JP2008081461A - ケフィアを用いた薬剤およびその製造方法、健康食品 - Google Patents

Abstract

【課題】ケフィアを用いた新規な医薬用途に適用した薬剤、およびその製造方法、ならびにケフィアを用いた新規な健康食品を提供する。
【解決手段】分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むインスリン非依存性糖尿病治療剤およびその製造方法。ケフィア水溶性画分（好ましくは分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物）を含むインスリン依存性糖尿病治療剤およびその製造方法。ケフィアを用いた（好ましくはケフィア水溶性画分を含む）抗肥満剤およびその製造方法。分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む健康食品。
【選択図】図１

Description

本発明は、ケフィアを用いたインスリン非依存性糖尿病治療剤、インスリン依存性糖尿病治療剤、抗肥満剤およびその製造方法、ならびにケフィアを用いた健康食品に関する。

ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）は、ウシ、ヤギ、ヒツジの乳をヤギの革袋に入れて保存していたものに偶然、乳酸菌、酵母が混入して乳酸およびアルコール発酵して生じた発酵乳液（ヨーグルト状の飲料）である。ケフィアは、スポンジ状の固まりで約２０種類の乳酸菌、酵母菌、酢酸菌などを有するケフィア粒（日本ではヨーグルトきのことも呼ばれる）に牛乳を入れ、所定時間常温で密閉することによりケフィア粒混入のケフィア（ケフィアヨーグルトとも呼ばれる）を得、これを濾してケフィア粒を取り除くことにより簡単に得ることができ、健康食品として一般家庭でも愛用されている。

近年、ケフィアは健康食品としてだけでなく、その優れた保健効果に着目され、医薬用途への応用についての研究が盛んになされている。本発明者らは、ケフィアを、インスリン非依存性のＩＩ型糖尿病（たとえば、特開２００２−１０４９７９号公報（特許文献１））、抗酸化剤（たとえば、特開２００３−２９２４４８号公報（特許文献２））、皮膚外用剤（たとえば、国際公開２００３／０７２１１９号パンフレット（特許文献３））などに好適に適用できることを提案してきた。このようにケフィアは様々な医薬用途への適用の可能性を有すると考えられ、さらなる新規な医薬用途の開発が望まれている。
特開２００２−１０４９７９号公報 特開２００３−２９２４４８号公報 国際公開２００３／０７２１１９号パンフレット

本発明の目的は、ケフィアを用いた新規な医薬用途に適用した薬剤、およびその製造方法、ならびにケフィアを用いた新規な健康食品を提供することである。

本発明は、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む、インスリン非依存性糖尿病治療剤を提供する。

本発明はまた、ケフィアから得られた水溶性画分を用いた、インスリン依存性糖尿病治療剤を提供する。本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤は、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むことが好ましい。

また本発明は、ケフィアを用いた抗肥満剤を提供する。本発明の抗肥満剤は、ケフィアから得られた水溶性画分を含むことが好ましい。

本発明は、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む健康食品についても提供する。

また本発明は、ケフィアから上清を分離する工程と、得られた上清から分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を得る工程とを含む、インスリン非依存性糖尿病治療剤の製造方法についても提供する。

本発明はまた、ケフィアから上清を分離する工程を含むインスリン依存性糖尿病治療剤の製造方法についても提供する。本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤の製造方法は、得られた上清から分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を得る工程をさらに含むことが好ましい。

本発明はさらに、ケフィアから上清を分離する工程を含む抗肥満剤の製造方法についても提供する。

本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤または健康食品によれば、細胞の糖取り込みを促進させる作用を示す分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むため、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）の治療、改善または予防の用途に有用である。

本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤によれば、インスリンを放出する膵臓β細胞の活性酸素障害から保護する作用を示すケフィアから得られた水溶性画分（好ましくは分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物）を含むため、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）の治療の用途に有用である。

本発明のケフィアを用いた抗肥満剤によれば、脂肪細胞分化抑制効果および脂質燃焼促進効果が発揮され、肥満の改善の用途に有用である。

〔１〕インスリン非依存性糖尿病治療剤
本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤は、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むことを特徴とする。分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物は、ヨーグルト状のケフィア発酵乳液を、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法で上清と沈殿物とに分離し、得られた上清から透析、ゲルろ過などの公知の適宜の方法を用いて、分子量１４０００Ｄａ以上の画分を分離することにより得られるケフィア抽出物である。この分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物は、クロロホルム−メタノールなどの有機溶媒によって抽出されない水溶性画分に存在し、糖成分を主体成分とする。また本発明における分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物は、陰イオン交換樹脂に吸着しない２つの成分（分子量３１ｋＤａの成分および分子量１９ｋＤａの成分）を含む。

後述する実験例１で明らかにされるように、本発明者らは、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物が、細胞の糖（グルコースなど）の取り込みを促進させる作用を有することを見出した。日本人の糖尿病のうち９割を占めるインスリン非依存性のＩＩ型糖尿病は、健康維持のための中核となる生理作用である細胞のグルコースの取り込みが行えないことで、生体の恒常性の維持が行えず、結果として様々な合併症を併発して深刻な症状を呈する。本発明によれば、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を用いることで、細胞の糖取り込みを活性化して増強させ、結果として生体内の血糖値を低下させ得ることが期待される。本発明は、このような分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）の治療に有用な薬剤を提供するものである。なお、本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤は、インスリン非依存性糖尿病の予防に用いてもよい。

本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤は、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を有効成分として含有しているのであれば、その含有量（含有率）については特に制限されるものではない。ここで「有効成分として含有」するとは、上述したインスリン非依存性糖尿病治療の効果が有意に発揮されるように当該糖尿病治療剤中に分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物が含まれることを指す。好ましくは、薬剤中に０．５〜１．５％（より好適には０．８〜１．２％）の割合で分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物が含有される。

本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤は、有効成分である分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物以外の成分については特に制限されるものではなく、医薬的に許容可能な従来公知の適宜の任意成分、担体を含むことができる。本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤の薬剤形態および投与形態についても特に制限されるものではなく、注射投与（皮下注射、腹腔内注射など）、経口投与など適宜の形態にて投与し得るように、注射剤、錠剤、顆粒剤などの適宜の形態の薬剤で実現できる。

上述した分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含有する本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤は、ケフィアから上清を分離する工程と、得られた上清から分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を得る工程とを含む方法によって好適に製造することができる。本発明は、このように本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤を製造する方法についても提供するものである。

本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤の製造方法では、まず、ケフィアから上清を分離する。原料となるケフィアとしては、ヨーグルト状のケフィア発酵乳液（ケフィアヨーグルト）を用いることができる。このケフィア発酵乳液は、ケフィア粒を含み、ケフィア粒以外の成分としてはその大部分が水分であり、水に溶けたタンパク質、糖、アルコールと脂溶性の脂質などがコロイド状に存在している。このケフィアから上清を分離する方法としては特に制限されるものではなく、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法が挙げられるが、中でも遠心分離が好ましく適用できる。遠心分離によってケフィアから上清を分離する場合、たとえば、１０，０００×ｇで３０分間の条件での遠心分離が例示される。このようにして、ケフィア水溶性画分としてケフィアの上清が得られる。

ケフィアから分離された上清は、不純物（脂質、タンパク質など）を含む場合があるため、当該不純物を除去することが好ましい。当該不純物の除去は、たとえばエタノール沈殿によって好適に行うことができる。具体的には、上清に同容量のエタノールを添加し、３，５００×ｇで３０分間の遠心分離を行った後に生じた沈殿物を除去するようにすればよい。

次に、上述のようにして得られた上清（ケフィア水溶性画分）から、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を得る。この分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を得る方法としては特に制限されるものではなく、透析、ゲルろ過などの公知の適宜の方法が挙げられるが、中でも透析が好ましく適用できる。透析によって分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を得る場合、排出限界分子量１４０００Ｄａの透析膜を用い、透析外液としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いた透析（たとえば４℃で一晩中行う）が例示される。透析後、得られた透析内液（透析膜内の液）を凍結乾燥することで、粉末状の分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物が得られる。得られた粉末状のケフィア抽出物を用いてインスリン非依存性糖尿病治療剤を調製する場合には、所望の割合で当該ケフィア抽出物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させて使用すればよい。

〔２〕インスリン依存性糖尿病治療剤
本発明はまた、ケフィアから得られた水溶性画分（ケフィア水溶性画分）を用いたインスリン依存性糖尿病治療剤についても提供する。本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤に用いられるケフィア水溶性画分は、ヨーグルト状のケフィア発酵乳液を、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法で上清と沈殿物とに分離することで、得ることができる。

本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤は、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むものであることが好ましい。ケフィア水溶性画分に含まれる成分の中でも、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含む場合に、特に顕著な効果が発揮される。分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物は、上述した水溶性画分から、透析、ゲルろ過などの公知の適宜の方法を用いて、分子量１０００Ｄａ未満の画分を分離することにより得られるケフィア抽出物である。この分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物は、水溶性を有し、酸性または中性で安定であり、かつ高圧蒸気滅菌にも安定である。

本発明におけるケフィア水溶性画分（特に分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物）は、インスリンを放出する膵臓β細胞の活性酸素障害から保護する作用を有する。膵臓のβ細胞は、グルコース刺激に応じて細胞内ＡＴＰを増大させて、インスリンを細胞外に放出する。糖尿病のうち、インスリン依存性の糖尿病（Ｉ型糖尿病）は、この膵臓のβ細胞が、免疫細胞が出す活性酸素によって酸化障害を起こすことによって生じることが知られている。そこで本発明者らは、Ｉ型糖尿病誘起剤であり、活性酸素を発生させるアロキサンを投与し、膵臓のβ細胞に活性酸素障害を引き起こした場合に、ケフィア水溶性画分および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物が、膵臓のβ細胞のアロキサン毒性を軽減し、グルコース刺激下で細胞内ＡＴＰ量を増大させ、インスリン放出を促進する作用を有することを突き止めた。また、上記アロキサンを投与した場合に、ケフィア水溶性画分および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物により生体中の血糖値の上昇が有意に減少され、かつ血漿インスリン量が有意に増加されることも確認された。したがって、本発明は、このようなケフィア水溶性画分（特に分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物）を含むインスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）の治療に有用な薬剤についても提供するものである。なお、本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤は、インスリン依存性糖尿病の予防に用いてもよい。

本発明の糖尿病治療剤は、ケフィア水溶性画分を有効成分として含有しているのであれば、その含有量（含有率）については特に制限されるものではない。ここで「有効成分として含有」するとは、上述したインスリン依存性糖尿病治療の効果が有意に発揮されるように当該糖尿病治療剤中にケフィア水溶性画分（特に、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物）が含まれることを指す。好ましくは、薬剤中に０．０５〜０．２％（より好適には０．０８〜０．１５％）の割合で分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物が含有される。

本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤は、有効成分であるケフィア水溶性画分以外の成分については特に制限されるものではなく、医薬的に許容可能な従来公知の適宜の任意成分、担体を含むことができる。本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤の薬剤形態および投与形態についても特に制限されるものではなく、注射投与（皮下注射、腹腔内注射など）、経口投与など適宜の形態にて投与し得るように、注射剤、錠剤、顆粒剤などの適宜の形態の薬剤で実現できる。

上述したケフィア水溶性画分を含有する本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤は、ケフィアから上清を分離する工程を含む方法によって好適に製造することができる。本発明は、このように本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤を製造する方法についても提供するものである。

本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤の製造方法では、上述したように、ヨーグルト状のケフィア発酵乳液（ケフィアヨーグルト）を原料として、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法によって、上清を分離する。中でも遠心分離が好ましく適用でき、たとえば１０，０００×ｇで３０分間の条件での遠心分離が例示される。このようにして、ケフィア水溶性画分としてケフィアの上清が得られる。

上述した分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を用いて本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤を製造する場合には、本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤の製造方法は、上記得られた上清（ケフィア水溶性画分）から分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を分離する工程をさらに含むことが好ましい。この分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を得る方法としては特に制限されるものではなく、透析、ゲルろ過などの公知の適宜の方法が挙げられるが、中でも透析が好ましく適用できる。透析によって分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を得る場合、排出限界分子量１０００Ｄａの透析膜を用い、透析外液としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いた透析（たとえば４℃で一晩中行う）が例示される。透析後、得られた透析外液（透析膜外の液）を、エバポレータなどを用いて減圧濃縮した後、凍結乾燥することで、粉末状の分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物が得られる。得られた粉末状のケフィア抽出物を用いてインスリン依存性糖尿病治療剤を調製する場合には、所望の割合で当該ケフィア抽出物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させて使用すればよい。

なお、ケフィアから分離された上清であるケフィア水溶性画分は、上述した分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物以外に、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物も含む。後述する実験例３，４では、この分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物についても、水溶性画分および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物ほど顕著ではないが、膵臓β細胞を活性酸素障害から保護する作用を示す。このため、本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤は、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を用いたものであってもよい。この分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を用いたインスリン依存性糖尿病治療剤は、上述したようにして分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を分離した後の水溶性画分（透析により分離した場合には、透析内液）を凍結乾燥して粉末状にし、これをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させることで調製できる。

また、ケフィアから分離された上清であるケフィア水溶性画分は、インスリン非依存性糖尿病治療剤に有用な分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物も含む。上述したように、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物についても、水溶性画分および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物ほど顕著ではないが、膵臓β細胞を活性酸素障害から保護する作用を示すため、本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤は、この分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を用いたものであってもよい。この場合、上述したインスリン非依存性糖尿病治療剤を製造する場合と同様にして、調製できる。

また上述した分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を分離した後の水溶性画分（透析により分離した場合には、透析外液）は、分子量１４０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むことになるが、上述した特に顕著な効果を発揮する分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物も含むことになる。したがって、上述した本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤を製造する際に副次的に得られた分子量１４０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を、本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤に用いるようにしてもよい。この場合、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を分離した後の水溶性画分（透析により分離した場合には、透析外液）を、エバポレータなどを用いて減圧濃縮した後、凍結乾燥して粉末状にし、これをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させることで調製できる。なお、当該粉末状の抽出物を、調製開始時の液量となるようにＤＭＥＭに溶解し、フィルタ滅菌して用いてもよい。また、上述した本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤を製造する際に副次的に得られた分子量１４０００Ｄａ未満のケフィア抽出物から分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を分離して、本発明のインスリン依存性糖尿病治療剤に用いるようにしても勿論よい。

〔３〕抗肥満剤
後述する実験例２で明らかにされるように、本発明者らは、ケフィアが脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、細胞内脂肪蓄積抑制効果が期待できることを見出した。また本発明者らは、ケフィアが、脂肪合成に関与する酵素であるグリセロール−３リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）の活性を抑制し、また脂肪細胞の分化に関係するＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター：peroxisome proliferator-activated receptor）γの遺伝子発現を抑制することを確認した。さらにケフィアが、ＰＰＡＲ遺伝子の下流にコードされるａＰ２、ＬＰＬなどの酵素遺伝子の発現を抑制するとともに、ＰＰＡＲ遺伝子の上流にコードされる延命因子などとも呼ばれるＳｉｒｔ１のタンパク量を増加させることを確認した。これらの実験から、ケフィアは、脂肪細胞分化抑制作用を示すことが見出された。

また本発明者らは、ケフィアが、細胞内における脂肪分解によって培地中に分泌される脂肪分解産物であるグリセロールを増加させたことを確認した。このことから、ケフィアは上述した脂肪細胞分化抑制作用だけでなく、脂肪分解を促進する脂質燃焼促進作用も示すことが見出された。抗肥満因子であるアディポネクチンは脂肪細胞から分泌されるが、脂肪細胞に酸化ストレスを与えると、このアディポネクチンの産生が抑制されることが知られている。本発明者らは、ケフィアが、アディポネクチンの遺伝子発現量を上昇させることを確認した。これは、ケフィアが酸化ストレスによるアディポネクチンの産生の抑制から脂肪細胞を回復させたことによるものと考えられ、ケフィアは、脂肪細胞のエネルギー代謝亢進に役立つ可能性があると考えられる。さらに、本発明者らは、ケフィアが、筋肉細胞の脂肪分解（すなわち、β酸化）を促進するであろうことも見出した。このため、ケフィアは、飢餓時に誘導される遺伝子群と関係するＰＰＡＲδの活性化を抑制し、脂肪酸燃焼へ方向づける効果を有すると考えられる。

上述した知見に基づき、本発明は、ケフィアを用いた抗肥満剤についても提供するものである。本発明の抗肥満剤は、ケフィアを用いたものであればよいが、上述した脂肪細胞分化抑制作用および脂質燃焼促進作用を特に顕著に発揮し得ることから、ケフィア水溶性画分を用いたものであることが好ましい。本発明の抗肥満剤に用いられるケフィア水溶性画分は、上述のようにヨーグルト状のケフィア発酵乳液を、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法で上清と沈殿物とに分離することで、得ることができる。

本発明の抗肥満剤は、ケフィアを有効成分として含有しているのであれば、その含有量（含有率）については特に制限されるものではない。ここで「有効成分として含有」するとは、上述した抗肥満の効果が有意に発揮されるように当該抗肥満剤中にケフィア（特に、ケフィア水溶性画分）が含まれることを指す。好ましくは、薬剤中に５〜１２％（より好適には６〜１０％）の割合でケフィア水溶性画分が含有される。

本発明の抗肥満剤は、有効成分であるケフィア以外の成分については特に制限されるものではなく、医薬的に許容可能な従来公知の適宜の任意成分、担体を含むことができる。本発明の抗肥満剤の薬剤形態および投与形態についても特に制限されるものではなく、注射投与（皮下注射、腹腔内注射など）、経口投与など適宜の形態にて投与し得るように、注射剤、錠剤、顆粒剤などの適宜の形態の薬剤で実現できる。

ケフィア水溶性画分を含む本発明の好ましい抗肥満剤は、ケフィアから上清を分離する工程を含む方法によって好適に製造することができる。本発明は、このように本発明の抗肥満剤を製造する方法についても提供するものである。

本発明の抗肥満剤の製造方法では、上述したように、ヨーグルト状のケフィア発酵乳液（ケフィアヨーグルト）を原料として、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法によって、上清を分離する。中でも遠心分離が好ましく適用でき、たとえば１０，０００×ｇで３０分間の条件での遠心分離が例示される。このようにして、ケフィア水溶性画分としてケフィアの上清が得られる。本発明の抗肥満剤は、得られたケフィア水溶性画分をそのまま用いて、あるいは凍結乾燥して粉末状とした後Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させることで調製することができる。

なお、本発明の抗肥満剤は、上述したケフィア水溶性画分を分離した後の沈殿物から得られた脂溶性の画分（ケフィア脂溶性画分）を用いてもよい。実験例２にて詳述するが、ケフィア脂溶性画分についても、ケフィア水溶性画分ほど顕著ではないが、脂肪細胞分化抑制作用および脂質燃焼促進作用を示す。ケフィア脂溶性画分を用いる場合、上述のようにして上清（ケフィア水溶性画分）を分離した後の沈殿物に、たとえば５倍容のクロロホルム−メタノール（２：１）を加えて１時間攪拌した後、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法によって上清を分離する。上清を分離後の沈殿物に、たとえば５倍容のクロロホルム−メタノールを加え、上記の工程を繰り返す。最終的に得られた上清をたとえばエバポレータによって減圧濃縮し、乾燥物を得る。こうして得られた乾燥物を、適宜の溶媒（医薬的に許容可能な溶媒）に溶解して用いることができる。

〔４〕健康食品
本発明の健康食品は、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むことを特徴とする。この分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物は、本発明のインスリン非依存性糖尿病治療剤に用いられるケフィア抽出物と同じであり、上述と同様の方法により好適に製造できる。本発明は、この分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む健康食品についても提供するものであり、この本発明の健康食品によってもインスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）の改善または予防の効果が期待できる。本発明の健康食品は、上述のようにして得られた分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を粉末状または液体状で含有する。健康食品としては、従来公知の適宜の健康食品が揚げられ、特に制限されるものではない。

以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実験例１＞
〔１〕クロロホルム：メタノール処理によるケフィア中の成分変化の検討
（１）分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物の調製
１００ｍｌのヨーグルト状のケフィア発酵乳液（日本ケフィア株式会社より提供）を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清より不純物を取り除くために同容量のエタノールを添加してエタノール沈殿を行った。その後、３，５００×ｇで３０分間遠心分離を行い、エタノール沈殿処理により生じた沈殿を除去して得られた上清をケフィア水溶性画分として得た。このケフィア水溶性画分を排出限界分子量１４０００Ｄａの透析膜を用いて、ケフィア上清５０ｍｌあたり、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１Ｌにて終夜４℃で透析を行った。透析で得られた分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む溶液を凍結乾燥し、ケフィア水溶性画分５０ｍｌ分の粉末／１０ｍｌ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水の割合に溶解し、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル１）を調製した。

（２）クロロホルム：メタノール処理したケフィア抽出物の調製
上記で得られたケフィア水溶性画分に同容量のクロロホルム：メタノール（２：１）を添加し、クロロホルム：メタノール処理を行った。その後、３，０００×ｇで３０分間遠心分離を行い、上層の水層の回収を行った。水層を排出限界分子量１４０００Ｄａの透析膜を用いて、水層５０ｍｌ／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１Ｌの割合で終夜４℃で透析を行った。透析で得られた分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む溶液を凍結乾燥により濃縮した後、クロロホルム：メタノール沈殿処理前のケフィア水溶性画分と同容量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加し溶解させて、クロロホルム：メタノール処理した分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル２）を調製した。

〔２〕グルコース取り込み増強活性成分に関する検討
（１）マウス由来前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１の培養
脂肪細胞の一例としてマウス由来前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１（ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）より入手）を用いた。細胞培養には、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。また、脂肪細胞への分化誘導試薬として１−メチル−３−イソブチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）およびインスリンを使用した。

まず、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を１０％ウシ胎仔血清添加ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）培地で培養し、セミコンフルエントに達した後２４穴プレートに１穴当たり１．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を１ｍｌずつ播種した。コンフルエントに達するまで１−２日間培養後、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ、０．２５μｌ ＤＥＸ、１０μｇ／ｍｌ インスリン添加培地で７２時間培養後、１０μｇ／ｍｌ インスリンのみを含む培地で４８時間培養した後に１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭのみの培地に戻すことにより分化誘導を行った。分化誘導開始後１２−１４日後の脂肪細胞（脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１）を実験に用いた。

（２）グルコース取り込み検定
上記〔１〕で調製したサンプル１，２を用いて、グルコース取り込み増強活性の検討を行った。まず、上述のようにして分化誘導させた脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を１時間無血清培養した後、サンプル１，２を添加した各培地で４時間培養後、１００ｎＭ インスリン刺激を２０分間行った。グルコース取り込み検定は、トリチウム標識２−デオキシ−Ｄ−〔１−³Ｈ〕グルコースを細胞に取り込ませ、細胞を溶解し、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。またコントロールとして、サンプル１，２を添加しない以外は同様にした場合についてもグルコース取り込み検定を行った。

図１は、サンプル１，２およびコントロールについてグルコース取り込み検定を行った結果を示すグラフである。図１において、縦軸はコントロールのグルコース取り込み量を１とした場合の相対グルコース取り込み量を示している。図１より、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物は、クロロホルム：メタノール処理を行った場合（サンプル２）であっても、未処理の場合（サンプル１）と同程度の活性を示すことが分かる。

（３）タンパク質濃度および糖濃度の定量
サンプル１，２について、タンパク質濃度をローリー法、糖濃度をフェノール硫酸法によって定量した。図２（ａ）は、サンプル１、２のタンパク質濃度を定量した結果を示すグラフであり、図２（ｂ）はサンプル１，２の糖濃度を定量した結果を示すグラフである。図２（ａ）における縦軸はタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、また図２（ｂ）における縦軸は糖濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。図２から分かるように、クロロホルム：メタノール処理された場合（サンプル２）では、タンパク質量は１５％以下に減少しているにもかかわらず、糖濃度は未処理の場合（サンプル１）とほぼ同程度であることが確認された。

（４）イオン交換クロマトグラフィによるグルコース取り込み増強活性成分の検討
グルコース取り込み増強活性成分のイオン性を明らかにするために、サンプル１について、イオン交換クロマトグラフィを行った。図３（ａ）はサンプル１についての陽イオン交換クロマトグラフィの結果を示すグラフであり、図３（ｂ）はサンプル１についての陰イオン交換クロマトグラフィの結果を示すグラフである。図３（ａ），（ｂ）において、図中左側の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度、図中右側の縦軸はＮａＣｌのモル濃度（Ｍ）、横軸は時間（分）である。また図３（ａ），（ｂ）において、実線は２８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ示し、破線はＮａＣｌのモル濃度をそれぞれ示している。

まず、陽イオン交換カラムトヨパール−ＳＰ ６５０Ｍ（東ソー社製）を用い、サンプル１について陽イオン交換クロマトグラフィを行った。サンプル１を、トヨパール−ＳＰ ６５０Ｍに供し、０−１Ｍ ＮａＣｌによるグラジエントをかけ、溶出を行った。結果、全成分がカラムに吸着されなかった（図３（ａ））。

また、陰イオン交換カラムトヨパール−ＤＥＡＥ ６５０Ｍ（東ソー社製）を用い、サンプル１を用いて陰イオン交換クロマトグラフィを行った。サンプル１を、トヨパール−ＤＥＡＥ ６５０Ｍに供し、０−１Ｍ ＮａＣｌによるグラジエントをかけて溶出を行った。結果、２つの画分（画分１，２）が分取された（図３（ｂ））。

得られた画分１，２を排出限界分子量１４０００Ｄａの透析膜を用いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で終夜４℃での透析を行った。透析後、凍結乾燥により濃縮を行い、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解して、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む画分１，２を調製した。

サンプル１および画分１，２を用いて、上述と同様にしてグルコース取り込み検定を行った。またコントロールとして、サンプル１および画分１，２を添加しない以外は同様にした場合についてもグルコース取り込み検定を行った。図４は、サンプル１、画分１，２およびコントロールについてグルコース取り込み検定を行った結果を示すグラフである。図４において、縦軸はコントロールのグルコース取り込み量を１とした場合の相対グルコース取り込み量を示している。図４に示すように、画分１では高いグルコース取り込み増強活性が確認されたが、画分２ではグルコース取り込み増強活性は確認されなかった。

（５）ゲルろ過クロマトグラフィによるグルコース取り込み増強活性成分の検討
グルコース取り込み増強活性成分の単離を行うために、トヨパールＨＷ−５５Ｆ（東ソー社製）を用い、サンプル１についてゲルろ過クロマトグラフィを行った。図５は、サンプル１についてのゲルろ過クロマトグラフィの結果を示すグラフであり、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度、横軸は時間（分）である。図５から分かるように、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル１から、８つの画分（ゲルろ過画分１〜８）が分取された。

この画分１−８を排出限界分子量１４０００Ｄａの透析膜を用いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で終夜４℃での透析を行った。透析後、凍結乾燥により濃縮を行い、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解して、分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むゲルろ過画分１〜８を調製した。

サンプル１およびゲルろ過画分１〜８を用いて、上述と同様にしてグルコース取り込み検定を行った。またコントロールとして、サンプル１およびゲルろ過画分１〜８を添加しない以外は同様にした場合についてもグルコース取り込み検定を行った。図６は、サンプル１、ゲルろ過画分１〜８およびコントロールについてグルコース取り込み検定を行った結果を示すグラフである。図６において、縦軸はコントロールのグルコース取り込み量を１とした場合の相対グルコース取り込み量を示している。図６に示すようにゲルろ過画分については、ゲルろ過画分３，４のみグルコース取り込み増強活性が確認された。

また、分子量既知の標準物質を用い、上述したようにグルコース取り込み増強活性が確認されたゲルろ過画分３，４について、ＨＷ−５５Ｆカラムによる液体クロマトグラフィにより分子量の測定を行った。図７は、ゲルろ過画分３，４について分子量を測定した結果を示すグラフであり、縦軸は分子量、横軸は溶出時間（分）である。また、表１には、標準物質として用いたアルブミン、オバルブミン、キモトリプシノゲンＡ、リボヌクレアーゼＡおよびインスリンの分子量および溶出時間と、ゲルろ過画分３，４とについての溶出時間と推定された分子量を示している。図７および表１に示されるように、グルコース取り込み増強活性成分の分子量は、ゲルろ過画分３が約３１ｋＤａ、ゲルろ過画分４が約１９ｋＤａと推定された。

＜実験例２＞
〔１〕ケフィアの脂肪細胞分化抑制効果の検討
（１）細胞染色によるケフィアの細胞内脂肪蓄積抑制効果の検討
脂肪細胞分化における細胞内脂肪蓄積を調べるため、細胞内脂肪滴のオイルレッド（oil red O）染色を行った。まず、前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１をＰＢＳで２回洗浄した後、１０％中性ホルマリンで室温（２５℃）にて１０分間固定した。固定後ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を６０％ ２−プロパノールに１分間置換した後、オイルレッド染色液（１．８ｍｇ／ｍｌ ６０％ ２−プロパノール）で１５分間、室温で染色を行った。染色後、６０％ ２−プロパノールで１回、ＰＢＳで２回洗浄した。染色したオイルレッド色素を抽出するために、４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０／２−プロパノール１ｍｌを添加し、１５分間室温にて色素を抽出して溶液を回収し、溶出液の４９０ｎｍにおける吸光度を測定し定量化を行った。

１００ｍｌのヨーグルト状のケフィア発酵乳液（日本ケフィア株式会社より提供）を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清に同容量のエタノールを添加してエタノール沈殿を行った。その後、３，５００×ｇで３０分間遠心分離を行い、エタノール沈殿処理により生じた沈殿を除去して得られた上清をケフィア水溶性画分として得た。このケフィア水溶性画分を凍結乾燥した後、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水に溶解させてケフィア１０倍濃縮サンプル（サンプル３）、５０倍濃縮サンプル（サンプル４）をそれぞれ調製した。なお、このＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した量が、調製開始時のヨーグルト状のケフィア発酵乳液量と比較して何倍に濃縮したかを計算し、サンプル濃縮の値（×倍濃縮サンプル）とした（たとえば、ケフィア発酵乳液５０ｍｌを用いてサンプル調製を始めた場合、凍結乾燥したものを１０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解したとき、５倍濃縮サンプルとする）。

分化誘導期間中、分化誘導試薬（ＩＢＭＸ、ＤＥＸ、インスリン）の他、上述のようにして調製したサンプル３またはサンプル４を培地に対して１０％の割合で添加した（サンプル３，４の終濃度はそれぞれ１倍、１０倍濃度）。またコントロールとして、ＰＢＳを培地に対して１０％の割合で添加した。分化試薬添加開始日を０日目とし、分化試薬添加直後から３日後、５日後、７日後、１０日後の変化を経時的に調べた。

図８は、サンプル３，４およびコントロールについての細胞染色によるケフィアの細胞内脂肪蓄積抑制効果の検討結果を示すグラフであり、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度、横軸は分化時間（日）である。図８に示されるように、コントロールの細胞は分化が進むに従って、細胞内脂肪の蓄積が認められたのに対し、サンプル３，４を添加した細胞では分化誘導開始後５日目、１０日目において、細胞内脂肪蓄積の抑制が認められた。

（２）グリセロール−３リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性測定によるケフィアの脂肪細胞分化抑制効果の検討
ケフィアの脂肪細胞分化抑制効果を検討するために、脂肪細胞分化に伴い活性が増加するグリセロール−３リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）の活性を測定した。前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を用い、上述と同様に分化誘導試薬の他、サンプル３，４を培地に対して１０％の割合で添加して分化誘導させた。またコントロールとして、ＰＢＳを培地に対して１０％の割合で添加した。ＧＰＤＨ活性測定は分化開始から、３日目、５日目、７日目、１０日目の各日に行い、細胞内脂肪合成活性を経時的に評価した。ＧＰＤＨ活性測定に際しては、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＧＰＤＨ活性キット（株式会社ホクドー社製）の酵素抽出試薬を加え、室温で１０分間反応させた後、超音波処理にて細胞破砕液を作製し、１２，８００×ｇ、４℃で５分間遠心し、得られた上清を用いた。ＧＰＤＨ活性測定には、ＧＰＤＨ活性測定キットを用い、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨ吸光度の変化を測定した。

図９は、サンプル３，４およびコントロールについてのＧＰＤＨ活性測定によるケフィアの脂肪細胞分化抑制効果の検討結果を示すグラフであり、縦軸はＧＰＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）、横軸は分化時間（日）である。図９に示されるように、サンプル３，４を添加した細胞では、脂肪細胞分化に伴い増加する活性を分化開始３日目から低下させた。特に、５０倍濃縮の場合（サンプル４）の添加では、顕著にＧＰＤＨ活性の低下が認められた。

〔２〕ケフィアによる脂肪細胞分化関連分子の挙動
（１）脂肪細胞分化関連分子のｍＲＮＡ発現量変化の検討
Ｃ／ＥＢＰ（ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク：CAAT/enhancer binding protein）ファミリー（Ｃ／ＥＢＰα、β、δ）とＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター：peroxisome proliferator-activated receptor）ファミリーのγ−アイソフォーム（ＰＰＡＲγ₁とＰＰＡＲγ₂）は脂肪細胞分化抑制に重要な役割を果たす。そこで、これら転写因子の発現にケフィアがどのように作用するかをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。また、脂肪細胞マーカー（adipocyte marker）として、ａＰ２（脂肪酸結合タンパク：fatty-acid binding protein）、およびＬＰＬ（リポタンパクリパーゼ：lipoprotein lipase）についても、同様に調べた。これらは、ＰＰＡＲγをコードする遺伝子の下流の配列にコードされた酵素である。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）は実験の内部標準として使用した。使用したプライマー、ＰＣＲのアニーリング温度、サイクル数などの反応条件を表２に示す。

サンプルとしては、上述したオイルレッド染色およびＧＰＤＨ活性測定において顕著な脂肪細胞分化抑制効果が認められた５０倍濃縮の場合（サンプル４）のみを用いて、ケフィア処理を行った。まず、前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を用い、上述と同様に分化誘導試薬の他、サンプル４を培地に対して１０％の割合で添加して分化誘導させた。コントロールとして、分化誘導試薬のみを添加した場合についても同様にして分化誘導させた。分化試薬添加開始日を０日目とし、分化試薬添加開始から３日目、５日目、７日目、１０日目に細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、脂肪細胞分化関連分子のｍＲＮＡ発現量変化を調べた。

図１０，１１は、各脂肪細胞分化関連分子の経時的なｍＲＮＡ発現量変化の結果を示すゲル電気泳動写真である。図１０は、Ｃ／ＥＢＰα，β，δ、ＰＰＡＲγ，γ１，γ２およびＧＡＰＤＨについての結果を示しており、また図１１は、ａＰ２、ＬＰＬおよびＧＡＰＤＨについての結果を示している。図１０，１１において横軸は分化日数（日）であり、−で示されたレーンはケフィア処理を施さなかった場合、＋で示されたレーンはケフィア処理を施した場合である。図１０，１１に示されるように、サンプル４を添加することによるケフィア処理によって、ＰＰＡＲγ、ＬＰＬは分化３日目から、Ｃ／ＥＢＰα、ａＰ２は分化５日目からｍＲＮＡ発現量低下が認められた。一方、Ｃ／ＥＢＰβ，δのｍＲＮＡ発現量の低下は特に見られなかった。

次に、ｍＲＮＡ発現量の低下が特に見られなかったＣ／ＥＢＰβ，δについて、分化開始直後、２、４、８、１２時間後に細胞を回収し同様にＲＴ−ＰＣＲを行った以外は、上述と同様にしてｍＲＮＡ発現量変化を調べた。図１２は、Ｃ／ＥＢＰβ，δの経時的なｍＲＮＡ発現量変化の結果を示すゲル電気泳動写真である。図１２において横軸は分化時間（時間）であり、−で示されたレーンはサンプル４を添加しなかった場合、＋で示されたレーンはサンプル４を添加した場合である。図１２に示されるように、分化誘導初期においては、ケフィア処理によるｍＲＮＡ発現量の低下は見られなかった。

（２）タンパク質発現量変化の検討
ケフィア処理によってｍＲＮＡレベルで有意な発現量低下を示したＰＰＡＲγについて、タンパク質レベルでの発現量の変化をウェスタンブロッティングによって検討した。まず、前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を用い、上述と同様に分化誘導試薬の他、サンプル４を培地に対して１０％の割合で添加して分化誘導させた。コントロールとして、分化誘導試薬のみを添加した場合についても同様にして分化誘導させた。ウェスタンブロッティングは分化開始から３日目、５日目、７日目、１０日目の各日に行った。細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、一次抗体として、抗ＰＰＡＲγ抗体（Ｈ−１００：ｓｃ−７１９６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎｃ製、２００倍希釈）にて処理を行い、二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス社製、４０００倍希釈）、検出にＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）で化学発光させ、ＬＡＳ−１０００（フジフィルム社製）により検出を行った。図１３は、ＰＰＡＲγの経時的なタンパク質発現量変化の結果を示すウェスタンブロッティングである。図１３において横軸は分化日数（日）であり、−で示されたレーンはサンプル４を添加しなかった場合、＋で示されたレーンはサンプル４を添加した場合である。図１３に示されるように、ケフィア処理後５日目に、脂肪細胞特異的に発現するＰＰＡＲγ２の発現低下が認められた。

また、ケフィア処理によるＰＰＡＲγ発現低下にＳｉｒｔ１の現象が関与しているかを検討した。Ｓｉｒｔ１は、ＰＰＡＲγをコードする遺伝子の上流にコードされており、延命因子とも呼ばれる。一次抗体として抗Ｓｉｒｔ１抗体（Ｈ−３００：ｓｃ−１５４０４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎｃ製、４００倍希釈）を用いたこと以外は上述と同様にして、Ｓｉｒｔ１についてもタンパク質レベルでの発現量の変化をウェスタンブロッティングによって検討した。図１４は、Ｓｉｒｔ１の経時的なタンパク質発現量変化の結果を示すウェスタンブロッティングである。図１４において横軸は分化日数（日）であり、−で示されたレーンはサンプル４を添加しなかった場合、＋で示されたレーンはサンプル４を添加した場合である。図１４に示されるように、ケフィア処理１日目、２日目にＳｉｒｔ１の発現増加が認められた。

〔３〕ケフィアの脂肪細胞内脂肪への影響の検討
（１）ケフィアの脂肪細胞内脂肪の減少効果の検討
０．５倍濃度のケフィア水溶性画分のサンプル（サンプル５）および０．０１倍濃度のケフィア脂溶性画分のサンプル（サンプル６）を用いて、ケフィアの脂肪細胞内脂肪に与える効果を検討した。ケフィア水溶性画分のサンプルであるサンプル５は、０．５倍濃度とした以外は上述したサンプル３，４と同様に調製した。ケフィア脂溶性画分のサンプルであるサンプル６については、まず、１００ｍｌのヨーグルト状のケフィア発酵乳液（日本ケフィア株式会社より提供）を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた沈殿物に５倍容のクロロホルム−メタノール（２：１）を加えて１時間攪拌した。１５，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。沈殿物に５倍容のクロロホルム−メタノールを加え、上記の工程を繰り返した。回収した上清をエバポレータによって減圧濃縮し、乾燥物を得た。この乾燥物の１／１００量をＤＭＳＯ１ｍｌに溶解したものをケフィア脂溶性画分１倍液とした。

まず、分化誘導後の脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を上述と同様にしてオイルレッド染色を行った後、サンプル５またはサンプル６を用いてケフィア処理を４日間行った。その後、脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１をＰＢＳで２回洗浄した後、１０％中性ホルマリンで室温（２５℃）にて１０分間固定した。固定後ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を６０％ ２−プロパノールに１分間置換した後、オイルレッド染色液（１．８ｍｇ／ｍｌ ６０％ ２−プロパノール）で１５分間、室温で染色を行った。染色後、６０％ ２−プロパノールで１回、ＰＢＳで２回洗浄した。染色したオイルレッド色素を抽出するために、４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０／２−プロパノール１ｍｌを添加し、１５分間室温にて色素を抽出して溶液を回収し、４９０ｎｍにおける吸光度を観察することによって、脂肪細胞内の脂肪量を測定した。また、ケフィア処理を行わなかった以外は同様にしたものをコントロールとした。図１５は、サンプル５，６を用いてケフィア処理を行った場合およびコントロールについての細胞内脂肪の測定結果を示すグラフであり、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を示している。図１５に示されるように、ケフィア水溶性画分を用いたサンプル（サンプル５）において、細胞内脂肪の減少が認められた。

（２）ケフィアの脂肪細胞内の脂肪分解促進作用の検討
ケフィアが脂肪分解に与える効果を検討するため、脂肪分解に伴い培地中に放出されるグリセロール量をＡｄｉｐｏｌｙｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ製）を用いて行った。分化誘導後の脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１に２４時間ケフィア処理を行った後、培地を除き、１００μｌのＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄した。ケフィア処理には、１倍濃度とした以外は上述したサンプル３，４と同様に調製したケフィア水溶性画分のサンプル（サンプル７）または０．０１倍濃度のケフィア脂溶性画分のサンプルである上述のサンプル６に、１０％ＦＢＳを添加したものを用いた。２４時間のケフィア処理後、溶液を除き、Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＋２％ ＢＳＡ中に０．２５ｍｌ／穴加え、３時間インキュベートした。グリセロールフリーコンテナ中に細胞上清を集めた。グリセロール標準液（０．４μｇ／ｍｌ−２６μｇ／ｍｌ）と培養上清２５μｌを９６ウェルプレートに分注し、Ｆｒｅｅ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｒｅｇｅｎｔを２００μｌずつ加えた。室温で１５分インキュベートし、５４０ｎｍの吸光度を測定し、グリセロール量の測定を行った。また、ケフィア処理に換えて、１０％ＦＢＳのみを添加したこと以外は同様にした場合をコントロールとした。

図１６は、サンプル７，６およびコントロールについて測定されたグリセロール量を示すグラフであり、縦軸はグリセロール量（μｇ／ｍｌ）を示している。図１６に示されるようにケフィア水溶性画分のサンプル（サンプル７）でケフィア処理を行った場合の脂肪細胞は、コントロールと比較して培地中に５倍量のグリセロールを放出していることが認められた。この結果より、ケフィアの水溶性画分で処理された脂肪細胞では中性脂肪を分解し、細胞内脂肪蓄積が減少していると考えられた。

〔４〕ケフィアによるアディポネクチン発現量への影響の検討
アディポネクチンは脂肪細胞から分泌される代表的なインスリン感受性アディポサイトカインである。アディポネクチンの血中濃度は肥満者において低下し、内臓脂肪の蓄積とともに血中濃度が低下する。アディポネクチンは多くの臓器でエネルギー代謝を正常に働かせる重要な役割を担っている。そこでケフィア処理後のマウスアディポネクチンの発現量をリアルタイムにＲＴ−ＰＣＲにより調べた。

まず、前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を６０ｍｍ ｄｉｓｈに５．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／５ｍｌになるように播種し、分化誘導させた後、２時間または６時間のケフィア処理を行った。ケフィア処理には、０．５倍濃縮のケフィア水溶性画分のサンプル（サンプル５）または０．０１倍濃縮のケフィア脂溶性画分のサンプル（サンプル６）を用いた。ケフィア処理後、全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した後、ＳＹＢＥＲ ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、使用したプライマーは表３に示した。また、ケフィア処理を行わなかったこと以外は同様にして、コントロールとした。図１７は、サンプル５，６で２時間のケフィア処理を行った場合およびコントロールについてのアディポネクチン発現量の測定結果を示すグラフであり、縦軸はコントロールのアディポネクチン発現量を１とした場合の相対アディポネクチン発現量を示している。図１７に示されるように、ケフィア水溶性画分、ケフィア脂溶性画分のいずれを用いて２時間のケフィア処理を行った場合であっても、アディポネクチンの発現量の増加が認められた。

また、Ｈ₂Ｏ₂処理によりアディポネクチン発現量を低下させても改善できるか否か検討した。０．５ｍＭ Ｈ₂Ｏ₂を用いた処理を２時間行ったこと以外は、上述と同様にしてサンプル５，６を用いてアディポネクチンの発現量を測定した。また、ケフィア処理を行わず、Ｈ₂Ｏ₂処理を行った場合、行わなかった場合それぞれをコントロールとした。図１８は、サンプル５，６で２時間のケフィア処理およびＨ₂Ｏ₂処理を行った場合ならびにコントロールについてのアディポネクチン発現量の測定結果を示すグラフであり、縦軸はコントロールのアディポネクチン発現量を１とした場合の相対アディポネクチン発現量を示している。また、図１８中、（−）はＨ₂Ｏ₂処理を行わなかった場合、（＋）はＨ₂Ｏ₂処理を行った場合をそれぞれ示している。図１８に示されるように、Ｈ₂Ｏ₂処理によりアディポネクチン発現が低下している状態でもアディポネクチンの発現回復が認められた。

これらの結果から、脂肪細胞においてケフィアがアディポネクチンの発現量増強を介して脂肪細胞の機能を改善する可能性が示唆された。

〔５〕ケフィアの筋管細胞におけるβ酸化の増強効果の検討
アディポネクチンは骨格筋で脂肪酸の燃焼やエネルギー消費を促進し、中性脂肪含量を減少させる。ケフィアが骨格筋細胞におけるエネルギー代謝活性、特に脂肪酸燃焼に及ぼす効果を調べるため、パルミチン酸のβ酸化を測定した。脂肪酸のβ酸化は¹⁴Ｃ−パルミチン酸を添加し、代謝され生じた¹⁴ＣＯ₂量を測定することにより評価した。

（１）マウス骨格筋由来筋由来筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２の培養
骨格筋細胞の一例としてマウス骨格筋由来筋由来筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を使用した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で培養し、コンフルエントに達するまで１日間培養後、非働化した馬血清を２％含む培地に交換することにより筋管細胞への分化誘導を行い、分化誘導開始から４−１０日目の細胞を用いた。

（２）ケフィアのβ酸化促進効果の検討
Ｃ２Ｃ１２細胞を２５ｍｌ容Ｔ−フラスコ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に４×１０⁵ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ播種し、分化誘導後の細胞を用いた。０．５倍濃縮のケフィア水溶性画分のサンプル（サンプル５）または０．０１倍濃縮のケフィア脂溶性画分のサンプル（サンプル６）を用いて２４時間のケフィア処理を行った後、グルコースフリーのＤＭＥＭで１時間プレインキュベートした。８０μＭ Ｐａｌｍｉｔａｔｅ（１−¹⁴Ｃ Ｐａｌｍｉｔａｔｅ、０．２μＣｉ／ｍｌ）（第一化学薬品株式会社製）、３２０μＭ 脂肪酸フリーウシ血清アルブミンを加え、３０分インキュベートした後、培地を５０ｍｌ容遠沈管に移した。２ｍｌ容チューブにＨｙａｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ １０−Ｘ（パーキンエルマージャパン社製）５００μｌを入れ、培地の入った５０ｍｌ遠沈管に培地がチューブ内に侵入しないように注意しながら入れた。次に、培地からＣＯ₂を放出させるため、１０％か塩素酸を培地に添加し、３０分インキュベートし、Ｈｙａｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ １０−Ｘ中にＣＯ₂を捕集した。Ｈｙａｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ １０−Ｘの２５０μｌを回収し、液体シンチレーションカクテル１ｍｌを加え、液体シンチレーションカウンターで¹⁴Ｃの放射能測定を行った。また、ケフィア処理を行わなかった以外は同様にしたものをコントロールとした。

図１９は、サンプル５，６を用いてケフィア処理を行った場合およびコントロールについての¹⁴ＣＯ₂産生量の測定結果を示すグラフであり、縦軸はコントロールの¹⁴ＣＯ₂産生量を１とした場合の相対¹⁴ＣＯ₂産生量を示している。図１９に示されるように、ケフィア水溶性画分、ケフィア脂溶性画分のいずれを用いてケフィア処理を行った場合であっても、¹⁴ＣＯ₂量が増加し、エネルギー代謝が亢進していることが示唆された。

（３）ケフィアによるＰＰＡＲδの発現量の変化
ケフィアの脂肪酸β酸化促進効果はどのようなメカニズムで起こっているかを調べるため、ＰＰＡＲδの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより調べた。骨格筋において飢餓時に誘導される遺伝子群はＰＰＡＲδの活性化に伴い誘導される代謝関連遺伝子と重複する。ＰＰＡＲδの刺激はたとえば飽食下であっても脂肪蓄積ではなく燃焼・消費し、蓄積された脂肪を消費すると考えられた。

上述したように分化誘導させたＣ２Ｃ１２細胞について、０．５倍濃縮のケフィア水溶性画分のサンプル（サンプル５）または０．０１倍濃縮のケフィア脂溶性画分のサンプル（サンプル６）を用いて２時間または６時間のケフィア処理を行った後、全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した後、ＳＹＢＥＲ ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、使用したプライマーは表３に示した。また、ケフィア処理を行わなかったこと以外は同様にして、コントロールとした。

図２０は、サンプル５、６で２時間または６時間のケフィア処理を行った場合およびコントロールについてのＰＰＡＲδ発現量の測定結果を示すグラフであり、縦軸はコントロールのＰＰＡＲδ発現量を１とした場合の相対ＰＰＡＲδ発現量を示している。図２０に示されるように、ケフィア脂溶性画分を用いた場合（サンプル６）には、２時間処理でも６時間処理でもＰＰＡＲδ発現は０．７倍程度に抑制された。また、ケフィア水溶性画分を用いた場合（サンプル５）では２時間処理において０．５倍に抑制されたが、６時間処理では同程度に発現が回復していた。このことから、ケフィアにはＰＰＡＲδの活性化を抑制し、脂肪酸燃焼に方向付ける効果があると考えられた。

＜実験例３＞
〔１〕ＨＩＴ−Ｔ１５細胞増殖に対する影響の検討
（１）ＨＩＴ−Ｔ１５細胞の培養
脾臓ランゲルハンス島β細胞の一例として、ハムスター由来脾臓β細胞株ＨＩＴ−Ｔ１５を使用した。ＨＩＴ−Ｔ１５細胞は１０％ ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。また、全ての細胞は３７℃の加湿した５％炭酸ガス大気下で培養を行った。

（２）ＨＩＴ−Ｔ１５細胞増殖に対するケフィア水溶性画分の影響
上述したようにして調製したケフィア水溶性画分を含むサンプルを、培地に対して最終濃度が１０％、２５％および５０％となるようにそれぞれ添加した場合についてのＨＩＴ−Ｔ１５細胞増殖を観察した。ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加後、３日目および６日目に細胞数計測器（Ｓｙｓｍｅｘ Ｆ−３００、東亞医用機器株式会社製）を用いて細胞数を測定した。また、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加しなかったこと以外は同様にしたものをコントロールとした。図２１は、最終濃度１０％、２５％、５０％となるようにケフィア水溶性画分を添加した場合およびコントロールについての経時的な細胞数を示すグラフであり、縦軸は細胞数（×１０^-5ｃｅｌｌｓ）、横軸は時間（日）を示している。図２１に示されるように、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを培地に対して２５％、５０％添加した場合には、コントロールと比較してＨＩＴ−Ｔ１５細胞増殖を抑制した。一方、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを培地に対して１０％添加した場合に関しては、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。

〔２〕アロキサン毒性に対する細胞保護効果の検討
（１）ＨＩＴ−Ｔ１５細胞生存率に対するアロキサンの効果
アロキサンは膵β細胞に特異的に毒性を及ぼす。アロキサン毒性に対する膵β細胞の感受性は、細胞株ごとで異なっている。そのため、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞に対するアロキサンの細胞毒性を調べた。アロキサンの添加濃度を０．０５ｍＭから５ｍＭまで変えて、アロキサン処理を１時間行い、培地を交換し、２４時間後におけるＨＩＴ−Ｔ１５細胞の生存率を評価した。またアロキサンを添加したかったこと以外は同様にした場合をコントロールとした。図２２は、各濃度でアロキサンを添加した場合およびコントロールについてのＨＩＴ−Ｔ１５細胞の生存率の測定結果を示すグラフであり、縦軸は細胞生存率（％）を示している。図２２に示されるように、培地にアロキサンを添加することによって、アロキサンの濃度依存的にＨＩＴ−Ｔ１５細胞の生存率が減少された。たとえばアロキサン添加濃度が２．５ｍＭの場合には、コントロールと比較して５２％の細胞生存率を示した。

（２）アロキサン毒性に対するケフィア水溶性画分の細胞保護効果
アロキサンにより誘導されるＨＩＴ−Ｔ１５細胞生存率の減少に対するケフィア水溶性画分の効果を調べた。ケフィア水溶性画分を含むサンプルとしては、次のようにして分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）および分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）を調製して用いた。まず、１００ｍｌのヨーグルト状のケフィア発酵乳液（日本ケフィア株式会社より提供）を１００００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清を排出限界分子量１０００Ｄａの透析膜を用いて、ケフィア上清１００ｍｌあたり、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水３Ｌの割合とし、終夜４℃で透析を行った。透析外液である分子量１０００Ｄａ未満の溶液は、減圧濃縮を行い、凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水に溶解して分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）とした。また透析内液はそのまま凍結乾燥した後、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水に溶解して分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）とした。さらに、透析を行う前の上清も、ケフィア水溶性を含むサンプル（サンプル１０）として用いた。ＨＩＴ−Ｔ１５細胞に２．５ｍＭの濃度でアロキサンを添加し、さらにサンプル８、サンプル９またはサンプル１０を最終濃度が１０％となるように培地に添加した後、細胞生存率を測定した。また、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加しなかった場合、アロキサンを添加しなかった場合をコントロールとした。

図２３は、ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定された細胞生存率を示すグラフであり、縦軸は細胞生存率（％）を示している。図２３中、−，＋はそれぞれアロキサンの非存在下、存在下の場合を示している。図２３に示されるように、透析前の上清（サンプル１０）および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）が、アロキサン誘導細胞毒性からＨＩＴ−Ｔ１５細胞を強く保護した。また、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）も弱い保護効果を示した。細胞生存率は、コントロールで３５．７％、透析前の上清（サンプル１０）で５２．８％、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）で８４．６％、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）で４５．５％であった。

〔３〕インスリン放出量に対する効果の検討
ＨＩＴ−Ｔ１５細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌで２４穴プレートに播種し、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加した培地中で２４時間前培養した。ケフィア水溶性画分を含むサンプルとしては、上述と同様、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）および透析前の上清（サンプル１０）を用い、最終濃度が１０％となるように培地に添加した。その後、２．５ｍＭアロキサンを含むＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＫＲＢ）液、またはアロキサンを含まないＫＲＢ液で洗浄後、１５ｍＭのグルコースを含むＫＲＢ液で１時間、３７℃でグルコース刺激を行った。上清を回収し、Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによりインスリン放出量を測定した。また、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加しなかったこと以外は同様にした場合をコントロールとした。

図２４は、ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定されたインスリン放出量を示すグラフであり、縦軸はインスリン放出量（ｐｇ／ｍｌ）を示している。図２４中、−，＋はそれぞれアロキサンの非存在下、存在下の場合を示している。

図２４に示されるように、アロキサンを添加しなかった場合、透析前の上清（サンプル１０）および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）を用いた場合では、グルコース刺激インスリン放出が促進された。この場合、インスリンの放出量は、コントロールで２６６．８ｐｇ／ｍｌ、透析前の上清（サンプル１０）で５８６．８ｐｇ／ｍｌ、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）で７６３．５ｐｇ／ｍｌ、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）で２８９．６ｐｇ／ｍｌであった。

また２．５ｍＭのアロキサンを添加した場合、アロキサンの毒性により、インスリンの放出量は減少したが、透析前の上清（サンプル１０）および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）は低下したグルコース刺激インスリン放出を回復させていた。この場合、インスリンの放出量は、コントロールで１８７．５ｐｇ／ｍｌ、透析前の上清（サンプル１０）で３２８．４ｐｇ／ｍｌ、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）で３６６．８ｐｇ／ｍｌ、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）で１９７．５ｐｇ／ｍｌであった。

〔４〕細胞内ＡＴＰ量に対する効果の検討
ＨＩＴ−Ｔ１５細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌで６穴プレートに播種し、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加した培地中で２４時間前培養した。ケフィア水溶性画分を含むサンプルとしては、上述と同様、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）および透析前の上清（サンプル１０）を用い、最終濃度が１０％となるように培地に添加した。その後、２．５ｍＭアロキサンを含むＫＲＢ液、またはアロキサンを含まないＫＲＢ液で３０分間、３７℃で処理した。ＫＲＢ液で洗浄後、１５ｍＭのグルコースを含むＫＲＢ液で３７℃、１時間処理し、グルコース刺激を行った。刺激後、トリプシンで細胞を回収し、洗浄後、遠心（２００×ｇ、５分間）し、上清を捨てた。４×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度になるよう１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）を加え、懸濁した。沸騰水中で２分間インキュベートし、遠心（６００×ｇ、５分間）し、上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。サンプルを５０μｌとり、ルシフェラーゼ溶液５０μｌと混合し、素早くルミノメーター（Ａｌｏｋａ製、ｔｙｐｅ ＢＬＲ−３０１）で測定した。また、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加しなかったこと以外は同様にした場合をコントロールとした。

図２５は、ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定された細胞内ＡＴＰ量を示すグラフであり、縦軸は細胞内ＡＴＰ量（％）を示している。図２５中、−，＋はそれぞれアロキサンの非存在下、存在下の場合を示している。図２５に示されるように、アロキサンを添加しなかった場合、コントロールとケフィア水溶性画分を含むサンプル添加した場合（サンプル８〜１０）との間に有意な差は確認されなかった。一方、２．５ｍＭのアロキサンを添加した場合、アロキサン毒性により細胞内ＡＴＰ量は減少したが、透析前の上清（サンプル１０）および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）を添加した場合には細胞内ＡＴＰ量の減少が抑制された。アロキサンを添加した場合の細胞内ＡＴＰ量は、コントロールで４７．５％、透析前の上清（サンプル１０）で６０．６％、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）で７２．０％、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）で５２．５％であった。

〔５〕細胞内酸化還元状態に対する効果の検討
フリーラジカルは、膵β細胞におけるアロキサンの細胞毒性に関与しているとされている。そこで、アロキサンで処理したＨＩＴ−Ｔ１５細胞の細胞内酸化還元状態を、ＲＯＳ感受性プローブであるＤＣＦＨ−ＤＡを用いて調べた。方法としては、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞５×１０⁶ｃｅｌｌｓを６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加したＨＢＳＳ溶液で２４時間培養した。ケフィア水溶性画分を含むサンプルとしては、上述と同様、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）および透析前の上清（サンプル１０）を用い、最終濃度が１０％となるように添加した。サンプル処理後、２．５ｍＭアロキサンを含むＨＢＳＳ溶液、またはアロキサンを含まないＨＢＳＳ溶液で３０分間、３７℃で処理した。上清を捨て、ＰＢＳ（−）で洗浄後、５μＭ ＤＣＦＨ−ＤＡを含むＣａ²⁺、Ｍｇ²⁺−ｆｒｅｅ ＨＢＳＳ溶液で１５分間、３７℃でインキュベートした。トリプシン処理で細胞を回収し、遠心（２００×ｇ、５分間）し、上清を捨てた。Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺−ｆｒｅｅ ＨＢＳＳ溶液１ｍｌで懸濁後、ＥＰＩＣＳ ＸＬ／ＸＬ−ＭＬＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いてＤＣＦ蛍光強度のフローサイトメトリー（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ（ＦＬ１））解析を行った。ＤＣＦＨ−ＤＡは細胞に取り込まれた後、細胞内のエステラーゼで加水分解されて膜非透過性のＤＣＦＨになる。さらに、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）によって酸化され蛍光物質ＤＣＦとなるため、蛍光強度を測定することで細胞内の相対的酸化還元状態を評価できる。また、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加しなかったこと以外は同様にした場合をコントロールとした。

図２６は、ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定された細胞内ＲＯＳレベルを示すグラフであり、縦軸は細胞内ＲＯＳレベル（％）を示している。図２６中、−，＋はそれぞれアロキサンの非存在下、存在下の場合を示している。

図２６に示されるように、アロキサンを添加しなかった場合、透析前の上清（サンプル１０）および分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）の場合に、細胞内ＲＯＳレベルが有意に減少された。また、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）に関しても細胞内ＲＯＳレベルはわずかに減少していた。この場合、細胞内ＲＯＳレベルは、コントロールを１００％としたとき、透析前の上清（サンプル１０）で５４．５％、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）で４０．７％、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）で７８．８％であった。

また、２．５ｍＭのアロキサンを添加した場合についても同様の減少傾向を示した。この場合、細胞内ＲＯＳレベルは、アロキサンを添加しないコントロールを１００％としたとき、アロキサンを添加した場合のコントロールで１３３．８％、透析前の上清（サンプル１０）で１１９．６％、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）で９７．９％、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）であった。この結果よりケフィア水溶性画分はアロキサン毒性により生じた細胞内ＲＯＳを消去できることが明らかにされた。

＜実験例４＞
アロキサン誘導糖尿病マウスに対するケフィア水溶性画分の効果を検討した。この動物実験は、「九州大学大学院農学研究院、大学院生物資源環境科学府及び農学における動物実験指針」、「動物の愛護及び管理に関する法律」（昭和４８年１０月１日法律第１０５号）、「実験動物の飼養及び保管等に関する基準」（昭和５５年３月２７日総理府告示第６号）の規則に基づいて行われた。ＩＣＲマウスは日本チャールズ・リバー社から購入した。４週齢より１週間の予備飼育を経た後、５週齢時に無作為にグループ分けを行った。各グループを表４に示す。

ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加した水は、上述と同様、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル８）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプル（サンプル９）および透析前の上清（サンプル１０）を用いて、それぞれ最終濃度が１０％となるようにＭｉｌｌｉ−Ｑ水にそれぞれ添加して調製した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水およびケフィア水溶性画分を含むサンプル添加を添加した水は自由飲水させた。また餌は自由摂取させた。飼育小屋を２２−２５℃、１２時間の明暗サイクルで維持した。６匹／１ゲージとし、敷床は１週間に２回交換した。

図２７は、このアロキサン誘導糖尿病マウスに対する効果に関するプロトコールを概略的に示す図である。図２７に示すように、飼育開始後４週間経過後に、グループ３〜６のマウスについてはアロキサンを投与し、アロキサン投与後さらに２週間飼育した。アロキサンを投与するグループについては、マウスを１８時間絶食させた後、クエン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ４．０）に溶解したアロキサンを腹腔内投与（アロキサン１００ｍｇ／ｋｇ）した後、４８時間ごとに投与して合計３回の腹腔内投与を行った（計３００ｍｇ／ｋｇ）。一方、アロキサンを投与しないグループについては、クエン酸緩衝液を同様に投与した。アロキサンを投与したグループのマウスを糖尿病マウス、アロキサンを投与しなかったグループのマウスを非糖尿病マウスとした。

図２８は、各グループのマウスの平均体重の変化を経時的に示すグラフであり、左側から順に飼育開始時、飼育開始後４週間経過時、飼育開始後７週間経過時（アロキサン投与後３週間経過時）についての結果を示している。なお、図２８の縦軸は各グループのマウスの平均体重（ｇ）を示している。また図２９（ａ），（ｂ）は、各グループのマウスの経時的な餌消費量、水消費量をそれぞれ示すグラフである。なお、図２９（ａ）の縦軸は餌消費量（ｇ／日／マウス）、図２９（ｂ）の縦軸は水消費量（ｍｌ／日／マウス）を示し、図２９（ａ），（ｂ）の横軸は共に飼育期間（週）を示している。図２８および図２９から分かるように、アロキサン投与前である飼育開始後４週間経過時には、ケフィア水溶性画分を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス（グループ２、４〜６）と、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を自由飲水させたマウス（グループ１，３）との間に有意な差は見られなかった。

図２８に示されるように、アロキサン誘導糖尿病マウスのグループ（グループ３〜６）において、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を自由飲水させたマウス群（グループ３）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ６）については、アロキサン投与後の体重が、アロキサンを投与しなかったマウス群（グループ１，２）と比較して有意な減少を示した。また、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ５）に関しても、アロキサン投与によって体重は適度に減少したが、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を自由飲水させたマウス群（グループ３）と比較すると、体重の減少は阻害されていた。この結果から、ケフィア水溶性画分は、アロキサン誘導糖尿病マウスの体重減少を部分的に抑えることができることが示された。

また図２９（ａ）に示されるように、餌消費量に関しては、アロキサンを投与したマウス群（グループ３〜６）については、アロキサン投与直後に全て餌消費量が減少した。その後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を自由飲水させたマウス群（グループ３）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ６）については、餌消費量が急激に増加した。一方、透析前の上清を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ４）、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ５）に関しては、餌消費量の急激な増加を阻害しており、アロキサンを投与しなかったマウス群（グループ１，２）とほぼ同程度の餌消費量になっていた。

また、図２９（ｂ）に示されるように、水消費量に関しては、アロキサンを投与したマウス群（グループ３〜６）については、アロキサン投与直後に全て水消費量がわずかに増加していた。その後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を自由飲水させたマウス群（グループ３）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ６）については、水消費量が急激に増加した。一方、透析前の上清を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ４）、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ５）に関しては、水消費量の急激な増加は阻害されていた。

また図３０は、各グループのマウスの平均の血糖値の変化を経時的に示すグラフであり、左側から順に飼育開始時、飼育開始後４週間経過時、飼育開始後７週間経過時（アロキサン投与後３週間経過時）についての結果を示している。なお、図３０の縦軸は各グループのマウスの平均の血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示している。図３０に示されるように、アロキサン投与前である飼育開始直後、飼育開始後４週間経過時の時点では、各グループのマウスの血糖値に有意な差は見られなかった。また、アロキサンを投与したマウス群（グループ３〜６）は、飼育開始後７週間経過（アロキサン投与後３週間経過）の時点で、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を自由飲水させたマウス群（グループ３）、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ６）については、血糖値の急激な上昇が見られた。一方、透析前の上清を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ４）、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ５）に関しては、血糖値の急激な増加は阻害されていた。なお、マウスの血糖値は、デキスターＺ血糖測定器（バイエルメディカル株式会社製）により測定した。

また、図３１は、飼育開始後７週間経過時（アロキサン投与後３週間経過時）における各グループのマウスの平均の血漿インスリン量を示すグラフであり、縦軸は各グループのマウスの平均の血漿インスリン量（ｐｇ／ｍｌ）を示している。アロキサンを投与されたマウスにおいては、膵β細胞が破壊され、血漿インスリン量は急激に減少する。図３１に示されるように、アロキサンを投与しなかった場合には、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水のみを自由飲水させた場合（グループ１）と透析前の上清を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ２）との間に差は見られなかった。これに対し、アロキサンを投与した場合には、透析前の上清を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ４）、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ５）に関しては、血漿インスリン量の減少を大幅に抑制していた。また、アロキサンを投与した場合、分子量１０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ６）に関しても、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を自由飲水させたマウス群（グループ３）と比較してわずかに抑制していた。このように、アロキサン投与した場合であっても、透析前の上清を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ４）、分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むサンプルを添加した水を自由飲水させたマウス群（グループ５）においては、アロキサン誘導Ｉ型糖尿病からマウスを保護することができた。なお、血漿インスリン量は、Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔにより測定した。

今回開示された実施の形態および実験例は全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。

サンプル１，２およびコントロールについてグルコース取り込み検定を行った結果を示すグラフである。 図２（ａ）は、サンプル１、２のタンパク質濃度を定量した結果を示すグラフであり、図２（ｂ）はサンプル１，２の糖濃度を定量した結果を示すグラフである。 図３（ａ）はサンプル１についての陽イオン交換クロマトグラフィの結果を示すグラフであり、図３（ｂ）はサンプル１についての陰イオン交換クロマトグラフィの結果を示すグラフである。 サンプル１、画分１，２およびコントロールについてグルコース取り込み検定を行った結果を示すグラフである。 サンプル１についてのゲルろ過クロマトグラフィの結果を示すグラフである。 サンプル１、ゲルろ過画分１〜８およびコントロールについてグルコース取り込み検定を行った結果を示すグラフである。 ゲルろ過画分３，４について分子量を測定した結果を示すグラフである。 サンプル３，４およびコントロールについての細胞染色によるケフィアの細胞内脂肪蓄積抑制効果の検討結果を示すグラフである。 サンプル３，４およびコントロールについてのＧＰＤＨ活性測定によるケフィアの脂肪細胞分化抑制効果の検討結果を示すグラフである。 各脂肪細胞分化関連分子の経時的なｍＲＮＡ発現量変化の結果を示すゲル電気泳動写真である。 各脂肪細胞分化関連分子の経時的なｍＲＮＡ発現量変化の結果を示すゲル電気泳動写真である。 Ｃ／ＥＢＰβ，γの経時的なｍＲＮＡ発現量変化の結果を示すゲル電気泳動写真である。 ＰＰＡＲγの経時的なタンパク質発現量変化の結果を示すウェスタンブロッティングである。 Ｓｉｒｔ１の経時的なタンパク質発現量変化の結果を示すウェスタンブロッティングである。 サンプル５，６を用いてケフィア処理を行った場合およびコントロールについての細胞内脂肪の測定結果を示すグラフである。 サンプル７，６およびコントロールについて測定されたグリセロール量を示すグラフである。 サンプル５，６で２時間のケフィア処理を行った場合およびコントロールについてのアディポネクチン発現量の測定結果を示すグラフである。 サンプル５，６で２時間のケフィア処理およびＨ₂Ｏ₂処理を行った場合ならびにコントロールについてのアディポネクチン発現量の測定結果を示すグラフである。 サンプル５，６を用いてケフィア処理を行った場合およびコントロールについての¹⁴ＣＯ₂産生量の測定結果を示すグラフである。 サンプル５、６で２時間または６時間のケフィア処理を行った場合およびコントロールについてのＰＰＡＲδ発現量の測定結果を示すグラフである。 最終濃度１０％、２５％、５０％となるようにケフィア水溶性画分を添加した場合およびコントロールについての経時的な細胞数を示すグラフである。 各濃度でアロキサンを添加した場合およびコントロールについてのＨＩＴ−Ｔ１５細胞の生存率の測定結果を示すグラフである。 ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定された細胞生存率を示すグラフである。 ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定されたインスリン放出量を示すグラフである。 ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定された細胞内ＡＴＰ量を示すグラフである。 ケフィア水溶性画分についてのアロキサン毒性の存在下の場合およびコントロールの測定された細胞内ＲＯＳレベルを示すグラフである。 アロキサン誘導糖尿病マウスに対する効果に関するプロトコールを概略的に示す図である。 各グループのマウスの平均体重の変化を経時的に示すグラフであり、図中左側から順に飼育開始時、飼育開始後４週間経過時、飼育開始後７週間経過時（アロキサン投与後３週間経過時）についての結果を示している。 図２９（ａ）は、各グループのマウスの経時的な餌消費量を示すグラフであり、図２９（ｂ）は、各グループのマウスの経時的な水消費量を示すグラフである。 各グループのマウスの平均の血糖値の変化を経時的に示すグラフであり、左側から順に飼育開始時、飼育開始後４週間経過時、飼育開始後７週間経過時（アロキサン投与後３週間経過時）についての結果を示している。 飼育開始後７週間経過時（アロキサン投与後３週間経過時）における各グループのマウスの平均の血漿インスリン量を示すグラフである。

Claims (10)

1. 分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む、インスリン非依存性糖尿病治療剤。
2. ケフィアから得られた水溶性画分を用いた、インスリン依存性糖尿病治療剤。
3. 分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を含むことを特徴とする、請求項２に記載のインスリン依存性糖尿病治療剤。
4. ケフィアを用いた抗肥満剤。
5. ケフィアから得られた水溶性画分を含む、請求項４に記載の抗肥満剤。
6. 分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を含む健康食品。
7. ケフィアから上清を分離する工程と、得られた上清から分子量１４０００Ｄａ以上のケフィア抽出物を得る工程とを含む、インスリン非依存性糖尿病治療剤の製造方法。
8. ケフィアから上清を分離する工程を含む、インスリン依存性糖尿病治療剤の製造方法。
9. 得られた上清から分子量１０００Ｄａ未満のケフィア抽出物を得る工程をさらに含む、請求項８に記載のインスリン依存性糖尿病治療剤の製造方法。
10. ケフィアから上清を分離する工程を含む、抗肥満剤の製造方法。

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