JP2003523721A - 抗原性ｈｉｖｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用 - Google Patents

抗原性ｈｉｖｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫原性ＨＩＶ Ｃ型Ｇａｇ含有ポリペプチドおよび／または免疫原性ＨＩＶ Ｃ型Ｅｎｖ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。ＤＮＡ免疫、パッケージング細胞株の作製、およびＧａｇ含有タンパク質および／またはＥｎｖ含有タンパク質の産生を含む適用におけるポリヌクレオチドの使用もまた、記載される。本発明はまた、ＨＩＶ ＧａｇポリペプチドまたはＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 抗原性Ｃ型ＨＩＶのＧａｇ含有および／またはＥｎｖ含有ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドが記載される。そして免疫原性組成物中でのこれらのポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド生成物の使用が、記載される。
【０００２】 （発明の背景） 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代の医学が直面している最も大きな
健康の脅威の１つとして認識される。現在もなお、この疾患についての療法は存
在しない。
【０００３】 １９８３年〜１９８４年においては、３つのグループが、ＡＩＤＳの推測され
る病因学的な因子を別々に同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら
（１９８３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅ
ｒら、Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌ
ｌｏ，ＥｓｓｅｘおよびＧｒｏｓｓ編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４
）、Ｌａｎｃｅｔ １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら、（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２５：８４０−８４２。これらの単離物は、リンパ節腫脹症（ｌｙｍｐａｄｅｎ
ｏｐａｔｈｙ）関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞リンホトロピック（ｌｙｍ
ｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ
関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と、さまざまに呼ばれた。これらの単離物の全て
が、同じウイルスの株であり、そして後にまとめて、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）と呼ばれた。関連するＡＩＤＳを引き起こすウイルスの単離物を用いて、
最初にＨＩＶと呼ばれた株が、現在ＨＩＶ−１と呼ばれており、そして関連する
ウイルスが、ＨＩＶ−２と呼ばれている。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７
）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６２２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９
８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）
Ｎａｔｕｒｅ ３２４：６９１−６８５を参照のこと。
【０００４】 情報の非常な詳細は、ＨＩＶウイルスについては蓄積されているが、しかし、
有効なワクチンについては今日までには同定されていない。ＨＩＶによってコー
ドされるｅｎｖおよびＧａｇ遺伝子産物を含むワクチンの開発のためのいくつか
の標的が、試験されている。Ｇａｇ遺伝子産物として、Ｇａｇ−ポリメラーゼお
よびＧａｇ−プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。Ｅｎｖ遺伝
子産物として、単量体のｇｐ１２０ポリペプチド、オリゴマーの（ｏｌｉｇｏｍ
ｅｒｉｃ）ｇｐ１４０ポリペプチドおよびｇｐ１６０ポリペプチドが挙げられる
が、これらに限定されない。
【０００５】 Ｈａａｓら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６（３）：３１５−３２４、
１９９６）は、ＨＩＶ−１による選択的なコドン使用が、ウイルスのタンパク質
合成の実質的にわずかな非効率性を説明するようであることを示唆した。Ａｎｄ
ｒｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４９７−１５０３、１９８８）は、最
適化されたコドン使用を有する合成ｇｐ１２０配列を使用するＤＮＡのワクチン
接種によって誘発される、増大された免疫応答を記載した。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
ら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２−４９０３、１９９７）は、Ｇａｇ
コード配列およびＧａｇプロテアーゼコード配列内に配置された阻害（または不
安定性）エレメント（ＩＮＳ）の不活化を議論している。
【０００６】 ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、ウイルス様の粒子のアセンブリに必要であ
る。ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、アセンブリ、粒子の放出後のビリオンの
成熟、およびウイルスの複製における初期の侵入後の工程を含む、ウイルスの生
存周期の多くの段階に関連している。ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質の役割は多
数あり、そして複雑である（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１
：１−１５、１９９８）。
【０００７】 Ｗｏｌｆら、（１９９６年１０月３日に公開された、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６
／３０５２３；１９９１年１０月２日に公開された、欧州特許出願公開番号第０
，４４９，１１６ Ａ１号）は、非感染性のレトロウイルス様の粒子キャリアと
して作用するように、特に、免疫学的に重要なエピトープの提示のために、変更
されたＨＩＶ−１のｐｒ５５ Ｇａｇの使用を記載した。Ｗａｎｇら（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ ２００：５２４−５３４、１９９４）は、ビリオンへのＨＩＶ Ｇａ
ｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質のアセンブリを研究するための系を記
載している。彼らは、ＨＩＶ Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を
コードする配列の構築、ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質の存在下でのこのような配列
の発現、およびウイルス粒子へのこれらのタンパク質のアセンブリを記載してい
る。
【０００８】 Ｓｈｉｖｅｒら（１９９８年８月１３日に公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ９８
／３４６４０号）は、ＨＩＶ Ｇａｇをコードする合成ＤＮＡ分子、およびＨＩ
Ｖ Ｇａｇの改変を産生するための、ＨＩＶ−１（ＣＡＭ１）Ｇａｇコード配列
の変更を記載した。合成分子のコドンは、計画された宿主細胞によって好まれる
コドンであった。
【０００９】 最近、免疫原性の組成物中でのＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドの使用が記載され
ている。（異なるＨＩＶ ｅｎｖ改変体をそれぞれ発現する少なくとも４つの異
なる組換えウイルスの混合物を含む免疫原性の組成物を記載している、１９９８
年１２月８日に発行されたＨｕｒｗｉｔｚらの米国特許第５，８４６，５４６号
；および、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質のエピトープに対応するペプチド
を記載している、１９９８年１１月２４日に発行された、Ｖａｈｌｎｅらの米国
特許第５，８４０，３１３号を参照のこと）。さらに、１９９９年３月２日に発
行された、Ｓｉａらの米国特許第５，８７６，７３１号は、配列ＧＰＧＲを含有
しているＨＩＶ−１単離物のＶ３ループタンパク質のＢ細胞エピトープのアミノ
酸配列に対して直接連結されたＧａｇのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含有
しているＨＩＶに対する候補のワクチンを記載している。抗原性のＨＩＶポリペ
プチド（特に、Ｃ型の単離物）の必要性がなお存在している。
【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、Ｃ型ＨＩＶのＧａｇ含有ポリペプチドの改善された発現、およびウ
イルス様粒子の産生、ならびにＥｎｖ含有ポリペプチドに関する。
【００１１】 本発明の１つの局面は、発現カセット、およびその中に含まれるポリヌクレオ
チドに関する。１つの実施形態においては、発現カセットは、ＨＩＶのＧａｇ含
有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
ここでは、Ｇａｇポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列は、本明
細書中に教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、
より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する
配列を含む。Ｇａｇ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列として
、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図１のヌク
レオチド８４４〜９０３（Ｇａｇの主要な相同領域）（配列番号１）；図２のヌ
クレオチド８４１〜９００（Ｇａｇの主要な相同領域）（配列番号２）；図１に
示される配列（配列番号３）および図２に示される配列（配列番号４）。本発明
のＧａｇ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、さらなるポリ
ペプチドをコードする配列を含み得る。このようなさらなるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドとして、例えば、他のＨＩＶタンパク質のコード配列（
例えば、ＨＩＶプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
およびＨＩＶポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）が
挙げられ得る。１つの実施形態においては、ＨＩＶポリメラーゼポリペプチドを
コードする配列は、逆転写酵素およびインテグラ−ゼに対応するコード領域の欠
失によって改変され得る。ポリメラーゼポリペプチド中でのこのような欠失はま
た、ポリヌクレオチド配列がＴ−ヘルパー細胞およびＣＴＬエピトープを保存す
るように作成され得る。他の目的の抗原が、同様にポリメラーゼ中に挿入され得
る。
【００１２】 別の実施形態においては、発現カセットは、ＨＩＶのＥｎｖ含有ポリペプチド
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ここでは、Ｇａ
ｇポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列は、本明細書中に教示さ
れる配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは
約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｅ
ｎｖ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列として、以下のポリヌ
クレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図３のヌクレオチド１２１
３〜１３５３（配列番号５）（Ｅｎｖの共通領域）；図３のヌクレオチド８２〜
１５１２（配列番号６）（ｇｐ１２０ポリペプチド）；図３のヌクレオチド８２
〜２０２５（配列番号７）（ｇｐ１４０ポリペプチド）；図３のヌクレオチド８
２〜２５４７（配列番号８）（ｇｐ１６０ポリペプチド）；図３のヌクレオチド
１〜２５４７（配列番号９）（シグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチド）
；図３のヌクレオチド１５１３〜２５４７（配列番号１０）（ｇｐ４１ポリペプ
チド）；図４のヌクレオチド１２１０〜１３５３（配列番号１１）（Ｅｎｖの共
通領域）；図４のヌクレオチド７３〜１５０９（配列番号１２）（ｇｐ１２０ポ
リペプチド）；図４のヌクレオチド７３〜２０２２（配列番号１３）（ｇｐ１４
０ポリペプチド）；図４のヌクレオチド７３〜２５６５（配列番号１４）（ｇｐ
１６０ポリペプチド）；図４のヌクレオチド１〜２５６５（配列番号１５）（シ
グナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチド）；および、図４のヌクレオチド１
５１０〜２５６５（配列番号１６）（ｇｐ４１ポリペプチド）。
【００１３】 本発明はさらに、選択された宿主細胞中での使用のための組換え発現系を含む
。ここでは、組換え発現系は、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットを
使用する。このような系においては、ポリヌクレオチド配列は、必要に応じて、
選択された宿主細胞中での発現に適合する制御エレメントに対して作動可能に連
結される。多数の発現制御エレメントが、当業者に公知であり、これらとして以
下が挙げられるがこれらに限定されない：転写プロモーター、転写エンハンサー
エレメント、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の
最適化のための配列、および翻訳終結配列。例示的な転写プロモーターとして、
ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ，ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ
−ｌｔｒ、およびメタロチオネインに由来するものが挙げられるが、これらに限
定されない。
【００１４】 本発明の別の局面においては、本発明の発現カセットを含む細胞を含む。ここ
では、ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｅｎｖ含有および／またはＧａｇ含有ポ
リペプチドをコードする）が、選択された細胞中での発現に適合する制御エレメ
ントに対して作動可能に連結されている。１つの実施形態においては、このよう
な細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞として、ＢＨＫ、ＶＥＲ
Ｏ、ＨＴ１０８０、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ細胞が挙げられる
が、これらに限定されない。他の細胞、細胞型、組織型など（これらは、本発明
の実施に有用であり得る）として、以下から得られるものが挙げられるが、これ
らに限定されない：昆虫細胞（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｎ
５）、およびＳｆ９）、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、抗原提示細胞（例えば
、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およびそれらの
先祖細胞）、初代細胞、固定化された細胞、腫瘍に由来する細胞。
【００１５】 さらなる局面においては、本発明は、免疫学的応答を生成するための組成物を
含む。ここでは、組成物は、代表的には、本発明の発現カセットの少なくとも１
つを含み、そして例えば、発現カセットの組合せ（例えば、Ｇａｇ−ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを保有している１つ以上の発現カセット、およ
びＥｎｖ−ポリペプチドをコードするポリペプチドを保有している１つ以上の発
現カセット）を含む。このような組成物はさらに、アジュバントを含み得る。組
成物はまた、１つ以上のＧａｇ含有ポリペプチドおよび／または１つ以上のＥｎ
ｖ含有ポリペプチドを含み得る。Ｇａｇ含有ポリペプチドおよび／またはＥｎｖ
含有ポリペプチドは、組成物中の発現カセットによってコードされるポリペプチ
ドに対応し得るか、あるいは、Ｇａｇ含有ポリペプチドおよび／またはＥｎｖ含
有ポリペプチドは、発現カセットによってコードされるものとは異なり得る。組
成物中で提供される場合の、同じポリペプチドをコードする発現カセット中のポ
リヌクレオチドの一例は以下である：発現カセット中のポリヌクレオチドは図１
のＧａｇ−ポリペプチド（配列番号３）をコードし、そしてポリペプチドは、図
１に示される配列によってコードされるポリペプチド（配列番号１７）である。
組成物中で提供される場合の、異なるポリペプチドをコードする発現カセット中
のポリヌクレオチドの一例は、以下である：Ｇａｇ−ポリメラーゼポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを有する発現カセット、および組成物中で提供さ
れるポリペプチドが、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−プロテアーゼポリペプチド
であり得る。発現カセット（または本発明のポリヌクレオチド）およびポリペプ
チドの両方を含有している組成物においては、本発明のＥｎｖおよびＧａｇ発現
カセットが混合され得、そして／または本明細書中に記載されるＥｎｖ含有およ
びＧａｇ含有ポリペプチドと混合され得、そして／または適合させられ得る。
【００１６】 本発明の別の局面においては、被験体の免疫化の方法を含む。この方法におい
ては、任意の上記の組成物は、被験体中での発現カセットの発現に適合する条件
下で、被験体中に導入される。１つの実施形態においては、発現カセット（また
は本発明のポリヌクレオチド）は、遺伝子送達ベクターを使用して導入され得る
。遺伝子送達ベクターは、例えば、ウイルス性のベクターまたは非ウイルス性の
ベクターであり得る。例示的なウイルス性のベクターとして、シンドビスウイル
スに由来するベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクタ
ーが挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的応答の生成に有用な組成物
はまた、粒子状のキャリアを使用して送達され得る。さらに、このような組成物
は、例えば、金またはタングステン粒子状にコーティングされ得、そしてコーテ
ィングされた粒子は、例えば、遺伝子銃を使用して被験体に送達され得る。組成
物はまた、リポソームとして処方され得る。この方法の１つの実施形態において
は、被験体は哺乳動物であり、そして例えば、ヒトであり得る。
【００１７】 さらなる局面においては、本発明は、被験体中で免疫応答を生成する方法を含
む。ここでは、本発明の発現カセットまたはポリヌクレオチドは、本発明のポリ
ヌクレオチドによってコードされるＥｎｖ含有および／またはＧａｇ含有ポリペ
プチドの発現を提供するように、適切な細胞中で発現される。次いで、ポリペプ
チドが単離され（例えば、実質的に精製され）、そして免疫応答を誘発するため
に十分な量で被験体に投与される。
【００１８】 本発明はさらに、被験体中で免疫応答を生成する方法を含む。ここでは、被験
体の細胞は、任意の上記の本発明の発現カセットまたはポリヌクレオチドで、選
択されたポリヌクレオチドの発現および目的のポリペプチド（例えば、本発明の
任意の発現カセットによってコードされる）の産生を可能にする条件下で、トラ
ンスフェクトされる。この方法によって、ポリペプチドに対する免疫学的応答が
被験体中で誘発される。細胞のトランスフェクションは、エキソビボで行われ得
、そしてトランスフェクトされた細胞は被験体中に再度導入される。あるいは、
またはそれに加えて、細胞は、被験体中でインビボでトランスフェクトされ得る
。免疫応答は、液性であり得るか、および／または細胞によって媒介され得る（
細胞性）。さらなる実施形態においては、この方法はまた、被験体中への発現カ
セットの導入の前、それと同時に、および／またはその後での、Ｅｎｖ−および
／またはＧａｇ含有ポリペプチドの投与を含み得る。
【００１９】 本発明のさらなる実施形態は、精製されたポリヌクレオチドを含む。Ｇａｇ含
有ポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列として、以下のポリ
ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図１のヌクレオチド８４
４〜９０３（Ｇａｇの主要な相同領域）（配列番号１）；図２のヌクレオチド８
４１〜９００（Ｇａｇの主要な相同領域）（配列番号２）；図１に示される配列
（配列番号３）および図２に示される配列（配列番号４）。Ｅｎｖ含有ポリペプ
チドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列として、以下のポリヌクレオチ
ドが挙げられるが、これらに限定されない：図３のヌクレオチド１２１３〜１３
５３（配列番号５）（Ｅｎｖの共通領域）；図３のヌクレオチド８２〜１５１２
（配列番号６）（ｇｐ１２０ポリペプチド）；図３のヌクレオチド８２〜２０２
５（配列番号７）（ｇｐ１４０ポリペプチド）；図３のヌクレオチド８２〜２５
４７（配列番号８）（ｇｐ１６０ポリペプチド）；図３のヌクレオチド１〜２５
４７（配列番号９）（シグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチド）；図３の
ヌクレオチド１５１３〜２５４７（配列番号１０）（ｇｐ４１ポリペプチド）；
図４のヌクレオチド１２１０〜１３５３（配列番号１１）（Ｅｎｖの共通領域）
；図４のヌクレオチド７３〜１５０９（配列番号１２）（ｇｐ１２０ポリペプチ
ド）；図４のヌクレオチド７３〜２０２２（配列番号１３）（ｇｐ１４０ポリペ
プチド）；図４のヌクレオチド７３〜２５６５（配列番号１４）（ｇｐ１６０ポ
リペプチド）；図４のヌクレオチド１〜２５６５（配列番号１５）（シグナル配
列を有するｇｐ１６０ポリペプチド）；および、図４のヌクレオチド１５１０〜
２５６５（配列番号１６）（ｇｐ４１ポリペプチド）。本発明のＧａｇ含有ポリ
ペプチドおよびＥｎｖ−ｗを含有しているポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列は、代表的には、本明細書中に教示される配列に対して、少なくとも
約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましく
は約９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術、またはそれらの組合せ
によって産生され得る。
【００２１】 本発明のこれらおよび他の実施形態が、本明細書中の開示を参照して当業者に
容易に行われる。
【００２２】 （発明の詳細な説明） 本発明の実施は、他に特に示されない限りは、当業者の範囲内である、化学的
、生化学的、分子生物学的、免疫学的、および薬理学的な従来の方法を使用する
。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版（Ｅ
ａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ
．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃ
ｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏ
ｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４
版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ）；
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅ
ｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧ
ｒａｈａｍ編、１９９７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）。
【００２３】 本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用される場合は、単数の「ａ」、
「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他に特に明確に示されない限りは、複数形の対
象物を含む。従って、例えば、「抗原」に関しては、２つ以上のこのような因子
の混合物を含む。
【００２４】 （１．定義） 本発明を記載するにあたって、以下の用語が使用され、そして以下に示される
ように定義されることが意図される。
【００２５】 本明細書中で使用される場合には、「合成」配列は、その発現が本明細書中で
記載されているように、例えば、阻害配列のコドンの置換および不活化によって
最適化されている、Ｇａｇ−をコードするポリヌクレオチドをいう。「野生型」
または「天然の」配列は、本明細書中で使用される場合には、それらが天然にお
いて見出される本質的なポリペプチドのコード配列をいう。例えば、Ｃ型の単離
物（例えば、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８、または
ＡＦ１１０９７５）中で見出される、Ｇａｇおよび／またはＥｎｖをコードする
配列。
【００２６】 本明細書中で使用される場合は、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は
、以下にさらに議論される任意のいくつかのウイルスに由来する、複製性ではな
いウイルスの殻をいう。ＶＬＰは、一般的には、キャプシドタンパク質、コート
タンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質、および／またはエンベロープタン
パク質と呼ばれるこれらのタンパク質、あるいはこれらのタンパク質に由来する
粒子形成ポリペプチド（これらに限定されない）のような、１つ以上のウイルス
タンパク質から構成される。ＶＬＰは、適切な発現系中でタンパク質の組換え発
現の際に自発的に形成し得る。粒子状のＶＬＰを産生するための方法が当該分野
で公知であり、そして以下により完全に記載される。ウイルスタンパク質の組換
え発現後のＶＬＰの存在は、当該分野で公知の従来技術（例えば、電子顕微鏡分
析、Ｘ線結晶解析など）を使用して検出され得る。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照のこと。例え
ば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離され得、そして／または特徴的な
密度のバンド形成によって同定され得る。あるいは、低温電子顕微鏡分析が、対
照のＶＬＰ調製物のガラス状にされた水溶性のサンプル対して行われ得、そして
適切な露出条件下で画像が記録され得る。
【００２７】 特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」によって、全
長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、ならびにそれらのフラグメント、また
は内部欠失を有するウイルスタンパク質が意味される。これらは、ＶＬＰ形成に
好ましい条件下でＶＬＰを形成する能力を有する。従って、ポリペプチドは、全
長の配列、フラグメント、短縮された配列および部分的な配列、ならびに対象分
子のアナログおよび前駆体の形態を含み得る。従って、この用語は、ポリペプチ
ドがＶＬＰを形成する能力を維持している限りは、配列に対する欠失、付加，お
よび置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然のバリエ
ーションを含む。なぜなら、コートタンパク質におけるバリエーションはしばし
ば、ウイルスの単離物間で生じるからである。この用語はまた、タンパク質がＶ
ＬＰを形成する能力を維持している限りは、対象のタンパク質中では天然には生
じない欠失、付加、および置換を含む。
【００２８】 好ましい置換は、天然に保存されている置換（すなわち、アミノ酸の側鎖に関
連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換）である。詳細には、アミノ酸は、
一般的に、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およ
びグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非
極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラ
ニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電極性−−グリシン、
アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェ
ニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸とし
て分類される。
【００２９】 「抗原」とは、液性および／または細胞性抗原特異的応答を生じる宿主免疫系
を刺激する１以上のエピトープを含む分子（線状、配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎａｌ）のいずれか、またはその両方）をいう。この用語は、用語「免疫原」
と交換可能に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミ
ノ酸を含むが、３〜４個の程度の少なさのアミノ酸であり得る。Ｔ細胞エピトー
プ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、
そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含
む。通常、エピトープは、約７と１５との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１
２、または１５個のアミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（す
なわち、抗原が天然に関連している生物全体から分離され、そして別個である抗
原）、ならびに殺傷されたか、弱毒化されたか、または不活性化された細菌、ウ
イルス、真菌、寄生体、または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イデ
ィオタイプ抗体）、またはそのフラグメントおよび合成ペプチドミモトープ（こ
れは、抗原または抗原決定基を模倣し得る）もまた、本明細書中で使用される場
合、抗原の定義の下にとらえられる。同様に、例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ
免疫適用において、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定義内に含まれる。
【００３０】 本発明の目的のために、抗原は、以下により十分に記載されるように、いくつ
かの既知のウイルス、細菌、寄生体および真菌のいずれかに由来し得る。この用
語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを意図する。さらに、本発明の目的のため
に、「抗原」は、タンパク質が本明細書中に定義されるように免疫学的応答を誘
発する能力を維持する限り、ネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付
加および置換）（一般に天然に保存される）を含むタンパク質をいう。これらの
改変は、部位特異的変異誘発を通してのように故意であってもよく、または抗原
を産生する宿主の変異を通してのように偶然であってもよい。
【００３１】 抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する抗原
に対する被験体の液性および／または細胞性免疫応答における発生である。本発
明の目的のために、「液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答
をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球に
より媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細
胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答に関する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝
子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と結合して存在し、そして細
胞表面上に発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内
微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を
補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関
する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣと結合したペプチド抗原を提
示する細胞に対する機能を刺激し、そしてこの細胞に対する非特異的エフェクタ
ー細胞の活性に焦点を当てることを補助するように作用する。「細胞性免疫応答
」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他
の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するもの）により産生される他
のこのような分子の産生をいう。
【００３２】 細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と
結合している抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。こ
の細胞媒介性免疫応答は、その細胞の表面に抗原を提示する細胞に、またはその
付近で指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来的
な保護を可能にするように生成される。
【００３３】 細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定の抗原の能力は、多くのアッセイによ
って（例えば、リンホ増殖（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）（リン
パ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または感作さ
れた被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイをすることによ
って）決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例
えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８
９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２
３６９〜２３７６。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、Ｔ細胞集団に
よる細胞内サイトカインまたはサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異
的Ｔ細胞の測定を含む（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ
，Ａ．Ｊ．、およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１８７（９）１３６７〜１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５〜２１、１９９６；Ｌ
ａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９〜８６５、１９９
７）により総説される）。
【００３４】 従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／ま
たはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗
原もまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、１以上
の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の
組成物またはワクチンに存在する抗原に対して特異的なサプレッサーＴ細胞およ
び／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あ
るいは抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫
された宿主に対する免疫を提供するように働き得る。このような応答は、当該分
野において周知である、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決
定され得る。
【００３５】 「免疫学的組成物」は、被験体への組成物の投与が、目的の抗原性分子に対す
る被験体の液性免疫応答／細胞性免疫応答の発生を生じる抗原性分子を含む組成
物である。免疫原性組成物は、例えば、注射、吸入、経口、鼻腔内、および粘膜
（例えば、直腸内または膣内）投与によって、レシピエント被験体に直接導入さ
れ得る。
【００３６】 「サブユニット」ワクチンとは、目的の病原体由来（例えば、ウイルス、細菌
、寄生体または真菌由来）の抗原に由来するか、またはそれに相同である、１以
上の選択された抗原（しかし、全ての抗原ではない）を含むワクチン組成物を意
味する。このような組成物は、インタクトな病原性細胞または病原性粒子、また
はこのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、「サブユ
ニットワクチン」は、病原体から少なくとも部分的に精製された（好ましくは、
実質的に精製された）免疫原性ポリペプチド、またはそのアナログから調製され
得る。従って、サブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的
な精製技術、組換え産生、または合成産生を含み得る。
【００３７】 「実質的に精製される（た）」とは、一般に、基質（化合物、ポリヌクレオチ
ド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、存在するサンプルの
主要な割合を含むように、基質を単離することをいう。代表的には、サンプル中
に、実質的に精製された成分は、このサンプルの５０％、好ましくは８０〜８５
％、より好ましくは９０〜９５％を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密
度に従う沈降が挙げられる。
【００３８】 「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切
な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合、インビボで
転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳され（ｍＲＮＡの場合）
る核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端で開始コドンによ
って、そして３’（カルボキシ）末端で翻訳終止コドンによって決定される。コ
ード配列には、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、
ウイルスまたは原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列
さえが含まれるが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対し
て３’に位置され得る。
【００３９】 代表的な「制御エレメント」には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレ
メント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止配列に対して３’に
位置する）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’に位置
する）、および翻訳終結配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】 「核酸」分子には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来
のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、お
よび合成ＤＮＡ配列でさえが含まれるが、これらに限定されない。その用語はま
た、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を捕捉する
。
【００４１】 「作動可能に連結した」は、エレメントの配置をいい、ここで、そのように記
載された成分は、それらの機能を行うように構成されている。従って、コード配
列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合
、コード配列の発現をもたらし得る。そのプロモーターは、それがその発現を指
向するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例
えば、転写はされるが翻訳はされない介在配列が、プロモーター配列とコード配
列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能
に連結」していると考えられ得る。
【００４２】 本明細書において、核酸分子を記載するために使用される「組換え」は、その
起源または操作により、（１）天然において結合しているポリヌクレオチドの全
てまたは一部と結合していない；および／または（２）天然において結合してい
る以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合
成の起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関し
て使用される用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成さ
れたポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、
「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞部分として培養された原核生物微生
物または真核生物細胞株を示すそのような他の用語は、互換的に使用され、そし
て組換えベクターまたはその他の移入ＤＮＡのためのレシピエントとして使用さ
れ得る、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされ
ている始原細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的な変異または意図
的な変異に起因して、必ずしも、形態学上、または起源の親に相補的なゲノムも
しくは全ＤＮＡにおいて完全に同一でなくてもよいことが理解される。関連する
特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって
特徴づけられるべき親に充分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって
意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。
【００４３】 アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一
般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および／ま
たは物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する適切な部位での２つ以上
のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。次いで、いわゆ
る「パーセント同一性」は、比較したポリペプチド配列間で決定され得る。核酸
およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた、当該分野で周知であ
り、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する（通常、ｃＤＮ
Ａ中間体を介して）こと、およびそれによりコードされるアミノ酸配列を決定す
ること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較することを包含する。一般に、
「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、
正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。
【００４４】 ２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定す
ることによって比較され得る。２つ以上のアミノ酸配列は、同様に、「パーセン
ト同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一
性（核酸またはペプチド配列が一般に記載されているか否か）は、一般に、より
短い配列の長さによって除算され、そして１００を積算された２つの整列された
配列間の正確な整合の数として記載される。核酸配列についてのおよその整列は
、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的な相同
性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｏｆｆ，Ａｔ
ｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５補遺、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、そしてＧｒｉｓｋｏｖ
、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６
）によって規格化された、スコア付けマトリックスを使用して、ペプチド配列を
用いる使用にまで拡張し得る。核酸およびペプチド配列についてのこのアルゴリ
ズムの実行は、それらのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションにお
いてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
）によって提供される。この方法についてのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏ
ｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に記載される。配列間
のパーセント同一性または類似性を計算するための他の等しく適切なプログラム
は、当該分野で一般に公知である。
【００４５】 例えば、特定のヌクレオチド配列の、参照配列に対するパーセント同一性は、
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、デフォルトスコア
付け表および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーとともに使用して決定
され得る。本発明の状況においてパーセント同一性を確立するための別の方法は
、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって
開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって頒布されているＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅ
ｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権の帰属するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使
用することである。このパッケージソフトから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ
アルゴリズムが、スコア付表（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１
のギャップ拡張ペナルティ、および６のギャップ）について使用されるデフォル
トパラメータが使用される場合に、利用され得る。作成されたデータから、「マ
ッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似
性を計算するための他の適切なプログラム（例えば、整列プログラムＢＬＡＳＴ
（これはデフォルトパラメータでも使用され得る））は、一般に、当該分野で公
知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラ
メータでも使用され得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；
カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０
配列；選別＝高スコア；データベース＝非縮重、Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋Ｄ
ＤＢＪ＋ＰＤＢ＋Ｇｅｎｂａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕ
ｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアド
レスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇ
ｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４６】 当業者は、上記のプログラムにおいて所定の配列について使用するための適切
な検索パラメータを容易に決定し得る。例えば、検索パラメータは、問題の配列
のサイズに基づいて変化し得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は
、Ｘ個の連続するヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含み、こ
こで、（ｉ）Ｘ個の連続するヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の配列
に由来するＹ個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約５０％の同一性を
有し；（ｉｉ）ＸとＹは等しく、かつ（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチドよりも大
きいか、それに等しく、そして５０００ヌクレオチドまでであり、好ましくは、
８ヌクレオチドより大きいか、またはそれに等しく、そして５０００ヌクレオチ
ドまでであり、より好ましくは、１０〜１２ヌクレオチドであり、そして５００
０ヌクレオチドまでであり、そしてさらにより好ましくは、１５〜２０ヌクレオ
チドであり、本明細書に記載される全長配列（例えば、配列表および特許請求の
範囲を参照）に存在するヌクレオチドの数までであり、上記の範囲内の全ての整
数値が含まれる。
【００４７】 本発明の合成の発現カセット（および精製したポリヌクレオチド）には、本明
細書に記載される合成の発現カセット配列に対して（例えば、本発明の特許請求
された配列またはその他の配列）、本発明の配列が問い合わせ配列として使用さ
れた場合に、約８０％〜１００％の、８０〜８５％より大きい、好ましくは、９
０〜９２％より大きい、より好ましくは、９５％より大きい、そして最も好まし
くは、９８％より大きい配列同一性（これらの記載の範囲に入る全ての整数値を
含む）有する関連するポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００４８】 ２つの核酸フラグメントは、本明細書に記載される場合、「選択的にハイブリ
ダイズ」すると考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このよう
な分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分
的に同一の核酸配列は、少なくとも部分的に、完全に同一な配列が標的分子にハ
イブリダイズすることを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーション
の阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン
ブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、など、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照）を使用して評価され得
る。このようなアッセイは、例えば、低ストリンジェントから高ストリンジェン
トまでの種々の条件を使用して、種々の程度の選択性を使用して行われ得る。低
ストリンジェンシー条件が利用される場合、非特異的結合の不在は、非特異的な
結合事象の不在下で、二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分
的な程度の配列同一性を欠損する二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％よ
りも少ない配列同一性を有するプローブ）を使用することによって評価され得る
。
【００４９】 ハイブリダイゼーションに基づく検出システムが利用される場合、標的核酸配
列に対して相補的な核酸プローブが選択され、次いで適切な条件の選択により、
そのプローブおよび標的配列が、互いに、「選択的にハイブリダイズする」か、
結合して、ハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」な条件
下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択さ
れた核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも
約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハ
イブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的
には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より大きな配列同一性を
有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能
にする。プローブと標的が特定の程度の配列同一性を有するプローブ／標的ハイ
ブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で
公知なように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍ
ｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｇｉｎｓ編、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈ
ｉｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）。
【００５０】 ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多数の
等価な条件が、例えば、以下のファクターを変化させることによって、特定のス
トリンジェンシーを確立するために利用され得ることは、当該分野で周知である
：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および
その他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液
中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、およびポリエ
チレングリコール）の存在も非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時
間パラメータ、ならびに種々の洗浄条件。特定の組のハイブリダイゼーション条
件の選択は、当該分野での標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照）。
【００５１】 第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドの領域、そのｃＤＮＡ、
その相補物と、同一の塩基対配列を有するか、または実質的に同一の塩基対配列
を有する場合、あるいは第１のポリヌクレオチドが上記のように配列同一性を示
す場合、その第１のポリヌクレオチドは、その第２のポリヌクレオチドに「由来
する」。
【００５２】 第１のポリペプチドが、（ｉ）第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリ
ヌクレオチドによってコードされる場合、または（ｉｉ）上記のように第２のポ
リペプチドと配列同一性を示す場合、その第１のポリペプチドは、その第２のポ
リペプチドに「由来する」。
【００５３】 ウイルスポリペプチドが、（ｉ）そのウイルスのポリヌクレオチド（ウイルス
ポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされる場合
、（ｉｉ）上記のようにそのウイルスのポリペプチドに対する配列同一性を示す
場合、一般に、そのウイルスポリペプチドは、ウイルスの特定のポリペプチド（
ウイルスポリペプチド）に「由来する」。
【００５４】 「コードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいい、ここ
で、ポリペプチド配列またはその部分は、核酸配列によってコードされるポリペ
プチド由来の、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０
アミノ酸、そしてなおより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸
配列を含む。その配列によってコードされるポリペプチドを用いて免疫学的に同
定され得るポリペプチド配列もまた、含まれる。
【００５５】 「精製されたポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが天然に会合す
るタンパク質を実質的に含まない（例えば、約５０％未満を含む、好ましくは約
７０％未満を含む、そしてより好ましくは約９０％未満を含む）目的のポリヌク
レオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製する技
術は、当該分野において周知であり、そして、例えば、カオロピック剤を用いる
ポリヌクレオチドを含有する細胞の破壊、およびイオン交換クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降によるポリヌクレオ
チドおよびタンパク質の分離が挙げられる。
【００５６】 「核酸免疫化」によって、インビボにおける抗原（単数および複数）あるいは
エピトープ（単数および複数）の発現のために、宿主細胞中に１つ以上の選択し
た抗原をコードする核酸分子を導入することを意味する。核酸分子は、例えば、
注入投与、吸入投与、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシ
ピエント被験体中に直接的に導入され得るか、あるいは、エキソビボで宿主から
取り出された細胞中に導入され得る。後者の場合、形質転換された細胞は、被験
体中に再導入され、被験体中で、核酸分子によってコードされる抗原に対する免
疫応答を開始し得る。
【００５７】 「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、宿主細胞中に目的のＤＮＡを確実
に挿入するための方法または系をいう。そのような方法は、非組み込み型移入Ｄ
ＮＡの一過性の発現、染色体外複製および移入レプリコン（例えば、エピソーム
）の発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への移入された遺伝子物質の挿入を
生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイ
ルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定さ
れない。免疫化のために使用される場合、そのような遺伝子送達発現ベクターは
、ワクチンまたはワクチンベクターと称され得る。
【００５８】 「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、免疫系の細胞媒介性攻撃の部分を構成す
る非抗体産生リンパ球である。Ｔ細胞は、骨髄から胸腺（胸腺でＴリンパ球は、
胸腺ホルモンの指令のもと、成熟化プロセスを受ける）に移動する未成熟のリン
パ球から生じる。ここで、成熟リンパ球は、迅速に分裂し、非常に大多数に増加
する。成熟するＴ細胞は、特定の抗原を認識しそして結合するその能力に基づい
て、免疫適格となる。免疫適格Ｔ細胞の活性化は、抗原がリンパ球表面レセプタ
ーに結合する場合に、誘発される。
【００５９】 用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうた
めに使用される。外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入される場合、その細胞は、「
トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野
において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉ
ｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３
：１９７を参照のこと。そのような技術を使用して、適切な宿主細胞中に１つ以
上の外来ＤＮＡ部分を導入し得る。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みお
よび一過性の取り込みの両方をいい、そしてペプチド結合ＤＮＡおよび抗体結合
ＤＮＡの取り込みを含む。
【００６０】 「ベクター」は、標的細胞に対して、遺伝子配列を移入し得る（例えば、ウイ
ルスベクター、非ウイルスベクター、粒子キャリア、およびリポソーム）。典型
的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」
は、目的の遺伝子の発現を指向し得る任意の核酸構築物を意味し、標的細胞へ遺
伝子配列を移入し得る。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現
ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００６１】 標的細胞への「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の移入は、通常の
細胞に対して比較的非毒性の化合物または組成物に対して細胞を感受性にする。
Ｍｏｏｌｔｅｎ、Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、
１：２７９〜２８７。自殺遺伝子の例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ
（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら、（１９９６）Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：５１３〜５２０）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（
Ｍａｎｏｍｅら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（５）：５
６７〜５７３）および細菌酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら（１９９６）
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：７１３〜７２０）である。これら
の遺伝子を発現する細胞は、比較的非毒性のプロドラッグであるガンシクロビル
（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１）、シト
シンアラビノシド（ヒトのデオキシシチジンキナーゼ）または５−フルオロシト
シン（細菌シトシンデアミナーゼ）の効果に対して、感受性となる。Ｃｕｌｖｅ
ｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１５５０〜１５５２、Ｈｕｂｅｒら
（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８３０２
〜８３０６。
【００６２】 「選択マーカー」または「レポーターマーカー」とは、治療的活性を有さない
が、むしろ遺伝子移入ベクターのより単純な調製、操作、特徴付けまたは試験を
可能にするために含まれる、遺伝子移入ベクター中に含まれるヌクレオチド配列
をいう。
【００６３】 「特異的結合剤」とは、分子の特異的結合対のメンバーをいい、ここでこの分
子の１つは、化学的および／または物理的手段を通じて、第２の分子に特異的に
結合する。特異的結合剤の１つの例は、選択された抗体に対する抗体である。
【００６４】 「被験体」によって、限定することなく、ヒトおよび他の霊長類（非ヒト霊長
類、例えば、チンパンジーおよび他の尾なしザル種およびサル種を含む）；ウシ
、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウシのような家畜；イヌおよびネコのようなペット
；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験室動物；ニワト
リ、シチメンチョウ、および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウなどのような
ペット、野生のトリおよび競技用のトリを含むトリ、を含む脊索動物亜門のメン
バーを意味する。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成熟個体およ
び新生個体を含むことが意味される。これら全ての脊椎動物の免疫系は、同様に
作動するので、上記の系は、上記の任意の脊椎動物種における使用が意図される
。
【００６５】 「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」によって、生物学的では
なく、またそれ以外においても望まれないことのない物質、すなわち、望まれな
い生物学的効果を全く生じることなく、かつその物質が含まれる組成物のいずれ
の化合物とも有害な様式において相互作用することなく、処方物または組成物中
で個体に投与され得る物質が意味される。
【００６６】 「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」によって、約７．２〜８．０
の範囲内のｐＨ（ｐＨ７．２およびｐＨ８．０を含む）、より典型的には約７．
２〜７．６の範囲内のｐＨ（ｐＨ７．２およびｐＨ７．６を含む）が、意味され
る。
【００６７】 本明細書において使用される場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンに
おけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または除去、およ
び（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な除去または完全な除去、のいずれかをいう
。処置は、予防的（感染前）であっても、治療的（感染後）であってもよい。
【００６８】 「レンチウイルスベクター」および「組換えレンチウイルスベクター」とは、
目的の核酸分子を輸送し、そして特定の実施形態において、目的の核酸分子の発
現を指向し得る核酸構築物をいう。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つ
の転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座決定エレメント、あるいは選
択的スプライシング、核ＲＮＡの搬出、メッセンジャーの転写後修飾、またはタ
ンパク質の翻訳後修飾のような他の手段によって遺伝子発現を制御する他のエレ
メントを含む。そのようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長
末端反復（ＬＴＲ）もしくはその部分、ならびに使用されるレトロウイルスに適
切な正鎖プライマー結合部位および逆鎖プライマー結合部位を含まなければなら
ない（レトロウイルスベクター中に既に存在しない場合）。必要に応じて、組換
えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、Ｎｅｏ
、ＴＫ、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、またはＤＨＦＲ
のような選択マーカー、ならびに１つ以上の制限部位、および翻訳終結配列を含
み得る。例として、そのようなベクターは、代表的に５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合
部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲま
たはそれらの部分を含む。
【００６９】 本発明において使用される場合、「レンチウイルスベクター粒子」とは、少な
くとも１つの目的の遺伝子を輸送するレンチウイルスをいう。レトロウィルスは
また、選択マーカーを含み得る。組換えレンチウイルスは、感染の際に、その遺
伝子物質（ＲＮＡ）をＤＮＡに逆転写し、そしてこの遺伝子物質を宿主細胞のＤ
ＮＡ中に組み込み得る。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスエンベ
ロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、二重の（ａｍｐｈｏ）エンベ
ロープまたはＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、あるいはキメラエンベロープを有し得
る。
【００７０】 「核酸発現ベクター」または「発現カセット」とは、目的の配列または目的の
遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。核酸発現ベクターは、目的の配列
または目的の遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含む。他の制御エレメ
ントもまた、存在し得る。本明細書において記載される発現カセットは、プラス
ミド構築物中に含まれ得る。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物は
また、細菌の複製起点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物を１本鎖Ｄ
ＮＡとして生成させるシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、多重クローニング
部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０複製起点またはアデノウ
イルス複製起点）を含み得る。
【００７１】 「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウィルスベクターには欠失してい
るが、感染性組換えレトロウィルスの産生に必要なエレメントを含む細胞をいう
。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、Ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ
タンパク質をコードし、タンパク質を発現し得る１つ以上の発現カセットを含む
。
【００７２】 「プロデューサー細胞」または「ベクター産生細胞」とは、組換えレトロウィ
ルスベクター粒子の産生のために必要なエレメントの全てを含む細胞をいう。
【００７３】 （２．発明を実施するための形態） 本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん、特定の処方物もプロセス
のパラメーターも変動し得るので、特定の処方物にもプロセスのパラメーターに
も限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、
本発明の特定の実施形態を記載する目的のためでしかなく、限定されることは意
図されないこともまた理解されるべきである。
【００７４】 本明細書中に記載された方法および材料と類似するかまたは等価な多数の方法
および材料が、本発明の実施で用いられ得、好ましい材料および方法が本明細書
中に記載される。
【００７５】 （２．１ 合成発現カセット） （２．１．１ ＨＩＶ−１ Ｃ型ＧＡＧ核酸コード配列ＥＮＶ核酸コード配列
の改変） 本発明の１つの局面は、対応する野生型配列と比較して改善された発現を有す
る、ＨＩＶ−１ Ｃ型ＧａｇおよびＥｎｖのタンパク質コード配列ならびに関連
の配列の作製である。
【００７６】 （２．１．１．１．ＧＡＧ核酸コード配列の改変） 本発明の例示的な実施形態は、ＨＩＶ−１のＣサブ型のＡＦ１１０９６５株お
よびＡＦ１１０９６７株（例えば、Ｂｏｔｓｗａｎａからの種々のＣサブ型クロ
ーンの分子クローニングについてＫｏｒｂｅｒら（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍ
ｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
；Ｎｏｖｉｔｓｋｙら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：４４２７−４
４３２を参照のこと）から得られたＧａｇタンパク質野生型配列を改変すること
により、本明細書中で例示される。他のＣ型ＨＩＶ−１改変体から得られたＧａ
ｇ配列は、本明細書の教示に従って類似の様式で操作され得る。このような他の
改変体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、Ｎｏｖｉ
ｔｓｋｙら（１９９９）前出；Ｍｙｅｒｓら，下記；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版
（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編，１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，１９９１
）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ，ＤＭ Ｋｎｉｐｅ，ＰＭ
Ｈｏｗｌｅｙ編，１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａ
ｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡおよびＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（インターネット）
において、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｇｉ
−ｂｉｎ／ｈｉｖＤＢ３／ｐｕｂｌｉｃ／ｗｄｂ／ｓｓａｍｐｕｂｌｉｃおよび
ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．において記載されるような
ＨＩＶ−１ Ｃ型の単離体から得られたＧａｇタンパク質コード配列。
【００７７】 第１に、得られる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子のコドン使
用法に匹敵するように、ＨＩＶ−１コドン使用法パターンを改変した（実施例１
）。ＨＩＶコドン使用法は、コドントリプレットのヌクレオチドＡまたはＴの高
い含量を反映する。ＨＩＶ−１コドン使用法の効果は、減少した翻訳能力および
ｍＲＮＡの不安定性をもたらす、ＤＮＡ配列における高いＡＴ含量である。比較
すると、高度に発現されるヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。Ｇａ
ｇコード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン使用法
に匹敵するように改変された。
【００７８】 第２に、Ｇａｇコード配列のコード配列内に位置する、阻害性（または不安定
性）エレメント（ＩＮＳ）が存在する。ＲＲＥは、ＨＩＶコードＲｅｖ−タンパ
ク質と相互作用して、ＩＮＳの発現下方調節効果を克服する二次ＲＮＡ構造であ
る。ＲＲＥおよびＲｅｖの転写後活性化機構を克服するために、不安定性エレメ
ントは、コードされるタンパク質のリーディングフレームを変更しない複数の点
変異を導入することによって不活化され得る。不活化されたＲＲＥ部位を有する
Ｃサブ型Ｇａｇコード配列を、図１（配列番号３）、図２（配列番号４）、図５
（配列番号２０）および図６（配列番号２６）に示す。
【００７９】 Ｇａｇポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株（ならびに昆
虫細胞を含むがこれに限定されない他の型の細胞株）において、野生型コード配
列と比較して改善された発現をもたらす。さらに、この配列の発現は、これらの
細胞株によるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生をもたらす（以下を参照のこと）
。
【００８０】 （２．１．１．２ ＥＮＶ核酸コード配列の改変） 同様に、本発明はまた、改変されたＥｎｖタンパク質を包含する。野生型Ｅｎ
ｖ配列は、ＨＩＶ−１のＣ型のＡＦ１１０９６８株およびＡＦ１１０９７５株か
ら得られる（例えば、Ｂｏｔｓｗａｎａからの種々のサブ型Ｃクローンの分子ク
ローニングについては、Ｎｏｖｉｔｓｋｙら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３
（５）：４４２７−４４３２を参照のこと）。他のＣ型ＨＩＶ−１改変体から得
られたＥｎｖ配列は、本明細書の教示に従って同様の様式で操作され得る。この
ような他の改変体としては、上記の、ＨＩＶ−１のＣ型の単離体から得られたＥ
ｎｖタンパク質コード配列が挙げられるがこれに限定されない。
【００８１】 得られる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出される
コドン使用法と匹敵するように、Ｅｎｖについてのコドン使用法パターンを、Ｇ
ａｇについて上記のように改変した。実験を、本発明の支持の下で行って、合成
Ｅｎｖ配列が、ネイティブなＥｎｖ配列と比較してより高いレベルでタンパク質
産生し得ることを示し得る。
【００８２】 Ｅｎｖポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株（ならびに昆
虫細胞を含むがこれに限定されない他の型の細胞株）において、野生型コード配
列と比較して改善された発現をもたらす。類似のＥｎｖポリペプチドコード配列
を得て、最適化し、そしてＧａｇについて上記で記載された単離体を含む種々の
単離体からの改善された発現について試験し得る。
【００８３】 （２．１．２ ＨＩＶ−１ ＧＡＧ核酸コード配列を含む配列のさらなる改変
） 実験を行って、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ−プロテアーゼ配列およびＧａｇ−ポリメ
ラーゼ配列の類似の改変もまた、ポリタンパク質の改善された発現、ならびにこ
のような改変されたコード配列から産生されるポリペプチドによって形成された
ＶＬＰの産生をもたらすことを示し得る。
【００８４】 Ｇａｇ−プロテアーゼ配列については、コドン使用法の変更は、代表的に−１
フレームシフトまでの領域に制限され、そして代表的にＧａｇリーディングフレ
ームの最後で再度始まる；しかし、フレームシフト翻訳領域内の領域もまた改変
され得る。さらに、Ｇａｇ−プロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列
内に位置する阻害性（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）もまた変更され得
る。
【００８５】 Ｇａｇ−ポリメラーゼ配列については、コドン使用法における変更は、Ｇａｇ
−プロテアーゼ配列についてのコドン使用法と類似であり得る。
【００８６】 ＨＩＶ関連配列を含むポリタンパク質に加えて、本発明のＧａｇコード配列は
、免疫原性応答が所望される他のポリペプチド（キメラポリペプチドを作製する
）へと融合され得る。
【００８７】 本発明の実施において有用なさらなる配列としては、以下が挙げられるがこれ
らに限定されない：さらなるウイルスエピトープ／抗原をコードする配列｛以下
を含むがこれらに限定されない：ＨＣＶ抗原（例えば、Ｅ１、Ｅ２；１９９８年
２月３日に発行された、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら，米国特許第５，７１４，５
９６号；１９９８年１月２７日に発行された、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら，米国
特許第５，７１２，０８８号；１９９７年１１月４日に発行された、Ｈｏｕｇｈ
ｔｏｎ，Ｍ．ら，米国特許第５，６８３，８６４号；１９９８年３月１７日に発
行された、Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら，米国特許第５，７２８，５２０号；１９
９８年６月１６日に発行された、Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら，米国特許第５，７
６６，８４５号；１９９７年９月２３日に発行された、Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．
ら，米国特許第５，６７０，１５２号）、ＨＩＶ抗原（例えば、ｔａｔ、ｒｅｖ
、ｎｅｆおよび／またはｅｎｖ由来）｝；ならびに腫瘍抗原／エピトープをコー
ドする配列。さらなる配列は、以下に記載される。また、互いに対するＧａｇお
よび他のコード配列の配向についてのバリエーションは、以下に記載される。
【００８８】 Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、および／またはＧａｇ−ポリメラーゼポリペ
プチドコード配列は、Ｃ型ＨＩＶ単離体から入手され得る（例えば、Ｍｙｅｒｓ
ら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉ
ｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａ
ｎｄ Ａｉｄｓ，１９９７，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌ
ｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）
。合成発現カセットは、このようなコード配列を出発物質として、本明細書の教
示（例えば、実施例１を参照のこと）に従って用いて作製され得る。
【００８９】 さらに、本発明の合成発現カセットとしては、本明細書中に開示される合成発
現カセット配列（例えば、図１、２、５および６（配列番号３、４、２０および
２１）に対して８５％を超える、好ましくは９０％を超える、より好ましくは９
５％を超える、そして最も好ましくは９８％を超える配列同一性を有する、関連
するＧａｇポリペプチドコード配列が挙げられる。
【００９０】 本発明としてはまた、本明細書中に開示される配列（例えば、図３および図４
、配列番号５〜１７）に対して８５％を超える、好ましくは９０％を超える、よ
り好ましくは９５％を超える、そして最も好ましくは９８％を超える配列同一性
を有する、関連するＥｎｖポリペプチドコード配列が挙げられる。種々のコード
領域を図３および図４に示し、例えば、図３（ＡＦ１１０９６８）では、ヌクレ
オチド１〜８１（配列番号１８）はシグナルペプチドをコードし、ヌクレオチド
８２〜１５１２（配列番号６）はｇｐ１２０ポリペプチドをコードし、ヌクレオ
チド１５１３〜２５４７（配列番号１０）はｇｐ４１ポリペプチドをコードし、
ヌクレオチド８２〜２０２５（配列番号７）はｇｐ１４０ポリペプチドをコード
し、そしてヌクレオチド８２〜２５４７（配列番号８）はｇｐ１６０ポリペプチ
ドをコードする。
【００９１】 （２．１．３ ＨＩＶ−１ ＧＡＧまたはＥＮＶおよび関連するポリペプチド
をコードする合成配列の発現） 本発明の合成Ｇａｇコード配列および合成Ｅｎｖコード配列（発現カセット）
は、発現のレベルを評価するために、そしてＧａｇの場合、ＶＬＰの産生を評価
するために多数の種々の発現ベクター中にクローン化され得る。ＥｎｖおよびＧ
ａｇについての合成ＤＮＡフラグメントは、真核生物発現ベクター（一過性発現
ベクター、ＣＭＶプロモーターに基づく哺乳動物ベクター、およびバキュロウイ
ルス発現系において使用するためのシャトルベクターを含む）中にクローン化さ
れ得る。対応する野生型配列もまた、同じベクター中にクローン化され得る。
【００９２】 次いで、これらのベクターは、種々の哺乳動物細胞株を含む数種の異なる細胞
型（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能な２９３細胞株、ＲＤ細胞株、ＣＯ
Ｓ−７細胞株およびＣＨＯ細胞株）中にトランスフェクトされ得る。次いで、こ
れらの細胞株は、適切な条件下で培養され、そしてｐ２４（Ｇａｇ）またはｇｐ
１６０もしくはｇｐ１２０（Ｅｎｖ）発現の上清中でのレベルが評価され得る（
実施例２）。Ｅｎｖポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：例えば、ネイティブｇｐ１６０、オリゴマーｇｐ１４０、モノマーｇｐ
１２０、ならびにこれらのポリペプチドの改変された配列。これらのアッセイの
結果は、合成Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＧａｇ−プロテアーゼコード配列の発現が、
対応する野生型配列よりも有意に高いことを実証する。
【００９３】 さらに、ウェスタンブロット分析を用いて、合成Ｇａｇ発現カセットまたは合
成Ｅｎｖ発現カセットを含む細胞が、予想されるタンパク質を、ネイティブの発
現カセットを含む細胞よりも高い、細胞あたりの濃度で産生することを示し得る
。このＧａｇタンパク質およびＥｎｖタンパク質は、細胞溶解産物および上清の
両方において見られ得る。産生レベルは、本発明の合成発現カセットでトランス
フェクトした細胞についての細胞上清において有意に高い。
【００９４】 合成Ｇａｇ発現カセットまたは合成Ｅｎｖ発現カセットでトランスフェクトし
た哺乳動物細胞由来の上清の分画を用いて、このカセットが、Ｇａｇタンパク質
およびＥｎｖタンパク質の両方の、そしてＧａｇの場合、ＶＬＰの、野生型配列
と比較して優れた産生を提供することを示し得る。
【００９５】 哺乳動物細胞株におけるこれらのＧａｇ含有ポリペプチドおよび／またはＥｎ
ｖ含有ポリペプチドの効率的な発現は、以下の利点を提供する：このポリペプチ
ドは、バキュロウイルス夾雑物を含まないこと；ＦＤＡによって承認された樹立
された方法による産生；純度の上昇；（ネイティブのコード配列と比較して）よ
り高い収率；および本発明の構築物を用いて得られる発現の増加がないと実行可
能でないＣＨＯ細胞中でＧａｇ含有ポリペプチドおよび／またはＥｎｖ含有ポリ
ペプチドを産生する新規方法。例示的な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９
３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６
６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭおよ
びＣＥＭＸ１７４（このような細胞株は、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可
能である）。
【００９６】 本発明の合成Ｇａｇ発現カセットはまた、昆虫細胞へとトランスフェクトされ
た場合に高レベルの発現およびＶＬＰ産生を示す。合成Ｅｎｖ発現カセットはま
た、昆虫細胞における高レベルの発現を実証する。さらに、より高い総タンパク
質収率に加えて、合成ポリペプチドからの最終産物は、ネイティブなＧａｇまた
はＥｎｖからの最終産物よりも少ない量の夾雑バキュロウイルスタンパク質を一
貫して含む。
【００９７】 さらに、本発明の合成Ｇａｇ発現カセットおよびＥｎｖ発現カセットはまた、
酵母ベクター中へと導入され得、これは次いで、酵母細胞へと形質転換され得、
そして酵母細胞によって効率的に発現され得る（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｅａ；１９９８年３月１７日に発行された、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許第３５，７４９
号に記載されるようなベクターを用いて）。
【００９８】 哺乳動物ベクターおよび昆虫ベクターに加えて、本発明の合成発現カセットは
、種々の発現ベクター中へと、選択された発現制御エレメントを用いて組み込ま
れ得る。任意の所定の細胞型について適切なベクターおよび制御エレメントは、
発現ベクターについての本明細書の教示および当該分野で公知の情報を考慮して
当業者によって選択され得る。
【００９９】 例えば、合成Ｇａｇ発現カセットまたは合成Ｅｎｖ発現カセットは、選択され
た細胞型における遺伝子の発現を可能にする、所望のコード配列に作動可能に連
結された制御エレメントを含むベクター中に挿入され得る。例えば、哺乳動物細
胞発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、以下が挙げられる：
ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモ
ーター（ＣＭＶプロモーターはイントロンＡを含み得る））、ＲＳＶ、ＨＩＶ−
Ｌｔｒ、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ｌｔｒ）、アデ
ノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイル
スプロモーター。他の非ウイルス性プロモーター（例えば、マウスメタロチオネ
イン遺伝子由来のプロモーター）はまた、哺乳動物発現についての用途を見出す
。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列はまた、翻訳終止コドンに
対して３’側に位置して存在する。好ましくは、コード配列に対して５’側に位
置する、翻訳開始の最適化のための配列もまた存在する。転写ターミネーター／
ポリアデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載される
ような、ＳＶ４０由来の転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナル、ならび
にウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。スプライスドナー部位お
よびスプライスアクセプター部位を含むイントロンもまた、本発明での使用のた
めに構築物中で設計され得る（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【０１００】 エンハンサーエレメントをまた本明細書中で用いて、哺乳動物構築物の発現レ
ベルを増加させ得る。例としては、以下が挙げられる：Ｄｉｊｋｅｍａら，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるようなＳＶ４０初期遺伝子エン
ハンサー、Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（
１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反
復配列（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーターおよびＢｏｓｈａｒｔ
ら，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるようなヒトＣＭＶに由来す
るエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に含まれるエレ
メント）。
【０１０１】 所望の合成Ｇａｇポリペプチドコード配列またはＥｎｖポリペプチドコード配
列は、適切な宿主系でのポリペプチドの発現を生じるために多数の市販のベクタ
ー中にクローン化され得る。これらの系としては、以下が挙げられるがこれらに
限定されない：バキュロウイルス発現｛Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．ら，ＢＡＣＵＬ
ＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｍｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ １１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）｝、ワクシニア発現｛Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．ら，「Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅ
ｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編
），Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌ
ｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；１９９２年
８月４日に発行されたＭｏｓｓ，Ｂ．ら，米国特許第５，１３５，８５５号｝、
細菌中での発現｛Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣ
ＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ｝、酵母中
での発現｛１９９８年３月１７日に発行されたＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．および
Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許第３５，７４９号；１９９７
年５月１３日に発行されたＳｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，
２０３号；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．ら，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗ
ｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ
．Ａ．ら，Ｙｅａｓｔ ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（１９９
０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１）｝、哺乳動物細胞中での発現｛Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒｏｕｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；例え
ば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．ら，Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａ
ｕ，Ｙ．Ｆ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９
８４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，第１８５巻，５３７−５６６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（１９９１）｝、および植物細胞中での発現｛
植物クローン化ベクター，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡおよびＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｈｏｏｄ，Ｅ
．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎ
ａｇｅｌ，Ｒ．ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（
１９９０）；Ａｎら，「Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ」など、Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３：１−１９（１９８８
）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．ら，２４９−２６５頁など、Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．ら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ（１９８７）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ｐ．Ｇ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉ
ｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒ
ｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｓｓ，１
９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９７｝。
【０１０２】 本発明にはまた、コード配列および適切な宿主におけるコード領域の発現を可
能にする発現制御エレメントを含む発現ベクターが含まれる。この制御エレメン
トは一般に、プロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳終結配列および転写
終結配列、ならびに挿入片をベクター中へと導入するための挿入部位を含む。翻
訳制御エレメントは、Ｍ．Ｋｏｚａｋ（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｍａｍｍ．
Ｇｅｎｏｍｅ ７（８）：５６３−５７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍｉｅ ７６（９）：８１５−８２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，
Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａ
ｋ，Ｍ．およびＳｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
６０：３６０−３７５，１９７９）によって概説された。
【０１０３】 酵母系における発現は、商業的産生の利点を有する。ワクシニアおよびＣＨＯ
細胞株による組換えタンパク質産生は、哺乳動物発現系であるという利点を有す
る。さらに、ワクシニアウイルス発現は、以下を含むいくつかの利点を有する：
（ｉ）その広範な宿主域；（ｉｉ）組換えタンパク質の信頼のおける転写後改変
、プロセシング、折り畳み、輸送、分泌、およびアセンブリー；（ｉｉｉ）比較
的可溶性の組換えタンパク質の高レベルの発現；ならびに（ｉｖ）外来ＤＮＡを
収容する大きな能力。
【０１０４】 合成Ｇａｇコード発現カセットおよび／またはＥｎｖコード発現カセットから
組換え発現されたポリペプチドは代表的に、溶解された細胞または培養培地から
単離される。精製は、以下を含む、当該分野で公知の方法によって実施され得る
：塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラ
フィー、サイズ分画およびアフィニティークロマトグラフィー。免疫アフィニテ
ィークロマトグラフィーは、例えば、Ｇａｇ抗原またはＥｎｖ抗原に基づいて生
成された抗体を用いて使用され得る。
【０１０５】 哺乳動物細胞を用いて本発明のＧａｇ含有タンパク質および／またはＥｎｖ含
有タンパク質を発現することの利点としては、以下が挙げられるがこれらに限定
されない：大規模産生について充分に樹立されたプロトコル；ＶＬＰを生成する
能力；細胞株は、優良製造プロセス（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ
ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＧＭＰ）基準を満たすに適切であること；哺乳動物細胞につ
いての培養条件は当該分野で公知であること。
【０１０６】 本明細書中に記載される、本発明の種々の形態の異なる実施形態が合わせられ
得る。
【０１０７】 （２．２ ウイルス様粒子の産生およびパッケージング細胞株を作製するため
の本発明の構築物の使用） ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の群特異的抗原（Ｇａｇ）は、種々
の真核生物細胞から出芽によって放出される非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）
へと自己アセンブリーする（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１
：１−１５，１９９８によって概説される）。本発明の合成発現カセットは、種
々の異なる細胞型（哺乳動物細胞を含むがこれに限定されない）を用いたＨＩＶ
−Ｇａｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生のために効率的な手段を提供する。
【０１０８】 ウイルス粒子は、ウイルス粒子に封入または会合された抗原の、宿主免疫系へ
の適切な提示のためのマトリクスとして用いられ得る。
【０１０９】 （２．２．１ 本発明の合成発現カセットを用いたＶＬＰ産生） 実験は、本発明の合成発現カセットがＧａｇタンパク質およびＶＬＰの両方の
、ネイティブＧａｇコード配列と比較して優れた産生を提供することを実証する
ために、本発明に支持されて行われ得る。さらに、ＶＬＰ産生の電子顕微鏡評価
は、予想されたサイズの遊離および出芽した未成熟ウイルス粒子が合成発現カセ
ットを含む細胞によって産生されることを示し得る。
【０１１０】 ネイティブなＧａｇコード配列ではなく、本発明の合成発現カセットを、ウイ
ルス様粒子の産生に用いて、いくつかの利点を提供する。第１に、ＶＬＰは、向
上した品質で産生され得、ＶＬＰの単離および精製をより容易にする。第２に、
ＶＬＰは、種々の細胞型において合成発現カセットを用いて産生され得る（特に
、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞株がＶＬＰ産生に用いられ得る）。ＣＨＯ細
胞を用いた産生は、以下を提供する：（ｉ）ＶＬＰ形成；（ｉｉ）正確なミリス
チル化および出芽；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞夾雑物（例えば、昆虫ウイルスお
よび／または細胞）が存在しないこと；ならびに（ｉｖ）精製の容易さ。本発明
の合成発現カセットはまた、哺乳動物細胞株以外の細胞型における発現の増強に
有用である。例えば、合成発現カセットをコードするバキュロウイルスベクター
での昆虫細胞の感染は、（野生型コード配列と比較して）より高レベルの総Ｇａ
ｇタンパク質収率およびより高いレベルのＶＬＰ産生をもたらす。さらに、バキ
ュロウイルス−Ｇａｇ合成発現カセットに感染させた昆虫細胞由来の最終産物は
一貫して、野生型コード配列を用いた場合の最終産物よりも少ない量の夾雑昆虫
タンパク質を含む。
【０１１１】 ＶＬＰは、目的の粒子形成ポリペプチドが適切な宿主細胞中で組換え発現され
る場合、自発的に形成し得る。従って、本発明の合成発現カセットを用いて産生
されるＶＬＰは、組換え技術を用いて便利に調製される。以下に考察されるよう
に、本発明のＧａｇポリペプチドコード合成発現カセットは、目的の他のポリペ
プチドコード配列（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶポリメラーゼ、ＨＣＶ
コア；Ｅｎｖ；合成Ｅｎｖ；実施例１を参照のこと）を含み得る。このような合
成発現カセットの発現は、Ｇａｇポリペプチドならびに目的のポリペプチドを含
むＶＬＰを生じる。
【０１１２】 一旦、所望の粒子形成ポリペプチドについてのコード配列が単離または合成さ
れたら、これらは、任意の適切なベクターまたはレプリコン中に発現のためにク
ローン化され得る。多数のクローン化ベクターが当業者に公知であり、そして適
切なクローン化ベクターの選択は、選択の問題である。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら，前出を参照のこと。次いで、このベクターを用いて、適切な宿主細胞を形
質転換する。適切な組換え発現系としては、当該分野で周知の以下が挙げられる
がこれらに限定されない：細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス／昆
虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）発現系、アルフ
ァウイルス（例えば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ））発現系、哺
乳動物発現系、酵母発現系およびＸｅｎｏｐｕｓ発現系。特に好ましい発現系は
、哺乳動物細胞株、ワクシニア系、シンドビス系、昆虫系および酵母系である。
【０１１３】 例えば、多数の哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、そして例えば、以下
だがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な不死細胞株を含む：チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎
臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）など。同様に、細菌宿主（例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｓｐｐ．）は、本発現構築物を用いての用途を見出す。本発明で有用
な酵母宿主としては、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ
、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ
ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に用いるため
の昆虫細胞としては、とりわけ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。例えば、Ｓｕｍｍｅｒ
ｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第１５５５号（１９８７）を参照
のこと。
【０１１４】 ウイルスベクターは、真核生物細胞における粒子産生（例えは、ワクシニアウ
イルスおよびトリポックスウイルスを含む、ポックスファミリーのウイルス由来
の粒子）に用いられ得る。さらに、Ｔｏｍｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３
）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（
１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載されるようなワクシニアに基づく感
染／トランスフェクション系はまた、本発明についての用途を見出す。本系にお
いて、細胞は最初に、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードす
るワクシニアウイルス組換え体を用いてインビトロで感染される。このポリメラ
ーゼは、Ｔ７プロモーター保有テンプレートのみを転写するという点で精妙な特
異性を提示する。感染に続いて、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される
目的のＤＮＡでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質
中で発現されたポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡへと転
写し、次いでこのＲＮＡは、宿主の翻訳機構によってタンパク質へと翻訳される
。あるいは、Ｔ７は、「前駆体」系（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０）においてのように
、精製されたタンパク質または酵素として付加され得る。この方法は、大量のＲ
ＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで、一過性の細胞質産生を提供する。
【０１１５】 選択される発現系および宿主に依存して、ＶＬＰは、発現ベクターによって形
質転換された宿主細胞を、粒子形成ポリペプチドが発現され、そしてＶＬＰが形
成され得る条件下で増殖させることによって産生される。適切な増殖条件の選択
は、当該分野の技術範囲内である。ＶＬＰが細胞内で形成される場合、細胞は、
細胞を溶解するがＶＬＰを実質的にインタクトなままに保つ、化学的、物理的ま
たは機械的な手段を用いて破壊される。このような方法は、当業者に公知であり
、そして例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒ
ｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編，１９９０）に記載される。
【０１１６】 次いで、粒子が、粒子の完全性を保存する方法を用いて（例えば、勾配遠心（
例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配、スクロース勾配、ペレット化など）（
例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９
−６９３６を参照のこと）ならびに標準的精製技術（例えば、イオン交換クロマ
トグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む）によって）単離される
（または実質的に精製される）。
【０１１７】 被験体に投与される場合、本発明の合成発現カセットを含む細胞によって産生
されるＶＬＰを用いて、免疫応答を惹起し得る。本発明の１つの利点は、ＶＬＰ
が合成発現カセットを保有する哺乳動物細胞によって、以前は可能でなかったレ
ベルで産生され得ることである。上記で考察したように、ＶＬＰは、Ｇａｇポリ
ペプチド（例えば、Ｇａｇ−プロテアーゼ，Ｇａｇ−ポリメラーゼ、Ｅｎｖ、合
成Ｅｎｖなど）に加えて種々の抗原を含み得る。本発明の合成発現カセットを用
いて産生された精製されたＶＬＰは、通常はワクチン組成物の形態で、脊椎動物
被験体へと投与され得る。このようなワクチンが、例えば、アジュバントである
サブユニットタンパク質（例えば、Ｅｎｖ）を含む、組み合わせワクチンもまた
用いられ得る。投与は、単独で処方されたかまたは他の抗原とともに処方された
ＶＬＰを用いて行われ得る。さらに、ＶＬＰは、ＤＮＡ免疫のための合成発現カ
セットの送達（以下を参照のこと）および／または他のワクチンの送達の前に、
またはそれらの送達と同時に、またはそれらの送達に続いて投与され得る。また
、ＶＬＰ投与の部位は、投与される他のワクチン組成物と同じまたは別であり得
る。遺伝子送達は、以下を含むがこれらに限定されない多数の方法によって達成
され得る：ＤＮＡでの免疫、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベク
ターおよびワクシニアウイルスベクター。
【０１１８】 ＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、
キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。免疫刺激組成物は、免疫学的応答
を開始させるのに十分な量のＶＬＰ／抗原を含む。適切な有効量は、当業者によ
って決定され得る。このような量は、慣用的試験によって決定され得る比較的広
い範囲に入り、そして一般に、約０．１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは
約１μｇ〜約３００μｇのオーダーのＶＬＰ／抗原の量である。
【０１１９】 この組成物を受ける個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない分子
であるキャリアは、必要に応じて存在する。適切なキャリアは代表的に、大きな
、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ酪酸、ポリグ
リコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油
小滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子）である。粒子状キャリアの
例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来の粒子状キャリアならびに
ポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する巨大粒子
（ＰＬＧとして公知）が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら，Ｐｈａｒｍ．
Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら，Ｊ Ｍｉｃ
ｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａ
ｎ ＤＴら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこ
と。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは
、免疫刺激剤（「アジュバント」）として作用し得る。さらに、抗原は、細菌ト
キソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラなどに由来するトキソイド）な
らびにＥ．ｃｏｌｉに由来する毒素へと結合体化され得る。
【０１２０】 アジュバントを用いてまた、この組成物の有効性を増強し得る。このようなア
ジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）アルミ
ニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、
硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（ムラミルペプチ
ド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を
有するかまたは有さない）（例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅ
ｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭ
ＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含むがその必要はない）、マイクロフルイダ
イザー（例えば、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉ
ｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ））を用いて１ミクロン未満の粒子へと処方され
た、ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号））、（ｂ）１ミクロン未満
のエマルジョンへとマイクロフルイダイズされたかまたはより大きな粒子サイズ
のエマルジョンを作製するためにボルテックスされたかのいずれかの、１０％ス
クアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％ プルロニックブロックポリマー
Ｌ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含むＳＡＦ、ならびに（
ｃ）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリピド
Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ
）からなる群より選択される１以上の細菌細胞壁成分、好ましくは、ＭＰＬ＋Ｃ
ＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）を含む、ＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒ
ｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ））；（３）サポニン
アジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）が用いられ得る）またはそれから作製
された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）））；（４）完全フロイン
トアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（
５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マ
クロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）
；（６）免疫刺激ＣｐＧモチーフをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリマ
ー分子（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：８７０
−８７６，１９９８；Ｓａｔｏ，Ｙ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２−３
５４，１９９６）または抗原／オリゴヌクレオチドの複合体｛ポリマー分子とし
ては、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにそれらの骨格改変物
（例えば、メチルホスホネート結合）が挙げられる）；または（７）細菌ＡＤＰ
リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）またはＥ．
ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ））の無毒化変異体（特にＬＴ−Ｋ６３（ここで
、リジンが、６３位で野生型アミノ酸を置換している）、ＬＴ−Ｒ７２（ここで
、アルギニンが、７２位で野生型アミノ酸を置換している）、ＣＴ−Ｓ１０９（
ここで、セリンが１０９位で野生型アミノ酸を置換している）、およびＰＴ−Ｋ
９／Ｇ１２９（ここで、リジンが９位で野生型アミノ酸を置換しており、そして
グリシンが１２９位でグリシンを置換している））（例えば、国際公開第ＷＯ９
３／１３２０２号およびＷＯ９２／１９２６５号を参照のこと）；ならびに（８
）この組成物の有効性を増強する免疫刺激剤として作用する他の物質。さらに、
このようなポリマー分子としては、例えば、以下のような、しかしこれらに限定
されない代替的ポリマー骨格構造が挙げられる：ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａ，
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０４：３９，１９７０ａ；Ｐｉ
ｔｈａ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，９：９６５，１９７０ｂ）およびモルホリノ
骨格（１９９２年８月２５日に発行されたＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら，米国特
許第５，１４２，０４７号；１９９３年２月９日に発行されたＳｕｍｍｅｒｔｏ
ｎ，Ｊ．ら，米国特許第５，１８５，４４４号）。種々の他の荷電および非荷電
のポリヌクレオチドアナログが報告されている。以下を含むがこれらに限定され
ない、多数の骨格改変物が当該分野で公知である：非荷電結合（例えば、メチル
ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデートおよびカルバメート）お
よび荷電結合（例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）｝；
ならびに（７）ＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物の有効性を増強する免
疫刺激剤として作用する他の物質。ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよ
びＭＦ５９が好ましい。
【０１２１】 ムラミルペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｎ−
アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）
、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｎ−ａｃ
ｅｔｙｌ−ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕａｔｍ
ｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル
タミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【０１２２】 ＶＬＰ組成物を用いた投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量ス
ケジュールであり得る。複数回用量スケジュールは、最初のクール（ｃｏｕｒｓ
ｅ）のワクチン接種が、１〜１０個の別々の用量であり得、次いで他の用量がそ
の後、免疫応答を維持および／または増強するように選択された時間間隔（例え
ば、第２の用量について１〜４ヶ月間）を置いて与えられ、そして必要な場合、
続いての用量が数ヵ月後に与えられるスケジュールである。この投薬レジメンは
また、少なくとも部分的に、被験体の必要性によって決定され、そして開業医の
判断に依存する。
【０１２３】 疾患の予防が所望される場合、抗原を保有するＶＬＰは一般に、目的の病原体
での一次感染前に投与される。処置が（例えば、症状または再発の低減）所望さ
れる場合、このＶＬＰ組成物は一般に、一次感染後に投与される。
【０１２４】 （２．２．２ 本発明の合成発現カセットを使用してのパッケージング細胞株
の作製） 多数のウイルスベースの系が、哺乳動物宿主細胞に関する遺伝子移入ベクター
としての使用のために、開発されてきた。例えば、レトロウイルス（特に、レン
チウイルスベクター）は、遺伝子送達系のための便利な土台を提供する。目的の
コード配列（例えば、遺伝子治療適用に有用な配列）が、当該分野で公知の技術
を使用して、遺伝子送達ベクター中に挿入され得、そしてレトロウイルス粒子中
にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、そしてイン
ビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多数のレト
ロウイルス系が、記載されてきた。それらは、例えば、以下を含む：米国特許第
５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ７：９８０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ １：５；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８
０：８４９；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９０：８０３３；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら（１９９３）Ｃｕｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２；ＧＢ ２２００６５１；
ＥＰ ０４１５７３１；ＥＰ ０３４５２４２；ＷＯ ８９／０２４６８；ＷＯ
８９／０５３４９；ＷＯ ８９／０９２７１；ＷＯ ９０／０２８０６；ＷＯ
９０／０７９３６；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ
９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；ＷＯ ９３／１１２３０；ＷＯ
９３／１０２１８；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｕ．Ｓ．５，２１９，７４０；
Ｕ．Ｓ．４，４０５，７１２；Ｕ．Ｓ．４，８６１，７１９；Ｕ．Ｓ．４，９８
０，２８９およびＵ．Ｓ．４，７７７，１２７；米国特許出願番号第０７／８０
０，９２１；ならびにＶｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８
６０〜３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：９６２〜
９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８３〜８８；Ｔａｋ
ａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３〜５０３
；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９〜７３５；Ｍａ
ｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１
９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １． 他の実施形態において、遺伝子移入ベクターが、サイトカインまたは他の免疫
調節分子をコードするように構築され得る。例えば、ネイティブＩＬ−２をコー
ドする核酸配列およびγ−インターフェロンをコードする核酸配列が、それぞれ
、米国特許番号第４，７３８，９２７号および同第５，３２６，８５９号に記載
されるように入手され得、一方、これらのタンパク質の有用な変異体が、米国特
許番号第４，８５３，３３２号に記載されるように入手され得る。ｍＣＳＦの短
い形態をコードする核酸配列および長い形態をコードする核酸配列が、それぞれ
、米国特許番号第４，８４７，２０１号および同第４，８７９，２２７号に記載
されるように入手され得る。本発明の特定の局面において、サイトカインまた免
疫調節遺伝子を発現するレトロウイルスベクターが、本明細書中に記載されるよ
うに（例えば、本発明のパッケージング細胞株を使用して）そして国際出願番号
ＰＣＴ ＵＳ ９４／０２９５１「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」に記載される
ように、作製され得る。
【０１２５】 本明細書中での使用に適切な免疫調節分子の例としては、以下が挙げられる：
ＩＬ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ １４４：２９０〜２９８、Ｗｅｂｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６６：１７１６〜１７３３、Ｇａｎｓｂａｈｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７〜１２２４；および米国特許番号第４，７３８，
９２７号）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら（１９８９）Ｃｅｌｌ
５７：５０３〜５１２、Ｇｏｌｕｍｂｅｋら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
４：７１３〜７１６、および米国特許番号第５，０１７，６９１号）；ＩＬ−５
およびＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら（１９８７）Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３
９：４１１６〜４１２１、および国際出願番号ＷＯ９０／０６３７０）；ＩＬ−
７（米国特許番号第４，９６５，１９５号）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０
、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｕｌｌｅｔ
ｉｎ、Ｓｕｍｍｅｒ １９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；α−インター
フェロン（Ｆｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｄｒｕｇｓ ４２：７４９〜７６５、米
国特許番号第４，８９２，７４３号および同第４，９６６，８４３号、国際公開
番号ＷＯ ８５／０２８６２、Ｎａｇａｔａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８
４：３１６〜３２０、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉら（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚ．７８：３８７〜３９４、Ｔｗｕら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２０４６〜２０５０；およびＦａｋｔｏｒ
ら（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：８６７〜８７２）；β−インターフェロ
ン（Ｓｅｉｆら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４〜６７１）；γ−イ
ンターフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄら（１９９１）Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓ
ｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００８２０１５、Ｗａｔａｎａ
ｂｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９
４５６〜９４６０、Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ５０：７８２０〜７８２５、Ｍａｉｏら（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４〜４２；および米国特許番号第
４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特
許番号第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）；ＧＭ−ＣＳ
Ｆ（国際公開番号ＷＯ ８５／０４１８８）・ 免疫調節因子はまた、これらの分子のアゴニスト、アンタゴニスト、またはリ
ガンドであり得る。例えば、可溶形態のレセプターは、しばしば、これらの型の
因子のアンタゴニストとして挙動し得、同様に、これらの因子自体の変異形態も
アンタゴニストとして挙動し得る。
【０１２６】 上記の物質をコードする核酸分子、および本発明における使用に有利な他の核
酸分子は、種々の供給源から容易に入手され得る。このような供給源としては、
例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
のような寄託機関、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌ
ｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的
供給源が、挙げられる。代表的例としては、以下が挙げられる：ＢＢＧ １２（
１２７アミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、Ｂ
ＢＧ ６（γ−インターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．
受託番号３９６５６（ＴＮＦをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託
番号２０６６３（α−インターフェロンをコードする）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託
番号３１９０２、同３１９０２および同３９５１７（β−インターフェロンをコ
ードする）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６７０２４（インターロイキン−１ｂを
コードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号３９４０５、同３９４５２
、同３９５１６、同３９６２６および同３９６７３（インターロイキン−２をコ
ードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５９３９９、同５９３９８、
および同６７３２６（インターロイキン−３をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ
．Ｃ．Ｃ．受託番号５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を含む
）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５９３９４および同５９３９５（インターロイキ
ン−５をコードする配列を含む）、ならびにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６７１５
３（インターロイキン−６をコードする配列を含む）。
【０１２７】 サイトカイン遺伝子または免疫調節遺伝子を含むプラスミド（国際公開番号Ｗ
Ｏ ９４／０２９５１およびＷＯ）が、適切な制限酵素で消化され得、そして目
的の特定の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、標準的分子生物学技術を使用し
て、遺伝子移入ベクター中に挿入され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出
、またはＡｕｓｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｇ ａｎ
ｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと）。
【０１２８】 上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列が、組換え法（例えば、その遺
伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをス
クリーニングすることによってか、またはこのその遺伝子を含むことが公知のベ
クターからその遺伝子を誘導することによって）入手され得る。変化した細胞生
成物をコードする配列を含むプラスミドが、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．のような寄託機関
または商業的供給源から、入手され得る。目的のヌクレオチド配列を含むプラス
ミドが、適切な制限酵素で消化され得、そしてそのヌクレオチド配列を含むＤＮ
Ａフラグメントが、標準的分子生物学技術を使用して、遺伝子移入ベクター中に
挿入され得る。
【０１２９】 あるいは、本発明を用いる使用のためのｃＤＮＡ配列が、標準技術（例えば、
フェノール抽出、およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、そ
の配列を発現するかまたは含む、細胞から入手され得る。例えば、Ｓｍａｂｒｏ
ｏｋら、前出を、ＤＮＡを入手および単離するために使用される技術の記載に関
して参照のこと。簡潔には、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡが、オ
リゴ−ｄＴプライマーまたはランダムプライマーを使用して、逆転写酵素を用い
て逆転写され得る。次いで、一本鎖ｃＤＮＡが、所望の配列のいずれかの側の配
列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅され
得る（米国特許番号第４，６８３，２０２号、同４，６８３，１９５号および同
４，８００，１５９号を参照のこと。また、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｅｒｌｉｃｈ（編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ、１９８９も参照のこと）。
【０１３０】 目的のヌクレオチド配列はまた、クローン化する以外に、ＤＮＡ合成機（例え
ば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａから入手可能））を使用して、合成によって作製され得る。このヌクレオチド
配列は、所望の発現産物に適切なコドンを用いて設計され得る。完全配列が、標
準的方法により調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完
全コード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ
２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１
２９９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参
照のこと。
【０１３１】 本発明の合成発現カセットは、レトロウイルスベクターを用いる使用のための
、パッケージング細胞株の構築に使用され得る。
【０１３２】 レトロウイルスの１つの型（マウス白血病ウイルス、すなわち「ＭＬＶ」）が
、遺伝子治療適用に広く利用されてきた（一般的には、Ｍａｎｎら（Ｃｅｌｌ
３３：１５３、１９９３）、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９、１９８４）、およびＭｉ
ｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５〜１４、１９９０
を参照のこと）。
【０１３３】 レンチウイルスベクターは、代表的には、以下：５’レンチウイルスＬＴＲ、
ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、目的の１つ以上の遺伝子に作動可
能に連結したプロモーター、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’レンチウイル
スＬＴＲを含み、このレンチウイルスベクターは、核輸送エレメントを含む。こ
の核輸送エレメントは、目的のコード配列（例えば、本発明の合成Ｇａｇ発現カ
セットまたは合成Ｅｎｖ発現カセット）の上流（５’側）または下流（３’側）
のいずれかに位置し得る。特定の実施形態において、この核輸送エレメントは、
ＲＰＥではない。１つの実施形態において、このパッケージングシグナルは、長
くしたパッケージングシグナルである。他の実施形態において、このプロモータ
ーは、組織特異的プロモーターであるか、あるいはＣＭＶのようなプロモーター
である。他の実施形態において、このレンチウイルスベクターは、さらに内部リ
ボソーム侵入部位を含む。
【０１３４】 広範な種類のレンチウイルスが、本発明の状況において利用され得る。そのよ
うなレンチウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩ
ＶおよびＳＩＶからなる群より選択される、レンチウイルスが挙げられる。
【０１３５】 本発明の１つの実施形態において、合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセットが、
提供される。このカセットは、プロモーターならびに、合成Ｇａｇポリメラーゼ
とｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆのうちの少なくとも１つをコードする配
列を含み、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼ、およびｖｐｒ、ｖｐｕ、
ｎｅｆ、またはｖｉｆに作動可能に連結されている。
【０１３６】 本発明のなお別の実施形態において、本明細書中に記載の発現カセットのいず
れかを含む、宿主細胞（例えば、パッケージング細胞株）が提供される。例えば
、１つの局面において、合成Ｇａｇポリメラーゼおよび核輸送エレメントをコー
ドする配列を含む発現カセットを含む、パッケージング細胞株が、提供される。
このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結さ
れている。パッケージング細胞株は、さらに、プロモーター、およびｔａｔ、ｒ
ｅｖ、またはエンベロープをコードする配列を含み得、このプロモーターは、ｔ
ａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖタンパク質または改変Ｅｎｖタンパク質をコードする配列
に作動可能に連結されている。このパッケージング細胞株は、ｎｅｆ、ｖｉｆ、
ｖｐｕ、またはｖｐｒのうちのいずれか１つ以上をコードする配列をさらに含み
得る。
【０１３７】 １つの実施形態において、その発現カセット（例えば、合成Ｇａｇポリメラー
ゼを保有する）は、安定に組み込まれている。このパッケージング細胞株は、レ
ンチウイルスベクターの導入に際して、代表的には粒子を産生する。この合成発
現カセットの発現を調節するプロモーターは、誘導性であり得る。代表的には、
このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入に際して、複製コ
ンピテントウイルスを本質的に含まない、粒子を産生する。
【０１３８】 本明細書中に記載される、合成Ｇａｇポリメラーゼ遺伝子の発現を指向する発
現カセットを含むか、または合成Ｅｎｖ遺伝子の発現を指向する発現カセットを
含む、パッケージング細胞株が、提供される。（また、Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（２）：１４９７〜１５０３、１
９９８；Ｈａａｓ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６（３）：３１
５〜３２４、１９９６を、他の改変Ｅｎｖ配列の記載については参照のこと）。
レンチウイルスベクターが、このパッケージング細胞株中に導入されて、ベクタ
ー産生細胞株が生成される。
【０１３９】 上記のように、レンチウイルスベクターが、目的の選択された遺伝子または配
列を保有または発現するように設計され得る。レンチウイルスベクターは、広範
な種類のレンチウイルスから容易に構築され得る（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒ
ｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、１９８５を参照のこと）。レンチウイルスの代表的例は、ＨＩＶ、ＨＩＶ
−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶおよびＳＩＶを含んだ。このようなレンチウイルスは
、患者の単離物から、またはより好ましくはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託機関もしくはコレクションから
入手されるか、あるいは利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離される
のいずれかであり得る。
【０１４０】 このレンチウイルス遺伝子送達ベクター（またはビヒクル）の一部は、別のウ
イルスに由来し得る。例えば、所定の組換えレンチウイルスベクターにおいて、
ＬＴＲはＨＩＶに、パッケージングシグナルはＳＩＶに、そして第２鎖合成起点
はＨｒＶ−２に由来し得る。レンチウイルスベクター構築物は、以下：５’レン
チウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異
種配列、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲを含み得、このレンチウイ
ルスベクターは、ＲＲＥでない核輸送エレメントを含む。
【０１４１】 簡略には、長末端反復（「ＬＴＲ」）は、Ｕ５、ＲおよびＵ３と呼ばれる３つ
のエレメントに細分される。これらのエレメントは、レトロウイルスの生物学的
活性を担う種々のシグナルを含み、そのようなシグナルとしては、例えば、Ｕ３
中に位置するプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントが挙げられ
る。ＬＴＲは、プロウイルス（組み込みＤＮＡ形態）において、そのゲノムのい
ずれかの末端でのそのＬＴＲの正確な反復によって、容易に同定され得る。本明
細書中で使用される場合、５’ＬＴＲは、５’プロモーターエレメント、ならび
にそのベクターのＤＮＡの形態の逆転写および組み込みを可能にするに十分なＬ
ＴＲ配列を含むことが、理解されるべきである。３’ＬＴＲは、ポリアデニル化
シグナル、およびそのベクターのＤＮＡ形態の逆転写および組み込みを可能にす
るに十分なＬＴＲ配列を含むことが、理解されるべきである。
【０１４２】 ｔＲＮＡ結合部位および第２鎖ＤＮＡ合成起点もまた、レトロウイルスが生物
学的に活性であるために重要であり、そして当業者によって容易に同定され得る
。例えば、レトロウイルスｔＲＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成により、
ｔＲＮＡ結合部位に結合し、そしてレトロウイルスゲノムとともに、ウイルス粒
子中に保有される。次いで、このｔＲＮＡは、逆転写酵素によるＤＮＡ合成のプ
ライマーとして利用される。このｔＲＮＡ結合部位は、５’ＬＴＲのすぐ下流に
あるその位置に基づいて、容易に同定され得る。同様に、第２鎖ＤＮＡ合成の起
点は、その名前は意味する通り、レトロウイルスの第２鎖ＤＮＡの合成に重要で
ある。この領域は、ポリリジントラクトとも呼ばれ、３’ＬＴＲのすぐ下流に位
置する。
【０１４３】 ５’および３’のＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、および第２鎖ＤＮＡ合成起点に
加えて、組換えレトロウイルスベクター構築物はまた、パッケージングシグナル
、ならびに目的も１つ以上の遺伝子またはコード配列も含み得る。さらに、この
レンチウイルスベクターは、好ましい実施形態においてはＲＲＥではない、核輸
送エレメントを有する。適切な核輸送エレメントの代表的例は、ラウス肉腫ウイ
ルス中のエレメント（Ｏｇｅｒｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０、３８３４〜３８４
３、１９９６）、ラウス肉腫ウイルス中のエレメント（ＬｉｕおよびＭｅｒｔｚ
、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．９、１７６６〜１７８９、１９９５）およびシミアンレ
トロウイルスＩ型のゲノム中のエレメント（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ Ｖｉ
ｒｏｌ．６８、７９４４〜７９５２、１９８４）を含む。他の可能なエレメント
としては、ヒストン遺伝子中のエレメント（Ｋｅｄｅｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．４８、８３７〜８７０、１９７０）、α−インターフェロン遺伝
子（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ ２８７、４０１〜４０８、１９８０）、β
−アドレナリン作用性レセプター遺伝子（Ｋｏｉｌｋａら、Ｎａｔｕｒｅ ３２
９、７５〜７９、１９８７）、およびｃ−Ｊｕｎ遺伝子（Ｈａｔｔｏｒｉｅら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、９１４８〜９１５２、
１９８８）が、挙げられる。
【０１４４】 組換えレンチウイルスベクター構築物は、代表的に、Ｇａｇポリメラーゼおよ
びＥｎｖのコード配列の両方を欠く。組換えレンチウイルスベクターは、代表的
には、Ｇａｇポリメラーゼ遺伝子およびＥｎｖ遺伝子において見出される、２０
個未満、好ましくは１５個、より好ましくは１０個、および最も好ましくは８個
連続するヌクレオチドを含む。本発明の１つの利点は、組換えレトロウイルスベ
クター構築物のためのパッケージング細胞株を構築するために使用され得る、合
成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセットが、野生型Ｇａｇポリメラーゼ配列に対して
ほとんど相同性を有さず、従って、この合成配列と野生型配列との間の相同組換
えの可能性をかなり減少または排除することである。
【０１４５】 レンチウイルスベクターはまた、目的の１つ以上の遺伝子または配列の発現を
駆動するための組織特異的プロモーターを含み得る。
【０１４６】 レンチウイルスベクター構築物は、１つより多くの数の目的の遺伝子が発現さ
れるように、作製される。これは、ジシストロン性カセットまたはオリゴシスト
ロン性カセットの使用を介して（例えば、コード領域が、８０ヌクレオチド以下
離れている場合、一般的には、Ｌｅｖｉｎら、Ｇｅｎｅ １０８：１６７〜１７
４、１９９１を参照のこと）か、または内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」
）の使用を介して、達成され得る。
【０１４７】 上記の組換えレトロウイルスベクター構築物を用いる使用に適切なパッケージ
ング細胞株は、本明細書中に提供される開示を考慮して、容易に調製され得る。
簡略には、そのパッケージング細胞株が由来する親細胞株が、種々の哺乳動物細
胞株（例えば、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細
胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、および骨髄腫細胞が挙げられる）から選
択され得る。
【０１４８】 パッケージング細胞株の作製に適切な宿主細胞の選択の後、１つ以上の発現カ
セットが、欠失されているベクターのトランス成分を相補または供給するために
、その細胞株中に導入される。
【０１４９】 適切な発現カセットの代表的例は、本明細書中に記載されている。これらとし
ては、合成Ｅｎｖ発現カセット、合成Ｇａｇ発現カセット、合成Ｇａｇプロテア
ーゼ発現カセット、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセットが挙げられる。
これらのカセットは、プロモーター、ならびに例えば、Ｇａｇポリメラーゼ、お
よびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆのうちの少なくとも１つをコードする
配列を含み、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼ、およびｖｐｒ、ｖｐｕ
、ｎｅｆまたはｖｉｆに作動可能に連結されている。上記のように、ネイティブ
のＥｎｖコード配列および／または改変Ｅｎｖコード配列もまた、これらの発現
カセットにおいて利用され得る。
【０１５０】 上記の発現カセットを利用して、広範な種類のパッケージング細胞株が、作製
され得る。例えば、１つの局面において、合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする
配列および核輸送エレメントを含む、発現カセットを含むパッケージング細胞株
が、提供される。このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に
作動可能に連結されている。他の局面において、プロモーター、ならびにｔａｔ
、ｒｅｖ、Ｅｎｖもしくは他のＨＩＶ抗原またはこれら由来のエピトープをコー
ドする配列を含む、パッケージング細胞株が提供される。このプロモーターは、
ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖ、もしくはＨＩＶ抗原またはエピトープをコードする配
列に、作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、このパッケージ
ング細胞株は、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、またはｖｐｒのうちのいずれか１つ以
上をコードする配列を含み得る。例えば、このパッケージング細胞株は、単独で
ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒのみを含んでも、ｎｅｆおよびｖｉｆを含
んでも、ｎｅｆおよびｖｐｕを含んでも、ｎｅｆおよびｖｐｒを含んでも、ｖｉ
ｆおよびｖｐｕを含んでも、ｖｉｆおよびｖｐｒを含んでも、ｖｐｕおよびｖｐ
ｒを含んでも、ｎｅｆ、ｖｉｆおよびｖｐｕを含んでも、ｎｅｆ、ｖｉｆおよび
ｖｐｒを含んでも、ｎｅｆ、ｖｐｕおよびｖｐｒを含んでも、ｖｉｆ、ｖｐｕお
よびｖｐｒを含んでも、またはｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｖｐｒの４つすべ
てを含んでもよい。
【０１５１】 １つの実施形態において、この発現カセットは、安定に組み込まれる。別の実
施形態において、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入
に際して、粒子を産生する。さらなる実施形態において、このプロモーターは誘
導性である。特定の好ましい実施形態において、このパッケージング細胞株は、
レンチウイルスベクターの導入に際して、複製コンピテントウイルスを含まない
粒子を産生する。
【０１５２】 最適にされたコード配列を含む合成カセットが、選択された細胞株に移入され
る。（ｉ）代表的には組み込まれている、Ｇａｇコード配列、Ｐｏｌコード配列
、およびＥｎｖコード配列の安定なコピーを保有し、そして（ｉｉ）受容可能な
レベルのこれらのポリペプチドを発現している（発現は、当該分野で公知の方法
によって評価され得る。例えば、実施例１〜４を参照のこと）、移入された細胞
が、選択される。
【０１５３】 目的の配列は、上記のように適切なウイルスベクターへと構築される。次いで
、この欠損ウイルスは、このパッケージング細胞株中へと移入される。このパッ
ケージング細胞株は、目的の配列を含むこの欠損ウイルスのゲノムがパッケージ
ングされる、ウイルス様粒子を生成するために必要な機能を提供する。次いで、
これらのＶＬＰが単離され、そして例えば、遺伝子送達または遺伝子治療におい
て使用され得る。
【０１５４】 さらに、このようなパッケージング細胞株はまた、単独のＶＬＰを生成するた
めに使用され得、これは例えば、他の抗原を伴う投与またはワクチン組成物中で
の投与のためのアジュバントとして使用され得る。また、このパッケージング細
胞株中のポリペプチド（例えば、抗原）をコードする選択された目的の配列の同
時発現はまた、このＶＬＰ中での選択されたポリペプチドの捕捉および／または
このＶＬＰと選択されたポリペプチドとの会合を生じ得る。
【０１５５】 （２．３ ＤＮＡ免疫および遺伝子送達） 種々のＨＩＶポリペプチド抗原（特に、Ｃ型ＨＩＶ抗原）が、本発明の実施に
おいて使用される。ＨＩＶ抗原は、例えば、そのポリペプチド抗原のコード配列
にインフレームで融合された合成Ｇａｇ発現カセットを含む、ＤＮＡ免疫構築物
中に含まれ得、この構築物の発現が、目的の抗原を提示するＶＬＰを生じる。
【０１５６】 本発明の実施において使用される特に目的とするＨＩＶ抗原は、ｔａｔ、ｒｅ
ｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、および他のＨＩＶ抗原またはエピトープ
を含む。例えば、このパッケージング細胞株は、ｎｅｆのみ、および以下を含む
がこれらに限定されないＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶなどと
も呼ばれる）を含み得る：ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０のような抗原（ネ
イティブおよび改変型の両方）；Ｇａｇ；ならびにＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、Ｈ
ＩＶ−１SF162、ＨＩＶ−１SF170、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN、ＨＩＶ−
１CM235、ＨＩＶ−１US4、多岐のサブタイプ（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およ
びＯ）からの他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および多岐のサブタイプ（例えば
、ＨＩＶ−２UC1およびＨＩＶ−２UC2）を含むがこれらに限定されない種々の単
離株由来のｐｏｌ。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂ
ａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌ
ｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、
Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙを参照のこと。
【０１５７】 効力を評価するために、本発明の合成発現カセットを使用して、ＤＮＡ免疫が
、例えば、実施例４に記載されるように実施され得る。マウスが、Ｇａｇ（およ
び／またはＥｎｖ）合成発現カセットおよびＧａｇ（および／またはＥｎｖ）野
生型発現カセットの両方で免疫される。プラスミドＤＮＡでのマウスの免疫は、
この合成発現カセットが、ネイティブの発現カセットと比較して、免疫原性の明
らかな改善を提供することを示す。また、第２回のブースト免疫が、例えば、２
週間後に、２次免疫応答を誘導する。さらに、ＣＴＬアッセイの結果は、ＤＮＡ
免疫による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導について、合成Ｇａｇ（
および／またはＥｎｖ）発現カセットの能力の増強を示す。
【０１５８】 本発明が、広範な種類の抗原に対する免疫応答を開始するため、従ってＨＩＶ
感染（特に、Ｃ型ＨＩＶ感染）を処置または予防するために使用され得ることが
、容易に明らかである。
【０１５９】 （２．３．１ 本発明の合成発現カセットの送達） 上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列が、組換え方法（例えば、その
遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーを
スクリーニングすることによるか、またはその遺伝子を含むことが公知であるベ
クターからその遺伝子を誘導することによる）を使用して、入手され得る。さら
に、所望の遺伝子が、その遺伝子をふくむ細胞および組織から直接、標準的方法
（例えば、フェノール抽出、およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使
用して単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、をＤＮＡを入手およ
い単離するために使用される技術の説明については参照のこと。目的の遺伝子は
また、クローン化する以外に、合成によっても作製され得る。そのヌクレオチド
配列は、所望される特定のアミノ酸配列に適切なコドンを用いて設計され得る。
一般的に、その配列が発現される意図する宿主に好ましいコドンが選択される。
完全配列は、標準的方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから組み立て
られ、そして完全コード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５
９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：
４９〜５３を参照のこと。
【０１６０】 次いで、所望の抗原をコードする遺伝子配列が、本発明の合成Ｇａｇ発現カセ
ットまたは合成Ｅｎｖ発現カセットを含むベクター中に挿入され得る。この抗原
は、組み合わされた配列が発現される場合に、Ｇａｇポリペプチドおよび目的の
抗原（例えば、Ｅｎｖ（ネイティブまたは改変型）、またはＨＩＶ由来の他の抗
原）を含むＶＬＰの産生を生じるように、合成Ｇａｇコード配列中に挿入される
。挿入が、コード配列内かまたはコード配列のいずれかの末端（５’末端（発現
されたＧａｇポリペプチドのアミノ末端）；３’末端（発現されるＧａｇポリペ
プチドのカルボキシ末端））で行われ得る（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ａｒｃｈ
Ｖｉｒｏｌ．１２７：１１７〜１３７、１９９２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ２００：１６２〜１７５、１９９４；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６９（６）：３３８９〜３３９８、１９９５；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｔ．ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ２００：５２４〜５３４、１９９４；Ｃｈａｚａｌ，Ｎ．ら、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８（１）１１１〜１２２、１９９４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ
，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（６）：３１９１〜３１９８、１９９３；
Ｒｅｉｃｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：６４２〜６５０、１
９９５）。
【０１６１】 ｐ５５Ｇａｇのコード配列のうちの５０％までが、ウイルス様粒子へのアセン
ブリーおよび発現効率に影響することなく、欠失され得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉ，
Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）９３１３〜９３１７、１９９８；Ｇａｍ
ｉｅｒ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２（６）：４６６７〜４６７７、１９９８
；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２（３）：１７８２〜１７８９、１
９９８；Ｗａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２（１０）：７９５０〜７９５
９、１９９８）。本発明の１つの実施形態において、高レベルで発現する合成Ｇ
ａｇ発現カセットの免疫原性は、異なる構造的ＨＩＶ抗原または非構造的ＨＩＶ
抗原、マルチエピトープカセット、あるいはサイトカイン配列をＧａｇ配列の欠
失している領域に挿入することによって、増加され得る。このような欠失は、本
発明の教示および当業者に利用可能な情報に従って、作製され得る。このアプロ
ーチの１つの潜在的利点は、異種ポリペプチドに融合した全長配列を使用するこ
とに比較して、高い、発現産物の発現効率／分泌効率であり得る。
【０１６２】 配列が、Ｇａｇのアミノ末端に付加される場合、そのポリペプチドは、Ｇａｇ
含有ポリペプチドへのミリスチン酸部分の付加のシグナルをコードする、コード
配列（例えば、Ｍｅｔ−Ｇｌｙをコードする配列）を５’末端に含む。
【０１６３】 Ｇａｇ含有ポリペプチド構築物がＶＬＰを形成する能力は、本発明の教示に従
って経験的に決定され得る。
【０１６４】 Ｇａｇ／抗原（例えば、Ｇａｇ／Ｅｎｖ）合成発現カセットは、コード配列に
作動可能に連結されたコントロールエレメントを含み、このエレメントによって
、被験体種におけるインビボでの遺伝子発現が可能になる。例えば、哺乳動物細
胞発現のための代表的プロモーターとしては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモー
ター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター）、マウス乳腺
癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ
ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが、挙げられる。他の非ウ
イルス性プロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモー
ター）もまた、哺乳動物発現のための用途が見出される。代表的には、転写終結
配列およびポリアデニル化配列もまた存在して、翻訳終止コドンの３’側に位置
する。好ましくは、翻訳の開始の最適化のための配列もまた、コード配列の５’
側に位置して、存在する。転写終結因子／ポリアデニル化シグナルとしては、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載のような、ＳＶ４０由来のシグナル、ならびにウ
シ成長ホルモンターミネーターが、挙げられる。
【０１６５】 エンハンサーエレメントもまた、本明細書中で、哺乳動物構築物の発現レベル
を増加するために使用され得る。例としては、以下が挙げられる：Ｄｉｊｋｅｍ
ａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載のような、ＳＶ４０初期遺
伝子エンハンサー；Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載のような、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、ならびにＢｏｓｈａｒ
ｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５１２に記載のような、ヒトＣＭＶ由来のエ
レメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント）。
【０１６６】 さらに、キメラ抗原コード配列遺伝子配列（例えば、目的とする複数の抗原／
エピトープ（例えば、１つより多くのウイルス単離株由来）をコードする）を含
む、プラスミドが、構築され得る。
【０１６７】 代表的には、この抗原コード配列は、合成コード配列の前または後に存在し、
そしてこのキメラ転写単位は、目的の抗原および合成Ｇａｇコード配列の両方を
コードする、単一のオープンリーディングフレームを有する。あるいは、マルチ
シストロン性カセット（例えば、ジシストロン性カセット）が構築され得、これ
により、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳなどを使用して、単一のｍＲＮＡからの複数の抗原
が可能になる。
【０１６８】 完成すると、この構築物は、標準的遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免
疫に使用される。遺伝子送達のための方法は、当該分野で公知である。例えば、
米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９
，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達されるか、ある
いはその被験体由来の細胞にエキソビボで送達されて、その細胞がその被験体に
再移植されるかの、いずれかであり得る。
【０１６９】 多数のウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発さ
れている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利な土台を提供
する。選択された配列は、当該分野で公知の技術を使用して、ベクター中に挿入
され得、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換
えウイルスが単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体
の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系が記載されている（米国特許番
号５，２１９，７４０；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０〜９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５〜１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９〜８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｖａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３〜８０３７
；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２〜１０９）。
【０１７０】 多数のアデノウイルスベクターもまた、記載されている。宿主ゲノム中に組み
込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外のままで存在
し、それによって挿入性突然変異に関連する危険が最小になる（Ｈａｊ−Ａｈｍ
ａｎおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７〜２７４
；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１〜５９２１；Ｍｉ
ｔｔｅｒｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７
１７〜７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３〜９４
０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１〜５８；Ｂｅ
ｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６〜
６２９；およびＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３
）４：４６１〜４７６）。
【０１７１】 さらに、種々のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が、遺伝子送達のた
めに開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して、容
易に構築され得る。例えば、米国特許番号５，１７３，４１４および同５，１３
９，９４１；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）
および同ＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋ
ｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，（１９８８）８：３９８８〜３９６６
；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，
Ｂ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（１９９２）３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９
２）１５８：９７〜１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３〜８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉ
ｔｈ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５〜１６９；ならびにＺ
ｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７〜１８７５を参
照のこと。
【０１７２】 本発明のポリヌクレオチドを送達するために有用な別のベクター系が、Ｓｍａ
ｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．ら、（米国特許番号５，６７６，９５０、１９９７年１
０月１４日発行）に記載される、経験的に投与される組換えポックスウイルスワ
クチンである。
【０１７３】 目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための使用が見出されるさらなる
ウイルスベクターとしては、ポックスファミリー（ワクシニアウイルスおよび鳥
類ポックスウイルス（ａｖｉａｎ ｐｏｘｖｉｒｕｓ）を含む）由来のベクター
が、挙げられる。例として、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、
以下のように構築され得る。特定の合成Ｇａｇ／抗原コード配列またはＥｎｖ／
抗原コード配列をコードするＤＮＡが、まず、適切なベクター中に、そのＤＮＡ
が、ワクシニアプロモーターおよび隣接するワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように、挿入される。次
いで、このベクターが、細胞をトランスフェクトするために使用され、この細胞
が同時にワクシニアに感染する。相同組換えが、このワクシニアプロモーター、
および目的のコード配列をコードする遺伝子を、ウイルスゲノム中に挿入するよ
うに作用する。生じたＴＫ組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で
細胞を培養すること、および５−ブロモデオキシウリジンに耐性であるウイルス
プラークを拾うことによって、選択され得る。
【０１７４】 あるいは、トリポックスウイルス（例えば、ニワトリポックスウイルスおよび
カナリアポックスウイルス）もまた、これらの遺伝子を送達するために使用され
得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する、組換えトリポックスウイルスが
、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を付与することが公知である。トリポ
ックスベクターの使用が、ヒト種および他の哺乳動物種において特に望ましい。
なぜなら、トリポックス（ａｖｉｐｏｘ）属のメンバーは、感受性の鳥類種での
み生産的に複製し得、従って、哺乳動物細胞においては感染力がない。組換えト
リポックスウイルスを生成するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワ
クシニアウイルスの生成に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用
する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ８９／０３４２９；およびＷＯ９２
／０３５４５を参照のこと。
【０１７５】 分子結合ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（
１９９３）２６８（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９
９〜６１０３に記載される、アデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送
達のために使用され得る。
【０１７６】 アルファウイルス属のメンバー（例えば、これらに限定はされないが、シンド
ビスウイルス由来のベクター、セムリキ森林ウイルス由来のベクター、およびベ
ネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス由来のベクター）もまた、本発明のポリヌクレオ
チド（例えば、合成Ｇａｇポリペプチドをコードする発現カセット）を送達する
ためのウイルスベクターとして使用が見出される。本発明の方法の実施に有用な
シンドビスウイルス由来ベクターの記載に関しては、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８〜５１９；および国際公開番号ＷＯ９５
／０７９９５およびＷＯ９６／１７０７２；ならびにＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．
Ｔ．Ｗ．ら、米国特許番号５，８４３，７２３（１９９８年１２月１日発行）お
よびＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．Ｔ．Ｗ．、米国特許番号５，７８９，２４５号（
１９９８年４月４日発行）を参照のこと。
【０１７７】 ワクシニアに基づく感染系／トランスフェクション系が、宿主細胞において目
的のコード配列の誘導性の一過性発現を提供するために、簡便にしようされ得る
。この系において、細胞が、まず、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼをコードするワクシニアウイルス組換え体に、インビトロで感染される。この
ポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを保有するテンプレートのみを転写するとい
う点で、精巧な特異性を示す。感染の後、細胞は、目的のポリヌクレオチドでト
ランスフェクトされ、Ｔ７プロモーターにより駆動される。このワクシニアウイ
ルス組換え体から細胞質において発現されるポリメラーゼは、このトランスフェ
クトされたＤＮＡをＲＮＡへと転写し、次にこのＲＮＡが、宿主の翻訳機構によ
ってタンパク質へと翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物
に、高レベルで一過性の細胞質での産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔ
ｅｉｎおよびＭｏｓｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９
９０）８７：６７４３〜６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２〜８１２６を参照のこと。
【０１７８】 ワクシニアウイルス組換え体またはトリポックスウイルス組換え体での感染の
ため、または他のウイルスベクターを使用する遺伝子送達のための、代替的アプ
ローチとして、宿主細胞への導入後に高レベルの発現をもたらす増幅系が、使用
され得る。詳細には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのコード領域の前にあるＴ７
ＲＮＡポリメラーゼが、操作され得る。このテンプレートからのＲＮＡの翻訳に
よって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが生成され、次いで、このＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼが、より多くのテンプレートを転写する。同時に、発現がＴ７ポリメラ
ーゼの制御下にあるｃＤＮＡが存在する。従って、増幅テンプレートＲＮＡの翻
訳から産生されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのうちのいくらかが、所望の遺伝子
の転写をもたらす。いくらかのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが増幅を開始するため
に必要とされるので、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、転写反応を刺激（ｐｒｉｍ
ｅ）するためのテンプレートともに、細胞中に導入され得る。このポリメラーゼ
は、タンパク質として導入され得るか、またはこのＲＮＡポリメラーゼをコード
するプラスミド上で導入され得る。Ｔ７系および細胞を形質転換するためのさら
なる記載に関しては、例えば、国際公開番号ＷＯ９４／２６９１１；Ｓｔｕｄｉ
ｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１
３〜１３０；ＤｅｎｇおよびＷｏｆｆ、Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５〜
２４９；Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
（１９９４）２００：１２０１〜１２０６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７〜２８７２；Ｃｈｅｎら、Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４）２２：２１１４〜２１２０；ならびに
米国特許番号５，１３５，８５５を参照のこと。
【０１７９】 目的の合成Ｇａｇ含有発現カセットおよび／またはＥｎｖ含有発現カセットは
また、ウイルスベクターを用いないで送達され得る。例えば、この合成発現カセ
ットは、被験体またはその被験体に由来する細胞に送達する前に、リポソーム中
にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般に、核酸を安定に結合また
は捕捉しそして保持し得る、リポソームを使用して達成される。濃縮ＤＮＡの、
脂質調製物に対する比は、変化し得るが、一般的には約１：１（ＤＮＡ（ｍｇ）
：脂質（μｍｏｌ））であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のた
めのキャリアとしての使用の概説に関しては、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１〜１７；
Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１
９８３）、第１０１巻、５１２〜５２７頁を参照のこと。
【０１８０】 本発明における使用のためのリポソーム性調製物としては、カチオン性（正に
荷電した）調製物、陰イオン性（負に荷電した）調製物および中性調製物が挙げ
られ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、プラス
ミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓａｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６
０８１）；および精製転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の、機能性形態での細胞内送達を媒介
することが示されている。
【０１８１】 カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ[１−２，３−
ジオレイルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴ
ＭＡ）リポソームが、商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、
Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手可能である。（また、Ｆｅｌｇｎｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１
３〜７４１６も参照のこと）。他の市販の脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ
）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカ
チオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な材
料から調製され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４〜４１９８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９
０／１１０９２を、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリ
メチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載に関して参照のこと。
【０１８２】 同様に、陰イオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から入手可能で
あるか、または容易に入手可能な材料を使用して、容易に調製され得る。このよ
うな材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、
ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が、挙げられる。これらの材料はまた、適
切な比率で、ＤＯＴＭＡ開始材料およびＤＯＴＡＰ開始材料と混合され得る。こ
れらの材料を使用してリポソームを生成するための方法が、当該分野で周知であ
る。
【０１８３】 これらのリポソームは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソーム
（ＳＵＶ）、または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソ
ーム−核酸複合体が、当該分野で公知の方法を使用して、調製される。例えば、
Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１
９８３）第１０１巻、５１２〜５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４〜４１９８；Ｐａｐａｈ
ａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７
５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；Ｄ
ｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；Ｅｎ
ｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏ
ｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７
５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１
９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【０１８４】 これらのＤＮＡ抗原および／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊ
ｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）
３９４：４８３〜４９１により記載されるものと類似する、渦巻形の脂質組成物
中で送達され得る。また、米国特許番号４，６６３，１６１および同４，８７１
，４８８も参照のこと。
【０１８５】 目的の合成発現カセットはまた、粒子状キャリアにカプセル化されても、吸着
されても、または会合してもよい。このようなキャリアは、この免疫系に対する
選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所的リンパ節における抗原の
捕捉および保持を促進する。この粒子は、マクロファージにより貪食され得、そ
してサイトカインの放出を介して、抗原提示を増強し得る。粒子状キャリアの例
としては、ポリメタクリル酸メチルポリマーに由来する粒子状キャリア、ならび
にポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に由来する微粒
子（ＰＬＧとして公知）が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ
．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２〜３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら、Ｊ Ｍｉ
ｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）１９７〜２１０、１９９７；Ｏ’Ｈａｇａ
ｎ ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９〜５４、１９９３を参照のこ
と。適切な微粒子はまた、荷電した界面活性剤（例えば、陰イオン性界面活性剤
またはカチオン性界面活性剤）の存在下で、製造されて、正味で負電荷を有する
かまたは正味で正電荷を有する表面を有する微粒子が生じ得る。例えば、陰イオ
ン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴ
ＡＢ）を用いて製造された微粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）は、負
に荷電した高分子（例えば、ＤＮＡ）を吸着する。（例えば、国際出願番号ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９９／１７３０８を参照のこと）。
【０１８６】 さらに、他の粒子系およびポリマーが、目的の遺伝子のインビボ送達またはエ
キソビボ送達のために使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、
ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、ならびにこれら
の分子の結合体）は、目的の核酸を移入するために有用である。同様に、ＤＥＡ
Ｅデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、または他
の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ケイ酸アルミニウム（ベント
ナイトおよびカオリンを含む）、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、滑石など）
を使用する沈殿は、本発明の方法を用いる使用が見出される。例えば、Ｆｅｌｇ
ｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉ
ｅｗｓ（１９９０）５：１６３〜１８７を、遺伝子移入に有用な送達系の概説に
関して参照のこと。ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、米国特許番
号５，８３１，００５（１９９８年１１月３日発行））もまた、本発明の構築物
の送達に使用され得る。
【０１８７】 さらに、粒子状キャリア（例えば、金およびタングステン）を使用する微粒子
銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達系が、本発明の全身発現カセットを送達するため
に特に有用である。これらの粒子は、一般的に減圧下で「遺伝子銃」からの火薬
放出を使用して送達されそして高速に加速されるべき、合成発現カセットでコー
ティングされる。このような技術およびその技術に有用な装置の記載に関して、
例えば、米国特許番号４，９４５，０５０；同５，０３６，００６；同５，１０
０，７９２；同５，１７９，０２２；同５，３７１，０１５および同５，４７８
，７４４を参照のこと。また、針なし注射器も、使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ
．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１５０３〜１５０９、１９９４；Ｂｉｏｊｅ
ｃｔ，Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）。
【０１８８】 本発明の合成発現カセットを保有する組換えベクターが、脊椎動物被験体への
送達のための組成物へと処方される。これらの組成物は、予防用（感染を予防す
るため）または治療用（感染後に疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
これらの組成物は、「治療上有効な量」の目的の遺伝子を、その組成物が投与さ
れる個体において免疫応答が生成されるような量の抗原がインビボで産生される
ように、含む。必要な正確な量は、数ある要因の中でも、処置される被験体；処
置される被験体の年齢および一般的状態；その被験体の免疫系が抗体を合成する
能力；所望される保護の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定の抗原
およびその投与様式に依存して変化する。適切な有効量は、当業者により容易に
決定され得る。従って、「治療上有効な量」とは、慣用的試行を介して決定され
得る、比較的広い範囲にある。
【０１８９】 組成物は一般に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（
例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン
酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤
、ｐＨ緩衝化物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。核酸の取り込
みおよび／または発現の特定の促進剤はまた、組成物に含まれ得るか、または例
えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロース（に限定されない）と共に投与さ
れ得る。
【０１９０】 いったん処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与され得る（例え
ば、上記のように）か、あるいは、上記のような方法を用いて、被験体由来の細
胞にエクスビボに送達され得る。例えば、形質転換された細胞の被験体へのエク
スビボ送達および再移植の方法は、当該分野において公知であり、そして、例え
ば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレ
ン媒介トランスフェクション、リポフェクトアミンおよびＬＴ−１媒介トランス
フェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、リポソーム中
へのポリヌクレオチドのカプセル化（対応する抗原ありまたはなし）、および核
へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられ得る。
【０１９１】 インビボでの合成発現カセット組成物の直接送達は、一般に、上記のように、
慣用的な注射器または遺伝子銃（例えば、Ａｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達
システム（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｏｘ
ｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）のいずれかを用いる注射によって、ウイルスベクタ
ーを用いても用いないでも達成され得る。構築物は、皮下、上皮、皮内、粘膜内
（例えば、鼻腔内、直腸内および膣内）、腹腔内、静脈内、経口または筋肉内の
いずれかで注射され得る。表皮細胞へのＤＮＡの送達は、この投与様式が皮膚関
連のリンパ細胞への接近を提供し、そしてレシピエント中にＤＮＡの一過的な存
在を提供する場合、特に好ましい。投与の他の様式は、経口投与および肺投与、
坐剤、注射針なしの注射、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓおよびｔｒａ
ｎｓｄｅｒｍａｌ）適用を含む。投与処置は、単一の用量スケジュールまたは複
数の用量スケジュールであり得る。核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質
の投与との組み合わせであり得る。
【０１９２】 （２．３．２ 本発明の合成発現カセットのエクスビボ送達） １つの実施形態において、Ｔ細胞および関連細胞型（抗原提示細胞（例えば、
マクロファージ、単球、リンパ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およ
びその前駆細胞）を含むが、これに限定されない）は、本発明の合成発現カセッ
トのエクスビボ送達のために使用され得る。Ｔ細胞は、当業者に公知の種々の手
順によって、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離され得る。例えば、Ｔ細胞集団
は、アクセサリー細胞およびＢ細胞の除去を通じて、ＰＢＬの集団から「濃縮さ
れ」得る。特に、Ｔ細胞濃縮は、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を用い
る非Ｔ細胞の排除によって達成され得る。同様に、他の抗体は、非Ｔ細胞の特定
の集団を枯渇するために使用され得る。例えば、抗Ｉｇ抗体分子は、Ｂ細胞を枯
渇するために使用され得、そして抗ＭａｃＩ抗体分子は、マクロファージを枯渇
するために使用され得る。
【０１９３】 Ｔ細胞はさらに、当業者に公知の技術によって、異なる多くの部分集団に分画
され得る。２つの主要な部分集団を、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８の差
示的な発現に基づいて単離し得る。例えば、上記のようなＴ細胞の濃縮に続き、
ＣＤ４+細胞をＣＤ４に特異的な抗体を用いて濃縮し得る（Ｃｏｌｉｇａｎら（
前出）を参照のこと）。抗体を磁気ビーズのような固相に結合し得る。逆に、Ｃ
Ｄ８＋細胞を、ＣＤ４に特異的な抗体の使用を通じて濃縮し得る（ＣＤ４+細胞
を除去して）か、または固相に結合したＣＤ８抗体の使用によって単離し得る。
ＨＩＶ−１感染患者由来のＣＤ４リンパ球を、Ｗｉｌｓｏｎら（１９９５）Ｊ．
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：８８によって記載されるような形質導入の前ま
たは後にエクスビボで拡張し得る。
【０１９４】 Ｔ細胞の精製に続いて、当業者に公知の種々の遺伝的改変を、本明細書中に記
載されるような、非ウイルスベースまたはウイルスベースの遺伝子移入ベクター
構築物を用いて実施し得る。例えば、１つのこのようなアプローチは、ベクター
産生細胞由来の培養物のベクター含有上清を有する精製Ｔ細胞集団の形質導入を
含む。第二のアプローチは、照射された単層のベクター産生細胞と精製Ｔ細胞と
の同時培養を含む。第三のアプローチは、類似の同時培養アプローチを含む；し
かし、精製Ｔ細胞は、種々のサイトカインで事前に刺激され、そして照射された
ベクター産生細胞との同時培養の前４８時間培養される。このような形質導入の
前の、事前の刺激は、効果的な遺伝子移入を増加する（Ｎｏｌｔａら、（１９９
２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０６５）。増殖のためのこれらの培養物
の刺激はまた、患者への再注入のための増加した細胞集団を提供する。同時培養
に続いて、Ｔ細胞をベクター産生細胞単層から回収して、拡張し、そして液体窒
素中で凍結する。
【０１９５】 本発明の１つ以上の合成発現カセットを含む遺伝子移入ベクター（単離された
Ｔ細胞に送達するための適切な制御エレメントに関連する）を、公知の方法を用
いてアセンブルし得る。
【０１９６】 選択マーカーはまた、遺伝子移入ベクターの構築物中に使用され得る。例えば
、細胞傷害性剤に耐性な遺伝子移入ベクターで形質導入された哺乳動物細胞を知
らせるマーカーが、使用され得る。細胞傷害性剤は、ネオマイシン、アミノグリ
コシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、サルファ剤、アクチノマイ
シン、ネトロプシン、ジスタマイシンＡ、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃ
ｙｃｌｉｎｅ）、またはピラジナミドでありえるが、これらに限定されない。例
えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩは、ネオマイシンアナログの
ジェネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を与える。
【０１９７】 Ｔ細胞はまた、選択される前に、少なくとも１つの型の増殖因子を含む培地中
で維持され得る。種々の増殖因子は、当該分野において公知であり、これらは、
特定の型の細胞の増殖を維持する。このような増殖因子の例は、ｒＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５のようなサイトカインマイトジェンで
あり、これらは、リンパ球の増殖および活性化を促進する。特定の型の細胞は、
ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）およびヒト成長ホルモンを含
む）のような他の増殖因子によって刺激される。特定の細胞集団に対する適切な
増殖因子の選択は、当業者によって容易に達成される。
【０１９８】 例えば、白血球（分化した前駆細胞および幹細胞）は、種々の増殖因子によっ
て刺激される。より好ましくは、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ（活性化ＴHおよび活性
化マクロファージによって産生される）は、骨髄幹細胞を刺激する。次いで、こ
の細胞は、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆細胞、好酸球前駆細胞、好塩基球前
駆細胞、巨核球、および赤血球前駆細胞に分化する。分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびＥＰＯのような増殖因子によって調節さ
れる。
【０１９９】 次いで、多能性幹細胞は、リンパ球幹細胞、骨髄間質細胞、Ｔ細胞前駆細胞、
Ｂ細胞前駆細胞、胸腺細胞、ＴH細胞、ＴC細胞およびＢ細胞に分化する。この分
化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、
Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−５のような増殖因子によって調節される。
【０２００】 顆粒球−単球前駆細胞は、単球、マクロファージおよび好中球に分化する。こ
のような分化は、増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８）によ
って調節される。好酸球前駆細胞は、好酸球に分化する。このプロセスは、ＧＭ
−ＣＳＦおよびＩＬ−５によって調節される。
【０２０１】 好塩基球前駆細胞の肥満細胞および好塩基球への分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ
−４、およびＩＬ−９によって調節される。巨核球は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、
およびＩＬ−６に応答して血小板を産生する。赤血球前駆細胞は、ＥＰＯに応答
して赤血球に分化する。
【０２０２】 従って、ＣＤ−３結合因子による活性化の間、Ｔ細胞はまた、マイトジェン（
例えば、ＩＬ−２のようなサイトカイン）と接触し得る。特に好ましい実施形態
において、ＩＬ−２は、約５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度でＴ細胞の集団に添加
される。ＣＤ３結合因子を用いる活性化を、２〜４日間実施し得る。
【０２０３】 いったん適切に活性化されると、Ｔ細胞へのベクターのトランスフェクション
が可能な条件下で、Ｔ細胞を適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによっ
て、Ｔ細胞は一般に改変される。Ｔ細胞集団の細胞密度が約０．１×１０6と５
×１０6との間、好ましくは０．５×１０6と２×１０6との間である場合、遺伝
的改変が実施される。多くの適切なウイルスベースまたは非ウイルスベースの遺
伝子移入ベクターが、使用について本明細書中で記載される。
【０２０４】 形質導入後に公知の技術を用いて、形質導入細胞を、非形質導入細胞から選択
する。例えば、形質導入に用いられた遺伝子移入ベクターが細胞傷害性剤に対し
て耐性を示す選択マーカーを含む場合、細胞は適切な細胞傷害性剤に接触され得
、これにより非形質導入細胞は、形質導入細胞から陰性に選択される。選択マー
カーが細胞表面マーカーである場合、細胞は特定の細胞表面マーカーに特異的な
結合因子と接触され得、これにより、形質導入された細胞は、この集団から陽性
に選択される。この選択工程はまた、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）技術を
包含し得（例えば、ＦＡＣＳが使用され、特定の細胞表面マーカーを含む集団か
ら細胞を選択する場合）、またはこの選択工程は、標的細胞捕獲および／または
バックグラウンド除去のための回収可能な支持体として、磁気的に反応性な粒子
の使用を包含する。
【０２０５】 より好ましくは、形質導入細胞の陽性選択を、ＦＡＣＳセルソーター（例えば
、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅTM Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊ
ｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施し得、選択可能な細胞表面マーカーを発現する形質
導入された細胞をソートし、そして回収する。形質導入に続いて、細胞を、特定
の細胞表面マーカーに対する蛍光標識抗体分子で染色する。それぞれの細胞に結
合した抗体の量を、セルソーターを通じて、細胞を含有する滴体を通過すること
によって測定し得る。染色された細胞を含む滴体に電磁気的電荷を与えることに
よって、形質導入細胞を他の細胞から分離し得る。次いで、陽性に選択された細
胞を、滅菌回収容器内に回収する。これらの細胞ソーティング手順を、例えば、
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅTM Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（項３−１１〜３
−２８および１０−１〜１０−１７を特に参照して）に詳細に記載する。
【０２０６】 形質導入細胞の陽性選択はまた、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく
細胞の磁気的分離を用いて実施され得る。このような分離技術において、陽性に
選択される細胞を、まず特定の結合因子（例えば、細胞表面因子と特異的に相互
作用する抗体または因子）と接触する。次いで、細胞を、回収可能な粒子（例え
ば、磁気的に反応性な粒子）と接触する。この粒子は、特異的結合因子（陽性細
胞に結合した）と結合する試薬と結合されている。次いで、細胞結合因子−粒子
複合体を、非標識細胞と物理的に分離し得る（例えば、磁場を用いて）。磁気的
に反応性な粒子を用いる場合、標識細胞を磁場を用いて容器内に留め得る一方、
陰性細胞を除去する。これらおよび類似の分離手順は、当業者に公知である。
【０２０７】 選択された形質導入細胞におけるベクターの発現を、当業者に公知の多くのア
ッセイによって評価し得る。例えば、ウエスタンブロット分析またはノーザン分
析を、目的の挿入ヌクレオチド配列の特性に依存して使用し得る。いったん発現
が達成され、そして形質導入されたＴ細胞が選択された合成発現カセットの存在
について試験された場合、末梢血流を介する患者への注入が準備される。
【０２０８】 本発明は、初代培養哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝的改変についてのキ
ットを含む。このキットは代表的に、少なくとも１つの選択マーカーおよび少な
くとも１つの合成発現カセットをコードする遺伝子移入ベクターを含み、付属の
試薬またはハードウェア、およびキットの使用についての取扱説明書を１つ以上
の容器に含む。
【０２０９】 （実験） 以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。これらの実
施例は、例示的な目的にのみに提供され、そしていずれにしても本発明の範囲を
限定することは意図しない。
【０２１０】 使用される数（例えば、量、温度など）に関する精度を保障するための試みが
なされたが、もちろん、いくつかの実験的誤差および偏差が考慮されるべきであ
る。
【０２１１】 （実施例１） （合成発現カセットの生成） （Ａ．ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼおよびＧａｇ−ポ
リメラーゼの核酸コード配列の改変） Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、およびＧａｇ−ポリメラーゼのコード配列を
、Ｃ型株ＡＦ１１０９６５およびＡＦ１１０９６７から選択した。Ｅｎｖコード
配列を、Ｃ型株ＡＦ１１０９６８およびＡＦ１１０９７５から選択した。これら
の配列を操作して、これらの遺伝子産物の発現を最小化した。
【０２１２】 第一に、ＨＩＶ−１コドン使用頻度パターンを改変して、その結果、得られた
核酸コード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子に見出される使用頻度に匹敵し
た。ＨＩＶコドン使用は、コドン−３連のヌクレオチドＡまたはＴの高い含有量
を反映する。ＨＩＶ−１コドン使用頻度の効果は、ＤＮＡ配列における高いＡＴ
含量であり、これは、翻訳能の減少およびｍＲＮＡの不安定性を生じる。比較し
て、高度に発現されたヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。コード配
列は改変されて、高度に発現されるヒト遺伝子に見出されるコドン使用頻度に匹
敵する。
【０２１３】 第二に、Ｇａｇのコード配列およびＧａｇ−プロテアーゼコード配列内に位置
する阻害（または不安定）エレメント（ＩＮＳ）が存在する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅ
ｒ Ｒ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２−４９０３、１９９７）。
ＲＲＥは、ＲＮＡの二次構造であり、ＨＩＶのコードするＲｅｖタンパク質と相
互作用し、ＩＮＳの発現下方制御効果を克服する。ＲＲＥおよびＲｅｖの転写後
活性化機構を克服するために、不安定なエレメントを、複数の点変異を導入する
ことによって不活性化する。これらの変異は、コードタンパク質のリーディング
フレームを変化しない。図５および６（配列番号３、４、２０および２１）は、
株ＡＦ１１０９６５およびＡＦ１１０９６７由来の合成配列にいくつか残存する
ＩＮＳの位置を示す。これらの配列に作製された変化を、図中で囲む。図５およ
び６において、上線は、示された株由来のＧａｇポリペプチドのコドン最適化配
列を示す。囲まれた領域中の線の下に示されるヌクレオチドは、ＩＮＳをさらに
除くように作製された変化を示す。従って、囲まれた領域内に示された変化が作
成される場合、得られた配列は、それぞれ図１および２に示された配列に対応す
る。
【０２１４】 Ｇａｇ−プロテアーゼ配列について、コドン使用頻度における変化を−１のフ
レームシフトまで領域を制限し、そしてＧａｇリーディングフレームの末端にお
いて再度開始する。さらに、Ｇａｇ−プロテアーゼポリペプチドコード配列のコ
ード配列内に位置する阻害（または不安定）エレメント（ＩＮＳ）を、十分に変
化する。合成コード配列を、例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒ
ｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｔｅｘａｓ）のような会社に
よって、当該分野において公知の方法によってアセンブリする。
【０２１５】 Ｇａｇ−ポリメラーゼ配列の改変は、フレームシフト領域を保存するためにＧ
ａｇ−プロテアーゼについて記載されるような、類似の改変を含む。
【０２１６】 本発明の１つの実施形態において、Ｇａｇ−ポリメラーゼ配列の全長ポリメラ
ーゼコード領域は、合成の最適化されたＧａｇ／Ｅｎｖ発現カセットによって発
現されるウイルス様粒子に対するエピトープの数を増加するように、Ｇａｇまた
はＥｎｖの合成配列に包含される。合成ＨＩＶ−１Ｇａｇ−ポリメラーゼが機能
的酵素逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）を発現するので（構
造タンパク質およびプロテアーゼに加えて）、ＲＴ機能およびＩＮＴ機能を不活
性化することが重要である。ＲＴおよびＩＮＴのコード配列におけるいくつかの
欠失または変異を、それらのＲＴ活性およびＩＮＴ活性に関する触媒的な非機能
的酵素を達成するために作製され得る。｛Ｊａｙ．Ａ．Ｌｅｖｙ（編）（１９９
５）Ｔｈｅ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ．ＩＳＢＮ ０−３０６−４５０３３Ｘ．２１５−２０頁；Ｇｒｉｍｉ
ｓｏｎ，Ｂ．およびＬａｕｒｅｎｃｅ，Ｊ．（１９９５）、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏ
ｆ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍ
ｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ９（１）：５８−６
８；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｋ．ら、（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ６６（１１）：６８０６−６８１２；Ｅｓｎｏｕｆ，Ｒ．ら、
（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（４）
：３０３−３０８；Ｍａｉｇｎａｎ，Ｓ．ら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏ
ｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８２（２）：３５９−３６８；Ｋ
ａｔｚ，Ｒ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．（１９９４）Ａｎｎｕａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３（１９９４）；Ｊａｃｏｂ
ｏ−Ｍｏｌｉｎａ，Ａ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１３）：６３
２０−６３２４；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ａ．Ｂ．ら、（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ
Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（４６）：２９２７
９−２９２８７；Ｇｏｌｄｇｕｒ，Ｙ．ら、（１９９８）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ Ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ Ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９５
（１６）：９１５０−９１５４；Ｇｏｅｔｔｅ，Ｍら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎ
ａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３（１７）：１
０１３９−１０１４６；Ｇｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（６）：５０４６−５０５５；Ｅｎｇｅｌｍ
ａｎ，Ａ．ら、（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（
５）：３５０７−３５１４；Ｄｙｄａ，Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６（５１
９３）：１９８１−１９８６；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｆ．ら、（１９９１）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５２（５００２）：８８−９５；Ｂｕｊａｃｚ，Ｇ．ら、（１９９
６）Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９８（２−３）：１７５−１７８；Ｂｅａｒ
ｄ，Ｗ．Ａ．ら、（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１（２１）：１２２１３−１２２２０；Ｋｏｈｌｓｔ
ａｅｄｔ，Ｌ．Ａ．ら、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（５０６５）：１
７８３−１７９０；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９
１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（４４）：１０６１４−１０６２３；Ｍａ
ｚｕｍｄｅｒ，Ａ．ら、（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｙ ４９（４）：６２１−６２８；Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ，Ｃ．ら、（１
９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２７２（１７）：１１１５７−１１１６４；Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．ら、（１
９９５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ
ｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９２（４）：１２２２−１２２６；Ｓｈｅｎｇ，Ｎ．
およびＤｅｎｎｉｓ，Ｄ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２（１８
）：４９３８−４９４２；Ｓｐｅｎｃｅ，Ｒ．Ａ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６７（５２００）：９８８−９９３｝。
【０２１７】 さらに、選択されたＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープを、Ｇ
ａｇ−ポリメラーゼ構築物のＲＴコード配列およびＩＮＴコード配列の欠失内に
加え、ＲＴおよびＩＮＴの機能的改変によって欠失される任意のエピトープを置
換および増強し得る。あるいは、ＲＴおよびＩＮＴから選択されたＢ細胞エピト
ープおよび／またはＴ細胞エピトープ（ＣＴＬエピトープを含む）を、上記の合
成Ｇａｇカセットまたは合成ＧａｇＰｒｏｔカセットの発現によって形成される
最小限のＶＬＰに組み込み得る。（公知のＨＩＶ Ｂ細胞エピトープおよびＴ細
胞エピトープの記載について、ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ ＣＴＬ Ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；Ｌｏｓ
Ａｌａｍｏｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｅｎｄｉａ、１９８７−１９９７
；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ
／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０２１８】 得られた改変コード配列は、以下のように示される：合成Ｅｎｖ発現カセット
；合成Ｇａｇ発現カセット；合成Ｇａｇ−プロテアーゼ発現カセット；および合
成Ｇａｇ−ポリメラーゼ発現カセット。共通のＧａｇ領域（Ｇａｇ共通）は、Ａ
Ｆ１１０９６５に関連して、ヌクレオチド８４４位〜９０３位（配列番号１）（
または、配列番号１７のおよそのアミノ酸残基２８２〜３０１（配列番号１７）
）まで、そしてＡＦ１１０９６７に関連して、ヌクレオチド８４１位〜９００位
（配列番号２）（または、配列番号２２のおよそのアミノ酸残基２８１〜３０１
）まで、伸長する。共通のＥｎｖ領域（Ｅｎｖ共通）は、ＡＦ１１０９６８に関
連して、ヌクレオチド１２１３位〜１３５３位（配列番号５）、および配列番号
２３のおよそのアミノ４０５位〜４５１位まで、そしてＡＦ１１０９７５に関連
して、ヌクレオチド１２１０位〜１３５３位（配列番号１１）、およびアミノ酸
残基４０４〜４５１（配列番号２４）まで、伸長する。
【０２１９】 ＧａｇおよびＥｎｖに関する合成ＤＮＡフラグメントを、以下の真核生物発現
ベクターにクローニングする：ｐＣＭＶＫｍ２（一過性の発現アッセイおよびＤ
ＮＡ免疫研究のため）、ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍ
ａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６
）由来であり、カナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモ
ーターエンハンサーおよびイントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）Ａを含み、以下に記載の
合成配列のための挿入部位が続き、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグ
ナルが続く。ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ポリペプチドリンカー部位がｐＣＭＶ
Ｋｍ２に挿入されてｐＣＭＶ−ｌｉｎｋを生成する点でのみ、ｐＣＭＶ−ｌｉｎ
ｋベクターと異なる；ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（チャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のため）、ならびにｐＡｃＣ１
３（バキュロウイルス発現系における使用のためのシャトルベクター）（ｐＡｃ
Ｃ１３は、ｐＡｃＣ１２由来であって、ｐＡｃＣ１２は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ
Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２，１
９９０によって記載される）。
【０２２０】 簡単には、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒの構築物は以下の通りである。
【０２２１】 ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵
入部位）リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌ
ｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）にＸｂａ−Ｎｃｏフラグメントとして挿入
してｐＥＴ−ＥＭＣＶを得た。ｄｈｆｒ遺伝子をｐＥＳＮ２ｄｈｆｒからＰＣＲ
増幅して、翻訳終止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサ
ーを有する産物を得、Ｎｃｏ−ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入し、ｐＥＴ−
Ｅ−ＤＨＦＲを得た。次に、減弱したｎｅｏ遺伝子を、ｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥ
Ｔ−Ｅ−ＤＨＦＲの独特のＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎ
ｅｏ(m2)を得た。最終的に、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターを、ｎｅｏ遺
伝子の下流に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)ＢＧＨｔを得た。ＥＭ
ＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−Ｄ
ＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)ＢＧＨｔの切断によって調製した。
【０２２２】 ＣＭＶエンハンサー／プロモーターさらにイントロンＡを、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃ
ｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−
３９８６）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントとしてｐＵＣ１９（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に移
入した。ｐＵＣ１９のベクター骨格を、ＮｅｄＩ部位からＳａｐ１部位まで削除
した。上記のＤＨＦＲカセットをこの構築物に加え、その結果、ＥＭＣＶ ＩＲ
ＥＳがＣＭＶプロモーターに続いた。このベクターはまた、ａｍｐr遺伝子およ
びＳＶ４０複製起点を含む。
【０２２３】 （Ｂ．ＨＩＶ−１ ｐ５５ Ｇａｇの主要な相同性領域（ＭＨＲ）の規定） ＨＩＶ−１ ｐ５５（Ｇａｇ）の主要な相同性領域（ＭＨＲ）は、Ｇａｇのｐ
２４−ＣＡ配列に位置する。これは、約２０アミノ酸の保存的ストレッチである
。野生型ＡＦ１１０９６５ Ｇａｇタンパク質におけるこの位置は、２８２〜３
０１（配列番号２５）であり、そしてＧａｇ ＤＮＡ配列に対する８４４〜９０
３（配列番号２６）の領域にかかる。合成Ｇａｇタンパク質における位置はまた
、２８２〜３０１（配列番号２５）であり、そして合成ＧａｇＤＮＡ配列に対す
る８４４〜９０３（配列番号１）の領域にかかる。野生型および合成のＡＦ１１
０９６７ Ｇａｇタンパク質におけるこの位置は、２８１〜３００（配列番号２
７）であり、そして改変Ｇａｇ ＤＮＡ配列に対する８４１〜９００（配列番号
２）の領域にかかる。ＭＨＲにおける変異または欠失は、粒子産生を重度に損い
得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：９３１３−
９３１７、１９９８；Ｍａｍｍａｎｏ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６８（８）：
４９２７−４９３６，１９９４）。
【０２２４】 この配列に対する同一性パーセントを、例えば、以下の模範的なパラメーター
を有するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索アルゴリズム（Ｔｉｍｅ Ｌｏｇｉ
ｃ，Ｉｎｃｌｉｎｅ Ｖｉｌｌａｇｅ，ＮＶ）を用いて決定し得る：重量マトリ
ックス＝ｎｕｃ４ｘ４ｈｂ；ギャップ開放ペナルティ＝２０、ギャップ伸長ペナ
ルティ＝５。
【０２２５】 （Ｃ．ＨＩＶ−１ Ｅｎｖの共通配列領域の規定） ＨＩＶ−１ Ｅｎｖの共通配列領域（ＣＳＲ）は、ＥｎｖのＣ４配列に位置す
る。これは、約４７アミノ酸の保存的ストレッチである。野生型および合成のＡ
Ｆ１１０９６８ Ｅｎｖタンパク質における位置は、アミノ酸残基約４０５〜４
５１（配列番号２８）であり、そしてＥｎｖ ＤＮＡ配列に関して１２１３〜１
３５３（配列番号５）の領域にかかる。野生型および合成のＡＦ１１０９７５
Ｅｎｖタンパク質における位置は、アミノ酸残基約４０４〜４５１（配列番号２
９）であり、そしてＥｎｖ ＤＮＡ配列に関して１２１０〜１３５３（配列番号
１１）の領域にかかる。
【０２２６】 この配列に対する同一性パーセントを、例えば、以下の模範的なパラメーター
を有するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索アルゴリズム（Ｔｉｍｅ Ｌｏｇｉ
ｃ，Ｉｎｃｌｉｎｅ Ｖｉｌｌａｇｅ，ＮＶ）を用いて決定し得る：重量マトリ
ックス＝ｎｕｃ４ｘ４ｈｂ；ギャップ開放ペナルティ＝２０、ギャップ伸長ペナ
ルティ＝５。
【０２２７】 本明細書中に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態は、組み合わ
せられ得る。
【０２２８】 （実施例２） （合成コード配列についての発現アッセイ） （Ａ．Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＧａｇ−プロテアーゼコード配列） 野生型Ｅｎｖ（ＡＦ１１０９６８またはＡＦ１１０９７５由来）配列、Ｇａｇ
（ＡＦ１１０９６５およびＡＦ１１０９６７由来）配列およびＧａｇ−プロテア
ーゼ（ＡＦ１１０９６５およびＡＦ１１０９６７由来）配列を、合成Ｅｎｖ、Ｇ
ａｇおよびＧａｇ−プロテアーゼの配列をクローニングするベクターと同じ特徴
を有する発現ベクターにクローニングする。
【０２２９】 野生型および合成のＥｎｖ配列およびＧａｇ配列を有する種々のベクターにつ
いての発現有効性を、以下のように評価する。いくつかの哺乳動物細胞株由来の
細胞（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ；全てをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９
より入手した）を、トランスフェクション試薬ＬＴ１（ＰａｎＶｅｒａ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、５４５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
中の２μｇのＤＮＡでトランスフェクトする。細胞を減少した血清培地（Ｏｐｔ
ｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で５時
間インキュベートする。次いで、培地を以下のような正常の培地に置換する：２
９３細胞、ＩＭＤＭ、１０％ ウシ胎児血清、２％ グルタミン（ＢｉｏＷｈｉ
ｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ＲＤ細胞およびＣＯＳ−７
細胞、Ｄ−ＭＥＭ、１０％ ウシ胎児血清、２％ グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）；およびＣＨＯ細
胞、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２、１０％ ウシ胎児血清、２％ グルタミン（Ｏｐｔ
ｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。細胞を
４８時間または６０時間のいずれかの期間、インキュベートする。細胞溶解物を
、以下の実施例３に記載のように回収する。上清を回収し、そして０．４５μｍ
シリンジフィルターを通して濾過滅菌する。Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４−ａｓｓａ
ｙ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳ）
を用いて、ＨＩＶ核抗原に対するマウスモノクローナル抗体でコートされた９６
ウェルプレートを使用して、上清を評価する。ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原を、コー
トしたウェルに結合する。ＨＩＶに対するビオチン化抗体は、結合したｐ２４抗
原を認識する。結合したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼは、
このビオチンと反応する。ＴＭＢ基質を用いる過酸化水素の反応によって、色を
発色させる。４Ｎ Ｈ2ＳＯ4の添加によって、反応を停止する。色の強度は、サ
ンプル中のＨＩＶ ｐ２４抗原の量と直接比例する。
【０２３０】 合成Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＧａｇ−プロテアーゼの発現カセットは、種々の細
胞株において発現される場合、これらのタンパク質産物の産生において、ネイテ
ィブ（野生型Ｃ型）に比べて劇的な増加を提供する。
【０２３１】 （実施例３） （発現のウエスタンブロット分析） （Ａ．Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＧａｇ−プロテアーゼのコード配列） ヒト２９３細胞を、ネイティブまたは合成のＥｎｖまたはＧａｇの発現カセッ
トを含むｐＣＭＶ６ａベースのベクターを用いて、実施例２に記載のようにトラ
ンスフェクトする。細胞を、トランスフェクション後６０時間培養する。上清を
記載のように調整する。細胞溶解物を以下のように調製する。細胞をリン酸緩衝
化生理食塩水で一回洗浄し、界面活性剤（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
．５）中の１％ ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ））を用いて溶解し、そして溶解物を新しいチューブに移す。Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル（プレキャスト８〜１６％；Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、２０μｌの上清または１２．５μｌの細胞溶解物を用い
てロードする。タンパク質標準もまたロードする（５μｌ、ｂｒｏａｄ ｓｉｚ
ｅ ｒａｎｇｅ ｓｔａｎｄａｒｄ；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。電気泳動を実施し、そしてタンパク質をＢｉｏＲ
ａｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
によって推奨される転写用緩衝液を使用して、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ ｍｅｍ
ｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転
写する。ここで、この転写は、１００ボルトで９０分間実施する。メンブレンを
、ＨＩＶ−１陽性ヒト患者血清に曝露し、そしてｏ−フェニレンジアミンジヒド
ロクロライド（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫染色する。
【０２３２】 イムノブロッティング分析は、合成ＥｎｖまたはＧａｇの発現カセットを含む
細胞が、ネイティブの発現カセットを含む細胞より高い値（細胞濃度あたり）で
期待のタンパク質を産生する。このタンパク質は、細胞溶解物および上清の両方
に見られる。本発明の合成発現カセットを用いてトランスフェクトした細胞に関
して、細胞上清における産生のレベルは、顕著に高い。
【０２３３】 さらに、トランスフェクトした２９３細胞由来の上清をスクロース勾配上で分
画する。上清のアリコートを、ＰｏｌｙｃｌｅａｒTM ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉ
ｆｕｇｅ ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍ
ｂｉａ，ＭＤ）に移し、２０％（重量／重量）のスクロースの溶液を下敷きして
、そして２８，０００ｒｐｍで２時間、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローターで遠
心分離に供する。得られたペレットをＰＢＳ中に懸濁し、そして２０〜６０％（
重量／重量）のスクロースの勾配上に重層し、そして４０，０００ｒｐｍで２時
間、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ｔｉローターで遠心分離に供する。
【０２３４】 次いで、この勾配を約１０×１ｍｌのアリコート中（頂点から始め、２０％〜
最後の勾配）に分画する。サンプルを画分１〜９に得、そして８〜１６％のＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。２９３／合成ＥｎｖまたはＧａｇ
の細胞からの上清は、２９３／ネイティブのＥｎｖまたはＧａｇの細胞からの上
清よりより強いバンドを与える。
【０２３５】 （実施例４） （合成ＧａｇおよびＥｎｖ発現カセットのインビボ免疫原性） （Ａ．免疫） 合成ＧａｇおよびＥｎｖの発現カセットのできる限り改良された免疫を評価す
るために、マウスの研究を実施する。プラスミドＤＮＡであるｐＣＭＶＫＭ２（
合成Ｇａｇ発現カセットを有する）を、１００μｌの総注射量における以下の最
終濃度に希釈する：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇ、０．０２μｇおよび０．０
０２μｇ。希釈したＤＮＡの起こり得る陰性希釈効果を克服するために、各々の
サンプル中の総ＤＮＡ濃度を、ベクター（ｐＣＭＶＫＭ２）単独を用いて２０μ
ｇまで上げる。コントロールとして、ネイティブＧａｇ発現カセットのプラスミ
ドＤＮＡを、同一の様式において扱う。４〜１０のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａ
ｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の１２群を、表１のスケジュール
に従って、筋肉内で免疫（肢あたり５０μｌ、前脛骨筋内への筋肉内注射）する
。
【０２３６】
【表１】 。
【０２３７】 １〜５群および１１〜１５群を、０週（免疫前）、４週、６週、８週および１
２週に採血する。６〜２０群および１６〜２０群を、０週（免疫前）、４週に採
血する。
【０２３８】 （Ｂ．液性免疫応答） 液性免疫応答を、免疫後０および４週（５〜１２群）さらにそれぞれ免疫の６
および８週後、二度目の免疫の２および４週後（１〜４群）のマウス血清の、抗
ＨＩＶ ＧａｇまたはＥｎｖ抗体ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）を用いて調
べる。
【０２３９】 血清の抗体力価を、抗Ｇａｇ抗体または抗Ｅｎｖ抗体のＥＬＩＳＡによって決
定する。簡単には、免疫したマウス由来の血清を、ＨＩＶ ｐ５５ Ｇａｇタン
パク質またはＥｎｖタンパク質（例えば、ｇｐ１６０またはｇｐ１２０）に対す
る抗体についてスクリーニングする。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、
１ウェル当たり０．２μｇのＧａｇまたはＥｎｖのタンパク質で一晩コートし、
そして４回洗浄する；引き続き、ＰＢＳ−０．２％ Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）
を用いて２時間ブロッキングする。ブロッキング溶液の除去後、１００μｌの希
釈マウス血清を添加する。血清を１/２５希釈、そしてその後の連続３倍希釈で
試験する。マイクロタイタープレートを４回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結
合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でインキ
ュベートする。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、そして１ウェル当たり１００μｌ
の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を添
加する。各々のウェルの最適濃度を１５分後に測定する。報告された力価は、最
大半分吸光度（Ｏ．Ｄ．）を与えた血清の希釈の逆数である。
【０２４０】 合成発現カセットは、ネイティブ発現カセットに比較して、明瞭な免疫原性の
改善を提供する。
【０２４１】 （Ｃ．細胞性免疫応答） 特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の頻度を、ペプチドおよびＢａｌｂ／
ｃマウスＣＤ４細胞の標準クロム放出アッセイによって、評価する。ＣＤ−８細
胞に感染させたＧａｇまたはＥｎｖの発現ワクチンウイルスを、陽性コントロー
ルとして使用する。簡単には、脾臓細胞（エフェクター細胞、Ｅ）を、上記のよ
うに免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスから得、そして培養し、再刺激し、そして記
載された（Ｄｏｅ，Ｂ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．、ＡＩＤＳ １０（７）
：７９３−７９４、１９９６）ように、Ｇａｇペプチド標識細胞に対するＣＴＬ
活性についてアッセイする。細胞傷害性活性を、標準51Ｃｒ放出アッセイにおい
て測定する。標的（Ｔ）細胞を、種々のＥ：Ｔ比で４時間エフェクター（Ｅ）と
培養し、そして複製のウェルからの平均ｃｐｍを用いて特異的51Ｃｒ放出パーセ
ントを計算する。
【０２４２】 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を、ＨＩＶ Ｇａｇ ＤＮＡまたはＥｎｖ
ＤＮＡを用いて免疫したマウスから回収した脾臓細胞において測定する。Ｇａｇ
またはＥｎｖのＤＮＡ免疫動物由来のエフェクター細胞は、ＣＴＬ応答を示すＧ
ａｇまたはＥｎｖのペプチド標識ＳＶ−ＢＡＬＢ（ＭＨＣ一致）標的細胞の特異
的な溶解を示す。ペプチド標識され、そしてＭＨＣ非対応のマウス系統（ＭＣ５
７）由来である標的細胞は、溶解されない。
【０２４３】 従って、合成ＥｎｖおよびＧａｇの発現カセットは、ＤＮＡ免疫による細胞傷
害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導について増加した効力を示す。
【０２４４】 （実施例５） （合成ＥｎｖまたはＧａｇの発現カセットを用いる非ヒト霊長類のＤＮＡ免疫
） 非ヒト霊長類を、種々の用量（例えば、１〜５ｍｇ）の合成Ｇａｇおよび／ま
たはＥｎｖ含有プラスミドを用いて、皮内、粘膜内または両方、大腿四頭筋への
筋肉内に複数回（例えば、０、４、８および２４週）免疫する。この動物からそ
れぞれの免疫２週間後に採血し、そして単離した血漿を用いてＥＬＩＳＡを実施
する。ＥＬＩＳＡを、二次抗体結合物が抗ヒトＩｇＧのｇ鎖特異的ペルオキシダ
ーゼ結合物（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＤ
６３１７８）（１：５００の希釈で使用される）であることを除いて、原則的
には実施例４に記載のように実施する。５０μｇ／ｍｌの酵母抽出物を、血漿サ
ンプルおよび抗体結合物の希釈物に添加し、非ヒト霊長類に前もって存在する酵
母抗体に起因する非特異的バックグラウンドを減少させる。
【０２４５】 さらに、Ｔヘルパー細胞機能の誘導を示す、抗原に応答するリンパ球増殖応答
をまた、免疫後に評価し得る。
【０２４６】 合成ＥｎｖおよびＧａｇのプラスミドＤＮＡの両方が、非ヒト霊長類における
免疫原性であることを期待される。
【０２４７】 （実施例６） （合成ＥｎｖおよびＧａｇの発現カセットの含有する、組換えシンドビスＲＮ
ＡおよびＤＮＡのインビトロ発現） アルファウイルスベクターにおける合成ＥｎｖおよびＧａｇの発現カセットの
発現効率を評価するために、選択された合成発現カセットを、プラスミドＤＮＡ
ベースのシンドビスウイルスベクターおよび組換えベクター粒子ベースのシンド
ビスウイルスベクターの両方にサブクローニングする。特に、シンドビスウイル
スＲＮＡベクターレプリコンのインビトロ転写のためのｃＤＮＡベクター構築物
（ｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−
５１９、１９９６）を改変して、プラスミド直線化のためのＰｍｅＩ部位および
異種遺伝子の挿入のためのポリリンカーを含める。ポリリンカーを、ＸｈｏＩ部
位、ＰｍｌＩ部位、ＡｐａＩ部位、ＮａｒＩ部位、ＸｂａＩ部位、およびＮｏｔ
Ｉ部位を含む２つのオリゴヌクレオチド（ＸＰＡＮＸＮＦおよびＸＰＡＮＸＮＲ
）を用いて作製する。
【０２４８】 プラスミドｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）を、ＸｈｏＩお
よびＮｏｔＩで消化し、ルシフェラーゼ遺伝子挿入物を除去し、Ｋｌｅｎｏｗお
よびｃＮＴＰを用いて平滑末端化し、そしてＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏｌ
０１、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を用いてアガロースゲルより精製する。オリゴヌクレ
オチドを互いにアニールし、プラスミドに連結する。得られた構築物をＮｏｔＩ
およびＳａｃＩで消化し、最小限のシンドビス ３’末端配列およびＡ40トラク
トを除去し、そしてＰＫＳＳＩＮ１−ＢＶ（ＷＯ９７／３８０８７）由来の約０
．４ｋｂｐのフラグメントと連結する。ｐＫＳＳＩＮ１−ＢＶをＮｏｔＩおよび
ＳａｃＩで消化して、そしてアガロースゲルからのサイズ分画後の精製によって
、この０．４ｋｂｐフラグメントを得る。このフラグメントは、完全なシンドビ
スウイルスの３’末端、Ａ40トラクト、および連結のためのＰｍｅＩ部位を含む
。この新しいベクター構築物を、ＳＩＮＢＶＥと称する。
【０２４９】 合成ＨＩＶ ＧａｇおよびＥｎｖのコード配列を、ＥｃｏＲＩでの消化、Ｋｌ
ｅｎｏｗおよびｄＮＴＰを用いる平滑末端化、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩでの精製
、ＳａｌＩでの消化、アガロースゲルでのサイズ分画、およびアガロースゲルか
らのＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いる精製によって、親プラスミドから得る。こ
の合成ＨＩＶ ＧａｇまたはＥｎｖのコードフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＰ
ｍｔＩで消化されるＳＩＮＢＶＥベクターに連結する。得られたベクターを、Ｇ
ｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精製し、ＳＩＮＢＶＧａｇと称する。ベクターＲ
ＮＡレプリコンを、ＳＩＮＢＶＧａｇからインビトロで転写（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ
ら、前出）し得、細胞の形質転換のために直接使用し得る。あるいは、これらの
レプリコンを、欠損ヘルパーＲＮＡとの同時発現によってかまたはアルファウイ
ルスパッケージング細胞株を用いて、組換えベクター粒子内にパッケージし得る
。
【０２５０】 ＤＮＡベースのシンドビスウイルスベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｂｅｔａ−ｇ
ａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６
）をＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子挿入物を除
去し、そしてアガロースゲルサイズ分画後にＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精
製する。ＨＩＶ ＧａｇまたはＥｎｖの遺伝子を、ＳＩＮＢＶＧａｇのＳａｌＩ
およびＸｈｏＩでの消化、アガロースゲルサイズ分画後のＧａｇ含有フラグメン
トのＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いる精製、および連結によって、ｐＤＣＭＶＳ
ＩＮ−ｂｅｔａ−ｇａｌに挿入する。得られた構築物を、ｐＤＳＩＮ−Ｇａｇと
称し、インビボ投与または本明細書中に記載の任意の方法を用いる処方のために
、直接使用し得る。
【０２５１】 ＢＨＫ細胞および２９３細胞を、組換えシンドビスＲＮＡおよびＤＮＡを用い
て、それぞれトランスフェクトする。上清および細胞融解物を、Ｃｏｕｌｔｅｒ
捕獲ＥＬＩＳＡで試験する（表２）。
【０２５２】 ＢＨＫ細胞を組換えシンドビスＲＮＡを用いて、エレクトロポーレーションに
よってトランスフェクトする。
【０２５３】 ２９３細胞を、ＬＴ−１（実施例２）を用いて、組換えシンドビスＤＮＡでト
ランスフェクトする。合成Ｇａｇおよび／またはＥｎｖ含有プラスミドを、陽性
コントロールとして使用する。上清および溶解物を、トランスフェクション４８
時間後に回収する。
【０２５４】 ＧａｇおよびＥｎｖのタンパク質を、合成発現カセットを用いて、ＤＮＡおよ
びＲＮＡベースのシンドビスベクターシステムの両方から効果的に発現し得る。
【０２５５】 （実施例７） （組換えシンドビスレプリコンベクターを含有する合成Ｇａｇおよび／または
Ｅｎｖの発現カセットのインビボの免疫原性） （Ａ．免疫） シンドビスレプリコン中の組換え合成ＧａｇおよびＥｎｖの発現カセットの免
疫原性を評価するために、マウスの研究を実施する。合成Ｇａｇおよび／または
Ｅｎｖの発現カセットを有するを有するシンドビスウイルスＤＮＡベクター（実
施例６）を、１００μｌの総注射量における以下の最終濃度に希釈する：２０μ
ｇ、２μｇ、０．２μｇ、０．０２μｇおよび０．００２μｇ。希釈したＤＮＡ
の起こり得る陰性希釈効果を克服するために、各々のサンプル中の総ＤＮＡ濃度
を、シンドビスレプリコンベクターＤＮＡ単独を用いて２０μｇまで上げる。４
〜１０のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍ
Ａ）の１２群を、表２のスケジュールに従って、筋肉内で免疫（肢あたり５０μ
ｌ、前脛骨筋内への筋肉内注射）する。あるいは、シンドビスウイルス粒子を、
以下の用量で調製する：表３に示されるように、１００μｌ中に１０3ｐｆｕ，
１０5ｐｆｕおよび１０7ｐｆｕ。シンドビスＥｎｖまたはＧａｇの粒子調製物を
筋肉内経路および皮下経路を用いてマウスに投与する（部位あたり５０μｌ）。
【０２５６】
【表２】 。
【０２５７】
【表３】 。
【０２５８】 各群を採血し、そして、原則的には実施例４に記載のように液性および細胞性
の両方の評価（例えば、特異的ＣＴＬの頻度）を実施する。
【０２５９】 本発明の好ましい実施形態が詳細に記載されているにもかかわらず、明白な改
変が、添付する特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神および範
囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１（配列番号３）は、合成Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列を示す。示されるヌクレオチド配列は、Ｃ型株ＡＦ１１０
９６５を改変することによって得られ、そしてＩＮＳのさらなる改変を含む。
【図２】 図２（配列番号４）は、合成Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列を示す。示されるヌクレオチド配列は、Ｃ型株ＡＦ１１０
９６７を改変することによって得られ、そしてＩＮＳのさらなる改変を含む。
【図３】 図３（配列番号９）は、合成Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列は、ｇｐ１６０（シグナルペプ
チドを含む）を示し、そしてＣ型株ＡＦ１１０９６８を改変することによって得
られた。矢印は、ポリヌクレオチドの種々の領域の位置を示し、これらには、以
下をコードするシグナル配列が挙げられる：シグナルペプチド（ヌクレオチド１
〜８１）（配列番号１８）、ｇｐ１２０ポリペプチド（ヌクレオチド８２〜１５
１２）（配列番号６）；ｇｐ４１ポリペプチド（ヌクレオチド１５１３〜２５４
７）（配列番号１０）、ｇｐ１４０ポリペプチド（ヌクレオチド８２〜２０２５
）（配列番号７）、およびｇｐ１６０ポリペプチド（ヌクレオチド８２〜２５４
７）（配列番号８）。シグナルペプチドをコードするコドンが、ネイティブＨＩ
Ｖ−１のシグナル配列から改変される（本明細書中で上記のように）。
【図４】 図４（配列番号１５）は、合成Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、ｇｐ１６０（シグナ
ルペプチドを含む）を示し、そしてＣ型株ＡＦ１１０９７５を改変することによ
って得られた。矢印は、ポリヌクレオチドの種々の領域の位置を示し、これらに
は、以下をコードするシグナル配列が挙げられる：シグナルペプチド（ヌクレオ
チド１〜７２）（配列番号１９）、ｇｐ１２０ポリペプチド（ヌクレオチド７３
〜１５０９）（配列番号１２）；ｇｐ４１ポリペプチド（ヌクレオチド１５１０
〜２５６５）（配列番号１６）、ｇｐ１４０ポリペプチド（ヌクレオチド７３〜
２０２２）（配列番号１３）、およびｇｐ１６０ポリペプチド（ヌクレオチド７
３〜２５６５）（配列番号１４）。シグナルペプチドをコードするコドンが、ネ
イティブＨＩＶ−１のシグナル配列から改変される（本明細書中で上記のように
）。
【図５】 図５は、ＡＦ１１０９６５に由来する合成Ｇａｇ配列中のいくつかの残存して
いるＩＮＳの位置を示す。これらの配列に対する変更は、図中に四角で囲まれる
。上部の線は、示された株に由来するＧａｇポリペプチドのコドンを最適化され
た配列を示す（配列番号２０）。四角で囲まれた領域の線の下に示すヌクレオチ
ドは、さらなるＩＮＳの除去のために作成された変更を示し、図１中に示される
配列に対応する（配列番号３）。
【図６】 図６は、ＡＦ１１０９６８に由来する合成Ｇａｇ配列中のいくつかの残存して
いるＩＮＳの位置を示す。これらの配列に対して作成された変更が、図中に四角
で囲まれる。上部の線は、示された株に由来するＧａｇポリペプチドのコドンを
最適化された配列を示す（配列番号２１）。四角で囲まれた領域の線の下に示す
ヌクレオチドは、さらなるＩＮＳの除去のために作成された変更を示し、図２中
に示される配列に対応する（配列番号４）。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 37/02 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 31/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｃ０８７ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 ザーメジェド， ジャン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608， エミリービル， ホートン ストリート − アール440 4560， カイロン コ ーポレイション Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA31 CA01 DA02 EA02 FA02 FA06 FA07 HA17 4B064 AG32 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA95Y AB01 AC14 BA02 BA05 CA24 CA33 CA44 4C076 AA19 BB11 CC07 CC47 EE01 FF31 FF68 4C084 AA02 AA13 AA14 BA01 BA08 BA23 BA35 CA53 CA56 MA02 NA05 NA13 NA14 ZB072 ZC552 4C085 AA32 AA38 CC03 CC04 CC05 CC21 EE01 EE06 FF24 4C087 AA02 BC83 CA20 MA02 MA66 NA01 NA13 NA14 ZB07 ZC55

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドを
    コードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号２に対して少
    なくとも９０％の同一性を有する少なくとも６０個のヌクレオチドの連続する配
    列を含む、発現カセット。
  2. 【請求項２】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドを
    コードする該ポリヌクレオチド配列が、（Ａ）配列番号３に対して少なくとも約
    ９０％の同一性を有する少なくとも１４７９個のヌクレオチド、または（Ｂ）配
    列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも１５０９個のヌ
    クレオチド、の連続する配列を含む、発現カセット。
  3. 【請求項３】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドを
    コードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号３に対して少なくとも約９０％
    の同一性を有する少なくとも１４７９個のヌクレオチドの連続する配列を含む、
    発現カセット。
  4. 【請求項４】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドを
    コードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号４に対して少なくとも９０％の
    同一性を有する少なくとも１５０９個のヌクレオチドの連続する配列を含む、発
    現カセット。
  5. 【請求項５】 前記Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
    が、配列番号３からなる、請求項３に記載の発現カセット。
  6. 【請求項６】 前記Ｇａｇポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド
    配列が、配列番号４からなる、請求項４に記載の発現カセット。
  7. 【請求項７】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドを
    コードする該ポリヌクレオチド配列が、（Ａ）Ｘ個の連続するヌクレオチドであ
    って、ここで（ｉ）該Ｘ個の連続するヌクレオチドが、配列番号１由来のＹ個の
    連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが
    Ｙに等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘが６０個のヌクレオチドである、ヌクレオチド
    ；または（Ｂ）Ｘ個の連続するヌクレオチドであって、ここで（ｉ）Ｘ個の連続
    するヌクレオチドが、配列番号２のＹ個の連続するヌクレオチドに対して少なく
    とも約９０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸがＹに等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘが
    ６０個のヌクレオチドである、ヌクレオチド、を含む、発現カセット。
  8. 【請求項８】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドを
    コードする該ポリヌクレオチド配列が、（Ａ）Ｘ個の連続するヌクレオチドであ
    って、ここで（ｉ）該Ｘ個の連続するヌクレオチドが、配列番号３由来のＹ個の
    連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが
    Ｙに等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘが１４７９個のヌクレオチドである、ヌクレオ
    チド；または（Ｂ）Ｘ個の連続するヌクレオチドであって、ここで（ｉ）Ｘ個の
    連続するヌクレオチドが、配列番号４のＹ個の連続するヌクレオチドに対して少
    なくとも約９０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸがＹに等しく、そして（ｉｉｉ）
    Ｘが１５０９個のヌクレオチドである、ヌクレオチド、を含む、発現カセット。
  9. 【請求項９】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドを
    コードするポリヌクレオチド配列が、Ｘ個の連続するヌクレオチドであって、こ
    こで（ｉ）該Ｘ個の連続するヌクレオチドが、配列番号３のＹ個の連続するヌク
    レオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸがＹに等しく、
    そして（ｉｉｉ）Ｘが１４７９個のヌクレオチドである、ヌクレオチド、を含む
    、発現カセット。
  10. 【請求項１０】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、Ｘ個の連続するヌクレオチドであって、
    ここで（ｉ）該Ｘ個の連続するヌクレオチドが、配列番号４のＹ個の連続するヌ
    クレオチドに対して少なくとも約９０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸがＹに等し
    く、そして（ｉｉｉ）Ｘが１５０９個のヌクレオチドである、ヌクレオチド、を
    含む、発現カセット。
  11. 【請求項１１】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号３のＸ個の連続するヌクレオチ
    ドからなり、そしてＸが１４７９個のヌクレオチドである、発現カセット。
  12. 【請求項１２】 ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号４のＸ個の連続するヌクレオチ
    ドからなり、そしてＸが１５０９個のヌクレオチドである、発現カセット。
  13. 【請求項１３】 前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＩＶプロテアーゼポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜１２のいず
    れか１項に記載の発現カセット。
  14. 【請求項１４】 前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＩＶポリメラーゼポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜１２のいず
    れか１項に記載の発現カセット。
  15. 【請求項１５】 前記ＨＩＶポリメラーゼポリペプチドをコードする配列が
    、逆転写酵素およびインテグラーゼに対応するコード領域の欠失により改変され
    ている、請求項１４に記載の発現カセット。
  16. 【請求項１６】 前記Ｇａｇをコードするポリヌクレオチド配列が、Ｔヘル
    パー細胞エピトープおよびＣＴＬエピトープを保存している、請求項１〜１５の
    いずれか１項に記載の発現カセット。
  17. 【請求項１７】 ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｅｎｖポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５に対して少なくとも９０％の
    同一性を有する少なくとも１４１個のヌクレオチドの連続する配列を含む、発現
    カセット。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の発現カセットであって、該ＨＩＶ Ｅ
    ｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、（Ａ）配列番号６に対
    して少なくとも９０％の同一性を有する１４３０個のヌクレオチド；（Ｂ）配列
    番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する１９４３個のヌクレオチド；
    （Ｃ）配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有する２４６５個のヌク
    レオチド；または（Ｄ）配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有する
    ２５４６個のヌクレオチド、からなる群より選択される連続する配列を含む、発
    現カセット。
  19. 【請求項１９】 ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｅｎｖポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１０に対して少なくとも９０％
    の同一性を有する少なくとも１０３４個のヌクレオチドの連続する配列を含む、
    発現カセット。
  20. 【請求項２０】 ＨＩＶ Ｅｎｖポリヌクレオチドを含むポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該ポリヌクレオチ
    ド配列が、配列番号１１に対して少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも
    １４３個のヌクレオチドの連続する配列を含む、発現カセット。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の発現カセットであって、該ＨＩＶ Ｅ
    ｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、以下：（Ａ）配列番号
    １２に対して少なくとも９０％の同一性を有する１４３６個のヌクレオチド；（
    Ｂ）配列番号１３に対して少なくとも９０％の同一性を有する１９４９個のヌク
    レオチド；（Ｃ）配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有する２４
    ９２個のヌクレオチド；または（Ｄ）配列番号１５に対して少なくとも９０％の
    同一性を有する２５６４個のヌクレオチド、からなる群より選択される連続する
    配列をさらに含む、発現カセット。
  22. 【請求項２２】 ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｅｎｖポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１６に対して少なくとも９０％
    の同一性を有する少なくとも１０５５個のヌクレオチドの連続する配列を含む、
    発現カセット。
  23. 【請求項２３】 ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｅｎｖポリペプチド
    をコードする該ポリヌクレオチド配列が、図３または図４のいずれかとして示さ
    れる配列からなる、発現カセット。
  24. 【請求項２４】 ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｅｎｖポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、Ｘ個の連続するヌクレオチドであって、
    ここで（ｉ）該Ｘ個の連続するヌクレオチドが、配列番号１０のＹ個の連続する
    ヌクレオチドに対して少なくとも約９０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸがＹに等
    しく、そして（ｉｉｉ）Ｘが１０３５個のヌクレオチドである、ヌクレオチド、
    を含む、発現カセット。
  25. 【請求項２５】 ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｅｎｖポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列が、（Ａ）Ｘ個の連続するヌクレオチドであ
    って、ここで（ｉ）Ｘ個の連続するヌクレオチドが、配列番号５のＹ個の連続す
    るヌクレオチドに対して少なくとも約９０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸがＹに
    等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘが１４１個のヌクレオチドである、ヌクレオチド、
    を含む、発現カセット。
  26. 【請求項２６】 選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系で
    あって、該系は、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットを含み、
    該ポリヌクレオチド配列が、該選択された宿主細胞における発現と適合する制御
    エレメントに作動可能に連結されている、組換え発現系。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の組換え発現系であって、前記制御エレ
    メントが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル
    、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列
    からなる群より選択される、組換え発現系。
  28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の組換え発現系であって、該転写プロモ
    ーターが、ＣＭＶ、ＣＭＶおよびイントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌ
    ｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒ、ならびにメタロチオネインからなる群より選択される
    、組換え発現系。
  29. 【請求項２９】 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットを含
    む細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が、前記選択された細胞における発
    現に適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、細胞。
  30. 【請求項３０】 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の細胞
    。
  31. 【請求項３１】 前記細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細
    胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＣＨＯ細胞から選択される
    、請求項３０に記載の細胞。
  32. 【請求項３２】 請求項２９に記載の細胞であって、前記細胞が、昆虫細胞
    、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、霊長類細胞、不死化細胞、腫瘍由来細胞、マ
    クロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、および始原細胞から
    なる群より選択される、細胞。
  33. 【請求項３３】 レンチウイルスベクターをパッケージングするために有用
    な細胞株であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットを含む
    発現ベクターでトランスフェクトされている適切な宿主細胞を含み、該ポリヌク
    レオチド配列が、該宿主細胞における発現と適合する制御エレメントに作動可能
    に連結されている、細胞株。
  34. 【請求項３４】 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットを含
    む遺伝子送達ベクターであって、該ポリヌクレオチド配列が、被験体における発
    現に適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、ベクター。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の遺伝子送達ベクターであって、該遺伝
    子送達ベクターが、非ウイルスベクター、ウイルスベクターおよび細菌プラスミ
    ドベクターからなる群より選択される、ベクター。
  36. 【請求項３６】 請求項３５に記載のウイルスベクターであって、レトロウ
    イルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、αウイル
    スベクター、およびポックスウイルスベクターからなる群より選択される、ウイ
    ルスベクター。
  37. 【請求項３７】 前記ベクターが真核生物階層ベクター開始系を含む、請求
    項３６に記載のαウイルスベクター。
  38. 【請求項３８】 前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスであ
    る、請求項３６に記載のポックスウイルスベクター。
  39. 【請求項３９】 前記ベクターがリポソーム調製物中にカプセル化されてい
    る、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載のベクター。
  40. 【請求項４０】 前記ベクターがリポソーム調製物中にカプセル化されてい
    る、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載のベクター。
  41. 【請求項４１】 免疫応答を刺激するための、請求項１〜２５のいずれか１
    項に記載の発現カセットの使用。
  42. 【請求項４２】 被験体において免疫応答を誘導するための医薬品の製造に
    おける、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットの使用。
  43. 【請求項４３】 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットによ
    り発現されるポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が、該ポリペ
    プチドの発現を生じる条件下で宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチド
    を回収する工程を包含する、方法。
  44. 【請求項４４】 被験体において免疫応答を誘導するための医薬品の製造に
    おける、請求項４２から回収されるポリペプチドの使用。
  45. 【請求項４５】 免疫応答を刺激するための、請求項１〜２５のいずれか１
    項に記載のポリヌクレオチド配列の使用であって、該ポリヌクレオチド配列が、
    被験体の組織中に直接導入された場合に、ＨＩＶポリヌクレオチドを作動可能に
    コードする、使用。
  46. 【請求項４６】 前記ポリヌクレオチド配列が、遺伝子送達ベクターによっ
    て組織中に導入される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ド配列の使用。
  47. 【請求項４７】 アジュバントをさらに含む、請求項４３に記載のポリペプ
    チドの使用。
  48. 【請求項４８】 被験体において免疫応答を誘導するための医薬品の製造に
    おける、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットを含む組成物。
  49. 【請求項４９】 前記免疫応答が液性免疫応答である、請求項４８に記載の
    組成物の使用。
  50. 【請求項５０】 前記免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項４８に記載
    の組成物の使用。
  51. 【請求項５１】 被験体における免疫応答を刺激するための第１組成物およ
    び第２組成物の使用であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセ
    ットを含む該第１組成物が、プライム工程において被験体に投与され、そして請
    求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットを含む該第２組成物が、ブー
    スト工程において同じ被験体に投与される、使用。
  52. 【請求項５２】 前記第１組成物または前記第２組成物がアジュバントをさ
    らに含む、請求項５１に記載の第１組成物および第２組成物の使用。
  53. 【請求項５３】 前記第１組成物および前記第２組成物の両方がアジュバン
    トをさらに含む、請求項５１に記載の第１組成物および第２組成物の使用。
  54. 【請求項５４】 ＨＩＶの処置における使用のための、請求項４８〜５３の
    いずれか１項に記載の組成物。
  55. 【請求項５５】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発現カセットの少
    なくとも１つによってコードされるさらなるＧａｇポリペプチドをさらに含む、
    請求項４８に記載の組成物。
  56. 【請求項５６】 請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の発現カセットの
    少なくとも１つによってコードされるさらなるＥｎｖポリペプチドをさらに含む
    、請求項４８に記載の組成物。
  57. 【請求項５７】 アジュバントをさらに含む、請求項４８、４９、５０、５
    ４、５５または５６のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 【請求項５８】 請求項４９または５０のいずれか１項に記載の免疫応答を
    誘導するための組成物の使用であって、Ｅｎｖポリペプチドが、Ｇａｇポリペプ
    チドが投与される前に、その投与と同時に、またはその投与後に、被験体に投与
    される、使用。
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