番号９９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１０３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号１０４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１０５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号１１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１０９のＶＨと、配
列番号１１９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１２３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号１２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号１３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号１３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１２９のＶＨと、配
列番号１３９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１４３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号１４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１４５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号１５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号１５５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１４９のＶＨと、配
列番号１５９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１６３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号１６４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１６５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号１７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号１７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１６９のＶＨと、配
列番号１７９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１８３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号１８４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号１９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号１９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号１８９のＶＨと、配
列番号１９９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号２０３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号２０４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２０５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号２１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号２１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号２０９のＶＨと、配
列番号２１９のＶＬとを含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号２２３の重鎖可変領
域ＣＤＲ１、配列番号２２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２２５の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ３、配列番号２３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号２３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、配列番号２２９のＶＨと、配
列番号２３９のＶＬとを含む。
一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３抗体は、アンタゴニスト抗体である。ある種の実施形態
では、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体は、表２に記載される抗体である。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを
認識する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔ
ｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化
（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸
配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択さ
れ、ＨＤドメインが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、抗体または
その断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、抗体またはその断片が、Ｎｏｔｃｈ
３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させる、単離抗体またはその断片に関す
る。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを
認識する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔ
ｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化
（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸
配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択さ
れ、ＨＤドメインが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、抗体または
その断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、抗体またはその断片が、Ｎｏｔｃｈ
３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させ、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが
、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、単離抗体またはその断片に関す
る。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを
認識する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔ
ｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化
（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸
配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択さ
れ、ＨＤドメインが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、抗体または
その断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、抗体またはその断片が、Ｎｏｔｃｈ
３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させ、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが
、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、単離抗体またはその断片に関す
る。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを
認識する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔ
ｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化
（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸
配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択さ
れ、ＨＤドメインが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、抗体または
その断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、抗体またはその断片が、Ｎｏｔｃｈ
３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させ、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが
、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有し、突然変異が、Ｓ１５８０Ｌおよび
Ｇ１４８７Ｄからなる群から選択される、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗
体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー内のアミノ酸残基をさ
らに含む、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー内のアミノ酸残基およ
びＮＲＲ領域のＬＮＲ−ＨＤリンカー内のアミノ酸残基をさらに含む、単離抗体またはそ
の断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、コンフォメーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−ＨＤリンカー
内のアミノ酸残基をさらに含む、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、コンフォメーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−ＨＤリンカー
内のアミノ酸残基およびＨＤβ４−α３ループ内のアミノ酸残基をさらに含む、単離抗体
またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、コンフォメーショナルエピトープが、ＨＤβ４−α３ループ内のアミノ酸
残基をさらにむ、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、コンフォメーショナルエピトープが、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー内、ＬＮＲ
−Ｂ／Ｃリンカー内、ＬＮＲ−ＨＤリンカー内、およびＨＤβ４−α３ループ内のアミノ
酸残基をさらに含む、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、コンフォメーショナルエピトープが、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー内、ＬＮＲ
−Ｂ／Ｃリンカー内、ＬＮＲ−ＨＤリンカー内、およびＨＤβ４−α３ループ内のアミノ
酸残基をさらに含み、抗体またはその断片が、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己
阻害状態で安定化させる、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状
態で安定化させる、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状
態で安定化させ、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の
突然変異を有する、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突
然変異を有する、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが、Ｓ１５８０Ｌ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｙ１６
２４Ｈ、Ｌ１５１８Ｍ、Ａ１５３７Ｔ、Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、Ｒ１５２６Ｃ（Ｈ
Ｄ）およびＧ１４８７Ｄ（ＬＮＲ−Ｃ）、Ｐ２０３４ｆｓ、Ｐ２０６７ｆｓ（「ｆｓ」と
は、フレームシフトを指す）、ｐ２１７７ｆｓ、Ｑ２０７５＊（「＊」とは、停止コドン
を指す）、Ｗ２１７２＊、Ｇ２１１２Ｄ、Ｌ２２１２Ｍ、Ｆ２１２１Ｌ、Ｇ２０３８Ｓ、
Ｇ２０５９Ｒ、Ｒ２０２２Ｈ、Ｙ２１２７Ｈ、Ｙ２２１１Ｃ、Ｖ２２０２Ｉ、Ｓ２０９６
Ｌ、Ｐ２０８９Ｌ、Ｐ２２０９Ｌ、Ｒ１９８１Ｃ、Ｒ２１４５Ｑ、Ｐ２１７８Ｓ、または
これらの組合せからなる群から選択される、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異
を有する、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、コンフォメーショナルエピトープが、アミノ酸残基：１４２７〜１４２９
（ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜１４４５、１４４７〜１４５０、
１４５３、１４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４６２、１４６４（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃ
リンカーの）、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ−ＨＤリンカーの）、１５９２、
１５９４〜１５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループの）、および１６０６（ＨＤα３
へリックスの）、またはこれらのサブセットを含む、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、抗体またはその断片のＶＨが、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２
、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９
、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４
、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７
、Ａｓｐ１５９８、およびＨｉｓ１５９９のうちの少なくとも１つに結合する、単離抗体
またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、ＨＤドメインが、ＨＤα３へリ
ックスであり、抗体またはその断片のＶＬが、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｇｌｎ１４２７
、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、Ｓｅｒ１４４７
、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、Ｌｅｕ１５０８
、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、およびＳｅｒ１
６０６のうちの少なくとも１つに結合する、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗
体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ内のアミノ酸残基をさらに含む、単
離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ内のアミノ酸残基をさらに含み、Ｎ
ＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内のアミノ酸残基をさらに含む、単離抗体またはその
断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内のアミノ酸残基をさ
らに含む、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内のアミノ酸残基をさ
らに含み、ＨＤα３−β５ループ内のアミノ酸残基をさらに含む、単離抗体またはその断
片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＨＤα３−β５ループ内のアミノ酸残基をさらに含む、単離
抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、コンフォ
メーショナルエピトープが、ＬＮＲ−Ｂ内、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内、およびＨＤα３
−β５ループ内のアミノ酸残基をさらに含む、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、抗体また
はその断片が、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させる、単離
抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体が、突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体であり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメイン
が、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、単離抗体またはその断片に関
する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体が、突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体であり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが、
Ｓ１５８０Ｌ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｙ１６２４Ｈ、Ｌ１５１８Ｍ、Ａ１５３７Ｔ、Ｎ１５９７
Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、Ｒ１５２６Ｃ（ＨＤ）およびＧ１４８７Ｄ、（ＬＮＲ−Ｃ）、Ｐ２０
３４ｆｓ、Ｐ２０６７ｆｓ、ｐ２１７７ｆｓ、Ｑ２０７５＊、Ｗ２１７２＊、Ｇ２１１２
Ｄ、Ｌ２２１２Ｍ、Ｆ２１２１Ｌ、Ｇ２０３８Ｓ、Ｇ２０５９Ｒ、Ｒ２０２２Ｈ、Ｙ２１
２７Ｈ、Ｙ２２１１Ｃ、Ｖ２２０２Ｉ、Ｓ２０９６Ｌ、Ｐ２０８９Ｌ、Ｐ２２０９Ｌ、Ｒ
１９８１Ｃ、Ｒ２１４５Ｑ、Ｐ２１７８Ｓ、またはこれらの組合せからなる群から選択さ
れる、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、単離抗体またはその断片に
関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体が、突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体であり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが、
少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有し、コンフォメーショナルエピトープが
、アミノ酸残基：１４４０（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６３、１４６５〜１４６８（ＬＮＲ−
Ｂ／Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２、１４７４、１４８６〜１４８７、（ＬＮＲ−
Ｃの）、１５３４（ＨＤα３へリックスの）、ならびに１６１８、１６１９、および１６
２１（α３−β５ループの）、またはこれらのサブセットを含む、単離抗体またはその断
片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体が、突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体であり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメインが、
少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有し、抗体またはその断片のＶＨが、以下
のＮｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６
９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、およびＧｌｙ
１４８７のうちの少なくとも１つに結合する、単離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体が、突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体であり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメイン
が、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有し、抗体またはその断片のＶＬが、
以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１
４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４７２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１
６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１のうちの少なくとも１つに結合する、単
離抗体またはその断片に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに
特異的に結合する単離抗体またはその断片であって、コンフォメーショナルエピトープが
、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ
二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続
アミノ酸配列を含み、ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、ＨＤドメインが、ＨＤα２へリ
ックスであり、抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断し、Ｎｏｔｃ
ｈ３受容体が、突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体であり、ＬＮＲ領域またはＨＤドメイン
が、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、単離抗体またはその断片に関
する。
抗体の可変領域または全長鎖が、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系
から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物
」であるか、またはこれ「から導出された」、重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域または
全長重鎖もしくは全長軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有す
るトランスジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化すること、または対象の抗原を伴う
ファージ上で提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングするこ
とを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはこれ「か
ら導出された」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリ
ンのアミノ酸配列に照らして比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近縁（すなわち、同一
性％が最大）である、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、そ
れ自体として同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の
産物」であるか、またはこれ「から導出された」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞
突然変異または部位指向突然変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系列の配列と比較
したアミノ酸の差違を含有しうる。しかし、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレー
ムワーク領域内で、選択されたヒト抗体は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列免疫グロ
ブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、
ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列（例えば、マウス生殖
細胞系列の配列）と比較した場合、ヒト抗体として同定する、アミノ酸残基を含有するこ
とが典型的である。ある種の場合に、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に
よりコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも６０％、７０％、８
０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは少なくとも９６％、９７％、９８％
、もしくは９９％同一でありうる。組換えヒト抗体は、ＶＨフレームワーク領域内または
ＶＬフレームワーク領域内の、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされ
るアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差違を提示することが典型的である。ある種の
場合に、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配
列との、５以下、なおまたは４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の差違を提示しうる。
本明細書で開示される抗体は、単鎖抗体、ダイアボディー、ドメイン抗体、ナノボディ
ー、およびユニボディーの誘導体でありうる。「単鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、ＶＨドメイ
ンへと連結されたＶＬドメインを含む単一のポリペプチド鎖であって、ＶＬドメインとＶ
Ｈドメインとが対合して、一価分子を形成する、ポリペプチド鎖からなる。単鎖抗体は、
当技術分野で公知の方法に従い調製することができる（例えば、Bird et al., (1988) Sc
ience 242:423-426；およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:587
9-5883を参照されたい）。「ダイアボディー」は、各鎖が、短いペプチドリンカーにより
接続される、同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変領域へと接続された、重鎖可変領域を含む
２つの鎖であって、同じ鎖上の２つの領域は互いと対合しないが、他の鎖上の相補的なド
メインとは対合して、二特異性分子を形成する２つの鎖からなる。当技術分野では、ダイ
アボディーを調製する方法が公知である（例えば、Holliger et al., (1993) Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；およびPoljak et al., (1994) Structure 2:1121-1123
を参照されたい）。ドメイン抗体（ｄＡｂ：domain antibody）とは、抗体の重鎖または
軽鎖の可変領域に対応する、抗体の小型の機能的な結合性単位である。ドメイン抗体は、
細菌細胞系内、酵母細胞系内、および哺乳動物細胞系内で良好に発現する。当技術分野で
は、ドメイン抗体およびその作製法についてのさらなる詳細が公知である（例えば、米国
特許第６，２９１，１５８号、同第６，５８２，９１５号、同第６，５９３，０８１号、
同第６，１７２，１９７号、同第６，６９６，２４５号；欧州特許第０３６８６８４号お
よび同第０６１６６４０号；ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０
４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９、およびＷＯ０３
／００２６０９を参照されたい）。ナノボディーは、抗体の重鎖から導出される。ナノボ
ディーは、単一の可変ドメインと、２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）とを含み
、元の抗体の抗原結合能を保持することが典型的である。ナノボディーは、当技術分野で
公知の方法（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号；米国特許第６，８３８，２５４
号、ＷＯ０６／０７９３７２を参照されたい）により調製することができる。ユニボディ
ーは、ＩｇＧ４抗体の１つの軽鎖と１つの重鎖とからなる。ユニボディーは、ＩｇＧ４抗
体のヒンジ領域を除去することにより作製することができる。ユニボディーおよびこれら
を調製する方法のさらなる詳細については、ＷＯ２００７／０５９７８２において見出す
ことができる。
相同な抗体
さらに別の実施形態では、本開示は、表２に記載される配列と相同なアミノ酸配列を含
む抗体またはその断片を提示し、前記抗体は、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（例えば、ヒトＮ
ｏｔｃｈ３および／またはカニクイザルＮｏｔｃｈ３）に結合し、表２に記載される抗体
の所望の機能的特性を保持する。
例えば、本開示は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、単離モノクローナル抗体（
または機能的その断片）であって、重鎖可変領域が、配列番号９、２９、４９、６９、８
９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、および２２９からなる群から選
択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％
同一なアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１９、３９、５９、７９、９９、
１１９、１３９、１５９、１７９、１９９、および２１９からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ
酸配列を含む、単離モノクローナル抗体を提示する。Ｎｏｔｃｈ３（例えば、ヒトＮｏｔ
ｃｈ３および／またはカニクイザルＮｏｔｃｈ３）に結合し、例えば、実施例で記載され
るＩＣＤ３アッセイにより測定しうる、Ｎｏｔｃｈ３のシグナル伝達活性を阻害する。ま
た、可変重鎖および可変軽鎖の親ヌクレオチド配列、ならびに哺乳動物細胞内の発現につ
いて最適化された全長重鎖および軽鎖配列も、範囲内に含まれる。他の抗体は、突然変異
させているが、上記で記載した配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５
、または９８％の同一性を有する、アミノ酸または核酸を含む。いくつかの実施形態では
、他の抗体は、突然変異体のアミノ酸配列であって、上記で記載した配列により描示され
る可変領域と比較して、可変領域内のアミノ酸の欠失、挿入、または置換により、１つ、
２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させているアミノ酸配列を含む
。
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、表２に示される配列と
、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または
９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、
１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き、同一で
ありうる。表２に記載される抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域に対する同一性が大きな（す
なわち、８０％以上である）、ＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、突然変異誘発（
例えば、部位指向突然変異誘発またはＰＣＲ媒介型突然変異誘発）の後で、本明細書で記
載される機能的アッセイを使用して、コードされる、変化させた抗体の、保持された機能
についての試験を行うことにより得ることができる。
他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、上記で
示した配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一でありうる。
本明細書で使用される、２つの配列の間の「同一性パーセント」とは、２つの配列の最
適なアライメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを
考慮に入れるときに配列により共有される、同一な位置の数の関数である（すなわち、同
一性％は、同一な位置の数／位置の総数×１００に等しい）。配列の比較および２つの配
列の間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例において記載されている、数学
的アルゴリズムを使用して達成することができる。
加えて、または代替的に、本開示のタンパク質配列はさらに、公開のデータベースに対
して検索を実施して、例えば、類縁配列を同定する「クエリー配列」としても使用するこ
とができる。例えば、このような検索は、Altschul et al., (1990) J.Mol. Biol. 215:4
03-10によるＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）を使用して実施することが
できる。
保存的修飾を伴う抗体
他の抗体またはそれらの断片は、突然変異させているが、ＣＤＲ領域内で、表２に記載
される配列により描示されるＣＤＲ領域との、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５
、または９８パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、他
の抗体またはそれらの断片は、突然変異体のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ領域内で、表２
に記載される配列により描示されるＣＤＲ領域と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、ま
たは５つ以下のアミノ酸を突然変異させているが、元の抗体のエピトープに対するそれら
の特異性をやはり維持している。
他の抗体またはそれらの断片は、突然変異させているが、フレームワーク領域内で、表
２に記載される配列により描示されるフレームワーク領域との、少なくとも６０、７０、
８０、９０、９５、または９８パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの
実施形態では、他の抗体またはそれらの断片は、突然変異体のアミノ酸配列を含み、フレ
ームワーク領域内で、表２に記載される配列により描示されるフレームワーク領域と比較
して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ以下のアミノ酸を突然変異させ
ているが、元の抗体のエピトープに対するそれらの特異性をやはり維持している。本開示
はまた、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニクイザ
ルＮｏｔｃｈ３）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコ
ードする核酸配列も提示する。
ある種の実施形態では、抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を
含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変
領域とを有し、これらのＣＤＲ配列のうちの１または複数は、本明細書で記載される抗体
に基づく指定されたアミノ酸配列、またはそれらの保存的修飾を有し、抗体は、本開示の
Ｎｏｔｃｈ３結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
したがって、本開示は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖
可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とか
らなる、単離Ｎｏｔｃｈ３モノクローナル抗体またはその断片であって、重鎖可変領域の
ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４
３、１６３、１８３、および２０３、ならびにこれらの保存的修飾からなる群から選択さ
れ；重鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号４、２４、４４、６４、８４、１
０４、１２４、１４４、１６４、１８４、および２０４、ならびにこれらの保存的修飾か
らなる群から選択され；重鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号５、２５、４
５、６５、８５、１０５、１２５、１４５、１６５、１８５、および２０５、ならびにこ
れらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配
列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３、１３３、１５３、１７３、１９３、およ
び２１３、ならびにこれらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域のＣＤＲ
２アミノ酸配列が、配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、
１７４、１９４、および２１４、ならびにこれらの保存的修飾からなる群から選択され；
軽鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１
５、１３５、１５５、１７５、１９５、および２１５、ならびにこれらの保存的修飾から
なる群から選択され；抗体またはその断片は、Ｎｏｔｃｈ３に特異的に結合し、実施例で
記載されるＮｏｔｃｈ３アッセイ（例えば、ＩＣＤ３アッセイ）により測定しうる、Ｎｏ
ｔｃｈ３のシグナル伝達経路を阻害することによりＮｏｔｃｈ３活性を阻害する、単離Ｎ
ｏｔｃｈ３モノクローナル抗体またはその断片を提示する。
同じコンフォメーショナルエピトープに結合する抗体
本開示は、表２に記載されるＮｏｔｃｈ３結合性抗体が相互作用するのと同じコンフォ
メーショナルエピトープと相互作用する（例えば、結合、立体障害、空間的分布の安定化
により）抗体を提示する。したがって、Ｎｏｔｃｈ３結合アッセイにおいて、他の抗体と
交差競合する（例えば、統計学的に有意な様式で、他の抗体の結合を競合的に阻害する）
それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。Ｎｏｔｃｈ３タンパク質
（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニクイザルＮｏｔｃｈ３）に対する本開示
の抗体の結合を阻害する被験抗体の能力は、被験抗体が、Ｎｏｔｃｈ３への結合について
、その抗体と競合しうることを裏付け、非限定的な理論に従い、このような抗体は、Ｎｏ
ｔｃｈ３タンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは類縁の（例えば、構
造的に類似するか、または空間的に近接する）コンフォメーショナルエピトープに結合す
る。ある種の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３上の同じコンフォメーショナルエピトープに結
合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、
本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。
一実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎｏｔｃｈ３のＬＮＲ領域内およびＨＤ内の
両方における、非連続アミノ酸残基を含むコンフォメーショナルエピトープに結合して、
Ｎｏｔｃｈ３を自己阻害コンフォメーションで保持し、これにより、ＨＤ内のＳ２部位の
、プロテアーゼへの曝露と、その後におけるプロテアーゼによるＳ３部位の切断とを防止
する。これらの部位における切断の欠如は、下流のＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を防止する
。
理論を提示することに束縛されるわけではないが、作用機構についての１つの可能なモ
デルは、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲが典型的に、各々がＣａ２＋イオンを配位結合させる３つ
のＬＮＲが、ＨＤを包み込んで、Ｓ２部位をＡＤＡＭプロテアーゼによる接近から保護す
る（例えば、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーに由来する保存的なＬ１４１９が、Ｓ２部位を直接
塞ぎ、Ｓ２部位を、プロテアーゼによる接近から立体的に閉鎖する）、自己阻害コンフォ
メーションで存在するということである。ＬＮＲとＨＤとの間の相互作用の安定性のほか
、これらの領域内の相互作用の安定性も、ＮＲＲの自己阻害コンフォメーションを維持す
るのに極めて重要である。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ内の突然変異は、自己阻害コンフォメー
ションを開放し、これにより、Ｓ２部位が、プロテアーゼによる切断に供され、その後、
Ｓ３部位が、プロテアーゼによる切断に供され、これにより、下流のＮｏｔｃｈ３シグナ
ル伝達を活性化させるように、ＨＤドメインを露出させる。したがって、関与性のがん（
本明細書で開示される）において見出される突然変異と同様、ＮＲＲを不安定化させる突
然変異であれば、Ｎｏｔｃｈ３の活性化を増強しうるであろう。他方、ＬＮＲ−ＨＤ間相
互作用を安定化させうる抗体などの試薬は、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を潜在的に阻害し
うる。２０３５０、および２０３５８などの抗体またはそれらの断片は、Ｎｏｔｃｈ３の
自己阻害コンフォメーションに結合し、自己阻害コンフォメーションを安定化させ（これ
を直接維持し、保持し、ロックし）、これにより、ＨＤのプロテアーゼによる切断への曝
露と、その後における下流のＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を防止する。
抗体またはそれらの断片は、Ｎｏｔｃｈ３のリガンド依存的活性化；Ｎｏｔｃｈ３のリ
ガンド非依存的活性化；ならびにＮｏｔｃｈ３のリガンド依存的活性化およびリガンド非
依存的活性化の両方を、リガンドの結合を防止することなく阻害する。各機構により顕著
に異なる腫瘍型が駆動されるのであれば、治療用抗体は、Ｎｏｔｃｈ３活性化の単一の機
構（すなわち、リガンド依存的またはリガンド非依存的）をターゲティングする抗体より
広範なスペクトルにわたる腫瘍において臨床的有用性を有するので、これは有利であると
考えられる。
結果として、既存の治療用抗体が臨床的に無効である状態を処置するのに、抗体を使用
することができる。
操作修飾抗体
本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１または複数を有する抗
体を、出発抗体から変化させた特性を有しうる修飾抗体を操作する出発材料として使用し
て、抗体をさらに調製することもできる。抗体は、可変領域（すなわち、ＶＨおよび／ま
たはＶＬ）のうちの一方または両方の中の、例えば、１もしくは複数のＣＤＲ領域内、お
よび／または１もしくは複数のフレームワーク領域内の１または複数の残基を修飾するこ
とにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を
修飾することにより操作して、例えば、抗体のエフェクター機能を変化させることもでき
る。
実施しうる可変領域操作の１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主に
６つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内および軽鎖ＣＤＲ内に位置するアミノ酸残基を介
して、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外部の
配列より、個々の抗体の間で多様である。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の
一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフ
トされた、具体的な自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築するこ
とにより、具体的な自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能で
ある（例えば、Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327；Jones et al., (1986)
Nature 321:522-525；Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-1003
3；Ｗｉｎｔｅｒによる、米国特許第５，２２５，５３９号；ならびにＱｕｅｅｎらによ
る、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７
６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
したがって、別の実施形態は、単離Ｎｏｔｃｈ３抗体またはその断片であって、配列番
号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、および２０
３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号４、２４、４
４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、および２０４からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；ならびに配列番号４、１０、２２、２
８、４０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１
３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２
２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３
１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６４、および３７０からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞれを含む、重鎖可変領域と、配列番号１３
、３３、５３、７３、９３、１１３、１３３、１５３、１７３、１９３、および２１３か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号１４、３４、５４
、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、および２１４からなる群から
選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；ならびに配列番号１５、３５、５５、７
５、９５、１１５、１３５、１５５、１７５、１９５、および２１５からなる群から選択
されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞれを有する、軽鎖可変領域とを含む、
単離Ｎｏｔｃｈ３抗体またはその断片に関する。
したがって、このような抗体は、抗体のＶＨ ＣＤＲ配列およびＶＬ ＣＤＲ配列を含
有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。このような
フレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む、公開のＤＮＡデータベー
スまたは刊行された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子お
よびヒト軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列のＤＮＡ配列は、「Ｖａｓｅ」ヒト生
殖細胞系列配列データベース（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａ
ｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいて利用可能である）のほか、それらの各々の内容が参照によ
り明示的に本明細書に組み込まれる、Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of
Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Servi
ces, NIH Publication No. 91-3242；Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-9
17；Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883；およびAl-Lazikani et al., (1997)
J. Mol. Biol. 273:927-948；Tomlinson et al., (1992) J. fol. Biol. 227:776-798；
およびCox et al., (1994) Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことができる
。
抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、選択された本開示の抗体により
使用されるフレームワーク配列、例えば、本開示のモノクローナル抗体により使用される
コンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似する配列である。Ｖ
Ｈ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ Ｃ
ＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が
由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一な配列を有するフ
レームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列の配列と比
較して、１カ所または複数カ所の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトす
ることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異さ
せて、抗体の抗原結合能を維持または増強することが有益であると見出されている（例え
ば、Ｑｕｅｅｎらによる、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号
、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
可変領域修飾の別の種類は、ＶＨ ＣＤＲ１領域内、ＶＨ ＣＤＲ２領域内、および／
もしくはＶＨ ＣＤＲ３領域内、ならびに／またはＶＬ ＣＤＲ１領域内、ＶＬ ＣＤＲ
２領域内、および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、こ
れにより、「アフィニティー成熟」として公知である通り、対象の抗体の１または複数の
結合特性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位指向突然変異誘発また
はＰＣＲにより媒介される突然変異誘発を実施して、突然変異を導入し、本明細書で記載
され、実施例において提示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッ
セイにおいて、抗体の結合に対する効果、または他の対象の機能的特性を査定することが
できる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸置
換、アミノ酸付加、またはアミノ酸欠失でありうる。さらに、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ
、３つ、４つ、または５つ以下の残基を変化させることが典型的である。
したがって、別の実施形態では、本開示は、単離Ｎｏｔｃｈ３抗体またはそれらの断片
であって、配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１
８３、および２０３を有する群から選択されるアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１領域
、または配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８
３、および２０３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ
酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列；配列番号４、２４、４４、６４、
８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、および２０４からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域、または配列番号４、２４、４４、６４、８
４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、および２０４と比較して、１、２、３、
４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミ
ノ酸配列；ならびに配列番号５、２５、４５、６５、８５、１０５、１２５、１４５、１
６５、１８５、および２０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤ
Ｒ３領域、または配列番号５、２５、４５、６５、８５、１０５、１２５、１４５、１６
５、１８５、および２０５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換
、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と
；配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３、１３３、１５３、１７３、１９３、
および２１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、また
は配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３、１３３、１５３、１７３、１９３、
および２１３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠
失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列；配列番号１４、３４、５４、７４、９
４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、および２１４からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、または配列番号１４、３４、５４、７４、９
４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、および２１４と比較して、１、２、３、
４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミ
ノ酸配列；ならびに配列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５５、
１７５、１９５、および２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ Ｃ
ＤＲ３領域、または配列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５５、
１７５、１９５、および２１５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸
置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領
域とからなる、単離Ｎｏｔｃｈ３抗体またはそれらの断片を提示する。
抗体断片の、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、Ｎｏｔｃｈ３に特異的に結合する、少なくとも１
つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワーク
または足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫
グロブリンまたはその断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化の側
面を有する、他の動物種の免疫グロブリンを含む。当業者により、新規のフレームワーク
、足場、および断片が発見および開発され続けている。
一態様では、本開示は、その上にＣＤＲをグラフトしうる、非免疫グロブリン足場を使
用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のＮｏ
ｔｃｈ３タンパク質（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニクイザルＮｏｔｃｈ
３）に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知であるかまたは将来的な、非免疫グ
ロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非
免疫グロブリンフレームワークまたは非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏ
ｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アンキ
リン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌ
ａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、お
よびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉ
ｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子モ
ジュラー免疫医薬品（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓ
ｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディー（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびア
フィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｇ
ｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィ
ブロネクチンの第１０モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブロ
ネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパッキングされてタンパク質のコアを形
成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループ（ＣＤＲと類似する）もさ
らに含有する、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有す
る。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあ
り、ここで、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（ＵＳ６
，８１８，４１８を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダＩｇＧ内およびラマ
ＩｇＧ内の抗原認識単位全体を含む、最小の機能的抗体断片である、重鎖可変領域のフォ
ールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリン
ではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗
体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉ
ｎ ｖｉｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏに
おけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。
これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子の
ループ領域をＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンから導出されたリピートモジュールを伴うタンパク質を
、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく
。アンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのα−へリックスおよびβ
−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソーム
ディスプレイを使用することにより、最もよく最適化することができる。
アビマーは、Ｎｏｔｃｈ３など、天然のＡドメイン含有タンパク質から導出される。こ
れらのドメインは、天然では、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超
えるタンパク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介し
て連結された多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に
結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号；同第２
００５００５３９７３号；同第２００５００４８５１２号；および同第２００６０００８
８４４号において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディーとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメ
インのうちの１つの足場に基づく３へリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパ
ク質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数の
リガンド変異体を伴うアフィボディーライブラリーを作り出すようにランダム化されてい
る、５８アミノ酸からなる（例えば、ＵＳ５，８３１，０１２を参照されたい）。アフィ
ボディー分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量が
６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディー分子の結合性部位は、そ
の抗体の結合性部位と類似する。
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された生成
物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理
学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカ
リンから導出される。ヒト組織内またはヒト体液中では、複数の天然リポカリンが生じる
。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上に超可変ループを伴い
、免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、
リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりごくわずかに大きい、１６０〜１８０
アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのル
ープのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる
形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性
部位を特許権のある工程で成形し直すことができる。４つのループのセットを突然変異誘
発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパ
ク質である、オオモンシロチョウ（Pieris brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢ
Ｐ）が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ公
開第ＷＯ１９９９１６８７３号における例である。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのため
にデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、
それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから極め
て迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対して
、いかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それ
らのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方
は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も極めて小
型で、高度な温度安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高
度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリ
ンに由来するタンパク質の例は、ＷＯ２００１０４１４４において記載されており、「ユ
ビキチン様」タンパク質の例は、ＷＯ２００４１０６３６８において記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な
二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの
環状ペプチド様分子（ＭＷ：１〜２ｋＤａ）である。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域を変化させることにより、Ｆａｂを、サイレントＩ
ｇＧ１フォーマットへと転換する。例えば、表２の抗体は、ＩｇＧフォーマットへと転換
することができる。
ヒト抗体またはヒト化抗体
本開示は、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザル／マウ
スＮｏｔｃｈ３）に特異的に結合する完全ヒト抗体を提示する。キメラ抗体またはヒト化
抗体と比較して、ヒトＮｏｔｃｈ３結合性抗体は、ヒト対象へと投与される場合の抗原性
がさらに低減されている。
ヒトＮｏｔｃｈ３結合性抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して作り出すことがで
きる。例えば、ヒト化操作技術を使用して、非ヒト抗体を、操作ヒト抗体へと転換する。
米国特許公開第２００５０００８６２５号は、非ヒト抗体の結合特徴に照らして、同じ結
合特徴を維持するか、または良好な結合特徴をもたらしながら、非ヒト抗体の可変領域を
、抗体内のヒト可変領域で置きかえるためのｉｎ ｖｉｖｏ法について記載している。方
法は、エピトープ誘導型、非ヒト基準抗体の可変領域の、完全ヒト抗体による置きかえに
依拠する。結果として得られるヒト抗体は一般に、基準の非ヒト抗体とは構造的に類縁で
ないが、基準抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。略述すると、一連のエピト
ープにより誘導される相補性置換法は、「コンペティター」と、基準抗体の多様なハイブ
リッド体（「被験抗体」）のライブラリーとの間の、抗原に対する被験抗体の結合に応答
するレポーター系の存在下における限定量の抗原への結合についての、細胞内の競合を準
備することにより可能となる。コンペティターは、基準抗体または、単鎖Ｆｖ断片など、
その誘導体でありうる。コンペティターはまた、抗原の天然または人工のリガンドであっ
て、基準抗体と同じエピトープに結合するリガンドでもありうる。コンペティターの唯一
の要件は、基準抗体と同じエピトープに結合し、基準抗体と、抗原への結合について競合
することである。被験抗体は、非ヒト基準抗体に由来する１つの抗原結合性Ｖ領域を共有
し、ヒト抗体のレパートリーライブラリーなど、多様な供給源に由来する、他のＶ領域は
、ランダムに選択される。基準抗体に由来する共通のＶ領域は、選択に、基準抗体への抗
原結合忠実度が最高となる方向へのバイアスがかかるように、被験抗体を抗原上の同じエ
ピトープ上に、同じ配向性で位置決めするガイドとして用いられる。
多くの種類のレポーター系を使用して、被験抗体と抗原との間の所望の相互作用を検出
することができる。例えば、レポーターが、被験抗体が抗原に結合する場合に限り、断片
の相補により活性化するように、相補的レポーター断片を、抗原および被験抗体のそれぞ
れへと連結することができる。被験抗体側のレポーター断片と、抗原側のレポーター断片
との融合体を、コンペティターと共に共発現させると、レポーターの活性化は、コンペテ
ィターと競合する被験抗体の能力であって、被験抗体の抗原に対するアフィニティーに比
例する能力に依存するようになる。使用されうる他のレポーター系は米国特許出願第１０
／２０８，７３０号（同公開第２００３０１９８９７１号）で開示されている、自己阻害
レポーター再活性化系（ＲＡＩＲ）の再活性化因子、または米国特許出願第１０／０７６
，８４５号（同公開第２００３０１５７５７９号）で開示されている、競合活性化系を含
む。
一連のエピトープ誘導型相補性置換系により選択を行って、単一の被験抗体を、コンペ
ティター成分、抗原成分、およびレポーター成分と共に発現させる細胞を同定する。これ
らの細胞では、各被験抗体は、コンペティターと一対一で、限定量の抗原への結合につい
て競合する。レポーターの活性は、被験抗体に結合した抗原の量に比例し、これは、結果
として被験抗体の抗原に対するアフィニティーおよび被験抗体の安定性に比例する。まず
、被験抗体として発現させた場合の、基準抗体の活性に照らしたそれらの活性に基づき、
被験抗体を選択する。第１のラウンドの選択の結果は、それらの各々が、基準抗体に由来
する同じ非ヒトＶ領域と、ライブラリーに由来するヒトＶ領域とを含み、それらの各々が
、基準抗体と同じ、抗原上のエピトープに結合する、「ハイブリッド」抗体のセットであ
る。第１のラウンドで選択されたハイブリッド抗体のうちの１または複数は、抗原に対し
て、基準抗体のアフィニティーと同等であるかまたはこれより大きなアフィニティーを有
するであろう。
第２のＶ領域置換ステップでは、第１のステップで選択されたヒトＶ領域を、残りの非
ヒト基準抗体のＶ領域のための、コグネイトのヒトＶ領域の多様なライブラリーによるヒ
ト置換を選択するためのガイドとして使用する。第１のラウンドで選択されたハイブリッ
ド抗体はまた、第２のラウンドの選択のためのコンペティターとして使用することもでき
る。第２のラウンドの選択の結果は、基準抗体と構造的に異なるが、基準抗体と、同じ抗
原への結合について競合する、完全ヒト抗体のセットである。選択されたヒト抗体のうち
のいくつかは、基準抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。これらの選択された
ヒト抗体の中で、１または複数のヒト抗体は、基準抗体のアフィニティーと同等であるか
またはこれより大きなアフィニティーで、同じエピトープに結合する。
上記で記載した、マウスＮｏｔｃｈ３結合性抗体またはキメラＮｏｔｃｈ３結合性抗体
のうちの１つを基準抗体として使用するこの方法は、同じ結合特異性および同じであるか
または良好な結合アフィニティーでヒトＮｏｔｃｈ３に結合するヒト抗体を作り出すのに
たやすく援用することができる。加えて、このようなヒトＮｏｔｃｈ３結合性抗体はまた
、ヒト抗体を特注で作製する企業、例えば、ＫａｌｏＢｉｏｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａ
ｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）からも市販されている。
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama pacos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vic
ugna））などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタ
コブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Camelus dromaderius））フ
ァミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト
対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺
乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する
抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、４つの鎖による典型的な四次構造
とは構造的に顕著に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日
に公表されたＷＯ９４／０４６７８）を参照されたい。
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は
、標的に対するアフィニティーが大きな低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ
科動物ナノボディー」として公知の、低分子量抗体から導出されるタンパク質を結果とし
てもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に交付された米国特
許第５，７５９，８０８号を参照されたい。また、Stijlemans et al., (2004) J Biol C
hem 279:1256-1261；Dumoulin et al., (2003) Nature 424:783-788；Pleschberger et a
l., (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo et al., (2002) Int J Ca
ncer 89:456-62；およびLauwereys et al., (1998) EMBO J 17:3512-3520も参照されたい
。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈ
ｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている（例えば、ＵＳ２００６０１１５４７０；Ｄ
ｏｍａｎｔｉｓ（ＵＳ２００８００６５４４０、ＵＳ２００９０１４８４３４））。非ヒ
ト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似す
る配列を得るように、組換えにより変化させることができる、すなわち、ナノボディーは
、「ヒト化する」ことができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小
さな抗原性を、さらに低減することができる。
ラクダ科動物ナノボディーの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タ
ンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結
は、大型の抗体タンパク質には機能的に対象外である抗原性部位に結合するラクダ科動物
ナノボディーの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディーは、古典的な免疫学的
技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり
、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は
、ラクダ科動物ナノボディーが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の
特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、
よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力
において用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨお
よびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボデ
ィーを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディーが、循環系から組織
へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうる
ことである。ナノボディーはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２０
０４年８月１９日に公表された米国特許出願第２００４０１６１７３８号を参照されたい
。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな
治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核
細胞内で十分に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発
現させることができ、機能的である。
したがって、本開示の特色は、Ｎｏｔｃｈ３に対するアフィニティーが大きなラクダ科
動物抗体またはラクダ科動物ナノボディーである。本明細書のある種の実施形態では、ラ
クダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディーは、天然ではラクダ科動物において産生
される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、Ｎｏｔｃｈ
３またはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的
に、Ｎｏｔｃｈ３結合性ラクダ科動物ナノボディーは、操作もされる、すなわち、例えば
、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのＮｏｔｃｈ３を伴うパニング
手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディータンパク質を提示
するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディーは
さらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間とな
るようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体また
はラクダ科動物ナノボディーを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載さ
れている通り、ヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディーまたは単一ドメ
イン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
一実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディーは、以下のＮｏｔ
ｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ１４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅ
ｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌ
ｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ１５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌ
ｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ１５９８、およびＨｉｓ１５９９のうちの少なくと
も１つに結合する。一実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディー
は、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ１４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒ
ｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙ
ｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ１５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓ
ｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、およびＳｅｒ１６０６のうちの少なくとも１つに結合する
。
一実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディーは、以下のＮｏｔ
ｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａ
ｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ１４７４、Ｇｌｎ１４８６、およびＧｌｙ１４８７
のうちの少なくとも１つに結合する。一実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科
動物ナノボディーは、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ１４６５、Ｔｈ
ｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ１４７２、Ａｒ
ｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１のうちの少なくと
も１つに結合する。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本開示は、本開示のＮｏｔｃｈ３抗体またはその断片を含む二パラトー
プ性分子、二特異性分子、または多特異性分子を特色とする。本開示の抗体またはその断
片は、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り
出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタン
パク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。
抗体は実際、２つを超える異なる結合性部位および／または標的分子に結合する二パラト
ープ性分子または多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の複数の機
能的分子へと連結することもでき、このような二パラトープ性分子または多特異性分子も
また、本開示に包摂されることを意図する。本開示の二特異性分子を創出するには、抗体
を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または
結合性模倣体など、１または複数の他の結合分子へと機能的に連結する（例えば、化学的
カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で）ことが
できる。
１つの抗体内の、２つ以上の抗原への結合により、さらなる臨床的利益がもたらされる
（Coloma et al., (1997)；Merchant et al., (1998)；Alt et al., (1999)；Zuo et al.
, (2000)；Lu et al., (2004)；Lu et al., (2005)；Marvin et al., (2005)；Marvin et
al., (2006)；Shen et al., (2007)；Wu et al., (2007)；Dimasi et al., (2009)；Mic
haelson et al., (2009)；Morrison et al., (1997) Nature Biotech. 15:159-163；Alt
et al., (1999) FEBS Letters 454:90-94；Zuo et al., (2000) Protein Engineering 13
:361-367；Lu et al., (2004) JBC 279:2856-2865；Lu et al., (2005) JBC 280:19665-1
9672；Marvin et al., (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658；Marvin et al.
, (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193；Shen et al., (2007) J Immun Meth
ods 218:65-74；Wu et al., (2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297；Dimasi et al., (2
009) J Mol Biol. 393:672-692；およびMichaelson et al., (2009) mAbs 1:128-141）。
本開示の二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特
異性物質をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分
子の各結合特異性物質は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることが
できる。結合特異性物質がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング
剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例
は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテ
ート（ＳＡＴＡ：N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate）、５，５’−ジチオビス（２
−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スク
シンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホ
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ：sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-car
boxylate）を含む（例えば、Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu et
al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Pau
lus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132；Brennan et al., (1985) Science 229
:81-83；およびGlennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375において記載され
ている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣであり、
いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から市
販されている。
結合特異性物質が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスル
フヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態で
は、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒド
リル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性物質も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内
で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍ
Ａｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タン
パク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。二特異
性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決
定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子
を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６０，
２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特
許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，
７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および
米国特許第５，４８２，８５８号において記載されている。
二特異性分子の、それらの特異的な標的に対する結合は、例えば、酵素免疫測定アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥ
Ａ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）、またはウェスタンブロット
アッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合
体に特異的な、標識された試薬（例えば、抗体）を援用することにより、特に対象となる
タンパク質−抗体間複合体の存在が検出される。
別の態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体の、少なくとも２つの、同一で
あるかまたは異なる断片を含む、多価化合物を提示する。抗体断片は、タンパク質の融合
または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併せて連結することができる
。四価化合物は、例えば、本開示の抗体を、本開示の抗体の定常領域、例えば、Ｆｃ領域
またはヒンジ領域に結合する抗体と架橋することにより得ることができる。三量体化ドメ
インについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許であるＥＰ１０１２２８０Ｂ１におい
て記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８
９７において記載されている。
一実施形態では、二パラトープ性／二特異性分子は、Ｎｏｔｃｈ３のＬＮＲ内およびＨ
Ｄ内のアミノ酸残基に結合する。
別の実施形態では、本開示は、単一のモノクローナル抗体を、抗原結合性部位が、Ｎｏ
ｔｃｈ３および別の抗原（例えば、Ｎｏｔｃｈ１、ＥＧＦＲ）の両方に結合する二官能性
抗体など、複数の抗原に結合するように改変した、二官能性抗体に関する。したがって、
二官能性抗体は、Ｎｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ１またはＥＧＦＲの両方に結合しうる。
二官能性抗体による二重の結合特異性は、さらに二重の活性または活性の阻害へも変換さ
れうる（例えば、Jenny Bostrom et al., (2009) Science: 323; 1610-1614を参照された
い）。
半減期を延長した抗体
本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質に特異
的に結合する抗体を提示する。
多くの因子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例え
ば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）によ
る分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和、ならびにマクロフ
ァージおよび樹状細胞による取込み）。様々な戦略を使用して、本開示の抗体の半減期を
延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethyleneglycol
）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ：polysialic acid）、ヒ
ドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ：hydroxyethyl starch）、アルブミン結合性リガンド
、および炭水化物シールドとの化学的連結により；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およ
びトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により；
ナノボディー、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー、アフィボディー、およびアンチカリ
ンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化
学的に）ことにより；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性
タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により；またはナノ担体、徐放処方物、もしくは
医療デバイスへの組込みによる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不
活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュ
ゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多
官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へ
と接合することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体またはその断片を、ＰＥＧの反
応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、１ま
たは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片へと接合する条件下で反応させることが典型的
である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）との
アシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される
「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチ
レングリコールもしくはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリーロキシ−ポリエチレングリコールま
たはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用
されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包摂することを意図する。ある種の実施形態
では、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状
ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、
使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析に
より緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認す
ることができる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン
交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる
。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載され
るイムノアッセイにより、結合活性のほか、ｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性についても調
べることができる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化するための方法が公知であり
、本開示の抗体に適用することができる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１
５４３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
他の改変ＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介し
て、化学的に性状が明らかな側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、ＲｅＣＯＤＥ Ｐ
ＥＧ（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）技術を含む。こ
の技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（E. coli）細胞内、酵母細胞内、お
よび哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。ｔＲＮＡは、非天然ア
ミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、終止コドンであるアン
バーコドンを、化学的に性状が明らかなアミノ酸の組込みのシグナルを伝達するコドンへ
と転換する。
組換えＰＥＧ化（ｒＰＥＧ：recombinant pegylation）技術はまた、血清中半減期の延
長にも使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク
質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構
造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパ
ク質の血清中半減期は、大幅に延長される。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要
請する従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大幅に簡略化され、生成物は、均質であ
る。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿
命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術であ
る。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの
薬物送達に使用される場合、ポリシアル酸は、コンジュゲーションされると、保護的微小
環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系
により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される
。ＰＳＡポリマーは、数百万年にわたり、それらの細胞壁をＰＳＡポリマーでコーティン
グするように進化した、ある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシ
アリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった
。自然による究極のステルス技術であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、
所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内では
ＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完
全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体へと連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使
用を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンから導出された、修飾天然ポリマーで
あり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレ
オロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させ
ることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし
、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを
変化させることにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすること
ができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１または複数のアミノ酸修飾（
すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性
断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作り
出すことができる。例えば、国際公開第ＷＯ９８／２３２８９号、国際公開第ＷＯ９７／
３４６３１号；および米国特許第６，２７７，３７５号を参照されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、または
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミンへとコンジュゲー
トさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際公開第ＷＯ９
３／１５１９９号、同第ＷＯ９３／１５２００号、および同第ＷＯ０１／７７１３７号；
ならびに欧州特許第ＥＰ４１３，６２２号を参照されたい。
Ｎｏｔｃｈ３抗体またはその断片はまた、１または複数のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ
：human serum albumin）ポリペプチドまたはそれら部分へと融合させることもできる。
その成熟形態において５８５アミノ酸のタンパク質であるＨＳＡは、血清の浸透圧のうち
のかなりの部分の一因となり、また、内因性リガンドおよび外因性リガンドの担体として
も機能する。アルブミンの担体分子としての役割およびその不活性の性質は、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおけるポリペプチドの担体および輸送体としての使用に所望される特性である。ア
ルブミンの、多様なタンパク質のための担体としてのアルブミン融合タンパク質の成分と
しての使用は、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、およびＥＰ４１３６２２
において示唆されている。また、ＨＳＡのＮ末端断片の、ポリペプチドへと融合させるた
めの使用も提起されている（ＥＰ３９９６６６）。したがって、抗体またはそれらの断片
を、アルブミンへと、遺伝子的または化学的に融合またはコンジュゲートさせることによ
り、保管寿命を安定化させるかもしくは延長し、かつ／または溶液中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
、および／もしくはｉｎ ｖｉｖｏにおける分子活性を長期間にわたり保持することがで
きる。
アルブミンの、別のタンパク質への融合は、ＨＳＡまたはその断片をコードするＤＮＡ
を、タンパク質をコードするＤＮＡへと接合させるような遺伝子操作により達成すること
ができる。次いで、適切な宿主を、融合ポリペプチドを発現させるように、適切なプラス
ミド上に配置された融合ヌクレオチド配列で、形質転換するかまたは適切な宿主にこれを
トランスフェクトする。発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、原核細胞または真
核細胞から行うこともでき、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、トランスジェニック生物
から行うこともできる。ＨＳＡの融合に関するさらなる方法は、例えば、参照により本明
細書に組み込まれる、ＷＯ２００１０７７１３７およびＷＯ２００３０６００７において
見出すことができる。具体的な実施形態では、融合タンパク質の発現を、哺乳動物細胞系
内、例えば、ＣＨＯ細胞系内で実施する。また、低ｐＨおよび高ｐＨにおける、示差的な
抗体の受容体への結合の変化も、本開示の範囲内にあることが想定されている。例えば、
ヒスチジンなどのさらなるアミノ酸を、抗体のＣＤＲに含むように、抗体を改変すること
により、低ｐＨ、例えば、リソソーム内の低ｐＨで、その受容体への結合を維持するよう
に、抗体のアフィニティーを改変することができる（例えば、Tomoyuki Igawa et al. (2
010) Nature Biotechnology; 28, 1203-1207を参照されたい）。
抗体コンジュゲート
本開示は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチド
へと（もしくはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３
０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８
０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えに
より融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーション
および非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質に特異
的に結合する抗体またはそれらの断片を提示する。特に、本開示は、本明細書で記載され
る抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイ
ン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリ
ペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提示する。当技術分野では、タ
ンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片へと融合またはコンジ
ュゲートさせるための方法が公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同
第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第
５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号；欧州特許第ＥＰ３０７，４３
４号および同第ＥＰ３６７，１６６号；国際公開第ＷＯ９６／０４３８８号および同第Ｗ
Ｏ９１／０６５７０号；Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:105
35-10539；Zheng et al., (1995) J. Immunol. 154:5590-5600；ならびにVil et al., (1
992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシ
ャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と
称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを援用して、抗体ま
たはそれらの断片の活性を変化させる（例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小
さい抗体またはそれらの断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号
、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、
および同第５，８３７，４５８号；Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol.
8:724-33；Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson et al., (1999
) J. Mol. Biol. 287:265-76；およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2)
:308- 313（これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明
細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされた
抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲを介するランダム突
然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより変化させる
ことができる。Ｎｏｔｃｈ３タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコード
するポリヌクレオチドは、１または複数の異種分子の１または複数の成分、モチーフ、区
間、部分、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へ
と融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それら
のうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．
、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）にお
いて提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentz et al., (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されている通り、例えば、ヘキサ
ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグ
は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から導出されたエピトープ（Wilson et al
., (1984) Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッ
グ」タグを含むがこれらに限定されない。
他の実施形態では、本開示の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出用薬剤へと
コンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発症（onset、development
）、進行、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査
手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断
および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ
−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定され
ない多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるが
これらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン
酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシル
クロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノ
ールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およ
びイクォリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２
５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３
Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネ
シウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラ
ジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１
８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、
１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９
７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、
５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに
限定されない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金
属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない、検出可能な物質へ
とカップリングすることにより達成することができる。
本開示は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさら
に包摂する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞
剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコン
ジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤
を含む。
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物
部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的な化
学的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物
学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このような
タンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス（Pseudomonas）属外毒素
、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロ
ン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン
活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質；または例えば、リンホカ
インなどの生体応答修飾剤を含みうる。一実施形態では、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体またはその
断片を、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）、または放射性毒素などの治療用部分へ
とコンジュゲートさせる。本明細書では、このようなコンジュゲートを、「イムノコンジ
ュゲート」と称する。１または複数の細胞毒素を含むイムノコンジュゲートを、「抗毒素
」と称する。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に対して有害な（例えば、細胞を死滅さ
せる）任意の薬剤を含む。例は、タキソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エ
チジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビン
ブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン
ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテスト
ステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロ
ール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体を含む。治療剤は
また、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チ
オグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アブレーション剤（
例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（Ｂ
ＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロ
モマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジア
ミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ：シスプラチン））、アントラサイクリン（例えば、ダウノル
ビシン（旧称：ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生剤（例えば、ダクチノマ
イシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラ
マイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラ
スチン）も含む。例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる、ＵＳ２００９０３
０４７２１を参照されたい。
抗体へとコンジュゲートさせうる治療用細胞毒素の他の例は、デュオカルマイシン、カ
リケアミシン、メイタンシン、およびアウリスタチン、ならびにこれらの誘導体を含む。
カリケアミシンによる抗体コンジュゲートの例は、市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（
商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。
細胞毒素は、当技術分野で利用可能なリンカー技術を使用して、抗体へとコンジュゲー
トさせることができる。細胞毒素を抗体へとコンジュゲートさせるのに使用されているリ
ンカーの種類の例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプ
チド含有リンカーを含むがこれらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低ｐＨに
よる切断を受けやすいか、またはカテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カ
テプシンＤ）など、腫瘍組織内で優先的に発現するプロテアーゼなどのプロテアーゼによ
る切断を受けやすいリンカーを選択することができる。
細胞毒素、リンカーの種類、および治療剤を抗体へとコンジュゲートさせるための方法
についてのさらなる議論についてはまた、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev.
55:199-215；Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne,
(2003) Cancer Cell 3:207-212；Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan
and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter and Springe
r, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照されたい。
本開示の抗体はまた、ラジオイムノコンジュゲートともまた称する細胞傷害性の放射性
医薬品を作り出すのに、放射性同位体へもコンジュゲートさせることができる。診断的使
用または治療的使用のために抗体へとコンジュゲートさせうる放射性同位体の例は、ヨウ
素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、およびルテチウム１７７を含むがこれ
らに限定されない。当技術分野では、放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法
が確立されている。Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含
むラジオイムノコンジュゲートの例が市販されており、本開示の抗体を使用して、ラジオ
イムノコンジュゲートを調製するのに、同様の方法を使用することができる。ある種の実
施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと接合させうる、１，
４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（
ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々
が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardo et al., (1998) Clin Cancer
Res. 4(10):2483-90；Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；およ
びZimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50において記載されている。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arno
n et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"
, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-5
6 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", i
n Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel
Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Th
erapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applicati
ons, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；"Analysis, Results, And Future
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",
in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.)
, pp. 303-16 (Academic Press 1985)；およびThorpe et al., (1982) Immunol. Rev. 62
:119-58を参照されたい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと接合
させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに
限定されない。
別の態様では、本開示は、別の抗体、低分子阻害剤、ならびにＥＧＦＲおよび白金化学
療法など、標準治療による療法など、他の治療剤と組み合わせて使用される、Ｎｏｔｃｈ
３抗体またはそれらの断片に関する。
抗体を作製する方法
（ｉ）抗体をコードする核酸
本開示は、上記で記載したＮｏｔｃｈ３抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリ
ペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提示する。核酸のいくつかは、Ｎ
ｏｔｃｈ３抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または軽鎖可変
領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表２で
同定した核酸分子である。他のいくつかの核酸分子は、表２で同定した核酸分子のヌクレ
オチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一
なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させる場合、これらのポリヌク
レオチドによりコードされるポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ３抗原結合能を呈示することが
可能である。
本開示ではまた、上記で示したＮｏｔｃｈ３抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくと
も１つのＣＤＲ領域、および、通例、３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチ
ドも提示される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したＮｏｔｃｈ３抗体の
重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コード
の縮重性のために、様々な核酸配列が、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードする
ことになろう。
核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。核酸配列のうちの
いくつかは、表２で示した、Ｎｏｔｃｈ３抗体の成熟重鎖可変領域配列と実質的に（例え
ば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な成熟重鎖可変領域配列をコードす
るヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、表２で示した、Ｎｏｔｃｈ３抗体の
成熟軽鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）
同一な成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成により作製することもでき、Ｎｏｔ
ｃｈ３抗体またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載
される配列）に対するＰＣＲ突然変異誘発により作製することもできる。核酸の直接的な
化学合成は、Narang et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法
；Brown et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:109によるホスホジエステル法；Beaucage e
t al., (1981) Tetra. Lett., 22:1859によるジエチルホスホルアミダイト法；および米
国特許第４，４５８，０６６号による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により
達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、
例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A.
Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila
et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:967；およびEckert et al., (1991) PCR Method
s and Applications 1:17において記載されている通りに実施することができる。
本開示ではまた、上記で記載したＮｏｔｃｈ３結合性抗体を作製するための発現ベクタ
ーおよび宿主細胞も提示される。多様な発現ベクターを援用して、Ｎｏｔｃｈ３抗体鎖ま
たはＮｏｔｃｈ３結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。
ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺
乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス
系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセット
を伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al.,
(1997) Nat Genet 15:345を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内
のＮｏｔｃｈ３結合性ポリヌクレオチドおよびＮｏｔｃｈ３結合性ポリペプチドの発現に
有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ、ｐＴｈｉｏＨｉｓＢ、およびｐＴｈ
ｉｏＨｉｓＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、ｐＥＢＶＨｉｓＢ、およ
びｐＥＢＶＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベ
クター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベ
クターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピロー
マウイルス、エプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ
森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al., (1995) supra；Smith, Annu. Rev. Mi
crobiol. 49:807；およびRosenfeld et al., (1992) Cell 68:143を参照されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存す
る。発現ベクターは、Ｎｏｔｃｈ３抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作
動可能に連結したプロモーターおよび他の調節的配列（例えば、エンハンサー）を含有す
ることが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導的プロモーターを援用して、誘導
条件下を除く、挿入された配列の発現を防止する。誘導的プロモーターは、例えば、アラ
ビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを
含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容さ
れるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。
プロモーターに加えて、他の調節エレメントもまた、Ｎｏｔｃｈ３抗体鎖または断片の効
率的な発現に要請または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コ
ドンおよび隣接するリボソーム結合性部位または他の配列を含むことが典型的である。加
えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増
強することもできる（例えば、Scharf et al., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20
:125；およびBittner et al., (1987) Meth. Enzymol., 153:516を参照されたい）。例え
ば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の
発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＮｏｔｃｈ３抗体配列によりコードされるポリペプチ
ドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置も備える場合がある。
挿入されたＮｏｔｃｈ３抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連
結することが多い。Ｎｏｔｃｈ３抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコー
ドする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそ
れらの部分もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての
可変領域の発現を可能とし、これにより、無傷抗体またはそれらの断片の産生をもたらす
。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
Ｎｏｔｃｈ３抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合も
あり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本開示のポリヌクレオチドをクロ
ーニングし、発現させるのに有用な１つの原核細胞宿主である。使用に適する他の微生物
宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、ならびにサルモネラ（Salmonella）
属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種な
ど、他の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）を含む。これらの原核細胞宿主内ではまた、
典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクタ
ーも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由
来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在させることに
なろう。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典
型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列な
ども有する。本開示のＮｏｔｃｈ３結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他
の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた
昆虫細胞も使用することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＮｏｔｃｈ３結合性ポリペプチドを発現させ、作製
するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、哺乳動物宿主細胞は、内因性免疫グロ
ブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６
．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺
乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。哺乳動
物宿主細胞は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不
死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、無傷免疫グロブリンを分泌することが可能
な多数の適切な宿主細胞系であって、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞
、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む宿主細胞系が開発されて
いる。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織による細胞培養物の使用について
は、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987に
おいて一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プ
ロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., (1986) I
mmunol. Rev. 89:49-68を参照されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプ
ライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列など、必要なプロセシ
ング情報部位を含みうる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロ
モーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモータ
ーは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、細胞周期段階特異的プロモータ
ー、および／またはモジュレート性プロモーターもしくは調節性プロモーターでありうる
。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後
期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、
ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘
導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモー
ター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに
限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿
主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核
細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使
用することができる。一般に、Sambrook, et al., supraを参照されたい。他の方法は、
例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注入およびマイ
クロインジェクション、遺伝子銃による方法（ballistic method）、ウィロソーム、イム
ノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、
ヘルペスウイルス構造タンパク質であるＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, (1997
) Cell 88:223）、ＤＮＡの薬剤増強型取込み、ならびにｅｘ ｖｉｖｏにおける形質導
入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望さ
れることが多かろう。例えば、Ｎｏｔｃｈ３抗体鎖またはＮｏｔｃｈ３結合性断片を安定
的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マ
ーカー遺伝子を含有する、発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導
入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り
替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在によ
り細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに
成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組
織培養法を使用して増殖させることができる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and
Milstein, (1975) Nature 256:495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含
む様々な技法により作製することができる。例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換ま
たは発がん性形質転換など、モノクローナル抗体を調製するための多くの技法を援用する
ことができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリ
ドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野では、融合体のために、免疫
化された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコールおよび免疫化法が公知である。融
合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
本開示のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記で記載した通りに調製されるマウスモノ
クローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免
疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子
生物学法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操
作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法（例
えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）を使用
して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出す
るには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワーク
へと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５２２５５３９号；
ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５５３０１０１号；同第５５８５０８９号；同第
５６９３７６２号；および同第６１８０３７０号を参照されたい。
ある種の実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。Ｎｏｔｃｈ３を指向
するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系ではなく、ヒト免疫系の部分を
保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソーマルマウスを使用して作
り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソーマル
マウスは、本明細書で、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを
含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性μ鎖遺伝子座
および内因性κ鎖遺伝子座を不活化する、ターゲティングされた突然変異と併せて、再配
列されていないヒト重（μおよびγ）鎖免疫グロブリン配列およびヒトκ軽鎖免疫グロブ
リン配列をコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、
Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859）。したがって、マウスは、マウス
ＩｇＭまたはマウスＩｇκの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重
鎖トランス遺伝子およヒトび軽鎖トランス遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突
然変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を作り出す（Lonber
g et al., (1994) supra；reviewed in Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pha
rmacology 113:49-101；Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol.13:65-93；
およびHarding and Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡ
ｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノムの改変は
、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込ま
れる、Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen et al., (1
993) International Immunology 5:647-656；Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 94:3720-3724；Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123；Chen et
al., (1993) EMBO J. 12:821-830；Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-29
20；Taylor et al., (1994) International Immunology 579-591；およびFishwild et al
., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851においてさらに記載されている。さらに、
全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，
５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７
８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１
４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；Ｓｕｒａ
ｎｉらによる、米国特許第５，５４５，８０７号；全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに
よる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２１０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９
４／２５５８５号、同第ＷＯ９７１１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および
同第ＷＯ９９／４５９６２号；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１
４４２４号も参照されたい。
別の実施形態では、ヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロ
モソームを保有するマウスなど、トランス遺伝子上およびトランスクロモソーム上にヒト
免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用してもたらすことができる。本明細書で「Ｋ
Ｍマウス」と称するこのようなマウスは、ＩｓｈｉｄａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／
４３４７８号において詳細に記載されている。
当技術分野ではなおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランス
ジェニック動物系も利用可能であり、本開示のＮｏｔｃｈ３結合性抗体をもたらすのに使
用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称す
る代替的なトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば
、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５
，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号；および同第６，１
６２，９６３号において記載されている。
当技術分野ではさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスクロ
モソーマル動物系も利用可能であり、本開示のＮｏｔｃｈ３結合性抗体をもたらすのに使
用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖トランスクロモソーム
およびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができるが
、このようなマウスは、Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-
727において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖トランスクロモソームお
よびヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するウシも記載されており（Kuroiwa et al.,
(2002) Nature Biotechnology 20:889-894）、本開示のＮｏｔｃｈ３結合性抗体をもたら
すのに使用することができる。
ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリー
ニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野
では、ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法が確立されているか
、または下記の実施例で記載される。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２
３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅ
ｒらによる米国特許第５，４２７，９０８号；および同第５，５８０，７１７号；ＭｃＣ
ａｆｆｅｒｔｙらによる米国特許第５，９６９，１０８号；および同第６，１７２，１９
７号；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらによる米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，
５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５
８２，９１５号；および同第６，５９３，０８１号を参照されたい。
ヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化されると、ヒト抗体応答を作り出しうるように
ヒト免疫細胞を再構成した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このよう
なマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる米国特許第５，４７６，９９６号；および同
第５，６９８，７６７号において記載されている。
（ｉｉｉ）フレームワークまたはＦｃの操作
操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨ内および／またはＶＬ内のフ
レームワーク残基へと修飾を施した、操作抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は
、抗体の免疫原性を減殺するように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１
または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させ
る」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が導出された生殖
細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレー
ムワーク配列を、抗体が導出された生殖細胞系列配列と比較することにより同定すること
ができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、
例えば、部位指向突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰
突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本開示
に包摂されることを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、フレームワーク領域内の１もしくは複数の残基、な
おまたは、１もしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを
除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた
、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号に
おいてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に
、抗体を、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作して、典型的に、血清中半減期、補体の結
合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用など、抗体の
１または複数の機能的特性を変化させることもできる。さらに、抗体は、化学的に修飾す
ることもでき（例えば、１または複数の化学的部分を抗体へと接合することができる）、
そのグリコシル化を変化させるように修飾して、ここでもまた、抗体の１または複数の機
能的特性を変化させることもできる。これらの実施形態の各々については、下記で詳細に
記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスによる番
号付けである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を変化させる、例えば、増大また
は減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによ
る米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域
内のシステイン残基の数は、例えば、抗体の軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とする
か、または抗体の安定性を増大もしくは減少させるように変化させる。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を
短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌（Staphylococcus）属プロテインＡ（Ｓｐ
Ａ：Staphylococcus protein A）への結合が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結
合と比べて損なわれるように、１または複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片の
ＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによ
る米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基で置
きかえることにより、Ｆｃ領域を変化させて、抗体のエフェクター機能を変化させる。例
えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを変化させているが、親抗
体の抗原結合能は保持するように、１または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置
きかえることができる。それに対するアフィニティーを変化させるエフェクターリガンド
は、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、いずれもＷｉｎ
ｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号；および同第５，６４８，２６０号にお
いてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を変化させ、かつ／または補体依存性細胞
傷害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１ま
たは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることもできる。この手法は、Ｉ
ｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号においてさらに詳細に記載され
ている。
別の実施形態では、１または複数のアミノ酸残基を変化させて、これにより、補体に結
合する抗体の能力を変化させる。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９
４／２９３５１号においてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、１または複数のアミノ酸を修飾することにより、Ｆｃ領域を
修飾して、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ：antibody dependent cellula
r cytotoxicity）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する
抗体のアフィニティーを増大させる。この手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ
００／４２０７２号においてさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、Ｆｃγ
ＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされ
ており、結合を改善させた変異体も記載されている（Shields et al., (2001) J. Biol.
Chen. 276:6591-6604を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を改変する。例えば、脱グリコシル化抗
体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化を
変化させて、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる
。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を
変化させることにより達成することができる。例えば、１または複数の可変領域フレーム
ワークのグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１または複数のアミノ酸置換を
施して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このよ
うな脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができ
る。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号；および同第６，
３５０，８６１号においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝
型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を変化させた抗体を作製
することもできる。このようなグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能を増大
させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構
を変化させた宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分
野では、グリコシル化機構を変化させた細胞が記載されており、組換え抗体を発現させ、
これにより、グリコシル化を変化させた抗体を産生するための宿主細胞として使用するこ
とができる。例えば、ＨａｎｇらによるＥＰ１，１７６，１９５は、このような細胞系内
で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコ
ードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。Ｐｒｅｓｔａ
によるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、変異体のＣＨＯ細胞系である、Ｌｅｃ
ｌ３細胞であって、フコースをＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと接合する能力を
低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、
Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields et al., (2002) J. Biol. Chem.
277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３
４２号は、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としても
たらす、二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するよう、糖タンパク質を改変する、グ
リコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎアセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系につい
て記載している（また、Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照された
い）。
別の実施形態では、抗体を改変して、その生物学的半減期を延長する。多様な手法が可
能である。例えば、Ｗａｒｄによる、米国特許第６，２７７，３７５号において記載され
ている、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１または複数を
導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、Ｐｒｅｓｔａらに
よる、米国特許第５，８６９，０４６号、および同第６，１２１，０２２号において記載
されている通り、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取された、サ
ルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１領域内またはＣＬ領域
内で変化させることもできる。
（ｉｖ）変化させた抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖配列お
よび全長軽鎖配列を有するＮｏｔｃｈ３結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全
長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと接合された定常領域
を修飾することにより、新たなＮｏｔｃｈ３結合性抗体を創出するのに使用することがで
きる。したがって、本開示の別の態様では、Ｎｏｔｃｈ３抗体の構造特色を使用して、構
造的に類縁のＮｏｔｃｈ３結合性抗体であって、ヒトＮｏｔｃｈ３に結合し、また、Ｎｏ
ｔｃｈ３の１または複数の機能的特性も阻害することなど、本開示の抗体の少なくとも１
つの機能的特性を保持する、Ｎｏｔｃｈ３結合性抗体を創出する。例えば、本開示の抗体
の１もしくは複数のＣＤＲ領域またはそれらの突然変異は、組換えにより、公知のフレー
ムワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、上記で論じた通り、組換えによ
り操作された、本開示のさらなるＮｏｔｃｈ３結合性抗体を創出することができる。他の
種類の改変は、前出の節で記載した改変を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で
提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１もしくは複数、またはそれらの
１もしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるＶ
Ｈ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１もしくは複数、またはそれらの１もしくは複
数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる
）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、出発材料として使
用して、元の配列から導出される「第２世代」の配列を創出し、次いで、「第２世代」の
配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施形態では、本開示は、配列番号３、２３、４３、６３、８３、１
０３、１２３、１４３、１６３、１８３、および２０３からなる群から選択されるＣＤＲ
１配列；配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８
４、および２０４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；ならびに／または配列番号５
、２５、４５、６５、８５、１０５、１２５、１４５、１６５、１８５、および２０５か
らなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する、重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１
３、３３、５３、７３、９３、１１３、１３３、１５３、１７３、１９３、および２１３
からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１
４、１３４、１５４、１７４、１９４、および２１４からなる群から選択されるＣＤＲ２
配列；ならびに／または配列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５
５、１７５、１９５、および２１５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する、軽
鎖可変領域の抗体配列とからなる、Ｎｏｔｃｈ３抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列
内および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変化させ
て、少なくとも１つの変化させた抗体配列を創出し、変化させた抗体配列をタンパク質と
して発現させるための方法を提示する。変化させた抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、また
は、ＵＳ２００５０２５５５５２において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基
は一定とし、かつ、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性を有する、抗体ライブラ
リーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、フ
ァージディスプレイ技術など、抗体を抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切
な、任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
標準的な分子生物学法を使用して、変化させた抗体配列を調製し、発現させることがで
きる。変化させた抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書で記載されるＮｏｔｃｈ
３結合性抗体の機能的特性であり、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニクイザルＮｏｔ
ｃｈ３に特異的に結合することを含むがこれらに限定されない機能的特性のうちの１つ、
一部、または全部を保持する抗体であって、本明細書で記載されるレポーターアッセイに
おいて、Ｎｏｔｃｈ３に結合し、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達活性を阻害することにより、
Ｎｏｔｃｈ３の生物学的活性を中和する抗体である。
変化させた抗体の機能的特性は、実施例で示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）な
ど、当技術分野で利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なアッセイ
を使用して評価することができる。
本開示の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３結合性抗体コード
配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入すること
ができ、結果として得られる改変Ｎｏｔｃｈ３結合性抗体を、本明細書で記載される結合
活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分
野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２
／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれ
らの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法につい
て記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７４６７９号
は、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化す
る方法について記載している。
抗体の特徴付け
抗体は、多様な機能アッセイにより特徴付けることができる。例えば、抗体は、本明細
書で記載される遺伝子レポーターアッセイを使用して、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻害
することにより生物学的活性を中和するそれらの能力、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質（例えば
、ヒトＮｏｔｃｈ３および／またはカニクイザルＮｏｔｃｈ３）に対するそれらのアフィ
ニティー、エピトープビニング、タンパク質分解に対するそれらの耐性、およびＮｏｔｃ
ｈ３による下流のシグナル伝達を遮断するそれらの能力により特徴付けることができる。
多様な方法を使用して、Ｎｏｔｃｈ３により媒介されるシグナル伝達を測定することがで
きる。例えば、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路は、ＩＣＤ３を測定することによりモニタ
リングすることができる。
Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体の能力は、対象の抗体を標識することにより直接的に検出
することもでき、抗体を標識せずにおき、当技術分野で公知の、多様なサンドイッチアッ
セイフォーマットを使用して、結合を間接的に検出することもできる。
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ３抗体は、基準Ｎｏｔｃｈ３抗体の、Ｎｏｔｃｈ
３ポリペプチドまたはタンパク質への結合を遮断するか、またはこれと競合する。Ｎｏｔ
ｃｈ３抗体は、上記で記載した完全ヒトＮｏｔｃｈ３抗体でありうる。Ｎｏｔｃｈ３抗体
はまた、基準抗体と同じエピトープに結合する、他のマウスＮｏｔｃｈ３抗体、キメラＮ
ｏｔｃｈ３抗体、またはヒト化Ｎｏｔｃｈ３抗体でもありうる。基準抗体の結合を遮断す
るか、またはこれと競合する能力は、被験Ｎｏｔｃｈ３抗体が、基準抗体により規定され
るエピトープと同じであるかもしくは類似するエピトープ、または基準Ｎｏｔｃｈ３抗体
が結合するエピトープに十分に近接するエピトープに結合することを指し示す。このよう
な抗体は、とりわけ、基準抗体について同定される有利な特性を共有する可能性が高い。
基準抗体を遮断するか、またはこれと競合する能力は、例えば、競合的結合アッセイによ
り決定することができる。競合的結合アッセイでは、被験抗体を、Ｎｏｔｃｈ３ポリペプ
チドまたはタンパク質などの一般的抗原への基準抗体の特異的結合を阻害する能力につい
て検討する。過剰な被験抗体が、基準抗体の結合を実質的に阻害する場合、被験抗体は、
基準抗体と、抗原への特異的結合について競合する。実質的な阻害とは、被験抗体が、基
準抗体の特異的結合を、通例少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％
低減することを意味する。
Ｎｏｔｃｈ３抗体の、基準Ｎｏｔｃｈ３抗体との、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質への結合に
ついての競合を評価するのに使用しうる、多数の競合的結合アッセイが公知である。競合
的結合アッセイは、例えば、固相直接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：radioimmunoassay
）または固相間接ＲＩＡ、固相直接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ：enzyme immunoassay）
または固相間接酵素ＥＩＡ、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., (1983) Method
s in Enzymology 9:242-253を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kir
kland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619を参照されたい）；固相直接標識アッ
セイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow & Lane, supraを参照されたい）；Ｉ
−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 2
5:7-15を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., (1990)
Virology 176:546-552）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., (1990) Scand.
J. Immunol. 32:77-82）を含む。このようなアッセイは、標識されていない被験Ｎｏｔｃ
ｈ３抗体または標識された基準抗体のうちの一方を保有する固体表面または細胞に結合さ
せた、精製抗原の使用を伴うことが典型的である。競合的阻害は、被験抗体の存在下で、
固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通例、被験抗体
を過剰に存在させる。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、基準抗体と同
じエピトープに結合する抗体、および基準抗体が結合するエピトープに、立体障害が生じ
る程度に十分に近接する、隣接エピトープに結合する抗体を含む。
選択されたＮｏｔｃｈ３モノクローナル抗体が、固有のエピトープに結合するのかどう
かを決定するには、市販の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ製の試
薬）を使用して、各抗体をビオチニル化することができる。標識されていないモノクロー
ナル抗体およびビオチニル化されたモノクローナル抗体を使用する競合研究は、Ｎｏｔｃ
ｈ３ポリペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して実施することができ
る。ビオチニル化ｍＡｂの結合は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプロー
ブにより検出することができる。精製Ｎｏｔｃｈ３抗体のアイソタイプを決定するには、
アイソタイプＥＬＩＳＡを実施することができる。例えば、マイクロ滴定プレートのウェ
ルを、４℃で一晩にわたり、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧによりコーティングすることが
できる。１％のＢＳＡによるブロッキングの後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下のＮｏｔ
ｃｈ３モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、周囲温度で１〜２時間にわた
り反応させる。次いで、ウェルを、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭに特異的なアルカリホ
スファターゼコンジュゲートプローブと反応させることができる。次いで、精製抗体のア
イソタイプを決定しうるように、プレートを現像および解析する。
Ｎｏｔｃｈ３モノクローナル抗体の、Ｎｏｔｃｈ３ポリペプチドを発現させる生細胞へ
の結合を裏付けるには、フローサイトメトリーを使用することができる。略述すると、Ｎ
ｏｔｃｈ３を発現させる細胞系（標準的な成長条件下で成長させた）を、０．１％のＢＳ
Ａおよび１０％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中に多様な濃度のＮｏｔｃｈ３抗体と混
合し、４℃で１時間にわたりインキュベートすることができる。洗浄の後、細胞を、一次
抗体による染色と同じ条件下で、フルオレセイン標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。試
料は、光および側方散乱特性を使用して、単一の細胞にゲートをかける、ＦＡＣＳｃａｎ
測定器により解析することができる。フローサイトメトリーアッセイに加え、またはフロ
ーサイトメトリーアッセイの代わりに、蛍光顕微鏡法を使用する代替的なアッセイを使用
することもできる。細胞は、まさに上記で記載した通りに染色し、蛍光顕微鏡法により検
討することができる。この方法は、個々の細胞の視覚化を可能とするが、抗原の密度に応
じて、感度を減衰させる場合がある。
Ｎｏｔｃｈ３抗体は、Ｎｏｔｃｈ３ポリペプチドまたは抗原性断片との反応性について
、ウェスタンブロット法によりさらに調べることができる。略述すると、精製Ｎｏｔｃｈ
３ポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはＮｏｔｃｈ３を発現させる細胞からの細
胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけるこ
とができる。電気泳動の後、分離された抗原を、ニトロセルロース膜へと移し、１０％の
ウシ胎仔血清でブロッキングし、被験モノクローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧの
結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質
タブレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により現像する
ことができる。
本明細書で記載されるアッセイ（例えば、ＩＣＤ３アッセイ）など、細胞ベースのアッ
セイにおける多数のリードアウトを使用して、Ｎｏｔｃｈ３抗体の有効性および特異性を
評価することができる。下記の実施例節ではまた、機能アッセイの例も記載される。
その腫瘍形成性表現型が本明細書に示される、ヒト腫瘍細胞系の腫瘍異種移植片のｉｎ
ｖｉｖｏにおける成長を遮断する抗体またはそれらの断片の能力は、Ｎｏｔｃｈ３によ
る細胞内シグナル伝達に少なくとも部分的に依存し、免疫不全マウスにおいて、単独で評
価することもでき、問題の細胞系に適切な細胞傷害剤と組み合わせて評価することもでき
る。
予防的使用および治療的使用
本開示は、それを必要とする対象へと、有効量の、本開示の抗体を投与することにより
、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路と関連する疾患または障害を処置する方法を提示する。
具体的な実施形態では、本開示は、それを必要とする対象へと、有効量の、本開示の抗体
を投与することにより、がん（例えば、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨髄腫、
卵巣がん、肝がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血
病、ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、
ユーイング肉腫、骨肉腫、有棘細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頸部がん、
膀胱がん、食道がん、神経膠芽腫、軟組織明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎が
ん、および黒色腫）を処置または防止する方法を提示する。いくつかの実施形態では、本
開示は、それを必要とする対象へと、有効量の、本開示の抗体を投与することにより、Ｎ
ｏｔｃｈ３シグナル伝達経路と関連するがんを処置または防止する方法を提示する。
具体的な実施形態では、本開示は、乳がん、肺がん、およびＴ細胞性急性リンパ芽球性
白血病（ＴＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路と関
連するがんを処置する方法を提示する。
Ｎｏｔｃｈ３抗体はまた、呼吸器疾患、骨粗鬆症、骨関節炎、多発性嚢胞腎、糖尿病、
統合失調症、血管疾患、心疾患、非発がん性増殖性疾患、線維症、およびアルツハイマー
病などの神経変性疾患を含むがこれらに限定されない、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の異常
または不全性と関連する他の障害を処置または防止するのに使用することもできる。
Ｎｏｔｃｈ３抗体との組合せ処置に適する薬剤は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路をモジ
ュレートすることが可能な、当技術分野で公知の標準治療剤を含む。Ｎｏｔｃｈ３に適す
る標準治療剤の例は、ＥＧＦＲ阻害剤または白金ベースの化学療法を含むがこれらに限定
されない。Ｎｏｔｃｈ３抗体との組合せ処置に適しうる他の薬剤は、受容体チロシンキナ
ーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、成長／生存シグナル伝達経路、核内ホルモン受容体、ア
ポトーシス経路、細胞周期、および血管新生をモジュレートする薬剤を含むがこれらに限
定されない。
診断的使用
一態様では、本開示は、がんに罹患しているか、またはがんを発症する危険性がある個
体に由来する生体試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）の文脈において、Ｎｏｔｃｈ
３タンパク質および／またはＮｏｔｃｈ３核酸の発現のほか、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質の
機能も決定するための診断アッセイを包摂する。
本開示は、それを必要とする対象へと、有効量の、本開示の抗体を投与することにより
、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路と関連する疾患または障害を同定するための方法を提示
する。具体的な実施形態では、本開示は、それを必要とする対象へと、有効量の、本開示
の抗体を投与することにより、がん（例えば、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨
髄腫、卵巣がん、肝がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄
性白血病、ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白
血病、ユーイング肉腫、骨肉腫、有棘細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頸部
がん、膀胱がん、食道がん、神経膠芽腫、軟組織明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症
、腎がん、および黒色腫）を処置または防止する方法を提示する。いくつかの実施形態で
は、本開示は、それを必要とする対象へと、有効量の、本開示の抗体を投与することによ
り、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路と関連するがんを処置または防止する方法を提示する
。
具体的な実施形態では、本開示は、乳がん、肺がん、およびＴ細胞性急性リンパ芽球性
白血病（ＴＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路と関
連するがんを同定するための方法を提示する。
Ｎｏｔｃｈ３突然変異の検出は、任意の数の方途、例えば、ＤＮＡシークエンシング、
ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲベースの方法、マイクロアレイ解析、サザンブロット法、ノー
ザンブロット法、およびディップスティック解析により行うことができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）を使用して、腫瘍組織
から抽出されたゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに由来する、Ｎｏｔｃｈ４突然変異を増幅およ
び同定することができる。当技術分野では、ＰＣＲが周知であり、Saiki et al., Scienc
e 1988, 239:487；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８
３，２０３号において詳細に記載されている。
遺伝子発現の検出は、例えば、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量、または遺伝子から
転写されたｍＲＮＡの逆転写から作製されたｃＤＮＡの量、または遺伝子によりコードさ
れるポリペプチドもしくはタンパク質の量を検出するステップを含む、任意の適切な方法
を介することが可能である。これらの方法は、試料に対して、試料ベースで実施すること
もでき、ハイスループット解析のために改変して実施することもできる。例えば、Ａｆｆ
ｙｍｅｔｒｉｘ（商標）マイクロアレイチップを使用することによる。
一態様では、遺伝子発現を、そのバイオマーカーについての適切なプローブと特異的に
ハイブリダイズするプローブとのハイブリダイゼーションにより検出および定量化する。
プローブはまた、当技術分野で公知の方法を使用するハイスループットスクリーニングア
ッセイにおける使用のための固体支持体へと接合させることもできる。ＷＯ９７／１０３
６５ならびに米国特許第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、および同第
５，４４５，９３４号は、例えば、本明細書で開示される配列のうちの１または複数を含
有しうる、高密度オリゴヌクレオチドチップの構築について開示している。米国特許第５
，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、および同第５，４４５，９３４号で開
示される方法を使用して、誘導体化されたガラス表面上で本発明のプローブを合成する。
光保護されたヌクレオシドホスホルアミダイトを、ガラス表面へとカップリングさせ、フ
ォトリソグラフィーマスクを介する光分解により選択的に脱保護し、保護された第２のヌ
クレオシドホスホルアミダイトと反応させる。所望のプローブが完成するまで、カップリ
ング／脱保護工程を繰り返す。
代替的に、公知の技法を使用して、遺伝子コピー数、転写、または翻訳のうちのいずれ
か１つを決定することもできる。例えば、ＰＣＲなどの増幅法が有用でありうる。ＰＣＲ
のための全般的な手順は、MacPherson et al., PCR: A Practical Approach, (IRL Press
at Oxford University Press (1991))において教示されている。しかし、各適用におけ
る反応のために使用されるＰＣＲ条件は、経験的に決定される。多数のパラメータが、反
応の成功に影響を及ぼす。それらの中には、アニーリングの温度および時間、伸長時間、
Ｍｇ２＋および／またはＡＴＰの濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、鋳型、およびデオキ
シリボヌクレオチドの相対濃度がある。増幅の後、結果として得られたＤＮＡ断片は、ア
ガロースゲル電気泳動に続く、臭化エチジウム染色および紫外線照射による視覚化を介し
て検出することができる。
一実施形態では、ハイブリダイズさせた核酸は、試料核酸へと接合させた１または複数
の標識を検出することにより検出する。標識は、当業者に周知の多数の手段のうちのいず
れかにより組み込むことができる。しかし、一態様では、試料核酸を調製するときの増幅
ステップにおいて、標識を同時に組み込む。したがって、例えば、標識されたプライマー
または標識されたヌクレオチドを伴うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増
幅産物をもたらすであろう。個別の実施形態では、上記で記載した通り、標識されたヌク
レオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する転写増
幅により、標識を、転写される核酸へと組み込む。
代替的に、標識は、元の核酸試料（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡな
ど）へと直接付加することもでき、増幅が完了した後で、増幅産物へと付加することもで
きる。当業者には、標識を核酸へと接合させる手段が周知であり、例えば、核酸のキナー
ゼ処理の後における、試料核酸を標識（例えば、フルオロフォア）へと接合する核酸リン
カーの接合（ライゲーション）を介する、ニック翻訳または末端標識づけ（例えば、標識
されたＲＮＡによる）を含む。
本開示における使用に適する、検出可能な標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化
学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段により検出可能
な任意の組成物を含む。本発明において有用な標識は、標識ストレプトアビジンコンジュ
ゲートによる染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）
）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパ
ク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、
酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳ
Ａにおいて一般に使用される他の酵素）、および金コロイドまたは有色ガラスもしくは有
色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）によるビー
ズなどの比色標識を含む。このような標識の使用について教示する特許は、米国特許第３
，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，
９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号；および同第
４，３６６，２４１号を含む。
標識の検出は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真用フィ
ルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは
、発光した光を検出する光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、酵素に
基質を与え、酵素の基質に対する作用により生成する反応生成物を検出することにより検
出することが典型的であり、比色標識は、有色の標識を単に視覚化することにより検出す
る。
ＷＯ９７／１０３６５において記載されている標識など、検出可能な標識を、ハイブリ
ダイゼーションの前に、またはハイブリダイゼーションの後で、標的（試料）核酸へと付
加することができる。これらの検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前に、標的
（試料）核酸へと直接接合することもでき、標的（試料）核酸へと組み込むこともできる
。これに対し、「間接標識」は、ハイブリダイゼーションの後で、ハイブリッド体の二重
鎖へと接合する。一般に、間接標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸へと接合
させた、結合性部分へと接合させる。例えば、標的核酸は、ハイブリダイゼーションの前
にビオチニル化することができる。ハイブリダイゼーション後、アビジンコンジュゲート
フルオロフォアは、ビオチンを保有するハイブリッド体の二重鎖に結合し、容易に検出さ
れる標識をもたらす。核酸を標識し、標識された、ハイブリダイズさせた核酸を検出する
方法の詳述な総説については、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevi
er, N.Y. (1993)を参照されたい。
Ｎｏｔｃｈ３突然変異は、タンパク質へと翻訳されると、特異的抗体により検出するこ
とができる。Ｎｏｔｃｈ３突然変異の発現レベルはまた、Ｎｏｔｃｈ３突然変異体のタン
パク質発現またはタンパク質産物を検討することにより決定することもできる。タンパク
質レベルの決定は、患者から得られた試料中のバイオマーカーのポリペプチドを選択的に
認識し、これに選択的に結合する抗体の間で生じる、任意の免疫特異的結合の量を測定し
、これを、対照試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの免疫特異的結合の量と比較す
ることを伴う。Ｎｏｔｃｈ３のタンパク質発現の量は、対照の発現と比較して増大する場
合もあり、低減される場合もある。
競合アッセイなどの診断アッセイは、被験試料解析物と、共通の結合パートナー上の限
定された数の結合性部位について競合する、標識された類似体（「トレーサー」）の能力
に依拠する。結合パートナーは一般に、競合の前に、または競合の後で不溶化させ、次い
で、結合パートナーに結合したトレーサーおよび解析物を、結合しなかったトレーサーお
よび解析物から分離する。この分離は、デカントすること（結合パートナーをあらかじめ
不溶化させる場合）により達成することもでき、遠心分離すること（結合パートナーを競
合反応の後で沈殿させる場合）により達成することもできる。被験試料解析物の量は、マ
ーカー物質の量により測定される通り、結合したトレーサーの量に反比例する。被験試料
中に存在する解析物の量を定量的に決定するために、公知量の解析物による用量反応曲線
を作成し、試験結果と比較する。酵素を、検出可能なマーカーとして使用する場合、これ
らのアッセイをＥＬＩＳＡシステムと呼ぶ。この形態のアッセイでは、抗体とＮｏｔｃｈ
３抗体との競合的結合により、結合したＮｏｔｃｈ３タンパク質、好ましくは本開示のＮ
ｏｔｃｈ３エピトープが結果としてもたらされ、血清試料中の抗体、最高度に特定すれば
、血清試料中の中和抗体の尺度となる。
アッセイの著明な利点は、測定が中和抗体（すなわち、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質、具体
的に、Ｎｏｔｃｈ３エピトープの結合に干渉する中和抗体）から直接なされることである
。特に、ＥＬＩＳＡ試験の形態におけるこのようなアッセイは、臨床環境および日常的な
血液スクリーニングにおいて重要な適用を有する。
バイオマーカーのアッセイ
本開示の別の態様は、個体におけるＮｏｔｃｈ３核酸の発現またはＮｏｔｃｈ３タンパ
ク質の活性を決定し、これにより、その個体に適する治療剤または予防剤を選択するため
の方法（本明細書では「薬理ゲノム学」と称する）を提示する。薬理ゲノム学は、個体の
治療的処置または予防的処置のための薬剤（例えば、低分子薬物または抗体もしくはそれ
らの断片などの生物学的物質）の、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に応答する個体
の能力を決定する、検討される個体の遺伝子型）に基づく選択を可能とする。
本開示のさらに別の態様は、臨床試験において、薬剤（例えば、低分子薬物または抗体
もしくはそれらの断片などの生物学的物質）の、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質の発現または活
性に対する影響をモニタリングすることに関する。
患者をＮｏｔｃｈ３突然変異についてアッセイし、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤（例えば、低分
子阻害剤またはＮｏｔｃｈ３抗体もしくはその断片などの生物学的薬剤）に対して感受性
であることが予測されたら、任意のＮｏｔｃｈ３阻害剤の患者への投与を、処置コースを
通して、持続的に行うこともでき、間欠的に行うこともできる。薬剤の適切な剤形および
投与法は、Ｎｏｔｃｈ３突然変異体の存在および発現レベルに基づき、経験的に調整する
ことができる。
患者が、Ｎｏｔｃｈ３処置への感受性を維持しているのかどうかを決定するために、Ｎ
ｏｔｃｈ３突然変異について、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤を投与した後でアッセイすることがで
きる。加えて、Ｎｏｔｃｈ３突然変異について、単回のＮｏｔｃｈ３阻害剤投与の後の複
数の時点においてもアッセイすることができる。例えば、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤の初期ボー
ラスを投与し、Ｎｏｔｃｈ３突然変異について、初回の処置の、１時間後、２時間後、３
時間後、４時間後、８時間後、１６時間後、２４時間後、４８時間後、３日後、１週間後
、または１カ月後もしくは数カ月後においてアッセイすることができる。
患者に、複数回にわたるＮｏｔｃｈ３阻害剤の投与を施し、次いで、異なる時点におい
て、Ｎｏｔｃｈ３突然変異についてアッセイすることもできよう。例えば、処置コースは
、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤の初回投与、指定された時間後における２回目の投与、さらに２回
目の投与の数時間後における３回目の投与の実施を要請する場合がある。Ｎｏｔｃｈ３突
然変異について、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤の各回の投与を実施した１時間後、２時間後、３時
間後、４時間後、８時間後、１６時間後、２４時間後、４８時間後、３日後、１週間後、
または１カ月後もしくは数カ月後においてアッセイすることができる。
任意のＮｏｔｃｈ３阻害剤（例えば、抗体またはその断片）の活性を評価するためのキ
ットを作製することができる。例えば、Ｎｏｔｃｈ３突然変異のためのＰＣＲまたはマイ
クロアレイハイブリダイゼーションのための核酸プライマーを含むキットを、Ｎｏｔｃｈ
３突然変異体の存在を評価するために使用することができる。代替的に、キットは、表２
に列挙されたＮｏｔｃｈ３突然変異のための抗体またはそれらの断片を備えることもでき
る。
Ｎｏｔｃｈ３突然変異を使用して、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤についてスクリーニングするこ
とが可能である。この方法は、表２によるＮｏｔｃｈ３突然変異を含有する細胞を用意す
るステップと、細胞を、候補Ｎｏｔｃｈ３阻害剤（例えば、低分子または抗体もしくはそ
の断片などの生物学的薬剤）と接触させるステップと、処置された細胞のＩＣ５０を、公
知のＮｏｔｃｈ３阻害剤と比較するステップとを含む。
医薬組成物
Ｎｏｔｃｈ３抗体またはその断片を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するには、
Ｎｏｔｃｈ３抗体またはその断片を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。
組成物は、がん（乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝がん、胃
がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、マ
ントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ユーイング肉腫、慢性骨髄性白血病、骨肉
腫、有棘細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、
神経膠芽腫、軟組織明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎がん、および黒色腫）を
処置またはを防止するのに適する、１または複数の他の治療剤をさらに含有しうる。
治療剤および診断剤の処方物は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローショ
ン、または懸濁液の形態における、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤
と混合することにより調製することができる（例えば、Hardman et al,. (2001) Goodman
and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York,
N.Y.；Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott
, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.；Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutic
al Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY；Lieberman, et al. (e
ds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY；Lieberman,
et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekke
r, NY；Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker,
Inc., New York, N.Y.を参照されたい）。
治療剤のための投与レジメンの選択は、血清中または組織中の実体の代謝回転率、症状
のレベル、実体の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性を含
む、複数の因子に依存する。ある種の実施形態では、投与レジメンにより、許容可能な副
作用のレベルと符合する限りにおいて、患者へと送達される治療剤の量を最大化する。し
たがって、送達される生物学的薬剤の量は、部分的に、特定の実体および処置される状態
の重症度に依存する。抗体、サイトカイン、および低分子の適切な用量の選択における指
針は、入手可能である（例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientif
ic Pub. Ltd, Oxfordshire, UK；Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytoki
nes and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.；Bach (ed.) (1993) Monoclonal A
ntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N
.Y.；Baert et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608；Milgrom et al., (1999)
New Engl. J. Med. 341:1966-1973；Slamon et al., (2001) New Engl. J. Med. 344:783
-792；Beniaminovitz et al., (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619；Ghosh et al.,
(2003) New Engl. J. Med. 348:24-32；Lipsky et al., (2000) New Engl. J. Med. 343:
1594-1602を参照されたい）。
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響を及ぼすことが当技術分野で公知であるかも
しくは疑われるか、または処置に影響を及ぼすことが予測されるパラメータまたは因子を
使用して、主治医が行う。一般に、投与は、いくぶんか最適用量未満の量で始め、以後、
任意の負の副作用と比べて、所望の効果または最適の効果が達成されるまで、小さな増分
で増大させる。重要な診断的尺度は、症状、例えば、炎症の症状、または産生される炎症
性サイトカインのレベルについての尺度を含む。
本開示の医薬組成物中の、有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性となら
ずに、特定の患者、組成物、および投与方式について所望の治療的応答を達成するのに有
効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援
用される本開示の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、
投与経路、投与回数、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される
特定の組成物と組み合わせて使用される、他の薬物、化合物、および／または材料を含む
、様々な薬物動態因子、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康、およ
び既往歴、ならびに医療技術分野で公知のその他の因子に依存するであろう。
抗体またはそれらの断片を含む組成物は、連続注入により施すこともでき、例えば、１
日おき、１週間おき、または毎週１〜７回の投与により施すこともできる。投与は、静脈
内投与、皮下投与、局所投与、経口投与、鼻腔内投与、直腸内投与、筋内投与、脳内投与
、または吸入により施すことができる。具体的な投与プロトコールは、著明な所望されな
い副作用を回避する、最大用量または最高投与頻度を伴う投与プロトコールである。毎週
の総用量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．０５μｇ、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、
少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少
なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ
、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ
、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇでありうる（例えば、Yang et al., (2003) New Engl
. J. Med. 349:427-434；Herold et al., (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698；Li
u et al., (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456；Portielji et al., (200
3) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144を参照されたい）。抗体またはそれらの断
片の所望の用量は、体重１ｋｇ当たりのモルベースの抗体またはポリペプチドの用量とほ
ぼ同じである。抗体またはそれらの断片の所望の血漿中濃度は、ほぼ、体重１ｋｇ当たり
のモルベースの濃度である。用量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なく
とも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なく
とも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なく
とも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なく
とも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇ
でありうる。対象へと投与される投与回数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、または１２回以上でありうる。
本開示の抗体またはそれらの断片の、患者へと投与される投与量は、患者の体重１ｋｇ
当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇでありうる。投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり０
．０００１ｍｇ〜２０ｍｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間、０．０
００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの間、０
．０００１〜１ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇの間、０
．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ
／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．
００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０
ｍｇ／ｋｇでありうる。
抗体またはそれらの断片の投与量は、ｍｇ／ｋｇ単位の投与される用量を乗じた、キロ
グラム（ｋｇ：kilogram）単位の患者の体重を使用して計算することができる。抗体また
はそれらの断片の投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり１５０μｇ以下、１２５μｇ／ｋｇ
以下、１００μｇ／ｋｇ以下、９５μｇ／ｋｇ以下、９０μｇ／ｋｇ以下、８５μｇ／ｋ
ｇ以下、８０μｇ／ｋｇ以下、７５μｇ／ｋｇ以下、７０μｇ／ｋｇ以下、６５μｇ／ｋ
ｇ以下、６０μｇ／ｋｇ以下、５５μｇ／ｋｇ以下、５０μｇ／ｋｇ以下、４５μｇ／ｋ
ｇ以下、４０μｇ／ｋｇ以下、３５μｇ／ｋｇ以下、３０μｇ／ｋｇ以下、２５μｇ／ｋ
ｇ以下、２０μｇ／ｋｇ以下、１５μｇ／ｋｇ以下、１０μｇ／ｋｇ以下、５μｇ／ｋｇ
以下、２．５μｇ／ｋｇ以下、２μｇ／ｋｇ以下、１．５μｇ／ｋｇ以下、１μｇ／ｋｇ
以下、０．５μｇ／ｋｇ以下、または０．５μｇ／ｋｇ以下でありうる。
抗体またはそれらの断片の単位用量は、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ
、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍｇ〜７
ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５〜
１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５〜８ｍｇ、０．２５ｍｇ
〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ
〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７ｍｇ、
１ｍｇ〜５ｍｇ、または１ｍｇ〜２．５ｍｇでありうる。
抗体またはそれらの断片の投与量は、対象において、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少
なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なく
とも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１
５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０
μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１
５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくと
も２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少な
くとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、
少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清中力価を達成し
うる。代替的に、抗体またはそれらの断片の投与量は、対象において、少なくとも０．１
μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ
／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ
、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、
少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ
、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／
ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μ
ｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５
０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清
中力価を達成しうる。
抗体またはそれらの断片の投与は、繰り返すことができ、投与は、少なくとも１日間、
２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２カ月間、７５日
間、３カ月間、または少なくとも６カ月間隔てることができる。
特定の患者にとっての有効量は、処置される状態、患者の全般的健康、投与経路および
投与用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化しうる（例えば、Maynard et
al., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Bo
ca Raton, Fla.；Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Pub
l., London, UKを参照されたい）。
投与経路は、例えば、局所適用または皮内適用を介する投与の場合もあり、静脈内注射
または静脈内注入、腹腔内注射または腹腔内注入、脳内注射または脳内注入、筋内注射ま
たは筋内注入、眼内注射または眼内注入、動脈内注射または動脈内注入、脳脊髄内注射ま
たは脳脊髄内注入、病変内注射または病変内注入を介する投与の場合もあり、持続放出系
またはインプラントを介する投与の場合もある（例えば、Sidman et al., (1983) Biopol
ymers 22:547-556；Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277；Lange
r (1982) Chem. Tech. 12:98-105；Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 82:3688-3692；Hwang et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034；米
国特許第６，３５０，４６６号、および同第６，３１６，０２４号を参照されたい）。必
要な場合、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるリドカインなどの
局所麻酔剤も含みうる。加えて、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアゾール化剤を
伴う処方物を使用することにより、肺内投与もまた援用することができる。例えば、それ
らの各々が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０
１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３
４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０
，５４０号、および同第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２
４４号、同第ＷＯ９７／３２５７２号、同第ＷＯ９７／４４０１３号、同第ＷＯ９８／３
１３４６号、および同第ＷＯ９９／６６９０３号を参照されたい。
本開示の組成物はまた、当技術分野で公知の様々な方法のうちの１または複数を使用す
る、１または複数の投与経路を介して投与することもできる。当業者により察知される通
り、投与経路および／または投与方式は、所望の結果に応じて変化するであろう。抗体ま
たはそれらの断片のために選択される投与経路は、例えば、注射または注入による、静脈
内投与経路、筋内投与経路、皮内投与経路、腹腔内投与経路、皮下投与経路、脊髄内投与
経路、または他の非経口投与経路を含む。非経口投与は、通例注射による、腸内投与およ
び局所投与以外の投与方式を表す場合があり、限定なしに述べると、静脈内注射および静
脈内注入、筋内注射および筋内注入、動脈内注射および動脈内注入、髄腔内注射および髄
腔内注入、関節包内注射および関節包内注入、眼窩内注射および眼窩内注入、心内注射お
よび心内注入、皮内注射および皮内注入、腹腔内注射および腹腔内注入、経気管注射およ
び経気管注入、皮下注射および皮下注入、表皮下注射および表皮下注入、関節内注射およ
び関節内注入、被膜下注射および被膜下注入、くも膜下注射およびくも膜下注入、脊髄内
注射および脊髄内注入、硬膜外注射および硬膜外注入、ならびに胸骨下注射および胸骨下
注入を含む。代替的に、組成物は、局所投与経路、表皮投与経路、または経粘膜投与経路
、例えば、鼻腔内投与経路、経口投与経路、膣内投与経路、直腸内投与経路、舌下投与経
路、または局所投与経路など、非経口経路以外の経路を介して投与することもできる。一
実施形態では、抗体またはそれらの断片を、注入により投与する。別の実施形態では、多
特異性エピトープ結合性タンパク質を皮下投与する。
抗体またはそれらの断片を、制御放出系または持続放出系で投与する場合は、ポンプを
使用して、制御放出または持続放出を達成することができる（Langer, supra；Sefton, (
1987) CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20；Buchwald et al., (1980), Surgery 88:507
；Saudek et al., (1989) N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい）。ポリマー材料を
使用して、治療の制御放出または持続放出を達成することもできる（例えば、Medical Ap
plications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton,
Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performan
ce, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, (1983) J.
Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい；また、Levy et al., (19
85) Science 228:190；During et al., (1989) Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., (
1989) J. Neurosurg. 7 1:105；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１
６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米
国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号；およびＰＣＴ公
開第ＷＯ９９／２０２５３号も参照されたい）。持続放出処方物中で使用されるポリマー
の例は、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）
、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、
ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニル
アルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬ
Ａ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルを
含むがこれらに限定されない。一実施形態では、持続放出処方物中で使用されるポリマー
は不活性であり、濾過可能な不純物を含まず、保管において安定的であり、無菌であり、
生体分解性である。制御放出系または持続放出系は、予防標的または治療標的に近接させ
て配置することができ、したがって、全身用量の一部を要請するに過ぎない（例えば、Go
odson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138
(1984)を参照されたい）。
制御放出系は、Langer, (1990), Science 249:1527-1533による総説において論じられ
ている。当業者に公知の任意の技法を使用して、１または複数の本開示の抗体またはそれ
らの断片を含む持続放出処方物を作製することができる。例えば、それらの各々が参照に
よりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５２６，９３８号、
ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２０６９８号、Ning et
al., (1996), Radiotherapy & Oncology 39:179-189；Song et al., (1995) PDA Journal
of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleek et al., (1997) Pro. In
t'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLam et al., (1997) Pro
c. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。
抗体またはそれらの断片を局所投与する場合、それらは、軟膏、クリーム、経皮パッチ
、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液、エマルジョンの形態、
または当業者に周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharma
ceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mac
k Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。スプレー不可能な局所剤形では、局所
適用に適合性であり、場合によって、水を超える動粘性を有する、担体または１もしくは
複数の賦形剤を含む、粘性形態〜半固体形態または固体形態を援用することが典型的であ
る。適切な処方物は、限定なしに述べると、所望の場合、滅菌されるかまたは例えば、浸
透圧などの多様な特性に影響を与えるための補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、保湿剤
（wetting agent）、緩衝剤、または塩）と混合された、溶液、懸濁液、エマルジョン、
クリーム、軟膏（ointment）、粉末、塗布剤、軟膏（salve）などを含む。他の適切な局
所剤形は、場合によって、固体または液体の不活性担体と組み合わせた有効成分を、高圧
揮発性物質（例えば、フレオンなどの推進剤ガス）との混合物中、またはスクイーズボト
ル内にパッケージングした、スプレー可能なエアゾール調製物を含む。また所望の場合、
保湿剤（moisturizerまたはhumectant）も、医薬組成物および剤形へと添加することがで
きる。当技術分野では、このようなさらなる成分の例が周知である。
抗体またはそれらの断片を含む組成物を、鼻腔内投与する場合は、組成物を、エアゾー
ル形態、スプレー、ミスト、または液滴の形態で製剤化することができる。特に、本開示
に従う使用のための予防剤または治療剤は、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロ
メタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、また
は他の適切なガス）の使用を伴う、高圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーに
よる提示形態で送達すると好都合でありうる。高圧エアゾールの場合、投与単位は、計量
された量を送達するバルブを装備することにより決定することができる。吸入器（inhale
rまたはinsufflator）における使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラ
チンからなる）であって、化合物の粉末ミックスおよびラクトースまたはデンプンなど、
適切な粉末ベースを含有する、カプセルおよびカートリッジも製剤化することができる。
当技術分野では、第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗
生剤、または放射線との共投与または共処置ための方法が公知である（例えば、Hardman
et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeu
tics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.；Poole and Peterson (eds.) (200
1) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott,
Williams & Wilkins, Phila., Pa.；Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemothe
rapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい）
。有効量の治療剤は、症状を、少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０
％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％減殺しうる。
抗体またはそれらの断片と組み合わせて投与されうる、さらなる治療（例えば、予防剤
または治療剤）は、本開示の抗体またはそれらの断片から、５分間未満の間隔を置いて、
３０分間未満の間隔を置いて、１時間の間隔を置いて、約１時間の間隔を置いて、約１〜
約２時間の間隔を置いて、約２時間〜約３時間の間隔を置いて、約３時間〜約４時間の間
隔を置いて、約４時間〜約５時間の間隔を置いて、約５時間〜約６時間の間隔を置いて、
約６時間〜約７時間の間隔を置いて、約７時間〜約８時間の間隔を置いて、約８時間〜約
９時間の間隔を置いて、約９時間〜約１０時間の間隔を置いて、約１０時間〜約１１時間
の間隔を置いて、約１１時間〜約１２時間の間隔を置いて、約１２時間〜１８時間の間隔
を置いて、１８時間〜２４時間の間隔を置いて、２４時間〜３６時間の間隔を置いて、３
６時間〜４８時間の間隔を置いて、４８時間〜５２時間の間隔を置いて、５２時間〜６０
時間の間隔を置いて、６０時間〜７２時間の間隔を置いて、７２時間〜８４時間の間隔を
置いて、８４時間〜９６時間の間隔を置いて、または９６時間〜１２０時間の間隔を置い
て投与することができる。２つ以上の治療を、１回の同じ患者来院内に投与することもで
きる。
抗体またはそれらの断片および他の治療は、周期的に投与することができる。サイクリ
ング療法は、ある期間にわたる第１の治療（例えば、第１の予防剤または治療剤）の投与
を伴い、これに続き、ある期間にわたる第２の治療（例えば、第２の予防剤または治療剤
）の投与を伴い、これに続き、任意選択で、ある期間にわたる第３の治療（例えば、予防
剤または治療剤）の投与などを伴い、治療のうちの１つに対する耐性の発生を低減し、治
療のうちの１つの副作用を回避もしくは低減し、かつ／または治療の有効性を改善するた
めに、この逐次的投与、すなわち、サイクルを繰り返す。
ある種の実施形態では、抗体またはそれらの断片は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適正な分
布を確保するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ：blood-brai
n barrier）は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。治療用化合物がＢＢＢを越え
ることを確保するために（所望の場合）、例えば、リポソームにより製剤化することがで
きる。リポソームの製造法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第
５，３７４，５４８号および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、
特異的な細胞または臓器へと選択的に輸送され、これにより、薬物送達のターゲティング
を増強する、１または複数の部分を含みうる（例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharma
col. 29:685を参照されたい）。例示的なターゲティング部分は、葉酸またはビオチン（
例えば、Ｌｏｗらによる、米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシ
ド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloe
man et al., (1995) FEBS Lett. 357:140；Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents C
hemother. 39:180）；界面活性剤であるプロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1995) A
m. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9
090）を含み、また、K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123；J. J.
Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
本開示は、抗体またはそれらの断片を含む医薬組成物を、単独で、または他の治療と組
み合わせて、それを必要とする対象へと投与するためのプロトコールを提示する。本開示
の組合せ療法の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、対象へと、共時的に投与するこ
ともでき、逐次的に投与することもできる。本開示の組合せ療法の治療（例えば、予防剤
または治療剤）はまた、周期的に投与することもできる。サイクリング療法は、ある期間
にわたる第１の治療（例えば、第１の予防剤または治療剤）の投与を伴い、これに続き、
ある期間にわたる第２の治療（例えば、第２の予防剤または治療剤）の投与を伴い、治療
（例えば、薬剤）のうちの１つに対する耐性の発生を低減し、治療（例えば、薬剤）のう
ちの１つの副作用を回避もしくは低減し、かつ／または治療の有効性を改善するために、
この逐次的投与、すなわち、サイクルを繰り返す。
組合せ療法の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、対象へと、共時的に投与するこ
とができる。「共時的に」という用語は、まさに同じ時点における治療（例えば、予防剤
または治療剤）の投与に限定されず、むしろ、抗体が、他の治療と併せて作用して、それ
らを他の形で投与した場合より増大させた利益をもたらすように、抗体またはそれらの断
片を含む医薬組成物を、逐次的に、かつ、ある間隔以内に対象へと投与することも意図さ
れる。例えば、各治療は、対象へと、同時に投与することもでき、異なる時点において、
任意の順序で、逐次的に投与することもできるが、同時に投与しない場合は、所望の治療
効果または予防効果をもたらすように、時間的に十分に近接させて投与するものとする。
各治療は、対象へと、個別に、任意の適切な形態で、かつ、任意の適する経路を介して投
与することができる。多様な実施形態では、治療（例えば、予防剤または治療剤）を、１
５分間未満、３０分間未満、１時間未満の間隔を置いて、約１時間の間隔を置いて、約１
時間〜約２時間の間隔を置いて、約２時間〜約３時間の間隔を置いて、約３時間〜約４時
間の間隔を置いて、約４時間〜約５時間の間隔を置いて、約５時間〜約６時間の間隔を置
いて、約６時間〜約７時間の間隔を置いて、約７時間〜約８時間の間隔を置いて、約８時
間〜約９時間の間隔を置いて、約９時間〜約１０時間の間隔を置いて、約１０時間〜約１
１時間の間隔を置いて、約１１時間〜約１２時間の間隔を置いて、２４時間の間隔を置い
て、４８時間の間隔を置いて、７２時間の間隔を置いて、または１週間の間隔を置いて、
対象へと投与する。他の実施形態では、２つ以上の治療（例えば、予防剤または治療剤）
を、同じ患者来院内に投与する。
組合せ療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物により、対象へと投与することが
できる。代替的に、組合せ療法の予防剤または治療剤は、個別の医薬組成物により、対象
へと、共時的に投与することができる。予防剤または治療剤は、対象へと、同じ投与経路
により投与することもでき、異なる投与経路により投与することもできる。
本開示について十分に記載してきたが、以下の実施例および特許請求の範囲によりこれ
をさらに例示するが、これらは、例示的なものであり、さらに限定的であることを意図す
るものではない。
ＩＣＤ３アッセイおよびその使用
一態様では、本開示は、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を検出するためのアッセイに関する
。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、一連のタンパク質分解性切断により活性化される。ガンマ
セクレターゼ複合体は、核へと移行して、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の転写を活性化させる、
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を最終的に放出する、Ｎｏｔｃｈ受容体の最終的な
切断を媒介する。ネオエピトープ抗体（検出抗体）を作り出して、ヒトＮｏｔｃｈ３のア
ミノ酸であるＧｌｙ１６６１とＶａｌ１６６２との間で切断される場合に限る、Ｎｏｔｃ
ｈ３ ＩＣＤ（ＩＣＤ３：Notch3 ICD）のガンマセクレターゼによる切断形態を検出した
。
アッセイは、Ｎｏｔｃｈ３の、ガンマセクレターゼにより切断されたドメイン（ＩＣＤ
３）内のネオエピトープである、ＶＭＶＡＲＲＫ（配列番号２４３）を検出する検出抗体
の使用を含む。ＩＣＤ３は、野生型Ｎｏｔｃｈ３または突然変異体Ｎｏｔｃｈ３の位置Ｇ
ｌｙ１６６１〜Ｖａｌ１６６２における切断により作製することができる。
本明細書で開示されるアッセイによるＩＣＤ３の検出は、Ｎｏｔｃｈ３シグナルの活性
化および伝達を指し示す。Ｎｏｔｃｈ３シグナルの活性化および伝達を防止する抗体また
はその断片は、ＩＣＤ３の産生を防止し、これにより、その中に含有されるネオエピトー
プの、検出抗体による検出も防止する。一実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎｏｔ
ｃｈ３を自己阻害コンフォメーションで保持し、これにより、Ｓ２切断部位およびＳ３切
断部位のプロテアーゼへの曝露を不可能とし、これにより、検出抗体により認識されるネ
オエピトープを含むＩＣＤ３の形成を防止する。
一態様では、本開示は、がんに罹患しているか、またはがんを発症する危険性がある個
体に由来する生体試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）の文脈において、Ｎｏｔｃｈ
３タンパク質および／またはＮｏｔｃｈ３核酸の発現のほか、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質の
機能も決定するための診断アッセイを包摂する。
ＩＣＤ３アッセイを使用して、活性化されたＮｏｔｃｈ３シグナル伝達の存在を検出す
ることができる。Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の活性化は、Ｎｏｔｃｈ３突然変異または高
度なＮｏｔｃｈ３発現／遺伝子の増幅により達成することができる。生体試料を調製し、
ＩＣＤ３タンパク質の存在または非存在について解析することができる。Ｎｏｔｃｈ３
ＩＣＤが存在する場合、ＮＲＲドメインは、ＮＲＲの自己阻害コンフォメーションを変化
させ、これにより、ＨＤドメインをプロテアーゼによる切断へと露出させることと、本開
示の抗体を検出することにより検出しうる、ＩＣＤ３の産生とを結果としてもたらす突然
変異を含有しうる。これらの試験の結果および解釈に関する情報は、被験個体との通信の
ために、医療ケア従事者へと返還することができる。このような診断法は、診断検査室で
実施することもでき、代替的に、診断キットを製造し、医療ケア従事者へと販売すること
もでき、自己診断用に、個人の個体へと販売することもできる。
本開示の別の態様は、個体におけるＮｏｔｃｈ３核酸の発現またはＮｏｔｃｈ３タンパ
ク質の活性を決定し、これにより、その個体に適する治療剤または予防剤を選択するため
の方法（本明細書では「薬理ゲノム学」と称する）を提示する。薬理ゲノム学は、個体の
治療的処置または予防的処置のための薬剤（例えば、低分子薬物または抗体もしくはそれ
らの断片などの生物学的物質）の、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に応答する個体
の能力を決定する、検討される個体の遺伝子型）に基づく選択を可能とする。
本開示のさらに別の態様は、臨床試験において、薬剤（例えば、低分子薬物または抗体
もしくはそれらの断片などの生物学的物質）の、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質の発現または活
性に対する影響をモニタリングすることに関する。
〔実施例１〕
カニクイザルＮｏｔｃｈ３のクローニング
カニクイザルＮｏｔｃｈ３の配列は公衆のデータベースで利用可能ではなかったので、
それを以下のようにクローニングした。
カニクイザル全ＲＮＡ
全ての全ＲＮＡは、Ｚｙａｇｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｚｙａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ
．ｐｈｐ、サンディエゴ、ＣＡ９２１２１）から購入した。全ＲＮＡは、カニクイザルの
種々の組織（脳、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、膵臓、脾臓、皮膚、胃、精巣、胸腺、甲状腺
、骨髄）から抽出した。起源および個々のサルの参照はＺｙａｇｅｎによって特定されな
かった。全ＲＮＡは、マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡの迅速な単離を可能にするグアニジ
ンイソチオシアネート−フェノール：クロロホルム抽出法を使用して組織／細胞から通常
のように抽出した。ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅで処置して残留ＤＮＡを除去し
、正確に定量し、−８０℃に保存した。インタクトなリボソームＲＮＡによって示される
ように、各ＲＮＡ試料の完全性を変性アガロースゲル電気泳動によって検証した。ＲＮＡ
の純度を分光光度計（Ａ２６０／Ａ２８０：１．９〜２．１）によって評価した。ＲＮＡ
は、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ＳＩヌクレアーゼアッセ
イ、ＲＴ−ＰＣＲ／Ｑ−ＰＣＲ分析、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）およびライブ
ラリー構築のためのｍＲＮＡの精製に理想的であった。全ＲＮＡは、１ｍｇ／ｍｌの濃度
にてＲＮａｓｅフリー水、１ｍＭクエン酸ナトリウムまたは０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に提
供され、ドライアイス上で輸送された。全ての全ＲＮＡを受け取った後、試料を−８０℃
にて保存する。
ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写およびＰＣＲ増幅
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ
．１１１４６−０１６）およびオリゴｄＴを使用して全ての全ＲＮＡを逆転写した。２μ
ｇの全ＲＮＡを概して各ｃＤＮＡプールのために使用し、２０μｌ中で溶出した。１μｌ
プライマー（５０μＭオリゴ（ｄＴ２０）、２μｇ（組織）。全ＲＮＡおよび２μｌの１
０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物を合わせ、体積をＤＥＰＣ処置した水で１２μｌに調製した。６
５℃にて５分間のインキュベーション後、４μｌの５×ｃＤＮＡ合成緩衝液、１μｌの０
．１Ｍ ＤＴＴ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＤＥＰ
Ｃ処置した水および１μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ（１５単位／μｌ）
のマスター混合物を調製し、全体積８μｌを氷上の各々の以前の反応チューブに加えた。
全ＲＮＡ試料の逆転写相は５５℃にて９０分で完了した。次いでこの反応を、８５℃にて
５分間、全反応物をインキュベートすることによって停止させた。最後に、１μｌのＲＮ
ａｓｅ Ｈを加え、試料を３７℃にて２０分間インキュベートした。全てのポリメラーゼ
連鎖反応のための原料物質としてｃＤＮＡ反応物を−２０℃にて保存した。
２μｌのｃＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅を実施した。プライマーをＵＴＲ領域およびコ
ード配列において設計した。ＰＣＲ産物を直接、ゲル抽出し、直接シークエンシングによ
って分析した。
カニクイザルＮｏｔｃｈ３遺伝子フィッシング（gene fishing）のためのＰＣＲプライマ
ー
非ヒト霊長類、例えば、ゴリラ、オランウータン、アカゲザルの標的配列を、プライマ
ー設計および特異性試験のためのヒト配列と並べた。標的配列のマウスおよびラット配列
もまた、必要とされ得る。アラインメントのための標的配列は、ＮＣＢＩ、ｅＥｎｓｅｍ
ｂｌまたはＵｎｉＰｒｏｔのようなデータベースから抽出できる。

ＰＣＲおよびゲル精製
ｃＤＮＡのＰＣＲは、ＫＡＰＡ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ（２×）を使用してＣｏｒｂｅｔｔ（登録商標）Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ６０００
（現在ＱＩＡＧＥＮ（登録商標） Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ）ＲＴ−ＰＣＲによって達
成した。ＫＡＰＡ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍ
ｉｘ（２×）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ、抗体媒介ホットスタートを含有する使用準備済のカク
テル、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光色素、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰならびにｑ
ＰＣＲにおけるＤＮＡの増幅および検出のための安定剤（ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ
）。ＰＣＲのために、１０μｌのＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、０．４μｌのフォワー
ドプライマー（１０μＭ）、０．４μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、２μｌの鋳
型および７．２μｌのＨ２Ｏ ＲＮａｓｅフリーからなる２０μｌの体積の反応混合物を
、各々０．１ｍｌのＰＣＲチューブに調製し、そのチューブをキャップで閉じた。ＰＣＲ
サイクルに先立って、５分間９５℃の温度を保持し、サイクルステップを４５回反復した
。変性は、反応物を１０秒間９５℃の温度に加熱することからなった。そのステップの後
、温度を３０秒間６０℃に低下させ、一本鎖ＤＮＡ鋳型に対するプライマーのアニーリン
グを可能にした。３０秒間７２℃に温度を増加させることによって伸長を得、サイクルス
テップを反復した。次いで全てのＰＣＲ産物を１×ＴＢＥアガロースゲル、１％ＰＣＲ断
片サイズに載せ、ゲルを抽出し、エチジウムブロマイド（３×１０−３ｍｇ／ｍｌ）で染
色した。
次いで標的ＤＮＡ断片のゲル抽出をその後実施した。この場合、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−Ｎ
ＡＧＥＬ（登録商標）によるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）８／９６Ｅｘｔｒａｃｔ
ＩＩと組み合わせたＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔプロトコールに基づいた手順を使用してＤＮＡ断片を精製した。ＰＣＲ ＤＮＡ断片
を抽出するために、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）の４００μｌのＱＧ可溶化緩衝液を９６ウ
ェルプレート中の各々のゲルバンドの部分に加えた。ゲルバンドを溶解するために、約１
５分間、ディープウェルプレートを温水浴（５０〜６０℃）に入れた。溶液をＮｕｃｌｅ
ｏＳｐｉｎ（登録商標）８／９６Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩフィルタープレート上にピペット
で取る前に、溶液を注意深くボルテックスした。ＤＮＡバンドが４００ｂｐより短かった
場合、さらに１００μｌのイソプロパノールを使用した。溶液を２回濾過した。このステ
ップの後、カラムを６５０μｌの洗浄緩衝液ＮＴ３で２回洗浄し、次いでそれをＲＮａｓ
ｅフリー水によるＤＮＡ断片の溶出前に２０分間真空下に置くことによって乾燥させた。
そのために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）８／９６Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩフィルタ
ープレートの下の回収容器を溶出プレート「Ｕ底」と置き換え、１００μｌのＲＮａｓｅ
フリー水をそれと接触させずに膜の中央に直接加えた。ＤＮＡの抽出を真空濾過の使用に
よって達成し、溶出液は最終的にシークエンシングのために使用できた。
シークエンシングおよびデータ分析
精製したＤＮＡ断片をシークエンシングするために、８μｌの精製したＰＣＲ試料を、
４μｌのＨ２Ｏ ＲＮａｓｅフリーおよび１μｌのフォワードまたは１μｌのリバースプ
ライマー（１０μＭ）と混合した。ＰＣＲ断片のシークエンシングを、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＡＢＩ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ分析器と組み合わせた
Ｓａｎｇｅｒ法により完了した。ＤＮＡ配列の読み取りはプログラムに重要であり、トリ
ムし、次いで参照、この場合、ヒト遺伝子の配列にアセンブルした。対応する遺伝子の配
列は、ＥｎｓｅｍｂｌｅまたはＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔゲノムデータベースブラウザからＶ
ｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）内に直接コピーした。参照配列の使用により、完全長配
列の識別が可能となった。
カニクイザルＮｏｔｃｈ３配列。３つの天然ＳＮＰを位置：２１３Ｓ／Ｎ；７１９Ｅ／
Ｄ；および２０５３Ｖ／Ａにて識別した。


〔実施例２〕
Ｎｏｔｃｈ３抗体のスクリーニングおよびタンパク質／細胞結合の評価
ヒトＮｏｔｃｈ３を認識する抗体を選択するために、ファージディスプレイライブラリ
ーを用いたパニングにおいて、Ｎｏｔｃｈ３受容体の重要な領域を表すいくつかの組換え
タンパク質を使用した（図１における細胞外ドメイン構造の概略図を参照のこと）。Ｎｏ
ｔｃｈ３のＮＲＲ、ＥＧＦ３２−ＮＲＲおよびリガンド結合（ＬＢＤ）領域をパニングに
使用した。加えて、外因性または内因性Ｎｏｔｃｈ３のいずれかを発現する細胞株を、以
下に記載されるような全細胞パニングまたはディファレンシャル全細胞パニングのいずれ
かに使用した。ヒトＮｏｔｃｈ３タンパク質に対する抗体を、抗体バリアントタンパク質
の供給源として市販のファージディスプレイライブラリー、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣ
ＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用して、高い親和結合親和性を有
するクローンを選択することによって生成した。組換えタンパク質（ヒト、マウス、カニ
クイザル）およびＮｏｔｃｈ３を発現する細胞の両方に対するＮｏｔｃｈ３抗体の結合特
性を図３〜６に示す。
細胞株
Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ１１４３はＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢ
Ｓおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足した増殖培地中に通常のように維持
した。細胞株ＴＡＬＬ−１はＤＳＭＺから購入し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−
ストレプトマイシンを補足した増殖培地中に通常のように維持した。ＨＬＲ ＰａｔｈＤ
ｅｔｅｃｔ細胞はＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入し、製造業者の指示書に従って維持した
。
Ｎｏｔｃｈ３−ＮＲＲドメインおよびＮｏｔｃｈ３−ＮＲＲ−ＥＧＦドメインについての
発現ベクターの生成
ヒトＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲドメイン（アミノ酸１３７８〜１６４０）についてのコード
配列を遺伝子合成し、マウスＩｇＫシグナルペプチドおよびＣ末端の６個のヒスチジン精
製タグを含むように発現ベクターｐＲＳ５ａの誘導体中にサブクローニングした。同様に
、ヒト、カニクイザルおよびマウスＥＧＦ３２−ＮＲＲ二重ドメイン（それぞれ、アミノ
酸１２４６−１６４０、１２４６−１６４０、１２４７−１６４１）を遺伝子合成し、マ
ウスＩｇＫシグナルペプチドおよびＣ末端の６個のヒスチジン精製タグを含むようにｐＲ
Ｓ５ａ内にクローニングした。ｐＲＳ５ａはＣＭＶプロモーターを含有し、ＨＥＫ２９３
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性トランスフェクションによ
るタンパク質の発現のために使用した。
組換えＮｏｔｃｈ３タンパク質の発現／精製
Ｎｏｔｃｈ３タンパク質を発現するためのベクターを、１：３の比のＤＮＡ：ＰＥＩト
ランスフェクション試薬を使用してＨＥＫ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞内に一過性に
トランスフェクトした。トランスフェクションの７日後、ヒスチジンタグ化タンパク質を
精製するために、細胞上清をＮｉｃｋｅｌ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に適用した。
タンパク質をイミダゾールで溶出し、続いてＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）
でのサイズ排除によってさらに精製してあらゆる凝集タンパク質を取り除いた。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−サイズ排除によってタンパク質を分析して純度および凝集状態
を評価した。
Ｎｏｔｃｈ３−ＬＢＤタンパク質
組換えヒトＮｏｔｃｈ３−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ（受託番号Ｑ９ＵＭ４７、ａａ４０−
４６７）はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（＃１５５９−ＮＴ−０５０）から購入した。組換え
マウスＮｏｔｃｈ３−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ（受託番号Ｑ６１９８２、ａａ４０−４６８
）はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（＃１３０８−ＮＴ−０５０）から購入した。
Ｎｏｔｃｈ３を過剰発現する細胞株の生成
Ｎｏｔｃｈ３を過剰発現する細胞株を生成するために、Ｎｏｔｃｈ３−ＧＦＰ ｃＤＮ
ＡはＯｒｉｇｅｎｅ（カタログ番号ＲＧ２２４７１１）から購入した。製造業者からの指
示書に従ってＮＥＯＮエレクトロポレーション機器（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して
Ｕ２ＯＳ細胞を電気穿孔した。エレクトロポレーションパラメータは、１２３０Ｖパルス
電圧、１０ｍｓパルス幅、４パルスであった。１００ｕＬのＮＥＯＮチップ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＰＫ１００９６）を使用して、１００万個のＵ２ＯＳ細胞を
２μｇのＮｏｔｃｈ３−ＧＦＰ ｃＤＮＡと混合した。エレクトロポレーションの２４時
間後、細胞を２週間選択（２００μｇ／ｍＬにおいてＧ４１８）下に置いた。Ｎｏｔｃｈ
３ ＧＦＰ陽性細胞は２つの集団：高ＧＦＰおよび中間ＧＦＰ陽性細胞に分類したＦＡＣ
Ｓであった。各々の亜集団由来のクローン株を選択し、ＦＡＣＳによるＮｏｔｃｈ３細胞
表面発現についてさらに試験した。
ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）パニング
ヒトＮｏｔｃｈ３を認識する抗体を選択するために、複数のパニング戦略を利用した。
ヒトＮｏｔｃｈ３タンパク質に対する治療抗体を、抗体バリアントタンパク質の供給源と
して市販のファージディスプレイライブラリー、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬ
ＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用して、高い親和結合親和性を有するクロー
ンを選択することによって生成した。ファージミドライブラリーはＨｕＣＡＬ（登録商標
）コンセプト（Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296: 57-86）に基づき、ファージ表
面上にＦａｂを表示するためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）技術（Ｌｏｈｎｉｎｇ
、ＷＯ０１／０５９５０）を利用する。抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を単離するために、固相、溶
液、全細胞およびディファレンシャル全細胞パニングアプローチを使用して標準的なパニ
ング戦略を実施した。
固相パニング
抗原選択プロセスの前に、抗原のための最適なコーティング濃度を決定するためにコー
ティングチェックＥＬＩＳＡを実施した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレートの適
切な数（サブライブラリープールの数に依存する）のウェルを４℃にて一晩（ｏ／ｎ）、
３００μｌのＮｏｔｃｈ３抗原でコーティングした。各パニングのために、約４×１０１
３個のＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ抗体をＰＢＳ／０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０／５％粉乳／５％ＢＳＡで遮断した。遮断手順の後、予め遮断したファージ
混合物を、コーティングした各々の抗原に加え、ウェルを遮断し、マイクロタイタープレ
ートシェーカー上で室温（ＲＴ）にて２時間インキュベートした。その後、非特異的結合
ファージを数回の洗浄ステップによって洗い落とし、特異的に結合したファージを溶出す
るために、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８中のＤＴＴを使用した。ＤＴＴ溶出物を
１４ｍｌの大腸菌（E.coli）ＴＧ１に移し、その後、大腸菌（E.coli）ＴＧ１とＤＴＴ溶
出物の混合物をファージ感染のために水浴中で３７℃にて４５分間インキュベートした。
細菌ペレットを２ｘＹＴ培地中に再懸濁し、ＬＢ／Ｃａｍ寒天プレート上に置き、３０℃
にてｏ／ｎ、インキュベートした。コロニーをプレートからこすり取り、ファージレスキ
ュー、選択したクローンのポリクローナル増幅およびファージ産生のために使用した。精
製したファージを用いて、次のパニングラウンドを開始した。
第２および第３ラウンドの固相パニングを、減少した量の抗原およびよりストリンジェ
ントな洗浄条件を除いて、第１ラウンドのプロトコールに従って実施した。
ストレプトアビジン結合電磁ビーズを用いた溶液パニングプロトコール
溶液パニングのための必須条件は抗原のビオチン化およびビオチン化抗原の保持活性の
確認であった。溶液パニングの間、Ｆａｂを表示するファージおよびビオチン化抗原を、
ファージによる抗原の接近性を促進する溶液中でインキュベートした。
ファージプールごとに、ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）
Ｍ−２８０ストレプトアビジン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および各パニングのために、Ｈ
ｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ抗体をＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒで遮
断し、次いで１００ｎＭビオチン化Ｎｏｔｃｈ３抗原をファージ粒子に加え、ローター上
でＲＴにて１〜２時間インキュベートした。２ｍｇの遮断したストレプトアビジンビーズ
を使用してファージ−抗原複合体を捕捉し、ストレプトアビジンビーズに結合したファー
ジ粒子を磁性分離器で回収した。非特異的結合ファージを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０およびＰＢＳを使用した数回の洗浄ステップによって洗い落とした。特異的に結合
したファージをストレプトアビジンビーズから溶出するために、ＤＴＴを使用した。次い
でＤＴＴ溶出物を大腸菌（E.coli）ＴＧ１に移し、ＴＧ１とＤＴＴ溶出物の混合物をファ
ージ感染のために水浴中で３７℃にて４５分間インキュベートした。細菌ペレットを２ｘ
ＹＴ培地中に再懸濁し、ＬＢ／Ｃａｍ寒天プレート上に置き、３０℃にてｏ／ｎ、インキ
ュベートした。コロニーをプレートからこすり取り、ファージレスキュー、選択したコロ
ニーのポリクローナル増幅およびファージ産生のために使用した。精製したファージを用
いて、次のパニングラウンドを開始した。
第２および第３ラウンドの溶液パニングを、減少した量の抗原およびよりストリンジェ
ントな洗浄条件を除いて、第１ラウンドのプロトコールに従って実施した。
Ｎｏｔｃｈ３に対する全細胞パニング
各パニングのために、約４×１０１３個のＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）
ファージ抗原をＰＢＳ／５％ＦＣＳ中で遮断した。並行して、ファージプールごとに、Ｎ
ｏｔｃｈ３抗原を発現する０．５〜１．０×１０７個の標的細胞および（適用される場合
）Ｎｏｔｃｈ３を発現しない０．５〜１．０×１０７個の吸着細胞を氷上で遮断するため
に１ｍｌのＰＢＳ／５％ＦＣＳ中に再懸濁した。遮断した標的細胞を沈降させ、予め遮断
したファージ粒子中に再懸濁し、回転子上で４℃にて２時間インキュベートした。ファー
ジ−細胞複合体をＰＢＳ／５％ＦＣＳ中で３回洗浄した。特異的に結合したファージの標
的細胞からの溶出を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ／０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．２を用
いた１０分の酸性溶出により実施した。遠心分離後、２Ｍの緩衝化されていないＴｒｉｓ
を加えることによって上清（溶出物）を中和した。最終上清を大腸菌（E.coli）ＴＧ１培
養物のファージ感染のために使用した。細菌ペレットを２ｘＹＴ培地中に再懸濁し、ＬＢ
／Ｃａｍ寒天プレート上に置き、３０℃にてｏ／ｎ、インキュベートした。コロニーをプ
レートからこすり取り、ファージレスキューおよびファージ増幅のために使用した。増幅
したファージを次のパニングラウンドのために使用した。
第２および第３ラウンドの全細胞パニングを第１ラウンドのプロトコールに従って実施
した。
Ｎｏｔｃｈ３に対するディファレンシャル全細胞パニング
ディファレンシャル全細胞パニングにおいて、細胞および精製タンパク質に対して交互
に選択を行った。精製抗原についての選択ラウンドを、固相パニングに記載されるように
実施した。細胞についての選択ラウンドに関しては、全細胞パニングについての手順を参
照のこと。全細胞パニングと対照的に、後の吸着はＤＷＣＰにおいて省略されてもよい。
成熟パニング
選択した抗体断片の親和性および生物活性を増加させるために、フレームワーク領域を
一定に維持しながら、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２領域を、トリヌクレオチド定方向
突然変異誘発（Virnekas et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:5600-5607）を使用し
たカセット突然変異誘発によって並行して最適化した。親和性成熟についてクローニング
する前に、親Ｆａｂ断片を、対応する発現ベクターからディスプレイベクター内にサブク
ローニングした。
親和性を改善した結合剤を選択するために、成熟ライブラリーに由来するファージを、
Ｎｏｔｃｈ３抗原（ｈＮ３＿ＥＧＦ４−１１＿Ｆｃ、ｈＮ３＿ＥＧＦ４−１１＿Ｆｃ＿ｂ
ｉｏｔ、ｈＮ３＿ＥＧＦ３２＿ＮＲＲ＿ＨｉｓおよびｈＮ３＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ＿ｂｉｏｔ
）を使用した３ラウンドの固相、溶液またはディファレンシャル全細胞パニングに供した
。各パニングラウンドにおいて抗原濃度を低下させることによってストリンジェンシーを
増加させた（Low et al., (1996) J Mol Biol 260: 359-368）。抗原減少に加えて、オフ
レート選択（off-rate selection）（Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 226: 889-896
）を実施した。これを２２℃の長時間の洗浄ステップと組み合わせた。
選択したＦａｂ断片のサブクローニングおよび微小発現
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、選択したＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ
（登録商標）ファージのＦａｂコード挿入物を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ディスプ
レイベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標
）ｘ１１＿ＦＨ内にサブクローニングした。
ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ／ＢｍｔＩによる３重消化によってサブクローニングを実施した
。大腸菌（E.coli）の形質転換後、ＴＧ１−Ｆ−単一クローン発現およびＨｕＣＡＬ（登
録商標）−Ｆａｂ断片を含有するペリプラズム抽出物の調製を以前に記載されたように実
施した（Rauchenberger et al., (2003) J Biol Chem. 278:38194-38205）。
ＥＬＩＳＡスクリーニングのためのＦａｂ含有細菌溶解物の調製
５μｌの各々のｏ／ｎ培養物を、１つのウェルにつき４０μｌの２ｘＹＴ培地（３４μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）；０．１％グルコース）を予め充填した滅菌
３８４ウェルマイクロタイタープレートに移した。培養物がわずかに混濁するまで、プレ
ートを３７℃にてインキュベートした。これらの発現プレートに、１つのウェルにつき１
０μｌの２ｘＹＴ培地（３４μｇ／ｍｌのＣａｍおよび５ｍＭのＩＰＴＧ）を加えた。プ
レートをガス透過性テープで密封し、２２℃にてｏ／ｎインキュベートした。発現プレー
トの各ウェルに、１５μｌのＢＥＬ緩衝液（２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、４ｍＭのＥ
ＤＴＡ、１０Ｕ／μｌのベンゾナーゼ）を加え、プレートを２２℃にて１時間インキュベ
ートした。後のＥＬＩＳＡのために、Ｆａｂを含有する大腸菌（E.coli）溶解物のスクリ
ーニングを、１５μｌの１２．５％ＭＰＢＳＴを各ウェルに加え、４００ｒｐｍおよび２
２℃にて少なくとも３０分間プレートを振盪することによって遮断した。発現プレートを
即座に使用したか、または−２０℃にて保存した。
ＦＡＣＳスクリーニングのためのＦａｂ含有細菌溶解物の調製
５μｌの各々のｏ／ｎ培養物を、１つのウェルにつき１００μｌの２ｘＹＴ培地（３４
μｇ／ｍｌのＣａｍ；０．１％のグルコース）を予め充填した滅菌９６ウェルマイクロタ
イタープレートに移した。培養物がわずかに混濁するまでプレートを２２℃にてインキュ
ベートした。これらの発現プレートに、１つのウェルにつき２０μｌの２ｘＹＴ培地（３
４μｇ／ｍｌのＣａｍ；３ｍＭのＩＰＴＧ）を加えた。プレートをガス透過性テープで密
封し、２２℃にてｏ／ｎインキュベートした。発現プレートの各ウェルに、１５μｌのＢ
ＥＬ緩衝液（２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、４ｍＭのＥＤＴＡ、１０Ｕ／μｌのベンゾ
ナーゼ）を加え、プレートを２２℃にて１時間インキュベートした。後のＦＡＣＳのため
に、Ｆａｂを含有する大腸菌（E.coli）溶解物のスクリーニングを、１５μｌの１６％Ｆ
ＢＳを各ウェルに加え、４００ｒｐｍおよび２２℃にて少なくとも３０分間プレートを振
盪することによって遮断した。インキュベーション後、ＢＥＬ溶解物を遠心分離して細菌
細胞残屑を沈降させた。Ｆａｂ含有上清をスクリーニング目的のために即座に使用したか
、または−２０℃にて保存した。
直接コーティングした抗原についてのＥＬＩＳＡスクリーニング
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中で、２．５μｇ／ｍｌ、
５μｇ／ｍｌまたは１．２５μｇ／ｍｌの濃度にてそれぞれＮｏｔｃｈ３抗原ｈＮ３＿Ｎ
ＲＲ＿Ｈｉｓ、ｈＮ３＿ＥＧＦ３２＿ＮＲＲ＿ＨｉｓおよびｈＮ３＿ＥＧＦ４−１１＿Ｆ
ｃでコーティングした。ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でプレートを遮断した後、Ｆａｂ含有大
腸菌（E.coli）溶解物を加えた。Ｆａｂの結合を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光体（Ｒｏｃｈｅ
、＃１１６８１９８２００１）を使用してアルカリ性リン酸塩（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−０５５−０９７；１：５０００希釈）にコンジュゲ
ートしたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧにより検出した。５３５ｎｍにおける蛍光
発光を４３０ｎｍにおける励起で記録した。
ビオチン化抗原のＥＬＩＳＡスクリーニング
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）コーティングプレートを、ＰＢＳ中で希釈した２．５
〜５μｇ／ｍｌのｈＮ３＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ、５〜１０μｇ／ｍｌのｈＮ３＿ＥＧＦ３２＿
ＮＲＲ＿Ｈｉｓビオチン化Ｎｏｔｃｈ３抗原または１．２５μｇ／ｍｌのｈＮ３＿ＥＧＦ
４−１１＿Ｆｃ抗原のいずれかでコーティングした。ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン
で遮断した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）溶解物を加えた。その後、捕捉したＨｕＣＡ
Ｌ（登録商標）−Ｆａｂ断片を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光体（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９
８２００１）を使用してアルカリ性ホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−０５５−０９７；１：５０００希釈）にコンジュゲートしたＦ
（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧにより検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光を４３
０ｎｍにおける励起で記録した。
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳスクリーニングにおいて、細胞表面に発現した抗原に結合している単一のＦａ
ｂクローンをパニング出力から識別した。Ｆａｂ含有粗製大腸菌（E.coli）溶解物を使用
してＦａｂを試験した。使用した細胞株はＵ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−９６；非修
飾細胞＝Ｕ２ＯＳ＿ｐａｒまたはヒトＮｏｔｃｈ３を高度に発現するように遺伝子組換え
された＝Ｕ２ＯＳ＿Ｎ３のいずれか）およびＮｏｔｃｈ３遺伝子の増幅を維持する乳癌細
胞株ＨＣＣ１１４３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２３２１）であった。
１００μｌの細胞懸濁液を新鮮な９６ウェルプレート内に移した（１×１０５個の細胞
／ウェルを生じた）。標的細胞懸濁液を含有するプレートを遠心分離し、上清を捨てた。
残っている細胞ペレットを再懸濁し、５０μｌのＦａｂ含有ＦＡＣＳ ＢＥＬ抽出物を対
応するウェルに加えた。プレートを氷上で１時間インキュベートした。インキュベーショ
ン後、細胞を沈降させ、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）で３回洗浄
した。各洗浄ステップの後、細胞を遠心分離し、注意深く再懸濁した。
ＰＥがコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ
番号１０９−１１６−０９８）を加え、試料を氷上でインキュベートし、その後、Ｆａｂ
インキュベーションに応じて洗浄した。
最後に、細胞ペレットを１つのウェルにつき１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し
、試料をＢＤ ＦＡＣＳアレイにおいて分析した。
親和性成熟後のスクリーニング
（Haenel et al., (2005) Anal Biochem. 339:182-184）に記載されている原理に基づ
いて溶液平衡滴定によって成熟した結合剤をランク付けするために、一定量の希釈したＢ
ＥＬ抽出物を異なる濃度の抗原で一晩平衡化した。
次いで混合物を、以前に抗原でコーティングしたＭＳＤプレートに移し、インキュベー
ションおよび洗浄後、適切なＭＳＤ−スルホ−タグ標識化検出抗体を加えた。
その後、未結合のＦａｂの濃度を、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ゲイザースバーグ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用してＥＣＬ
検出により定量した。
ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアを使用し、親和性を推定し、それによって成熟に
より最も改善されたクローンを識別するために対応するフィットモデルを適用して、結果
を処理した。
大腸菌（E.coli）（ｍｇスケール）中のＨｉｓタグ化ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片
の発現および精製
大腸菌（E.coli）ＴＧ１ Ｆ細胞中のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１＿Ｆａｂ＿ＦＨ
によりコードされたＦａｂ断片の発現を、０．１％のグルコースおよび３４μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコールを補足した５００ｍｌの２ｘＹＴ培地を使用して振盪フラスコ培養
物中で実施した。ＯＤ６００が０．５の値に到達するまで培養物を３０℃にて振盪した。
Ｆａｂ発現を、０．７５ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド）を加え、３０℃にてさらに２０時間培養することにより誘導した。細胞を
収集し、リゾチームを使用して破壊した。Ｈｉｓ６タグ付きＦａｂ断片をＩＭＡＣ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ、ドイツ）により単離し、イミダゾールを使用して溶出した。１×ダルベッコ
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）への緩衝液の交換を、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ、ドイツ）を使用して実施した。試料を濾過滅菌した（０．２μｍ）。タンパク質濃度
をＵＶ分光光度法によって判定した。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを変性させ、還元させる際
に試料の純度を分析した。較正基準を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥ
Ｃ）により天然状態においてＦａｂ調製物の均一性を判定した。
ＩｇＧへの変換
完全長ＩｇＧを発現するために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片
をＦａｂ発現ベクターから、ヒトＩｇＧ１ｆについての適切なｐＭｏｒｐｈ４（登録商標
）＿ｈＩｇＧ１ｆベクター内にサブクローニングした。
ＩｇＧスクリーニングスケールにおけるヒトＩｇＧの一過性発現
真核性ＨＥＫ２９３ ｃ１８細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−１０８５２）を、特異性およ
び／または機能的スクリーニングアッセイにおいて後で使用するために完全長ＩｇＧを含
有する馴化細胞培養物上清を生成するために９６ウェル発現系において使用した。
ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）発現またはディスプ
レイベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４Ｉｇ発現ベクター内にサブクローニングし
た。生じたライゲーションを大腸菌（E.coli）ＸＬ１ Ｂｌｕｅの形質転換のために使用
し、続いて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースを含有するＬＢプレ
ート上に試料を播種した。
単一コロニーのＤＮＡ調製物を、ＢｉｏＲｏｂｏｔ（登録商標）８０００デバイスと組
み合わせた適切なＤＮＡ調製物キットを使用することによって調製した。個々のＤＮＡ濃
度をＵＶ分光光度法によって判定した。
真核性ＨＥＫ２９３ ｃ１８細胞を、前日に約４×１０４個の細胞／５０μｌ／ウェル
の密度で９６ウェル平底プレート中に播種し、これに等量のＩｇ発現ベクターＤＮＡをト
ランスフェクトした。３７℃および６％ＣＯ２にて４０〜５０時間インキュベーションし
た後、培養物上清を９６ウェルＵ底プレートに移し、遠心分離によって清澄した。生じた
Ｉｇ上清を、既知の標準物を参照してＩｇ濃度を算出するために抗Ｆｄ捕捉ＥＬＩＳＡに
よって試験し、特異性および／または機能的スクリーニングアッセイにおいて後で使用す
るために−２０℃に保存した。
直接コーティングした抗原上での精製したＩｇＧによるＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中のＮｏｔｃｈ３抗原ｈＮ
３＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ（２．５μｇ／ｍｌ）、Ｎ３＿ＥＧＦ３２＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ（ヒト、
カニクイザルおよびマウスについて５μｇ／ｍｌ）およびＮ３＿ＥＧＦ４−１１＿Ｆｃ（
ｈｕ１．２５μｇ／ｍｌ；カニクイザルおよびマウス：５μｇ／ｍｌ）でコーティングし
た。ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でプレートを遮断した後、試験的スケール発現からのＩｇＧ
を加えた（ＥＬＩＳＡ ＥＣ５０判定について、１：３希釈ステップにおいて５０μｇ／
ｍｌ（３３３．３ｎＭ）から減少させた１２点滴定を実施した）。ＩｇＧの結合を、Ａｔ
ｔｏｐｈｏｓ蛍光体（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２００１）を使用してアルカリ性ホ
スファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−０５５−０
９７；１：５０００希釈）にコンジュゲートしたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧに
より検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光を４３０ｎｍにおける励起で記録した。
試験的スケールＩｇＧによるＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳスクリーニングにおいて、細胞表面に発現した抗原に結合している試験的スケ
ール発現からのＩｇＧを識別した。使用した細胞株は、Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ
−９６；非修飾細胞＝Ｕ２ＯＳ＿ｐａｒまたはヒトＮｏｔｃｈ３を高度に発現するように
遺伝子組換えされた＝Ｕ２ＯＳ＿Ｎ３のいずれか）およびＮｏｔｃｈ３遺伝子の増幅を維
持する乳癌細胞株ＨＣＣ１１４３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２３２１）であった。
１００μｌの細胞懸濁液を新鮮な９６ウェルプレート内に移した（１×１０５個の細胞
／ウェルを生じた）。標的細胞懸濁液を含有するプレートを遠心分離し、上清を捨てた。
残っている細胞ペレットを再懸濁し、５０μｌのＩｇＧ希釈物を対応するウェルに加えた
。ＦＡＣＳ ＥＣ５０判定を、１：５希釈ステップにおいて２０μｇ／ｍｌから減少させ
て実施した。プレートを氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞
を沈降させ、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）で３回洗浄した。各洗
浄ステップの後、細胞を遠心分離し、注意深く再懸濁した。ＰＥがコンジュゲートしたヤ
ギ抗ヒトＩｇＧ二次検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）
を加え、試料を氷上でインキュベートし、その後、Ｆａｂインキュベーションに応じて洗
浄した。最後に、細胞ペレットを１つのウェルにつき１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再
懸濁し、試料をＢＤ ＦＡＣＳアレイにおいて分析した。
Ｎｏｔｃｈ３抗体を発現する安定な細胞株を生成するための発現ベクター
Ｎｏｔｃｈ３抗体のより大きなスケールの発現のために、軽鎖および重鎖コード配列を
、ファージベクターから、安定な細胞株を生成するための単一の二重ＣＭＶプロモーター
プラスミドを含有するマウスＩｇＫシグナルペプチド内にクローニングした。細胞をＮｏ
ｔｃｈ３抗体の高レベル発現のためにＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｋｄ判定
動態パラメータを判定することによって親和性判定を、以下に記載されるようにＢｉａ
ｃｏｒｅ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰ
Ｒにより実施した。
直接コーティングした抗原でのＢｉａｃｏｒｅ判定。固定化抗原への結合を以下のよう
に分析した。製造業者のプロトコールに従って抗原をチップ表面上に固定した。６つの異
なるＦａｂ濃度（２倍連続希釈）を使用して動態測定を行った。各サイクルの後、センサ
ーチップを再生した。ランニング緩衝液のブランク注入を二重参照のために使用した。Ｂ
ＩＡ評価ソフトウェア４．１．１（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使
用して全てのセンサーグラムを適合して、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度定数を判定し、それ
らを、ＫＤを算出するために使用した。
あるいは、定性的結合実験のために、ＩｇＧ試料を試料として使用した。ＩｇＧ試料の
相対比較のためにＦａｂ断片に関して同じモデルを使用して結合曲線を適合した。
１０μｇ／ｍＬに１０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．５中で希釈した約１００ＲＵ ｈＮ
３＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ（または４００ＲＵ ｈＮ３＿ＥＧＦ３２＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ）を、標
準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学作用を使用してＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏ
ｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定した。参照フローセル１のみを活性化およ
び非活性化させた。ランニング緩衝液は、２５μｌ／分の流量で０．００５％（ｖ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）ｐＨ７．２であった。１５．６〜５００ｎ
Ｍの範囲のＦａｂ濃度を１２０秒の注入時間および例えば２４０秒の適切な解離時間で使
用した。グリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．５（２０秒）の１回の注入およびグリシン／ＨＣｌ
ｐＨ２（２０秒）の１回の注入を用いて、結合した検体の再生を行った。「グローバル
（global）」に設定したパラメータＲｍａｘおよび０に設定したＲＩを用いて適合を実施
した。
抗体捕捉設定によるＢｉａｃｏｒｅ ＫＤ判定。捕捉抗体への単量体抗原の結合を以下
のように分析した。ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に
、適切な捕捉抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＥＤＣ／ＮＨＳ
化学作用を使用して共有結合により固定した。抗体を捕捉し、その後、６つの異なる抗原
濃度（２倍連続希釈）を注入することによって動態測定を行った。各サイクルの後、セン
サーチップを再生した。ランニング緩衝液のブランク注入を二重参照のために使用した。
ＢＩＡ評価ソフトウェア４．１．１（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を
使用して全てのセンサーグラムを適合して、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度定数を判定し、そ
れらを、ＫＤを算出するために使用した。
ランニング緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）ｐＨ７
．２であった。抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用
して１００ＲＵのＩｇＧを捕捉した。例えば１５．６〜５００ｎＭの範囲の抗原濃度（ｈ
Ｎ３＿ＮＲＲ＿ＨｉｓまたはｈＮ３＿ＥＧＦ３２＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ）を、３０μｌ／分の
流量、１８０秒の注入時間および例えば３６０秒の適切な解離時間で使用した。抗体／抗
原複合体の再生を３０秒にて３ＭのＭｇＣｌ２の２回の注入により行った。「グローバル
」に設定したパラメータＲｍａｘおよび０に設定したＲＩを用いて適合を実施した。
抗原捕捉によるＢｉａｃｏｒｅ ＫＤ判定に関して。捕捉抗原へのＦａｂの結合を以下
のように分析した。ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に
、適切な抗−抗原タグ捕捉抗体を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学作用を使用して共有結合により固
定した。抗原を捕捉し、その後、６つの異なるＦａｂ濃度（２ｎ連続希釈）の注入により
動態測定を行った。各サイクルの後、センサーチップを再生した。ランニング緩衝液のブ
ランク注入を二重参照のために使用した。全てのセンサーグラムを、ＢＩＡ評価ソフトウ
ェア４．１．１（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して適合して、
ｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度定数を判定し、それらを、ＫＤを算出するために使用した。
ランニング緩衝液は０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）ｐＨ７．
２であった。約７５ＲＵの抗原（例えば、ｈＮ３＿ＥＧＦ４−１１＿Ｆｃ、５０ｎＭ）を
、抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して捕捉した
。例えば、１５．６〜５００ｎＭの範囲の抗体Ｆａｂ断片濃度を、３０μｌ／分の流量、
１８０秒の注入時間および適切な解離時間（例えば最大１８００秒）で使用した。抗体／
抗原複合体の再生を、３５秒にて３Ｍ ＭｇＣｌ２の２回の注入により行った。「グロー
バル」に設定したパラメータＲｍａｘおよび０に設定したＲＩを用いて適合を実施した。
Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００（ＭＳＤ）を使用したＫＤ判定のための溶液平衡滴
定（ＳＥＴ）法
溶液中の親和性判定を基本的に文献（Friquet et al., (1985) J Immunol Methods 77:
305-319）に記載されているように実施した。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するため
に、それを古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技術（Haenel et al., (2005) Anal Bio
chem 339: 182-184）に移した。
１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２断片特異的抗体（ＤｉａｎｏｖａまたはＢｅｔ
ｈｙｌ）を、製造業者の指示書に従ってＭＳＤスルホ−ＴＡＧＴＭ ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ
（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ゲイザースバーグ、ＭＤ、ＵＳＡ）で標
識した。マウス抗体のＫＤ判定のために、対応する抗マウスＩｇＧを標識し、検出試薬と
して使用した。
この実験は、アッセイ緩衝液として０．５％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０
を含有するポリプロピレンマイクロタイタープレートおよびＰＢＳ ｐＨ７．４中で実施
した。未標識の抗原を、予想されるＫＤより少なくとも１０倍高い濃度で開始して、２倍
連続で希釈した。抗原を含まないウェルを使用してＢｍａｘ値を判定し、アッセイ緩衝液
のみを含有するウェルを使用してバックグラウンドを判定した。適切な量の結合剤（予想
されるＫＤと同等またはそれ未満の抗体濃度、６０μｌの最終体積）を添加した後、混合
物を室温にて一晩インキュベートした。
ＭＳＤプレートを抗原（３０μｌ／ウェル）でコーティングした。０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０を有するＰＢＳでプレートを洗浄した後、平衡化した試料をこれらのプレート（
３０μｌ／ウェル）に移し、２０分間インキュベートした。洗浄後、３０μｌ／ウェルの
ＭＳＤ−スルホ−タグで標識した検出抗体（抗ヒト（Ｆａｂ）２、最終希釈は典型的に１
：２，０００）をＭＳＤプレートに加え、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆシェーカー（７００ｒｐｍ
）で室温にて３０分間インキュベートした。
ＭＳＤプレートを洗浄し、界面活性剤を有する３０μｌ／ウェルのＭＳＤリード緩衝液
Ｔを加えた後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃ
ｏｖｅｒｙ、ゲイザースバーグ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して電気化学発光シグナルを検出
した。
カスタマイズされた適合モデルを適用しているＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアを
用いてデータを評価した。Ｆａｂ分子のＫＤ判定のために、（（Abraham et al., (1996)
J Mol Recognit. 9, 456-461）に従って改変された、（Haenel et al., (2005) Anal Bi
ochem 339: 182-184）に従って以下の適合モデルを使用した：

［Ｆａｂ］ｔ：適用された全Ｆａｂ濃度
ｘ：適用された全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を有しないＦａｂの最大シグナル
ＫＤ：親和性
ＩｇＧ分子のＫＤ判定のために、ＩｇＧについて以下の適合モデルを使用した（（Pieh
ler et al., (1997) J Immunol Methods 201: 189-206）に従って改変した：

［ＩｇＧ］：適用された全ＩｇＧ濃度
ｘ：適用された全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を有しないＩｇＧの最大シグナル
ＫＤ：親和性
実験設定：
ＨｕＣＡＬ（登録商標）＿Ｆａｂ（またはＩｇＧ）のＫＤ判定を基本的に以下のように
実施した：抗原ｈＮ３＿ＥＧＦ４−１１＿Ｆｃを標準的なＭＳＤプレート上で４℃にてｏ
／ｎ、ＰＢＳ中で０．２μｇ／ｍＬにてコーティングした（または試料の特異性に応じて
１μｇ／ｍＬにてｈＮ３＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ）。続いて、ＭＳＤプレートを、室温にて１時
間、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳで遮断した。単量体抗原（ｈＮ３＿ＮＲＲ＿Ｈｉｓ）が
、ＩｇＧ試料を滴定するために使用されなければならず、Ｆａｂ断片のＫＤ判定のために
、ｈＮ３＿ＮＲＲ＿ＨｉｓおよびｈＮ３＿ＥＧＦ４−１１＿Ｆｃの両方が使用できた。
パニング戦略およびスクリーニングの概要
組換えＮｏｔｃｈ３抗原およびＮｏｔｃｈ３発現細胞株を単独または組合せのいずれか
で使用して１１の初期のパニング戦略を実施した。パニング出力を抗原結合および機能活
性についてスクリーニングした。３７７１個の最初のヒットはＮｏｔｃｈ３組換え抗原に
結合し、７７４個はＮｏｔｃｈ３を発現する細胞で陽性であり、２９５個の特有のクロー
ンを生じたことが示された。完全な抗体特徴付けを５５個のＩｇＧで実施し、１２個の候
補を親和性成熟のために選択した（Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲドメインに結合する５個のクロ
ーンおよびＮｏｔｃｈ３ ＬＢＤドメインに結合する７個のクローンを含む）。親和性成
熟後のＳＥＴスクリーニングにより、３１５個の改善された特有のクローン（９個のファ
ミリー）が生じた。ＩｇＧを発現した１１１μスケールを抗原結合および機能性について
スクリーニングした。３１／１１１個のＩｇＧ（８個の異なるＨＣＤＲ３ファミリー由来
）をさらに特徴付けし、４個の異なるＨＣＤＲ３ファミリーに属する９個の優先的なクロ
ーンが生じた。
〔実施例３〕
リガンド駆動レポーター遺伝子アッセイにおけるＮｏｔｃｈ３抗体の特徴付け
１つの細胞においてＮｏｔｃｈ受容体が隣接細胞におけるリガンドと相互作用する場合
、標準的なＮｏｔｃｈシグナル伝達が活性化する。哺乳動物において、５つの膜貫通型リ
ガンド、３つのＤｅｌｔａ様リガンド（ＤＬＬ１、ＤＬＬ４およびＤＬＬ３）および２つ
のＪａｇｇｅｄリガンド（Ｊａｇ１、Ｊａｇ２）が存在する。Ｎｏｔｃｈ３リガンド誘発
シグナル伝達を阻害する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の能力を判定するために、二重安定レポータ
ー細胞株ＨＬＲ−ｈｕＮｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６／Ｇａｌ４−ＵＡ−ル
シフェラーゼを使用したレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を開発した。このアッセイ
を使用して、Ｊａｇ１またはＤＬＬ１のいずれかによって活性化されるＮｏｔｃｈ３シグ
ナル伝達の阻害を試験した。同様のアッセイをヒトＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２受容
体について開発した。この一連のＮｏｔｃｈ受容体特異的ＲＧＡアッセイにおけるＮｏｔ
ｃｈ３抗体の試験により、Ｎｏｔｃｈ３の阻害について抗体の特異性評価が可能となった
。
Ｎｏｔｃｈ３リガンド誘導シグナル伝達を阻害する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の能力を判定す
るために、二重安定レポーター細胞株ＨＬＲ−ｈｕＮｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＮＬＳ−Ｖ
Ｐ１６／Ｇａｌ４−ＵＡ−ルシフェラーゼを使用したレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ
）を開発した。
ヒトＮｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６／Ｇａｌ４−ＵＡ−ルシフェラーゼを発
現する細胞株の生成
ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２およびＮｏｔｃｈ３ならびにカニクイザルＮｏｔｃｈ
３細胞外および膜貫通部分、続いてＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン、ＶＰ１６および核局
在配列（ＮＬＳ）をレトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ
番号６３１５０３）内にクローニングした。これらのキメラＮｏｔｃｈ受容体および対応
するレポーター遺伝子アッセイの生成により、Ｎｏｔｃｈ受容体特異的シグナル伝達のＮ
ｏｔｃｈ３抗体の効果の試験が可能となった。
Ｎｏｔｃｈ１−、Ｎｏｔｃｈ２−、およびＮｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＶＰ１６についての
発現ベクター
Ｇａｌ４−ＶＰ１６についてのコード配列を遺伝子合成し、ベクターｐＬＮＸＣ２（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）のＳａｌＩ−ＣｌａＩ部位内にクローニングしてｐＬＮＸＣ２−Ｇａｌ
４−ＶＰ１６を作製した。カニクイザルＮｏｔｃｈ３（アミノ酸１〜１６６９）、ヒトＮ
ｏｔｃｈ１（アミノ酸１〜１７６２）およびヒトＮｏｔｃｈ２（１〜１７０４）の細胞外
（ＥＣＤ）および膜貫通ドメインを遺伝子合成し、ｐＬＮＸＣ２−Ｇａｌ４−ＶＰ１６の
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位内にクローニングして、それぞれのＮｏｔｃｈタンパク質
とＧａｌ４−ＶＰ１６との融合物を産生した。
Ｎｏｔｃｈ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６発現系の構築
ヒトＮｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＶＰ１６


カニクイザルＮｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＶＰ１６


ヒトＮｏｔｃｈ１−Ｇａｌ４−ＶＰ１６

ヒトＮｏｔｃｈ２−Ｇａｌ４−ＶＰ１６

Ｎｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＶＰ１６を発現するためのレトロウイルスの生成
適切なレトロウイルスベクター（ｐＬＮＣＸ２＿ｈＮｏｔｃｈ１＿Ｇａｌ４−ＶＰ１６
、ｐＬＮＣＸ２＿ｈＮｏｔｃｈ２＿Ｇａｌ４−ＶＰ１６ ｐＬＮＣＸ２＿ｈＮｏｔｃｈ３
＿Ｇａｌ４−ＶＰ１６ ｐＬＮＣＸ２＿ｃＮｏｔｃｈ３＿Ｇａｌ４−ＶＰ１６）を２９３
−ＧＰ２パッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１４５８）にトラ
ンスフェクトしてレトロウイルスを産生した。ＰｒｏｍｅｇａのＦｕｇｅｎｅ６を脂質系
トランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクションを製造業者の指示書に
従って実施した。トランスフェクションの４８時間後にウイルスを収集し、即座に使用し
てＨＬＲ細胞（ＨＬＲ−ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質導入した
。形質導入した細胞を少なくとも２週間選択下に置き、その後、それらを共培養アッセイ
において試験した。各細胞株についてのクローン集団を選択した。
Ｎｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６−ＵＡ−ルシフェラーゼリガンド誘導レポー
ター遺伝子アッセイ
ＨＬＲ−Ｎｏｔｃｈ３−Ｇａｌ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６／Ｇａｌ４−ＵＡ−ＴＡＴＡ−ル
シフェラーゼ（ＨＬＲ−Ｎ３）細胞を、細胞表面で発現したｒｒＪａｇｇｅｄ１（ＳＮ３
Ｔ９）またはｒｒＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ１−１９）のいずれかを安定に発現するＬ細胞と
の共培養により活性化した（Hicks C et al. (2000) Nature Cell Bio 2:515-520; Linds
ell C et al. (1995) Cell 80:909-917）。リガンドを発現する細胞との共培養により、
Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達およびＮｏｔｃｈ３キメラ受容体のタンパク質分解切断の活性
化が生じてＧａｌ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６を放出した。このＧａｌ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６は
、それがＧａｌ４−ルシフェラーゼレポーターに結合する核へ移行し、ルシフェラーゼの
産生を生じる。９０％コンフルエンシーにて、トリプシン−ＥＤＴＡを使用してＨＬＲ−
Ｎ３細胞を解離し、２×１０５個の細胞／ｍｌの濃度でアッセイ培地（ＤＭＥＭ、高グル
コース、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２１０６３−０２９；１０％
ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを補足した）中に希釈した。５０μｌのＨＬＲ−Ｎ３細胞／ウェル（
＝１×１０４個の細胞）を白色平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３
９１７）内に播種し、３７℃および５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。
翌日、ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体（ＩｇＧ）をＰＢＳ中に所望の濃度にて希釈した。
ウェルごとに１０μｌの抗体希釈物を播種した細胞に加え、３７℃および５％ＣＯ２にて
２時間インキュベートした。次のＪａｇｇｅｄ１およびＤｅｌｔａ１リガンド発現マウス
Ｌ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して解離し、８×１０５個の細胞／ｍｌの濃度で
アッセイ培地中に希釈した。ウェルごとに５０μＬのマウスＬ細胞（＝４×１０４個の細
胞／ウェル）を培養したＨＬＲ−Ｎ３細胞（５０μｌのＨＬＲ細胞＋１０μｌの抗体＋５
０μｌのマウス細胞＝１１０μｌの最終体積）に加え、３７℃および５％ＣＯ２にて一晩
インキュベートした。対照として、５０μｌのマウス親Ｌ細胞をリガンドの独立した設定
の代わりに加えた。
一晩のインキュベーション後、５０μｌの新たに調製したＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬を
室温に適合し（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２６１０）、各ウェルに加えた。５分の
インキュベーション時間後、発光を照度計（ＧｅｎｉｏｓＰｒｏ、Ｔｅｃａｎ）で読み取
った。それぞれの抗体の全滴定後、Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０値を算出した。ＩｇＧ
対照に対する阻害パーセントを示す。抗体を加えると、増加したシグナル伝達を検出した
場合、負の数を使用した。
概要および考察
ｈｕＮｏｔｃｈ３ ＲＧＡに加えて、カニクイザルＮｏｔｃｈ３ ＲＧＡならびにｈｕ
Ｎｏｔｃｈ１ ＲＧＡ（ＤＬＬ１リガンド設定のみ）およびｈｕＮｏｔｃｈ２ ＲＧＡ（
Ｊａｇｇｅｄ１およびＤＬＬ１）を上記のように実施した。記載されるＮｏｔｃｈ３抗体
のどれも、１０μｇ／ｍｌの最大濃度までｈｕＮｏｔｃｈ１またはｈｕＮｏｔｃｈ２ Ｒ
ＧＡにおいていかなる活性も示さなかった。Ｎｏｔｃｈ３抗体は、Ｊａｇｇｅｄ１および
Ｄｅｌｔａ１の両方により誘導されるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻害することを確認し
た。阻害パーセントおよびＩＣ５０は活性化のために使用した抗体およびリガンドに応じ
て変化した。ＬＢＤドメイン（１２２２９、２０３６４、２０８０２）に対して向けられ
たパニングから識別した抗体は、図７Ａ〜Ｄに示されるように、このリガンド駆動ＲＧＡ
アッセイからのシグナル伝達を阻害するのに最も効果的であった。
〔実施例４〕
Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子ｍＲＮＡレベルに対するＮｏｔｃｈ３抗体の効果
一連の乳癌細胞株においてＮｏｔｃｈ標的遺伝子を識別するために、遺伝子のｍＲＮＡ
発現に対するガンマセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）処置の効果を評価した。Ａｆｆｙｍｅ
ｔｒｉｘヒトＵ１３３Ａアレイを使用して、７２時間、ＤＭＳＯまたは１０μＭのＤＡＰ
Ｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ５６５７７０）のいずれかによるＨＣＣ７０、ＭＤＡ−ＭＢ
４６８またはＨＣＣ１１４３細胞の処置をプロファイルした。時点ごとに３つの複製が存
在した。Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒフレームワークを使用し、Ｌｉｍｍａパッケージ
を利用して、ＤＭＳＯ処置とＤＡＰＴ処置との間で異なって発現された遺伝子を決定した
。０．０５の調整したＰ値を閾値として使用して、異なって発現された遺伝子のセットを
決定した。最終的に、２つの標的遺伝子を細胞株ごとに選択し、以下の表にまとめた。Ｈ
ｅｓ１、ＭＭＰ７およびＶＳＮＬ１ ｍＲＮＡレベルはＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害す
ると減少するが、ＤＫＫ１ ｍＲＮＡレベルはＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害すると増加
する。
上記の遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量するために、細胞株ＨＣＣ７０、ＭＤＡ−ＭＢ−
４６８またはＨＣＣ１１４３を、１×１０５個の細胞／ｍＬの細胞密度にて９６ウェルプ
レート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６１０）の１００μＬ中で播種した。プレートを
３７℃にて一晩インキュベートし、その後、適切な濃度にて抗体で処置した。処置したプ
レートをさらに７２時間インキュベーターに戻し、その後、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ
キット（カタログ番号７４１８１）を使用してＲＮＡ抽出のために溶解した。Ｔａｑｍａ
ｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｎ８０８−０２３
４）を使用してｃＤＮＡを合成した。ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ
Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ、カタログ番号４４４４５５７）により判定した。リアルタイムＰＣＲをＶｉｉ
Ａ ７リアルタイムＰＣＲシステムまたは７９００ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシ
ステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実施した。各標的遺伝子のレ
ベルを定量するために、２−［デルタ］［デルタ］Ｃｔ法を利用した。デルタデルタＣｔ
の算出は、対象の試料のＣｔ値を未処置の試料またはＤＭＳＯ処置した試料（Ｓｃｈｍｉ
ｔｔｇｅｎおよびＬｉｖａｋ ２００８ Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ３：１１
０１−１１０８）などの対照と比較することを含む。
概要および考察
図８に示されるように、Ｎｏｔｃｈ３抗体は一連の乳癌細胞株において内因性Ｎｏｔｃ
ｈ３シグナル伝達を阻害できることを確認した。Ｎｏｔｃｈ３抗体による乳癌細胞株の処
置により、ＨＥＳ１またはＭＭＰ７ ｍＲＮＡの減少した発現ならびにＤＫＫ１ ｍＲＮ
Ａの増加した発現が生じた。
〔実施例５〕
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲおよびＰＥＳＴドメインの突然変異の識別および特徴付け
今まで、がんにおけるＮｏｔｃｈ受容体についての証拠は主にＮｏｔｃｈ１シグナル伝
達の変化に焦点を当てていた。Ｎｏｔｃｈ３は卵巣がんにおいて増幅するが、その増幅は
Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達への依存につながるという直接的な証拠は存在しない。加えて
、Ｎｏｔｃｈ３において突然変異を活性化させるという証拠は存在しない。Ｎｏｔｃｈ３
を細胞株のパネルにおいて配列決定して、さらなる特徴付けのために遺伝子における突然
変異を識別した。
がん細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）を使用して９４７個のヒトがん細胞株を
特徴付けした（Barretina J. et al. (2012) Nature 483:603-7）。液相ハイブリッド捕
捉技術を使用した大量の並行シークエンシングにより突然変異体情報を＞１６００個の遺
伝子について得た。エクソーム捕捉シークエンシングについての多重ライブラリーを、Ｓ
ｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔシステム（Ａｌｉｇｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して記載されるように構築した。Ｎｏｔｃｈ３は配列
決定した遺伝子の１つであり、データを分析してタンパク質のＮＲＲ（エクソン２５、２
６、アミノ酸１３７８〜１６４０）およびＰＥＳＴ（エクソン３３アミノ酸１９７２〜２
３２２）ドメインにおける任意の突然変異を識別した。９４７個のがん細胞株からの配列
データの精密な検査により、突然変異を識別するためにエクソン２５および３３において
不十分な配列包括度が存在することが決定された。表はＮｏｔｃｈ３におけるエクソンの
平均包括度を示す。記載される数字は表３における塩基対ごとの読み取り値の平均数であ
る。
これらの細胞株または原発性腫瘍のいずれかがこれらの領域において突然変異を含有し
ているかどうかを判定するために、Ｓａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｇｅｎｅｗｉ
ｚ）、ＲａｉｎＤａｎｃｅ（Tewhey et al. (2009) Nature Biotechnology 27:1025-1031
）およびＲＮＡｓｅｑ（Wang et al. (2009) Nature Reviews Genetics 10:57-63）を含
む３つのアプローチを使用した。突然変異を図９に示されるように複数の細胞株および腫
瘍試料のＮＲＲおよびＰＥＳＴドメインの両方において識別した。図９ａにおいて、上側
のパネルはＮＲＲ突然変異を有する細胞株を示し、一方、下側のパネルはＰＥＳＴ突然変
異を有する。原発性腫瘍において識別したＮＲＲ突然変異は図９ｂに示される。
原発性腫瘍の単離および原発性腫瘍異種移植片のバンクの生成
原発性ヒト腫瘍異種移植片から得られるデータを以下のように生成した：腫瘍試料を、
１時間未満の虚血時間で外科的切除の間に患者から、１％ペニシリン／ストレプトマイシ
ンを補足したＲＰＭＩ中に収集した。壊死組織を含まない１５〜３０ｍｍ３の断片を、イ
ソフルラン麻酔下で６〜８週齢のメスのヌードマウスの肩甲骨脂肪体内に皮下移植した。
マウスを、特定の病原体を含まない動物収容施設に維持し、承認されたプロトコールおよ
び規則に従って処理した。異種移植片が移植から２〜８カ月後に移植部位において現れた
。その後、合理的に一貫性のある増殖速度が達成されるまで、腫瘍が７００〜８００ｍｍ
３に到達すると、それらの異種移植片をマウスからマウスに移植した。５０％ＦＢＳおよ
び１０％ＤＭＳＯを補足したＲＰＭＩ中に凍結したストックをマウスにおける連続継代の
間に生成し、異種移植モデルの首尾良い構築を確実にするために試験した。患者由来の３
０〜５０ｍｇの断片および各継代における異種移植片を、遺伝子発現プロファイリング、
コピー数および突然変異分析のために即座に凍結した。各々の首尾良く生着された異種移
植モデルの１５０ｍｇの断片も収集し、組織学的分析に供した。構築した腫瘍異種移植モ
デルを、４回の継代後、ｉｎ ｖｉｖｏでの研究のためにさらに使用した。遺伝子発現プ
ロファイリングのために、親和性樹脂（ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ
；ＱＩＡＧＥＮ ＡＧ）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ完全性および純度を、Ｂ
ｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけ
るＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐシステムを用いて評価した。
〔実施例６〕
レポーター遺伝子アッセイにおけるＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ突然変異の特徴付け
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ突然変異によるＮｏｔｃｈ３発現ベクターの生成
２つの突然変異を特徴付けのために選択した。ＴＡＬＬ−１細胞はＳ１５８０Ｌ突然変
異を有するｔ細胞急性リンパ芽球性細胞株である。ＴＡＬＬ−１細胞はＤＳＭＺ（＃ＡＣ
Ｃ５２１）から購入した。乳房腫瘍（Ｘ−１００４）もまた、Ｇ１４８７Ｄ突然変異で識
別した。Ｘ−１００４試料中の突然変異を検出するＲＮＡｓｅｑ分析のために使用したＲ
ＮＡは５回の継代のマウスの由来であった。これらの突然変異をベクターｐＬＮＣＸ２＿
Ｎｏｔｃｈ３−ＧＡＬ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６内に導入した。
構築物
Ｎｏｔｃｈ３＿Ｓ１５８０Ｌ＿Ｇａｌ４−ＶＰ１６

Ｎｏｔｃｈ３＿Ｇ１４８７Ｄ＿Ｇａｌ４−ＶＰ１６
２９３−ＧＰ２パッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１４５８
）に適切なレトロウイルスベクターをトランスフェクトすることによってレトロウイルス
を産生した。ＰｒｏｍｅｇａのＦｕｇｅｎｅ６を脂質系トランスフェクション試薬として
使用した。製造業者の指示書に従ってトランスフェクションを実施した。トランスフェク
ションの４８時間後にウイルスを収集し、ＨＬＲ細胞（ＨＬＲ−ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ、
Ｓｔｒａｔａｇｅ）に形質導入するために即座に使用した。ＨＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）に、Ｎｏｔｃｈ３ｗｔ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６、Ｎｏｔｃｈ３＿ｐ．Ｓ１８５０Ｌ
−Ｇａｌ４−ＶＰ１６またはＮｏｔｃｈ３＿ｐ．Ｇ１４８７Ｄ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６レト
ロウイルス粒子のいずれかを形質導入した。試験前の２週間にＧ４１８を用いて細胞を選
択した。
Ｎｏｔｃｈ３野生型およびＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ突然変異受容体の基礎活性を評価するた
めのＮｏｔｃｈ３レポーター遺伝子アッセイ
Ｎｏｔｃｈ３受容体遺伝子アッセイ：ＨＬＲ−Ｎｏｔｃｈ３ｗｔ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６
、ＨＬＲ−Ｎｏｔｃｈ３＿ｐ．Ｓ１５８０Ｌ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６およびＨＬＲ−Ｎｏｔ
ｃｈ３＿ｐ．Ｇ１４８７Ｄ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６細胞を、フェノールレッドを含まないＤ
ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１）、１％ペニシリ
ン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５１４０−１２２）、Ｌ−グルタミ
ン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０−０８１）、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシ
ン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０６８７−０１０）および４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８
（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０１３１−０２７）中に維持した。ＨＬＲ親系統を、フェ
ノールレッドを含まないＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３
００７１）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５１４０
−１２２）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０−０８１）および１
００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０６８７−０１０）中に
維持した。完全培地中で増殖したサブコンフルエントな細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタ
ログ番号２００１２−０２７）で洗浄し、ＴｒｙｐｌＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２
６０５０１０）でトリプシン処理し、４×１０４個の細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬの
細胞懸濁液を、４０００個の細胞／ウェルの密度にて９６ウェルの透明底の白色プレート
（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６１０）中に入れた。次いで全てのプレートをＤＡＰＴ
（１０μＭ、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）による処置の前に３７℃にて一晩インキュベートし
た。プレートを２４時間インキュベーターに戻し、その後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を判定した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリー
ダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光量を判定した。
野生型および突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体の細胞表面レベルを評価するためのＦＡＣＳア
ッセイ
細胞株における突然変異Ｎｏｔｃｈ３受容体の発現を実証するために、フローサイトメ
トリーを使用した。突然変異Ｎｏｔｃｈ３および野生型Ｎｏｔｃｈ３（標準的な条件下で
増殖させた）を発現する細胞株を、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを
含有するＰＢＳ中でＡＰＣフルオレセイン標識（Ｒ＆Ｄ カタログ番号ＦＡＢ１５５９Ａ
）を含有する抗Ｎｏｔｃｈ３結合および検出抗体と混合し、４℃にて１時間インキュベー
トした。洗浄後、単細胞をゲートするために光および側方散乱特性を使用してＢＤ ＦＡ
ＣＳＣａｎｔｏ機器により細胞を分析した。
突然変異体および内因性Ｎｏｔｃｈ３を発現する細胞に対する、市販の抗Ｎｏｔｃｈ３
ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ＃ＦＡＢ１５５９Ａ）で標識した抗体の結合により細胞表面上のＮｏｔ
ｃｈ３受容体のレベルを判定し、ＦＡＣＳによって評価した。細胞をトリプシン処理し（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴｒｙｐＬＥカタログ番号１２６０５−０１０）、ＦＡＣＳ緩衝
液（ＰＢＳ／３％ ＦＢＳ／０．０１％ ＮａＮ３）中で２×１０６個の細胞／ｍＬに希
釈した。２．５×１０５個の細胞／ウェルを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタロ
グ番号３６１０）の各ウェルに加え、４℃で１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、その
後、上清を除去した。抗Ｎｏｔｃｈ３ ＡＰＣ抗体またはＡＰＣ（Ｒ＆Ｄカタログ番号Ｉ
Ｃ０１６Ａ）で標識したヒツジＩｇＧアイソタイプ対照を、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液
中に０．１μｇの最終濃度にて細胞ペレットに加え、４℃にて１時間インキュベートした
。細胞を洗浄し、１００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液で２回ペレット化した（pelleted）。最後
に、細胞を２００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて蛍光値を測定した。細胞表面に結合した抗Ｎｏｔｃ
ｈ３ ＡＰＣ抗体の量を、平均チャネル蛍光を測定することによって評価した。
概要および考察
Ｓ１５８０Ｌ突然変異またはＧ１４８７Ｄ突然変異のいずれかのＮｏｔｃｈ３受容体内
への導入により、野生型対照と比較して受容体からの基礎シグナル伝達の約１０倍の増加
が生じた。この系において、野生型および突然変異受容体は、ＦＡＣＳアッセイによって
判定して、ほぼ等しいレベルで発現した。このデータは、これらの突然変異がこれらおよ
び他の同様の突然変異を発現する細胞株および腫瘍においてＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を
活性化することを示唆している（実施例７、９、１０、１１、１５におけるさらなる考察
を参照のこと）。
〔実施例７〕
ＴＡＬＬ−１細胞におけるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に対す
るＮｏｔｃｈ３抗体の効果
ＴＡＬＬ−１細胞株はＳ１５８０ＬにおけるＮｏｔｃｈ３のＮＲＲドメインにおいて突
然変異を有する。この突然変異のＮｏｔｃｈ３発現構築物内への導入により、Ｎｏｔｃｈ
３シグナル伝達の活性化が生じた。この細胞株におけるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達の阻害
の効果をさらに特徴付けるために、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを試験し、細
胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖をＮｏｔｃｈ３抗体の存在下でモニターした。
ＴＡＬＬ−１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
１×１０４個のＴＡＬＬ−１細胞／ウェルを、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ、カタログ番号３６１０）内の１００ｕｌ培地（１０％ウシ胎仔血清および１％ペ
ニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０）中に播種した。同じ日に
、抗体希釈物を１Ｘ ＰＢＳ中に調製し、それからの５μｌの２０Ｘ抗体希釈物をウェル
ごとに加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて抗体とインキュベートした。３７℃／５％
ＣＯ２における０および９日間のインキュベーション後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅ
ｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートシェーカーでプレートを１０分間イ
ンキュベートした。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使
用して発光量を判定した。ＩｇＧ対照で処置した細胞のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光
値を使用してデータを正規化し、Ｎｏｔｃｈ３抗体による処置に起因する増殖の阻害パー
セントを算出した。
ＴＡＬＬ−１ ｍＲＮＡ定量アッセイ
Ｄｅｌｔｅｘ１はＴＡＬＬ株におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の十分に特徴付けられた
標的遺伝子である（Weng et al., 2006, Genes Dev. 20:2096-2109）。１×１０４個のＴ
ＡＬＬ−１細胞／ウェルを、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番
号３６１０）内の１００μｌ培地（１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリンストレプト
マイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０）中に播種した。同じ日に、抗体および化合物希
釈物を１Ｘ ＰＢＳ中で調製し、そこからの５μｌの２０Ｘ抗体または化合物希釈物をウ
ェルごとに加えた。ＤＡＰＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５６５７７０）およ
びＤＭＳＯ（ＡＴＣＣ、カタログ番号４−Ｘ−５）はこのアッセイに使用した化合物であ
った。細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて７２時間、抗体または化合物とインキュベートした
。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ９６キットを使用してＲＮＡを単離した。ＴａｑＭａｎ逆
転写試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴ
Ｃ−２２５サーマルサイクラーを使用してｃＤＮＡを作製した。Ｄｅｌｔｅｘ１（ＤＴＸ
１）（Ｈｓ００２６９９９５＿ｍ１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびハウ
スキーピング遺伝子ＰＰＩＡ（Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）についての遺伝子発現プローブと共にＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＴａ
ｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを実施した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔリアルタ
イムＰＣＲシステムで実施した。Ｄｅｌｔｅｘ １のレベルを定量するために、２−［デ
ルタ］［デルタ］Ｃｔ法を利用した。デルタデルタＣｔの算出は、対象の試料のＣｔ値を
未処置の試料またはＤＭＳＯ処置した試料などの対照と比較することを含む（Schmittgen
and Livak (2008) Nature Protocols 3: 1101-1108）。
概要および考察
図１１Ａ〜Ｂに示されるように、ＮＲＲドメインまたはＥＧＦ３２−ＮＲＲドメイン（
２０３５０、２０３５８、２０３３７）に対するパニングから識別されたＮｏｔｃｈ３抗
体は、ＴＡＬＬ−１細胞におけるＤｅｌｔｅｘ１ ｍＲＮＡ発現を強く阻害した。対照的
に、ＬＢＤドメイン（２０３６４）に対する抗体はＤｅｌｔｅｘ１ ｍＲＮＡを顕著に阻
害しなかった。加えて、２０３５０、２０３５８、２０３３７は用量依存的にＴＡＬＬ−
１増殖を顕著に阻害した。Ｎｏｔｃｈ３抗体を他のＴＡＬＬ細胞株（ＤＮＤ４１、Ｐ１２
−Ｉｃｈｉｋａｗａ、ＳＵＰＴ１、ＳＵＰＴ１１およびＲＰＭＩ−８４０２）のパネルに
おいて試験した場合、増殖に対する効果は検出されなかった。
〔実施例８〕
Ｎｏｔｃｈ３細胞内ドメインのガンマセクレターゼ切断型を検出するネオエピトープ抗体
の生成
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を一連のタンパク質分解切断によって活性化する。ガンマセク
レターゼ複合体はＮｏｔｃｈ受容体の最後の切断を媒介し、最終的に核へ移行するＮｏｔ
ｃｈ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を生じてＮｏｔｃｈ標的遺伝子転写を活性化する。ネオエ
ピトープ抗体を生成して、アミノ酸Ｇｌｙ１６６１とＶａｌ１６６２（ヒトＮｏｔｃｈ３
）との間で切断した場合のみ、Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ（ＩＣＤ３）のガンマセクレターゼ
切断型を検出した。
ＩＣＤ３ウサギポリクローナル抗体の生成
免疫付与および陰性選択（欠失ペプチド）のために使用したペプチドを示す。
免疫付与ペプチド：Ｈ２Ｎ−ＶＭＶＡＲＲＫ（ｄＰＥＧ４）Ｃ−アミド（配列番号２７
８）
欠失ペプチド：Ａｃ−ＶＩＬＶＬＧＶＭＶＡＲＲＫ（ｄＰＥＧ４）Ｃ−アミド（配列番
号２７９）。ウサギポリクローナル抗体を標準的手順を使用してＣｏｖａｎｃｅにて生成
した。簡潔に述べると、７７日プロトコールを、５００μｇの免疫ペプチドおよびフロイ
ントアジュバントによる最初の追加免疫により利用した。５００μｇの免疫ペプチドによ
るさらなる追加免疫を２１、４２および６３日に実施した。ガンマセクレターゼ切断後、
ネオエピトープではなく、Ｎｏｔｃｈ３のＶＭＶＡＲＲＫ（配列番号２４３）配列を認識
する非特異的抗体を欠失させるために、欠失ペプチドを陰性選択のために使用した。「陰
性」親和性クロマトグラフィーによって欠失ペプチドを使用して、精製した試料を欠失さ
せた。末端システインを使用してペプチドをカラムに結合してペプチドを適切に正しい方
向に配置した。交差反応抗体を試料から取り除き、ＥＬＩＳＡにより確認した。特定のバ
ンドが検出されたかどうかを判定するために、ウサギ由来の血清をＴＡＬＬ１−細胞にお
いてウェスタンブロットによって試験した。
ウサギポリクローナルＩＣＤ３抗体のウサギモノクローナル抗体への変換
ウサギポリクローナル抗体をウサギモノクローナル抗体へ変換するために、免疫ペプチ
ドの最後のＩＶ追加免疫を、選択したウサギで実施した。４日後、脾臓摘出を実施し、ウ
サギハイブリドーマをＥｐｉｔｏｍｉｃｓにおいて標準的手順によって生成した。簡潔に
述べると、１匹のウサギの脾臓由来の全てのリンパ球を単離した。４０×９６ウェルプレ
ートの融合および標準的なＥＬＩＳＡスクリーニングを実施した。全てのＥＬＩＳＡ陽性
ハイブリドーマを２４ウェルプレートまで増やし、免疫ペプチドおよび欠失ペプチドの両
方を用いてＥＬＩＳＡを再び実施した。１３９個の陽性ハイブリドーマ由来の上清をＴＡ
ＬＬ−１細胞におけるウェスタンブロッティングによって分析した。ＥＬＩＳＡ陽性ハイ
ブリドーマのウェスタンスクリーニングに基づいて、３個のハイブリドーマ（７３、１２
８、９５）をサブクローニングのために選択した。ハイブリドーマをサブクローニングす
るために、選択した親ハイブリドーマの限界希釈（０．５個の細胞／ウェル）を実施し、
これらのサブクローンを４×９６ウェルプレートに置いた。免疫ペプチドおよび欠失ペプ
チドの両方を使用してＥＬＩＳＡによってサブクローンを再びスクリーニングした。クロ
ーンを２４ウェルプレートまで増やし、ＥＬＩＳＡ陽性サブクローン由来の上清をＴＡＬ
Ｌ−１細胞におけるウェスタンブロッティングによってスクリーニングした。３個のサブ
クローンからの例示的なウェスタンデータを示す。
ＩＣＤ３抗体を使用したＮｏｔｃｈ３シグナル伝達阻害のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニン
グ
Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤを標的とする抗体を使用して経路活性を評価した。細胞株ＴＡＬ
Ｌ−１はＤＳＭＺから購入し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン
を補足した増殖培地中で通常のように維持した。実験設定：５００万個のＴＡＬＬ−１細
胞を２５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０６３９）内の１
０ｍＬの培地中に播種した。細胞を０．５％ＤＭＳＯまたは１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５６５７７０）のいずれかで７２時間処置した。ＴＡＬＬ
−１細胞を沈降させ、次いでＰＢＳ中で洗浄した。Ｎ−エチルマレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３０３０）およびプロテアーゼおよびホスファ
ターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号７８４４４）を加えることにより、細胞を６
０μＬの１Ｘ細胞溶解緩衝液（ＣＳＴ、カタログ番号９８０３）中で溶解させた。ＢＣＡ
法を使用してタンパク質定量を実施し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５マイクロプレートリ
ーダーで読み取った。３０μＬのタンパク質試料を４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００６−１）中にウェルごとに充填した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：１８０Ｖにて約９０分間、１ＸＮｕＰａｇｅ ＭＯＰＳ ＳＤＳラ
ンニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００１）中で標準的な条件
下で試料を流した。ニトロセルロース膜（ｉＢｌｏｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移す前
に、ゲルを、２０％メタノールを有する２×トランスファー緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、カタログ番号ＮＰ０００６−１）中に浸した。膜を４％ミルク−ＴＢＳＴ中で１時間
遮断し、ハイブリドーマ上清由来の上清を２％ミルク−ＴＢＳＴ中で１：４に希釈し、穏
やかに振盪しながら４℃にてＯＮ、インキュベートした。ＴＢＳＴによる一連の膜の洗浄
後、二次抗体を４５分間２％ミルク−ＴＢＳＴ中に加えた。ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔ
ｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番
号ＲＰＮ２２３２）を使用して膜を発展させた。
ＩＣＤ３抗体によるＴ細胞急性リンパ性白血病細胞株のパネルのスクリーニング
細胞株ＴＡＬＬ−１（＃ＡＣＣ５２１）、ＲＰＭＩ８４０２（＃ＡＣＣ２９０）、ＤＮ
Ｄ４１（＃ＡＣＣ５２５）、ＳＵＰＴ１１（＃ＡＣＣ６０５）およびＰ１２−Ｉｃｈｉｋ
ａｗａ（＃ＡＣＣ３４）はＤＳＭＺから購入し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ス
トレプトマイシンを補足した増殖培地中に通常のように維持した。細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ
およびＪｕｒｋａｔ細胞はＡｎｄｒｅａｓ Ｓｔｒａｓｓｅｒ（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ
Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
、オーストラリアから商業的に得た。５００万個のＴＡＬＬ−１細胞を２５ｃｍ２組織培
養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０６３９）中の１０ｍＬの培地に入れた
。細胞を沈降させ、次いでＰＢＳ中で洗浄した。細胞を溶解し、ウェスタンを上記のよう
に実施した。ハイブリドーマサブクローン７３−８からの精製した抗体を１：５０００希
釈にてさらなる研究のために使用した、この抗体は本明細書以下において「ＩＣＤ３ Ａ
ｂ」と称し、その配列を表２に詳述する。１：１０００の希釈にてＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａ
ｌｉｎｇ（＃２４２１）からの抗体を使用してＩＣＤ１タンパク質レベルを評価した。
概要および考察
図１２Ａ〜Ｂに示されるように、高レベルのＩＣＤ３タンパク質を、他のＴ細胞急性リ
ンパ性白血病細胞株のパネルではなく、ＴＡＬＬ−１細胞のみにおいて検出した。高いＩ
ＣＤ１レベルは、Ｎｏｔｃｈ１において突然変異を活性化することが知られている、ＨＰ
ＢＡＬＬ、ＲＰＭＩ−８４０２、ＤＮＤ４１、Ｐ１２ ＩｃｈｉｋａｗａおよびＪｕｒｋ
ａｔを含むいくつかのＴＡＬＬ株において検出できる（Weng et al. (2004) Science 306
:269-71）。ＩＣＤ３抗体は、Ｎｏｔｃｈ１突然変異を有するこれらの他のＴＡＬＬ株に
おけるシグナルの欠如により証明されるようにＩＣＤ１と交差反応しない。
〔実施例９〕
抗体処置によるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達阻害のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価
ＣＣＬＥ株のパネルにおけるＮｏｔｃｈ３突然変異状態の評価により、ＮＲＲ突然変異
を有するＴＡＬＬ−１およびＰＥＳＴドメイン突然変異を有するＭＤＡ−ＭＢ４６８が識
別された。ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞はアミノ酸２０３４においてフレームシフト突然変異
を有し、これにより早期停止コドンの導入を生じる。したがって、ＩＣＤ３はウェスタン
ブロットでより速く移動しているバンドとして検出され得る変化した分子量を有する。
ＷＴおよびＭＤＡＭＢ４６８ ＰＥＳＴドメインの部分の配列：
ＷＴ Ｎｏｔｃｈ３配列（ＮＰ＿０００４２６）アミノ酸２０３４末端

ＭＤＡ−ＭＢ４６８配列アミノ酸２０３４末端

最初にこれらの２個の細胞株モデルを使用してＮｏｔｃｈ３シグナル伝達に対するＮｏ
ｔｃｈ３阻害抗体の効果を特徴付けた。ＩＣＤ３抗体によるウェスタンブロットを使用し
てシグナル伝達阻害をモニターした。実験設定：１００万個のＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞を
６０ｍｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０１９６）内の３ｍＬの培地中
に入れたか、または５００万個のＴＡＬＬ−１細胞を２５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０６３９）内の１０ｍＬの培地中に入れた。１０μｇ／ｍ
Ｌの最終濃度のＮｏｔｃｈ３阻害抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８および２０８
０２ならびにＩｇＧ対照で処置する前にプレートを３７℃にて一晩インキュベートした。
抗体をプレートに直接加え、それらを３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間、さらにインキュ
ベートした。加えて、いくつかの細胞を０．５％ＤＭＳＯまたは１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５６５７７０）のいずれかで７２時間処置した。培地
を吸引し、１ｍＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２００１２−０２７）中でリンス
し、プレートから細胞を剥がし、ベンチ上部の遠心分離機で沈降させることによって細胞
を収集した。懸濁細胞を沈降させ、次いでＰＢＳ中で洗浄した。ウェスタンブロットを以
前に記載されたように精製したＩＣＤ３抗体で実施した。
加えて、３個の他の細胞株を、Ｎｏｔｃｈ３抗体処置によるＩＣＤ３レベルおよびシグ
ナル伝達阻害について特徴付けした：−（ｉ）Ｉｓｈｉｋａｗａｈｅｒａｋｌｉｏ０２＿
ＥＲはＮ１５９７ＲにてＮＲＲ突然変異を有し、（ｉｉ）Ａ５４９は２０３４にてＰＥＳ
Ｔフレームシフト突然変異を有し、一方（ｉｉｉ）ＴＥ−１１は２２６０にてＰＥＳＴフ
レームワークシフト突然変異を有する。
概要および考察
図１３Ａ〜Ｂに示されるように、以前に記載されたリガンド駆動ＲＧＡおよびＮｏｔｃ
ｈ標的遺伝子ｍＲＮＡ定量に加えて、ＩＣＤ３のレベルを測定することによってＮｏｔｃ
ｈ３シグナル伝達もモニターできる。ＩＣＤ３レベルはＮｏｔｃｈ３シグナル伝達活性の
膜近接読み出し値である。Ｎｏｔｃｈ抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８によるＴ
ＡＬＬ−１細胞の処置により、減少したレベルのＩＣＤ３が生じた。ＩＣＤ３のレベルは
ＩｇＧ対照試料およびＤＭＳＯ試料において同等であった。このデータはこれらの抗体に
よる処置のときのＤｅｌｔｅｘ１ ｍＲＮＡおよびＴＡＬＬ−１増殖の阻害と一致する。
対照的に、ＩＣＤ３レベルに対する効果は１２２２９処置により検出されなかった。図１
３Ｂに示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞において、アミノ酸２０３４におけるフ
レームシフト突然変異により、早期停止コドンおよびより小さなＩＣＤ３が生じる。この
ＩＣＤ３はウェスタンブロットで、より速く移動しているバンドとして検出され得る。Ｎ
ｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８で処置すると、減少したレ
ベルのＩＣＤ３が検出された。対照的に、２０８０２、ＬＢＤ抗体による処置は対照Ｉｇ
Ｇと比べてＩＣＤレベルが変化しなかった。図１４Ａ〜Ｃに示されるように、Ｉｓｈｉｋ
ａｗａｈｅｒａｋｌｉｏ０２＿ＥＲ、ＴＥ−１１およびＡ５４９細胞におけるＮｏｔｃｈ
３抗体処置のときに、ＩＣＤ３レベルに対する様々な効果が検出された。しかしながら、
試験した全ての細胞株において、２０３５０処置は一貫して顕著に減少したＩＣＤ３レベ
ルを生じた。
〔実施例１０〕
Ｎｏｔｃｈ３増幅細胞株における抗体処置によるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達阻害のｉｎ
ｖｉｔｒｏでの評価
ＨＣＣ１１４３細胞はＮｏｔｃｈ３を増幅することが記載されていた（Yamaguchi et a
l. (2008) Cancer Res. 68:1881-1888）。活性Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達のレベルを、Ｉ
ＣＤ３抗体を使用してこの細胞株において試験した。ＩＣＤ３抗体によるウェスタンブロ
ットを使用してシグナル伝達阻害をモニターした。
実験設定：１００万個のＨＣＣ１１４３細胞を、２５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ、カタログ番号４３０６３９）内の６０ｍｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタ
ログ番号４３０１９６）内の３ｍＬの培地中に入れた。プレートを、１０μｇ／ｍＬの最
終濃度のＮｏｔｃｈ３阻害抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８および２０８０２な
らびにＩｇＧ対照で処置する前に３７℃にて一晩インキュベートした。抗体をプレートに
直接加え、それらを３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間、さらにインキュベートした。細胞
を収集し、ウェスタンブロットを以前に記載されたように実施した。
概要および考察
図１５に示されるように、ＨＣＣ１１４３細胞をＮｏｔｃｈ３について増幅させると、
高レベルのＩＣＤ３を示す。全てのＮｏｔｃｈ３抗体処置により、減少したＩＣＤ３レベ
ルが生じた。１０μｇ／ｍｌにて、２０３５０処理により、ＩＣＤ３レベルの最大の低下
が生じた。
〔実施例１１〕
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ評価
ＰＤ調節を、Ｎｏｔｃｈ３において遺伝子異常（abberations）を有する３つの異種移
植モデル：ＮＲＲ突然変異ＴＡＬＬ−１ヒト白血球モデル、ＰＥＳＴ突然変異ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４６８ヒト胸部モデルおよびＮｏｔｃｈ３が増幅したＨＬＵＸ１８２３患者由来の肺
モデルにおいて調べた。
ＴＡＬＬ−１ヒト白血病異種移植モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ
ＴＡＬＬ−１異種移植片を有するメスのＳＣＩＤベージュ色マウスを単回用量のＮｏｔ
ｃｈ３抗体で処置した。ハンクス平衡塩類溶液の懸濁液中の１０×１０６個の細胞をマウ
スに皮下注射により接種した。腫瘍が３００から５００ｍｍ３の間（ｎ＝３／群）に到達
すると、マウスを無作為に割り当てて、２０ｍｇ／ｋｇ用量の３２０７（ＩｇＧ対照）、
２０３５０、２０３５８または２０８０２を単回で静脈内に与えた。処置後、腫瘍を、選
択した時点で収集し、ＩＣＤ３を以下に記載されるようにウェスタンブロットおよびＩＨ
Ｃにより評価した。
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌異種移植モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移植片を有するメスのＳＣＩＤベージュ色マウスを単回用量
のＮｏｔｃｈ３抗体で処置した。３×３×３ｍｍ３の腫瘍断片をＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫
瘍保有マウス（ドナー）から継代し、左および右脇腹の両方でＳＣＩＤベージュ色レシピ
エントマウス内に皮下移植した。腫瘍が３００から５００ｍｍ３の間（ｎ＝３／群）に到
達すると、マウスを無作為に未処置の対照群に割り当てたか、または２０ｍｇ／ｋｇ用量
の２０３５０を単回で静脈内に与えた。さらなる研究において、ＰＢＳまたは３２０７非
標的化ＩｇＧ対照と比べて２０ｍｇ／ｋｇ用量の２０３５０、２０３５８、２０３３７お
よび２０８０２の単回静脈内注射の効果を評価した。種々の処置後、腫瘍を収集し、ＩＣ
Ｄ３を以下に記載されるようにウェスタンブロットにより評価した。
ＨＬＵＸ１８２３患者由来の肺癌異種移植モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ
抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の活性もまた、Ｎｏｔｃｈ３が増幅した患者由来の原発性肺癌腫瘍
異種移植モデル、ＨＬＵＸ−１８２３において評価した。これらの研究において、ＤＭＥ
Ｍ中に５０％フェノール−レッドフリーマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を
含有する３×３×３ｍｍ３の腫瘍断片をｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植すると、移植後３０
日で約２５０ｍｍ３に到達した。腫瘍が３００から５００ｍｍ３の間（ｎ＝３／群）に到
達すると、マウスを無作為に割り当てて、ＰＢＳまたは３２０７非標的化ＩｇＧ対照抗体
もしくは２０３５８もしくは１２２２９（２０３６４および２０８０２が由来する親抗体
）のいずれかの単回の２０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量のいずれかを与えた。種々の処置後、
腫瘍を収集し、ＩＣＤ３を以下に記載されるようにウェスタンブロットにより評価した。
腫瘍細胞溶解物の調製およびＩＣＤ３ウェスタン
腫瘍試料を、３０Ｈｚにて１分間、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）
を使用して完全ミニＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ、カタ
ログ番号０４６９３１５９００１）を有する２００〜４００μＬのＴ−ＰＥＲ組織タンパ
ク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号７８５１０）に溶解した。１つの５ｍｍステ
ンレス鋼ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号６９９６５）を組織溶解に役立つようにチ
ューブごとに置いた。ビーズ除去後、次いで試料を、４℃にて１５分間最高速度で、ベン
チ上部の遠心分離機で遠心分離した。上清を回収し、後の時間の研究のための−８０℃ま
たはＢＡＣ法（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３２５５０）を使用して評価したタンパク
質濃度のいずれかで保存し、ＩＣＤ３についてのウェスタンブロットを以前に記載された
ように実施した。適用可能な場合、ウェスタンをまた、完全長Ｎｏｔｃｈ３抗体で実施し
て全レベルのＮｏｔｃｈ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃２８８９、１：１０００
希釈）を検出した。
ＩＨＣによるＩＣＤ３レベルの検出
異種移植腫瘍を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。５μｍ切片を荷
電したポリリシンでコーティングしたスライドガラス上に置いた。免疫組織化学プロトコ
ールを自動システムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＵＬＴＲＡ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｓｙｓｔｅｍ）で最適化した。
切片を６０℃にて８分間ベークし、続いて脱パラフィン化した（deparaffination）。
抗原回復を、７６分間高温にて、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１、わ
ずかに塩基性ｐＨを有するＴＲＩＳ系緩衝液）において達成した。抗原の非特異的結合の
遮断を、特異的Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ（カタログ番号７６０−４２０４）
を使用して継続した。一次抗体Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ（２０μｇ／ｍｌ）を３７℃にて６
０分間インキュベートし、続いて二次抗体を３２分間インキュベートした。製造業者の仕
様書に従って特異的Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＨＱキット＃７
６０−０５２（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して増幅ステ
ップを実施した。検出をジアミノベンジジン（diaminobenzydine）（ＤＡＢ）を用いて達
成し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。全てのこれらのステップはＶｅｎｔａｎａ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＵＬＴＲＡ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ
）で実施した。
概要および考察
図１６〜１８はいくつかの異種移植モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ研究を示す
。本出願の上記に記載されたように、Ｎｏｔｃｈ３抗体を用いたＴＡＬＬ−１細胞のｉｎ
ｖｉｔｒｏでの処置により、Ｄｅｌｔｅｘ１ ｍＲＮＡレベルおよびＩＣＤ３タンパク
質レベルの両方によって評価されるようにシグナル伝達の阻害が生じた。ＴＡＬＬ−１細
胞を異種移植片として増殖させ、マウスをＮｏｔｃｈ３抗体で処置した。ＴＡＬＬ−１腫
瘍におけるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達の変化を、ウェスタンブロッティングまたはＩＨＣ
によってＩＣＤ３レベルを評価することによってモニターした。抗体２０３５０または２
０３５８での処置により、図１６Ａ〜Ｂに示されるように減少したレベルのＩＣＤ３が生
じた。ＩＨＣによるＩＣＤ３染色は図１６Ｂに示されるように腫瘍切片における黒／濃い
灰色の細胞により示される。腫瘍におけるＩＣＤ３レベルを最後のＮｏｔｃｈ３抗体投与
の７２時間後に評価し、まだいくつかの細胞が、強いＩＣＤ３発現を示した腫瘍内に存在
した。ＭＤＡ−ＭＢ４６８モデルにおいて、ウェスタンブロッティングによって評価され
るように、２０３５０で処置した動物は、未処置の対照マウスと比べて、投与の２４時間
および７２時間後にＩＣＤ３の顕著な減少を生じた（図１７Ａ）。７２時間の時点で、２
０３５０、２０３５８および２０３３７（これらの全てはＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲを標的と
する）は、ＰＢＳおよび３２０７（ＩｇＧ）対照と比べて、ＩＣＤ３レベルの減少を誘導
した。対照的に、２０８０２（これはＮＲＲの外側のＮｏｔｃｈ３の領域を標的とする）
による処置後、ＩＣＤ３レベルは対照レベルと同様に見える（図１７Ｂ）。ＨＬＵＸ１８
２３ Ｎｏｔｃｈ３−遺伝子増幅モデルにおいて、ウェスタンブロッティングによって評
価されるように、２０３５８または１２２２９のいずれかで処置した動物は、対照マウス
と比べて、投与の７２時間後にＩＣＤ３の顕著な減少を生じた（図１８）。まとめると、
これらのデータは、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体が、ＮＲＲまたはＰＥＳＴドメインのいず
れかにおけるＮｏｔｃｈ３遺伝子増幅または突然変異の存在下でＮｏｔｃｈ３シグナル伝
達を阻害できるのに対して、この領域の外側で増加したＮｏｔｃｈ３抗体は遺伝子増幅の
存在下でＮｏｔｃｈ３シグナル伝達のみを阻害でき、突然変異の存在下で、より限定され
た活性を有することを実証している。
〔実施例１２〕
ＴＡＬＬ−１異種移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏでの効果
ルシフェラーゼを構成的に発現するＴＡＬＬ−１細胞株の生成
ＴＡＬＬ−１細胞株にｐＭＭＰ−ＬｕｃＮｅｏレトロウイルス（ＵＳ７３９９８５１を
参照のこと）を形質導入し、数週間、１ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８）中で選
択した。ＴＡＬＬ−１＿Ｌｕｃ細胞は、このレトロウイルスが不在であったＴＡＬＬ−１
細胞と比較して高レベルのルシフェラーゼを発現する。野生型およびルシフェラーゼ型（
luciferased）細胞を、Ｎｏｔｃｈ３抗体阻害剤を用いた増殖実験に供すると、同一の結
果を示し、感染がＮｏｔｃｈ３阻害に対するＴＡＬＬ−１感受性を妨げなかったことが示
唆される。
ＴＡＬＬ−１細胞株異種移植モデルにおけるＮｏｔｃｈ３抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性の評
価
ハンクス平衡塩類溶液の懸濁液中の１０×１０６個のＴ−ＡＬＬ１＿Ｌｕｃ細胞を皮下
注射によりマウスに接種し、Ｘｅｎｏｇｅｎ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化システム（Ｃａｌｉ
ｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して腫瘍の存在をモニターした。腫瘍の存
在は７日までに検出可能であった。１１日目に、腫瘍保有動物を無作為に割り当てて、１
週間に２回、単一の薬剤として、静脈内用量のＰＢＳあるいは２０ｍｇ／ｋｇの３２０７
陰性対照ＩｇＧ抗体またはＮｏｔｃｈ３抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８もしく
は２０８０２のいずれかを与えた。Ｘｅｎｏｇｅｎ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化システムを使
用して腫瘍サイズをモニターした。
概要および考察
図１９に示されるように、２０３５８および２０３５０は、この研究において評価した
抗体の最大の抗腫瘍活性を示した。図１９Ａは、研究の時間的経過にわたる種々の処置後
に得た発光シグナルのグラフ表示を示し、図１９Ｂは、２９日（腫瘍サイズに起因して画
像化することが可能であった最後の時点）における対照群および４３日における抗Ｎｏｔ
ｃｈ３抗体処置群の発光シグナルを示す。
〔実施例１３〕
Ｂｉａｃｏｒｅを用いたＮＲＲ Ｎｏｔｃｈ３抗体のエピトープビニング
Ｂｉａｃｏｒｅによるエピトープビニングを実施してＮｏｔｃｈ３抗体（ＩｇＧまたは
Ｆａｂ断片）を同一または顕著に重なるエピトープ、すなわち互いの結合を阻害できる抗
体の群に分類した。
Ｂｉａｃｏｒｅを用いた実験設定エピトープビニング
Ｂｉａｃｏｒｅにおけるエピトープビニングのために、低密度の固定化または捕捉抗原
を有するセンサーチップを使用した（速度実験に相当する）。ＫＤ判定に関して同じ試料
の必要条件を適用した（すなわち単量体含有量）。チップの調製（抗原固定化／捕捉）に
関する実験条件および再生条件はＢｉａｃｏｒｅにおけるＫＤ判定と同一であった。エピ
トープの飽和を達成するために、１つの抗体につき１つの（高い）濃度のみを使用した（
例えば、９０秒間２５０ｎＭ）。
抗体試料を、完全要因アッセイ設計においてペアワイズ、例えば２つの抗体試料、Ａお
よびＢについて注入し、以下のペアワイズの注入を必要とした：Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ａ
、Ｂ−Ｂ。
センサーチップは第１の注入により抗体で飽和されなければならないので、第２の抗体
は異なるエピトープの場合にのみ結合できた。結合抗体の完全な再生は各々の二重注入の
後に実施されなければならなかった。
対照、すなわち同一の抗体（Ａ−Ａ、Ｂ−Ｂ）の二重注入の評価のために、各々の注入
の最後におけるそれらの結合レベルを評価した：第２の注入はさらなる結合を与えないと
予想された。異なる抗体試料対の二重注入を整合性のために比較した。例えば注入Ａ−Ｂ
により、Ｂ（異なるエピトープ）のさらなる結合が生じる場合、Ｂ−Ａの注入もＡのさら
なる結合を生じると予想された。
このような不一致を生じることについての起こり得る原因は、例えば、部分的に重なる
エピトープまたはＫＤの大きな相違であった。
概要および考察：
全てのペアワイズ抗体注入の評価をまとめている図２０を編纂し、これによりエピトー
プ群またはビンが判断され得るそれらの相互阻害状態が示される。これらの研究に基づい
て、ファージディスプレイスクリーニングから識別されたＮＲＲ抗体が異なるコンフォメ
ーショナルエピトープを有することが決定された。図２０に示されるように、２０３４５
が最初に加えられ、続いて２０３５０または２０３５１のいずれかが加えられた場合、さ
らなる結合は検出されなかった。実験においてどの抗体が最初に加えられたかに関係なく
同様の情報を得た。したがって、２０３４５、２０３５０および２０３５１は重なるエピ
トープを有し、それは濃い灰色の陰影で表に指定されている。このエピトープはＮＲＲ＿
Ｂと定義される。２０３３７が最初に加えられた場合、Ｂｉａｃｏｒｅへのさらなる結合
が、二番目に加えられる以下の抗体：２０３４５、２０３５０、２０３５１、２０３５８
およびＡ４のいずれかで検出され得る。２つの抗体の添加の順序が逆転された場合、同じ
結論に達した。したがって、２０３３７は、試験される他の抗体のいずれかに対する異な
るエピトープを有し、エピトープＮＲＲ＿Ａと指定された。２０３５８が最初に加えられ
た場合、さらなる結合を２０３３７、２０３４５、２０３５０および２０３５１で検出し
た。２つの抗体の添加の順序が逆転された場合、同じ結論に達した。したがって、２０３
５８は、試験されるこれらの他の抗体に対する異なるエピトープを有し、エピトープＮＲ
Ｒ＿Ｃと指定された。対照的に、２０３５８が最初に加えられ、Ａ４が二番目に加えられ
た場合、最小のさらなる結合が存在した（概要表において薄い灰色の陰影を有する細胞を
参照のこと）。この結果をさらなるＢｉａｃｏｒｅ研究においてさらに確認した。これら
の実験において、Ａ４または２０３５８のいずれかを適切なセンサーチップに固定し、Ｎ
ｏｔｃｈ３ ＮＲＲ（配列番号２８２）を表面上に流し、センサー表面に固定せず、Ｎｏ
ｔｃｈ３ ＮＲＲに結合する他の抗体の能力を評価した。これらのアッセイ条件下で、２
０３５８は、固定化Ａ４に結合したＮｏｔｃｈ３に結合できること、およびＡ４もまた、
センサー表面上で固定化２０３５８に結合したＮｏｔｃｈ３に結合できることが見出され
た。このデータは、実施した他の研究ならびにＡ４および２０３５８がＮｏｔｃｈ３ Ｎ
ＲＲ内の異なるエピトープに結合するという結論と完全に一致する。さらに、Ａ４が最初
に加えられた場合、さらなる結合を、以下の抗体：２０３３７、２０３４５、２０３５０
、２０３５１を二番目に加えた場合に検出した。２つの抗体の添加の順序が逆転された場
合、同じ結論に達した。したがって、Ａ４は、２０３３７、２０３４５、２０３５０、２
０３５１に対する異なるエピトープを有し、エピトープＮＲＲ＿Ｄと指定された。
〔実施例１４〕
２０３５０およびＮＲＲならびに２０３５８およびＮＲＲを用いた共結晶構造研究
２０３５０または２０３５８のＦａｂ断片に結合したヒトＮｏｔｃｈ３陰性調節領域（
ＮＲＲ、配列番号２８２）の２つの結晶構造を決定した。以下に詳述されるように、Ｎｏ
ｔｃｈ３ ＮＲＲを発現し、精製し、２０３５０または２０３５８Ｆａｂと混合して複合
体を形成した。タンパク質結晶学を利用し、２０３５０または２０３５８Ｆａｂのそれぞ
れに結合したＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲについての原子分解データを生成して、それらのエピ
トープを（抗体残基まで５Å距離内のＮｏｔｃｈ ＮＲＲ残基として）定義した。
タンパク質産生
結晶学のために産生したＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ、２０３５０Ｆａｂおよび２０３５８Ｆ
ａｂの配列を以下に示す。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの構築物は、組換え発現ベクター（小文
字で示される、配列番号２８２）由来のＮおよびＣ末端残基と共に、ヒトＮｏｔｃｈ３（
ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｑ９ＵＭ４７、配列番号１）の残基１３７８〜１６４０（下線）を
含む。マウスＩｇＧカッパ軽鎖由来のＮ末端シグナル配列を分泌発現のために使用し、発
現の間に切断し、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのインタクトなＮ末端を残した。２０３５０およ
び２０３５８Ｆａｂについて、重鎖および軽鎖の配列を示す（配列番号−６ ２８３、２
８４、２８５および２８６）。
結晶構造決定のために使用したタンパク質
構築物：
ヒトＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ（Ｑ９ＵＭ４７）

Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ

２０３５０Ｆａｂ重鎖
２０３５０Ｆａｂ軽鎖
２０３５８Ｆａｂ重鎖
２０３５８Ｆａｂ軽鎖

Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの産生
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲをＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ−細胞（ＡＴＣＣ）において分泌タ
ンパク質として発現した。１ｍｇのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ構築物ＤＮＡを５０ｍｌのＯｐ
ｔｉＭＥＭＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で希釈し、３０分間、５０
ｍｌの同じ培地中で２．５ｍｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベート
した。次いで混合物を、トランスフェクションのために８％のＣＯ２で３７℃にて、１０
０万個の細胞／ｍｌでＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の懸濁液中で増殖する１ＬのＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ−細胞内に
加えた。７２時間後、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲを含有する培地を遠心分離により収集した。
３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を培地中に加え、４℃
にて一晩連続して撹拌した。翌日、樹脂を重力カラム内に充填し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールで洗浄した。標的タンパク
質を同じ緩衝液および３００ｍＭイミダゾールで溶出し、４℃にて一晩、２０ｍＭ Ｈｅ
ｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２中で透析した。次い
でタンパク質を１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２（緩衝液Ａ）で３倍に希釈した。希釈したタンパク質を、緩衝液Ａおよび４％の
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１Ｍ ＣａＣｌ２および１０ｍＭ ＣａＣｌ２（緩衝
液Ｂ）中で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上
に負荷した。Ｑカラムを緩衝液Ａおよび２％〜１００％の緩衝液Ｂの勾配により溶出した
。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲを含有する主要ピークを収集し、４℃にて一晩、３０単位／ｍｇ
の標的タンパク質にてフーリン（ＮＥＢ）で処置した。次いで、フーリン処置したタンパ
ク質を濃縮し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化し
たＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷し
た。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより分析し、プールしてＦａｂと複
合体化した。
２０３５０および２０３５８Ｆａｂの産生
１００万個の細胞／ｍｌにて増殖する１ＬのＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、３日間、２０３５０（または２０３５８）の完全長ＩｇＧを含有
する１ｍｇのＤＮＡ構築物をトランスフェクトした。完全長ＩｇＧを、製造業者のプロト
コールに従ってＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ大容量クロマトグラフィー媒体樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ）によって培地から精製した。次いで精製したＩｇＧを固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）により消化してＦａｂ断片を生成した。具体的には、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ
７．０および１０ｍＭ ＥＤＴＡ中で２０ｍｇ／ｍｌにてＩｇＧを８０：１の重量比にて
固定化パパインと混合した。混合物を３７℃にて一晩１５ｍｌチューブ中で回転させた。
翌日、固定化パパインを重力流カラムにより除去し、ＦａｂおよびＦｃセグメントの両方
を含有するフロースルーを収集し、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥカラム
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷してＦｃセグメントを除去した。Ｆａｂ断片の
みを含有する、このステップからのフロースルーを濃縮し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ
７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ ７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧ
ＥおよびＬＣＭＳにより分析し、次いでプールしてＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲとの複合体を形
成した。
結晶化および構造決定
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０複合体またはＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８複
合体を同じように調製した。精製したＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲを２：１のモル比（ＬＣＵＶ
により測定した濃度）でＦａｂと混合した。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／Ｆａｂ複合体を３０
分間氷上でインキュベートし、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＧＥ Ｈｅａｌ
ｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより分析
した。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／Ｆａｂ複合体を含有する画分を、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／
２０３５０複合体について約２５ｍｇ／ｍｌ、またはＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８
複合体について１８ｍｇ／ｍｌに濃縮した。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／Ｆａｂ複合体を即座
に遠心分離し、結晶化についてスクリーニングした。
結晶をシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。具体的には、ＮＲＲ／２
０３５０複合体について、０．１μｌの複合体を、０．１Ｍ ＮａＡｃ ｐＨ５．６、１
７．５％ＰＥＧ３０００を含有する０．１μｌのリザーバー溶液と混合し、ドロップを２
０℃にて４５μｌのリザーバー溶液に対して平衡化した。
ＮＲＲ／２０３５８複合体について、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１０％ＰＥ
Ｇ８０００、１０％エチレングリコールを使用し、ドロップを２０℃にて４５μｌのリザ
ーバー溶液に対して平衡化した。
データ収集の前に、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／Ｆａｂ結晶を、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２
０３５０複合体についてさらに２２．５％グリセロールを含有するリザーバー溶液に移し
、または液体窒素中で即座に冷却する前にＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８複合体につ
いて２０％エチレングリコールを含有するリザーバー溶液に移した。
回折データをＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）においてベースライン１７−ＩＤにて収
集した。データを処理し、ＨＫＬ２０００（ＨＫＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してスケ
ールした。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０複合体のデータを、セル寸法ａ＝９１．９
２Å、ｂ＝１０４．３５Å、ｃ＝９２．８５Å、アルファ＝９０°、ベータ＝１１３．１
７°、ガンマ＝９０°で空間群Ｃ２において３．２Åに処理した。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ
／２０３５８複合体のデータを、セル寸法ａ＝８８．３４Å、ｂ＝１２３．８６Å、ｃ＝
１５０．５７Å、アルファ＝９０°、ベータ＝９０°、ガンマ＝９０°で空間群Ｐ２１２
１２１において２．１Åに処理した。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／Ｆａｂ複合体の構造を、Ｎ
ｏｔｃｈ１ ＮＲＲ構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＥＴＯ）および検索モデルとして２０３５０
または２０３５８Ｆａｂと最も高い配列同一性を有する社内のＦａｂ構造と共にＰｈａｓ
ｅｒ（McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674）を使用して分子置換によっ
て解明した。最終的なモデルをＣＯＯＴ（Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126
-2132）において構築し、Ｂｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ、ＬＴＤ）で精
製した。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０複合体について、ＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅ
ｅ値はそれぞれ２３．０％および２６．９％であり、結合長さおよび結合角のｒｍｓｄ値
はそれぞれ０．００８Åおよび１．１７°であった。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８
複合体について、ＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅ値はそれぞれ１９．２％および２２．６％
であり、結合長さおよび結合角のｒｍｓｄ値はそれぞれ０．０１０Åおよび１．１３°で
あった。
２０３５０または２０３５８Ｆａｂにおけるいずれかの原子の５Å以内に原子を含有す
るＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの残基をＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）により
識別し、表４および５に記載する。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲとＦａｂとの間の埋もれた表面
積をＣＣＰ４プログラムスーツからのＡＲＥＡＩＭＯＬにより算出する（Winn et al., (
2011) Acta. Cryst. D67:235-242）。
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの構造
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの構造は、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０複合体とＮｏｔｃ
ｈ３ ＮＲＲ／２０３５８複合体との間で非常に類似している。２つの複合体から重ね合
わせているＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの二乗平均平方根距離（ＲＭＳＤ）は０．４２Åであり
、これはＮＲＲがほとんど同一の構造であることを示している。したがって、Ｎｏｔｃｈ
３ ＮＲＲ／２０３５８複合体を、さらに構造を分析するための代表例として使用する。
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲは、Ｎｏｔｃｈ１（Gordan et al., (2009) Blood 113:4381-439
0; Gordon et al., (2009) 4:e6613; Wu et al., (2010) Nature 464:1052-1057）および
Ｎｏｔｃｈ２（Gordon et al., (2007) Nat Struct Mol Biol 14:295-300）のものと同様
の全体のフォールディングを有する。それは、３つのＬｉｎ１２／Ｎｏｔｃｈリピート（
ＬＮＲ）、すなわちＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−ＢおよびＬＮＲ−Ｃ、ならびにＳ１部位（Ｒ１
５７１とＥ１５７２との間）におけるフーリン切断によりＮ末端部分（ＨＤ−Ｎ）および
Ｃ末端部分（ＨＤ−Ｃ）に分けられるヘテロ二量化（ＨＤ）ドメインからなる。
ＮＲＲドメインは、３つのタンパク質分解ステップに関与するＮｏｔｃｈ受容体の活性
化を調節する。フーリン様転換酵素は、Ｎｏｔｃｈ前駆体の成熟の間、ＮＲＲ内のＳ１部
位で切断して、活性化を刺激する。ＡＤＡＭプロテアーゼは、同様にＮＲＲ内のＳ２部位
で切断して、ガンマセクレターゼによるＳ３部位での膜内タンパク質分解のための基質を
生じる。Ｓ３切断の後、Ｎｏｔｃｈの細胞内部分は核に入って転写を活性化する。Ｓ２切
断はこの活性化シリーズの重要なステップであり、ＮＲＲドメインにより負に調節される
。このいわゆる自己阻害の機構はＮＲＲ構造により説明できる。
図２１はＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの全体のＸ線構造を示す。１）タンパク質のＮおよびＣ
末端、２）３つのＬＮＲリピートおよび配位Ｃａ２＋イオン、３）Ｌ１４１９、自己阻害
栓、４）Ｓ１およびＳ２部位、５）ＨＤドメイン内の二次構造、ならびに６）Ｎｏｔｃｈ
１およびＮｏｔｃｈ２と顕著に異なる立体構造を有するＮｏｔｃｈ３における２つの領域
（ＬＮＲ−Ｂ／ＣリンカーならびにＬＮＲ−Ｃの前半およびＨＤドメインにおけるβ４−
α３ループ）が標識される。
Ｎｏｔｃｈ ３ ＮＲＲ構造のように、各々Ｃａ２＋イオンを配位している３つのＬＮ
Ｒは、ＡＤＡＭプロテアーゼによる接近からＳ２部位を保護するためにＨＤ周囲を包み込
む。特に、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカーから保存されているＬ１４１９はＳ２部位内に直接入
り込み、プロテアーゼ接近からそれを立体的に塞ぐ。ＬＮＲとＨＤとの間の相互作用およ
びドメイン内の相互作用の安定性はＮＲＲの自己阻害される立体構造を維持するのに不可
欠である。したがって、関連するがんに見出される突然変異のように、ＮＲＲを不安定化
する突然変異はＮｏｔｃｈ３の活性化を増強できる。他方で、ＬＮＲ−ＨＤ相互作用を安
定化できる抗体のような試薬はＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻害できる可能性がある。
図２２は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２およびＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの配列アラインメ
ントを示す。１）ドメイン名および境界、２）二次構造、３）Ｎｏｔｃｈ３対Ｎｏｔｃｈ
１およびＮｏｔｃｈ２の特有に構造化された領域、ならびに４）Ｓ１およびＳ２部位が標
識される。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲとＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｉ０８）お
よびＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＯＯ４）の構造的重ね合わせにより、１．
６８Åおよび１．４５ÅのＲＭＳＤ値が生じ、これは同様の全体のフォールディングを示
す。しかしながら、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのいくつかの部分は、主に２つの領域ＬＮＲ−
Ｂ／ＣリンカーならびにＨＤドメインにおいてＬＮＲ−Ｃの前半（Ｒ１４６３−Ａ１４７
６）およびβ４−α３ループ（Ｃ１５９１−Ｄ１５９８）において、顕著に異なる立体構
造（ＲＭＳＤ値＞２Å）を有する。興味深いことに、これらの２つの特有の領域の大部分
は２０３５０および２０３５８抗体により捕捉される。詳細な相互作用は次の段落に記載
される。
２０３５０および２０３５８に対するＮｏｔｃｈ３エピトープ
２０３５０エピトープ
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用して、２０３５０に
対するＮｏｔｃｈ３エピトープを識別した。２０３５０ＦａｂによるＮｏｔｃｈ３ ＮＲ
Ｒの相互作用表面を、いくつかの不連続（すなわち非隣接）配列：すなわち、表４に詳述
されるように、残基１４２７〜１４２９、１４４２、１４４４、１４４５、１４４７〜１
４５０、１４５３、１４５８、１４６１、１４６２、１４６４、１５０７、１５０８、１
５１０、１５９２、１５９４〜１５９９、１６０２および１６０６により形成した。これ
らの残基は、図２３に示されるように、２０３５０Ｆａｂにより認識される三次元表面を
形成する。興味深いことに、ＨＤドメインにおけるβ４−α３ループはＮｏｔｃｈ１およ
びＮｏｔｃｈ２と比較して特有の構造を有し、このセグメントの大部分は２０３５０エピ
トープ内にある。さらに、このループはＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８複合体におい
て大部分は構造化されていない（柔軟性に起因して電子密度がない）が、Ｆａｂに直接結
合することによってこの２０３５０複合体において安定化し、構造化されている。

２０３５０Ｆａｂは、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのＬＮＲ（主にＬＮＲ−Ｂ周囲）およびＨ
Ｄドメイン（主にβ４−α３ループ周囲）の両方にわたって結合する。２０３５０Ｆａｂ
とＬＮＲとの間の埋もれた表面積は５５４．９Å２であり、２０３５０ＦａｂとＨＤドメ
インとの間は５３５．２Å２である。Ｆａｂのこの配置は、２０３５０がＬＮＲおよびＨ
Ｄドメインを一緒に保持でき、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの自己阻害立体構造を安定化でき、
Ｎｏｔｃｈ３活性化を阻害できることを示す。
２０３５８エピトープ
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用して、２０３５８に
対するＮｏｔｃｈ３エピトープを識別した。２０３５８ＦａｂによるＮｏｔｃｈ３ ＮＲ
Ｒ上の相互作用表面をいくつかの不連続（すなわち非隣接）配列：すなわち、表５に詳述
されるように、残基１４４０、１４６３、１４６５〜１４７２、１４７４、１４８６、１
４８７、１５３４、１６１８、１６１９および１６２１によって形成した。これらの残基
は、図２４に示されるように、２０３５０Ｆａｂによって認識される三次元表面を形成す
る。興味深いことに、前半のＬＮＲ−ＣにおけるＬＮＲ−Ｂ／ＣリンカーはＮｏｔｃｈ１
およびＮｏｔｃｈ２と比較して特有の構造を有し、このセグメントの大部分は２０３５８
エピトープ内にある。

２０３５８Ｆａｂは、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのＬＮＲ（主にＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーお
よびＬＮＲ−Ｃ周囲）およびＨＤドメイン（主にα３−β５ループ周囲）の両方にわたっ
て結合する。２０３５８ＦａｂとＬＮＲとの間の埋もれた表面積は７２９．６Å２であり
、２０３５８ＦａｂとＨＤドメインとの間は１５２．２Å２である。Ｆａｂのこの配置は
、２０３５８がＬＮＲおよびＨＤドメインを一緒に保持でき、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの自
己阻害立体構造を安定化でき、Ｎｏｔｃｈ３活性化を阻害できることを示す。
２０３５０および２０３５８エピトープは重ならない
２０３５０および２０３５８のエピトープが重なるかどうかを決定するために、Ｎｏｔ
ｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０複合体およびＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８複合体の結
晶構造を、図２５に示されるように、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲに重ね合わせた。この図は、
２０３５０および２０３５８が、重ならないＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ内の異なる別のコンフ
ォメーショナルエピトープに結合することを明確に実証している。実際に、それらは最も
近い領域（２０３５０とのＥ１４６４−Ｒ５４水素結合および２０３５８とのＲ１４６３
−Ｄ１００塩橋）においてさえ十分に分離している。これは、２つの抗体が同時にＮｏｔ
ｃｈ３ ＮＲＲに結合できることを示しており、それらが異なるビンにあり、Ｎｏｔｃｈ
３を結合する際に互いに競合しないことを示すビニング実験と一致する（図２０を参照の
こと）。
２０３５０、２０３５８、２５６Ａ−１３、２５６Ａ−４および２５６Ａ−８の間のエピ
トープ比較
２０３５０および２０３５８のエピトープを２５６Ａ−１３（本明細書以下で「Ａ１３
」と称する）（ＵＳ２００８／０１１８５２０Ａ１）のエピトープならびに２５６Ａ−４
（本明細書以下で「Ａ４」と称する）および２５６Ａ−８（本明細書以下で「Ａ８」と称
する）（ＵＳ７，９３５，７９１Ｂ２）のエピトープと比較した。Ａ１３に関して、その
エピトープは、ＬＮＲ−ＡドメインにおいてＤ１４０２、Ｒ１４０３およびＥ１４０４を
含み、完全に２０３５０および２０３５８のエピトープの外側である。
Ａ４およびＡ８に関して、それらはＮｏｔｃｈ３（ＵＳ７，９３５，７９１Ｂ２）上の
同じエピトープにマッピングされているので、Ａ４エピトープのみを比較のために使用す
る。
図２６に示されるように、２０３５０のエピトープは完全にＡ４のエピトープの外側で
あり、２０３５８のエピトープは重なる可能性がある３つの残基（Ｇｌｕ１６１８、Ａｒ
ｇ１６１９およびＡｓｐ１６２１）を有するが、以下の理由のために可能性はかなり低い
：１）２０３５８のエピトープは単一原子およびそれ故単一残基の分解能までＸ線結晶学
によって決定されたのに対して、Ａ４のエピトープは、３〜８個のアミノ酸残基ストレッ
チの限定された分解能まで突然変異生成によって決定された。Ａ４に対する実際のエピト
ープ、またはそれが直線もしくはコンフォメーショナルエピトープであるかどうかをさら
に定義するための精細エピトープマッピングは行わなかった。これは、３〜８個のアミノ
酸ストレッチ内のＡ４と接触する１つの残基が存在する限り、ストレッチの残りは、その
残基がなくてもエピトープとして定義されることを意味する。したがって、３個のアミノ
酸がＡ４に対するエピトープを実際に構成するかどうかに対して高い程度の不確実性が存
在したままである。２）実施例１３に詳述されたエピトープビニングおよび結合実験は、
２０３５８およびＡ４がＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲを結合する際に互いに競合せず、その両方
はＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲに同時に結合できることを示す。これは、２つの抗体が重なった
エピトープを有しない場合にのみ達成され得る。したがって、２０３５８およびＡ４のエ
ピトープは重ならないと考えられる。
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの構造上にマッピングされたがん突然変異
Ｎｏｔｃｈ３のＮＲＲのさらなる機構の洞察を得るために、がん突然変異をＮｏｔｃｈ
３ ＮＲＲ構造上にマッピングした。構造解析により、これらの突然変異のいくつかがド
メイン内またはドメイン間相互作用を混乱させ、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの自己阻害立体構
造を不安定化させ、Ｎｏｔｃｈ３活性化およびシグナル変換を引き起こすことが示唆され
た。
その一方で、これらの突然変異と２０３５０および２０３５８エピトープとの比較は、
それらのほとんどがエピトープ内に存在しないことを示し、これは、２０３５０および２
０３５８が、Ｎｏｔｃｈ３シグナル変換を阻害するために自己阻害した立体構造において
野生型および突然変異体Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの両方に結合できることを示している。
１群（Ｓ１５８０Ｌ、Ｒ１５１０Ｈ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｙ１６２４Ｈ、Ｒ１５８９Ｑ）
この群における突然変異はＨＤドメイン内の水素結合を損失し、それにより不安定化を
引き起こす。
この群からの代表例はＳ１５８０Ｌである。それは細胞アッセイにおいてＮｏｔｃｈ３
シグナル伝達を活性化し（図１３ａ）、ＴＡＬＬ−１の駆動力である。構造において、（
ＨＤ−Ｎにおいて）Ｓ１５８０の側鎖の酸素は、（ＨＤ−Ｃにおいて）Ｐ１５２１の骨格
窒素との水素結合を形成する。Ｓ１５８０Ｌ突然変異はこの水素結合を損失し得、ＨＤド
メインを不安定化させ得る。Ｓ１５８０がＳ２部位に近い（約１０Å）ことを考慮して、
この不安定化はＳ２部位をＡＤＡＭプロテアーゼにとってより接近しやすくし得るので、
Ｎｏｔｃｈ３の活性化を増強する。
同様に、ＨＤ−ＮにおけるＲ１５１０Ｈ突然変異はＨＤ−ＣにおいてＤ１６０３との水
素結合を損失し得、Ｄ１５８７Ｎ Ｒ１５８９Ｑ突然変異は、最初に２つの残基ｔの間に
存在する塩橋を損失し得、ＨＤ−ＮにおけるＹ１６２４Ｈ突然変異はＨＤ−ＣにおけるＳ
１５２７およびＤ１５３０との水素結合を損失し得る。全てのこれらの突然変異はＨＤド
メインを不安定化させ得、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を活性化する可能性がある。
２群（Ｇ１４８７Ｄ、Ａ１４７６Ｔ、Ａ１６０８Ｔ、Ｌ１５１８Ｍ、Ａ１５３７Ｔ）
この群における突然変異は、ドメイン内の構造完全性に影響を与え得るか、または周囲
残基との衝突を引き起こし得、それによりＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲを不安定化させる。
この群からの代表例はＧ１４８７Ｄである。それは細胞アッセイにおいてＮｏｔｃｈ３
シグナル伝達を活性化する。Ｇ１４８７は、ＬＮＲ−ＣのＣ１４７５−Ｃ１４８８ジスル
フィド結合に隣接し、構造完全性およびこのドメイン内のＣａ２＋配位に不可欠である。
Ｇ１４８７Ｄ突然変異はこのジスルフィド結合の正確な配置を妨げ得、ＬＮＲ−Ｃドメイ
ンを不安定化させる。
Ｌ１５１８は、Ｒ１６２７、Ｙ１５５８およびＩ１５７８の側鎖によって形成される、
Ｓ２部位に隣接する疎水性ポケットに存在する。Ｌ１５１８Ｍ突然変異はこの疎水性ポケ
ットと衝突し得、それによりＳ２部位を不安定化させる。
ＨＤ−ＮにおけるＡ１５３７はＬＮＲ−ＣにおけるＥ１４９２から３．３Åだけ離れて
いる。Ａ１５３７Ｔ突然変異はＥ１４９２と衝突し得、ＬＮＲ−ＨＤ相互作用を不安定化
させる。
３群（Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、Ｒ１５２６Ｃ）
この群における突然変異はＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの表面上にある。Ｎ１５９７Ｋは細胞
アッセイにおいてＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を活性化し（図１４ａ）、これは、これらの
表面突然変異がＮＲＲの不安定化以外の機構、例えばタンパク質間相互作用事象の妨げに
より機能し得ることを示す。
がん突然変異対エピトープ
がん突然変異対２０３５０エピトープ
がん突然変異は２０３５０エピトープの大部分の範囲内にあるか、または外側にあり、
２０３５０は依然として野生型および突然変異体Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの両方に結合でき
ることを示す。
エピトープ内の２つのがん突然変異はＲ１５１０ＨおよびＮ１５９７Ｋである。例えば
、Ｒ１５１０ＨはＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲへの２０３５０の結合を弱め得る。なぜならこの
突然変異は、Ｄ５０との塩橋およびＮ３１との水素結合を含む、軽鎖とのいくつかの相互
作用を損失し得る。
がん突然変異対２０３５８エピトープ
Ｇ１４８７Ｄを除く全てのがん突然変異は２０３５８エピトープの外側にあり、２０３
５８は依然として野生型および突然変異体Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの両方に結合できること
を示す。
Ｇ１４８７ＤはＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲへの２０３５８の結合を弱め得る。なぜならこの
突然変異は、Ｙ１４７１（Ｎｏｔｃｈ３）とＨ５５（２０３５８重鎖）との間の水素結合
と衝突し、破壊し得るからである。
〔実施例１５〕
ヒトＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５０、ヒトＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３５８および
ヒトＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ／２０３３７複合体のＨＤｘ−ＭＳエピトープマッピング
重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）はタンパク質のアミド骨格上の重水素吸収を測定
し、これらの測定はアミドの溶媒露出度および骨格アミドの水素結合ネットワークの変化
に敏感である。ＨＤｘ−ＭＳは、多くの場合、アポ（apo）およびリガンド結合などの２
つの異なる状態におけるタンパク質を比較するために使用され、迅速なペプシン消化と関
連がある。このような実験において、２つの異なる状態の間で異なる重水素吸収を示す、
典型的に１０〜１５個のアミノ酸の領域を位置付けることができる。複合体において保護
される領域はリガンド結合に直接関与するか、またはリガンドの結合によってアロステリ
ックに影響を受けるかのいずれかである。
これらの実験において、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲタンパク質（配列番号２８２）の重水素
吸収を、３つのＩｇＧ抗体：２０３５０（配列番号２８７）、２０３５８（配列番号２８
８）および２０３３７（配列番号２８９）の不在および存在下でカルシウムを用いて測定
した。抗体が結合すると重水素吸収の減少を示すＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲにおける領域はエ
ピトープに関与する可能性があるが、測定の性質に起因して、直接結合部位から離れた位
置の変化（アロステリック効果）を検出することも可能である。アロステリック効果から
の直接結合事象を示すために、直交測定（例えば、以前の実施例に示されたＸ線結晶学）
も行った。
ＨＤｘ−ＭＳ実験に使用されるタンパク質
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ
２０３５０ ＩｇＧ

２０３５８ ＩｇＧ

２０３３７ ＩｇＧ

ＨＤｘ−ＭＳ実験の段落
ＬＥＡＰロボットシステム、ナノＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムおよびＳｙｎａｐ
ｔ Ｇ２質量分析計を備える、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＸプラットフォ
ームでＨＤｘ−ＭＳ実験を実施した。２つの実験方法を使用してＨＤｘ−ＭＳ測定を実施
した。第１の方法において全ての実験αを溶液中で実施し、第２の方法において抗体をビ
ーズに固定して、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗原のペプチド被覆を改善した。
第１の方法において、実験は、ＬｅａｐＳｈｅｌｌソフトウェアにより作動するＬＥＡ
Ｐロボットによって自動化し、重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、Ｕ
ＰＬＣシステムへの注入および消化時間制御を実施した。Ｌｅａｐロボットは、ＨＤｘ反
応のために３７℃に維持され、タンパク質およびクエンチ溶液の保存のために２℃に維持
される２つの温度で制御されたスタックを備える。３連の対照実験を、２５０ｐｍｏｌの
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗原を使用して実施した。抗原は、３７℃にて４０分間、９０．０
％Ｄの最終重水素濃度にて重水素化Ｔｒｉｓ緩衝液（Ｄ２Ｏ中の１５ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．６）に交換した。
重水素交換は、２℃にて５分間、交換溶液を（６Ｍ尿素および１Ｍ ＴＣＥＰ ｐＨ＝２
．５）と１：１で希釈することによってクエンチした。クエンチ後、試料をＷａｔｅｒｓ
ＵＰＬＣシステムに注入し、そこでその試料を、１２℃に維持した固定化ペプシンカラ
ムを使用して消化した。消化後、ペプチドをＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ ２
．１×５ｍｍプレカラム上に保持した。次いでペプチドをプレカラムから溶出し、８分の
２〜３５％アセトニトリル勾配を使用してＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８ １
．０×１００ｍｍカラム上で分離した。次に、３連の実験を抗原−ｍＡｂ複合体で実施し
た。これらの実験において、２５０ｐｍｏｌのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗原を、室温にて１
５分間、Ｔｒｉｓ緩衝液（水中の１５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、
１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．６）中で３７５ｐｍｏｌの抗体とプレインキュベー
トした。全ての他の実験パラメータは対照実験と同一であった。
ＬＮＲ−ＢドメインにおけるＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲのペプチド被覆を改善するために、
ＬＣ−ＭＳ実験における抗体シグナルを最小化するためにビーズへのｍＡｂの固定化を組
み込む第２のＨＤｘ−ＭＳ法を使用した。この方法において、３連の対照実験を以下のよ
うに実施した。４００ｐｍｏｌのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗原を、予め加温した３７℃の９
９％重水素化ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．６）中で希釈し、Ｔｈｅｒｍｏミキサー（７００
ｒｐｍ）において３７℃にて４０分間インキュベートする（％Ｄ＝９６．１％）。重水素
交換を、氷上で５分間、冷クエンチ緩衝液（６Ｍ尿素および１Ｍ ＴＣＥＰ ｐＨ＝２．
５）との１：１希釈によりクエンチした。クエンチ後、チューブをＬＥＡＰシステムに移
し、クエンチした試料を分析のためにＵＰＬＣシステム上にＬＥＡＰシステムにより注入
した。ＵＰＬＣシステムは作動中のペプシン消化（１２℃に維持した）を組み込む。８分
の２〜３５％アセトニトリル勾配およびＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８ １．
０×１００ｍｍカラムを分離のために使用した。次に、抗体を使用して３連の実験を実施
した。２０３５０および２０３５８抗体を、標準的な技術を使用してプロテインＧアガロ
ースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号２２８５１）に固定した。簡潔に述べると、抗体
を遠心分離して保存緩衝液を除去した。次いで２００μｌのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．６
）および４００ｐｍｏｌのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲを固定化Ａｂに加え、２５℃にて１５分
間インキュベートした。インキュベーション後、複合体を遠心分離し、２００ｕｌのＴＲ
ＩＳ緩衝液で洗浄し、再び遠心分離した。重水素交換のために、２００μＬの重水素化Ｔ
ＲＩＳを、３７℃にて４０分間、インキュベーションのために抗原−抗体複合体に加えた
（％Ｄ＝９６．１％）。次いで重水素緩衝液を除去し、即座に１２５μＬの氷冷クエンチ
緩衝液を加えた。クエンチ後、カラムを遠心分離し、フロースルーを予冷したＨＰＬＣバ
イアルに移し、同じ作動中のペプシン消化／ＬＣ−ＭＳ設定を使用して分析した。
ＨＤｘ−ＭＳの結果 ２０３５０および２０３５８
ＨＤｘ−ＭＳの結果を図２７および図２８にまとめる。図２７は２０３５０および２０
３５８の不在（対照）および存在下でのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲペプチドについての平均重
水素吸収を示す。図２７において、２つの相違：対照とｍＡｂとの間の相違およびｍＡｂ
間の相違を試験することは有用である。図２８は２０３５０および２０３５８抗体につい
てのアポと結合状態との相違を示す。０．５Ｄａ未満の相違（例えば、未結合のＮｏｔｃ
ｈ３ ＮＲＲ対照と比べて変化なし）は重要でないと考えられる。相違の試験により、Ｉ
ｇＧ結合に対して保護されるＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの領域を決定することができる。
図２７および２８から、ＬＮＲ−Ａ領域において、保護の全体のわずかな量が存在した
。この観察は、２０３５０と２０３５８抗体のどちらも、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのこの領
域と顕著に相互作用しないことを示唆している。ＬＮＲ−Ｂドメインにおいて、特にペプ
チド１４３２〜１４６３において保護が増加した。このペプチドはＬＮＲ−Ｂの大部分お
よびＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの一部におよび、固定化抗体実験においてのみ検出された。
ＬＮＲ−Ｂ／ＣリンカーおよびＬＮＲ−Ｃ領域において、少しのペプチド（１４５７〜１
４７１、１４５７〜１４７２および１４５７〜１４８９）は２０３５８において保護され
るが、これらのペプチドは２０３５０において保護されない。Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲへい
ずれかの抗体を結合することによって保護されなかったより短い領域１４７８〜１４８９
も検出された。この情報により、２０３５８により異なって保護される領域は１４５７〜
１４７７に及ぶ領域であると推測できる。最後に、ＬＮＲ−Ｃ（１４９０〜１５００）に
おける１つの他の領域は両方の抗体により保護された。ＨＤ−Ｎドメインにおいて、１５
３２〜１５４５に及ぶ領域を除いて、調べた抗体のいずれによる保護も観察されなかった
。ＨＤ−Ｃドメインにおいて、領域１５８０〜１５８３、１５９２〜１６１６および１６
１７〜１６２８は、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲへの２０３５０または２０３５８のいずれかの
結合に対して重水素交換から両方とも保護された。
図２９は、実施例１４に示されるＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ結晶構造を使用してＨＤｘ−Ｍ
Ｓ実験において保護された領域のマップを示す。構造上で保護された領域をマッピングす
ることにより、タンパク質の表面上に存在する領域（エピトープを形成するのに関与する
可能性がある）から構造内に多く埋もれる保護領域（アロステリック効果の可能性）を示
すことができる。例えば、図２７および２８において、α３ヘリックスの中心部分に対応
する領域１６０９〜１６１６は、たとえそれが２０３５０または２０３５８のいずれとも
直接相互作用しなくても両方の抗体によって実質的に保護される。保護は、性質上、アロ
ステリックであり、抗体が結合すると、α３ヘリックスを取り囲む、ＬＮＲドメインの安
定化に起因し得る。α３ヘリックスを取り囲むＬＮＲドメインの安定化は、後で重水素接
近性をα３ヘリックスの中心に制限し得る。α３ヘリックス保護はまた、抗体が結合する
と、α３ヘリックス水素結合ネットワークの安定化の増加に起因し得る。
表面上の保護を調べることにより、領域１４５７〜１４７７が表面上に位置することが
即座に観察された。全ＬＮＲ−Ｂ／ＣリンカーおよびＬＮＲ−ＣのＮ末端に及ぶこの領域
は、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲへ２０３５８が結合したときにのみ保護され、２０３５０では
保護されなかった。この領域における異なる保護を使用して２０３５０および２０３５８
抗体を識別することができ、これはＸ線結晶学研究（実施例１４）と一致する。表５から
、領域１４５７〜１４７７は２０３５８複合体に埋もれている１１個の残基を含有する。
対照的に、表４は、この領域が２０３５０複合体に埋もれている４個のみの残基を含有す
ることを示す。図２９から、両方の抗体がまた、ＬＮＲ−Ｂドメインと実質的に相互作用
と解釈することができる。Ｘ線結晶学（実施例１４）から、２０３５０のみがこの領域（
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲにおける１個の埋もれた残基に対して９個）と実質的に相互作用す
る。ＨＤｘ−ＭＳ実験における制限された分解能およびアロステリック効果に対する感受
性は誤った解釈の原因となる可能性がある。以前に述べられているように、ＬＮＲ−Ｂド
メインにおいて、最も保護されたペプチドは１４３２〜１４６３の範囲の３１アミノ酸に
及ぶ。このペプチドは両方の結晶構造に埋もれている残基を含有する（２０３５８におい
て２個の埋もれた残基に対して２０３５０において１１個の埋もれた残基）。両方の複合
体は１４３２〜１４５７からの同様の保護を有するので、近接するＬＮＲ−Ｃドメインに
おいて２０３５８の結合はまた、この領域においていくつかのアロステリック保護を誘導
するように見える。最後に、ＬＮＲ−ＡのＣ末端およびＡ／Ｂリンカーを含有する、より
小さなペプチド（例えば、１４２０〜１４３０）もまた、両方の抗体によるいくつかの（
および等しい）保護を示す。Ｘ線結晶学（実施例１４）は、この領域が２０３５０複合体
においてのみ埋もれたことを示す。ＨＤｘ−ＭＳデータは、この領域がまた、２０３５８
が結合すると、アロステリックに保護され、２０３５８の直接結合事象から識別できない
ことを示唆している。
最後に、図３０はＨＤｘ−ＭＳによって決定した保護された領域の概要を提供し、それ
らを、Ｘ線結晶学研究（実施例１４）からの埋もれた残基と比較する。全体として、ＨＤ
ｘ−ＭＳ実験はＸ線結晶学によりほとんど全ての埋もれた残基を含有する保護された領域
を検出する。以前に述べられているように、α３ヘリックスの中心などの、性質上、アロ
ステリックである可能性がある、保護のいくつかのさらなる領域も検出された。
ＩｇＧ抗体２０３３７についてのＨＤｘ−ＭＳ実験および結果
カルシウムの不在下でＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲを用いた予備実験もまた、自動化ＨＤｘ−
ＭＳシステムを使用して２つの以前に記載されたＩｇＧ抗体および１つのさらなるＩｇＧ
抗体：２０３３７（配列番号２８９）の存在下で未結合のＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲおよびＮ
ｏｔｃｈ３を使用して実施した。これらの実験において、２００ｐｍｏｌのＮｏｔｃｈ３
ＮＲＲ（対照）または２００ｐｍｏｌのＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ＋３００ｐｍｏｌのＩｇ
Ｇ抗体を、３７Ｃにて４０分間、Ｄ−ＰＢＳ（最終％Ｄ＝８８．３％）に交換する。重水
素交換を、２℃にて５分間、（６Ｍ尿素および１Ｍ ＴＣＥＰ ｐＨ＝２．５）を有する
交換溶液を１：１に希釈することによってクエンチした。クエンチ後、試料をＷａｔｅｒ
ｓ ＵＰＬＣシステム上に注入し、そこで、１２℃に維持した固定化ペプシンカラムを使
用してその試料を消化した。消化後、ペプチドをＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３
２．１×５ｍｍプレカラム上に保持した。次いでペプチドをプレカラムから溶出させ、
８分の２〜３５％アセトニトリル勾配を使用してＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１
８ １．０×１００ｍｍカラム上で分離した。
図３１の左側は、Ｃａ２＋の不在下で２０３５８または２０３３７のいずれかと複合体
化したＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲについてのＨＤＸ−ＭＳ相違プロットを示す。このプロット
の試験により、これらの２つの抗体間で異なって（differtially）保護される領域を見る
ことができる。例えば、領域１４１９〜１４３２および１４５６〜１４８８は２０３３７
と比べて２０３５８の存在下で、より保護された。対照的に、領域１４８９〜１４９８、
１５００〜１５０６、１５３８〜１５６８、１５７１〜１５８２および１５８３〜１５９
１は２０３５８の結合と比べてＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲへの２０３３７結合後に、より保護
された。２０３３７および２０３５８についての保護領域は図３１の右側で２つの図にお
いて黒色で強調される。異なるＨＤｘ−ＭＳの観察により、２０３３７抗体は２０３５８
（データを示した）および２０３５０（データは示さず）抗体と比べてＮｏｔｃｈ３ Ｎ
ＲＲ抗原と異なって相互作用することが示される。全体として、ＨＤｘ−ＭＳデータはエ
ピトープビニングデータ（実施例１３）およびｘ線結晶学（実施例１４）と一致し、２０
３３７、２０３５８および２０３５０がＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ上で異なる相互作用（およ
びエピトープ）を有することが示される。
同じ実験を、Ｃａ２＋の存在下でＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲ−２０３３７複合体に対応する
ＨＤｘ−ＭＳデータを獲得するために反復してもよく、Ｃａ２＋の不在下で見られるもの
と同様のデータ、すなわち、３つ全ての抗体によって異なって保護されるＮｏｔｃｈ３
ＮＲＲの領域が見られる可能性があることが予想される。
〔実施例１６〕
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのさらなるコンフォメーショナルエピトープの識別
Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのさらなるコンフォメーショナルエピトープは、本明細書に開示
される抗体（例えば、２０３３７、２０３５０、２０３５８およびＡ４）でＮｏｔｃｈ３
ＮＲＲを予め遮断することによって見ることができる。本明細書に開示されるＮｏｔｃ
ｈ３ ＮＲＲの構造に基づいて、抗体２０３３７、２０３５０、２０３５８およびＡ４の
エピトープをＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲの表面上でマッピングできる。図３２に示されるよう
に、４つの抗体のエピトープはＬＮＲおよびＨＤドメインの両方にわたって、Ｎｏｔｃｈ
３ ＮＲＲの表面の約６７％を覆い、約３３％の表面は覆われていないままである（図３
２）。
本明細書に開示される４つの抗体によって例示されるように、ＬＮＲおよびＨＤを架橋
するコンフォメーショナルエピトープを結合する抗体は、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻
害する抗体についての潜在的な機構である。抗体はＬＮＲおよびＨＤを一緒に固定し、Ｎ
ｏｔｃｈ３ ＮＲＲの自己阻害状態を安定化することによって機能する。Ｎｏｔｃｈ３
ＮＲＲの表面上の少なくとも２つのさらなる潜在的なエピトープは、２０３３７、２０３
５０、２０３５８およびＡ４によって覆われていないままであることを確認した。図３４
に示されるように、第１の潜在的なエピトープはＬＮＲ−ＣおよびＨＤドメインを含み、
第２はＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−ＡおよびＨＤドメインを含む。（ＬＮＲおよび
ＨＤを直接架橋する）これらの２つの潜在的なエピトープの有益な形状に関して、Ｎｏｔ
ｃｈ３のさらなる阻害抗体がそれらに対して見出され得るようである。
これらの２つの潜在的エピトープおよび他のコンフォメーショナルエピトープを標的と
する抗体をスクリーニングするために、以下の実験戦略を利用できる。一般に、以前に識
別されたＮｏｔｃｈ３抗体（例えば、２０３３７、２０３５０または２０３５８のいずれ
か）は、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリー
などの市販のファージディスプレイライブラリーによるパニング前に組換えＮＲＲタンパ
ク質とプレインキュベートできる。加えて、これらのＮｏｔｃｈ３抗体（２０３３７、２
０３５０、２０３５８）は、パニング前にＮｏｔｃｈ３を発現する細胞に事前に結合でき
る。単独または組合せのいずれかでのＮｏｔｃｈ３抗体とのプレインキュベーションはこ
れらの抗体のエピトープを遮断し、異なるおよび特有のエピトープに結合するクローン／
抗体を豊富にする。記載されるように、組換えＮＲＲタンパク質ならびに全細胞およびデ
ィファレンシャル全細胞パニングと共に固相または液相パニングのいずれかを使用した包
括的なパニング戦略が使用される。次いで、図３〜６に記載されるように組換えタンパク
質としてのＮｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ３を発現する細胞の両方への選択的結合を示す
クローン／抗体が選択される。加えて、上記のアプローチから識別された抗体は、図７、
８、１１、１３、１４、１５に記載されるように細胞ベースの機能アッセイ（リガンド駆
動レポーター遺伝子アッセイ、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子ｍＲＮＡ定量、ＩＣＤ３タンパク質
レベル、ＴＡＬＬ−１増殖）においてＮｏｔｃｈ３シグナル伝達の阻害についてスクリー
ニングされる。新たに識別されたＮｏｔｃｈ３抗体が、２０３３７、２０３５０、２０３
５８と同じエピトープまたは異なり、重なっていないエピトープに結合するかどうかを判
定するために、これらの一般的アプローチを使用できる：Ｂｉａｃｏｒｅによるエピトー
プビニング（図２０）；ＮＲＲタンパク質による共結晶構造（図２１、２３、２４、２５
）；および抗体／Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ複合体のＨＤｘ−ＭＳエピトープマッピング（図
２７〜３１）。最終的に、ＮＲＲタンパク質とのこれらの新規抗体の共結晶構造により、
抗体のエピトープを識別し、エピトープが２０３３７、２０３５８および２０３５０と異
なるかどうかを判定することが可能となる。
均等物
上述の記載された明細書は、当業者が本開示を実施できるようにするのに十分であると
みなされる。上述の記載および実施例は本開示の特定の好ましい実施形態を詳述し、本発
明者らによって意図される最適な様式を記載している。しかしながら、上述が本文中にい
かに詳細に記載されているように見え得るとしても、本開示は多くの手段で実施可能であ
り、本開示は添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであ
ることは理解されるであろう。
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書に引用される全ての参考文献およ
びそれらに引用される参考文献は、それらが既に引用されていない限り、本明細書に参照
によりその全てが組み込まれる。

Claims (46)

  1. Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを含む単離ポリペプチドであっ
    て、前記コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、
    ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ：heterodimerization）ドメ
    イン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、
    前記ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択され、前記
    ＨＤドメインが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、前記リンカー領
    域が、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−ＨＤリンカーからな
    る群から選択される、単離ポリペプチド。
  2. Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを含む単離ポリペプチドであっ
    て、前記コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、
    ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカ
    ー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、前記ＬＮＲ領域が、Ｌ
    ＮＲ−Ｂであり、前記ＨＤドメインが、ＨＤα３へリックスであり、前記リンカー領域が
    、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−ＨＤリンカーからなる群
    から選択される、単離ポリペプチド。
  3. Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを含む単離ポリペプチドであっ
    て、前記コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲドメインの、
    ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメイン内、およびリンカ
    ー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、前記ＬＮＲ領域が、Ｌ
    ＮＲ−Ｃであり、前記ＨＤドメインが、ＨＤα２へリックスであり、前記リンカー領域が
    、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー、ＬＮＲ−ＨＤリンカーからなる群
    から選択される、単離ポリペプチド。
  4. Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープを認識する単離抗体またはその
    断片であって、前記コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体のＮＲＲド
    メインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメイン内、お
    よびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、前記ＬＮＲ
    領域が、ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃからなる群から選択され、前記ＨＤドメイ
    ンが、Ｎ末端ＨＤおよびＣ末端ＨＤからなる群から選択され、前記抗体またはその断片が
    、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗体またはその断片。
  5. 前記Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させる、請求項４に記
    載の単離抗体またはその断片。
  6. 前記Ｎｏｔｃｈ３受容体が、突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体であり、前記ＬＮＲ領域
    または前記ＨＤドメインが、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、請求
    項４に記載の単離抗体またはその断片。
  7. 前記Ｎｏｔｃｈ３の突然変異体が、Ｓ１５８０ＬおよびＧ１４８７Ｄからなる群から選
    択される突然変異を含む、請求項６に記載の単離抗体またはその断片。
  8. Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに特異的に結合する単離抗体ま
    たはその断片であって、前記コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体の
    ＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメイ
    ン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、前
    記ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｂであり、前記ＨＤドメインが、ＨＤα３へリックスであり、
    前記抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗体またはそ
    の断片。
  9. 前記コンフォメーショナルエピトープが、前記ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー内
    のアミノ酸残基をさらに含む、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  10. 前記コンフォメーショナルエピトープが、前記ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内
    のアミノ酸残基をさらに含む、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  11. 前記コンフォメーショナルエピトープが、前記ＮＲＲ領域のＬＮＲ−ＨＤリンカー内の
    アミノ酸残基をさらに含む、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  12. 前記コンフォメーショナルエピトープが、ＨＤβ４−α３ループ内のアミノ酸残基をさ
    らに含む、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  13. 前記コンフォメーショナルエピトープが、ＬＮＲ−Ａ／Ｂリンカー内、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃ
    リンカー内、ＬＮＲ−ＨＤリンカー内、およびＨＤβ４−α３ループ内のアミノ酸残基を
    さらに含む、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  14. 前記Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させる、請求項８に記
    載の単離抗体またはその断片。
  15. 前記Ｎｏｔｃｈ３受容体が、突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体であり、前記ＬＮＲ領域
    または前記ＨＤドメインが、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、請求
    項８に記載の単離抗体またはその断片。
  16. 前記Ｎｏｔｃｈ３の突然変異体が、Ｓ１５８０Ｌ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｙ１６２４Ｈ、Ｌ１
    ５１８Ｍ、Ａ１５３７Ｔ、Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、Ｒ１５２６Ｃ（ＨＤ）およびＧ
    １４８７Ｄ、（ＬＮＲ−Ｃ）、Ｐ２０３４ｆｓ、Ｐ２０６７ｆｓ、ｐ２１７７ｆｓ、Ｑ２
    ０７５＊、Ｗ２１７２＊、Ｇ２１１２Ｄ、Ｌ２２１２Ｍ、Ｆ２１２１Ｌ、Ｇ２０３８Ｓ、
    Ｇ２０５９Ｒ、Ｒ２０２２Ｈ、Ｙ２１２７Ｈ、Ｙ２２１１Ｃ、Ｖ２２０２Ｉ、Ｓ２０９６
    Ｌ、Ｐ２０８９Ｌ、Ｐ２２０９Ｌ、Ｒ１９８１Ｃ、Ｒ２１４５Ｑ、Ｐ２１７８Ｓ、または
    これらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、請求項８に記載の単離抗体ま
    たはその断片。
  17. 前記コンフォメーショナルエピトープが、アミノ酸残基：１４２７〜１４２９（ＬＮＲ
    −Ａ／Ｂリンカーの）、１４４２、１４４４〜１４４５、１４４７〜１４５０、１４５３
    、１４５８（ＬＮＲ−Ｂの）、１４６１〜１４６２、１４６４（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー
    の）、１５０７〜１５０８、１５１０（ＬＮＲ−ＨＤリンカーの）、１５９２、１５９４
    〜１５９９、１６０２（ＨＤβ４−α３ループの）、および１６０６（ＨＤα３へリック
    スの）、またはこれらのサブセットを含む、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  18. 前記抗体またはその断片のＶＨが、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｃｙｓ１４４２、Ｐｒｏ
    １４４４、Ａｌａ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ１４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ
    １４５３、Ｃｙｓ１４５８、Ｇｌｙ１４６１、Ｇｌｙ１４６２、Ｇｌｙ１４６４、Ｌｅｕ
    １５９２、Ｓｅｒ１５９４、Ｐｒｏ１５９５、Ｇｌｕ１５９６、Ａｓｎ１５９７、Ａｓｐ
    １５９８、およびＨｉｓ１５９９のうちの少なくとも１つに結合する、請求項８に記載の
    単離抗体またはその断片。
  19. 前記抗体またはその断片のＶＬが、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｇｌｎ１４２７、Ｃｙｓ
    １４２８、Ｇｌｕ１４２９、Ｐｒｏ１４４４、Ｓｅｒ１４４５、Ｓｅｒ１４４７、Ｓｅｒ
    １４４８、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｙｒ１４５３、Ｌｅｕ１５０７、Ｌｅｕ１５０８、Ａｒｇ
    １５１０、Ｌｅｕ１５９２、Ａｓｐ１５９８、Ｐｒｏ１６０２、およびＳｅｒ１６０６の
    うちの少なくとも１つに結合する、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  20. 前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、お
    よび合成抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の単離抗体またはその断片。
  21. Ｎｏｔｃｈ３受容体のコンフォメーショナルエピトープに特異的に結合する単離抗体ま
    たはその断片であって、前記コンフォメーショナルエピトープが、Ｎｏｔｃｈ３受容体の
    ＮＲＲドメインの、ＬＮＲ（Lin Notch Repeat）領域内、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメイ
    ン内、およびリンカー領域内の、連続アミノ酸配列および非連続アミノ酸配列を含み、前
    記ＬＮＲ領域が、ＬＮＲ−Ｃであり、前記ＨＤドメインが、ＨＤα２へリックスであり、
    前記抗体またはその断片が、リガンド依存性シグナル伝達を遮断する、単離抗体またはそ
    の断片。
  22. 前記コンフォメーショナルエピトープが、前記ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ内のアミノ酸残
    基をさらに含む、請求項２１に記載の単離抗体またはその断片。
  23. 前記コンフォメーショナルエピトープが、前記ＮＲＲ領域のＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内
    のアミノ酸残基をさらに含む、請求項２１に記載の単離抗体またはその断片。
  24. 前記コンフォメーショナルエピトープが、ＨＤα３−β５ループ内のアミノ酸残基をさ
    らに含む、請求項２１に記載の単離抗体またはその断片。
  25. 前記コンフォメーショナルエピトープが、ＬＮＲ−Ｂ内、ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカー内、
    およびＨＤα３−β５ループ内のアミノ酸残基をさらに含む、請求項２１に記載の単離抗
    体またはその断片。
  26. 前記Ｎｏｔｃｈ３受容体のＬＮＲ領域を、自己阻害状態で安定化させる、請求項２１に
    記載の単離抗体またはその断片。
  27. 前記Ｎｏｔｃｈ３受容体が、突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体であり、前記ＬＮＲ領域
    または前記ＨＤドメインが、少なくとも１カ所のアミノ酸残基の突然変異を有する、請求
    項２１に記載の単離抗体またはその断片。
  28. 突然変異体のＮｏｔｃｈ３受容体が、Ｓ１５８０Ｌ、Ｄ１５８７Ｎ、Ｙ１６２４Ｈ、Ｌ
    １５１８Ｍ、Ａ１５３７Ｔ、Ｎ１５９７Ｋ、Ｌ１５４７Ｖ、Ｒ１５２６Ｃ（ＨＤ）および
    Ｇ１４８７Ｄ、（ＬＮＲ−Ｃ）、Ｐ２０３４ｆｓ、Ｐ２０６７ｆｓ、ｐ２１７７ｆｓ、Ｑ
    ２０７５＊、Ｗ２１７２＊、Ｇ２１１２Ｄ、Ｌ２２１２Ｍ、Ｆ２１２１Ｌ、Ｇ２０３８Ｓ
    、Ｇ２０５９Ｒ、Ｒ２０２２Ｈ、Ｙ２１２７Ｈ、Ｙ２２１１Ｃ、Ｖ２２０２Ｉ、Ｓ２０９
    ６Ｌ、Ｐ２０８９Ｌ、Ｐ２２０９Ｌ、Ｒ１９８１Ｃ、Ｒ２１４５Ｑ、Ｐ２１７８Ｓ、また
    はこれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、請求項２１に記載の単離抗
    体またはその断片。
  29. 前記コンフォメーショナルエピトープが、アミノ酸残基：１４４０（ＬＮＲ−Ｂの）、
    １４６３、１４６５〜１４６８（ＬＮＲ−Ｂ／Ｃリンカーの）、１４６９〜１４７２、１
    ４７４、１４８６〜１４８７、（ＬＮＲ−Ｃの）、１５３４（ＨＤα３へリックスの）、
    ならびに１６１８、１６１９、および１６２１（α３−β５ループの）、またはこれらの
    サブセットを含む、請求項２１に記載の単離抗体またはその断片。
  30. 前記抗体またはその断片のＶＨが、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ａｒｇ１４６３、Ｔｈｒ
    １４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｔｙｒ１４７１、Ｔｙｒ
    １４７４、Ｇｌｎ１４８６、およびＧｌｙ１４８７のうちの少なくとも１つに結合する、
    請求項２１に記載の単離抗体またはその断片。
  31. 前記抗体またはその断片のＶＬが、以下のＮｏｔｃｈ３残基：Ｓｅｒ１４４０、Ａｒｇ
    １４６５、Ｔｈｒ１４６６、Ａｓｎ１４６８、Ｐｒｏ１４６９、Ｖａｌ１４７０、Ｇｌｕ
    １４７２、Ａｒｇ１４３４、Ｇｌｕ１６１８、Ａｒｇ１６１９、およびＡｓｐ１６２１の
    うちの少なくとも１つに結合する、請求項２１に記載の単離抗体またはその断片。
  32. 前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、お
    よび合成抗体からなる群から選択される、請求項４から３１に記載の単離抗体またはその
    断片。
  33. Ｎｏｔｃｈ３リガンド駆動レポーター遺伝子アッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、Ｎｏｔｃｈ
    ３標的遺伝子ｍＲＮＡの定量化、ＴＡＬＬ−１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖、お
    よびＮｏｔｃｈ３細胞内ドメイン（ＩＣＤ：intracellular domain）のガンマセクレター
    ゼ切断形態の検出からなる群から選択されるアッセイにより評価される、Ｎｏｔｃｈ３シ
    グナル伝達を阻害する、請求項４から３１に記載の単離抗体またはその断片。
  34. Ｎｏｔｃｈ３受容体に対する単離抗体またはその断片であって、解離速度定数（ＫＤ）
    を、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０
    １１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１とし、前記抗体またはその断片が、Ｎｏｔ
    ｃｈ３リガンド駆動レポーター遺伝子アッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、Ｎｏｔｃｈ３標的遺
    伝子ｍＲＮＡの定量化、ＴＡＬＬ−１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖、およびＮｏ
    ｔｃｈ３細胞内ドメイン（ＩＣＤ）のガンマセクレターゼ切断形態の検出からなる群から
    選択されるアッセイにより評価される、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻害する、単離抗体
    またはその断片。
  35. 表２に記載された抗体と同じコンフォメーショナルエピトープに結合する、請求項３４
    に記載の単離抗体またはその断片。
  36. 表２に記載された抗体と交差競合する、請求項３４に記載の単離抗体またはその断片。
  37. Ｎｏｔｃｈ３受容体に対する単離抗体またはその断片であって、配列番号９、配列番号
    ２９、配列番号４９、配列番号６９、配列番号８９、配列番号１０９、配列番号１２９、
    配列番号１４９、配列番号１６９、配列番号１８９、配列番号２０９、および配列番号２
    ２９；からなる群から選択されるＶＨ、ならびに配列番号１９、配列番号３９、配列番号
    ５９、配列番号７９、配列番号９９、配列番号１１９、配列番号１３９、配列番号１５９
    、配列番号１７９、配列番号１９９、配列番号２１９、および配列番号２３９からなる群
    から選択されるＶＬ、またはこれらに対する同一性が９７〜９９％であるアミノ酸配列を
    含む、単離抗体またはその断片。
  38. 配列番号９を有する可変重鎖および配列番号１９を有する可変軽鎖配列、配列番号２９
    を有する可変重鎖配列および配列番号３９を有する可変軽鎖配列、配列番号４９を有する
    可変重鎖配列および配列番号５９を有する可変軽鎖配列、配列番号６９を有する可変重鎖
    配列および配列番号７９を有する可変軽鎖配列、配列番号８９を有する可変重鎖配列およ
    び配列番号９９を有する可変軽鎖配列、配列番号１０９を有する可変重鎖配列および配列
    番号１１９を有する可変軽鎖配列、配列番号１２９を有する可変重鎖配列および配列番号
    １３９を有する可変軽鎖配列、配列番号１４９を有する可変重鎖配列および配列番号１５
    ９を有する可変軽鎖配列、配列番号１６９を有する可変重鎖配列および配列番号１７９を
    有する可変軽鎖配列、配列番号１８９を有する可変重鎖配列および配列番号１９９を有す
    る可変軽鎖配列、配列番号２０９を有する可変重鎖配列および配列番号２１９を有する可
    変軽鎖配列、ならびに配列番号２２９を有する可変重鎖配列および配列番号２３９を有す
    る可変軽鎖配列からなる群から選択される、可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む、単
    離抗体またはその断片。
  39. 配列番号９を有する可変重鎖および配列番号１９を有する可変軽鎖配列、配列番号２９
    を有する可変重鎖配列および配列番号３９を有する可変軽鎖配列、配列番号４９を有する
    可変重鎖配列および配列番号５９を有する可変軽鎖配列、配列番号６９を有する可変重鎖
    配列および配列番号７９を有する可変軽鎖配列、配列番号８９を有する可変重鎖配列およ
    び配列番号９９を有する可変軽鎖配列、配列番号１０９を有する可変重鎖配列および配列
    番号１１９を有する可変軽鎖配列、配列番号１２９を有する可変重鎖配列および配列番号
    １３９を有する可変軽鎖配列、配列番号１４９を有する可変重鎖配列および配列番号１５
    ９を有する可変軽鎖配列、配列番号１６９を有する可変重鎖配列および配列番号１７９を
    有する可変軽鎖配列、配列番号１８９を有する可変重鎖配列および配列番号１９９を有す
    る可変軽鎖配列、配列番号２０９を有する可変重鎖配列および配列番号２１９を有する可
    変軽鎖配列、ならびに配列番号２２９を有する可変重鎖配列および配列番号２３９を有す
    る可変軽鎖配列からなる群から選択される、可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む、単
    鎖抗体またはその断片。
  40. Ｎｏｔｃｈ３受容体に対する単離抗体またはその断片であって、配列番号５、配列番号
    ２５、配列番号４５、配列番号６５、配列番号８５、配列番号１０５、配列番号１２５、
    配列番号１４５、配列番号１６５、配列番号１８５、配列番号２０５、および配列番号２
    ２５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  41. 配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号５
    の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４の軽鎖可
    変領域ＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２３の重鎖可変
    領域ＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２５の重鎖可変領域ＣＤ
    Ｒ３、配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、お
    よび配列番号３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列
    番号４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号４５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号５３
    の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号５５の
    軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６４の重鎖可変
    領域ＣＤＲ２、配列番号６５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤ
    Ｒ１、配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ
    ３、配列番号８３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列
    番号８５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９４
    の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１０３
    の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１０５の重
    鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１４の軽鎖可
    変領域ＣＤＲ２、および配列番号１１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１２３の重鎖
    可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２５の重鎖可変
    領域ＣＤＲ３、配列番号１３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３４の軽鎖可変領域
    ＣＤＲ２、および配列番号１３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１４３の重鎖可変領
    域ＣＤＲ１、配列番号１４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１４５の重鎖可変領域Ｃ
    ＤＲ３、配列番号１５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ
    ２、および配列番号１５５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１６３の重鎖可変領域ＣＤ
    Ｒ１、配列番号１６４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１６５の重鎖可変領域ＣＤＲ３
    、配列番号１７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、お
    よび配列番号１７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１８３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、
    配列番号１８４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列
    番号１９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配
    列番号１９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２０３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番
    号２０４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２０５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２
    １３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号
    ２１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２２３の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２
    ４の重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２２５の重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２３３の
    軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号２３５
    の軽鎖可変領域ＣＤＲ３からなる群から選択される、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の
    ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  42. 請求項４から４１から選択される抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを
    含む、医薬組成物。
  43. Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路により媒介されるがんであって、乳がん、結腸直腸がん
    、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄
    性白血病、ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白
    血病、ユーイング肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、骨肉腫
    、有棘細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、神
    経膠芽腫、軟組織明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎がん、および黒色腫からな
    る群から選択されるがんの処置における使用のための、請求項４から４１に記載の抗体ま
    たはその断片。
  44. Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路により媒介されるがんであって、Ｔ細胞性急性リンパ芽
    球性白血病（ＴＡＬＬ：T-cell acute lymphoblastic leukemia）であるがんの処置にお
    ける使用のための、請求項４３に記載の抗体または断片。
  45. Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路により媒介されるがんであって、乳がん、結腸直腸がん
    、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄
    性白血病、ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白
    血病、ユーイング肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、骨肉腫
    、有棘細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、神
    経膠芽腫、軟組織明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎がん、および黒色腫からな
    る群から選択されるがんを処置するための医薬としての使用のための、請求項４から４１
    に記載の抗体またはその断片。
  46. Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達経路により媒介されるがんであって、Ｔ細胞性急性リンパ芽
    球性白血病（ＴＡＬＬ）であるがんを処置するための医薬としての使用のための、請求項
    ４５に記載の抗体または断片。
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