JP2004018390A

JP2004018390A - Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secretagogue

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Publication number: JP2004018390A
Application number: JP2002171373A
Authority: JP
Inventors: Tokiko Sakai; 坂井　登紀子; Yukihisa Naito; 内藤　恭久; Mamoru Kiyougashima; 京ヶ島　守
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2002-06-12
Filing date: 2002-06-12
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2022-06-12
Also published as: JP4317350B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secretagogue promoting secretion of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor for a cell or a tissue and highly safe even when contaminated in vivo. <P>SOLUTION: The granulocyte-macrophage colony-stimulating factor comprises chondroitin sulfate satisfying the relationship of n/N≥0.3 between the total number N of disaccharide units in the basic skeleton and the total number n of the disaccharide units represented by formula (1) in the basic skeleton or its pharmacologically acceptable salt. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグリコサミノグリカンを含む成長因子分泌促進剤に関する。より詳細にはコンドロイチン骨格を有すると共に硫酸基を有するグリコサミノグリカンを含む顆粒球マクロファージコロニー刺激因子分泌促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グリコサミノグリカンは成長因子と相互作用をすることが従来から知られている。例えばグリコサミノグリカンの成長因子誘導剤としての利用が特開２００２−３３８４に開示されている。上記文献には、線維芽細胞の培養時にヘパラン硫酸やガラクトサミノグリカン（デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸）を添加すると塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の分泌が促進されることが記載されている。しかし、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下「ＧＭ−ＣＳＦ」とも略記する）の分泌を促進することができるグリコサミノグリカンについての言及はなく、又は特定のグリコサミノグリカンがＧＭ−ＣＳＦ分泌の促進活性を有することを示唆する記載も存在しない。
【０００３】
ＧＭ−ＣＳＦはＴ細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞等の細胞が分泌する分化誘導因子である。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒状細胞やマクロファージ前駆細胞に作用してそれらの増殖を促進し、これらの細胞の好中球や単核球への分化を誘導する。従って遺伝子組換で調製したＧＭ−ＣＳＦを造血幹細胞の培養時に添加することにより造血幹細胞の組織や細胞への分化を促す再生医療も考え得る。しかし、この方法によるとコストがかかりすぎるという問題点が存在する。この問題点を解決する試みとして、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（以下「ＨＵＶＥＣ」とも記載する）と造血幹細胞を共培養し、ＨＵＶＥＣにＧＭ−ＣＳＦを分泌させるという手法が検討されている（Ｌｅｕｋ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　１９９８，　３１，　６１−６９、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　１９９６，　８，　７０２−７０９）。この試みは、ＩＬ−１、ＴＮＦα、ＬＰＳ、ＩＬ−３等の物質を培地に添加して培養細胞にＧＭ−ＣＳＦを分泌させるというものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＩＬ−１、ＴＮＦα、ＬＰＳ、ＩＬ−３等の物質はそれ自体が生体に対して強い生理活性を有している。従って再生組織の内部にこれらの物質が残留した場合に、再生組織を移植された宿主の免疫・恒常性に上記の残留物質が影響を与える可能性あった。一方、再生された組織の内部に残留した上記の物質を完全に除去することは極めて困難である。従って、仮に再生組織内部に残留して生体に混入した場合であっても、生体に対し悪影響を与えない程度の安全性を有するＧＭ−ＣＳＦ分泌促進剤が強く望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討した結果、驚くべきことに一般にコンドロイチン硫酸Ｅと呼ばれるコンドロイチン硫酸が極めて強いＧＭ−ＣＳＦ分泌促進活性を示すことを見い出した。そしてこの知見に基づき上記コンドロイチン硫酸をＧＭ−ＣＳＦ分泌促進剤（以下「本発明促進剤」とも記載する）として用いて本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００６】
（１）　二糖単位の全数Ｎと下記式１に示す二糖単位の数ｎとの関係がｎ／Ｎ≧０．３を充たすコンドロイチン硫酸又はその薬理学的に許容される塩を含むことを特徴とする顆粒球マクロファージコロニー刺激因子分泌促進剤。
【化２】

（２）　コンドロイチン硫酸の重量平均分子量が２００００以上であることを特徴とする（１）記載の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子分泌促進剤。
（３）　ｎ／Ｎが０．５以上であることを特徴とする（１）又は（２）記載の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子分泌促進剤。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
１．本発明促進剤は、二糖単位の全数Ｎと下記式（１）に示す二糖単位の数ｎとの関係がｎ／Ｎ≧０．３を充たすコンドロイチン硫酸又はその薬理学的に許容される塩を含むことを特徴とするＧＭ−ＣＳＦ分泌促進剤である。
【０００８】
【化３】

【０００９】
コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸の基本骨格は、下記式（２）で示される二糖単位が繰り返して結合してなる構造である。
【００１０】
【化４】

【００１１】
式（２）中、Ｒ_１、Ｒ_２、及びＲ_３は各々独立して水素原子又は硫酸基を示す。
【００１２】
本発明促進剤の有効成分であるコンドロイチン硫酸は、その基本骨格を構成する上記式（２）で表される二糖単位の数Ｎと上記式（１）に示す二糖単位の数ｎとの関係がｎ／Ｎ≧０．３を充たす。また、好ましい該コンドロイチン硫酸としては前記ｎ／Ｎの値が０．５以上であるものが挙げられ、０．６以上である該コンドロイチン硫酸が最も好ましい。このようなコンドロイチン硫酸はＧＭ−ＣＳＦの分泌を効率よく促進することができるからである。
【００１３】
上記ｎ／Ｎの値は、例えばコンドロイチン硫酸分解酵素（例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ）でコンドロイチン硫酸を消化し、消化されて新たに生じた不飽和二糖を、分子量の相違によって物質を分離する手段（例えばゲル濾過など）によって分析して、得られたピークの面積などから容易に算出することが可能である。この方法はグリコサミノグリカンの構造分析に広く一般に用いられている酵素的二糖分析法であり、具体的には後述の実施例に記載された方法によって測定することが可能である。
上記酵素的二糖分析法によりコンドロイチン硫酸を分析する際に酵素消化することにより下記式（３）の不飽和二糖が生ずる。
【００１４】
【化５】

【００１５】
【表１】

【００１６】
これらの不飽和二糖に相当するピーク面積の合計に対する、ΔＤｉ−Ｓ_Ｅに相当するピーク面積の割合が、上記のｎ／Ｎの値と同じ値を示す。
【００１７】
本発明促進剤におけるコンドロイチン硫酸の分子量が低すぎると本発明促進剤の所望の効果を十分に奏することが困難となる。従って特定以上の分子量を有することが好ましい。すなわち、その重量平均分子量は２０，０００以上であることが好ましく、４０，０００以上であることが更に好ましい。更に５０，０００以上の重量平均分子量を有するコンドロイチン硫酸が最も好ましいコンドロイチン硫酸として挙げられる。このようなコンドロイチン硫酸を含む本発明促進剤は、後述の実施例に記載された方法に従って測定される培地中におけるＧＭ−ＣＳＦの濃度を１５ｐｇ／ｍｌ以上に増加させる程度のＧＭ−ＣＳＦ分泌促進活性を有する。
【００１８】
本発明促進剤におけるコンドロイチン硫酸の由来及び調製法は上記構造を有する限り、特に限定はされず、何れであっても使用することが可能であり、生体組織から抽出したコンドロイチン硫酸であっても或いは化学的に合成したコンドロイチン硫酸であっても構わない。しかし、その中でも特に生体組織から抽出して調製したコンドロイチン硫酸が好ましく、特にイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｅとも指称されるコンドロイチン硫酸）が好ましい。このようなコンドロイチン硫酸は上記式（１）に示す二糖単位の含有量が極めて高く、本発明促進剤の所望の効果を奏することが極めて容易となるからである。
【００１９】
本発明促進剤におけるコンドロイチン硫酸の薬理学的に許容される塩は、アルカリ土類金属イオン（マグネシウムイオン・カルシウムイオン等）との塩又はアルカリ金属イオン（ナトリウムイオン・カリウムイオン等）との塩が例示され、特にアルカリ金属イオンとの塩が好ましい塩として例示される。その中でも特にナトリウムイオンとの塩が好ましい。本発明促進剤の使用によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養した再生組織において当該再生組織を生体などに移植して生体内で一時的にナトリウムイオン濃度が上昇しても、生体には充分なナトリウム排出機構が存在して恒常性が維持されるからである。
【００２０】
本発明促進剤は、後述の「本発明促進剤の使用方法」に記載した通り、培養液等の培地中において細胞又は組織を培養するに際して、当該培養される細胞又は組織のＧＭ−ＣＳＦの分泌を促進するために使用することができる。
【００２１】
２．本発明促進剤の使用方法
本発明促進剤は、それを培地中に添加して、当該培地中において細胞又は組織の培養を行い、培養される細胞又は組織のＧＭ−ＣＳＦ分泌作用の促進するために使用することができる。
【００２２】
上記目的の為に本発明促進剤が添加される培地は、培養される細胞又は組織の培養に適している培地であれば特に限定はされない。例えば培養すべき細胞としてヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いる場合にはＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２（クラボウ株式会社製）等が挙げられ、ヒト皮膚毛細血管内皮細胞を用いる場合にはＣＳ−Ｃ或いはＳＦＭ　ＣＳ−Ｃ培地（セルシステムズ社製）等が挙げられ、またヒト大動脈血管平滑筋細胞、ヒト肺静脈血管平滑筋細胞、ヒト冠状動脈血管平滑筋細胞を用いる場合にはＨｕＭｅｄｉａ−ＳＧ２或いはＨｕＭｅｄｉａ−ＳＤ２（クラボウ株式会社製）等が挙げられる。ヒト気管支由来表皮細胞を用いる場合には２ｍＭ　グルタミン、１％ウシ胎児血清を含むＦ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ　Ｏ．，　ｅｔ　ａｌ　（１９９２）　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　７７：３３０−３３７）等が挙げられる。ヒト新生児包皮表皮角化細胞、ヒト成人乳房表皮角化細胞を用いる場合にはＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２或いはＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ株式会社製）が挙げられる。ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞を用いる場合には１０６Ｓ或いはＬＳＧＳ培地（クラボウ株式会社製）が挙げられる。
【００２３】
一方、培養される組織として胃粘膜を用いる場合には２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎児血清を含むＦ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｂｅａｌｅｓ　ＩＬ．　ｅｔ　ａｌ（１９９７）　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ　Ｈｅｐａｔｏｌ．　９：４５１−４５５）等が挙げられ、肝組織を用いる場合には２ｍＭグルタミン、２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｋａｔｏ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ　（１９９４）　Ｌｕｎｇ　１７２：１１３−１２４）等が挙げられる。
【００２４】
また、本発明促進剤は例えば上記ＨＵＶＥＣ等のＧＭ−ＣＳＦを分泌する性質を有する細胞に対して特に強くＧＭ−ＣＳＦの分泌を促進するので、ＧＭ−ＣＳＦの分泌しないがＧＭ−ＣＳＦによって分化が誘導される細胞（例えば顆粒球、マクロファージ前駆細胞、造血幹細胞等）とＨＵＶＥＣ等のＧＭ−ＣＳＦを分泌する細胞とを共培養して上記の分化を誘導すべき細胞に対して効率的に分化を誘導することも可能である。
【００２５】
培地に本発明促進剤を添加する場合の濃度は１〜５００μｇ／ｍｌが例示され、好ましくは１０〜２００μｇ／ｍｌが挙げられる。このような範囲であれば、例えばＨＵＶＥＣであれば２〜４日で十分量（１５ｐｇ／ｍｌ以上の濃度）のＧＭ−ＣＳＦを分泌させることが可能だからである。
ＧＭ−ＣＳＦの分泌を促進するための培養時間は通常は１日以上、好ましくは２日以上である。
【００２６】
本発明促進剤は例えば白血病、悪性リンパ腫、再生不良性貧血、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、放射線による造血障害などの血液疾患の処置剤（治療、予防、進行抑制剤）等を目的とした医薬として利用することが可能である。
【００２７】
本発明促進剤は、コンドロイチン硫酸の他に、緩衝剤、水、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤などを含有することができ、また他の薬効を有する薬剤、成長因子などと混合して複合的な作用を示す医薬組成物として、温血動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等）へ非経口的又は経口的に適用しうる医薬とすることが可能である。
【００２８】
本発明促進剤には、薬学的に許容される補助剤、例えばｐＨ調節剤、緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤、安定化剤、無機塩類、界面活性剤、消泡剤、糖類、糖アルコールなどを混合してもよい。
【００２９】
本発明促進剤を、例えば血液疾病への適用を目的とする医薬として使用する場合の剤形としては、コンドロイチン硫酸を医薬品に慣用される水性溶媒（例えば蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水性有機溶媒を含む水などが挙げられ、蒸留水又は緩衝液が好ましい）に溶解した注射剤などが挙げられ、また創傷治癒を目的とする医薬とするのであれば、錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、軟膏剤などが挙げられるが、目的の用途で使用可能である限り特に限定はされない。
【００３０】
例えば本発明促進剤を造血障害の改善を目的とする造血機能改善剤として使用する場合は、公知の造血機能改善剤（例えばラクトフェリン、サポニン、セファランチン等）などの増殖因子と同時に生体内に存在するように投与することでＧＭ−ＣＳＦ分泌促進効果に基づく優れた造血機能改善効果を示す。両者は一緒に製剤化しても良く、または別個に製剤化しても良い。別個に製剤化する場合には、投与経路・用法は同一でも良く、また別々であっても良い。
【００３１】
本発明促進剤中のコンドロイチン硫酸の配合量及び投与量は、その製剤の投与方法、剤形、患者の具体的症状、及び患者の体重に応じて適宜個別的に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、一般にコンドロイチン硫酸の投与量は１日あたり概ね１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を例示することができる。また、上記製剤の投与回数は１日１回程度でも可能であり、１日２〜４回、又はそれ以上の回数に分けて投与することも可能である。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
＜調製法＞
１．デルマタン硫酸−１（ＤＳ−１）
鶏冠１０００ｋｇに水４０００Ｌを加えてミンチした後煮沸した。これを、冷却後プロテアーゼ（プロナーゼ、科研製薬株式会社）を添加して一晩タンパク質を分解し、酵素分解液を得た。酵素分解液に塩化ベンザルコニウム溶液３２Ｌを加えた後、珪藻土でろ過して目的物質を含む１１３ｋｇの珪藻土を得た。この珪藻土に水３５０Ｌと塩化ナトリウム４２ｋｇを加えた後ろ過し、ろ液に終濃度０．５Ｍになるように水酸化ナトリウムを加え４０℃で一時間攪拌した。これを塩酸で中和し、その後終濃度４２％になるようにエタノールを加えて沈殿を生じさせ、生じた沈殿物を回収した。この沈殿物を適当量の水に溶解し１％の塩化ナトリウムと２倍量のエタノールを加えて沈殿を生じさせ、この沈殿物を乾燥させて粉体１．０ｋｇを得た。
【００３３】
上記粉体を水１．０Ｌに溶解して１０％（ｗ／ｗ）となるように調製し、ＳｈｉｖｅｌｙとＣｏｎｒａｄの方法（Ｓｈｉｖｅｌｙ　ＪＥ，　Ｃｏｎｒａｄ　ＨＥ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（１９７０）　Ｈａｎ　６；　９（１）：　３３−４３）により亜硝酸処理を行ってヘパリン／ヘパラン硫酸を除去した。すなわち、上記粉体を溶解した溶液を０．１％（ｗ／ｗ）亜硝酸水溶液に混和し、２４℃で１０分間放置した後、沈殿をろ過して除いた。ろ過液のｐＨを３．０に調整した後、珪藻土を用いて更にろ過した。ついで終濃度０．２５Ｍになるように水酸化ナトリウムを添加し、４０℃で１時間攪拌した。その後ｐＨを１０．５に調整し、塩化ナトリウムを終濃度１％になるように加え、さらにエタノールを終濃度４８％（ｗ／ｗ）になるように３０〜４０分かけて攪拌しながら加えた。得られた沈殿物に活性炭を加えて吸引ろ過し、ろ過液をイオン交換樹脂Ｄｉａｉｏｎ　ＳＡ−１２Ａ、ＰＫ２２０（三菱化学株式会社）に通して脱塩し、通過液にエタノールを加え、４７４ｇのデルマタン硫酸（ＤＳ−１）を得た。
【００３４】
２．低分子化デルマタン硫酸（ＬＭＷＤＳ）
１．で調製したＤＳ−１を酸加水分解の手法で低分子化した。すなわち、１０％（ｗ／ｗ）濃度のＤＳ−１の水溶液に終濃度０．５Ｍになるように塩酸を加え、６５℃で２８０分間攪拌した。水酸化ナトリウム水溶液で中和後、１．５％（ｗ／ｗ）の酢酸ナトリウムを加え終濃度４８％（ｗ／ｗ）になるようにエタノールを加えＬＭＷＤＳを得た。
【００３５】
３．ナマコ由来グリコサミノグリカン（ＳＣ−ＧＡＧ）
ナマコ体壁２ｋｇをホモジナイズし、クロロホルム：メタノール＝２：１の混液により脱脂した。１２０℃で３０分間オートクレーブ処理後、適当量のアルカリプロナーゼ（アクチナーゼ：科研製薬株式会社製）により５５℃で８時間消化した。さらに終濃度０．４Ｍになるように水酸化ナトリウムを加え４０℃で一時間攪拌し、終濃度１０％（ｗ／ｗ）になるようにトリクロロ酢酸を加えタンパク質を除去した。流水透析した後、２．５％（ｗ／ｗ）の酢酸ナトリウム存在下でエタノール沈殿を行い、粗精製品１５ｇを得た。
【００３６】
得られた粗精製品５００ｍｇを２回に分けて５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解しＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００カラム（φ３．４×１００ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に付し、カルバゾール反応（Ｂｉｔｔｅｒ−Ｍｕｉｒ法，Ｔ．　Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｈ．　Ｍｕｉｒ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ，　４，　３３０−３３４　（１９６２））において陽性を示す画分を５７４ｍｇ回収した。次いで１００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液に溶解しＤＥＡＥ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（φ１．８×１８ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に付し１．２Ｍまでの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出させ、同じくカルバゾール反応陽性の画分を回収しＳＣ−ＧＡＧ　２１０ｍｇを得た。
【００３７】
＜測定法＞
二糖分析法
（１）グリコサミノグリカン分解酵素による消化
新生化学実験講座３、糖質ＩＩ　５４−５９頁に記載の方法により、被検物質１．０ｍｇを２ｍＭ酢酸カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２２０μｌに溶解して、グリコサミノグリカン分解酵素（コンドロイチン骨格を有するグリコサミノグリカンを分析する場合にはコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製）、ヘパリンを分析する場合にはヘパリチナーゼＩとヘパリナーゼの混合物（何れも生化学工業株式会社製））２０ｍＵを加えて、３７℃で２時間反応させた。
【００３８】
（２）ＨＰＬＣによる分析
上記（１）による酵素消化を行った後の溶液２０μｌを、ＨＰＬＣ（株式会社島津製作所製、ＬＣ６ＡＤ型）を用いて分析した。イオン交換カラム（ＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ−１カラムφ４．０×２５０ｍｍ：Ｄｉｏｎｅｘ社製）を使用し、２３２ｎｍでの吸光度を測定した。公知の方法（Ｋａｒｉｙａ，　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）　Ｃｏｍｐ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　１０３Ｂ，　４７３−４７９）に準拠し、流速１ｍｌ／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（５０ｍＭ→２．５Ｍ）で測定した。
【００３９】
＜実施例＞
１．ＧＭ−ＣＳＦ分泌促進活性の定量
細胞はクラボウ株式会社より市販されているＨＵＶＥＣを用いた。細胞の培養にはＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２（クラボウ株式会社）　５００ｍＬに対し、０．５ｍｌのｈＥＧＦ　１０ｕｇ／ｍｌ，　ｈＦＧＦ−Ｂ　５ｕｇ／ｍｌ，ヘパリン　１０ｍｇ／ｍｌ，　ハイドロコーチゾン　１ｍｇ／ｍｌ，　抗菌剤（ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ　＋　アンフォテリシン　０．５ｕｇ／ｍｌ）　と　１ｍｌのアルギニン，グルコースを添加した培地を使用し、この培地でＨＵＶＥＣを培養して３世代継代維持した。その後、２４穴プレートに５ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１ｍｌになるよう細胞を植え込み、　ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。低栄養培養液（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２（クラボウ株式会社）　５００ｍＬに対し、ハイドロコーチゾン　１ｍｇ／ｍｌ，　抗菌剤（ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ　＋　アンフォテリシン　０．５ｕｇ／ｍｌ）　と　１ｍｌのアルギニン，グルコースを添加したもの）に培地交換し、さらに一日培養しコンフルエントの状態にした。８０μｇ／ｍｌで被検物質〔ＤＳ−１、ＬＭＷＤＳ、ＤＳ−２（生化学工業株式会社より市販されているブタ皮由来デルマタン硫酸）、ＣＳＣ（生化学工業株式会社より市販されているサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸ナトリウム（注射用））、ＣＳＥ（生化学工業株式会社より市販のイカ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｅ）、ＳＣ−ＧＡＧ、ヘパリン（Ｈｅｐ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）：ＤＳ−１、ＬＭＷＤＳ、ＳＣ−ＧＡＧの調製方法は前述の調製法参照〕を含む低栄養培養液に培地交換した。３日間培養した後、培養上清を別の容器に移し、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して細胞成分を除去した後、ＧＭ−ＣＳＦの濃度をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ　Ｈｕｍａｎ　ＧＭ−ＣＳＦ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて定量した。対照として何も添加せずに同様に培養して得られた培養上清中のＧＭ−ＣＳＦの濃度を用いた（図１）。
その結果、ＣＳＥのみが極めて高いＧＭ−ＣＳＦ濃度を示すことが明らかとなった。
【００４０】
２．二糖組成の分析
ＤＳ−１、ＬＭＷＤＳ、ＤＳ−２、ＣＳＣ、ＣＳＥはコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社）を用いて酵素処理した。生成した不飽和二糖の組成をポリアミン結合型シリカ担体カラム（株式会社ＹＭＣ製）に付し、標準不飽和二糖（不飽和コンドロ二糖キット；生化学工業株式会社）の溶出位置と比較することにより、前記硫酸化多糖中の二糖組成およびその含量を解析した。Ｈｅｐはヘパリチナーゼ（生化学工業株式会社）により酵素処理し標準不飽和二糖（不飽和ヘパリン二糖キット）を用いて以下同様に解析した。結果を表１及び表２に示した。
【００４１】
【表２】
表１

【００４２】
【表３】
（表２）

【００４３】
なお、Ｈｅｐをヘパリチナーゼで消化して得られた不飽和二糖は下記式（４）の通りである。
【００４４】
【化６】

【００４５】
【表４】

【００４６】
ＳＣ−ＧＡＧは糖鎖分解酵素で消化されないため化学的分解により分析した（　Ｋａｒｉｙａｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ　（１９９０）２６５，　５０８１−８５）。ＳＣ−ＧＡＧの基本的な骨格は下記式（２）の通りである。
【００４７】
【化７】

【００４８】
【表５】

【００４９】
ＳＣ−ＧＡＧの基本的な骨格の構成単位の比は下記表３の通りだった。
【００５０】
【表６】
表３

【００５１】
ＧＭ−ＣＳＦ分泌促進活性の定量と二糖組成の分析から４，６−二流酸−コンドロイチン不飽和二糖（ΔＤｉ−Ｓ_Ｅ）を多く含むコンドロイチン硫酸はＧＭ−ＣＳＦ分泌を著しく促進することが明かとなった。
【００５２】
３．分子量分析
ＤＳ−１、ＬＭＷＤＳ、ＤＳ−２、ＣＳＣ、ＣＳＥ、Ｈｅｐの重量平均分子量は、Ａｒａｉらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，１１１７，６０−７０，１９９２）に準拠して測定した。分子量が既知のコンドロイチン硫酸Ｃ（重量平均分子量３９１００、１８０００、８０３０）及びヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量１０４０００）を標準品としてＨＰＬＣを用いたゲルろ過での溶出時間により決定した。カラムは、Ｔｓｋ　ｇｅｌ　Ｇ４０００ＰＷ_ＸＬ、Ｇ３０００ＰＷ_ＸＬおよびＧ２５００ＰＷ_ＸＬ（各φ７．８×３００ｍｍ、東ソー株式会社）を連結したものを用いた。溶媒は０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を用い、流速は０．６ｍｌ／分とし、検出器は示差屈折率検出器（ＲＩ−８０２０、東ソー株式会社）を用いた。重量平均分子量の解析にはＧＰＣ−８０２０ソフトウェア（東ソー株式会社）を用いた。
【００５３】
ＳＣ−ＧＡＧは糖鎖構造がＤＳ−１、ＬＭＷＤＳ、ＤＳ−２、ＣＳＣ、ＣＳＥ、Ｈｅｐと異なり分岐構造を持つため超遠心沈降法により重量平均分子量を求めた（Ｋａｒｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８６）　Ｃｏｎｎｅｃｔ．　Ｔｉｓｓｕｅ（Ｔｏｋｙｏ）　１８，　３１２−３１３）。
その結果、重量平均分子量は表４の通りだった。
【００５４】
【表７】
表４

【００５５】
【発明の効果】本発明により、新たなＧＭ−ＣＳＦ分泌促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各被検物質のＨＵＶＥＣに対するＧＭ−ＣＳＦ分泌促進活性を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a growth factor secretagogue containing glycosaminoglycan. More specifically, the present invention relates to a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secretion promoter comprising a glycosaminoglycan having a chondroitin skeleton and a sulfate group.
[0002]
[Prior art]
Glycosaminoglycans have been known to interact with growth factors. For example, use of glycosaminoglycan as a growth factor inducer is disclosed in JP-A-2002-3384. According to the above literature, the addition of heparan sulfate or galactosaminoglycan (dermatan sulfate or chondroitin sulfate) promotes secretion of basic fibroblast growth factor (bFGF) and hepatocyte growth factor (HGF) during fibroblast culture. Is described. However, there is no mention of glycosaminoglycans capable of promoting secretion of granulocyte macrophage colony stimulating factor (hereinafter abbreviated as “GM-CSF”), or a specific glycosaminoglycan is not capable of secreting GM-CSF. There is no description suggesting that it has promoting activity.
[0003]
GM-CSF is a differentiation-inducing factor secreted by cells such as T cells, vascular endothelial cells, and fibroblasts. GM-CSF acts on granular cells and macrophage precursor cells to promote their proliferation, and induces these cells to differentiate into neutrophils and monocytes. Therefore, regenerative medicine that promotes differentiation of hematopoietic stem cells into tissues and cells by adding GM-CSF prepared by genetic recombination during the culture of hematopoietic stem cells can also be considered. However, this method has a problem that the cost is too high. As an attempt to solve this problem, a method of co-culturing human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (hereinafter also referred to as “HUVEC”) with hematopoietic stem cells and causing HUVEC to secrete GM-CSF has been studied (Leuk). Lymphoma 1998, 31, 61-69, Cytokine 1996, 8, 702-709). This attempt is to add GM-CSF to cultured cells by adding substances such as IL-1, TNFα, LPS, and IL-3 to a medium.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Substances such as IL-1, TNFα, LPS, and IL-3 themselves have strong physiological activity on living organisms. Therefore, when these substances remain inside the regenerated tissue, the above-mentioned residual substances may affect the immunity and homeostasis of the host transplanted with the regenerated tissue. On the other hand, it is extremely difficult to completely remove the above substances remaining inside the regenerated tissue. Therefore, a GM-CSF secretion promoter having a safety level that does not adversely affect the living body even if it remains in the regenerated tissue and enters the living body has been strongly desired.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems and, surprisingly, have found that chondroitin sulfate, generally called chondroitin sulfate E, exhibits an extremely strong GM-CSF secretion promoting activity. Based on this finding, the present invention has been completed by using the above chondroitin sulfate as a GM-CSF secretion promoter (hereinafter also referred to as “the present promoter”).
That is, the present invention is as follows.
[0006]
(1) The relationship between the total number N of disaccharide units and the number n of disaccharide units represented by the following formula 1 includes chondroitin sulfate or a pharmaceutically acceptable salt thereof satisfying n / N ≧ 0.3. A granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secretion promoter.
Embedded image

(2) The granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secretion promoter according to (1), wherein the weight average molecular weight of chondroitin sulfate is 20,000 or more.
(3) The granulocyte-macrophage colony stimulating factor secretion promoter according to (1) or (2), wherein n / N is 0.5 or more.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the present invention.
1. The accelerator of the present invention is a chondroitin sulfate wherein the relationship between the total number N of disaccharide units and the number n of disaccharide units represented by the following formula (1) satisfies n / N ≧ 0.3 or pharmacologically acceptable. It is a GM-CSF secretagogue characterized by containing a salt.
[0008]
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[0009]
The basic skeleton of chondroitin and chondroitin sulfate has a structure in which disaccharide units represented by the following formula (2) are repeatedly bonded.
[0010]
Embedded image

[0011]
In the formula (2), R ₁ , R ₂ and R ₃ each independently represent a hydrogen atom or a sulfate group.
[0012]
Chondroitin sulfate, which is an active ingredient of the accelerator of the present invention, comprises the number N of disaccharide units represented by the above formula (2) constituting the basic skeleton and the number n of disaccharide units represented by the above formula (1). The relationship satisfies n / N ≧ 0.3. Preferred examples of the chondroitin sulfate include those having the value of n / N of 0.5 or more, and the chondroitin sulfate having a value of 0.6 or more is most preferable. This is because such chondroitin sulfate can efficiently promote secretion of GM-CSF.
[0013]
The value of n / N is determined by, for example, means for digesting chondroitin sulfate with chondroitin sulfate-degrading enzyme (eg, chondroitinase ABC) and separating a newly generated unsaturated disaccharide from the digested substance by a difference in molecular weight ( For example, analysis can be performed by gel filtration and the like, and it can be easily calculated from the area of the obtained peak. This method is an enzymatic disaccharide analysis method widely used for the structural analysis of glycosaminoglycan, and can be specifically measured by the method described in Examples below.
When chondroitin sulfate is analyzed by the above-mentioned enzymatic disaccharide analysis method, an unsaturated disaccharide of the following formula (3) is generated by enzymatic digestion.
[0014]
Embedded image

[0015]
[Table 1]

[0016]
To the sum of the peak areas corresponding to these unsaturated disaccharide, the ratio of the peak area corresponding to [Delta] Di-S _E indicates the same value as the value of the above n / N.
[0017]
If the molecular weight of chondroitin sulfate in the accelerator of the present invention is too low, it will be difficult to sufficiently exhibit the desired effects of the accelerator of the present invention. Therefore, it is preferable that the compound has a specific molecular weight or more. That is, the weight average molecular weight is preferably 20,000 or more, more preferably 40,000 or more. Further, chondroitin sulfate having a weight average molecular weight of 50,000 or more is mentioned as the most preferred chondroitin sulfate. The promoter of the present invention containing such chondroitin sulfate has a GM-CSF secretion promoting activity of increasing the concentration of GM-CSF in a medium to 15 pg / ml or more, which is measured according to the method described in Examples described later. Having.
[0018]
The origin and preparation method of chondroitin sulfate in the promoter of the present invention are not particularly limited as long as it has the above structure, and any of them can be used, and even if it is chondroitin sulfate extracted from a biological tissue or It may be chemically synthesized chondroitin sulfate. However, among them, chondroitin sulfate prepared by extracting from living tissue is particularly preferable, and chondroitin sulfate derived from squid cartilage (chondroitin sulfate also referred to as chondroitin sulfate E) is particularly preferable. This is because such chondroitin sulfate has a very high content of the disaccharide unit represented by the above formula (1), and it is extremely easy to exhibit the desired effect of the accelerator of the present invention.
[0019]
The pharmacologically acceptable salt of chondroitin sulfate in the accelerator of the present invention is a salt with an alkaline earth metal ion (eg, magnesium ion / calcium ion) or a salt with an alkali metal ion (eg, sodium ion / potassium ion). Illustrative, and particularly preferred are salts with alkali metal ions. Among them, salts with sodium ions are particularly preferred. In the regenerated tissue cultured in vitro by using the promoter of the present invention, even if the regenerated tissue is transplanted into a living body or the like and the sodium ion concentration is temporarily increased in the living body, the living body has a sufficient sodium excretion mechanism. This is because homeostasis is maintained.
[0020]
The present invention enhancer secretes GM-CSF from the cultured cells or tissues when the cells or tissues are cultured in a culture medium such as a culture solution, as described in “Methods for Using the Present Invention Promoter” described below. Can be used to promote.
[0021]
2. Method for Using the Promoter of the Present Invention The promoter of the present invention is added to a medium to culture cells or tissues in the medium, and to promote the GM-CSF secretion action of the cultured cells or tissues. Can be used for
[0022]
The medium to which the promoter of the present invention is added for the above purpose is not particularly limited as long as it is a medium suitable for culturing cells or tissues to be cultured. For example, when human umbilical cord vascular endothelial cells (HUVEC) are used as cells to be cultured, HuMedia-EB2 (manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) and the like are used. When human skin capillary endothelial cells are used, CS-C or SFM CS is used. -C medium (manufactured by Cell Systems), and when using human aortic vascular smooth muscle cells, human pulmonary vein vascular smooth muscle cells, or human coronary vascular smooth muscle cells, HuMedia-SG2 or HuMedia-SD2 ( Manufactured by Kurabo Industries, Ltd.). When human bronchial epidermal cells are used, F12 / DMEM medium containing 2 mM glutamine and 1% fetal bovine serum (Cromwell O., et al (1992) Immunology 77: 330-337) can be used. When using human neonatal foreskin epidermal keratinocytes or human adult mammary epidermal keratinocytes, HuMedia-KG2 or HuMedia-KB2 (manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) can be used. When human neonatal foreskin skin fibroblasts or human adult skin fibroblasts are used, 106S or LSGS medium (manufactured by Kurabo Co., Ltd.) can be used.
[0023]
On the other hand, when gastric mucosa is used as the tissue to be cultured, F12 / DMEM medium containing 2 mM glutamine and 10% fetal bovine serum (Beales IL. Et al (1997) Eur J Gastroenterol Hepatol. 9: 451-455) and the like are used. When liver tissue is used, a DMEM medium (Kato M. et al (1994) Lung 172: 113-124) containing 2 mM glutamine and 20% fetal bovine serum can be used.
[0024]
In addition, the promoter of the present invention particularly strongly promotes the secretion of GM-CSF to cells having the property of secreting GM-CSF such as the above-mentioned HUVEC, so that the promoter does not secrete GM-CSF but differentiates by GM-CSF. The induced cells (eg, granulocytes, macrophage progenitor cells, hematopoietic stem cells, etc.) and GM-CSF secreting cells such as HUVECs are co-cultured to efficiently differentiate the above cells to be induced to differentiate. It is also possible to guide.
[0025]
When the promoter of the present invention is added to the medium, the concentration is, for example, 1 to 500 μg / ml, and preferably 10 to 200 μg / ml. Within this range, for example, HUVEC can secrete a sufficient amount (15 pg / ml or more) of GM-CSF in 2 to 4 days.
The culture time for promoting the secretion of GM-CSF is usually 1 day or more, preferably 2 days or more.
[0026]
The promoter of the present invention includes, for example, agents for treating (treating, preventing, inhibiting progression) of blood diseases such as leukemia, malignant lymphoma, aplastic anemia, multiple myeloma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, and hematopoietic disorders caused by radiation. It can be used as a target drug.
[0027]
The accelerator of the present invention may contain, in addition to chondroitin sulfate, a buffer, water, a pharmaceutically acceptable carrier, an excipient, a diluent, and the like, and other drugs having a medicinal effect, growth factors, and the like. Is applied parenterally or orally to warm-blooded animals (humans, mice, rats, hamsters, rabbits, dogs, cats, horses, cows, pigs, etc.) It can be a medicament.
[0028]
The accelerator of the present invention includes pharmaceutically acceptable auxiliaries such as pH adjusters, buffers, tonicity adjusters, wetting agents, stabilizers, inorganic salts, surfactants, defoamers, sugars and sugars. Alcohol and the like may be mixed.
[0029]
When the accelerator of the present invention is used, for example, as a drug for the purpose of applying to blood diseases, the dosage form may be chondroitin sulfate in an aqueous solvent commonly used in pharmaceuticals (eg, distilled water, buffer, saline, aqueous solution). Water containing an organic solvent, etc., preferably distilled water or a buffer solution), and tablets, capsules, liquids, gels if the drug is intended for wound healing. Agents, ointments and the like, but are not particularly limited as long as they can be used for the intended use.
[0030]
For example, when the promoter of the present invention is used as a hematopoietic function improving agent for the purpose of improving hematopoietic disorders, it is present in the living body at the same time as a growth factor such as a known hematopoietic function improving agent (eg, lactoferrin, saponin, cepharanthin, etc.). By such administration, an excellent hematopoietic function improving effect based on the GM-CSF secretion promoting effect is exhibited. Both may be formulated together or separately. When formulated separately, the administration route and usage may be the same or different.
[0031]
The blending amount and dosage of chondroitin sulfate in the accelerator of the present invention are administration methods of the preparation, dosage form, specific symptoms of the patient, and items to be appropriately determined individually according to the weight of the patient, Although not particularly limited, generally, the dose of chondroitin sulfate can be approximately 100 μg / kg to 100 mg / kg per day. In addition, the above-mentioned formulation can be administered about once a day, or can be administered in 2 to 4 times a day or more.
[0032]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples.
<Preparation method>
1. Dermatan sulfate-1 (DS-1)
4000 L of water was added to 1000 kg of a cockscomb, minced, and then boiled. After cooling, protease (Pronase, Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to decompose the protein overnight, to obtain an enzyme-decomposed solution. After adding 32 L of benzalkonium chloride solution to the enzymatic decomposition solution, it was filtered through diatomaceous earth to obtain 113 kg of diatomaceous earth containing the target substance. After adding 350 L of water and 42 kg of sodium chloride to the diatomaceous earth, the mixture was filtered. Sodium hydroxide was added to the filtrate to a final concentration of 0.5 M, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. This was neutralized with hydrochloric acid, and then ethanol was added to a final concentration of 42% to form a precipitate, and the formed precipitate was collected. This precipitate was dissolved in an appropriate amount of water, and 1% sodium chloride and twice the amount of ethanol were added to form a precipitate. The precipitate was dried to obtain 1.0 kg of powder.
[0033]
The above powder was dissolved in 1.0 L of water to prepare 10% (w / w), and the method of Shivery and Conrad (Shivery JE, Conrad HE., Biochem. (1970) Han 6; 9 (1) ): Heparin / heparan sulfate was removed by performing nitrous acid treatment according to 33-43). That is, the solution in which the powder was dissolved was mixed with a 0.1% (w / w) aqueous nitrous acid solution, left at 24 ° C. for 10 minutes, and the precipitate was removed by filtration. After adjusting the pH of the filtrate to 3.0, it was further filtered using diatomaceous earth. Then, sodium hydroxide was added to a final concentration of 0.25M, and the mixture was stirred at 40 ° C for 1 hour. Thereafter, the pH was adjusted to 10.5, sodium chloride was added to a final concentration of 1%, and ethanol was further added to the final concentration of 48% (w / w) with stirring over 30 to 40 minutes. . Activated carbon was added to the obtained precipitate, followed by suction filtration. The filtrate was desalted by passing through ion exchange resin Diaion SA-12A, PK220 (Mitsubishi Chemical Corporation), and ethanol was added to the filtrate, and 474 g of dermatan sulfate was added. (DS-1) was obtained.
[0034]
2. Low molecular weight dermatan sulfate (LMWDS)
1. DS-1 prepared in the above was reduced in molecular weight by an acid hydrolysis technique. That is, hydrochloric acid was added to a 10% (w / w) aqueous solution of DS-1 to a final concentration of 0.5 M, and the mixture was stirred at 65 ° C for 280 minutes. After neutralization with an aqueous sodium hydroxide solution, 1.5% (w / w) sodium acetate was added, and ethanol was added to a final concentration of 48% (w / w) to obtain LMWDS.
[0035]
3. Sea cucumber-derived glycosaminoglycan (SC-GAG)
2 kg of sea cucumber body wall was homogenized and degreased with a mixed solution of chloroform: methanol = 2: 1. After autoclaving at 120 ° C. for 30 minutes, the mixture was digested with an appropriate amount of alkaline pronase (actinase: manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) at 55 ° C. for 8 hours. Further, sodium hydroxide was added to a final concentration of 0.4 M, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. Trichloroacetic acid was added to a final concentration of 10% (w / w) to remove proteins. After running water dialysis, ethanol precipitation was performed in the presence of 2.5% (w / w) sodium acetate to obtain 15 g of a crude product.
[0036]
The obtained crude purified product (500 mg) was divided into two portions, dissolved in a 50 mM aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, applied to a Sephadex G-100 column (φ3.4 × 100 cm, manufactured by Amersham Bioscience Co., Ltd.), and subjected to a carbazole reaction (Bitter- 574 mg of a fraction positive in the Muir method, T. Bitter, H. Muir, Anal. Biochem. J, 4, 330-334 (1962)) was recovered. Next, it was dissolved in a 100 mM aqueous sodium acetate solution, applied to a DEAE cellulose column (φ1.8 × 18 cm, manufactured by Amersham Biosciences), and eluted with a linear concentration gradient of sodium chloride up to 1.2 M. It was recovered and 210 mg of SC-GAG was obtained.
[0037]
<Measurement method>
Disaccharide analysis method (1) Digestion by glycosaminoglycan-degrading enzyme Chemo-experimental chemistry course 3, Carbohydrate II According to the method described in pp. 54-59, 1.0 mg of a test substance was added to 20 mM sodium acetate containing 2 mM calcium acetate ( (pH 7.0) dissolved in 220 μl to analyze glycosaminoglycan degrading enzyme (chondroitinase ABC (manufactured by Seikagaku Corporation) when analyzing glycosaminoglycans having a chondroitin skeleton, and heparin when analyzing heparin. Was added with 20 mU of a mixture of heparitinase I and heparinase (all manufactured by Seikagaku Corporation) and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
[0038]
(2) Analysis by HPLC 20 μl of the solution after the enzyme digestion according to the above (1) was analyzed by HPLC (LC6AD, manufactured by Shimadzu Corporation). The absorbance at 232 nm was measured using an ion exchange column (CarboPac PA-1 column φ4.0 × 250 mm: manufactured by Dionex). According to a known method (Kariya, et al. (1992) Comp. Biochem. Physiol., 103B, 473-479), at a flow rate of 1 ml / min, a gradient system (50 mM → 2.5 M) using lithium chloride. It was measured.
[0039]
<Example>
1. HUVEC commercially available from Kurabo Industries, Ltd. was used as the cells for quantifying GM-CSF secretion promoting activity. For culturing cells, for 500 mL of HuMedia-EB2 (Kurabo Industries, Ltd.), 0.5 ml of hEGF 10 ug / ml, hFGF-B 5 ug / ml, heparin 10 mg / ml, hydrocortisone 1 mg / ml, antibacterial agent (gentamicin 50 mg / ml) HUVEC was cultured in a medium supplemented with 1 ml of arginine and glucose (ml + amphotericin 0.5 ug / ml) and 1 ml of arginine and glucose. Thereafter, the cells were inoculated in a 24-well plate at 5 × 10 ⁴ cells / well / 1 ml, and cultured in a CO ₂ incubator for 2 days. To 500 mL of a low nutrient culture solution (HuMedia-EB2 (Kurabo Co., Ltd.), 1 mg / ml of hydrocortisone, an antibacterial agent (50 mg / ml of gentamicin + 0.5 ug / ml of amphotericin) and 1 ml of arginine and glucose added) The medium was replaced, and the cells were further cultured for one day to obtain a confluent state. At 80 μg / ml, test substances [DS-1, LMWDS, DS-2 (porcine skin dermatan sulfate commercially available from Seikagaku Corporation), CSC (shark cartilage commercially available from Seikagaku Corporation) Sodium chondroitin sulfate (for injection), CSE (chondroitin sulfate E derived from squid cartilage commercially available from Seikagaku Corporation), SC-GAG, heparin (Hep: Scientific Protein Laboratories): DS-1, LMWDS, SC- For the method of preparing GAG, see the above-mentioned preparation method], the medium was replaced with a low nutrient culture solution containing the same. After culturing for 3 days, the culture supernatant was transferred to another container, and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to remove the cell components. Then, the concentration of GM-CSF was changed to Quantikine Human GM-CSF Immunoassay (manufactured by R & D systems). And quantified. As a control, the concentration of GM-CSF in the culture supernatant obtained by similarly culturing without any addition was used (FIG. 1).
As a result, it was revealed that only CSE exhibited an extremely high GM-CSF concentration.
[0040]
2. Analysis of Disaccharide Composition DS-1, LMWDS, DS-2, CSC and CSE were treated with chondroitinase ABC (Seikagaku Corporation). The composition of the generated unsaturated disaccharide is applied to a polyamine-bonded silica carrier column (manufactured by YMC Corporation) and compared with the elution position of a standard unsaturated disaccharide (unsaturated chondro disaccharide kit; Seikagaku Corporation). Thus, the disaccharide composition and the content thereof in the sulfated polysaccharide were analyzed. Hep was treated with heparitinase (Seikagaku Corporation) and treated with a standard unsaturated disaccharide (unsaturated heparin disaccharide kit) in the same manner. The results are shown in Tables 1 and 2.
[0041]
[Table 2]
Table 1

[0042]
[Table 3]
(Table 2)

[0043]
The unsaturated disaccharide obtained by digesting Hep with heparitinase is represented by the following formula (4).
[0044]
Embedded image

[0045]
[Table 4]

[0046]
Since SC-GAG was not digested with a sugar chain-degrading enzyme, it was analyzed by chemical degradation (Kariya et al., J. Biol. Chem (1990) 265, 5081-85). The basic skeleton of SC-GAG is represented by the following formula (2).
[0047]
Embedded image

[0048]
[Table 5]

[0049]
Table 3 below shows the ratio of the structural units of the basic skeleton of SC-GAG.
[0050]
[Table 6]
Table 3

[0051]
4,6 mediocre acid from the analysis of quantitative and disaccharide composition of GM-CSF secretion promoting activity - chondroitin sulfate containing many chondroitin unsaturated disaccharide _{(ΔDi-S E)} is bright significantly promote GM-CSF secretion It was ok.
[0052]
3. Molecular Weight Analysis The weight average molecular weights of DS-1, LMWDS, DS-2, CSC, CSE, and Hep were measured according to the method of Arai et al. (Biochem. Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992). . The molecular weight was determined by the elution time in gel filtration using HPLC using chondroitin sulfate C (weight average molecular weight: 39100, 18,000, 8030) and sodium hyaluronate (weight average molecular weight: 104000) as standards. The column used was a column in which Tsk gel G4000PW _XL , G3000PW _XL and G2500PW _XL (each φ7.8 × 300 mm, Tosoh Corporation) were connected. The solvent used was a 0.2 mol / L sodium chloride solution, the flow rate was 0.6 ml / min, and the detector used was a differential refractive index detector (RI-8020, Tosoh Corporation). GPC-8020 software (Tosoh Corporation) was used for the analysis of the weight average molecular weight.
[0053]
Since SC-GAG has a branched structure unlike the sugar chain structure of DS-1, LMWDS, DS-2, CSC, CSE, and Hep, the weight average molecular weight was determined by ultracentrifugation (Kariya et al., (1986)). Connect.Tissue (Tokyo) 18, 312-313).
As a result, the weight average molecular weight was as shown in Table 4.
[0054]
[Table 7]
Table 4

[0055]
According to the present invention, a novel GM-CSF secretagogue is provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the activity of each test substance to promote GM-CSF secretion on HUVEC.

Claims

The relationship between the total number N of disaccharide units and the number n of disaccharide units represented by the following formula (1) includes chondroitin sulfate satisfying n / N ≧ 0.3 or a pharmacologically acceptable salt thereof. Granulocyte macrophage colony stimulating factor secretion promoter.

2. The granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secretion promoter according to claim 1, wherein the weight average molecular weight of chondroitin sulfate is 20,000 or more.

The granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secretion promoter according to claim 1 or 2, wherein n / N is 0.5 or more.