FI89063C - Foerfarande foer framstaellning av peptidderivat av hirudin som hindrar koagulationen i blod - Google Patents

Description

, 89063

Mentelmä syklisten veren hyytymistä estävien hirudiinin pept idij ohdanna i Sten valmi stamiseksi Tämä keksintö koskee uusien syklisten peptidien 5 valmistamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia veren hyytymistä estäviä aineita (antikoagulantteina).

Veren hyytymistä estävät aineet ovat käyttökelpoisia terapeuttisia aineita esimerkiksi akuutin syvän laskimotukoksen, keuhkoveritulpan, raajojen akuuttien valti-10 motukosten, sydäninfarktin ja sairauden, jossa veri hyytyy useassa elimistön kohdassa yhtäaikaa (DIC), farmakologisessa hoidossa. Antikoagulanttien ennaltaehkäisevän antamisen uskotaan estävän veritulpan uusiutumisen potilailla, joilla on reumaattinen tai verisuonten kalkkiutu-15 misesta johtuva sydänsairaus, ja estävän kirurgian yhteydessä tiettyjä, veren hyytymisestä muodostuvien tulppien aiheuttamia komplikaatioita. Veren hyytymistä estävien aineiden antaminen on myös ollut aiheellista sepelvaltimon ja aivoverisuonien sairauksien hoidossa. Valtimotu-20 kos, erityisesti sydänlihasta ja aivoja ravitsevissa valtimoissa, on huomattava kuoleman aiheuttaja.

Hirudiini on 65 aminohappotähdettä sisältävä poly-peptidi, joka on eristetty verijuotikkaiden sylkirauhasista. Se on veren hyytymistä estävä aine ja trombiinin 25 spesifinen estäjä. Verijuotikasuutteista eristetyn hirudiinin, vaikka se onkin melko tehokasta, kliininen käyttö näyttää epätodennäköiseltä, koska sitä on vähän, se on kallista ja aiheuttaa allergisia reaktioita niin kuin tavallisesti minkä tahansa tämän kokoisen vieraan proteii-: 30 nin antaminen.

Hakijat ovat löytäneet hirudiinistä tarkoin määrätyn alueen, joka saa aikaan, ainakin osaksi, sen veren hyytymistä estävän vaikutuksen. Tämä alue on syntetisoitu kemiallisesti ja eräät sen syklisistä analogeista näyttä--35 vät sitoutuvan trombiinin tunnistamiskohtaan, mutta eivät 2 89063 entsymaattiseen pilkkomiskohtaan,joka on avaruudellisesti erillään. Synteettisten peptidien sitoutuminen kilpaillen (kompetitiivisesti) estää fibrinogeenin sitoutumisen trombiinin tunnistamiskohtaan, mikä on edellytys 5 fibriinin tuotannolle ja hyytymän muodostumiselle. Tämän keksinnön peptideillä on merkittävä veren hyytymistä estävää vaikutusta, ja niiden epätavallinen kyky sitoutua trombiinin tunnistamiskohtaan ilman, että ne sitoutuvat sen pilkkomiskohtaan, saattaa antaa tieteellisesti mie- 10 lenkiintoisen ja terapeuttisesti merkittävän avun veren hyytymistä estävään hoitoon.

Tämä keksintö koskee hirudiinin johdannaisten valmistamista, joilla on rakennekaavat A, B tai C: 15 A* CO-A5—Ae-NRi'

X-A1-A2-A3 - N(Ri)-C-lf L R^C-CO - A8-A9-A10-Y

I I

20 Alki-B-- Alk2 , B. CO-A5—A6-NRi'

25 X-A1-A2-A3 - N(R 1)-0^ L R^C-CO - A8-A9-A10-Y

I >

Alki Alk2 I 1

B B

30 I I

Alk2 Alk-j

Y-A-io-Ag-As —CO-ci· L D ^C-N(Ri) - A3-A2-A,-X

I I

NRi' — Ae — A5 — CO tai 3 89063 c. co—A5—A6-NR<|'

X-ArA2-A3 - N(R1)-C-'Rr L R^C-CO - A8-A9-A10-Y

5 I 1

Alki Alk2

I I

B B

I I

Al^ Alk2 10 --'D * --

X-Ai-A2-A3 — N(Ri)-C-R R'-C-CO - Ae-Ag-A10-Y

I l CO-As — Ae — NRi' jossa 15 X on aminoterminaalinen tähde, joka valitaan ve dystä, l:stä 6:een hiiliatomia sisältävästä, yhdestä tai kahdesta alkyyllryhmästä, 2:sta 10:een hiiliatomia sisältävästä, yhdestä tai kahdesta asyyliryhmästä, karbobent-syylioksista tai t-butyylioksikarbonyylistä; 20 A! on sidos tai Gly-Asp; A2 on Phe; A3 on Glu; A5 on Ile; A6 on Pro; 25 A8 on Glu; A, on Tyr-Leu; A10 on sidos tai Gin; Y on karboksiterminaalainen tähde, joka valitaan OH:sta, (Ci.gJ-alkoksista, aminos ta, mono- tai di-iC^.,)- 30 alkyylillä substituoidusta amlnosta tai bentsyyliaminos-ta; R, R1, Rj ja Rj1 valitaan jokainen vedystä tai ()-alkyyllryhmästä; B valitaan -S-:stä, -S-S-:stä tai S-Alk3-S-:stä; 35 Alk3, Alk2 ja Alk3 valitaan jokainen (C^gJ-metylee- niryhmästä; 4 89063 ja jossa "D" ja "L" ilmaisevat, että osoitetun hiilen stereokemia vastaa D-kysteiinin ja L-kysteiinin stereokemiaa, tässä järjestyksessä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomais-5 ta, että kaavan Aj mukainen, sopivasti suojattu aminohappo sidotaan aktivoituun hartsikantajaan, myöhemmin kaavojen A2-A10 mukaiset muut alfa-aminosuojatut aminohapot sidotaan kasvavan peptidiketjun, josta on sillä välin poistettu sen aminon suojaryhmä, terminaaliseen aminoryh-10 mään, ja lopuksi lineaarinen peptidi altistetaan hapettavalle kytkennälle.

Koko tämän patenttiselityksen ajan aminohapoista käytetään seuraavia yleisiä lyhenteitä;

Gly - glysiini 15 Ala - alaniini

Vai - väliini Leu - leusiini Ile - isoleusiini Pro - proliini 20 Phe - fenyylialaniini

Trp - tryptofaani Met - metioniini Ser - seriini Thr - treoniini 25 Cys - kysteiini

Tyr - tyrosiini Asn - asparagiini Gin - glutamiini Asp - asparagiinihappo . 30 Glu - glutamiinihappo

Lys - lysiini Arg - arginiini His - histidiini Nle - norleusiini 35 Hyp - hydroksiproliini 5 89065 3,4-dehydroPro - 3,4-dehydroproliini Tyr(S03H) - tyrosiinisulfaatti Pgl - fenyyliglysiini NMePgl - N-metyylifenyyliglysiini 5 Sar - sarkosiini (N-metyyliglysiini) pSubPhe - para-substitutoitu fenyylialaniini SubPhe - orto-, meta- tai para- mono- tai disubs-tituoitu fenyylialaniini DAIa - D-alanlini 10 Ac - asetyyli

Sue - sukkinyyli pCIPhe - para-kloorifenyylialaniini PN02Phe - para-nitrofenyylialaniini Pen - penisillamiini (β,β-dimetyylikysteiini) 15 DCys - D-kysteiini

Alkyyliryhmän ja alkoksiryhmän alkyyliosan katsotaan käsittävän suorat, haarjoittuneet tai sykliset al-kyyliryhmät, esimerkiksi metyyli, etyyli, propyyli, iso-propyyli, butyyli, isobutyyli, tert-butyyli, pentyyli, 20 isopentyyli, sec-pentyyli, syklopentyyli, heksyyli, iso-heksyyli, sykloheksyyli ja syklopentyylimetyyli. 2:sta 10:een hiiliatomia sisältävän asyyliryhmän katsotaan käsittävän suorat, haaroittuneet, sykliset, tyydyttyneet ja tyydyttymättömät asyyliryhmät, joissa on ryhmää kohti 1 25 tai 2 karbonyyliosaa, esimerkiksi asetyyli, bentsoyyli ja sukkinyyli. Termi "(C^eJ-metyleeniryhmä" merkitsee kaksiarvoista ryhmää, joka on saatu avoketjuisesta tai syklisestä, tyydyttyneestä tai tyydyttymättömästä alkyyliryh-mästä, jossa on l:stä 8:aan hiiliatomia, poistamalla kä-30 sitteellisesti alkyyliryhmästä kaksi vetyatomia yhdestä hiiliatomista tai kahdesta vierekkäisestä hiiliatomista. Tämän keksinnön (C^J-metyleeniryhmiä ovat esimerkiksi metyleeni tai metylideeni (-CH2-), etylideeni (CH3CH<), 1-metylietylideeni (CH3C(CH3)<), 1-metyylipropylideeni 35 tai sec-butylideeni (CH3CH2C(CH3)<), 2,2-dimetyylipropyli- 6 89063 deeni tai neopentylideenl (CH3C(CH3)2CH<), etyleeni tai dimetyleeni ( -CH2CH2-), metyylietyleeni (-CH2CH(CH3)-), etyylietyleeni (-CH2CH(C2H5)-), etenyleeni tai vinyleeni (-CH-CH-), 1,1-etenylideani (CH2»C<), 1,1-sykloheksyli-5 deeni (C6H10<) ja 1,2-syklopentylideeni (C5He<). Halogeeni-ryhmä on fluori-, kloori-, bromi- tai jodiryhmä.

Tässä käytetty termi "mikä tahansa aminohappo" käsittää luonnossa esiintyvät aminohapot, samoin kuin muutkin "ei-proteiini"-a-aminohapot, joita peptidikemian 10 asiantuntijat tavallisesti käyttävät valmistaessaan luonnossa esiintyvien peptidien synteettisiä analogeja. Luonnossa esiintyviä aminohappoja ovat glysiini, alaniini, väliini, leusiini, isoleusilni, soriini, metioniini, treoniini, fenyylialaniini, tyrosiini, tryptofaani, kys-15 telini, proliini, histidiini, asparagiinihappo, aspara-giini, glutamiinihappo, glutaniini, arginiini, ornitiini ja lysiini. "Ei-proteiini"- a-aminohappoja ovat esimerkiksi norleusiini, norvaliini, alloisoleusiini, homoargi-niini, tiaproliini, dehydroproliini, hydroksiproliini 20 (Hyp), homoseriini, sykloheksyyliglysiini (Chg), a-amino-n-voihappo (Aba), sykloheksyylialaniini (Cha), aminofe-nyylivoihappo (Pba), fenyylialaniinit, jotka on mono- tai disubstituoitu fenyyliosan orto-, meta- tai para-asemasta (C^ )-alkyyli-, (C^ )-alkoksi-, halogeeni- tai nitroryh-25 millä tai metyleenidioksiryhmällä, S-(2- ja 3-tienyyli)-alaniini, B-(2 ja 3-furanyyli)alaniini, B-(2-, 3- ja 4-pyridyyli)alaniini, B-bentsoetienyl-2- Ja 3-yyli)alaniini, S-(1- ja 2-naftyyli)alaniini, seriinin, treoniinin tai tyrosiinin O-alkyloidut johdannaiset, S-alkyloitu 30 kysteiini, tyrosiinin O-sulfaattiesteri, 3,5-dijodityrosiini ja luonnossa esiintyvien aminohappojen D-isomeerit.

Termi "lipofiilinen aminohappo" sisältää Tyrin, Tyr(S03H):N Phe:n, Leu:n, Nle:n, Hein, Valin, Hisin ja Proin.

7 89063

Luonnon aminohapoissa on, glysiiniä lukuunottamatta, kiraalinen hiiliatomi. Ellei nimenomaan toisin mainita, tässä käsiteltävillä optisesti aktiivisilla aminohapoilla on L-konfiguraatio. Esimerkiksi millä tahansa ryh-5 män Ax tai A10 aminohapolla voi olla D- tai L-konfiguraatio. Tässä peptidien rakenne esitetään, kuten tavallista, niin, että aminoterminaalinen osa on ketjun vasemmalla puolella ja karboksiterminaalinen osa on ketjun oikealla puolella.

10 Termin "dimeerit" tarkoitetaan merkitsevän niitä peptidejä, jotka saadaan, kun kaksi erillistä lineaarista peptidiä liittyy yhteen syklisointivaiheen aikana joko "head to head"- tai "head to tail" -tavalla. "B"-ryhmän kautta tapahtuvan halutun sisäisen syklisoinnin suoritta- 15 misen aikana joku lineaarinen lähtöainepeptidi liittyy mieluummin toiseen lineaariseen lähtöainepeptidiin kuin itseensä. Saatu tuote on "dimeeri" siinä mielessä, että se on muodostunut kahdesta lineaarisesti lähtöpeptidistä, mutta se ei ole dimeeri siinä mielessä, että dimeerin mo- 20 lekyylikaava on täsmälleen kaksi kertaa monomeerin mole-kyylikaava. Tämän keksinnön peptidijohdannaisten dimee-rillä on rakennekaava: CO-A5—Ae-NRi*

X-A1-A2-A3 - N(Ri)-C-lf L R^C-CO - A8-A9-Aio-Y

I I

Alki Alk2

I I

B B

30 I I

Alk2 Alki L o *—

Y-Aio-A9-A8 —CO-C-R' R-C-N(Ri) — Aj-A^-Af-X

I I

35 NRi' — Ae — A5 — CO

"Head to tail"-dimeeri β 89063 CO-As —A*-NRi' L-.

X-A1-A2-A3 - N(Ri)-C-R R'*C-CO - Ae-Ag-Aio-Y

I I

K Alki Alk2

5 I I

B B

I I

Alki Alk2

D l--"*J

10 X-A1-A2-A3 — N(Ri)-C-R R'-C-CO - A8-Ag-A10-Y

I l .

CO-A5 — Ας — NRi' "Head to head"-dimeeri 15 joissa substituentit ovat samoja kuin edellä on määritelty rakenteelle 1. Koko tämän selityksen ajan viittaus peptidijohdannaisiin sisältää dimeerit ja seokset ellei lauseyhteys edellytä toisin. Vaikka syklisointi-vaiheesta saatavat monomeerin ja dimeerin seokset voi-20 daan erottaa helposti alan asiantuntijoille tunnetuin keinoin, tämän keksinnön mukaisissa veritulppia ehkäisevissä koostumuksissa voidaan käyttää seoksia niitä erottamatta.

Kaavan 1 mukaiset polypeptidit voivat muodostaa 25 farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja minkä tahansa myrkyttömän, orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa. Valaisevia esimerkkejä epäorgaanisista hapoista, jotka muodostavat sopivia suoloja, ovat vetykloridi-, vety-bromidi-, rikki- ja fosforihappo ja happamat metalli-30 suolat, kuten esimerkiksi natriummonovetyortofosfaatti ja kaliumvetysulfaatti. Sopivia suoloja muodostaviin orgaanisiin happoihin kuuluvat esimerkiksi mono-, di-ja trikarboksyylihapot. Valaisevia esimerkkejä tällaisista hapoista ovat etikka-, hydroksietikka-, maito-, 9 89063 palorypäle-, maloni-, meripihka-, glutaari-, fumaari-, omena-, viini-, sitruuna-, askorbiini-, maleiini-, hyd-roksimaleiini-, bentsoe-, hydroksibentsoe-, fenyyli-etikkakaneli-, salisyyli-, 2-fenoksibentsoe- ja sulfo-5 nihapot, kuten esimerkiksi metaanisulfonihappo ja 2- hydroksietaanisulfonihappo. Aminohappo-osan terminaalinen karboksiryhmän suoloihin kuuluvat myrkyttömät kar-boksyylihapposuolat, jotka ovat muodostuneet minkä tahansa sopivan epäorgaanisen tai orgaanisen emäksen 10 kanssa. Näihin suoloihin kuuluvat kuvaavasti alkalime- tallien, esimerkiksi natriumin ja kaliumin suolat; maa-alkalimetallien, kuten kalsiumin ja magnesiumin suolat; ryhmän IIIA kevytmetallien suolat aluminium mukaan lukien; ja orgaanisten primaaristen, sekundaaristen ja 15 tertiääristen amiinien suolat, esimerkiksi trialkyyli- amiinien suolat, trietyyliamiinin, prokaiinin, dibent-syyliamiinin, 1-etenamiinin, N,N'-dibentsyylietyleeni-diamiinin, dihydroabietyyliamiinin, N-(alempi)alkyyli-piperidiinin ja minkä tahansa sopivan amiinin suolat 20 mukaan lukien.

Kuten kemiallisten yhdisteiden minkä tahansa yleisen ryhmän kohdalla tietyt ryhmät ovat edullisia. Hakijat pitävät edullisina niitä kaavan 1 mukaisia pep-tidijohdannaisia, joissa .25 x on vety, asetyyli tai sukkinyyli.

Edullisia ovat myös ne kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa

Ai on -Gly-Asp-, Y, OH tai NH2; ja 30 B on -S-S-.

10 89063 Tämän keksinnön mukaiset peptidit voidaan valmistaa eri menetelmillä, jotka alan asiantuntijat ilman muuta tuntevat. Tällaisiin menetelmiin kuuluvat kiinteän faasin jaksolliset ja "block" synteesit, geenikloonaus ja 5 näiden tekniikkojen yhdistelmät. Kiinteän faasin jaksollinen menetelmä voidaan suorittaa vakiintuneita automatisoituja menetelmiä, kuten automatisoitua peptidin syntetisointilaitetta käyttäen. Tässä menetelmässä <*-aminosuojattu aminohappo sidotaan hartsikantajaan.

10 Käytettävä hartsikantaja voi olla mitä tahansa sopivaa hartsia, jota käytetään tavanomaisesti alan piirissä polypeptidien kiinteän faasin valmistamisessa, edullisesti se on polystyreeniä, joka on ristiinsidottu 0,5:stä noin 3:een prosentilla divinyylibentseeniä, ja 15 se on joko kloorimetyloitu tai hydroksimetyloitu, jotta on saatu kohtia, jotka muodostavat esterin alussa tuotetun rt-aminosuojatun aminohapon kanssa.

Esimerkin hydroksimetyylihartsista esittävät Bodanszky et ai., Chem. Ind (London) 38 (1966) 1597-98.

20 Kloorimetyloitua hartsia on kaupallisesti saatavilla Bio Rad Laboratories'ista, Richmond, Kalifornia, ja tällaisen hartsin valmistamisen kuvaavat Stewart et ai., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), luku 1, s. 1-6. Suojatut aminohapot 25 voidaan sitoa hartsiin Gisin'in, Helv. Chem. Acta, 56 (1973) 1476, menetelmällä. Monia hartsiin sidottuja suojattuja aminohappoja on kaupallisesti saatavilla. Esimerkiksi tämän keksinnön mukaisen polypeptidin, jossa karboksiterminaalinen pää on Thr-tähde, valmistamisessa 11 89063 voidaan käyttää tert-butyylioksikarbonyylillä (Boc) suojattua Thr:ä, joka on sidottu bentsyloituun, hydroksi-metyloituun fenyyliasetamidometyyli (PAM)-hartsiin, ja sitä kaupallisesti saatavilla.

5 ö<-aminosuojatun aminohapon hartsiin kytkemisen jälkeen suojaryhmä poistetaan mitä tahansa sopivaa menetelmää käyttäen, esimerkiksi käyttämällä trifluori-etikkahappoa metyleenikloridissa, trifluorietikkahappoa yksinään tai HCl:a dioksaanissa. Suojaus poistetaan läm-10 pötilassa, joka on 0 °C:n ja huoneen lämpötilan välillä.

Erityisen o(-aminon suojaryhmien poistamiseen voidaan käyttää muita lohkaisevia perusreagenssejä ja olosuhteita. o(-aminon suojaryhmän poistamisen jälkeen muut aminosuo-jatut aminohapot kytketään asteittain halutussa järjes-15 tyksessä. Vaihtoehtoisesti monet aminohapporyhmät voidaan kytkeä liuosmenetelmällä ennen kytkemistä hartsiin, joka pitää yllä aminohappojärjestyksen.

c<-aminon suojaryhmä, jota käytetään jokaisessa polypeptidijonoon tuodussa aminohapossa, voi olla mikä 20 tahansa tällainen alan piirissä tunnettu suojaryhmä.

Mahdollisena pidettäviä suojaryhmiä d'-aminon suojaryhmä-luokista ovat (1) asyylityyppiset suojaryhmät, kuten -. esimerkiksi: formyyli, trifluoriasetyyli, ftalyyli, tolueenisulfonyyli (tosyyli), bentseenisulfonyyli, nitro-25 fenyylisulfenyyli, trityylisulfenyyli, o-nitrofenoksi-asetyyli ja Λ-klooributyryyli? (2) aromaattiset uretaa-nityyppiset suojaryhmät, kuten esimerkiksi bentsyyli-oksikarbonyyli ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyyli-30 karbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli, p-metoksi-bentsyylioksikarbonyyli, 1-(p-bifenylyyli)-1-metyyli-.·;· etoksikarbonyyli, <<,<i-dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyyli- oksikarbonyyli ja bentshydryylioksikarbonyyli; (3) ali-faattiset uretaanisuojaryhmät, kuten esimerkiksi tert-35 butyylioksikarbonyyli (Boc), di-isopropyylimetoksi- karbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikarbonyyli 12 89063 ja allyylioksikarbonyyli; (4) sykloalkyyliuretaanityyp-piset suojaryhmät, kuten esimerkiksi syklopentyylioksi-karbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja sykloheksyyli-oksikarbonyyli; (5) tiouretaanityyppiset suojaryhmät, 5 kuten esimerkiksi fenyylitiokarbonyyli; (6) alkyylityyp-piset suojaryhmät, kuten esimerkiksi trifenyylimetyyli (trityyli) ja bentsyyli; ja (7) trialkyylisilaaniryhmät, kuten esimerkiksi trimetyylisilaani. Edullinen <K-aminon suojaryhmä on tert-butyylioksikarbonyyli.

10 Sopivan kytkentäreagenssin valitseminen on alan asiantuntemuksen piirissä. Erityisen sopiva kytkentä-reagenssi silloin, kun lisättävä aminohappo on Gin,

Asn tai Arg, on N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja 1-hydroksibentsotriatsoli. Näiden reagenssien käytöllä 15 estetään nitriilin ja laktaamin muodostuminen. Muita kytkentäreagesseja ovat (1) karbodi-imidit (esim. N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N1-(V-dimetyyli-aminopropyylikarbodi-imidi); (2) syanaraidit (esim. N,N-dibentsyylisyanamidi); (3) keteniimiinit; (4)isoksat-20 soliumsuolat (esim. N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsolium-3'-sulfonaatti); (5) aromaattisluontoiset monosykliset typpeä sisältävät heterosykliset amidit, joiden renkaassa on yhdestä neljään typpiatomia, kuten esimerkiksi imidatsolidit, pyratsolidit ja 1,2,4-triatsolidit.

25 Erityisiin käyttökelpoisiin heterosyklisiin amideihin kuuluvat N,N'-karbonyyl9idi-imidatsoli ja N,N-karbo-nyyli-di-l,2,4-triatsoli; (6) alkoksiloitu asetyleeni (esim. etoksiasetyleeni); (7) reagenssit, jotka muodostavat seka-anhydridin aminohapon karboksyyliosan kans-30 sa (esim. etyyliklooriformaatti ja isobutyylikloori-formaatti) tai kytkettävän aminohapon symmetrinen anhydridi (esim. Boc-Ala-O-Ala-Boc) ja (8) typpeä sisältävät heterosykliset yhdisteet, joissa on hydroksi-ryhmä yhdessä rengastypessä (esim. N-hydroksiftaali-35 imidi, N-hydroksisukkinimidi ja 1-hydroksibentsotriatsoli) . Kapoor, J. Pharm. Sei. 59 (1970) s. 1-27, esit- 13 89063 tää muita aktivointireagenssejä ja niiden käyttöä peptidi-kytkennässä. Hakijoista kytkentäreagenssina on edullista käyttää symmetristä anhydridiä kaikkiin muihin aminohappoihin paitse Argriin, Asn:iin ja Gin:iin.

5 Jokaista suojattua aminohappoa tai aminohappo- jonoa pannaan kiinteän faasin reaktoriin noin nelinkertainen ylimäärä, ja kytkentä suoritetaan väliaineessa, jossa on dimetyyliformamidia ja metyleenikloridia (1:1) tai pelkästään dimetyyliformamidia tai edullisesti pel-10 kästään metyleenikloridia. Tapauksissa, joissa kytkeytyminen on epätäydellistä, kytkentämenettely toistetaan ennen o(-aminon suojaryhmän poistamista, ennen seuraavan aminohapon kytkemistä kiinteän faasin reaktorissa. Kyt-keytymisreaktion onnistumista tarkkaillaan synteesin 15 jokaisessa vaiheessa ninhydriinireaktiolla kuten E. Kaiser et ai., Analyt. Biochem. 34 (1970) 595, ovat esittäneet.

Sen jälkeen kun haluttu aminohappojärjestys on saatu, peptidi poistetaan hartsista. Se voidaan suorit-20 taa hydrolyysillä, kuten esimerkiksi käsittelemällä hartsia, johon polypeptidi on sidottu, liuoksella, jossa on dimetyylisulfidia, p-kresolia ja tiokresolia laimeassa vetyfluoridihapon vesiliuoksessa.

: : : Niin kuin kiinteän faasin peptidisynteesin alal- 25 la tiedetään, monissa aminohapoissa on funktionaalisia ryhmiä, jotka täytyy suojata ketjun valmistuksen aikana. Sopivan suojaryhmän käyttäminen ja valitseminen kuuluu alan asiantuntijoiden taidon piiriin ja riippuu suojattavasta aminohaposta ja peptidissä olevista muis-30 ta suojatuista aminohappotähteistä. Tällaisen sivu- ketjua suojaavan ryhmän valitseminen on tärkeää siksi, koska ryhmän täytyy olla sellainen, että se ei poistu lohkaisemalla βί-amino-osan suojaryhmän lohkaisun aikana.

.**. Lysiinin sivuketjun sopivia suojaryhmiä ovat esimerkik- 35 si bentsyylioksikarbonyyli ja substituoitu bentsyyli-oksikarbonyyli, mainittu substituentti valitaan halo- 14 89063 geenistä (esim. kloori, bromi, fluori) ja nitrosta (esim.

2-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksi-karbonyyli, 3,4-diklooribentsyylioksikarbonyyli), to-syyli, t-amyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyyli ja 5 di-isopropyylimetoksikarbonyyyli. Treoniinin ja seriinin alkoholinen hydroksyyliryhmä voidaan suojata asetyyli-, bentsoyyli-, tert-butyyli-, trityyli-, bentsyyli-, 2,6-diklooribentsyyli- tai bentsyylioksikarbonyyliryh-mällä. Bentsyyli on edullinen suojaryhmä.

10 Nämä ryhmät voidaan poistaa alan piirissä tunne tuin menetelmin. Suojaryhmä poistetaan tyypillisesti sen jälkeen, kun peptidiketjun synteesi on valmis, mutta suojaryhmät voidaan poistaa minä muuna sopivana ajankohtana tahansa.

15 Syklisoidut peptidit valmsitetaan tavallisesti sopivasta lineaarisesta johdannaisesta joko ennen lineaarisen peptidin poistamista kiinteästä kantajasta tai sen jälkeen. Rakenteen 1 mukaiset yhdisteet, joissa B on -S-S- -ryhmä, valmistetaan vastaavista vapaan sulf-20 hydryylin sisältävistä lineaarisista peptideistä tunne-tuiolla hapettavilla kytkentämenetelmillä, esimerkiksi hapettamalla lineaarinen peptidi kaliumferrisyanidilla, kuvattu esimerkiksi teoksessa Stewart et ai., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Fransisco 25 1969), luku 1, s. 95. Rakenteen 1 mukaiset yhdisteet, joissa B on -S-Alkg-S- -ryhmä ja Alk3 on (C3_g)-etylee-niryhmä, voidaan valmistaa vapaan sulfhydryylin sisältävistä lineaarisista peptideistä antamalla niiden reagoida sopivan avoketuisen tai syklisen, tyydyttyneen 30 tai tyydyttymättömän alkyylin 1,2-dibromijohdannaisen kanssa vastaavalla tavalla kuin H.I. Mosberg ja J. R. Omnaas, J. Amer, Chem. Soc, 107 (1985) 2986-2987,ovat esittäneet. Rakenteen 1 mukaiset yhdisteet, joissa B on -S-Alkg-S- -ryhmä ja Alk3 on (C3_g)-metyleeni-35 ryhmä, valmsitetaan antamalla vapaan sulfhydryylin sisältävän lineaarisen peptidin reagoida sopivan avo- is 89063 ketjuisen tai syklisen, tyydyttyneen tai tyydyttymättömän alkyyliketonin tai -aldehydin kanssa vastaavalla tavalla kuin julkaisussa J. Amer. Chem. Soc. 76 (1954) 1945 on esitetty. Niiden rakenteen 1 mukaisten yhdisteiden, 5 joissa B on -S- -ryhmä, valmistaminen voidaan toteuttaa tavalla, joka on esitetty julkaisussa K. Jost, Collect. Czech. Chem. Commun. 36 (1971) 218 ja US-patentissa nro 4 161 521.

Tämän keksinnön peptidijohdannaisen hyytymistä 10 estävä annos on päivässä 0,2 mg:sta 250 mg:aan potilaan kehonpainokiloa kohti riippuen potilaasta, veritulppaan liittyvän hoidettavan tilan vaikeudesta ja valitusta peptidijohdannaisesta. Tietylle potilaalle sopiva annos voidan määrittää helposti. Päivittäiset annokset, joita 15 on edullisesti 1:stä 4tään, annetaan annoksina, joissa on tyypillisesti 5 mg:sta 100 mg:aan vaikuttavaa yhdistettä.

Veren hyytymistä estävä hoito on aiheellista erilaisten veritulppaan liittyvien tilojen, erityisesti se-20 pelvaltimon ja aivoverisuonten sairauksien hoidossa ja ennaltaehkäisyssä. Alan asiantuntijat ovat ilman muuta selvillä niistä olosuhteista, jolloin hyyvytmistä estävä hoito on tarpeen. Tässä käytetyn termin "potilas" katsotaan tarkoittavan nisäkkäitä kuten esimerkiksi 25 kädellisiä, ihmiset, lampaat, hevoset, nautakarja, siat, koirat, kissat, rotat ja hiiret mukaan lukien.

Vaikka jotkut peptidi johdannaisista saattavat ^ säilyä kuljettuaan suoliston läpi oraalisen antamisen jälkeen, hakijat pitävät muuta kuin oraalista anta-30 mistä edullisena, esimerkiksi subkutaanista, intrave-noosia, intramuskulaarista tai intraperitoneaalista antamista; pitkävaikutteisena ruiskeena antamista; implantoitavana valmisteena antamista; tai limakalvoille asettamista, kuten esimerkiksi nenän, kurkun ja 35 keuhkoputkien limakalvolle, esimerkiksi aerosolina, joka voi sisältää tämän keksinnön peptidijohdannaista “ suihkeen tai kuivan jauheen muodossa.

16 89063

Parenteraalisessa antamisessa yhdisteet voidaan antaa ruiskutettavina annoksina, joissa yhdiste on liuoksena tai suspensiona fysiologisesti hyväksyttävässä lai-mentimessa farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa, joka 5 voi olla steriili neste, kuten vesi ja öljyt, yhdessä lisätyn pinta-aktiivisen aineen ja muiden farmaseuttisesti hyväksyttävien apuaineiden kanssa tai ilman niitä. Valaisevia esimerkkejä öljyistä, joita voidaan käyttää näissä valmisteissa, ovat maaöljy, eläinöljyt, kasvis-10 öljyt tai synteettistä alkuperää olevat öljyt, esimerkiksi mapähkinäöljy, soijapapuöljy ja mineraaliöljy. Yleensä vesi, suolaliuos, glukoosin vesiliuos ja vastaavanlaiset sokeriliuokset, etanoli ja glykolit kuten propyleeniglykoli tai polyetyleeniglykoli ovat edulli-15 siä nestemäisiä kantaja-aineita, erityisesti injektio-liuoksiin.

Yhdisteet voidaan antaa pitkävaikutteisena ruiskeena tai implantoitavana valmisteena, joka voidaan formuloida niin, että vaikuttava aineosa vapautuu siitä 20 pitkitetysti. Vaikuttava aineosa voidaan puristaa pillereiksi tai pieniksi sylintereiksi ja implantoida ihon alle tai lihakseen pitkävaikutteisena ruiskeena tai implantaattina. Implantaateissa voidaan käyttää tehottomia aineita kuten esimerkiksi biologisesti hajoavia 25 polymeerejä tai synteettisiä silikoneja, esimerkiksi Silastic-silikonikumia, jota valmistaa Dow-Corning Corporation.

Esimerkit Tätä keksintöä havainnollistetaan seuraavilla 30 esimerkeillä.

17 89063

Esimerkki 1 H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Cys-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH:n valmistaminen 5 Peptidi syntetiosoitiin kiinteän faasin menetelmällä käyttäen 0,6 mmol/g Boc-Gln-PAM -hartsia 0,1 mmol. Kaksinkertaiset kytkennät symmetrisellä anhydridillä suoritettiin 2,0 mmol:11a No<-Boc-aminohappoa (Peptides International) paitsi Boc-Gln:n tapauksessa, jolloin 10 kytkettiin DCC/HOBT-menetelmällä. Käytetty sivuketjun suojaus oli: Asp(Chx), Cys(pMeBzl), Glu(Bzl), Tyr(2-BrZ). Kun synteesi oli valmis, Nof-Boc-suojaus poistettiin 50 %:isella trifluorietikkahapolla metyleenikloridissa. Hartsia pestiin kolme kertaa metyleenikloridilla, neut-15 raloitiin pesemällä kolme kertaa 10 %:isella di-isopropyy-lietyyliamiinilla metyleenikloridissa, pestiin kolme kertaa metyleenikloridilla, asetyloitiin N-asetyyli-imidatsolilla metyleenikloridissa, pestiin kolme kertaa metyleenikloridilla ja kuivattiin vakuumissa. Peptidin 20 suojaus poistettiin ja se lohkaistiin hartsista vedellä ja pienellä määrä 30 %:ista etikkahapon vesiliuosta.

Uute laimennettiin vedellä tilavuudeltaan 2 l:ksi ja pH säädettiin 8,5:ksi ammoniumhydroksidilla. Liuokseen lisättiin kaliumferrisyanidia (0,01 N) kunnes keltainen 25 väri pysyi. Liuosta sekoitettiin 30 minuuttia, sitten pH säädettiin etikkahapolla 4:n ja 5:n välille. Sitten seosta sekoitettiin 2 tuntia Bio-Rad- AG3-X4A ionin-vaihtohartsin kanssa. Seos suodatettiin ja suodos kyl-mäkuivattiin.

30 Peptidi puhdistettiin suolanpoistolla 92 x 2,9 cm:n Sephadex G-15-kolonnissa 5 % vesipitoisessa etikkahapossa ja kylmäkuivattiin. Preparatiivinen HPLC 1 fi suoritettiin C Vydac 218TP1010 (250 x 10 mm) -kolonnilla ajonesteellä, jossa oli 24 % asetonitriiliä 35 0,1 %:ssa vesipitoisessa trifluorietikkahapossa, virtaus- nopeudella 5 ml/min. Pääpiikki kerättiin ja kylmäkuivat- ie 89063 tiin, jolloin saatiin 24 mg haluttua tuotetta, ja di-meeri eristettiin myöhemmin eluoituvasta piikistä (14,2 mg). Tasa-aineisuus määritettiin HPLCsllä ja TLCtllä. HPLC Vydac 218TP54 (250 x 4,6 mm) C18 -kolonni, 5 2 ml/min, t = 1,8 min: eluoitumisaika 25-50 %:isen asetonitriilin 0,1 %:isessa trifluorietikkahapossa lineaarisella gradientilla 1 %/min (HPLC) on 9,3 min. FAB-MS: (M + H) = 1414 + 1 mji (laskettu 1413) . Amino-happoanalyysi (6 N HC1 -hydrolyysi; 24 tuntia 106 °C:ssa) 10 esitetään taulukossa 1.

Peptidipitoisuus 62 paino-%.

Seuraavien esimerkkien 2-4 mukaiset peptidit valmistettiin samanlaisella tavalla.

Esimerkki 2 15 (H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Cys-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH)2

I I

s s

I I

Esimerkki 3

? A

H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

I _1

Esimerkki 4 (H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH)2

25 I I

s s

II

Esimerkkien 1-4 mukaisilla peptideillä on seu-raavat ominaisuudet: 19 89063

Egim Aminohappoanalyysi (6N HCl-hydrolyysi; 24 tuntia" 106 Csssa)

nr° Asx Glx Pro G?y He* Leu Tyr Phe^ 1 1.03(1) 3.08(3) 0.91(1)' 1·01(ΪΓ 0.72(1) 0-98(1) 0.95(1) J.QdW

5 "5 1.00(1) 3.10(3) 0.97(1) 0.99(1) 0.91(1) 1.01(1) 0 88(1) 0.94(1), "1 1.00(1) 3.00(3) 0.83(1) 1.01(1) 0.68(1) 1.01(1) 1.00(1) 0.99(0 4 TÖTÖT 2.94(3) 0.98(1) 1.02(1) 0.85(1) 1.02(1) 1.02(1) I.OKj).

* Osaa, joka muuttui allo-ILe:ksi hydrolyysin aikana, ei määritetty kvantitatiivisesti.

10

Fysikaaliset ominaisuudet

Esim. HPLC FAB-MS

nro tr (min) (M + H) 15 1 9.3 1414 2 12.8 2826 3 51 1445 4 13.6 2883 20

Claims (5)

20 8 9 0 6 3

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hiru-diinipeptidijohdannaisen ja sen dimeerin valmistamiseksi, 5 jolla on kaava A* CO-As — Ae-NR,' X-AVA2-A3 - N(Ri)-GlT L R^C-CO - A8-A9-A10-Y

10. I Alki-B-Alk2 , B· CO-A5 — Ae-nR^ X-A1-A2-A3 - N(Ri)-C-^ L RMZ-CO - A8-A9-A10-Y I I Alki Alk2 I I

20 B * i i Alk2 Alki Y-A10-A9-A8 —CO-ci* L D Sk-N(Ri) - A3-A2-ArX I I

25 NRi' —Ae —As—CO ftai c. co—a5—Ae — nri' X-AvA2-A3 - N(R,)-C-^ L R^C-CO - Ae-Ag-Aio-Y

30. I Alki Alk2 I I B B I I

35 Alki Alk2 D I-- Χ-Αη-Α2-Α3 — N(Ri)-C-R R'-C-CO - Ae-Ag-Aio-Y i i CO-As-Ae — NR-i' 2i 89063 jossa X on aminoterminaalinen tähde, joka valitaan vedystä, l:stä 6:een hiiliatomia sisältävästä, yhdestä tai kahdesta alkyyliryhmästä, 2:sta 10:een hiiliatomia sisäl-5 tävästä, yhdestä tai kahdesta asyyliryhmästä, karbobent-syylioksista tai t-butyylioksikarbonyylistä; Aj on sidos tai Gly-Asp; A2 on Phe; A3 on Glu;

10 A5 on Ile; A6 on Pro; A8 on Glu; A, on Tyr-Leu; A10 on sidos tai Gin; 15. on karboksiterminaalainen tähde, joka valitaan OH:sta, (C^gJ-alkoksista, aminosta, mono- tai di-iC^)-alkyylillä substituoidusta aminosta tai bentsyyliaminos-ta; R, R', R: ja Rj' valitaan jokainen vedystä tai 20 (0^4)-alkyyliryhmästä; B valitaan -S-:stä, -S-S-:stä tai S-Alk3-S-:stä; Alklr Alk2 ja Alk3 valitaan jokainen (C^gJ-metylee-niryhmästä; ja jossa "D" ja "L" ilmaisevat, että osoitetun 25 hiilen stereokemia vastaa D-kysteiinin ja L-kysteiinin stereokemiaa, tässä järjestyksessä, tunnettu siitä, että kaavan Ax mukainen, sopivasti suojattu aminohappo sidotaan aktivoituun hartsikantajaan, myöhemmin kaavojen A2-A10 mukaiset muut alfa-aminosuojatut aminoha-30 pot sidotaan kasvavan peptidiketjun, josta on sillä välin * poistettu sen aminon suojaryhmä, terminaaliseen aminoryh- mään, ja lopuksi lineaarinen peptidi altistetaan hapettavalle kytkennälle.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että valmistetaan 22 h > 0 ‘j 3 H-Glv-A3p-Phe-Glu-DCv3-Ile-Pro-Cvs-Glu-Tvr-Leu-Qln-0H

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan (H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Cys-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH)2 I I s s

10. I

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH 15 [_J

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 20 (H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH)2 I I s s I I 23 8 9 0 6 3