JP2001514376A - Nucleic acid estimation - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 核酸物質の特性またはパラメータを、もしくは、化学反応または生化学反応によって核酸が変異するプロセスを推定する方法であって、この特性またはパラメータは核酸物質の電気伝導率と関連し、核酸物質あるいはこの物質を含有する反応混合物の電気伝導率を測定する手段と、電気伝導率と前記特性またはパラメータとの間の所定の相関性を参照して、核酸物質の特性またはパラメータ、もしくは、プロセスの測定結果からそれらを推定する手段とを含む。 (57) [Summary] A method of estimating a property or parameter of a nucleic acid material or a process of mutating a nucleic acid by a chemical or biochemical reaction, wherein the property or parameter is related to the electrical conductivity of the nucleic acid material, Means for measuring the electrical conductivity of the reaction mixture containing, and referring to a predetermined correlation between the electrical conductivity and the property or parameter, the property or parameter of the nucleic acid substance, or the measurement result of the process. Means for estimating them.
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、核酸の推定、より具体的には核酸の特性またはパラメータ、あるい
は、核酸が化学反応または生化学反応によって修飾するプロセスの推定に関する
。本発明は、特に溶液中の核酸濃度測定（定量）及び核酸分子の分子量測定（サ
イジング）に関する。本発明は、また、核酸が化学的または生化学的に修飾する
反応を監視するのにも利用できる。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to estimating nucleic acids, and more specifically to estimating the properties or parameters of nucleic acids, or the processes by which nucleic acids are modified by chemical or biochemical reactions. The present invention particularly relates to the measurement of nucleic acid concentration in solution (quantification) and the measurement of molecular weight of nucleic acid molecules (sizing). The invention can also be used to monitor reactions where nucleic acids are chemically or biochemically modified.
【０００２】 （背景技術） 従来、ＤＮＡ濃度は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド環構造による紫外線（およそ
２６０ｎｍ）の特徴的吸収に基づく測定法である分光光度計法により測定されて
いた。分子量測定に際しては、通常アガロースゲル電気泳動法によってＤＮＡ分
子をサイズ別に分離し、次いで分離されたＤＮＡ分子は臭化エチジウム色素を用
いて可視化される。ＤＮＡは、紫外線（およそ３００ｎｍ）による蛍光発光後続
励起を測定し、既知量の標準品と比較することにより、アガロースゲル中で定量
化することも可能である。しかし、いずれの方法にも本質的な欠陥がある。ＵＶ
分光光度計は高価な石英製のキュベットの使用を必要とする高価な装置であり、
かなり大量のサンプルを損傷させる処理を要するものである。臭化エチジウムを
使用してＤＮＡの可視化及び定量化を行う方法は安価な代替法となり得るが、極
めて高い毒性及び発癌性の問題から望ましい方法とは言えない。BACKGROUND ART [0002] Conventionally, DNA concentration has been measured by a spectrophotometer method, which is a measurement method based on the characteristic absorption of ultraviolet light (about 260 nm) by the nucleotide ring structure of a DNA molecule. In measuring the molecular weight, DNA molecules are usually separated according to size by agarose gel electrophoresis, and the separated DNA molecules are then visualized using an ethidium bromide dye. DNA can also be quantified in an agarose gel by measuring the subsequent excitation of the fluorescence by ultraviolet light (approximately 300 nm) and comparing it to a known amount of a standard. However, both methods have inherent deficiencies. UV
Spectrophotometers are expensive instruments that require the use of expensive quartz cuvettes,
It requires processing that damages a fairly large amount of sample. The use of ethidium bromide to visualize and quantify DNA can be an inexpensive alternative, but is not a desirable method due to its extremely high toxicity and carcinogenicity.
【０００３】 （発明の開示） 本発明は、核酸物質の性質又はパラメータが核酸物質の電気伝導率と相関性を
有することを利用した、核酸物質の性質またはパラメータ、あるいは核酸が化学
的または生化学的に修飾するプロセスを推定する方法からなる。その方法は、核
酸物質あるいはこの物質を含む反応混合物の電気伝導率を測定し、電気伝導率と
前記性質及びパラメータとの間の所定の相関性を参照して、前記測定結果から核
酸物質の性質またはパラメータ、もしくはプロセスを推定することから構成され
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION [0003] The present invention utilizes the fact that the properties or parameters of a nucleic acid substance have a correlation with the electrical conductivity of the nucleic acid substance. It consists of a method of estimating the process to be modified. The method comprises measuring the electric conductivity of a nucleic acid substance or a reaction mixture containing the substance, and referring to a predetermined correlation between the electric conductivity and the property and parameter, from the measurement result, the property of the nucleic acid substance. Or it consists of estimating parameters or processes.
【０００４】 本発明は、しばしば望まれる核酸の定量が核酸溶液の伝導性を測定することに
よって算定可能であるとの核酸の重要な特性の発見に基づくものである。このよ
うな特性上の変化は電気伝導率についての対応する変化にも表れる。本発明によ
って決定される重要な特性の例として、溶液中の核酸濃度及びある種の核酸の分
子量が挙げられる。ＤＮＡあるいは他の核酸を酵素処理する過程で発生する分子
量の変化は、従って、水溶液または反応混合物の電気伝導率における変化を監視
することで決定される。[0004] The present invention is based on the discovery of an important property of nucleic acids that often the desired quantification of nucleic acids can be calculated by measuring the conductivity of the nucleic acid solution. Such changes in properties are reflected in corresponding changes in electrical conductivity. Examples of important properties determined by the present invention include the concentration of nucleic acids in solution and the molecular weight of certain nucleic acids. Changes in molecular weight that occur during the enzymatic treatment of DNA or other nucleic acids are thus determined by monitoring changes in the electrical conductivity of the aqueous solution or reaction mixture.
【０００５】 本発明によれば、電気伝導率は、核酸物質溶液中を流れる電流から便宜的に測
定することが可能である。According to the present invention, the electric conductivity can be conveniently measured from the current flowing in the nucleic acid substance solution.
【０００６】 本発明は、単一種の核酸の特性あるいは特性の変化を決定するのに特に重要な
ものである。しかしながら、該核酸物質は必ずしも完全に精製されている必要は
なく、本発明は少量の核酸についても、あるいは、他種核酸をも含む他の物質を
含んでいる核酸についても利用することが可能である。The present invention is of particular importance in determining the properties or changes in properties of a single species of nucleic acid. However, the nucleic acid material does not necessarily need to be completely purified, and the present invention can be used with small amounts of nucleic acid, or with nucleic acids containing other materials, including other types of nucleic acids. is there.
【０００７】 ＤＮＡ濃度は、一定既知の交流電流周波数に於ける電流／伝導率を測定するこ
とによって決定することが可能である。何らかの一定周波数で記録した電流は、
ＤＮＡ濃度に比例していることが明らかとなっている。例えば、図１は２ＫＨｚ
で記録された電流／伝導率がＤＮＡ濃度と如何に異なるかを示すものである。こ
の相関性は単一核酸に適用できるのみならず、大きさの異なる分子についても適
用可能である。本発明方法を実施する為の装置の設計に際しては、伝導率測定装
置が直ちに採用され、電流の流れと核酸濃度との一定の相関性に従って測定する
ことが可能である。実用上は、通常均一なＤＮＡ種に対応しているが一定範囲の
分子量には対応していない計器で較正することが好ましい。従って、サンプルは
通常まず適当な大きさにサイジングされ、その後で濃度測定に適当な核酸の設定
が選択される。[0007] DNA concentration can be determined by measuring current / conductivity at a constant, known alternating current frequency. The current recorded at some constant frequency is
It has been found that it is proportional to the DNA concentration. For example, FIG.
Shows how the current / conductivity recorded in Example 2 differs from the DNA concentration. This correlation can be applied not only to a single nucleic acid, but also to molecules of different sizes. In designing an apparatus for carrying out the method of the present invention, a conductivity measuring apparatus is immediately adopted, and the measurement can be performed according to a certain correlation between the current flow and the nucleic acid concentration. In practice, it is preferable to calibrate with an instrument that usually corresponds to a homogeneous DNA species but does not correspond to a certain range of molecular weight. Therefore, the sample is usually first sized to a suitable size, and then the appropriate nucleic acid settings are selected for concentration measurements.
【０００８】 ＤＮＡ種の分子量は、電極を介して加えられた各周波数に対するこれら分子の
反応から測定される。最大電流／伝導率反応の百分率（％反応率）として記録さ
れた電流／伝導率を、２本の電極間に加えられた交流信号の周波数に対してプロ
ットすると、対応分子の分子量とは異なる特徴的な曲線が与えられる（図２）。[0008] The molecular weight of DNA species is measured from the response of these molecules to each frequency applied through an electrode. When the current / conductivity, recorded as a percentage of the maximum current / conductivity response (% reaction), is plotted against the frequency of the alternating signal applied between the two electrodes, the characteristic differs from the molecular weight of the corresponding molecule. A typical curve is given (FIG. 2).
【０００９】[0009]
【表１】 [Table 1]
【００１０】 単一ＤＮＡ種に関しては、分子量はまず（周波数範囲が０−５×１０５Ｈｚ以
上の）周波数曲線に対する反応勾配を計算して決定することが可能である。次い
で勾配値は勾配に対してプロットされた分子量の経過記録の較正曲線(図3)と比 較することができる。試験された全てのＤＮＡ分子に関しては、勾配値が大きけ
れば大きい程、分子量は小さくなるように勾配は分子量に従って変動する。この
ような相関性の根拠は、周波数の変化につれてＤＮＡ分子の運動性が変化するた
めだと推測される。すなわち、周波数が増加すると、分子量の大きな分子が分子
量の小さな分子と比較して変化に反応しにくくなる為と考えられる。For a single DNA species, the molecular weight can be determined by first calculating the slope of the response to a frequency curve (frequency range 0-5 × 10 5 Hz or more). The slope value can then be compared to a calibration curve of the molecular weight history plotted against the slope (FIG. 3). For all DNA molecules tested, the gradient varies according to molecular weight such that the higher the gradient value, the lower the molecular weight. It is presumed that the reason for such a correlation is that the mobility of DNA molecules changes as the frequency changes. That is, it is considered that when the frequency is increased, molecules having a large molecular weight are less likely to react to a change than molecules having a small molecular weight.
【００１１】 本発明に基づくＤＮＡ定量方法及び分子量測定方法は、従来の方法に伴う問題
点を解消し、かつ、これら従来の方法に多数の明らかな利点を付与するものであ
る。従って、本発明は分子量及び濃度の迅速かつ正確な測定を可能とするもので
あり、より感度が高く正確であり、少ないサンプル量で測定を可能とする測定方
法をもたらすものである。The DNA quantification method and the molecular weight measurement method according to the present invention eliminate the problems associated with the conventional methods and provide many obvious advantages to these conventional methods. Therefore, the present invention enables rapid and accurate measurement of molecular weight and concentration, and provides a measurement method which is more sensitive and accurate, and enables measurement with a small sample amount.
【００１２】 上記に略述したＤＮＡの特性指摘は、ＤＮＡを含む溶液中の２本の細い白金電
極線（銅、ステンレス等の他の金属を代用してもよい）間の変調周波数の交流信
号を用いて達成される。通常は、０〜１０ボルトの一定の交流信号が２本の細い
伝導性電極線間に印加される。この交流信号の周波数は０〜１ＭＨｚの範囲であ
り、これらの電極を通して印加され、対応する伝導率は前記溶液を介して通過す
る電流として各周波数ごとに順に記録される。例えば、サンプルＤＮＡを少なく
とも１０μｌの水あるいはＴＥ緩衝液中に溶解する。便宜上、５００μｌの標準
プラスチックチューブを用いても良い。２本の細い白金性電極線を溶液中へ設置
し、これを交流１Ｖで作動する関数発生器へ接続する。０〜１ＭＨｚの範囲の周
波数が溶液中を通って、その結果得られた電流が電流計を用いてｍＡ単位で測定
される。ＤＮＡ濃度は、周波数２ＫＨｚで溶液中を通った電流を標準曲線と比較
して算出する（ＤＮＡ濃度を一定の周波数で電流と参照する）。他の周波数を使
用することも可能である。[0012] The characteristics of the DNA outlined above are based on the fact that an AC signal of a modulation frequency between two thin platinum electrode wires (other metals such as copper and stainless steel may be used instead) in a solution containing DNA. Is achieved using Typically, a constant AC signal of 0-10 volts is applied between two thin conductive electrode wires. The frequency of this AC signal ranges from 0 to 1 MHz and is applied through these electrodes, and the corresponding conductivity is recorded sequentially for each frequency as a current passing through the solution. For example, the sample DNA is dissolved in at least 10 μl of water or TE buffer. For convenience, a 500 μl standard plastic tube may be used. Two fine platinum electrode wires are placed in the solution and connected to a function generator operating at 1V AC. Frequencies ranging from 0 to 1 MHz pass through the solution and the resulting current is measured in mA using an ammeter. The DNA concentration is calculated by comparing the current passing through the solution at a frequency of 2 KHz with a standard curve (the DNA concentration is referred to as a current at a constant frequency). Other frequencies can be used.
【００１３】 （実施例の説明） 溶液中のＤＮＡ分子の分子量が伝導率法によって決定できることの確認は、４
種の異なるミリＱ水及びトリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（塩基オリゴヌクレオチ
ド２５、塩基対フラグメント７００、ｐＵＣ１８（＝２，６９０塩基対）及びラ
ムダ（＝５０，０００塩基対）双方のＤＮＡ溶液と、分子量が不明なＤＮＡを含
む５番目の溶液（ＵＮ）とを調製することによって達成された。これらの溶液の
伝導率は、２×１０４Ｈｚ〜１０５Ｈｚの範囲の周波数をμＡ単位で測定した。
ＤＮＡの保存に用いられる最も一般的なバッファー中でＤＮＡ分子が精密に一定
の大きさに分離されることを示すような有意な差異はミリＱとＴＥ緩衝液との間
には認められなかった。(Explanation of the Examples) Confirmation that the molecular weight of the DNA molecule in the solution can be determined by the conductivity method is as follows.
DNA solutions of both different Milli-Q water and Tris EDTA (TE) buffers (base oligonucleotide 25, base pair fragment 700, pUC18 (= 2,690 base pairs) and lambda (= 50,000 base pairs) This was achieved by preparing a fifth solution (UN) containing DNA of unknown molecular weight, the conductivity of which was measured in μA in the frequency range 2 × 10 4 Hz to 10 5 Hz. did.
No significant differences were observed between Milli-Q and TE buffers indicating that DNA molecules were precisely separated to a constant size in the most common buffers used for DNA storage. .
【００１４】 分子量と伝導率との関係を確認するため、溶液を３反復調製し試験に供した。
表２はこれを確認するものであり、その反復間での差異が軽微であることを示す
ものである。表３は平均伝導率をμＡで、また最大伝導率を％で示すものである
。データを％反応率で表す主要な理由は、１回の実験におけるばらつきは（表１
に示したように）小さいものの、電流プローブ装置の脆弱さゆえに、複数の実験
においては、μＡの読み取りに多大なばらつきが生じる為である。しかし、（％
反応率で表される）伝導率の変化の傾向は、各実験間で一定している。To confirm the relationship between molecular weight and conductivity, the solution was prepared in triplicate and subjected to a test.
Table 2 confirms this and shows that the differences between the iterations are minor. Table 3 shows the average conductivity in μA and the maximum conductivity in%. The main reason for expressing the data in% response is that the variability in a single experiment is (Table 1).
This is because, although small, the fragility of the current probe device causes a large variation in μA readings in multiple experiments. However,(%
The tendency of the change in conductivity (expressed in reaction rate) is constant between each experiment.
【００１５】 図４は、表３の平均％反応率データをグラフにプロットして示すものである。
ＤＮＡ溶液間での最も明白な相違点は傾斜の勾配である。この勾配を２×１０４ 及び４×１０５での伝導率から算出した場合、勾配と対数分子量間にほぼ線型の
関係を認め得る（図５参照）。従って、この勾配を分子量を算出するのに利用す
ることが可能である。FIG. 4 shows the average% conversion data in Table 3 plotted on a graph.
The most obvious difference between DNA solutions is the slope of the slope. When this gradient is calculated from the conductivity at 2 × 10 4 and 4 × 10 5 , a nearly linear relationship between the gradient and the log molecular weight can be seen (see FIG. 5). Therefore, this gradient can be used to calculate the molecular weight.
【００１６】 図５から得られたサンプルＵＮの分子量は約１０４７ｂｐｓであり、これは同
一断片のアガロースゲル・サイジングから推定した結果とよく一致している。The molecular weight of the sample UN obtained from FIG. 5 is about 1047 bps, which is in good agreement with the result estimated from agarose gel sizing of the same fragment.
【００１７】[0017]
【表２】 [Table 2]
【００１８】[0018]
【表３】 [Table 3]
【００１９】 上記の相関性は、静止条件の下に特徴指摘ＤＮＡに適用される。これらの相関
性のさらなる新規な活用法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
、逆転写、ＤＮＡ間結さつ等、ＤＮＡが酵素的に修飾するときの、あるいは、例
えばＤＮＡ―タンパク質相互作用等、非酵素タンパク質がＤＮＡと相互作用する
時の反応の進行及びプロセスをリアルタイムで監視することできる。このプロセ
スがもたらす利点は数多くあり、すなわち、反応あるいはプロセスの終末点の決
定、反応あるいはプロセスのキーステージの識別、トラブルシューティングおよ
びオートメーションなどである。例えば、ＰＣＲを特異な遺伝子特性を有する個
人を識別するのに使用すると、ＰＣＲが学術的な研究および医療的診療の双方に
おいて主要な分子生物学的ツールとなる。医療的診断において遭遇する主要な障
害の１つがＰＣＲ産生の分析である。これには、通常、正確なサイジングが求め
られる単一の純正ＤＮＡの産生が必要である。これは、普通、細心の注意を要す
るゲル電気泳動法によって実行される。The above correlations apply to characterization DNA under static conditions. Further novel uses of these correlations include, for example, the polymerase chain reaction (PCR)
The reaction progress and process when DNA is enzymatically modified, such as reverse transcription, ligation between DNA, etc., or when non-enzymatic proteins interact with DNA, eg, DNA-protein interaction. Can be monitored. The benefits of this process are numerous: determining the endpoint of a reaction or process, identifying key stages of a reaction or process, troubleshooting and automation. For example, when PCR is used to identify individuals with unique genetic characteristics, PCR becomes a major molecular biological tool in both academic research and medical practice. One of the major obstacles encountered in medical diagnosis is the analysis of PCR production. This usually requires the production of a single genuine DNA that requires accurate sizing. This is usually performed by meticulous gel electrophoresis.
【００２０】 伝導率の測定もＰＣＲに利用されている。一定周波数の交流信号（０および１
ＭＨｚ―０〜１０ボルト）を上記のような２本の白金ワイヤ電極間に通し、ＰＣ
Ｒ反応を介して測定された電流／伝導率を反応が進行する通りに混合する。測定
は固定ポイントで、反応の間、または常時行われる。ＰＣＲ中の伝導率の変動は
、反応査定をリアルタイムで行うに十分な、それと識別できるパターンを辿る。
初期には、おそらくゲノミックテンプレートＤＮＡの解離および変性が引起こす
のであろう伝導率の低下が認められる。首尾よく進んだ反応では、反応の終結到
達を示すプラトーに達する進行サイクルにおいて伝導率の急速な上昇が見られる
（図４）。不首尾に終わった反応では、進行サイクルにおけるそうした伝導率の
上昇は見られない。こうして得られた実験の詳細及び結果を、以下に記載する。Measurement of conductivity has also been used in PCR. AC signal of constant frequency (0 and 1
MHz-0 to 10 volts) between the two platinum wire electrodes as described above,
The current / conductivity measured via the R reaction is mixed as the reaction proceeds. Measurements are taken at fixed points, during the reaction, or constantly. Fluctuations in conductivity during PCR follow a discriminating pattern sufficient to perform reaction assessment in real time.
Initially, there is a decrease in conductivity, presumably caused by dissociation and denaturation of the genomic template DNA. Successful reactions show a rapid increase in conductivity in the progressive cycle reaching a plateau indicating the end of the reaction (FIG. 4). The unsuccessful reaction does not show such an increase in conductivity in the progressive cycle. The details and results of the experiment thus obtained are described below.
【００２１】 ＰＣＲ反応のリアルタイムの監視では、類似の結果が認められた。収量が乏し
い反応としては、図７に示すような曲線が代表的である。初期の最初の数サイク
ルに亘って、コンダクタンス全体に若干の上昇が認められ（ａ）、次に、コンダ
クタンスは低下し（ｂ）、次いで水平状態になるまで上昇し（ｃ）、反応の最終
段階では、上下変動の無いプラトー状態となる（ｄ）。[0021] Real time monitoring of the PCR reaction showed similar results. As a reaction with a poor yield, a curve as shown in FIG. 7 is typical. Over the first few cycles of the initial phase, there is a slight increase in overall conductance (a), then the conductance decreases (b) and then rises to level (c), the final stage of the reaction. Then, there is a plateau state with no vertical fluctuation (d).
【００２２】 反応の最終サイクルにおける伝導率の上昇は、反応収量の上昇に起因すると考
える事ができる。初期サイクルにおける伝導率の低下は、プライマー、ヌクレオ
チド、無機イオンなど、小さな導電種の濃度変化によるものと考察される。これ
らの小さな導電種は、高交流周波数が使用された場合、これより大きなＤＮＡ分
子に比べてより広範囲な移動性をもたらす。産生物の濃度が高まるにつれて、溶
液の伝導率全体に広がり始め、従って、ＤＮＡ濃度が高いと、反応混合物の伝導
率は上昇する。反応が限界に達すると、ＤＮＡ濃度が水平状態になり始め、溶液
のコンダクタンスはプラトー状態に到達する。[0022] The increase in conductivity in the final cycle of the reaction can be attributed to an increase in reaction yield. The decrease in conductivity during the initial cycle is thought to be due to changes in the concentration of small conductive species, such as primers, nucleotides, and inorganic ions. These small conductive species result in a wider range of mobility when high AC frequencies are used compared to larger DNA molecules. As the concentration of the product increases, it begins to spread throughout the conductivity of the solution, and therefore, at higher DNA concentrations, the conductivity of the reaction mixture increases. When the reaction reaches the limit, the DNA concentration begins to level out and the conductance of the solution reaches a plateau.
【００２３】 反応の終末点における単一の反応素子の追加は、従って、反応の収量をさらに
高め、これは溶液の伝導率の上昇として現れる。図８は、Ｔａｑポリマーゼ（ｅ
）の追加が反応伝導率と反応の全体収量の双方をどのように上昇させるかを表し
ている。これはＴａｑが限定的であることを暗示している。さらに、制限素子を
確立する実験では、プライマー、ヌクレオチドおよび緩衝液の追加が含まれるべ
きであろう。The addition of a single reaction element at the end of the reaction therefore further increases the yield of the reaction, which manifests itself as an increase in the conductivity of the solution. FIG. 8 shows Taq polymerase (e
) Shows how the addition of both increases the reaction conductivity and the overall yield of the reaction. This implies that Taq is limiting. In addition, experiments establishing the restriction element should include the addition of primers, nucleotides and buffers.
【００２４】 上記した通り、核酸物質の特性またはパラメータを、もしくは、化学反応また
は生化学反応によって核酸が修飾するプロセスを推定する方法であって、前記核
酸物質の特性またはパラメータが核酸物質の電気伝導率と相関性を有し、核酸物
質、あるいは、この物質を含有する反応混合物の電気伝導率を測定し、前記電気
伝導率と前記特性またはパラメータ間の所定の相関性を参照して前記測定値から
核酸物質の特性あるいはパラメータ、もしくはプロセスを推定すること、からな
る方法が提供される。As described above, a method for estimating a property or parameter of a nucleic acid substance or a process of modifying a nucleic acid by a chemical reaction or a biochemical reaction, wherein the property or parameter of the nucleic acid substance is an electric conductivity of the nucleic acid substance. And the nucleic acid substance, or the electrical conductivity of a reaction mixture containing this substance is measured, and the measured value is referred to by referring to a predetermined correlation between the electrical conductivity and the property or parameter. Estimating a property or parameter, or process, of the nucleic acid material from the method.
【００２５】 推定されるパラメータは、単一種の核酸溶液中における核酸濃度であろう。一
方、推定される特性は核酸の分子量であって、これは核酸の分子量を、分子量と
、電流／周波数反応の特徴曲線またはその一部との所定の相関性から推定されよ
う。この相関性は分子量と周波数反応の特徴曲線より下の範囲との間のものであ
ろう。さらなる応用例としては、推定される特性が核酸種の範囲における分子量
全体の指標となろう。The estimated parameter will be the nucleic acid concentration in a single nucleic acid solution. On the other hand, the property to be estimated is the molecular weight of the nucleic acid, which will be estimated from the predetermined correlation between the molecular weight and the characteristic curve of the current / frequency response or a part thereof. This correlation may be between molecular weight and the range below the frequency response characteristic curve. As a further application, the putative properties may be indicative of the overall molecular weight in the range of nucleic acid species.
【００２６】 所定の相関性に従って予め較正された装置によってこの測定は実施されよう。
この相関性とはすなわち、分子量と伝導率との関係および濃度と伝導率との関係
の双方である。This measurement will be performed by a device that has been pre-calibrated according to a predetermined correlation.
This correlation is both the relationship between molecular weight and conductivity and the relationship between concentration and conductivity.
【００２７】 プロセスパラメータが推定される場合、このパラメータは、ポリメラーゼ連鎖
反応、逆転写または核酸結さつなど、核酸の酵素的処理が行われる範囲であろう
。If process parameters are estimated, they will be in the range in which enzymatic processing of the nucleic acid is performed, such as polymerase chain reaction, reverse transcription or nucleic acid ligation.
【００２８】 （付記）データ収集およびシステム設計 ＰＣＲ伝導率の測定は、２ｋＨｚ、反応混合物を介して１Ｖの交流パルス電流
を通すことで達成された（図１．０）。これは、可変利得増幅器（１−２５）を
介して増幅され、この信号はＰＣを介して記録された。信号パルスの周波数およ
びデータ取得もＰＣによって制御された。ＰＣＲ伝導率を測定するための実験表
を図９に示す。(Appendix)Data collection and system design The measurement of PCR conductivity is 2 kHz, 1 V AC pulse current through the reaction mixture
(FIG. 1.0). This makes the variable gain amplifier (1-25)
The signal was recorded via a PC. Signal pulse frequency and
Data acquisition was also controlled by the PC. Experimental table for measuring PCR conductivity
Is shown in FIG.
【００２９】 デジタルからアナログへの切替回路の制御、および、アナログからデジタル測
定へは、単一Ｉ／Ｏカード（ＰＣＬ−８１２ＰＧ、Semaphore Systems社製、ロ
ンドン）を使用して制御された。初期の伝導率デ−タは所定の間隔を置いて収集
されたが、最近の重大な修正（付加的な電子回路板の設計を伴うもの）が温度に
よる収集を調整し、その結果、温度が代表的なアニ−リング値に達し、収集率が
向上した。高変性および温度の伸びが収集回数を上昇させた（表４）。The control of the switching circuit from digital to analog and from analog to digital measurement were controlled using a single I / O card (PCL-812PG, Semaphore Systems, London). Initial conductivity data was collected at predetermined intervals, but a recent significant modification (with the additional electronic board design) adjusted the temperature collection so that the temperature was reduced. Typical annealing values were reached and the collection rate improved. High denaturation and elongation of temperature increased the number of collections (Table 4).
【００３０】[0030]
【表４】 [Table 4]
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成１２年２月１７日（２０００．２．１７）[Submission date] February 17, 2000 (2000.2.17)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【発明の名称】 核酸の推定[Title of the Invention] Nucleic acid estimation
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
【０００１】 本発明は、核酸の推定、より具体的には核酸が化学反応または生化学反応によ
って修飾するプロセスの特性またはパラメータの推定に関する。 本発明は、化学反応または生化学反応によって核酸が修飾するプロセスの特性
またはパラメータを推定する方法であって、前記特性またはパラメータは核酸物
質の電気伝導率と相関性を有し、前記物質を含有する反応混合物の電気伝導率を
測定し、電気伝導率と前記特性あるいはパラメータ間の所定の相関性を参照して
前記測定から核酸物質の特性あるいはパラメータ、もしくはプロセスを推定する
ことから構成される。The present invention relates to estimating nucleic acids, and more specifically to estimating the properties or parameters of processes in which nucleic acids are modified by chemical or biochemical reactions. The present invention is a method for estimating a property or parameter of a process in which a nucleic acid is modified by a chemical or biochemical reaction, wherein the property or parameter is correlated with the electrical conductivity of the nucleic acid substance and contains the substance. Measuring the electrical conductivity of the reaction mixture to be performed and estimating a property, parameter, or process of the nucleic acid substance from the measurement with reference to a predetermined correlation between the electrical conductivity and the property or parameter.
【０００２】 本発明によれば、電気伝導率は、核酸物質溶液中を流れる電流から便宜的に測
定することが可能である。According to the present invention, the electric conductivity can be conveniently measured from a current flowing in a nucleic acid substance solution.
【０００３】 ＤＮＡの特性付けは、ＤＮＡを含む溶液中の２本の細い白金電極線（銅、ステ
ンレス等の他の金属を代用してもよい）間の変調周波数の交流信号を用いて達成
される。通常は、０〜１０ボルトの一定の交流信号が２本の細い伝導性電極線間
に印加される。この交流信号の周波数は０〜１ＭＨｚの範囲であり、これらの電
極を通して印加され、対応する伝導率は前記溶液を介して通過する電流として各
周波数ごとに順に記録される。例えば、サンプルＤＮＡを少なくとも１０μｌの
水あるいはＴＥ緩衝液中に溶解する。便宜上、５００μｌの標準プラスチックチ
ューブを用いても良い。２本の細い白金性電極線を溶液中へ設置し、これを交流
１Ｖで作動する関数発生器へ接続する。０〜１ＭＨｚの範囲の周波数が溶液中を
通って、その結果得られた電流が電流計を用いてｍＡ単位で測定される。ＤＮＡ
濃度は、周波数２ＫＨｚで溶液中を通った電流を標準曲線と比較して算出する（
ＤＮＡ濃度を一定の周波数で電流と参照する）。他の周波数を使用することも可
能である。[0003] Characterization of DNA is achieved using an alternating signal at a modulation frequency between two fine platinum electrode wires (other metals such as copper and stainless steel may be substituted) in a solution containing DNA. You. Typically, a constant AC signal of 0-10 volts is applied between two thin conductive electrode wires. The frequency of this AC signal ranges from 0 to 1 MHz and is applied through these electrodes, and the corresponding conductivity is recorded sequentially for each frequency as a current passing through the solution. For example, the sample DNA is dissolved in at least 10 μl of water or TE buffer. For convenience, a 500 μl standard plastic tube may be used. Two fine platinum electrode wires are placed in the solution and connected to a function generator operating at 1V AC. Frequencies ranging from 0 to 1 MHz pass through the solution and the resulting current is measured in mA using an ammeter. DNA
The concentration is calculated by comparing the current passed through the solution at a frequency of 2 KHz with a standard curve (
DNA concentration is referred to as current at a constant frequency). Other frequencies can be used.
【０００４】 新規な活用法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写、Ｄ
ＮＡ間結さつ等、ＤＮＡが酵素的に修飾する時に、あるいは、例えばＤＮＡ―タ
ンパク質相互作用等、非酵素タンパク質がＤＮＡと相互作用する時に、その反応
の進行及びプロセスをリアルタイムで監視することできる。このプロセスがもた
らす利点は数多くあり、すなわち、反応あるいはプロセスの終末点の決定、反応
あるいはプロセスのキーステージの識別、トラブルシューティングおよびオート
メーションなどである。例えば、ＰＣＲを特異な遺伝子特性を有する個人を識別
するのに使用すると、ＰＣＲが学術的な研究および医療的診断の双方において主
要な分子生物学的ツールとなる。医療的診断において遭遇する主要な障害の１つ
がＰＣＲ産生の分析である。これには、通常、正確なサイジングが求められる単
一の純正ＤＮＡの産生が必要である。これは、普通、細心の注意を要するゲル電
気泳動法によって実行される。[0004] New applications include, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription, D
The progress and process of the reaction can be monitored in real-time when the DNA is enzymatically modified, such as between the NAs, or when non-enzymatic proteins interact with the DNA, for example, DNA-protein interactions. . The benefits of this process are numerous: determining the endpoint of a reaction or process, identifying key stages of a reaction or process, troubleshooting and automation. For example, when PCR is used to identify individuals with unique genetic characteristics, PCR becomes a major molecular biological tool in both academic research and medical diagnosis. One of the major obstacles encountered in medical diagnosis is the analysis of PCR production. This usually requires the production of a single genuine DNA that requires accurate sizing. This is usually performed by meticulous gel electrophoresis.
【０００５】 通常、アガロースゲル電気泳動法によってＤＮＡ分子をサイズ別に分離し、次
いで分離されたＤＮＡ分子は臭化エチジウム色素を用いて可視化される。ＤＮＡ
は、紫外線（およそ３００ｎｍ）による蛍光発光後続励起を測定し、既知量の標
準品と比較することにより、アガロースゲル中で定量化することも可能である。
臭化エチジウムを使用してＤＮＡの可視化及び定量化を行う方法は安価な代替法
となり得るが、一方、極めて高い毒性及び発癌性の問題から望ましい方法とは言
えない。[0005] Usually, DNA molecules are separated by size by agarose gel electrophoresis, and the separated DNA molecules are then visualized using an ethidium bromide dye. DNA
Can be quantified in an agarose gel by measuring the subsequent excitation of the fluorescence by ultraviolet light (approximately 300 nm) and comparing it to a known amount of a standard.
The method of visualizing and quantifying DNA using ethidium bromide can be an inexpensive alternative, but is not a desirable method due to its extremely high toxicity and carcinogenicity.
【０００６】 伝導率の測定もＰＣＲに利用されている。一定周波数の交流信号（０および１
ＭＨｚ―０〜１０ボルト）を上記のような２本の白金ワイヤ電極間に通し、ＰＣ
Ｒ反応を介して測定された電流／伝導率を反応が進行する通りに混合する。測定
は固定ポイントで、反応の間、または、常時行われる。ＰＣＲ中の伝導率の変動
は、反応査定をリアルタイムで行うに十分な、それと識別できるパターンを辿る
。初期には、おそらくゲノミックテンプレートＤＮＡの解離および変性が引起こ
すのであろう伝導率の低下が認められる。首尾よく進んだ反応では、反応の終結
到達を示すプラトーに達する進行サイクルにおいて伝導率の急速な上昇が見られ
る（図１）。不首尾に終わった反応では、進行サイクルにおけるそうした伝導率
の上昇は見られない。こうして得られた実験の詳細及び結果を、以下に記載する
。[0006] Conductivity measurements have also been used in PCR. AC signal of constant frequency (0 and 1
MHz-0 to 10 volts) between the two platinum wire electrodes as described above,
The current / conductivity measured via the R reaction is mixed as the reaction proceeds. Measurements are taken at fixed points, during the reaction, or constantly. Fluctuations in conductivity during PCR follow a discriminating pattern sufficient to perform reaction assessment in real time. Initially, there is a decrease in conductivity, presumably caused by dissociation and denaturation of the genomic template DNA. Successful reactions show a rapid increase in conductivity in the progressive cycle reaching a plateau indicating the end of the reaction (FIG. 1). The unsuccessful reaction does not show such an increase in conductivity in the progressive cycle. The details and results of the experiment thus obtained are described below.
【０００７】 ＰＣＲ反応のリアルタイムの監視では、類似の結果が認められた。収量が乏し
い反応としては、図２に示すような曲線が代表的である。初期段階、最初の数サ
イクルに亘って、コンダクタンス全体に若干の上昇が認められ（ａ）、次に、コ
ンダクタンスは低下し（ｂ）、次いで水平状態になるまで上昇し（ｃ）、反応の
最終段階では、上下変動の無いプラトー状態となる（ｄ）。[0007] Real-time monitoring of the PCR reaction has shown similar results. As a reaction with a poor yield, a curve as shown in FIG. 2 is typical. During the initial phase, over the first few cycles, there is a slight increase in overall conductance (a), then the conductance decreases (b), then rises until level (c), and the end of the reaction At the stage, a plateau state without vertical fluctuation is obtained (d).
【０００８】 反応の最終サイクルにおける伝導率の上昇は、反応収量の上昇に起因すると考
えられる。初期サイクルにおける伝導率の低下は、プライマー、ヌクレオチド、
無機イオンなど、小さな導電種の濃度変化によるものと考察される。これらの小
さな導電種は、高交流周波数が使用された場合、これより大きなＤＮＡ分子に比
べてより広範囲な移動性をもたらす。産生物の濃度が高まるにつれて、溶液の伝
導率全体に広がり始め、従って、ＤＮＡ濃度が高いと、反応混合物の伝導率は上
昇する。反応が限界に達すると、ＤＮＡ濃度が水平状態になり始め、溶液のコン
ダクタンスはプラトー状態に達する。[0008] The increase in conductivity in the last cycle of the reaction is believed to be due to an increase in reaction yield. The decrease in conductivity during the initial cycle is due to primers, nucleotides,
It is considered to be due to the change in the concentration of small conductive species such as inorganic ions. These small conductive species result in a wider range of mobility when high AC frequencies are used compared to larger DNA molecules. As the concentration of the product increases, it begins to spread throughout the conductivity of the solution, and therefore, at higher DNA concentrations, the conductivity of the reaction mixture increases. When the reaction reaches the limit, the DNA concentration begins to level out and the conductance of the solution reaches a plateau.
【０００９】 反応の終末点における単一の反応素子の追加は、従って、反応の収量をさらに
高め、これは溶液の伝導率の上昇として現れる。図３は、Ｔａｑポリマーゼ（ｅ
）の追加が反応伝導率と反応の全体収量の双方をどのように上昇させるかを表し
ている。これはＴａｑが限定的であることを暗示している。さらに、制限素子を
確立する実験では、プライマー、ヌクレオチドおよび緩衝液の追加が含まれるべ
きであろう。The addition of a single reaction element at the end of the reaction therefore further increases the yield of the reaction, which manifests itself as an increase in the conductivity of the solution. FIG. 3 shows Taq polymerase (e
) Shows how the addition of both increases the reaction conductivity and the overall yield of the reaction. This implies that Taq is limiting. In addition, experiments establishing the restriction element should include the addition of primers, nucleotides and buffers.
【００１０】 上記した通り、化学反応または生化学反応によって核酸が修飾するプロセスの
特性またはパラメータを推定する方法であって、前記特性あるいはパラメータは
核酸物質の電気伝導率と相関性を有し、前記核酸物質を含有する反応混合物の電
気伝導率を測定し、電気伝導率と前記特性あるいはパラメータ間の所定の相関性
を参照して前記測定から核酸物質の特性あるいはパラメータ、またはプロセスを
推定すること、からなる方法が提供される。As described above, a method for estimating a property or parameter of a process in which a nucleic acid is modified by a chemical reaction or a biochemical reaction, wherein the property or parameter has a correlation with an electrical conductivity of a nucleic acid substance, Measuring the electrical conductivity of the reaction mixture containing the nucleic acid substance, and estimating the property or parameter of the nucleic acid substance or the process from the measurement with reference to a predetermined correlation between the electrical conductivity and the property or parameter; Is provided.
【００１１】 プロセスパラメータが推定される場合、このパラメータは、ポリメラーゼ連鎖
反応、逆転写または核酸結さつなど、核酸の酵素的処理が行われる範囲であろう
。When process parameters are estimated, they will be in the range in which enzymatic processing of the nucleic acid is performed, such as polymerase chain reaction, reverse transcription or nucleic acid ligation.
【００１２】 （付記）データ収集およびシステム設計 ＰＣＲ伝導率の測定は、２ｋＨｚ、反応混合物を介して１Ｖの交流パルス電流
を通すことで達成された。これは、可変利得増幅器（１−２５）を介して増幅さ
れ、この信号はＰＣを介して記録された。信号パルスの周波数およびデータ取得
もＰＣによって制御された。(Supplementary note)Data collection and system design The measurement of PCR conductivity is 2 kHz, 1 V AC pulse current through the reaction mixture
Was achieved by passing through. This is amplified through a variable gain amplifier (1-25).
This signal was recorded via a PC. Signal pulse frequency and data acquisition
Was also controlled by the PC.
【００１３】 デジタルからアナログへの切替回路の制御、および、アナログからデジタル測
定へは、単一Ｉ／Ｏカード（ＰＣＬ−８１２ＰＧ、Semaphore Systems社製、ロ
ンドン）を使用して制御された。初期の伝導率デ−タは所定の間隔を置いて収集
されたが、最近の重大な修正（付加的な電子回路板の設計を伴うもの）が温度に
よる収集を調整し、その結果、温度が代表的なアニ−リング値に達し、収集率が
向上した。高変性および温度の伸びが収集回数を上昇させた（表４）。The control of the switching circuit from digital to analog and from analog to digital measurement were controlled using a single I / O card (PCL-812PG, Semaphore Systems, London). Initial conductivity data was collected at predetermined intervals, but a recent significant modification (with the additional electronic board design) adjusted the temperature collection so that the temperature was reduced. Typical annealing values were reached and the collection rate improved. High denaturation and elongation of temperature increased the number of collections (Table 4).
【００１４】[0014]
【表４】 [Table 4]
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】全図[Correction target item name] All figures
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１】 FIG.
【図２】 FIG. 2
【図３】 FIG. 3
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラークソン ジョン マイケル イギリス ウィルトシャー ビーエイ15 １ワイピー ブラッドフォード・オン・エ イヴォン ピーオーボックス2237 モレキ ュラ センサーズリミテッド Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 FB01 FB05 GC16 JA01 JA06 2G060 AA06 AA07 AD06 AE16 AF08 KA05 4B063 QA05 QQ42 QR90 QS25 QX04──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Clarkson John Michael United Kingdom Wiltshire B.A. 15 1 Wippy Bradford on Aivon P.O.Box 2237 Molecula Sensors Limited F-term (reference) 2G045 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 FB01 FB05 GC16 JA01 JA06 2G060 AA06 AA07 AD06 AE16 AF08 KA05 4B063 QA05 QQ42 QR90 QS25 QX04
Claims (15)
タを、もしくは化学反応または生化学反応によって核酸が修飾するプロセスを推
定する方法であって、核酸物質、あるいは、この物質を含有する反応混合物の電
気伝導率を測定し、電気伝導率と前記特性あるいはパラメータ間の所定の相関性
を参照して前記測定から該核酸物質の特性またはパラメータ、もしくはプロセス
を推定することからなる方法。1. A method for estimating a property or parameter of a nucleic acid substance having a correlation with electric conductivity, or a process of modifying a nucleic acid by a chemical reaction or a biochemical reaction, comprising the steps of: Measuring the electrical conductivity of the contained reaction mixture and estimating a property or parameter or process of the nucleic acid material from the measurement with reference to a predetermined correlation between the electrical conductivity and the property or parameter. .
１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the parameter to be estimated is a nucleic acid concentration in a nucleic acid solution.
記載の方法。3. The method according to claim 2, wherein the nucleic acid substance mainly comprises a single kind of nucleic acid.
。4. The method of claim 1, wherein the putative property is the molecular weight of the nucleic acid.
伝導率を測定する請求項４に記載の方法。5. The method according to claim 4, wherein the conductivity of the nucleic acid-containing solution is measured using alternating currents in different frequency ranges.
はその一部との所定の相関性から推定する請求項５に記載の方法。6. The method according to claim 5, wherein the molecular weight of the nucleic acid is estimated from a predetermined correlation between the molecular weight and a current / frequency response characteristic curve or a part thereof.
の間のものである請求項６に記載の方法。7. The method of claim 6, wherein said correlation is between molecular weight and a lower region of a frequency response characteristic curve.
表示である請求項４〜７のいずれかに記載の方法。8. The method according to claim 4, wherein the putative property is an overall indication of the molecular weight for a range of nucleic acid species.
れる前記請求項の何れかに記載の方法。9. A method according to any of the preceding claims, wherein the measurement is performed on a device that has been pre-calibrated according to a predetermined correlation.
性との双方に関して予め較正されている請求項６に記載の方法。10. The method of claim 6, wherein the device is pre-calibrated for both molecular weight / conductivity correlation and concentration / conductivity correlation.
酸の酵素的処理が行われる範囲である請求項１に記載の方法。11. The method of claim 1, wherein the process parameters, if estimated, are in a range in which enzymatic processing of the nucleic acid is performed.
結さつである請求項１１に記載の方法。12. The method according to claim 11, wherein the enzymatic reaction is a polymerase chain reaction, reverse transcription or nucleic acid ligation.
ことによって測定される前記請求項の何れかに記載の方法。13. The method according to any of the preceding claims, wherein the conductivity is measured by measuring an alternating current flowing through the nucleic acid substance solution.
る手段とを含む前記請求項の何れかに記載の方法を実施するための装置。15. Apparatus for performing a method according to any of the preceding claims, comprising means for measuring conductivity and means for varying the frequency of the applied alternating current.
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