FR2527630A1 - Enzyme leucocytaire humaine de type pepsique, procede pour sa preparation et agent therapeutique la contenant - Google Patents

Abstract

L'INVENTION FOURNIT UNE ENZYME LEUCOCYTAIRE HUMAINE DE TYPE PEPSIQUE ET UN AGENT THERAPEUTIQUE POUR LE TRAITEMENT DES TROUBLES ALLERGIQUES, DES MALADIES AVEC IMMUN-COMPLEXES ET DES TUMEURS, CONTENANT L'ENZYME EN TANT QU'INGREDIENT ACTIF. L'ENZYME LEUCOCYTAIRE HUMAINE DE TYPE PEPSIQUE DE L'INVENTION EST UNE PROTEINE D'ORIGINE HUMAINE ET, EN CONSEQUENCE, UN AGENT THERAPEUTIQUE CONTENANT CETTE ENZYME EN TANT QU'INGREDIENT ACTIF MONTRE EXTREMEMENT PEU DE REACTIONS NEFASTES, TELLES QUE L'ANAPHYLAXIE, ET EST DONC TRES SUR.

Description

2 D 27630

L'invention concerne une enzyme leucocytaire humaine, de type pepsique, un procédé pour la préparation de l'enzyme et un agent thérapeutique pour les troubles allergiques, les maladies

avec immun-complexe et les tumeurs, ledit agent contenant l'en-

zyme en tant qu'ingrédient actif.

Les troubles allergiques sont dûs à une réaction allergi-

que qui, par suite d'une réaction antigène-anticorps, produit une pathogénèse dans un organisme vivant Le mécanisme de la

pathogénèse des troubles allergiques serait le suivant Lors-

qu'il est exposé à un antigène pathogène, un organisme vivant

produit des anticorps La seconde attaque du même antigène en-

tratne une réaction antigène-anticorps qui se traduit par une libération de médiateurs chimiques à partir des cellules Ces

médiateurs endommagent les tissus et/ou les complexes antigène-

anticorps formés se déposent sur les tissus, produisant des troubles allergiques ou des troubles auto-immuns Parmi les divers antigènes pathogènes, on citera les antigènes xénogènes,

tels que l'allergène inhalé, l'allergène alimentaire, des médi-

caments et l'allergène de contact, et les antigènes allogènes ou autologues qui proviennent de constituants autologues des tissus ou organes dénaturés pour une raison quelconque, et se

comportant donc en substances étrangères.

Les troubles dits allergiques dûs à des antigènes xéno-

gène, tels que l'asthme bronchique, l'allergie alimentaire ou

l'urticaire, sont classés en quatre types selon leurs sympto-

mes ou leurs causes C'est-à-dire qu'ils sont classés en aller-

gies de Type I (type anaphylactique), provenant d'anticorps se déposant sur les tissus et caractérisées par une augmentation de la perméabilité capillaire et une contraction des muscles lisses, les allergies de Type Il (type cytotoxique) provenant

de la présence de compléments et caractérisées par un endomma-

gement des cellules, les allergies de Type III (type Arthus)

résultant du dépôt de complexes antigène-anticorps sur les pa-

rois vasculaires et d'une participation ultérieure des complé-

ments et des leucocytes polymorphonucléaires, et caractérisées par des réactions inflammatoires, et enfin en allergies de

type IV résultant d'une immunité à médiation cellulaire et ca-

ractérisées par l'apparition d'une hypersensibilité retardée telle que la réaction à la Tuberculine Parmi les réactions allergiques, les allergies de type I, III et IV participent, par exemple, à l'asthme bronchique et chacune de ces réactions est considérée individuellement ou ensemble comme provoquant l'attaque asthmatique Le mécanisme pathogène de ces troubles

allergiques peut être considéré agir comme suit.

Un antigène qui envahit un organisme vivant, est traité

par des macrophages et l'information immunologique sur l'anti-

gène est transmise au système cellule T cellule B Les cel-

lule B qui ont reçu l'information produisent de l'immunoglobu-

line (l'anticorps de type Ig E est surtout produit dans les al-

lergies de type I et l'anticorps de type Ig G est surtout pro-

duit dans les allergies de type II et de type III) et l'anti-

corps de type Ig E se fixe sur les basophiles dans le système

circulatoire ou sur les mastocytes dans les tissus, établis-

sant ainsi l'état de sensibilisation Les mêmes antigènes qui envahissent l'organisme sensibilisé se fixent sur les anticorps

fixés sur les cellules, leur permettant de libérer des média-

teurs chimiques tels que l'histamine et des substances à réac-

tion lente de l'anaphylaxie (SRS-A) Les médiateurs chimiques

libérés induisent des symptomes allergiques tels que des éry-

thèmes, des oedèmes ou une augmentation de la sécrétion glandu-

laire due à une contraction des muscles lisses ou une augmen-

tation de la perméabilité capillaire D'autre part, l'anticorps de type Ig G se fixe sur les leucocytes polymorphonucléaires

pour produire une sensibilisation et on suppose qu'il y a éga-

lement une secrétion ultérieure de SRS-A comme médiateur chi-

mique.

Les agents anti-allergiques peuvent avoir un but thérapeu-

tique en supprimant un stade quelconque dans ces processus.

On utilise de manière classique des dérivés de xanthine,

des stimulants F-adrénergiques (p-stimulants) ou des cortico-

stéro 5 des dans le traitement de l'asthme Cependant, ces médi-

caments montrent souvent des réactions contraires indésirables.

Par exemple, on a observé des palpitations, une tachycardie, etc associées à l'utilisation de dérivés de xanthine et de p-stimulants De plus, les corticostéro 5 des peuvent provoquer des réactions néfastes telles que les ulcères peptiques et des complications d'infection bactérienne En outre, les agents

anti-histaminiques peuvent engendrer des difficultés d'expec-

toration des sécrétions de la trachée, plutôt que de se montrer

efficaces contre une attaque d'asthme, de sorte qu'ils aggra-

vent parfois l'état clinique de l'asthme.

Les maladies avec immun-complexe ou les troubles auto-

immuns dans lesquels l'anticorps pathogène est un auto-antigè-

ne, par exemple dans le rhumatisme articulaire, le lupus éry-

thémateux systémique (SLE) et le lupus néphritique, comme im-

pliqué dans les appellations, sont des troubles résultant de

complexes d'antigènes et d'anticorps, c'est-à-dire des immun-

complexes Bien que le mécanisme pathogénétique des maladies avec immuncomplexe soit compliqué et qu'il n'ait pas encore été expliqué sous bien des aspects, on suppose généralement qu'il est le suivant Lorsque les tissus sont endommagés par

des infections bactériennes ou virales, il y a production d'an-

ticorps opposés aux auto-antigènes fraîchement produits ou aux cellules infectées par un virus et ces anticorps réagissent

avec les antigènes correspondants en formant des immun-comple-

xes Etant donné que ces immun-complexes activent le système du complément et les plaquettes, des substances vaso-actives telles que l'histamine et la sérotonine sont libérées et la

perméabilité des vaisseaux sanguins augmente Les immun-comple-

xes en circulation pénètrent dans les parois vasculaires dont

la perméabilité est accrue et se déposent le long des membra-

nes sous-endothéliales Les leucocytes polymorphonucléaires se rassemblent sur les sites de dép 8 t des immun-complexes sous l'action des facteurs chimiotactiques leucocytaires produits par l'action du complément sur les immun-complexes déposés Les

leucocytes polymorphocucléaires réagissent avec les immun-com-

plexes, libèrent diverses substances endommageant les tissus, telles que les cathepsines D et E, la collagénase, l'élastase et des facteurs de perméabilité, et ces substances endommagent éventuellement le tissu Le taux du complément dans le sérum d'un malade atteint d'une maladie avec immun-complexe telle

que le SLE est généralement faible et une aggravation des con-

ditions de la maladie est étroitement associée à la diminu-

tion du taux du complément Cette diminution du taux du com-

plément serait due à une consommation importante du complément sur le site de la réaction entre les antigènes et les anticorps,

se trouvant notamment dans les reins et les vaisseaux sanguins.

De plus, on considère que les immun-complexes sont également

en rapport avec les systèmes de coagulation sanguine et on pen-

se qu'ils conduisent à des états plus sérieux par divers-méca-

nismes tels que l'accélération du dép 6 t de fibrinoides sur les

tissus endommagés.

Pour le traitement des maladies avec immun-complexe, on

utilise actuelleient des agents anti-inflammatoires et des a-

gents immunosuppresseurs comprenant des stéroldes pour suppri-

mer le système immun hypersensibilisé et réduire les inflamma-

tions locales et la douleur, ou des anticoagulants et des a-

gents anti-plaquettes pour améliorer les anomalies du système

de coagulation-fibrinolyse dans les vaisseaux sanguins Cepen-

dant, comme ces médicaments se montrent peu actifs et sont as-

sociés à de fortes réactions néfastes, on a activement cherché

à développer des médicaments qui soient sûrs et très effica-

ces dans le traitement des maladies.

De plus, de nombreux médicaments ont été développés pour

le traitement des tumeurs malignes Les médicaments anti-tu-

meurs sont classés de manière grossière en les deux types ci-

dessous Le premier type comprend des "cytotoxines" qui sup-

priment directement le développement de la tumeur Le second type comprend des médicaments qui agissent indirectement sur le développement des tumeurs en les reconnaissant comme des

substances étrangères par l'activation des fonctions immuno-

logiquement protectrices de l'hôte Cependant, les médicaments

appartenant au premier type n'exercent pas une toxicité sé-

lective suffisante vis-à-vis des cellules tumorales et se mon-

trent également toxiques vis-à-vis des cellules normales de

l'hôte En conséquence, leur posologie totale est considérable-

ment limitée D'autre part, le dernier type, c'est-à-dire les immunopotentialisateurs, montre des réactions néfastes moins fréquentes que le premier, de sorte qu'ils sont généralement utilisés de manière sûre Toutefois, ils posent un problème

essentiel, car étant donné qu'une tumeur par elle-même pro-

vient de cellules normales d'un patient et peut ne pas être

suffisamment reconnue comme substance étrangère par les fonc-

tions immunologiques protectrices, certains immunopotentiali-

sateurs ne montrent pas un effet anti-tumeur suffisant.

L'invention a pour but de fournir une enzyme leucocytai-

re hi'm'aine de tylpe pepsique ayant une activité contre les trou-

bles allergiques, contre les maladies avec immun-complexe et

contre les tumeurs.

L'invention a encore pour but de fournir des procédés pour la production d'une enzyme leucocytaire humaine de type pepsique.

L'invention a également pour but de fournir un agent thé-

rapeutique pour les troubles allergiques, les maladies avec

immun-complexe et les tumeurs, qui contient une enzyme leucocy-

taire humaine de type pepsique comme ingrédient actif.

Aux dessins annexés donnés uniquement à titre d'exemples: la Fig 1 est un diagramme illustrant les résultats de

l'exemple expérimental 1.

la Fig 2 et la Fig 3 sont des diagrammes illustrant

les résultats de l'exemple expérimental 3.

la Fig 4 est un diagramme illustrant les résultats de la mesure de la protéine urinaire dans l'exemple expérimental 4 o on a déterminé la teneur en protéine urinaire d'après la coloration du papier d'essai et on l'a exprimée en termes de moyenne des indices d'un groupe Ce système d'indice comporte les nombres 0,1, 2, 3 et 4 correspondant respectivement aux

colorations (-), (+), (++), (+++), et (++++).

A la suite dtune recherche intense et prolongée pour mettre au point un agent thérapeutique plus efficace contre les troubles allergiques, les maladies avec immun-complexes et les tumeurs, la Demanderesse a trouvéqu'une enzyme de type pepsique présente dans les leucocytes humains (appelés ci-après enzyme leucocytaire humaine de type pepsique) exerce un effet anti-allergique prononcé et un remarquable effet suppresseur

vis-à-vis des diverses maladies avec imun-complexes, et en mê-

me temps montre un excellent effet anti-tumeur L'invention a

été trouvée dans le cadre des données ci-dessus.

L'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique existe non seulement dans les leucocytes humains, mais également dans

des cellules telles que les promyélocytes leucémiques, de sou-

che HL-60, traitées avec une substance destinée à induire une

différenciation telle que l'actinomycine D, et peut être obte-

nue à partir du liquide surnageant résultant d'un homogénéisai de ces cellules par une combinaison appropriée de procédés usuels utilisés dans la purification des protéines, par exemple le fractionnement par un sel, la chromatographie d'adsorption sur un adsorbant inorganique, la chromatographie d'échange d'ion sur une résine échangeuse d'ions et la chromatographie sur gel avec un effet de tamis moléculaire De plus, l'enzyme peut être obtenue en grandes quantités à partir de cultures de cellules préparées en réunissant des cellules tumorales

avec des cellules produisant une enzyme de type pepsique, tel-

les que des leucocytes humaine ou en appliquant une technique

de génie génétique, par exemple en préparant un ADM complémen-

taire à l'aide de la reverse transcriptase en utilisant comme

copie l'ARN messager pour l'enzyme leucocytaire humaine de ty-

pe pepsique, puis en intégrant cet ADN dans E coli pour produi-

re l'enzyme.

On décrira maintenant à l'aide d'exemples expérimentaux

l'action pharmacologique et la toxicité de cette enzyme leuco-

cytaire humaine de type pepsique.

Exemple expérimental 1 Effet suppresseur sur la production d'anticorps de type Ig E anti-ovalbumine On utilise des groupes de 10 rats mâles Wistar pesant chacun de 180 à 200 g Par voie intra-péritonéale, on injecte

0,1 mg d'ovalbumine avec 20 mg d'un gel d'hydroxyde d'alumi-

nium A partir du lendemain, par voie intraveineuse, on injec-

te l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique, une fois par jour pendant 14 jours Les 7 ème, 10 ème et 14 ème jours après l'administration d'ovalbumine, on prélève des échantillons de

sang et on détermine le taux d'anticorps de type Ig E anti-oval-

bumine dans le sérum par la réaction PCA homologue chez un rat

(anaphylaxie active cutanée) (H Maruyama et al, Folia Phar-

macologica Japonica 74, 179, 1978) Les résultats sont rappor-

tés sur la figure 1.

La production d'anticorps de type Ig E anti-ovalbumine est supprimée de manière significative par l'administration de

l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique.

Exemple expérimental 2 Effet suppresseur sur l'asthme bronchique On utilise des groupes de 10 rats mâles Wistar pesant chacun de 180 à 200 g Par voie intra-péritonéale, on injecte

01 mg d'ovalbumine avec 20 mg d'un gel d'hydroxyde d'alumi-

nium et, à partir du lendemain, par voie intraveineuse on in-

jecte l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique une fois par jour pendant 14 jours Après ces 14 jours, on administre par voie intraveineuse 25 mg/kg d'ovalbumine pour induire un asthme bronchique et on mesure la contraction de la trachée

selon la méthode de Konzett et R 6 ssler (Arch Exptl Path.

Pharmacol 195, 71, ( 1940) On calcule le taux de contraction relatif de la trachée de chaque groupe en évaluant à 100 la contraction du groupe témoin Les résultats sont rapportés dans

le Tableau 1.

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Tableau 1

Taux de contraction de la trachée Dose ' Témoin l O O Enzyme leucocytaire humaine de type pepsique 0,05 mg/kg 73 0,5 mg/kg 49 mg/kg 23 La contraction de la trachée est supprimée de manière significative par l'administration de l'enzyme leucocytaire

humaine de type pepsique.

Exemple expérimental 3 Effet suppresseur sur la néphrite de Masugi Selon la méthode de Suzuki et al (Folia Pharmacologica Japonica 68, 572, 1972), par voie intraveineuse on administre un sérum de rein de lapin anti-rat à des groupes de 10 rats

mâles Wistar, à une dose de 5 ml/kg pour induire une néphrite.

Lorsque la néphrite s'est déclarée, on prélève régulièrement

des échantillons de sang et d'urine pour mesurer les taux d'im-

mun-complexe sérique et de protéine urinaire Par voie intra-

veineuse, on injecte l'enzyme leucocytaire humaine de type

pepsique une fois par jour après l'administration de l'anti-

corps de rein anti-rat et de la même manière on administre au groupe témoin une enzyme leucocytaire humaine de type pepsique,

inactivée Les résultats sont rapportés sur les figures 2 et 3.

Dans les groupes traités avec l'enzyme leucocytaire hu-

maine de type pepsique, on observe une diminution des taux de

protéine urinaire et d'immun-complexe sanguin.

Exemple expérimental 4 Effet suppresseur sur les troubles rénaux spontanés La détermination est faite selon la méthode de Abe et al

(The Ryumachi 14, 43, 1974).

A des groupes de 16 souris femelles de 16 semaines

(NZB x NZW) F 1, on injecte par voie intraveineuse l'enzyme leu-

cocytaire humaine de type pepsique à une dose de 10 mg/kg, une fois par jour On administre de mime une enzyme leucocytaire humaine de type pepsique, inactivée,par voie intraveineuse à

un groupe témoin Toutes les 4 semaines-, on détermine la pro-

S téine urinaire des souris au moyen d'un papier d'essai du com-

merce (Combisticks) Les résultats sont rapportés sur la figu-

re 4 De plus, on sacrifie 6 souris de chaque groupe à l'âge de 32 semaines et on observe l'infiltration cellulaire dans les glomérules rénaux Les autres 10 souris de chaque groupe continuent à recevoir chaque jour la même dose et on détermine le taux de survie à 50 semaines Les résultats sont rapportés

dans le Tableau 2.

On observe que grace à l'administration de l'enzyme leu-

cocytaire humaine de type-pepsique, l'augmentation de la pro-

téîne urinaire est supprimée de manière significative, l'in-

filtration cellulaire après 32 semaines est légère et le taux

de surv 3 e 50 semaines est plus élevé dans les groupes trai-

tés avec l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique Ces résultats indiquent que les troubles spontanés du rein chez les

souris sont supprimés par l'enzyme leucocytaire humaine de ty-

pe pepsique.

Tableau 2

Groupe traité avec l'enzyme leucocytaire Groupe témoin humaine de type pepsique Infiltration Forte infiltra Légère infiltration cellulaire tion dans les autour des parois microlymphocytes vasculaires

et les plasmo-

cytes Taux de survie 20 % 80 %* * p L 0,05 Exemple expérimental 5 Effet suppresseur sur la thyroidite On effectue cette expérience selon la méthode de Kotani

et al (Clinical Immunology 9, ( 8), 635 ( 1977) On soumet cha-

que groupe de 10 rats m les BUF/HDK (âgés de 6 semaines) à une thymectomie et on les expose ensuite à des irradiations aux rayons X de 200 rads chacune, répétées 4 fois toutes les 2 semaines 14 semaines après la thymectomie, on sacrifie les rats pour une exsanguination On isole les glandes thyroïdes et on les enrobe dans un bloc de paraffine, puis on colore

avec de l'hématoxyline-éosine ou de l'azan On évalue la sévé-

rité de la thyroidite avec une note de O a 4 en fonction de l'infiltration des cellules mononucléaires, de la destruction du réticulum endoplasmique et de la fibrose glandulaire Par voie intraveineuse on a administré aux animaux de l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique une fois par jour et on

a administré de même au groupe témoin de l'enzyme leucotytai-

re humaine de type pepsique, inactivée Les résultats sont rap-

portés dans le Tableau 3.

Par rapport au groupe témoin, dans les groupes traités

avec l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique l'appari-

tion et la sévérité de la thyroldite diminuent en fonction de

la dose.

Tableau 3 Présence (%) Sévérité Témoin 90 3,5 0,4 Enzyme leucocytaire humaine de type pepsique 1 mg/kg 80 3,0 + 0,5 3 mg/kg 60 1,9 + 0,2 mg/kg 40 * 1,3 + 0,1 * * p 40,05 ** p 40,01 Exemple expérimental 6 Hydrolyse d'un immun-complexe humain On recueille du sérum de malades atteints de rhumatisme articulaire, de lupus érythémateux systémique et d'hépatite, lesquels maladies s'avèrent avoir un immun-complexe dans leur sérum A 1 ml de sérum, on ajoute l'enzyme leucocytaire humaine

de type pepsique en une quantité de 10, 30 ou 100 pg et on in-

cube le sérum à 37 C pendant 60 minutes Après la réaction, on détermine la quantité d'immun-complexe dans le sérum par la réaction hémolytique d'érythrocytes de mouton en présence de complément de cobaye selon la méthode de Fust et al (Athé- rosclérosis 29, 181, 1978), en utilisant de l'Ig G humaine en

agrégats comme substance de référence Les résultats sont rap-

portés dans le Tableau 4.

Tableau 4

Maladies Rhumatisme articulaire Sérum n Quantité d'enzyme

leucocytaire hu-

maine de type pep-

sique ajoutés (Pg/ml)

Taux d'im-

mun-com-

plexe (pg/ml) below 50 Lupus érythémateux systémique (SLE) o below 50 Tableau 4 (suite) Hépatite 1 O 65 below 50 100 below 50

2 O 70

66

55

51

L'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique réduit la quantité d'immuncomplexe dans le sérum des malades atteints de rhumatisme chronique, de lupus érythémateux systémique et

d'hépatite, en fonction de la dose.

Exemple expérimental 7 Effet sur le développement de cellules MX-1 de cancer du sein

humain, et de cellules leucémiques L 1210 de la souris, culti-

vées. Dans un milieu d'Eagle contenant 10 % de sérum de veau et les substances d'essai, on met respectivement en suspension des cellules MX-1 de cancer du sein humain et des cellules

leucémiques L 1210 de la souris, à une concentration cellulai-

re de 10 /ml On cultive les cellules à 37 C sous 5 % de CO pendant 48 heures Puis on compte le nombre de cellules via bles après coloration avec du Bleu Tripan On calcule le taux d'inhibition du développement selon l'équation suivante, les

résultats sont rapportés dans le Tableau 5.

Nombre de cellules viables Taux d'inhibition dans le groupe traité du développement = ( 1) X 1 OO Nombre de cellules viables dans le groupe témoin

Tableau 5

Taux d'inhibition Concentration du développement ( 5)

MX-1 L 1210

Enzyme leucotytaire 16 7 humaine de type pepsique 30

32 22

*300 55 29

Mitomycine C 100 48 61 L'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique inhibe le

développement des cellules cancéreuses même à une faible con-

centration.

Exemple expérimental 8 Effet sur des souris porteuses de cellules leucémiques P 388 On transplante 105 cellules leucémiques P 388 par voie intrapéritonéale à un groupe de 5 souris males BDF 1 On injecte l'nrzym 2 leuc 3 zytaire humaine de type pepsique aux souris par

voie intraveineuse, deux fois par jour en commençant le lende-

main, jusqu'à la mort des animaux On calcule la durée de vie moyenne et on l'exprime en pourcentage du témoin Les résultats

sont rapportés dans le Tableau 6.

Durée de vie moyenne (%) Nombre moyen de jours de survie du groupe traité Nombre survie

Tableau 6

moyen de jours de du groupe témoin Dose Durée de vie moyenne (mg/kg) (%) Témoin Enzyme leucocytaire humaine de type pepsique Mitomycine C * p L 0, 05 X 100 + 5 0,3 1,0 3,0 0,5

109 + 5

+ 5

124 + 8 *

+ 16 L'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique augmente

nettement la durée de vie moyenne.

Exemple expérimental 9 úffet sur le cancer du sein humain' Mx-1, transplante chez une souris dénudée. Des fragments de 2 mm 2 de cancer du sein humain MX-1 qui ont été sous-cultivés sur des souris dénudées (BALB/C, nu/nu), sont transplantés par voie souscutanée sur le dos d'animaux dans des groupes de 5 souris dénudées de la même souche Deux

semaines plus tard, on administre l'enzyme leucocytaire humai-

ne de type pepsique par voie intraveineuse deux fois par jour pendant 18 jours 18 jours après la première administration de l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique, on isole

les tumeurs et on pèse Les résultats sont montrés dans le Ta-

bleau 7.

Tableau 7

Dose tg/kg) Poids de la tumeur (g) Témoin 1,34 + 0,10 Enzyme leucocytaire humaine de type pepsique 0,3 0,76 + 0,12 *

3,0 0,66 + 0,13 *

*p 40,05 L'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique montre

un effet anti-tumeur significatif même à la plus faible dose.

Exemple expérimental 10 Toxicité aiguë

A des groupes de 10 souris dd Y pesant 20 + 1 g, on ad-

ministre par voie intraveineuse ou intrapéritonéale 2 g/kg de l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique dissoute dans une solution saline physiologique Puis, on met les souris en observation journalière pour réceler tout symptome de toxicité pendant une semaine Pendant cette période, on n'observe aucun signe de toxicité, Tel que décrit dans les exemples expérimentaux, l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique qui est un ingrédient

actif de l'agent pharmaceutique de l'invention supprime nette-

ment la production d'anticorps de type Ig E et montre un effet thérapeutique évident contre l'asthme expérimental De plus,

l'enzyme supprime clairement l'établissement et le développe-

ment de plusieurs maladies qu'on pense être induites par des immuncomplexes, par exemple la thyroldite et la néphrite Et également, cette enzyme leucocytaire humaine de type pepsique

montre un effet anti-tumeur prononcé.

D'après les résultats de l'étude de la toxicité aiguë, la dose requise pour obtenir ces effets est dans une gamme de sécurité suffisante On pense qu'étant donné que cette enzyme

leucocytaire humaine de type pepsique est une protéine d'ori-

gine humaine, elle a peu de risque d'induire des réactions néfastes sérieuses dues à une antigénicité, telles qu'un choc anaphylactique Elle peut donc fournir un agent thérapeutique

trèsutile contre divers troubles allergiques comprenant l'as-

thme bronchique, l'urticaire, le rhume des foins, la dermati-

te de contact, l'allergie alimentaire, l'allergie aux médica-

ments, la rhinite allergique, la pneumonite par hypersensibi-

lité, différentes maladies avec immun-complexe telles que le

lupus érythémateux systémique, le glomérulonéphrite avec immun-

complexe, la périartérite noueuse, le rhumatisme articulaire, l'hépatite avec immun-complexe, la thyroidite, la maladie du sérum, la myasthénie grave et différentes tumeurs telles que le cancer de l'estomac, le cancer du poumon, le cancer du foie,

le cancer du colon, le cancer du sein, le cancer de la prosta-

te, le cancer de l'utérus, le cancer de la vessie, la leucémie,

le cancer de l'oesophage, le lymphome.

L'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique peut être préparée comme suit On fait passer le produit surnageant d'un

homogénéisat de leucocytes humains sur une colonne de DEAE-

cellulose équilibrée avec une solution de tampon à l'acétate 0,1 M (p H de 5,3) pour adsorber l'enzyme On élue l'enzyme avec

la même solution tampon contenant 0,5 M de chlorure de sodium.

On peut concentrer i'éluat et le purifier ensuite par chroma-

tographie sur gel sur une colonne de Sephadex G-100 gonflé

avec une solution saline physiologique à 0,9 S% L'enzyme leu-

cocytaire humaine de type pepsique s'avère avoir une masse moléculaire de 35 000 à 41 000 par chromatographie sur gel sur Sephadex G-100; un point isoélectrique dans la gamme de p H de 2,5 à 3,5 par concentrationisoélectrique sur Ampholine; une adsorption maximale-à 278 nm; elle montre en outre une réaction positive à la ninhydrine et est facilement soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther et le chloroforme De plus, l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique montre une forte activité hydrolytique vis-à-vis de l'hémoglobine dans une gamme acide de p H inférieur à 7,0 et wn p H optimal

est compris entre 2,0 et 3,5.

L'agent de l'invention est généralement préparé sous la

forme d'une solution injectable et est injecté par voie intra-

veineuse, souscutanée, intramusculaire ou intra-articulaire

ou sur le Pite local d'une tumeur elle-même Mais il peut éga-

lement être utilisé sous la forme d'un agent oral, d'un agent à inhaler ou d'un suppositoire rectal La dose journalière de l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique est de 1 à 1 000 mg, de préférence de 50 à 500 mg, mais elle peut être augmentée ou diminuée de manière appropriée, selon l'âge, les

symptomes et le mode-d'application.

L'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique peut être formulée en un agent pharmacologique par un procédé classique

avec tout véhicule ou excipient pharmaceutique classique.

Des préparations pour injection peuvent inclure des pré-

parations lyophilisées qui sont dissoutes au moment de l'ad-

ministration et des préparations liquides; on préfère égale-

ment des préparations à libération commandée pour maintenir

une concentration efficace prolongée.

Les préparations orales peuvent se présenter sous la for-

me de gélules de comprimés, de granules, de poudres ou de pré-

pirations orales liquides; elles sont de préférence sous la

forme de corps d'inclusion de liposomes dans le but de pro-

mouvoir l'absorption.

Les agents à inhaler sont de préférence sous la forme de préparations lyophilisées; pour une administration rectale,

on préfère la forme de suppositoires.

L'invention est illustrée par les exemples suivants.

Exemple 1

On met des cellules leucémiques HL-60 ( 101 cellules) préalablement traitées avec de l'Actinomycine D en suspension dans un litre de solution saline physiologique à 0,9 % et on les détruit dans un homogénéiseur On concentre le liquide surnageant obtenu par centrifugation ( 10 000 tours/minute, 30 minutes) et on dessale en utilisant un ultraconcentrateur

(Millipore, Diaflow Modèle 202) On verse la solution concen-

trée sur une colonne de DEAE-cellulose ( 10 x 50 cm) équili-

bz ave unr e solution de tampon de phosphate 0,01 M (de p H 7,0).

On lave la colonne avec 4 litres de la même solution tampon contenant 0,1 M de Na C 1 et on élue une fraction active avec

la même solution tampon contenant 0,4 M de Na Cl Puis on ver-

se la fraction active sur une colonne de Sephadex G-100 ( 10 x 90 cm) équilibrée avec une solution saline physiologique à 0,9 %, apyrogène, et on soumet à une filtration sur gel pour

obtenir 50 mg de l'enzyme de type pepsique L'activité spéci-

fique de l'enzyme de type pepsique est de 1930 U/mg, mesurée selon la méthode d'Anson (J Gen Physiol 22, 79, 1938) en utilisant de la pepsine de Swine comme substance de référence

et de l'hémoglobine dénaturée comme substrat.

Exemple 2

On met des leucocytes humains ( 100 cellules en suspen-

sion dans une solution 2 Om M de tampon Tris-H Cl (de p H 7,4) contenant 1 % de Triton X-100, 10 m M d'un complexe de vanadyle,

3 m M d'acétate de magnésium, 10 m M de Ma Cl et 5 % de saccha-

rose et on détruit les cellules dans un homogénéiseur en Te-

flon On recueille la fraction polysomale par centrifugation

de l'homogénéisat et on extrait le m-ARN avec du phénol à par-

tir de la fraction polysomale, avant de précipiter avec de l'éthanol A ce précipité, on ajoute une solution 0,2 M de tampon Tris-H Cl (de p H 9,0) contenant 0,5 % de SOS, 0,O 1 M d'EDTA et 50 m M de Na C 1 et on incube le mélange à 70 C pen-

dant 3 minutes On adsorbe cette solution de m-ARN sur une co-

lonne d'oligo(d T) cellulose On lave la colonne et on élue

avec une solution 10 m M de tampon Tris-H Cl (de p H 7,4) conte-

nant 0,5 % de SDS et 1 m M d'EDTA pour obtenir une fraction de m-ARN contenant le Poly A On fractionne ensuite cet m-ARN par un gradient de densité de saccharose à une concentration de 5 à 25 % On analyse les fractions quant à l'activité en

m-ARN correspondant à l'enzyme de type pepsique dans le sys-

tème de synthèse de la protéine des ovocytes de Xenopus, et on obtient une fraction active On ajoute 5 jg du m-ARN de

l'enzyme de type pepsique ainsi préparé à 100 O Ol d'une solu-

tion 40 m M de tampon Tris-H Cl (p H de 7,5) contenant 1 pg d'o-

ligo (DT)10, 5 m M de mercapto-éthanol, 0,5 m M de désoxy-adé-

nine triphosphate (d ATP), désoxy-thymine triphosphate (d TTP),

désoxy-guanidine triphosphate (d GTP) et désoxy-cytosine tri-

phosphate (d CTP) et 10 unités de reverse transcriptase (ANV-

RT) et on incube à 42 C pendant 90 minutes Lorsque l'incuba-

tion est terminée, on sépare 'ARN par déprotéination et un traitement alcalin pour obtenir l'ADN complémentaire On incube alors cet ADN dans le même milieu que celui utilisé dans la préparation de l'ADN complémentaire ci-dessus (à condition

qu'il n'y ait pas d'oligo (d T)O 10) pour obtenir un ADN complé-

mentaire bicaténaire Après un traitement avec 0,25 unité de nucléase SI, on ajoute l'ADN complémentaire bicaténaire à 30 p 1 d'une solution d'acide cacodylique 140 m M (de p H 7,6) contenant 5 unités de terminal transférase, 1 m M de d ATP, 0,1 m M de dithiothréitol, 30 m M de trihydroxylamine et 1 m M de chlorure de cobalt et on incube à 37 C pendant 15 minutes

pour effectuer l'addition des chaînes de désoxyadénine.

D'autre part, on traite 3 pg d'ADN plasmique p BR 322 de E.coli avec 0,25 unité de Eco RI à 37 C pendant 20 heures et on incube ensuite avec 17,5 unités d'une exonucléase à O C pendant 90 minutes Lorsque l'incubation est terminée, on obtient un ADN plasmique à chaîne de désoxythymidine de la

même manière que dans la préparation de l'ADN à cha ne de dé-

soxyadénine (à condition d'utiliser du d TTP au lieu de d ATP).

l'ADN plasmique à chaîne de désoxythymidine ainsi pro-

duit et l'ADN à chaîne de désoxyadénine ci-dessus sont asso-

ciés par traitement à 65 C pendant 2 minutes, à 46 C pendant minutes, à 37 C pendant 60 minutes et à 23 C pendant minutes dans une solution tampon 50 m M de Tris-H Cl (de p H

7,5) contenant 5 m M d'EDTA et 0,1 M de Na Ci.

Puis on transforme E coli NIHJ C-2 en utilisant 1 'ADN plasmique recombiné et on clone à partir d'une souche 5 000 résistant à l'ampicilline On introduit l'ADN cloné dans E. coli en reliant au site promoteur du tryptophane opéron selon la méthode de Goeddel et al (Nature, 287, 411, 1980) Dans un

milieu LB contenant 20 mg/1 d'ampicilline, on cultive une sou-

che (E-931) qui montre une production de l'enzyme de type pep-

sique à des concentrations élevées A partir du liquide sur-

nageant résultant de l'homogénéisat de 17 kg de cellules cul-

tivées, on obtient 355 g de l'enzyme de type pepsique de la

même manière que dans l'exemple 1.

Exemple 3

On dissout 1 gramme d'enzyme leucocytaire humaine de ty-

pe pepsique dans 100 ml de solution saline physiologique et on

filtre dans des conditions aseptiques sur un filtre à membrane.

On place des portions d'un ml de filtrat dans des récipients

en verre stérilisés et on scelle après lyophilisation pour ob-

tenir des préparations en poudre lyophilisées.

Exemple 4

On pèse 1 gramme de l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsine, 7 g de lactose et 3 g de stéarate de magnésium et on mélange uniformément Puis, on incorpore des portions de 200 mg de ce mélange dans des gélules de gélatine n 2 et on applique

un revêtement entérique pour obtenir des gélules entériques.

Exem Dle 5

On mélange de la lécithine de jaune d'oeuf, du choles-

térol et du phosphate de diacétyle dans un rapport molaire de

7:2:1 et on dissout 100 mg du mélange dans 12,5 ml de chloro-

forme A partir de cette solution, on forme un mince film sur la paroi d'une fiole On prépare une dispersion en mélangeant

ce film avec 25 ml de solution de tampon de phosphate conte-

nant 100 mg de l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsine.

Après un traitement aux ultrasons, on centrifufe la dispersion à 110 000 g On met le précipité résultant en suspension dans 3 ml d'une solution saline physiologique et on stérilise pour

obtenir une préparation pour liposome contenant l'enzyme leu-

cocytaire humaine de type pepsique.

R EV EN D I C A T I O N S

1 Enzyme leucocytaire humaine de type pepsique ayant les propriétés suivantes: a) une masse moléculaire de 35 000 à 41 000, b) un point iosélectrique de p H 2,5 à 3,5, c) une absorption maximale à 278 nm, d) une réaction positive à la ninhydrine,

e) elle est facilement soluble dans l'eau et inso-

luble dans l'éther et le chloroforme, f) un aspect pulvérulent blanc, et

g) une activité anti-allergique, contre les mala-

dies avec immun-complexe et contre les tumeurs,

sous une forme pratiquement purifiée.

2 Procédé de préparation d'une enzyme de type pepsique

à partir de leucocyte humain.

3 Procédé de préparation d'une enzyme de type pepsique

par un procédé génétique.

4 Composition thérapeutique pour le traitement des troubles allergiques, des maladies avec immun-complexe et des

tumeurs, caractérisée en ce qu'elle comprend une enzyme leucocy-

taire humaine de type pepsique sous une forme pratiquement pu-

rifiée, en tant qu'ingrédient actif.

Composition thérapeutique selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'enzyme leucocytaire humaine de type pepsique a les propriétés suivantes: a) une masse moléculaire de 35 000 à 41 000, b) un point isoélectrique de p H 2,5 à 3,5, c) une absorption maximale A 278 nm, d) une réaction positive à la ninhydrine,

e) elle est facilement soluble dans l'eau et inso-

luble dans l'éther et le chloroforme, f) un aspect pulvérulent blanc, et

g) une activité anti-allergique, contre les mala-

dies, avec immun-complexe et contre les tumeurs.

6 Composition thérapeutique selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'un ou

de plusieurs excipients et/ou adjuvants avec l'enzyme leucocy-

taire humaine de type pepsique.

7 Composition thérapeutique selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que la composition est sous la forme

d'une préparation pour injection, d'une préparation pour ad-

ministration orale d'un suppositoire ou d'une préparation à inhaler.