JP2001337092A

JP2001337092A - 免疫学的測定方法及び測定用試薬

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Publication number: JP2001337092A
Application number: JP2000156265A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Takahashi; 弘至高橋; Hirokazu Yago; 弘和矢後; Yoji Hayashi; 要司林
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2001-12-07
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: JP4458622B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【解決手段】測定対象である抗原を含む試料と、(A)
抗原を固定化した不溶性担体粒子、(B)前記抗原と反応
する遊離状態の特異抗体、及び(C)前記特異抗体におけ
る(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプ
ターを混合し、試料中の遊離の測定対象抗原によって生
じる免疫学的凝集阻止反応を、光学的に測定することを
特徴とする免疫学的測定方法、及びこれに用いる測定用
試薬。【効果】免疫学的凝集阻止反応を利用して、試料中に
存在する抗原を特異的に、簡便かつ迅速に測定すること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的粒子凝集
阻止法を利用して、簡便、迅速かつ特異的に試料中の抗
原を測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】病院、検査センター等においては、人員
及び経費の削減に伴い、臨床検査の自動化、簡便化、測
定時間の短縮化が図られている。ここで用いられる抗原
抗体反応に基づく免疫学的測定法のうち、免疫比濁法と
称される測定方法は、測定対象抗原を該抗原に対する特
異抗体と反応させて生じる免疫学的凝集形成の度合いを
光学的に測定する方法である。とりわけ不溶性担体粒子
を利用して免疫学的粒子凝集又は凝集阻止反応を生起さ
せ、被検物質を定性、定量する方法は、高感度化が可能
な方法であり、またＢ／Ｆ分離が必要なＥＬＩＳＡ法や
ＲＩＡ法に比べて反応ステップが少なく、自動化に適し
ており、早くから種々の測定原理に基づいた専用の測定
装置が商品化されている。また最近では、酵素反応など
に基づく他の測定項目とともに、汎用の自動分析装置を
利用して測定されるようになってきた。

【０００３】免疫学的粒子凝集法は、分析対象抗原に対
する特異抗体を不溶性担体粒子に物理吸着又は共有結合
により固定化し、これと血清や尿などの被検試料を混合
し、対応する抗原との抗原−抗体反応に基づく免疫凝集
反応を生起させることにより、被検試料中の抗原を測定
する方法で、幅広い成分が測定対象として採用されるよ
うになっている。しかしながら、これら測定対象成分の
うち、炎症マーカーであるＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）や
血清アミロイドＡ、アレルギー症状の指標となるＩｇ
Ｅ、腎障害の指標となる尿中のアルブミン等の通常低濃
度であるが異常時には非常に高濃度まで広く濃度範囲が
変動するダイナミックレンジの広い成分の測定において
は、被検試料中の測定対象抗原の濃度が試薬の測定濃度
範囲を大きく上回っている場合、抗原過剰により凝集形
成が抑制され、見かけ上の測定値が低くなり、その濃度
が正常値の範囲内であるような誤った測定値を与えるこ
とがある。この現象はフック現象又はプロゾーン現象と
称され、免疫学的粒子凝集法の原理を用いた測定系にお
いては大きな問題になっている。

【０００４】一方、免疫比濁法のうち免疫学的粒子凝集
阻止法として知られる測定方法は、被検試料と、測定対
象抗原と同様の抗原を予め固定化した不溶性担体粒子及
び該抗原に対する特異抗体とを混合し、被検試料中に存
在する遊離状態の測定対象抗原が、不溶性担体粒子上の
固定化抗原と該抗原に対する特異抗体との抗原抗体反応
に競合し、免疫学的凝集の形成が阻害されることにより
被検試料中の測定対象抗原を測定する方法である。免疫
学的粒子凝集阻止法はその測定原理から、仮に被検試料
中に含まれる測定対象抗原の濃度が測定上限濃度を大き
く超過した場合でも凝集形成阻害が減弱されないため、
高い抗原濃度が低値であるかのような誤った測定値を与
えることがないという特徴を有している。

【０００５】また、被検試料中の遊離状態の測定対象抗
原と担体粒子上に固定化された特異抗体との抗原抗体反
応に基づく粒子凝集形成を測定の本質とする免疫学的粒
子凝集法においては、測定対象抗原の種類によっては測
定が不可能であり、さらに利用抗体に関しても様々な制
約が存在するのに対し、免疫学的粒子凝集阻止法におい
ては、それらは何ら障害とならずに適用することができ
る。すなわち、測定対象抗原がハプテンのような低分子
の一価抗原の場合には、遊離状態のハプテンは抗体によ
り架橋されないため凝集形成が不可能であり、被検試料
中の抗原を抗体固定化担体粒子で凝集させる免疫学的粒
子凝集法では測定ができない。また近年、より抗原特異
性が高く均一な性能が得られるモノクローナル抗体が種
々の免疫学的測定試薬に使用されているが、免疫学的粒
子凝集法での利用に関しては、抗原上の一つの抗原決定
基のみと結合するというモノクローナル抗体の性質上、
特殊な抗原（分子上に同一の抗原決定基が複数存在する
抗原、例えばＣＲＰ、フェリチン、Ｌｐ(a)等の多価抗
原）を除いては１種類のモノクローナル抗体では凝集の
形成が不可能で適用できないため、通常、ポリクローナ
ル抗体との併用という補助的な意味合いでの利用や、多
数の異種モノクローナル抗体の併用といった抗原特異性
・均一性といったモノクローナル抗体本来の利点が失わ
れる条件下での利用に留まっている。

【０００６】一方、粒子凝集形成を被検試料中に存在す
る遊離状態の測定対象抗原が阻止することにより、被検
試料中の抗原を測定する免疫学的粒子凝集阻止法におい
て、担体粒子の凝集形成は粒子表面上に均一に固定化さ
れた抗原と特異抗体との免疫反応により担体粒子間が架
橋されることによって惹起され、測定法の本質である凝
集阻止は被検試料中の測定対象抗原により固定化抗原と
特異抗体との反応が阻止され、その結果凝集形成が減弱
されるという原理に基づく。従って、測定対象となる抗
原及び特異抗体の遊離状態での凝集形成能の有無は、免
疫学的粒子凝集阻止法においては全く障害とならないた
め、ハプテンを含め抗原性を有している物質であれば測
定対象としての適用が可能であり、また抗体の種類に対
してもモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいず
れでも使用することができる。実際、血中の薬物等のハ
プテンの測定には、モノクローナル抗体を利用した免疫
学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法が汎用されてい
る。

【０００７】以上の事実から、免疫学的粒子凝集阻止法
を原理とする測定法は、広範なダイナミックレンジを有
する抗原の測定に好適であるのみならず、様々な抗原に
適用可能であり、またモノクローナル抗体単独の利用が
容易であることから、より特異性に優れた有用な測定法
である。

【０００８】しかして、免疫学的粒子凝集阻止法におい
ては、測定適用への前提条件として、抗原固定化担体粒
子と遊離状態の特異抗体を混和した際に、十分な粒子凝
集が生起されなければならないという問題がある。この
粒子凝集形成が不十分だと、測定に適用しても被検試料
中の抗原による感度変化が小さいため、正確な測定値が
得られない。特に、特異抗体にモノクローナル抗体を用
いた場合、ポリクローナル抗体よりも凝集を生じ難いこ
とから、この傾向はより顕著であり、大量の非特異的凝
集剤を添加しなければならない。

【０００９】例えば、特開昭57-206859号公報には、ハ
プテン抗原の測定にＲＦ、Ｃｌｑ、マウス血清又は腹水
等の典型的な非特異的凝集剤を利用する粒子凝集阻止法
が提案されている。ここで用いられている凝集剤は、遊
離状態の抗原−抗体複合体との親和性が低いのに対し、
抗原固定化担体粒子−抗体複合体の状態、すなわち担体
粒子上に固定化抗原−抗体複合体が密に分布する状態に
ある場合に初めて親和性が顕在化し、凝集形成を促進す
るという特徴を有していることから、その作用は免疫学
的凝集形成の促進ではなく、非特異的な作用であるとい
える。このような非特異的凝集剤は、免疫学的凝集形成
に相乗的に作用するため、凝集状態、非凝集状態の担体
粒子の判別を容易にし、例えば非凝集状態の担体粒子の
直接計数により測定対象抗原を測定するような方法にお
いては利用が可能である。しかしながら、抗原−抗体反
応に基づく免疫学的凝集形成の度合いから測定対象抗原
を光学的に測定する免疫比濁法においては、誤った測定
値を与える可能性が高く、このような非特異的凝集剤を
利用することはできない。

【００１０】また、特開昭59-173760号公報には、特異
抗体として用いる単一種のモノクローナル抗体を担体に
担持して使用することにより、凝集形成を促進する測定
方法が提案されている。しかしながら、特許第2840852
号に示されるように、モノクローナル抗体を担体に担持
する際には、抗体の抗原上の認識部位や担体への結合の
方式によっては、立体障害などの理由から、該抗体が遊
離状態で示す抗原に対する特異性や反応性が消失、変質
する可能性があるという問題があり、簡便に利用するこ
とは困難である。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、免疫学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法におい
て、前記のような問題がなく、簡便、迅速かつ特異的に
試料中の抗原を測定する方法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、免疫学的
粒子凝集阻止法において、抗原を固定化した不溶性担体
粒子と特異抗体との凝集形成の際に、特定のレセプター
を用いれば、十分な凝集反応が起こり、試料中の抗原に
よる感度変化が大きく、当該抗原を正確に測定できるこ
とを見出し、本発明を完成した。

【００１３】すなわち、本発明は、測定対象である抗原
を含む試料と、(A)抗原を固定化した不溶性担体粒子、
(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び(C)前
記特異抗体における(A)との結合部位以外の部位をリガ
ンドとするレセプターを混合し、試料中の遊離の測定対
象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を、光学的
に測定することを特徴とする免疫学的測定方法を提供す
るものである。

【００１４】また、本発明は、試料中の遊離の測定対象
抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を測定するた
めに試料と混合して用いる試薬であって、(A)抗原を固
定化した不溶性担体粒子、(B)前記抗原と反応する遊離
状態の特異抗体、及び(C)前記特異抗体における(A)との
結合部位以外の部位をリガンドとするレセプターを含有
することを特徴とする免疫学的測定用試薬を提供するも
のである。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明において、測定の対象とな
る抗原物質を含む試料としては、ヒト又は動物の体液、
例えば血清、唾液、尿等が挙げられる。これらに含まれ
る抗原物質としては、抗原決定基の価数に限定されず、
一価のハプテンの測定にも特に有用である。ハプテンと
しては、例えばテオフィリン、バルビトン、フェニルヒ
ダントイン、ジゴキシン、ジギトキシン、ゲンタマイシ
ン等の薬物及び薬物代謝物；サイクリック−ＡＭＰ、サ
イクリック−ＧＭＰ、プロスタグランジン、プロスタグ
ランジン代謝物等の細胞内伝達物質；向甲状腺ホルモン
放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ソマトス
タチン、メラトニン、サブスタンス−Ｐ、脳下垂体ホル
モン（オキシトシン、バゾプレッシン等）、甲状腺ホル
モン（サイロキシン、トリヨードチロニン等）、消化管
系ホルモン（ガストリン、セクレチン、コレシストキニ
ン、セロトニン等）、膵臓ホルモン（グルカゴン等）、
ステロイドホルモン（エストラジオール、プロゲステロ
ン、テストステロン、アルドステロン、コルチゾール
等）等のホルモン類；Ｂ₁₂、葉酸、ビタミンＤ代謝物等
のビタミン類；白血病ウイルスの糖脂質等の細菌又はウ
イルス起源のハプテンなどが挙げられる。また、広範な
ダイナミックレンジを有することから通常の免疫学的粒
子凝集法では誤った測定値を与える可能性の高い抗原、
例えばＣＲＰ、血清アミロイドＡ、ＩｇＥ等の血清中成
分；アルブミン等の尿中成分などの測定にも好適であ
る。

【００１６】本発明で用いられる不溶性担体粒子の材質
は特に制限されず、従来用いられている物質であればい
ずれでも良く、有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血
球、微生物等が挙げられる。有機高分子物質としては、
ラテックス粒子が好ましく、特にアクリル酸重合体、ス
チレン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂の微粉末が
１種又は２種以上均一に懸濁したラテックス粒子が好ま
しい。また、無機物質としては、シリカ、アルミナ等の
微粒子が好ましい。これらの不溶性担体粒子は、平均粒
径が１．６μm以下のものが好ましく、特に平均粒径
０．０５〜１μm、更に０．０５〜０．５μmのものが、
免疫凝集体を直接光学的に測定する上で好ましい。

【００１７】このような不溶性担体粒子に予め固定化さ
せる抗原としては、特異抗体に対して測定対象抗原と同
質の抗原性を有するものであればいずれでも良く、例え
ば単離精製された抗原、遺伝子組換によって得られるリ
コンビナント抗原、抗原の断片又は構造が類似した物質
等を使用することができる。これらの抗原を不溶性担体
粒子に担持させる方法は特に制限されず、公知の物理吸
着や化学結合法による方法等を用いることができ、特に
化学結合法を用いるのが、より安定な試薬を得ることが
できるので好ましい。

【００１８】本発明で用いる(B)特異抗体は、(A)の抗原
を固定化した不溶性担体粒子と免疫反応により凝集を形
成するものである。かかる特異抗体としては、測定対象
である抗原と特異的に結合し得るもので、遊離状態であ
ればいずれでも良く、モノクローナル抗体、ポリクロー
ナル抗体等を、それぞれ単独又は組み合せて用いること
ができる。特に、モノクローナル抗体のみを用いるので
あれば、１種類の使用でも良い。また、モノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体いずれの場合にも、遊離状態
の抗原と反応した際に免疫凝集物を形成しないものが好
ましい。これらは、市販品を好適に使用することができ
る。

【００１９】本発明で用いられる(C)前記特異抗体にお
ける(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセ
プターは、前記(A)及び(B)による凝集を促進させる作用
を有するもので、(B)と特異的に結合するものである。
かかるレセプターとしては、遊離状態のものであれば特
に限定されないが、当該リガンドと反応して凝集を形成
しないものが好ましく、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、プロテインＡ、プロテインＧが特に好まし
い。これらのレセプターは市販品を用いることができ、
またモノクローナル抗体は、常法により調製することが
できる（G. Kohler and C. Milstein, Nature, 1975, 2
56, Yarmush M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77, 2899-, 1980）。

【００２０】すなわち、レセプターとして用いるモノク
ローナル抗体は、(1)抗原物質に対する抗体がポリクロ
ーナル抗体の場合には、ポリクローナル抗体由来の免疫
動物のイムノグロブリンを免疫したマウスの脾臓細胞と
マウスのミエローマ細胞を融合したハイブリドーマから
調製できる。(2)抗原物質に対する抗体がマウス由来の
モノクローナル抗体の場合には、マウスイムノグロブリ
ンを免疫したラット脾臓細胞とラットのミエローマ細胞
を融合したハイブリドーマ、又はマウスイムノグロブリ
ンを免疫したラット、ラビット等の異種動物の脾臓細胞
とマウスのミエローマ細胞を融合したヘテロハイブリド
ーマから調製できる。(3)抗原物質に対する抗体がラッ
ト、ラビット等のヘテロハイブリドーマ由来のモノクロ
ーナル抗体の場合には、(1)と同様に調製できる。得ら
れたハイブリドーマのうち、目的とする抗体を産生する
ものをクローニングし、細胞を樹立する。モノクローナ
ル抗体の大量調製は、ハイブリドーマを培養した培養上
清を回収して、あるいは動物の腹腔内にハイブリドーマ
を接種して増殖させた後、腹水を回収して、これに含ま
れるモノクローナル抗体を塩析法、吸着クロマトグラフ
ィー法等により濃縮、精製することができる。なお、動
物の腹腔内に接種する場合、ヘテロハイブリドーマでは
ヌードマウス又はヌードラットを用いるのが好ましい。

【００２１】本発明において、不溶性担体の懸濁液、被
検試料の希釈液等としては、特に制限されず、通常用い
られる緩衝液、例えば酢酸、クエン酸、リン酸、トリ
ス、グリシン、ホウ酸、炭酸、グッドの緩衝液等を使用
することができ、反応におけるｐＨは５〜１０、特にｐ
Ｈ６〜９が好ましい。

【００２２】本発明の測定方法は、前記(A)、(B)及び
(C)による凝集体の形成を、試料中の測定対象抗原が阻
止することにより、試料中の抗原を測定できるものであ
り、その凝集の程度を、光学的に測定する。凝集体を光
学的に測定する方法は、通常行われている方法であれば
特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光度測定を測
定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外を測定波長
とした装置、積分球濁度を測定原理とした装置、散乱光
強度を測定する装置等の光学的測定機器などを用いるこ
とができる。

【００２３】本発明において、被検試料と特異抗体の反
応は、抗原固定化担体粒子及びレセプターのいずれか、
又は両者の共存下で行なっても良いし、抗原固定化担体
粒子及びレセプター非共存下で反応させた後に両者を反
応させても良い。

【００２４】本発明の測定試薬は、前記(A)、(B)及び
(C)を含有するものである。試薬は２剤以上の構成にす
ることができ、(C)は(A)又は(B)のいずれに添加してお
いても良い。

【００２５】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるもので
はない。

【００２６】実施例１（１）ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡ）固定化担体
粒子−プロテインＡ溶液の調製：ポリスチレンラテック
ス（平均粒径０．２μm、セキスイ化学社製）２００μL
に、８００μLの２０mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）
を添加して希釈したのち、ＨＳＡ（シグマ社製）を２．
５mg／mLの濃度で上記ＭＥＳ緩衝液に溶解した溶液１mL
を加え、４℃で２時間反応させた。次いで、２mg／mLの
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）水溶液２mLを加
え、４℃で１時間反応させた。この溶液に、１．５％の
ポリエチレングリコール２００００、０．１％のＢＳＡ
を含有する水溶液９６mLを加えて攪拌し、ＨＳＡ固定化
担体粒子溶液を得た。この溶液にプロテインＡ（シグマ
社製）を最終濃度１０μg／mLとなるように添加し、Ｈ
ＳＡ固定化担体粒子−プロテインＡ溶液を得た。

【００２７】（２）抗ＨＳＡモノクローナル抗体の製
造：（ａ）免疫；マウスの免疫には１回当たり市販のＨＳＡ
１００μgを使用した。初回免疫はフロインドの完全ア
ジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全ア
ジュバントを使用した。具体的にはＨＳＡ１００μLと
フロインドのアジュバント１００μLを混合し、得られ
たエマルジョン２００μLを１回の免疫につき１匹のＢ
ＡＬＢ／Ｃ雄性マウスの腹腔に注射し、免疫を２週間間
隔で４回繰り返した。マウスの眼底静脈から採血し、抗
体価をＥＬＩＳＡ法で測定して、抗体価の高いマウスを
選んで細胞融合に使用した。

【００２８】（ｂ）細胞融合；４回目の免疫から２週間
後に、生理食塩水２００μLに希釈したＨＳＡ１００μg
をマウス腹腔に注射し、その３日後にマウスから脾臓を
摘出した。摘出した脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中で
ピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよくほぐ
し、脾細胞を回収した。これを１５００rpmで５分間遠
心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心した。最
終的に１５％牛胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含む同培地
２mLを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数
は、アクリジンオレンジ／臭化エチジュウム溶液（各
０．１mgをＰＢＳ１mLに溶解）と懸濁液を１：１で混ぜ
蛍光顕微鏡下でカウントした。生きた脾細胞１０⁸個と
予め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミ
エローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４の１０⁷個を混合
した後に１５００rpmで５分遠心した。上清を除去し、
細胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８
ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ₂ＨＰ
Ｏ₄：１．４１ｇ，ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ：０．７８ｇ
を精製水１Ｌに溶解）にて懸濁し、１５００rpmで５分
間遠心を行い、細胞の洗浄を行なった。同洗浄を繰り返
した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１
５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mLを徐々に加え、静かに
１分間攪拌した。これにＧＫＮ溶液１０mLを徐々に静か
に加えて反応を停止させ、１５００rpmで５分間遠心し
た。得られた細胞について、１５％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地３０mLに浮遊させ、フィーダー細胞１０
⁶個を含むＨＡＴ培地（１０^-4Ｍヒポキサンチン、４×
１０^-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０^-5Ｍチミジン及
び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）を予め１
ウエル当たり２００μL分注した９６穴マイクロカルチ
ャープレート３枚に１ウエル当たり１００μLづつ分注
して、３７℃５％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日
後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。

【００２９】（ｃ）抗ＨＳＡ抗体産生細胞の選択とクロ
ーン化；培養上清中の抗ＨＳＡ抗体の存在をＥＬＩＳＡ
法で確認した。すなわち、ＨＳＡ（２μg／mL）を固相
化した９６穴マイクロプレートを用いてスクリーニング
を行なった。具体的には、ＨＳＡを０．７２％ＮａＣｌ
を含む１３mMリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳｐＨ７．
４）で２μg／mLに希釈し、５０μL／ウエルの割合で９
６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。
これを１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳｐＨ７．４（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。
対照とするプレートは１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳｐＨ７．４（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で
３回洗浄した。プレートの各ウエルに培養上清５０μL
を加え、３７℃で１時間保温した。次いでＰＢＳで３回
洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオ
キシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異
的，ヤギ由来：第一化学薬品社製）を５０μL加え、３
７℃で１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、
０．２％オルトフェニレンジアミン、０．０２％過酸化
水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．０を５０
μL／ウエル加えて室温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸
を５０μL／ウエル加えて反応を停止させた。５５０nm
の波長で測定し、対照のプレートと比較して吸光度の高
いウエルを選択した。単クローン化は限界希釈法で行な
った。すなわち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの胸腺細胞を１ウエル当たり１０⁶個／２００μLづ
つ分注した９６穴マイクロカルチャープレートに、特異
抗体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mLとなる
ように希釈したものを１００μLづつ分注した。培地は
初回にはＨＴ培地を、２回目以降は１５％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃５％炭酸ガス培
養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による特異抗
体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化
操作を各３回繰り返して、抗ＨＳＡモノクローナル抗体
産生細胞を得た。

【００３０】（ｄ）抗ＨＳＡモノクローナル抗体の分離
及び精製前項の方法によって得た抗ＨＳＡモノクローナル抗体産
生細胞を、マウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体
を作らせた。前処理として８週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス
の腹腔内に０．５mLのプリスタン（２，６，１０，１４
−テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後、
０．５mLのＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊した細胞４〜
１５×１０⁵個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与
後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集め
た腹水は３，０００rpmで１０分間遠心分離を行い、細
胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置し
て得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２
０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、透
析した。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中の
ＮａＣｌ０〜０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ、精製抗
体を得た。

【００３１】（３）抗ＨＳＡモノクローナル抗体溶液の
調製：（２）で製造したＨＳＡモノクローナル抗体（マ
ウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように精製水で希
釈した。次いで抗体濃度が６０μｇ／mLとなるように、
１．５％のポリエチレングリコール２００００、０．１
％ＢＳＡを含有する水溶液で希釈し、抗ＨＳＡモノクロ
ーナル抗体溶液を得た。

【００３２】（４）感度測定方法：汎用型の日立７１７
０型自動分析装置を用いて感度を測定した。具体的には
第１試薬として（３）で調製した抗ＨＳＡモノクローナ
ル抗体溶液を用い、その１００μLに、ＨＳＡを１０、
１００又は２５０μg／mL含有する試料液５μLを加えて
３７℃で５分間加温後、第２試薬として（１）で調製し
たＨＳＡ固定化担体粒子−プロテインＡ溶液１００μL
を加えて攪拌した。その後１〜５分間の主波長３４０nm
副波長８００nmにおける吸光度変化を感度として測定し
た。

【００３３】（５）測定結果：生理食塩水を試料として
用いたときの感度をゼロとして、ＨＳＡ含有試料を測定
した際の感度変化を図１に示した。

【００３４】比較例１（１）ＨＳＡ固定化担体粒子溶液の調製：プロテインＡ
を添加しない以外は実施例１−（１）と同様にして、Ｈ
ＳＡ固定化担体粒子溶液を得た。

【００３５】（２）感度測定方法：第２試薬を（１）で
調製したＨＳＡ固定化担体粒子溶液に変更した以外は実
施例１と同様に行なった。

【００３６】（３）測定結果：生理食塩水を試料として
用いたときの感度をゼロとして、ＨＳＡ含有試料を測定
した際の感度変化を図１に示した。

【００３７】図１に示したように、プロテインＡをレセ
プターとして使用した実施例１では、ＨＳＡ濃度２５０
μｇ／mLまでＨＳＡの濃度に依存した十分な感度変化が
認められた。これに対し、レセプターを用いない比較例
１ではＨＳＡ含有試料測定による感度変化は小さくＨＳ
Ａ濃度１００μｇ／mLで頭打ちになった。

【００３８】実施例２（１）ＨＳＡ固定化担体粒子溶液の調製：ポリスチレン
ラテックス（平均粒径０．１μm、セキスイ化学社製）
２００μLに、８００μLの２０mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
６．５）を添加して希釈したのち、ＨＳＡ（シグマ社
製）を３mg／mLの濃度で上記ＭＥＳ緩衝液に溶解した溶
液１．０mLを加え、４℃で２時間反応させた。次いで、
２mg／mLのＢＳＡ水溶液２．０mLを加え、４℃で１時間
反応させた。この溶液に２％のポリエチレングリコール
２００００、０．１％のＢＳＡを含有する水溶液１１６
mLを加えて攪拌し、ＨＳＡ固定化担体粒子溶液を得た。

【００３９】（２）抗マウスＩｇＧラットモノクローナ
ル抗体の製造：（ａ）免疫；ラットへの免疫には１回当たり市販の正常
マウスＩｇＧ１００μgを使用した。初回免疫はフロイ
ンドの完全アジュバントを用い、追加免疫ではフロイン
ドの不完全アジュバントを使用した。具体的には市販の
正常マウスＩｇＧ１００μLとフロインドのアジュバン
ト１００μLを混合し、得られたエマルジョン２００μL
を１回の免疫につき１匹のＳＤ雄性ラットの腹腔に注射
を行い、免疫を２週間間隔で４回繰り返した。ラットの
尾静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定して、
抗体価の高いラットを選んで細胞融合に使用した。

【００４０】（ｂ）細胞融合；４回目の免疫から２週間
後に、生理食塩水の２００μLに希釈した正常マウスＩ
ｇＧ１００ｇをラット腹腔に注射し、その３日後にラッ
トから脾臓を摘出した。摘出した脾臓をＲＰＭＩ１６
４０培地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部
分でよくほぐし、脾細胞を回収した。これを１５００rp
mで５分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、
遠心した。最終的に１５％ＦＣＳを含む同培地２mLを加
え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数は、アク
リジンオレンジ／臭化エチジュウム溶液（各０．１mgを
ＰＢＳ１mLに溶解）と懸濁液を１：１で混ぜ蛍光顕微鏡
下でカウントした。生きた脾細胞１０⁸個と予め培養し
ておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細
胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４の１０⁷個を混合した後に１
５００rpmで５分遠心した。上清を除去し、細胞をよく
解きほぐした後、ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣ
ｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄：１．
４１ｇ，ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ：０．７８ｇを精製水
１Ｌに溶解）にて懸濁し、１５００rpmで５分間遠心を
行い、細胞の洗浄を行なった。同洗浄を繰り返した後、
５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５４０を
含むＧＫＮ溶液０．５mLを徐々に加え静かに１分攪拌し
た。これにＧＫＮ溶液１０mLを徐々に静かに加えて反応
を停止させ、１５００rpmで５分間遠心した。得られた
細胞を１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地３０m
Lに浮遊し、フィーダー細胞１０⁶個を含むＨＡＴ培地
（１０^-4Ｍヒポキサンチン、４．０×１０^-7Ｍアミノプ
テリン、１．５×１０^-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含
有ＲＰＭＩ１６４０培地）を予め１ウエル当たり２０
０μL分注した９６穴マイクロカルチャープレート３枚
に１ウエル当たり１００μLづつ分注して３７℃５％炭
酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエルで
融合細胞の増殖を確認した。

【００４１】（ｃ）抗マウスＩｇＧ抗体産生細胞の選択
とクローン化；培養上清中の抗マウスＩｇＧ抗体の存在
をＥＬＩＳＡ法で確認した。すなわち、マウスＩｇＧ
（２μg／mL）を固相化した９６穴マイクロプレートを
用いてスクリーニングを行なった。具体的には、正常マ
ウスＩｇＧを０．７２％ＮａＣｌを含むＰＢＳｐＨ
７．４で２μg／mLに希釈し、５０μL／ウエルの割合で
９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置し
た。これらを１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳｐＨ７．４（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄
した。プレートの各ウエルに培養上清５０μLを加え、
３７℃で１時間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄後、
ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識抗ラットＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由
来：バイオソース社製）を５０μL加え、３７℃で１時
間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、０．２％オル
トフェニレンジアミン、０．０２％過酸化水素水を含む
クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．０を５０μL／ウエル
加えて室温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸を５０μL／
ウエル加えて反応を停止させた。５５０nmの波長で測定
し、対照のプレートと比較して吸光度の高いウエルを選
択した。単クローン化は限界希釈法で行なった。すなわ
ち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細
胞を１ウエル当たり１０⁶個／２００μLづつ分注した９
６穴マイクロカルチャープレートに、特異抗体陽性ウエ
ル中のハイブリドーマを１０個／mLとなるように希釈し
たものを１００μLづつ分注した。培地は初回にはＨＴ
培地を、２回目以降は１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０培地を用い、３７℃５％炭酸ガス培養器中で１０
日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエル
の選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回
繰り返して、抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体産生細
胞を得た。

【００４２】（ｄ）抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体
の分離及び精製；前項の方法によって得た抗マウスＩｇ
Ｇモノクローナル抗体産生細胞を、ヌードラット腹腔内
で培養してモノクローナル抗体を作らせた。前処理とし
て４週齢のヌードラット（Ｆ３４４／njcl-rnu）の腹腔
内に２．５mLのプリスタン（２，６，１０，１４−テト
ラメチルペンタデカン）を投与した。１０日後、１．０
mLのＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊した細胞１×１０⁶個
をこのヌードラットの腹腔内に投与した。投与後９日目
から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水は
３，０００rpmで１０分間遠心分離を行い、細胞等の不
溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置して得られ
た沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、透析し
た。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ
カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮａ
Ｃｌ０〜０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ、精製抗体を
得た。

【００４３】（３）抗ＨＳＡモノクローナル抗体−抗マ
ウスＩｇＧモノクローナル抗体混和溶液の調製：実施例
１−（３）で製造した抗ＨＳＡモノクローナル抗体（マ
ウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように精製水で希
釈した。次に（２）で調製した抗マウスＩｇＧラットモ
ノクローナル抗体を０．５mg／mLの濃度なるように精製
水で希釈し、両者を液量１：１で混和した。その後、混
和抗体濃度が４５μg／mL（抗ＨＳＡモノクローナル抗
体濃度３０μg／mL、抗マウスＩｇＧラットモノクロー
ナル抗体濃度１５μg／mL）となるように、０．１％の
ＢＳＡ、２％のポリエチレングリコール２００００を含
有する水溶液で希釈し、抗ＨＳＡモノクローナル抗体−
抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体混和溶液を得
た。

【００４４】（４）感度測定方法：汎用型の日立７１７
０型自動分析装置を用いて感度を測定した。具体的には
第１試薬として（３）で調製した抗ＨＳＡモノクローナ
ル抗体−抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体混和溶液を
用い、その１００μLに、ＨＳＡを含有する試料液５μL
を加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬として（１）
で調製したＨＳＡ固定化担体粒子溶液１００μLを加え
て攪拌した。その後１〜５分間の主波長３４０nm副波長
８００nmにおける吸光度変化を感度として測定した。

【００４５】（５）測定結果：ＨＳＡ濃度（０，１０，
２５，５０，１００，２５０μg／mL）の標準品を測定
したときの感度から検量線を作成し図２に示した。ま
た、この検量線を用い、既知濃度のヒトアルブンを含有
する尿検体について、アルブミン濃度を測定した。結果
を表１に示した。

【００４６】

【表１】

【００４７】比較例２（１）抗ＨＳＡモノクローナル抗体溶液の調製：実施例
１−（２）で製造した抗ＨＳＡモノクローナル抗体（マ
ウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように精製水で希
釈した。次いで抗体濃度が３０μｇ／mLとなるように、
２％のポリエチレングリコール２００００、０．１％Ｂ
ＳＡを含有する水溶液で希釈し、抗ＨＳＡモノクローナ
ル抗体溶液を得た。

【００４８】（２）感度測定方法：第１試薬を（１）で
調製したＨＳＡモノクローナル抗体溶液に変更した以外
は実施例２と同様に行なった。

【００４９】（３）測定結果：ＨＳＡ濃度（０，１０，
２５，５０，１００，２５０μg／mL）の標準品を測定
したときの感度を図２に示した。

【００５０】比較例３（１）抗ＨＳＡモノクローナル抗体−ＲＦ混和溶液の調
製：実施例１−（２）で製造した抗ＨＳＡモノクローナ
ル抗体（マウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように
精製水で希釈した。次いで最終溶液中のＲＦ濃度が１I
Ｕ／mLとなるようにヒトのリウマチ患者血清（インター
ジェン社製）を添加した、２％のポリエチレングリコー
ル２００００、０．１％ＢＳＡを含有する水溶液で抗体
濃度が３０μｇ／mLとなるように希釈し、抗ＨＳＡモノ
クローナル抗体−ＲＦ混和溶液を得た。

【００５１】（２）感度測定方法：第１試薬を（１）で
調製した抗ＨＳＡモノクローナル抗体−ＲＦ混和溶液に
変更した以外は実施例２と同様に行なった。

【００５２】（３）測定結果：ＨＳＡ濃度（０，１０，
２５，５０，１００，２５０μg／mL）の標準品を測定
したときの感度を図２に示した。

【００５３】図２に示したように、実施例２において
は、高感度かつＨＳＡ濃度に依存した感度変化により良
好な検量線が得られ、これを用いて表１に示したように
尿中のヒトアルブミンを測定することができた。これに
対し、レセプターを用いない比較例２では、感度及び感
度変化が小さいため検量線が得られなかった。また、凝
集剤とてＲＦを用いた比較例３では、感度は得られた
が、ＨＳＡ濃度に依存した感度変化が認められず検量線
は得られなかった。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、免疫学的凝集阻止反応
を利用して、被検試料中の抗原を特異的に、簡便かつ迅
速に測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１及び比較例１において、ＨＳＡ含有試
料を測定したときの感度変化を示す図である。

【図２】実施例１、比較例２及び３において、ＨＳＡ含
有試料を測定したときの感度を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定対象である抗原を含む試料と、(A)
抗原を固定化した不溶性担体粒子、(B)前記抗原と反応
する遊離状態の特異抗体、及び(C)前記特異抗体におけ
る(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプ
ターを混合し、試料中の遊離の測定対象抗原によって生
じる免疫学的凝集阻止反応を、光学的に測定することを
特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項２】 (B)の特異抗体が、モノクローナル抗体
である請求項１記載の免疫学的測定方法。
【請求項３】 (B)の特異抗体が、ポリクローナル抗体
である請求項１記載の免疫学的測定方法。
【請求項４】 (C)のレセプターが、リガンドと反応し
て凝集しないものである請求項１記載の免疫学的測定方
法。
【請求項５】不溶性担体粒子が、平均粒径１．６μm
以下のものである請求項１〜４のいずれか１項記載の免
疫学的測定方法。
【請求項６】試料中の遊離の測定対象抗原によって生
じる免疫学的凝集阻止反応を測定するために試料と混合
して用いる試薬であって、(A)抗原を固定化した不溶性
担体粒子、(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗
体、及び(C)前記特異抗体における(A)との結合部位以外
の部位をリガンドとするレセプターを含有することを特
徴とする免疫学的測定用試薬。