JP5586232B2

JP5586232B2 - 微小粒子の凝集反応を用いる検体の免疫学的測定方法および測定用キット

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Publication number: JP5586232B2
Application number: JP2009544622A
Authority: JP
Inventors: 真理柳谷; 睦田中; 美恵子小坂; 昌泰榎本
Original assignee: Alfresa Pharma Corp
Current assignee: Alfresa Pharma Corp
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2008-11-10
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2028-11-10
Also published as: EP2230516A1; EP2230516B1; WO2009072385A1; US8354238B2; EP2230516A4; JPWO2009072385A1; US20100248392A1

Description

本発明は、物質を結合した微小粒子を用いる免疫学的測定法に関する。特に、主として工業、環境、および臨床検査の分野における、抗原抗体反応を利用した微量成分の免疫学的測定方法ならびに免疫測定試薬キットに関する。

近年、臨床検査などの各種検査では自動化および測定時間の短縮が図られている。その検査の方法として、生体試料中の物質を測定するために免疫反応を利用する測定方法が広く用いられている。免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などの多くの方法がある。その中でも、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないホモジニアス系での測定が可能なため、測定の自動化や短時間での測定に適している。特に、金コロイド粒子は５ｎｍ〜１００ｎｍの大きさであり、これはラテックス粒子より小さいため、より微量物質の測定に利用可能である（特開２００５−２８３２５０号公報および特開２００４−３２５１９２号公報）。
これらの測定法における主反応成分は、被測定物質に特異的に反応（例えば、結合）する物質を結合したラテックス粒子や金コロイド粒子などの微小粒子である。微小粒子上に存在する抗体などの特異的結合物質が被測定物質と結合することにより、微小粒子の凝集が生じる。その凝集は被測定物質の量依存的に生じるので、その現象を機械的に測定することで、被測定物質量を算出することができる。
しかしながら、被測定物質の分子量が小さい薬剤や化学物質などは、特異的結合物質と被測定物質との結合部位が少なく、凝集反応が生じにくいため、凝集反応を用いたホモジニアスな測定系を組むことは困難であった。そのため、特別にハプテンを結合させた競合体を反応系に添加することなどの工夫が必要であった（例えば、特開２００４−３２５１９２号公報および特開２００６−３８５９４号公報参照）。

本発明の目的は、分子中に特異的結合部位が少ない被測定物質についての、免疫学的微小粒子の凝集反応を用いる測定方法および測定用キットを提供することである。
本発明では、被測定物質または被測定物質の類似体と、被測定物質に特異的に結合し得る物質に特異的に結合する物質とを、共に不溶性担体上に結合させた微小粒子を用いて、被測定物質の測定を行うことにより、特別にハプテンを結合させた競合体と被測定物質とを同時に競合させることなく、より簡便に被測定物質を測定することを可能にした。
本発明は、検体中の被測定物質を測定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）該被測定物質、第１の特異的結合物質、および微小粒子を混合する工程であって、該第１の特異的結合物質が、該被測定物質に特異的に結合し得る物質であり、該微小粒子が、該被測定物質または該被測定物質の類似体と、第２の特異的結合物質とを共に表面上に結合させた不溶性担体であり、そして該第２の特異的結合物質が、該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、工程；および
（ｂ）該工程（ａ）で得られた該混合液において、該微小粒子の凝集反応を測定する工程；
を含む。
１つの実施態様では、上記被測定物質はハプテンであり、そして上記被測定物質の類似体はハプテン結合蛋白質である。
１つの実施態様では、上記被測定物質に特異的に結合し得る物質は該被測定物質に対する抗体である。
ある実施態様では、上記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質に対するモノクローナル抗体である。
さらなる実施態様では、上記被測定物質の類似体は上記被測定物質に特異的に結合し得る物質と結合し得る認識部位、または該認識部位の構造類似体である。また、上記認識部位または構造類似体が複数個結合した物質であってもよい。
１つの実施態様では、上記不溶性担体は、ラテックスまたは金コロイドである。
本発明はまた、測定用試薬キットを提供し、該キットは、
被測定物質に特異的に結合し得る物質である第１の特異的結合物質を含む第一試薬；および
微小粒子を含む第二試薬であって、該微小粒子が、該被測定物質または該被測定物質の類似体と、第２の特異的結合物質とを共に表面上に結合させた不溶性担体であり、そして該第２の特異的結合物質が、該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、第二試薬；
を含む。
１つの実施態様では、上記被測定物質はハプテンであり、そして上記被測定物質の類似体はハプテン結合蛋白質である。
本発明の方法によれば、ラテックスや金コロイドなどの不溶性担体に、被測定物質または被測定物質の類似体と、被測定物質に特異的に結合し得る物質に特異的に結合し得る物質とを、共に結合させた微小粒子を凝集反応の主成分として使用するので、特別にハプテンを結合させた競合体を反応系に添加して被測定物質と競合体とを同時に競合させることなく、より簡便に凝集反応を用いたホモジニアスな測定系を組むことが可能である。

図１は、ジアセチルスペルミン測定におけるジアセチルスペルミン濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである（実施例４）。
図２は、ジアセチルスペルミン測定におけるジアセチルスペルミン濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである（実施例６）。
図３は、ブロムペリドールにおけるブロムペリドール濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである（実施例９）。

本発明において、測定に供する被測定物質を含む検体としては、血液、血漿、血清、尿、糞便（懸濁液）、髄液、腹水などの生体試料；環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。
被測定物質は、該被測定物質に特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）が存在し得るものであれば、特に限定されない。被測定物質としては、例えば、アルブミン、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ミオグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン、シスタチンＣ、フェリチン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、ペプシノーゲンＩおよびＩＩ、コラーゲンなどの蛋白質；高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質などの脂質蛋白質；デオキシリボ核酸、リボ核酸などの核酸；アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素、リパーゼ、アミラーゼなどの酵素；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、これらに対する抗体などの感染症に関する抗原や抗体；スペルミン、スペルミジン、プトレッシン、ジアセチルスペルミンなどのポリアミン、および生理活性物質；ハロペリドール、ブロムペリドールなどの薬物；性ホルモンなどのホルモンなどが挙げられる。
被測定物質に特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）としては、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。例えば、抗体または抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。被測定物質を特異的に認識できかつ以下で詳述する不溶性担体に結合した第２の特異的結合物質に認識されやすい（すなわち、特異的に結合する）点で、該第１の結合物質に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が好ましい。また、第１の特異的結合物質は、第２の特異的結合物質による認識部位（例えば、タグ）が化学的または分子生物学的手法を用いて付加されていてもよい。このような第１の特異的結合物質は、市販のものであってもよく、あるいは被測定物質に応じて当業者が通常用いる方法によって調製したものであってもよい。
被測定物質に特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）に特異的に結合する物質（第２の特異的結合物質）は、不溶性担体の表面上に結合される。第２の特異的結合物質としては、免疫反応を利用した免疫測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。あるいは、測定対象に特異的に結合する物質に特異的に結合するものも利用可能である。例えば、抗体または抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。
第２の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質に特異的に結合し、その結合部位は、第１の特異的結合物質に存在する任意の領域を認識する。例えば、第１の特異的結合物質が抗体である場合は、抗体のＦｃ領域、Ｖ領域、あるいは化学的または分子生物学的手法を用いて付加されたタグ領域などが挙げられる。第２の特異的結合物質は、抗体である場合、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。このような第２の特異的結合物質は、市販のものであってもよく、あるいは第１の特異的結合物質に応じて当業者が通常用いる方法によって調製したものであってもよい。
第２の特異的結合物質と共に不溶性担体に結合される被測定物質または被測定物質の類似体は、第１の特異的結合物質に特異的に結合するものであればよく、被測定物質自体、第１の特異的結合物質により認識される被測定物質の認識部位（すなわち、被測定物質の一部）、またはその構造類似体である。また、それらが複数個結合した物質であってもよい。被測定物質が、免疫原性を欠き反応原性のみを有するハプテン（例えば、分子量数百以下の低分子）である場合は、被測定物質の類似体はハプテン結合蛋白質であることが好ましい。複数の被測定物質（例えば、ハプテン）、その一部、またはその構造類似体を結合させるための蛋白質としては、各種動物由来のアルブミン、ヘモシアニン、サイログロブリン、フィブリノーゲン、酵素などから適宜選択される。本発明においては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。ハプテン結合蛋白質としては、蛋白質１分子当たり、４〜４０程度の被測定物質（ハプテン）、その一部、またはその構造類似体が結合していることが好ましい。
被測定物質またはその一部とこれらの蛋白質との結合は、当業者が通常用いる方法により行うことができる。このような結合方法は、被測定物質またはその一部に存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基などの官能基を利用して、被測定物質またはその一部と担体とを直接または結合剤を介して化学結合させるものであり、被測定物質またはその一部の構造に応じて種々のものが知られている（生化学実験法１１エンザイムイムノアッセイ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ著、石川栄治編、２５２頁、１９８９年、東京化学同人）。化学結合を形成させるための試薬としては、アシル化剤、アルキル化剤などが挙げられる。好ましくは、カルボキシル基を活性化することにより得られるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、弱アルカリ条件下で用いられるマレイミド類などである。
本発明において、被測定物質または被測定物質の類似体と第２の特異的結合物質とを共に結合させるための不溶性担体は、免疫測定試薬に使用され得る微小粒子であればよい。ラテックスおよび金属コロイドが好ましい。金属コロイドの場合、金コロイドが一般的に利用されやすい点で好ましい。金コロイド粒子は、市販されているものを用いてもよく、あるいは当業者が通常用いる方法（例えば、塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法）により調製したものを用いてもよい。金コロイド粒子の粒径は、通常１０ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
本発明の方法に用いられる被測定物質または被測定物質の類似体と第２の特異的結合物質とを共に結合した金コロイド粒子（以下、結合金コロイド粒子という場合がある）は、例えば、以下のように調製し得る：金コロイド粒子溶液（５４０ｎｍにおける吸光度が約２．０）１Ｌに対して、通常、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇの被測定物質または被測定物質の類似体（例えば、ウシ血清アルブミン結合被測定物質）と０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇの第２の特異的結合物質（例えば、抗体）を添加し、冷蔵または室温下で５分〜２４時間撹拌する。次いで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングし、遠心分離を行うことにより、目的の結合金コロイド粒子を得ることができる。得られた微小粒子は、測定に必要な濃度となるように緩衝液に分散させる。緩衝液のｐＨは５〜９が好ましく、濃度は１〜１００ｍＭが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、あるいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）などのグッド緩衝液が好適に用いられる。
緩衝液は、必要に応じて、糖および糖アルコール、アジ化ナトリウム、アルブミン、塩化ナトリウムなどの塩類、防腐剤などの添加物を含有してもよい。糖および糖アルコールとしては、グルコース、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられ、その濃度は、０．０１〜１０ｗ／ｖ％が好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく、その濃度は０．００１〜１ｗ／ｖ％が好ましい。防腐剤としてはアジ化ナトリウムが好ましく、その濃度は、０．０１〜０．５ｗ／ｖ％が好ましい。その他の添加物としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、５−ブロモサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモールなどが挙げられる。
被測定物質と第１の特異的結合物質との結合反応、および得られた結合物と第２の特異的結合物質などが結合した不溶性担体との凝集反応において、反応温度、ｐＨ、緩衝液の種類、共存する塩の種類や濃度、その他の共存物質などの反応条件は、従来の免疫学的反応と同様である。例えば、一般的に行われているように、反応促進の目的で、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの水溶性高分子を反応系に添加してもよい。例えば、ポリエチレングリコールの場合、測定系によっても異なるが、１〜５ｗ／ｖ％程度添加される。
本発明において、検体中の被測定物質を測定する方法は、
（ａ）該被測定物質、第１の特異的結合物質、および微小粒子を混合する工程であって、該第１の特異的結合物質が、該被測定物質に特異的に結合し得る物質であり、該微小粒子が、該被測定物質または該被測定物質の類似体と、第２の特異的結合物質とを共に表面上に結合させた不溶性担体であり、そして該第２の特異的結合物質が、該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、工程；および
（ｂ）該工程（ａ）で得られた該混合液において、該微小粒子の凝集反応を測定する工程；
を含む。
この方法において、被測定物質が、第１の特異的結合物質を複数個結合し得る場合は、例えば、工程（ａ）で、まず、被測定物質と該被測定物質に特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）とを反応させて複合体を形成させ、次いで、被測定物質に特異的に結合する物質を認識する物質（第２の特異的結合物質）を結合させたラテックスや金コロイドなどの不溶性担体でなる微小粒子と反応させることによって凝集反応を生じさせ、その程度を工程（ｂ）で機械的に測定する。
本発明の方法は、例えば、以下のように行われる：第１の反応として、被測定物質を含む検体または該検体を緩衝液などで適切に希釈したものなどと被測定物質に特異的に結合する第１の特異的結合物質とを混合する。次いで第２の反応として、この混合液に、上記のように得られた不溶性担体でなる微小粒子を添加して混合する。第１の反応で被測定物質と結合していない第１の特異的結合物質は、不溶性担体上の被測定物質または被測定物質類似体と結合する。不溶性担体上の第２の特異的結合物質が、不溶性担体上の被測定物質または被測定物質類似体に結合した第２の特異的結合物質に結合することにより、微粒子の凝集反応が生じる。この凝集反応は、第２の反応において不溶性担体上の被測定物質に結合する第１の特異的結合物質の量に依存するので、第１の反応で被測定物質と結合していない第１の特異的結合物質の量に依存することになる。すなわち、第１の反応の被測定物質の量に依存して第２の反応の凝集反応が減少する。例えば、不溶性担体として金コロイドを用いる場合は、この凝集反応に起因する所定の波長における吸光度変化を測定する。測定結果を、予め作成しておいた金コロイド凝集反応の吸光度変化と被測定物質の量との関係を表す検量線に当てはめることにより、容易に検体中の被測定物質の量を求めることができる。なお、例えば、吸光度変化が一定値未満であれば陰性、一定値以上であれば陽性と設定して判定を行うことにより、定性および半定量をすることも可能である。
金コロイドを用いる場合、反応開始後の吸光度変化は、一波長測定であっても二波長測定であってもよい。二波長測定の場合は、測定波長は、第一波長６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍと、第二波長３６０ｎｍ〜５８０ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５５０ｎｍである。一波長測定の場合は、上記二波長測定の場合の第一波長または第二波長のいずれか一方の波長領域の波長で測定することができる。本発明の方法において吸光度変化とは、以下の２通りの測定により得られた値であり、いずれであってもよい：
（１）反応開始後に反応液の吸光度を適当な間隔で２回測定し、その差を吸光度変化とする；または
（２）反応開始後に反応液の吸光度を連続的に測定し、時間当たりの吸光度変化率（その最大変化率を用いる場合もある）を吸光度変化とする。
上記測定には、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析装置などが利用できる。特に、本発明の方法を生化学自動分析装置での測定に適用することにより、多数の検体を短時間に測定することが可能である。
本発明によれば、本発明の方法に用いるための測定用試薬キットが提供される。このキットは、被測定物質に特異的に結合し得る物質である第１の特異的結合物質を含む第一試薬；および微小粒子を含む第二試薬であって、該微小粒子が、該被測定物質または該被測定物質の類似体と、第２の特異的結合物質とを共に表面上に結合させた不溶性担体であり、そして該第２の特異的結合物質が、該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、第二試薬；を含む。
上記の試薬は、どのような形態で提供されてもよく、それぞれ個別に密封包装されて提供されることが好ましい。上記キットは、検量線作成用の被測定物質の標準品、使用時に各物質を溶解して適切な濃度の溶液を調製するための緩衝液、使用説明書など含んでいてもよい。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
（実施例１：金コロイド液の調製）
９５℃の蒸留水１Ｌに１０ｗ／ｖ％塩化金酸溶液２ｍＬを撹拌しながら加え、１分後に２ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間撹拌した後、３０℃に冷却した。冷却後、０．１ｗ／ｖ％炭酸カリウムでｐＨ７．１に調節した。
（実施例２：ジアセチルスペルミンと抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体とを結合した金コロイド試薬の調製）
ジアセチルスペルミン結合ＢＳＡ（特開２００６−３８５９４号公報参照）を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のジアセチルスペルミン結合ＢＳＡ溶液を得た。これとは別に、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体（ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＳｅｒｖｉｃｅｓ社）を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈して、４０μｇ／ｍＬの濃度のモノクローナル抗体溶液を得た。ジアセチルスペルミン結合ＢＳＡ溶液５０ｍＬを上記実施例１で調製した約１Ｌの金コロイド液に加え１０分間室温で撹拌し、続いてモノクローナル抗体溶液を５０ｍＬ加え、冷蔵下で１８時間撹拌した。この液に、５．４６ｗ／ｖ％マンニトール、０．５ｗ／ｖ％ＢＳＡ、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、室温にて１時間撹拌した。８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、沈渣に３ｗ／ｖ％マンニトール、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去し、Ａ溶液を加えて抗体結合金コロイドを分散させ、全量を７０ｍＬとし、ジアセチルスペルミンと抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体とを結合した金コロイド溶液を調製した。
次いで、得られたジアセチルスペルミンと抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体とを結合した金コロイド溶液７０ｍＬに、Ａ溶液を２８０ｍＬ添加し、ジアセチルスペルミンと抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体とを結合した金コロイド試薬を調製した。
（実施例３：ジアセチルスペルミン測定例１用第一試薬の調製）
１．０ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、０．５ｗ／ｖ％ＥＤＴＡ、および０．３５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．２ＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）の溶液（Ｂ溶液）に、抗ジアセチルスペルミンマウスＩｇＧ抗体（株式会社トランスジェニック）を０．５μｇ／ｍＬ、ならびに反応促進剤としてポリエチレングリコールを２．０ｗ／ｖ％添加して、ジアセチルスペルミン用第一試薬とした。
（実施例４：ジアセチルスペルミンの測定例１）
本実施例では、第一試薬として実施例３で調製したジアセチルスペルミン測定例１用第一試薬を、第二試薬として実施例２で調製したジアセチルスペルミンと抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体とを結合した金コロイド試薬を用いた。ジアセチルスペルミンを、それぞれ０、５、１０、２５、５０、７５、１００および２００ｎＭの濃度になるように、試料を調製した。ジアセチルスペルミン含有試料１０μＬに、第一試薬を１６０μＬ添加し、３７℃で約５分間加温した後、第二試薬を８０μＬ加えて３７℃にて反応させて、日立７０７０自動分析装置により、波長５４６ｎｍおよび６６０ｎｍでの測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化量を測定した。図１および表１にジアセチルスペルミン濃度と吸光度変化量との関係を示す。

図１および表１に示すように、被測定物質であるジアセチルスペルミンの濃度依存的に、凝集反応による吸光度変化量が変化した。すなわち、ジアセチルスペルミンの濃度が高いほど、吸光度変化量が少なくなった。したがって、検体中の被測定物質であるジアセチルスペルミン量を、凝集反応の吸光度変化量として測定し、検量線と比較することによって定量できることがわかる。
（実施例５：ジアセチルスペルミン測定例２用第二試薬の調製）
１．０ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、０．５ｗ／ｖ％ＥＤＴＡ、および０．３５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．２ＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）の溶液（Ｂ溶液）に、抗ジアセチルスペルミンマウスＩｇＧ抗体（株式会社トランスジェニック）を０．７５μｇ／ｍＬ、ならびに反応促進剤としてポリエチレングリコールを２．０ｗ／ｖ％添加して、ジアセチルスペルミン測定例２用第二試薬とした。
（実施例６：ジアセチルスペルミンの測定例２）
本実施例では、第一試薬として実施例２で調製したジアセチルスペルミンと抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体とを結合した金コロイド試薬、第二試薬として実施例５で調製したジアセチルスペルミン測定例２用第二試薬を用いた。ジアセチルスペルミンを、それぞれ０、２００、４００、６００および１０００ｎＭの濃度になるように、試料を調製した。ジアセチルスペルミン含有試料１０μＬに、第一試薬を８０μＬ添加し、３７℃で約５分間加温した後、第二試薬を１６０μＬ加えて３７℃にて反応させて、日立７０７０自動分析装置により、波長５４６ｎｍおよび６６０ｎｍでの測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化量を測定した。図２および表２にジアセチルスペルミン濃度と吸光度変化量との関係を示す。

図２および表２に示すように、被測定物質であるジアセチルスペルミンの濃度依存的に、凝集反応による吸光度変化量が変化した。すなわち、ジアセチルスペルミンの濃度が高いほど、吸光度変化量が少なくなった。したがって、検体中の被測定物質であるジアセチルスペルミン量を、凝集反応の吸光度変化量として測定し、検量線と比較することによって定量できることがわかる。
（実施例７：ブロムペリドールと抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体とを結合した金コロイド試薬の調製）
ブロムペリドール結合ＢＳＡ（特開２００４−３２５１９２号公報参照）を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のブロムペリドール結合ＢＳＡ溶液を得た。これとは別に、抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈して４０μｇ／ｍＬの濃度のモノクローナル抗体溶液を得た。ブロムペリドール結合ＢＳＡ溶液５０ｍＬを上記実施例１で調製した約１Ｌの金コロイド液に加え１０分間室温で撹拌し、続いてモノクローナル抗体溶液を５０ｍＬ加え、冷蔵下で１８時間撹拌した。この液に、５．４６ｗ／ｖ％マンニトール、０．５ｗ／ｖ％ＢＳＡ、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、室温にて１時間撹拌した。８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、沈渣にＡ溶液を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去し、Ａ溶液でブロムペリドールと抗体結合金コロイドを分散させ、全量を７０ｍＬとし、ブロムペリドールと抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体とを結合した金コロイド溶液を調製した。
次いで、ブロムペリドールと抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体とを結合した金コロイド溶液７０ｍＬに、Ａ溶液を２８０ｍＬ添加し、ブロムペリドールと抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体とを結合した金コロイド試薬を調製した。
（実施例８：ブロムペリドール測定用第一試薬の調製）
上記実施例３に記載のＢ溶液に、抗ブロムペリドールウサギポリクローナル抗体（特開２００４−３２５１９２号公報参照）を６μｇ／ｍＬ、ウサギＩｇＧネガティブコントロール（Ｄａｋｏ社）を４μｇ／ｍＬ、および反応促進剤としてポリエチレングリコールを４．５ｗ／ｖ％添加して、ブロムペリドール測定用第一試薬とした。
（実施例９：ブロムペリドールの測定）
本実施例では、第一試薬として実施例８で調製したブロムペリドール測定用第一試薬を、第二試薬として実施例７で調製したブロムペリドールと抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体とを結合した金コロイド試薬を用いた。ブロムペリドールを、それぞれ０、１０、２０、５０、および１００ｎｇ／ｍＬの濃度になるように３ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン含有０．０５ＭＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解したものを試料とした。ブロムペリドール含有試料２０μＬに、第一試薬を１６０μＬ添加し、３７℃で約５分間加温した後、第二試薬を８０μＬ加えて３７℃にて反応させて、日立７０７０自動分析装置により、波長５４６ｎｍおよび６６０ｎｍでの測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化量を測定した。図３および表３にブロムペリドール濃度と吸光度変化量との関係を示す。

図３および表３に示すように、被測定物質であるブロムペリドールの濃度依存的に、凝集反応による吸光度変化量が変化した。すなわち、ブロムペリドールの濃度が高いほど、吸光度変化量が少なくなった。したがって、検体中の被測定物質であるブロムペリドール量を、凝集反応の吸光度変化量として測定し、検量線と比較することによって定量できることがわかる。

本発明によれば、ラテックスや金コロイドなどの不溶性担体に、被測定物質または被測定物質の類似体と、被測定物質に特異的に結合し得る物質に特異的に結合する物質とを、共に結合させた微小粒子を凝集反応の主成分として使用することにより、特別にハプテンを結合させた競合体を反応系に添加して被測定物質と競合体とを同時に競合させることなく、より簡便に凝集反応を用いたホモジニアスな測定系を組むことが可能になる。
また、Ｂ／Ｆ分離を必要としないため、自動化にも非常に適している。したがって、工業、環境、および臨床検査の分野における、抗原抗体反応を利用した微量成分の免疫学的測定方法に好適である。

Claims

検体中の被測定物質を測定する方法であって、
（ａ）該被測定物質、第１の特異的結合物質、および微小粒子を混合する工程であって、該第１の特異的結合物質が、該被測定物質に特異的に結合し得る物質であり、該微小粒子が、該被測定物質または該被測定物質の類似体と、第２の特異的結合物質とを共に表面上に結合させた不溶性担体であり、そして該第２の特異的結合物質が、該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、工程；および
（ｂ）該工程（ａ）で得られた該混合液において、該微小粒子の凝集反応を測定する工程；を含み、
該被測定物質が、該被測定物質と特異的に結合する物質との結合部位が少なく、かつ競合法による測定が可能な物質であり、
該第２の特異的結合物質が、該第１の特異的結合物質に対するモノクローナル抗体である、方法。
前記被測定物質がハプテンであり、そして前記被測定物質の類似体がハプテン結合蛋白質である、請求項１に記載の方法。
前記被測定物質に特異的に結合し得る物質が、該被測定物質に対する抗体である、請求項１または２に記載の方法。
前記被測定物質の類似体が、前記被測定物質に特異的に結合し得る物質と結合し得る認識部位、該認識部位の構造類似体、あるいは、それらが複数個結合した物質である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
前記不溶性担体が、ラテックスまたは金コロイドである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
検体中の被測定物質を測定する測定用試薬キットであって、
被測定物質に特異的に結合し得る物質である第１の特異的結合物質を含む第一試薬；および
微小粒子を含む第二試薬であって、該微小粒子が、該被測定物質または該被測定物質の類似体と、第２の特異的結合物質とを共に表面上に結合させた不溶性担体であり、そして該第２の特異的結合物質が、該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、第二試薬；を含み、
該被測定物質が、該被測定物質と特異的に結合する物質との結合部位が少なく、かつ競合法による測定が可能な物質であり、
該第２の特異的結合物質が、前記第１の特異的結合物質に対するモノクローナル抗体である、測定用試薬キット。
前記被測定物質がハプテンであり、そして前記被測定物質の類似体がハプテン結合蛋白質である、請求項６に記載の測定試薬キット。