JP2007525196A - 前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）変異体及びその部分配列 - Google Patents

前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）変異体及びその部分配列 Download PDF

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Abstract

ＰＳＣＡ及びそれがコードするタンパク質並びにそれらの変異体が開示される。ＰＳＣＡは正常成人組織において組織特異的な発現を示し、表１に掲げられた癌で異常発現する。その結果、ＰＳＣＡは癌の診断、予後、予防及び／又は治療ターゲットを提供する。ＰＳＣＡ遺伝子、それらのフラグメント、又はそれらのコードするタンパク質、それらの変異体若しくはそれらのフラグメントは、液性又は細胞性免疫応答を惹起するために用いることができ、ＰＳＣＡ反応性の抗体又はＴ細胞は能動免疫又は受動免疫に用いることができる。

Description

本発明は、ある種の癌において発現される、遺伝子及び該遺伝子によってコードされＰＳＣＡと称されるタンパク質、及びＰＳＣＡを発現する癌の管理（処置）に有用な診断及び治療方法及び組成物に関する。
癌は、冠動脈疾患に次いで２番目に多い人間の死因である。世界中で、毎年数百万人が癌で死亡している。米国だけでも、American Cancer Societyの報告によれば、毎年癌で死亡する人は５０万より遥かに多く、毎年１２０万人以上が新たに癌と診断される。心疾患死は著しく減少しているのに対し、癌による死は一般に増加している。来世紀の初期には、癌は最大の死因になっているものと予想される。
世界的に見れば、幾つかの癌は主要な死因として際立っている。とりわけ、肺癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌及び卵巣癌は、癌による死因の主要なものである。これらの癌及び事実上その他のすべての癌は、死に至らしめるある共通の特徴を共有している。ごく僅かな例外はあるが、１つの癌からの転移による疾患が致命的なのである。更に、さしあたっては、原発性の（第一次の）癌を乗り切った癌患者でさえも、共通に、その生活が劇的に変容を受けることが経験的に明らかにされている。癌患者の多くは、再発又は治療の不成功の可能性に対する意識によって引き起こされる強度の不安を経験する。また、癌患者の多くは、治療後、肉体の衰弱を経験する。更に、癌患者の多くは、再発を経験する。
世界的に見れば、前立腺癌は、男性の４番目に多い癌である。北アメリカ及び北部ヨーロッパでは、男性の最も一般的な癌であり、男性の２番目に多い癌による死因である。米国だけでも、年間３万人を遥かに超える男性が前立腺癌で死亡するが、肺癌に次いで２番目に多い。このような数字の大きさにも関わらず、転移性前立腺癌に対する効果的な治療法は依然として存在しない。外科的前立腺切除、放射線治療、ホルモン消失療法、外科的性腺摘除及び化学療法が、未だに主要な治療法である。残念ながら、これらの治療法は、有効でないことが多く、望ましくない結果に至ることもままある。
診断の最前線では、初期ステージの局在癌を正確に検出できる前立腺癌マーカーが存在しないため、当該癌の診断及び治療（管理）には著しい制限がある。血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは極めて有効な手段であったが、その特異性及び一般的有用性は、幾つかの重要な点において不足があることが広く評価されている。
前立腺癌に対する更なる特異的マーカーの同定における進捗具合は、マウスにおいて前立腺癌の異なる複数のステージを反復することが可能な前立腺癌異種移植片の生成によって改善された。ＬＡＰＣ（Los Angeles Prostate Cancer）異種移植片は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける継代を耐え抜きかつアンドロゲン依存からアンドロゲン非依存への移行の擬態能を示した前立腺癌異種移植片である（Klein et al., 1997, Nat. Med. 3:402）。比較的最近同定された前立腺癌マーカーとしては、例えば、ＰＣＴＡ−１（Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252）、前立腺特異的膜（ＰＳＭ）抗原（Pinto et al., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51）、ＳＴＥＡＰ（Hubert, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8）及び前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735）等がある。
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡ及びＰＳＣＡのようなかつて同定されたマーカーは、前立腺癌の診断及び治療の労力を軽減したが、診断及び治療を一層改善するために、前立腺及び関連する癌に対する付加的なマーカー及び治療ターゲットの同定に対する要求は依然として存在する。
腎細胞癌（ＲＣＣ）は、成人の悪性腫瘍の凡そ３％を占める。腺腫がひとたび直径２〜３ｃｍの大きさになれば、それは悪性腫瘍である可能性がある。成人の２つの主要な悪性腎腫瘍は、腎細胞腺癌及び腎盂又は輸尿管の移行上皮癌である。腎細胞腺癌の発症は、米国において２９，０００例超と推定され、１９９８年のことであるが、１１，６００人超の患者がこの癌で死亡した。移行上皮癌の発症率はより小さいが、米国では毎年凡そ５００の発症例がみられる。
手術は、過去幾十年にわたり、腎細胞腺癌の主要な治療法であった。最近まで、転移性癌は、如何なる全身的治療法に対しても難治性であった。全身的治療法、とりわけ免疫療法における最近の進展により、転移性腎細胞癌（metastatic renal cell carcinoma）は、適切な患者において長期的な治療効果の可能性をもって積極的にアプローチすることも可能ではあろう。しかしながら、このような患者に対しても有効な治療法の必要性は依然として存在する。
米国における癌の新患全体のうち、膀胱癌は、男性では凡そ５％（５番目に多い腫瘍）、女性では凡そ３％（８番目に多い腫瘍）を占める。発症は徐々に増加しており、しかも高齢になるほど増加している。１９９８年では、推定５４，５００例あったが、うち男性は３９，５００例、女性は１５，０００例であった。米国における年齢調整後の発症率は、男性では１００，０００人当り３２人、女性では１００，０００人当り８人である。３：１という歴史的な男性対女性割合は、女性の喫煙習慣に関連して減少するであろう。１９９８年の膀胱癌による死亡例は推定１１，０００例（男性７，８００例、女性３，９００例）であった。膀胱癌の発症率及び死亡率は、年齢と共に著しく増加しており、かつ世代が上がるに連れ問題も深刻になっている。
膀胱癌の多くは膀胱で再発する。膀胱癌は、経尿道的膀胱（腫瘍）切除術（ＴＵＲ）と、膀胱内化学療法又は免疫療法とのコンビネーションによって処置される。膀胱癌の多病巣性・再発性は、ＴＵＲの限界を示している。筋浸潤性癌の多くはＴＵＲ単独によっては治癒しない。根治的膀胱切除術及び尿路変更術は、癌を除去する最も効果的な手段であるが、排尿及び性機能に対し不可避の影響が出る。従って、膀胱癌患者に有益な治療法に対する必要性は依然として大きい。
米国では、２０００年に、推定１３０，２００例の結腸直腸癌が見られ、うち９３，８００例は結腸癌、３６，４００例は直腸癌であった。結腸直腸癌は、男性及び女性において３番目に多い癌である。発症率は、１９９２年から１９９６年にかけて大きく低下した（年率−２．１％）。調査結果によれは、検診及びポリープ切除が増えたことにより、ポリープの浸潤癌への進行が阻止されたことが、発症率の減少に至ったことが示唆されている。２０００年の死亡例は、推定５６，３００例（結腸癌４７，７００例、直腸癌８，６００例）であったが、これは米国の癌の死亡例全体の凡そ１１％を占める。
現在、手術は、結腸直腸癌の最も多い治療形態であり、まだ転移していない癌に対しては、治癒的であることが多い。化学療法、又は化学療法プラス放射線療法は、癌が腸壁を深く穿孔したか或いはリンパ節に転移した患者の多くに対し手術前後に適用される。永久人工肛門形成術（排泄物の排出のための腹部開口の形成）の必要性は、結腸癌の場合は、それ程多くはない、直腸癌の場合は稀にしかない。結腸直腸癌に対する効果的な診断・治療法の必要性は依然として存在する。
２０００年の肺及び気管支癌の新規発症は推定１６４，１００例であったが、これは米国における癌診断例全体の１４％を占める。肺及び気管支癌の発症率は、男性では、１００，０００人当り８６．５人（１９８４年）から７０．０人（１９９６年）というように大きく減少している。女性の増加率は１９９０年代には減少し始めた。１９９６年の女性の発症率は、１００，０００人当り４２．３人であった。
２０００年の肺及び気管支癌による死亡例は、推定１５６，９００例であったが、これは癌の死亡例全体の２８％を占める。１９９２年〜１９９６年の間に、肺癌の死亡率は男性では著しく減少した（年率−１．７％）が、女性の場合逆に大きく増加しつづけた（年率０．９％）。１９８７年以来、毎年、肺癌で死亡する女性の数は、４０歳以上では女性の癌による主要な死因である乳癌の場合より多い。肺癌の発症率及び死亡率の減少は、過去３０年にわたる喫煙率の減少の結果であると考えられるが、女性の喫煙習慣の減少は、男性のそれよりも遅れをとっている。問題は、タバコの使用は、成人で減少しているのに対し、若年層では再び増加していることである。
肺及び気管支癌の治療法の選択肢は、当該癌のタイプ及びステージに応じて決定されるが、例えば、手術、放射線治療、化学療法である。多くの局在癌に対しては、通常、手術が、治療法として選択される。この癌は、通常、発見された時には既に転移しているので、放射線治療及び化学療法が、手術と組合せて使用する必要があることが多い。化学療法は、単独で又は放射線治療と組み合わされて、小細胞肺癌の治療法として選択される。この方法では、患者の大部分が、場合によっては長く持続する寛解を経験する。しかしながら、肺及び気管支癌に対する効果的な治療・診断方法に対する必要性は依然として存在する。
２０００年に米国において女性に発症した浸潤乳癌の新規発症例は推定１８２，８００例であると予想された。更に、男性の場合でも、２０００年では、凡そ１，４００例の乳癌の新規発症例が診断されると予想された。女性の乳癌発症率は、１９８０年代に年率凡そ４％増加した後、１９９０年代には横ばい状態になって１００，０００人当り凡そ１１０．６例となった。
米国だけでも、２０００年には、乳癌による死亡は推定４１，２００例（女性４０，８００例、男性４００例）であった。乳癌は、女性の癌による２番目の死亡原因である。ごく最近のデータによれば、１９９２年〜１９９６年の間に、死亡率は大きく減少したが、とりわけ白人及び黒人の何れにおいてもより若い女性では最も大きく減少した。この減少は、恐らく、早期発見と治療法の改善の結果であろう。
医療環境及び患者の好みを考慮すると、乳癌の治療法としては、乳腺腫瘍摘出術（腫瘍の局所的除去）及び腋窩リンパ節の除去；乳房切除術（乳房の外科的除去）及び腋窩リンパ節の除去；放射線治療；化学療法；又はホルモン療法があり得る。２又は３以上の方法を組合せて使用することも多い。多くの研究により、初期ステージの乳癌に対しては、乳腺腫瘍摘出術プラス放射線治療後の長期生存率は、修正された根治的乳房切除術後の生存率に類似することが示された。再建技術の著しい進歩により、乳房切除術後の乳房再建のための選択肢は増えた。最近、そのような再建術は、乳房切除と同時に行われた。
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）の局所的切除は、周囲の正常な乳房組織の適正量も同時に切除されるが、ＤＣＩＳの局所的再発を阻止し得る。乳房への放射線照射及び／又はタモキシフェンは、残余の乳房組織にＤＣＩＳが発生する可能性を減少し得る。このことは、ＤＣＩＳは、未処置のまま放置されれば、浸潤乳癌に進行し得るので重要である。しかしながら、これらの治療法には、深刻な副作用ないし後遺症が伴う。従って、効果的な乳癌治療の必要性は存在する。
２０００年の米国における卵巣癌の新規発症例は、推定２３，１００例であった。これは、女性の癌全体の４％を占め、婦人科系の癌では２番目に多い。１９９２年〜１９９６年の間、卵巣癌発症率は著しく減少した。２０００年では、卵巣癌の結果による死亡例は、推定１４，０００例であった。卵巣癌による死亡例は、女性の生殖器系の他のどの癌より多い。
手術、放射線治療、及び化学療法が、卵巣癌の治療のための選択肢である。手術は、通常、卵巣の一方又は両方の摘出、輸卵管の摘出（卵管卵巣摘出）、及び子宮の摘出（子宮摘出）を含む。ごく初期の腫瘍では、とりわけ子供を持つことを希望する若い女性の場合、関係のある卵巣のみが摘出される場合もある。病状が進行した場合には、化学療法の効果を増強するために、腹腔内の患部を全部除去することが試みられる。卵巣癌の効果的な治療手段に対する必要性は大きい。
２０００年の米国における膵臓癌の新規発症例は、推定２８，３００例であった。過去２０年間に、膵臓癌の発症率は男性では減少した。女性の場合の発症率は、ほぼ一定に留まっているが、減少し始めるであろう。米国では、２０００年に、膵臓癌による死亡例は推定２８，２００例であった。過去２０年間に、男性では死亡率は僅かではあるが有意に減少した（年率凡そ−０．９％）のに対し、女性では僅かに増加した。
手術、放射線治療、及び化学療法が、膵臓癌の治療のための選択肢である。これらの治療法は、患者の多くに対し、生存の長期化及び／又は症状の緩和を可能とするが、大抵は治癒に至らしめることはない。膵臓癌の更なる治療・診断方法に対する必要性は大きい。
本発明は、表１に記載した癌において過剰発現されることが見出されているＰＳＣＡと称される遺伝子に関する。正常組織におけるＰＳＣＡ遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成人の組織における限定的な発現パターンを示す。ＰＳＣＡのヌクレオチド配列（図２）及びアミノ酸配列（図２、及び図３）も提供する。成人の正常組織におけるＰＳＣＡ組織関連特性は、表１に示した組織で観察される過剰発現と組み合わされることにより、ＰＳＣＡは少なくとも幾つかの癌において異常に過剰発現され、従って表１に示したもののような組織の癌のための有用な診断、予防、予後及び／又は治療ターゲットとして機能することを示している。
本発明は、ＰＳＣＡ遺伝子、ｍＲＮＡ及び／又はコード配列の全部又は一部に一致又は相補的なポリヌクレオチドを、好ましくは単離型で提供するが、このようなポリヌクレオチドには、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６以上の連続アミノ酸のＰＳＣＡ関連タンパク質及びフラグメントをコードするポリヌクレオチド；ＰＳＣＡ関連タンパク質の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００又は１００超の連続アミノ酸、並びにペプチド／タンパク質自体；ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及び関連分子、ＰＳＣＡ遺伝子又はｍＲＮＡ配列又はそれらの一部に相補的又は少なくとも９０％ホモロジーを有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、及びＰＳＣＡ遺伝子、ｍＲＮＡ、又はＰＳＣＡコードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド等が含まれる。また、ｃＤＮＡ及びＰＳＣＡをコードする遺伝子を単離する手段も提供する。ＰＳＣＡポリヌクレオチドを含有する組換えＤＮＡ分子、該分子によって形質転換又は形質導入された細胞、及びＰＳＣＡ遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系も提供する。本発明は、更に、ＰＳＣＡタンパク質及びそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供する。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、マウスその他の哺乳類の抗体、キメラ抗体、ヒト化及び完全ヒト抗体、及び検出可能なマーカー又は治療剤で標識された抗体等がある。図２の全核酸配列がコードされない及び／又は図２の全アミノ酸配列が調製されないことを条件とする実施形態もある。また、或る実施形態では、図２の全核酸配列がコードされ及び／又は図２の全アミノ酸配列が調製されるが、それらの何れか一方が、そのヒト単位用量形態とされる。
本発明は、更に、種々の生物学的サンプル中におけるＰＳＣＡポリヌクレオチド及びタンパク質の存在及び状態の検出方法、並びにＰＳＣＡを発現する細胞の同定方法を提供する。本発明の典型的な一実施形態では、癌のような増殖調節不全のある形態を有するか有すると思われる組織又は血液サンプル中におけるＰＳＣＡ遺伝子産物のモニター方法が提供される。
本発明は、更に、表１に示した組織の癌のようなＰＳＣＡを発現する癌を治療するための、種々の免疫原性又は治療組成物及びストラテジーを提供する。例えば、ＰＳＣＡの転写、翻訳、プロセッシング又は機能の阻害を目的とする治療法、並びに癌ワクチン等が該当する。本発明は、１つの視点では、ヒト被検体においてＰＳＣＡを発現する癌を治療するための組成物、及び該組成物を含む方法を提供するが、該組成物は、人間に対する使用に適切な担体、及びＰＳＣＡの産生又は機能を阻害する１又は２以上の剤のヒト単位用量を含む。上記担体は、ヒトにユニークな担体であることが好ましい。本発明の他の一視点では、上記剤は、ＰＳＣＡタンパク質と免疫反応性の成分である。そのような成分としては、例えば、抗体（単鎖、モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラ、又はヒト抗体等）、抗体の機能的等価物（天然又は合成の何れであってもよい。）、及びそれらの任意のコンビネーション等がある。抗体は、診断又は治療成分とコンジュゲートされてもよい。他の一視点では、上記剤は、本書で定義されるような小分子である。
他の一視点では、上記剤は、ヒトの中でＨＬＡクラスＩ分子と結合しＰＳＣＡに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発するＣＴＬエピトープを含む１又は２以上のペプチド及び／又はヒトの中でＨＬＡクラスＩＩ分子と結合しヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を誘発するＨＴＬエピトープを含む１又は２以上のペプチドを含む。本発明のペプチドは、同一の又は１若しくは２以上の別個のポリペプチド分子上に存在し得る。本発明の更なる一視点では、上記剤は、上述のような１又は２以上のＣＴＬ又はＨＴＬ応答刺激ペプチドを発現する１又は２以上の核酸分子を含む。本発明の更に他の一視点では、上記１又は２以上の核酸分子は、上述のようなＰＳＣＡと免疫学的に反応性である成分を発現し得る。上記１又は２以上の核酸分子は、ＰＳＣＡの産生を阻害する分子であるか、又はそのような分子をコードするものであってもよい。そのような分子としては、例えば、ＰＳＣＡの産生に本質的なヌクレオチド配列に相補的な分子（例えば、ＰＳＣＡの産生に本質的なヌクレオチド二重らせんと共に三重らせんを形成するアンチセンス配列又は分子）又はＰＳＣＡ ｍＲＮＡの溶解に効果を有するリボザイム等が該当する。
表８〜表２１及び表２２〜表４４（まとめてＨＬＡペプチド表という）に示した任意のペプチドのその親タンパク質、例えば変異体１、変異体２等に対する起始点を決定するために、３つの要素、即ち特定の変異体、ＨＬＡペプチド表中のペプチドの長さ、及び表７中のサーチペプチドについて参照が行われることに注意すべきである。一般的に、１つのユニークなサーチペプチドは、１つの特定の変異体のためのＨＬＡペプチド（複数）を得るために使用される。個々のサーチペプチドのその親分子に対する位置は、表７に示されている。従って、或るサーチペプチドが位置“Ｘ”で開始する場合、ＨＬＡペプチドのその親分子内における実際の位置を求めるためには、表８〜表２１及び表２２〜表４４の各位置に値“Ｘ−１”を加えなければならない。例えば、特定のサーチペプチドがその親分子の位置１５０で開始する場合、ＨＬＡペプチドアミノ酸のその親分子における位置を計算するために個々のＨＬＡペプチドアミノ酸位置に１５０−１即ち１４９を加えなければならない。
本発明の一実施形態は、表８〜表２１及び表２２〜表４４に合せて少なくとも２回現れるＨＬＡペプチド、又は該ＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む。本発明の他の一実施形態は、表８〜表２１に少なくとも１回現れかつ表２２〜表４４に少なくとも１回現れるＨＬＡペプチド、又は該ＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む。
本発明の他の一実施形態は、（１つの）ペプチド領域、又は該ペプチド領域をコードするオリゴヌクレオチドを含む抗体エピトープであるが、該ペプチド領域は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ又は５つを有する：
i）図３の特定のペプチドの、図３の当該タンパク質の全長まで任意の整数刻みで増加する、少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域であって、図５の親水性プロファイル（特性曲線）において、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいか又はより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含むもの；
ii）図３の特定のペプチドの、図３の当該タンパク質の全長まで任意の整数刻みで増加する、少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域であって、図６の疎水性親水性（Hydropathicity）プロファイルにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１に等しいか又はより小さい値を有するか、又は０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含むもの；
iii）図３の特定のペプチドの、図３の当該タンパク質の全長まで任意の整数刻みで増加する、少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域であって、図７のパーセント接触可能残基（Percent Accessible Residues）プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいか又はより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含むもの；
iv）図３の特定のペプチドの、図３の当該タンパク質の全長まで任意の整数刻みで増加する、少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域であって、図８の平均可動（屈曲）（Flexibility）プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいか又はより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含むもの；
v）図３の特定のペプチドの、図３の当該タンパク質の全長まで任意の整数刻みで増加する、少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域であって、図９のベータターンプロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいか又はより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含むもの。
セクションの概要
Ｉ．） 定義
ＩＩ．）ＰＳＣＡポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．）ＰＳＣＡポリヌクレオチドの使用
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの具体例
ＩＩ．Ａ．３．）プライマー及びプライマー対
ＩＩ．Ａ．４．）ＰＳＣＡをコードする核酸分子の単離
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子及び宿主‐ベクター系
ＩＩＩ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ含有タンパク質の態様
ＩＩＩ．Ｂ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質の発現
ＩＩＩ．Ｃ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質の修飾
ＩＩＩ．Ｄ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質の用途
ＩＶ．）ＰＳＣＡ抗体
Ｖ．）ＰＳＣＡ細胞性免疫応答
ＶＩ．）ＰＳＣＡトランスジェニック動物
ＶＩＩ．）ＰＳＣＡの検出方法
ＶＩＩＩ．）ＰＳＣＡ関連遺伝子及びその産物のモニター方法
ＩＸ．）ＰＳＣＡと相互作用する分子の同定
Ｘ．）治療方法及び組成物
Ｘ.Ａ．）抗癌ワクチン
Ｘ.Ｂ．）抗体に基づく治療の標的としてのＰＳＣＡ
Ｘ.Ｃ．）細胞性免疫応答の標的としてのＰＳＣＡ
Ｘ.Ｃ.１．ミニ遺伝子ワクチン
Ｘ.Ｃ.２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ
Ｘ.Ｃ.３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合わせ
Ｘ.Ｃ.４．ＣＴＬ及び／又はＨＴＬペプチドでパルスしたＤＣを含んで
なるワクチン組成物
Ｘ.Ｄ．）養子免疫治療
Ｘ.Ｅ．）治療又は予防を目的とするワクチンの投与
ＸＩ．）ＰＳＣＡの診断及び予測の態様
ＸＩＩ．）ＰＳＣＡタンパク質機能の阻害
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体によるＰＳＣＡの阻害
ＸＩＩ．Ｂ．）組み換えタンパク質によるＰＳＣＡの阻害
ＸＩＩ.Ｃ．）ＰＳＣＡの転写又は翻訳の阻害
ＸＩＩ.Ｄ．）治療戦略の一般的考察
ＸＩＩＩ.）ＰＳＣＡモジュレーターの同定、特徴付け、及び、使用
ＸＩＶ．）キット
Ｉ．） 定義
別に定義されていない場合、ここで使用される全ての技術用語、表記法、及び、他の科学用語若しくは用語法は、本発明が属する技術分野の当業者によって、一般に理解されている意味を有することを意図するものである。幾つかの場合には、一般に使用されている用語を、この中で、明瞭さのために及び／又は素早い参照（ready reference）のために定義し、並びに、この中でのそのような定義の包含は、必ずしも当業者に一般に理解されている事柄との間の相当の差異を表すために説明されるものではない。この中で説明又は参照される多くの技術及び手順は、当業者によって、よく理解され通常使用される常套的な方法論―例えば、Sambrook et al.によるMolecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.中で記載されている広範に使用されている分子クローニングの方法論―である。適切な、市販されているキット及び試薬の使用を含む手順としては、他に記載されていなければ一般的には製造業者の規定したプロトコール及び／又はパラメータに従って行われる。
用語「進行型前立腺癌（advanced prostate cancer）」、「局所進行型前立腺癌（locally advanced prostate cancer）」、「進行型疾患（advanced disease）」、及び、「局所進行型疾患（locally advanced disease）」とは、前立腺嚢胞を介して伸展した前立腺癌を意味し、そして、アメリカ泌尿器科学会（ＡＵＡ）システムの下でステージＣ、Whitmore-Jewettシステムの下でステージＣ１−Ｃ２疾患、及び、ＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）システムの下でＴ３−Ｔ４とＮ＋疾患を意味する。一般に、局所進行型疾患の患者には手術は推奨できず、また、これらの患者は実質的には、臨床上、局所（臓器限定）前立腺癌の患者と比較して好ましくない結果となる。局所進行型疾患は、前立腺の側縁を超えた硬結、又は、前立腺底部の上の非対称性若しくは硬結という容易に知覚可能な証拠により臨床的に同定される。癌が、前立腺嚢胞を浸潤又は貫通、外科的なマージン（surgical margin）への伸展、又は、精嚢を浸潤している場合には、局所進行型前立腺癌は現在、根本的な前立腺切除の後に病理学的に診断される。
「天然型糖修飾パターンの改変（altering the native glycosylation pattern）」とは、天然型ＰＳＣＡ配列内に見出された１以上の糖質成分の欠失（内在性糖修飾部位の除去或いは化学的及び／又は酵素学的方法による糖修飾の削除）及び／又は、天然型ＰＳＣＡ配列内に存在しない１以上の糖修飾の付加を、意味することをここでの目的のために意図している。さらに、この言い回しは、天然型タンパク質の糖修飾における質的変化を含む（種々の糖成分の性質及び比率の変化を含む）。
用語「類似体（analog）」とは、もう一つの分子（例えば、ＰＳＣＡ関連タンパク質）と、構造的に類似した、又は、類似な若しくは相当する特性を共有する分子のことを言う。例えば、ＰＳＣＡタンパク質の類似体は、ＰＳＣＡタンパク質と特異的に結合する抗体又はＴ細胞によって、特異的に結合され得る。
用語「抗体」は、最も広義な意味で用いている。そのため、「抗体」は、自然に生成することも、又、従来のハイブリドーマ技術によって生産されたモノクローナル抗体のようなヒトによる作成も可能である。抗ＰＳＣＡ抗体は、ＰＳＣＡタンパク質、又はそのフラグメントと結合し、そして、モノクローナル及びポリクローナル抗体と同様に抗原結合領域及び／又は１以上のこれらの抗体の相補性決定領域も含む。
「抗体フラグメント（antibody fragment）」は、少なくともイムノグロブリン分子のその標的に結合する可変領域の部分すなわち抗原結合領域として定義される。一つの態様においては、一つの抗ＰＳＣＡ抗体及びそのクローン（作用物質、拮抗物質、及び、中和抗体を含む）及びポリエピトープに特異性（polyepitopic specificity）がある抗ＰＳＣＡ抗体組成物を包含する。
用語「コドン最適化配列」とは、使用頻度が凡そ２０％より少ない任意のコドンを置換することにより、特定の宿主の種に最適化された核酸配列のことを言う。配列は、２０％より少ない、より好ましくは凡そ３０％又は４０％よりも少ない使用頻度のコドンを全く含まないように、「完全に最適化（completely optimized）」されていてもよい。コドンの最適化に加え、偽のポリアデニル化部位の除去、エクソン／イントロンスプライシングシグナルの除去、トランスポゾン様リピートの除去、及び／又は、ＧＣ含量の最適化によって、特定の宿主種の中での発現に対し最適化された核酸配列を、ここでは、「発現増強配列（expression enhanced sequences）」と呼ぶ。
コンビナントリアルライブラリーは、試薬のような多くの化学的「基本要素（building blocks）」を組み合わせることにより化学合成又は生物学的合成の何れかにより生成された多様な化学的化合物の収集物である。例えば、ポリペプチド（例えばムテイン）のような線形コンビナントリアル ケミカルライブラリーは、所与の化合物長（例えばポリペプチド化合物における多くのアミノ酸）のためのあらゆる可能な方法でアミノ酸と呼ばれる化学的基本要素のセットを組み合わせる事により形成する。多数の化学化合物は、化学的基本要素のコンビナトリアル ミキシング（combinatorial mixing）のようなものを介して合成される(Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 (1994))。
コンビナントリアルライブラリーの調製及びスクリーニングは当業者に周知されている。このようなコンビナントリアルライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175、Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)、Houghton et al., Nature, 354:84-88 (1991)を参照）、ペプトイド（peptoids）（ＰＣＴ公報第WO 91/19735）、 コードペプチド（ＰＣＴ公報第WO 93/20242）、ランダム バイオ‐オリゴマー（ＰＣＴ公報第WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン（米国特許第5,288,514）、ヒダントレイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなdiversomers（Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)）、ビニロガスペプチド（vinylogous polypeptides）（Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)）、β-D-グルコース足場を付随する非ペプチド性ペプチド擬態（Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似性有機合成（Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)）、オリゴカーボネート（Cho, et al., Science 261:1303 (1993)）、及び／又は、ペプチジルホスホン酸塩（Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)）。一般的にはGordon et al., J. Med. Chem. 37:1385 (1994)、核酸ライブラリー（例えばStratagene, Corp.を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第5,539,083を参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996)、及びPCT/US96/10287を参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liang et al., Science 274:1520-1522 (1996)、及び、米国特許第5,593,853を参照）、及び、低有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン, Baum, C&EN, Jan 18, page 33 (1993)；イソプレノイド,米国特許第5,569,588；チアゾリジノン及びメタチアザノン,米国特許第5,549,974；ピロリジン 米国特許第5,525,735及び5,519,134；モルフォリノ化合物,米国特許第5,506,337；ベンゾジアゼピン,米国特許第5,288,514；等を参照）を参照。
コンビナントリアルライブラリー調製のための装置は商業的に利用できる（例えば、357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIAを参照）。多くの既知のロボットシステムは、また溶液相化学に対して発展させられてきたこれらのシステムには、武田化学株式会社（大阪、日本）及びロボットアームを使用する多くのロボットシステム（Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.；Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.）（それらは化学者による手作業の合成操作を模倣している）によって改良された自動化合成装置のような自動化ワークステーションを含む。上述の装置の何れも、本発明での使用に適している。ここで論じられているような操作が可能なようなこれら装置の修正の性質及び実行が（たとえあったにしても）、当業者には明白であろう。それに加えて、多数のコンビナントリアルライブラリーは、それ自体商業的に利用可能である（例えば、ComGenex, Princeton, NJ；Asinex, Moscow, RU；Tripos, Inc., St. Louis, MO；ChemStar, Ltd, Moscow, RU；3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD；等を参照）。
用語「細胞毒性薬剤（cytotoxic agent）」とは、細胞の発現活性若しくは細胞の機能を抑制若しくは阻害する物質、及び／又は、細胞破壊を惹起する物質を言う。本用語は、放射性同位元素化学療法剤、並びに、細菌、真菌、植物若しくは動物組織の小分子毒素若しくは酵素的に活性化する毒素のような毒素（それらのフラグメント及び／又は変異体を含む）を含むことを意図している。細胞毒性薬剤の例として、アウリスタチンス、アウロミシンス、マイタンシノイドス（maytansinoids）、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、コンブレスタチン、ズオカルミシンス、ドロスタチンス、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、cc1065、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシ アントラシン ジオン、アクチノマイシン、ジフテリアトキシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α‐サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロスズ、カリケアミシン、サパオナリア オフィシナリスインヒビター（sapaonaria officinalis inhibitor）、及び、グルココルチコイド、及びその他の化学療法剤と同様に、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２若しくは２１３、Ｐ３２及びＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位元素のような放射性同位元素を含むが、これらに限定されるものではない。抗体は、また、プロドラックをその活性化型に転換可能な抗癌プロドラック活性化酵素と結合してもよい。
「遺伝子産物」は本書ではしばしばタンパク質又はｍＲＮＡを意味する。例えば、「本発明の遺伝子産物」は、本書ではしばしば、「癌アミノ酸配列」、「癌タンパク質」、「表１に列挙されている癌のタンパク質」、「癌ｍＲＮＡ」、「表１に列挙されている癌のｍＲＮＡ」等を言う。一つの実施形態において、前記癌タンパク質は図２の核酸によってコードされる。癌タンパク質は、フラグメントであるか、或いは、図２の核酸によってコードされるフラグメントに対する全長タンパク質であってもよい。一つの実施形態において、癌アミノ酸配列は、配列同一性又は類似性を決定するために使用される。もう一つの実施形態において、前記配列は、図２の核酸によってコードされるタンパク質の天然アレル変異体である。もう一つの実施形態において、前記配列は本書で更に記述するような配列変異体である。
特定の核酸又はタンパク質産物の存在、不存在、定量、又は、その他の特性に関する「ハイスループットスクリーニング」は、当業者既知である。同様に、結合アッセイ及びリポーター遺伝子アッセイも周知されている。このように、例えば、米国特許第5,559,410はタンパク質のハイスループットスクリーニング法を開示しており米国特許第5,585,639は核酸結合のハイスループットスクリーニング法（すなわちアレイ）を開示しており；一方米国特許第5,576,220及び5,541,061はリガンド／抗体結合のハイスループットスクリーニング法を開示している。
加えて、ハイスループットスクリーニング系は、商業的に利用可能である（例えば、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA； Air Technical Industries, Mentor, OH； Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA；等を参照）。これらのシステムは、典型的には、全サンプル及び試薬のピペティッング、液の分注、インキュベーション時間の調節、及び、アッセイに適した検出器によるマイクロプレートの最終的な読み取りを含む全行程を自動化する。これらの構成システムは、ハイスループットに且つ迅速に立ち上げられるだけでなく、高度の柔軟性と注文による特製が可能である。そのようなシステムの製造業者は種々のハイスループットシステムに関する詳細なプロトコールを用意している。すなわち、例えば、Zymark Corp.は、遺伝子の転写、リガンド結合等の修飾の検出のためのスクリーニングシステムについて記述した技術公報を提供している。
用語「相同体（homolog）」とは、他の分子に対して、例えば、対応する位置で同一か類似である化学残基の配列を有することによって、相同性を示す分子を言う。
「ヒト白血球抗原」又は「ＨＬＡ」は、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩタンパク質である（例えば、Stites, et al., Immunology, 8th Ed., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)を参照）。
用語「ハイブリダイズ（hybridize）」、「ハイブリダイジング（hybridizing）」、「ハイブリダイジズ（hybridizes）」などは、ポリヌクレオチドの文脈で使用され、通常のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、５０％ホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ中で、ここでハイブリダイゼーション中の温度は３７℃以上、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄中の温度は５５℃以上であるハイブリダイゼーションであるような条件を意味する。
「単離された（isolated）」又は「生物学的に純粋な（biologically pure）」という表現は、その自然状態で見られる時に通常その物質に付随する成分が実質的または本質的に含まれていない物質を言う。よって、本発明に従って単離されたペプチドは、好ましくは、in situの環境下のペプチドと共に通常結合している又は存在している物質を含まない。例えば、ポリヌクレオチドは、ＰＳＣＡ遺伝子とは異なる遺伝子に相当する若しくは相補的な夾雑ポリヌクレオチドから、又は、ＰＳＣＡ遺伝子産物若しくはそのフラグメントとは異なるポリペプチドをコードする夾雑ポリヌクレオチドから、実質的に分離された時に、「単離された」と言われる。熟練した技術者は、単離されたＰＳＣＡポリヌクレオチドを得るために即座に核酸単離手順を使用出来る。例えば、物理的及び／又は化学的方法が、通常、該タンパク質と共に結合しているか存在している細胞の構成物質からＰＳＣＡタンパク質を移すために使用された場合、タンパク質は「単離された」と言われる。熟練した技術者は、単離されたＰＳＣＡタンパク質を得るために、即座に、標準的な精製法を使用可能である。或いは、単離されたタンパク質は、合成又は化学的方法によっても調製可能である。
用語「哺乳動物（mammal）」とは、哺乳動物として分類される任意の生物を意味し、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒトを含む。本発明の一つの態様において、哺乳動物はマウスである。本発明のもう一つの態様においては、哺乳動物はヒトである。
用語「転移性前立腺癌」及び「転移性疾患」は、局所リンパ節又は遠隔部位に伝播した、並びに、ＡＵＡシステムの下でステージＤ疾患及びＴＮＭシステムの下で、ステージＴｘＮｘＭ＋の前立腺癌を意味している。局所進行型前立腺癌の場合のように、転移性疾患の患者には一般に手術は適用とならず、ホルモン（アンドロゲン除去）療法が好ましい治療様式である。転移性前立腺癌の患者は、治療開始１２〜１８ヶ月以内に最終的には、アンドロゲン不応性状態に進行する。これらアンドロゲン不応性患者の凡そ半数は、その状態に進行した後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌骨転移は、しばしば溶骨性よりむしろ造骨性である（すなわち、正味の骨形成をもたらす）。骨転移は脊椎で最も高頻度に見られ、続いて、大腿骨、骨盤、肋骨、頭蓋、及び、上腕骨である。その他の転移が一般に見られる部位は、リンパ節、肺、肝臓、及び、脳を含む。転移性前立腺癌は、開放性又は腹腔鏡検査の骨盤リンパ節切除、全身放射性核種スキャン、骨格放射線写真撮影、及び／又は、骨病変生検により診断される。
用語「モジュレーター（修飾物質）」又は「被検化合物」又は「薬剤候補」又は本書で使用される文法上等価なものとは、直接又は間接に癌の表現型又は癌配列（例えば核酸又はタンパク質配列）の発現或いは癌配列の効果（例えばシグナリング、遺伝子発現、タンパク質相互作用等）を変える能力についてテストされるべき任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、低有機分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド等を言う。一態様においてモジュレーターは、本発明の癌タンパク質の効果を中和するであろう。「中和」によってとは、細胞における結果的な効果に従ってタンパク質の活性が抑制又は遮断されることを意味する。別の一態様において、本発明の遺伝子及びそれに相当するタンパク質の効果を前記タンパク質の標準化レベルによって中和するかもしれない。好ましい実施形態においては、モジュレーターは本書で提供される核酸又はタンパク質の発現プロファイル又は下流のエフェクター経路を変更する。一つの実施形態においては、モジュレーターは癌表現型を抑制する（例えば正常組織フィンガープリント）。もう一つの実施形態においては、モジュレーターは癌表現型を誘発する。一般に、複数のアッセイの混合は、種々濃度への異なる反応を得るために異なる薬剤濃度で平行して行う。典型的には、これら濃度のうち一つは、ネガティブコントロール即ち０濃度又は検出濃度以下にする。
モジュレーター、薬剤候補、又は、被検化合物は多数の化学的クラスを包含するが、典型的にはそれらは有機分子で好ましくは分子量が１００ダルトン以上で且つ凡そ２５００ダルトンより少ない低有機化合物である。好ましい低分子は、２０００Ｄ以下、又は、１５００Ｄ以下、又は、１０００Ｄ以下、又は、５００Ｄ以下である。候補薬剤は、タンパク質と構造的に相互作用（とりわけ水素結合性の）をするのに必要な官能基を含み、及び、典型的には少なくとも一つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、又は、カルボキシル基を、好ましくは、少なくとも二つの該官能基を含む。候補薬剤はしばしば環状炭素若しくは複素環式構造、及び／又は、１以上の上記官能基を付随した芳香族若しくは多重芳香族構造を含む。モジュレーターは、また、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、又は、それらの組み合わせのような生体分子を含む。とりわけ好ましいのはペプチドである。モジュレーターの一つのクラスはペプチドで、例えば、凡そ５から凡そ３５アミノ酸、好ましくは凡そ５から凡そ２０アミノ酸、特に好ましくは凡そ７から凡そ１５アミノ酸である。好ましくは、癌モジュレータータンパク質は可溶性であり、非‐膜貫通領域を含み、及び／又は、可溶性のためにＮ末端にシステインを有する。一つの実施形態においては、結合のために（すなわちシステインへの）、前記フラグメントのＣ末端は遊離酸に且つＮ末端は遊離アミンのままにしておく。一つの実施形態においては、本発明の癌タンパク質は、本書で考察する免疫原性薬剤と結合させる。一つの実施形態においては、前記癌タンパク質は、ＢＳＡと結合させる。本発明のペプチド例えば好ましい長さのものは、より長いペプチド／タンパク質を創製するために互いに又は他のアミノ酸と結合し得る。モジュレーターは、上に概説したような天然タンパク質を消化した物、ランダムなペプチド、又は、「バイアスをかけた」ランダムなペプチドであってもよい。好ましい実施形態においては、ペプチド／タンパク質を基礎とするモジュレーターは、本書で定義するような抗体及びそのフラグメントである。
癌のモジュレーターは核酸であってもよい。核酸修飾剤は、天然核酸、ランダムな核酸、又は、「バイアスをかけた」ランダムな核酸であってもよい。例えば、原核生物又は真核生物のゲノムを消化したものを、タンパク質について上述したような類似体のアプローチにおいて、使用してもよい。
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた一つの抗体を意味する―すなわち集団を構成する抗体が同一（天然に生じ得る少数の変異を除く）である。
ＰＳＣＡ関連タンパク質の生物学的モチーフにおける「モチーフ（motif）」とは、タンパク質の一次配列の部分を形成するアミノ酸の任意のパターンを言う―すなわち特定の機能（例えば、タンパク質‐タンパク質相互作用、タンパク質‐ＤＮＡ相互作用など）又は修飾（例えば、リン酸化される、糖修飾される、又は、アミド化される）又は局在化（例えば分泌性配列、核移行配列など）又は液性若しくは細胞性いずれかの免疫原性に関連した配列である。モチーフは、一般的に一定の機能又は特性と関連した特定の位置と隣接するか又は整列（aligned）する能力を有しうる。ＨＬＡモチーフの文脈中では「モチーフ」は、規定された長さのペプチドにおける残基のパターンを言い、通常、クラスＩ ＨＬＡモチーフについては凡そ８から凡そ１３アミノ酸からなるペプチド、そしてクラスＩＩ ＨＬＡモチーフについては凡そ６から凡そ２５アミノ酸からなるペプチドで、それらは特定のＨＬＡ分子によって認識される。ＨＬＡ結合のためのペプチドモチーフは、典型的には各ヒトＨＬＡアレルによってコードされた各タンパク質毎に異なっており、そして、１次及び２次アンカー残基のパターンにおいて差がある。
「医薬賦形剤（pharmaceutical excipient）」には、アジュバント、キャリアー、ｐＨ-調整及び緩衝剤、浸透圧調整剤（tonicity adjusting agent）、湿潤剤、防腐剤などのような物質を含む。
「医薬的に許容し得る（Pharmaceutically acceptable）」とは、無毒、不活性、及び／又は、ヒトのような哺乳動物に生理学的に適合性のある組成物を意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドの何れか又は何れかの型の修飾型である、少なくとも１０塩基又は塩基対の長さである核酸の重合体を意味し、且つ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの一重及び二重鎖型を意味する。本技術分野においては、本用語は、場合によっては、しばしば、「オリゴヌクレオチド」と置き換え可能なように使用されている。ポリヌクレオチドは、この中で開示されたヌクレオチド配列を含む事が出来るが、ここで、図２で例示されているようにチミジン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であることも可能；この定義はＤＮＡとＲＮＡとの化学構造における違い（特にＲＮＡの４つの主要な塩基の一つがチミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという知見）に関係している。
用語「ポリペプチド」は、少なくとも凡そ４、５、６、７、又は８アミノ酸の重合体を意味する。明細書を通して、アミノ酸表記のために標準的な３文字又は１文字表記を用いる。本技術分野において、本用語は、しばしば、「ペプチド」又は「タンパク質」と置き換え可能なように使用されている。
ＨＬＡ「一次（プライマリー）アンカー残基（primary anchor residue）」とは、免疫原ペプチドとＨＬＡ分子との接触点を提供するものと理解されているペプチド配列に沿った特異的な位置にあるアミノ酸である。１から３、普通は２の、限定された長さのペプチド内の一次アンカー残基は、免疫原ペプチドに関する「モチーフ」と定義される。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（groove）と、結合溝の特異的ポケット内に埋め込まれる側鎖と共に密に接触するものと理解されている。一つの態様では、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子に対する一次アンカー残基は、本発明に従うと、ペプチドエピトープのアミノ末端から２位の位置、及び、カルボキシ末端から８、９、１０、１１、又は１２位の位置にある。もう一つの態様において、例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドの一次アンカー残基は、ペプチド末端（該ペプチドは少なくとも９アミノ酸の長さである）からではなく、各々が互いに相対的な間隔を有している。各モチーフに対する一次アンカー残基は、表４で説明する。例えば、類似体ペプチド（analog peptides）は、表４に示した一次（primary）及び／又は二次（secondary）アンカー位置内の特定残基の存在若しくは不存在を変えることにより創出できる。そのような類似体は、特定のＨＬＡモチーフ若しくはスパーモチーフを含むペプチドの、結合親和性、及び／又は、集団範囲（population coverage）を調節するために使用される。
「放射性同位元素（radioisotopes）」は、以下のものを含むがこれらに限定されない（非極限の模範的使用法も説明する）：
** 医療用放射性同位元素の例：
Figure 2007525196

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本書で核酸及びタンパク質に適用する場合、「ランダム化」による又はそれと文法上等価なものとは、各々の核酸及びペプチドが本質的にランダムなヌクレオチド及びアミノ酸からそれぞれ成ることを意味する。これらのランダムなペプチド（又はここで述べたような核酸）は、任意の位置に、任意のヌクレオチド又はアミノ酸を組み込み得る。合成工程を、ランダム化されたタンパク質又は核酸が創生されるように設計し配列の全長に及ぶ可能な組み合わせの全て又はほどんどの編成を許容するようにしてもよく、それにより、ランダム化した候補生理活性タンパク質性試薬のライブラリーを編成する。
一つの実施形態において、ライブラリーは、任意の位置における配列優先性又は一定性が無く「完全にランダム化」されている。もう一つの実施形態において、ライブラリーは、「バイアス化されたランダム」なライブラリーである。すなわち、配列内の幾つかの位置が一定に固定されるか又は限定された数の可能性の中から選択される。例えば、核酸又はアミノ酸残基が規定されたクラス（例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアス化された（小さいか又は大きい）残基、核酸結合ドメインの創生、クロスリンクのためのシステインの創生、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位等のためのセリン、スレオニン、チロシン若しくはヒスチジン、又は、プリン等）の中でランダム化される。
「組換え（recombinant）」ＤＮＡ又はＲＮＡ分子とは、in vitroにおいて分子操作を受けたＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
低分子の非制限的な例にはＰＳＣＡと結合又は相互作用する化合物を含む；すなわち、ＰＳＣＡに結合する好ましくはＰＳＣＡタンパク質機能を阻害するリガンドでホルモン、ニューロペプチド、ケモカイン、匂い物質、リン脂質、及び、それらと機能的に等価なものを含む。このような非制限的な低分子は、好ましくは分子量において凡そ１０ｋＤａより小さく、より好ましくは凡そ９、凡そ８、凡そ７、凡そ６、凡そ５又は凡そ４ｋＤａより小さい。ある実施態様においては、低分子は、物理的にＰＳＣＡタンパク質と会合又は結合し；天然の代謝経路では見られず；及び／又は、非水性溶液よりも水性溶液においてより可溶性である。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（stringency）」は、本技術分野の通常の技術を有する者により即座に決定可能であり、一般的には、プローブ長、洗浄温度、及び、塩濃度に依存して経験的に予想される。一般に、適切なアニーリングのためには、短いプローブでは低い温度が必要なのに対し、長いプローブは高い温度が要求される。ハイブリダイゼーションは、相補鎖がその融解温度以下の環境で存在する場合には、一般的には、再アニーリングするための変性核酸配列の能力に依存する。プローブとハイブリダイズされる配列との所望のホモロジーの程度が高ければ、より高い相対的温度を使用し得る。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにし、一方でより低い温度はストリンジェンシーを低める傾向があることが分かる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての更に詳細な説明は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照。
ここで定義されたような「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」又は「高ストリンジェンシーな条件（high stringency conditions）」を、以下により確認するが、これらに限定されるものではない：（１）洗浄中の低イオン強度及び高温、例えば５０℃中で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドのような変性剤を使用する、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと共に、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムでｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；又は、（３）４２℃にて５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μg／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸にて処理し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２ｏＣにて及び５０％ホルムアミド中にて５５ｏＣにて洗浄し、続いて、５５ｏＣにてＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣで高ストリンジェンシーな洗浄をする。「中程度のストリンジェントな条件（moderately stringent conditions）」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989中にて記述されているがこれに限定されるものではなく、そして上述したものよりも低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及び、％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の一つの例としては、以下の溶液中で３７℃で終夜インキュベートする：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、及び、２０ｍｇ／ｍＬの変性し剪断されたサケ精子ＤＮＡ、続いて、凡そ３７‐５０ｏＣにて１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。熟練した技術者であれば、プローブ長などのような要因を適応させるのに必要な、温度、イオン強度その他を、どのように調整するかについて認識している。
ＨＬＡ「スーパーモチーフ（supermotif）」とは、２以上のＨＬＡアレルによってコードされたＨＬＡ分子によって共有（shared）されるペプチド結合特異性である。異なる人種の集団におけるＨＬＡスーパータイプの全体の表現型頻度を表４（Ｆ）において説明する。種々のスーパータイプの非制限的な構成要素は以下の通りである：
A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A* 0205, A*0206, A*6802, A*6901, A*0207
A3: A3, A11, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101
B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602
B44: B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001), B61 (B*4006)
A1: A*0102, A*2604, A*3601, A*4301, A*8001
A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003
B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B*4801-02, B*7301, B*2701-08
B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58
B62: B*4601, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77)
異なるＨＬＡ−スーパータイプの組み合わせによって提供されるところの算出された集団適用範囲を、表４（Ｇ）で説明する。
「治療するための（to treat）」又は「治療の（therapeutic）」及び文法的に関連した用語が本書で使用される場合、疾病の任意の結果の任意の改善すなわち生存の延長、罹患率の低下及び／又は副作用（選択的治療様式の副産物）の減少などを意味する；疾病の完全な根絶は要求されない。
「トランスジェニック動物」（例えばマウス又はラット）とは、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、該導入遺伝子は該動物又は該動物の出生前（例えば胎児期）にその祖先に導入される。「導入遺伝子（transgene）」とは、トランスジェニック動物がそれから発生するための細胞のゲノム内に組み込まれるべきＤＮＡを言う。
ここでのＨＬＡ又は細胞性免疫反応の使用における、「ワクチン」とは、本発明の１以上のペプチドを含むか又はコードする組成物である。そのようなワクチンの多数の態様、すなわち、１以上の単一ペプチドのカクテル；一つのポリエピトープ性ペプチドを含む１以上の本発明のペプチド；又は、そのような単一ペプチド若しくはポリペプチドをコードする核酸（例えばポリエピトープ性ペプチドをコードするミニ遺伝子）のような態様がある。「１以上のペプチド（one or more peptides）」は、１‐１５０又はそれ以上の任意の整数単位、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５若しくは１５０又はそれ以上の本発明のペプチドを含むことが可能である。ペプチド又はポリペプチドは、脂質化（lipidation）、ターゲティング又はその他の配列の付加によるなどして、任意的に修飾されることも可能である。本発明のＨＬＡクラスＩペプチドは、細胞障害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球の両者の活性化を促進するために、ＨＬＡクラスＩＩペプチドに混合又は結合させることが可能である。ＨＬＡワクチンは、またペプチドパルスした抗原提示細胞たとえば樹状細胞を含むことも可能である。
用語「変異体（variant）」とは、記述された型又は標準からの変異が存在する分子を言い、例えば、具体的に記述されたタンパク質（例えば図２又は図３で示したＰＳＣＡタンパク質）の相当する位置に１以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質である。類似体は変異体タンパク質の一つの例である。スプライスアイソフォーム及び一塩基多型（ＳＮＰｓ）は、変異体の更なる例である。
ＰＳＣＡ関連タンパク質は、ここで具体的に同定（identify）されたタンパク質と同様に、アレル変異体、保存された置換変異体、類似体及びホモログ（それらは、ここで概説される又は本技術分野における容易で有効な方法に従って、過度の実験を伴うこと無く、単離／生成、及び特徴づけがなされ得る）を含む。異なるＰＳＣＡタンパク質又はそのフラグメントの一部を組み合わせた融合タンパク質、と同様に、ＰＳＣＡタンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質をも、また含む。そのようなＰＳＣＡタンパク質を、集合的に、ＰＳＣＡ関連タンパク質、本発明のタンパク質、又は、ＰＳＣＡと呼ぶ。
用語ＰＳＣＡ関連タンパク質とは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５若しくは２５以上のアミノ酸、又は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５若しくは５７６以上のアミノ酸からなるポリペプチドフラグメント又はＰＳＣＡタンパク質配列を言う。
ＩＩ．）ＰＳＣＡポリヌクレオチド
本発明の一側面においては、ＰＳＣＡ遺伝子、ｍＲＮＡ、及び／又は、コード配列の全部若しくは一部に相当するか若しくは相補性であるポリヌクレオチドを、好ましくは単離した形状で提供する；該ポリヌクレオチドはＰＳＣＡ関連タンパク質及びそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及び関連分子、ＰＳＣＡ遺伝子若しくはｍＲＮＡ配列又はその一部に相補性のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、及びＰＳＣＡ遺伝子若しくはｍＲＮＡ配列に、又は、ＰＳＣＡをコードするポリヌクレオチド（総括的に「ＰＳＣＡポリヌクレオチド」）にハイブリダイズするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを包含する。このセクションで言及するすべての場合において、図２のＴはＵであってもよい。
ＰＳＣＡポリヌクレオチドの態様は以下のものを含む：図２に示した配列を有するＰＳＣＡポリヌクレオチド；図２に示したＰＳＣＡのヌクレオチド配列（ただし、ＴはＵである）；図２に示した配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも連続する１０ヌクレオチド；図２に示した配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも連続する１０ヌクレオチド（ただし、ＴはＵである）。例えば、ＰＳＣＡヌクレオチドの態様は、制限されるものではないが、以下を包含する：
（１）図２で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（２）図２Ａのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号１８から３８９で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（３）図２Ｂのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号５６から４２７で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（４）図２Ｃのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号４２３から７０７で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（５）図２Ｄのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号４２４から９９３で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（６）図２Ｅのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号９１０から１４７９で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（７）図２Ｆのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号８３から４２７で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（８）図２Ｇのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号５６から４２７で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（９）図２Ｈのストップコドンを含むヌクレオチド残基番号４２４から９９３で示された配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るポリヌクレオチド（但し、ＴはＵであってもよい）；
（１０）図２Ａ‐Ｈに示すアミノ酸配列全体に対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の相同性を有するＰＳＣＡ関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１１）図２Ａ‐Ｈに示すアミノ酸配列全体に対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有するＰＳＣＡ関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１２）表８ないし２１及び表２２ないし４９に示す、少なくとも一つのペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（１３）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのペプチド（該ペプチドは図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（１４）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのペプチド（該ペプチドは図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（１５）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのペプチド（該ペプチドは図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（１６）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのペプチド（該ペプチドは図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（１７）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのペプチド（該ペプチドは図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（１８）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのペプチド（該ペプチドは図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（１９）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのペプチド（該ペプチドは図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２０）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのペプチド（該ペプチドは図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２１）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのペプチド（該ペプチドは図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２２）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのペプチド（該ペプチドは図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２３）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのペプチド（該ペプチドは図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２４）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのペプチド（該ペプチドは図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２５）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのペプチド（該ペプチドは図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２６）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのペプチド（該ペプチドは図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２７）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのペプチド（該ペプチドは図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２８）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのペプチド（該ペプチドは図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（２９）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのペプチド（該ペプチドは図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（３０）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのペプチド（該ペプチドは図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（３１）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのペプチド（該ペプチドは図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（３２）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのペプチド（該ペプチドは図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（３３）（１）ないし（３２）の何れか一つのポリヌクレオチドと完全に相補的なポリヌクレオチド。
（３４）（１）から（３３）の何れかによってコードされるペプチド；及び；
（３５）医薬賦形剤及び／又はヒト最小投薬単位形態での(I)ないし(３３)の何れかのポリヌクレオチド又は(３４)のペプチドを含む組成物；
（３６）ＰＳＣＡ発現細胞を調節する方法において、(１)ないし(３３)の何れかのポリヌクレオチド又は(３４)のペプチド、又は、(３５)の組成物を使用する方法；
（３７）ＰＳＣＡ発現細胞を有する個体を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において(１)ないし(３３)の何れかのポリヌクレオチド又は(３４)のペプチド、又は、(３５)の組成物を使用する方法；
（３８）ＰＳＣＡ発現細胞（但し、該細胞は表１に列挙した組織の癌からの細胞）を有する個体を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において(１)ないし(３３)の何れかのポリヌクレオチド又は(３４)のペプチド、又は、(３５)の組成物を使用する方法；
（３９）癌を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において(１)ないし(３３)の何れかのポリヌクレオチド又は(３４)のペプチド、又は、(３５)の組成物を使用する方法；
（４０）表１に列挙した組織の癌を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において(１)ないし(３３)の何れかのポリヌクレオチド又は(３４)のペプチド、又は、(３５)の組成物を使用する方法；及び；
（４１）ＰＳＣＡ発現細胞のモジュレーターを同定又は特徴付けするための方法において(１)ないし(３３)の何れかのポリヌクレオチド又は(３４)のペプチド、又は、(３５)の組成物を使用する方法。
本明細書にて使用する場合、範囲は、その全整数単位の位置を具体的に開示するものと理解される。
本明細書に開示された発明の代表的な態様は、ＰＳＣＡｍＲＮＡ配列（及びかかる配列に相補的な配列）の特定の位置をコードするＰＳＣＡポリヌクレオチドであり、該タンパク質及び／又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドなどであり、例示すると：
（ａ）４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０，５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、及び、１２３、又は、それ以上のＰＳＣＡ変異体１の連続するアミノ酸であり；他の変異体に関する適切な最大長は：変異体３、９４アミノ酸；変異体４、１８９アミノ酸；変異体６、１１４アミノ酸；変異体１９、１８９アミノ酸；変異体２０、１８９アミノ酸；変異体２１、１８９アミノ酸；変異体２２、１８９アミノ酸；変異体２４、１８９アミノ酸；変異体２５、１８９アミノ酸；変異体２６、１８９アミノ酸；及び、変異体２７、１８９アミノ酸である。
例えば、本明細書に開示した本発明の代表的な態様は：
ポリヌクレオチド及びそれにコードされたペプチドそれ自体であって、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸１近傍からアミノ酸１０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸１０近傍からアミノ酸２０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸２０近傍からアミノ酸３０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸３０近傍からアミノ酸４０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸４０近傍からアミノ酸５０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸５０近傍からアミノ酸６０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸６０近傍からアミノ酸７０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸７０近傍からアミノ酸８０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸８０近傍からアミノ酸９０近傍をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸９０近傍からアミノ酸１００近傍をコードするポリヌクレオチドなどであり、凡そ１０アミノ酸区切りで図２又は図３に示すカルボキシル末端アミノ酸で終結する。従って、ＰＳＣＡタンパク質のカルボキシル末端のアミノ酸までのアミノ酸１００のアミノ酸配列の一部（凡そ１０アミノ酸の）をコードするポリヌクレオチドが本発明の態様である。この場合、それぞれ特定のアミノ酸の位置は、その位置のプラスマイナス５アミノ酸残基を開示すると理解される。
ＰＳＣＡタンパク質の比較的長い部分をコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内である。例えば、図２又は図３に示したＰＳＣＡタンパク質「又は変異体」のアミノ酸１近傍（又は２０又は３０又は４０など）からアミノ酸２０近傍（又は３０又は４０又は５０など）までをコードするポリヌクレオチドは、技術上既知の様々な技法により生成させることができる。これらのポリヌクレオチドフラグメントは図２に示したＰＳＣＡ配列の何れの部分をも包含し得る。
本明細書に開示した本発明のさらなる説明のための態様は、ＰＳＣＡタンパク質「又は変異体」配列内に含まれる生物学的モチーフの１つ以上（例えば、表８ないし２１及び表２２ないし４９に示したＰＳＣＡタンパク質「又は変異体」の１つ以上のモチーフ含有配列）をコードするＰＳＣＡポリヌクレオチドフラグメントを包含する。もう一つの態様において、本発明の典型的なポリヌクレオチドフラグメントは、既知分子に相同性を有するＰＳＣＡタンパク質又は変異体の１つ以上の領域をコードする。本発明のもう一つの態様において、典型的なポリヌクレオチドフラグメントは、ＰＳＣＡタンパク質又は変異体 Ｎ−グリコシル化部位、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、又は、Ｎ−ミリストイル化部位及びアミド化部位の１つ以上をコードし得る。
表８ないし２１及び表２２ないし４９（集団的なＨＬＡペプチドの表）のそれぞれに説明した任意のペプチドの開始位置を親ペプチドに対して決定することに注意する、例えば変異体１、変異体２等で、参照は３つの因子からなる：特定の変異体、ＨＬＡペプチドの表のペプチド長、及び、表７に列挙されている検索ペプチド（Search Peptides）。一般的に、独特な検索ペプチドは特定の変異体に対するＨＬＡペプチドを得るために使用する。各々の親ペプチドに対する各検索ペプチドの位置は、表７に列挙されている。検索ペプチドが位置Ｘで開始するのであれば、それらの親分子のＨＬＡペプチドの実際の位置を得るためには、表８ないし２１及び表２２ないし４９の各位置に値「Ｘ−１」を加えなければならない。例えば、特定の検索ペプチドが親分子の位置１５０で開始するのであれば、その親におけるアミノ酸位置を計算するためには、１５０−１すなわち１４９を各ＨＬＡペプチドアミノ酸位置に加えなければならない。
ＩＩ．Ａ．）ＰＳＣＡポリヌクレオチドの使用
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
前項のポリヌクレオチドは、多数の、異なる特別な用途を有する。ヒトのＰＳＣＡ遺伝子は実施例３に示す染色体上の場所に位置付けられている。例えば、ＰＳＣＡ遺伝子はこの染色体上に位置付けられているので、ＰＳＣＡタンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドは、この染色体位置における細胞遺伝学的異常（種々の癌と関連があるとして同定された異常など）を特徴づけるために使用される。ある種の遺伝子では、再配列を含む様々な染色体異常が、多種の癌において、頻度の高い細胞遺伝学的異常として同定されている（参照例：Krajinovic et al., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83(1998); Johansson et al., Blood 86(10): 3905-3914(1995) 及び Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)）。従って、ＰＳＣＡタンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性表現型に寄与し得るＰＳＣＡをコードする染色体領域における細胞遺伝学的異常について、これまで可能であったものよりも遥かに正確に描写するために使用することの可能な新規手段を提供する。これに関連して、これらのポリヌクレオチドは、より細かい、あまり共通性のない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感度を拡張する技術においてその必要性を満足する（参照例：Evans et al., Am.J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994)）。
さらに、ＰＳＣＡは前立腺癌及びその他の癌において高度に発現されることが示されたので、ＰＳＣＡポリヌクレオチドは、正常組織対癌性組織におけるＰＳＣＡ遺伝子産物の状態を評価する方法に使用される。典型的には、ＰＳＣＡタンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、ＰＳＣＡ遺伝子の特定の領域（１つ以上のモチーフを含むかかる領域など）における変異（欠失、挿入、点突然変異、又は抗原の喪失に至る変化など）の存在を評価するために使用される。例示としてのアッセイ法は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ及び１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（参照例：Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)）の両者を含み、この両者によって、これらタンパク質内の領域を調べるために、タンパク質の特定領域をコードするポリヌクレオチドを利用される。
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの具体例
本明細書に開示した本発明の他の具体的に考慮される核酸関連の態様は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム及びアンチセンス分子、並びに天然資源由来若しくは合成による代替骨格に基づく核酸分子（又は代替塩基を含む）であり、また、ＰＳＣＡのＲＮＡ又はタンパク質発現を阻害し得る分子を含む。例えば、アンチセンス分子はＲＮＡであっても他の分子であってもよく、塩基対依存性に特異的にＤＮＡ又はＲＮＡに結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）又はホスホロチオアート誘導体などの非核酸分子を包含する。当業者はＰＳＣＡポリヌクレオチド及び本明細書に開示したポリヌクレオチド配列を用いて、これらの部類の核酸分子を容易に得ることができる。
アンチセンス法は細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外来オリゴヌクレオチドの投与を必要とする。用語「アンチセンス」は、かかるオリゴヌクレオチドがその細胞内標的（例えば、ＰＳＣＡ）に相補的であるという事をいう。参照例：Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression (オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のアンチセンスインヒビター), CRC Press, 1989; 及び Synthesis 1:1-5 (1988)。本発明のＰＳＣＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオアート誘導体又はＳ−オリゴ体、参照：上記のJack Cohen）などの誘導体を含み、癌細胞増殖阻害作用が強化されたものである。Ｓ−オリゴ体（ヌクレオシドホスホロチオアート）はオリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電類似体であり、そのリン酸基の非架橋酸素原子がイオウに置き換わったものである。
本発明のＳ−オリゴ体は対応するＯ−オリゴ体をイオウ転移試薬である３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシドで処理することにより調製可能である。参照：Iyer, R.P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); 及びIyer, R.P. et al., J. Am. Chem. Soc., 112: 1253-1254 (1990)。本発明の、さらなるＰＳＣＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、技術上既知のモルホリノ・アンチセンスオリゴヌクレオチドである（参照例：Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175）。
本発明のＰＳＣＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＰＳＣＡゲノム配列の５’の最初の１００コドン若しくは３’の最後の１００コドン又はその対応するｍＲＮＡに相補的であり及び安定的にハイブリダイズするＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。絶対的相補性は必要としないが、高度の相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＰＳＣＡｍＲＮＡに対する選択的なハイブリダイズを可能とするが、タンパク質キナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡにはハイブリダイズしない。一態様において、本発明のＰＳＣＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＳＣＡｍＲＮＡにハイブリダイズする配列をもつアンチセンスＤＮＡ分子の１５ないし３０マーのフラグメントである。任意的には、ＰＳＣＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＳＣＡの、最初の１０の５’コドン又は最後の１０の３’コドンの領域に相補的である３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、該アンチセンス分子は、ＰＳＣＡ発現の阻害にリボザイムを採用するために修飾される；参照例：L.A. Couture & D.T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996)。
ＩＩ．Ａ．３．）プライマー及びプライマー対
本発明のこのヌクレオチドのさらに具体的な態様は、本発明のポリヌクレオチド又はそれらの任意の特定部分の特異的増幅を可能とするプライマー及びプライマー対、並びに、本発明の核酸分子又はそれらの任意の部分に選択的又は特異的にハイブリダイズするプローブを包含する。プローブは検出可能なマーカー、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート形成剤又は酵素などで標識し得る。かかるプローブ及びプライマーは、サンプル中のＰＳＣＡポリヌクレオチドの存在を検出するために、またＰＳＣＡタンパク質を発現する細胞の検出手段として使用される。
かかるプローブの例は、図２に示したヒトＰＳＣＡｃＤＮＡ配列の全部又は一部からなるポリペプチドを含む。ＰＳＣＡｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマー対の例は、実施例にも記載する。当業者も理解するように、非常に多くの異なるプライマーとプローブが本明細書において提供した配列に基づき調製可能であり、それらを効果的に使用してＰＳＣＡｍＲＮＡを増幅及び／又は検出することができる。本発明の好適なプローブは、本発明に開示したＰＳＣＡ核酸に見出される凡そ９個、凡そ１２個、凡そ１５個、凡そ１８個、凡そ２０個、凡そ２３個、凡そ２５個、凡そ３０個、凡そ３５個、凡そ４０個、凡そ４５個、及び、凡そ５０個、以上の連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
本発明のＰＳＣＡポリヌクレオチドは、多様な目的において有用であるが、これらに限定されるものではない：例えば、ＰＳＣＡ遺伝子、ｍＲＮＡ又はそのフラグメントの増幅及び／又は検出用のプローブ及びプライマーとして；前立腺癌及びその他の癌の診断及び／又は予測用の試薬として；ＰＳＣＡポリペプチドの発現を指向し得るコード配列として；ＰＳＣＡ遺伝子の発現及び／又はＰＳＣＡ転写物の翻訳を修飾又は阻害する手段として；及び、治療剤として、有用である。
本発明は、ヒト若しくは他の哺乳動物などの天然由来のＰＳＣＡ又はＰＳＣＡ関連核酸配列を同定及び単離するための本書で記述するような任意のプローブの使用、並びに、単離された核酸配列自体（プローブ使用で見出された全ての又はほとんどの配列を含む）を含む。
ＩＩ．Ａ．４．）ＰＳＣＡをコードする核酸分子の単離
本明細書に記載されたＰＳＣＡｃＤＮＡ配列は、ＰＳＣＡ遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、並びに、ＰＳＣＡ遺伝子産物相同体、選択的にスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子変異体、及びＰＳＣＡ遺伝子産物の突然変異体型をコードするポリヌクレオチド並びにＰＳＣＡ関連タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドの単離を、可能とする。ＰＳＣＡ遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを単離するため採用し得る様々な分子クローニング法は周知である（参照例：Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室マニュアル）, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 1995）。例えば、ラムダ・ファージ・クローニング法を、市販品として入手可能なクローニングシステム（例：ラムダＺＡＰエキスプレス、ストラタジーン）を用いて、簡便に採用し得る。ＰＳＣＡ遺伝子ｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識されたＰＳＣＡｃＤＮＡ又はそのフラグメントで探索することにより、同定し得る。例えば、一態様において、ＰＳＣＡｃＤＮＡ（例えば、図２）又はその一部を合成し、ＰＳＣＡ遺伝子に対応する重複した全長ｃＤＮＡを回収するためのプローブとして使用することができる。ＰＳＣＡ遺伝子それ自体は、ＰＳＣＡ ＤＮＡプローブ又はプライマーにより、ゲノムＤＮＡライブラリー、バクテリア人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、スクリーニングして単離し得る。
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子及び宿主‐ベクター系
本発明はまた、ＰＳＣＡポリヌクレオチドを含有する組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子、そのフラグメント、類似体若しくは相同体（例えば、限定されるものではないが、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、及び、技術上周知の種々のウイルス性若しくは非ウイルス性ベクターを含む）、並びに、かかる組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子で形質転換又は形質移入された細胞を、提供する。かかる分子を生成させる方法は周知である（参照例：Sambrook et al., 1989, 上記）。
本発明はさらに適切な原核又は真核宿主細胞中に、ＰＳＣＡポリヌクレオチド、そのフラグメント、類似体若しくは相同体を含有する組換えＤＮＡ分子を含んでなる宿主‐ベクター系を提供する。適切な真核宿主細胞の例は、酵母細胞、植物細胞、又は、哺乳動物細胞若しくは昆虫細胞（例：Ｓf９若しくはハイファイブ細胞などのバキュロウイルス感染性細胞）などの動物細胞である。適切な哺乳動物細胞の例は、種々の前立腺癌細胞株、例えば、ＤＵ１４５及びＴｓｕＰｒ１、その他の形質移入又は形質導入可能な前立腺癌細胞株；並びに、組換えタンパク質の発現に常套的に使用する多くの哺乳動物細胞（例：ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３、２９３Ｔ細胞）を含む。より詳しくは、ＰＳＣＡのコード配列を含んでなるポリヌクレオチド又はそのフラグメント、類似体若しくは相同体は、本技術分野で日常的に使用されよく知られている多数の宿主‐ベクター系の使用により、ＰＳＣＡタンパク質又はそのフラグメントを生成するのに使用され得る。
ＰＳＣＡタンパク質又はそのフラグメントの発現に適した広範な宿主‐ベクター系が利用可能である；参照例：Sambrook et al., 1989, 上記；Current Protocols in Molecular Biology, 1995, 上記。哺乳動物発現用の好適なベクターは、限定されるものではないが、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（インビトロジェン）及びレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785)である。これらの発現ベクターを使用して、数種の前立腺癌細胞株及び非前立腺細胞株、例えば、
２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、及び、ＴｓｕＰｒ１などによりＰＳＣＡを発現させることができる。本発明の宿主‐ベクター系はＰＳＣＡタンパク質又はそのフラグメントの生産に有用である。かかる宿主‐ベクター系はＰＳＣＡ及びＰＳＣＡ突然変異体若しくは類似体の機能的性質の研究に採用し得る。
組換えヒトＰＳＣＡタンパク質又はその類似体若しくは相同体若しくはフラグメントは、ＰＳＣＡ関連ヌクレオチドをコードする構築物で形質移入した哺乳動物細胞により生産することができる。例えば、２９３Ｔ細胞はＰＳＣＡ又はそのフラグメント、類似体若しくは相同体をコードする発現プラスミドで形質移入することができ、ＰＳＣＡタンパク質又は関連タンパク質は２９３Ｔ細胞中で発現され、また、組換えＰＳＣＡタンパク質は標準的な精製方法により単離する（例：抗ＰＳＣＡ抗体を使用するアフィニティ精製）。もう一つの態様において、ＰＳＣＡコード配列を、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏにサブクローニングし、ＰＳＣＡ発現細胞株を樹立するためにＮＩＨ３Ｔ３、ＴｓｕＰr１，２９３及びｒａｔ−１などの種々の哺乳動物細胞株に感染させるのに使用する。技術上周知の様々な他の発現系もまた採用し得る。ＰＳＣＡコード配列にインフレームで結合するリーダーペプチドをコードする発現構築物は、分泌型の組換えＰＳＣＡタンパク質の生成に使用することができる。
本明細書にて考察するように、遺伝暗号の重複性がＰＳＣＡ遺伝子配列の変化を可能とする。とりわけ、特定の宿主種はしばしば特定のコドン優先性を有し、その結果、開示された配列を所望の宿主に対して好適であるとして適合させ得ることは既知である。例えば、好適な類似のコドン配列は、一般に稀なコドン（すなわち、所望の宿主の既知配列において凡そ２０％未満の使用頻度をもつコドン）を有し、高頻度のコドンと置換されている。特定種に対するコドンの優先性は、例えば、ＵＲＬなどのインターネット上で利用可能なコドン使用表を利用することにより計算する；ＵＲＬ：dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html。
配列のさらなる修飾は、細胞性の宿主におけるタンパク質発現を上昇させることが知られている。これらの修飾は、擬似ポリアデニル化シグナル、エクソン／イントロンのスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様の反復、及び／又は、遺伝子発現に有害な他のこのようなよく特性化されている配列を除去することを含む。該配列のＧＣ含量は、宿主細胞で発現される既知遺伝子を参考にして計算し、任意の細胞性の宿主における平均レベルに調整する。可能な場合には、該配列の修飾により、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避する。その他の有用な修飾は、オープン・リーディング・フレームの開始点に、翻訳開始共通（コンセンサス）配列を付加することである；記載例：Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989)。真核細胞リボソームがもっぱら５’近位ＡＵＧコドンで翻訳を開始するという一般則は、稀な条件下でのみ棄却されることを当業者なら理解している（参照例：Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) 及び Kozak NAR 15(20):8125-8148 (1987)）。
ＩＩＩ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質
本発明のもう一つの側面ではＰＳＣＡ関連タンパク質を提供する。ＰＳＣＡタンパク質の具体的態様は、図２又は図３に示したように、ヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチドを含んでなる。あるいは、ＰＳＣＡタンパク質の態様は、図２又は図３に示すＰＳＣＡのアミノ酸配列に変更を有する変異体、相同体又は類似体ポリペプチドを含んでなる。
ＰＳＣＡポリペプチドの実施態様には以下を含む：図２に示す配列を有するＰＳＣＡポリペプチド；ＴがＵである図２に示す配列を有するＰＳＣＡポリペプチド；少なくとも１０の連続するペプチドの図２に示す配列を有するポリペプチド；又は、ＴがＵである少なくとも１０の連続するペプチドの図２に示す配列を有するポリペプチド。例えば、ＰＳＣＡペプチドの実施形態には以下を含むが限定されるものではない：
（１）図２ＡないしＨ又は図３ＡないしＬで示されたアミノ酸配列を含むか、から本質的に成るか、又は、から成るタンパク質；
（２）図２ＡないしＨ又は図３ＡないしＬに示すアミノ酸配列全体に対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の相同性を有するＰＳＣＡ関連タンパク質；
（３）図２ＡないしＨ又は図３ＡないしＬに示すアミノ酸配列全体に対し少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の類似性を有するＰＳＣＡ関連タンパク質；
（４）図２の全アミノ酸配列ではないという条件によって任意的に制限される表８から４９に示す少なくとも一つのペプチドを含むタンパク質；
（５）図２の全アミノ酸配列ではないという条件によって任意的に制限される表８から２１に一括して示す少なくとも一つのペプチド（該ペプチドは表２２から４９にも一括して示す）を含むタンパク質；
（６）図２の全アミノ酸配列ではないという条件によって任意的に制限される表８から４９に示すペプチドから選択される少なくとも二つのペプチドを含むタンパク質；
（７）図２のアミノ酸配列からの連続配列ではないという条件によって制限される表８から４９に一括して示すペプチドから選択される少なくとも二つのペプチドを含むタンパク質；
（８）図２のアミノ酸配列からの連続配列ではないという条件によって制限される、表８から２１に示すペプチドから選択される少なくとも一つのペプチド、及び、表２２から４９に示すペプチドから選択される少なくとも一つのペプチドを含むタンパク質；
（９）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのタンパク質（該タンパク質は図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１０）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのタンパク質（該タンパク質は図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１１）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのタンパク質（該タンパク質は図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１２）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのタンパク質（該タンパク質は図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１３）１２３まで任意の整数で増加する図３Ａのタンパク質（該タンパク質は図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１４）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのタンパク質（該タンパク質は図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１５）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのタンパク質（該タンパク質は図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１６）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのタンパク質（該タンパク質は図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１７）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのタンパク質（該タンパク質は図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１８）９４まで任意の整数で増加する図３Ｂのタンパク質（該タンパク質は図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（１９）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのタンパク質（該タンパク質は図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２０）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのタンパク質（該タンパク質は図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２１）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのタンパク質（該タンパク質は図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２２）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのタンパク質（該タンパク質は図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２３）１８９まで任意の整数で増加する図３Ｃ及び図３Ｅないし３Ｌのタンパク質（該タンパク質は図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２４）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのタンパク質（該タンパク質は図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２５）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのタンパク質（該タンパク質は図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２６）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのタンパク質（該タンパク質は図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２７）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのタンパク質（該タンパク質は図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２８）１１４まで任意の整数で増加する図３Ｄのタンパク質（該タンパク質は図９のベーターターンプロファイルの０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸を含むポリペプチド；
（２９）表８ないし２１及び表２２ないし４９の集団内に少なくとも２回存在するペプチド；
（３０）表８ないし２１及び表２２ないし４９の集団内に少なくとも３回存在するペプチド；
（３１）表８ないし２１及び表２２ないし４９の集団内に少なくとも４回存在するペプチド；
（３２）表８ないし２１及び表２２ないし４９の集団内に少なくとも５回存在するペプチド；
（３３）表８ないし２１内に少なくとも１回、及び、表２２ないし４９内に少なくとも１回存在するペプチド；
（３４）表８ないし２１内に少なくとも１回、及び、表２２ないし４９内に少なくとも２回存在するペプチド；
（３５）表８ないし２１内に少なくとも２回、及び、表２２ないし４９内に少なくとも１回存在するペプチド；
（３６）表８ないし２１内に少なくとも２回、及び、表２２ないし４９内に少なくとも２回存在するペプチド；
（３７）以下の特徴の１、２、３、４、若しくは、５を含むペプチド、又は、そのようなペプチドをコードするオリゴヌクレオチド：
１）図５の親水性プロファイルの０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいか若しくは大きい、又は、１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む図３のタンパク質の全長まで任意の整数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸領域；
２）図６の疎水性親水性プロファイルの０．５、０．４、０．３、０．２、０．１と等しいか若しくは小さい、又は、０．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む図３のタンパク質の全長まで任意の整数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸領域；
３）図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいか若しくは大きい、又は、１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む図３のタンパク質の全長まで任意の整数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸領域；
４）図８の平均可動性プロファイルの０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいか若しくは大きい、又は、１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む図３のタンパク質の全長まで任意の整数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸領域；
５）図９のベーターターンプロファイルの０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいか若しくは大きい、又は、１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む図３のタンパク質の全長まで任意の整数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸領域；
（３８）医薬賦形剤及び／又はヒト最小投薬単位形態と一緒の、（１）ないし（３７）のペプチド、又は、抗体若しくはその結合領域を含む組成物；
（３９）ＰＳＣＡ発現細胞を調節する方法において、（１）ないし（３７）のペプチド、又は、抗体若しくはその結合領域を含む組成物、又は、（３８）の組成物を使用する方法；
（４０）ＰＳＣＡ発現細胞を有する個体を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において、（１）ないし（３７）のペプチド、又は、抗体若しくはその結合領域を含む組成物、又は、（３８）の組成物を使用する方法；
（４１）ＰＳＣＡ発現細胞（但し、該細胞は表１に列挙した組織の癌からの細胞）を有する個体を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において、（１）ないし（３７）のペプチド、又は、抗体若しくはその結合領域を含む組成物、又は、（３８）の組成物を使用する方法；
（４２）癌を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において、（１）ないし（３７）のペプチド、又は、抗体若しくはその結合領域を含む組成物、又は、（３８）の組成物を使用する方法；
（４３）表１に列挙した組織の癌を診断、予防、予後、又は、治療するための方法において、（１）ないし（３７）のペプチド、又は、抗体若しくはその結合領域を含む組成物、又は、（３８）の組成物を使用する方法；及び；
（４４）ＰＳＣＡ発現細胞のモジュレーターを同定又は特徴付けするための方法において、（１）ないし（３７）のペプチド、又は、抗体若しくはその結合領域を含む組成物、又は、（３８）の組成物を使用する方法。
本書で使用する場合、範囲は、その全ての整数単位の位置について具体的に開示するものと理解される。
本書で開示する本発明の典型的な実施形態には、ＰＳＣＡｍＲＮＡ配列（及びかかる配列に相補的な配列）の特定の位置をコードするＰＳＣＡポリヌクレオチドを含み、該タンパク質及び／又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドなどであり、例示すると：
（ａ）４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０，５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、及び、１２３、又は、それ以上のＰＳＣＡ変異体１の連続するアミノ酸であり；他の変異体に関する適切な最大長は：変異体３、９４アミノ酸；変異体４、１８９アミノ酸；変異体６、１１４アミノ酸；変異体１９、１８９アミノ酸；変異体２０、１８９アミノ酸；変異体２１、１８９アミノ酸；変異体２２、１８９アミノ酸；変異体２４、１８９アミノ酸；変異体２５、１８９アミノ酸；変異体２６、１８９アミノ酸；及び、変異体２７、１８９アミノ酸である。
一般に、ヒトＰＳＣＡの天然に存在する対立遺伝子変異体は、高度の構造同一性と相同性をもつ（例：９０％以上の相同性）。典型的には、ＰＳＣＡタンパク質の対立遺伝子変異体は、本明細書に記載したＰＳＣＡ配列内に保存されたアミノ酸置換を含むか、又はＰＳＣＡ相同体に相当する位置からのアミノ酸置換を含む。一群のＰＳＣＡ対立遺伝子変異体は、特定のＰＳＣＡアミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高度の相同性をもつタンパク質であるが、しかし、さらに該配列から離脱した遊離基、例えば、非保存置換、末端切除、挿入又はフレームシフトを含む。タンパク質配列を比較すると、類似性、同一性、及び相同性という用語は、それぞれが遺伝学分野で評価される明瞭な意味をもつ。さらに、パラロジー（paralogy）及びオルソロジー（orthology）は、一つの生物の所定のタンパク質ファミリーのメンバーと他の生物の同じファミリーのメンバーとの関係を記載する重要な概念であり得る。
アミノ酸の略号を表２に提供する。タンパク質の保存されたアミノ酸置換は、多くの場合タンパク質のコンホメーション（高次構造）又は機能の何れも変えることなしに実施し得る。本発明のタンパク質は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の保存された置換を包含し得る。かかる変更は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、及びロイシン（Ｌ）の何れかをこれらの疎水性アミノ酸の他のものの代わりに用い；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）の代わりに、又はその逆を；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）の代わりに、又はその逆を；また、セリン（Ｓ）をトレオニン（Ｔ）の代わりに、又はその逆を置換に用いる。他の置換は、特定アミノ酸の環境及びそのタンパク質の三次元構造での役割により、保存的とも考え得る。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は多くの場合相互交換可能であり、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）も同様である。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は多くの場合、ロイシン及びイソロイシンと交換可能であり、場合によりバリンと交換可能である。リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であるような位置において、高頻度に交換可能であり、これら２つのアミノ酸残基のｐＫの違いは有意ではない。さらに他の変化は特定の環境において「保存的」であると考え得る（参照例：本明細書の表３；pages 13-15 "Biochemistry" 2nd ED. Lubert Stryer ed (スタンフォード大学)；Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 1995 May 19: 270(20):11882-6）。
本明細書に開示された本発明の態様は、ＰＳＣＡタンパク質の、広範な種類の技術的に許容される変異体又は類似体、例えば、アミノ酸挿入、欠失及び置換を有するポリペプチドなどを含む。ＰＳＣＡ変異体は、部位特異的変異誘発法、アラニンスキャニング、及び、ＰＣＲ‐変異誘発法などの技術上既知の方法を用いて実施し得る。部位指向性変異誘発（Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)）、カセット変異誘発法（Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)）、制限選択変異誘発法（restriction selection mutagenesis ）（Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）又は他の既知の技法をクローン化ＤＮＡ上で実施し、ＰＳＣＡ変異体ＤＮＡを生産し得る。
アミノ酸スキャニング解析もまた、タンパク質−タンパク質相互作用などの特定の生物活性に関与する連続する配列中の１個以上のアミノ酸を同定するために採用し得る。スキャンしたアミノ酸の中で好適なのは、比較的小さな中性アミノ酸である。かかるアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインである。アラニンは典型的にこの群の中での好適なアミノ酸であるが、その理由はベータ炭素の先の側鎖が除かれており、変異体の主鎖のコンホメーションをあまり変化させるとは思えないからである。アラニンはまた最もありふれたアミノ酸なので、一般的に好適である。さらに、アラニンは埋没した位置及び露出した位置の両方にしばしば見出される（Creighton, The proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)）。もしアラニン置換が十分量の変異体を生じないならば、立体的等価のアミノ酸を使用することができる。
本明細書に定義するように、ＰＳＣＡ変異体、類似体又は相同体は、図３のアミノ酸配列を有するＰＳＣＡタンパク質と「交差反応性」である少なくとも１個のエピトープをもつという識別可能な属性をもつ。本文で使用する場合、「交差反応性」とはＰＳＣＡ変異体に特異的に結合する抗体又はＴ細胞が、図３のアミノ酸配列をもつＰＳＣＡタンパク質にも特異的に結合するということを意味する。ポリペプチドは、ＰＳＣＡタンパク質と特異的に結合する抗体又はＴ細胞によって認識され得るエピトープをもはや含まない場合、図３に示すタンパク質の変異体ではなくなる。タンパク質を認識する抗体が種々の大きさのエピトープに結合し、そして、凡そ４又は５個程度の連続した又は連続していないアミノ酸の集まりが、最小エピトープにおける典型的なアミノ酸数とみなされるということを、当業者は理解している。参照例：Nair et al., J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26(9): 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135(4): 2598-608。
ＰＳＣＡ関連タンパク質変異体の他のクラスは、図３のアミノ酸配列又はそのフラグメントと７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％以上の類似性をもつ。もう一つの特定のクラスのＰＳＣＡタンパク質変異体又は類似体は、本明細書に記載のＰＳＣＡ生物学的モチーフ又は現在技術的に既知のモチーフを１個以上含んでなる。従って、元のフラグメントから相対的に変化した機能的性質（例えば、免疫原性）を有するＰＳＣＡフラグメント（核酸又はアミノ酸）の類似体は、本発明に包含される。現在のモチーフ又は技術の一部となるモチーフは、図２又は図３の核酸又はアミノ酸配列に適用されるべきことが認識される。
本明細書にて考察するように、特許請求した本発明の態様は、図２又は図３に示すＰＳＣＡタンパク質の全アミノ酸よりも少ない配列を含むポリペプチドを包含する。例えば、本発明の代表的態様は、図２又は図３に示すＰＳＣＡタンパク質の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の連続するアミノ酸を有するペプチド／タンパク質を含んでなる。
さらに、本明細書に開示した本発明の代表的態様は、ＰＳＣＡアミノ酸配列全体を通して、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸１近傍ないしアミノ酸１０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸１０近傍ないしアミノ酸２０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸２０近傍ないしアミノ酸３０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸３０近傍ないしアミノ酸４０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸４０近傍ないしアミノ酸５０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸５０近傍ないしアミノ酸６０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸６０近傍ないしアミノ酸７０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸７０近傍ないしアミノ酸８０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸８０近傍ないしアミノ酸９０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸９０近傍ないしアミノ酸１００近傍からなるポリペプチドなどである。さらに、図２又は図３に示されるＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸１（又は２０又は３０又は４０など）近傍ないしアミノ酸２０（又は１３０、又は１４０又は１５０など）近傍からなるポリペプチドも本発明の態様である。本項において開始位置と停止位置は、特定した位置並びにその特定した位置のプラスマイナス５個の残基をいうものと認識する。
ＰＳＣＡ関連タンパク質は、標準のペプチド合成法を用いるか、又は、技術上既知の化学的開裂方法（chemical cleavage method）を用いて生成させる。あるいは、組換え方法を用いてＰＳＣＡ関連タンパク質をコードする核酸分子を生成させることもできる。一態様において、核酸分子はＰＳＣＡタンパク質（又は、その変異体、相同体若しくは類似体）の所定のフラグメントを生成させる手段を提供する。
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ含有タンパク質の態様
本明細書に開示する本発明のさらなる説明の態様は、図２又は図３に示すＰＳＣＡポリペプチド配列内に含まれる１個以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含んでなるＰＳＣＡポリペプチドを包含する。様々なモチーフが技術分野で既知であり、タンパク質を、公的に利用可能な多数のインターネットサイトにより、かかるモチーフの存在について評価し得る（参照例：ＵＲＬアドレス：pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/; ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsit1.html; EpimatrixTM and EpimerTM, Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; 及び BIMAS, bimas,dcrt.nih.gov/）。
ＰＳＣＡタンパク質のモチーフ含有配列を表８〜２１及び２２〜４９に示し、確認する。
表５はpfamサーチ（参照：ＵＲＬアドレス pfam.wustl.edu/）に基づいて、数種のしばしば出現するモチーフを示す。表２０の各欄は（１）モチーフ名略号；（２）モチーフファミリーの異なるメンバーの中に見出されるパーセント同一性；（３）モチーフ名又は説明；及び、（４）最も共通の機能；位置情報はモチーフが位置に関連する場合に含めた。
上に考察したＰＳＣＡモチーフを１以上含んでなるポリペプチドは、上に考察したＰＳＣＡモチーフが増殖制御不全と関わりがあるという知見の観点より、また、ＰＳＣＡが特定の癌で過剰発現されるという理由で、悪性表現型の特別の性質を解明する上で有用である（参照例：表１）。カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰ及びｃａｍｐ依存性タンパク質キナーゼ、並びに、プロテインキナーゼＣは、例えば、悪性表現型の進展と関連することが分かっている酵素である（参照例：Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) 及びO' Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)）。さらに、グリコシル化とミリストイル化の両方は、癌、及び、癌の進行にも関連するタンパク質修飾である（参照例：Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473(1): 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)）。アミド化も、癌、及び、癌の進行に関連するもう一つのタンパク質修飾である（参照例：Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)）。
もう一つの態様において、本発明のタンパク質は表８〜２１及び２２〜４９に示すペプチドなど、技術的に認められている方法に従って同定される１以上の免疫反応性エピトープを含んでなる。ＣＴＬエピトープは、特定されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＰＳＣＡタンパク質内のペプチドを同定するための特別のアルゴリズムを用いて決定し得る（例：表４；EpimatrixTM and EpimerTM, Brown University,URL: brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; 及び BIMAS, URL: bimas,dcrt.nih.gov/.）。さらに、ＨＬＡ分子に対し十分な結合親和性をもつエピトープを同定する方法であって、免疫原性エピトープであることと関連させる方法は、技術上周知であり、過度な実験をせずとも実施し得る。加えて、免疫原性エピトープであるペプチドを同定する方法は技術上周知であり、過度な実験をせずともインビトロ又はインビボの何れでも実施し得る。
また、免疫原性を調節させるために、かかるエピトープの類似体を創製する原理も技術上既知である。例えば、ＣＴＬ又はＨＴＬモチーフを含有するエピトープから開始する（参照例：表４のＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ モチーフ／スーパーモチーフ）。該エピトープは、一ヶ所の特定の位置で一つのアミノ酸を取り除き、それをその特定の位置で他の一つのアミノ酸と置き換えることにより類似体化する。例えば、表４に規定した残基に基づいて、好適な残基など他の残基を選定して有害な（deleterious）残基を置き換える；好適な残基とあまり好ましくない残基とを置き換える；又は、他の好適な残基と当初に存在する好適な残基とを置き換えることができる。置換はペプチドの一次アンカー位置又は他の位置で起こり得る；参照、例えば、表４。
様々な文献が、対象とするタンパク質及びその類似体におけるエピトープの同定と生成についての技術を示している。参照例：ＷＯ９７３３６０２（Chesnut et al.）; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; 及び Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 1663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 及び Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92。
本発明の関連する態様は、表６に示す異なるモチーフ、及び／又は、表８ないし２１及び表２２ないし４９の予測した１種以上のＣＴＬエピトープ、及び／又は、表４６ないし４９の予測した１種以上のＨＴＬエピトープ、及び／又は、技術分野で既知の１種以上のＴ細胞結合モチーフの組み合わせからなるポリペプチドを含む。好適な態様は、該ポリペプチドのモチーフ又は介在配列内に、挿入、欠失又は置換を含まない。加えて、これらモチーフの両側に、多くのＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸残基を含む態様が望ましい（例えば、該モチーフが位置するポリペプチド構築物のより大きな部分を含むために）。典型的には、モチーフの両側上のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸残基の数は、凡そ１個ないし凡そ１００個のアミノ酸残基、好ましくは５個ないし凡そ５０個のアミノ酸残基の間である。
ＰＳＣＡ関連タンパク質は、具体的には、多くの形状で存在するが、好ましくは単離された形状で存在する。精製したＰＳＣＡタンパク質分子は、抗体、Ｔ細胞又は他のリガンドとＰＳＣＡが結合するのを妨げる他のタンパク質又は分子を、実質的に含まない。単離精製の性質と度合いは、意図する用途に左右される。ＰＳＣＡ関連タンパク質の態様は、精製したＰＳＣＡ関連タンパク質及び機能的な可溶性ＰＳＣＡ関連タンパク質を包含する。一態様において、機能的な可溶性ＰＳＣＡタンパク質又はそのフラグメントは、抗体、Ｔ細胞又は他のリガンドを結合させる能力を保持する。
本発明はまた、図２又は図３に示すＰＳＣＡアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含んでなるＰＳＣＡタンパク質を提供する。かかるタンパク質はＰＳＣＡタンパク質の性質、例えば、元のＰＳＣＡタンパク質と会合するエピトープに特異的に結合する抗体の生成をもたらす能力；かかる抗体を結合させる能力；ＨＴＬ又はＣＴＬの活性化をもたらす能力；及び／又は、特異的に元のタンパク質と結合もするＨＴＬ又はＣＴＬに認識させる能力；などを示す。
特に対象とする構造を含むＰＳＣＡ関連ポリペプチドは、技術上周知の様々な分析法、例えば、チョウ−ファスマン（Chou-Fasman）、ガミエル−ロブソン（Gamier-Robson）、カイト−ドーリットル（Kyte-Doolittle）、アイゼンベルグ（Eisenberg）、カープラス−シュルツ（Karplus-Schultz）、又は、ジェイムソン−ウオルフ（Jameson-Wolf）解析の方法を用い、或いは、免疫原性に基づき、予測及び／又は同定することができる。かかる構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗ＰＳＣＡ抗体若しくはＴ細胞の生成に、又は、ＰＳＣＡに結合する細胞性因子の同定に特に有用である。例えば、親水性プロファイルは得ることが可能であり、そして、免疫原性のペプチドフラグメントをHopp, T.P. and Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828.の方法を用いて同定する。疎水性親水性プロファイルを得ることが可能であり、そして、免疫原性のペプチドフラグメントをKyte, J. and Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132.の方法を用いて同定する。パーセント接触可能残基プロファイルを得ることが可能であり、そして、免疫原性のペプチドフラグメントをJanin J., 1979, Nature 277:491-492の方法を用いて同定する。平均可動性プロファイルを得ることが可能であり、そして、免疫原性のペプチドフラグメントをBhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255.の方法を用いて同定する。ベータ−ターンプロファイルを得ることが可能であり、そして、免疫原性のペプチドフラグメントをDeleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.の方法を用いて同定する。
ＣＴＬエピトープは、特定したＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＰＳＣＡタンパク質内のペプチドを同定するための特別のアルゴリズムを用いて決定し得る（例：ワールドワイド・ウエブのＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイトを使用することによる。URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; 表４（Ａ）−（Ｅ）に掲載；EpimatrixTM and EpimerTM, Brown University, URL (URL: brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatris.html); 及び BIMAS, URL;bimas.dcrt.nih.gov/）。これを説明すると、ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７及びＢ３５の状況において、提示されるＰＳＣＡからペプチドエピトープが予測された（表８ないし２１及び表２２ないし４９）。具体的には、ＰＳＣＡタンパク質の完全アミノ酸配列及び他の変異体の適切な部分すなわち点変異又はその変異体の相当するエクソン接合部の側の何れかにおけるＭＨＣクラスＩ予測９隣接残基、及び、点変異又はその変異体の相当するエクソン接合部の側の何れかにおけるＭＨＣクラスＩＩ予測１４隣接残基を、上記のウエブサイト、バイオインフォマティクス・アンド・モレキュラー・アナリシス・セクション（ＢＩＭＡＳ）に見出されるＨＬＡペプチド・モチーフ・サーチ・アルゴリズムに；更にSYFPEITHIサイト（URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/）に入力した。
ＨＬＡペプチド・モチーフ検索アルゴリズムはパーカー博士（Dr. Ken Parker）が開発したもので、ＨＬＡクラスＩ分子の溝、特にＨＬＡ−Ａ２における特異的ペプチド配列の結合に基づくものである（参照例：Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２及び多くの他のＨＬＡクラスＩ分子に対し予測される結合について、完全なタンパク質配列から８マー、９マー及び１０マーペプチドの位置と順位を提供する。多くのＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは８、９、１０又は１１マーである。例えば、クラスＩのＨＬＡ−Ａ２については、エピトープは、好ましくは、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）を位置２に、また、バリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）をＣ末端に含む（参照例：Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992)）。ＰＳＣＡ予測結合ペプチドの選択結果を本明細書の表８ないし２１及び表２２ないし４９に示す。表８ないし２１及び表２２ないし４７に、各ファミリーメンバーについての選択された候補、９マー及び１０マーを、それらの位置、各特異的ペプチドのアミノ酸配列、及び、予測される結合スコアとともに示す。表４６ないし４９に、各ファミリーメンバーについての選択された候補、１５マーを、それらの位置、各特異的ペプチドのアミノ酸配列、及び、予測される結合スコアとともに示す。結合スコアは３７℃、ｐＨ６.５での該ペプチドを含む複合体が解離する推定半減時間に相当する。最高の結合スコアをもつペプチドは、細胞表面のＨＬＡクラスＩに、最長時間、最も堅固に結合することが予測され、従って、Ｔ細胞認識のための最良の免疫原標的を示すものである。
ＨＬＡ対立遺伝子に対するペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上での、ＨＬＡ発現の安定化により評価し得る（参照例：Xue et al., Prostate 30: 73-8 (1997) 及び Peshwa et al., Prostate 36: 129-38 (1998)）。特異ペプチドの免疫原性は、樹状細胞などの抗原提示細胞の存在下、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激によりインビトロで評価し得る。
評価すべきことは、ＢＩＭＡＳサイト、EpimerTM及びEpimatrixTMサイトにより予測される何れのエピトープ、或いは、技術的に利用可能な又は表４に示すように技術の一部となる（又はワールドワイド・ウエブサイト URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/若しくはBIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/を使用して決定される）ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩのモチーフにより特定された何れのエピトープも、ＰＳＣＡタンパク質に対して「適用される」べきことである。この文脈で使用する場合、「適用される」とはＰＳＣＡタンパク質を、例えば、関連分野の当業者が評価するように、目視にて、又はコンピュータに基づくパターン・ファインディング法により評価する。ＨＬＡクラスＩモチーフを含有する８、９、１０、又は１１のアミノ酸残基のＰＳＣＡのサブ配列、又は、ＨＬＡクラスＩＩモチーフを含有する９以上のアミノ酸残基のサブ配列は、何れも本発明の範囲内である。
ＩＩＩ．Ｂ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質の発現
以下の例に記載する態様において、ＰＳＣＡは、Ｃ末端６×ＨｉｓとＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、インビトロジェン、又は、Ｔａｇ５、ジェンハンターコーポレーション（GenHunter Corporation）ナッシュビル、ＴＮ）とともにＰＳＣＡをコードするＣＭＶ駆動ベクターなどの市販品として入手し得る発現ベクターにより形質移入した細胞（２９３Ｔ細胞など）で簡便に発現し得る。Ｔａｇ５ベクターは形質移入細胞中で分泌されたＰＳＣＡタンパク質の生産を容易にするために使用されるＩｇＧＫ分泌シグナルを提供する。培地中で分泌されたＨＩＳタグ標識−ＰＳＣＡは、例えば、標準法によりニッケルカラムを用いて精製し得る。
ＩＩＩ．Ｃ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質の修飾
共有結合修飾などのＰＳＣＡ関連タンパク質の修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の一つのタイプは、ＰＳＣＡポリペプチドの標的アミノ酸残基とＰＳＣＡの選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導化剤との反応である。本発明の範囲に包含されるＰＳＣＡポリペプチドのもう一つのタイプの共有結合修飾は、本発明タンパク質の本来のグリコシル化パターンを変化させることからなる。ＰＳＣＡのもう一つのタイプの共有結合修飾は、様々な非タンパク質ポリマーの一つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンなどに、米国特許（USP4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192又は4,179,337）に開示された方法により、ＰＳＣＡポリペプチドを結合させることからなる。
本発明のＰＳＣＡ関連タンパク質はまた、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＳＣＡを含んでなるキメラ分子を形成するように、修飾することができる。かかるキメラ分子は、化学的に又は組換えにより合成し得る。キメラ分子は、本発明のタンパク質が別の腫瘍関連抗原又はそのフラグメントと融合したものを、持ち得る。あるいは、本発明によるタンパク質は、ＰＳＣＡ配列（アミノ酸又は核酸）のフラグメントの融合を含んでなり、その結果、分子はその全長で図２又は図３に示されるアミノ酸又は核酸配列に直接相同ではないものとして創製される。かかるキメラ分子はＰＳＣＡの複数の同じサブ配列を含み得る。キメラ分子は、ＰＳＣＡ関連タンパク質と、ポリヒスチジンエピトープタグ（固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する）、サイトカイン、又は、増殖因子、との融合物を含んでなる。エピトープタグは一般に、ＰＳＣＡの、アミノ又はカルボキシル末端に設置する。代わり得る態様において、キメラ分子はＰＳＣＡ関連タンパク質と免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合物を含んでなる。キメラ分子の二価形状（「イムノアドヘシン」ともいう）の場合、かかる融合物はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対し得る。Ｉｇ融合物は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ＰＳＣＡポリペプチドの可溶性（膜透過性ドメインの欠失又は不活化）形状との置換を含む。好適な態様において、免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧｌ分子のヒンジＣＨ２及びＣＨ３を、又は、ヒンジＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合物の生産についての参照例：米国特許５,４２８,１３０（１９９５年６月２７日発行）。
ＩＩＩ．Ｄ．）ＰＳＣＡ関連タンパク質の用途
本発明のタンパク質は多くの異なる特異的な用途を有する。ＰＳＣＡは前立腺癌及び他の癌で高度に発現されるので、ＰＳＣＡ関連タンパク質は正常組織とそれに対する癌組織中でのＰＳＣＡ遺伝子産物の状態を評価し、それによって悪性表現型を解明する方法に使用する。典型的には、ＰＳＣＡタンパク質の特定領域からのポリペプチドは、これら領域（１個以上のモチーフを含む領域など）の変異（欠失、挿入、点突然変異など）の存在を評価するために使用する。模範となるアッセイ法では、正常組織とそれに対する癌組織中でのこの領域の特性を評価するために、又は、エピトープに対する免疫応答を惹起するために、ＰＳＣＡポリペプチド配列内に含まれる１個以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含んでなるＰＳＣＡ関連タンパク質を標的とする抗体又はＴ細胞を利用する。別法としては、ＰＳＣＡタンパク質の１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＰＳＣＡ関連タンパク質を、ＰＳＣＡの当該領域と相互作用する因子をスクリーニングするために使用する。
ＰＳＣＡタンパク質フラグメント／サブ配列は、ＰＳＣＡ又はその特定の構造ドメインに結合する物質又は細胞性因子を同定するために、ドメイン特異的抗体（例えば、ＰＳＣＡタンパク質の細胞外又は細胞内エピトープを認識する抗体）の生成及び特徴付けに特に有用であり、また種々の治療及び診断状況、例えば、限定されるものではないが、診断アッセイ、癌ワクチン及びかかるワクチンの製造法に有用である。
ＰＳＣＡ遺伝子がコードするタンパク質、又は、その類似体、相同体若しくはフラグメントがコードするタンパク質は、様々な用途を有する；例えば、限定されるものではないが、ＰＳＣＡ遺伝子産物に結合する抗体の生成、並びに、リガンド及びその他の物質及び細胞性成分を同定する方法などである。ＰＳＣＡタンパク質又はそのフラグメントに対する抗体は、表１に掲載したようなＰＳＣＡタンパク質の発現により特徴づけられるヒトの癌の管理における診断及び予知のアッセイ並びに画像化方法に有用である。かかる抗体は細胞内で発現可能であり、かかる癌をもつ患者の治療方法に使用し得る。ＰＳＣＡ関連の核酸又はタンパク質もまた、ＨＴＬ又はＣＴＬ反応を生成させる際に使用する。
ＰＳＣＡタンパク質の検出に有用な種々の免疫学的アッセイ法が使用される；例えば、限定されるものではないが、種々タイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学法などである。抗体は標識して、ＰＳＣＡ発現細胞を検出し得る免疫学的画像形成剤として使用し得る（例：ラジオシンチグラフ画像化法にて）。ＰＳＣＡタンパク質はまた、さらに本明細書に記載するように、癌ワクチンの生成に特に有用である。
ＩＶ．）ＰＳＣＡ抗体
本発明のもう一つの側面は、ＰＳＣＡ関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好適な抗体は、生理的条件下で、ＰＳＣＡ関連タンパク質に特異的に結合し、ＰＳＣＡ関連タンパク質ではないペプチド又はタンパク質には結合しない（結合してもわずかである）。本文脈における生理的条件の例には以下を含む：１）リン酸緩衝食塩水;２）トリス緩衝食塩水（２５ｍＭトリス及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する）；又は、３）通常の生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）；４）ヒト血清のような動物血清；又は、５）１）から４）のいずれかの組み合わせ；これらの反応は、ｐＨ７．５で生じるのが好ましく、或いは、ｐＨ ７．０から８．０の範囲で、又は、或いは、ｐＨ６．５から８．５の範囲で；また、こららの反応は４℃から３７℃の温度で生じる。例えば、ＰＳＣＡに結合する抗体は、ＰＳＣＡ関連タンパク質、例えばその相同体又は類似体、に結合する。
本発明のＰＳＣＡ抗体は、癌（参照、例、表１）の診断及び予測のアッセイにおいて並びに画像化方法において、特に有用である。同様に、かかる抗体は、ＰＳＣＡが他の癌にも発現又は過剰発現される限りにおいて、それらの癌の治療、診断、及び／又は予測において、特に有用である。さらに、細胞内で発現される抗体（例：一本鎖抗体）は、進行又は転移した前立腺癌など、ＰＳＣＡの発現が関与する癌の治療において、治療上有用である。
本発明は、ＰＳＣＡ及び突然変異ＰＳＣＡ関連タンパク質の検出と定量に有用な種々の免疫学的アッセイ法をも提供する。かかるアッセイ法は、適切な場合、ＰＳＣＡ関連タンパク質を認識及び結合し得る１種以上のＰＳＣＡ抗体を含み得る。これらのアッセイは技術上周知の種々の免疫学的アッセイ形式に基づいて実施する；該方法は限定されるものではないが、種々タイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）などである。
本発明の免疫学的な非抗体アッセイは、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性又は刺激性）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）結合アッセイをも含む。
加えて、ＰＳＣＡを発現する前立腺癌及びその他の癌を検出し得る免疫学的画像化法もまた本発明により提供される；かかる方法は限定されるものではないが、標識したＰＳＣＡを使用するラジオシンチグラフ画像化法である。かかるアッセイ法は、前立腺癌などのＰＳＣＡを発現する癌の検出、モニター、及び、予測において臨床的に有用である。
ＰＳＣＡ抗体はまた、ＰＳＣＡ関連タンパク質の精製法、並びに、ＰＳＣＡ相同体及び関連分子の単離方法にも、使用される。例えば、ＰＳＣＡ関連タンパク質の精製法は、固体マトリックスに結合されているＰＳＣＡ抗体を、ＰＳＣＡ抗体がＰＳＣＡ関連タンパク質と結合することが可能な条件下で、ＰＳＣＡ関連タンパク質を含む溶出液又はその他の溶液とインキュベートし；該固体マトリックスを洗浄して不純物を除き；結合した抗体からＰＳＣＡ関連タンパク質を溶出することからなる。本発明のＰＳＣＡ抗体のその他の用途は、ＰＳＣＡタンパク質を模倣（mimic）する抗イディオタイプ抗体の生成を含む。
様々な抗体調製法が技術上周知である。例えば、単離された形状の又は免疫コンジュゲート形状のＰＳＣＡ関連タンパク質、ペプチド又はフラグメントを用い、適当な哺乳動物宿主を免疫することにより、抗体を調製し得る（Antibodies: A Laboratory Manual (抗体：実験室マニュアル)、CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)）。加えて、ＰＳＣＡの融合タンパク質、例えば、ＰＳＣＡ ＧＳＴ融合タンパク質なども使用し得る。特定の態様においては、図２又は図３のアミノ酸配列の全部又は大部分を含んでなるＧＳＴ融合タンパク質を製造し、それを免疫原として使用し、適切な抗体を生成する。もう一つの態様においては、ＰＳＣＡ関連タンパク質を合成し、免疫原として使用する。
加えて、技術上既知の、裸のＤＮＡ（naked DNA）免疫化技法は、コードされた免疫原に免疫応答を生じさせるために（精製したＰＳＣＡ関連タンパク質又はＰＳＣＡ発現細胞とともに又は不存在下に）使用される（参照総説：Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15:617-648）。
図２又は図３に示すＰＳＣＡのアミノ酸配列を分析して、抗体を生成させるためのＰＳＣＡタンパク質の特異的領域を選択することができる。例えば、ＰＳＣＡアミノ酸配列の疎水性及び親水性分析を用いて、ＰＳＣＡ構造中の親水性領域を同定する（参照例：標題「抗原性プロフィール」の実施例）。免疫原構造を示すＰＳＣＡタンパク質の領域、並びに、その他の領域及びドメインを、技術上既知のその他の種々の方法を用いて容易に同定し得る；例えば、チョウ−ファスマン（Chou-Fasman）、ホップとウッズ（Hopp and Woods）、カイト−ドーリットル（Kyte-Doolittle）、ジャニン（Janin）、バスカランとポヌスワミイ（Bhaskaran and Ponnuswamy）、デリージとロー（Deleage and Roux）、ガミエル−ロブソン（Gamier-Robson）、アイゼンベルグ（Eisenberg）、カープラス−シュルツ（Karplus-Schultz）、又は、ジェイムソン−ウオルフ（Jameson-Wolf）分析などである。親水性プロファイルは、Hopp, T.P. and Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828.の方法を用いて得ることが可能である。疎水性親水性プロファイルは、Kyte, J. and Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132.の方法を用いて得ることが可能である。パーセント（％）接触可能残基プロファイルは、Janin J., 1979, Nature 277:491-492の方法を用いて得ることが可能である。平均可動性プロファイルは、Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255.の方法を用いて得ることが可能である。ベータ−ターンプロファイルは、免疫原性のペプチドフラグメントをDeleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.の方法を用いて得ることが可能である。従って、これらのプログラム又は方法の何れかにより同定される各領域は、本発明の範囲内である。ＰＳＣＡ抗体を生成させる方法については、本明細書中に提供した実施例の方法によりさらに説明する。免疫原として使用するタンパク質又はポリペプチドの調製法は技術上周知である。ＢＳＡ、ＫＬＨ又はその他の担体タンパク質などの担体と、タンパク質との免疫原抱合体の調製法も、また技術上周知である。ある場合には、例えば、カルボジイミド試薬を用いる直接抱合を用いる；他の場合にはピアス・ケミカル（ロックフォード、ＩＬ）が供給するような連結試薬が有効である。ＰＳＣＡ免疫原の投与は、しばしば適当な時間間隔の注射により実施し、技術上理解されるように、適当なアジュバントと共に使用する。免疫化スケジュールの期間に、抗体形成の適正を確認するために、抗体力価を測定し得る。
ＰＳＣＡモノクローナル抗体は技術的に周知の種々の手段により製造し得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化した細胞は、一般的に知られているように、コーラーとミルシュタイン（Kohler and Milstein）の標準的ハイブリドーマ法、又は、抗体産生Ｂ細胞を不死化するような修飾、を用いて調製する。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がＰＳＣＡ関連タンパク質である免疫学的検定（イムノアッセイ）によりスクリーニングする。適切な不死化細胞培養が同定された場合、該細胞培養を拡張し、インビトロ培養系又は腹水液から抗体を産生させ得る。
本発明の抗体又はフラグメントは、組換えの手法によっても製造し得る。キメラの又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植された、多種由来の抗体の状態において、ＰＳＣＡタンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域を製造することもできる。ヒト化又はヒトのＰＳＣＡ抗体もまた製造可能であり、治療における使用に好ましい。１種以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列と置換することにより、マウス又はその他の非ヒト抗体を、ヒト化する方法は周知である（参照例：Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536）。Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 及び Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296 も参照。
完全ヒトモノクローナル抗体の製造法は、ファージディスプレイ及びトランスジェニック法を含む（参照総説：Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-639）。完全ヒトＰＳＣＡモノクローナル抗体は、大規模ヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリーを用いたクローニング技法（すなわち、ファージディスプレイ）により生成させ得る（Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries (インビトロ免疫系の構築：ファージディスプレイライブラリイからのヒト抗体). Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man (ヒトにおける予防及び治療適用抗体分子のタンパク質エンジニアリング), Clark, M.(Ed.), Nottingham Academic, pp45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries (コンビナトリアルライブラリーからのヒト抗体), Id., pp65-82）。完全ヒトＰＳＣＡモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように設計したトランスジェニックマウスを用いて製造することができる；記載例は１９９７年１２月３日公開されたKucherlapati及びJakobovitsらによるＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（また、Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614； 米国特許６,１６２,９６３（２０００年１２月１９日発行）；ＵＳＰ６,１５０,５８４（２０００年１１月１２日発行）；及び、６,１１４,５９８（２０００年９月５日発行）も参照）。この方法は、ファージディスプレイ技法で必要なインビトロ操作を回避し、効率的に高親和性で真正のヒト抗体を産生する。
ＰＳＣＡ抗体のＰＳＣＡ関連タンパク質との反応性は、多くの既知の方法、例えば、ＰＳＣＡ関連タンパク質、ＰＳＣＡ発現細胞又はその抽出物を適切に使用した、ウエスタンブロット、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析により立証可能である。ＰＳＣＡ抗体若しくはそのフラグメントは検出可能なマーカーで標識するか、又は、第二分子に抱合させ得る。適当な検出可能マーカーは、限定されるものではないが、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート又は酵素である。さらに、２つ以上のＰＳＣＡエピトープに特異的な二重特異性抗体は、技術上一般に知られた方法を用いて生成させる。ホモダイマー抗体もまた、技術上既知の架橋法により生成させ得る（例：Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565）。
Ｖ.）ＰＳＣＡ細胞性免疫応答
Ｔ細胞が抗体を認識するメカニズムについて、詳細が描写されてきている。本発明の有効なペプチドエピトープワクチン組成物は、世界的な集団の非常に広範な部分において、治療的又は予防的な免疫反応を誘導する。細胞性免疫応答を誘発する本発明組成物の価値及び有効性を理解するために、免疫学関連技法の簡潔な概説が提供されている。
ＨＬＡ分子とペプチド抗原の複合体は、ＨＬＡ制限Ｔ細胞により認識されるリガンドとして作用する（Buus, S. et al., Cell 47: 1071, 1986; Babbitt, B.P. et al., Nature 317: 359, 1985; Townsend, A. and Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R.N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993）。単一アミノ酸置換の抗原類似体の研究、及び、内因性に結合する天然に作用するペプチドの配列決定を経て、ＨＬＡ抗原分子に特異的に結合するために必要なモチーフに対応する重要な（決定的な）残基が同定されており、それを表４に示す（参照例：Southwood, et al., J. Immunol. 160: 3363, 1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41: 178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, access via World Wide Web at URL (134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm); Settem A. and Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. and Grey, H.M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. and Hammer, J. Curr. Biol. 6: 52, 1994; Ruppert et al., Cell 74: 929-937, 1993; Kondo et al., J. Immunol. 155: 4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157: 3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45: 79-93, 1996; Sette, A. and Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov; 50(3-4): 201-12, 総説）。
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶解析により、ペプチドリガンドが保持する残基をアレル特異的様式で収容するＨＬＡ分子の該ペプチドが結合する割れ目／溝の中に、ポケットがあることが明らかになった；結果として、これらの残基が、これらの残基を有するペプチドのＨＬＡ結合能を決定する（参照例：Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587; Smith, et al., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J.H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053,1993; Guo, H.C. et al., Nature 360:364,1992; Silver, M.L. et al., Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D.H. et al., Science 257:919, 1992; Saper, M.A., Bjorkman, P.J. and Wiley, D.C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991）。
従って、クラスＩ及びクラスＩＩアレル特異的ＨＬＡ結合モチーフ、又は、クラスＩ若しくはクラスＩＩスーパーモチーフを限定することで、特定のＨＬＡ抗原に対する結合と（相関）関係にあるタンパク質内領域を、同定することが可能となる。
従って、ＨＬＡモチーフの同定によって、エピトープに基づくワクチンの候補が同定されている；かかる候補はＨＬＡ−ペプチド結合アッセイによりさらに評価し、該エピトープ及びその相当するＨＬＡ分子の結合親和性及び／又は会合時間を決定することができる。さらなる確認作業は、これらのワクチン候補の中で、集団の適用範囲の点で、及び／又は、免疫原性の点で、好適な特性をもつエピトープを選択するために実施し得る。
細胞性の免疫原性を評価するためには、以下の様々な戦略を利用し得る：
１）正常個体からの一次Ｔ細胞培養物の評価（参照例：Wentworth, P.A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1, 1998）。この手法は、正常被験者からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、抗原提示細胞の存在下にインビトロでテストペプチドにより数週間にわたり刺激することからなる。該ペプチドに特異的なＴ細胞はこの期間に活性化されることとなり、例えば、リンホカイン又は５１Ｃｒ放出アッセイ（ペプチド感作標的細胞を含む）により検出する。
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化（参照例：Wentworth, P.A. et al., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P.A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159:4753, 1997）。例えば、かかる方法では、不完全フロインドアジュバント中のペプチドをＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与する。免疫の数週間後、脾細胞を取り出し、テストペプチドの存在下に約１週間培養する。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイ（ペプチド感作標的細胞及び内因性に生成される抗原を発現する標的細胞を含む）により、検出する。
３）効果的にワクチン接種した免疫個体からの、及び／又は、慢性段階ＩＩＩの患者からのリコールＴ細胞応答の証明（参照例：Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181;1047, 1995; Doolan, D.L. et al., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S.C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H.M. et al., J. Virol. 71:6011, 1997）。従って、病気のため該抗原に接触し結果として免疫応答を「自然に」生じた被験者からの、又は、該抗原に対しワクチン接種した患者からのＰＢＬを培養することにより、リコール応答は検出される。被験者からのＰＢＬは、テストペプチドと抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下に１〜２週間インビトロで培養することにより、「メモリー」Ｔ細胞の活性化（「ナイーブ」Ｔ細胞に比較して）が可能となる。培養終了時点において、５１Ｃｒ放出（ペプチド感作標的を含む）、Ｔ細胞増殖、又はリンホカイン放出を含むアッセイにより、Ｔ細胞活性を検出する。
ＶＩ．）ＰＳＣＡトランスジェニック動物
ＰＳＣＡ関連タンパク質をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の生成にも使用し得るが、該動物は結果として治療的に有用な試薬の開発及びスクリーニングにおいて有用である。確立された技法に従い、ＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡは、ＰＳＣＡをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用し得る。クローン化ゲノム配列は、次いでＰＳＣＡをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成させるために使用し得る。トランスジェニック動物、特にマウス又はラットなどの動物についての生成方法は技術上常套のものとなっており、例えば、米国特許４,７３６,８６６（１９８８年４月１２日発行）及び４,８７０,００９（１９８９年９月２６日発行）に記載されている。典型的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを含むＰＳＣＡ導入遺伝子の標的となろう。
ＰＳＣＡをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を使用して、ＰＳＣＡをコードするＤＮＡの発現増加の効果を試験することができる。かかる動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的症状から保護すると考えられる試薬についての試験動物として、使用し得る。本発明のこの側面によると、動物を試薬で処置し、該導入遺伝子を含有する未処置動物に比較して病理学的症状の発生率が低下している場合、その病理学的症状に対する潜在的な治療的介在があったとする。
あるいは、ＰＳＣＡの非ヒト相同体は、ＰＳＣＡ「ノックアウト」動物を構築するために使用し得る；ノックアウト動物はＰＳＣＡをコードする内在性遺伝子と、その動物の胚細胞に導入したＰＳＣＡをコードする改変ゲノムＤＮＡとの間の相同的組み換えの結果として、ＰＳＣＡのコードに欠陥のある遺伝子又は改変された遺伝子をもつ動物である。例えば、ＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡを用い、確立された技法に従ってＰＳＣＡをコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。ＰＳＣＡをコードするゲノムＤＮＡの一部は削除するか、又は組込みをモニターするために使用し得る選択可能なマーカーをコードする遺伝子などの別の遺伝子と置き換え得る。典型的には、数キロベースの未変化末端切除ＤＮＡ（５’及び３’両末端）が該ベクターに含まれている（参照例：相同的組み換えベクターの説明 Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)）。該ベクターは胚性幹細胞株に導入し（例えば、エレクトロポレーションにより）、導入したＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同性に組み換った細胞を選択する（参照例：Li et al., Cell, 69:915 (1992)）。選択した細胞は、次いで動物（例：マウス又はラット）の胚盤胞に注入し、集合キメラを形成させる（参照例：Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (奇形癌腫及び胚性幹細胞：実用法)、E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp.113-152）。キメラ胚は次いで適当な偽妊娠メス里子哺育動物に移植し、該胚が「ノックアウト」動物を創生する条件とする。その幹細胞に相同的組み換えＤＮＡを保持する子孫は標準的技法により同定可能であり、その動物の細胞すべてが相同的組み換えＤＮＡを含む動物に繁殖するために使用することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理学的症状に対しての防御能力、又は、ＰＳＣＡポリペプチドの存在しないことによる病理学的症状の発症において、特徴付けることができる。
ＶＩＩ．）ＰＳＣＡの検出方法
本発明のもう一つの側面は、ＰＳＣＡポリヌクレオチドと及びＰＳＣＡ関連タンパク質の検出方法、並びにＰＳＣＡを発現する細胞の同定方法に関する。ＰＳＣＡの発現プロフィールは転移性疾患の診断マーカーとなる。従って、ＰＳＣＡ遺伝子産物の状態は、疾患のステージが進行する可能性、進行速度、及び／又は、腫瘍攻撃性などを含む種々の因子を予測するために有用な情報を提供する。本明細書で詳細に考察するように、患者サンプル中のＰＳＣＡ遺伝子産物の状態は、技術上周知の様々なプロトコール、例えば、免疫組織化学分析、in situ ハイブリダイゼーションなどの様々なノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉顕微解剖サンプル）、ウエスタンブロット分析、及び組織アレイ分析などにより分析し得る。
より詳しくは、本発明は、生体サンプル、例えば、尿、血清、骨、前立腺液、組織、精液、細胞調製品など中のＰＳＣＡポリヌクレオチドを検出するアッセイ法を提供する。検出可能なＰＳＣＡポリヌクレオチドは、例えば、ＰＳＣＡ遺伝子又はそのフラグメント、ＰＳＣＡｍＲＮＡ、選択的スプライス変異体ＰＳＣＡｍＲＮＡ、及び、ＰＳＣＡポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子である。ＰＳＣＡポリヌクレオチドの存在を、増幅及び／又は検出する多くの方法が技術上周知であり、本発明のこの局面の実施に採用し得る。
一態様において、生体サンプル中のＰＳＣＡｍＲＮＡを検出する方法は、少なくとも１種のプライマーを用い、逆転写によりサンプルからｃＤＮＡを生産し、そのように生産したｃＤＮＡを、センス及びアンチセンスプライマーとしてのＰＳＣＡポリヌクレオチドにより増幅して、サンプル中のＰＳＣＡｃＤＮＡを増幅し、次いで増幅したＰＳＣＡｃＤＮＡの存在を検出することからなる。任意的に、増幅したＰＳＣＡｃＤＮＡの配列を決定し得る。
もう一つの態様において、生体サンプル中のＰＳＣＡ遺伝子を検出する方法は、先ずサンプルからゲノムＤＮＡを分離すること；センス及びアンチセンスプライマーとしてＰＳＣＡポリヌクレオチドを用い、単離したゲノムＤＮＡを増幅すること；及び増幅したＰＳＣＡ遺伝子の存在を検出すること；からなる。いくつもの適切なセンス及びアンチセンスプローブの組み合わせを、ＰＳＣＡ用に提供されるヌクレオチド配列（参照、例えば図２）から設計し、この目的に使用し得る。
本発明はまた、組織又は他の生体サンプル、例えば、尿、血清、精液、骨、前立腺、細胞調製品など中のＰＳＣＡタンパク質の存在を検出するアッセイ法を提供する。ＰＳＣＡ関連タンパク質を検出する方法もまた周知であり、例えば、免疫沈降法、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどを含む。例えば、生体サンプル中のＰＳＣＡ関連タンパク質の存在を検出する方法は、先ずサンプルをＰＳＣＡ抗体、そのＰＳＣＡ反応性フラグメント、又はＰＳＣＡ抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質と接触させること；次いでサンプル中のＰＳＣＡ関連タンパク質の結合を検出すること；からなる。
ＰＳＣＡを発現する細胞の同定法もまた、本発明の範囲内である。一態様において、ＰＳＣＡ遺伝子を発現する細胞の同定アッセイ法は、細胞中のＰＳＣＡｍＲＮＡの存在を検出することからなる。細胞中の特定のｍＲＮＡの検出方法は周知であり、例えば、相補性ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ（標識したＰＳＣＡリボプローブを用いるin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技法など）及び種々の核酸増幅アッセイ法（ＰＳＣＡに特異的な相補性プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ、及び他の増幅型検出法、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）を含む。あるいは、ＰＳＣＡ遺伝子を発現する細胞の同定アッセイ法は、細胞中の、又は細胞が分泌するＰＳＣＡ関連タンパク質の存在を検出することからなる。様々なタンパク質検出法が技術的に周知であり、ＰＳＣＡ関連タンパク質の検出及びＰＳＣＡ関連タンパク質を発現する細胞の検出に採用される。
ＰＳＣＡ発現分析はまたＰＳＣＡ遺伝子発現を調節する薬剤の同定及び評価用の手段としても有用である。例えば、ＰＳＣＡ発現は前立腺癌で有意に上方制御され、表１に掲載した組織の癌において発現される。癌細胞中でＰＳＣＡ発現又は過剰発現を阻害する分子又は生物学的物質の同定には治療上の価値がある。例えば、かかる物質はＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション又は抗体結合によりＰＳＣＡの発現を定量するスクリーニングを用いることにより同定することができる。
ＶＩＩＩ．）ＰＳＣＡ関連遺伝子及びその産物のモニター方法
発癌は多段階プロセスであることが知られており、細胞増殖が進行性に制御不全となり、細胞が正常の生理的状態から前癌状態、さらには癌状態にまで進行する（参照例：Alers et al., Lab Invest. 77(5):437-438 (1997) 及び Isaacs et al., Cancer Surv. 23:19-32 (1995)）。この状況下で、制御不全細胞増殖を証明するために生体サンプルを調べることにより（癌における異常なＰＳＣＡ発現など）、治療選択のさらに限定される段階及び／又は予後の悪化する段階へと癌が進行するような病的状態になる前に、かかる異常な生理状態の初期検出が可能となる。かかる試験においては、対象の生体サンプルの状態を、例えば、対応する正常サンプル（例：病理学的影響を受けていない個体あるいは別の個体からのサンプル）中のＰＳＣＡの状態と比較することができる。生体サンプル中のＰＳＣＡの状態の変化は（正常サンプルと比較した場合）、制御不全細胞増殖の証拠を提供する。正常サンプルとして病理学的に影響を受けていない生体サンプルを使用することに加えて、ｍＲＮＡ発現を予め決定した正常レベルなど予め決定した基準値を、サンプル中のＰＳＣＡの状態を比較するために使用することもできる（参照例：Grever et al., J. Comp. Neurol. 1996 Dec 9:376(2):306-14 及び米国特許５,８３７,５０１）。
この状況下、用語「状態」はその技術的に受け入れられている意味に従って使用され、また遺伝子及びその産物の条件又は状態をいう。一般的に、当業者は多くのパラメーターを使用し、遺伝子及びその産物の条件又は状態を評価する。これらは、限定されるものではないが、発現された遺伝子産物の位置（ＰＳＣＡ発現細胞の位置を含む）並びにそのレベル、及び発現された遺伝子産物の生物活性（ＰＳＣＡｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド及びポリペプチドなど）を含む。一般的に、ＰＳＣＡの状態の変化は、ＰＳＣＡ及び／又はＰＳＣＡ発現細胞の位置における変化、及び／又はＰＳＣＡｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現の増加からなる。
サンプル中のＰＳＣＡの状態は、技術上周知の多くの手段により分析し得る；その手段は限定されるものではなく、免疫組織化学的分析、in situ ハイブリダイゼーション、レーザー捕捉顕微解剖サンプル上のＲＴ−ＰＣＲ分析、ウエスタンブロット分析、及び組織アレイ分析などを含む。ＰＳＣＡ遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価する代表的なプロトコールは、例えば、以下の文献に見出される；Ausubel et al., eds. 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Unite 2 (ノーザンブロッティング)、4 (サザーンブロッティング)、15 (免疫ブロッティング)及び18（ＰＣＲ分析）。従って、生体サンプル中のＰＳＣＡの状態は、当業者が利用する様々な方法によって評価される；かかる方法は、限定されるものではないが、ゲノム・サザーン分析（例えば、ＰＳＣＡ遺伝子の変異を試験するため）、ＰＳＣＡｍＲＮＡのノーザン分析及び／又はＰＣＲ分析（例えば、ＰＳＣＡｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列又は発現レベルの変化を試験するため）、及びウエスタン及び／又は免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列の変化、サンプル内のポリペプチド位置の変化、ＰＳＣＡタンパク質の発現レベルの変化及び／又はＰＳＣＡタンパク質とポリペプチド結合パートナーとの会合を試験するため）などを含む。検出可能なＰＳＣＡポリヌクレオチドは、例えば、ＰＳＣＡ遺伝子又はそのフラグメント、ＰＳＣＡｍＲＮＡ、選択スプライス変異体、ＰＳＣＡｍＲＮＡ、及びＰＳＣＡポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
ＰＳＣＡの発現プロフィールは、それを局所及び／又は転移疾患に対する診断マーカーとし、生体サンプルの増殖又は発癌の潜在能力についての情報を提供する。特に、ＰＳＣＡの状態は特定疾患の病期、進行、及び／又は腫瘍攻撃性を予測するために有用な情報を提供する。本発明はＰＳＣＡの状態を決定し、表１に掲載した組織の癌など、ＰＳＣＡを発現する癌を診断する方法及びアッセイ法を提供する。例えば、ＰＳＣＡｍＲＮＡは、正常前立腺組織に比較して、前立腺癌、その他の癌においてかなり高度に発現されるので、生体サンプル中のＰＳＣＡｍＲＮＡ転写物又はタンパク質のレベルは、ＰＳＣＡ制御不全と関連する疾患の診断に使用することが可能であり、適切な治療選択肢を決定する際に有用な予後情報を提供し得る。
ＰＳＣＡの発現状態は、形成異常、前癌及び癌状態の存在、段階及び位置などについての情報、疾患が種々の段階へ進行する可能性を予測する情報、及び／又は、腫瘍攻撃性を正確に測定するための情報を提供する。さらに、発現プロフィールは、それを転移疾患用の画像化剤として有用なものとする。結果として、本発明の一つの側面は、癌などの制御不全細胞増殖を特徴とする病態に罹患している個体又は罹患している疑いのある個体からのサンプルなど、生体サンプル中のＰＳＣＡの状態を試験するための種々の分子レベルの予測法及び診断法を目指すものである。
上述のように、生体サンプル中のＰＳＣＡの状態は、技術上周知の多くの手法により試験することができる。例えば、身体の特定部分から採取した生体サンプル中のＰＳＣＡの状態は、ＰＳＣＡ発現細胞（例：ＰＳＣＡｍＲＮＡ又はタンパク質を発現する細胞）の存在又は不存在についてサンプルを評価することにより試験し得る。この試験において、例えば、ＰＳＣＡ発現細胞が、通常かかる細胞を含まない生体サンプル（リンパ節など）に見出される場合、制御不全細胞増殖の証拠を提供し得る；その理由は生体サンプル中のＰＳＣＡの状態のかかる変化が、しばしば制御不全細胞増殖と関連するからである。具体的には、制御不全細胞増殖の一指標は、元の臓器（前立腺など）から身体の異なる領域（リンパ節など）への癌細胞の転移である。この意味で、制御不全細胞増殖の証拠は、例えば潜在性のリンパ節転移が前立腺癌の相当数の患者の集団に検出されるので重要であり、かかる転移は疾患進行の既知予測因子と関連する（参照例：Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Sur. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) 及び Freeman et al., J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1): 474-8）。
一側面において、本発明はＰＳＣＡ遺伝子産物をモニターする方法を提供するが、該方法は制御不全細胞増殖（過形成又は癌など）と関連する疾患をもつ疑いのある個体からの細胞が発現するＰＳＣＡ遺伝子産物の状態を決定し、そのように決定した状態を、相当する正常サンプル中のＰＳＣＡ遺伝子産物の状態と比較することからなる。正常サンプルに比較して、テストサンプル中に異常なＰＳＣＡ遺伝子産物が存在する場合、これはその個体の細胞内に制御不全細胞増殖の存在を示すものとなる。
もう一つの側面において、本発明は個体に癌の存在することを決定する際の有用なアッセイ法を提供するが、該アッセイ法はテスト細胞又は組織におけるＰＳＣＡｍＲＮＡ又はタンパク質発現が、相当する正常細胞又は組織における発現レベルと比較して、有意な増大のあることを検出することからなる。ＰＳＣＡｍＲＮＡの存在は、例えば、表１に掲載した組織に限定されるものではないが、該組織サンプル中で評価し得る。これら組織の何れかにおける有意なＰＳＣＡ発現の存在は、癌の発生、存在及び／又は重篤度を示すために有用であるが、その理由は相当する正常組織がＰＳＣＡｍＲＮＡを発現しないか又は低レベルでしか発現しないからである。
関連する態様において、ＰＳＣＡの状態は核酸レベルよりもむしろタンパク質レベルで決定される。例えば、かかる方法はテスト組織サンプル中の細胞が発現するＰＳＣＡタンパク質のレベルを決定し、そのように決定されたレベルを相当する正常サンプル中で発現されるＰＳＣＡのレベルと比較することからなる。一態様において、ＰＳＣＡタンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学的方法により評価する。ＰＳＣＡタンパク質発現を検出し得るＰＳＣＡ抗体又は結合パートナーは、この目的のために技術上周知の様々なアッセイ形式で使用される。
さらなる態様においては、これら分子構造の変異を同定するために、生体サンプル中のＰＳＣＡヌクレオチド及びアミノ酸配列の状態を評価することができる。これらの変異は挿入、欠失、置換などを含むことが出来る。かかる評価は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の変異が、増殖制御不全表現型と関連する多くのタンパク質に観察されるため有用である（参照例：Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378）。例えば、ＰＳＣＡの配列内における突然変異は、腫瘍の存在又は促進を示すものであり得る。従って、かかるアッセイ法はＰＳＣＡの突然変異は、機能の潜在的な喪失又は腫瘍増殖の増大を示す場合、診断的又は予後的価値を有する。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列における変異を観察するための幅広いアッセイ法は、技術上周知である。例えば、ＰＳＣＡ遺伝子産物の核酸及びアミノ酸配列のサイズ及び構造は、本明細書にて考察したノーザン、サザーン、ウエスタン、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定プロトコールにより観察される。加えて、１本鎖高次構造多型など、ヌクレオチド及びアミノ酸配列における変異を観察するためのその他の方法は、技術上周知である（参照例：米国特許５,３８２,５１０（１９９９年９月７日発行）及びＵＳＰ５,９５２,１７０（１９９５年１月１７日発行））。
さらには、生体サンプル中のＰＳＣＡ遺伝子のメチル化状態を試験し得る。遺伝子５’制御領域におけるＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化及び／又は過剰メチル化が不死化及び形質転換細胞に起こり、結果として種々の遺伝子の発現に変化を起こし得る。例えば、πクラス グルタチオンＳトランスフェラーゼ（正常前立腺で発現しているタンパク質であるが、前立腺癌腫の９０％以上で発現していない）のプロモーター過剰メチル化は、この遺伝子の持続的な転写サイレンシングとして表れ、前立腺癌腫において最も高頻度に検出される(De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999))。加えて、重い前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の少なくとも７０％のケースにおいてこの変化が存在している(Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536)。その他の例では、ＬＡＧＥ―Ｉ癌特異的遺伝子（該遺伝子は正常前立腺では発現していないが前立腺癌の２５―５０％で発現している）の発現が、リンパ芽球腫細胞におけるデオキシ‐アザシチジンによって誘導され、これは、腫瘤の発現が脱メチルによることを示唆している(Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998))。遺伝子のメチル化状態を試験する様々な方法が技術上周知である。例えば、サザーンハイブリダイゼーション法では、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を評価するために、メチル化ＣｐＧ部位を含む配列を切断することのできないメチル化感受性制限酵素を利用することができる。加えて、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランドに存在するすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態の概略を迅速に描き出すことができる。この手法では、重亜硫酸ナトリウムにより最初にＤＮＡを修飾（すべての非メチル化シトシンをウラシルに変換する）、次いでメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの各々に特異的なプライマーを用いて増幅することからなる。メチル化干渉に関わるプロトコールはまた、例えば、文献に見出される（Current Protocols in Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel el al., eds., 1995）。
遺伝子増幅はＰＳＣＡの状態を評価するさらなる方法である。サンプル中における遺伝子増幅を直接測定する；例えば、本明細書に提供した配列に基づき、適切に標識したプローブを用い、ｍＲＮＡ転写を定量する常套のサザーンブロッティング若しくはノーザンブロッティング（Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又は、in situ ハイブリダイゼーションによる。あるいは、特異的二重鎖、例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖又はＤＮＡ−タンパク質二重鎖を認識する抗体を採用する。該抗体を次に標識し、二重鎖が表面に結合している場合、アッセイを実施し、その結果、表面の二重鎖の形成に基づき、二重鎖に結合した抗体の存在を検出し得る。
生検組織又は末梢血は、ＰＳＣＡの発現を検出するために、例えば、ノーザン、ドットブロット又はＲＴ−ＰＣＲ分析を用い、癌細胞の存在について簡便にアッセイすることができる。ＲＴ−ＰＣＲで増幅可能なＰＳＣＡｍＲＮＡの存在は、癌の存在を示すものとなる。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは技術上周知である。末梢血腫瘍細胞のＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイについては、多くのヒト固形腫瘍の診断及び管理に使用するために、現在評価されつつある。前立腺癌領域においては、ＰＳＡ及びＰＳＭの発現細胞を検出するためのＲＴ―ＰＣＲ分析が、これに含まれる(Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688)。
本発明のさらなる側面は、癌の発生について、個体が有する罹患率を評価することである。一態様において、罹患率を予測する方法は、組織サンプル中のＰＳＣＡｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質を検出することからなり、その存在は癌に罹患可能性であることを示し、その場合、ＰＳＣＡｍＲＮＡ発現の度合いは、罹患可能性の度合いと相関する。具体的な態様において、前立腺又はその他の組織におけるＰＳＣＡの存在を試験し、サンプル中にＰＳＣＡが存在する場合は、前立腺癌の罹患可能性（又は前立腺腫瘍の発生又は存在）を示すものとする。同様に、挿入、欠失、置換などのこれら分子の構造における変異を同定するために、生体サンプル中のＰＳＣＡヌクレオチドとアミノ酸配列の完全性を評価し得る。サンプル中のＰＳＣＡ遺伝子産物に１つ以上の変異の存在する場合は、癌の罹患可能性（又は腫瘍の発生又は存在）を示している。
本発明はまた、腫瘍攻撃性を正確に測定する方法を含んでなる。一態様において、腫瘍の攻撃性を正確に測定する方法は、腫瘍細胞が発現するＰＳＣＡｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質のレベルを決定し、そのように決定したレベルと、同じ個体から採取した対応する正常組織又は正常組織対照サンプルにて発現されるＰＳＣＡｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質のレベルとを比較することからなり、その際、腫瘍サンプル中のＰＳＣＡｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質の、正常サンプルに比較した発現度によって、攻撃度を示すものとする。特定の態様において、腫瘍の攻撃性は腫瘍細胞中でＰＳＣＡがどの程度発現されるかを決定し、発現レベルが高いほど、より攻撃性の腫瘍であるとする。もう一つの態様では、挿入、欠失、置換などのこれら分子構造の変異を確認するために、生体サンプル中のＰＳＣＡヌクレオチド及びアミノ酸配列の完全性を評価する。１つ以上の変異の存在は、腫瘍がより攻撃的であることを示す。
本発明のもう一つの態様は、個体の悪性度の進行を経時的に観察する方法を指向する。一態様において、個体の悪性度の進行を経時的に観察する方法は、腫瘍細胞が発現するＰＳＣＡｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質のレベルを決定し、そのように決定したレベルと、同じ個体から異なる時間に採取した等価の組織サンプルにて発現されるＰＳＣＡｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質のレベルとを比較することからなるが、その際、腫瘍サンプル中のＰＳＣＡｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質の経時的な発現度が、癌進行に関する情報を提供する。特定の態様において、癌の進行は腫瘍細胞中のＰＳＣＡの発現を経時的に測定することにより評価するが、その際、発現が経時的に増大しているならば、癌が進行しているとする。また、挿入、欠失、置換などのこれら分子構造の変異を確認するために、生体サンプル中のＰＳＣＡヌクレオチド及びアミノ酸配列の完全性を評価するが、その場合、１つ以上の変異の存在は、癌が進行していることを示す。
上記の診断方法は、技術上既知の様々な予測及び診断プロトコールの何れか１つと組合わせることができる。例えば、本発明のもう一つの態様は、組織サンプルの状態を診断及び予測する手段として、ＰＳＣＡ遺伝子及びＰＳＣＡ遺伝子産物の発現（又は、ＰＳＣＡ遺伝子及びＰＳＣＡ遺伝子産物の変異）及び悪性度と関連する因子の間の同時発生を観察する方法を目的とする。悪性度と関連する多様な因子、例えば、悪性度と関連する遺伝子発現（例：前立腺癌におけるＰＳＡ、ＰＳＣＡ、及び、ＰＳＭ発現など）並びに肉眼による細胞学的観察（参照例：Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson et al.,1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24）が利用し得る。ＰＳＣＡ遺伝子及びＰＳＣＡ遺伝子産物の発現（又は、ＰＳＣＡ遺伝子及びＰＳＣＡ遺伝子産物の変異）及び悪性度と関連するもう１つの因子の間の同時発生を観察する方法は、例えば、疾患と同時に生じる１セットの因子の存在が組織サンプルの状態を診断し、予測するために決定的な情報を提供するので有用である。
一態様において、ＰＳＣＡ遺伝子及びＰＳＣＡ遺伝子産物の発現（又はＰＳＣＡ遺伝子及びＰＳＣＡ遺伝子産物の変異）及び悪性度と関連するもう１つの因子の間の同時発生を観察する方法は、組織サンプル中のＰＳＣＡｍＲＮＡ若しくはタンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＰＳＡ ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の過剰発現（又はＰＳＣＡ若しくはＰＳＭ発現）を検出すること、及びＰＳＣＡｍＲＮＡ若しくはタンパク質及びＰＳＡ ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の過剰発現（又はＰＳＣＡ若しくはＰＳＭ発現）の同時発生を観察することを必要とする（Amara et al., 2001, Cancer Res 61:4660-4665; Konety et al., Clin Cancer Res. 2000, 6(7):2618-2625）。特定の態様において、前立腺組織におけるＰＳＣＡ及びＰＳＡの発現を試験するが、その場合、サンプル中の、ＰＳＣＡ及びＰＳＡ ｍＲＮＡの過剰発現の同時発生は、前立腺癌の存在、前立腺癌の罹患可能性又は前立腺腫瘍の発生若しくは状態を示す。
ＰＳＣＡｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を検出し、定量する方法は本明細書に記載され、標準的核酸とタンパク質の検出及び定量法は、技術上周知である。ＰＳＣＡｍＲＮＡの標準的検出及び定量法は、標識したＰＳＣＡリボプローブを用いるin situ ハイブリダイゼーション、ＰＳＣＡポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロット及び関連技法、ＰＳＣＡに特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ分析、及びその他の増幅型検出法、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどを含む。特定の態様において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＳＣＡｍＲＮＡの発現を検出及び定量するために使用される。ＰＳＣＡを増幅し得る数種のプライマーがこの目的に使用し得る；プライマーは制限されるものではないが、本明細書に具体的に記載した種々のプライマーセットを含む。特定の態様において、野生型のＰＳＣＡタンパク質と特異的に反応するポリクローナル又はモノクローナル抗体が、剖検組織の免疫組織化学アッセイに使用し得る。
ＩＸ．）ＰＳＣＡと相互作用する分子の同定
本明細書に開示したＰＳＣＡタンパク質及び核酸配列は、ＰＳＣＡと相互作用するタンパク質、小分子及びその他の物質並びにＰＳＣＡが活性化する経路を、技術的に受け容れられている種々のプロトコールの何れか一つにより当業者が同定することを可能とする。例えば、いわゆる相互作用トラップシステム（「ツーハイブリッドアッセイ」ともいう）の一つを利用する。かかるシステムにおいては、分子同士が作用し合い、レポーター遺伝子の発現を指示する転写因子を再構築し、それによってレポーター遺伝子の発現をアッセイする。他のシステムでは、真核細胞転写活性化因子の再構築を介してインビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する；参照例：米国特許５,９５５,２８０（１９９９年９月２１日発行）、ＵＳＰ５,９２５,５２３（１９９９年７月２０日発行）、ＵＳＰ５,８４６,７２２（１９９８年１２月８日発行）、及び、ＵＳＰ６,００４,７４６（１９９９年１２月２１日発行）。アルゴリズムも、タンパク質機能のゲノムに基づく予測のために、技術的に利用し得る（参照例：Marcotte, et al., Nature 402:4 November 1999, 83-86）。
あるいは、ＰＳＣＡタンパク質配列と相互作用する分子を同定するために、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる。かかる方法において、ＰＳＣＡに結合するペプチドを、ランダム又は調整されたコレクションのアミノ酸をコードするライブラリーをスクリーニングすることにより同定する。該ライブラリーがコードするペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現されるので、ＰＳＣＡタンパク質に対してバクテリオファージ粒子をスクリーニングする。
従って、治療、予測又は診断薬などの多様な用途をもつペプチドは、予想されるリガンド又はレセプター分子の構造に関する事前の情報がなくても、このように同定される。ＰＳＣＡタンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用し得る代表的なペプチドライブラリー及びスクリーニング方法は、例えば、米国特許５,７２３,２８６（１９９８年３月３日発行）及びＵＳＰ５,７３３,７３１（１９９８年３月３１日発行）に開示されている。
あるいは、ＰＳＣＡを発現する細胞株は、ＰＳＣＡが介在するタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用する。かかる相互作用は免疫沈降法を用いて試験し得る（参照例：Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51）。ＰＳＣＡタンパク質は、抗ＰＳＣＡ抗体を用いてＰＳＣＡ発現細胞株から免疫沈降させ得る。あるいは、Ｈｉｓタグに対する抗体は、ＰＳＣＡとＨｉｓタグの融合物を発現するように調製した細胞株中で使用し得る（上記ベクター）。免疫沈降複合体は、ウエスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識化、タンパク質マイクロシークエンシング、銀染色及び二次元ゲル電気泳動などの手法により、タンパク質会合について試験し得る。
ＰＳＣＡと相互作用する小分子及びリガンドは、かかるスクリーニングアッセイの関係する態様を介して同定し得る。例えば、タンパク質機能に干渉する小分子は同定可能であり、リン酸化と脱リン酸化、細胞周期の調節を示すものとしてのＤＮＡ又はＲＮＡ分子との相互作用、セカンドメッセンジャーシグナル伝達又は腫瘍形成を仲介するＰＳＣＡの能力に干渉する小分子である。同様に、ＰＳＣＡ関連イオンチャンネル、タンパク質ポンプ、又は、ＰＳＣＡの細胞間コミュニケーション機能を調節する小分子を同定し、ＰＳＣＡを発現する癌を有する患者の治療に使用する（参照例：Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes（興奮性膜のイオンチャンネル）2nd Ed., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992）。さらに、ＰＳＣＡの機能を調節するリガンドを、ＰＳＣＡと結合しレポーター構築物を活性化する能力に基づいて、同定し得る。代表的な方法は、例えば、米国特許５,９２８,８６８（１９９９年７月２７日発行）に考察されており、少なくとも１個のリガンドが小分子であるハイブリッドリガンドを形成する方法を含む。実例となる態様においては、ＰＳＣＡとＤＮＡ結合タンパク質の融合タンパク質を発現するように調製した細胞を用い、ハイブリッドリガンド／小分子とｃＤＮＡライブラリー転写活性化因子タンパク質の融合タンパク質を同時発現する。該細胞はさらにレポーター遺伝子を含み、その発現が第一と第二融合タンパク質の近傍上で調整され、その事象はハイブリッドリガンドが両ハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合した場合にのみ起こる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞が選択され、未知小分子又は未知リガンドが同定される。この方法は、ＰＳＣＡを活性化するか又は阻害するモジュレーターを同定する手段を提供する。
本発明の態様は、図２又は図３に示すＰＳＣＡアミノ酸配列と相互作用する分子をスクリーニングする方法を包含し、該方法は分子集団とＰＳＣＡアミノ酸配列とを接触させる工程、該分子集団とＰＳＣＡアミノ酸配列とが容易に相互作用する条件下で相互作用させる工程、ＰＳＣＡアミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、及び、続いてＰＳＣＡアミノ酸配列と相互作用しない分子を相互作用する分子から分離する工程からなる。特定の態様において、該方法はさらにＰＳＣＡアミノ酸配列と相互作用する分子を精製、特徴づけ及び同定する工程を含んでなる。同定した分子は、ＰＳＣＡが果たす機能を調節するために使用し得る。好適な態様において、ＰＳＣＡアミノ酸配列はペプチドライブラリーと接触させる。
Ｘ．）治療方法及び組成物
限定された一群の組織において正常に発現されるが、表１で列挙されたような癌でも発現されるタンパク質としてＰＳＣＡを同定することは、かかる癌の治療において多くの治療方法の道を開く。
注目すべきことに、抗癌療法は、標的タンパク質が正常組織たとえ生命維持に重要な正常組織に発現している場合でも、有用である。
生命維持に重要な器官は、生命維持に必須のものであり、心臓、大腸などである。生命維持に重要でない器官は、個体から取り除いても生存可能なような器官である。生命維持に重要でない器官の例は、卵巣、乳、前立腺である。
例えば、ハーセプチン（登録商標） はＦＤＡ認可医薬品であり、その活性成分として抗体（該抗体は種々のＨＥＲ２、 ＨＥＲ２／ｎｅｕ、及びｅｒｂ‐ｂ‐２として知られるタンパク質と免疫反応する）を有している。ジェネンテックにより市販され、抗癌剤として商業的に成功している。２００２年のハーセプチンの売り上げは４億ドルに到達した。ハーセプチンはＨＥＲ２陽性乳癌のための治療である。しかし、ＨＥＲ２の発現がこのような癌に限定されてはいない。同一のタンパク質は多くの正常組織で発現している。とりわけ、ＨＥＲ２／ｎｅｕが正常な腎臓及び心臓で発現しているのは知られており、そのため、これら組織はハーセプチンのヒト受容者全てに存在する。正常な腎臓におけるＨＥＲ２／ｎｅｕの存在は、Latif, Z., et al., B.J.U. International (2002) 89:5-9.によっても確認されている。この論文（該論文は、腎臓細胞癌腫はハーセプチンのような抗ＨＥＲ２抗体の好ましい適応であるか否かを評価している）に示されているように、タンパク質及びｍＲＮＡの両者が悪性でない腎臓組織で産生されている。明白に、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は、悪性でない腎臓組織で強く発現している。
ＨＥＲ２／ｎｅｕが心臓及び腎臓のような生命維持に重要な組織で発現しているにもかかわらず、ハーセプチンは非常に有用であり、ＦＤＡ認可され、商業的にも成功している薬剤である。心臓組織へのハーセプチンの影響すなわち心臓毒性は治療における稀な副作用である。ハーセプチン単独で患者が治療された場合、有意な心臓毒性は非常に低い割合の患者でしか起こらなかった。
とりわけ注目すべきは、腎臓組織が、正常発現の存在を、心臓組織より高い発現で示したにもかかわらず、腎臓は評価できるほどのハーセプチンの副作用がなかったことである。さらに、ＨＥＲ２が発現している正常組織の多様なアレイにおいて、ほとんど副作用が生じていない。結局、心臓組織のみでしか評価できる副作用は明らかになっていない。腎臓のようなＨＥＲ２／ｎｅｕ発現が特に顕著な組織は、副作用の基礎とはなっていなかった。
更に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする抗癌療法において好都合な治療効果が見出された。ＥＧＦＲも、多数の正常組織で発現している。抗ＥＧＦＲ療法を用いた後の正常組織における副作用は非常に限定されたものだった。
ゆえに、正常組織たとえ生命維持に重要な正常組織における標的タンパク質の発現は、ある種の癌の治療としてのタンパク質に対する標的薬剤の使用を失敗させない（該正常組織で該タンパク質が過剰発現していても）。
それゆえ、ＰＳＣＡタンパク質活性を抑制する治療アプローチは、ＰＳＣＡを発現する癌で苦しむ患者に有用である。これら治療アプローチは、一般に二つのクラスに分けられる。一つのクラスは、ＰＳＣＡタンパク質のその結合パートナー又はその他のタンパク質との結合又は会合を抑制する種々の方法を含む。もう一つのクラスは、ＰＳＣＡ遺伝子の転写又はＰＳＣＡ ｍＲＮＡの翻訳を抑制する種々の方法を含む。
Ｘ.Ａ．）抗癌ワクチン
本発明はＰＳＣＡ関連タンパク質又はＰＳＣＡ関連核酸を含んでなる癌ワクチンを提供する。ＰＳＣＡを発現するという観点で、癌ワクチンはＰＳＣＡを発現する癌を予防及び／又は治療するが、非標的組織に対しては影響が無いか又は殆ど無い。体液性及び／又は細胞仲介免疫応答を生じるワクチンにおいて腫瘍抗原を、抗癌療法に使用することは技術上周知であり、ヒトＰＳＭＡ及び齧歯類ＰＡＰ免疫原を用いて前立腺癌に用いられてきた（参照例：Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117）。
かかる方法はＰＳＣＡ関連タンパク質を採用することにより、又はＰＳＣＡをコードする核酸分子及びＰＳＣＡ免疫原（一般的には多くの抗体又はＴ細胞エピトープを含んでなる）を発現・提示し得る組換えベクターを採用することにより、容易に実施し得る。当業者も理解するように、免疫反応性エピトープを送達するための多様なワクチン系が技術上既知である（参照例：Heryln et al., Ann Med 1999 Feb 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32）。簡単に説明すると、哺乳動物で（体液性及び／又は細胞仲介などの）免疫応答を生成するかかる方法は、哺乳動物免疫系を免疫反応性エピトープ（例：図３に示すＰＳＣＡタンパク質又はその類似体若しくは相同体に存在するエピトープ）に接触させる工程、結果として該哺乳動物がそのエピトープに特異的な免疫応答を生じる（例えば、そのエピトープを特異的に認識する抗体を生じる）工程からなる。好適な方法において、ＰＳＣＡ免疫原は生物学的モチーフを含む；例えば、表８〜２１及び２２〜４９、又は、図５、図６、図７、図８、及び図９に示すＰＳＣＡからのサイズ範囲のペプチドを参照されたい。
全ＰＳＣＡタンパク質、その免疫原性領域又はエピトープを組合わせ、種々の手段で送達する。かかるワクチン組成物は、例えば、リポペプチド（例：Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）微粒子のカプセルに詰めたペプチド組成物（参照例：Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991; Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13:675-681, 1995）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれるペプチド組成物（参照例：Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998）、多重抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（参照例：Tam, J.P., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996）、多価ペプチドとして調製したペプチド；射出送達系に使用するペプチド、典型的な結晶化ペプチド、ウイルス送達ベクター（Perkus, M.E. et al.,In: Concepts in vaccine development (ワクチン開発の概念) Kaufmann, S.H.E., ed., p,379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535,1986; Hu, S.L. et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F.H. et al., J. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P.K. et al., Virology 175:535, 1990）、ウイルス又は合成起源の粒子（例：Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods, 192:25, 1996; Eldridge, J.H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L.D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995）、アジュバント（Warren, H.S., Vogel, F.R., and Chedid, L.A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R.K. et al., Vaccine 11:293, 1993）、リポソーム（Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K.L., Immunol. Today 17:131, 1996）、裸又は粒子吸収ｃＤＮＡ（Ulmer, J.B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H.L., Hunt, L.A., and Webster, R.G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J.W. et al., Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p.423, 1996; Cease, K.B., and Berzofsky, J.A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 and Eldridge, J.H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993）を、包含する。レセプター仲介標的化としても知られる毒素標的化送達法、例えば、アバント・イムノセラピューティックス・インク（Avant Immunotherapeutics, Inc.）（ニーダム、マサチューセッツ）のものも、また使用し得る。
本発明のワクチン組成物はまた、ＰＳＣＡ関連癌の患者において、癌に使用される他の治療法、例えば、手術、化学療法、薬物療法、放射線療法などと共に使用し得るし、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどの免疫補助剤との組み合わせでも使用し得る。
細胞性ワクチン
ＣＴＬエピトープは、対応するＨＬＡアレルに結合するＰＳＣＡタンパク質内のペプチドを同定するための特別のアルゴリズムを用いて決定し得る（参照例：表４；EpimerTM and EpimatrixTM, Brown University (URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); 及び BIMAS,(URL. bimas,dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI at URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)。好適な態様においてＰＳＣＡ免疫原は、表８〜２１及び２２〜４９に示した配列など、技術上周知の技法を用いて同定した１つ以上のアミノ酸配列、又はＨＬＡクラスＩモチーフ／スーパーモチーフにより特定される８、９、１０又は１１個のアミノ酸のペプチド（例：表４（Ａ）、表４（Ｄ）、又は表４（Ｅ））及び／又はＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフを含んでなる少なくとも９個のアミノ酸のペプチド（例：表４（Ｂ）又は表４（Ｃ））、を含む。技術上認められているように、ＨＬＡクラスＩ結合の溝は実質的に閉鎖されており、その結果、特定サイズ範囲のペプチドのみがその溝に嵌合し、結合することができる；一般にＨＬＡクラスＩのエピトープは、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸の長さである。対して、ＨＬＡクラスＩＩの結合溝は実質的に開放されている；従って、約９個以上のアミノ酸のペプチドがＨＬＡクラスＩＩ分子と結合することができる。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ間の結合溝の差のために、ＨＬＡクラスＩモチーフは鎖長特異的である、すなわち、クラスＩモチーフの位置２は該ペプチドのアミノからカルボキシルの方向に２番目のアミノ酸である。クラスＩＩモチーフにおけるアミノ酸位置は、ペプチド全体ではなく互いに対してのみの関係である、すなわち、追加されたアミノ酸は、モチーフ含有配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端に付着することができる。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、多くの場合、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のアミノ酸の長さであるか、又は２５個を超えるアミノ酸長である。
抗体に基づくワクチン
哺乳動物において免疫応答を生じさせる多様な方法が技術上既知である（例えば、ハイブリドーマ生成における第一ステップとして）。哺乳動物において免疫応答を生成させる方法は、哺乳動物の免疫系を、タンパク質（例：ＰＳＣＡタンパク質）上の免疫原エピトープに接触させ、その結果として、免疫応答を生じさせる。典型的な態様は宿主中にＰＳＣＡに対する免疫応答を生じさせる方法からなり、該方法は該宿主を十分量の少なくとも１種のＰＳＣＡ Ｂ細胞若しくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ又はその類似体と接触させること、そしてその後、少なくとも一定の期間間隔で該宿主をＰＳＣＡ Ｂ細胞若しくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ又はその類似体と再接触させることからなる。特定の態様は、ＰＳＣＡ関連タンパク質又は人工的多重エピトープペプチドに対して免疫応答を生じさせる方法からなる；該方法はワクチン製剤中のＰＳＣＡ免疫原（例：ＰＳＣＡタンパク質又はそのペプチドフラグメント、ＰＳＣＡ融合タンパク質又は類似体など）をヒト又は別の哺乳動物に投与することからなる。一般的に、かかるワクチン製剤はさらに適切なアジュバント（参照例：米国特許６,１４６,６３５）又はＰＡＤＲＥＴＭペプチド（エピミューン・インク（Epimmune Inc.）、サンディエゴ、ＣＡ）などの普遍性ヘルパーエピトープを含む（参照例：Alexander et al., J.Immunol. 2000 164(3)：1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 及び Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92）。代替方法はＰＳＣＡ免疫原に対し個体に免疫応答を生じさせることからなるが、該方法は個体身体の筋肉又は皮膚に、ＰＳＣＡ免疫原をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ分子をインビボ投与することによる；該ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列の発現を制御する調節配列に有効に結合している；ＤＮＡ分子が細胞に取り込まれると、そのＤＮＡ配列は細胞内で発現し、該免疫原に対して免疫応答を生じる（参照例：米国特許５,９６２,４２８）。選択肢として、遺伝子ワクチン促進因子、例えば、アニオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；及び尿素なども投与する。更に、抗イディオタイプ抗体が、標的高原に対する反応を生起するために模倣ＰＳＣＡとして投与され得る。
核酸ワクチン
本発明のワクチン組成物は核酸仲介様式のものである。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを患者に投与し得る。遺伝子免疫化法は、ＰＳＣＡ発現癌細胞に対して予防的又は治療的体液性及び細胞性免疫応答を生じさせるために採用し得る。ＰＳＣＡ関連タンパク質／免疫原及び適切な調節配列をコードするＤＮＡを含んでなる構築物は、個体の筋肉又は皮膚に直接注射することができ、その結果、筋肉又は皮膚の細胞は該構築物を取り込み、コードされたＰＳＣＡタンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンはＰＳＣＡ関連タンパク質を含んでなる。ＰＳＣＡ関連タンパク質免疫原の発現は、結果としてＰＳＣＡタンパク質を含有する細胞に対して予防的又は治療的体液性及び細胞性免疫を生じさせる。技術上既知の予防的及び治療的遺伝子免疫化法が使用し得る（概説については、インターネットアドレス genweb.com で公開されている情報及び文献参照）。核酸に基づく送達については、文献に記載されている（例えば、Wolff et al., Science 247:1465 (1990) 並びに、米国特許５,５８０,８５９；５,５８９,４６６；５,８０４,５６６；５,７３９,１１８；５,７３６,５２４；５,６７９,６４７；国際特許出願ＷＯ９８／０４７２０）。ＤＮＡに基づく送達法の例は、「裸のＤＮＡ」促進化（ブピビカイン、ポリマー、ペプチド仲介）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子仲介（「遺伝子銃」）又は圧力仲介送達（参照例：ＵＳＰ５,９２２,６８７）を含む。
治療又は予防的な免疫化を目的に、本発明のタンパク質はウイルス又はバクテリアベクター経由で発現させ得る。本発明の実施に使用し得る種々のウイルス遺伝子送達系は、制限されるものではないが、ワクチニア、鶏痘、カナリア痘、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、及びシンドビスウイルスを含む（参照例：Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang et al., J. Natl. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)）。非ウイルス送達系を採用し、ＰＳＣＡ関連タンパク質をコードする裸のＤＮＡを患者に（例えば、筋肉内又は皮内に）導入し、抗腫瘍応答を誘導することもできる。
ワクチニアウイルスは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして使用する。宿主への導入により、組換えワクチニアウイルスは免疫原性ペプチドのタンパク質を発現し、それによって宿主の免疫応答を引き出す。免疫化プロトコールに有用なワクチニアベクター及び方法は、米国特許４,７２２,８４８に記載されている。もう一つのベクターはＢＣＧ（Bacille Calmette Guerin）である。ＢＣＧベクターは文献（Stover et al., Nature 351:456-460 (1991)）に記載がある。本発明ペプチドの治療目的投与又は免疫化に有用な、多様な他のベクター、例えば、アデノ及びアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、サルモネラ・ティフィ・ベクター、解毒化炭疽菌毒素ベクターなどは、本明細書の記載から、当業者に明らかであろう。
従って、遺伝子送達系はＰＳＣＡ関連核酸分子の送達に使用する。一態様においては、全長ヒトＰＳＣＡｃＤＮＡを採用する。もう一つの態様においては、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び／又は抗体エピトープをコードするＰＳＣＡ核酸分子を採用する。
エキソビボ（生体外）・ワクチン
免疫応答を生成させるために、種々のエキソビボ（生体外）戦略も採用し得る。一つの方法は、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を使用して、患者の免疫系にＰＳＣＡ抗原を提示することである。樹状細胞はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子、Ｂ７共刺激因子、及びＩＬ−１２を発現するので、高度特殊化抗原提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルスした自己樹状細胞が、前立腺癌患者の免疫系を刺激するため、第Ｉ相臨床試験にて使用されている（Tjoa et al., 1996, Prostate 28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29:371-380）。従って、樹状細胞はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の環境下で、ＰＳＣＡペプチドをＴ細胞に提示するために使用する。一態様において、自己樹状細胞はＭＨＣクラスＩ及び／又はＩＩ分子に結合し得るＰＳＣＡペプチドでパルスする。もう一つの態様において、樹状細胞は完全ＰＳＣＡタンパク質にてパルスする。さらにもう一つの態様は、技術上既知の、アデノウイルス（Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25）、レトロウイルス（Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770）、レンチウイルス，アデノ関連ウイルス、ＤＮＡ形質移入（Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869）、又は腫瘍由来ＲＮＡ形質移入（Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182）など、種々の手段のベクターを使用し、樹状細胞中でＰＳＣＡ遺伝子が過剰発現するように設計することからなる。ＰＳＣＡを発現する細胞は、ＧＭ−ＣＳＦなど、免疫モジュレーターを発現するように設計し、免疫化剤としても使用し得る。
Ｘ.Ｂ．）抗体に基づく治療の標的としてのＰＳＣＡ
抗体療法は、特に化学療法剤の毒性によく耐え切れない患者にとって、同時に実施する化学療法の用量を低下させて使用することを可能とする。
癌患者はＰＳＣＡ発現の存在及びレベルについて、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学評価、定量的ＰＳＣＡ画像化、又はＰＳＣＡ発現の存在及び程度を信頼し得るものとして示すその他の技法により評価し得る。腫瘍生検又は手術標本についての免疫組織化学分析は、この目的に好適である。腫瘍組織の免疫組織化学分析方法は技術上周知である。
前立腺癌及びその他の癌を治療する抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、腫瘍又は直接細胞毒性であるものに対し強力な免疫応答を引き起こす抗体である。この観点で、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体仲介又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）メカニズムにより腫瘍細胞溶解を引き起こす；両メカニズムは補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のために、免疫グロブリン分子の未処理Ｆｃ部分を必要とする。加えて、腫瘍増殖に直接の生物学的影響を及ぼす抗ＰＳＣＡｍＡｂは、ＰＳＣＡを発現する癌の治療に有用である。直接に細胞傷害性ｍＡｂが作用するメカニズムは以下のとおりである：細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍血管形成因子プロフィールの調節、及びアポトーシスの誘導。特定の抗ＰＳＣＡｍＡｂが抗腫瘍作用を発揮するメカニズムは、技術上一般に知られるように、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体仲介細胞溶解などの細胞死を評価するいくつかのインビトロアッセイを用いて評価する。
一部患者において、マウス又は他の非ヒトモノクローナル抗体、又はヒト／マウスキメラｍＡｂを使用することは、非ヒト抗体に対する穏和ないし強力な免疫応答を誘導し得る。これは循環系からの抗体のクリアランスと効力の低下に至る。最も深刻な場合、かかる免疫応答は大量の免疫複合体の形成に導き、それが潜在的に腎不全の原因となる。従って、本発明の治療法に使用される好適なモノクローナル抗体は、完全なヒトの、又はヒト化した抗体であり、標的のＰＳＣＡ抗原に高い親和性で特異的に結合するが、患者での抗原性は示さないか、又は低い抗体である。
本発明の治療方法では、単一の抗ＰＳＣＡｍＡｂ並びに異なるｍＡｂの組み合わせ、又はカクテルの投与を期待する。かかるｍＡｂカクテルは、それらが異なるエピトープを標的とするか、異なるエフェクターメカニズムを活用するか、又は細胞毒性ｍＡｂと免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂとを直接組み合わせたものである限り、確実な進歩性を有し得る。加えて、抗ＰＳＣＡｍＡｂは他の治療様式、例えば、限定されるものではないが、種々の化学療法剤、アンドロゲン遮断剤、免疫調節剤（例：ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、手術又は放射線照射などと同時に投与し得る。抗ＰＳＣＡｍＡｂはそれらの「裸の」又は非抱合の形状で投与するか、又はそれらに抱合させた治療剤を有し得る。
抗ＰＳＣＡ抗体の製剤は、該抗体を腫瘍細胞に送達し得る何れかの経路によって投与する。投与経路は、制限されるものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などである。治療は一般に静脈内投与（ＩＶ）などの許容し得る投与経路を経て、典型的には約０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は、２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、抗ＰＳＣＡ抗体製剤を繰返し投与することからなる。一般に、１週間あたりｍＡｂ１０〜１０００ｍｇの範囲の用量が有効であり、また十分に寛容である。
転移乳癌の治療におけるハーセプチン（Herceptin）ＴＭ ｍＡｂでの臨床試験に基づくと、当初の負荷用量が約４ｍｇ／ｋｇ（患者体重）静注、次いで週用量約２ｍｇ／ｋｇ静注の抗ＰＳＣＡｍＡｂ製剤が、許容し得る用量投与計画の代表である。好ましくは、初期負荷用量を９０分以上の点滴として投与する。断続的維持用量は、初期用量が十分に寛容である場合に、３０分以上の点滴として投与する。当業者が認めるように、特定の事例では、様々な因子が理想的な用量投与計画に影響し得る。かかる因子とは、例えば、使用したＡｂ又はｍＡｂの結合親和性及び半減期、患者におけるＰＳＣＡ発現の程度、遊離するＰＳＣＡ抗原の循環の範囲、所望の恒常状態抗体濃度レベル、治療の頻度、及び本発明治療方法と組合わせて使用する化学療法剤又はその他の物質の影響、並びに特定患者の健康状態である。
選択肢として、最も有効な投与計画などの決定に役立てるために、所定のサンプル中のＰＳＣＡレベル（例：循環するＰＳＣＡ抗原及び／又はＰＳＣＡ発現細胞のレベル）について患者を評価すべきである。かかる評価はまた治療全般のモニターの目的にも使用され、他のパラメータ（例えば、尿細胞診断及び／又は膀胱癌治療における免疫Ｃｙｔレベル、又は類推による前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）の評価と組合わせて、治療の成功を正確に測定するために有用である。
抗イディオタイプ抗ＰＳＣＡ抗体は、抗癌治療において、ＰＳＣＡ関連タンパク質を発現する細胞に免疫応答を誘発するワクチンとして有用である。特に、抗イディオタイプ抗体の生成は、技術上周知である；この方法論はＰＳＣＡ関連タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＰＳＣＡ抗体を生成するために、容易に適合させることができる（参照例：Wagner et al., 1997, Hybridoma 16:33-40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96:334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76）。かかる抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチン戦略に使用することができる。
Ｘ.Ｃ．）細胞性免疫応答の標的としてのＰＳＣＡ
本明細書に記載した１種以上のＨＬＡ結合ペプチドの免疫原としての有効量を含むワクチン及びワクチンの調製法は、本発明のさらなる態様である。さらに、本発明によるワクチンは、請求項記載の１種以上のペプチドからなる組成物を包含する。ペプチドは個々にワクチン中に存在し得る。あるいは、該ペプチドは同じペプチドの複数コピーを含むホモポリマーとして、又は、種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは免疫反応を増大させる利点を有し、また、ポリマー作製のために異なるエピトープが使用される場合、病原性生物体の異なる抗原決定基と、又は免疫応答を目標とする腫瘍関連ペプチドと反応する抗体及び／又はＣＴＬを誘導するさらなる能力を有する。その構成成分は天然起源の抗原でもよく、又は、例えば、組換えにより若しくは化学合成により調製してもよい。
本発明のワクチンとともに使用し得る担体は、技術上周知のものであり、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風菌毒素、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などである。該ワクチンは生理学的に耐性を示す（すなわち、許容し得る）希釈剤、例えば、水又は食塩水、好ましくはリン酸緩衝食塩水を含み得る。該ワクチンは一般的にアジュバントを含む。技術上周知のアジュバントの例は、不完全フロイントのアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はアルムなどの物質である。さらに、本明細書に開示するように、ＣＴＬ応答は本発明のペプチドを、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの脂質に抱合させることにより、あらかじめ刺激することができる。さらに、合成シトシン−ホスホロチオール化グアニン含有（ＣｐＧ）オリゴヌクレオチドなどのアジュバントは、ＣＴＬ応答を１０倍ないし１００倍増大させることが見出されている（参照例：Davila and Cells, J. Immunol. 165:539-547 (2000)）。
本発明によれば、注射、エーロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内、又はその他の適当な経路を経由するペプチド組成物による免疫化により、宿主の免疫系は所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬ及び／又はＨＴＬを生産することにより、該ワクチンに応答する。その結果、宿主はＰＳＣＡ抗原を発現若しくは過剰発現する細胞のその後の成長に、少なくとも部分的に免疫状態となるか、又は該抗原が腫瘍関連であった場合には、少なくともある種の治療上の利益を誘導する。
一部の態様において望ましいことは、クラスＩペプチド成分と、標的抗原に対する抗体及び／又はヘルパーＴ細胞応答の中和を誘発又は促進する成分とを組合わせることである。かかる組成物の好適な態様は、本発明によるクラスＩ及びクラスＩＩエピトープを包含する。かかる構成成分の別の態様は、本発明によるクラスＩ及び／又はクラスＩＩエピトープを、ＰＡＤＲＥＴＭ（エピインミューン（Epimmune）、サンディエゴ、ＣＡ）分子などの交差反応性ＨＴＬエピトープとともに包含する（例えば、米国特許５,７３６,１４２に記載）。
本発明のワクチンはまた、本発明のペプチドを提示する媒体として、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）をも含み得る。ワクチン組成物は樹状細胞の可動化と採取に続き、インビトロで創生可能であり、それによって樹状細胞の負荷がインビトロで生じる。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明によるミニ遺伝子により形質移入するか、又はペプチドでパルスする。樹状細胞は次いで患者に投与し、インビボでの免疫応答を引き出すことができる。ワクチン組成物は、ＤＮＡに基づくものでも、ペプチドに基づくものであっても、樹状細胞可動化と組合わせてインビボでも投与し得るが、それによって樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
ワクチンに使用するポリエピトープ構成成分に包含させるための一連のエピトープを選択する場合、あるいはワクチンに包含させるべき及び／又はミニ遺伝子などの核酸がコードするべき不連続のエピトープを選択する場合、好ましくは以下の原則を利用する。以下のそれぞれの原則は、選択を実施するために均衡させることが好ましい。所定のワクチン組成物に包含させるべき複数のエピトープは、必ずしもその必要はないが、該エピトープを誘導する元の抗原の配列に相接することがある。
１.）エピトープは、投与したときに、腫瘍クリアランスと相関することが観察されている免疫応答に類似するものを選択する。ＨＬＡクラスＩについて、このものは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩの場合、同様の理論的解釈を採用する；再び、３〜４個のエピトープが少なくとも１つのＴＡＡから選択される（参照例：Rosenberg et al., Science 278:1447-1450）。１つのＴＡＡからのエピトープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組合わせて使用し、しばしば発現されるＴＡＡの多様な発現パターンをもつ腫瘍を標的とするワクチンを製造することができる。
２.）免疫原性と相関することの証明された、必要な結合親和性をもつエピトープを選択する；ＨＬＡクラスＩについては、ＩＣ５０が５００ｎＭ以下、多くの場合、２００ｎＭ以下；また、クラスＩＩについては、ＩＣ５０が１０００ｎＭ以下。
３.）十分なスーパーモチーフ含有ペプチド、又は、十分な一連のアレル特異的モチーフ含有ペプチドは、広範な集団を範囲に含むように選択する。例えば、少なくとも８０％の集団を範囲に含むことが好ましい。モンテカルロ分析は技術上既知の統計評価手段であるが、これを採用して集団範囲の幅又は重複性を評価することができる。
４.）癌関連抗原からエピトープを選択する場合、患者は元のエピトープに耐性を生じている可能性があるので、類似体を選択するのがしばしば有用である。
５.）特に関連性のあるのは、「ネステッドエピトープ」といわれるエピトープである。ネステッドエピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列において重なり合う場合に生じる。ネステッドペプチド配列は、Ｂ細胞、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る。ネステッドエピトープを提供する場合、一般的な目的は、配列あたりの最大多数のエピトープを提供することである。従って、一側面では、ペプチドのアミノ末端エピトープのアミノ端末よりも長く、またカルボキシル末端エピトープのカルボキシル端末よりも長いペプチドを提供することは避けることである。ネステッドエピトープを含んでなる配列など、複数エピトープの配列を提供する場合、一般的に重要なことは、それが病理学的又は他の有害な生物学的性質をもたないことを保証するために、その配列をスクリーニングにかけることである。
６.）もしポリエピトープタンパク質が創生されているならば、又はミニ遺伝子を創製する場合、目標は対象のエピトープを包含する最小のペプチドを生成させることである。たとえ、ネステッドエピトープを含むペプチドを選択する場合に採用されるものと同じでなくとも、この原則は同じである。しかし、人工的ポリエピトープペプチドの場合、サイズ最小化の目標は、ポリエピトープタンパク質内のエピトープ間のスペーサー配列を組み込む必要性に対して均衡する。スペーサーアミノ酸配列は、例えば、連結部エピトープ（免疫系が認識するが、標的抗原には存在せず、またエピトープの人工並置によってのみ創生されるエピトープ）を回避するか、又は、エピトープ間の切断を促進するように導入し、それによってエピトープの提示を強めることができる。連結部エピトープは一般には回避すべきである；その理由は、非先天性のエピトープに対し、受容者が免疫応答を生じる可能性があるからである。特に関心のあるのは、「優性エピトープ」である連結部エピトープである。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少するか又は抑制されるような強力な応答へ導く。
７.）同じ標的タンパク質の複数変異体の配列が存在する場合、強力なペプチドエピトープがその保存性に基づき選択され得る。例えば、保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの全配列が、又は、クラスＩＩ結合ペプチドの全９マーコアが、特定タンパク質抗原について評価した配列の規定パーセンテージに保存されていることと定義し得る。
Ｘ.Ｃ.１．ミニ遺伝子ワクチン
複数エピトープの同時送達を可能とする多くの異なる方法が利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、特に有用な本発明の態様である。ミニ遺伝子に包含されるエピトープは、前のセクションで述べたガイドラインに従って、好適に選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好適な手段では、本発明の１個又は複数のエピトープを含んでなるペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
複数エピトープミニ遺伝子の使用については、以下の文献に記載されている；Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L and Whitton, J.L., J. Virol. 71:2292 1997; Thomson, S.A. et al., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton, J.L., et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998。例えば、ＰＳＣＡから誘導されるスーパーモチーフ−及び／又はモチーフ−含有エピトープ、ＰＡＤＲＥ（登録商標）普遍ヘルパーＴ細胞エピトープ又はＰＳＣＡからの多重ＨＴＬエピトープ（参照、表８ないし２１及び表２２ないし４９）、及び、小胞体移行シグナル配列、をコードする複数エピトープＤＮＡプラスミドを設計することができる。ワクチンは他のＴＡＡから誘導されるエピトープを含んでいてもよい。
複数エピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験するエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するためのトランスジェニックマウスにて確認し得る。さらに、ＤＮＡ‐コードエピトープのインビボ免疫原性は、ＤＮＡプラスミドで形質移入した標的細胞に対する特異的ＣＴＬ株のインビトロ応答と相関させることができる。従って、これらの実験では、ミニ遺伝子が以下の両方に働くことを示し得る； １）ＣＴＬ応答を生じること、また、２）誘発されたＣＴＬが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識すること。
例えば、ヒト細胞での発現のために選択したエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を創製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳することができる。ヒトコドン用法の表を利用し、各アミノ酸に対するコドン選択を進めることができる。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は直接隣接させることができ、その結果、翻訳に際し、連続するポリペプチド配列を創出する。発現及び／又は免疫原性を最適化させるために、ミニ遺伝子の設計にさらなる要素を取り込ませることができる。逆翻訳が可能で、ミニ遺伝子配列に包含させ得るアミノ酸配列の例は；ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、抗体エピトープ、ユビキチン化シグナル配列、及び／又は小胞体標的化シグナルである。加えて、ＣＴＬ及びＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬ又はＨＴＬエピトープに隣接して、合成（例：ポリ−アラニン）又は天然フランキング配列を含ませることにより改善し得る；該エピトープを含んでなるこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み上げることにより、ＤＮＡに変換することができる。オーバーラップしたオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）は、周知の技法を用い、適切な条件下で合成し、リン酸化し、精製し、そしてアニールすることができる。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることができる。該エピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、次いで所望の発現ベクターにクローン化することができる。
当業者周知の標準的調節配列は、標的細胞中での発現を確かなものとするために、好ましくはベクターに含める。数種のベクター要素が望ましい：ミニ遺伝子挿入用の下流クローニング部位をもつプロモーター；効果的な転写終結用のポリアデニル化シグナル；大腸菌起源の複製；及び大腸菌選択可能マーカー（例：アンピシリン又はカナマイシン耐性）。数種のプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターがこの目的のために使用し得る。参照例：他の適切なプロモーター配列について米国特許５,５８０,８５９及び５,５８９,４６６。
ミニ遺伝子の発現と免疫原性を最適化するためには、さらなるベクターの修飾が望まれる。一部の事例においては、効率的な遺伝子発現のために、イントロンが必要であり、１種以上の合成又は天然のイントロンをミニ遺伝子の転写領域に取り込ませ得る。ｍＲＮＡ安定化配列及び哺乳動物細胞中の複製用配列を含有させることが、ミニ遺伝子発現増大のためにも考え得る。
発現ベクターを選択した後、ミニ遺伝子をプロモーター下流のポリリンカー領域にクローン化する。このプラスミドを適切な大腸菌株に形質転換し、標準的技法を用いてＤＮＡを調製する。ミニ遺伝子の方向及びＤＮＡ配列、並びにベクターに含まれる他のすべての要素を、制限マッピング及びＤＮＡ配列分析により確認する。正しいプラスミドを取り込むバクテリア細胞は、マスター細胞バンク及び作業用細胞バンクとして保存し得る。
加えて、免疫刺激性配列（ＩＳＳ又はＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすと思われる。これらの配列は、免疫原性を上昇させたい場合、ミニ遺伝子コード配列の外側でベクターに含ませ得る。
一部の態様においては、ミニ遺伝子コードエピトープと第二のタンパク質（免疫原性を上昇させるか、又は低下させるために入れる）両方の産生を可能とするバイシストロン発現ベクターを使用することができる。免疫応答を有益に上昇させ得るタンパク質又はポリペプチドの例は、もし同時に発現されるとするなら、サイトカイン（例：ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例：ＬｅＩＦ）、同時刺激性分子、又はＨＴＬ応答の場合の、パン−ＤＲ結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、エピインミューン（Epimmune）、サンディエゴ、ＣＡ）である。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは細胞内標的化シグナルに結合可能であり、発現したＣＴＬエピトープとは別に発現される；このことはＨＴＬエピトープがＣＴＬエピトープの区画とは異なる細胞の区画に向かうことを可能とする。要すれば、このことはＨＴＬエピトープが、ＨＬＡクラスＩＩ経路により効率的な侵入を促進し、それによってＨＴＬの誘発を改善する。ＨＴＬ又はＣＴＬの誘発に対して、免疫抑制分子（例：ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答を特異的に低下させることは、ある種疾患において有益であり得る。
治療量のプラスミドＤＮＡは、例えば、大腸菌における発酵と、引き続く精製により製造し得る。作業用細胞バンクからの一部を用いて増殖培地に播種し、周知の技法に従ってシェーカーフラスコ又はバイオリアクターにて飽和状態まで増殖させる。プラスミドＤＮＡは標準的バイオ分離技法、例えば、キアゲン・インク（QIAGEN, Inc.）(バレンシア、カリフォルニア)が供給する固相アニオン交換樹脂などにより精製し得る。要すれば、ゲル電気泳動又は他の方法により、開環状及び線状形状からスーパーコイルＤＮＡを単離し得る。
精製したプラスミドＤＮＡは、様々の剤形を用いて注射用に調製し得る。これらの内、最も簡単なのは、凍結乾燥したＤＮＡを無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再構成することである。「裸のＤＮＡ」として知られるこの方法は、現在、臨床治験において、筋肉内（ＩＭ）投与用に使用されている。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫療法効果を最大とするために、精製したプラスミドＤＮＡの別の製剤化方法が望まれる。様々な方法が記載されており、新しい技法が利用可能となる可能性がある。カチオン性脂質、糖脂質、及び融合性リポソームが、製剤化にも使用し得る（参照例：国際特許出願ＷＯ９３／２４６４０；Mannino & Gould-Fogerite, Bio Techniques 6(7):682 (1988); 米国特許５,２７９,８３３；国際特許出願ＷＯ９１／０６３０９；及び、 Felgner, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987) に記載）。加えて、予防、相互作用、非縮合化合物（ＰＩＮＣ）のような集合的な属性を有するペプチド及び化合物は、精製したプラスミドＤＮＡと複合体を形成し、安定性、筋肉内分散性、又は特定の臓器若しくは細胞型への輸送などの変数に影響する可能性がある。
標的細胞の感作は、ミニ遺伝子コード‐ＣＴＬエピトープの発現とＨＬＡクラスＩ提示の機能的アッセイとして使用し得る。例えば、プラスミドＤＮＡを、標準的ＣＴＬクロム放出アッセイの標的として適当な哺乳動物細胞株に導入する。使用する形質導入法は最終の製剤化に左右されるだろう。エレクトロポレーションを「裸の」ＤＮＡについて使用し得る一方で、カチオン性脂質はインビトロでの直接形質導入を可能とする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時形質導入して、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による形質導入細胞の濃縮化を可能とする。次いでこれらの細胞をクロム５１（５１Ｃｒ）標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ株の標的細胞として使用する；５１Ｃｒの放出によって検出される細胞溶解は、ミニ遺伝子コード‐ＣＴＬエピトープの産生とＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するアッセイ法を用いて、同様の方法で評価し得る。
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤を機能的に試験する第二の方法である。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、ＤＮＡ産物で免疫化する。投与量及び投与経路は剤形による（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合体ＤＮＡについては腹腔内（ｉ．ｐ．））。免疫化の２１日後、膵細胞を採取し、試験する各エピトープをコードするペプチドの存在下に、１週間再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準法により、ペプチド負荷、５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに相当するペプチドエピトープを負荷したＨＬＡにより感作した標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ誘導について、ＤＮＡワクチンの機能を証明する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、同様の方法でトランスジェニックマウスにて確認する。
あるいは、該核酸は文献（例えば、米国特許５,２０４,２５３）に記載された射出送達法により投与し得る。この技法を用いて、ＤＮＡのみを含んでなる粒子を投与する。さらなる別の態様において、ＤＮＡは金粒子などの粒子に付着させることができる。
ミニ遺伝子はまた、技術上周知の、他のバクテリア又はウイルス送達系を用いて、送達することもできる；例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物を、ワクチニアなどのウイルスベクターに取り込ませることもできる。
Ｘ.Ｃ.２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ
本発明のＣＴＬペプチドを含んでなるワクチン組成物は、修飾、例えば、同族化し、改善された血清半減期、拡大した母集団範囲、又は上昇した免疫原性など、所望の性質を提供し得る。
例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１個のエピトープを含む配列に、該ペプチドを連結することにより増強し得る。ＣＴＬペプチドはＴヘルパーペプチドに直接結合させ得るが、多くの場合、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ抱合体は、スペーサー分子により連結する。該スペーサーは一般に、生理的条件下に実質的に荷電しない、比較的小さな中性分子、例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体などからなる。該スペーサーは一般に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、又はその他の非極性アミノ酸又は中性極性アミノ酸の中性スペーサーから選択される。理解されることは、任意に存在するスペーサーが同じ残基で構成される必要はなく、従って、ヘテロ−又はホモ−オリゴマーであり得る。スペーサーが存在する場合、そのスペーサーは通常少なくとも１個又は２個の残基、より一般的には３個ないし６個の残基、場合によっては１０個以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、Ｔヘルパーペプチドエピトープに直接つながるか、又はＣＴＬペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端のスペーサーを介してつながり得る。免疫原性ペプチド又はＴヘルパーペプチド何れものアミノ末端はアシル化し得る。
ある一定の態様において、Ｔヘルパーペプチドは遺伝的に多様な集団の大多数に存在するＴヘルパー細胞が認識するペプチドである。これはＨＬＡクラスＩＩ分子の多数、大部分又は全部に結合するペプチドを選択することにより実施し得る。多くのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するかかるアミノ酸の例は、破傷風毒素の位置８３０〜８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ；配列番号：１）、熱帯熱マラリア原虫サーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の位置３７８〜３９８（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ；配列番号：２）、及び連鎖球菌１８ｋＤタンパク質の位置１１６〜１３１（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ；配列番号：３）などの抗原からの配列である。その他の例としては、ＤＲ１−４−７スーパーモチーフを含有するペプチド又はＤＲ３モチーフの何れかを含む。
あるいは、自然界には見出されていないアミノ酸配列を用い、厳密ではないＨＬＡ制限様式で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（参照例：ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７）。パン−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥＴＭ、エピインミューン・インク（Epimmune Inc.）、サンディエゴ、ＣＡ）と呼称されるこれら合成化合物は、殆どのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も好適に結合するように設計する。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡａ（配列番号：４）（式中、「Ｘ」はシクロへキシルアラニン、フェニルアラニン、又はチロシンの何れかであり、ａはＤ−アラニン又はＬ−アラニンの何れかである）を有するパン−ＤＲ−結合エピトープペプチドは、ＨＬＡタイプに関係なく、殆どのＨＬＡ−ＤＲアレルに結合し、殆どの個体からのＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが判明している。パン−ＤＲ−結合エピトープの代替物は、すべての「Ｌ」天然アミノ酸を含んでなり、該エピトープをコードする核酸の形状で提供し得る。
ＨＴＬペプチドエピトープも修飾して、その生物学的性質を変えることができる。例えば、それらはＤ−アミノ酸を含むように修飾して、プロテアーゼに対する抵抗性を増し、その血清半減期を延長することが可能であり、又は、それらは脂質、タンパク質、炭水化物などの他の分子に抱合させて、その生物学的活性を上昇させることができる。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ又はカルボキシ末端の何れかで、１個以上のパルミチン酸鎖に抱合させることができる。
Ｘ.Ｃ.３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合わせ
一部態様においては、Ｂリンパ球又はＴリンパ球を初回感作する少なくとも１種の成分を本発明の医薬組成物に含めることが望ましい。脂質はＣＴＬをインビボで感作し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のε−及びα−アミノ基に付着させ、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどの１個以上の連結残基を介して、免疫原ペプチドに連結し得る。次いで、リピド化ペプチドをミセル又は粒子に直接処理し、リポソームに取り込ませるか又はアジュバント例えば不完全フロイントアジュバントに乳化することができる。好適な態様において、特に有効な免疫原構成成分は、Ｌｙｓのε−及びα−アミノ基に付着させたパルミチン酸を含んでなり、これがＳｅｒ−Ｓｅｒなどの結合を介して、免疫原ペプチドのアミノ末端に付着する。
ＣＴＬ応答の脂質感作のもう一つの例として、トリパルミトル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌リポタンパク質は、適切なペプチドに共有結合で付着している場合、ウイルス特異的ＣＴＬを初回感作するために使用し得る（参照例：Deres, et al., Nature 342: 561, 1989）。本発明のペプチドは、Ｐ３ＣＳＳ、例えば、及び、標的抗原へ特異的な免疫応答を刺激するために個体に投与されるリポペプチドに、結合させることができる。さらに、Ｐ３ＣＳＳ結合エピトープによって中和抗体の誘導も刺激されるので、２つのかかる構成成分は体液性及び細胞仲介応答をより効果的に引き出すために組み合わせることができる。
Ｘ.Ｃ.４．ＣＴＬ及び／又はＨＴＬペプチドでパルスしたＤＣを含んでなるワクチン組成物
本発明によるワクチン組成物の態様は、患者血液からのＰＢＭＣへ、又はそこから単離されたＤＣへ、エピトープ含有ペプチドのカクテルを生体外で（ex vivo）投与することからなる。ＤＣの採取を容易にする医薬、例えば、プロゲニポイエチン（ProgenipoietinTM）（ファルマシア−モンサント、セントルイス、ＭＯ）又はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４などを使用し得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、また患者への再導入に先立ち、ＤＣは洗浄して非結合ペプチドを除く。この態様において、ワクチンは表面上にＨＬＡ分子と複合体形成したパルスペプチドエピトープを提示する、ペプチドパルス‐ＤＣを含んでなる。
ＤＣを、ペプチドカクテルにより生体外でパルスすることができ、その一部がＰＳＣＡに対するＣＴＬ応答を刺激する。選択肢として、天然又は人工のゆるやかに制限されたＨＬＡクラスＩＩペプチドなどのヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチドを包含させて、ＣＴＬ応答を促進することができる。従って、本発明によるワクチンはＰＳＣＡを発現又は過剰発現する癌の治療に使用する。
Ｘ.Ｄ．養子免疫治療
抗原性ＰＳＣＡ関連ペプチドを使用して、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を生体外で同様に引き出す。得られるＣＴＬ又はＨＴＬ細胞は、他の通常形態の療法に反応しない患者の腫瘍、又は本発明による治療用ワクチンペプチド又は核酸に反応しそうにない患者の腫瘍の治療に使用し得る。特定の抗原に対する生体外ＣＴＬ又はＨＴＬ応答は、組織培養において、患者の又は遺伝学的に矛盾のないＣＴＬ又はＨＴＬ前駆体細胞を、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）供給源及び適切な免疫原ペプチドとともにインキュベートすることにより誘導する。適切なインキュベーション時間（典型的には凡そ７〜２８日）（この間、該前駆体細胞が活性化され、エフェクター細胞へと発展する）の後、細胞を点滴で患者に戻す；その際、該細胞は特定の標的細胞（例：腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、又は破壊を促進（ＨＴＬ）する。形質導入された樹状細胞はまた、抗原提示細胞としても使用し得る。
Ｘ.Ｅ．治療又は予防を目的とするワクチンの投与
本発明の医薬組成物及びワクチン組成物は、代表的にはＰＳＣＡを発現又は過剰発現する癌の治療及び／又は予防に使用する。治療適用において、ペプチド及び／又は核酸組成物は、抗原に対し有効なＢ細胞、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を引き出すために、また症候及び／又は合併症を治癒するか、又は少なくとも阻止するか、又は減速するために十分な量、患者に投与する。これを実施するために適切な量は、「治療有効量」と定義する。この用途に有効な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与様式、治療する疾患の段階及び重篤度、患者の体重と全身の健康状態、及び処方医師の判断による。
医薬組成物として、本発明の免疫原性ペプチド、又はそれらをコードするＤＮＡは、一般にＰＳＣＡを発現する腫瘍をすでに有する個体に投与する。該ペプチド又はそれらをコードするＤＮＡは、単独で、又は１種以上のペプチド配列の融合物として投与し得る。患者は免疫原ペプチドにより単独で、又は適切な場合には、その他の治療、例えば、手術などとともに治療され得る。
治療での使用では、投与は一般にＰＳＣＡ関連癌の最初の診断時に開始すべきである。この後、少なくとも症候が実質的に消滅するまで、その後の一定期間、ブースター投与を続ける。患者に送達するワクチン組成物の態様（すなわち、限定されるものではないが、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、又はＴＡＡ特異的ＣＴＬ又はパルスされた樹状細胞などの態様）は、疾患の段階又は患者の健康状態により変わり得る。例えば、ＰＳＣＡを発現する腫瘍をもつ患者において、ＰＳＣＡ特異的ＣＴＬを含んでなるワクチンは、進行した疾患の患者の腫瘍細胞を死滅させるのに、別の態様よりもより有効であり得る。
細胞傷害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するような投与様式によって、一定量のペプチドエピトープが送達されることが、一般には重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物は、本発明の態様に従って与えることもできる。
治療免疫開始時の投与量は、低値が凡そ１、５、５０、５００又は１,０００μｇであり、高値が凡そ１０,０００、２０,０００、３０,０００又は５０,０００μｇの単位投与量の範囲にある。ヒトの投与量値は一般に７０キログラムの患者あたり、凡そ５００μｇないし凡そ５０,０００μｇの範囲である。数週間ないし数ヶ月にわたるブースト投与計画に従って、凡そ１.０μｇないし凡そ５０,０００μｇのブースト投与量を、患者の血液から得たＣＴＬ及びＨＴＬの特異活性の測定よって判定した患者の応答及び症状に基づいて、投与し得る。投与は、少なくとも臨床症候又は実験室でのテストにより、その後の期間、異常増殖が除去されるか又は減少していることを示すまで継続すべきである。投与量、投与経路、及び投与計画は、技術上既知の方法に従って調整する。
一定の態様において、本発明のペプチド及び組成物は、深刻な疾病状態、すなわち、生命危機状態又は潜在的な生命の危機状況において採用される。かかる事例において、本発明の好適な組成物中の外来性物質の量が最少であることと、ペプチドの性質が比較的非毒性であることの結果として、ここに示した投与量に比較して、実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、治療する医師にとっても望ましいと思われる。
本発明のワクチン組成物は、純然たる予防薬としても使用し得る。一般に、当初の予防的免疫化の投与量は、低値が凡そ１、５、５０、５００又は１,０００μｇであり、高値が凡そ１０,０００、２０,０００、３０,０００又は５０,０００μｇの単位投与量の範囲にある。ヒトの投与量値は一般に７０キログラムの患者あたり、凡そ５００μｇないし凡そ５０,０００μｇの範囲である。これに続き、ペプチド凡そ１.０μｇないし凡そ５０,０００μｇのブースト投与量を、最初のワクチン投与後４週間ないし６ヶ月の所定の間隔で投与する。ワクチンの免疫原性は、患者の血液サンプルから得たＣＴＬ及びＨＴＬの特異的活性を測定することにより評価することができる。
治療処置用の医薬組成物は、非経口、外用、経口、経鼻、鞘内、又は局所（例；クリーム又は局所軟膏として）投与用を意図する。好ましくは、該医薬組成物は非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内に投与する。従って、本発明は、許容し得る担体、好ましくは水性担体に溶解又は懸濁した免疫原ペプチドの溶液からなる非経口用組成物を提供する。
様々な水性担体を使用し得る；例えば、水、緩衝水、０.８％食塩水、０.３％グリシン、ヒアルロン酸などである。これらの組成物は常套の、周知の無菌化法により無菌化するか、又は無菌濾過することができる。得られる水溶液はそのまま使用するようにパッケージに詰めるか、又は凍結乾燥し、凍結乾燥品は投与前に無菌溶液と組み合わせる。
該組成物は生理的条件に近づけることが必要な場合、医薬的に許容し得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤（tonicity adjusting agent）、湿潤剤、保存剤などを含み得る；例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどである。
該医薬組成物中の本発明ペプチドの濃度は、広範に変化し得る；すなわち、重量で凡そ０.１％未満から通常は凡そ２％、又は少なくとも凡そ２％ないし２０％から５０％、又はそれ以上であり、選択した特定の投与様式に従い、液量、粘稠性などにより最初に選択する。
組成物のヒト単位投与形状は、典型的には、医薬組成物中に、許容し得る担体、一つの実施形態においては水性担体のヒト単位投与用量を含み、そして、ヒトへのそのような組成物の投与に使用されるべき当業者周知の用量／含量で投与される（参照例：Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985）。例えば、最初の免疫のためのペプチド用量は、患者７０ｋｇあたり、凡そ１から凡そ５０，０００μｇ、一般的には１００‐５，０００μｇであり得る。例えば、核酸のための最初の免疫化は、裸の核酸形状の発現ベクターを用いて複数部位に０．５‐５ｍｇの量で、ＩＭ（又はＳＣ若しくはＩＤ）投与により遂行してもよい。遺伝子銃を用いて核酸（０．１から１０００μｇ）を投与することも可能である。３−４週間のインキュベーション期間の後、ブースト投与を行う。ブーストは、５‐１０７から５ｘ１０９ｐｆｕの 組換え型伝染性上皮腫ウイルスでもよい。
抗体に関して、治療は、一般的には抗ＰＳＣＡ抗体調製物の、静脈内注射（ＩＶ）のような許容されている投与経路で、一般的には凡そ０．１から凡そ１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、頻回投与を含む。一般に、週当たり１０‐５００ｍｇ ｍＡｂの用量範囲が効果的でよく寛容される。更に、凡そ４ｍｇ／ｋｇ患者体重 ＩＶの初期投与用量に続いて、週当たり凡そ２ｍｇ／ｋｇ ＩＶの抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ調整物の投与が、許容できる用量管理である。当業者に理解されているように、種々の要因が特定の場合の理想的な用量に影響を与え得る。そのような要因には、例えば、組成物の半減期、抗体の結合親和性、物質の免疫原性、患者におけるＰＳＣＡの発現程度、循環しているＰＳＣＡ抗原の程度、望ましい安定状態濃度範囲、投与頻度、及び、化学療法又は本発明の治療法と併用使用する他の薬剤の影響、並びに、特定の患者の健康状態を含む。制限するものではないが、好ましいヒト単位用量は、例えば、５００μｇ‐１ｍｇ、１ｍｇ‐５０ｍｇ、５０ｍｇ‐１００ｍｇ、１００ｍｇ‐２００ｍｇ、２００ｍｇ‐３００ｍｇ、４００ｍｇ‐５００ｍｇ、５００ｍｇ‐６００ｍｇ、６００ｍｇ‐７００ｍｇ、７００ｍｇ‐８００ｍｇ、８００ｍｇ‐９００ｍｇ、９００ｍｇ‐１ｇ、又は、１ｍｇ‐７００ｍｇである。ある実施形態において、用量は２‐５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、例えば週に１‐３ｍｇ／ｋｇの用量をこれに続ける；０．５ｍｇ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量に、例えば０．５‐１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、例えば、週ごとに２、３、又は、４週続ける；週当たり２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００ｍｇ ｍ２体表面積；週当たり１‐６００ｍｇ ｍ２体表面積；週当たり２２５‐４００ｍｇ ｍ２体表面積；これらの用量は、週ごとに２、３、４、５、６、７、８、９、１９、１１、１２又はそれ以上を続けてもよい。
一つの実施形態において、ポリヌクレオチドのヒト単位用量は、任意の治療効果を実現する適切な用量範囲又は効果的な量を含む。当業者によって認識されているように、治療効果は、ポリヌクレオチドの配列、ポリヌクレオチドの分子量、及び、投与経路を含む多くの因子に依存する。用量は、一般に、症状の重篤度、患者の履歴等のような当該技術分野で既知の種々のパラメーターに従い、医師又はその他の健康管理専門家によって選択される。一般に、凡そ２０塩基のポリヌクレオチドについては、用量範囲は選択され得るが、例えば、凡そ０．１、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００又は５００ｍｇ／ｋｇ以上という下限から独立に選択され、下限より大きな凡そ６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１０，０００ｍｇ／ｋｇという上限から独立に選択される。例えば、用量は凡そ以下の何れかでもよい：０．１から１００ｍｇ／ｋｇ、０．１から５０ｍｇ／ｋｇ、０．１から２５ｍｇ／ｋｇ、０．１から１０ｍｇ／ｋｇ、１から５００ｍｇ／ｋｇ、１００から４００ｍｇ／ｋｇ、２００から３００ｍｇ／ｋｇ、１から１００ｍｇ／ｋｇ、１００から２００ｍｇ／ｋｇ、３００から４００ｍｇ／ｋｇ、４００から５００ｍｇ／ｋｇ、５００から１０００ｍｇ／ｋｇ、５００から５０００ｍｇ／ｋｇ、又は、５００から１０，０００ｍｇ／ｋｇ。一般に、非経口的投与経路は、疾患組織へのヌクレオチドの直接適用と比較して、ポリヌクレオチドの長さが増加した場合同様に、より高いポリヌクレオチドの用量を必要とする。
一つの実施形態において、Ｔ細胞のヒト単位用量は、任意の治療効果を実現する適切な用量範囲又は効果的な量を含む。当業者によって認識されているように、治療効果は多くの因子に依存する。用量は、一般に、症状の重篤度、患者の履歴等のような当該技術分野で既知の種々のパラメーターに従い、医師又はその他の健康管理専門家によって選択される。用量は、凡そ１０４細胞から凡そ１０６細胞、凡そ１０６細胞から凡そ１０８細胞、凡そ１０８細胞から凡そ１０１１細胞、又は、凡そ凡そ１０８から凡そ５Ｘ１０１０細胞でよい。用量はまた、凡そ１０６細胞／ｍ２から凡そ１０１０細胞／ｍ２、又は、凡そ１０６細胞／ｍ２から凡そ１０８細胞／ｍ２でもよい。
本発明のタンパク質及び／又は該タンパク質をコードする核酸は、リポソームを介して投与することもできる；リポソームは：１）タンパク質をリンパ組織など特定の組織に目標を定めること；２）疾患細胞に選択的に目標を定めること；又は、３）ペプチド組成物の半減期を延ばすこと；などのためにも働く。リポソームはエマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散、ラメラ層などである。これらの製剤において、送達すべきペプチドはリポソームの一部として、単独で、又はＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体など、リンパ細胞に存在するレセプターに結合する分子とともに、又は他の治療若しくは免疫原組成物とともに取り込まれる。従って、本発明の所望のペプチドが満たされているか又は修飾されているリポソームは、リンパ細胞の当該部位に向かい、そこでリポソームはペプチド組成物を送達する。本発明により使用するリポソームは、標準の小胞形成脂質から形成され、それが一般的には中性及び負に荷電したリン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は一般的には、例えば、リポソームのサイズ、酸に対する不安定性及び血流中での安定性を考慮して導かれる。様々な方法がリポソーム調製のために利用可能であり、例えば、文献（Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)；及び、米国特許４,２３５,８７１；４,５０１,７２８；４,８３７,０２８；及び５,０１９,３６９）に記載されている。
免疫系の細胞を標的とするために、リポソームに取り込むべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体又はそのフラグメントでもよい。ペプチド含有リポソーム懸濁液は、用量を、特にその投与様式、送達するペプチド、及び治療すべき疾患の段階に応じて変化させ、静脈内、局所的、外用的に投与し得る。
固形の組成物では、常套の非毒性固体担体が使用可能であり、例えば、医薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどである。経口投与では、医薬的に許容し得る非毒性組成物は、すでに一覧掲載した担体などの通常使用される賦形剤の何れか、及び、一般的には１０〜９５％の濃度の有効成分すなわち１種以上の本発明ペプチドを、より好ましくは２５％〜７５％の濃度で取り込ませることにより形成する。
スプレーによる投与の場合、免疫原ペプチドは、好ましくは微細に分割した形状で、界面活性剤及び噴射剤とともに供給する。ペプチドの典型的パーセントは凡そ０.０１〜２０重量％、好ましくは凡そ１％〜１０％である。界面活性剤は勿論、非毒性でなければならず、また噴射剤に可溶でなければならない。かかる試薬の代表例は、炭素原子凡そ６個ないし２２個を含む脂肪酸のエステル又は部分エステルであり、カプロン酸、オクタン酸、タウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸、リノレイン酸、オレステリン酸、及びオレイン酸などと、脂肪族多価アルコールとのエステル、又はその環状無水物である。混合若しくは天然グリセリドなどの混合エステルも採用し得る。界面活性剤は組成物の凡そ０.１〜２０重量％、好ましくは凡そ０.２５〜５％を構成し得る。該組成物のバランスは通常噴射剤である。担体も望ましい場合含有し得るが、例えば、鼻腔内送達の場合レシチンである。
ＸＩ．ＰＳＣＡの診断及び予測の態様
本明細書に開示するように、ＰＳＣＡポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、反応性ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）及び抗ポリペプチド抗体は、癌、特に表１に掲載した癌などの制御不全細胞増殖と関連する症状を試験する周知の診断、予測及び治療アッセイにおいて使用する（参照例：例えば、「正常組織及び患者検体におけるＰＳＣＡの発現解析」と題する実施例に記載したような、組織発現の特異的パターン、及び、特定の癌でのその過剰発現の両方）。
ＰＳＣＡは、前立腺関連抗原ＰＳＡ（前立腺癌の存在を同定及びモニターするため数年間医師によって使用されてきた典型的なマーカー）に類似させ得る（参照例：Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al., J. Urol. Aug; 162(2):293-306 (1999) 及び Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640(1999)）。種々のその他の診断マーカーを、ｐ５３及びＫ‐ｒａｓを含め同様の意味で、使用してもよい（参照例：Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102及び Minimoto et al., Cancer Detect Prev 2000;24(1):1-12）。従って、ＰＳＣＡポリヌクレオチド及びポリペプチド（並びにこれらの分子の存在を同定するために使用するＰＳＣＡポリヌクレオチドプローブ及び抗ＰＳＣＡ抗体）及びその性質についての本開示は、例えば、癌関連症状を試験することを目的とする様々な診断アッセイに使用する方法と同様の方法において、当業者がこれらの分子を利用することを可能にする。
ＰＳＣＡポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性Ｔ細胞及び抗体を利用する診断方法の典型的態様は、例えば、ＰＳＡポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性Ｔ細胞及び抗体を採用するよく確立された診断アッセイの方法と同様である。例えば、丁度、ＰＳＡポリヌクレオチドがプローブ（例えば、ノーザン分析；参照例：Sharief et al., Biochem Mol. Biol. Int. 33(3):567-74 (1994)）及びプライマー（例えば、ＰＣＲ分析；参照例：Okegawa et al., J. Urol. 163(4):1189-1190 (2000)）として、ＰＳＡ過剰発現又は前立腺癌の転移をモニターする方法において、ＰＳＡ ｍＲＮＡの存在及び／又はレベルを観察するために使用するように、本明細書に記載したＰＳＣＡポリヌクレオチドは、ＰＳＣＡ過剰発現又はＰＳＣＡ遺伝子を発現する前立腺細胞の腫瘍転移及びその他の癌細胞を検出するために利用し得る。あるいは、ＰＳＡポリペプチドがＰＳＡタンパク質の過剰発現（参照例：Stephen et al., Urology 55(4):560-3 (2000)）又は前立腺細胞の転移（参照例：Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在及び／又はレベルを観察するために使用し得るＰＳＡ特異的抗体を生成させるのに使用するように、本明細書に記載したＰＳＣＡポリペプチドは、ＰＳＣＡの過剰発現又はこの遺伝子を発現する前立腺細胞の腫瘍転移及びその他の癌の転移を検出するために利用し得る。
具体的には、転移が、起源となった臓器（肺又は前立腺など）から身体の異なる領域（リンパ節など）への癌細胞の移動を伴っているので、ＰＳＣＡポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを発現する細胞の存在について、生体サンプルを試験するアッセイを用いて、転移の証拠を提供することができる。例えば、通常ＰＳＣＡ発現細胞を含まない組織（リンパ節）からの生体サンプルが、ＬＡＰＣ４及びＬＡＰＣ９、リンパ節から分離した異種移植片及び骨転移でそれぞれに見られるＰＳＣＡ発現など、ＰＳＣＡ発現細胞を含むと判明した場合、この知見は転移を物語っている。
別法として、ＰＳＣＡポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを使用して、癌の証拠を提供することができる；例えば、通常、ＰＳＣＡを発現しないか、又は異なったレベルでＰＳＣＡを発現する生体サンプルが、ＰＳＣＡを発現するか、又はＰＳＣＡの発現が増加している（参照例：表１に掲載した癌及び添付の図に示した患者サンプルなどにおけるＰＳＣＡの発現）場合である。かかるアッセイにおいて、熟練した技術者は（ＰＳＣＡに加えて）さらに第二の組織限定マーカー、例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡなどの存在について、生体サンプルをテストすることにより、転移の補足的証拠を生み出そうとする（参照例：Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)）。
組織切片内のＰＳＣＡポリペプチドの存在を同定するための免疫組織化学の使用は、その組織内のある細胞の変化した状態を示し得る。癌細胞で発現しているポリペプチドに局在する抗体の能力が、疾患の存在、疾患ステージ、進行、及び／又は、腫瘍の病原力の診断の手段である。そうした抗体は、癌細胞内のポリペプチドの分布変化を、対応する悪性でない組織と比較して、検出すことも可能である。
ＰＳＣＡポリペプチド及び免疫原性組成物は、また疾患状態で細胞内タンパク質局在が変化した現象の観察に有用である。正常から疾患状態への細胞の変化は、細胞の形態変化を誘発し、また、しばしば細胞内のタンパク質局在／分布の変化と関連している。例えば、正常細胞で極性を有した様式で発現している細胞膜タンパク質は、疾患により変化し得、その結果、タンパク質が極性を有しない様式で細胞の全表面に渡って分布する。
疾患状態で細胞内タンパク質局在が変化した現象は、免疫組織化学の方法を用いてＭＵＣ１及びＨｅｒ２タンパク質の発現で証明されている。正常上皮細胞はＭＵＣ１の典型的な尖端分布を有し、加えて糖タンパク質の幾らかの核上性分布があるのに対し、悪性腫瘍ではしばしば無極性の染色パターンが実証されている（Diaz et al, The Breast Journal, 7; 40-45 (2001); Zhang et al, Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao, et al, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1547-1557 (1997)）。また、正常乳上皮ではＨｅｒ２タンパク質は陰性であるか測定部のみに存在するかの何れかであるのに対し、悪性腫瘍細胞では細胞の全表面に渡って該タンパク質が発現し得る（De Potter, et al, International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989): McCormick, et al, 117; 935-943 (2002)）。或いは、前記タンパク質の分布は疾病状態において、細胞表面だけから細胞質中での散在性の発現に変化してもよい。このような例は、ＭＵＣ１で見られ得る（Diaz, et al, The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)）。
免疫組織化学的手法によって検出した前記細胞におけるタンパク質の局在／分布の変化は、ある種の好ましい治療様式について価値ある情報を提供し得る。この最後の点は、タンパク質が正常組織の細胞内にあるが悪性細胞の細胞表面にあるような状況によって説明される；このような細胞表面局在は、抗体に基づく診断及び治療管理によく感受性のある細胞を形成する。ＰＳＣＡについて、このようなタンパク質局在の変化が起きた場合、該ＰＳＣＡタンパク質及びこれと関連した免疫反応は非常に有用である。従って、２４Ｐ４Ｃ１２について細胞内タンパク質局在の変化が生じているか否かを判定する能力は、ＰＳＣＡタンパク質及びそれと関連した免疫反応を有用なものとする。ＰＳＣＡ組成物の使用は、当業者が重要な診断及び治療上の決定をするのを可能とする。
ＰＳＣＡが通常産生されていない組織でこのポリペプチドが見られる場合には、ＰＳＣＡに特異的な免疫組織化学試薬はＰＳＣＡを発現する癌転移の検出にも有用である。
従って、ＰＳＣＡポリペプチド及びそれとの反応から得られた抗体は、当業者に知られた診断、予後、予防、及び／又は、治療目的のような種々の重要な用途において有用である。
ちょうど、当業者がＰＳＡのモニター方法に使用するために、ＰＳＡポリヌクレオチドフラグメント及びポリヌクレオチド変異体を採用するように、ＰＳＣＡポリヌクレオチドフラグメント及びポリヌクレオチド変異体を同様の方法に使用する。特に、ＰＳＡのモニター法に使用する典型的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ ｃＤＮＡ配列のフラグメントから構成されるプローブ又はプライマーである。これを説明すると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用するプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応にて機能するために、全長ＰＳＡ配列よりも短いものでなければならない。かかるＰＣＲ反応の環境下、当業者は一般に、対象ポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するか、又は増幅反応を最適化するために、プライマーとして使用し得る多様なポリヌクレオチドフラグメントを創出する（参照例：Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3):472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)）。かかるフラグメント使用のさらなる説明は、「正常組織及び患者検体におけるＰＳＣＡの発現解析」というタイトルの実施例で提供してあるが、そこではＰＳＣＡポリヌクレオチドフラグメントをプローブとして使用し、癌細胞におけるＰＳＣＡ ＲＮＡの発現を示している。加えて、変異体ポリヌクレオチド配列は、一般にＰＣＲ及びノーザン分析において相当するｍＲＮＡのプライマー及びプローブとして使用される（参照例：Sawai et al., Fetal Diagn, Ther. 1996 Nov-Dec 11(6):407-13 及び Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Unit 2, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995）。ポリヌクレオチドフラグメント及び変異体は、それらが高ストリンジェントな条件下で、標的ポリヌクレオチド配列（例：図２に示すＰＳＣＡポリヌクレオチド又はその変異体）に結合し得るものである状況下で有用である。
さらに、抗体又はＴ細胞が認識し、特異的に結合し得るエピトープを含むＰＳＡポリペプチドは、ＰＳＡのモニター方法に使用する。ＰＳＣＡポリペプチドフラグメント及びポリペプチド類似体又は変異体も同様の方法で使用し得る。抗体（抗ＰＳＡ抗体又はＴ細胞など）を生成させるために、ポリペプチドフラグメント又はポリペプチド変異体を使用する実験は、技術的に一般的であり、実験者が使用している融合タンパク質など、多様な系がある（参照例；Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995）。これに関連して、各エピトープは抗体又はＴ細胞が反応性である構造を提供するように機能する。典型的例として、当業者は対象のポリペプチドの異なる部分に特異的な免疫応答を生じさせるために使用し得る多様なポリペプチドフラグメントを創出する（参照例：米国特許５，８４０，５０１及び５,９３９,５３３）。例えば、本明細書にて考察したＰＳＣＡの生物学的モチーフの一つを含む、又は、技術的に利用可能なモチーフに基づき当業者によって容易に同定されるモチーフ含有配列を含む、ポリペプチドを利用するのが好適である。ポリペプチドフラグメント、変異体又は類似体は、それらが標的のポリペプチド配列（例：図３に示すＰＳＣＡポリペプチド）に特異的な抗体又はＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限り、この状況で一般に有用である。
本明細書に示すように、ＰＳＣＡポリヌクレオチド及びポリペプチド（並びにこれらの分子の存在を同定するために使用するＰＳＣＡポリヌクレオチドプローブ及び抗ＰＳＣＡ抗体又はＴ細胞）は、表１に掲載した癌などを診断する際にそれらを有用とする特別の性質を示す。本明細書に記載する前立腺癌などの病状の存在又は発病を評価するための、ＰＳＣＡ遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、前立腺癌のモニターがＰＳＡにより成功裏に実施されているのと同様、予防的測定又はさらなるモニター用として、患者の確認に使用する。ＰＳＣＡポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの物質（並びにこれらの分子の存在の確認に使用するＰＳＣＡポリヌクレオチドプローブ及び抗ＰＳＣＡ抗体）は、前立腺癌の状況下、ＰＳＡに類似の又は補足的特性をもつ分子について、技術上の必要性を満足する。更に、これらの物質はＰＳＡに類似の又は補足的特性をもつ分子について、ある状況下で（例えば、前立腺起源の転移の正確な診断はＰＳＡに対する試験のみに基づいては成し得なかった(参照例、Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996))、）、技術上の必要性を満足するものであり、そして、その結果、ＰＳＣＡポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの物質（並びにこれらの分子の存在の確認に使用するＰＳＣＡポリヌクレオチドプローブ及び抗ＰＳＣＡ抗体）を、前立腺起源の転移の確認に供する必要がある。
最後に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加え、本明細書に記載のＰＳＣＡポリヌクレオチドは、多くの他の用途、例えば、ＰＳＣＡ遺伝子がマップされている染色体領域における発癌遺伝子関連染色体異常の同定における用途などを有する（「ＰＳＣＡの染色体マッピング」と題する下記実施例参照）。さらに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書に開示したＰＳＣＡ関連タンパク質及びポリヌクレオチドは、未知起源組織の法医学的分析における使用など、他の用途を有する（参照例：Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28:80(1-2):63-9）。
さらに、本発明のＰＳＣＡ関連タンパク質又はポリヌクレオチドは、ＰＳＣＡの過剰発現を特徴とする病的症状を治療するために使用し得る。例えば、図２又は図３のアミノ酸又は核酸配列は、何れもＰＳＣＡ抗原に対し、免疫応答を生じさせるために使用し得る。ＰＳＣＡと反応する抗体又はその他の分子は、この分子の機能を調節するために使用し得るが、それによって治療上の利益を提供する。
ＸＩＩ．）ＰＳＣＡタンパク質機能の阻害
本発明は、ＰＳＣＡとその結合パートナーとの結合又はＰＳＣＡとその他のタンパク質との会合を阻害する種々の方法及び組成物、並びに、ＰＳＣＡの機能を阻害する方法を包含する。
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体によるＰＳＣＡの阻害
一方法においては、ＰＳＣＡに特異的に結合する一本鎖抗体をコードする組み換えベクターを、遺伝子導入技術によって、ＰＳＣＡ発現細胞に導入する。従って、コードされた一本鎖抗ＰＳＣＡ抗体は細胞内で発現され、ＰＳＣＡタンパク質と結合し、それによってＰＳＣＡタンパク質の機能を阻害する。かかる細胞内一本鎖抗体の設計方法は周知である。かかる細胞内の抗体は「細胞内発現抗体（intrabody）」としても知られ、細胞内の特定の区画を特異的に標的化し、処置の抑制的活性の焦点となる部位を制御する。この技法は技術的に成功裏に適用されている（参照概説：Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH vol.13）。細胞内発現抗体は、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている（参照例：Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1:332-337）。
一本鎖抗体は、柔軟な（flexible）リンカーポリペプチドによって結合する重鎖と軽鎖の可変領域を含んでなり、単一のポリペプチドとして発現される。選択肢として、一本鎖抗体は、軽鎖定常領域と結合する一本鎖可変領域フラグメントとして発現される。所望の細胞内区画に対し細胞内発現抗体が正確に標的化するように、周知の細胞内トラフィッキングシグナルを、かかる一本鎖抗体をコードする組み換えポリヌクレオチドベクターに組み込む。例えば、小胞体（ＥＲ）を標的とする細胞内発現抗体は、リーダーペプチド、及び選択肢としてＫＤＥＬアミノ酸モチーフなどのＣ末端ＥＲ残留シグナルを組込むように設計する。核内で活性を発揮するように意図した細胞内発現抗体は、核局在化シグナルを含むように設計する。原形質膜の細胞質ゾル側に細胞内発現抗体を繋ぎ止めるために、脂質部分を細胞内発現抗体に結合する。細胞内発現抗体はまた、細胞質ゾル内で機能を発揮するために標的となり得る。例えば、細胞質ゾル‐細胞内発現抗体を、因子を細胞質ゾル内に取り込むために使用し、それによって該因子が本来の細胞内目的地に輸送されるのを防ぐ。
一態様において、細胞内発現抗体を、核内でＰＳＣＡを捕捉するために使用し、それによって核内でのＰＳＣＡの活性を防止する。所望の標的化を達成するために、核標的シグナルをかかるＰＳＣＡ細胞内発現抗体に組み込む。かかるＰＳＣＡ細胞内発現抗体は、特定のＰＳＣＡドメインと特異的に結合するように設計する。もう一つの態様において、ＰＳＣＡタンパク質と特異的に結合する細胞質ゾル‐細胞内発現抗体を、ＰＳＣＡの核への接近を阻害するのに使用し、それによって、ＰＳＣＡが核内で生物活性を働かせるのを阻害する（例えば、ＰＳＣＡが他の因子と転写複合体を形成するのを阻害する）。
特定の細胞でのかかる細胞内発現抗体の発現を特異的に指向するため、細胞内発現抗体の転写を、適切な腫瘍特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの調節制御下に置く。前立腺に特異的に細胞内発現抗体の発現を標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーター及び／又はプロモーター／エンハンサーを利用することができる（参照例：米国特許５,９１９,６５２（１９９９年７月６日発行））。
ＸＩＩ．Ｂ．）組み換えタンパク質によるＰＳＣＡの阻害
もう一つの方法においては、組み換え分子がＰＳＣＡに結合し、それによってＰＳＣＡの機能を阻害する。例えば、これらの組み換え分子は、ＰＳＣＡがその結合パートナーに接近／結合すること、又は、その他のタンパク質と会合することを防止若しくは阻害する。かかる組み換え分子は、例えば、ＰＳＣＡ特異的抗体分子の反応性部分を含み得る。特定の態様において、ＰＳＣＡ結合パートナーのＰＳＣＡ結合ドメインが、二量体融合タンパク質に組み込まれるが、その場合の融合タンパク質はヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧのＦｃ部分と結合する２つのＰＳＣＡリガンド結合ドメインを含んでなる。
かかるＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。かかる二量体融合タンパク質は、ＰＳＣＡの発現と関連する癌に罹患している患者に、可溶性形状で投与する；その場合、当該二量体融合タンパク質はＰＳＣＡに特異的に結合し、結合パートナーとのＰＳＣＡ相互作用を遮断する。かかる二量体融合タンパク質は、さらに、既知の抗体結合法により多量体タンパク質と組み合わせる。
ＸＩＩ.Ｃ．）ＰＳＣＡの転写又は翻訳の阻害
本発明はまた、ＰＳＣＡ遺伝子の転写を阻害する種々の方法及び組成物をも包含する。同様に、本発明はまた、ＰＳＣＡｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する方法及び組成物をも提供する。
一つの方法において、ＰＳＣＡ遺伝子の転写を阻害する方法は、ＰＳＣＡ遺伝子をＰＳＣＡアンチセンスポリヌクレオチドと接触させることからなる。もう一つの方法において、ＰＳＣＡｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、ＰＳＣＡｍＲＮＡとアンチセンスポリヌクレオチドとを接触させることからなる。もう一つの方法においては、ＰＳＣＡ特異的リボザイムを用いてＰＳＣＡメッセージを切断し、それによって翻訳を阻害する。かかるアンチセンス及びリボザイムに基づく方法は、ＰＳＣＡプロモーター及び／又はエンハンサー要素など、ＰＳＣＡ遺伝子の調節領域にも向けることができる。同様に、ＰＳＣＡ遺伝子の転写因子を阻害し得るタンパク質を、ＰＳＣＡ ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用する。上記の方法に有用な種々のポリヌクレオチド及び組成物については、上に記載した。転写及び翻訳を阻害するアンチセンス及びリボザイム分子の使用は、技術上周知である。
ＰＳＣＡの転写活性化に干渉することによりＰＳＣＡの転写を阻害するその他の因子もまた、ＰＳＣＡを発現する癌の治療に有用でもある。同様に、ＰＳＣＡのプロセシングに干渉する因子は、ＰＳＣＡを発現する癌の治療に有用である。かかる因子を利用する癌治療方法もまた、本発明の範囲内である。
ＸＩＩ.Ｄ．）治療戦略の一般的考察
遺伝子導入及び遺伝子治療法の技術を、治療用のポリヌクレオチド分子を、ＰＳＣＡを合成する腫瘍細胞に送達するために使用する（すなわち、アンチセンス、リボザイム、細胞内発現抗体及び他のＰＳＣＡ阻害分子をコードするポリヌクレオチド）。多くの遺伝子治療法が技術上既知である。ＰＳＣＡアンチセンスポリヌクレオチドをコードする組み換えベクター、リボザイム、ＰＳＣＡ転写に干渉し得る因子などを、かかる遺伝子治療法を利用することにより標的腫瘍細胞に送達し得る。
上記の治療方法を、様々の外科手術、化学療法又は放射線療法プログラムの何れか一つと組み合わせ得る。本発明の治療方法では、化学療法（又は他の療法）での投与量を減量すること及び／又は投与回数を減ずることなどが可能となり、すべての患者にとって、特に化学療法剤の毒性への耐性が弱い患者にとって有利である。
特定の構成成分（例えば、アンチセンス、リボザイム、細胞内発現抗体）又はかかる成分の組み合わせの抗腫瘍活性は、種々のインビトロ及びインビボのアッセイ系を用いて評価し得る。治療活性を評価するインビトロアッセイは、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイ及び腫瘍増進活性を示すその他のアッセイ、及び、治療組成物がＰＳＣＡの結合パートナーとの結合をどの程度阻害するかを判定し得る結合アッセイ、などである。
ＰＳＣＡ治療用組成物のインビボ作用は、適当な動物モデルで評価し得る。例えば、異種間の前立腺癌モデルを使用し得るが、この場合、ヒトの前立腺癌移植片又は継代異種移植組織を、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入する（Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８及び米国特許６，１０７，５４０には、ヒト前立腺癌の種々の異種間移植モデルが、初期癌の進行、微小転移、及び、後期疾患の造骨細胞転移の形成について再現可能であることを記載している。腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮又は転移などの阻害を測定するアッセイを用い、有効性を予測し得る。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイは、治療用組成物の評価に有用である。一態様において、治療用組成物で処置した腫瘍保持マウスからの異種移植片を、アポトーシス巣の存在について試験し、異種移植片を有する未処置のマウスと比較し得る。処置マウスの腫瘍において、どの程度のアポトーシスが見出されるか、それが該組成物の治療有効性の指標を提供する。
前記方法の実施に使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適する担体を含んでなる医薬組成物に製剤化することができる。適切な担体は、治療用組成物と組み合わせた場合に治療用組成物の抗腫瘍機能を維持し、かつ、患者の免疫系と一般的に非反応性である物質を包含する。例示としては、限定されるものではないが、多くの標準的医薬用担体、例えば、無菌リン酸緩衝塩溶液、静菌水などの何れかである（一般的参照例：Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980）。
治療用製剤は、可溶化され、腫瘍部位に治療用構成成分を送達し得る任意の経路を介して投与し得る。可能性のある有効な投与経路は、限定されるものではないが、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、臓器内、同所性（orthotopic）などである。静脈注射用の好適な剤形は、保存性の静菌水、無菌非保存水の溶液とした治療用組成物、及び／又は、注射用の塩化ポリビニル又はポリエチレンバッグに入った０.９％無菌塩化ナトリウム中で希釈された治療用組成物（ＵＳＰ）、を含む。
治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥し、無菌粉末として、好ましくは真空下に置き、次いで注射に先立ち、静菌的な水（例えば、ベンジルアルコール保存剤を含む）又は無菌水中にて再構成され得る。
上記方法による癌治療のための投与量と投与プロトコールは、その方法と標的となる癌により変わり、一般には技術上認められているその他の多くの因子に左右される。
ＸＩＩＩ.）ＰＳＣＡモジュレーターの同定、特徴付け、及び、使用
モジュレーターの同定法と使用法
一態様においては、スクリーニングを、特定の発現プロフィールを誘発又は抑制し、特定の経路、抑制又は誘発するモジュレーター（好ましくはそれによって関連表現型が生成される）を同定するために、実施する。もう一つの態様においては、特定の状況にて重要な示差的（differentially）に発現された遺伝子を同定する；個別遺伝子の発現の増加又は減少の何れかを変化させるモジュレーターを同定するためにスクリーニングを実施する。もう一つの態様において、スクリーニングを、示差的（differentially）に発現された遺伝子の発現産物の生物学的機能を変化させるモジュレーターを同定するために実施する。さらにまた、特定の状況における遺伝子の重要性を確認し、スクリーニングを、遺伝子産物に結合及び／又はその生物学的活性を調節する物質を同定するために実施する。
加えて、候補物質に応答して誘導される遺伝子について、スクリーニングを実施する。モジュレーター（癌発現パターンを抑制し、正常発現パターンに導くモジュレーター、又は正常組織におけると同様の遺伝子発現に導く癌遺伝子のモジュレーター）を同定した後、該物質に応答して特異的に調節される遺伝子を同定するためにスクリーニングを実施する。正常組織と物質で処理された癌組織間の発現プロフィールを比較することで、正常組織又は癌組織では発現されないが、物質処理組織では発現されるか、又はその逆の場合の遺伝子が明らかとなる。これらの物質特異的な配列を同定し、癌遺伝子又はタンパク質のための本明細書に記載の方法に使用する。特に、これらの配列及びこれらがコードするタンパク質を用いて、物質を処理された細胞を作成又は同定する。加えて、該物質で誘発されたタンパク質に対する抗体を作成し、治療された癌組織サンプルに対する新規の治療法を目指すために使用する。
モジュレーター関連同定とスクリーニングアッセイ：
遺伝子発現関連アッセイ
本発明のタンパク質、核酸、及び抗体をスクリーニングアッセイに使用する。癌関連タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質及びこれらの配列を含む細胞はスクリーニングアッセイに使用し、例えば、「遺伝子発現プロフィール」、ポリペプチドの発現プロフィール又は生化学的機能の変化などに対する薬物候補の作用を評価する。一態様において、発現プロフィールは、好ましくは、候補物質で処理した後の遺伝子の発現プロフィールのモニターを可能とするハイスループットスクリーニング法とともに使用する（例：Davis, GF, et al., J Biol Screen 7:69 (2002); Zlokarnik et al., Science 279:84-8 (1998); Heid, Genome Res 6:986-94, 1996）。
癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質及び未改変の、又は改変した癌タンパク質又は遺伝子を含む細胞は、スクリーニングアッセイに使用する。すなわち、本発明は本発明の癌表現型又は癌タンパク質の生理的機能を調節する組成成分のスクリーニング法を含んでなる。この方法は遺伝子そのものについて実施するか、又は「遺伝子発現プロフィール」又は生物学的機能に対する薬物候補の効果を評価することにより実施する。一態様において、発現プロフィールは、好ましくは、候補物質で処理した後のモニターを可能とするハイスループットスクリーニング法とともに使用する（上記、Zlokarmik）。
様々のアッセイが本発明の遺伝子及びタンパク質を対象に実施される。アッセイは個々の核酸又はタンパク質レベルに関し実施する。すなわち、癌により上方制御された特定の遺伝子を同定し、遺伝子発現を調節する能力について、又は本発明の癌タンパク質に対する結合について、テスト化合物をスクリーニングする。この状況での「調節」は遺伝子発現の増加又は低下を意味する。調節の好適な量は、正常組織における遺伝子発現の当初の変化と、対する癌罹患組織における変化に左右されるが、少なくとも１０％の変化、好ましくは５０％、より好ましくは１００〜３００％、そしてある態様では３００〜１０００％以上の変化である。従って、もし遺伝子が正常組織に比べて癌組織で４倍の増加を示すならば、凡そ４倍の低下が多くの場合望ましい；同様に、正常組織に比べて癌組織で１０倍減少しているなら、テスト化合物による発現が１０倍増加した値を目標とすることが、多くの場合望ましい。癌に見られる遺伝子発現型を悪化させるモジュレーターは、例えば、さらなる分析における上方制御標的としても有用である。
遺伝子発現量は核酸プローブを用いてモニターし、遺伝子発現レベルの定量、又は二者択一として、遺伝子産物それ自体を、例えば、癌タンパク質に対する抗体及び標準的イムノアッセイ法の使用を介してモニターする。プロテオミクス及び分離方法もまた発現の定量を可能とする。
遺伝子発現を修飾する化合物を同定するための発現モニタリング
一態様において、遺伝子発現モニタリング、すなわち、発現プロフィールは、多くの実体と同時にモニターする。かかるプロフィールは、典型的には図２の１種以上の遺伝子に関わる。この態様において、例えば、癌核酸プローブはバイオチップに付着させ、特定細胞中の癌配列を検出し、定量する。あるいは、ＰＣＲを使用し得る。従って、一系列の、例えば、マイクロタイタープレートのウエルを用い、所望のウエルにプライマーを分配する。次いでＰＣＲ反応を実施し、各ウエルについて分析する。
発現モニタリングは、１種以上の癌関連配列、例えば、図２に示すポリヌクレオチド配列の発現を修飾する化合物を同定するために実施する。一般に、分析に先立ち、細胞にテストモジュレーターを加える。さらに、癌を調節するか、本発明の癌タンパク質を調節するか、本発明の癌タンパク質に結合するか、又は本発明の癌タンパク質及び抗体又は他の結合パートナーの結合に干渉する物質を同定するためのスクリーニング法も提供される。
一態様において、ハイスループットスクリーニング法は、膨大な数の可能性のある治療用化合物（候補化合物）を含むライブラリを提供することと関わる。かかる「コンビナトリアルケミカルライブラリ」を次いで、所望の特徴的活性を示すこれらのライブラリメンバー（特定の化学種又はサブクラス）を同定するための１種以上のアッセイ法でスクリーニングする。このように同定した化合物は、スクリーニング用の化合物としての、又は治療薬としての簡便な「リード化合物」として役立ち得る。
ある態様において、有力なモジュレーターのコンビナトリアルライブラリは、癌ポリペプチドに結合するか、又は活性を調節する能力についてスクリーニングする。簡便には、有用な性質を有する新規化学因子は、ある種所望の性質又は活性（例：阻害活性）を有する化学物質（「リード化合物」と呼称）を同定し、リード化合物の変種を創製し、そしてこれら変種化合物の性質と活性を評価することにより生成させる。多くの場合、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法はかかる分析のために採用する。
上記のように、遺伝子発現モニターリングは候補モジュレーター（例：タンパク質、核酸又は小分子）を試験するために、簡便に使用する。候補物質を加え、細胞をある期間インキュベートした後、分析すべき標的配列を含むサンプルは、例えば、バイオチップに加える。
要すれば、標的配列は既知の技法を用いて調製する。例えば、サンプルは既知溶解バッファー、エレクトロポレーションなどにより細胞を処理溶解し、適切であれば精製及び／又はＰＣＲなどの増幅を実施する。例えば、ヌクレオチドに共有結合付着させた標識によるインビトロ転写を実施する。一般に、核酸は、ビオチン−ＦＩＴＣ又はＰＥで、又はｃｙ３又はｃｙ５で標識する。
標的配列は、例えば、蛍光、化学発光、化学的、又は放射活性シグナルにより標識し、プローブに対する標的配列特異的結合を検出する手段を提供することができる。標識はまた適切な基質を供給したときに、検出可能な産物を生じるアルカリホスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素でもよい。あるいは、標識は標識化合物であるか、又は酵素インヒビターなどの小分子であって、結合はするが、酵素が触媒作用を及ぼすことも、変化させることもない分子である。標識はまたエピトープタグ又はストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンなどの部分又は化合物でもよい。ビオチンの例では、ストレプトアビジンを上記のように標識し、それによって結合した標的配列に検出可能なシグナルを提供する。非結合標識ストレプトアビジンは、一般に分析の前に除去する。
当業者も承知するように、これらのアッセイ法は直接のハイブリダイゼーションアッセイであるか、又は複数のプローブを使用する「サンドイッチアッセイ」でもよい；その概要は米国特許に記載がある：ＵＳＰ５,６８１,７０２；５,５９７,９０９；５,５４５,７３０；５,５９４,１１７：５,５９１,５８４；５,５７１,６７０；５,５８０,７３１；５,５９１,５８４；５,６２４,８０２；５,６３５,３５２；５,５９４,１１８；５,３５９,１００；５,１２４,２４６；及び５,６８１,６９７。この態様において、一般に、標的の核酸は上記のように調製し、ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とする条件下に、複数の核酸プローブからなるバイオチップに加える。
本発明では上に概説した高、中及び低ストリンジェントな条件など、様々なハイブリダイゼーション条件を使用する。該アッセイは一般に、標的の存在下でのみ標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とするストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェンシーの程度は熱力学的変数であるステップパラメーター、例えば、限定されるものではないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度などを変えることにより制御し得る。これらのパラメーターは、米国特許５,６８１,６９７に概説されているように、非特異的結合を制御するためにも使用し得る。従って、非特異的結合を低減するためには、より高いストリンジェントな条件であるステップを実施することが望ましい。
本明細書に概略した反応は様々な方法で遂行し得る。反応成分は、同時に、又は順序だてて、異なる順序で添加し得るが、下記に示すのが好適な態様である。加えて、反応は多様な他の試薬を含み得る。これらは塩、バッファー、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などであり、最適のハイブリダイゼーション及び検出を促進し、及び／又は非特異的又はバックグランド相互作用を減少させるために使用し得るものである。アッセイの効率を他の状態でも改善する試薬、例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などは、サンプル調製法と標的の純度により、適切な場合に使用してもよい。アッセイデータを分析し、個々の遺伝子の発現レベルと、状態間での発現レベルの変化を決定して、遺伝子発現プロフィールを作成する。
生物活性関連アッセイ
本発明は、本発明の癌関連遺伝子又はタンパク質の活性を調節する化合物の同定方法又はスクリーニング方法を提供する。該方法は上記定義のように、本発明の癌タンパク質を含んでなる細胞にテスト化合物を加えることからなる。該細胞は本発明の癌タンパク質をコードする組み換え核酸を含有する。もう一つの態様において、候補物質のライブラリを複数の細胞について試験する。
一側面において、該アッセイ法は生理的シグナル、例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、化学療法剤などの薬理物質、放射線照射、発癌剤、又は他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触）の存在下若しくは不存在下又は事前若しくは事後の接触により評価する。もう一つの例において、判定は細胞周期過程の異なる段階でなされる。この方式で、本発明の遺伝子又はタンパク質を調節する化合物を同定する。薬理活性をもつ化合物は本発明の癌タンパク質の活性を上昇させるか、又は活性に干渉し得る。同定後、同様の構造を評価し、化合物の必須の構造的特長を同定する。
一態様において提供される癌細胞の分裂を調節（例えば、阻害）する方法は、癌モジュレーターを投与することからなる方法である。もう一つの態様において提供される癌を調節（例えば、阻害）する方法は、癌モジュレーターを投与することからなる方法である。さらなる態様において提供される癌細胞又は癌を有する個体の治療方法は、癌モジュレーターを投与することからなる方法である。
一態様においては、本発明の遺伝子を発現する細胞の状態を調節する方法が提供される。本明細書にて使用する場合、状態とは技術上受け入れられているパラメーター、例えば、細胞の成長、増殖、生存、機能、アポトーシス、老化、局在、酵素活性、シグナル伝達などを意味する。一態様において、癌インヒビターは上記考察の抗体である。もう一つの態様において、癌インヒビターはアンチセンス分子である。本明細書に記載したように、様々の細胞成長、増殖、及び転移アッセイ法が当業者に既知である。
モジュレーター同定のためのハイスループットスクリーニング
適切なモジュレーターを同定するためのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに受け入れられる。好適なアッセイ法は、従って、癌遺伝子転写の上昇又は阻害、ポリペプチド発現の阻害又は上昇、及びポリペプチド活性の阻害又は上昇を検出することである。
一態様において、ハイスループットスクリーニング法により評価されたモジュレーターは、タンパク質であり、多くの場合、天然型タンパク質又は天然型タンパク質のフラグメントである。従って、例えば、タンパク質含有細胞性抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物の無作為若しくは企図した消化物を使用する。タンパク質ライブラリはこの方式で本発明方法においてスクリーニングする。この態様において特に好適なのは、バクテリア、カビ、ウイルス、及び哺乳動物タンパク質のライブラリであるが、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。特に有用なテスト化合物は、標的が属するタンパク質の群に、例えば、酵素の基質、又はリガンド及びレセプターなどを指向する。
モジュレーターの同定及び特徴付けにおける軟寒天増殖コロニー形成の使用
正常細胞は付着と増殖のために固体基質を必要とする。細胞を形質転換する場合、細胞はその表現型を失い、基質から切り離されて増殖する。例えば、形質転換細胞は、攪拌懸濁培養において、又は半固体若しくは軟寒天などの半固体培地に懸濁した状態で増殖することが可能である。形質転換細胞は、腫瘍抑制因子遺伝子で形質移入したとき、正常表現型を再生し、再び付着、増殖するための固体基質を必要とする。アッセイにおける軟寒天増殖又はコロニー形成は、癌配列のモジュレーターを同定するために使用するが、宿主細胞で発現された場合、異常細胞増殖及び形質転換を阻害する。モジュレーターは寒天などの固体又は半固体培地に懸濁した宿主細胞の増殖能力を低下させるか、又は除去する。
懸濁アッセイにおける軟寒天増殖又はコロニー形成の技法については、文献に記載がある：Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basich Technique (3rd ed., 1994)。上記文献（Garkavtsev et al. (1996)の方法に関する章）も参照されたい。
モジュレーターの同定と特徴付けのための接触阻害と増殖密度の評価
正常細胞は細胞培養において、一般に他の細胞と接触するまで、平床組織化パターンで増殖する。細胞が互いに触れ合うと、接触を阻害され、増殖を止める。しかし、形質転換細胞は非組織化巣で、接触を阻害されることなく、高密度まで増殖を続ける。従って、形質転換細胞は、対応する正常細胞よりも高飽和密度に増殖する。このことは細胞の無秩序な単層の形成により、又は巣中の細胞により形態的に検出される。別法として、飽和密度での（３Ｈ）チミジンによる標識指数を用いて、増殖の密度限界を測定する；同様に、ＭＴＴ又はアラマー（Alama）ブルーアッセイは、細胞の増殖能力と、それに影響するモジュレーターの能力を明らかにしよう。参照文献：Freshney (1994), supra。形質転換細胞は、腫瘍抑制因子遺伝子で形質転換した場合、正常表現型を再生し、接触が阻害されるようになり、低密度に増殖する。
このアッセイにおいて、飽和密度での（３Ｈ）チミジンによる標識指数は、増殖密度限界を測定する好適な方法である。形質転換宿主細胞は癌関連配列で形質移入し、非限界培地条件下、飽和密度で２４時間増殖する。（３Ｈ）チミジンによる細胞標識化のパーセントは、取り込まれたｃｐｍで判定する。
接触非依存性の増殖は、異常細胞の増殖と形質転換に導いた癌配列のモジュレーターを同定するために使用する。モジュレーターは接触非依存性の増殖を低下させるか、又は除去し、該細胞を正常な表現型に戻す。
モジュレーターの同定と特徴付けのための増殖因子又は血清依存性の評価
形質転換細胞はその正常対照物よりも低い血清依存性を有する（参照例：Temin, J. Natl. Cancer Inst. 37:167-175 (1966); Eagle et al., J. Exp. Med 131:836-879 (1970); Freshney, supra）。これは一部分、形質転換細胞による様々な増殖因子の放出によるものである。形質転換宿主細胞の増殖因子又は血清依存性の度合いは、対照と比較することができる。例えば、細胞の増殖因子又は血清依存性は、本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定・特徴付けする方法によりモニターする。
モジュレーターの同定と特徴付けのための腫瘍特異的マーカーレベルの使用
腫瘍細胞は対応する正常細胞よりも増加した量のある種因子（以下「腫瘍特異的マーカー」）を放出する。例えば、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）は、ヒトのグリオーマから、正常の脳細胞からよりも高いレベルで放出される（参照例：Guillino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth (脈管形成、腫瘍血管形成、及び腫瘍増殖の潜在的干渉), in Biological Responses in Cancer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985)。同様に、腫瘍脈管形成因子（ＴＡＦ）は、腫瘍細胞において対応する正常細胞よりも高レベルで放出される。参照例：Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem Cancer Biol. (1992); 一方、ｂＦＧＦは内皮腫瘍から放出される（Ensoli, B et al）。
これらの因子の放出を測定する種々の技法が文献（Freshney, 1994, supra）に記載されている。また、以下の文献も参照されたい：Unkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976); Whur et al., Br. J. Cancer 42:305 312 (1980); Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Research in Cancer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985); Freshney, Anticancer Res. 5:111-130 (1985)。例えば、腫瘍特異的マーカーレベルは、本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定し、特徴付けする方法によりモニターする。
モジュレーターの同定と特徴付けのためのマトリゲルへの侵入
マトリゲル又は細胞外マトリックス成分への侵入の度合いは、癌関連配列を調節する化合物を同定し特徴付けするアッセイとして使用し得る。腫瘍細胞は細胞の悪性度と、マトリゲル又はある種他の細胞外マトリックス成分への侵入との間に、正の相関を示す。このアッセイでは、一般に腫瘍化細胞を宿主細胞として使用する。これらの宿主細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現は、宿主細胞の侵入を低下させよう。文献（Freshney (1994), supra）記載の方法を使用し得る。簡単に説明すると、宿主細胞の侵入レベルは、マトリゲル又はある種細胞外マトリックス成分で被覆したフィルターを用いて測定する。ゲルへの浸透、又はフィルターの端部からの浸透は、侵入度として評価され、組織学的には細胞数と移動距離により、又は細胞の１２５Ｉによる事前標識とフィルター端部若しくはディッシュ底部の放射活性測定により評価する。文献（Freshney (1994), supra）参照。
モジュレーターの同定と特徴付けのためのインビボ腫瘍増殖の評価
細胞増殖に対する癌関連配列の影響は、トランスジェニック生物又は免疫抑制生物で試験する。トランスジェニック生物は様々な技術的に受け容れられている方法で調製する。例えば、ノックアウトトランスジェニック生物、例えば、マウスなどの哺乳動物は、癌遺伝子が破壊されているか、又は癌遺伝子が挿入されている生物として創出する。ノックアウトトランスジェニックマウスは、マーカー遺伝子又は他の異種遺伝子を、相同組み換えを介してマウスゲノムの内在性癌遺伝子部位に挿入することにより創出する。かかるマウスはまた内在性癌遺伝子を癌遺伝子の突然変異体と置き換えることにより、又は内在性癌遺伝子を、例えば、発癌物質に接触させることによる突然変異により創出し得る。
トランスジェニック・キメラ動物、例えば、マウスを調製するためには、ＤＮＡ構築物を胚幹細胞の核に導入する。新たに設計作製された障害巣をもつ細胞を宿主マウス胚に注射し、それを受容メスに再移植する。これら胚のいくつかは、突然変異細胞株由来の生殖細胞をもつキメラマウスに成長する。それ故、このキメラマウスを飼育することにより、導入した遺伝的障害をもつマウスの新株を得ることが可能である（参照例：Capecchi et al., Science 244:1288 (1989)）。キメラマウスは以下の文献に従い、誘導し得る：米国特許６,３６５,７９７（２００２年４月２日発行）；ＵＳＰ６,１０７,５４０（２０００年８月２２日発行）；Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual（マウス胚の操作；実験室マニュアル）, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 及び Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach（奇形癌腫及び胚幹細胞；実用方法）, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987)。
別法として、種々の免疫抑制又は免疫欠失宿主動物を使用し得る。例えば、遺伝的胸腺欠損「ヌード」マウス（参照例：Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:921 (1974)）、ＳＣＩＤマウス、胸腺切除マウス、又は放射線照射マウス（参照例：Bradley et al., Br. J. Cancer 38:263 (1978); Selby et al., Br. J. Cancer 41:52 (1980)）などが宿主として使用し得る。同質遺伝子的宿主に注射した移植可能な腫瘍細胞（典型的には凡そ１０６細胞）は、高比率の頻度で侵襲性腫瘍を生じるが、一方、同様の起源の正常細胞は生じない。侵襲性腫瘍を成長させた宿主に、癌関連配列を発現する細胞を皮下又は同所的に注射する。次いで、マウスを対照群と処置実験群（例えば、モジュレーターで処理）とを含むグループに分ける。適当な時間、好ましくは４〜８週間、置いた後、腫瘍増殖を測定し（例えば、容積によるか、又はその二次元最大値又は重量による）、対照と比較する。統計的に有意な減少（例えば、スチューデント‐Ｔ検定を使用）を示す腫瘍は、増殖が阻害されたと言われる。
モジュレーターの同定と特徴付けのためのインビトロアッセイ
調節活性を有する化合物の同定アッセイはインビトロで実施し得る。例えば、癌ポリペプチドは先ず可能性のあるモジュレーターと接触させ、適当な時間量、例えば、０.５〜４８時間インキュベートする。一態様において、癌ペプチドレベルはタンパク質又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定する。タンパク質レベルは、癌ポリペプチド又はそのフラグメントに選択的に結合する抗体を用い、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイにより測定する。ｍＲＮＡの測定には、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲを用いる増幅、又は例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、ドットプロッティングなどのハイブリダイゼーションアッセイが好適である。タンパク質又はｍＲＮＡのレベルは、直接的又は間接的に標識した検出試薬、例えば、本明細書に記載の蛍光又は放射活性標識した核酸、放射活性又は酵素で標識した抗体などを用いて検出する。
あるいは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ、又はＰ‐ｇａｌなどのレポーター遺伝子に操作可能に結合した癌タンパク質プロモーターを用い、レポーター遺伝子系を案出することができる。レポーター構築物は、一般に細胞に形質移入する。可能性のあるモジュレーターで処理した後、レポーター遺伝子転写、翻訳、又は活性の量を、当業者既知の標準的技法に従って測定する（Davis GF, supra; Gonzalez, J. & Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechol. 1998: 9:624）。
上に概説したように、インビトロスクリーニングは、個々の遺伝子と遺伝子産物について実施する。すなわち、特定の状態で重要とされる特定の示差的に発現された遺伝子を同定し、該遺伝子の発現又はその遺伝子産物のモジュレーターそのもののスクリーニングを実施する。
一態様において、特別の遺伝子発現のモジュレーターのスクリーニングを実施する。一般に、単一の、又は２〜３の遺伝子の発現を評価する。もう一つの態様において、スクリーニングは示差的に発現されたタンパク質に結合する化合物を先ず見出すように設計する。次いで、これらの化合物について、示差的に発現された活性を調節する能力を評価する。さらに、当初の候補化合物を同定した後、構造活性の関連性をよりよく評価するために、変異体をさらにスクリーニングする。
モジュレーターの同定と特徴付けのための結合アッセイ
本発明による結合アッセイにおいては、本発明の精製又は単離した遺伝子産物を一般に使用する。例えば、抗体は本発明のタンパク質に対して生成させ、イムノアッセイはタンパク質の量及び／又は位置を決定するために実施する。あるいは、癌タンパク質を含んでなる細胞をアッセイで使用する。
従って、該方法は本発明の癌タンパク質とリガンドなどの候補化合物とを組み合わせ、本発明の癌タンパク質に対する化合物の結合を決定することからなる。好適な態様ではヒトの癌タンパク質を利用する；ヒト疾患の動物モデルも開発し、使用し得る。また、他の類似の哺乳動物タンパク質も、当業者が認識するように、使用し得る。さらに、一部態様においては、変異又は誘導癌タンパク質が使用される。
一般に、本発明の癌タンパク質又はリガンドは、不溶性支持体に拡散せずに結合する。該支持体は、例えば、単離したサンプル受容領域をもつものである（マイクロタイタープレート、アレイなど）。不溶性支持体は組成物が結合し得る何らかの構成物で作られたもので、可溶性物質から容易に分離し得るものであり、スクリーニング方法全般と他の面でも両立し得るものである。かかる支持体の表面は固体でも多孔性でもよく、またどのように簡便な形状でもよい。
適当な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜及びビーズである。これらは代表的に、ガラス、プラスチック（例：ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、又はテフロン（登録商標）などで作製される。マイクロタイタープレート及びアレイは、少量の試薬とサンプルを用いて、膨大な数のアッセイを同時に実施できるので、特に便利である。組成物が支持体に結合する特定の様式は、それが本発明の試薬及び方法全体と両立し、組成物の活性を維持し、拡散性でない限り、決定的なものではない。タンパク質を支持体に結合させる際に好適な結合方法は、リガンドの結合部位又は活性化配列の何れをも立体的に遮断しない抗体を使用すること、「粘着性」又はイオン性支持体に直接結合させること、化学的架橋、表面上でのタンパク質又は物質の合成などである。支持体にタンパク質又はリガンド／結合剤を結合させた後、過剰の未結合物質を洗浄により除去する。サンプル受容領域は、次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又はその他の無害なタンパク質又はその他の成分と、インキュベーションすることにより遮断してもよい。
本発明の癌タンパク質を支持体に結合させた後、テスト化合物をアッセイ系に加える。あるいは、候補結合物質を支持体に結合させ、次いで本発明の癌タンパク質を加える。結合物質は特異的抗体、ケミカルライブラリのスクリーニングにおいて同定される非天然の結合物質、ペプチド類似体などである。
特に興味深いことは、ヒトの細胞に対し毒性の低い物質を同定するアッセイ法である。多様なアッセイ法がこの目的に使用し得る；例えば、増殖アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、標識化インビトロタンパク質−タンパク質アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についてのイムノアッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などである。
本発明の癌タンパク質に対するテスト化合物（リガンド、結合物質、モジュレーターなど）の結合の決定は、多くの方法で実施し得る。テスト化合物は標識してもよく、結合は、例えば、本発明の癌タンパク質の全部又は一部を固体支持体に付着させ、標識した候補化合物（例えば、蛍光標識）を加え、過剰の試薬を洗い流し、次いで標識物が固体支持体上に存在するかを判定することにより直接決定する。適切な場合には、様々なブロッキングステップと洗浄ステップを利用し得る。
ある特定の態様では、１つの成分のみ、例えば、本発明のタンパク質又はリガンドのみを標識する。あるいは、１つを超える成分について異なる標識により、例えば、タンパク質についてはＩ１２５により、また、該化合物については蛍光体により標識する。近接試薬、例えば、クエンチング試薬又はエネルギー転移試薬も有用である。
モジュレーターの同定と特徴付けのための競合的アッセイ
一態様において、「テスト化合物」の結合は、「拮抗剤」との競合的結合アッセイにより判定する。拮抗剤は標的分子（例えば、本発明の癌タンパク質）に結合する結合残基である。拮抗剤は、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどの化合物である。ある特定の条件下、テスト化合物と拮抗剤との間の競合的結合は、テスト化合物と置き換わる。一態様において、テスト化合物は標識される。テスト化合物、拮抗剤、又はその両方を、結合を可能とする十分な時間、タンパク質に加える。インキュベーションは最適な活性を促進する温度、一般に、４〜４０℃で実施する。インキュベーション時間は、一般に、例えば、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するように最適化する；例えば、０〜１時間で十分である。過剰の試薬は一般に除去又は洗い流す。次いで、第二成分を加え、標識化成分の存在又は不存在を追跡し、結合を示す。
一態様においては、先ず拮抗剤を加え、次いでテスト化合物を加える。拮抗剤の置き換えは、テスト化合物が癌タンパク質に結合していること、従って、癌タンパク質に結合可能であり、癌タンパク質の活性を調節する可能性のあることを示している。この態様においては、両成分を標識し得る。従って、例えば、もし拮抗剤が標識されているならば、テスト後化合物の洗浄液に標識が存在することは、テスト化合物に置き換わったことを示す。あるいは、もしテスト化合物が標識されているならば、支持体上に標識の存在することは、置換のあることを示す。
別の態様においては、先ずテスト化合物を加え、インキュベートし、洗浄した後に拮抗剤を加える。拮抗剤による結合がなければ、テスト化合物が拮抗剤よりも高い親和性で癌タンパク質に結合したことを示す。従って、もしテスト化合物が標識されているならば、支持体上の標識の存在は、拮抗剤の結合欠如と組み合わせて、テスト化合物が本発明の癌タンパク質に結合し、調節する可能性のあることを示している。
従って、競合的結合法は、本発明の癌タンパク質活性を調節し得る物質同定のための示差スクリーニングを包含する。この態様において、該方法は第一サンプルに癌タンパク質と拮抗剤を組み合わせることからなる。第二サンプルは、テスト化合物、癌タンパク質、及び拮抗剤からなる。拮抗剤の結合は両サンプルについて決定され、２つのサンプル間の結合の変化又は差は、物質が存在すること、その物質が癌タンパク質に結合可能であり、かつその活性を調節する可能性のあることを示している。すなわち、もし拮抗剤の結合が第一サンプルに比べて第二サンプルで異なっているならば、その物質は癌タンパク質に結合可能である。
あるいは、示差スクリーニングは未改変の癌タンパク質に結合するが、改変した癌タンパク質には結合し得ない薬物候補を同定するために使用する。例えば、癌タンパク質の構造をモデルとして理に適った薬物の設計に使用し、その部位と相互作用する作用因子、部位改変したタンパク質には一般的に結合しない作用因子を合成する。さらに、未改変癌タンパク質の活性に影響するかかる薬物候補はまた、かかるタンパク質の活性を上昇又は低下させる能力について薬物をスクリーニングすることによっても同定される。
陽性対照及び陰性対照はこのアッセイで使用し得る。好ましくは、対照とテストサンプルは統計的に有意な結果を得るために、少なくとも３組で実施する。すべてのサンプルのインキュベーションは、物質とタンパク質との結合が可能となる十分な時間行う。インキュベーションに続き、サンプルを洗浄して非特異的に結合した物質を除き、結合した量、通常は標識化物質を定量する。例えば、放射線標識を採用する場合、シンチレーション・カウンターによりサンプルを計測し、結合化合物量を定量することができる。
様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに包含させ得る。これらは塩様試薬、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などであり、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、及び／又は非特異的若しくはバックグランドの相互作用を低下させるために使用する。また、その他の点でアッセイの効率を改善する試薬、例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などを使用することもできる。成分の混合物は、必要な結合を提供する順序で加える。
本発明のタンパク質を下方制御又は阻害するポリヌクレオチドの使用
癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、リガンド結合分子との抱合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入し得る（国際特許出願ＷＯ９１／０４７５３の記載参照）。適切なリガンド結合分子は、限定されるものではないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合するその他のリガンドである。好ましくは、リガンド結合分子の抱合は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する能力に実質的に干渉せず、またセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその抱合体が細胞に入り込むのも遮断しない。あるいは、癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されているように、例えば、ポリヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞に導入し得る。理解されることは、アンチセンス分子又はノックアウト及びノックインモデルが、治療方法に加えて、上に考察したようにスクリーニングアッセイにも使用し得ることである。
阻害性及びアンチセンスヌクレオチド
ある特定態様において、癌関連タンパク質の活性は、アンチセンスポリヌクレオチド又は抑制性の核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、すなわち、コードｍＲＮＡ核酸配列に相補性であり、また好ましくは特異的にハイブリダイズし得る核酸の使用により、下方制御されるか、又は全体として阻害される；例えば、本発明の癌タンパク質、ｍＲＮＡ、又はそのサブ配列である。アンチセンスポリヌクレオチドとｍＲＮＡとの結合は、そのｍＲＮＡの翻訳及び／又は安定性を低下させる。
本発明の文脈において、アンチセンスポリヌクレオチドは天然のヌクレオチドからなるか、又は天然型のサブユニット若しくはその密接な相同体から形成される合成種を含み得る。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、改変した糖部分又は糖間結合を有し得る。これらの内の代表例はホスホロチオアート及び他のイオウ含有種であり、技術的に使用の知られたものである。類似体は本発明のヌクレオチドと有効にハイブリダイズするように機能する限り、本発明に包含される。参照例：Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc. Natick, MA。
かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、組み換え手法を用いて容易に合成可能であるか、又はインビトロで合成し得る。そのような合成に用いる器材は、アプライドバイオシステム社を含むいくつかのメーカーから販売されている。その他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオアート及びアルキル化誘導体などの調製についても、当業者に周知である。
ここで使用するアンチセンス分子とは、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドである。センスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖との結合によって、転写を遮断するために採用し得る。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドは、癌分子の標的ｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含む。本発明によるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、一般には少なくとも凡そ１２個のヌクレオチド、好ましくは１２〜３０個のヌクレオチドを含んでなる。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力については、文献に記載がある：例：Stein & Cohen (Cancer Res. 48:2659 (1988)) 及び van der Krol et al., (Bio Techniques 6:058 (1988))。
リボザイム
アンチセンスポリヌクレオチドに加えて、癌関連ヌクレオチド配列の転写を標的とし、阻害するために、リボザイムを使用することができる。リボザイムは他のＲＮＡ分子を触媒的に切断するＲＮＡ分子である。異なる種類のリボザイム、例えば、グループＩリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、リボヌクレアーゼＰ、及び斧型ヘッドリボザイムなどが文献に記載されている（異なるリボザイムの性質についての一般的概説参照例：Castanotto et al., Adv. in Pharmacology 25:289-317 (1994)）。
ヘアピンリボザイムの一般的特徴については文献に記載がある；例：Hampel et al., Nucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); 欧州特許公開Ｎｏ．０３６０２５７；米国特許５,２５４,６７８。その調製法については当業者に周知である（参照例：ＷＯ９４／２６８７７；Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344 (1993); Yamada et al., Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:699-703 (1995): Leavitt et al., Human Gene Therapy 5:1151-120 (1994); 及び Yamada et al., Virology 205: 121-126 (1994)）。
表現型スクリーニングにおけるモジュレーターの使用
一態様において、テスト化合物は、関連する癌の発現プロフィールをもつ一群の癌細胞に投与する。本明細書において、「投与」又は「接触」とは、モジュレーターを、細胞による取り込み作用及び細胞内作用によって又は細胞表面での作用により、細胞に作用するような方法で細胞に加えることを意味する。一部の態様において、タンパク質様物質（すなわち、ペプチド）をコードする核酸を、アデノウイルス又はレトロウイルス構築物などのウイルス構築物に入れ、ペプチド物質の発現が遂行されるように、細胞に加える；例：国際特許ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９。制御可能な遺伝子療法システムも使用し得る。一旦細胞にモジュレーターを投与した後、所望により細胞を洗浄し、好ましい生理的条件下に、所要時間インキュベートする。次いで細胞を採取し、新たな遺伝子発現プロフィールを生成させる。このように、例えば、調節する物質について癌組織をスクリーニングし、例えば、癌表現型を誘発又は抑制する。少なくとも１つ、好ましくは多くの遺伝子における発現プロフィールの変化は、物質が癌の活性に対して作用をもつことを示している。同様に、生物学的機能の変化又はシグナル伝達の変化は、モジュレーター活性の証拠である。癌表現型のかかるサインを定義することによって、該表現型を変える新薬のスクリーニングが案出される。この方法により、薬物標的は既知であることを要せず、また当初の遺伝子／タンパク質発現スクリーニングプラットホームに提示される必要もなく、あるいは変化する必要のある標的タンパク質の転写物のレベルも必要ない。機能を阻害するモジュレーターは代用マーカーとして働く。
上に概説したように、スクリーニングは遺伝子又は遺伝子産物を評価するために行う。すなわち、特定の状態で、特定の示差的発現遺伝子を重要なものとして同定した後、遺伝子又は遺伝子産物自体の発現のモジュレーターのスクリーニングを実施する。
本発明ペプチドに影響するモジュレーターの使用
癌ポリペプチド活性の測定又は癌表現型の測定は、種々のアッセイ法を用いて実施する。例えば、癌ポリペプチドの機能に対するモジュレーターの作用は、上記のパラメーターを試験することにより測定する。活性に影響する生理的変化は、本発明のポリペプチドに対するテスト化合物の影響を評価するために使用する。機能的成果を未改変細胞又は動物により判定する場合、様々な作用について、固形腫瘍、腫瘍増殖、腫瘍転移、新生血管形成、ホルモン放出、既知及び未特徴付け遺伝子マーカー（例えば、ノーザンブロットによる）、細胞増殖若しくはｐＨ変化などの細胞メカニズムの変化、及びｃＧＮＩＰなどの細胞内セカンドメッセンジャーの変化、などと関連する癌の事例のように、評価し得る。
癌関連配列を同定・特徴付けする方法
種々の遺伝子配列の発現は、癌と相関する。従って、突然変異又は変異型癌遺伝子に基づく疾病が決定される。一態様において、本発明は変異型癌遺伝子を含む細胞を同定する方法、例えば、細胞中の少なくとも１種の内在性癌遺伝子の配列、その全部又は一部の存在を決定する方法を提供する。この方法はいくつかの配列決定技法を用いて実施する。本発明は個体の癌表現型を同定する方法、例えば、個体において本発明の少なくとも１種の遺伝子の配列の全部又は一部を決定する方法からなる。これは一般的に個体の少なくとも１種の組織、例えば、表１に示す組織で実施し、多数の組織についての、又は同じ組織の異なるサンプルについての評価を含み得る。この方法は配列決定した遺伝子の配列を既知の癌遺伝子、すなわち、野生型遺伝子と比較し、ファミリーメンバー、相同体、突然変異又は変異体の存在を決定することからなる。次いで、その遺伝子の全部又は一部の配列を既知癌遺伝子の配列に比較し、何らかの差異が存在するかを判定することができる。これはいくつかの既知相同性プログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｂｅｓｔｆｉｔなどを用いて行う。患者の癌遺伝子と既知癌遺伝子との間に、配列の差が存在する場合、本明細書に概説するように、それは病状と相関するか、又は病的傾向と相関する。好適な態様において、癌遺伝子はゲノムの癌遺伝子のコピー数を決定するためにプローブとして使用する。癌遺伝子は癌遺伝子の染色体位置を決定するためのプローブとして使用する。染色体位置などの情報には、特に、トランスロケーションなどの染色体異常が癌遺伝子巣に同定される場合に、診断又は予測を提供するという用途がある。
ＸＩＶ．）キット／製造物
本明細書に記載の、実験室、予測、予防、診断及び治療適用で使用するキットは本発明の範囲内である。かかるキットは担体、包装、又はバイアル、チューブなどの１個以上の容器を受容するために区画分けした容器からなり、各容器は本方法に使用すべき個々の要素と、本明細書に記載した用途など、使用説明書を含むレーベル又は添付文書とを含んでなる。例えば、該容器は、検出可能に標識した又は標識し得るプローブを含み得る。かかるプローブは本発明のタンパク質又は遺伝子若しくはメッセージにそれぞれ特異的な抗体又はポリヌクレオチドであり得る。本方法が標的の核酸を検出するために核酸のハイブリダイゼーションを利用する場合、キットもまた標的核酸配列増幅用のヌクレオチドを容れた容器を有する。キットはレポーターを含む容器を含み得る；例えば、酵素、蛍光体、又は放射性同位元素などのレポーター分子に結合したビオチン結合タンパク質、例えば、アビジン又はストレプトアビジンなどである：かかるレポーターは、例えば、核酸又は抗体とともに使用し得る。キットは図２又は図３のアミノ酸配列の全部若しくは一部又はその類似体、又はかかるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含み得る。
本発明のキットは、典型的には、上記の容器及びそれと関連する１個以上の容器からなり、該容器は商業的及びユーザーの観点から望まれる物質、例えば、バッファー、希釈剤、フィルター、針、注射筒など；担体、包装、容器、バイアル及び／又はチューブレーベル掲載内容及び／又は使用説明書、及び使用説明書付き添付文書などを含んでなる。
レーベルは、該組成物が予測、予防、診断又は実験室応用など、特異的な治療又は非治療応用に使用することを明記する容器上又は容器とともに存在し得るものであり、本明細書に記載するように、インビボ又はインビトロでの使用法を指示することもできる。説明書及び／又はその他の情報は、キットとともに、又はキット上に含める添付文書又はレーベルに含めることもできる。レーベルは容器上とするか、又は容器と関連付け得る。レーベルは文字、数字又はレーベルを形成するその他の特徴を容器自体に形作るか、又は彫り込む場合に、容器上に存在し得る；レーベルは、それが例えば添付文書のように、容器を保持する容器又は運搬用具内に在る場合、容器と関連付け得る。レーベルは、該組成物が表１に示す組織の異常増殖など、症状の診断、治療、予防又は予測に使用することを示し得る。
「キット」及び「製造物」という用語は、同義語として使用し得る。
本発明のもう一つの態様においては、アミノ酸配列（類）、小分子（類）、核酸配列（類）、及び／又は抗体（類）、例えば、表１に示したような組織の異常増殖の診断、予測、予防及び／又は治療に有用な物質などの組成物を含有してなる製造物が提供される。製造物は代表的には少なくとも１つの容器と少なくとも１つのレーベルからなる。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、注射筒、及び試験管である。容器は様々な材料、例えば、ガラス、金属又はプラスチックなどから形成し得る。容器はアミノ酸配列（類）、小分子（類）、核酸配列（類）、細胞集団（群）、及び／又は抗体（類）を収容し得る。一態様において、該容器は細胞のｍＲＮＡ発現プロフィールの試験に使用するポリヌクレオチドを、この目的に使用する試薬とともに収容する。もう一つの態様において、容器は細胞及び組織中のＰＳＣＡのタンパク質発現を評価する際に使用する、又は関連する実験室、予測、予防及び治療を目的する、抗体、その結合フラグメント又は特異的結合タンパク質を含んでなる；かかる使用のための効能・効果及び／又は用法説明書も、これらの目的に使用する試薬及び他の組成分又は器具同様に、かかる容器に含めることができる。もう一つの態様において、容器は細胞性又は体液性免疫応答を引き出すための物質を、関連する効能・効果及び／又は用法説明書とともに含んでなる。もう一つの態様において、容器は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）又はヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）などの養子免疫治療用の物質を、関連する効能・効果及び／又は用法説明書とともに含んでなる；かかる目的に使用する試薬及び他の組成分又は器具もまた含め得る。
該容器は、あるいは症状を治療、診断、予測又は予防するために有効な組成物を収容することが可能で、無菌の出入口を有し得る（例えば、容器は静注溶液用バッグ又はバイアルであり、皮下注射用針により穿孔し得る栓を有する）。該組成物中の活性剤はＰＳＣＡに特異的に結合し、ＰＳＣＡの機能を調節し得る抗体であり得る。
該製造物はさらにリン酸緩衝塩溶液、リンゲル溶液及び／又はデキストロース溶液など、医薬的に許容し得るバッファーを収容する第二容器を含み得る。このものはさらに商業上及びユーザーの観点から望まれるその他の物質、例えば、他のバッファー、希釈剤、フィルター、スターラー、針、注射筒、及び／又は効能・効果及び／又は用法を記載する添付文書を含み得る。
本発明の様々な形態が後述のいくつかの例として述べられ、示されるが、そのいずれもこの発明の範囲を制限するものでは無い。
実施例１：ＰＳＣＡ遺伝子のｃＤＮＡ断片のＳＳＨ生成単離
意図的に省略
実施例２：ＰＳＣＡ遺伝子全長をコードしたｃＤＮＡの単離
意図的に省略
実施例３：ＰＳＣＡ遺伝子の染色体上での位置決定（マッピング）
意図的に省略
実施例４：正常組織と患者の検体におけるＰＳＣＡ変異体の発現解析
先に、ＰＳＣＡ（ここではＰＳＣＡｖ．１と呼ばれる）は、前立腺癌において発現している抗原の一つとして同定された。その発現は、原発性の前立腺癌の８０％以上において、及び前立腺への転移のほとんどにおいて検出された。膀胱癌、卵巣癌、膵癌においても、その発現が見られた；これらの癌は表１に挙げられている。免疫組織化学的な解析により、ＰＳＣＡはほとんどの尿路上皮の移行性癌の細胞表面、及び６０％の原発性膵臓腺癌において過剰に発現していることが示された。このＰＳＣＡの発現データは、いくつかの特許公報（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４６６４，ＰＣＴ／ＵＳ／２８８８３，ＰＣＴ／ＵＳ００／１９９６７）と、いくつかの査読式の論文（Saffran et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Feb 27; 98(5): 2658-2663; Amara et al., Cancer Res. 2001 Jun 15; 61(12): 4660-65; Reiter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Feb 17; 95(4): 1735-40; Argani et al., Cancer Res. 2001 Jun 1; 61(11): 4320-24）において報告されている。
異なるＰＳＣＡ変異体の特異的な発現が正常組織と癌患者の検体において調べられた（図１４及び図１５）。ＰＳＣＡｖ．１／ｖ．２／ｖ．４、ＰＳＣＡｖ．３、及びＰＳＣＡｖ．５．のそれぞれが区別できるようにプライマーは設計された。ＰＳＣＡｖ．１／ｖ．２／ｖ．４の場合には４２５ｂｐ、ＰＳＣＡｖ．３の場合には３００ｂｐ、ＰＳＣＡｖ．５の場合には９１０ｂｐの大きさのＰＣＲ産物を生じるように設計された（図１４Ａ）。
ファーストストランドｃＤＮＡは、正常な膀胱、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、前立腺、脾臓、骨格筋、精巣、膵臓、大腸、胃、及び、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、転移癌、膵臓癌の摘出組織の貯蔵物から調製された（図１４Ｂ）。標準化はアクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲで行った。各変異体特異的なプライマーを用いた半定量的ＰＣＲは、増幅サイクルを３０に設定して行われた。
その結果、ＰＳＣＡｖ．５は主に乳癌、転移した癌、及び、膵癌において、また、低レベルではあるが大腸癌と肺癌においても発現が見られた。ＰＳＣＡｖ．１／ｖ．２／ｖ．４のＰＣＲ産物は、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、転移した癌と膵臓癌で検出された。正常組織のなかで、ＰＳＣＡｖ．１／ｖ．２／ｖ．４のＰＣＲ産物は唯一、前立腺と胃のみで、さらに、より低レベルでは腎臓と肺において検出されたのに対して、ＰＳＣＡｖ．５は正常組織ではまったく検出されなかった。ＰＳＣＡ ｖ．３のＰＣＲ産物は調べた試料のいずれにおいても検出されなかった。
ＰＳＣＡｖ．４とＰＳＣＡｖ．５とを区別できるようなプライマーを設計した（図１５Ａ）。ＰＳＣＡｖ．４の場合には４６０ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、他方、ＰＳＣＡｖ．５の場合には９４５ｂｐの大きさのＰＣＲ産物を生じる。
ファーストストランドｃＤＮＡは、正常な膀胱、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、前立腺、脾臓、骨格筋、精巣、膵臓、大腸、胃、及び、前立腺癌の、膀胱癌、多異種移植片の貯蔵物（前立腺癌、腎臓癌、及び、膀胱癌異種移植片）（図１５Ｂ）から調製された。標準化はアクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲで行った。各変異体特異的なプライマーを用いた半定量的ＰＣＲは、増幅サイクルを３０に設定して行われた。
その結果、ＰＳＣＡｖ．４は前立腺癌、膀胱癌、及び多異種移植片の貯蔵物（正常な腎臓と前立腺）において発現していることが解った。ＰＳＣＡｖ．５は、正常な前立腺と膀胱癌においてのみ検出された。
正常な組織のなかで限られた組織においてのみＰＳＣＡ変異体が発現していることと、癌患者の検体においてその発現が検出されたことは、ＰＳＣＡ変異体がヒトの癌の治療、予後、研究、予防、及び、診断上の標的であることを示している。
実施例５：ＰＳＣＡの転写変異体
ここで使用されるように、変異体という用語は転写変異体と一塩基多型（ＳＮＰｓ）とを含む。転写変異体とは、選択的転写、又は選択的スプライシングにより同じひとつの遺伝子から生じる成熟型ｍＲＮＡの変異種である。選択的転写物は、同じ遺伝子からの転写物であるが、異なる開始位置から転写される。スプライシング変異体は、同じ転写物から異なってスプライスされたｍＲＮＡ変異体である。真核生物においては、ゲノムＤＮＡから複数のエキソンを有する遺伝子が転写される場合、最初に作られるＲＮＡはスプライシングされることによって機能的ｍＲＮＡとなり、このｍＲＮＡはエキソンのみを含み、アミノ酸配列への翻訳に使われる。従って、任意の遺伝子は、ゼロから多くの選択的転写物を得る事ができ、それぞれの転写物がさらにゼロから多数の選択的スプライシング変異体を産み出すことができる。それぞれの転写変異体は、独自のエキソン構成を有しており、その本来の転写物とは異なる翻訳、及び／又は非翻訳（５’及び３’端）領域を有することがある。これら転写変異体は、同じか、類似の、又は異なるタンパク質をコードすることができ、そういったタンパク質は同じか、類似の、又は異なる機能を有することがある。こういったタンパク質変異体が、同じ組織において同時期に、異なる組織において同時期に、又は同じ組織において異なる時期に、若しくは異なる組織において異なる時期に発現していることがありえる。転写変異体にコードされているタンパク質は、類似の、又は異なる細胞内、又は細胞外局在性（例えば、分泌型に対して細胞内型のように）を有するかもしれない。
転写変異体は、種々の技術的に確立した方法で同定される。例えば、選択的変異体とスプライシング変異体は全長クローニングか、又は全長転写産物及びＥＳＴ配列を用いて同定される。最初に、ヒトＥＳＴの全ては、互いが直接、又は間接的な同一性を示す集団に分類された。次に、同じ集団に属するＥＳＴは、さらに副次的な集団に分類され、ひとつの保存配列をもとに統合された。その由来である遺伝子の配列がそれら保存配列、又は他の全長配列と比較される。各々の保存配列は、その遺伝子のスプライシング変異体である可能性がある。確認される様相のいくつかは、ノーザン分析、全長クローニング、あるいは、プローブライブラリーの使用等による変異体の同定のような技術においては既知である。たとえ、一つの変異体が一つの全長クローンではないと同定された場合でも、その変異体の部位は一つの研究ツールとして非常に有用である。例えば、技術的には既知の手法を使って、抗原作成、又は全長スプライシング変異体の更なるクローニングのために有用である。
更に、技術的にはコンピュータプログラムが、ゲノム配列に基づいて転写変異体を同定するのに利用できる。ゲノムベース転写変異体同定プログラムには、FgenesH (A. Salamov and V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA," Genome Research. 2000 April; 10(4):516-22)、Grail (URL compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm)、及び、GenScan(URL genes.mit.edu/GENSCAN.html)が含まれる。スプライシング変異体の同定プロトコールに関する一般的な議論については、例えば、Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001 Jun 8; 498(2-3):214-8; de Souza, S.J., et al., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7; 97(23):12690-3、などを参照すること。
転写変異体のパラメータを更に確定するために、従来技術において、例えば全長クローニング、タンパク質レベルでの確認、ＰＣＲに基づく確認、及び５’ＲＡＣＥによる確認などの様々な技術が利用できる。（例えば、以下の文献を参照すること。タンパク質レベルでの確認に関して：Brennan, S.O., et al., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 1999 Aug 17;1433(1-2):321-6; Ferranti P, et al., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1997 Oct 1;249(1):1-7. ＰＣＲに基づく確認に関して： Wellmann S, et al., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Apr;47(4):654-60; Jia, H.P., et al., Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Jan 24; 263(1-2):211-8. PCR、及び、５’ＲＡＣＥによる確認に関して： Brigle， K.E., et al., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Aug 7; 1353(2): 191-8）
従来技術において、癌はゲノム領域が変化することが知られている。ひとつの遺伝子がマップされるゲノム領域がある特定の癌において変異を被るときには、その遺伝子に由来する選択的転写物、又は選択的スプライシング変異体も同様に変異を被る。ＰＳＣＡが癌に関連した特定の発現特性（例えば、表１を参照せよ）を有していることをここで明らかにする。例えば、これらの組織の一つ以上において、及び同様に特定の付加的な組織において、ＰＳＣＡの選択的転写物、及び選択的スプライシング変異体もまた癌に関与している。このように、これらの変異体は、癌関連のマーカー／抗原として用いられる。
ＰＳＣＡの全長遺伝子をＥＳＴ配列と共に用いることによって、４種類の付加的な転写変異体が同定されて、それらは、ＰＳＣＡｖ．２、ｖ．３、ｖ．４、及び、ｖ．５と名付けられた。原転写産物であるＰＳＣＡｖ．１におけるエキソンの境界を表５１に示した。その転写変異体の核酸配列の構造の模式図は図１０に示されている。図１０において、同じグラフィックパターンで示されたバーは、隣接する遺伝物質の範囲を示している。例えば、黒いバーは変異体１で見出されたゲノム配列を示している。
表５２（ａ）〜（ｄ）から表５５（ａ）〜（ｄ）は、変異体ごとに示されている。表５１（ａ）〜（ｄ）は転写変異体のヌクレオチド配列を示している。表５３（ａ）〜（ｄ）はＰＳＣＡｖ．１（ｖ．２に対してのみ）、あるいは、ＰＳＣＡｖ．２（その他すべての変異体に対して）の核酸配列に対する転写変異体の配列比較を示している。表５４（ａ）〜（ｄ）は同定されたリーディングフレームの配向に基づく転写変異体のアミノ酸配列を示している。表５５（ａ）〜（ｄ）は、ＰＳＣＡｖ．１のアミノ酸配列と、スプライシング変異体にコードされているアミノ酸配列との配列比較を示している。
実施例６：ＰＳＣＡの一塩基多型
一塩基多型（ＳＮＰ）とは、塩基配列の特定の位置での一塩基対の変異である。ゲノムの任意の位置において、４種類の可能なヌクレオチドの塩基対が存在し得る：すなわち、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｇ／Ｃ、及び、Ｔ／Ａである。ここで使われるように、対立遺伝子とは、対象としている遺伝子の一連の変形の一つであり、ＤＮＡの配列が異なり、したがって、産物（ＲＮＡ、及び／又は、タンパク質）に影響を及ぼすものである。
ｃＤＮＡ上で起こるＳＮＰはｃＳＮＰと言われる。このｃＳＮＰは、その遺伝子にコードされているタンパク質のアミノ酸配列に変異を生じさせて、その結果、そのタンパク質の機能を変えることもある。ＳＮＰのいくつかは遺伝病の原因となる；それ以外でも、個体間で、表現型における量的な差異や、食物摂取や薬物使用を含む環境要因に対する反応に関与している。従って、ＳＮＰ、及び／又は対立遺伝子の組み合わせ（ハプロタイプと呼ばれる）の実体には、多くの有用な利用があり得る。例えば、遺伝病の診断、薬に対する反応と投薬量の決定、病因遺伝子の同定、及び、個体間の遺伝子レベルでの相性の分析、等である（P. Nowotny, J. M. Kwon and A. M. Goate, "SNP analysis to dissect human traits," Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct; 11(5):637-641; M. Pirmohamed and B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions," Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6)：298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai and A. Roses, "The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes," Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):39-47; R. Judson, J. C. Stephens and A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response," Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):15-26）。
ＳＮＰｓは様々な技術的に認知された方法で同定される（P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery," Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20(９):18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation," Genome Res. 1998 Jul; 8(7):691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies," Clin. Chem. 2001 Feb; 47(2):164-172）。例えば、ＳＮＰｓは制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）や変性密度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）のようなゲル実験法により多型を示すＤＮＡ断片の塩基配列決定によって同定される。また、異なる個体から得られたＤＮＡ試料の塩基配列を直接決めたり、又は異なるＤＮＡ試料から得られた塩基配列を比較することによっても見出される。公的、若しくは私的なデータベースにおける塩基配列データの急速な蓄積に伴い、コンピュータプログラムを用いてそれらの配列を比較する事によってもＳＮＰｓは発見されるようになった（Z. Gu, L. Hillier and P. Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace," Hum. Mutat． 1998; 12(4):221-225）。ダイレクトシーケンスやハイスループットマイクロアレイを含む様々な方法によって、ＳＮＰｓは確認可能であり、一個体の遺伝型やハプロタイプも決定可能である（P． Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms," Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines and A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. 2000 Dec; 5(4):329-340）。
上述の方法を用いて、１３種のＳＮＰがＰＳＣＡｖ．２の転写物において見出された。変異体１よりも塩基の曖昧さが少なかったので、例えば変異体１よりもむしろ変異体２が使われた。結果的に、ＰＳＣＡｖ．２の５７（ｔ／ｃ）、３６７（ｃ／ｔ）、４２４（ａ／ｃ）、４９５（ｃ／ｇ）、４９９（ｃ／ｔ）、５６３（ｃ／ｔ）、５６７（ｇ／ａ）、６２７（ｇ／ａ）、６３４（ｔ／ｇ）、８３５（ｇ／ａ）、８４７（ｇ／ａ）、８７８（ｇ／ａ）、及び、９７８（ｃ／ｇ）の位置にＳＮＰが見出された。選択的対立遺伝子を伴うこれらの転写産物、あるいは、タンパク質は、表５６と図１２ａに示すように、ＰＳＣＡ ｖ．６〜ｖ．１８というように命名された。
ｖ．６における塩基変異は、ｖ．１の開始コドンに変異を生じ、その結果翻訳は次のＡＴＧ（ｍＲＮＡにおいてはＡＵＧ）まで始まらないことになり、ｖ．１よりは９アミノ酸短いタンパク質を生じる（図１１ａ）。ｖ．７とｖ．８における塩基変異は、タンパク質のレベルではアミノ酸の変異を生じないものであった。
これら１３種のＳＮＰｓのうちの１２種は、また、図１２ｂと表５６に示すように変異体４にも存在する。ＰＳＣＡｖ．４に関連するこれら１２種の変異体は、ＰＳＣＡｖ．１９からｖ．３０と呼ばれる。変異体１９から２７は変異を伴うアミノ酸をコードしている（図１１ｂ、及び、表５６）。
表５６には、また、タンパク質のアミノ酸配列の変異が示されている。これらのＳＮＰは、個々に、別々にここでは示されてはいるが、異なった組み合わせで、さらには、このＳＮＰ部位を含む転写変異体のいずれにおいても、起こりえる。
実施例７：原核生物システムでの組換えＰＳＣＡの製造
組換えＰＳＣＡ及びＰＳＣＡ変異体を原核細胞で発現させるために、全長、又は部分的なＰＳＣＡとＰＳＣＡ変異体のｃＤＮＡ配列とを技術的に既知の様々な発現ベクターのいずれかにクローニングして組み込む。１つ、又はそれ以上のＰＳＣＡ変異体の以下の領域：図２及び３に記載された全長配列、又はＰＳＣＡ、ＰＳＣＡ変異体、若しくはその類似体の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上の隣接するアミノ酸を発現させる。
Ａ．試験管内転写及び翻訳用構築物
ｐＣＲＩＩ：ＲＮＡのインサイツ（生体内原位置）研究のためのＰＳＣＡのセンス、及びアンチセンスＲＮＡプローブを作成するために、ＰＳＣＡのｃＤＮＡの全て又は断片をコードしてｐＣＲＩＩ（Invitrogen, Carlsbad CA）コンストラクトを作成した。ｐＣＲＩＩベクターは、ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用するためのＰＳＣＡのＲＮＡの転写を駆動するための、挿入遺伝子に隣接するＳｐ６、及びＴ７プロモーターを有している。これらのプローブは、細胞、及び、組織におけるＲＮＡでのＰＳＣＡの発現の解析のために使用される。ＰＳＣＡ遺伝子のｃＤＮＡのアミノ酸コード領域に相当する転写されたＰＳＣＡのＲＮＡは、ＰＳＣＡタンパク質を合成するために、例えばTnTTM Coupled Reticulolysate System（Promega, Corp., Madison, WI）のような試験管内翻訳システムで使用される。
Ｂ．細菌用構築物
ｐＧＥＸコンストラクト：グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質と融合した組換えＰＳＣＡタンパク質を細菌で産生するために、全長、又は部分的なＰＳＣＡｃＤＮＡタンパク質コード配列がＧＳＴ融合ベクターであるｐＧＥＸファミリー（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上にクローニングされて組み込まれている。これらのコンストラクトにより、アミノ末端にＧＳＴが、また、カルボキシル末端には６ヒスチジンエピトープ（６×Ｈｉｓ）が融合した組換えＰＳＣＡタンパク質の配列の制御下での発現が可能となる。ＧＳＴ、及び、６×Ｈｉｓタグにより、適当なアフィニティーマトリックスを用いた、組換えタンパク質を発現させた細菌からの組換え融合タンパク質の精製と、抗ＧＳＴ抗体、及び、抗６×Ｈｉｓ抗体を用いた融合タンパク質の検出が可能となる。６×Ｈｉｓタグは、３’端側のクローニングプライマーにヒスチジン６個分のコドンを付与することにより作成する。例えば、それはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’端側のクローニングプライマーである。例えばｐＧＥＸ-６Ｐ-１内のＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮＴＭ認識部位のような、タンパク分解性切断があれば、ＰＳＣＡ関連タンパク質からのＧＳＴタグの切除が可能とするよに用いることもできる。アンピシリン耐性遺伝子と、ｐＢＲ３２２の由来により大腸菌においてｐＧＥＸプラスミドの選択と維持が可能となっている。
ｐＭＡＬコンストラクト：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合した組換えＰＳＣＡタンパク質を細菌で産生するために全長、又は部分的なＰＳＣＡｃＤＮＡタンパク質コード配列が、ｐＭＡＬ-ｃ２Ｘ、及びｐＭＡＬ-ｐ２Ｘベクター（New England Biolabs, Beverly, MA）にクローニングされることで、ＭＢＰ遺伝子と融合された。これらのコンストラクトにより、アミノ末端にＭＢＰが、また、カルボキシル末端には６ヒスチジンエピトープ（６×Ｈｉｓ）が融合した組換えＰＳＣＡタンパク質の配列の調節された発現が可能となる。ＭＢＰ、及び６×Ｈｉｓタグにより、適当なアフィニティーマトリックスを用いた、組換えタンパク質を発現させた細菌からの組換え融合タンパク質の精製と、抗ＭＢＰ抗体、及び抗６×Ｈｉｓ抗体を用いた融合タンパク質の検出が可能となる。６×Ｈｉｓタグは、３’端側のクローニングプライマーにヒスチジン６個分のコドンを付与することにより作成する。Ｘａ因子認識部位によりＰＳＣＡからのｐＭＡＬタグの切除が可能である。ｐＭＡＬ-ｃ２Ｘ、及びｐＭＡＬ-ｐ２Ｘベクターは、組換えタンパク質が細胞質、又はペリプラズムに発現するように、それぞれ至適化されている。ペリプラズムにおける発現は、ジスルフィド結合を有するタンパク質の構造形成を亢進する。
ｐＥＴコンストラクト：ＰＳＣＡタンパク質を細菌で発現させるために、全長、あるいは、部分的なＰＳＣＡｃＤＮＡタンパク質コード配列がｐＥＴファミリーのベクター（Novagen, Madison, WI）上にクローニングされて組み込まれる。これらのベクターにより、ＮｕｓＡやチオレドキシン（Ｔｒｘ）のような組換えタンパク質の可溶性を亢進するようなタンパク質、及び６×ＨｉｓタグやＳタグのような組換えタンパク質の精製や検出を支援するようなエピトープタグを伴うか、あるいは、伴わずに、細菌において組換えＰＳＣＡタンパク質の発現を厳密に制御することが可能となる。例えば、ｐＥＴのＮｕｓＡ融合システム４３．１を用いて、ＰＳＣＡタンパク質の領域のＮ末端にＮｕｓＡが融合した形で発現するようにコンストラクトのいくつかは作成されている。
Ｂ．酵母用構築物
ｐＥＳＣコンストラクト：組換えタンパク質の産生と機能研究のための出芽酵母種サッカロミセス・セレビシエにおいてＰＳＣＡを発現させるために、全長、又は部分的なＰＳＣＡｃＤＮＡタンパク質コード配列が、それぞれが４つの選択マーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、及びＵＲＡ３のうちの一つを含むｐＥＳＣファミリーのベクター（Stratagene, La Jolla, CA）上にクローニングされて組み込まれる。これらのベクターにより、ＦｌａｇＴＭ、あるいは、Ｍｙｃエピトープタグを含んだ二つまでの異なる遺伝子、又はクローニングされた配列が同じプラスミドから、同じ酵母細胞において、調節された発現が可能となる。このシステムは、ＰＳＣＡのタンパク質−タンパク質相互作用を調べるのに有用である。加えて、酵母における発現では、糖鎖修飾やリン酸化のような、真核細胞において発現させたときに見出される翻訳後修飾に類似した翻訳後修飾を施すことができる。
ｐＥＳＰコンストラクト：分裂酵母種サッカロミセス・ポンベにおいてＰＳＣＡを発現させるために、全長、又は部分的なＰＳＣＡｃＤＮＡタンパク質コード配列がｐＥＳＰファミリーのベクター上にクローニングされて組み込まれる。これらのベクターにより、組換えタンパク質の精製を支援するＧＳＴがアミノ末端か、又はカルボキシル末端に融合したＰＳＣＡタンパク質配列の高レベルの発現を制御することが可能となる。ＦｌａｇＴＭエピトープタグにより、抗ＦｌａｇＴＭ抗体による組換えタンパク質の検出が可能となる。
実施例８：高等真核生物システムにおける組換えＰＳＣＡの製造
意図的に省略
実施例９：抗原性特性と二次構造
図５Ａ-Ｃ、図６Ａ-Ｃ、図７Ａ-Ｃ、図８Ａ-Ｃ、及び図９Ａ-Ｃは、図示によるＰＳＣＡ変異体１、３、及び４の５つのアミノ酸プロファイルを示す。各評価は、ExPasy molecular biology server上のProtScaleウエブサイト（URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）にアクセスすることで得られたものである。
これらのプロファイル（図５、親水性（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）；図６、疎水性親水性指標（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）；図７、パーセント接触可能残基（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）；図８、平均可動性（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）；図９、βターン（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294））、及びＰｒｏｔＳｃａｌｅウエブサイト上でのように、従来技術で任意的に得られる他のものも、ＰＳＣＡ変異体タンパク質のそれぞれの抗原性領域を同定するのに使用された。上述のＰＳＣＡ変異体のアミノ酸特性のそれぞれは、解析のために以下に述べるＰｒｏｔＳｃａｌｅのパラメータを用いて作成された；１）ウインドウサイズ、９；２）ウインドウの中央と比較して１００％のウインドウ端の重み；３）０から１の範囲内になるように規格化されたアミノ酸特性値。
親水性（図５）、疎水性親水性指標（図６）、及びパーセント接触可能残基（図７）プロファイルは、親水性アミノ酸の連なる領域を決めるのに使われた（すなわち、親水性と接触可能残基の割合の値が０．５以上で、疎水性神聖性指標の値が０．５以下）。このような領域は、水性環境に露出していて、タンパク質の表面に存在する可能性があり、従って、抗体のような免疫認識に利用できる。
平均可動性（図８）、及びβターン（図９）特性は、βシートやαヘリックスのような二次構造内に捕縛されていないアミノ酸配列の連なる領域（すなわち、βターン特性と平均可動性特性の値が０．５以上）を決める。こういった領域は、また、さらにタンパク質においては露出している可能性が高く、従って、抗体によるような免疫認識に利用できる可能性がさらに高い。
例えば、図５Ａ-Ｃ、図６Ａ-Ｃ、図７Ａ-Ｃ、図８Ａ-Ｃ、及び／又は図９Ａ-Ｃに述べられるような特性により示されるＰＳＣＡ変異体タンパク質の抗原性配列は、治療、及び、診断のための抗ＰＳＣＡ抗体を作成するための免疫原（ペプチド、あるいは、それらをコードする核酸）を調製するのに使われる。免疫原は、図２と３に挙げられている、アミノ酸特性が図９に示されているＰＳＣＡ変異体タンパク質に由来する５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０のいずれか、又は５０以上の連続するアミノ酸か、又はそれらをコードする対応する核酸であり得る。あるいは、図９に記述されている変異体と同じ配列を対象とする変異体が有するために推測できることもあり得る。特に、本発明のペプチド免疫原は、図５の親水性特性において０．５以上の値を示すアミノ酸の位置を含む、図２と３に示された最低で５アミノ酸から全長にいたるまでの長さを有するペプチド領域；図６の疎水性親水性プロファイルにおいて０．５以下の値を示すアミノ酸の位置を含む、図２と３に示された最低で５アミノ酸から全長にいたるまでの長さを有するペプチド領域；図７のパーセント接触可能残基において０．５以上の値を示すアミノ酸の位置を含む、図２と３に示された最低で５アミノ酸から全長にいたるまでの長さを有するペプチド領域；図８の平均可動性特性において０．５以上の値を示すアミノ酸の位置を含む、図２と３に示された最低で５アミノ酸から全長にいたるまでの長さを有するペプチド領域；図９のβターン特性において０．５以上の値を示すアミノ酸の位置を含む、図２と３に示された最低で５アミノ酸から全長にいたるまでの長さを有するペプチド領域；を含むことができる。本発明のペプチド免疫原には、また、先に述べたいずれかのペプチドをコードする核酸を含むこともある。
本発明の全ての免疫原、ペプチド、及び、核酸は、ヒトへの単位投与量形式として具体的に示すこともできるし、ヒトの生理機能に適合性のある医薬賦形剤を含む組成から成ることもある。
ＰＳＣＡタンパク質変異体１、３、４、及び６の二次構造、すなわちαヘリックス、伸びたストランド、及び、ランダムコイルの存在と位置の予測が、一次アミノ酸配列を用いて、ＨＮＮ（Hierarchical Neural Network）法（NPS＠: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol. 25, No 3 [291]:147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., https://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）に、ExPasy molecular biology server （https://www.expasy.ch/tools/）からアクセスすることによって行われた。この解析では、ＰＳＣＡ変異体１が３０．８９％のαヘリックス、２１．９５％の伸びたストランド、４７．１５％のランダムコイルから成る事が示されている（図１３Ａ）。ＰＳＣＡ変異体３は１４．８９％のαヘリックス、８．５１％の伸びたストランド、７６．６０％のランダムコイルから成る（図１３Ｂ）。ＰＳＣＡ変異体４は９．５２％のαヘリックス、８．９９％の伸びたストランド、８１．４８％のランダムコイルから成る（図１３Ｃ）。ＰＳＣＡ変異体６は２４．５６％のαヘリックス、２１．９３％の伸びたストランド、５３．５１％のランダムコイルから成る（図１３Ｄ）。
ＰＳＣＡ変異体タンパク質の膜貫通ドメインの存在可能性の解析は、ExPasy molecular biology server （https://www.expasy.ch/tools/）からアクセスして、種々の膜貫通ドメイン予測アルゴリズムを用いて行われた。ＴＭｐｒｅｄプログラムを用いて行った変異体１、３、４、及び６の解析結果がそれぞれ、図１３のＥ、Ｇ、Ｉ、及びＫに視覚的に示されている。ＴＭＨＭＭプログラムを用いて行った変異体１、３、４、及び６の解析結果がそれぞれ、図１３のＦ、Ｈ、Ｊ、及びＬに視覚的に示されている。ＰＳＣＡ変異体タンパク質１、及び６はＧＰＩ様タンパク質である可能性がある。有意な予測膜貫通ドメインが存在しなかったので、変異体３、及び４は可溶性タンパク質である可能性が高い。これら構造解析プログラムの解析結果は、表５０に要約されている。
実施例１０：抗ＰＳＣＡポリクローナル抗体の産生
ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤と、もし望むなら免疫賦活剤とを一回、又はそれ以上接種することで哺乳類動物に作らせることができる。一般的には、免疫剤、及び／又は免疫賦活剤は複数回の皮下、あるいは、腹膜内注射により哺乳類動物に接種される。全長ＰＳＣＡタンパク質変異体を用いて免疫するのに加えて、コンピュータプログラムが、免疫原性を有し、免疫されるホスト動物の免疫系により認識され得るという特徴を含むアミノ酸配列の解析に基づいて免疫原を設計するのに使われる（標題「抗原性特性と二次構造」の実施例参照）。こういった領域は、親水性で、柔軟性があり、βターン構造中に含まれ、さらに、タンパク質の表面に露出していると予測されるはずである（例えば、ＰＳＣＡタンパク質変異体１のそのような領域を示しているアミノ酸特性を図示した図５Ａ-Ｃ、図６Ａ-Ｃ、図７Ａ-Ｃ、図８Ａ-Ｃ、あるいは、図９Ａ-Ｃを参照）。
例えば、ＰＳＣＡタンパク質変異体の親水的で、柔軟性があるβターン領域を含む、細菌で作成した組換え融合タンパク質、又はペプチドが、ニュージーランド白ウサギでポリクローナル抗体を作成するために、あるいは、実施例１１で述べられるようなモノクローナル抗体を作成するために、抗原として使われる。例えば、ＰＳＣＡ変異体１に関しては、その領域に限られる訳では無いが、そういった領域はアミノ酸２８から５６と、アミノ酸６６から９４を含む。ＰＳＣＡ変異体３に関しては、その領域に限られる訳では無いが、そういった領域はアミノ酸７から３９と、アミノ酸７０から９４を含む。ＰＳＣＡ変異体４に関しては、その領域に限られる訳では無いが、そういった領域はアミノ酸６から１８、アミノ酸２７から３９、アミノ酸１０３から１３３、及び、アミノ酸１７７から１８９を含む。ＰＳＣＡ変異体６に関しては、その領域に限られる訳では無いが、そういった領域はアミノ酸１９から３５と、アミノ酸５７から８５を含む。免疫剤を、免疫を施される哺乳類動物で免疫原性があることが知られているタンパク質に抱合させるのは有用である。そういった免疫原性タンパク質には、それに限られる訳ではないが、スカシ貝由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシ由来チログロブリン、及び大豆由来トリプシンインヒビターが含まれる。１つの実施形態において、ＰＳＣＡ変異体４の１０３から１３３番までのアミノ酸に相当するペプチドがＫＬＨに抱合されて、ウサギを免疫するのに使われる。あるいは、免疫剤には全長か、ＰＳＣＡ変異体タンパク質、類縁タンパク質、あるいは、その融合タンパク質の一部分を含めることもできる。例えば、ＰＳＣＡ変異体のアミノ酸配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨＩＳタグの付いた融合タンパク質のような、技術的には良く知られた種々の融合タンパク質の相手のいずれとでも融合させることができる。１つの実施形態において、ＰＳＣＡ変異体１の配列、アミノ酸１８から９８が、組換え技術を用いてｐＧＥＸ発現ベクターに融合され、発現、精製されて、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を作成するために、それぞれウサギとマウスの免疫に使われた。こうした融合タンパク質は、適当なマトリックスを使って、それらを発現している細菌から精製される。
使用可能なその他の細菌で作成する組換え融合タンパク質には、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、あるいは、免疫グロブリン定常領域が含まれる（標題「原核生物システムを用いた組換えＰＳＣＡの作成」の実施例と、Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N., and Ledbetter, L.(1991) J.Exp. Med. 174, 561-566を参照）。
細菌を用いて作成した融合タンパク質に加えて、哺乳類細胞で発現させたタンパク質抗原もまた使用される。こういった抗原は、Ｔａｇ５やＦｃ融合ベクターのような哺乳動物細胞発現ベクターから発現し（標題「真核生物システムにおける組換えＰＳＣＡの作成」の実施例を参照）、天然のタンパク質において見出されている糖鎖のような翻訳後修飾を保持している。１つの実施形態において、Ｎ末端の先導ペプチドとＣ末端のＧＰＩアンカーを欠いたＰＳＣＡ変異体１のｃＤＮＡがＴａｇ５哺乳動物細胞分泌ベクター上にクローニングされて、２９３Ｔ細胞で発現させた。組換えタンパク質は金属キレートクロマトグラフィーを用いて、ベクターにより組換えタンパク質を定常的に発現している２９３Ｔ細胞の組織培養上清から精製された。精製されたＴａｇ５ ＰＳＣＡタンパク質は、それから免疫原として使用された。
免疫の手順において、宿主動物の免疫反応を亢進する賦活剤に抗原を混ぜるか、又は乳化させることは有用である。それに限られる訳では無いが、賦活剤の例には、完全フロイント賦活剤（ＣＦＡ）とＭＰＬ-ＴＤＭ（一リン酸化脂質Ａ、合成トレハロース６，６-ジミコレート）賦活剤が含まれる。
典型的な手順では、ウサギは最初に、完全フロイント賦活剤（ＣＦＡ）と混合した、最高で２００μｇ、一般的には１００〜２００μｇの融合タンパク質、又はＫＬＨに抱合させたペプチドで皮下に免疫される。それから、ウサギは、２週間おきに、最高で２００μｇ、一般的には１００〜２００μｇの不完全フロイント賦活剤（ＩＦＡ）と混ぜた抗原を皮下に注射される。試験採血が各免疫作業の約７から１０日後に行われて、ＥＬＩＳＡによる抗血清のタイターをモニターするのに使われる。
ＰＳＣＡ変異体３、又はＰＳＣＡ変異体４のＧＳＴ融合タンパク質による免疫で得られたウサギ血清のような、免疫血清の反応性と特異性を調べるために、各々の全長ＰＳＣＡ変異体ｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３．１ｍｙｃ-ｈｉｓ発現ベクターにクローニングされた（Invitrogen、標題「真核生物システムにおける組換えＰＳＣＡの作成」の実施例を参照）。２９３Ｔ細胞にこのコンストラクトを移入した後、抗変異体血清、及び抗Ｈｉｓ抗体（Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA）をプローブとして用いるウエスタンブロッティング技術により変性させた変異体タンパク質に対するこの細胞のライセートへの特異的な反応性を決定する。更に、２９３Ｔ細胞、及び他の組換えＰＳＣＡ変異体を発現している細胞に対して、この免疫血清の天然タンパク質（非変性タンパク質）を特異的に認識する能力が蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、及び免疫沈降を用いて調べられる。内在的にＰＳＣＡを発現している細胞を用いたウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、及び、フローサイトメトリー技術は、また、反応性と特性を調べるためにも行われる。
ＧＳＴやＭＢＰ融合タンパク質のようなＰＳＣＡ変異体融合タンパク質で免疫されたウサギの抗血清は、融合相手の配列に反応する抗体を、融合相手のみ、あるいは、関係無い融合タンパク質の一部という形で有するアフィニティーカラムに通すことによって排除することで精製される。例えば、ＧＳＴ-ＰＳＣＡ変異体１融合タンパク質を用いて得られた抗血清は、最初にＧＳＴタンパク質がＡｆｆｉＧｅｌマトリックスに共有結合しているカラム（BioRad, Hercules, Calif.）を通すことによって精製される。それから、その抗血清は、ＭＢＰ-ＰＳＣＡ融合タンパク質が共有結合しているＡｆｆｉＧｅｌマトリックスから成るカラムを通すことにより精製される。それからさらに血清はＩｇＧ画分を単離するためにプロテインＧアフィニティーカラムにより精製される。その他、Ｈｉｓタグ抗原やペプチドで免疫されたウサギから得られる血清は、融合相手に対する抗体を除いた後の血清と同様に、もとのタンパク質免疫原、あるいは、ペプチドのみが結合したカラムマトリックスを通すことにより、アフィニティー精製される。
実施例１１：ＰＳＣＡモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の産生
１つの実施形態において、ＰＳＣＡ変異体に対する治療用ｍＡｂｓは、例えば、リガンドや結合相手との相互作用を阻害するような、ＰＳＣＡ変異体の生理的な機能を阻害するか調節する、各々の変異体タンパク質に特異的なエピトープ、あるいは、それら変異体間で共通の配列に特異的に反応するｍＡｂｓを含む。こういったｍＡｂｓを作成するための免疫原には、ＰＳＣＡタンパク質変異体配列の全長をコードするか、あるいは、そのアミノ酸配列のコンピュータ解析から抗原性があると予測されたＰＳＣＡタンパク質変異体の領域を含むように設計された抗原を含む（例えば、図５Ａ〜Ｃ、図６Ａ〜Ｃ、図７Ａ〜Ｃ、図８Ａ〜Ｃ、又は図９Ａ〜Ｃと、標題「抗原性特性」の実施例を参照）。免疫原には、ペプチド、細菌で作成した組換えタンパク質、及び哺乳動物細胞で発現させたＴａｇ５タンパク質、及びヒトとマウスのＩｇＧ ＦＣ融合タンパク質が含まれる。加えて、２９３Ｔ-ＰＳＣＡ変異体４、あるいは、３００．１９-ＰＳＣＡ変異体４マウスＰｒｅ-Ｂ細胞のような、各々のＰＳＣＡ変異体を高レベルで発現するように作られた細胞がマウスを免疫するのに使われる。
ＰＳＣＡ変異体に対するｍＡｂｓを産生するために、マウスは最初に腹腔（ＩＰ）内に、完全フロイント賦活剤と混ぜた１０から５０μｇのタンパク質免疫原、又は１０７ＰＳＣＡ発現細胞により免疫される。マウスは、それから、２〜４週間おきに不完全フロイント賦活剤と混ぜた１０から５０μｇのタンパク質免疫原、又は１０７ＰＳＣＡ発現細胞により腹腔内免疫される。あるいは、ＭＰＬ-ＴＤＭ賦活剤が免疫で使用される。上述のタンパク質、及び細胞に基づく免疫ストラテジーに加えて、ＤＮＡを使用する免疫プロトコールも使用される。その場合には、ＰＳＣＡ変異体配列をコードして哺乳動物細胞用の発現ベクターが、このプラスミドＤＮＡを直接接種させることによるマウスの免疫に使われる。例えば、ＰＳＣＡの変異体４の完全長ｃＤＮＡがＴａｇ５哺乳動物細胞分泌用ベクターにクローニングされて、この組換えベクターが免疫原として使われる。別の例では、同じアミノ酸配列がＦｃ融合型分泌用ベクターにクローニングされる。その場合には、ＰＳＣＡ変異体４配列のアミノ末端にはＩｇＫリーダー配列が、カルボキシル末端にはヒト、または、マウスのＩｇＧ Ｆｃ領域をコードする配列が融合する。この組換えベクターが、免疫原として使用される。プラスミド免疫プロトコールは、同じベクターから発現した精製タンパク質と、各ＰＳＣＡ変異体を発現している細胞と一緒に使用される。
免疫プロトコール中には、試験採血が接種の７〜１０日後に行われて、免疫応答のタイターと特異性がモニターされる。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、蛍光顕微鏡、及びフローサイトメトリー解析により一旦適当な反応性と特異性が確認されれば、技術的には良く知られた確立された方法により、融合とハイブリドーマの作成が行われる（例えば、Harlow and Lane, 1988を参照）。
ＰＳＣＡモノクローナル抗体の作成の一例においては、アミノ酸１〜１８９をコードする変異体４抗原のＧＳＴ融合型が発現され、安定に形質導入した２９３Ｔ細胞からの精製に使用される。ＢａｌｂＣマウスが、最初に完全フロイント賦活剤と混ぜた２５μｇのＧＳＴ-ＰＳＣＡ変異体４タンパク質により腹腔内免疫される。マウスは、それから、２週間おきに不完全フロイント賦活剤と混ぜた２５μｇの抗原により、合計３回免疫される。ＧＳＴ融合抗原、又はＧＳＴの部分を取り除いた断片産物を用いたＥＬＩＳＡにより、免疫されたマウスから得られた血清のタイターが決まる。ＰＳＣＡ変異体４タンパク質全長に対する血清の反応性と特異性は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、及びＰＳＣＡ変異体１ｃＤＮＡをコードしている発現ベクターにより形質転換された２９３Ｔ細胞を用いたフローサイトメトリーによりモニターされる（標題「真核生物システムにおける組換えＰＳＣＡの作成」の実施例参照）。それ以外の組換えＰＳＣＡ変異体４を発現している細胞、又は内因的にＰＳＣＡ変異体４を発現している細胞もまた使用される。最も高い反応性を示したマウスは休ませたのちにＰＢＳに溶かしたＴａｇ５抗原で最後の接種を行い、それから４日後に屠殺する。屠殺したマウスの脾臓は回収されて、標準的な手順で使われるＳＰＯ／２ミエローマ細胞と融合される（Harlow and Lane, 1988）。ＨＡＴ選択で生育したウエルから得られた培養上清は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、蛍光顕微鏡、及び、フローサイトメトリーにより選別されて、ＰＳＣＡ特異抗体産生クローンが同定される。
ＰＳＣＡ変異体４タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を作成するために、免疫原はこの変異体独自の配列をコードするように設計される。例えば、ＰＳＣＡ変異体４のアミノ酸６〜１８をコードするペプチドが合成されて、ＫＬＨに含有され、免疫原として使われる。ハイブリドーマの培養上清は、それから、ペプチド抗原により選別されて、さらにＰＳＣＡ変異体４タンパク質を発現している細胞を用いて選別された後、変異体４特異モノクローナル抗体を得る為に他のＰＳＣＡ変異体を発現している細胞を用いて、交差選択される。
ＰＳＣＡ変異体モノクローナル抗体の結合親和性は、標準的な手法を用いて決定される。親和性測定は、エピトープに対する抗体の結合の強さを定量し、当該技術における専門家に評価されるように、どのＰＳＣＡ変異体モノクローナル抗体が診断や治療のための使用に適しているかを決定するのを助けるのに使われる。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Uppsala, Sweden）は、結合親和性を決定するための好ましい方法のひとつである。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、表面プラズモン共鳴（SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268）を、生体分子の相互作用をリアルタイムでモニターするために使用する。都合のよいことには、ＢＩＡｃｏｒｅ解析により、結合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、及び親和定数が決定できる。
実施例１２：ＨＬＡクラスＩ、及びクラスＩＩ結合アッセイ
精製されたＨＬＡ分子を用いたＨＬＡクラスＩ、及びクラスＩＩの結合アッセイは、開示されているプロトコルに従って実施される（例えば、国際公開公報ＷＯ９４／２０１２７、及び、ＷＯ９４／０３２０５；Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995); Sette, et al.， Mol. Immunol. 31:813 (1994)）。簡単に言うと、述べられるように、精製したＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を様々な非標識ペプチドインビター、及び１〜１０ｎＭの濃度の１２５Ｉで放射性同位元素標識したプローブペプチドと一緒にインキュベートする。インキュベートした後、ＭＨＣ−ペプチド複合体はゲル濾過によって結合していないペプチドと分けられて、結合しているペプチド画分が決定される。一般的には、事前の実験にて、各ＭＨＣ標品は、固定された量の放射性同位元素標識ペプチドの存在下にて、その全放射活性の１０〜２０％を結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決めるために滴定しておく。それ以降、すべての阻害、及びダイレクト結合アッセイは、ここで決めたＨＬＡ濃度を使って実施される。
こういった条件下では、［ｌａｂｅｌ］＜［ＨＬＡ］でＩＣ５０≧［ＨＬＡ］なので、測定されるＩＣ５０値は真のＫＤ値の理にかなった近似値となる。ペプチドインヒビターは、通常は、１２０μｇ／ｍＬ〜１．２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内でテストされ、２回〜４回の完全に独立した実験でテストされる。異なる実験で得られたデータを比較できるようにするために、阻害に関するポジティブコントロールのＩＣ５０値を各試験ペプチドのＩＣ５０値（一般的には放射性同位元素標識プローブペプチドの実験を標識していないペプチドで行う）で割る事により、相対結合図が各々のペプチドに対して計算される。データベース化する際と、実験間の比較の為に、相対結合値が集計される。これらの値は、その後に阻害に関するポジティブコントロールのＩＣ５０値を目的ペプチドの相対結合値で割る事によって、ＩＣ５０ｎＭに逆変換することができる。このデータ編纂法は、異なる日に調べられたペプチド間、又は異なるロット間の精製ＭＨＣでの比較のために正確で整合性がある。
上で概略を述べた結合アッセイは、ＨＬＡスーパーモチーフ、及び／又はＨＬＡモチーフを有するペプチドを解析するために使える（表４参照）。
実施例１３：ＨＬＡスーパーモチーフ及びモチーフを有するＣＴＬエピトープ候補の同定
本発明のＨＬＡワクチン組成物には複数のエピトープを含むことができる。複数のエピトープは、広い人種への適用を可能とするために、複数のＨＬＡスーパーモチーフ又はモチーフを含むことができる。本実施例は、このようなワクチン組成物に含ませるための、スーパーモチーフ及びモチーフを有するエピトープの同定と確認を説明する。人種への適用範囲の計算は、以下に述べる方法を用いて行われる。
スーパモチーフ及び／又はモチーフを有するエピトープの同定のためのコンピュータ検索とアルゴリズム
「抗原性特性」という標題の実施例、並びに表８〜２１及び表２２〜４４におけるモチーフを有するペプチド配列を見つけ出すために行われた検索は、図２と３に記載されたＰＳＣＡ遺伝子産物からのタンパク質配列データが使用され、これらの表を作成するのに使われた特異的検索ペプチドは表７に挙げられている。
ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩスーパーモチーフ又はモチーフを有するエピトープのコンピュータ検索は以下のように行われる。翻訳されたＰＳＣＡタンパク質の配列の全てを、文字列検索ソフトウエアプログラムを用いて解析し、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む可能性のあるペプチド配列を同定する；そのようなプログラムは、既知のモチーフ／スーパーモチーフに関する開示を技術的に考慮した情報に従って簡単に作成される。さらに、そういった計算は計算機を使わずに行うこともできる。
同定されたＡ２-、Ａ３-、及びＤＲ-スーパーモチーフ配列は、多項式アルゴリズムを用いてスコアーがつけられ、特定のＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ分子に対する結合能が予測される。これらの多項式アルゴリズムは、異なるアミノ酸が異なる位置にあることの影響を説明するものであり、本質的には、ペプチド−ＨＬＡ分子間相互作用の全体としての親和性（あるいは、ΔＧ）は、以下の形式の線形多項式関数のように近似できるという前提に基づいている：
"ΔＧ"＝ ａ１ｉ ｘ ａ２ｉ ｘ ａ３ｉ ．．．．．． ｘ ａｎｉ
ここで、ａｊｉは、ｎ残基のアミノ酸のペプチドの配列上において、任意のアミノ酸（ｊ）が、任意の位置（ｉ）に存在する時の効果を表す係数である。この方法の重要な仮定は、各々の位置における効果は、本質的にはそれぞれ独立である（すなわち、個々の側鎖の独立な結合）ということである。ペプチドにおいてｉの位置に残基ｊがあるとき、そのペプチドの残りの配列には関わりなく、一定量のｊｉがそのペプチドの結合の自由エネルギーに寄与すると仮定される。
特定のアルゴリズム係数の導出方法については、Gulukota et al., J. Mol. Biol. 267:1258-126, 1997のなかで述べられている（Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996; and Southwood et al., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998も参照）。簡単に言うと、すべてのｉ位置に関して、アンカーであってもなくても同様に、ｊを保持するすべてのペプチドの平均相対的結合（ＡＲＢ）の幾何学的平均がグループの残りと比較し計算されて、ｊｉの推定値として使われる。クラスＩＩペプチドに関しては、もしマルチプルアラインメントが可能なのであれば、もっともスコアーの高かったアラインメントのみが使われて、反復操作に続く。テストセットにおいて、任意のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、ペプチドの配列に対応するＡＲＢ値が掛け合わされる。もし得られた値が設定された閾値を超えたら、そのペプチドは結合すると予測される。望まれる予測精度の厳しさの程度に応じて、適当な閾値が選ばれる。
ＨＬＡ-Ａ２スーパータイプ交差反応ペプチドの選別
ＰＳＣＡのタンパク質配列はモチーフ同定ソフトウエアを用いて調べられて、８-、９-、１０-、及び１１-アミノ酸長のＨＬＡ−Ａ２-スーパーモチーフ主アンカー特異性を有する配列が同定される。一般的には、これらの配列は、同定されると上述の方法を用いてスコアが出されて、正のスコアの配列に相当するペプチドは合成され、精製されたＨＬＡ-Ａ＊０２０１分子との結合能が試験管内で調べられる（ＨＬＡ-Ａ＊０２０１は、プロトタイプＡ２スーパータイプ分子のひとつと考えられている）。
これらのペプチドは、さらに他のＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６、及び、Ａ＊６８０２）との結合能についても調べられる。調べられる５つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子のうちの少なくとも３つに結合するペプチドが、一般的にはＡ２スーパータイプと交差反応する結合分子とみなされる。望ましいペプチドというのは、５００ｎＭ以下の親和性で、３つ以上のＨＬＡ-Ａ２スーパータイプ分子と結合するものである。
ＨＬＡ-Ａ３スーパーモチーフを有するエピトープの選別
上述のように調べられたＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸配列は、また、ＨＬＡ-Ａ３スーパーモチーフプライマリーアンカーを有するペプチドが存在しないかについても調べられる。ＨＬＡ-Ａ３スーパーモチーフを有する配列に相当するペプチドは、同定されると合成されて、ＨＬＡ-Ａ＊０３０１とＨＬＡ-Ａ＊１１０１分子への結合が調べられる。ＨＬＡ-Ａ＊０３０１とＨＬＡ-Ａ＊１１０１は、２つの最も一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子にコードされている分子である。５００ｎＭ以下（多くは２００ｎＭ以下）の親和性で二つの対立遺伝子のうちの少なくともひとつに結合するペプチドは、同定されたのち、それ以外の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（例えば、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１、及び、Ａ＊６８０１）との交差結合反応が調べられて、調べられた５つのＨＬＡ-Ａ３スーパータイプ分子のうちの少なくとも３つと結合できるペプチドが同定される。
ＨＬＡ-Ｂ７スーパーモチーフを有するエピトープの選別
上述のように調べられたＰＳＣＡのタンパク質のアミノ酸配列は、また、８-、９-、１０-、又は１１-アミノ酸長の、ＨＬＡ-Ｂ７-スーパーモチーフを有するペプチドが存在するかどうか解析される。対応するペプチドは合成されて、最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子にコードされている分子（すなわち、Ｂ７スーパータイプ対立遺伝子のプロトタイプ）である、ＨＬＡ-Ｂ＊０７０２との結合が調べられる。Ｂ＊０７０２にＩＣ５０が５００ｎＭ以下で結合するペプチドが標準的な手法を用いて同定される。これらのペプチドは、同定された後、その他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（例えば、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１、及び、Ｂ＊５４０１）との結合が調べられる。調べられた５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子のうち３つ以上に結合できるペプチドがこれによって同定される。
Ａ１、及びＡ２４モチーフを有するエピトープの選別
さらに多くの人種をカバーするために、ＨＬＡ-Ａ１、及びＡ２４エピトープも、また、ワクチンの成分に取り込むことができる。ＰＳＣＡタンパク質の解析は、また、ＨＬＡ-Ａ１、及びＡ２４モチーフを含む配列を同定するために行うこともできる。
他のモチーフ、及び／又はスーパーモチーフを有し、高い親和性、及び／又は交差結合反応性のあるエピトープが類似の方法により同定される。
実施例１４：免疫原性の確認
このように同定されたＣＴＬ-Ａ２スーパーモチーフを有するペプチドとしての交差反応候補が、試験管内免疫原性を確認するために選ばれる。その確認は、以下のような方法により行われる。
細胞スクリーニングのための標的株化細胞：
２２１Ａ２．１株化細胞は、ＨＬＡ-Ａ２．１遺伝子を、ヒトＢリンパ芽球腫株化細胞７２１．２２１のＨＬＡ-Ａ、-Ｂ、-Ｃ無発現変異体に導入することで作られ、これがＨＬＡ-Ａ２．１制限ＣＴＬの活性を測るために、ペプチドを提示した標的として使用される。この株化細胞は、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び１０％（Ｖ／Ｖ）の熱不活性化ＦＣＳを加えたＰＲＭＩ-１６４０培地で培養される。目的の抗原を発現している細胞、又は目的の抗原をコードしている遺伝子を含む形質導入細胞が、ペプチド特異的ＣＴＬの内因性抗原を認識する能力を確認するための標的細胞として使用することができる。
ＣＴＬ由来初代培養細胞
樹状細胞（ＤＣ）の作成：ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を３０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、２回洗ったのち、完全培地（ＲＰＭＩ-１６４０に５％ＡＢヒト血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ-グルタミン、及び、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えたもの）に再懸濁する。単球は、６ウエルプレートに１ウエルあたりＰＭＢＣが１０×１０６個になるようにまいて精製する。３７℃で２時間培養した後、非接着性の細胞はゆっくりとプレートを振ってから上清を吸い出すことにより除去される。このウエルを３ｍＬのＰＲＭＩで全部で３回洗浄することにより、非接着性、及び弱くしか接着していない細胞のほとんどが取り除かれる。５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ-ＣＳＦと、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ-４を含む完全培地３ｍＬをそれぞれのウエルに加える。このＤＣに６日目にＴＮＦαを７５ｎｇ／ｍＬになるように加え、７日目にＣＴＬ由来カルチャー用に使用する。
ＤＣとペプチドによるＣＴＬの誘導：ＣＤ８＋Ｔ-細胞は、ダイナル社の免疫磁性ビーズ（ダイナビーズ（登録商標）Ｍ-４５０）とdetacha-bead（登録商標）を用いたポジティブセレクションにより単離される。一般的には、約２００-２５０×１０６個のＰＭＢＣを用いて、２４×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞（４８ウエルプレート分のカルチャーには充分な量）が得られる。簡単に言うと、ＰＢＭＣを３０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗ったのち、２０×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳに再懸濁する。磁気ビーズはＡＢ血清を含むＰＢＳで３回洗ったのち、この細胞に加えられて（１４０μＬ／２０ｘ１０６細胞）、撹拌しながら４℃で１時間、培養される。ビーズと細胞は、ＡＢ血清を含むＰＢＳで４回洗浄されて、非接着性の細胞が除かれた後、１００×１０６細胞／ｍＬ（もともとの細胞の数に基づく）になるように、１００μＬ／ｍＬのdetacha-bead（登録商標）と３０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅを加えたＡＢ血清を含むＰＢＳに再懸濁される。この混合物を撹拌しながら室温で１時間培養する。このビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／ＤＮＡｓｅで再度洗浄して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を集める。このＤＣを集めて、５から７分、１３００ｒｍｐで遠心し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、数を数えたのち、３μｇ／ｍＬのβ２ミクログロブリン存在下、１〜２×１０６／ｍＬの細胞濃度で、４０μｇ／ｍＬのペプチドを適用し、２０℃で４時間、培養する。その後、このＤＣに放射線を照射し（４２００ラド）、培地で１回洗浄したのちに、再び、その数を数える。
誘導カルチャーのセットアップ：０．２５ｍＬのサイトカインを生産しているＤＣ（１×１０５細胞／ｍＬ）を、０．２５ｍＬのＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）と、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ-７存在下、４８ウエルプレートの各ウエルで、共培養する。組換えヒトＩＬ-１０を、終濃度１０ｎｇ／ｍＬになるようにその次の日に加え、さらに、ヒトＩＬ-２を１０ＩＵ／ｍＬになるように４８時間後に添加する。
ペプチドを適用した接着性細胞による誘導培養細胞の再刺激：最初の誘導から７日後と１４日後に、それらの細胞はペプチドを適用した接着性細胞により、再び刺激を与えられる。ＰＢＭＣは解凍され、ＰＲＭＩとＤＮＡｓｅで２回洗浄される。この細胞は、５×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁されて、約４２００ラドの放射線が照射される。このＰＢＭＣは、１ウエルあたり０．５ｍＬの完全培地中に２×１０６細胞になるように蒔かれて、３７℃で２時間、培養される。このプレートをＰＲＭＩを加えて、指でかるくはじくようにして２回、洗浄することで非接着性細胞は除去され、接着性細胞には各ウエルあたり０．２５ｍＬの５％ＡＢを含むＰＲＭＩ中のβ２ミクログロブリン（３μｇ／ｍＬ）存在下、３７℃、２時間で、１０μｇ／ｍＬのペプチドが適用される。各ウエルのペプチド溶液は、吸引除去され、ウエルはＰＲＭＩで一度洗浄される。培養液のほとんどが培養細胞（ＣＤ８＋細胞）から吸引除去されて、０．５ｍＬの新しい培地が加えられる。細胞は、このペプチドを適用した接着細胞を含むウエルに移し替えられる。２４時間後に、組換えヒトＩＬ-１０が、終濃度１０ｎｇ／ｍＬになるように加えられて、その次の日とさらに２、３日後に、組換え・ヒトＩＬ-２５０ＩＵ／ｍＬの濃度になるように加えられる（Tsai et al., Critical Reviews in Immunology 18(1-2):65-75, 1998）。７日後には、この培養細胞のＣＴＬ活性が、５１Ｃｒ放出アッセイにより調べられる。いくつかの実験においては、培養細胞は２回目の再刺激時にインサイツＩＦＮγＥＬＩＳＡによりペプチド特異的認識が調べられた後に、７日後には内因性の認識が調べられる。細胞の増殖の後には、並べて比較するために、どのアッセイにおいても、活性が測られる。
５１ Ｃｒ放出によるＣＴＬ溶解活性の測定
２回目の再刺激から７日後に、標準的（５時間）な５１Ｃｒ放出アッセイで、個々のウエルを、ひとつの効果細胞：標的細胞比で調べることによって細胞毒性が決められる。ペプチドを適用した標的は、１０μｇ／ｍＬの濃度のペプチドと３７℃で一晩、細胞を培養することにより調製する。
接着性の標的細胞は、培養用のフラスコから、トリプシン-ＥＤＴＡにより引きはがされる。標的細胞は、３７℃、１時間で２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Dupont, Wilmington, DE）で標識される。標識された標的細胞は、１ｍＬあたり１０６細胞になるように再懸濁されてから、３．３×１０６細胞／ｍＬの濃度のＫ５６２細胞（非特異的細胞溶解を減らすために使われるＮＫ感受性の赤芽球腫株化細胞）により１０倍に希釈される。標的細胞（１００μＬ）と効果細胞（１００μＬ）は、丸底９６ウエルプレートに蒔かれて、３７℃で５時間、培養される。このとき、上清の１００μＬがそれぞれのウエルから回収されて、細胞溶解の割合が以下の定式に従って決められる：
［テスト試料のｃｐｍ-自発的５１Ｃｒ放出試料のｃｐｍ］／［最も５１Ｃｒを放出している試料のｃｐｍ-自発的５１Ｃｒ放出試料のｃｐｍ］×１００
放出量の最大値と自発的な放出量の値は、標識された標的を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、あるいは、培地のみでそれぞれ培養することにより決められる。ポジティブな培養細胞とは、特異的な細胞溶解（試料−バックグラウンド）が、各ウエルの場合には１０％以上であり、増大したカルチャーが調べられるときには、ふたつの最も値の大きい効果細胞：標的細胞比において１５％以上であるものというように定義される。
ペプチド特異的、及び内因性認識の指標としてのヒト・ＩＦＮγ産生のインサイツ測定
Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレートが、４℃、一晩、マウス由来抗ヒトインターフェロンγモノクローナル抗体（４μｇ／ｍＬ、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）でコートされる。このプレートは、Ｃａ２＋、及び、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄されたあと、２時間、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳでブロッキングされた後に、ＣＴＬ（１００μＬ／ウエル）と標的（１００μＬ／ウエル）がそれぞれのウエルに加えられる。空のウエルは標準物質とブランクのためにおいておく（いずれにも培地のみがはいる）。標的細胞は、ペプチドが適用されたものも、内因性の標的も、いずれも１×１０６細胞／ｍＬの濃度で使用される。プレートは、５％炭素ガス環境下、３７℃で４８時間培養される。
４００ｐｇ、あるいは、１２００ｐｇ／１００μＬ／ウエルで開始して、組換えヒトインターフェロンγが標準用のウエルに加えられ、プレートは３７℃で２時間、保温される。このプレートは洗浄後、１００μＬのビオチン化マウス由来抗ヒトインターフェロンγモノクローナル抗体（２μｇ／ｍＬのＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液）が加えられ、室温で２時間、静置される。再度洗浄の後、１００μＬのＨＲＰ-ストレプトアビジン（４０００倍希釈）が加えられ、プレートは室温で１時間、静置される。それから、このプレートは洗浄バッファーで６回洗浄の後、１ウエルあたり１００μＬの発色溶液（ＴＭＢ１：１）が加えられて、５から１５分、ウエルの発色が行われる。発色反応はウエルあたり５０μＬの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えることで停止されて、４５０ｎｍの吸光度が測定される。もしも、ウエルあたりインターフェロンγが少なくとも５０ｐｇ、バックグラウンド以上に測定されて、それが発現のバックグラウンドレベルの２倍以上であれば、そのカルチャーはポジティブとみなされる。
ＣＴＬの増殖
ペプチドを適用した標的、及び／又は標的腫瘍に対して特異的な細胞溶解活性を示したカルチャーは、抗ＣＤ３で、２週間以上、増幅培養される。簡単に述べると、５×１０４個のＣＤ８＋細胞が以下のものを含むＴ２５フラスコに加えられる：１ｍＬあたり１×１０６個の放射線照射（４２００ラド）された（自己、又は同種の）ＰＢＭＣ、１ｍＬあたり２×１０５個の放射線照射（８０００ラド）されたＥＢＶ形質転換細胞、及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）を含むＲＰＭＩ-１６４０で、そこには、１０％（ｖ／ｖ）のヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５μＭの２メルカプトエタノール、Ｌ-グルタミン、及び、ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれている。組換え・ヒト・ＩＬ２が２４時間後に、終濃度２００ＩＵ／ｍＬで加えられ、それ以降は３日おきに５０ＩＵ／ｍＬの新しい培養液が使われる。もしも細胞濃度が１×１０６個／ｍＬを超えたら細胞は分けられる。培養細胞は、１３日から１５日の間に、効果細胞：標的細胞：標的細胞比が３０：１、１０：１、３：１、及び、１：１で５１Ｃｒ放出アッセイか、あるいは、１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で、増幅培養前のように同じ標的を使ったインサイツインターフェロンγアッセイにより調べられる。
培養細胞は、抗ＣＤ３＋非存在下で、以下のように増幅培養される。ペプチド、及び、内因性標的に対して特異的な細胞溶解活性を示すようなカルチャーが選ばれて、５×１０４個のＣＤ８＋細胞が以下のものを含むＴ２５フラスコに加えられる：１０μｇ／ｍＬのペプチドで３７℃、２時間、ペプチド適用がなされて、放射線照射（４，２００ ｒａｄ）された、１ｍＬあたり１×１０６個の自家性ＰＢＭＣ；１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭの２メルカプトエタノール、Ｌ-グルタミン、及びゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ-１６４０に１ｍＬあたり２×１０５個の放射線が照射（８０００ラド）されたＥＢＶ形質転換細胞。
Ａ２スーパーモチーフを有するペプチドの免疫原性
Ａ２スーパーモチーフ交差結合反応性ペプチドは、ペプチド特異的ＣＴＬを通常の個体において誘発する能力が細胞アッセイによって調べられる。この分析で、もしそれがペプチド特異的ＣＴＬを少なくとも個体において誘発し、なるべくなら内因的に発現しているペプチドを認識すれば、一般的にはひとつのエピトープとみなされる。
免疫原性は、また、ＰＳＣＡを発現している癌を患っている患者から単離されたＰＢＭＣを使って確認することもできる。簡単に言うと、ＰＢＭＣは患者から単離されると、ペプチドが適用された単球で再度刺激を受け、抗原を内因的に発現している形質導入細胞だけでなく、ペプチドが適用された標的細胞も認識できるかが調べられる。
Ａ＊０３／Ａ１１免疫原性の評価
ＨＬＡ-Ａ３スーパーモチーフを有する、交差結合反応性ペプチドは、また、ＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するのに用いられるのと同様の方法で、免疫原性が評価される。
Ｂ７免疫原性の評価
ここで述べられるように同定されたＢ７スータータイプ交差結合反応性ペプチドの免疫原性のスクリーニングは、Ａ２、及び、Ａ３スーパーモチーフを有するペプチドの確認のために使われる方法と似たやり方で確認される。
他のスーパーモチーフ／モチーフ（例えば、ＨＬＡ-Ａ１、ＨＬＡ-Ａ２４、等）を有するペプチドも、また、同様の方法を用いて確認される。
実施例１５：類似物を作成することによる、拡張スーパーモチーフの天然型エピトープへの結合能の改善の実施
ＨＬＡモチーフとスーパーモチーフ（主要、及び／又は、二次的残基から成る）は、ここで示すように、高度に交差反応する天然型ペプチドの同定と調製において有用である。さらに、例えば、スータータイプで構成される一群のＨＬＡ分子内で更に強く交差反応する特質、及び／又は、こういったＨＬＡ分子の一部、または、全てとさらに強く結合する親和性、等のような、ペプチドに一定の特質を付与するために類似化することができる天然型ペプチドのアミノ酸配列内の残基を同定することによって、ＨＬＡモチーフとスーパーモチーフの同定によって、高度に交差反応するエピトープの設計が可能となる。ペプチドを類似化して調節された結合親和性を示す例が、この例の中で示される。
主要アンカー残基における類似化
ペプチド設計戦略は、そのエピトープの交差反応性をさらに増すように行われる。例えば、Ａ２スーパーモチーフを有するペプチドの主要アンカーは、例えば、好ましいＬ、Ｉ、Ｖ、あるいは、Ｍを２番目に、また、ＩかＶをＣ末端に導入するように変えられる。
この類似ペプチドの交差反応性を解析するために、設計された類似体の各々は、最初にＡ２スーパー対立遺伝子プロトタイプのＡ＊０２０１に対する結合が調べられて、もしＡ＊０２０１結合能が保持されているようであれば、次に、Ａ２スーパータイプとの交差反応が調べられる。
あるいは、ペプチドは、ひとつ、あるいは、すべてのスーパータイプ構成要素との結合が確認された後に、人種への適用範囲を付与するためにいずれかひとつ（あるいは、ひとつ以上）のスーパータイプ構成要素との結合親和性を調節するように類似化される。
細胞スクリーニング解析における免疫原性に関する類似体の選別は、一般には、その親野生型（ＷＴ）ペプチドの、例えば、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子の三つかそれ以上に対して少なくとも弱くは、例えば、５０００ｎＭかそれ以下のＩＣ５０で、結合する能力によりさらに制限される。この必要条件の正当性というのは、野生型ペプチドが生物学的に適切になるように充分量、内在しているはずであるということである。類似化ペプチドは、親エピトープに対する免疫原性とＴ細胞特異性による交差反応性を上昇させることが示されている（例えば、Parkhurst et al., J. Immunol. 157:2539, 1996; and Pogue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8166, 1995を参照）。
これらのペプチド類似体の細胞スクリーニングでは、類似体特異的ＣＴＬが、また、その野生型ペプチドも認識することができるかと、可能な時には、そのエピトープを内因的に発現している標的細胞をも認識できるかを確認することが重要である。
ＨＬＡ-Ａ３、及び、Ｂ７スーパーモチーフを有するペプチドの類似化
ＨＬＡ-Ａ３スーパーモチーフを有するエピトープの類似体は、ＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフを有するペプチドを類似化する際に用いられたのと同様のやり方で作られる。例えば、Ａ３スーパータイプ分子の３／５に結合するペプチドは、プライマリーアンカー残基において、２番目に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、Ｍ、あるいは、Ａ）を持つように設計される。
類似体ペプチドは、それから、Ａ＊０３とＡ＊１１（Ａ３ス−パータイプ対立遺伝子のプロトタイプ）に結合する能力が調べられる。これらのうち５００ｎＭ以下の結合能をしめすものは、次に、Ａ３スーパータイプ間での交差反応性が確認される。
Ａ２、及び、Ａ３モチーフを有するペプチドと同様に、３つか、あるいは、それ以上のＢ７スーパータイプ対立遺伝子に結合するペプチドを改良して、もし可能ならば、交差結合反応性を上げたり、結合親和性を高めたり、あるいは、結合半減期を長くしたりすることができる。Ｂ７スーパーモチーフを有するペプチドは、例えば、好ましい残基（Ｖ、Ｉ、Ｌ、あるいは、Ｆ）をＣ末端のプライマリーアンカー部位に持つように設計することが、Sidneyらによって示されたように、可能である（J. Immunol. 157:3480-3490, 1996）。
その他のモチーフ、更に／あるいは、スーパーモチーフを有するエピトープのプライマリーアンカー残基における類似化も、同様のやり方で行われる。
類似体ペプチドは、それから、免疫原性が、一般的には、細胞スクリーニングアッセイにおいて、確認される。再度、類似体特異的ＣＴＬが、さらに、野生型ペプチドも認識できて、もし可能ならば、そのエピトープを内因的に発現している標的も認識出来る事を示すことが、一般的には重要となる。
二次的アンカー残基における類似化
さらに、高い交差反応性を有するペプチド、及び／又は二次アンカー部位に存在する、こういった特質に関係のある特定の残基を同定することにより強められた親和性でＨＬＡ分子に結合するペプチドを設計する際に、ＨＬＡスーパーモチーフは有用である。例えば、１番目にＦ残基があるＢ７スーパーモチーフを有するペプチドの結合能力が調べられる。それから、そのペプチドは、例えば、１番目のＦがＬに置換される。この類似化ペプチドは、結合親和性の増大、結合半減期、及び／又は、交差反応性の増加が評価される。こういった手順で、類似化されたペプチドのどのような特質が強化されたかが同定される。
充分に結合能力、あるいは、交差反応性が改良された強化類似体は、また、例えば、ＩＦＡ免疫、あるいは、リポペプチド免疫の後に、ＨＬＡ-Ｂ７遺伝子導入マウスを使って免疫原性も調べることができる。類似体化ペプチドは、さらに、ＰＳＣＡを発現している癌患者由来のＰＢＭＣを使って、リコール応答を刺激する能力が調べられる。
その他の類似化方法
別の型のペプチド類似化は、アンカー部位に関係無いもので、システインのαアミノ酪酸への置換を含むものである。その化学的な性質のために、システインはジスルフィド結合を形成する性質を有しており、結合能を損なうようにペプチドを構造的に大きく変化させてしまう。システインのαアミノ酪酸への置換は、この問題を軽減するだけでなく、いくつかの例においては、結合、及び、交差結合能力をも改善することが示されている（総説Sette et al., In: Persistent Viral Infections, Eds. R. Ahmed and I. Chen, John Wiley & Sons, England, 1999を参照）。
このように、一アミノ酸置換を使う事によって、ペプチドリガンドのＨＬＡスーパータイプに対する結合特性、及び／又は、交差反応性を調節することができる。
実施例１６：ＨＬＡ-ＤＲ結合モチーフを有するＰＳＣＡ由来配列の同定と確認
ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフ、あるいはモチーフを有するペプチドエピトープは、ＨＬＡクラスＩペプチドに関して述べたのと同様の方法により、以下にその概略を述べるようにして同定され、確認される。
ＨＬＡ-ＤＲスーパーモチーフを有するエピトープの選別
ＰＳＣＡ由来のＨＬＡクラスＩＩＨＴＬエピトープを同定するために、ＰＳＣＡ抗原は、ＨＬＡ-ＤＲモチーフ、又はスーパーモチーフを有する配列が存在するかどうか調べる。特に、ＤＲスーパーモチーフを含み、９アミノ酸配列のコアとＮ末端とＣ末端のそれぞれに３残基の隣接領域（計１５アミノ酸）から成る１５アミノ酸配列が選別される。
ＤＲ分子に結合するペプチドを予測するための方法は開発されている（Southwood et al., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998）。これらの手順により、各ＤＲ分子に特異的に、９アミノ酸コア領域の点数化と序列化が可能になる。各々の手順は、９アミノ酸配列のコア内のＤＲスーパーモチーフプライマリーアンカー（すなわち、１番目と６番目の位置）の有無に関してペプチド配列に点数をつけるだけでなく、付随的に二次アンカーの有無に関しても配列を評価することになる。対立遺伝子特異的選別表（例えば、Southwood et al（引用文献）を参照）を使って、特定のＤＲ分子への結合の高い可能性を有するペプチド配列をこれらの方法が効果的に選別することが分かっている。更に、これらの手順を連繋して行う事により、特にＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、及びＤＲ７に関してこの方法が効果的にＤＲ交差反応性ペプチドを選別できることが示されている。
上で同定されたＰＳＣＡ由来ペプチドは、様々な一般のＨＬＡ-ＤＲ分子に対してその結合能力が調べられる。全てのペプチドは、最初に主要パネルにあるＤＲ分子、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、及びＤＲ７への結合が調べられる。これら三つのＤＲ分子のうちの少なくとも二つに結合するペプチドは、二次アッセイで、ＤＲ２ｗ２β１、ＤＲ２ｗ２β２、ＤＲ６ｗ１９、及び、ＤＲ９分子への結合が調べられる。最後に、二次パネルの４つのＤＲ分子のうち少なくとも二つ、すなわち、併せると７つの異なるＤＲ分子のうち少なくとも４つに結合するペプチドは、三次アッセイで、ＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１１、及びＤＲ８ｗ２分子に対する結合が調べられる。１次、２次、及び３次スクリーニングアッセイを為す１０個のＤＲ分子のうちの少なくとも７つに結合するペプチドは、交差反応性ＤＲ結合分子とみなされる。共通のＨＬＡ-ＤＲ対立遺伝子に結合する事が分かったＰＳＣＡ由来ペプチドは特に興味深い。
ＤＲ３モチーフペプチドの選別
ＨＬＡ-ＤＲ３は、白人、黒人、及び、ラテンアメリカ系人種で優勢な対立遺伝子なので、ＤＲ３結合能はＨＴＬエピトープの選別においてはひとつの直接的な判断基準である。このように、候補であると示されたペプチドは、また、それらのＤＲ３結合能に関しても調べられるであろう。しかしながら、ＤＲ３モチーフの結合特異性の観点においては、ＤＲ３にのみ結合するペプチドも、また、ワクチンの処方に含める候補としてみなすことができる。
ＤＲ３に結合するペプチドを効果的に同定するために、標的ＰＳＣＡ抗原がＧｅｌｕｋらにより報告されたＤＲ３特異的に結合する二つのモチーフ（J. Immunol. 152:5742-5748, 1994）のうちのどちらかを有する配列として調べられる。それから、その配列に相当するペプチドが合成され、１μＭかそれ以上（すなわち１μＭ以下の解離定数）の親和性でＤＲ３に結合する能力を有するかどうかが調べられる。この結合基準を満たすことが分かったペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ高親和性結合分子として認められる。
このようなやり方で同定されたＤＲ３結合エピトープは、ＤＲスーパーモチーフを有するペプチドエピトープを伴い、ワクチンの組成に含められる。
ＨＬＡクラスＩモチーフを有するペプチドの場合と同様、クラスＩＩモチーフを有するペプチドは、親和力、あるいは、交差反応性を改良するために類似体化される。例えば、９アミノ酸コア配列の４番目の位置のアスパラギン酸は、ＤＲ３結合のために最も有効な残基であり、この残基の置換がしばしばＤＲ３結合を改善する。
実施例１７：ＰＳＣＡ由来ＨＴＬエピトープの免疫原性
この例は、免疫原性ＤＲスーパーモチーフ、及びＤＲ３モチーフを有するエピトープを、ここで示す方法を使って同定されるもののなかから決定する。
ＨＴＬエピトープの免疫原性は、ＨＴＬ応答を刺激する能力を調べるか、及び／又は適当なトランスジェニックマウスモデルを使って、ＣＴＬエピトープの免疫原性の決定と同様のやり方で決められる。免疫原性は以下のものに対するスクリーニングによって確認される：１）通常のＰＢＭＣを用いた試験管内一次誘導、あるいは、２）ＰＳＣＡを発現している癌を有する患者からのリコール応答。
実施例１８：人種の適用範囲の幅を決定するための様々な民族的背景におけるＨＬＡスーパータイプの表現型の頻度の計算
この例は、複数のスーパーモチーフ、及び／又はモチーフから成る複数のエピトープで構成されるワクチンの組成の人種範囲の幅の評価方法を示す。
人種の適用範囲を解析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度が決定される。各ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度は、二項分配式ｇｆ＝１-（ＳＱＲＴ（１-ａｆ））を使って、抗原、あるいは対立遺伝子頻度から計算される（例えば、Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996を参照）。全体の表現型頻度を得る為には、累積遺伝子頻度が計算され、累積抗原頻度は先の反転式ａｆ＝１-（１-Ｃｇｆ）２を使って得られる。
ＤＮＡタイピングのレベルでは頻度データが得られないときには、血清学的に定義された抗原頻度に一致すると仮定される。総潜在的スーパータイプ人種適用範囲を得る為に、連鎖の不均衡は無いことが仮定され、各々のスーパータイプに属する事が確認された対立遺伝子のみが含められる（最少見積）。座位間の組み合わせによりなされる、総潜在的適用範囲の見積は、Ａという適用範囲に、想定されたＢ対立遺伝子により網羅されることが予想される非Ａ適用人種の割合を加えることにより行われる（例えば、総量＝Ａ＋Ｂ＊（１-Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認された構成要素は、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１、及び、Ａ＊６８０１である。Ａ３様スーパータイプには、Ａ３４、Ａ６６、及び、Ａ＊７４０１もまた含まれるが、これらの対立遺伝子は総頻度の計算には含められなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認された構成要素は、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、及び、Ａ＊６９０１である。最後に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ＊３５０１-０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１-２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、及び、Ｂ＊７８０１である（可能性としては、Ｂ＊１４０１、Ｂ＊３５０４-０６、Ｂ＊４２０１、及び、Ｂ＊５６０２も含まれる）。
Ａ２、Ａ３、及び、Ｂ７スーパータイプの組み合わせにより得られる人種適用範囲は、５つの主な民族集団において８６％となる。適用範囲は、Ａ１、及び、Ａ２４モチーフを有するペプチドを含めることで拡範することができるはずである。平均としては、５つの異なる主要民族集団（白人、北アメリカ黒人、中国人、日本人、及び、ラテンアメリカ人）を横断した人種のＡ１は１２％、Ａ２４は２９％に存在する。両者を併せると、これらの対立遺伝子は、これらと同じ民族人種において３９％の平均頻度を表す。Ａ１とＡ２４を、Ａ２、Ａ３、及び、Ｂ７スーパータイプ対立遺伝子の適用範囲と組み合わせると、主要民族を横断した総適用範囲は９５％以上になる（表ＩＶ（Ｇ）参照）。同様の研究方法が、クラスＩＩモチーフを有するエピトープの組み合わせによりなされる人種適用範囲の見積に使用可能である。
ヒトにおける免疫原性研究（例えば、Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Doolan et al., Immunity 7:97, 1997; and Threlkeld et al., J. Immunol. 159：1648, 1997）は、高交差結合反応性ペプチドがエピトープとしてほとんど常に認識されることを示している。高交差結合反応性ペプチドの使用は、多種多様な人種において免疫原性であるワクチンに含めるエピトープの候補を同定する際の重要な選択基準である。
充分な数のエピトープ（ここで開示されるもの、及び従来技術で開示されているもの）を伴えば、５つの主要民族人種のそれぞれにおいて、９５％以上の平均人種適用範囲が予想される。技術的に既知（例えば、Osborne， M.J. and Rubinstein, A. "A course in game theory" MIT Press, 1994を参照）の、ゲームセオリー・モンテカルロシミュレーション分析が、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人、ラテンアメリカ人民族集団からなる人種における個々人のどれくらいの割合がここで述べられたワクチンエピトープを認識するであろうかを見積もるのに使用可能である。好ましい割合は９０％である。より好ましい割合は９５％である。
実施例１９：初回免疫刺激後の内因的に処理された抗原のＣＴＬ認識
この例は、野生型、又はここで述べられたように同定されて選択された類似体化ペプチドエピトープにより誘導されたＣＴＬが内因的に合成された、すなわち、天然の抗原を認識することを確認する。
例えばＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフをもつエピトープのようなペプチドエピトープで免疫されたトランスジェニックマウスから単離された効果細胞が、ペプチドでコートされた刺激細胞を用いて試験管内で再刺激される。六日後には、効果細胞は細胞傷害性が調べられて、ペプチド特異的な細胞傷害性を有する株化細胞は、さらに刺激される。さらに６日後、５１Ｃｒ標識されたＪｕｒｋａｔ-Ａ２．１／Ｋｂ標的細胞に対する細胞傷害性がペプチドの存在下、及び、非存在下で調べられ、さらに、内因的に合成される抗原を有する５１Ｃｒ標識された標的細胞、すなわち、ＰＳＣＡ発現ベクターにより安定に形質転換された細胞に対してもその活性が調べられる。
その結果は、ペプチドエピトープで刺激された動物から得られたＣＴＬ株化細胞は内因的に合成されるＰＳＣＡ抗原を認識するというものである。こういった分析に用いる為のトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されるエピトープに依存する。ＨＬＡ-Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに加えて、ヒトＡ１１を有するマウス（これはＡ３エピトープを評価するのにも、また、使われる）やＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかのその他のトランスジェニックマウスモデルに関してもその特徴が調べられ、さらに、それら以外（例えば、ＨＬＡ-Ａ１やＡ２４のトランスジェニックマウス）も開発中である。ＨＬＡ-ＤＲ１とＨＬＡ-ＤＲ３のマウスモデルもまた開発されて、ＨＴＬエピトープの評価のために使われるはずである。
実施例２０：トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ-ＨＴＬ接合エピトープの活性
この例では、ＰＳＣＡ由来のＣＴＬとＨＴＬペプチドワクチン成分を用いたトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬとＨＴＬの誘導が示される。ここで使われるワクチンの組成は、ＰＳＣＡを発現している癌の患者に投与されるペプチドから成る。そのペプチド成分は、複数のＣＴＬ、及び／又は、ＨＴＬエピトープから構成されることもできる。そのエピトープは、ここで述べられるような方法を用いて同定される。この例は、さらに、免疫原性の強化が、ＣＴＬワクチン成分にひとつかそれ以上のＨＴＬエピトープを含めることで行うことができるということも、また、示す；そのようなペプチド成分とは、ＣＴＬエピトープに接合したＨＴＬエピトープから成ることもある。そのＣＴＬエピトープとは、解離定数が５００ｎＭ以下の親和性で複数のＨＬＡファミリー構成要素に結合するものであってもよいし、そのエピトープの類似体であってもよい。そのペプチドは、もし望ましいなら、脂質化されてもよい。
免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫は文献（Alexander et al., J. Immunol. 159:4753-4761, 1997）に述べられているように行われる。例えば、Ａ２／Ｋｂマウスは、ヒトＨＬＡのＡ２．１対立遺伝子の形質が導入されており、ＨＬＡ-Ａ＊０２０１もチーフかＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフを有するエピトープの免疫原性を確認するのに使われ、不完全フロイント賦活剤に混ぜた０．１ｍＬのペプチドか、あるいは、もしそのペプチド成分が脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ接合物であった場合にはＤＭＳＯ／生理食塩水に混ぜたもの、あるいは、もしそのペプチド成分がポリペプチドであった場合には、ＰＢＳか不完全フロイント賦活剤に混ぜたもので、皮下（尾部基底）に抗原刺激される。抗原刺激の７日後に、これらの動物から得られた脾細胞がペプチドでコートされた放射線被照射ＬＰＳ活性化ジンジェニックリンパ芽球により再度刺激される。
株化細胞：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイに使用する標的細胞は、ＨＬＡ-Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子の形質が導入されたジャーカット細胞（ヒト白血病Ｔ細胞株）である（例えば、Vitiello et al., J. Exp. Med. 173:1007, 1991参照）。
試験管内ＣＴＬ活性化：免疫刺激の１週間後に、脾臓細胞（３０ｘ１０６細胞／フラスコ）をＴ２５フラスコで１０ｍＬ培養液を用いて、ペプチドをコートした放射線被照射（３，０００ｒａｄｓ）シンジェニックリンパ芽球とともに、３７℃で共培養する。６日後に、効果細胞を回収して、細胞傷害活性を調べる。
細胞傷害活性のアッセイ：標的細胞（１．０ ｔｏ １．５ｘ１０６個）を、２００μＬの５１Ｃｒ存在下、３７℃で培養する。６０分後、３回、細胞を洗浄し、Ｒ１０培地に再懸濁する。ペプチドを１μｇ／ｍＬの濃度になるように加える。アッセイのために、１０４個の５１Ｃｒ標識された標的細胞が、Ｕ底の９６ウエルプレートの、いくつかの異なる濃度に調製した効果細胞（総体積２００μＬ）に加えられる。３７℃で６時間の培養の後、それぞれのウエルから上清を０．１ｍＬとって、Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動γ線測定装置で放射活性を決定する。特異的細胞溶解の割合は、以下の式によって決定される：特異的放出の割合＝１００×（実験上の放出量−自然放出量）／（最大放出量−自然放出量）。同じ条件下で行われる別々のＣＴＬアッセイ間での比較を容易にするために、５１Ｃｒ放出％データは、１０６個細胞あたりの細胞溶解単位として表現される。１細胞溶解単位は、６時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおける、１０，０００個の標的細胞の３０％を溶解するのに必要な効果細胞の数として、任意に定義される。特異的細胞溶解単位／１０６個細胞を求める為には、ペプチド非存在下で求められた細胞溶解単位／１０６個細胞を、ペプチド存在下で求められた細胞溶解単位／１０６個細胞から差し引けばよい。例えば、もし３０％の５１Ｃｒ放出がペプチド非存在下では、５０：１の効果細胞（Ｅ）：標的細胞（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の標的細胞に対して、効果細胞は５ｘ１０５個）で、ペプチド存在下では、５：１（すなわち、１０，０００個の標的細胞に対して、効果細胞は５ｘ１０４個）だったとすると、特異的細胞溶解単位は、［（１／５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０６＝１８ＬＵ（細胞溶解単位）ということになる。
これらの結果は、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ抱合ワクチン製剤を注射された動物のＣＴＬ応答の強さを評価するために解析され、例えば、上述の標題「免疫原性の確認」の実施例中で概略が述べられたようなＣＴＬエピトープを用いて為されるＣＴＬ応答の強さと比較される。これと同様の解析により、複数のＣＴＬ、及び／または、複数のＨＴＬエピトープを含むペプチド接合体の免疫原性の確認も行えるであろう。これらの手順に従って、ＣＴＬ応答が誘発されたことが分かるし、付随的にそういった成分の投与によりＨＴＬ応答が誘導されることも分かる。
実施例２１：ＰＳＣＡ特異的ワクチンに含めるＣＴＬ、及びＨＴＬエピトープの選別
この例は、本発明のワクチン成分のためのペプチドエピトープを選別する手順を示す。このペプチドは、そのペプチドをコードする一つ以上の塩基配列（ミニ遺伝子）からなる核酸配列の形でもよいし、あるいは、ひとつ、及び／又は複数のエピトープを有するペプチドでもよい。
以下の原理は、ワクチンの成分として含めるために多数のエピトープを選別する際に有用なものである。
エピトープは、投与時に、ＰＳＣＡの体内からの排除に関連する免疫応答を模倣するように選択される。使用されるエピトープの数は、自発的なＰＳＣＡの体外排除がある患者の観察結果に依存する。例えば、もし、ＰＳＣＡ発現細胞を自発的に体外排除している患者において、ＰＳＣＡ抗原由来の少なくとも３つのエピトープに対する免疫応答が生じていることが観察されれば、少なくとも三つのエピトープがＨＬＡクラスＩに対して含められる。同様の原理はＨＬＡクラスＩＩエピトープを決めるのにも使われる。
エピトープは、ＨＬＡクラスＩ分子に対してはＩＣ５０で５００ｎＭ以下の結合親和性を持つもの、また、クラスＩＩに対してはＩＣ５０で１０００ｎＭ以下の結合親和性を持つものがしばしば選ばれる；あるいは、ＢＩＭＡＳウエブサイト（URL:https://bimas.dcrt.nih.gov/）で高結合スコアが得られたＨＬＡクラスＩペプチドが選ばれる。
様々な人種を通じた広範なワクチンの適用範囲を得るために、充分な種類のスーパーモチーフを有するペプチド、あるいは、充分な種類の対立遺伝子特異的モチーフを有するペプチドのアレイが選ばれて、広範な人種適用範囲を得るのに使われる。ひとつの具体例では、少なくとも８０％の人種適用範囲を得るために複数のエピトープが選別される。モンテカルロ解析は、技術上は統計評価の一つとして知られており、人種適用範囲の幅と重複度を評価するのに使うことができる。
複数のエピトープを含む成分、又はそういったものをコードするミニ遺伝子を作製する際には、目的のエピトープを含有できる最小のペプチドを作製することが一般的には望ましい。使用される原理は、入れ子にしたエピトープから成るペプチドを選別するときに使われる原理と同じではないにしても、同様のものである。例えば、その配列の中に最大数のエピトープを含んでいる（すなわち、その配列は高濃度のエピトープを有するということになる）という理由で、ワクチンの成分としてひとつのタンパク質のアミノ酸配列が選ばれる。エピトープは、入れ子状になっていたり、あるいは、重複している（すなわち、互いに関して読み枠がずれている）こともある。例えば、重複しているエピトープでは、二つの９アミノ酸配列エピトープと、ひとつの１０アミノ酸配列エピトープが、ひとつの１０アミノ酸配列ペプチドの中に存在することが可能である。こういったペプチドが投与された場合には、各々のエピトープが露出されて、ＨＬＡ分子に結合することが可能である。複数のエピトープを有するペプチドは、化学合成、組換え技術、あるいは、天然材料を分解することにより作製することができる。あるいは、この野生型配列から類似体を作る事ができる。それによって、複数エピトープペプチドの交差反応性、及び／又は、結合親和性特性を変えるような置換を、ひとつかそれ以上のエピトープに含めることになる。こういったワクチン成分は、治療、あるいは、予防の目的で投与される。この具体例は、その時までは未発見だった免疫系のプロセッシングのある面が、天然の入れ子配列に適用されて、その結果、治療、あるいは、予防のための免疫応答を誘導するワクチン成分の生産を促進するかもしれないという可能性に備えるものである。加えて、こういった具体例は、現在は未知のＨＬＡ構造に体するモチーフを有するエピトープの可能性にも備えるものである。さらに、この具体例（いかなる類似体の作製なしに）は、ＰＳＣＡに実際に存在する複数のペプチド配列に、免疫応答を向けさせる。これによって、境界のエピトープの評価の必要が避けられる。最終的には、この具体例は、核酸ワクチン成分を合成する際には、規模の節約を可能とする。この具体例に関連して、技術的な原理に従ってコンピュータープログラムを作り、標的配列中の、単位配列長における最大数のエピトープを同定することができる。
選ばれたペプチドから成るワクチン成分は、投与時には、安全で、効果的で、ＰＳＣＡを有するか、あるいは、過剰発現している細胞を調節するか、あるいは、体外排除する免疫応答と同じくらいの強さの免疫応答を誘導するものである。
実施例２２：「ミニ遺伝子」複数エピトープＤＮＡプラスミドの構築
この例では、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を議論する。ミニ遺伝子プラスミドは、当然のことながら、Ｂ細胞、ここで述べられているＣＴＬ、及び／又はＨＴＬエピトープ、又はエピトープ類似物の様々な配置を含む。
ミニ遺伝子発現プラスミドは、一般的には、複数のＣＴＬとＨＴＬペプチドエピトープを含んでいる。今の例では、ＨＬＡ-Ａ２、Ａ３、Ｂ７スーパーモチーフを有するペプチドエピトープと、ＨＬＡ-Ａ１とＡ２４モチーフを有するペプチドエピトープが、ＤＲスーパーモチーフを有するエピトープ、及び／又は、ＤＲ３エピトープと共に使われる。ＨＬＡクラスＩスーパーモチーフ、あるいは、モチーフを有するＰＳＣＡ由来のペプチドエピトープが選別されて、複数のスーパーモチーフ／モチーフが広範な人種適用範囲を保証するように表される。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープがＰＳＣＡから広範な人種適用範囲を得るために選別される。これはすなわち、ＨＬＡＤＲ-１-４-７スーパーモチーフを有するエピトープとＨＬＡＤＲ-３モチーフを有するエピトープがミニ遺伝子の構築において、ともにそこに含められるように選択されるということである。選ばれたＣＴＬとＨＴＬエピトープは、発現ベクターによる発現のために、ミニ遺伝子内に導入される。
こういった構築には、ＨＴＬエピトープを小胞体にもっていくための配列を付加的に含めることもある。例えば、技術的に述べられているように、Ｉｉタンパク質をひとつかそれ以上のＨＴＬエピトープと融合することもある。その場合、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが小胞体に持っていかれるようにＩｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は取り除かれてＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列に置き換えられ、そこでそのエピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。
この例は、ミニ遺伝子を有する発現ベクターの構築に用いられる方法を示す。ミニ遺伝子の構成のために使われる他の発現ベクターも入手可能であり、当該技術における専門家間で既知である。
この例におけるミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドには、保存コザック配列と保存マウスκ免疫グロブリン軽鎖シグナル配列が含まれ、ここで開示される原理に基づいて選択されるＣＴＬ、及び／又は、ＨＴＬエピトープがそれにつながっている。オープンリーディングフレームをコードしている配列は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｙｃ-ＨｉｓベクターにコードされているＭｙｃ、及びＨｉｓ抗体エピトープタグに融合している。
例えば、１５ヌクレオチドの重複を伴って、平均して約７０ヌクレオチド長に達することが可能な重複オリゴヌクレオチドが合成されてＨＰＬＣで精製される。このオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープだけではなくて、適当なリンカーヌクレオチド、コザック配列、及びシグナル配列もコードしている。最終的な複数エピトープミニ遺伝子は、３回のＰＣＲ反応により、その重複オリゴヌクレオチドが伸長されることによって構築される。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ９６００ＰＣＲ装置が使われて、以下の条件で３０サイクルのＰＣＲが行われる：９５℃で１５秒、アニーリング温度（各プライマーペアの予測Ｔｍの中で最も低い温度よりさらに５℃下げた温度）で３０秒、７２℃で１分。
例えば、ミニ遺伝子は以下のように調製される。最初のＰＣＲ反応では、ふたつのオリゴヌクレオチドのそれぞれ５μｇがアニールされ、伸長される。８つのオリゴヌクレオチド（すなわち、４組のプライマー）が使われる例では、オリゴヌクレオチド１＋２、３＋４、５＋６、及び、７＋８が、Ｐｆｕプリメラーゼ用バッファー（１ｘは１０ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、及び２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μＬの反応液中でそれぞれ組み合わされる。全長２本鎖産物はゲルで精製され、１＋２と３＋４、及び、５＋６と７＋８反応生成物を含む２種類の反応物が混合されて、アニールされたのち、１０回の反応で伸長される。それから、全長産物を増幅するためにフランキングプライマーが加えられる前に、これらふたつの反応物の半分が混和され、５回のアニーリングと伸長反応が行われる。全長産物はゲルで精製され、ｐＣＲ-ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）上にクローニングされた後、各クローンがＤＮＡ塩基配列を読むことで選別される。
実施例２３：プラスミド構成と免疫原性の誘導の程度
例えば、先の例に従って構築したようなプラスミドが、免疫原性をどれくらい誘導できるかの程度は、エピトープを発現する核酸のコンストラクトでＡＰＣを形質導入か形質移入した後に、ＡＰＣによるエピトープの提示を決定することにより、試験管内で決められる。こういった解析が"抗原性"を決めるのであり、ヒトＡＰＣの使用を可能とする。このアッセイは、細胞表面におけるエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによってＴ細胞による認識を評価するという状況で、ＡＰＣによって提示されるべきエピトープの能力を決定する。定量化は、ＡＰＣから遊離されるペプチドの量を直接測る（例えば、Sijts et al., J. Immunol. 156:683-692, 1996; Demotz et al., Nature 342:682-684, 1989を参照）ことにより行われ得る；あるいは、ペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数は、病気にかかったか又は形質が移入された標的細胞により誘導される細胞溶解、又はリンフォカインの放出量を測り、それから、同等のレベルの細胞溶解、又はリンフォカインの放出に必要なペプチドの濃度を決定することにより見積もることができる。
あるいは、免疫原性は、マウスへのインビボ接種と、それに続く試験管内でのＣＴＬ、及びＨＴＬ活性の評価により確認することができる。ＣＴＬ、及びＨＴＬ活性の評価は、例えば、Alexander et al., Immunity 1:751-761, 1994において詳細が述べられているように、細胞傷害性アッセイと細胞増殖性アッセイによりそれぞれ調べられる。
例えば、ＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフペプチドを少なくともひとつは含むＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトが生体内でＣＴＬを誘導する能力を確かめるために、ＨＬＡ-Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスが、一例として、１００μｇの裸のｃＤＮＡ（ベクターを用いない導入ＤＮＡ）を用いて筋肉注射により免疫される。ｃＤＮＡ免疫により誘導されるＣＴＬのレベルを比較するために、コントロール群の動物は、また、そのミニ遺伝子にコードされるようにひとつのポリペプチドとして合成された複数のエピトープから成る本来のペプチド成分により免疫される。
免疫動物から得られた脾細胞は、各々（ミニ遺伝子にコードされているペプチドエピトープ、あるいは、複数エピトープペプチド）の組成の各々により２回刺激され、それから、５１Ｃｒ放出アッセイによりペプチド特異的細胞傷害活性が調べられる。その結果は、Ａ２制限エピトープに対して誘導されたＣＴＬ応答の大きさを示しており、従って、それは、生体内でのミニ遺伝子ワクチンと複数エピトープワクチンの免疫原性を示していることになる。
それゆえ、ミニ遺伝子は、複数エピトープペプチドワクチンがそうであるように、ＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対して向いている免疫応答を誘発することが分かる。同様の解析は、また、ＨＬＡ-Ａ３、及び、ＨＬＡ-Ｂ７モチーフ、あるいは、スーパーモチーフエピトープによるＣＴＬの誘導を評価するために、ＨＬＡ-Ａ３、及び、ＨＬＡ-Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを使って実施される。それによって、与えられたエピトープに対して向いている適切な免疫応答をそのミニ遺伝子が誘導する事も分かるのである。
生体内でクラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子がＨＴＬを誘導する能力を確認するために、例えば、ＤＲトランスジェニックマウス、あるいは、適当なマウスＭＨＣ分子と交差反応するようなエピトープ、すなわちＩ-Ａｂ制限マウスが、１００μｇのプラスミドＤＮＡで筋肉内に免疫される。ＤＮＡ免疫により誘導されるＨＴＬのレベルを比較するために、一群のコントロール動物もまた、完全フロイント賦活剤で乳化した実際のペプチド成分で免疫される。ＣＤ４＋Ｔ細胞、すなわちＨＴＬは、免疫された動物の脾細胞から調製されて、それぞれの組成（ミニ遺伝子にコードされているペプチド）の各々により刺激される。ＨＴＬ応答は、３Ｈチミジン取り込み増殖アッセイ（例えば、Alexander et al. Immunity 1:751-761, 1994を参照）を用いて測られる。この結果は、ＨＴＬ応答の大きさを示しており、従ってミニ遺伝子の生体内免疫原性を示していることになる。
ＤＮＡミニ遺伝子は、先の実施例において述べられたように構築されて、追加抗原刺激法により追加免疫剤と組み合わせてワクチンとして確立することもできる。追加免疫剤は、組換えタンパク質（例えば、Barnett et al., Aids Res. And Human Retroviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998参照）、あるいは、例えば、ミニ遺伝子か目的のタンパク質全体をコードしているＤＮＡを発現しているような組換えワクチン（例えば、anke et al., Vaccine 16:439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:7648-53, 1998; Hanke and McMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999; and Robinson et al., Nature Med. 5:526-34, 1999参照）で構成することができる。
例えば、追加抗原刺激法で使われるＤＮＡミニ遺伝子の有効性は、最初はトランスジェニックマウスで評価される。この例では、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスが、少なくともひとつのＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフを有するペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードするＤＮＡミニ遺伝子、１００μｇによって免疫される。インキュベーション期間（３から９週間）の後、マウスは１匹あたり１０７ｐｆｕのＤＮＡミニ遺伝子にコードされているのと同じ配列を発現している組換えワクチンウイルスにより、追加免疫される。コントロールマウスは、１００μｇのＤＮＡ、又はミニ遺伝子配列を欠く組換えワクチン、あるいは、ミニ遺伝子をコードしているＤＮＡと、しかしながらワクチン追加免疫無しで、免疫される。さらに２週間のインキュベーションの後、すぐに、マウスの脾細胞はＥＬＩＳＰＯＴアッセイでペプチド特異的活性が調べられる。加えて、脾細胞はミニ遺伝子と組換えワクチンにコードされたＡ２制限ペプチドエピトープにより試験管内で刺激され、それから、α、β、及び／又は、γインターフェロンＥＬＩＳＡによりペプチド特異活性が調べられる。
追加免疫刺激法で使われるミニ遺伝子が、ＤＮＡだけを使う時よりも、強い免疫応答を、ＨＬＡ-Ａ２スーパーモチーフペプチドに対して誘導することが分かる。ＨＬＡ-Ａ３、あるいは、ＨＬＡ-Ｂ７モチーフ、あるいは、スーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために、ＨＬＡ-Ａ１１、あるいは、ＨＬＡ-Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて、このような解析を行うこともできる。ヒトにおける追加免疫刺激法の使用が、標題「追加免疫刺激法をもちいたＣＴＬ応答の誘導」の実施例中で、以下に述べられる。
実施例２４：予防的な使用のためのペプチド組成
本発明のワクチン成分は、この抗原を有している癌の発病の危険にある人において、ＰＳＣＡ発現をおさえるのに使うことができる。例えば、上述の実施例中で選別したような、複数のＣＴＬ、及び、ＨＴＬエピトープを含む複数エピトープペプチドエピトープ成分（あるいは、同じものから成る核酸）は、また、８０％以上の人種を標的とするために選別されて、ＰＳＣＡ関連癌の発病の危険がある個体に投与される。
例えば、ペプチドを基にする成分は、複数のエピトープを含有するひとつのポリペプチドとして提供される。ワクチンは、一般的には、不完全フロイント賦活剤のような賦活剤からなる生理溶液に溶かして投与される。最初の免疫のためのペプチドの投与量は、体重７０ｋｇの成人に対して約１μｇから約５０，０００μｇで、一般的には１００から５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与のあと４週間後に追加免疫のための投薬が行われ、その後に、ＰＢＭＣ試料におけるエピトープ特異的ＣＴＬ集団の有無を決める技術によって、その患者における免疫応答の強さが評価される。必要に応じて、さらに追加免疫用量が投与される。ＰＳＣＡ関連疾患に対する予防として、その成分が安全で効果的であることが分かる。
あるいは、一般的には形質移入剤から成る成分が、技術的には既知で、ここで開示される方法に従って、核酸ベースのワクチンの投与のために使われる。
実施例２５：野生型ＰＳＣＡ配列から得られる複数エピトープワクチンの成分
複数のエピトープを含むポリプロテインの「比較的短い」領域を同定するために、各クラスＩ、及び／又はクラスＩＩスーパーモチーフ、あるいはモチーフを定義したコンピュータアルゴリズムをなるべく使うことで、野生型ＰＳＣＡポリプロテインの配列が調べられる。「比較的短い」領域というのは、全野生型抗原よりも長さがなるべく短いものである。複数の別個の、あるいは、重複した「入れ子の」エピトープを含むこの比較的短い配列は、ミニ遺伝子コンストラクトを作成するのに使うことができる。そのコンストラクトは、野生型タンパク質の配列に相当するペプチドを発現するように設計される。「比較的短い」ペプチドとは、一般的には、２５０アミノ酸長よりも短いもので、しばしば１００アミノ酸長よりも短く、好ましくは７５アミノ酸長よりも短く、さらに好ましくは５０アミノ酸長よりも短いものである。ワクチン成分のタンパク質配列は、それがその配列内に含まれる最大数のエピトープを有している、すなわち、それが高エピトープ濃度を有しているという理由で選ばれる。ここで示すように、エピトープモチーフは入れ子にされたり、あるいは、重複したりすることがある（すなわち、お互いに関してシフトしたフレームになっている）。例えば、重複しているエピトープでは、二つの９アミノ酸配列エピトープと、ひとつの１０アミノ酸配列エピトープが、ひとつの１０アミノ酸配列ペプチドの中に存在することが可能である。こういったワクチン成分は、治療、あるいは、予防の目的で投与される。
ワクチンの成分には、例えば、ＰＳＣＡ抗原由来の複数のＣＴＬエピトープと、少なくともひとつのＨＴＬエピトープを含めることができる。この複数エピトープ野生型配列は、ペプチドとして、あるいは、このペプチドをコードする核酸配列として投与される。あるいは、この野生型配列から類似体を作製することもできる。その際、ひとつかそれ以上のエピトープは、その複数エピトープペプチドの交差反応性、及び／又は結合親和性特性を変えるような置換から成る。
この実施例の具体化は、これまでは未発見の免疫系の作用の側面が野生型入れ子配列に適用されて、その結果、治療用、又は予防用の免疫応答誘導ワクチン成分の生成を促進する可能性を生み出す。加えて、こういった具体化は、現在は未知のＨＬＡ構造に体するモチーフを有するエピトープの可能性を与える。さらに、この具体化（類似体化は除く）は、免疫応答を実際にＰＳＣＡ内に存在する複数のペプチド配列に向けさせて、その結果、結合エピトープを評価する必要性を排除する。最終的には、この具体化によって、ペプチド、又は核酸ワクチン成分を合成する際の規模の節約が可能となる。
この具体例に関連して、標的配列内で、配列長あたり数が最も多いエピトープを同定するのに使うことができる技術において、コンピュータプログラムが利用可能である。
実施例２６：複数の抗原に由来する複数エピトープワクチン成分
本発明のＰＳＣＡペプチドエピトープは、他の標的癌関連抗原由来のエピトープと共に使われて、ＰＳＣＡやこのようなその他の抗原を発現している癌を予防したり処置したりするのに使用できるワクチン成分が作られる。例えば、ＰＳＣＡの発現に関連した標的癌においてしばしば発現している癌関連抗原のみならず、ＰＳＣＡ由来の複数のエピトープを組み込んだひとつのポリペプチドとしてもワクチン成分を用意することができる。あるいは、ひとつかそれ以上の個別のエピトープの混合物から成る成分として、ワクチン成分を投与することもできる。あるいは、ミニ遺伝子コンストラクト、あるいは、試験管内でペプチドエピトープを負荷された樹状細胞として、ワクチンを投与することもできる。
実施例２７：免疫応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドは、特異的抗体、すなわＰＳＣＡに対するＣＴＬ、あるいは、ＨＴＬ
の存在に関して免疫応答を解析するのに使用することができる。こういった分析は、Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1998に述べられているやり方で行うことができる。この例では、本発明に従ったペプチドは、免疫原としてではなく、診断目的、あるいは、予後の目的のための試薬として使われる。
この実施例では、高感受性ヒト白血球抗原４量体化複合体（「４量体」）が、例えば、進行段階が異なるＨＬＡ Ａ＊０２０１陽性の個々人由来の、例えば、ＰＳＣＡ ＨＬＡ-Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ度数の横断面分析のために使われたり、あるいは、Ａ＊０２０１モチーフを含むＰＳＣＡペプチドからなる以降の免疫のために使われる。４量体複合体は、Musey et al., N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997に述べられるように合成される。簡単に言うと、精製したＨＬＡ重鎖（この例ではＡ＊０２０１）とβ２ミクログロブリンが原核細胞を用いた発現系により合成される。重鎖は、膜貫通−細胞質側テールの削除とＢｉｒＡ酵素的ビオチン化サイトを含む配列のＣＯＯＨ末端の付加により改造される。この重鎖と、β２ミクログロブリン、及び、ペプチドは希釈操作によってリフォールディングされる。４５ｋＤの分子量のリフォールディング産物が、高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより精製されて、それから、ビオチン（Sigma, St. Louis, Missouri）、アデノシン５’３リン酸（ＡＴＰ）、及び、マグネシム存在下にて、ＢｉｒＡによりビオチン化される。ストレプトアビジン−フィコエリトリン接合体が１：４のモル比で加えられて、４量体化産物は濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮される。その結果出来上がった産物を、４量体フィコエリトリンと呼ぶ。
患者の血液試料を分析するためには、約１００万個のＰＢＭＣを５分、３００ｇの遠心操作で集めてから、冷やしたリン酸バッファー生理食塩水５０μＬに再懸濁する。抗ＣＤ８Ｔｒｉｃｏｌｏｒと、抗ＣＤ３８と一緒に、４量体フィコエリトリンを用いてＴｒｉ-ｃｏｌｏｒ分析が行われる。ＰＢＭＣは、４量体、及び、抗体と氷上に３０分から６０分、静置され、ホルムアルデヒド固定の前に２回、洗浄される。コントロール試料の９９．９８％以上を含むようにゲートは設定される。４量体のコントロールには、Ａ＊０２０１陰性の被験者、及び、Ａ＊０２０１陽性であるが疾患を患っていない提供者を含める。４量体を伴って染色される細胞の割合は、フローサイトメトリーにより決定される。その結果は、ＰＢＭＣ試料におけるエピトープ制限ＣＴＬを含む細胞の数を示しており、それによって、用意に、ＰＳＣＡエピトープに対する免疫応答の程度が示され、さらに、ＰＳＣＡに対しての露出状態、あるいは、保護的、又は治療的応答を誘導するワクチンに対する露出状態を示している。
実施例２８：リコール応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明のペプチドエピトープは、患者において、急性応答、又はリコール応答のような、Ｔ細胞応答を評価するための試薬として使われる。こういった分析は、ＰＳＣＡ関連疾患から回復したか、あるいは、ＰＳＣＡワクチンでワクチン接種が行われた患者に関して実施されることになる。
例えば、ワクチン接種が行われた個体のクラスＩ制限ＣＴＬ応答が分析される。ワクチンとしては、どのようなＰＳＣＡワクチンでもよい。ワクチン接種された個々人からＰＢＭＳが集められて、ＨＬＡの型に分けられる。それから、複数のＨＬＡスーパータイプファミリーの構成要素に対して交差反応を可能とするスーパーモチーフを至適に有する、本発明のペプチドエピトープのうち適当なものが、そのＨＬＡ型を有する個々人由来の試料の分析のために使われる。
ワクチン接種した個々人由来のＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ-Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）により分離され、ＨＢＳＳ（GIBCO Laboratories）で３回洗浄されて、Ｌグルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン、（５０μｇ／ｍｌ）、及び、１０％ 熱非活性化ヒトＡＢ血清を含むヘペス（１０ｍＭ）（完全ＲＰＭＩ）に再懸濁されて、ミクロカルチャー形式を使って培養プレートに蒔かれる。本発明のエピトープのひとつから成る合成ペプチドが、各ウエルあたり１０μｇ／ｍＬの濃度になるように加えられてから、ＨＢＶコア１２８-１４０エピトープが、最初の１週間の刺激の間のＴ細胞の援助源として、各ウエルあたり１μｇ／ｍＬの濃度になるように加えられる。
ミクロカルチャー形式では、各ウエルあたり１００μＬの完全ＰＲＭＩ中、９６ウエル丸底プレートを用いて、８つの同型培養でペプチドにより４ｘ１０５個のＰＢＭＣが刺激される。３日目と１０日目に、１００μＬの完全ＰＲＭＩと、終濃度２０Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ-２が各ウエルに加えられる。７日目には、カルチャーは９６ウエル平底プレートに移されて、ペプチド、組換えＩＬ-２、及び、１０５個の被放射線照射（３，０００ｒａｄ）自家支持細胞により再刺激を受ける。１４日目に、カルチャーの細胞傷害活性が調べられる。ＣＴＬ応答陽性とされるには、８つの同型培養の２つ以上で、先に述べたような疾患を患っていないコントロール被験者との比較に基づいて１０％以上の特異的５１Ｃｒ放出が示される必要がある（Rehermann, et al., Nature Med. 2:1104,1108, 1996; Rehermann et al., J. Clin. Invest. 97:1655-1665, 1996; and Rehermann et al. J. Clin. Invest. 98:1432-1440, 1996）。
標的株化細胞は、自家性、及び、アロジェネイックなＥＢＶ形質転換Ｂ-ＬＣＬで、American Society for Histocompatibility and Immunogenetics （ASHI, Boston, MA）から購入するか、Guilhot, et al. J. Virol. 66:2670-2678, 1992に述べられたように、患者の蓄えから確立される。
細胞傷害性アッセイは、以下のようなやり方で行われる。標的細胞は、アロジェネイックなＨＬＡ適合、あるいは、自家性ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫株化細胞で、これらは１０μＭの濃度の本発明の合成ペプチドエピトープ共存下で一晩培養され、ＨＢＳＳで４回洗浄された後に、１時間、１００μＣｉの５１Ｃｒ（Amersham Corp., Arlington Heights, IL）で標識されたものである。
細胞傷害性は、１ウエルあたり３，０００個の標的をいれた丸底９６ウエルプレートを用いた、標準的な４-ｈ、スプリットウエル５１Ｃｒ放出アッセイで決められる。刺激を加えられたＰＢＭＣは、１４日めに、２０から５０：１の効果細胞／標的細胞（Ｅ／Ｔ）比で調べられる。細胞傷害性のパーセントは、以下の式から決められる：１００ｘ［（実験的に観測された放出量−自発放出量）／最大放出量−自発放出量）］。最大放出量は、界面活性剤（２％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００；Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）による標的の溶解により決定される。自然放出量は、全ての実験のなかで最大の放出量の２５％以下である。
こういった分析の結果から、ＨＬＡ制限ＣＴＬ集団が、ＰＳＣＡ、あるいは、ＰＳＣＡワクチンに対する事前の曝露により刺激される程度が示される。
同様に、クラスＩＩ制限ＨＴＬ応答もまた、分析される。精製されたＰＭＢＣが、１ウェルあたり、１．５×１０５個の細胞密度で、丸底９６ウエルプレートにて培養され、本発明の合成ペプチド、ＰＳＣＡ抗原全体の合成ペプチド、あるいは、ＰＨＡの合成ペプチドによって１０μｇ／ｍＬの濃度で刺激を加えられる。細胞は、それぞれの条件に関して、４から６ウエルを使用して機械的に同型培養される。７日間の培養の後、培養液が除かれて、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ-２を含む新鮮な培養液に換えられる。その２日後に、１μＣｉの３Ｈ標識されたチミジンが各ウエルに加えられて、さらに１８時間、培養が続けられる。細胞ＤＮＡが、それから、ガラス繊維製のマット上に回収されて、３Ｈ標識されたチミジンの取り込みが調べられる。抗原特異Ｔ細胞の増殖は、抗原存在下での３Ｈ標識されたチミジンを抗原非存在下での３Ｈ標識されたチミジンで割った値として計算される。
実施例２９：ヒトにおける特異的なＣＴＬ応答の誘導
本発明のＣＴＬ、及びＨＴＬエピトープから成る免疫原性成分に関するヒト臨床試験が、治験薬フェーズＩ、すなわち、投与量の増量として企画され、無作為化した、二重盲式（実験中は被験者にも実験者にもその仕組みが分からない方式）の、偽薬で対照をとる試験が実施される。
総数が２７程度の個体が登録されて、３つのグループに分けられる。
グループＩ：３人の被験者には偽薬が接種され、６人の被験者には５μｇのペプチド成分が接種される。
グループＩＩ：３人の被験者には偽薬が接種され、６人の被験者には５０μｇのペプチド成分が接種される。
グループＩＩＩ：３人の被験者には偽薬が接種され、６人の被験者には５００μｇのペプチド成分が接種される。
最初の接種から４週間後に、全ての被験者は、同じ投与量で追加免疫接種を受ける。
この研究で測られるエンドポイントは、その免疫原性のみでなく、ペプチド成分の安全性と許容度にも関連している。ペプチド成分に対する細胞免疫応答は、このペプチド成分の内因的活性の指標であり、従って、生理学的有効性の基準としてみることができる。以下では、安全性と有効性エンドポイントに関連する臨床データ、及び、実験室でのデータを概観する。
安全性：有害事象の発生率は、偽薬、及び、薬剤処理集団においてモニターされ、程度及び可逆性の点で評価される。
ワクチンの効力の評価：ワクチンの効力を評価するために、接種の前後で被験者の採血が行われる。末梢血単核細胞がヘパリン処理された新鮮血から、Ｆｉｃｏｌｌ-Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心により単離され、凍結用培養液に分注されて、凍結保存される。試料は、ＣＴＬ、及び、ＨＴＬ活性に関して調べられる。
ワクチンは、安全で有効と分かる。
実施例３０：ＰＳＣＡを発現している患者におけるフェーズＩＩ試験
フェーズＩＩ試験は、ＣＴＬ-ＨＴＬペプチド成分がＰＳＣＡを発現している癌を患っている患者に投与された際の効果を調べるために実施される。この試験の主な目的は、ＰＳＣＡを発現している癌患者でＣＴＬを誘導するための効果的な投与量と治療方式を決める事、こういった患者においてＣＴＬやＨＴＬを誘導することの安全性を確認すること、及び、ＣＴＬをどれくらいの程度活性化すると、例えば、病変の減少、及び／又は縮小に現れるような、こういった患者の病像が改善されるかをみることである。こういった研究は、例えば、以下のように計画される：
研究は、複数のセンターで実施される。臨床試験計画は、オープンラベル（マスキングをしない臨床試験）で、対照をとらない、投与量段階的増大手順となり、その際には、ペプチド成分が、同じ用量による１回の追加免疫投与を６週間後に伴う１回の用量で投与される。投与量は、接種あたり５０、５００、及び、５０００μｇである。薬剤関連副作用（重症度と可逆性）が記録される。
３つの群に患者は分けられる。一つ目のグループは、５０μｇのペプチド成分が接種され、第２、第３のグループには、それぞれ、５００μｇ、５０００μｇのペプチド成分が接種される。それぞれのグループに属する患者の年齢は２１歳から６５歳の範囲で、民族的背景も様々なものになるようにされる。すべての被験者がＰＳＣＡを発現している癌を患っている。
臨床症状、あるいは、抗原特異的Ｔ細胞応答がモニターされて、ペプチド成分の投与効果が評価される。ワクチン成分は、ＰＳＣＡ関連疾患の処置において、安全、かつ効果的であることが分かる。
実施例３１：追加免疫抗原刺激手順を用いたＣＴＬ応答の誘導
根本原則において、例えば、標題「プラスミド構成と、免疫原性の誘導の程度」の実施例において述べられたようなトランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチンの有効性の確認に使われるのと同様の追加免疫抗原刺激手順が、また、ヒトに対するワクチン投与について使用可能である。このようなワクチン療法は、例えば、最初にＤＮＡそのものが投与されてから、ワクチンをコードしている組換えウイルス、又は組換えタンパク質／ポリペプチド、又は免疫賦活剤に混ぜたペプチド混合物による追加免疫を含んでいる。
例えば、最初の免疫は発現ベクターを用いて実施することもできる。それは、例えば、標題「「ミニ遺伝子」複数エピトープＤＮＡプラスミドの構築」において構築されて、裸の核酸の形で、複数の部位に、０．５〜５ｍｇの量がＩＭ（Intramuscular：筋肉内）（あるいは、ＳＣ（Subcutaneour：皮下）、あるいは、ＩＤ（Intradermal：皮内））投与されるようなものである。核酸（０．１〜１０００μｇ）は、また、遺伝子銃を使用して投与されることもある。３週間〜４週間のインキュベーションに続いて、追加免疫用量が投与される。追加免疫剤は、５×１０７〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え伝染性上皮腫ウイルスでもよい。代わりに、ＭＶＡ、カナリヤポックスウイルス、アデノウイルス、あるいはアデノ関連ウイルスのような組換えウイルスを追加免疫のために使うこともできるし、あるいは、複数エピトープタンパク質やペプチド混合物を投与することもできる。ワクチンの有効性を評価するために、患者の血液試料が、最初のワクチン接種とワクチンの追加免疫用量の後の一定間隔をおいてだけではなく、免疫前にも採取される。末梢血単核細胞がＦｉｃｏｌｌ-Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心により新鮮なヘパリン化血液より単離されて、凍結用培養液に分注され、凍結保存される。サンプルは、ＣＴＬ、及びＨＴＬ活性が評価される。
この結果を分析することで、ＰＳＣＡに対する治療、あるいは、防御のための免疫をほどこすのに充分な応答が生じていることが示される。
実施例３２：樹状細胞（ＤＣ）を用いたワクチン組成物の投与
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンは、ＡＰＣ（抗原提示細胞）、又は樹状細胞のような「専用」ＡＰＣを使って投与することもできる。本実施例では、ペプチドが適用されたＤＣが、生体内でＣＴＬ応答を刺激するために患者に投与される。この方法では、樹状細胞が単離されて、増幅培養されて、本発明のＣＴＬ、及びＨＴＬペプチドエピトープを含むワクチンが適用される。この樹状細胞が患者に注入されて戻され、生体内でＣＴＬ、及びＨＴＬ誘導が誘発される。誘導されたＣＴＬとＨＴＬは、ワクチンに含まれるエピトープが引き出されたＰＳＣＡタンパク質を有する標的細胞をそれぞれ、破壊するか、又は破壊を促進する。
例えば、エピトープを構成するペプチドの混合物が、生体外(ex vivo)でＰＢＭＣ、あるいは、そこから単離されたＤＣに投与される。ＤＣの回収を促進するための医薬品、例えば、ProgenipoietinTM（Monsanto, St. Louis, MO）、あるいは、ＧＭ-ＣＳＦ／ＩＬ-４を使う事ができる。ペプチドをＤＣに適用後、患者に再び注入する前に、ＤＣは結合しなかったペプチドを除去するために洗浄される。
臨床的に評価されるように、また、臨床結果に基づいて当該技術における専門家により容易に決定できるように、患者に再注入されるＤＣの数は変えることができる（例えば、 Nature Med. 4:328, 1998; Nature Med. 2:52, 1996 and Prostate 32:272, 1997を参照）。一般的には、患者あたり２から５０ｘ１０６個のＤＣが投与されるが、１０７あるいは、１０８のようなさらに大量のＤＣがあてがわれることもある。こういった細胞集団には、一般的には、５０から９０％のＤＣが含まれている。
ある具体例においては、ペプチドを提示したＰＢＭＣがＤＣを精製することなく患者に接種される。例えば、ProgenipoietinTMのような薬剤で処理されたあとに生じたＰＢＭＣが、ＤＣを精製することなく患者に接種される。投与されるＰＢＭＣの総数は、しばしば、１０８〜１０１０個の範囲である。一般的には、患者に接種される細胞投与量は、各患者の血液中のＤＣの％に基づいており、例えば、特異的な抗ＤＣ抗体を用いた免疫蛍光分析によりそれは決定される。このように、例えば、もしProgenipoietinTMが対象患者の末梢血中の２％のＤＣを動員し、その患者が５×１０６個のＤＣを受け入れたとしたら、その患者には総数２．５×１０８個のペプチド提示ＰＢＭＣが注射されることになる。ProgenipoietinTMのような薬剤により動員されたＤＣの％は、一般的には、２〜１０％の間に見積もられるが、当該技術における専門家に認められているように、その値は変わることもある。
ＣＴＬ／ＨＴＬ応答の生体外(Ex vivo)活性化
あるいは、ＰＳＣＡ抗原に対する生体外ＣＴＬ、あるいは、ＨＴＬ応答は、ＤＣのようなＡＰＣ源と免疫原性ペプチドと一緒に、組織培養中で、患者由来か、あるいは、遺伝的に互換性のあるＣＴＬ、あるいは、ＨＴＬ前駆体細胞を培養することで誘導することができる。前駆体細胞が活性化されて効果細胞に発展する、適当なインキュベーション時間（一般的には約７日〜２８日）の後に、細胞は患者に注入されて、それらがその特異的標的細胞、すなわち癌細胞を破壊（ＣＴＬ）したり、破壊を促進（ＨＴＬ）したりする。
実施例３３：モチーフを有するペプチドを同定して確認するための代替法
モチーフを有するペプチドを同定し確認する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を有している細胞からそれらのペプチドを溶出するというものである。例えば、組織の分類に使われるＥＢＶ形質転換株化Ｂ細胞が、それらがどのＨＬＡ分子を発現しているのかを決定するために、さらに掘り下げて特徴が調べられる。ある場合には、これらの細胞は唯一、ひとつの型のＨＬＡ分子のみを発現している。こういった細胞は、目的の抗原、例えばＰＳＣＡを発現する核酸で形質転換することができる。形質導入の結果として作られたペプチドの内因性抗原処理により生成したペプチドは、細胞内でＨＬＡ分子に結合して、運搬され、細胞表面に提示される。それから、ペプチドはおだやかな酸性条件にさらされることでＨＬＡ分子から溶出されて、そのアミノ酸配列が、例えば、質量スペクトル分析（例えば、Kubo et al., J. Immunol. 152:3913, 1994）により、決定される。特定のＨＬＡ分子に結合するペプチドのほとんどはモチーフを有しているので、これは、細胞上で発現している特定のＨＬＡ分子に関連するモチーフを有するペプチドを得る為の代替様式となる。
あるいは、ＨＬＡ分子を内因的には発現していない株化細胞を、ひとつのＨＬＡ対立遺伝子をコードしている発現コンストラクトにより形質導入することができる。こういった細胞は、それから、以下に述べるように使うことが可能である。すなわち、それらの細胞には、その細胞表面に提示されているＰＳＣＡに対応するペプチドを単離するために、ＰＳＣＡをコードしている核酸で形質を導入することができる。こういった分析から得られるペプチドは、その細胞で発現しているひとつのＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフをひとつかそれ以上、有している。
技術的に認められているように、ひとつ以上のＨＬＡ対立遺伝子を有している細胞に同様の分析を行い、その後に発現している各々のＨＬＡ対立遺伝子に対して特異的なペプチドを決めることもできる。さらに、タンパク質抗原の負荷のような、形質移入以外の方法が、細胞に抗原の原料を提供するために使えることを、また、当該技術における専門家も認めるであろう。
実施例３４：相補的ポリヌクレオチド
ＰＳＣＡをコードしている配列に相補的な配列、あるいは、その部分配列が、天然に生じるＰＳＣＡの発現の検出、抑制、あるいは、阻害のために使われる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用が記述されるが、本質的には同じ方法がより短い、あるいは、より長い配列長断片に対しても使われる。例えば、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウエア（National Biosciences）とＰＳＣＡをコードしている配列が使われて、適切なオリゴヌクレオチドが設計される。転写を阻害するためには、最も独特の５'配列から相補的なオリゴヌクレオチドが設計されて、そのコード配列にプロモーターが結合するのを阻害するために使われる。翻訳を阻害するためには、ＰＳＣＡをコードしている転写産物にリボソームが結合するのを防ぐように相補的オリゴヌクレオチドが設計される。
実施例３５：ＰＳＣＡ特異抗体を用いた天然、又は組換えＰＳＣＡの精製
天然、又は組換えＰＳＣＡは、ＰＳＣＡに特異的な抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて充分に精製される。免疫アフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）のような、活性化したクロマトグラフィー用の樹脂に抗ＰＳＣＡ抗体を共有結合でくっつけることにより作製される。結合処理の後に、メーカーによる手順に従って、樹脂はブロッキング処理され、洗浄される。
ＰＳＣＡを含む培養液をこの免疫アフィニティーカラムに通してから、このカラムは、ＰＳＣＡが充分に結合できていられるような条件（例えば、界面活性剤存在下での高イオン強度バッファー）で洗浄される。それから、このカラムで、抗体／ＰＳＣＡ結合を引き離すような条件下（例えば、ｐＨ２からｐＨ３、あるいは、尿素やチオシアン酸イオンのような高濃度のカオトロープのバッファー）で、溶出が行われる。
実施例３６：ＰＳＣＡと相互作用する分子の同定
ＰＳＣＡ、又は生物的に活性のあるその断片が、１２１Iボルトン−ハンター試薬（例えば、Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識される。マルチウエルプレートのウエルに前もって並べられた候補分子は、標識されたＰＳＣＡとともにインキュベートされ、洗浄の後に、標識されたＰＳＣＡ複合体の存在が調べられる。異なるＰＳＣＡ濃度を用いて得られたデータが、その結合数、結合親和性、そして、ＰＳＣＡの候補分子との会合を計算するのに使われる。
実施例３７：ＰＳＣＡｖ．４による腫瘍成長促進のインビボアッセイ
腫瘍細胞の成長に対するＰＳＣＡｖ．４タンパク質の影響が、ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞と欠失している細胞の腫瘍の分化と成長を評価することによって、生体内（インビボ）で評価される。例えば、ＳＣＩＤマウスのそれぞれの側腹部の皮下に、ｔｋＮｅｏ空ベクターかＰＳＣＡｖ．４を含む、１×１０６個の３Ｔ３細胞、前立腺癌（例えば、ＰＣ３細胞）、膀胱癌（例えば、ＵＭ-ＵＣ３細胞）、又は膵臓癌（例えば、ＰＡＮＣ１細胞）株化細胞が接種される。少なくとも二つの手法を使うことができる：（１）ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス（UK 2,211,504;5 July 1989公開）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムからか、あるいは、例えば、それらのプロモーターが宿主細胞系にも互換性であるという条件下で、アクチンプロモーター、あるいは、免疫グロブリンプロモーターのような異種性哺乳動物プロモータから得られた常時発現型プロモーターのようなプロモーターの制御下にある恒常的なＰＳＣＡｖ．４の発現、及び、（２）それらのプロモーターが宿主細胞系にも互換性であるという条件下で、エクダイソン、テトラサイクリン、等で誘導されるベクター系の制御下での制御された発現。腫瘍の大きさは、触診可能な腫瘍が生じたときにノギスで測ることによりモニターされ、ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞がより早く成長するのかどうかと、ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞により生成する腫瘍が変質した病原力の特徴（例えば、転移の亢進、血管新生、化学療法薬に対する反応性の低下、等）を示すかどうかを、ずっと追跡して決められる。
加えて、１×１０５個の同じ細胞が正位に移植されて、ＰＳＣＡｖ．４が膵臓において局所的な成長に対して効果があるかどうか、及び、ＰＳＣＡｖ．４がリンパ節、及び骨組織に特異的に転移するその細胞の能力に影響を及ぼすかどうかが決められる（（Miki T et al, Oncol Res. 2001;12:209; Fu X et al, Int. J Cancer. 1991, 49:938））。骨組織腫瘍の形成と成長に対するＰＳＣＡｖ．４の影響は、頸骨内への腫瘍細胞の注入によって評価することができる。
このアッセイは、例えば、ＰＳＣＡｖ．４イントラボディー、ＰＳＣＡｖ．４アンチセンス分子、及び、リボザイムのような、治療成分の候補のＰＳＣＡｖ．４阻害効果を決めるのにも、また、使うことができる。
実施例３８：生体内におけるＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体に媒介される腫瘍の抑制
ＰＳＣＡｖ．４が、癌組織において大量に発現しており、正常組織においては限られた量しか発現していないことにより、ＰＳＣＡｖ．４は抗体治療の良い標的となる。同様に、ＰＳＣＡｖ．４はＴ細胞ベースの免疫治療の標的でもある。このように、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌（たとえば、ＰＡＮＣ１細胞）、及び表１に挙げられているその他のＰＳＣＡｖ．４関連癌を含むヒト由来癌異種移植マウスモデルに対する抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体の治療有効性が、ヒト異種移植モデル（Saffran et al PNAS 1999, 10:1073-1078）だけではなく、ＰＣ３-ＰＳＣＡｖ．４、ＵＭ-ＵＣ３-ＰＳＣＡｖ．４、ＰＡＮＣ１-ＰＳＣＡｖ．４、及び３Ｔ３-ＰＳＣＡｖ．４（例えば、Kaighn, M.E., et al., Invest Urol, 1979. 17(1): 16-23を参照）のような組換え株化細胞を使って評価される。
腫瘍の増殖と転移形成に関する抗体の効果は、例えば、マウス正位卵巣、膵臓、又は血液癌異種移植モデルで調べられる。抗体は、この例に述べられるような何も付けない状態か、あるいは、技術的には認知されているような治療様相に結合させることもできる。抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体は、異種移植マウスにおける腫瘍の形成を阻害する。抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体は、また、定着した正位での腫瘍の成長を遅らせ、腫瘍をもったマウスの生存期間を延ばす。こういった結果は、局所的、かつ、進行段階のいくつかの固定癌の効果に対する抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体の有効性をしめしている（例えば、Saffran, D., et al., PNAS 10:1073-1078、あるいは、URL pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698を参照）。
抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体の投与により、定着した正位の癌の成長を遅らせ、別の場所への転移を抑えることができるので、その結果、腫瘍を有するマウスの生存期間が著しく延びる。こういった研究は、ＰＳＣＡｖ．４を免疫治療の魅力的な標的として提示し、局所的、かつ、転移性腫瘍の処理に関する抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体の治療可能性を明示している。この例は、何とも結合させていない抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体が、ＳＣＩＤマウスで成長したヒト膵臓癌、卵巣癌、及び、リンパ腫癌異種移植片の成長を阻害するのに効果的であることを示している；それに応じて、こういった効果的なモノクローナル抗体の組み合わせも、また、有効である。
複数の非接合ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体を使った腫瘍の抑制
材料と結果
ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、標題「ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体の産生」において述べられたように、ＰＳＣＡｖ．４に対して作られる。抗体の特徴は、ＰＳＣＡｖ．４に結合する能力に関してＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ、及び、免疫沈降実験により調べられる。抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体のエピトープマッピングデータは、ＥＬＩＳＡとウエスタン分析により調べられて、ＰＳＣＡｖ．４タンパク質上のエピトープが判明する。免疫組織化学的な分析が、癌組織、及び細胞に関してこういった抗体を用いて行われる。
モノクローナル抗体は、プロテインＧセファロースクロマトグラフィーにより腹水、あるいは、ハイブリドーマ組織培養上清から精製され、ＰＢＳに対して透析された後、フィルター滅菌されて、−２０℃で保存される。タンパク質の検出は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）により行われる。治療用モノクローナル抗体、あるいは、個々のモノクローナル抗体を混ぜた混合物が調製されて、ＰＣ３、ＵＭ-ＵＣ３、ＣａＫｉ、及び、Ａ４２７腫瘍異種移植片を皮下、あるいは、正位に注入したマウスを処置するのに使われる。
株化細胞及び異種移植片
ＬＡＰＣ-９異種移植片は、野生型のアンドロゲン受容体を発現し、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を生産しており、週齢が６週から８週間の雄のＩＣＲ−重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Taconic Farms）の皮下に套管針により植え付けられる（Craft, N., et al., 1999, Cancer Res. 59:5030-5036）。ＡＧＳ-Ｋ３、及び、ＡＧＳ-Ｋ６腎臓異種移植片も、また、皮下移植によって、週齢が６週から８週間のＳＣＩＤマウスに植え付けられる。腫瘍細胞の一細胞懸濁液は、Ｃｒａｆｔらに述べられたようにして調製される。
繊維芽株化細胞ＮＩＨ３Ｔ３と同様、癌細胞はＰＣ３、ＵＭ-ＵＣ３、及びＰＡＮＣ１株化細胞に系統化される（American Type Culture Collection）。前立腺癌株化細胞ＰＣ３は、Ｌグルタミンと１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩで維持され、膀胱癌と膵臓癌のそれぞれ株化細胞であるＵＭ-ＵＣ３とＰＡＮＣ１は、Ｌグルタミンと１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで維持される。ＰＣ３-ＰＳＣＡｖ．４、ＵＭ-ＵＣ３-ＰＳＣＡｖ．４、ＰＡＮＣ１-ＰＳＣＡｖ．４、及び、３Ｔ３-ＰＳＣＡｖ．４細胞集団は、文献（Hubert, R.S., et al., Proc Natl. Acad. Sci U S A, 1999. 96(25): 14523）に述べられたとおりに、レトロウイルス遺伝子導入により作られる。
異種移植マウスモデル
皮下の癌は、雄のＳＣＩＤマウスの右脇腹にマトリゲルと１：１の割合で混ぜた２×１０６個の癌細胞を注入することにより作られる（共同研究）。腫瘍形成に対する抗体の有効性を調べるために、抗体の注入は腫瘍細胞の注入と同じ日に開始される。コントロールとして、マウスには精製したマウスＩｇＧ（ＩＣＮ）とＰＢＳも注入される；あるいは、ヒト細胞中には発現していない関連性の無い抗原を認識する精製されたモノクローナル抗体が注入される。予備的な研究では、腫瘍の成長に関しては、マウスＩｇＧとＰＢＳの間では違いが見出されない。腫瘍の大きさは、ノギスで測って決められる。腫瘍の体積は、長さ×幅×高さで計算されて求められる。直径が１．５ｃｍよりも大きな皮下腫瘍を有するようになったマウスは屠殺される。
正位置への注入は、ケタミン／キシラジンによる麻酔下で行われる。正位前立腺の研究に関しては、膀胱と精嚢を露出するために腹筋を介して切開が行われる。それから、膀胱と精嚢は、その背側の前立腺を露出するための切開で摘出される。マトリゲルと混ぜた１０μＬのＬＡＰＣ-９細胞（５×１０５）が、各背側葉に注入される。腫瘍の成長をモニターするために、ＰＳＡレベルを決めるための週単位での採血がマウスに行われる。正位膵臓モデルに関しては、乳房組織を露出するように腹筋を介した切開が行われて、膵臓癌細胞の一細胞浮遊液が乳房に注入される。正位膀胱モデルに関しては、ＡＧＳ-Ｂ１膀胱癌組織が膀胱壁上に癒着させられる。腫瘍移植の後に、マウスは、注入される抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体、あるいは、コントロール用のモノクローナル抗体を用いた適切な処置のためにいくつかのグループに分けられる。腫瘍の成長をモニターするために、マウスの触診と、ｈＣＧレベルの測定のための週単位での採血が行われる。
ＰＳＣＡｖ．４を発現している癌異種移植腫瘍の成長の抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体による阻害
腫瘍形成に対する抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体の効果は、株化細胞（例えば、ＰＣ３、ＵＭ-ＵＣ３、ＰＡＮＣ１、及び３Ｔ３）と患者から得られた腫瘍正位モデルを用いて調べられる。皮下注射腫瘍も出ると比較するために、正位モデルでは、マウスの臓器に直接腫瘍細胞が注入されなくてはならない。その結果、局所的な腫瘍の成長、異なる部位への転移の発生、マウスの健康の悪化、及び、それに続く死亡が生じる（Saffran, D., et al., PNAS supra）。こういった特質により、ヒト疾患の進行に関するより再現された正位モデルが得られ、臨床的に関連のあるエンドポイントへのモノクローナル抗体の治療効果を理解することが可能となる。
正位癌モデルの大きな優位性は、転移の発生を調べることができるということである。定着した正位腫瘍を有するマウスにおける転移の発生は、前立腺癌に対する抗ＣＫ２０のような、腫瘍特異的細胞表面タンパク質に対する抗体を使った、肺部位におけるＩＨＣ分析により調べられる（Lin S et al, Cancer Detect Prev. 2001;25:202）。
もうひとつの異種移植癌モデルの優位性は、新生毛細血管形成と腫瘍起因性血管形成を調べることができるということである。腫瘍の成長は、部分的には新しい血管の発生に依存している。毛細血管系と血流ネットワークの形成は宿主由来のものであるが、新生脈管構造の形成開始と構造は異種移植腫瘍によって制御される（Davidoff AM et al, Clin Cancer Res. 2001;7:2870; Solesvik O et al,, Eur. J Cancer Clin Oncol. 1984, 20:1295）。新血管新生に対する抗体や低分子の効果は、例えば、腫瘍組織とその周辺微小環境のＩＨＣ分析のような、技術的には既知の手法に従って調べられる。
定着した正位腫瘍を有するマウスに、４週間に渡って１０００μｇの抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体とＰＢＳの注射が施される。両方のグループのマウスによって、高生体内総量の腫瘍を確立し、マウスの肺における高頻度の転移形成を確保することができる。それから、マウスは屠殺されて、その膀胱、肝臓、骨組織、及び、肺における腫瘍細胞の有無がＩＨＣ分析により調べられる。これらの研究により、抗ＰＳＣＡｖ．４抗体の、異種移植マウスモデルにおける前立腺癌の発生と進行に対するひろい抗腫瘍効果が示される。抗ＰＳＣＡｖ．４抗体は、既に定着した腫瘍の成長を遅らせて、治療されたマウスの生存期間を延ばすだけでなく、癌の腫瘍形成を阻害する。さらに、抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体は、腫瘍の生体内総量が多大な場合でさえも、局所的な前立腺癌の別の部位への拡大に対して驚くべき阻害効果を発揮する。このように、抗ＰＳＣＡｖ．４モノクローナル抗体は、主要な臨床的に適切なエンドポイント（腫瘍の成長）、生存期間の延長、及び、健康に対して有効である。
実施例３９：ヒトにおける抗ＰＳＣＡ抗体の治療、及び診断のための使用
抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、ヒトにおいては、安全かつ効果的に、診断、予防、予後、及び／又は治療の目的で使われる。抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体を用いた、癌組織、及び癌異種移植のウエスタンブロット、及び免疫組織化学的な分析は、癌においては強度で広範囲の染色を示すが、正常組織においては、有為に弱い、あるいは、検出されない程度の染色しか示さない。癌と転移性疾患におけるＰＳＣＡの検出は、診断における、及び／又は予後の指示薬として、このモノクローナル抗体が有用であることを示している。抗ＰＳＣＡ抗体は、それゆえ、疾患が疑われる患者において癌を検出するために、腎臓生検標本の免疫組織化学のような診断法において使用される。
フローサイトメトリーにより確証されるように、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、特異的に癌細胞に結合する。このように、抗ＰＳＣＡ抗体は、ＰＳＣＡの発現を示す局所的な転移性の癌の検出のために、たとえば、放射免疫シンチグラフィーや放射免疫療法のような（例えば、Potamianos S., et. al. Anticancer Res 20(2A):925-948 (2000)を参照）、診断用全身イメージング法において使用される。例えば、アルカリホスホジエステラーゼＢ１０において見られるような（Meerson, N. R., Hepatology 27:563-568 (1998)）、細胞外環境への、ＰＳＣＡの細胞外ドメインの分断、あるいは、放出により、疾患が疑われる患者の血清、及び／又は、尿中のＰＳＣＡの診断のための検出が抗ＰＳＣＡ抗体により可能となる。
ＰＳＣＡに特異的に結合する抗ＰＳＣＡ抗体は、ＰＳＣＡを発現している癌を処置するための治療応用において使用される。抗ＰＳＣＡ抗体は、なにもくっつけない様式で使われることもあるし、また、プロドラッグ、酵素、あるいは、放射性同位体のような、技術的にはよく知られた様々な治療、あるいは、イメージングのための様式のひとつに抗体がくっついたような接合型として使われることもある。前臨床試験においては、非接合型、及び、接合型抗ＰＳＣＡ抗体の、ＳＣＩＤマウス腫瘍異種移植モデル、例えば、腎臓癌モデルＡＧＳ-Ｋ３やＡＧＳ-Ｋ６（標題「生体内におけるＰＳＣＡモノクローナル抗体に媒介される腫瘍の抑制」の実施例を参照）での癌予防、及び、成長阻害の有効性が調べられる。接合型、及び、非接合型抗ＰＳＣＡ抗体のいずれもが、単独でか、あるいは、以下の例で述べられるような他の治療と組み合わせて、ヒト臨床試験における治療様式として使用される。
実施例４０：生体内におけるヒト抗ＰＳＣＡ抗体の使用によるヒトの癌の治療と診断に関するヒト臨床試験
ＰＳＣＡ上のエピトープを認識する抗体は、本発明に従って使用され、さらに表１に挙げられているような特定の癌の治療においても使われる。ＰＳＣＡの発現を含む、多数の因子に基づいて、表１に挙げられているような腫瘍が、ただちに優先的な適応症となる。これらの適応症のそれぞれを結びつけることによって、三つの臨床応用がうまく遂行される。
Ｉ．）補助的療法：補助的療法においては、化学療法剤、又は抗悪性腫瘍薬及び／又は放射線療法との組み合わせによって、患者は抗ＰＳＣＡ抗体で治療される。例えば表１に挙げられているような、主要な癌標的は、標準的な初回治療（ファーストライン治療）と第二次治療（セカンドライン治療）に抗ＰＳＣＡ抗体を加える事により、標準的な手順で治療される。手順は、標準の化学療法の通常の投薬量を減らすことができるだけでなく、腫瘍の大きさが小さくなるかどうかによって評価されるような有効性をもつように設計される。このように投薬量が減る事によって、化学療法剤の用量関連毒性が減り、付加的、及び／又は、長期的治療が可能となる。抗ＰＳＣＡ抗体は、化学療法剤、あるいは、抗悪性腫瘍薬、アドリアマイシン（進行性前立腺癌）、シスプラチン（進行性頭部癌、頸部癌、及び、肺癌）、タキソール（乳癌）、及びドキソルビシン（前臨床）などと組み合わせた、いくつかの補助的臨床試験において使われる。
ＩＩ．）単独治療：腫瘍の単独治療における抗ＰＳＣＡ抗体の使用に関連して、化学療法剤、又は抗悪性腫瘍薬無しに、抗体が患者に投与される。ひとつの例では、単独治療は、広範な転移疾患を伴う最終段階の癌患者において臨床的に行われる。患者は、ある程度の病状の安定化を示す。臨床試験は、癌性腫瘍を伴う難治性患者における有効性を示している。
ＩＩＩ．）造影剤：放射性核種（例えば、ヨウ素Ｉ１３１、又はイットリウムＹ９０）を抗ＰＳＣＡ抗体に結合させることによって、診断薬、及び／又は造影剤として放射性同位元素標識抗体が使われる。こういった役割では、この標識化抗体は、ＰＳＣＡを発現している細胞の転移性病変だけでなく、いずれの固形癌にも局在化する。造影剤としての抗ＰＳＣＡ抗体の使用と組み合わせて、固形癌の外科的治療の付属物として、すなわち、どのような腫瘍が残っている、及び／又は、回復したかを確かめるため、術後の追跡調査だけでなく、手術前のスクリーニングにおいても、抗体が使われる。ひとつの例では、１１１Ｉｎ標識された抗ＰＳＣＡ抗体が、ＰＳＣＡを発現している癌を有する患者におけるフェーズＩヒト臨床試験において、造影剤として使われる（類推によって、例えば、Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)を参照）。患者は標準的な前方、及び後方γカメラにより追跡調査される。この結果は一次病巣と転移病巣が同定されることを示す。
投与量と投与経路
当該技術における通常の専門家に理解されているように、投薬量の考慮はその診療における類似の製品との比較により行うことができる。従って、抗ＰＳＣＡ抗体は、例えば、安全性研究に関して使用されるような最少用量をふまえて、５〜４００ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量で投与することができる。標的分子に対する、既知の抗体の親和性に比較した抗ＰＳＣＡ抗体の親和性が、当該技術における専門家によって、類似の投与計画を決めるために使われるひとつの限定要素である。さらに、完全なヒト抗体である抗ＰＳＣＡ抗体は、そのキメラ抗体と比較して、排除されるスピードが遅く、その結果、このような完全なヒト抗ＰＳＣＡ抗体の患者への投与量はより少なくすることができ、その範囲は５０から３００ｍｇ／ｍ２の範囲となるであろうが、それでも、まだ有効性を保持している。ｍｇ／ｍ２という表現での投与量は、これまでのｍｇ／ｋｇという表現での投与量の測定とは対照的に、表面積に基づく測定量であり、子供から大人まですべての大きさの患者を含むように設計された、投薬の便利な測定値である。
三つの異なる送達に関する研究方法が抗ＰＳＣＡ抗体の送達に関しては有用である。従来の静脈内送達は、多くの腫瘍に対する標準的な運搬技術の一つである。しかしながら、卵巣癌、胆管癌、他の種類の管の癌、等のような腹膜腔における腫瘍に関連して、腹腔内投与が、腫瘍に対する抗体の高適用を可能とし、抗体の排除を最低限に抑えるのに、有利であることが分かるである。同じようなやり方においては、ある固形癌は、局所灌流に適当な脈管構造を有している。局所灌流は腫瘍のある部位への高い抗体の用量を可能とし、個体の短期間での体外排除を最低限にする。
臨床開発計画（ＣＤＰ）
概観：ＣＤＰでは引き続き、補助的療法、単独療法、及び造影剤としての使用に関連した抗ＰＳＣＡ抗体を用いた治療法が開発される。治験では、最初に、安全性が示され、その後に、反復投与の有効性が確認される。治験では、標準的な化学療法と、標準療法に抗ＰＳＣＡ抗体を加えたものの比較をオープンラベルで行う。認知されるように、被験者の登録に関して使用できる基準のひとつは、生検により決定されるような、腫瘍におけるＰＳＣＡの発現量である。
接種に基づく治療用のどのようなタンパク質、あるいは、抗体に関しても、安全性の問題は主として以下の項目に関連する：（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち、低血圧、発熱、震え、寒気；（ｉｉ）使用素材に対する免疫原性応答の進行（すなわち、抗体療法に対する患者のヒト抗体の生成、あるいは、ＨＡＨＡ応答）；（ｉｉｉ）ＰＳＣＡを発現している正常細胞に対する細胞傷害性。標準的な試験と追跡は、これらの安全性項目のそれぞれをモニターするのに使われる。抗ＰＳＣＡ抗体は、ヒトへの投与に関しては安全であることが分かる。
実施例４１：ヒト抗ＰＳＣＡ抗体と化学療法剤による補助的療法のヒト臨床試験
フェーズＩのヒト臨床試験は、例えば、表１に挙げられている組織の癌のような、固形癌の治療に関連したヒト抗ＰＳＣＡ抗体の６回の静脈投与用量の安全性を調べることから始められる。この研究においては、ここに定義したような抗悪性腫瘍薬、又は化学療法薬（例えば、限定されるものではないが、シスプラチン、トポテカン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソール等）に対する補助的療法として使用されたときの、抗ＰＳＣＡ抗体の一回の投与量の安全性が評価される。臨床試験の計画には、治療の過程を通じて、以下のスケジュールに従って、おおよそ約２５ｍｇ／ｍ２〜約２７５ｍｇ／ｍ２まで抗体の投薬量を増やした、抗ＰＳＣＡ抗体の１回分の投与量６回分の投薬が含まれる：
Figure 2007525196
被験者は、抗体と化学療法剤の投与の各々の後、１週間しっかりと健康状態を監視される。特に、被験者は上で述べた安全性項目に関して調べられる：（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち、低血圧、発熱、震え、寒気；（ｉｉ）使用素材に対する免疫原性応答の進行（すなわち、抗体療法に対する患者のヒト抗体の生成、あるいは、ＨＡＨＡ応答）；（ｉｉｉ）ＰＳＣＡを発現している正常細胞に対する細胞傷害性。標準的な試験と追跡は、これらの安全性項目のそれぞれをモニターするのに使われる。被験者は、また、臨床的な成果に関しても調べられる。特に、ＭＲＩやその他の画像診断により明示されるような腫瘍の大きさの縮小に関して調べられる。
抗ＰＳＣＡ抗体は、安全で有効であることが示される。フェーズＩＩ臨床試験ではこの効力が確証され、至適投与量がより正確に決められる。
実施例４２：ヒト臨床試験：ヒト抗ＰＳＣＡ抗体による単独療法
抗ＰＳＣＡ抗体は、上で議論した補助的療法に関しては安全で、フェーズＩＩヒト臨床試験では、単独療法の有効性と至適投与量が確かめられる。そういった臨床試験が行われて、被験者が抗ＰＳＣＡ抗体の投与は受けるけれども、化学療法薬は受けないということをのぞいては、上述の補助的療法臨床試験と同様の安全性と成果の分析を伴う。
実施例４３：ヒト臨床試験：抗ＰＳＣＡ抗体による画像診断
今一度、上で議論した補助的療法は、上で議論した安全性基準内で安全であるので、ヒト臨床試験は抗ＰＳＣＡ抗体の画像診断薬としての使用に関して実施される。その手順は、Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)に述べられているような、技術的に述べられている方法と実質上は同じやり方で計画される。抗体は、診断用の様式で用いられたときには、安全、かつ、効果的であることが分かる。
実施例４４：ＰＳＣＡｖ．４と既知の配列との相同性比較
ＰＳＣＡｖ．４遺伝子は１８９アミノ酸のタンパク質をコードしている。ヒトＰＳＣＡｖ．４タンパク質は、ヒト前立腺幹細胞抗原（ｇｉ２７４８２１６０）と高い相同性を示し、タンパク質レベルでは両者は９８％の相同性を示す（図４）。ＰＳＣＡｖ．４のマウス相同体は未同定である。
ＰＳＣＡｖ．４タンパク質にはいつくかの変異種が存在する（図１１）。これらは、８個のＳＮＰｓと、スプライシング変異体を含み、ＰＳＣＡｖ．３と呼ばれている。ＰＳＣＡｖ．３タンパク質はＰＳＣＡｖ．４のＣ末端領域を包有した、ＰＳＣＡｖ．４の９４番目から１８９番目のアミノ酸に相当するものである。トポロジー予測プログラムを使用したバイオインフォマティックス解析により、ＰＳＣＡｖ．４は膜貫通ドメインを持たない可溶性タンパク質であることが示されている（表５０）。
モチーフ解析により、ＰＳＣＡｖ．４タンパク質内には二つのタンパク質機能モチーフの存在が明らかにされた（表５０）。つまり、カドヘリンモチーフとグラヌリンドメインが同定された。カドヘリンはカルシウム依存性細胞接着分子のファミリーに属する。それらは、免疫グロブリン様ドメインを有する１回膜貫通タンパク質であり、細胞接着と細胞の局在化に関与している（Shan et al, Biophys Chem 1999, 82:157）。例えば、カドヘリンは、リンパ球の上皮細胞表面への組織特異的細胞接着を媒介する。カドヘリンは、組織形態形成、細胞接着、細胞分化、細胞遊走、及び、腫瘍転移において機能していることが示されている（Yap AS, Kovacs EM. J Biol Chem 2003, 160:11; Vestweber D. Curr Opin Cell Biol 2002, 14:587; Bloom et al, Mol Biol Cell. 1999, 10:1521; Brodt P. Cancer Met Rev 1991, 10:23）。グラヌリン、あるいは、エピテリンは本来は細胞培養上清から生成された成長因子であり、細胞増殖を亢進することが示されていいる（Xu, S. Q. et al, J. Biol. Chem. 1998, 273:20078）。グラヌリンは、グリア細胞腫や腎癌を含むいくつかの癌において増大したレベルで発現している（Liau L et al Cancer Res. 60:1353, Donald, C. D et al, Anticancer Res. 21:3739）。
ＰＳＣＡｖ．４で見出されたモチーフは、ＰＳＣＡｖ．４が腫瘍の成長と、細胞増殖、細胞接着、細胞間連絡、浸潤、及び転移を制御することによる進展に関与できることを示している。
従って、ＰＳＣＡｖ．４が腫瘍の確立、腫瘍の成長、腫瘍の浸潤、生着、及び細胞シグナル伝達の調節因子として機能しているときには、ＰＳＣＡｖ．４は治療、診断、予後、及び／又は予防目的のために使用される。加えて、ＰＳＣＡｖ．４のスプライシング変異体、又はＳＮＰのような分子が表１に挙げられているような癌組織において発現している場合には、それらが治療、診断、予後、及び／又は予防の目的のために使われる。
実施例４５：転写調節
配列内のカドヘリンドメインの存在に伴うＰＳＣＡｖ．４のミトコンドリアへの局在は、ＰＳＣＡｖ．４が真核細胞遺伝子の転写調節を修飾していることを示している。遺伝子発現の調節は、例えば、ＰＳＣＡｖ．４を発現しているか、又は欠いている細胞における遺伝子発現の研究により、確認される。この目的のために、２種類の実験が行われる。
最初の一連の実験では、親細胞とＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞のそれぞれからＲＮＡを抽出し、市販されているジーンアレイ（Clontech）（Smid-Koopman E et al. Br J Cancer. 2000. 83:246）に対してハイブリダイゼーションを行う。ＦＢＳ、アンドロゲン、及び、成長因子で処理した細胞はもちろん、休止細胞も比較される。発現が異なる遺伝子が、技術的には既知の手法に従って同定される。発現が異なる遺伝子は、それによって、生物学的経路上にマップされる（Chen K et al. Thyroid. 2001. 11:41.）。
二つ目の一連の実験においては、特異的な転写経路の活性化が、ＮＦｋＢ-ｌｕｃ、ＳＲＥ-ｌｕｃ、ＥＬＫ１-ｌｕｃ、ＡＲＥ-ｌｕｃ、ｐ５３-ｌｕｃ、及び、ＣＲＥ-ｌｕｃを含む、市販（Stratagene）のルシフェラーゼレポータコンストラクトを使って評価される。これらの転写レポーターは、特徴が良く解っているシグナル伝達経路の下流に位置する既知の転写因子の保存結合部位を含んでおり、その経路の活性化の有無の確認、及び、経路の活性化が正と負のどちらの調節を受けているかのスクリーニングのための適当なツールとなっている。
このように、ＰＳＣＡｖ．４は、遺伝子調節においてひとつの役割を果たしており、そのために、それは、診断、予後、予防、及び／又は治療目的の標的として使われる。
実施例４６：潜在的なシグナル伝達経路の同定と確認
哺乳動物のタンパク質の多くは、シグナル伝達分子と相互作用して、シグナル伝達経路の調節に関与していることが報告されている（J Neurochem. 2001; 76:217-223）。カドヘリン分子は、Ｃｄｃ４２、及び、Ｒｈｏシグナリングに関係している（Kouklis J Biol Chem. 2003, 278: 16230）。免疫沈降技術とウエスタンブロッティング技術を使って、ＰＳＣＡｖ．４と相互作用してシグナル伝達現象を媒介するタンパク質が同定される。癌生物学において役割を担っていることが知られているいくつかの経路はＰＳＣＡｖ．４により調節されることもありえる。そこには、ＥＲＫ、ｐ３８、などのような分裂促進／生着カスケードはもちろん、ＰＩ３ＫやＡＫＴ、他、のようなリン脂質経路、ＦＡＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ-１、カテニン、等を含む遊走経路も含まれる（Cell Growth Differ. 2000, 11:279; J Biol Chem. 1999, 274:801; Oncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913．）。ＰＳＣＡｖ．４が充分に発現して特異的なシグナル伝達経路を制御するのか、あるいは、そうではなくて、休止癌細胞においては不活性なのかを決めるために、シグナル伝達カスケードの活性化におけるＰＳＣＡｖ．４の影響がＰＡ-１、Ｐａｎｃ１、及び、Ｄａｕｄｉのような癌細胞株で調べられる。ＰＳＣＡｖ．４を安定に発現している癌細胞、あるいは、新しい細胞が成長因子、ＦＢＳ、あるいは、その他の活性化分子で刺激される。全細胞溶解物がウエスタンブロッティングで調べられる。
ＰＳＣＡｖ．４が、直接的にしろ、間接的にしろ、既知の細胞内シグナル伝達経路を活性化していることを確認するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）による転写レポーターアッセイが各遺伝子を発現している細胞に関して行われる。これらの転写レポーターには、特徴がよく調べられているシグナル伝達系の下流に存在する既知の転写因子の保存結合部位を含んでいる。レポーターと、それらの関連した転写因子、シグナル伝達経路、及び、活性化のための刺激は以下に挙げられる。
１．ＮＦｋＢ-ｌｕｃ、ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ-リン酸化酵素／ＳＡＰＫ；生育／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ-ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；生育／分化
３．ＡＰ-１-ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；生育／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ-ｌｕｃ、アンドロゲン受容体；ステロイド／ＭＡＰＫ；生育、分化、アポトーシス
５．ｐ５３-ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；生育、分化、アポトーシス
６．ＣＲＥ-ｌｕｃ，ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；生育、分化、アポトーシス
７．ＴＣＦ-ｌｕｃ、ＴＣＦ／Ｌｅｆ；β−ｃａｔｅｎｉｎ；接着／浸潤
遺伝子に媒介される効果は、細胞内で、ｍＲＮＡの発現を示すことで評価することができる。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、脂質媒介形質移入（ＴＦＸ-５０，Ｐｒｏｍｅｇａ）により導入することができる。ルシフェラーゼの活性は、関連する転写活性の指標であり、ルシフェリン基質と細胞抽出物をインキュベーションすることで測られ、この反応の発光はルミノメーターでモニターされる。
ＰＳＣＡｖ．４により活性化されるシグナル伝達経路はマッピングされて、治療標的の同定と確認のために使われる。ＰＳＣＡｖ．４が細胞情報伝達に関与しているときには、ＰＳＣＡｖ．４が診断、予後、予防、及び／又は、治療目的の標的として使用される。
実施例４７：腫瘍の進行における関与
細胞増殖、接着、及び、タンパク質相互作用におけるグラヌリンモチーフとカドヘリンモチーフの役割に基づき、ＰＳＣＡｖ．４遺伝子は、癌細胞の増殖、接着、浸潤、及び、形質転換に寄与しえる。腫瘍の増殖におけるＰＳＣＡｖ．４の役割は、ＰＳＣＡｖ．４を安定に発現するように設計されたＮＩＨ３Ｔ３細胞だけでなく、前立腺株化細胞を含む、様々な初代、あるいは、形質移入細胞株で確認される。ＰＳＣＡｖ．４を欠く親細胞と、ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞の細胞増殖が、詳細に記述されている増殖アッセイ（Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000;44:61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7:288）を使って評価される。
形質転換の過程におけるＰＳＣＡｖ．４の役割を確認するために、コロニー形成アッセイにおけるＰＳＣＡｖ．４の効力が調べられる。厳しい条件下、及び、より寛容な条件下での軟寒天アッセイ（Song Z. et al. Cancer Res. 2000;60:6730）を使って、ＰＳＣＡｖ．４を欠く親ＮＩＨ-３Ｔ３細胞が、ＰＳＣＡ ｖ．４を発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞と比べられる。
癌細胞の浸潤と転移におけるＰＳＣＡｖ．４の役割を確認するために、よく確立されたアッセイ法、例えば、トランスウエルインサートシステムアッセイ（Becton Dickinson） （Cancer Res. 1999; 59:6010）が使われる。前立腺、膵臓、腎臓のＰＳＣＡｖ．４を欠いた株化細胞を含むコントロール細胞が、ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞と比較される。細胞に蛍光色素であるカルセインが添加されて、基底膜類似物で被覆されたトランスウエルインサートの上層ウエルに蒔かれる。浸潤は、総細胞数の蛍光に比較したときの、下層チャンバー内の細胞の蛍光により決定される。
ＰＳＣＡｖ．４は、また、細胞周期とアポトーシスにおいても役割を担うことができる。親細胞とＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞が、充分に確立されたＢｒｄＵアッセイ（Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136:247）を使って、細胞周期の制御における違いに関して比較される。簡単に言うと、細胞を至適（充分な血清）、及び、制限（低血清）条件下で培養し、ＢｒｄＵで標識し、抗ＢｒｄＵ抗体とヨウ化プロピジウムで染色する。細胞の、Ｇ１、Ｓ、及びＧ２Ｍフェーズへの移行が調べられる。あるいは、アポトーシスにおけるストレスの効果が、正常前立腺細胞、及び前立腺癌細胞を含む、コントロール親細胞とＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞において評価される。設計された細胞と親細胞は、エトポシドやタキソール、等のような様々な化学療法剤と、シクロヘキシミドのような様々なタンパク質合成阻害剤で処理される。細胞は、アネキシンＶ-ＦＩＴＣで染色された後、ＦＡＣＳ解析により細胞死が測られる。ＰＳＣＡｖ．４による細胞死の調節は、腫瘍の進行と荷重（腫瘍の存在による生存能力の低下）の制御において決定的な役割を果たすことができる。
細胞増殖、形質転換、浸潤、あるいは、アポトーシスにおいて、ＰＳＣＡｖ．４がなんらかの役割を担っている場合には、ＰＳＣＡｖ．４は、診断、予後、予防、及び／又は治療目的の標的として使用される。
実施例４８：血管新生への関与
血管新生、あるいは、新しい毛細血管の形成は、腫瘍の生育に必要である（Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139:441）。組織培養アッセイ血管内皮細胞管形成、及び、組織培養アッセイ血管内皮細胞増殖の組織培養のような、試験管内、及び、生体内で血管新生を測るためにいくつかのアッセイ法が開発された。試験管内新血管新生だけではなくて、こういったアッセイを使うことによって、ＰＳＣＡｖ．４の血管新生の亢進、あるいは、阻害が確認される。
例えば、ＰＳＣＡｖ．４を発現するように設計された血管内皮細胞が、管形成と増殖アッセイによって評価される。ＰＳＣＡｖ．４の効果は、さらに、動物モデルを使って生体内で確認される。例えば、ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞も欠いている細胞も、免疫無防備状態のマウスの皮下に移植される。血管内皮細胞の遊走と血管形成は、免疫組織化学的手法を使って５日から１５日後に評価される。ＰＳＣＡｖ．４は血管新生に影響を及ぼし、ＰＳＣＡｖ．４は診断、予後、予防、及び／又は、治療目的の標的として使うことができる。
実施例４９：タンパク質−タンパク質相互作用における関与
カドヘリンモチーフは、他のタンパク質との相互作用を仲介することが示された。イーストツーハイブリッドシステムに加えて、免疫沈降技術を使って、いくつかのＰＳＣＡｖ．４と結合するタンパク質が同定される。ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞から得られた免疫沈降物と、ＰＳＣＡｖ．４を欠いた細胞から得られたものとを比較して特異的なタンパク質−タンパク質結合を調べる。
ＰＳＣＡｖ．４が、核タンパク質、転写因子、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素等のエフェクター分子にどの程度結合しているのかを確認するために、研究が行われる。刺激を与えない／休止細胞と、サイトカイン、成長因子、アンドロゲン、及び抗インテグリン抗体のような上皮細胞活性化因子で処理した細胞を比較する研究だけでなく、ＰＳＣＡｖ．４陽性とＰＳＣＡｖ．４陰性の細胞を比較する研究も特有の相互作用を明らかにする。
加えて、タンパク質−タンパク質相互作用は、イーストツーハイブリッド実験法を使って確認される（Curr Opin Chem Biol. 1999, 3:64）。転写因子の活性化ドメインと融合したタンパク質のライブラリーをのせたベクターが、ＰＳＣＡｖ．４−ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質とレポーターコンストラクトを発現しているイーストに導入される。タンパク質−タンパク質相互作用は、比色レポーター活性により検出される。エフェクター分子と転写因子の特異的な会合は、専門家にＰＳＣＡｖ．４がどう活動しているのかを示し、それによって、癌の治療、予後、予防、及び／又は、診断のための標的を同定する。このアッセイ、及び同様のアッセイは、また、ＰＳＣＡｖ．４と相互作用する低分子の同定とスクリーニングのためにも使われる。
このように、ＰＳＣＡｖ．４はタンパク質、及び低分子に結合することが分かる。従って、ＰＳＣＡｖ．４とそれに結合するタンパク質や低分子は、診断、予後、予防、及び／又は治療目的で使われる。
実施例５０：細胞−細胞情報交換におけるＰＳＣＡｖ．４の関与
細胞−細胞情報交換は、臓器の整合性と恒常性を保つのに必須であるが、腫瘍の形成と進行が進んでいる間は、その両方ともが調節不全となってしまう。ＰＳＣＡｖ．４分子内に、細胞相互作用、及び、細胞−細胞接着に関与していることが知られているモチーフのひとつであるカドヘリンモチーフが存在することに基づき、ＰＳＣＡｖ．４は細胞情報交換を制御することができる。細胞間情報交換はふたつのタイプのアッセイ法を使って測ることができる（J. Biol. Chem. 2000, 275:25207）。最初のアッセイ法においては、蛍光色素を負荷された細胞が非標識レシピエント細胞の存在下で培養され、その細胞集団が蛍光顕微鏡下で調べられる。定性的アッセイでは、隣接する細胞間での色素の交換が測られる。ふたつめのアッセイ系においては、ドナー、及び、レシピエント細胞集団は上のように処理されてから、ＦＡＣＳ解析によりレシピエント細胞集団の定量的な測定が行われる。これら二つのアッセイ系を使って、ＰＳＣＡｖ．４を発現している細胞はＰＳＣＡｖ．４を発現していないコントロールと比較されて、ＰＳＣＡｖ．４が細胞情報交換を亢進することが分かる。ＰＳＣＡｖ．４により介在される細胞−細胞情報交換を調節するような低分子、及び／又は、抗体は、ＰＳＣＡｖ．４を発現している癌の治療のために使われる。ＰＳＣＡｖ．４が細胞−細胞情報交換や低分子輸送において機能している場合には、ＰＳＣＡｖ．４は、診断、予後、予防、及び／又は治療目的のための標的、あるいは、マーカーとして、使われる。
本出願を通じて、様々なウエブサイトのデータ内容、出版物、特許出願、及び、特許が参照事項に挙げられる（ウエブサイトは、Uniform Resource Locator、URL、ワールドワイドウエブ上のアドレスにて参照される）。これらの参照物の各々の開示内容は、ここに参照されることで、全体としてここに組み込まれる。加えて、本出願は、１９９９年７月２０日提出の米国特許出願０９／３５９，３２６；１９９９年５月２５日提出の米国特許出願０９／３０８，５０３；１９９９年２月１７日提出の米国特許出願０９／２５１，８３５；１９９８年１２月２日提出の米国特許出願０９／２０３，９３９；１９９８年３月１０日提出の米国特許出願０９／０３８，２６１；１９９７年３月１０日提出の米国特許出願０８／８１４，２７９；１９９８年１月１２日提出の米国特許出願６０／０７１，１４１；１９９８年２月１３日提出の米国特許出願６０／０７４，６７５；１９９９年３月１６日提出の米国特許出願６０／１２４，６５８；１９９９年２月１７日提出の米国特許出願６０／１２０，５３６；及び１９９８１２月２１日提出の６０／１１３，２３０に関連する。上述の出願の内容の全てが、本出願内に参照によって全て取り込まれる。
本発明は、ここで開示される実施例の範囲に限定されるものではなく、これらの実施例は本発明の個々の側面のひとつの例証として言及されており、機能的に等価なものはすべて本発明の範囲に含まれる。ここで述べられたものに加えて、本発明のモデルや方法に加えられる様々な改変が、前記の記述と教示から、当該技術における専門家達には明白なものであろうし、そういったものは同様に本発明の範囲に入るものと解釈される。そのような改変や、その他の具体化は、本発明の正当な範囲と精神からはずれては、実行できないものである。
表
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意図的欠落（取下げ）。 ＰＳＣＡ変異体１（“ＰＳＣＡ ｖ．１”又は“ＰＳＣＡ変異体１”ということもある。）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ａに示す。開始メチオニンには下線を付した。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸１８〜３８９に及ぶ。 ＰＳＣＡ変異体２（“ＰＳＣＡ ｖ．２”ということもある。）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｂに示す。開始メチオニンのコドンには下線を付した。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸５６〜４２７に及ぶ。 ＰＳＣＡ変異体３（“ＰＳＣＡ ｖ．３”ということもある。）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｃに示す。開始メチオニンのコドンには下線を付した。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸４２３〜７０７に及ぶ。 ＰＳＣＡ変異体４（“ＰＳＣＡ ｖ．４”ということもある。）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｄに示す。開始メチオニンのコドンには下線を付した。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸４２４〜９９３に及ぶ。 ＰＳＣＡ変異体５（“ＰＳＣＡ ｖ．５”ということもある。）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｅに示す。開始メチオニンのコドンには下線を付した。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸９１０〜１４７９に及ぶ。 ＰＳＣＡ変異体６（“ＰＳＣＡ ｖ．６”ということもある。）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｆに示す。開始メチオニンのコドンには下線を付した。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸８３〜４２７に及ぶ。 ＰＳＣＡ ｖ．２、ＰＳＣＡ ｖ．７〜ｖ．１８のＳＮＰ変異体。ＰＳＣＡ ｖ．７〜ｖ．１８タンパク質は、１２３個のアミノ酸を有する。変異体ＰＳＣＡ ｖ．７〜ｖ．１８は、ＰＳＣＡ ｖ．２と一ヌクレオチドの相違を有する変異体であり、ｖ．２と同じタンパク質をコードする。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、上述の図２Ａ〜図２Ｆに示した転写変異体（複数）の任意の組合せ及び何れか１つにも生じ得る。 ＰＳＣＡ ｖ．４、ＰＳＣＡ ｖ．１９〜ｖ．３０のＳＮＰ変異体。ＰＳＣＡ ｖ．１９〜ｖ．３０タンパク質は、１８９個のアミノ酸を有する。変異体ＰＳＣＡ ｖ．１９〜ｖ．３０は、ＰＳＣＡ ｖ．４と一ヌクレオチドの相違を有する変異体である。ＰＳＣＡ ｖ．９、ｖ．１０、ｖ．１１、ｖ．２４及びｖ．２５タンパク質は、ＰＳＣＡ ｖ．１と一アミノ酸だけ異なる。ＰＳＣＡ ｖ．２３、ｖ．２８、ｖ．２９及びｖ．３０は、ｖ．４と同じタンパク質をコードする。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、転写変異体ｖ．３及びｖ．４の任意の組合せ及び何れか１つにも生じ得る。 ＰＳＣＡ ｖ．１のアミノ酸配列を図３Ａに示す；構成アミノ酸１２３個。本書においては、ＰＳＣＡという場合、特に明示しない限り、その全ての変異体、例えば図２、図３、図１０、図１１及び図１２に示したもの等を含む。 ＰＳＣＡ ｖ．３のアミノ酸配列を図３Ｂに示す；構成アミノ酸９４個。 ＰＳＣＡ ｖ．４のアミノ酸配列を図３Ｃに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．６のアミノ酸配列を図３Ｄに示す；構成アミノ酸１１４個。 ＰＳＣＡ ｖ．１９のアミノ酸配列を図３Ｅに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．２０のアミノ酸配列を図３Ｆに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．２１のアミノ酸配列を図３Ｇに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．２２のアミノ酸配列を図３Ｈに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．２４のアミノ酸配列を図３Ｉに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．２５のアミノ酸配列を図３Ｊに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．２６のアミノ酸配列を図３Ｋに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．２７のアミノ酸配列を図３Ｌに示す；構成アミノ酸１８９個。 ＰＳＣＡ ｖ．４とヒト前立腺幹細胞抗原（ｇｉ ２７４８２１６０）の配列比較。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtscaleにおいてアクセスされるHopp及びWoodsの方法（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．１の親水性アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtscaleにおいてアクセスされるHopp及びWoodsの方法（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．３の親水性アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtscaleにおいてアクセスされるHopp及びWoodsの方法（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．４の親水性アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるKyte及びDoolittleの方法（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．１の疎水性親水性アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるKyte及びDoolittleの方法（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．３の疎水性親水性アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるKyte及びDoolittleの方法（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．４の疎水性親水性アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるJaninの方法（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．１のパーセント接触可能残基（Percent Accessible Residues）アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるJaninの方法（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．３のパーセント接触可能残基（Percent Accessible Residues）アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるJaninの方法（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．４のパーセント接触可能残基（Percent Accessible Residues）アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるBhaskaran及びPonnuswamyの方法（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．１の平均可動（屈曲）（Flexibility）アミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるBhaskaran及びPonnuswamyの方法（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．３の平均可動（屈曲）（Flexibility）アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるBhaskaran及びPonnuswamyの方法（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．４の平均可動（屈曲）（Flexibility）アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるDeleage及びRouxの方法（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．１のベータターンアミノ酸プロファイル（特性曲線）。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるDeleage及びRouxの方法（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．３のベータターンアミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverを介してワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたウェブサイトProtScaleにおいてアクセスされるDeleage及びRouxの方法（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定されたＰＳＣＡ ｖ．４のベータターンアミノ酸プロファイル。 ＰＳＣＡの転写変異体のエキソン組成。変異体ＰＳＣＡ ｖ．２、ｖ．３、ｖ．４及びｖ．５は、ｖ．１の転写変異体である。変異体ｖ．２は、ｖ．１より４７ｂｐだけ５’側に遡った部位から転写を開始した。変異体ｖ．３は、ｖ．２に対してより短いエキソン２を有した。変異体ｖ．４及びｖ．５は、代替的な第１のエキソンを有した。変異体ｖ．５は、ｖ．４と異なり、第２のイントロンを維持した。ヒトゲノムに存在し得るエキソンを順に並べたものは、一番下に図示されている。ポリＡテイルは図示しなかった。エキソンの末端は、ボックスの上方に示されている。ボックスの下方の丸括弧内の番号は、ＰＳＣＡ ｖ．２の番号に対応する。イントロン及びエキソンの長さは、比例的には図示されていない。 ＰＳＣＡのタンパク質変異体の模式的配列比較。タンパク質変異体はヌクレオチド変異体に対応する。ヌクレオチド変異体ＰＳＣＡ ｖ．２、ｖ．７〜ｖ．１８は、ｖ．１と同じタンパク質をコードした。変異体ｖ．５はｖ．４と同じタンパク質をコードし、タンパク質ｖ．３はｖ．４の一部であった。ヌクレオチド変異体ＰＳＣＡ ｖ．２、ｖ．３、ｖ．４及びｖ．５は、図１０に示したような、ｖ．１の転写変異体であった。ｖ．２にコドン変化を引き起こさないｖ．２のＳＮＰは、ｖ．３、ｖ．４及びｖ．５にはコドン変化を引き起こした。一アミノ酸差異は、ボックスの上方に示した。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．１と同じ配列を表す。ボックスの下方の番号はＰＳＣＡ ｖ．１に対応する。 ＰＳＣＡ ｖ．４のＳＮＰ変異体から翻訳されたタンパク質変異体の模式的配列比較。タンパク質変異体はヌクレオチド変異体に対応する。ヌクレオチド変異体ＰＳＣＡ ｖ．２３、ｖ．２８、ｖ．２９及びｖ．３０は、ｖ．４と同じタンパク質をコードした。ｖ．４に一アミノ酸変異を引き起こしたｖ．４のＳＮＰは、ｖ．５にも一アミノ酸変異を引き起こし、かつアミノ酸９６〜１８９の間に生じる場合、ｖ．３にも一アミノ酸変異を引き起こした。一アミノ酸差異は、ボックスの上方に示した。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．４と同じ配列を表す。ボックスの下方の番号はＰＳＣＡ ｖ．４に対応する。 ＰＳＣＡ ｖ．４のＳＮＰ変異体から翻訳されたタンパク質変異体の模式的配列比較。タンパク質変異体はヌクレオチド変異体に対応する。ヌクレオチド変異体ＰＳＣＡ ｖ．２３、ｖ．２８、ｖ．２９及びｖ．３０は、ｖ．４と同じタンパク質をコードした。ｖ．４に一アミノ酸変異を引き起こしたｖ．４のＳＮＰは、ｖ．５にも一アミノ酸変異を引き起こし、かつアミノ酸９６〜１８９の間に生じる場合、ｖ．３にも一アミノ酸変異を引き起こした。一アミノ酸差異は、ボックスの上方に示した。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．４と同じ配列を表す。ボックスの下方の番号はＰＳＣＡ ｖ．４に対応する。 ＰＳＣＡ ｖ．２のＳＮＰ変異体の模式的配列比較。変異体ＰＳＣＡ ｖ．６〜ｖ．１８は、変異体ｖ．２に対して一ヌクレオチド差異を有する変異体である。変異体ｖ．６は、ＯＲＦを５６〜４２７から８３〜４２７に変化した。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、図１２に示したｖ．４のような、複数の塩基対を含む転写変異体（複数）の任意の組合せ及び何れか１つにおいても生じ得る。番号はＰＳＣＡ ｖ．２の番号に対応する。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．２と同じ配列を表す。ＳＮＰはボックスの上方に示されている。 ＰＳＣＡ ｖ．２のＳＮＰ変異体の模式的配列比較。変異体ＰＳＣＡ ｖ．６〜ｖ．１８は、変異体ｖ．２に対して一ヌクレオチド差異を有する変異体である。変異体ｖ．６は、ＯＲＦを５６〜４２７から８３〜４２７に変化した。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、図１２に示したｖ．４のような、複数の塩基対を含む転写変異体（複数）の任意の組合せ及び何れか１つにおいても生じ得る。番号はＰＳＣＡ ｖ．２の番号に対応する。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．２と同じ配列を表す。ＳＮＰはボックスの上方に示されている。 ＰＳＣＡ ｖ．２のＳＮＰ変異体の模式的配列比較。変異体ＰＳＣＡ ｖ．６〜ｖ．１８は、変異体ｖ．２に対して一ヌクレオチド差異を有する変異体である。変異体ｖ．６は、ＯＲＦを５６〜４２７から８３〜４２７に変化した。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、図１２に示したｖ．４のような、複数の塩基対を含む転写変異体（複数）の任意の組合せ及び何れか１つにおいても生じ得る。番号はＰＳＣＡ ｖ．２の番号に対応する。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．２と同じ配列を表す。ＳＮＰはボックスの上方に示されている。 ＰＳＣＡ ｖ．４のＳＮＰ変異体の模式的配列比較。変異体ＰＳＣＡ ｖ．１９〜ｖ．３０は、変異体ｖ．４（ＯＲＦ：４２４〜９９３）に対して一ヌクレオチド差異を有する変異体である。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、図１０に示したｖ．５のような、複数の塩基対を含む転写変異体（複数）の任意の組合せ及び何れか１つにおいても生じ得る。番号はＰＳＣＡ ｖ．４の番号に対応する。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．４と同じ配列を表す。ＳＮＰはボックスの上方に示されている。 ＰＳＣＡ ｖ．４のＳＮＰ変異体の模式的配列比較。変異体ＰＳＣＡ ｖ．１９〜ｖ．３０は、変異体ｖ．４（ＯＲＦ：４２４〜９９３）に対して一ヌクレオチド差異を有する変異体である。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、図１０に示したｖ．５のような、複数の塩基対を含む転写変異体（複数）の任意の組合せ及び何れか１つにおいても生じ得る。番号はＰＳＣＡ ｖ．４の番号に対応する。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．４と同じ配列を表す。ＳＮＰはボックスの上方に示されている。 ＰＳＣＡ ｖ．４のＳＮＰ変異体の模式的配列比較。変異体ＰＳＣＡ ｖ．１９〜ｖ．３０は、変異体ｖ．４（ＯＲＦ：４２４〜９９３）に対して一ヌクレオチド差異を有する変異体である。これらＳＮＰ変異体は別々に示されているが、図１０に示したｖ．５のような、複数の塩基対を含む転写変異体（複数）の任意の組合せ及び何れか１つにおいても生じ得る。番号はＰＳＣＡ ｖ．４の番号に対応する。黒色のボックスは、ＰＳＣＡ ｖ．４と同じ配列を表す。ＳＮＰはボックスの上方に示されている。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。ＰＳＣＡタンパク質変異体１（配列番号：６５３２）の二次構造は、ＨＮＮ、即ちワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされるHierarchical Neural Network法（NPS@: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol. 25, No 3 [291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., https://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質一次配列から、アルファヘリックス、伸長ストランド（extended strands）及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の二次構造中の個々のタンパク質のパーセントも図に示した。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。ＰＳＣＡタンパク質変異体３（配列番号：６５３６）の二次構造は、ＨＮＮ、即ちワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされるHierarchical Neural Network法（NPS@: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol. 25, No 3 [291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., https://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質一次配列から、アルファヘリックス、伸長ストランド（extended strands）及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の二次構造中の個々のタンパク質のパーセントも図に示した。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。ＰＳＣＡタンパク質変異体４（配列番号：６５４０）の二次構造は、ＨＮＮ、即ちワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされるHierarchical Neural Network法（NPS@: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol. 25, No 3 [291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., https://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質一次配列から、アルファヘリックス、伸長ストランド（extended strands）及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の二次構造中の個々のタンパク質のパーセントも図に示した。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。ＰＳＣＡタンパク質変異体６（配列番号：６５４６）の二次構造は、ＨＮＮ、即ちワールドワイドウェブのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされるHierarchical Neural Network法（NPS@: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol. 25, No 3 [291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., https://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質一次配列から、アルファヘリックス、伸長ストランド（extended strands）及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の二次構造中の個々のタンパク質のパーセントも図に示した。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。それぞれ、ＴＭＢＡＳＥを用いるHofmann及びStoffelのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）に基づいたＰＳＣＡ変異体１の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。Sonnhammer、von Heijne及びKroghのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいたＰＳＣＡ変異体１の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。ＴＭｐｒｅｄ及びＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ExPasy molecular biology server（https://www.expasy.ch/tools/）からアクセスされる。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。それぞれ、ＴＭＢＡＳＥを用いるHofmann及びStoffelのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）に基づいたＰＳＣＡ変異体３の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。Sonnhammer、von Heijne及びKroghのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいたＰＳＣＡ変異体３の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。ＴＭｐｒｅｄ及びＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ExPasy molecular biology server（https://www.expasy.ch/tools/）からアクセスされる。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。それぞれ、ＴＭＢＡＳＥを用いるHofmann及びStoffelのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）に基づいたＰＳＣＡ変異体４の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。Sonnhammer、von Heijne及びKroghのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいたＰＳＣＡ変異体４の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。ＴＭｐｒｅｄ及びＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ExPasy molecular biology server（https://www.expasy.ch/tools/）からアクセスされる。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。それぞれ、ＴＭＢＡＳＥを用いるHofmann及びStoffelのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）に基づいたＰＳＣＡ変異体６の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。 ＰＳＣＡタンパク質変異体の二次構造及び膜貫通ドメインの予測。Sonnhammer、von Heijne及びKroghのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいたＰＳＣＡ変異体６の膜貫通領域の存在確立の模式的グラフ。ＴＭｐｒｅｄ及びＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ExPasy molecular biology server（https://www.expasy.ch/tools/）からアクセスされる。 ＰＳＣＡ変異体の発現。プライマーは、ＰＳＣＡ ｖ．１／ｖ．２／ｖ．４と、ＰＳＣＡ ｖ．３と、ＰＳＣＡ ｖ．５との間で互いに異なるものとなるように設計された。ＰＳＣＡ ｖ．１／ｖ．２／ｖ．４は大きさ４２５ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、ＰＳＣＡ ｖ．３は大きさ３００ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、ＰＳＣＡ ｖ．５は大きさ９１０ｂｐのＰＣＲ産物を生じる。 ＰＳＣＡ変異体の発現。第１ストランドｃＤＮＡは、正常な膀胱、正常な脳、正常な心臓、正常な腎臓、正常な肝臓、正常な肺、正常な前立腺、正常な脾臓、正常な骨格筋、正常な精巣、正常な膵臓、正常な結腸、正常な胃、前立腺癌のプール、膀胱癌のプール、腎臓癌のプール、結腸癌のプール、肺癌のプール、卵巣癌のプール、乳癌のプール、癌転移のプール、及び膵臓癌のプールから調製した。ノーマライゼーションは、アクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲによって実行した。変異体特異的プライマーを用いる半定量的ＰＣＲは、増幅サイクルを３０として実行した。結果から、ＰＳＣＡ ｖ．５の発現は、主として乳癌、癌転移、及び膵臓癌において見られるが、結腸癌及び肺癌では低レベルであることが分かる。ＰＳＣＡ ｖ．１／ｖ．２／ｖ．４ ＰＣＲ産物は、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、癌転移、及び膵臓癌において検出された。正常組織では、ＰＳＣＡ ｖ．１／ｖ．２／ｖ．４ ＰＣＲ産物は、前立腺、胃及び低レベルではあるが腎臓及び肺においてのみ検出されたが、ＰＳＣＡ ｖ．５は、正常組織では検出されなかった。ＰＳＣＡ ｖ．３ ＰＣＲ被検出産物は、試験サンプルの何れにおいても検出されなかった。 ＰＳＣＡ ｖ．４及びＰＳＣＡ ｖ．５の発現。プライマーは、ＰＳＣＡ ｖ．４とＰＳＣＡ ｖ．５との間で互いに異なるものとなるように設計された。ＰＳＣＡ ｖ．４は大きさ４６０ｂｐのＰＣＲ産物を生じ、ＰＳＣＡ ｖ．５は大きさ９４５ｂｐのＰＣＲ産物を生じる。 ＰＳＣＡ ｖ．４及びＰＳＣＡ ｖ．５の発現。第１ストランドｃＤＮＡは、正常な膀胱、正常な脳、正常な心臓、正常な腎臓、正常な肝臓、正常な肺、正常な前立腺、正常な脾臓、正常な骨格筋、正常な精巣、正常な膵臓、正常な結腸、正常な胃、前立腺癌のプール、膀胱癌のプール、及び多異種移植片プール（前立腺癌異種移植片、腎臓癌異種移植片及び膀胱癌異種移植片）から調製した。ノーマライゼーションは、アクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲによって実行した。変異体特異的プライマーを用いる半定量的ＰＣＲは、増幅サイクルを３０として実行した。結果から、ＰＳＣＡ ｖ．４の発現は、前立腺癌、膀胱癌、及び多異種移植片プール、正常な腎臓及び正常な前立腺において見られることが分かる。ＰＳＣＡ ｖ．５は、正常な前立腺及び膀胱癌においてのみ検出された。

Claims (46)

  1. ａ）図２のタンパク質の８、９、１０又は１１個の連続するアミノ酸からなるペプチド、
    ｂ）表８〜表２１のペプチド、
    ｃ）表２２〜表４５のペプチド、又は、
    ｄ）表４６〜表４９のペプチド、
    を含む、から本質的になる、又は、からなる組成物。
  2. 図２のタンパク質と関連するタンパク質を含む請求項１の組成物。
  3. 図２に示した全アミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は、９９％相同である請求項２のタンパク質。
  4. 前記物質が、図２のタンパク質のアミノ酸配列からの、ＣＴＬポリペプチド又はその類似体を含むことを特徴とする請求項１の組成物。
  5. 前記エピトープは図２の全アミノ酸配列ではないという条件によって更に制限される請求項４の組成物。
  6. 前記ポリペプチドは図２のタンパク質の全アミノ酸配列ではないという条件によって更に制限される請求項１の組成物。
  7. 図２のアミノ酸配列からの抗体ポリペプチドエピトープを含む請求項１の組成物。
  8. 前記エピトープは図２の全アミノ酸配列ではないという条件によってされに制限される請求項７の組成物。
  9. 前記抗体エピトープは、当該ペプチドの末端まで任意の整数で増加する図２の少なくとも５アミノ酸のペプチド領域を含み、
    前記エピトープは、
    ａ）図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
    ｂ）図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有するアミノ酸位置、
    ｃ）図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
    ｄ）図８の平均可動性プロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
    ｅ）図９のベータ−ターンプロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
    ｆ）前記ａ）〜ｅ）の少なくとも２つの組合せ、
    ｇ）前記ａ）〜ｅ）の少なくとも３つの組合せ、
    ｈ）前記ａ）〜ｅ）の少なくとも４つの組合せ、
    ｉ）前記ａ）〜ｅ）の５つの組合せ、
    から選択されるアミノ酸位置を含むことを特徴とする請求項７の組成物。
  10. 請求項１のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  11. 図２に示された核酸分子を含む請求項１０のポリヌクレオチド。
  12. 前記コードされたタンパク質は図２の全アミノ酸配列ではないという条件によって更に制限される請求項１０のポリヌクレオチド。
  13. 前記物質が、図２の核酸配列のコード配列を含むポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１１の組成物。
  14. 請求項１の付加的ペプチドをコードする付加的ヌクレオチド配列を更に含む請求項１１のポリヌクレオチド。
  15. 請求項１０のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチドを含む組成物。
  16. 図２のタンパク質に向けられた哺乳類免疫応答を惹起する方法であって、
    該方法は、前記哺乳類の免疫系の細胞を、
    ａ）ＰＳＣＡ関連タンパク質、及び／又は、
    ｂ）該タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    の一部に接触させることにより、該タンパク質に対する免疫応答が惹起されることを含む方法。
  17. 請求項１６の免疫応答惹起方法であって、
    少なくとも１つのＴ細胞エピトープ又は少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含むＰＳＣＡ関連タンパク質を用意すること、及び、
    該エピトープを哺乳類免疫系Ｔ細胞又はＢ細胞の各々に接触させることにより、Ｔ細胞又はＢ細胞が活性化されること、
    を含む方法。
  18. 前記免疫系細胞はＢ細胞であり、そのため活性化されたＢ細胞は、前記ＰＳＣＡ関連タンパク質に特異的に結合する抗体を産生することを特徴とする請求項１７の方法。
  19. 前記免疫系細胞は細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であるＴ細胞であり、そのため活性化されたＣＴＬは、前記ＰＳＣＡ関連タンパク質を発現する自己細胞を死滅することを特徴とする請求項１７の方法。
  20. 前記免疫系細胞はヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であるＴ細胞であり、そのため活性化されたＨＴＬは、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞障害活性又はＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌することを特徴とする請求項１７の方法。
  21. サンプル中におけるＰＳＣＡ関連タンパク質又はＰＳＣＡ関連ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、以下のステップ、
    前記サンプルをＰＳＣＡ関連タンパク質又はＰＳＣＡ関連ポリヌクレオチドの各々と特異的に結合する物質へ接触させること、及び、
    ＰＳＣＡ関連タンパク質と該物質との又はＰＳＣＡ関連ポリヌクレオチドと該物質との複合体の存在を各々判定すること、
    を含むことを特徴とする方法。
  22. サンプル中のＰＳＣＡ関連タンパク質の存在を検出するための、請求項２１の方法であって、以下のステップ、
    該サンプルをＰＳＣＡ関連タンパク質と特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの何れかと接触させること、及び、
    ＰＳＣＡ関連タンパク質と該抗体又はそのフラグメントとの複合体の存在を判定すること、
    を含むことを特徴とする方法。
  23. 癌を有する又は癌を有することが推測される患者からサンプルを得ることを、更に含むことを特徴とする請求項２１の方法。
  24. サンプル中の図２のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出する請求項２１の方法であって、
    少なくとも一つのプライマーを用いた逆転写により該サンプルからｃＤＮＡを合成すること、
    そのように合成されたｃＤＮＡを、センス及びアンチセンスプライマーとしてＰＳＣＡポリヌクレオチドを用いて増幅すること（但し、センス及びアンチセンスプライマーとして使用されるＰＳＣＡポリヌクレオチドはＰＳＣＡ ｃＤＮＡの増幅に供される）、及び、
    ＰＳＣＡ ｃＤＮＡの存在を検出すること、
    を含むことを特徴とする方法。
  25. 癌を有する又は癌を有することが推測される患者からの生物学的サンプル中の１又は２以上のＰＳＣＡ遺伝子産物をモニターするための請求項２１の方法であって：
    個体からの組織サンプル中の細胞によって発現された１又は２以上のＰＳＣＡ遺伝子産物の状態を決定すること、
    そのように決定されたＰＳＣＡ遺伝子産物の状態と対応する正常サンプルにおける１又は２以上のＰＳＣＡ遺伝子産物の状態とを比較すること、及び、
    正常サンプルに対しサンプル中における１又は２以上の異常なＰＳＣＡ遺伝子産物の存在を同定すること、
    を含むことからなる方法。
  26. １又は２以上の増加したＰＳＣＡ ｍＲＮＡ又はＰＳＣＡタンパク質の遺伝子産物が存在するか否かを決定するステップを更に含み、前記正常組織サンプルに対する前記被検サンプル中における１又は２以上の増加した遺伝子産物の存在が癌の存在又は状態の指標であることを特徴とする請求項２５の方法。
  27. 癌が表１に示された組織において生じていることを特徴とする請求項２６の方法。
  28. 図２のタンパク質を発現する細胞の状態を調節する組成物であって、
    ａ）図２のタンパク質を発現する細胞の状態を調節する物質、又は、
    ｂ）図２のタンパク質によって調節される分子、
    を含む組成物。
  29. 生理学的に許容可能な担体を更に含む請求項２８の組成物。
  30. ヒト最小投薬単位形態の請求項２８の組成物を含む医薬組成物。
  31. 前記物質が、図２のタンパク質と特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含むことを特徴とする請求項２８の組成物。
  32. モノクローナルである請求項３１の抗体又はそのフラグメント。
  33. ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である請求項３１の抗体。
  34. 請求項３１の抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物。
  35. 請求項３２の抗体を産生するハイブリドーマ。
  36. 図２のタンパク質を発現する細胞に細胞障害性薬剤又は診断薬を送達する方法であって、
    請求項４の抗体又はそのフラグメントとコンジュゲートされた細胞障害性薬剤又は診断薬を与えること、及び、
    前記細胞と、前記抗体−剤コンジュゲート又はフラグメント−剤コンジュゲートとを接触させること、
    を含む方法。
  37. 図２のタンパク質と免疫特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの何れかをコードするポリヌクレオチドを含む物質である請求項２８の組成物。
  38. 前記物質が、ａ）ＰＳＣＡコード配列を有するポリヌクレオチドを切断するリボザイム、又は、ｂ）リボザイムをコードする核酸分子；及び、生理学的に許容可能な担体とを含む請求項２８の組成物。
  39. ヒトＴ細胞を含む物質であることを特徴とする請求項２８の組成物であって、該Ｔ細胞がＰＳＣＡペプチド配列を特定のＨＬＡ分子の意味において特異的に認識する組成物。
  40. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を抑制する方法であって、請求項２８の組成物を細胞に投与することを含む方法。
  41. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を抑制する請求項４０の方法であって、ＰＳＣＡ関連タンパク質に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを該細胞に投与するステップを含む方法。
  42. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を抑制する請求項４０の方法であって、ＰＳＣＡ関連タンパク質を該細胞に投与するステップを含む方法。
  43. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を抑制する請求項４０の方法であって、ＰＳＣＡ関連タンパク質のコード配列を含むポリペプチド又はＰＳＣＡ関連タンパク質のコード配列に相補的なポリペプチドを含むポリペプチドを該細胞に投与するステップを含む方法。
  44. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を抑制する請求項４０の方法であって、図２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断するリボザイムを該細胞に投与するステップを含む方法。
  45. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を抑制する請求項４０の方法であって、図２のタンパク質のペプチド配列を特異的に認識するヒトＴ細胞を該癌細胞に投与するステップを含む方法（但し、該配列は特定のＨＬＡ分子の意味における）。
  46. 請求項４０の方法であって、一本鎖モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを送達するベクターを該細胞に投与し、それによりコードされた一本鎖抗体が図２のタンパク質を発現する癌細胞の細胞内で発現されることを特徴とする方法。


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