JP2018505662A - 血液脳関門輸送分子およびそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、目的の薬剤を血液脳関門を通過して運搬することが可能な輸送体分子を提供する。輸送体分子をコードするポリヌクレオチド、輸送体分子を作製する方法、および例えば中枢神経系疾患、障害、または傷害の診断、予防、または処置のために輸送体分子を使用する方法も提供される。【選択図】図１

Description

電子的に提出された配列表の参照
[0001]本出願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルの形態の電子的に提出された配列表（ＢＢＢ−１００Ｐ１＿Ｓｅｑ；サイズ：８４キロバイト；および作成日：２０１４年１２月１９日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
[0002]血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳のホメオスタシスを保護および制御して、脳のほとんどの部分への分子の自由な通過を防ぎ、そのため多くの脳疾患の処置が制限される。栄養素、増殖因子およびホルモンなどの必須の分子の輸送は、脳内皮細胞の通過を制御する一連の特異的な輸送体および受容体を介して達成される。それゆえに脳への生物製剤および他の薬物の送達は、重大な課題の一つである。加えて、脳から抗体を迅速に除去して、恐らくＦｃと炎症性反応を促進するエフェクターリガンドとの係合による炎症性反応を防ぐ輸送メカニズムが存在すると考えられる。
[0003]この１０年にわたり、輸送体分子の細胞外ドメインへの結合は、内皮細胞層を通過する受容体と抗体との複合体のトランスサイトーシスを容易にするという血液脳関門を通過する抗体輸送の報告が出現してきた。
[0004]血液脳関門は、主として脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）によって形成されるが（RubinおよびStaddon、Ann. Rev. Neurosci. 1999; 22:11〜28）、他の細胞型、例えば周皮細胞、星状細胞およびニューロン性細胞もＢＢＢの機能において重要な役割を果たす。ＢＣＥＣは、血液から脳への小さいおよび大きい（水溶性の）化合物の傍細胞輸送を防ぐ密着結合などの特定の特徴を有する（BrightmanおよびReese、J. Cell Biol. 1969; 40(3):648〜77; ReeseおよびKarnovsky、J. Cell Biol. 1967; 34(1):207〜17）。ＢＢＢは、物理的、代謝的および免疫学的なバリアとして機能する（Gaillardら、Microvasc. Res. 2003; 65(1):24〜31）。
[0005]ＢＢＢを通過することができるＦＣ５と称される単一ドメイン抗体（ラマ）が、学術研究所によってヒト脳内皮細胞の表面選択を使用して同定された（Muruganandamら、FASEB 2001; Abulrobら、J. Neurochemistry 2005; 95:1201〜1214；ＰＣＴ公報ＷＯ０２／０５７４４５号Ａ１、米国特許第８，３８３，１０７号）。ＦＣ５は、種交差反応性を有し、ラット、マウス、イヌおよびヒトの脳内の皮細胞に結合することができる。この抗体の推定上の受容体は、ＴＭＥＭ３０ａであり、これは、膜貫通タンパク質３０Ａ、ｃｄｃ５０ａ、ＦＬＪ１０８５６、またはＣ６ｏｒｆ６７とも称される。これは、正確な機能が不明なオーファン受容体である。これは、複合体が少なくとも２つのタンパク質：Ｐ型ＡＴＰアーゼのＰ４サブファミリーからのアルファサブユニット、およびＴＭＥＭ３０ａ（ｃｄｃ５０ａ）を包含するＣＤＣ５０−Ｌｅｍｐ３ファミリーからのベータサブユニットで構成されるアミノリン脂質のトランスロケーションにおいて役割を果たすと考えられる（Chenら、J. Immunol. 2011; 186:3215〜3225; Munoz-Martinezら、Biochemical Pharmacology 2010; 80:793〜800）。
ＰＣＴ公報ＷＯ０２／０５７４４５号Ａ１ 米国特許第８，３８３，１０７号
RubinおよびStaddon、Ann. Rev. Neurosci. 1999; 22:11〜28 BrightmanおよびReese、J. Cell Biol. 1969; 40(3):648〜77; ReeseおよびKarnovsky、J. Cell Biol. 1967; 34(1):207〜17 Gaillardら、Microvasc. Res. 2003; 65(1):24〜31 Muruganandamら、FASEB 2001 Abulrobら、J. Neurochemistry 2005; 95:1201〜1214 Chenら、J. Immunol. 2011; 186:3215〜3225 Munoz-Martinezら、Biochemical Pharmacology 2010; 80:793〜800
[0006]本開示は、ヒトでの使用に好適な機能的な分子として再構築された単一ドメインのラクダ抗体ＦＣ５に類似した特性を有する血液脳関門輸送体分子を提供する。
[0007]一形態において、本開示は、免疫グロブリンポリペプチドを包含する単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−１（Ｈ−ＣＤＲ１）、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−２（Ｈ−ＣＤＲ２）、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−３（Ｈ−ＣＤＲ３）、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−１（Ｌ−ＣＤＲ１）、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含み；Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３はそれぞれ、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４；（ｂ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；（ｃ）配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；（ｄ）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６６、配列番号６７、および配列番号６８；（ｅ）配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；（ｆ）配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；（ｇ）配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；（ｈ）配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３８、配列番号１３９、および配列番号１４０；（ｉ）配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５６、配列番号１５７、および配列番号１５８；（ｊ）配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７４、配列番号１７５、および配列番号１７６；（ｋ）配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１９２、配列番号１９３、および配列番号１９４；または（ｌ）配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１９、配列番号２２０、および配列番号２２０であり、該輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる、上記輸送体分子を提供する。
[0008]別の形態において、本開示は、免疫グロブリンポリペプチドを包含する単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、（ａ）配列番号２に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および配列番号１１に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列、（ｂ）配列番号２０に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２９に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｃ）配列番号３８に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号４７に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｄ）配列番号５６に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号６５に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｅ）配列番号７４に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号８３に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｆ）配列番号９２に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１０１に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｇ）配列番号１１０に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１１９に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｈ）配列番号１２８に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３７に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｉ）配列番号１４６に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１５５に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｊ）配列番号１６４に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１７３に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｋ）配列番号１８２に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１９１に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列、（ｌ）配列番号２０９に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２１８に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；または（ｍ）配列番号２２６に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２２７に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列を含み、該輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる、上記輸送体分子を提供する。
[0009]別の形態において、本開示は、免疫グロブリンポリペプチドを包含する単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、アミノ酸配列番号２００を有する単一ドメインのＶＨを含む、上記輸送体分子を提供する。特定の形態において、輸送体分子は、インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいて、ＦＣ５より効果的に脳微小血管内皮細胞ＢＭＶＥＣを通過することができる。
[0010]本明細書で提供される輸送体分子は、重鎖定常領域またはそれらのフラグメントをさらに包含していてもよく、例えば、Ｆｃ領域および／またはヒンジ領域を包含する。さらに、本明細書で提供される輸送体分子の免疫グロブリンポリペプチドは、抗体またはそれらのＢＢＢ透過性フラグメントを包含していてもよい。特定の形態において、抗体またはそれらのＢＢＢ透過性フラグメントは、２つまたはそれより多くのサブユニット、例えば、ジスルフィド結合を介して結合した重鎖および軽鎖を包含していてもよい。特定の形態において、重鎖定常領域またはそれらのフラグメントは、ＩｇＧ定常領域またはそれらのフラグメントであってもよい。特定の形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、あらゆるそれらの組合せ、またはあらゆるそれらの抗原結合フラグメントであってもよい。特定の形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、２つの重鎖および２つの軽鎖を包含する完全ＩｇＧ免疫グロブリンであってもよい。特定の形態において、それらのＢＢＢ透過性フラグメントは、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｄｓＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、またはｓｃ（Ｆｖ）２フラグメントであってもよい。例えば、フラグメントは、ｓｃＦｖフラグメントを包含していてもよく、ここでＳｃＦｖは、リンカーを介して一緒に融合したＶＨおよびＶＬを含み、またはフラグメントは、ｄｓＦｖフラグメントを包含していてもよく、ここでｄｓＦｖは、リンカーを介して一緒に融合したＶＨおよびＶＬを含む。特定の形態において、ｓｃＦｖまたはｄｓＦｖは、アミノ末端から、ＶＨ−Ｌ−ＶＬを包含していてもよく、式中Ｌはリンカーである。特定の形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である）（配列番号２３２）、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である）（配列番号２３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＬ（配列番号２３６）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号２３７）であってもよい。
[0011]特定の形態において、ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントは、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を包含していてもよく、ここで改変されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、ＦｃＲｎに関する変更された半減期および／または変更された結合親和性を有する。一例において、改変されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、ＦｃＲｎに関する増加した半減期および／または増加した結合親和性を有していてもよい。別の例において、改変されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、ＦｃＲｎに関する減少した半減期および／または減少した結合親和性を有する。特定の形態において、ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントは、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を包含していてもよく、ここで改変されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、低減したエフェクター機能および／または少なくとも１つのエフェクター分子への低減した結合を有する。特定の形態において、ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントは、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、変更された糖付加を有していてもよく、ここで改変されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、低減したエフェクター機能および／または少なくとも１つのエフェクター分子への低減した結合を有する。特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子の重鎖定常ドメインまたはそれらのフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４定常ドメインまたはそれらのフラグメントであってもよい。
[0012]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、軽鎖定常ドメインまたはそれらのフラグメントをさらに包含していてもよい。例えば、軽鎖定常ドメインまたはそれらのフラグメントは、ヒトカッパ定常ドメインもしくはそれらのフラグメント、またはヒトラムダ定常領域もしくはそれらのフラグメントであってもよい。
[0013]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、連結されたペイロードをさらに包含していてもよく、ここで輸送体分子は、ＢＢＢを通過してペイロードを輸送することができる。特定の形態において、ペイロードは、ペプチド結合を介して、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに融合されている。特定の形態において、ペイロードは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに化学的にコンジュゲートされている。特定の形態において、ペイロードは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドと非共有結合を介して連結される。
[0014]ペイロードとしては、例えば、抗微生物剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生体応答調整物質、医薬物質、リンホカイン、異種抗体もしくはそれらのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、または薬剤の２種もしくはそれより多くの組合せを挙げることができる。例えば、ペイロードとしては、神経刺激性のポリペプチド、例えば、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、パラクリン因子、視床下部放出因子、神経伝達物質ポリペプチド、ＣＮＳ細胞によって発現される受容体に関するポリペプチドアゴニスト、リソソーム蓄積症に関与するポリペプチドまたはあらゆるそれらの組合せを挙げることができる。別の例において、ペイロードとしては、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ダラージン（dalargin）、インターフェロン−β、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ニュールツリン、ニューレグリン、ネトリン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、セマフォリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−ｃｘ、ＴＧＦ−Ｂ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、あらゆるそれらのフラグメント、またはあらゆるそれらの組合せを挙げることができる。一形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域またはそれらのフラグメント、およびヒト軽鎖定常領域を含んでいてもよく、ここでＩＬ−１Ｒａポリペプチドが重鎖定常領域のＣ末端に融合されている。
[0015]特定の形態において、ペイロードは、異種抗体またはそれらのフラグメントを包含していてもよく、例えば、異種抗体またはそれらのフラグメントは、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ−４、テネイシン、アルファ−４（ａ４）インテグリン、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、アミロイド−１３（ＡＩ３）、ハンチンチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴｒｋＡ、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦ−１３、α−シヌクレインタウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、カスパーゼ６、神経栄養因子および／または神経栄養因子受容体の１つまたはそれより多くに特異的に結合する。特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）、例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、またはウシＢＭＶＥＣに結合することができる。特定の形態において、ＢＭＶＥＣは、脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）である。特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいて、ＢＣＥＣの単分子層を通過することができる。
[0016]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、脳内皮細胞への結合に関して単一ドメイン抗体ＦＣ５またはＢｂｂｔ０２４１と競合することができる。このタイプの例示的な輸送体としては、Ｂｂｂｔ０６２６、Ｂｂｂｔ０７２７、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６５４、Ｂｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７３２、またはＢｂｂｔ０７５４のＶＨおよびＶＬドメインが挙げられる。
[0017]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、脳内皮細胞への結合に関して単一ドメイン抗体ＦＣ５またはＢｂｂｔ０２４１と競合しない。このタイプの例示的な輸送体としては、Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０６７４、Ｂｂｂｔ０７５５、Ｂｂｂｔ０３５１、Ｂｂｂｔ０５７９またはＢｂｂｔ０６７１のＶＨおよびＶＬドメインが挙げられる。
[0018]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、ダイノルフィンにコンジュゲートさせて、ラットモデルで末梢投与される場合、ＢＢＢを通過することにより利尿を誘導することができる。特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、ＩＬ−１Ｒａに融合させて、ラットの坐骨神経部分結紮アッセイで末梢投与される場合、ＢＢＢを通過することにより神経因性疼痛を低減させることができる。特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、マウスモデルで末梢投与される場合、定量的全身オートラジオグラフィーによって測定される場合、小脳皮質、大脳灰白質、脊髄灰白質、脳橋、またはそれらの組合せに局在化する。
[0019]本開示はさらに、本明細書で提供される輸送体分子、および担体を包含する組成物を提供する。
[0020]本開示はさらに、本明細書で提供される輸送体分子、またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする核酸分子を包含する単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の形態において、核酸分子は、ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨおよびＶＬをコードしていてもよく、核酸分子は、配列番号２、配列番号１１、または配列番号２、および配列番号１１；配列番号２０、配列番号２９、または配列番号２０、および配列番号２９；配列番号３８、配列番号４７、または配列番号３８、および配列番号４７；配列番号５６、配列番号６５、または配列番号６６、および配列番号６５；配列番号７４、配列番号８３、または配列番号７４、および配列番号８３；配列番号９２、配列番号１０１、または配列番号９２、および配列番号１０１；配列番号１１０、配列番号１１９、または配列番号１１０、および配列番号１１９；配列番号１２８、配列番号１３７、または配列番号１２８、および配列番号１３７；配列番号１４６、配列番号１５５、または配列番号１４６、および配列番号１５５；配列番号１６４、配列番号１７３、または配列番号１６４、および配列番号１７３；配列番号１８２、配列番号１９１、または配列番号１８２、および配列番号１９１；配列番号２００；配列番号２０９、配列番号２１８、または配列番号２０９、および配列番号２１８；または配列番号２２６、配列番号２２７、または配列番号２２６、および配列番号２２７を含む。特定の形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチドはさらに、ペイロード、例えば上述したペイロードをコードする核酸を包含する。
[0021]本開示はさらに、本明細書で提供される輸送体分子、またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする２つまたはそれより多くの核酸分子を包含する組成物を提供する。特定の形態において、２つまたはそれより多くの核酸分子は、それぞれ、配列番号２および配列番号１１；配列番号２０および配列番号２９；配列番号３８および配列番号４７；配列番号５６および配列番号６５；配列番号７４および配列番号８３；配列番号９２および配列番号１０１；配列番号１１０および配列番号１１９；配列番号１２８および配列番号１３７；配列番号１４６および配列番号１５５；配列番号１６４および配列番号１７３；配列番号１８２および配列番号１９１；配列番号２０９および配列番号２１８；または配列番号２２６および配列番号２２７を包含していてもよい。特定の形態において、組成物は、ペイロードをコードする核酸分子をさらに包含していてもよい。特定の形態において、組成物の２つまたはそれより多くの核酸分子は、同じベクター中に存在する。特定の形態において、２つまたはそれより多くの核酸分子は、少なくとも２つの別々のベクター中に存在する。
[0022]本開示はさらに、本明細書で提供される単離されたポリヌクレオチド、または本明細書で提供される組成物の２つまたはそれより多くの核酸分子を包含するベクターを提供する。
[0023]特定の形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチド核酸分子は、１つまたはそれより多くのプロモーターに作動可能に（operably）連結されていてもよい。
[0024]特定の形態において、本開示は、本明細書で提供されるベクター、または２つまたはそれより多くの本明細書で提供されるベクターの組成物を包含する、単離された宿主細胞を提供する。本開示はさらに、本明細書で提供される輸送体分子の作製方法であって、（ａ）提供された宿主細胞を培養すること；および（ｂ）輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットを単離することを包含する、上記方法を提供する。特定の形態において、本方法はさらに、（ｃ）輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをペイロードにコンジュゲートすることを包含する。
[0025]特定の形態において、本開示は、本明細書で提供される輸送体分子、本明細書で提供される組成物、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、本明細書で提供されるベクター、または本明細書で提供される宿主細胞を包含する診断試薬を提供する。特定の形態において、本開示は、本明細書で提供される輸送体分子、本明細書で提供される組成物、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、本明細書で提供されるベクター、または本明細書で提供される宿主細胞を包含するキットを提供する。
[0026]別の形態において、本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、または傷害を処置する方法であって、処置が必要な対象に、本明細書で提供される輸送体分子を包含する組成物を末梢投与することを包含し、輸送体分子は、ＢＢＢを通過して輸送された後にＣＮＳに曝露されると疾患、障害、または傷害を処置することが可能な治療剤を含み、疾患、障害、または傷害を処置するのに十分な治療剤の量は、ＢＢＢを通過して輸送されることにより疾患、障害、または傷害を処置する量である、上記方法を提供する。特定の形態において、治療剤は、ＣＮＳへの侵入後に輸送体分子から放出される。特定の形態において、ＣＮＳの疾患、障害、または傷害は、これらに制限されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、神経因性疼痛、神経変性、神経炎症、進行性多巣性白質脳病（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロトフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス−メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏症候群、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ベル麻痺、原発性腫瘍、二次転移、またはあらゆるそれらの組合せであってもよい。一形態において、治療剤は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）であり、疾患、障害、または傷害は、神経因性疼痛である。
[0027]本開示はさらに、対象のＣＮＳの薬剤への曝露を増加させる方法であって、薬剤を、本明細書で提供される輸送体分子にカップリングすること、およびカップリングされた薬剤を末梢投与することを包含する、上記方法を提供する。本開示はさらに、ＢＢＢを通過して薬剤を輸送する方法であって、輸送体分子がそれらにカップリングされた薬剤をＢＢＢを通過して輸送するように、薬剤を、本明細書で提供される輸送体分子にカップリングすることを包含する、上記方法を提供する。
[0028]図１は、不死化ラット脳内皮細胞株（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）（パネルＡ）、および初代ラット脳内皮細胞（パネルＢ）によるＢｂｂｔ０３５１のトランスサイトーシスの程度を示す。結果は、Ｙ軸に見かけの透過性として示される（ｃｍ／分で）。Ａ：ナノＬＣ−ＳＲＭ質量分析によって測定されたＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞による、Ｂｂｂｔ０３５１−ＦｃまたはＦＣ５−Ｆｃと陰性対照のＶＨＨ抗体とのトランスサイトーシスの比較（Haqqani A. S.ら、Method. Mol. Pharmaceutics. 2013; 10, 1542〜1556）；Ｂ：ナノＬＣ−ＳＲＭ質量分析によって測定された初代ラット脳内皮細胞による、ＦＣ５−ＦｃおよびＢｂｂｔ０３５１−Ｆｃのトランスサイトーシスの直接的な比較。ＦＣ５およびＢｂｂｔ０３５１の両方をヒトＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ領域に遺伝学的に融合させた；Ｃ：１０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した後の２４時間にわたるＦＣ５−ＦｃおよびＢｂｂｔ０３５１−Ｆｃのマウス脳への曝露の比較；マウスをＰＢＳで潅流し、脳を取り出し、中性洗浄剤の存在下でホモジナイズして、遠心分離後、可溶性分画にＢＢＢ標的化分子を放出させた。メソスケールディスカバリーアッセイ技術（Mesoscale Discovery assay technology、ＭＳＤ）を介して脳への曝露を測定した。ＭＳＤは、アレイプレート上での結合事象を検出するのに電気化学発光検出を利用する。分析物、このケースではＦＣ５−ＦｃまたはＢｂｂｔ０３５１−Ｆｃのいずれかを捕獲するのに、マウスモノクローナル抗ヒトＦｃ捕獲抗体が使用され、この捕獲事象は、その後、蛍光タグを有するヒツジ抗ヒトＩｇＧの結合（Ｈ＋Ｌ）を介して検出される。Ｄ：ｉ．ｖ．投与後の最初の２４時間の間における別個のタイムポイントでの血漿中のＦＣ５−ＦｃおよびＢｂｂｔ０３５１−Ｆｃと比較した、脳中の注射されたＦＣ５−ＦｃおよびＢｂｂｔ０３５１−Ｆｃの比率の比較。 [0029]図２Ａは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）Ｂｂｂｔ０２４１、ＦＣ５のヒト化型の構造、およびそれに続く完全ＩｇＧ分子またはＦａｂ分子を形成するためのヒトＩｇＧ１およびカッパ定常領域の付加の概略図を示す。図２Ｂは、ｓｃＦｖライブラリーの構造を示す。ＣＡＴ２．０ライブラリービルド中にこれまでに述べられた軽鎖のライブラリーを含有する重鎖のアクセプターベクターにＳｆｉＩおよびＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位を介してＦＣ５ドメイン抗体を指向的にクローニングした（Lloyd C,ら、Protein Eng Des Sel 2009; 22 (3); 159〜68）。 [0030]図３Ａは、蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）アッセイの概略図を示す（Miraglia S,ら、J Biomol Screen 1999; 4 (4);193〜204）。目的のｓｃＦｖは、マウス抗ｈｉｓモノクローナル抗体と結合し、順にアレクサフルオロ（AlexaFluor）６４７で標識された抗マウスモノクローナル抗体と結合するヒスチジンタグと共に卵型として描写される。複合体は、ｓｃＦｖを介して脳内皮細胞に結合すると、細胞において蛍光の領域を発生させる。この細胞ベースの蛍光はゲーティングされ、蛍光単位（ＦＬ−１）としてプロットされる。図３Ｂは、ＦＭＡＴアッセイにおける希釈率を増加させたＦＣ５ ＤＡｂおよびＢｂｂｔ０２４１のｓｃＦｖのＢ．Ｅｎｄ３細胞への結合を示す。結果は、蛍光単位（ＦＬ−１）として示される。図３Ｃは、競合ＦＭＡＴアッセイにおいてＦＣ５ Ｄａｂと結合した細胞の写真を示す。一定量のＦＣ５ Ｄａｂを、量を増加させたＢｂｂｔ０２４１または対照ｈＩｇＧ１と共にインキュベートした。図３Ｄは、図３Ｃに提示されたデータの図式的な要約である。 [0031]図４Ａは、インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおける単一ウェルの概略図を示す。図４Ｂは、インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいてＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞を介した、ＦＣ５−Ｆｃ、Ｂｂｂｔ０２４１ ｈＩｇＧ１、およびＮＩＰ２２８ ｈＩｇＧ１、すなわちハプテン（ＢＳＡにコンジュゲートしたニトロフェノール）に対して生じたアイソタイプ陰性対照ＩｇＧのインビトロにおける輸送の程度を示すＰＡＰＰ値を提供する。 [0032]図５Ａは、κ−オピオイドアゴニストであるダイノルフィンにコンジュゲートしたｓｃＦｖ分子の概略図である。図５Ｂは、実施例で説明される利尿モデルに関する研究設計を示す。図５Ｃは、ダイノルフィンにコンジュゲートしているかまたは遊離の陰性対照ＮＩＰ２２８ ｈＩｇＧ１ＴＭと比較した、ダイノルフィンにコンジュゲートしているかまたは遊離のＢｂｂｔ０２４１ ｈＩｇＧ１ＴＭが投与されたラットにおける経時的な尿排出量を示す。各グループにつき、ｎ＝６。Ｐ値は、ビヒクルに対して、および陰性対照に対して示される。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をボンフェローニの事後検定を使用して得た。 [0033]図６Ａは、一定量のＦＣ５模倣剤ＳｃＦｖと濃度を増加させたＢｂｂｔ０２４１ ＩｇＧとを使用したＦＭＡＴ競合の結果を示す。図６Ｂは、一定量のＦＣ５様非模倣剤ＳｃＦｖと濃度を増加させたＢｂｂｔ０２４１ ＩｇＧとを使用したＦＭＡＴ競合の結果を示す。 [0034]図７Ａは、選択されたＦＣ５模倣剤および非模倣剤ダイノルフィンコンジュゲート（ＩｇＧ様式）をラットに投与した際の尿排出量の結果を示す。ｎ＝６。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をボンフェローニの事後検定を使用して得た。Ｐ値が示される。 図７Ｂは、ダイノルフィンにコンジュゲートしたＮＩＰ２２８−ＩｇＧ（黒色のバー）およびＢｂｂｔ０６２６−ＩｇＧ（灰色のバー）をラットに投与した際の尿排出量の用量応答曲線を示す。ｎ＝６。試験される動物の数のために、実験を２日かけて行った。結果は、これら両方の研究からの組み合わされたデータとして提示される。 [0035]図８は、坐骨神経部分結紮アッセイで実行される概略的な外科手術を示すグラフィック表示である。 [0036]図９は、ラットにおける部分的な坐骨神経結紮によって誘導された痛覚過敏の逆戻りにおけるＦＣ５模倣剤−ＩＬ１Ｒａ融合体の作用を示す。１グループ当たりｎ＝９〜１０。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をテューキーの事後検定を使用して得た。Ｐ値が示される。 [0037]図１０は、神経部分結紮によって誘導された痛覚過敏に対する用量を増加させたＢｂｂｔ０６２６−ＩＬ１Ｒａ融合体の作用を示す。グループ１つ当たりｎ＝７〜８。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をボンフェローニの事後検定を使用して得た。Ｐ値が示される。 [0038]図１１Ａは、神経部分結紮によって誘導された痛覚過敏に対するＢｂｂｔ０６２６−ＩＬ１Ｒａ融合体の静脈内投与と皮下投与との作用を比較する。グループ１つ当たりｎ＝７〜８。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をボンフェローニの事後検定を使用して得た。Ｐ値が示される。 図１１Ｂは、神経部分結紮によって誘導された痛覚過敏に対するＢｂｂｔ０６２６−ＩＬ１Ｒａ融合体の静脈内投与と皮下投与との作用を比較する。グループ１つ当たりｎ＝７〜８。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をボンフェローニの事後検定を使用して得た。Ｐ値が示される。 [0039]図１２Ａは、神経部分結紮によって誘導された痛覚過敏に対するＢｂｂｔ０６２６−ＩＬ１Ｒａ融合体の単回および反復投与を比較する。グループ１つ当たりｎ＝８〜１０。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をボンフェローニの事後検定を使用して得た。Ｐ値が示される。 [0039]図１２Ｂは、神経部分結紮によって誘導された痛覚過敏に対するＢｂｂｔ０６２６−ＩＬ１Ｒａ融合体の単回および反復投与を比較する。グループ１つ当たりｎ＝８〜１０。従属因子として時間および処置を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。それに続く統計的有意性をボンフェローニの事後検定を使用して得た。Ｐ値が示される。
定義
[0040]単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文章中に明らかな別段の指示がない限り、複数形の指示対象を包含する。用語「１つの（a）」（または「１つの（an）」）、加えて用語「１つまたはそれより多くの」、および「少なくとも１つの」は、本明細書において同義的に使用することができる。
[0041]さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合、その他のものを含むまたは含まない２つの特定のフィーチャまたは構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるものとする。したがって、用語「および／または」は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの成句で使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を包含することが意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの成句で使用される場合、以下の実施態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
[0042]別段の指定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語や科学用語は、本開示が関係する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology、Juo, Pei-Show、第2版、2002、CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology、第3版、1999、Academic Press；およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology、改訂版、2000、Oxford University Pressは、当業者に本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を提供するものである。
[0043]単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により容認された形態で表される。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。別段の指定がない限り、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシの方向に記載される。本明細書に記載される見出しは、本開示の様々な形態または実施態様を限定するものではなく、限定は、全体として本明細書を参照することによりなされ得る。したがって、以下に定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより十分に定義される。
[0044]実施態様が言語「含む」を用いて記載される場合はいつでも、「からなる」および／または「本質的にからなる」という用語で記載されるそれ以外の類似の実施態様も提供される。
[0045]アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されたそれらの一般的に公知の３文字記号または１文字記号によって本明細書で記述される。同様にヌクレオチドも、それらの一般的に容認された１文字コードによって記述される。
[0046]用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、本明細書において同義的に使用されるように、抗体全体およびあらゆるそれらの抗原結合フラグメントまたは単鎖を包含する。
[0047]典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。本明細書で説明されるような特定のラクダ抗体は、２つのＨ鎖を含むがＬ鎖は含まない。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃｌで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と称されるより高度に保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性を有する領域にさらに細かく分類できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＷで構成されており、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４で配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）などの宿主組織または因子への結合を媒介することができる。
[0048]用語「生殖細胞化（germlining）」は、抗体中の特異的な位置におけるアミノ酸が生殖細胞系のアミノ酸に逆突然変異することを意味する。
[0049]用語「抗体」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組合せなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して認識してそれに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す場合がある。用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、多重特異性抗体、例えば少なくとも２つの無傷の抗体から生成した二重特異性抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が特定の生物活性を提示する限り抗原認識部位を含む他のあらゆる改変免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかに属する可能性がある。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造および３次元立体配置を有する。抗体は、ネイキッドであってもよいし、または例えば毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートしていてもよい。
[0050]用語「抗原結合フラグメント」は、無傷の抗体の部分を指し、無傷の抗体の相補性を決定する可変領域を指す。抗体フラグメントの例としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、直鎖状抗体、単鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
[0051]「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基、またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対して向けられた異なる抗体を包含するポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、無傷のおよび全長モノクローナル抗体の両方、加えて抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体の部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他のあらゆる改変された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、これらに限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物などにより様々な方法で作製された抗体を指す。
[0052]用語「ヒト化抗体」は、最小の非ヒト（例えば、マウス）配列を含有するように操作された非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンから誘導された抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、目的の特異性、親和性、および／または能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター）のＣＤＲからの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Jonesら、1986、Nature、321：522〜525；Riechmannら、1988、Nature、332：323〜327；Verhoeyenら、1988、Science、239：1534〜1536）。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基は、目的の特異性、親和性、および／または能力を有する非ヒト種からの抗体における対応する残基で置き換えられている。
[0053]ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、および／または能力をより正確にし、最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域中および／または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかにおいて追加の残基の置換によりさらに改変されていてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全部または実質的に全部を含有する少なくとも１つ、典型的には２つまたは３つの可変ドメインの実質的に全部を含むと予想され、それに対してＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいてもよい。ヒト化抗体を生成するのに使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号または５，６３９，６４１号に記載されている。
[0054]抗体の「可変領域」は、単独または組合せのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、高度可変領域としても公知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結される４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＷ領域によって近接して一緒に保持されており、他方の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術：（１）異種間の配列の変動に基づくアプローチ（すなわち、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest（第5版、1991、国立衛生研究所（National Institutes of Health）、メリーランド州ベセスダ））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的な研究に基づくアプローチ（Al-lazikaniら（1997）J. Molec. Biol. 273：927〜948）がある。加えて、これらの２つのアプローチの組合せが、時にはＣＤＲを決定するために当業界において使用される。
[0055]カバット（Kabat）のナンバリングシステムは、一般的に、可変ドメイン中の残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）（例えば、Kabatら、Sequences of Immunological Interest、第5版、公衆衛生局（Public Health Service）、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（1991））を指す場合に使用される。
[0056]Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（1991）において、カバットでなされるようなアミノ酸位置のナンバリングは、抗体のコンパイルにおける重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。以下の表１を参照されたい。このナンバリングシステムを使用する場合、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷまたはＣＤＲの短縮またはそれらへの挿入に相当するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有する可能性がある。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に、単一のアミノ酸の挿入（カバットに従って、残基５２ａ）、および重鎖ＦＷの残基８２の後に、挿入された残基（例えば、カバットに従って残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を包含し得る。
[0057]カバットの残基ナンバリングは、所与の抗体に関して、抗体配列の相同性領域における「標準的な」カバットでナンバリングされた配列とのアライメントによって決定することができる。一方でコチア（Chothia）は、構造的なループの配置を参照する（ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol. 196：901〜917（1987））。コチアのＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、カバットのナンバリングの慣例を使用してナンバリングした場合、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４とで異なる（これはなぜなら、カバットのナンバリングスキームはＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を置くためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループの末端は３２であり、３５Ａのみ存在する場合、ループの末端は３３であり、３５Ａおよび３５Ｂの両方が存在する場合、ループの末端は３４である）。ＡｂＭの高度可変領域は、カバットのＣＤＲとコチアの構造的なループとの組合せにより示され、オックスフォードモレキュラー（Oxford Molecular）のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。
[0058]ＩＭＧＴ（ImMunoGeneTics）はまた、ＣＤＲなどの免疫グロブリン可変領域に関するナンバリングシステムも提供する。例えば、参照により本発明に組み入れられるLefranc, M.P.ら、Dev. Comp. Immunol. 27： 55〜77(2003)を参照されたい。ＩＭＧＴナンバリングシステムは、５，０００個より多くの配列のアライメント、構造データ、および高度可変ループの特徴付けに基づいたものであり、全ての種ごとの可変およびＣＤＲ領域の簡単な比較を可能にする。ＩＭＧＴナンバリングの概要に従えば、Ｈ−ＣＤＲ１は、２６位から３５位にあり、Ｈ−ＣＤＲ２は、５１位から５７位にあり、Ｈ−ＣＤＲ３は、９３位から１０２位にあり、Ｌ−ＣＤＲ１は、２７位から３２位にあり、Ｌ−ＣＤＲ２は、５０位から５２位にあり、Ｌ−ＣＤＲ３は、８９位から９７位にある。
[0059]本明細書全体にわたり使用されているように、記載されるＶＨ ＣＤＲ配列は古典的なカバットのナンバリング配置に対応しており、すなわちカバットＨ−ＣＤＲ１は、３１〜３５位にあり、Ｈ−ＣＤＲ２は、５０〜６５位にあり、Ｈ−ＣＤＲ３は、９５〜１０２位にある。Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３もまた、古典的なカバットのナンバリング配置に対応しており、すなわちそれぞれ５０〜５６位および８９〜９７位である。本明細書で使用される場合、用語「Ｌ−ＣＤＲ１」または「軽鎖ＣＤＲ１」は、ＶＬにおいてカバットの２３〜３４位に配置された配列に対応する（対照的に、カバットのナンバリングの概要に従う古典的なＬ−ＣＤＲ１配置は２４〜３４位に対応する）。
[0060]本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１）を除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、およびそれらのフラグメントを包含する。したがってＦｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常ドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常ドメイン、ならびに任意選択でこれらのドメインへのフレキシブルなヒンジ領域のＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、Ｆｃ領域は、Ｊ鎖を包含する場合もある。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびに任意選択でＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間にヒンジ領域を含む。
[0061]Ｆｃ領域の境界は変動する可能性があるが、ヒトＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域は通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端を含むと規定され、ここでナンバリングは、Kabat（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（1991））に記載された通りのＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、単独でこの領域を指す場合もあるし、または抗体、抗体フラグメント、またはＦｃ融合タンパク質の環境中のこの領域を指す場合もある。
[0062]抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えば、これらに限定されないが、カバットに記載された通りＥＵインデックスによってナンバリングした場合、２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位、および３５８位などのＦｃ位置）で、多形が観察されており、したがって本発明の配列と従来技術における配列とのわずかな差が存在する可能性がある。ヒト免疫グロブリンの多形体は、よく特徴付けられている。今のところ、１８Ｇｍアロタイプ：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ３、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）が公知である(Lefrancら、The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon、Oxford、43〜78頁(1990)；Lefranc, G.ら、1979、Hum. Genet.: 50、199〜211)。本発明の開示の抗体は、あらゆる免疫グロブリン遺伝子のあらゆるアロタイプ、同型アロタイプ（isoallotype）、またはハプロタイプを組み込むことができ、したがって本明細書で提供される配列のアロタイプ、同型アロタイプまたはハプロタイプに限定されないことが予期される。
[0063]本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ融合タンパク質」は、全長Ｆｃドメインを含むタンパク質（例えば、本発明の開示のコンジュゲート化合物）に加えて、Ｆｃドメインフラグメント（例えば、完全ＣＨ２ドメイン、完全ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２フラグメント、ＣＨ３フラグメント、またはそれらの組合せ）を含むタンパク質を包含する。Ｆｃ融合タンパク質はまた、ヒンジ領域の全部または一部を含んでいてもよい。
[0064]用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生産された抗体、または当業界において公知のあらゆる技術を使用して作製されたヒトによって生産された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。このヒト抗体の定義は、無傷または全長抗体、それらのフラグメント、ならびに／または少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などを包含する。
[0065]用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つまたはそれより多くの種から誘導されている抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖両方の可変領域が、目的の特異性、親和性、および／または能力を有する１種の哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）から誘導された抗体の可変領域に対応し、同時に、その種における免疫応答の惹起を回避するために、定常領域が別の種（通常ヒト）から誘導された抗体中の配列に相同である。
[0066]「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間における総計の非共有結合による相互作用の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原との）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書で説明される方法などの当業界において公知の一般的な方法によって測定することができる。低い親和性の抗体は、一般的に、抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、それに対して高親和性の抗体は、一般的に、抗原とより速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当業界において公知であり、そのうちいずれかを本発明の開示の目的のために使用することができる。
[0067]「効力」は通常、別段の指定がない限り、ＩＣ５０値としてｎＭまたはｐＭで表される。ＩＣ５０は、抗体分子の中央値の阻害濃度である。機能アッセイにおいて、ＩＣ５０は、生体反応をその最大値の５０％に低減する濃度である。リガンド結合研究において、ＩＣ５０は、受容体結合を最大の特異的な結合レベルの５０％に低減する濃度である。ＩＣ５０は、当業界において公知の様々な手段によって計算することができる。
[0068]本開示の抗体またはポリペプチドに関する効力向上の参照抗体と比較した場合の倍率は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、または少なくとも約１８０倍またはそれより高い倍率であり得る。
[0069]「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然に見出されない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、それらが天然に見出される形態でなくなる程度に精製されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物を包含する。一部の実施態様において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
[0070]「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後予測、または療法の必要を示すあらゆる対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象としては、ヒト、家畜、家畜、競技用動物、および動物園の動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどが挙げられる。
[0071]用語「医薬組成物」は、活性成分の生物活性を有効にすることができるような形態を有し、組成物が投与されると予想される対象にとって容認し難い程毒性である追加の要素を含有しない調製物を指す。このような組成物は、滅菌されていてもよい。
[0072]本明細書で開示される抗体の「有効量」は、具体的に述べられた目的を達成するのに十分な量である。「有効量」は、述べられた目的に関して、経験的に決定してもよいし、慣例的な方式で決定してもよい。
[0073]用語「治療有効量」は、対象または哺乳動物において疾患または障害を「処置」または「予防」するのに有効な抗体または他の薬物の量を指す。
[0074]言葉「標識」は、本明細書で使用される場合、「標識された」抗体が生成されるように抗体に直接的または間接的にコンジュゲートした検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自身検出可能であってもよいし（例えば、放射線同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識のケースでは、検出することができる基質化合物または組成物の化学的変更を触媒してもよい。
[0075]「処置すること」または「処置」または「処置するため」または「改善すること」または「改善するため」などの用語は、（１）診断された病理学的な症状または障害の症状を治癒する、スローダウンさせる、減らす、および／または診断された病理学的な症状または障害の進行を止める治療的手段、ならびに（２）標的化された病理学的な症状または障害の発生を予防する、および／または遅延させる予防的または予防的措置の両方を指す。したがって、処置が必要な者としては、障害を有する者；障害を有しやすい者；および障害を予防しようとする者が挙げられる。特定の実施態様において、患者が、例えば、炎症性または自己免疫性の疾患または障害に関連する症状の全体的、部分的または一過性の改善または消失を示す場合、その対象は、本明細書で提供される方法に従ってその疾患または障害についてうまく「処置」されている。
[0076]「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は、本明細書において同義的に使用されるように、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込むことができるあらゆる基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含んでいてもよい。前記の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの本明細書で述べられた全てのポリヌクレオチドに適用される。
[0077]用語「発現」は、本明細書で使用される場合、遺伝子が本明細書で提供される生化学的分子、例えば輸送体分子を生産するプロセスを指す。このプロセスは、細胞内における遺伝子の機能性の存在、例えば、これらに限定されないが、遺伝子ノックダウン、加えて一過性発現と安定な発現の両方などのあらゆる顕示化を包含する。そのようなものとしては、これらに限定されないが、遺伝子の１つまたはそれより多くのｍＲＮＡへの転写、およびこのようなｍＲＮＡの１つまたはそれより多くのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。最終産物が生化学的物質である場合、発現は、その生化学的物質およびあらゆる前駆体の生成を包含する。
[0078]「発現産物」は、核酸、例えば遺伝子の転写によって生産されたメッセンジャーＲＮＡ、またはポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される発現産物としてはさらに、転写後修飾、例えばポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、糖付加、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの連結、タンパク質分解切断、および同種のものを有するポリペプチドが挙げられる。
[0079]用語「ベクター」または「発現ベクター」は、本明細書では、宿主細胞中に導入して目的の発現産物を発現させるための媒体として使用されるベクターを意味するものとして使用される。当業者公知のように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群より容易に選択することができる。一般的に、ベクターは、選択マーカー、特定の核酸のクローニングを容易にするための適切な制限部位、ならびに真核または原核細胞中に入るおよび／またはそこで複製する能力を含んでいてもよい。ベクターの例としては、これらに限定されないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と連結されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞が挙げられる。
[0080]用語「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの発現産物をコードするベクターを有する細胞を指す。組換え宿主から発現産物を単離するためのプロセスの記載において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、同義的に使用され、明かに別段の指定がない限り発現産物の源を示し、すなわち、「細胞」からの発現産物の回収は、遠沈させた全細胞からの回収、または培地と懸濁された細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収のいずれかを意味する。
[0081]用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用され、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状でもよいし、または分岐状でもよく、改変されたアミノ酸を含んでいてもよいし、その間に非アミノ酸が介在していてもよい。これらの用語はまた、天然に改変された、または介入；例えば、ジスルフィド結合形成、糖付加、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他のあらゆる操作もしくは改変、例えば標識要素とのコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、例えば、１つまたはそれより多くのアミノ酸類似体（例えば、天然にはないアミノ酸など）、加えて当業界において公知の他の改変を含有するポリペプチドもこの定義内に包含される。本開示のポリペプチドは抗体をベースとしているため、特定の実施態様において、ポリペプチドは、単鎖または連結された鎖として生じる可能性があることが理解される。
[0082]２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチドの状況における用語「同一な」またはパーセント「同一性」は、２つまたはそれより多くの配列または部分配列が、配列同一性の一部としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮に入れずに対応が最大になるように比較して並べられた（必要に応じてギャップを導入して）場合、同じか、または同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有することを指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアライメントを得るのに使用することができる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当業界において公知である。
[0083]このような配列アライメントアルゴリズムの１つの非限定的な例は、Karlinら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci.、87：2264-2268、改変版として、Karlinら、1993、Proc. Natl. Acad. Sci.、90：5873-5877に記載されるアルゴリズムであり、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Altschulら、1991, Nucleic Acids Res.、25：3389〜3402）に取り入れられている。特定の実施態様において、ギャップ有りＢＬＡＳＴは、Altschulら、1997, Nucleic Acids Res. 25：3389〜3402で説明されるようにして使用することができる。配列を並べるのに使用することができる追加の公共的に利用可能なソフトウェアプログラムは、ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Altschulら、1996、Methods in Enzymology、266：460〜480）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（ジェネンテック（Genentech）、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）またはメガライン（Megalign）（DNASTAR）である。特定の実施態様において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または９０のギャップウェイト、および１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトを使用して）決定される。特定の代替の実施態様において、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48)：444〜453(1970)）を取り込んだＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定することができる（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイト、および１、２、３、４、５のレングスウェイトを使用して）。代替として、特定の実施態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＭｙｅｒｓおよびＭｙｅｒｓのアルゴリズム（CABIOS、4：11〜17（1989））を使用して決定される。例えば、パーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用して、およびＰＡＭ１２０を残基表、１２のギャップの伸長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーで使用して決定することができる。当業者は、特定のアライメントソフトウェアによって、最大のアライメントにとって適切なパラメーターを決定することができる。特定の実施態様において、アライメントソフトウェアのデフォルトパラメーターが使用される。
[0084]特定の実施態様において、第１のアミノ酸配列の第２の配列アミノ酸に対するパーセンテージ同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中Ｙは、第１および第２の配列のアライメント中の同一なマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによって並べられた場合）であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、第１の配列の第２の配列に対するパーセント同一性は、第２の配列の第１の配列に対するパーセント同一性より高いと予想される。
[0085]「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当業界で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換することは、保存的置換である。特定の実施態様において、本開示のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、抗原、すなわちそのポリペプチドまたは抗体が結合するＩＬ−２１への結合を無効にしない。抗原結合をなくさないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当業界において周知である（例えば、Brummellら、Biochem. 32：1180〜1187（1993）；Kobayashiら、Protein Eng. 12（10）：879〜884（1999）；およびBurksら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：.412〜417（1997）を参照）。
[0086]用語「コンセンサス配列」は、本明細書で軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）可変領域に関して使用される場合、ＶＬまたはＶＨ鎖内のどのアミノ酸残基が、抗原結合を損なわずに改変を受け入れることができるかに関する情報に基づき定義された、複合的な、または一般名称化したＶＬまたはＶＨ配列を指す。したがって、ＶＬまたはＶＨ鎖の「コンセンサス配列」において、特定のアミノ酸位置は、その位置における複数の可能性のあるアミノ酸残基の１つによって占められる。例えば、アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）が特定の位置に存在する場合、コンセンサス配列内のその特定の位置は、アルギニンまたはセリン（ＲまたはＳ）のいずれかであり得る。ＶＨおよびＶＬ鎖のコンセンサス配列は、例えば、インビトロにおける親和性の成熟（例えば、縮重をコードするプライマーを使用して、特定のＣＤＲ中のアミノ酸位置毎に無作為化すること）、抗体ＣＤＲ内のアミノ酸残基の変異誘発スキャンすること（例えば、アラニンスキャニング変異）、または当業界において公知の他のあらゆる方法を行い、それに続き抗原への突然変異体の結合を評価して、突然変異したアミノ酸位置が抗原結合に影響を与えるかどうかを決定することによって定義することができる。一部の実施態様において、突然変異は、ＣＤＲ領域に導入される。他の実施態様において、突然変異は、フレームワーク領域に導入される。いくつかの他の実施態様において、突然変異は、ＣＤＲおよびフレームワーク領域に導入される。
血液脳関門輸送体分子
[0087]本開示は、ペイロードと連結したままで、例えば、ペイロードに融合またはコンジュゲートしたままで脳内皮細胞を通過することができる輸送体分子を使用して、目的の物質、例えば治療剤または診断剤または「ペイロード」を血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して送達するための組成物を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、本明細書で提供される輸送体分子によってＢＢＢを通過する輸送を促進することができるあらゆる物質の省略表現として使用される。ペイロードは、例えば融合ポリペプチドとして輸送体分子の一部であってもよいし、またはジスルフィド結合または他の共有結合を介してポリペプチドに合体していてもよい。代替として、ペイロードは、さらに後述されるように、輸送体分子をＢＢＢを通過したその輸送が容易になるような状態にすることができるあらゆる方法で輸送体分子と連結していてもよい。特定の形態において、ペイロードは、ＢＢＢ輸送後も輸送体分子の一部のままであり、その形態で中枢神経系（ＣＮＳ）活性を保持する。代替として、ペイロードは、ＢＢＢ輸送中に輸送体分子と連結しているが、ＢＢＢ輸送後に輸送体分子から解離できるようになっていてもよい。ペイロード部分の例示的な非限定的な例は、本明細書の他所に提供されている。本開示はさらに、このような輸送体分子の使用を含む、ＣＮＳの疾患または障害を処置または診断するための方法を提供する。
[0088]特定の形態において、本開示は、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む単離された輸送体分子を提供する。特定の形態において、該ポリペプチドは、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）、例えば、マウスＢ．Ｅｎｄ３細胞への結合を検出するために蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用して同定され単離された、ラクダ抗体ＦＣ５のヒト化型である。特定の形態において、該ポリペプチドは、ＢＭＶＥＣへの結合を検出するために再度ＦＭＡＴを使用して同定され単離された、ＦＣ５からの２つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ナイーブｓｃＦｖファージライブラリーまたはｓｃＦｖファージライブラリーから単離された抗体ＶＨおよび抗体ＶＬを含む。特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、抗体またはそれらの活性なフラグメントであり、ここで「活性な」は、輸送体分子が、例えば、１つまたはそれより多くの種におけるＢＭＶＥＣ、例えば、マウスＢＭＶＥＣ、ラットＢＭＶＥＣ、カニクイザルＢＭＶＥＣ、またはヒトＢＭＶＥＣに結合する、１つまたはそれより多くの種のＢＭＶＥＣに内在化する、および／または単独で、またはペイロードと連結した状態のいずれかで血液脳関門を通過することができることを意味する。特定の形態において、輸送体分子は、Ｂｂｂｔ０２４１、Ｂｂｂｔ０３５１、Ｂｂｂｔ０６２６、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６５４、Ｂｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７２７、Ｂｂｂｔ０７３２、Ｂｂｂｔ０７５４、Ｂｂｂｔ０６７４、Ｂｂｂｔ０７５５、Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０５７９またはＢｂｂｔ０６７１の１つまたはそれより多くを含む。
[0089]特定の形態において、輸送体分子は、ＢＭＶＥＣに結合しないが、それでもなおインビトロのトランスサイトーシスアッセイで示されるようにＢＢＢを通過して輸送することが可能である。特定の形態において、この輸送体分子は、は、ＦＣ５より高い効率でＢＢＢを通過する。特定の形態において、この輸送体分子は、２つのアミノ酸置換、カバットの９７位におけるＴ９７Ａ置換、およびカバットの１００ａ位におけるＴ１００ａＤ置換を除いてＦＣ５のアミノ酸配列に同一であり、Ｂｂｂｔ０３５１のアミノ酸配列（配列番号２００）を有する。
[0090]特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。例えば免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−１（Ｈ−ＣＤＲ１）、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−２（Ｈ−ＣＤＲ２）、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−３（Ｈ−ＣＤＲ３）を包含していてもよい。特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲを追加で含んでいてもよいし、または代替として含んでいてもよい。例えば、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、相補性決定領域−１（Ｌ−ＣＤＲ１）、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−３（Ｌ−ＣＤＲ３）を包含していてもよい。特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、それぞれ以下のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含有していてもよい：
（ａ）Ｂｂｂｔ０２４１のＣＤＲである、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４；
（ｂ）Ｂｂｂｔ０６２６のＣＤＲに類似したＣＤＲである、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、ＱＧＤＳＬＸ２Ｘ３ＹＹＸ４Ｘ５（式中Ｘ２＝ＴまたはＲであり；Ｘ３＝Ｓ、Ｒ、またはＴであり；Ｘ４＝ＡまたはＴであり；Ｘ５＝ＮまたはＳである）（配列番号２２９）、ＧＸ８Ｘ９ＮＲＰＳ（式中Ｘ８＝ＫまたはＥであり、Ｘ９＝ＮまたはＤである）（配列番号２３０）、およびＮＳＲＤＸ１３Ｘ１４ＧＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｖ（式中Ｘ１３＝ＳまたはＮであり；Ｘ１４＝ＳまたはＴであり；Ｘ１５＝Ｎ、Ｋ、またはＨであり；Ｘ１６＝ＨまたはＰであり；Ｘ１７＝ＶまたはＷである）（配列番号２３１）；
（ｃ）Ｂｂｂｔ０６３２のＣＤＲに類似したＣＤＲである、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
（ｄ）Ｂｂｂｔ０６５４のＣＤＲである、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６６、配列番号６７、および配列番号６８；
（ｅ）Ｂｂｂｔ０７２６のＣＤＲに類似したＣＤＲである、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
（ｆ）Ｂｂｂｔ０７２７のＣＤＲに類似したＣＤＲである、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
（ｇ）Ｂｂｂｔ０７３２のＣＤＲに類似したＣＤＲである、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
（ｈ）Ｂｂｂｔ０７５４のＣＤＲである、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３８、配列番号１３９、および配列番号１４０；
（ｉ）Ｂｂｂｔ０６７４のＣＤＲである、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５６、配列番号１５７、および配列番号１５８；
（ｊ）Ｂｂｂｔ０７５５のＣＤＲである、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７４、配列番号１７５、および配列番号１７６；
（ｋ）Ｂｂｂｔ０６４３のＣＤＲである、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１９２、配列番号１９３、および配列番号１９４；または
（ｌ）Ｂｂｂｔ０５７９のＣＤＲである、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１。
[0091]特定の代替の実施態様において、上述した１つまたはそれより多くのＣＤＲは、例えば１、２、３、４、または５つの単一のアミノ酸の欠失、置換または挿入を有すること除いて、列挙されたＣＤＲと同一である。特定の実施態様において、上記で提供される輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる。特定の形態において、Ｂｂｂｔ０２４１バリアントであるＢｂｂｔ０２４１ｍのＨ−ＣＤＲ３は、２つの置換、カバットの９７位におけるＴ９７Ａ置換、およびカバットの１００ａ位におけるＴ１００ａＤ置換を含む。
[0092]特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、それぞれ以下のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含有していてもよい：
（ｂ）Ｂｂｂｔ０６２６のＣＤＲである、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２；
（ｃ）Ｂｂｂｔ０６３２のＣＤＲである、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０；
（ｅ）Ｂｂｂｔ０７２６のＣＤＲである、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８４、配列番号８５、および配列番号８６；
（ｆ）Ｂｂｂｔ０７２７のＣＤＲである、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号１０２、配列番号１０３、および配列番号１０４；または
（ｇ）Ｂｂｂｔ０７３２のＣＤＲである、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１２０、配列番号１２１、および配列番号１２２。
[0093]特定の代替の実施態様において、上述した１つまたはそれより多くのＣＤＲは、例えば１、２、３、４、または５つの単一のアミノ酸の欠失、置換または挿入を有すること除いて、列挙されたＣＤＲと同一である。特定の実施態様において、上記で提供される輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる。
[0094]特定の形態において、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、抗体ＶＨおよび抗体ＶＬが生産されるように免疫グロブリンフレームワーク領域中に存在していてもよい。特定の形態において、フレームワーク領域は、ヒトから誘導されたフレームワーク領域であってもよい。特定の形態において、抗体ＶＨおよび抗体ＶＬは、例えばフレキシブルなペプチドリンカーを介して一緒に融合され、ｓｃＦｖ分子を形成する。特定の形態において、ＶＨおよびＶＬは、１つまたはそれより多くの免疫グロブリンの定常ドメイン、例えば、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＬ−カッパドメイン、および／またはＣＬラムダドメインをさらに含む。特定の形態において、１つまたはそれより多くの免疫グロブリンの定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンから誘導される。特定の形態において、例えば、より長いもしくはより短い半減期、増加したもしくは低減したエフェクター機能、またはペプチド融合、ジスルフィド結合もしくは化学的なコンジュゲーションのいずれかを介してペイロード分子を接続する能力を助長するために、ＶＨ、ＶＬ、および／または定常ドメインは、突然変異を含んでいてもよい。
[0095]特定の形態において、本開示は、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）領域、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）領域または免疫グロブリンＶＨ領域および免疫グロブリンＶＬ領域を含む、上記輸送体分子を提供する。特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、以下を含む：
（ａ）配列番号２に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１１に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号２および配列番号１１は、Ｂｂｂｔ０２４１のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｂ）配列番号２０に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２９に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号２０および配列番号２９は、Ｂｂｂｔ０６２６のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｃ）配列番号３８に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号４７に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号３８および配列番号４７は、Ｂｂｂｔ０６３２のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｄ）配列番号５６に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号６５に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号５６および配列番号６５は、Ｂｂｂｔ０６５４のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｅ）配列番号７４に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号８３に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号７４および配列番号８３は、Ｂｂｂｔ０７２６のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｆ）配列番号９２に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１０１に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号９２および配列番号１０１は、Ｂｂｂｔ０７２７のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｇ）配列番号１１０に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１１９に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号１１０および配列番号１１９は、Ｂｂｂｔ０７３２のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｈ）配列番号１２８に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３７に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号１２８および配列番号１３７は、Ｂｂｂｔ０７５４のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｉ）配列番号１４６に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１５５に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号１４６および配列番号１５５は、Ｂｂｂｔ０６７４のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｊ）配列番号１６４に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１７３に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号１６４および配列番号１７３は、Ｂｂｂｔ０７５５のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｋ）配列番号１８２に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１９１に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号１８２および配列番号１９１は、Ｂｂｂｔ０６４３のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；
（ｌ）配列番号２０９に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２１８に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号２０９および配列番号２１８は、Ｂｂｂｔ０５７９のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列；または
（ｍ）配列番号２２６に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２２７に少なくとも８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列であって、配列番号２２６および配列番号２２７は、Ｂｂｂｔ０６７１のＶＨおよびＶＬ領域をコードする、上記配列。
特定の形態において、上記で提供される輸送体分子は、輸送体活性を有し、例えば、輸送体分子は、１つまたはそれより多くの種からのＢＭＶＥＣ、例えば、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトＢＭＶＥＣに結合することができるか、輸送体分子は、１つまたはそれより多くの種のＢＭＶＥＣに内在化することができるか、または輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる。
[0096]特定の形態において、本開示は、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ここで、
（ａ）ＶＨは配列番号２を含み、ＶＬは配列番号１１を含み；
（ｂ）ＶＨは配列番号２０を含み、ＶＬは、ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＸ１ＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＸ２Ｘ３ＹＹＸ４Ｘ５ＷＹＱＸ６ＫＰＧＱＡＰＶＬＶＸ７ＹＧＸ８Ｘ９ＮＲＰＳＧＸ１０ＰＤＲＦＳＧＳＸ１１ＳＧＸ１２ＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＸ１３Ｘ１４ＧＸ１５Ｘ１６Ｘ１７ＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（式中Ｘ１＝ＲまたはＧであり；Ｘ２＝ＴまたはＲであり；Ｘ３＝Ｓ、Ｒ、またはＴであり；Ｘ４＝ＡまたはＴであり；Ｘ５＝ＮまたはＳであり；Ｘ６＝ＨまたはＱであり；Ｘ７＝ＭまたはＩであり；Ｘ８＝ＫまたはＥであり；Ｘ９＝ＮまたはＤであり；Ｘ１０＝ＶまたはＩであり；Ｘ１１＝ＳまたはＲであり；Ｘ１２＝ＮまたはＴであり；Ｘ１３＝ＳまたはＮであり；Ｘ１４＝ＳまたはＴであり；Ｘ１５＝Ｎ、Ｋ、またはＨであり；Ｘ１６＝ＨまたはＰであり；Ｘ１７＝ＶまたはＷである）（配列番号２２８）または配列番号２９を含み；
（ｃ）ＶＨは配列番号３８を含み、ＶＬは配列番号２２８または配列番号４７を含み；
（ｄ）ＶＨは配列番号５６を含み、ＶＬは配列番号６５を含み；
（ｅ）ＶＨは配列番号７４を含み、ＶＬは配列番号２２８または配列番号８３を含み；
（ｆ）ＶＨは配列番号９２を含み、ＶＬは配列番号２２８または配列番号１０１を含み；
（ｇ）ＶＨは配列番号１１０を含み、ＶＬは配列番号２２８または配列番号１１９を含み；
（ｈ）ＶＨは配列番号１２８を含み、ＶＬは配列番号１３７を含み；
（ｉ）ＶＨは配列番号１４６を含み、ＶＬは配列番号１５５を含み；
（ｊ）ＶＨは配列番号１６４を含み、ＶＬは配列番号１７３を含み；または
（ｋ）ＶＨは配列番号１８２を含み、ＶＬは配列番号１９１を含む、輸送体分子を提供する。
特定の形態において、上記で提供される輸送体分子は、輸送体活性を有し、例えば、輸送体分子は、１つまたはそれより多くの種からのＢＭＶＥＣ、例えば、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトＢＭＶＥＣに結合することができるか、輸送体分子は、１つまたはそれより多くの種のＢＭＶＥＣに内在化することができるか、または輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる。
[0097]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含み、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、抗体またはそれらのＢＢＢ透過性フラグメントを含む。本明細書に記載される「ＢＢＢ透過性フラグメント」は、１つまたはそれより多くの種のＢＭＶＥＣに特異的に結合して、インビトロまたはインビボでＢＭＶＥＣを介して末梢血管系からＣＮＳ血管系に通過することができる輸送体分子のフラグメントである。所与のフラグメントがＢＢＢ透過性フラグメントであるかどうかは、当業界における通常の技術を有する者に公知の様々なインビトロまたはインビボのアッセイによって試験することができる。例えば、輸送体分子は、本明細書の他所で説明されるインビトロのトランスサイトーシスアッセイで、または本明細書の他所で説明される利尿アッセイなどのインビボのアッセイで試験することができる。インビボにおけるＢＢＢを通過するペイロードの送達を測定するのに使用することができる他のアッセイとしては、これらに限定されないが、慢性絞扼損傷（ＣＣＩ）；神経部分損傷モデル（ＳＮＩ）または脊髄神経結紮（ＳＮＬ）が挙げられ、これらは全て、ポーフリック（paw flick）、またはハーグリーブス方法（Hargreaves Kら、Pain; 1988; 32; 77〜88）により測定することができる。
[0098]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、２つまたはそれより多くのサブユニット、例えば、重鎖またはそれらのフラグメントおよび軽鎖またはそれらのフラグメントを含むかまたはからなる抗体またはそれらのＢＢＢ透過性フラグメントを含み、ここで重鎖および軽鎖は、例えば、単一の融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）として、または１つまたはそれより多くのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのサブユニットとして連結される。特定の形態において、重鎖は、ＶＨドメインまたはＶＨ領域を含み、軽鎖は、ＶＬドメインまたはＶＬ領域を含む。
[0099]特定の形態において、重鎖は、重鎖定常ドメイン、例えば、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、および／もしくはＣＨ３ドメイン、またはそれらのフラグメントをさらに含む。特定の形態において、重鎖定常ドメインは、ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメント、例えば、ヒトＩｇＧ定常ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常ドメインである。特定の形態において、ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントは、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、変更された糖付加および／または１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を含み、ここで改変されたＩｇＧは、特定の特性、例えば、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、増加または減少した半減期、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、増加もしくは減少したエフェクター機能のいずれか、または例えばペプチド結合、ジスルフィド結合もしくは化学的なコンジュゲーションを介して異種部分と接続する能力を有する。特定の形態において、ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントは、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、変更された糖付加を有し、ここで改変されたＩｇＧは、特定の特性、例えば、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、増加または減少した半減期、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、増加または減少したエフェクター機能のいずれかを有する。
[0100]様々なエフェクター機能、例えばこれらに限定されないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、または抗体依存性の細胞の食作用（ＡＤＣＰ）などは、免疫グロブリンの定常ドメインによって促進することができる。
[0101]半減期を増加または減少させることが可能な多数の特異的なＩｇＧ定常ドメイン置換が当業界において公知である。例えば、カバットに記載された通りＥＵインデックスによってナンバリングした場合の置換２５２Ｙ、２５４Ｔ、２５６Ｅ、およびそれらの組合せは、半減期を増加させることが示されている（例えば、ＵＳ７，０８３，７８４を参照）。また、残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、３０９、３１１、４２８、４３３、４３４およびそれらの組合せにおける置換も、半減期を変更することが報告されている（例えば、米国特許第６，２７７，３７５号、７，０８３，７８４号；７，２１７，７９７号、８，０８８，３７６号；ＵＳ２００２／０１４７３１１；ＵＳ２００７／０１４８１６４；ＷＯ９８２３２８９およびＷＯ０９０５８４９２を参照）。同様に、エフェクター機能を増加または減少させることが可能なＩｇＧ定常ドメインの置換が当業界において説明されている。例えば、カバットに記載された通りＥＵインデックスによってナンバリングした場合の置換２３９Ｓおよび／または３３２Ｅは、ＡＤＣＣ活性を増加させることが示されており（例えば、ＷＯ２００４０９９２４９、ＵＳ７，３１７，０９１を参照）、一方でカバットに記載された通りＥＵインデックスによってナンバリングした場合の置換２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｑ、２３５Ｙ、２３９Ａ、３３２Ｑ、３３１Ｓ、３３２Ｑおよびそれらの組合せは、ＡＤＣＣを減少させることが示されている。エフェクター機能を変更する（増加または減少させる）多数の他の置換を使用することができ、例えば、ＷＯ８８０７０８９、ＷＯ９９５８５７２、ＷＯ９９５１６４２、ＷＯ２０１２１７５７５１、ＷＯ２０１１１４９９９９、ＷＯ２０１１０６６５０１、ＷＯ２００００４２０７２、ＷＯ２０１１１２０１３４に記載された突然変異を参照されたい。
[0102]ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントを含む分子によって惹起されたエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）は、ＩｇＧ定常ドメインのＣＨ２領域に連結された炭水化物部分に強く依存する（Claudia Ferraraら、2006、Biotechnology and Bioengineering 93：851〜861）。したがって、ＩｇＧ定常のＣＨ２ドメインの糖付加を、エフェクター機能が増加または減少するように改変してもよい（例えば、Umanaら、1999、Nat. Biotechnol 17：176〜180；Daviesら、2001, Biotechnol Bioeng 74：288〜294；Shieldsら、2002、J Biol Chem 277：26733〜26740；Shinkawaら、2003、J Biol Chem 278：3466〜3473；米国特許第６，６０２，６８４号；６，９４６，２９２号；７，０６４，１９１号；７，２１４，７７５号；７，３９３，６８３号；７，４２５，４４６号；７，５０４，２５６号；米国公報第２００３／０１５７１０８号；２００３／０００３０９７号；２００９／００１０９２１号；ＰＯＴＩＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Biowa, Inc）；ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）糖付加加工技術（ロシュ（Roche））を参照）。特定には、フコシル化が低減されたＩｇＧ定常領域は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの増加した結合および強化されたＡＤＣＣ活性を有する。フコシル化が低減されているかまたはフコシル化がないＩｇＧ定常領域の生成方法が説明されている（例えば、ＵＳ２００５／０２２６８６７；Moriら、2004、Biotechnol Bioeng 88：901〜908；Coxら、2006、Nat Biotechnol.、24：1591〜7、および上述された参考文献を参照）。代替として、糖付加が欠失したＩｇＧ定常領域は、低減したエフェクター機能を有し（Walkerら、1989、Biochem. J. 259：347〜353）、例えば細菌の宿主細胞使用して生成できることが示されている（例えば、Simmonsら、２００２、J. Immunol. Methods、263：133〜147を参照）。
[0103]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、変更された糖付加および／または１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を含むＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントを含み、その場合、輸送体分子の少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）が、低減または消去される。特定の形態において、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の両方が低減または消去される。
[0104]特定の形態において、軽鎖は、軽鎖定常ドメインまたはそれらのフラグメント、例えば、ＣカッパドメインまたはＣラムダドメイン、例えば、ヒトカッパ定常ドメインもしくはそれらのフラグメント、またはヒトラムダ定常領域もしくはそれらのフラグメントをさらに含む。
[0105]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、あらゆるそれらの組合せ、またはあらゆるそれらの抗原結合フラグメントを含むかまたはからなる抗体またはそれらのＢＢＢ透過性フラグメントを含む。特定の形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む、完全ＩｇＧ免疫グロブリン、例えばヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。特定の形態において、輸送体分子は、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｄｓＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、またはｓｃ（Ｆｖ）２フラグメントを含むかまたはからなる。
[0106]特定の実施態様において、本明細書で提供される輸送体分子は、抗体のｓｃＦｖフラグメントを含み、ｓｃＦｖは、直接的に、またはリンカー、例えばフレキシブルなリンカーを介してのいずれかで互いに融合した、ＶＨドメインまたはＶＨ領域およびＶＬドメインまたはＶＬ領域を含む。ｓｃＦｖ中のＶＨおよびＶＬは、ＶＨがＮ末端にあり、ＶＬがＣ末端にあるか、またはその逆になるように配列されていてもよい。ＶＨおよびＶＬがリンカーを介して融合されている場合、ｓｃＦｖは、アミノ末端から、ＶＨ−Ｌ−ＶＬを含んでいてもよく、式中Ｌはリンカーであり、またはＶＬ−Ｌ−ＶＨを含んでいてもよく、式中Ｌはリンカーである。
[0107]ｓｃＦｖを調製するのに好適な様々なリンカーは、当業界において通常の技術を有する者に公知である。いくつかの非限定的な例としては、リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である）（配列番号２３２）、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である）（配列番号２３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＬ（配列番号２３６）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号２３７）が挙げられる。
[0108]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、ｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖは、Ｂｂｂｔ０２４１、Ｂｂｂｔ０６２６、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６５４、Ｂｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７２７、Ｂｂｂｔ０７３２、Ｂｂｂｔ０７５４、Ｂｂｂｔ０６７４、Ｂｂｂｔ０７５５、Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０５７９、またはＢｂｂｔ０６７１のＶＨおよびＶＬを含む。
[0109]特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、輸送体分子がＢＢＢを通過するペイロードの輸送を容易にすることができるように、ペイロードと連結される。特定の形態において、ペイロードは、ペプチドまたはポリペプチドであり、ペプチド結合を介して、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに融合されている。融合は、例えば、重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端、重鎖または軽鎖のいずれかのＣ末端、またはあらゆるそれらの組合せになされてもよい。特定の形態において、ペイロードは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド上の１つまたはそれより多くの部位にジスルフィド結合を介して接続されたペプチドまたはポリペプチドである。特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、ペイロードの１つまたはそれより多くのコピーの、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドへの正確なおよび／または高密度の接続を容易にするために、より多いまたはより少ないシステイン残基を含有するように操作されてもよい。特定の形態において、ペイロードは、例えば、遊離のシステインを介したＣＭＫ（クロロメチルケトン）カップリング；遊離のシステインを介したマレイミドカップリング；遊離のアミン基へのＮＨＳカップリング；「クリック」ケミストリー（アルキン＋アジ化物）；「オキシムライゲーション」（ヒドラジドまたはヒドロキシルアミン＋アルデヒド）または「ケント（Kent）ライゲーション」（チオエステル＋天然のシステイン）を介して、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに化学的にコンジュゲートされている。天然のまたは操作されたシステイン残基は、マレイミドまたはハロアセチルなどのチオール反応性基を介したコンジュゲーションを可能にすることから、特に有用である。
[0110]特定の形態において、ペイロードは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドと非共有結合を介して連結される。
[0111]ＣＮＳに輸送する必要があるあらゆるタイプのペイロードが、本明細書で提供される輸送体分子と連結されていてもよい。例えば、ペイロードは、ペプチドまたはポリペプチド、例えば、ペプチドタグ、ホルモンまたはそれらの誘導体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、または異種抗体もしくはそれらのフラグメント；ポリヌクレオチド、例えば、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ阻害剤、アンチセンス分子、およびＲＮＡｉ分子、ｃＤＮＡ、または遺伝子治療剤；炭水化物、ポリエチレングリコールなどのポリマー、化学療法剤などの小分子薬物、または抗微生物剤もしくは抗ウイルス剤、プロドラッグ、脂質、生体応答調整物質、検出可能な標識、または薬剤の２種もしくはそれより多くの組合せであってもよい。
[0112]特定の形態において、ペイロードは、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）またはそれらの活性なフラグメントを含む。本明細書の他所で説明されるように、ＩＬ−１Ｒａは、ＣＮＳへの侵入時に、神経因性疼痛を受けている対象に鎮痛作用を付与することができる（Gabay E1ら、Eur J Pain. 2011年3月；15（3）：242〜8）。しかしながら、アンタゴニストは、何らかの作用が観察される前にＣＮＳに到達しなければならない。ＩＬ−１ＲａのＢＢＢ輸送体へのカップリングは、髄腔内送達というよりも、ＩＬ−１ＲａのＣＮＳへの送達を容易にする方法の一つである。したがって、本開示は、ＩＬ−１Ｒａまたはそれらの活性なフラグメントに融合した、またはその他の方法で連結された、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む輸送体分子を提供する。ＩＬ−１Ｒａは、あらゆる好適な手段によって本明細書で提供される輸送体分子に接続させることができ、例えばＩＬ−１Ｒａポリペプチドは、本明細書で提供される免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに、重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端またはＣ末端で融合させることができる。例えば、本開示は、ＩＬ−１Ｒａに融合した輸送体分子であって、アミノ酸配列番号２２２を有するリンカーを介して、配列番号３８のＣ末端に融合したＩＬ−１Ｒａ（配列番号２２３）に融合した、アミノ酸配列番号３８を有するＶＨ（Ｂｂｂｔ０６３２）、およびアミノ酸配列番号２２２を有するリンカーを介して、配列番号２のＣ末端に融合したＩＬ−１Ｒａ（配列番号２２３）に融合した、アミノ酸配列番号４７を有するＶＬまたはアミノ酸配列番号２を有するＶＨ（Ｂｂｂｔ０２４１）、およびアミノ酸配列番号１１を有するＶＬを含む、輸送体分子を提供する。本開示に基づいて、当業界において通常の技術を有する者であれば、輸送体分子が活性を保持するように、例えば、輸送体分子が、ＢＭＶＥＣに特異的に結合することができるように、ＢＭＶＥＣに内在化することができるように、またはインビボまたはインビトロのいずれかでＢＭＶＥＣを通過して輸送することができるように、ＩＬ−１Ｒａに融合した本明細書で提供される免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む無数の他の輸送体分子を予期することができる。
[0113]エンケファリンは、有力な鎮痛作用を有する、ＣＮＳ中のニューロンによって放出される天然に存在するペプチドである。ダラージンなどのエンケファリン類似体が説明されており、神経因性疼痛を受けている対象に鎮痛作用を付与することができるが、何らかの作用が観察される前にＣＮＳに到達しなければならない（Rousselleら、（2003）J.Pharm.Exper.Ther. 306：371〜376）。エンケファリンおよび類似体をＢＢＢ輸送体にカップリングすることは、ＢＢＢを通過するエンケファリンおよび類似体の送達を容易にする方法の一つである。したがって、本開示は、エンケファリンまたはエンケファリン類似体に融合した、またはその他の方法で連結された、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む輸送体分子を提供する。
[0114]特定の形態において、ペイロードは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）阻害剤を含む。ＢＢＢを通過して送達されるＴＮＦ−α阻害剤は、神経保護作用があり、アルツハイマー病を処置するのに使用できることが示されている（Zhouら（2011）J. Pharm. Exp. Ther. 339：618〜23；TobinckおよびGross（2008）J.NeuroInflam 5：2）。ＴＮＦ−α阻害剤のＢＢＢ輸送体へのカップリングは、ＢＢＢを通過するこのような阻害剤の送達を容易にする方法の一つである。したがって、本開示は、ＴＮＦ−α阻害剤に融合した、またはその他の方法で連結された、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む輸送体分子を提供する。ＴＮＦ−α阻害剤は、あらゆる好適な手段によって本明細書で提供される輸送体分子に接続させることができ、例えばポリペプチドのＴＮＦ−α阻害剤は、本明細書で提供される免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに、重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端またはＣ末端で融合させることができる。多数の好適なＴＮＦ−α阻害剤が当業界において説明されており、そのようなものとしては、これらに限定されないが、ＴＮＦ受容体のリガンド結合部分（ＴＮＦＲ）、例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））；およびＴＮＦ−αと結合する抗体、例えば、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、インフリキシマブ（レミケード（登録商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））が挙げられる。
[0115]特定の形態において、ペイロードは、インターフェロン−β、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ニュールツリン、ニューレグリン、ネトリン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、セマフォリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−ｃｘ、ＴＧＦ−Ｂ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、またはそれらの組合せを含む。
輸送体分子活性
[0116]本明細書で提供される特定の輸送体分子は、異種ペイロード分子を単独で、またはそれと連結させてのいずれかでＢＢＢを通過して輸送する能力を有する。活性は、多数のアッセイによって実証することができる。例えば、特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、１つまたはそれより多くの種からのＢＭＶＥＣ、例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、またはウシＢＭＶＥＣに結合することができる。結合は、当業界における通常の技術を有する者に公知の様々な方法で、例えば、本明細書の他所で説明されるＦＭＡＴアッセイで実証することができる。特定の形態において、ＢＭＶＥＣは、脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）である。特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいて、ＢＣＥＣの単分子層を通過することができる。さらに、特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、本明細書の他所で詳細に説明される競合ＦＭＡＴアッセイにおいて、ＢＭＶＥＣへの結合に関して、単一ドメイン抗体であるＦＣ５（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ０２／０５７４４５を参照）またはＢｂｂｔ０２４１と競合することができる。ＢＭＶＥＣへの結合に関してＦＣ５またはＢｂｂｔ０２４１と競合する輸送体分子の例としては、Ｂｂｂｔ０６２６、Ｂｂｂｔ０７２７、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６５４、Ｂｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７３２、またはＢｂｂｔ０７５４のＶＨおよびＶＬドメインを含む輸送体分子が挙げられる。特定の代替の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、ＢＭＶＥＣに結合するが、競合ＦＭＡＴアッセイにおいて、ＢＭＶＥＣへの結合に関して、単一ドメイン抗体ＦＣ５またはＢｂｂｔ０２４１と競合しない。ＢＭＶＥＣへの結合に関してＦＣ５またはＢｂｂｔ０２４１と競合しない輸送体分子の例としては、Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０６７４、Ｂｂｂｔ０７５５、Ｂｂｂｔ０５７９またはＢｂｂｔ０６７１のＶＨおよびＶＬドメインを含む輸送体分子が挙げられる。
[0117]特定の形態において、輸送体分子活性は、インビボで実証することができる。例えば、κ−オピオイドペプチドのダイノルフィンは、動物モデルにおいて利尿を引き起こすことができるが、それがＣＮＳに到達した場合のみである。したがって、本明細書で提供される輸送体分子を１つまたはそれより多くのダイノルフィン分子にコンジュゲートさせて、対象に、例えばラットモデルにおいて、末梢投与、例えば静脈内投与することができ、活性は、動物における尿排出量の増加によって実証することができる。
[0118]別の例において、ＩＬ−１Ｒａは、神経因性疼痛によって引き起こされる痛覚過敏を低減することができるが、それがＣＮＳに到達した場合のみである。したがって、本明細書で提供される輸送体分子をＩＬ−１Ｒａに融合させて、神経因性疼痛モデル、例えばラットの坐骨神経部分結紮アッセイにおいて、末梢投与、例えば静脈内または皮下投与することができる。鎮痛作用は、輸送体分子がＢＢＢを通過することによって神経因性疼痛を低減できることを実証する。
[0119]特定の形態において、輸送体分子活性は、ＣＮＳにおける輸送体分子の可視化によって実証することができる。例えば、トリチウムで標識された輸送体分子を、対象、例えばマウスの末梢、例えば静脈内に送達して、次いで定量的全身ラジオグラフィーによりＣＮＳ中で可視化することができる。特定の形態において、輸送体分子は、ＣＮＳの特異的な領域、例えば、小脳皮質、大脳灰白質、脊髄灰白質、脳橋、またはそれらの組合せに局在化する。
ポリヌクレオチド
[0120]本開示は、本明細書で提供されるいずれかの輸送体分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の形態において、単離されたポリヌクレオチド、または２つもしくはそれより多くのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物であって、該ポリヌクレオチドは、単独で、または集合的に輸送体分子をコードし、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド、加えてＢＢＢを通過して輸送しようとするペイロードをコードしていてもよい、上記ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の形態において、単離されたポリヌクレオチド、または２つまたはそれより多くの単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物であって、該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）は、Ｂｂｂｔ０２４１、Ｂｂｂｔ０３５１、Ｂｂｂｔ０６２６、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６５４、Ｂｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７２７、Ｂｂｂｔ０７３２、Ｂｂｂｔ０７５４、Ｂｂｂｔ０６７４、Ｂｂｂｔ０７５５、Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０５７９、またはＢｂｂｔ０６７１の１つまたはそれより多くを含む免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを単独で、または集合的にコードする、１つまたはそれより多くの核酸分子を含む、上記組成物が提供される。
[0121]特定の形態において、単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする核酸分子を含み、該輸送体分子は、ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨおよびＶＬを含み、該核酸分子は、配列番号２、配列番号１１、または配列番号２、および配列番号１１；配列番号２０、配列番号２９、または配列番号２０、および配列番号２９；配列番号３８、配列番号４７、または配列番号３８、および配列番号４７；配列番号５６、配列番号６５、または配列番号６６、および配列番号６５；配列番号７４、配列番号８３、または配列番号７４、および配列番号８３；配列番号９２、配列番号１０１、または配列番号９２、および配列番号１０１；配列番号１１０、配列番号１１９、または配列番号１１０、および配列番号１１９；配列番号１２８、配列番号１３７、または配列番号１２８、および配列番号１３７；配列番号１４６、配列番号１５５、または配列番号１４６、および配列番号１５５；配列番号１６４、配列番号１７３、または配列番号１６４、および配列番号１７３；配列番号１８２、配列番号１９１、または配列番号１８２、および配列番号１９１；配列番号２００；配列番号２０９、配列番号２１８、または配列番号２０９、および配列番号２１８；または配列番号２２６、配列番号２２７、または配列番号２２６、および配列番号２２７をコードする、上記ポリヌクレオチドが提供される。
[0122]特定の形態において、単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする核酸分子を含み、該輸送体分子は、ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨおよびＶＬを含み、該核酸分子は、配列番号１、配列番号１０、または配列番号１、および配列番号１０；配列番号１９、配列番号２８、または配列番号１９、および配列番号２８；配列番号３７、配列番号４６、または配列番号３７、および配列番号４６；配列番号５５、配列番号６４、または配列番号５５、および配列番号６４；配列番号７３、配列番号８２、または配列番号７３、および配列番号８２；配列番号９１、配列番号１００、または配列番号９１、および配列番号１００；配列番号１０９、配列番号１１８、または配列番号１０９、および配列番号１１８；配列番号１２７、配列番号１３６、または配列番号１２７、および配列番号１３６；配列番号１４５、配列番号１５４、または配列番号１４５、および配列番号１５４；配列番号１６３、配列番号１７２、または配列番号１６３、および配列番号１７２；配列番号１８１、配列番号１９０、または配列番号１８１、および配列番号１９０；配列番号１９９；または配列番号２０８、配列番号２１７、または配列番号２０８、および配列番号２１７を含む、上記ポリヌクレオチドが提供される。
[0123]特定の形態において、単離されたポリヌクレオチドは、異種ペイロード、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドペイロードをコードする核酸分子をさらに含む。例示的なペイロードは、本明細書の他所で提供される。
[0124]特定の形態において、２つまたはそれより多くの単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物であって、該ポリヌクレオチドは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする２つまたはそれより多くの核酸分子を含み、該輸送体分子は、ＶＨおよびＶＬを含み、該核酸分子はそれぞれ、配列番号２および配列番号１１；配列番号２０および配列番号２９；配列番号３８および配列番号４７；配列番号５６および配列番号６５；配列番号７４および配列番号８３；配列番号９２および配列番号１０１；配列番号１１０および配列番号１１９；配列番号１２８および配列番号１３７；配列番号１４６および配列番号１５５；配列番号１６４および配列番号１７３；配列番号１８２および配列番号１９１；配列番号２０９および配列番号２１８；または配列番号２２６および配列番号２２７をコードする、上記ポリヌクレオチド組成物が提供される。
[0125]特定の形態において、２つまたはそれより多くの単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物であって、該ポリヌクレオチドは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする２つまたはそれより多くの核酸分子を含み、該輸送体分子は、ＶＨおよびＶＬを含み、該核酸分子は、それぞれ、配列番号１および配列番号１０；配列番号１９および配列番号２８；配列番号３７および配列番号４６；配列番号５５および配列番号６４；配列番号７３および配列番号８２；配列番号９１および配列番号１００；配列番号１０９および配列番号１１８；配列番号１２７および配列番号１３６；配列番号１４５および配列番号１５４；配列番号１６３および配列番号１７２；配列番号１８１および配列番号１９０；または配列番号２０８および配列番号２１７を含む、上記ポリヌクレオチド組成物が提供される。
[0126]特定の形態において、２つまたはそれより多くの単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物は、異種ペイロード、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドペイロードをコードする核酸分子をさらに含む。例示的なペイロードは、本明細書の他所で提供される。
[0127]特定の形態において、ベクター、または２つまたはそれより多くのベクターは、本明細書で提供される輸送体分子のディスプレイ、スクリーニング、単離、クローニング、および／または発現を容易にするために提供される。特定の形態において、ベクターまたはベクターは、発現ベクターである。
[0128]特定の形態において、ポリヌクレオチド組成物の２つまたはそれより多くの核酸分子は、同じベクター中に存在していてもよい。特定の形態において、ポリヌクレオチド組成物の２つまたはそれより多くの核酸分子は、少なくとも２つの別々のベクター中に存在していてもよい。
[0129]使用される発現ベクターは、本明細書で提供される輸送体分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを発現する。組換え発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子から誘導された好適な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結された輸送体分子のポリペプチド鎖をコードする合成またはｃＤＮＡから誘導されたＤＮＡフラグメントを有する、複製可能なＤＮＡコンストラクトである。転写単位は一般的に、（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝学的エレメントまたはエレメント（複数）、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されタンパク質に翻訳される構造的またはコード配列、ならびに（３）以下で詳細に説明されるような適切な転写および翻訳開始および終結配列の接合体を含む。このような調節エレメントとしては、転写を制御するためのオペレーター配列が挙げられる。加えて、通常複製起点によって付与される宿主中で複製する能力、および形質転換株の認識を容易にするための選択遺伝子が取り込まれていてもよい。
[0130]特定の形態において、単離されたポリヌクレオチドまたは２つまたはそれより多くの単離されたポリヌクレオチドを含む組成物であって、核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結されているか、または２つまたはそれより多くの核酸分子は、２つまたはそれより多くのプロモーターに作動可能に連結され、該プロモーターは、同一でもよいしまたは異なっていてもよい、上記組成物が提供される。
[0131]ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連している場合、「作動可能に連結されている（operably associated）」。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）に関するＤＮＡは、シグナルペプチドがポリペプチドの分泌に参加する前駆体として発現される場合、ポリペプチドに関するＤＮＡと作動可能に連結されており；プロモーターは、プロモーターが配列の転写を制御する場合、コード配列と作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、リボソーム結合部位が翻訳を許容するように配置される場合、コード配列と作動可能に連結されている。酵母発現系での使用を意図した構造的なエレメントとしては、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が挙げられる。代替として、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、タンパク質は、Ｎ末端のメチオニン残基を包含していてもよい。この残基は、任意選択で、最終産物が提供されるように、それに続き発現された組換えタンパク質から切断されてもよい。
[0132]発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存すると予想される。多種多様の発現宿主／ベクターの組合せを採用することができる。真核宿主にとって有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主にとって有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えばｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体などの大腸菌（E. coli）由来のプラスミド、より広い宿主域を有するプラスミド、例えばＭ１３、ならびに線維状の一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
[0133]特定の形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞が提供される。特定の形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチド組成物の２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを含む、１つまたはそれより多くの単離された宿主細胞が提供される。
[0134]本明細書で提供される輸送体分子の発現にとって好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌または杆菌が挙げられる。高等真核細胞としては、後述するような哺乳類起源の確立された細胞株が挙げられる。無細胞翻訳システムも採用することができる。抗体産生などのタンパク質生産方法に関する追加の情報は、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６，４１３，７４６号および６，６６０，５０１号、および国際特許公開ＷＯ０４００９８２３号で見出すことができる。
[0135]また様々な哺乳類または昆虫細胞培養系も、輸送体分子を発現させるのに採用することができる。哺乳類細胞における組換えタンパク質は、一般的に、正確にフォールディングされ、適切に改変され、完全に機能的であるため、このようなタンパク質の発現を実行させることができる。好適な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＨＥＫ−２９３およびＨＥＫ−２９３Ｔ、Gluzman（Cell 23：175、1981）によって記載されたサル腎臓細胞のＣＯＳ−７株、および他の細胞株、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株などが挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製起点などの非転写エレメント、発現させようとする遺伝子と作動可能に連結されている好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’フランキング非転写配列、ならびに５’または３’非翻訳配列、例えばリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含んでいてもよい。昆虫細胞における異種タンパク質生産のためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers、BioTechnology 6：47（1988）で総論されている。
[0136]本明細書で提供される宿主細胞は、本明細書で提供される輸送体分子の作製方法であって、（ａ）宿主細胞を培養すること、および（ｂ）宿主細胞から発現された輸送体分子を単離することを包含する、上記方法において利用することができる。特定の形態において、ペイロード部分は、輸送体分子の一部として発現される。特定の形態において、本方法は、輸送体分子を、例えば化学的なコンジュゲーションによって、ペイロード部分と連結させることをさらに含む。
医薬および診断用組成物
[0137]別の形態において、本開示は、本明細書で提供される輸送体分子の１つまたは組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物であって、１つまたはそれより多くの輸送体分子は、医薬的に許容される担体と共に製剤化された、ＢＢＢを通過する輸送のための１つまたはそれより多くのペイロード部分を含む、上記組成物を提供する。このような組成物は、本明細書で提供される１つまたは２つまたはそれより多くの異なる輸送体分子を包含していてもよい。
[0138]医薬組成物は、併用療法で、および／または他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、本明細書で提供される輸送体分子と、少なくとも１つの他の療法との併用を包含していてもよく、ここで療法は、例えば、免疫療法、化学療法、放射線処置、または薬物療法であり得る。
[0139]本明細書で提供される医薬化合物は、１つまたはそれより多くの医薬的に許容される塩を包含していてもよい。このような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。
[0140]本明細書で提供される医薬組成物はまた、医薬的に許容される抗酸化剤を包含していてもよい。医薬的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムおよび同種のもの；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール、および同種のもの；ならびに（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、および同種のものが挙げられる。
[0141]本明細書で提供される医薬組成物で採用することができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および同種のもの）、および好適なそれらの混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液のケースでは特定の粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
[0142]これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有していてもよい。滅菌手順と、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、および同種のものの包含との両方によって、微生物の存在を確実に予防することができる。また等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム、および同種のものも組成物に添加してもよい。加えて、注射可能な医薬の形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によって実現することができる。
[0143]好適で例示的な組成物および調合物、ならびにこのような組成物および調合物を調製する方法は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００９／０５８３７９号、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１１／１３０３２４号、およびＰＣＴ公報ＷＯ２０１１／１３０３２８号で見出すことができる。
[0144]本明細書で提供される組成物はまた、診断用組成物、例えば、イメージング用ペイロードをＣＮＳに送達するための組成物であってもよい。したがって、輸送体分子、輸送体分子をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）、ポリヌクレオチドを含むベクター（単数または複数）、またはベクター（単数または複数）を含む宿主細胞を含む診断用組成物が提供される。
輸送体分子の使用方法
[0145]本明細書で提供される輸送体分子は、インビトロおよびインビボにおける診断的および治療的な有用性を有する。例えば、これらの分子は、例えばインビトロまたはエクスビボで培養物中の細胞に投与することもできるし、または例えばインビボで対象に投与して、ＣＮＳの様々な疾患または障害を処置、予防または診断することもできる。
[0146]したがって本開示は、ＣＮＳの疾患、障害、または傷害を処置、診断、または予防する方法であって、本方法は、処置が必要な対象に、本明細書で提供される輸送体分子を含む組成物を末梢投与することを含み、輸送体分子は、ＢＢＢを通過して輸送された後にＣＮＳに曝露されたときに、疾患、障害、または傷害を診断する、予防する、または処置することが可能な治療的または診断的なペイロード部分を含み、疾患、障害、または傷害を診断する、予防する、または処置するのに十分な治療的または診断的なペイロード部分の量がＢＢＢを通過して輸送されることにより疾患、障害、または傷害を処置する、上記方法を提供する。
[0147]本開示は、単独で、または他の療法と組み合わせてのいずれかでの、ＣＮＳの疾患、障害、または傷害に関連する１つまたはそれより多くの症状を予防する、管理する、処置する、または改善するための、ＢＢＢを通過してペイロード部分を輸送するためのペイロード部分（例えば、治療剤または薬物）にコンジュゲートまたは融合した本明細書で提供される輸送体分子の使用を包含する。
[0148]特定の形態において、ペイロード部分は、ＣＮＳへの侵入後に輸送体分子から放出される。特定の形態において、ペイロード部分は、その活性を弱めることなく輸送体分子に連結されたままである。
[0149]様々なペイロード部分が、ＣＮＳの疾患、障害または傷害を診断する、予防する、または処置するのに採用することができ、ここで疾患、障害、または傷害は、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、神経因性疼痛、神経変性、神経炎症、認知症、進行性多巣性白質脳病（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロトフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス−メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏症候群、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ベル麻痺、原発性腫瘍（例えば、膠芽腫）もしくは二次転移、またはあらゆるそれらの組合せを含む。
[0150]特定の形態において、治療剤は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）であり、疾患、障害、または傷害は、神経因性疼痛である。
[0151]本開示はまた、疾患を診断する方法も提供する。造影剤などの部分を有する本明細書で提供される輸送体分子は、疾患を診断するのに使用される方法で実行されてもよい。
[0152]本開示はさらに、特異的な標的をイメージングする方法を提供する。一実施態様において、ＣＮＳにおける特異的な標的の存在、配置、または進行をイメージングする方法において、本明細書で提供される輸送体分子は、緑色蛍光タンパク質、他の蛍光タグ（Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなど）、ビオチン、または放射性核種などの造影剤であるペイロードに融合させるかまたはコンジュゲートさせて、これらのペイロードをＢＢＢを通過して輸送することができる。他の実施態様において、本明細書で提供される輸送体分子の利用を介して標的をイメージングする方法は、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャニング、Ｘ線、蛍光検出によって、または当業界において公知の他の検出方法によって実行される。
[0153]本開示はまた、本明細書で提供される輸送体分子を使用して疾患の進行、再発、処置、または改善をモニターする方法も提供する。一実施態様において、疾患の進行、再発、処置、または改善をモニターする方法は、本明細書で提供される輸送体分子の利用を介してＣＮＳ中の化合物／標的をイメージングする、診断する、またはそれらと接触させる方法によって達成される。
キット
[0154]本明細書で提供される組成物（例えば物質をＢＢＢを通過して送達することが可能な輸送体分子）および使用説明書を含むキットも本開示の範囲内である。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、または１つまたはそれより多くの追加の輸送体分子をさらに含有していてもよい。キットは、典型的には、キット内容物の意図した使用を示すラベルを包含する。ラベルという用語は、キット上もしくはキットと共に供給されるか、またはそれ以外の方法でキットに付随するあらゆる文書または記録材料を包含する。
均等物
[0155]当業者であれば、以下の慣例的な実験を使用して、本明細書で説明される具体的な実施態様の多くの均等物を認識するか、または確認することができると予想される。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
[0156]添付された特許請求の範囲の実施は、別段の指定がない限り、当業界の技術範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を採用すると予想される。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、Sambrookら、編（1989）Molecular Cloning A Laboratory Manual（第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Sambrookら、編（1992）Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Springs Harbor Laboratory、ニューヨーク）；D. N. Glover編（1985）DNA Cloning、I巻およびII巻；Gait編（1984）Oligonucleotide Synthesis；Mullisら、米国特許第４，６８３，１９５号；HamesおよびHiggins編（1984）Nucleic Acid Hybridization；HamesおよびHiggins編（1984）Transcription And Translation；Freshney（1987）Culture Of Animal Cells（Alan R. Liss, Inc.）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press）（1986）；Perbal（1984）A Practical Guide To Molecular Cloning；学術論文、Methods In Enzymology（Academic Press, Inc.、ニューヨーク）；MillerおよびCalos編（1987）Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（Cold Spring Harbor Laboratory）；Wuら編、Methods In Enzymology、154巻および155巻；MayerおよびWalker編（1987）Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（Academic Press、London）；WeirおよびBlackwell編（1986）Handbook Of Experimental Immunology、I〜IV巻；Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（1986）；およびAusubelら（1989）Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons、メリーランド州ボルチモア）を参照されたい。
［0157］抗体工学の一般原則は、Borrebaeck編（1995）Antibody Engineering（第2版；Oxford Univ. Press）に記載されている。タンパク質工学の一般原則は、Rickwoodら編（1995）Protein Engineering, A Practical Approach（Oxford Univ. PressにおけるIRL Press、英国オックスフォード）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原則は、Nisonoff（1984）Molecular Immunology（第2版；Sinauer Associates、マサチューセッツ州サンダーランド）；およびSteward（1984）Antibodies, Their Structure and Function（Chapman and Hall、ニューヨーク州ニューヨーク）に記載されている。加えて、当業界において公知であり具体的に説明されていない免疫学の標準的な方法は、全般的に、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、ニューヨーク；Stitesら編（1994）Basic and Clinical Immunology（第8版；Appleton & Lange、コネチカット州ノーウォーク）ならびにMishellおよびShiigi（編）（1980）Selected Methods in Cellular Immunology（W.H. Freeman and Co.、ニューヨーク）の記載に従う。
[0158]免疫学の一般原則を記載した標準的な参考文献としては、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、ニューヨーク；Klein（1982）J.、Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination（John Wiley & Sons、ニューヨーク）；Kennettら編（1980）Monoclonal Antibodies, Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses（Plenum Press、ニューヨーク）；Campbell（1984）、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology中の「Monoclonal Antibody Technology」、Burdenら編（Elsevier、アムステルダム）；Goldsbyら編（2000）Kuby Immunology（第4版；H. Freemand & Co.）；Roittら（2001）Immunology（第6版；London：Mosby）；Abbasら（2005）Cellular and Molecular Immunology（第5版；Elsevier Health Sciences Division）；KontermannおよびDubel（2001）Antibody Engineering（Springer Verlan）；Sambrook and Russell（2001）Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press）；Lewin（2003）Genes VIII（Prentice Hall 2003）；HarlowおよびLane（1988）Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press）；DieffenbachおよびDveksler（2003）PCR Primer（Cold Spring Harbor Press）が挙げられる。
[0159]上記で引用された全ての参考文献、加えて全ての本明細書で引用された参考文献は、この参照によりそれらの全体が開示に組み入れられる。
[0160]以下の実施例は、例証のために提供されたものであり、限定のために提供されたものではない。
実施例１：改善されたＦＣ５バリアント、Ｂｂｂｔ０３５１の構築および特徴付け
[0161]この実施例は、血液脳関門を通過するラクダ単一ドメイン抗体であるＦＣ５由来の改善されたラクダＢＢＢ輸送体分子の構築を説明する。Stanimirovicら、J. Neurochem. 95：1201（2005）。ＦＣ５は、げっ歯類細胞とヒト脳内皮細胞の両方を認識する。ＦＣ５の結合標的は、２つの膜貫通ドメインを有するグリコシル化オーファン受容体であるＴＭＥＭ３０ａであると報告されている。ＴＭＥＭ３０ａは３つのアイソフォームを有し、ほとんどの細胞型で普遍的に発現される。
[0162]ＦＣ５を、ＣＤＲ３アラニンおよび最小限の変異誘発（parsimonious mutagenesis）に供し、多数の突然変異体をＤＡｂ様式で作製し、発現する能力およびマウス脳内皮細胞と結合する能力に関して試験した。タンパク質を発現して、ＨＩＳ捕獲カラムでの精製後に精製タンパク質をもたらしたが、ＦＭＡＴ結合アッセイにおいてマウス脳内皮細胞での結合シグナルを提供しなかったバリアントをさらに評価した。バリアントＢｂｂｔ０３５１は、ＦＣ５の可変領域と比較して２つのアミノ酸置換、すなわちカバットの９７位におけるＴ９７Ａ置換、およびカバットの１００ａ位におけるＴ１００ａＤ置換を含む。Ｂｂｂｔ０３５１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１９９〜２０７として示される（表２）。Ｂｂｂｔ０３５１は、Ｆｃドメインと共に発現される場合、ｈＩｇＧ１のヒンジ領域のＮ末端に遺伝学的に融合される。
[0163]Ｂｂｂｔ０３５１は、脳内皮細胞への結合を示さないが、インビトロおよびインビボにおいてＦＣ５の輸送速度と比較して、増加した輸送速度を有するＦＣ５の突然変異形態である。２種のラットのインビトロＢＢＢモデルで、脳内皮細胞を通過するＢｂｂｔ０３５１−Ｆｃの輸送をＦＣ５−Ｆｃと比較した。初代ラット脳内皮細胞ＢＢＢモデルは説明されており（Watson P. M. D.ら、BMC Neuroscience 2013：14、59〜79）、このモデルのバリアを通過するトランスサイトーシスを測定するのに使用される方法は以下の通りである：細胞培養培地を、細胞培養挿入物上で３連で培養したＲＢＥＣの上および下の区画から除去し、リンゲルＨＥＰＥＳ緩衝液（ＢＳＡ非含有）で交換した。上の区画に目的の分子を添加して、各ウェル中で望ましい最終濃度にした。培養物を３７℃で振盪しながらインキュベートし、３０、６０および９０分後に下の区画中の新鮮な緩衝液を含む別のウェルに移した。下の区画からサンプルを収集し、ナノ−ＬＣ ＳＲＭ質量分析によって分析した。ラット細胞株ＢＢＢモデルを通過する分子のトランスサイトーシスを測定するための方法が説明されている（Haqqani A. S.ら、Method. Mol. Pharmaceutics. 2013；10、1542〜1556）。初代ラット脳内皮細胞または不死化ラット脳内皮細胞株を通過する大きい分子の輸送は、ナノ−ＬＣ ＳＲＭ質量分析技術によって検出することができる。
[0164]図１ＡおよびＢに、インビボにおけるＢｂｂｔ０３５１−ＦｃおよびＦＣ５−Ｆｃの輸送の比較を示す。結果は、方程式（ｄＱｒ／ｄＴ）／（Ａ×Ｃ０）を使用して計算される見かけの透過性（ＰＡＰＰ）として示され、式中、ｄＱｒ／ｄＴは、時間に対する下の区画における分子の累積量であり、Ａは、細胞培養挿入物の表面積であり、Ｃ０は、上の区画における分子の開始濃度である。これらの結果から、ＦＭＡＴ結合アッセイにおいてシグナルが示されないにもかかわらず、Ｂｂｂｔ０３５１−Ｆｃは、両方においてインビトロＢＢＢモデルを通過するＦＣ５−Ｆｃより優れた輸送を示すことが示される。
実施例２：Ｂｂｂｔ０２４１の構築および特徴付け
[0165]この実施例は、Ｂｂｂｔ０２４１、すなわちＦＣ５から開始したヒト化ＢＢＢ輸送体分子の構築を説明する。
[0166]以下の方法（図２Ａ）に従って、ＦＣ５を軽鎖の付加によってヒト化した。ＦＣ５ベースの単鎖Ｆｖフラグメント（ＦＣ５−ｓｃＦｖ）ファージライブラリーは、これまでに述べられたＣＡＴ２．０ライブラリーをベースとした（Lloyd C.ら、Protein Eng Des Sel 2009；22（3）；159〜68）。
[0167]簡単に言えば、生殖細胞系の特異的プライマーを使用してＶＬ遺伝子セグメントを増幅し（Hutchings C. Antibody Engineering. Springer Laboratory Manuals. 2001；93〜108）、その後、改変されたｐＣＡＮＴＡＢ６ベクターにクローニングした（McCafferty J.ら、J. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994；47；157〜171）。このベクターは、独立した重鎖および軽鎖のクローニングを可能にするためにＸｈｏＩおよびＡｐａＬＩ部位を両端に有する［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３リンカーを含有する。すでにクローニングした軽鎖ライブラリーを、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ指向性クローニングを介して［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３上流にＦＣ５ ＶＨＨを挿入するためのアクセプターベクターとして利用して、ＦＣ５−ｓｃＦｖライブラリーを作製した（１０８種の多様性）。ＦＣ５は、ＥＬＩＳＡによってプロテインＡと結合することが示され（ＶＨ３ファミリーのクローンは、プロテインＡと結合することができる）、それゆえに、ライブラリーをプロテインＡで選択して、完全ｓｃＦｖを形成し、それでもなおプロテインＡと結合できるクローンのみを濃縮した。
[0168]プロテインＡでの選択後、ファージ粒子をそのまま大腸菌に感染させ、個々のコロニーを採取してスクリーニングのために９６ウェルプレートに入れた。
[0169]ヒト化ＦＣ５−ｓｃＦｖバリアントの最初のスクリーニングは、可溶性ｓｃＦｖを発現する大腸菌細胞の未精製ペリプラズム抽出物（ペリプラズム調製物）を使用した蛍光微量測定技術アッセイ（ＦＭＡＴ）によるスクリーニングを介してなされた（図３Ａ）。これらのｓｃＦｖを、検出抗体、すなわちｓｃＦｖのＣ末端で６×ＨＩＳタグと結合すると予想されるマウス抗ＨＩＳ抗体、続いて抗ＨＩＳ抗体を検出すると予想されるアレクサフルオロ６４７で標識した抗マウスＩｇＧと共にそのままインキュベートした。次いでこの三次複合体を、同質溶液中でマウス（Ｂ．Ｅｎｄ３）由来の脳微小血管内皮（ＢＭＶＥＣ）細胞株に添加し、インキュベートした。細胞表面上で受容体と結合したＳｃＦｖを、陽性結合事象をもたらす細胞周辺の蛍光シグナルの濃度として読み取った。図３Ｂに、Ｂｂｂｔ０２４１に関するＦＭＡＴアッセイの結果を示す。
[0170]陽性ｓｃＦｖを「ヒット」と称し、これらをその後、説明の通りに発現させ精製した（Dobsonら、MAbs 2009；1（6）；552〜562）。簡単に言えば、ｓｃＦｖプラスミドを大腸菌ＴＧ１細胞中で培養し、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で発現を誘導して、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭスクロース（ＴＥＳ）のｐＨ７．４の緩衝液を使用した浸透圧性ショックによって、およびＮｉ２＿−ニトリロ三酢酸クロマトグラフィーでのＣ末端Ｈｉｓ−タグの捕獲によって、ｓｃＦｖタンパク質をペリプラズムから単離した。次いで単離されたプラスミドを再び発現させ、ニッケルカラム上での標準的なＨＩＳ精製手順によって精製した。マウスＢ．Ｅｎｄ３細胞株を公知の濃度の精製ｓｃＦｖと共に使用したＦＭＡＴアッセイで、「ヒット」の結合を確認した。さらに、Ｂ．Ｅｎｄ３細胞への結合に関してヒト化ＦＣ５ ｈＩｇＧのＦＣ５ ＤＡｂと競合する能力を競合ＦＭＡＴアッセイで試験した。図３Ｃは、一定濃度のＦＣ５ ＤＡｂおよび増加する濃度の競合物質ｈＩｇＧ１、例えばＢｂｂｔ０２４１を使用した競合ＦＭＡＴアッセイにおけるＢ．Ｅｎｄ３細胞の顕微鏡写真を示す。ＣＥＡ６は、陰性対照ｈＩｇＧ１である。図３Ｄは、競合を定量的に示すグラフである。次いで確認された「ヒット」を、他の種、例えばラットおよびカニクイザル由来のＢＭＶＥＣへの結合に関して試験した。ヒト化ＦＣ５バリアントの元のスクリーニングから、ｓｃＦｖ Ｂｂｂｔ０２４１をリード候補として同定した。Ｂｂｂｔ０２４１の配列は、配列番号１〜１８および１９９として提示される（表２）。
[0171]ラットに投与されたＢｂｂｔ０２４１の局在化を、以下のようにして定量的全身オートラジオグラフィー（ＱＷＢＡ）によって分析した。Ｂｂｂｔ０２４１ ｈＩｇＧ１ＴＭをトリチウム化Ｎ−スクシンイミジルプロピオネート（ＮＳＰ）で標識した。バイアルに、１．６ｍＣｉを含有するＮＳＰの単一のアリコートを分配した。室温で、穏やかな窒素ガス流下で溶媒を蒸発させた。残留物をＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ−シグマ（Sigma））に再懸濁し、混合して、放射標識された材料の完全な溶解を確認した。バイアルに、抗体溶液の単一のアリコート（１ｍＬ）を分配した。次いで溶液を、＋４℃でおよそ１６時間（一晩）そのまま静置した。次いで、ＭＷＣＯ４００００ゼブラスピン（Zebraspin）脱塩カラム（ピアース（Pierce））を使用したゲルろ過によって［３Ｈ］−抗体溶液を精製した。精製後、溶液中の精製Ｂｂｂｔ０２４１のＵＶ応答とそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーによる分析に基づき材料の特異的な活性を決定し、さらに放射活性の存在を決定した。［３Ｈ］−Ｂｂｂｔ０２４１を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝塩類溶液中の静脈注射用溶液として製剤化した。
[0172]雄のスプラギーダーレーラットに、単回用量のトリチウム化Ｂｂｂｔ０２４１を３０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。投与後２４時間で３匹の動物を、血漿中の量と比較した脳組織中のＢｂｂｔ０２４１のレベルについて分析した。投与後２４時間で、動物をイソフルランを使用して麻酔し、心臓穿刺によって約１ｍＬの血液を収集した。次いで、１０ＩＵ／ｍＬリチウムヘパリンを含有する約５０ｍＬのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を使用した心臓の左心室を介した放血によって動物を殺した。
[0173]脳を取り出し、−２０から−３０℃の間に冷却したイソペンタン中で凍結した。分析の前、脳サンプルを−７０℃未満で貯蔵した。血液を血清に加工し、ＬＳＣによって放射活性レベルを分析した。潅流の程度に関してラット全脳を評価し、次いで重さを量った。およそ５倍量の冷たい（およそ４℃の）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics））を含有するＰＢＳを全脳サンプルに添加し、次いでそれらを、１０ｍＬのポッターエルベージェムモルタルタイプガラスホモジナイザーで、ＰＴＦＥ乳棒を用いて、２×１０回の時計回りのストロークと５秒の休止時間を使用してホモジナイズした。未加工の脳ホモジネートのアリコートをパッカード（Packard）３０６サンプルコンバスターで燃焼させ、放射活性レベルを測定し、これを使用してサンプル加工後の放射活性の回収率を計算した。
[0174]ホモジネートをＬｏＢｉｎｄチューブ（エッペンドルフ）に移し、４℃、１６０００ｇで１時間の遠心分離によって細胞内および細胞外タンパク質を含有する可溶性フラグメントに加工した。可溶性分画の除去後、得られたペレットを、ガラスホモジナイザーで、１×１０回の時計回りのストロークを使用して０．５％トウィーン２０を含有する５倍量の冷ＰＢＳ中のＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）（およそ４℃）中でホモジナイズした。ホモジネートをＬｏＢｉｎｄチューブに移し、４℃、１６０００ｇで１時間遠心分離した。得られたペレット画分は、膜タンパク質に結合した放射活性ならびに実質およびＢＢＢ内皮からの膜に結合した標的受容体を含有していた。最後に、上述したように、ペレット画分に緩く結合した全ての残存する放射活性を、室温で、１％ＳＤＳを含有する５倍量のＰＢＳ中のＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）で抽出し、その後ＬｏＢｉｎｄチューブ中で均質化し、遠心分離した。全画分の重さを全てのサンプルにつき記録し、放射活性レベルを収集された分画の重さを量ったアリコート中で測定した。次いでこれらのサンプルを液体シンチレーション計数器（ＬＳＣ）によって分析した。全ての組織加工段階中、サンプルを氷上で維持した。
[0175]投与後５分、４時間、２４時間、および７２時間に、４匹の動物を全身および脳への曝露に関してスクリーニングした。投与後５分、４、２４および７２時間に、イソフルラン麻酔下でヘキサン／固体ＣＯ２（約−７０℃）中に浸漬することによって動物を殺した。殺す前に、血液サンプル（およそ０．５ｍｌ）を末梢の尾静脈から採取し、血清に加工した。肢および尾部の除去後、胴体を左側面を最も上にしてカルボキシメチルセルロースの１％水溶液中に埋め込み、固体ＣＯ２で−７０℃に冷却したヘキサン中で少なくとも３０分間凍結した。動物のブロックを、断片化に必要になるまで−２０℃で貯蔵した。断片化時に各ブロックを、およそ−２０℃に維持したライカ（Leica）ＣＭ３６００クリオマクロトーム（Cryomacrotome）（ライカマイクロシステムズ社（Leica Microsystems GmbH）、ドイツ）に搭載させた。できる限り多くの組織が包含されるようにラット身体の最大５つの異なるレベルで全身の矢状断片（３０μｍ）を調製した：
レベル１：眼窩外の涙腺
レベル２：眼窩内の涙腺
レベル３：ハーダー腺／副腎
レベル４：甲状腺
レベル５：脳および脊髄。
[0176]断片を断片化テープ（Ｔ４１０、ＴＡＡＢ）上に搭載させ、標識した。全ての断片を、蛍光イメージングプレートに曝露する前におよそ１時間凍結乾燥した（ＬｙｏＰｒｏ３０００凍結乾燥機）。目的の組織および臓器を最もよく表す蛍光イメージングのために断片を選んだ。事前に消光させた蛍光イメージングプレートに、断片を較正標準と共に設置した。イメージングプレートを室温で１４日間曝露し、環境放射線から保護するために鉛製の遮蔽ボックス中の遮光カセットに封入した。曝露後、Ｆｕｊｉ ＦＬＡ−５１００イメージアナライザー（レイテック（Raytek）、英国）を使用して、イメージングプレートを５０ｍｍのピクセルサイズでスキャンした。シースキャン（Seescan）バージョン２（ラボロジック（LabLogic）、英国）を使用して、目的の組織および臓器を定量した。
[0177]定量的全身オートラジオグラフィー（ＱＷＢＡ）研究から、Ｂｂｂｔ０２４１ ｈＩｇＧ１ＴＭが、脳および脊髄の別々の領域、すなわち小脳皮質、大脳の灰白質、脊髄の灰白質および脳橋に特異的に輸送されたことが示された。曝露研究から、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後２４時間で、Ｂｂｂｔ０２４１の脳：血漿の比率が１〜１．５％であったことが実証された。（マウスにおいて、Ｂｂｂｔ０６２６ ｈＩｇＧ１ＴＭでも類似の曝露レベルも実証された）。
[0178]またＢｂｂｔ０２４１も、インビトロのトランスサイトーシスアッセイで、Haqqani A. S.、Caram-Salas N.、Ding W.、Brunette E.、Delaney C. E.、Baumann E.、Boileau E.、Stanimirovic D. Multiplexed Evaluation of Serum and CSF Pharmacokinetics of Brain-Targeting Single-Domain Antibodies Using a Nano-LC SRM-ILIS Method. Mol. Pharmaceutics. 2013；10, 1542〜1556で説明される方法を使用して、陰性対照ＩｇＧ（ＮＩＰ２２８ ＩｇＧ）と並行して試験した（図４Ａ）。図４Ｂに結果を示す。
[0179]実施例１においてＢｂｂｔ０３５１の輸送体活性を改善すると同定された突然変異、カバットの９７位におけるＴ９７Ａ置換、およびカバットの１００ａ位におけるＴ１００ａＤ置換がＢｂｂｔ０２４１に導入されると、結果として突然変異型のＢｂｂｔ０２４１ｍが生じる。次いで改変されたｓｃＦｖまたはＢｂｂｔ０２４１ｍのＩｇＧ型を、実施例１で説明したインビトロのトランスサイトーシスアッセイを使用して改善された輸送体活性に関して試験する。
実施例３：ＢＢＢ輸送体分子に関する追加のライブラリーのスクリーニング
[0180]マウス脳内皮（Ｂ．Ｅｎｄ３）細胞を使用して競合細胞表面選択を実行し、Ｂｂｂｔ０２４１およびＦＣ５と競合するか、またはそれと類似の結合特性を有する追加のファージディスプレイライブラリーから、ファージディスプレイされたｓｃＦｖを同定した。３つのナイーブライブラリーをスクリーニングした。洗浄剤、例えば２％ホルムアルデヒド、続いてＰＢＳ中の０．２％トリトンの添加によりＢ．Ｅｎｄ３細胞を室温で１５分間破裂させ、室温で１５分間インキュベートし、その後細胞を遠沈させ、ＰＢＳで洗浄し、これをＦＣ５／Ｂｂｂｔ０２４１抗原のより大きいプールと接触できるようにすることによって、ＦＣ５／Ｂｂｂｔ０２４１標的抗原に結合するｓｃＦｖの濃縮にとってより優れた条件をもたらした。細胞を破裂させた後、細胞を上述したファージライブラリーと共に室温で１〜２時間インキュベートした。その後細胞をＰＢＳで最大１０回洗浄して、細胞から全ての未結合のまたは弱く結合したファージ粒子を除去した。その後、洗浄した細胞にＢｂｂｔ０２４１ ｈＩｇＧを添加し、再度１〜２時間インキュベートし、このＩｇＧを細胞に結合させ、選択から結合したｓｃＦｖを競合解離させた。細胞を２０００ｒｐｍで遠沈し、上清を採取し、これを使用して増殖中のＴＧ１細胞に感染させた。競合溶出選択を複数回繰り返して実行して、Ｂｂｂｔ０２４１と同じまたは類似のエピトープに結合するｓｃＦｖを濃縮した。
[0181]個々のクローンの結合を示すために、Ｂ．Ｅｎｄ３細胞でのＦＭＡＴアッセイにおいて、実施例１で説明されるように大腸菌ペリプラズム調製物を使用してライブラリーの最初のスクリーニングを実行した。この最初のスクリーニングからのヒットを選択し、配列決定し、その後、固有のｓｃＦｖを精製タンパク質調製（ＨＩＳ調製）に供し、確認のための結合ＦＭＡＴアッセイで使用した。
[0182]アッセイされたＢｂｂｔ０２４１、およびＦＣ５から誘導されたＳｃＦｖ（模倣剤および非模倣剤）の全てが、固有の結合プロファイルを有しており、それによりそれらは、細胞表面上で全く目立たない点状の結合部で細胞の部分集団のみ（通常約２５〜３０％）と結合することが観察された。
[0183]Ｂｂｂｔ０２４１ ｈＩｇＧ１またはＦＣ５−Ｆｃのいずれかが競合可能な場合、結合したｓｃＦｖ複合体によって提供される蛍光シグナルが減少したことから、特定のｓｃＦｖが、細胞結合に関してＢｂｂｔ０２４１／ＦＣ５（ＦＣ５模倣剤と称される、図６Ａ）と競合したことが示された。最初に、１０種の固有のＦＣ５模倣剤ｓｃＦｖが同定された。しかしながら、そのうち数種が、他の細胞、例えば初代ラットまたはイヌ大血管脳内皮細胞およびヒトＤ３脳内皮細胞とのＦＭＡＴ結合アッセイで試験した場合、種交差反応性を欠いていたため、それらを不適切にする安定性の低減のためにさらなる特徴付けから除外された。残りの７種のｓｃＦｖ、すなわちＢｂｂｔ０６２６、Ｂｂｂｔ０７２７、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６５４、Ｂｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７３２、およびＢｂｂｔ０７５４をＦＣ５模倣剤と称し、これらをさらに特徴付けた。リードｓｃＦｖを、ヒトＩｇＧ１−ＴＭ−Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（Oganesyan Vら、Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2008：64（6）；700〜704）を使用してＩｇＧ１様式に変換し、競合ＦＭＡＴを実行して、これらのｓｃＦｖのＩｇＧ型が、試験された全ての他のＦＣ５模倣剤と、細胞表面への結合に関して競合できるかどうかを決定した。７種のＦＣ５模倣剤は、それらが互いに競合することができる方式に応じて、３つの競合階級：Ｂｂｂｔ０６２６およびＢｂｂｔ０７２７を包含する第１のグループ、Ｂｂｂｔ０６３２およびＢｂｂｔ０６５４を包含する第２のグループ、ならびにＢｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７３２、およびＢｂｂｔ０７５４を包含する第３のグループに分類された。
[0184]スクリーニングされたファージペリプラズム調製物から、Ｂｂｂｔ０２４１に類似した結合プロファイルを有する別の１５種の固有のｓｃＦｖを同定したが、それらのＢ．Ｅｎｄ３細胞への結合は、Ｂｂｂｔ０２４１ ｈＩｇＧ１またはＦＣ５−Ｆｃによって競合的に阻害されなかった（図６Ｂ）。これらのうち３種が、許容できる安定性、配列および交差反応性特性を有することが見出された。これらのｓｃＦｖ、Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０６７４、およびＢｂｂｔ０７５５を、ＦＣ５様非模倣剤と称した。
[0185]これらのコンストラクトのＶＨおよびＶＬ領域のＤＮＡ配列、加えてｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ならびに様々なＣＤＲおよびフレームワークのアミノ酸配列は、表２に示される配列番号として提示される。
[0186]リードＦＣ５模倣剤および非模倣剤候補を、ｈＩｇＧ１ＴＭおよびｈＩｇＧ１ＴＭ＋ＡＤＣ様式に変換した。Ｆｃドメイン中の３つの残基（Ｔ２８９Ｃ、Ａ３３９ＣおよびＳ４４２Ｃ）をシステインに変換して、ペイロードの接続を可能にした（Dimasi N.ら、J. Mol. Biol. 2009；393；672〜692。
[0187]ｈＩｇＧ１ＴＭ様式において、クロロメチルケトン（ＣＭＫ）反応性基を有するペプチドを、チオール化学を介して、ｈＩｇＧ１ＴＭのヒンジおよびＣＨ１−ＣＬ１領域における鎖間および鎖内のジスルフィド結合でシステイン残基に接続した。
実施例４：インビトロにおけるＦＣ５模倣剤およびＦＣ５様非模倣剤の特徴付け
[0188]ＦＣ５模倣剤およびＦＣ５様非模倣剤を、追加のインビトロおよびインビボのアッセイによって特徴付けた。ヒットを、サイプロオレンジ（Sypro orange）標準方法（Ericssonら、2006 Analytical Biochemistry 357、289〜298頁）に従って熱安定性に関して試験し、さらに可能性のあるＮ結合型またはＯ結合型糖付加または脱アミド化部位などの配列の信頼性に関して試験した。実施例３で説明されるようなマウス脳内皮細胞株Ｂ．ｅｎｄ３への結合に関するｓｃＦｖヒットの試験に加えて、以下のＦＭＡＴ方法により、ｓｃＦｖをＢ．ｅｎｄ３細胞への内在化に関して試験した。これまでに述べられたような結合ＦＭＡＴアッセイと同様にして、ただし以下ようにプロトコールを変更して内在化ＦＭＡＴを実行した。ＦＭＡＴを３７℃で実行し、抗マウス検出抗体はＣｙｐＨｅｒ５Ｅで標識し、０．１％ＢＳＡを含有するリンゲルＨＥＰＥＳ緩衝液で実行した。ＦＣ５模倣剤およびＦＣ５様非模倣剤を、ｈＩｇＧ様式で、初代ラット脳内皮細胞（ＲＢＥＣ）、初代カニクイザル脳内皮細胞への結合に関して、さらにヒトＤ３細胞への結合に関して試験した。
[0189]表３および４に、これらのアッセイの結果を示す。
[0190]次いで全てのリードクローン（Ｂｂｂｔと称される）を、ラット、マウスおよびウシトランスサイトーシスアッセイで、説明の通りに、ビオチン化した精製ｓｃＦｖの輸送として試験した（Watson P. M. D.ら、BMC Neuroscience 2013：14、59〜79；Coisne C.ら、Lab Invest. 2005：85、734〜746；Dehouck M-P.ら、J. Neurochem. 1990：54、1798〜1801）。ＳｃＦｖを、ｓｃＦｖのＣ末端におけるＦＬＡＧと１０×ＨＩＳタグとの間において遊離のシステイン残基で特異的にビオチン化した。ＥＬＩＳＡにより、９６ウェルのＮｉ−ＮＴＡプレートでＨＩＳタグを介して輸送されたｓｃＦｖを捕獲することによりＳｃＦｖ輸送を検出し、ビオチンをユーロピウムで標識したストレプトアビジンで検出した。
実施例５：ＦＣ５模倣剤およびＦＣ５様非模倣剤のインビボにおける特徴付け
ラット利尿モデル
[0191]ＢＢＢを通過して鎮痛剤を含むペイロードを輸送することにおける本開示の輸送体ポリペプチドの効能を、以下のようにラット利尿モデルを使用して実証した。
[0192]ダイノルフィンは、前駆タンパク質であるプロダイノルフィンから生じる内因性オピオイドペプチドのクラスである。これらは、１モル当たりモルヒネより６〜１０倍高い効力を示し、主としてκ−オピオイド受容体（ＫＯＲ）を介してそれらの作用を発揮する。ダイノルフィンは、疼痛応答の調節因子であることがこれまでに示されている。ラット脊髄のクモ膜下腔にダイノルフィンペプチドを注入すると、用量依存性の無痛が引き起こされ、これはナロキソン処置によって一部消失する（Han JSら、Sci. Sin.、Ser. B, Chem. Biol. Agric. Med. Earth Sci. 27（2）：169〜77.（1984））。ダイノルフィンペプチドは、動物において末梢で制限され、ＢＢＢを通過することができない。しかしながら、ＢＢＢ標的部分にカップリングされたダイノルフィンペプチドは、ＢＢＢを通過して送達され、疼痛の緩和をもたらすことができた。
[0193]そのために、Ｂｂｂｔ０２４１（ｓｃＦｖおよびＩｇＧ様式の両方）を発現させ、精製し、クロロメチルケトン活性基を使用して、Ｂｂｂｔ０２４１ｓｃＦｖまたはｈＩｇＧ上のシステイン残基にダイノルフィンペプチドをカップリングすることによってκ−オピオイドペプチド（ダイノルフィン）にカップリングした（図５Ａ）。ｓｃＦｖ−ダイノルフィンコンジュゲートをラットに注射し（ｉ．ｖ．）、４時間にわたり１時間おきに利尿を測定した。図５Ｂに研究設計を示す。ダイノルフィンがＢＢＢを通過して輸送される場合、利尿の増加が観察される。ダイノルフィン単独の末梢投与は作用を示さない。図５Ｃは、ダイノルフィンにコンジュゲートしたＢｂｂｔ０２４１をラットに投与した際に観察された尿排出量の有意な増加を示す。
[0194]ＦＣ５模倣剤および非模倣剤のｓｃＦｖおよびＩｇＧ様式の両方を、ラット利尿モデルで試験した。図７Ａは、Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０６７４、Ｂｂｂｔ０７５４、およびＢｂｂｔ０６５４のＩｇＧ型を投与した際に観察された、ビヒクルを超える尿排出量の有意な増加を示す。ＩｇＧ化合物を体重１ｋｇ当たり４ｍｌで投与した。図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、対照と比較した異なる用量のＢｂｂｔ０６２６ ｈＩｇＧの作用を示す（用量は、グラフ上においてｍｇ／ｍｌで示される）。結果から、ダイノルフィンにコンジュゲートしたＢｂｂｔ０６２６の用量に伴い作用が増加することが示される。それに続くアッセイから、表３に記載のＦＣ５模倣剤の全ておよび表４に記載のＦＣ５非模倣剤の全てが、利尿モデルにおいて陽性であったことが実証された（データ示さず）。
マウスの坐骨神経部分結紮モデル
[0195]神経因性疼痛は、中枢神経が介在することから、疼痛の緩和をもたらすためには、薬物をＣＮＳに到達させなければならない。神経因性疼痛モデルはすでに説明されており（Seltzer Zら、Pain 43：205〜218（1990））、それによれば、マウスの１本の脚の坐骨神経を部分結紮し、結果として損傷した脚において脚の圧痛の閾値を低下させる。鎮痛薬は、ＣＮＳに到達することができれば、疼痛を低減すると予想され、脚の圧力比は、より等しくなると予想される。図８に、モデルの概略図を示す。
[0196]神経因性疼痛を緩和するための方策としてのＩＬ−１受容体拮抗作用の使用は、実証されている（Gabayら、Eur J Pain. 2011 Mar；15（3）：242〜8（2011）。ＩＬ−１Ｒａは、天然に存在するＩＬ−１受容体アンタゴニストである。このタンパク質はＢＢＢを通過せず、セルツァー（Seltzer）モデルによって測定する場合、疼痛の軽減を達成するにはクモ膜下に送達しなければならない。しかしながら、ＢＢＢ標的化部分にカップリングされたＩＬ−１Ｒａは、ｉ．ｖ．投与後、ＢＢＢを通過して送達されて、疼痛の緩和をもたらすことができた。
[0197]この目的を達成するために、Ｂｂｂｔ０２４１、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６２６、およびＢｂｂｔ０７２６（およびＮＩＰ２２８対照ＩｇＧ）を、重鎖定常領域のＣ末端にリンカーを介して融合したＩＬ−１Ｒａとの融合コンストラクトとして発現させた。これらまたは類似のビルディングブロックからのこれらの融合タンパク質のいずれかの構築は、十分に当業界において通常の技術を有する者の知識の範囲内である。融合コンストラクトを、標準的な方法に従ってＣＨＯ−ＥＢＮＡ細胞で発現させ（Daramolaら、Biotechnol Prog. 2014 30：132〜41）、得られたタンパク質を、プロテインＡの親和性およびゲルろ過によって精製した。インビトロでのアッセイにおいて、このコンストラクトはＩＬ１Ｒａ活性を保持することが示された（データ示さず）。
[0198]０日目に動物対象は外科手術を受けて、手術後７日目および１０日目に機械的な痛覚過敏に関して試験された。外科手術後１３日目におけるＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質または対照の投与後、投与後２時間（一部の実験）、４時間、１日、２日および４日で機械的な痛覚過敏に関して動物を再度試験した。
[0199]無痛覚計（analgysemeter）を使用して機械的な痛覚過敏を決定した（Randall LOら、Arch Int Pharmacodyn Ther. 111：409〜19（1957））（Ugo Basile）。逃避応答が観察されるまで、それぞれ順番に各後肢の背面に力を増加させて適用した。そのポイントで力の適用を中断し、重量をグラムで記録した。データを、同側および反対側の脚ごとに、逃避の閾値としてグラムで表した。ベースラインの読み取りを確立した後、マウスを、ほぼ等しい同側／反対側の比率を有する２つのグループに分割し、外科手術を施した。マウスを３％イソフルランで麻酔した。この後、大腿の中央のレベルでの切開による鈍的剥離によって、およそ１ｃｍの左坐骨神経を露出させた。次いで縫合材（１０／０のバージンシルク：エチコン）を背面の神経の３分の１に通し、きつく縛った。接着剤を使用して切開部を閉じ、試験開始前の少なくとも７日間、マウスを回復させた。偽の手術をしたマウスも同じプロトコールを受けたが、神経を露出させた後、創傷を接着剤で閉じ、そのまま回復させた。
[0200]マウスにおける予備的な用量応答研究から、４０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＢｂｂｔ０２４１およびＢｂｂｔ０６３２−ＩＬ−１Ｒａ融合体の静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、有意な無痛モデル系を示した（データ示さず）ことが示される。図９は、１００ｍｇ／ｋｇのＢｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６２６、およびＢｂｂｔ０７２６ ＩＬ−１Ｒａ融合体のｉ．ｖ．投与で有意な無痛が観察され、作用が投与後２日より長く継続したことを示す。Ｂｂｂｔ０６２６ ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質を用いて追加のインビボでの研究を行った。融合タンパク質 を２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与したところ、統計学的に有意な用量依存性の作用が実証された（図１０）。さらに、ｉ．ｖ．投与と皮下（ｓ．ｃ．）投与との比較から、２種の送達経路間に作用の差がないことが示された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
[0201]最後に、反復投与の作用を研究した。この研究において、０日目に動物は外科手術を受けて、手術後７日目および１０日目に機械的な痛覚過敏に関して試験された。１３日目に、Ｂｂｂｔ０６２６−ＩＬ−１ＲａまたはＮＩＰ２２８−ＩＬ−１Ｒａのいずれかを全ての動物に投与し、投与後４時間および１日で機械的な痛覚過敏に関して試験した。１４日目に、Ｂｂｂｔ０６２６−ＩＬ−１ＲａまたはＮＩＰ２２８−ＩＬ−１Ｒａのいずれかを一部の動物に再度投与し、４時間後に再度試験した。この研究は、動物の数が多いため、同数で半分に分けて行われた。次いで動物を投与後４日まで試験した。
[0202]図１２Ａおよび１２Ｂに、結果（組み合わされた研究からの）を示す。単回投与された動物において、ピークの鎮痛作用は、初期の研究の場合と同様に、投与後４時間から１日の間であった。２回の投与を受けた動物において、無痛のレベルは増加し、さらに２回目の投与後の４時間でピークの無痛を示した。作用は、第２回目の投与後の４日間にわたり統計学的に有意なままであった。１回目の投与（１７日目）から４日後に２回目の用量が投与されたさらなる研究において、それでもなお増加した作用が観察され、２回目の投与から少なくとも４日間続いた（データ示さず）。
[0203]前述した具体的な実施態様の説明は、他者が、当業界の技術範囲内の知識を適用することによって、このような具体的な実施態様を、余計な実験を行うことなく、本発明の開示の全般的な概念から逸脱することなく、様々な適用のために容易に改変したり、および／または適合させたりすることができる程度に詳細に本開示の全般的な性質を解明していると予想される。それゆえに、このような適合および改変は、本明細書で示された教示および指針に基づき、開示された実施態様の均等物の意味および範囲に含まれることが意図される。本明細書における表現または用語は、説明の目的のためであり、限定の目的のためではないことが理解されると予想され、したがって本明細書に記載の用語または表現は、当業者によって教示および指針の観点で解釈されることとする。
[0204]本発明の開示の幅および範囲は、上記で説明した例示的な実施態様のいずれによっても限定されないものとするが、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるものとする。

Claims (74)

  1. 免疫グロブリンポリペプチドを含む単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−１（Ｈ−ＣＤＲ１）、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−２（Ｈ−ＣＤＲ２）、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−３（Ｈ−ＣＤＲ３）、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−１（Ｌ−ＣＤＲ１）、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含み；Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３がそれぞれ、
    （ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４；
    （ｂ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
    （ｃ）配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
    （ｄ）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６６、配列番号６７、および配列番号６８；
    （ｅ）配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
    （ｆ）配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
    （ｇ）配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１；
    （ｈ）配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３８、配列番号１３９、および配列番号１４０；
    （ｉ）配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５６、配列番号１５７、および配列番号１５８；
    （ｊ）配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７４、配列番号１７５、および配列番号１７６；
    （ｋ）配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１９２、配列番号１９３、および配列番号１９４；または
    （ｌ）配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１９、配列番号２２０、および配列番号２２０
    を含み、該輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる、上記輸送体分子。
  2. 前記Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３がそれぞれ、
    （ｂ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２；
    （ｃ）配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０；
    （ｅ）配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８４、配列番号８５、および配列番号８６；
    （ｆ）配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号１０２、配列番号１０３、および配列番号１０４；
    （ｇ）配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１２０、配列番号１２１、および配列番号１２２；または
    （ｈ）配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３８、配列番号１３９、および配列番号１４０
    を含む、請求項１に記載の輸送体分子。
  3. 免疫グロブリンポリペプチドを含む単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、
    （ａ）配列番号２に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および配列番号１１に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号２０に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２９に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号３８に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号４７に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号５６に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号６５に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号７４に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号８３に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号９２に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１０１に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｇ）配列番号１１０に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１１９に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｈ）配列番号１２８に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３７に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｉ）配列番号１４６に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１５５に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｊ）配列番号１６４に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１７３に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｋ）配列番号１８２に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号１９１に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；
    （ｌ）配列番号２０９に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２１８に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列；または
    （ｍ）配列番号２２６に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＨアミノ酸配列、および配列番号２２７に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＶＬアミノ酸配列
    を含み、該輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる、上記輸送体分子。
  4. （ａ）ＶＨは配列番号２を含み、ＶＬは配列番号１１を含み；
    （ｂ）ＶＨは配列番号２０を含み、ＶＬは配列番号２２８を含み；
    （ｃ）ＶＨは配列番号３８を含み、ＶＬは配列番号２２８を含み；
    （ｄ）ＶＨは配列番号５６を含み、ＶＬは配列番号６５を含み；
    （ｅ）ＶＨは配列番号７４を含み、ＶＬは配列番号２２８を含み；
    （ｆ）ＶＨは配列番号９２を含み、ＶＬは配列番号２２８を含み；
    （ｇ）ＶＨは配列番号１１０を含み、ＶＬは配列番号２２８を含み；
    （ｈ）ＶＨは配列番号１２８を含み、ＶＬは配列番号１３７を含み；
    （ｉ）ＶＨは配列番号１４６を含み、ＶＬは配列番号１５５を含み；
    （ｊ）ＶＨは配列番号１６４を含み、ＶＬは配列番号１７３を含み；
    （ｋ）ＶＨは配列番号１８２を含み、ＶＬは配列番号１９１を含み；
    （ｌ）ＶＨは配列番号２０９を含み、ＶＬは配列番号２１８を含み；または
    （ｍ）ＶＨは配列番号２２６を含み、ＶＬは配列番号２２７を含む、請求項３に記載の輸送体分子。
  5. （ｂ）ＶＨは配列番号２０を含み、ＶＬは配列番号２９を含み；
    （ｃ）ＶＨは配列番号３８を含み、ＶＬは配列番号４７を含み；
    （ｅ）ＶＨは配列番号７４を含み、ＶＬは配列番号８３を含み；
    （ｆ）ＶＨは配列番号９２を含み、ＶＬは配列番号１０１を含み；または
    （ｇ）ＶＨは配列番号１１０を含み、ＶＬは配列番号１１９を含む、請求項４に記載の輸送体分子。
  6. 免疫グロブリンポリペプチドを含む単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、アミノ酸配列番号２００を有する単一ドメインのＶＨを含む、上記輸送体分子。
  7. インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいて、ＦＣ５より効果的に脳微小血管内皮細胞ＢＭＶＥＣを通過することができる、請求項６に記載の輸送体分子。
  8. 前記免疫グロブリンポリペプチドが、抗体またはそれらのＢＢＢ透過性フラグメントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  9. 前記抗体またはそれらのＢＢＢ透過性フラグメントが、２つまたはそれより多くのサブユニットを含む、請求項８に記載の輸送体分子。
  10. ジスルフィド結合を介して結合した重鎖および軽鎖を含む、請求項９に記載の輸送体分子。
  11. 重鎖定常領域またはそれらのフラグメントをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  12. 前記重鎖定常領域が、Ｆｃ領域を含む、請求項１１に記載の輸送体分子。
  13. 前記Ｆｃ領域が、ヒンジ領域を含む、請求項１２に記載の輸送体分子。
  14. 前記重鎖定常領域またはそれらのフラグメントが、ＩｇＧ定常領域またはそれらのフラグメントである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  15. 前記ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントが、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を含み、ここで改変されたＩｇＧは、該野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、ＦｃＲｎに関する変更された半減期および／または変更された結合親和性を有する、請求項１４に記載の輸送体分子。
  16. 前記改変されたＩｇＧが、前記野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、ＦｃＲｎに関する増加した半減期および／または増加した結合親和性を有する、請求項１５に記載の輸送体分子。
  17. 前記改変されたＩｇＧが、前記野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、ＦｃＲｎに関する減少した半減期および／または減少した結合親和性を有する、請求項１５に記載の輸送体分子。
  18. 前記ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントが、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を含み、ここで改変されたＩｇＧは、該野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、低減したエフェクター機能および／または少なくとも１つのエフェクター分子への低減した結合を有する、請求項１４に記載の輸送体分子。
  19. 前記ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメントが、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比較して、変更された糖付加を有し、ここで改変されたＩｇＧは、該野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、低減したエフェクター機能および／または少なくとも１つのエフェクター分子への低減した結合を有する、請求項１４に記載の輸送体分子。
  20. 前記重鎖定常ドメインまたはそれらのフラグメントが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常ドメインまたはそれらのフラグメントである、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  21. 軽鎖定常ドメインまたはそれらのフラグメントをさらに含む、請求項１〜５または１１〜２０のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  22. 前記軽鎖定常ドメインまたはそれらのフラグメントが、ヒトカッパ定常ドメインもしくはそれらのフラグメント、またはヒトラムダ定常領域もしくはそれらのフラグメントを含む、請求項２１に記載の輸送体分子。
  23. 前記抗体またはそれらのフラグメントが、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、あらゆるそれらの組合せ、またはあらゆるそれらの抗原結合フラグメントである、請求項８〜２２のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  24. 前記抗体またはそれらのフラグメントが、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む完全ＩｇＧ免疫グロブリンである、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  25. Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｄｓＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、またはｓｃ（Ｆｖ）２フラグメントである、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  26. ｓｃＦｖフラグメントを含み、ここでＳｃＦｖは、リンカーを介して一緒に融合したＶＨおよびＶＬを含む、請求項２５に記載の輸送体分子。
  27. ｄｓＦｖフラグメントを含み、ここでｄｓＦｖは、リンカーを介して一緒に融合したＶＨおよびＶＬを含む、請求項２５に記載の輸送体分子。
  28. アミノ末端から、ＶＨ−Ｌ−ＶＬを含み、式中Ｌはリンカーである、請求項２６に記載の輸送体分子。
  29. 前記リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である）（配列番号２３２）、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である）（配列番号２３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＬ（配列番号２３６）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号２３７）である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  30. 連結されたペイロードをさらに含み、ここで前記輸送体分子は、ＢＢＢを通過して該ペイロードを輸送することができる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  31. 前記ペイロードが、ペプチド結合を介して、前記免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに融合されている、請求項３０に記載の輸送体分子。
  32. 前記ペイロードが、前記免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに化学的にコンジュゲートされている、請求項３０に記載の輸送体分子。
  33. 前記ペイロードが、前記免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドと非共有結合を介して連結されている、請求項３０に記載の輸送体分子。
  34. 前記ペイロードが、抗微生物剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生体応答調整物質、医薬物質、リンホカイン、異種抗体もしくはそれらのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、または薬剤の２種もしくはそれより多くの組合せを含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  35. 前記ペイロードが、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、パラクリン因子、視床下部放出因子、神経伝達物質ポリペプチド、ＣＮＳ細胞によって発現される受容体に関するポリペプチドアゴニスト、およびリソソーム蓄積症に関与するポリペプチドからなる群より選択される神経刺激性のポリペプチドを含む、請求項３４に記載の輸送体分子。
  36. 前記ペイロードが、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ダラージン、インターフェロン−β、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ニュールツリン、ニューレグリン、ネトリン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、セマフォリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−ｃｘ、ＴＧＦ−Ｂ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、あらゆるそれらのフラグメント、またはあらゆるそれらの組合せを含む、請求項３５に記載の輸送体分子。
  37. 前記ペイロードが、異種抗体またはそれらのフラグメントを含む、請求項３４に記載の輸送体分子。
  38. 前記異種抗体またはそれらのフラグメントが、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ−４、テネイシン、アルファ−４（ａ４）インテグリン、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、アミロイド−１３（ＡＩ３）、ハンチンチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴｒｋＡ、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦ−１３、α−シヌクレインタウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、カスパーゼ６、神経栄養因子および／または神経栄養因子受容体の１つまたはそれより多くに特異的に結合する、請求項３７に記載の輸送体分子。
  39. ヒトＩｇＧ重鎖定常領域またはそれらのフラグメント、およびヒト軽鎖定常領域をさらに含み、ここでＩＬ−１Ｒａポリペプチドが該重鎖定常領域のＣ末端に融合されている、請求項３６に記載の輸送体分子。
  40. 脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）に結合することができる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  41. 前記ＢＭＶＥＣが、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、またはウシＢＭＶＥＣである、請求項４０に記載の輸送体分子。
  42. 前記ＢＭＶＥＣが、脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）である、請求項４０または４１に記載の輸送体分子。
  43. インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいて、ＢＣＥＣの単分子層を通過することができる、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  44. 脳内皮細胞への結合に関して単一ドメイン抗体ＦＣ５またはＢｂｂｔ０２４１と競合することができる、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  45. Ｂｂｂｔ０６２６、Ｂｂｂｔ０７２７、Ｂｂｂｔ０６３２、Ｂｂｂｔ０６５４、Ｂｂｂｔ０７２６、Ｂｂｂｔ０７３２、またはＢｂｂｔ０７５４のＶＨおよびＶＬドメインを含む、請求項４４に記載の輸送体分子。
  46. 脳内皮細胞への結合に関して単一ドメイン抗体ＦＣ５またはＢｂｂｔ０２４１と競合しない、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  47. Ｂｂｂｔ０６４３、Ｂｂｂｔ０６７４、Ｂｂｂｔ０７５５、Ｂｂｂｔ０３５１、Ｂｂｂｔ０５７９またはＢｂｂｔ０６７１のＶＨおよびＶＬドメインを含む、請求項４６に記載の輸送体分子。
  48. ダイノルフィンにコンジュゲートさせて、ラットモデルで末梢投与される場合、ＢＢＢを通過することにより利尿を誘導することができる、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  49. ＩＬ−１ＲＡに融合させて、ラットの坐骨神経部分結紮アッセイで末梢投与される場合、ＢＢＢを通過することにより神経因性疼痛を低減させることができる、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  50. マウスモデルで末梢投与される場合、定量的全身オートラジオグラフィーによって測定される場合、小脳皮質、大脳灰白質、脊髄灰白質、脳橋、またはそれらの組合せに局在化する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の輸送体分子。
  51. 請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子、および担体を含む組成物。
  52. 請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子、またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチド。
  53. ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨおよびＶＬをコードする、請求項５２に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、核酸分子が、配列番号２、配列番号１１、または配列番号２および配列番号１１；配列番号２０、配列番号２９、または配列番号２０および配列番号２９；配列番号３８、配列番号４７、または配列番号３８および配列番号４７；配列番号５６、配列番号６５、または配列番号６６および配列番号６５；配列番号７４、配列番号８３、または配列番号７４および配列番号８３；配列番号９２、配列番号１０１、または配列番号９２および配列番号１０１；配列番号１１０、配列番号１１９、または配列番号１１０および配列番号１１９；配列番号１２８、配列番号１３７、または配列番号１２８および配列番号１３７；配列番号１４６、配列番号１５５、または配列番号１４６および配列番号１５５；配列番号１６４、配列番号１７３、または配列番号１６４および配列番号１７３；配列番号１８２、配列番号１９１、または配列番号１８２および配列番号１９１；配列番号２００；配列番号２０９、配列番号２１８、または配列番号２０９および配列番号２１８；または配列番号２２６、配列番号２２７、または配列番号２２６および配列番号２２７を含む、ポリヌクレオチド。
  54. ペイロードをコードする核酸をさらに含む、請求項５２または５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  55. 請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子、またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする２つまたはそれより多くの核酸分子を含む組成物。
  56. 前記２つまたはそれより多くの核酸分子がそれぞれ、配列番号２および配列番号１１；配列番号２０および配列番号２９；配列番号３８および配列番号４７；配列番号５６および配列番号６５；配列番号７４および配列番号８３；配列番号９２および配列番号１０１；配列番号１１０および配列番号１１９；配列番号１２８および配列番号１３７；配列番号１４６および配列番号１５５；配列番号１６４および配列番号１７３；配列番号１８２および配列番号１９１；配列番号２０９および配列番号２１８；または配列番号２２６および配列番号２２７を含む、請求項５５に記載の組成物。
  57. ペイロードをコードする核酸分子をさらに含む、請求項５５または５６に記載の組成物。
  58. 前記２つまたはそれより多くの核酸分子が、同じベクター中に存在する、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. 請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の２つまたはそれより多くの核酸分子を含むベクター。
  60. 前記２つまたはそれより多くの核酸分子が、少なくとも２つの別々のベクター中に存在する、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
  61. 前記ポリヌクレオチドまたは前記２つまたはそれより多くの核酸分子が、１つまたはそれより多くのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項５９に記載のベクターまたは請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記ペイロードが、抗微生物剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生体応答調整物質、医薬物質、リンホカイン、異種抗体もしくはそれらのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、または薬剤の２種もしくはそれより多くの組合せを含む、請求項５４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５７に記載の組成物。
  63. 前記ペイロードが、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ダラージン、インターフェロン−β、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ニュールツリン、ニューレグリン、ネトリン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、セマフォリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−ｃｘ、ＴＧＦ−Ｂ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、あらゆるそれらのフラグメント、またはあらゆるそれらの組合せを含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチドまたは組成物。
  64. 請求項５９に記載のベクター、または請求項６０に記載の組成物を含む、単離された宿主細胞。
  65. 請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子の作製方法であって、（ａ）請求項６４に記載の宿主細胞を培養すること；および（ｂ）前記輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットを単離することを含む、上記方法。
  66. （ｃ）前記輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをペイロードにコンジュゲートすることをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子、請求項５１または請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項５９に記載のベクター、または請求項６４に記載の宿主細胞を含む、診断試薬。
  68. 請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子、請求項５１または請求項５５〜５８いずれか一項に記載の組成物、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項５９に記載のベクター、または請求項６４に記載の宿主細胞を含むキット。
  69. 中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、または傷害を処置する方法であって、処置が必要な対象に、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子を含む組成物を末梢投与することを含み、該輸送体分子は、ＢＢＢを通過して輸送された後にＣＮＳに曝露されると該疾患、障害、または傷害を処置することが可能な治療剤を含み、該疾患、障害、または傷害を処置するのに十分な該治療剤の量は、ＢＢＢを通過して輸送されることにより該疾患、障害、または傷害を処置する量である、上記方法。
  70. 前記治療剤が、ＣＮＳへの侵入後に前記輸送体分子から放出される、請求項６９に記載の方法。
  71. ＣＮＳの前記疾患、障害、または傷害が、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、神経因性疼痛、神経変性、神経炎症、進行性多巣性白質脳病（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロトフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス−メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏症候群、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ベル麻痺、原発性腫瘍、二次転移、またはあらゆるそれらの組合せを含む、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. 前記治療剤が、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）であり、前記疾患、障害、または傷害が、神経因性疼痛である、請求項７１に記載の方法。
  73. 対象のＣＮＳの薬剤への曝露を増加させる方法であって、該薬剤を、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子にカップリングすること、およびカップリングされた薬剤を末梢投与することを含む、上記方法。
  74. ＢＢＢを通過して薬剤を輸送する方法であって、輸送体分子がそれらにカップリングされた薬剤をＢＢＢを通過して輸送するように、該薬剤を、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の輸送体分子にカップリングすることを含む、上記方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022514290A (ja) * 2018-12-20 2022-02-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変抗体ｆｃおよび使用方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2967830A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Ossianix, Inc. Tfr selective binding compounds and related methods
WO2018031424A1 (en) * 2016-08-06 2018-02-15 Ossianix, Inc. In vivo methods for selecting peptides that cross the blood brain barrier, related compositions and methods of use
US10702589B2 (en) 2016-10-04 2020-07-07 Ann And Robert H. Lurie Children's Hospital Of Chicago Compositions and methods of treating neurological disorder and stress-induced conditions
EP3551666A4 (en) * 2016-12-12 2020-07-29 National Research Council of Canada VARIANTS OF ANTIBODIES CROSSING THE HEMATOENCEPHALIC BARRIER AND THEIR USES
JP7449092B2 (ja) * 2017-01-30 2024-03-13 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 血液脳関門移動化合物及びその使用
WO2019094608A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Denali Therapeutics Inc. Anti-bace1 antibodies and methods of use thereof
US20210046189A1 (en) * 2018-03-30 2021-02-18 HANMl PHARM. CO., LTD. Long-acting protein conjugates for brain targeting, a preparation method thereof, and a composition comprising the same
CN112771165A (zh) * 2018-08-30 2021-05-07 (株)纳斯摩仕 通过血脑屏障的核酸适配体及其应用
MA54070A (fr) * 2018-10-29 2021-09-08 Biogen Ma Inc Variants fc5 humanisés et stabilisés pour l'amélioration du transport à travers la barrière hémato-encéphalique

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002057445A1 (en) * 2000-05-26 2002-07-25 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
WO2007036021A1 (en) * 2005-09-27 2007-04-05 National Research Council Of Canada Blood-brain barrier epitopes and uses thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2393292A1 (en) * 1999-12-13 2001-06-21 Cambridge Antibody Technology Limited Brain specific binding members
EP2368996A3 (en) 2005-03-25 2011-12-14 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
US20100077498A1 (en) * 2008-09-11 2010-03-25 Pardridge William M Compositions and methods for blood-brain barrier delivery in the mouse
WO2010080463A1 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Imclone Llc Antibody humanization
US9499608B2 (en) * 2011-06-08 2016-11-22 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific monoclonal antibody therapeutics against West Nile virus with improved CNS penetration
EP3711778B1 (en) * 2011-12-02 2024-05-08 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
HUE039033T2 (hu) * 2012-01-10 2018-12-28 Biogen Ma Inc Terápiás molekulák transzportjának fokozása a vér-agy gáton keresztül

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002057445A1 (en) * 2000-05-26 2002-07-25 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
WO2007036021A1 (en) * 2005-09-27 2007-04-05 National Research Council Of Canada Blood-brain barrier epitopes and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY, vol. 95, JPN6020000998, 2005, pages 1201 - 1214, ISSN: 0004330215 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022514290A (ja) * 2018-12-20 2022-02-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変抗体ｆｃおよび使用方法

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