JPS63303996A - 環状抗凝固ペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 抗凝固剤は、例えば急性の深部静脈血栓、肺塞栓症、急
性の四肢動脈寒栓症、心筋梗寒、及び伝染した血管内凝
固の薬理学的な治療に於て有用な治療剤である。抗凝固
剤の予防的な投与はリュウマチ性の又は動脈硬化性心臓
病を有する患者の寒栓症の再発を防止し、ある種の外科
手術の血栓塞栓の合併症を防止すると信じられる。抗凝
固剤の投与は又冠状動脈及び大脳静脈病の治療において
治療が出来ることが示されている。動脈の血栓、特に心
筋及び脳に供給している動脈における血栓は死亡の主要
な原因である。

〔従来の技術〕

ヒルディン（ｈｉｒｕｄｉｎ）は蛭の唾液腺から単層さ
れる６５の残基のポリペプチドである。これは抗凝固剤
であって、トロンビン特異性阻害剤である。

〔発明が解決しようとする課題〕

ヒルディンは非常に強力ではあるが、その量が限定され
ていること、高価なこと、一般に任意のその寸法の外来
蛋白質投与後に起きる様なアレルギー反応があること等
の為、蛭抽出物から単離されたヒルディンの臨床的な使
用はできそうもないことである。

〔課題を解決する手段〕

出願人はヒルディンの特定の領域が少なくとも部分的に
でもその抗凝固活性の原因になるものであることを発見
した。この領域は化学的に合成され、その類似体のある
種のものはトロンビンの認識位置に結合するがそこから
空間的に離れている酵素開裂位置には結合しない。合成
ペプチドが結合すると、フィブリン生産及び凝固形成の
必要条件であるフィブリノゲンのトロンビン認識位置へ
の結合を競走的に防止する。本発明のペプチドは有意義
な抗凝固活性を有し、トロンビンの開裂位置に結合する
ことなく認識位置のみに結合する並外れたその能力は化
学的に興味があり、治療上有意義な抗凝固療法への補助
を提供する。

本発明は構造式ｌを有するヒルディンの誘導体〔式中Ｘ
は水素、１〜６個の炭素原子のアルキル基の１又は２個
、２〜ＩＯ個の炭素原子のアシル基の１又は２個、カル
ボベンジロキシ叉はｔ−ブチロキシカルボニルからなる
群から選ばれるアミノ末端残基であり、 Ａ１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸残
基を含むペプチド断片であり、 Ａ２はＰｈｅ、　５ｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
エニル）アラニン、β−（２−及び３・フラニル）アラ
ニン、β・（２−１３−及び４−ピリジル〉アラニン、
β−（ヘンゾチェニル−２−及び−３−イル）アラニン
、β−（ｌ−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
Ｔｒｐであり、 Ａ３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ、はｌｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、　Ｎｌｅ又はＴｈｒて
あり、八〇はＰｒｏ、　ｕｙｐ、３，４−デヒドロＰｒ
ｏ、チアゾリジン−４−カルボキシレート、　Ｓａｒ、
ＮＭｅＰｇｌ又は〇−立体配置を有する任意のアミノ酸
であり、 Ａ８は任意のアミノ酸であり、 Ａ９はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｍ）、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、
　Ｌｅｕ、　　Ｎｌｅ、１１ｅ１Ｖａｌ、Ｈｌｓ及びＰ
ｒｏから選ばれる親油性のアミノ酸であるか、又はそれ
らの親油性のアミノｍを少なくとも１つ含有しているジ
ペプチドであり、Ａ、。は結合であるか、又は１〜５個
の任意のアミノ酸の残基を含有しているペプチドの断片
であり、Ｙは０Ｈ１（ＣＩ−Ｃ６）アルコキシ、アミノ
、モノ又はジ（Ｃ１〜Ｃ，）アルキル置換アミノ又はベ
ンジルアミノから選ばれるカルボキシ末端残基であり、
Ｒ，Ｒ′、Ｒ，、及びＲ，ｌはそれぞれ水素又は（ＣＩ
−Ｃ４）アルキル基から選ばれ、 Ｂは−５−１・Ｓ−５−１又は−５−Ａｌｋ３−Ｓ−か
ら選ばれ、ＡＩｋ＋、Ａｌｋ２、及びＡｌｋ３はそれぞ
れ（Ｃ，〜Ｃａ）メチレン又はエチレン基から選ばれ、
「Ｄ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体化学がそれぞれ
０−システィン及びし・システィンに対応するものであ
ることを示す〕並びにこれらのペプチド誘導体の二量体
、及びそれらの混合物、及びこれらのペプチド誘導体、
その二量体、及び混合物の抗凝固剤としての用途に間す
るものである。

この明細書を通じて次の一般的なアミノ酸の省略形が使
用される。

６１ソ　　　　−　グリシン Ａｌａ　　　　　−アラニン Ｖａｌ　　　　　−バリン Ｌｅｕ　　　　　−ロイシン ｌｌｅ　　　　　−イソロイシン Ｐｒｏ　　　　　　−プロリン Ｐｈｅ　　　　　−フェニルアラニン Ｔｒｐ　　　　　−）リブトファン Ｍｅｔ　　　　　−メチオニン Ｓｅｒ　　　　　−セリン Ｔｈｒ　　　　　−スレオニン Ｃｙｓ　　　　　−システィン Ｔｙｒ　　　　　−チロシン Ａｓｎ　　　　　−アスパラギン Ｇｉｎ　　　　　　−グルタミン Ａｓｐ　　　　　−アスパラギン酸 Ｇｌｕ　　　　　　−グルタミン酸 しｙｓ　　　　　　−リジン Ａｒｇ　　　　　−アルギニン ＨＩＳ　　　　　−ヒスチジン Ｎｌｅ　　　　　−ノルロイシン Ｈｙｐ　　　　　−ヒドロキシプロリン３．４−テ”ヒ
ドロＰｒｏ−３，４−デヒドロプロリンＴｙｒ（ＳＯＪ
）　　−チロシンサルフェートＰｇｌ　　　　　−フェ
ニルグリシン ＮＭｅＰｇｌ　　　　−Ｎ−メチルフェニルグリシンＳ
ａｒ　　　　　−サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）ｐ
ｓｕｂＰｈｅ　　　−パラ［ｉｉ換フェニルアラニンＳ
　ｕ　１１　Ｐ　ｈ　ｅ　　　　−オルソ、メタ又はパ
ラのモノ又はジ置換フェニルアラニン ＤＡｌａ　　　　　−Ｄ−アラニン Ａｃ　　　　　　−アセチル Ｓｕｃ　　　　　−サクシニル ｐ（ＩＰｈｅ　　　　−パラクロロフェニルアラニンｐ
ＮＱ２Ｐｈｅ　　　−パラニトロフェニルアラニンＰｅ
ｎ　　　　　−ペニシラミン（β、β−ジメチルシステ
ィン） ＤＣｙｓ　　　　　−Ｄ−システィン アルキル基及びアルコキシ基のアルキル部分は直鎖、分
枝鎖、又は環状のアルキル基を含み、例えばメチル、エ
チル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、
第三ブチル、ペンチル、イソペンチル、第二ペンチル、
シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキ
シル及びシクロペンチルメチルを含む。２〜１０個の炭
素原子を有するアシル基は直鎖、分枝鎖、環状の飽和及
び不飽和アシル基であって、１〜２個のカルボニル部分
を基当り有するもの、例えばアセチル、ベンゾイル及び
サクシニルを含むものとする。「（Ｃ７〜Ｃ８）メチレ
ン又はエチレン基」という用語は、１〜８個の炭素原子
の非環式又は環式、飽和又は不飽和アルキル基から炭素
原子の一つから又はアルキル基の隣接する炭素原子の二
つから二つの水素原子を概念的に除去することによって
誘導される二価の基を指す、（Ｃ７〜Ｃａ）メチレン又
はエチレン基の本発明における例は、メチレン又はメチ
リデン（−ＣＨ２−）　、エチリデン（ＣＨ２Ｃｌ＜）
　、ｌ−メチルエチリデン（ＣＨ３Ｃ（ＣＨ３）　＜　
）、！−メチルプロピリデン又は第二ブチリデン（ＣＨ
３ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）＜）　、２，２−ジメチルプロピ
リデン又はネオペンチリデン（（Ｈ３Ｃ（Ｃ）Ｉ３）２
ｃＨ＜　）　、エチレン又はジメチレン（−ＣＬＣＩ＋
２−）　、メチルｘ　ｆ　レン（−Ｃ）１２Ｃ）Ｉ（Ｃ
Ｈ３）−）、エチルエチレン（”、Ｈ２ＣＨ（Ｃ２）１
５）−）、エテニレン又はビニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）
　、Ｉ、１４テニリデン（Ｃｔ１２”Ｃ＜）　、１．１
−シクロへキシリデン（ＣａＨ＋ａ＜）、及び１，２−
シクロペンチリデン（Ｃ５Ｈｇ＜　）である。

ハロゲン基はフルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード基
である。

「任意のアミノ酸」という用語は本明細書では天然のア
ミノ酸並びにペプチド化学技術に於て天然のペプチドの
合成類似体を製造する時に使用される池の非蛋白α−ア
ミノ酸を含む。天然のアミノ酸はグリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン
、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプト
ファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、アスパラ
ギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ア
ルギニン、オルニチン、及びリジンである。非蛋白α・
アミノ酸の例はノルロイシン、ノルバリン、アロイソロ
イシン、ホモアルギニン、チアプロリン、デヒドロプロ
リン、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモセリン、シ
クロヘキシルグリシン（Ｃｈ８）、α−アミノ−ｎ−酪
酸（Ａｂａ）、シクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）、ア
ミノフェニル酪ｔｉｔ（Ｐｂａ）、フェニル部分のパラ
位置で（Ｃ＋〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ＋〜Ｃ４）アルコ
キシ、ハロゲン、又はニトロ基で置換されたフェニルア
ラニン、β−（２−及び３−チエニルアラニン、β−（
２−及び３−フラニル）アラニン、β−（２−１３・及
び４−ピリジル）アラニン、β−（ヘンゾチェニル−２
−及び３−イル）アラニン、β−（１−及び２−ナフチ
ル）アラニン、セリン又はスレオニン又はチロシンの０
−アルキル化誘導体、Ｓ−アルキル化システィン、チロ
シンの０−サルフェートエステル、３．５−ショートチ
ロシン、及び天然のアミノ酸の〇−異性体である。

１銭油性のアミノ酸」という用語にはＴ　ｙ　ｒ　、　
Ｔ　ｙｒ（ＳＯ３Ｍ）、Ｐｈｅ、　Ｌｅｕ、　Ｎｌｅ、
Ｉｌｅ、　Ｖａｌ、Ｉ（ｉｓ及びＰｒ。

が含まれる。

グリシンを例外として天然のアミノ酸は不斉炭素原子を
含んでいる。それ以外に特定して記載されていなければ
本明細書で述べられる光学活性アミノ酸はＬ−立体配置
である。例えば、Ａ１又はＡ１゜群の任意のアミノ酸は
Ｄ−又はし−立体配置であり得る。普通そうであるよう
に、本明細書で記載されているペプチドの構造は慣習に
従ってアミノ末端が鎖の左側で、カルボキシ末端が鎖の
右側である。

「二量体」という用語は、二つの別々の線状のペプチド
が頭と頭、又は頭としっぽの形式のいずれかで環化段階
の間に結合することによって生じるペプチドを意味する
。「８」グループを経る所望の内部環化を実施する過程
で線状ペプチド出発物質の幾つかは、それ自体でなくっ
て別の線状ペプチド出発物質と結合する。生じるペプチ
ドは線状の出発ペプチドの二つからなっているという意
味で「二量体」であるが、モノマーの分子式を正確に二
倍した二量体の分子式という意味では二量体ではない。

本発明のペプチド誘導体の二量体は以下の構造式を有す
るであろう。

頭としっぽの二量体 頭と頭の二量体 式中置換基は、構造式ｌで定義した通りである。

本明細書を通じて、ペプチド誘導体という場合にはその
文脈がそうでないということを要求していない限り二量
体及び混合物を含むものとする。環化反応から生じるモ
ノマー及び二量体の混合物は当業者によって良く知られ
た手段により容易に分離できるが、混合物は分離する必
要なしに本発明の抗凝固組成物中に使用することができ
る。

式ｌのポリペプチドは任意の非毒性有機又は無機酸と製
薬上受入れられる塩を形成することが出来る。適当な塩
を形成する無機酸の例には塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐
酸、及びナトリウム−水素オルト燐酸及び硫酸水素カリ
ウム等の酸金属塩が含まれる。適当な塩を形成する有機
酸の例は、モノ、ジ、及びトリカルボン酸を含む。その
ような酸の例は例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピル
ビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマール酸
、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレ
イン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ
安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、２−フ
ェノキシ安息香酸、及びメタンスルホン酸や２−ヒドロ
キシェタンスルホン酸等のスルホン酸が含まれる。カル
ボキシ末端アミノ酸部分の塩には任意の適当な無機又は
有機塩基と形成される非毒性のカルボン酸が含まれろ。

例示すれば、これらの塩にはアルカリ金属、例えばナト
リウム及びカリウムのもの、アルカリ土類金属、例えば
カルシウム及びマグネシウムのもの、アルミニウムを含
めたｍａ族の軽金属のもの、及び有機第１級、第２級及
び第３級アミン、例えはトリエチルアミンを含めたトリ
アルキルアミン、プロ力イン、ジベンジルアミン、１−
エタナミン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、
ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ−（低級）アルキルピペ
リジンのもの、及び他の適当なアミンのものが含まれろ
。

化合物の任意の一般基がそうであるように、ある種の基
が好ましい。出願人はＸが水素、アセチル又はサクシニ
ルの式１のペプチド誘導体が好ましいと考えている。

又Ａ、が 一１ｌｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−１−Ａ
ｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−１−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−１ −６１ンーＡｓｐ−１ −ＡＳｐ−１又は結合、 Ａ２が好ましくはＰｈｅ、β−（２−又は３−チエニル
）アラニン、Ｔｙｒ、　Ｔｒｐ、又はｐｃＩＰｈｅ、Ａ
３がＧｌｕ、 Ａ、がｌｌｅ、 Ａ６がＰｒｏ、　Ｓａｒ、　ＤＡｌａ、　Ｈｙｐ、又は
ＮＭｅＰｇｌ、Ａ８がＧＩＩＪ又はＡｓｐ、 Ａ９がＴｙｒ又は少なくとも一つの残基がＴｙｒ又はＴ
ｙｒ（Ｓｏ３Ｎ）であるジペプチド断片、 Ａ１０がＬｅｕ、　Ａｓｐ、　Ａｓｐ−Ｇｌｕ、　Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ、又はＬｅｕ−Ｐｒｏ、Ａ１に、及びＡｌｋ
２がそれぞれメチレン基、そして ＹがＯＨ又はＮｌ２、及び Ｂが−５−５−である式１の化合物も好ましい。

特に好ましいのは、Ｘがアセチル、Ａ、が−Ｇ　Ｉ　ｙ
　−Ａｓｐ−又は−Ａｓｐ−であるか、又は×がサクシ
ニルでＡ、が結合の何れかであり、そして Ａ２がＰｈｅ、β−（２−チエニル）アラニン、Ｔｙｒ
、Ａ３が６１１１、 Ａ、が１１ｅ１ Ａ６がＰｒｏ。

Ａ８がＧｌｕ又はＡｓｐ。

Ａ９がＴｙｒ、又はＡｌａ−Ｔｙｒ、 ＡＩＯがＧｌｎ、　ＡＳｐ−−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、結合、
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−１−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−１ Ｒ，Ｒ’、　Ｒ，、及びＲ１′はそれぞれ水素であり、
ＡＩｋ＋及びＡｌｋ２がそれぞれメチレン基、Ｂが−５
−Ｓ−１そして ＹがＯＨ の式１のペプチド誘導体である。

本発明の蛋白はこの技術の当業者に容易にしられた種々
の手順によって製造される。そのような手順には固相・
シーケンシャル及びブロック合成、遺伝子クローニング
及びこれらの技術の組合せが含まれる。

固相、シーケンシャル手順は自動ペプチド合成機による
など確立された自動化された方法を使用して実施できろ
、この手順ではα−アミノ保護アミノ酸が樹脂支持体に
結合される。使用される樹脂支持体は任意の適当な固相
ペプチド調製にこの技術で都合良く使用される任意の適
当な樹脂であり得、好ましくは０．５〜３％のジビニル
ベンゼンで架橋されているポリスチレンであって、クロ
ロメチル化されているかヒドロキシメチル化されて、最
初に導入されたα−アミノ保護アミノ酸とエステル形成
の為の位置を与えているものである。

ヒドロキシメチル樹脂の例はボダンスキー等、Ｃｈｅｍ
、　ｌｎｄ、　（ロンドン）３訳１５９７−９８　（１
９６６）によって記載されている。クロロメチル化樹脂
はカリフォルニア州すッチモンド、バイオラドラボラト
リーズから商業的に人手出来、そのような樹脂の調製は
ステワード等「固相ペプチド合成」　（フリーマンアン
ドカンパニー、１９６９年サンフすンシスコ）第１章、
１〜６頁に記載される。保護されたアミノ酸はギシン（
Ｇｉｓｉｎ）、Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｅｍ　Ａｃｔａ、　５
６゜１４７６（＋９７３）の手順によって樹脂に結合で
きる。多くのＩＷ脂に結合された（呆護されたアミノ酸
が市販されている。例として、カルボキシ末端がＴ１１
「残基である本発明のポリペプチドを製造する為にベン
ジル化ヒドロキシメチル化フェニルアセトアミドメチル
（ＰＡＭ）樹脂に結合された第三級ブチルオキシカルボ
ニル（Ｂｏｃ）で保護されたＴｈｒを使用出来、商業的
に人手し得る。

α−アミノ保護アミノ酸を樹脂支持体に結合するに続い
て、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸、トリフ
ルオロ酢酸単独、又はジオキサン中のＨＣｌなと任意の
適当な手順を用いて保護基を除去する。脱保護は０℃と
室温の間の温度に於て実施される。特定のα−アミノ酸
ｆ呆護基の除去の為の他の標準の開裂試薬及び条件を使
用できる。

α−アミノ保護基の除去の後、他のアミノ保護アミノ酸
が所望の順序で段階的に結合される。別の方法として、
複数のアミノ酸基を樹脂支持されたアミノ酸配列と結合
するに先立って溶液方法で結合することが出来る。

ポリペプチド配列中に導入される各アミノ酸に使用され
るα−アミノ保護基は任意のこの技術で知られた保護基
であり得る。考慮に入れられるα−アミノ保護基の類の
中でも、（１）アシル型保護基、例えばホルミル、トリ
フルオロアセチル、フタリル、トルエンスルホニル（ト
シル）、ベンゼンスルホニル、ニド、ロフェニルスルフ
ェニル、トリチルスルフェニル、０−ニトロフェノキシ
アセチル、及びα−クロロブチリル、（２）芳香族ウレ
タン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル及び置
換ベンジルオキシカルボニル、例えばρ−クロロベンジ
ルオキシカルボニル、ｐ−二トロペンジル力ルボニル、
ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ρ−メトキシベ
ンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−
１−メチルエトキシカルボニル、α、α−ジメチルー３
，５−ジメトキシベンジロキシカルボニル、及びペンズ
ヒドリロキシ力ルボニル、（３）脂肪族ウレタン保護基
、例えば第三ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプ
ロピルメトキシカルボニル、イソプロビロキシカルボニ
ル、エトキシカルボニル、及びアリロキシカルボニル、
（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロ
ペンチロキシカルボニル、アダマンチロキシカルボニル
、及びシクロへキシロキシカルボニル、（５）チオウレ
タン型保護基、例えばフェニルチオカルボニル、（６）
アルキル型保護基、例えばトリフェニルメチル（トリチ
ル〉及びベンジル、及び（７）トリアルキルシラン基、
例えばトリメチルシランがある。好ましいα−アミノ保
護基は第三ブチルオキシカルボニルである。

適当な結合試薬の選択はこの技術の通常の知識を有する
者が行い得る範囲内である。加えられろアミノ酸がＧｌ
ｎ、　Ａｓｎ又はＡ「８である場合の特に適した結合試
薬は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド及び１
−ヒドロキシヘンシトリアゾールである。これらの試薬
の使用は、ニトリル及びラクタム形成を防止する。他の
結合試薬は（１）カルボジイミド頚、例えばＮ、Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド及びＮ・エチル−Ｎ’
（γ−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド）、（２
）シアナミド類、例えばＮ、Ｎ’−ジベンジルシアナミ
ド、（３）ケテンイミン類、（４）イソキサゾリウム塩
（例えばＮ−エチル−５−フエニルイツキサゾリウム−
３′−スルホネート、（５）環中に１〜４個の窒素を含
有している芳香族性の単環式窒素含有複素環アミド類、
例えばイミダゾリド類、ビリジリド類及び１，２．４−
　）リアゾリド類である・有用である特定の複素環アミ
ド類にはＮ　、　Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、及
びＮ、Ｎ・カルボ：　ルージー１．２．４−トリアゾー
ル、（６）アルコキシル化されたアセチレン（例えばエ
トキシアセチレン）　、（７）アミノ酸のカルボニル部
分と混合無水物を形成する試薬、例えばエチルクロロホ
ルメート及びイソブチルクロロホルメート、又は結合さ
れるべきアミノ酸の対称無水物（例えばＢｏｃ−Ａｌａ
−０−Ａｌａ−Ｂｏｃ）、及び（８）一つの環の窒素上
にヒドロキシ基を有している窒素含有複素環化合物（例
えばＮ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシコハ
ク酸イミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）が
含まれる。ペプチド結合に使用される他の活性化試薬及
びそれらの用途はカブール（にａｐｏｏｒ）、Ｊ、　Ｐ
ｈａｒｍ。

Ｓｃｉ、　５９．１〜２７頁（＋９７０）に記載されて
いる。出願人はＡｒｃ、Ａｓｎ及びＧｌｎを除いて全て
のアミノ酸に対して結合試薬として対称の無水物を使用
するのが好ましいと考える。

各々の保護されたアミノ酸又はアミノ酸配列は約４倍過
剰で固相反応器に導入され、結合がジメチルホルムアミ
ド対塩化メチレン（１：ｌ）又はジメチルホルムアミド
単独、又は好ましくは塩化メチレン単独の媒体中で実施
される。不完全な結合が起きた場合には、結合手順はα
−アミノ保護基を除去する前に、固相反応器中の次のア
ミノ酸の結合の前に繰り返される。合成の各段階に於け
る結合反応の成功は、イー、カイザー、等、Ａｎａｌｙ
ｔ。

Ｂｉｏｃｈｅ＊、　３４．５９５　（＋９７０）に記載
されるようにニンヒドリン反応によってモニターされろ
。

所望のアミノ酸配列が得られた後、ペプチドを樹脂から
除去する。これは樹脂に結合したポリペプチドを冷水性
弗化水素酸中のジメチルスルフィド、ｐ−クレゾール及
びチオクレゾールの溶液で処理するなどして加水分解す
ることによりなしうる。

固相ペプチド合成の技術に於て知られるように多くのア
ミノ酸は鎖調製の間に保護を必要とする官能基を有して
いる。適当な保護基の使用及び選択はこの技術の当業者
の能力のｉｉｓ囲内であり、保謹さ耽るべきアミノ酸及
びペプチド上の他の保護されたアミノ酸残基の存在に依
存するであろう。

そのような側鎖保護基の選択はα−アミノ部分の保護基
の開裂の間閏裂によって除去されないものでなければな
らないという点で臨界的である０例えばリジンに対する
適当な側鎖保護基はベンジルオキシカルボニル及び置換
ベンジルオキシカルボニルであり、その置換基はハロ（
例えばクロロ、ブロモ、フルオロ）及びニトロ（例えば
２−クロロベンジロキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジ
ロキシカルボニル、３，４−ジクロロベンジロキシカル
ボニル）、トシル、ｔ−アミロキシカルボニル、ｔ−ブ
チルオキシカルボニル、及びジイソプロピルメトキシカ
ルボニルから選ばれる。スレオニン及びセリンのアルコ
ール性ヒドロキシル基はアセチル、ベンゾイル、第３ブ
チル、トリチル、ベンジル、２゜６−ジクロロベンジル
又はベンジルオキシカルボニル基で保護できる。好まし
い保護基はベンジルである。

これらの基はこの技術で良く知られた手順によって除去
できる。典型的な保護基除去はペプチド鎖合成が完了し
た後に為されるが、保護基は任意の他の適当な時間に除
去することが出来る。

一般に環化されたペプチドは、固体支持体から線状のペ
プチドを除去する前又は後のいずれかに於いて適当な線
状の誘導体から製造される。Ｂが−５−５−基である構
造式ｌの化合物は、対応する遊離スルフヒドリル含有線
状ペプチドから良く知られた酸化的結合技術によって製
造され、例えばスチュワートら「同相ペプチド合成」　
（フリーマンアンド　カンパニー、サンフランシスコ　
＋９６７）、１章９５頁に記載される様なフェリシアン
化カリで線状ペプチドを酸化すること等による。８が−
５−Ａｌｋ３−５−基であって、Ａｌｋ３が（Ｃ＋〜Ｃ
Ｓ）エチレン基である構造式ｌの化合物は、遊離スルフ
ヒドリル含有線状ペプチドから適当な非環式又は環式、
飽和又は不飽和アルキルの１．２・ジブロモ誘導体との
反応によりエッチ、アイ、モスベルブ及びジエイ。

アール、オムナース、 Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１０７．２
９８６〜２９８７　（＋９８５）に記載されたのと類似
の方法で製造することが出来る。Ｂが−５−Ａｌｋ３−
５−基であって、Ａｌｋ、が（Ｃ＋〜Ｃａ）メチレン基
である構造式１の化合物は、遊離スルフヒドリル含有線
状ペプチドの適当な非環式又は環式、飽和又は不飽和ア
ルキルケトン又はアルデヒドとの反応によりＪ、　Ａｍ
ｅｒ、　Ｃｈｅｖａ、　Ｓｏｃ、　７６．１９４５　（
＋９５４）中に記載された方法と類似の方法で製造され
る。Ｂが−Ｓ−基である構造式ｌの化合物の製造は、ケ
イ、ジョスト、Ｃｏ１１ｅｃｔ、　Ｃｚｅｃｈ、　Ｃｈ
ｅｗ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　３６．２１８　（＋９７１）及び米国
特許第４１６１５２１に記載された方法で達成できる。

本発明のペプチド誘導体の抗凝固投与量は１日当り患者
体１１Ｋｇあたり０．２剛８〜２５０ｍｇであるが、愚
者、処置されるべき血栓症状のひどさ、および選ばれる
ペプチド誘導体に依存する。特定の患者に対する適当な
投与量は容易に決定できる。好ましくは１〜４回の毎日
の投与が典型的には５Ｂ〜ｌｏＯｍｇの投与当りの活性
化合物とともに投与される。

抗凝固療法は多種多様の血栓症状、特に冠状動脈及び脳
血管病の治療及び予防の為に示唆されている。この分野
に於けるこれらの経験は抗凝固療法を要求する状況を容
易に気づく。本明細書で使用する「患者」という用語は
、人を含めた霊長類、羊、馬、牛、豚、犬、ラット及び
マウス等の哺乳類を意味する。

ペプチド誘導体の幾つかは経口投与の後に胃腸を通過す
ることによって残り得るが、出願人は非経口投与が好ま
しいと考え、例えば皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内
、デボ−注射による投与、移植製剤による投与、又は粘
膜に対する適用、例えばスプレー又は乾燥粉末形に於け
る本発明のペプチド誘導体を含有しているエロゾル缶と
して例えば鼻の粘膜、喉の粘膜、気管支の粘膜に投与す
るのが好ましい。

非経口投与の為には化合物は水、及び油等の滅菌液体で
あり得、表面活性剤及び他の製薬上受入れられる助剤の
添加をした又はしない製薬担体を有する生理学上受入れ
られる希釈剤中の化合物の溶液又は懸濁液の注射可能な
投与物として投与できる。これらの製剤中で使用できる
油の例は石油、動物油・植物油、又は合成起源のもの、
例えばビーナツツ油、大豆油、及び鉱油である。一般に
水、塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、エ
タノール、及びグリコール類、 例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコー
ルが好ましい液体担体で、特に注射溶液に好ましい。

化合物は活性成分の持続した放出を可能とする方法で処
方し得るデボ−注射又は移植製剤の形態で投与できる。

活性成分はペレット又は小シリンダーに圧縮され、皮下
又は筋肉内にデボ−注射又は移植物として移植されろ。

移植物は不活性物質、例えば生物分解可能な重合体又は
合成シリコーン類、例えばダウコーニングコーポレーシ
ョンによって製造されるシリコーンゴムであるシラスチ
ックを使用できる。

〔実施例〕

本発明は次の非限定実施例によって説明される。

実施例　１ ペプチドを０．１ミリモルの０．６６ｍモル／ｇ　Ｂｏ
ｃ−Ｇｌｎ−ＰＡＭ樹脂を使用して固相法で合成した。

ＤＣＣ／ＨＯＢＴ方法によって結合された８ｏｃ−Ｇｌ
ｎの場合を除いて、２．０ｍモルのＮａ−８ｏｃ−アミ
ノ酸（ペブタイズインターナショナル）でダブルシンメ
トリカル（二重対称）無水物カップリングを実行した。

使用された側鎖保護はＡｓｐ（Ｃｈｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭ
ｅＢｚｌ　）、ＧＩＵ（８２１）、Ｔｙｒ（２−ＢｒＺ
）であった０合成の完了後、Ｎａ−Ｂｏｃ保護を塩化メ
チレン中の５０％トリフルオロ酢酸で除去した。樹脂を
３回塩化メチレンで洗浄し、塩化メチレン中の１０％ジ
イソプロピルエチルアミンの３回の洗浄によって中和し
、塩化メチレンで３回洗浄し、塩化メチレン中のＮ−ア
セチルイミダゾールでアセチル化し、塩化メチレンで３
回洗浄し、真空で乾燥した。ペプチドを脱保護させ、そ
して樹脂から水及び少量の３０％酢酸水溶液で開裂させ
た。

抽出物を２１容量に水で希釈し、ｐＨを水酸化アンモニ
ウムで８．５に調整した。フェリシアン化カリウム（０
，０＋）Ｉ）を黄色が持続するまで溶液に加えた。

溶液を３０分間攪拌し、次にｐＨを酢酸で４と５の間に
調整した。混合物を次に２時間バイオーラッ）　　ＡＣ
３−Ｘ４Ａイオン交換樹脂と攪拌した。混合物をろ過し
、ろτ夜を凍結乾燥した。

このペプチドを９２　ｘ　２．６　ｃｔａセファデック
スＧ−１５カラム上で５ｘ酢酸水溶液中に於て脱塩する
ことにより精製し、凍結乾燥した。分離用ＨＰＬＣをＣ
ｌｌ３Ｖｙｄａｃ　２１８ＴＰＩＯＩＯ（２５０ｘ　ｌ
ｏｏｍ）カラム上で０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中
の２４％アセトニトリルで５１７分において実施した。

主要なピークを集め、凍結乾燥し、２４Ｂの所望生成物
を残し二量体を後の溶離ビークとして単離した（＋４゜
２１ｇ）。均質性はＨＰＬＣ及びＴＬＣによって決定し
た。ＨＰＬＣＶｙｄａｃ　２１８ＴＰ５４　（２５０ｘ
　４．６ａ＋ｍ）ＣＩｌＩカラム、２１／分、ｔ０＝１
゜８分：０．１χトリフルオロ酢酸中の２５〜５０％ア
セトニトリル線形勾配での溶離時間は１％／分（ＨＰＬ
Ｃ）において９．３分であった。　ＦＡＢ−月Ｓ：　　
（Ｍ＋Ｈ）　＝１４１４±！信μ（計算＋４１３）　、
アミノ酸分析：　　（６Ｎ　）ＩＣＩ加水分解；２４４
時間１０６℃）を表１に示す。６２重量パーセントのペ
プチド含量であった。

同様な方法で次の実施例２〜４のペプチドを製造した。

実施例　２ Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＯＨ）２ 実施例　３ Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−０）１ 実施例　４ Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＯＨ）２ 実施例１〜４のペプチドは次の性質を有する。

本　加水分解の間にａｌｌｏｌｌｅに変換された部分は
定量されていない。

出願人　メレルダウ　ファーマスーティカルズインコー
ボレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のペプチド誘導体〔式中Ｘは水素、１〜６個の炭素原子
   のアルキル基の１又は２個、２〜１０個の炭素原子のア
   シル基の１又は２個、カルボベンジロキシ又はｔ−ブチ
   ロキシカルボニルからなる群から選ばれるアミノ末端残
   基であり、 Ａ＿１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸
   残基を含むペプチド断片であり、 Ａ＿２はＰｈｅ、ＳｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
   エニル）アラニン、β−（２−及び３−フラニル）アラ
   ニン、β−（２−、３−及び４−ピリジル）アラニン、
   β−（ベンゾチエニル−２−及び−３−イル）アラニン
   、β−（１−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
   Ｔｒｐであり、 Ａ＿３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿５はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＴｈｒで
   あり、Ａ＿６はＰｒｏ、Ｈｙｐ、３，４−デヒドロＰｒ
   ｏ、チアゾリジン−４−カルボキシレート、Ｓａｒ、Ｎ
   ＭｅＰｇｌ又はＤ−立体配置を有する任意のアミノ酸で
   あり、 Ａ＿８はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿９はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｔｒｐ、Ｐｈ
   ｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ及びＰｒ
   ｏから選ばれる親油性のアミノ酸であるか、又はそれら
   の親油性のアミノ酸を少なくとも１つ含有しているジペ
   プチドであり、Ａ＿１＿０は結合であるか、又は１〜５
   個の任意のアミノ酸の残基を含有しているペプチドの断
   片であり、ＶはＯＨ（Ｃ＿１〜Ｃ＿６）アルコキシ、ア
   ミノ、モノ又はジ（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル置換アミ
   ノ又はベンジルアミノから選ばれるカルボキシ末端残基
   であり、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１、及びＲ＿１′はそれぞれ水
   素又は（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル基から選ばれ、 Ｂは−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、又は−Ｓ−Ａｌｋ＿３−Ｓ−
   から選ばれ、Ａｌｋ＿１、Ａｌｋ＿２、及びＡｌｋ＿３
   はそれぞれ（Ｃ＿１〜Ｃ＿８）メチレン又はエチレン基
   から選ばれ、 「Ｄ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体化学がそれぞれ
   Ｄ−システイン及びＬ−システインに対応するものであ
   ることを示す〕並びにペプチド誘導体の二量体、又は混
   合物及びその二量体。 ２、Ａ＿２がＰｈｅ、β−（２−又は３−チエニル）ア
   ラニン、又はＴｙｒである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ３、Ａ＿３がＧｌｕである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ４、Ａ＿５がＩｌｅである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ５、Ａ＿６がＰｒｏである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ６、Ａ＿８がＧｌｕ又はＡｓｐである特許請求の範囲第
   １項に記載のペプチド誘導体。 ７、Ａ＿９がＴｙｒ、Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ｔｙｒ
   （ＳＯ＿３Ｈ）又はＧｌｕ−Ｌｅｕである特許請求の範
   囲第１項に記載のペプチド誘導体。 ８、Ａ＿１＿０がＧｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｇ
   ｌｕ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ａｌ
   ａ又は結合である特許請求の範囲第１項に記載のペプチ
   ド誘導体。 ９、ＸがＨ、アセチル、又はサクシニルである特許請求
   の範囲第１項に記載のペプチド誘導体。 １０、ＹがＯＨ又はＮＨ＿２である特許請求の範囲第１
   項に記載のペプチド誘導体。 １１、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１、Ｒ＿１′がそれぞれ水素であ
   る特許請求の範囲第１項に記載のペプチド誘導体。 １２、Ｂが−Ｓ−Ｓ−基である特許請求の範囲第１項に
   記載のペプチド誘導体。 １３、Ａｌｋ＿１及びＡｌｋ＿２がそれぞれ式−（ＣＨ
   ＿２）−のメチレン基である特許請求の範囲第１項に記
   載のペプチド誘導体。 １４、Ａ＿１が Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ａ
   ｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、 Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、 Ｇｌｙ−Ａｓｐ、 Ａｓｐ、又は 結合である特許請求の範囲第１項に記載のペプチド誘導
   体。 １５、特許請求の範囲第１〜１４項に記載のペプチド誘
   導体の抗凝固有効量、及び製薬上受入れられる担体を含
   む必要とする患者の血液凝固を減少させる薬剤。 １６、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のペプチド誘導体〔式中Ｘは水素、１〜６個の炭素原子
   のアルキル基の１又は２個、２〜１０個の炭素原子のア
   シル基の１又は２個、カルボベンジロキシ又はｔ−ブチ
   ロキシカルボニルからなる群から選ばれるアミノ末端残
   基であり、 Ａ＿１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸
   残基を含むペプチド断片であり、 Ａ＿２はＰｈｅ、ＳｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
   エニル）アラニン、β−（２−及び３−フラニル）アラ
   ニン、β−（２−，３−及び４−ピリジル）アラニン、
   β−（ベンゾチエニル−２−及び−３−イル）アラニン
   、β−（１−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
   Ｔｒｐであり、 ＡｓはＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿５はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＴｈｒで
   あり、Ａ＿６はＰｒｏ、Ｈｙｐ、３，４−デヒドロＰｒ
   ｏ、チアゾリジン−４−カルボキシレート、Ｓａｒ、Ｎ
   ＭｅＰｇｌ又は任意のＤ−立体配置を有するアミノ酸で
   あり、 Ａ＿８はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿９はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｔｒｐ、Ｐｈ
   ｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ及びＰｒ
   ｏから選ばれる親油性のアミノ酸であるか、又はそれら
   の親油性のアミノ酸を少なくとも１つ含有しているジペ
   プチドであり、Ａ＿１＿０は結合であるか、又は１〜５
   個の任意のアミノ酸残基を含有しているペプチドの断片
   であり、ＹはＯＨ、（Ｃ＿１〜Ｃ＿６）アルコキシ、ア
   ミノ、モノ又はジ（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル置換アミ
   ノ又はベンジルアミノから選ばれるカルボキシ末端残基
   であり、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１、及びＲ＿１′はそれぞれ水
   素又は（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル基から選ばれ、 Ｂは−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、又は−Ｓ−Ａｌｋ＿３−Ｓ−
   であり、Ａｌｋ＿１、Ａｌｋ＿２、及びＡｌｋ＿３はそ
   れぞれ（Ｃ＿１〜Ｃ＿３）メチレン又はエチレン基から
   選ばれ、ここで「Ｄ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体
   化学がそれぞれＤ−システイン及びＬ−システインに対
   応するものであることを示す〕並びにペプチド誘導体の
   二量体、又は混合物及びその二量体を製造する方法に於
   いて固相のシーケンシャル又はブロック合成、遺伝子ク
   ローニング、又はこれらの組合せにより遊離スルフヒド
   リル含有線状ペプチドを製造し、そして線状ペプチドを
   酸化カップリングにかけることからなる方法。 １７、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のペプチド誘導体を製造する固相シーケンシャル又はブ
   ロック合成において〔式中Ｘは水素、１〜６個の炭素原
   子のアルキル基の１又は２個、２〜１０個の炭素原子の
   アシル基の１又は２個、カルボベンジロキシ又はｔ−ブ
   トキシカルボニルからなる群から選ばれるアミノ末端残
   基であり、 Ａ＿１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸
   残基を含むペプチドであり、 Ａ＿２はＰｈｅ、ＳｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
   エニル）アラニン、β−（２−及び３−フラニル）アラ
   ニン、β−（２−、３−及び４−ピリジル）アラニン、
   β−（ベンゾチエニル−２−又は−３−イル）アラニン
   、β−（１−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
   Ｔｒｐであり、 Ａ＿３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿５はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＴｈｒで
   あり、Ａ＿６はｐｒｏ、Ｈｙｐ、３，４−デヒドロＰｒ
   ｏ、チアゾリジン−４−カルボキシレート、Ｓａｒ、Ｎ
   ＭｅＰｇｌ又はＤ−立体配置を有する任意のアミノ酸で
   あり、 Ａ＿８はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿９はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｔｒｐ、Ｐｈ
   ｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ及びＰｒ
   ｏから選ばれる親油性のアミノ酸であるか、又はそれら
   の親油性のアミノ酸を少なくとも１つ含有しているジペ
   プチドであり、Ａ＿１＿０は結合であるか、又は１〜５
   個の任意のアミノ酸の残基を含有しているペプチドの断
   片であり、ＹはＯＨ、（Ｃ＿１〜Ｃ＿６）アルコキシ、
   アミノ、モノ又はジ（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル置換ア
   ミノ又はベンジルアミノから選ばれるカルボキシ末端残
   基であり、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１、及びＲ＿１′はそれぞれ
   水素又は（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル基から選ばれ、 Ｂは−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、又は−Ｓ−Ａｌｋ＿３−Ｓ−
   から選ばれ、Ａｌｋ＿１、Ａｌｋ＿２、及びＡｌｋ＿３
   はそれぞれ（Ｃ＿１〜Ｃ＿３）メチレン又はエチレン基
   から選ばれ、「Ｄ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体化
   学がそれぞれＤ−システイン及びＬ−システインに対応
   するものであることを示す〕の並びにペプチド誘導体の
   二量体、又は混合物及びその二量体を製造する方法に於
   いて、適当に保護された式Ａ＿１アミノ酸を活性化樹脂
   支持体に結合させ、次にＡ＿２〜Ａ＿１＿０の他のアル
   ファアミノ保護アミノ酸を生長するペプチド鎖の末端ア
   ミノ基に結合させるが、その生長しているペプチド鎖は
   、その間アミノ保護基を除去することによって露出させ
   、そして最後に線状ペプチドを酸化的カップリングにか
   けることからなる方法。