FI103510B - Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi - Google Patents
Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI103510B FI103510B FI922105A FI922105A FI103510B FI 103510 B FI103510 B FI 103510B FI 922105 A FI922105 A FI 922105A FI 922105 A FI922105 A FI 922105A FI 103510 B FI103510 B FI 103510B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- factor viii
- plasma
- gel filtration
- volume
- column
- Prior art date
Links
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 title claims abstract description 121
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 121
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 73
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 26
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 18
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 33
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 13
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 12
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 108010088880 plasmagel Proteins 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 5
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 5
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 3
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 3
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 108010035369 Cohn fraction I Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 229940124135 Factor VIII inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 238000006887 Ullmann reaction Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- -1 proteins Chemical class 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Housing For Livestock And Birds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
103510
Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi - Förfarande for isolering av faktor VIII
Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään biologisten yhdisteiden, kuten prote-5 iinien, erityisesti hyytymistekijän VIII, eristämiseksi ruumiinnesteistä, kuten plasmasta, käyttämällä geelisuodatusta ensimmäisenä eristysvaiheena.
Tekijä Vili, joka tunnetaan myös verenvuototautia estävänä tekijänä A tai AHF, on plasmaproteiini, joka osallistuu veren hyytymisen sisäsyntyisyyteen. Tekijä VIII 10 kiertää veriplasmassa äärimmäisen alhaisessa pitoisuudessa kahden proteiinin ei-kovalenttisen yhdistelmän muodossa, jossa on tekijä VIII hyydyttävää toimintaa (tekijä VIII:C) ja ristosetiini-kofaktoritoimintaa (von Willebrand Factor (vWF)) vastaavasti, sanotun yhdistelmän molekyylipainon ollessa 1-20 x 106 D.
15 Noin viideltä sadasta tuhannesta henkilöstä, jotka sairastavat verenvuorotautia hemofilia A, puuttuu tekijä VIII:C tai se on viallinen.
von Willebrand -tekijä sitoutuu aktivoituneisiin verihiutaleisiin sellaisella tavalla, että aktivoituneiden verihiutaleiden aggregoituminen tehostuu. Tämä vaikutus voi-20 daan havaita in vitro aggregoimalla ristosetiini-indusoidut verihiutaleet, von Willeb-randin sairauden ohessa havaitaan pidentynyt verenvuotoaika, joka johtuu von Willebrand -tekijän biologisen aktiivisuuden puutteesta tai laskeneesta tasosta.
Verenvuototautisia, jotka sairastavat hemofilia Aita, ja potilaita, jotka sairastavat 25 von Willebrandin taudin vaikeaa lajia, hoidetaan nykyisin konsentraateilla, jotka käsittävät tekijän VIII:C/vWF, joka on hoito, joka on pidentänyt potilaiden elämänlaatua ja taloudellista tilaa huomattavasti sekä on pidentänyt näiden potilaiden elinaikaa.
30 Tekijää VIII (tekijä VIII:C ja/tai vWF) sisältävät farmaseuttiset valmisteet voidaan valmistaa verestä tai veriplasmasta. Tällaisten valmisteiden valmistaminen voidaan suorittaa erilaisilla tunnetuilla tavoilla, joille kaikille on tunnusomaista erityisesti tekijän VIII:C alhaiset saannot. Lähes kaikille menetelmille on tunnusomaista alku-puhdistusvaihe, joka käsittää kryopresipitoinnin. Kryopresipitoinnilla jäädytetty 35 plasma sulatetaan lämpötilassa 0-4 °C, mikä tuottaa presipitaatin, joka käsittää tekijän VIII, joka voidaan kerätä esimerkiksi sentrifugoimalla. Vaikkakin kryopresipi-tointi on suhteellisen yksinkertaista, sen oleellisena haittana on se, että kun sitä käytetään laajassa mittakaavassa, so. plasmapoolit, jotka käsittävät yli 5 kg, se tuot- 2 103510 taa alhaisen tekijä VIII:C-saannon (30-45 % plasman painosta), mikä tarkoittaa, että lopullinen saanto on alhainen riippumatta siitä, mitä seuraavia puhdistusvaiheita käytetään.
5 Lisäksi tekijä VIII -valmisteiden tuottamiseen on sisällytetty tavallisesti virusten inaktivointivaihe. Virusten inaktivointivaiheet ovat lisänneet merkittävästi turvallisuutta valmisteiden virussisällön suhteen mutta ne laskevat useimmissa tapauksissa lisää tekijän VIII:C saantoa.
10 Tekijän VIII erittäin alhainen kokonaissaanto on johtanut näiden valmisteiden puutteeseen useilla alueilla ja siksi tarvitaan uusia menetelmiä tekijän VIII puhdistamiseksi suurena saantona tekijän VIII kysynnän tyydyttämiseksi hemofiliaa potevien hoidossa.
15 Uudet menetelmät tekijän VIII erottamiseksi suoraan plasmasta suurena saantona olisivat erittäin mielenkiintoisia, koska 70 % plasman tekijä VIII -pitoisuudesta katoaa jo kryopresipitaatiossa tai ennen sitä.
Äskettäin on yritetty eristää tekijä VIII suoraan plasmasta käyttämällä affiniteet-20 tikromatografiaa (Thromb. Haemost., 61, (2), 234-237 (1989)) mutta saatiin vain alle 60 %:n saanto ja spesifinen aktiivisuus 1IU tekijää VIII/mg proteiinia eristetystä tekijää VHI-sisältävästä fraktiosta.
Geelisuodatus, jota myös nimitetään geelinläpäisykromatografiaksi tai kokoeks- • · · — 25 kluusiokromatografiaksi, on diffuusiokontrolloitu menetelmä, jota käytetään liuot- teiden erottamiseen niiden koon mukaan. Liuotteet viedään kolonnin läpi, johon on pakattu inerttejä huokoisia geelipartikkeleita, joiden huokoskoko sulkee pois suurimmat molekyylit, kun taas pienemmät molekyylit hajaantuvat stationaariseen faasiin geelipartikkelien sisään. Täten suuremmat molekyylit, jotka suljetaan täydelli-30 sesti pois geelipartikkeleista, eluoidaan ensin "välisijatilavuudella", kun taas pienemmät molekyylit kulkevat pitemmän aikaan kolonnissa ja eluoituvat pienenevän koon mukaan nousevilla "eluointitilavuuksilla".
Geelisuodatus voidaan suorittaa kahdella erilaisella tavalla: 35 3 103510 1. Ryhmäerotustapa
Ryhmäerotustavassa liuotteet erotetaan kahteen ryhmään, joiden molekyylikoossa on suuri ero, toisen ryhmän ollessa eluoitu välisijatilavuudella ja toisen ryhmän ol-5 lessa eluoitu myöhemmin paljon suuremmalla eluointitilavuudella, joka on usein lähellä "pakatun kolonnin kokonaistilavuutta"; tätä menetelmää käytetään ensisijaisesti proteiinien erottamiseen liuenneista suoloista tai puskurin vaihtamiseen ja sitä nimitetään "suolanpoistoksi". "Suolan poistamiseksi" käytetään jäykkiä geelejä, joiden huokoskoko on pieni, ja menetelmä voidaan suorittaa käyttämällä suuria määriä 10 materiaalia (näytetilavuudet ovat 20-30 % pakatun kolonnin tilavuudesta) ja käyttämällä suuria virtausnopeuksia (noin yksi pakatun kolonnin tilavuus puskuria tunnissa), jolloin kolonnin kapasiteetti on suuri.
2. Fraktionointitapa 15
Fraktionointitavassa erotetaan liuotteet, joiden molekyylipaino on erilainen; tämä menetelmää käytetään usein proteiinien erottamiseen. Tähän käytetään geelipartik-keita, joissa on suurempia huokosia, ja geelisuodatusväliaine valitaan siten, että varmistetaan se, että proteiinit eluoidaan välisijatilavuuden ja eluointitilavuuden, jo-20 ka vastaa pakatun kolonnin kokonaistilavuutta, välissä. Substanssit eluoidaan paljon tarkemmin kuin käyttämällä ryhmäerotusolosuhteita ja ne voivat limittyä. Suuret virtausnopeudet eivät ole toivottuja, koska tämä ei mahdollista proteiinien tehokasta erottamista ja kolonnin panostus täytyy pitää alhaisena, jotta saadaan yksittäisten proteiinien järkevä erotus. Täten geelisuodatusta, jota käytetään fraktionointitavassa, 25 on suositeltu vain proteiinien erottamiseen viimeisenä siloitusvaiheena, jossa frak-tionoitava tilavuus on pieni (Jagschies, Ullmanns Encyklopedia of Industrial Chemistry, voi B3(10), 1988 ja Bio/Technol., 4, 954-58 (1986)).
Tekijää VIII on yritetty eristää plasmasta käyttämällä geelisuodatusta (J. Lab. Clin. 30 Med., 72, (6), 1968, 1007-1008 ja J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962). Kokeissa havaittiin hyvä puhdistuminen mutta saannot olivat vain noin 40-50 %. Saadun tekijää VIII sisältävän fraktion puhtauden havaittiin olevan riippuvainen lähtöplasmasta, sillä suuri lipidi- ja kylomikronipitoisuus tuotti samean tekijä VIII -fraktion, jossa on pienempi spesifinen aktiivisuus. On huomattava, että käytetty geelinsuodatustek-35 nilkka ei salli suurien plasmamäärien käsittelemistä, vaikka esitutkimukset osoittivat, että paljon konsentroidumman Cohn-fraktio I:n geelisuodatus näytti mahdolliselta.
4 103510
Lisäksi Paulssen et ai. (Thromb. Diathes. Haemorr., 22, 1969, 577-583) havaitsivat, että tekijä VIII voidaan erottaa muista plasmaproteiineista käyttämällä geeliväliaine-Sepharose 6B:tä mutta tämä kromatografia käyttämällä geelisuodatusta näytti mahdolliselta vain suuressa mittakaavassa, kun uudelleenliuotettua kryopresipitaattia 5 käytettiin lähtömateriaalina.
US-patentissa 3 637 489 selostetaan menetelmä verikomponenttien erottamiseksi käyttämällä geelisuodatusta ja käyttämällä huokoisia lasipallosia. Menetelmä on tarkoitettu erityisesti immunologisesti aktiivisten materiaalien erottamiseen muista 10 konstituenteista seerumissa tai plasmassa.
On suoritettu lukuisia yrityksiä geelisuodatuksen käyttämiseksi tekijän VIII puhdistamiseen, mutta yritykset ovat keskittyneet osittain puhdistettujen plasmafraktioiden geelisuodatukseen (uudelleenliuotetttu kryopresipitaatti ja siitä edelleen puhdistetut 15 fraktiot). Kaikki yritykset on suoritettu käyttämällä joko pieniä pylvään panostuksia ja/tai pieniä virtausnopeuksia tai niiden yhdistelmiä.
Geelisuodatus on tunnettu proteiinien fraktionointimenetelmänä jo vuodesta 1959 ja sitä käytetään laajasti biokemiallisissa tutkimuslaboratorioissa proteiinien karakteri-20 sointimenetelmänä ja menetelmänä proteiinien puhdistamiseksi näytteistä, joiden tilavuudet ovat pieniä, esim. alle 1 litran. Geelisuodatusta ei ole käytetty tähän keksintöön mennessä suuressa mittakaavassa plasman fraktionointiin proteiinien erottamiseksi ainoan käytön oltua etanolin ja suolojen suolanpoisto albumiiniliuoksista. Täten kuten viitekirjoissa todetaan: "Pääsyy, miksi geelisuodatuksesta ei ole tullut 25 pääteknikkaa plasman fraktionoinnissa, on vähäinen proteiinin läpimeno kolonnin tilavuutta kohti" (J.H. Berglöf: "Fractionation by Gel Filtration", s. 163-173, J.M. Curling (toim.): "Methods of Plasma Protein Fractionation", Academic Press, London, 1980) ja "Valitettavasti proteiinimassat, joita voidaan käsitellä kohtuullisen kokoisissa kolonneissa, ovat pieniä ja näytteen laimennusta ei voida laiminlyödä. Siksi 30 menetelmää ei paljon käytetä plasman fraktionoinnissa" (J.J. Morgenthaler et ai.: "Preservation of structure and function during isolation of human plasma proteins", s. 127-138, Smit Sibinga et al. (toim): Plasma Fractionation and Blood Transfusion", Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1985).
35 US-patentissa 4 675 385 selostetaan menetelmä tekijä VIII -esihyydyttävän proteiinin eristämiseksi plasmavalmisteesta, joka käsittää tekijän VIII, suuren molekyyli-painon konstituentit ja alhaisen molekyylipainon konstituentit, jaksoittaisella suuren j 103510 suorituskyvyn ekskluusiokromatografialla valmistamalla ensimmäisessä vaihessa plasmavalmisteen puskuroitu vesipitoinen koostumus ja erottamalla alhaisen mole-kyylipainon konstituentit viemällä koostumus huokoisen suuren suorituskyvyn nes-tekromatografiapallosten kromatografiakolonniin pallosten koon ollessa noin 5 13 mikronista noin 35 mikroniin ja eluoimalla kolonni puskuroidulla vesipitoisella eluentilla. Hyvän erottamisen saavuttamiseksi US-patentti 4 675 385 opettaa kolonnien käytön, joissa sivusuhde ei ole alle 10-40, mikä vähentää kapasiteettiä, muttei varmista tekijä VIII -konstituenttien hyvää erottumista alhaisen molekyyli-painon plasmaproteiineista. Kuitenkaan tämä ensimmäinen eristäminen ei takaa 10 proteiinien, joissa esiintyy tekijä VIII:C-aktiivisuutta, hyvää erottumista toisista plasmavalmisteen konstituenteista, joka valmiste saadaan vain suorittamalla toinen HPLC.
Täten tähän keksintöön mennessä on hyväksytty tosiasia, että geelisuodatus ei ole 15 sopiva menetelmä proteiinien erottamiseen plasman fraktionoinnissa, kun käsitellään suuria tilavuuksia, esim. yli 5 litraa.
Nyt on yllättäen havaittu, että kun valitaan geelisuodatusmateriaalit, jotka on suunniteltu suurille virtausnopeuksille, on tekijän VIII erottaminen mahdollista puhtaan 20 fraktion muodossa ja hyvin suurena saantona suoraan plasmasta hyvin vähäisellä mekaanisella erottamisella ilman että on turvauduttava normaaliin alkukryopresipi-tointiin.
Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään tekijän VIII erottamiseksi tekijän 25 VIII:C ja vWF:n yhdistelmän muodossa muista veriplasmassa olevista proteiineista käyttämällä geelisuodatusta.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että eristetty plasma tai sulatettu äskettäin jäädytetty plasma alistetaan geelisuodatukseen ryhmässä erotusolo-30 suhteita, joissa käytetään suurta panostusta ja suurta virtausnopeutta geelisuodatus-väliaineen koostuessa partikkeleista, jotka ovat inerttejä tekijään VIII ja niiden frak-tionointialue on välillä 1x10 -8x10 . Fraktionointialue voi vaihdella esim. välillä 5x104-4x107.
35 Edullisessa suoritusmuodossa lisätyn plasman tilavuus on vähintään 5 % pakatun kolonnin tilavuudesta. Lisätyn plasman määrä on edullisesti 15-40 % pakatun kolonnin tilavuudesta.
6 103510
Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan edullisesti käyttämällä virtausnopeutta vähintään 0,3 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa, edullisimmin 0,5-2 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa.
5 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Esillä olevassa keksinnössä käytetään geelisuodatusväliainetta, jossa on jäykkyys, joka sallii nopean eluaation. Lisäksi geelin tulee olla kemiallisesti ja immunologi-sesti inertti tekijään VIII geelisuodatuksen aikana. Kokeet ovat osoittaneet, että 10 esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa käyttämällä kaupallisia geelejä, kuten Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65(F) ja Matrex Cel-lufine CGL 2000, jotka kaikki ovat sopivia esillä olevan keksinnön tarkoitukseen. Tällaisten geelien partikkelikoko (märkä) on tavallisesti välillä noin 32 pm - noin 15 200 pm.
Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän erään suoritusmuodon mukaisesti jäädytetty plasma sulatetaan ja varmistetaan, että kaikki tekijä VIII on liuennut, minkä jälkeen sulatettu plasma lisätään edullisesti kolonniin välittömästi sen jäl-20 keen, kun kaikki tekijä VIII on liuennut. Lämpötilan ei anneta edullisesti nousta liian korkeaksi, jotta vältetään tekijän VIII liian laaja hajoaminen. Plasma voidaan esi-käsitellä lisäämällä esim. hepariinia, sitraattia, sakkaroosia, aminohappoja, suoloja tai muita stabilointiaineita ja suodattaa, sentrifugoida, konsentroida ultrasuo-datuksella, esipresipitoida käyttämällä tavallisia presipitointiaineita tai esikäsitellä 25 muulla tavalla ennen sen lisäämistä kolonniin kunhan optionaalinen esikäsittely ei vaikuta merkittävästi plasman tekijä VIII -pitoisuuteen.
On osoittautunut, että keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan erittäin suuri tekijän VIII saanto. Tavallisesti yli 70 % plasman tekijä VIII -pitoisuudesta palautuu 30 tuotteeseen ja menetelmä tuottaa erittäin puhtaita tuotteita, joiden spesifinen aktiivi suus on 1 - noin 4 IU tekijää VIII:C/mg proteiinia. Tämä voi osittain johtua seikasta, että käytettäessä keksinnön mukaista menetelmää tekijä VIII erottuu proteolyyttisis-tä entsyymeistä, jotka normaalisti aiheuttavat tekijän VIII:C hajoamisen hyvin varhain eristysprosessissa.
35
Keksinnön mukainen menetelmä mahdollistaa suurten plasmamäärien käsittelyn olosuhteissa, joissa plasmaa käytetään suurina panostuksina ja suurina virtausnope- i 7 103510 uksina geelisuodatuksessa, joka tuottaa tekijän VIII erittäin suuren talteenoton erittäin puhtaana. Täten taijotaan erittäin tehokasta menetelmää, jolla on teollista käyttöä.
5 Geelisuodatuksesta peräisin oleva (olevat) tekijää VIII sisältävä (sisältävät) fraktio (fraktiot) tai useammista geelisuodatuksista peräisin olevat yhdistetyt fraktiot voidaan sitten konsentroida ja puhdistaa käyttämällä itsessään tunnettuja tekniikoita, kuten ultrasuodatus, presipitoinnit, ioninvaihto, affiniteettikromatografia tai niiden kaltaiset.
10 Jäljelle jäävät plasmaproteiinit, kuten albumiini, immunoglobuliinit, protrombiini-kompleksi, antitrombiini III ja muut voidaan myös eristää geelisuodatuksen myöhemmistä fraktioista käyttämällä itsessään tunnettuja tekniikoita, kuten alkoholilla presipitointi, PEG-presipitoinnit, kromatografia tai niiden kaltaiset.
15
Tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittäminen voidaan suorittaa käyttämällä joko kaksivaiheista testiä tai yksivaiheista testiä. On todistettu tosiasia, että yksivaiheiset ja kaksivaiheiset testit voivat johtaa tekijä VIII:C-aktiivisuuden erilaisiin määrityksiin näytteessä. Lisäksi tiedetään, että toistetut määrittelyt käyttäen samaa testiä samassa 20 näytteessä voivat tuottaa vaihteluita tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittelyssä.
Tässä käytettynä ilmaus "plasma" tarkoittaa verta, josta on poistettu kaikki verisolut ja verihiutaleet esimerkiksi sentrifiigoimalla.
25 "Tekijä VIII:Ag" tarkoittaa tekijän VIE kaltaista antigeeniä ja "vWF:Ag" von Wil lebrand -tekijän kaltaista antigeeniä. "Pakatun kolonnin tilavuus" on määritetty pakatun geeliväliaineen ja välisijatilavuuden tilavuudeksi. "Välisijatilavuus" on määritetty geelipartikkelien välisen puskurin tilavuudeksi ja "eluointitilavuus" on spesifisen materiaalin eluoimiseen käytetyn puskurin tilavuus. Ilmausta "kolonnin täyte" 30 on käytetty kerrokseen lisätyn materiaalin tilavuuden ilmaisemiseen laskettuna pro-.: senttinä pakatun kolonnin tilavuudesta. Ilmauksen "fraktionointialue" on tarkoitettu tarkoittavan (globulaaristen) proteiinien tai suurempien molekyylien molekyylipai-nojen aluetta, jolle toimittaja on suositellut geelimateriaalia.
35 Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää selostetaan edelleen viitaten piirustuksiin ja esimerkkeihin, jotka selventävät keksinnön suoritusmuotoja. Esimerkit on 8 103510 annettu vain keksinnön valaisemiseksi eikä niitä ole tehty keksinnön piirin rajoittamiseksi, joka on määritetty oheistetuissa patenttivaatimuksissa.
Esillä olevaa keksintöä valaistaan lisäksi viitaten oheisiin piirustuksiin, joissa 5 kuvio 1 esittää käyrää, joka esittää tekijän VIII eluoitumisen geelisuodatuksella esillä olevan keksinnön mukaisesti ja joka on määritetty erilaisilla testeillä, ja kuvio 2 esittää erilaisten plasmaproteiinien eluointijärjestyksen geelisuodattamal-10 la tämän keksinnön mukaisesti.
Esimerkki 1
Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi 15 Halkaisijaltaan 2,6 cm:n kolonniin pakattiin Sepharose CL-4B:tä lopulliseen 60 cm:n korkeuteen.
Eräästä tanskalaisesta veripankista peräisin oleva jäätynyt plasma sulatettiin 25 °C:een vesikylvyssä. 1 IU hepariinia/ml lisäämisen jälkeen 50 ml plasmaa (16 % 20 pakatun kolonnin tilavuudesta) lisättiin kolonniin käyttäen virtausta 100 ml/h, minkä jälkeen kolonni eluoitiin käyttämällä 200 ml/h puskurin pakotettua virtausta, joka vastaa 0,63 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa. Kolonnin tasapainottaminen ja eluointi suoritettiin käyttämällä puskuria 0,02 M sitraattia, 0,15 M NaCl, pH 7,4. Puskuriin lisättiin lisäksi 2,55 ml 1 M CaCl2 litraa kohti, mikä tuottaa vapaan kai-25 siumionin (Ca ) konsentraation noin 7 x 10' M. Vapaan kalsiumionin konsentraatio tarkistettiin käyttämällä kalsiumselektiivistä elektrodia, joka oli Ingold GmbH:sta (Frankfurt/Main, Saksa). Fraktiot kerättiin ja jokaiselle fraktiolle määritettiin OD28o, tekijä VIII:C (käyttämällä sekä yksivaiheista hyytymistestiä sekä kaksivaiheista kro-mogeenistä testiä), tekijä VIII:Ag, albumiini, IgG, fibrinogeeni, IgM, alfa-2-makro-30 globuliini, tekijä IX, tekijä X, proteiini C ja antitrombiini III. Proteiini mitattuna OD280:lla, eluoitiin pienenä huippuna välisijatilavuudessa (fraktiot 10-18), mitä seurasi erittäin suuri leveä huippu (fraktiot 19-50, vrt. kuvio 1). 82 % tekijä VIII:C-aktiivisuudesta määritettynä kaksivaiheisella ja 91 % tekijä VIII:C-aktiivisuudesta määritettynä yksivaiheisella hyytymistestillä eluoitui yhdessä kasaumahuipussa, jos-35 sa on välisijatilavuus (tekijän VIII pääfraktio) yhdessä aikaisemman pienen proteii-nihuipun kanssa. Loput tekijästä VIII eluoitui pienessä seuraavassa huippuhännässä välittömästi tekijän VIII pääfraktion jälkeen (fraktiot 19-26). Tekijä VIII:Ag ja 9 103510 vWF:Ag eluoituivat yhdessä tekijän VIII:C kanssa, mutta niissä oli hieman laajemmat niitä seuraavat huippuhännät. Kaikki muut määritetyt plasmaproteiinit eluoituivat fraktiossa, joka on tekijän VIII pääfraktion jälkeen yhdessä suuren leveän huipun kanssa (katso kuvio 2). Tekijästä VIII:C erotettujen plasmaproteiinien molekyy-5 lipainot ovat seuraavat:
Antitrombiini ΙΠ 65000 D
Proteiini C 62000 D
Tekijä X 59000 D
10 Tekijä IX 57000 D
Alfa-2-makroglobuliini 718000 D
IgM 900000 D
Fibrinogeeni 340000 D
IgG 150000 D
15 Albumiini 67000 D
Tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittely käyttäen kaksivaiheista kromogeenistä testiä suoritettiin käyttämällä kromogeenistä substraattimenetelmää (KABI, Coatest Factor VIII), alkuperäisessä menetelmässä käytetään testiputkia 37 °C:ssa ja se on oli mo-20 difioitu suoritettavaksi käyttämällä mikrotiitterilevyjä käyttäen vähemmän reagens-seja. Käytetään 50 mikrolitran näytettä tai standardia, jota inkuboidaan sen jälkeen kun siihen on sekoitettu 75 mikrolitraa fosfolipidiliuosta, tekijää IXa, tekijää X ja CaCh, 37 °C:ssa 15 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 50 mikrolitraa substraattia. 20 minuutin lisäinkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen reaktio sammutetaan lisäämällä 25 50 mikrolitraa 1 M sitruunahappoa. Värin kehittyminen luetaan 405 nm:ssä vertai lun ollessa 492 nm:ssä.
Tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittely käyttäen yksivaiheista testiä suoritettiin käyttämällä APTT-menetelmää (Activated Partial Thromboplastin Time). 100 mik-30 rolitraa näytettä tai standardia pipetoidaan kulhoihin, minkä jälkeen lisätään . 100 mikrolitraa puutteista plasmaa (tekijä VHI-puutteinen plasma, General Diag nostic) ja liuosta lämpösäädettiin 37 °C:ssa 5 minuuttia. 100 mikrolitran 0,03 M CaCb lisäämisen jälkeen määritettiin aika, jossa liuos hyytyi.
35 Kvantitatiivisia määritettyjä varten tuotettiin kalibraatiokäyrät, jotka perustuvat vasten WHO-standardia (3rd Int. Standard of FVIII, Human plasma, 3,9 IU/ml) kalibroidun ominaisstandardin laimennussarjoihin. Tässä kuvatussa kaksivaiheisessa 10 103510 testissä on alempi (noin 10 kertaa) havaintoraja kuin yksivaiheisessa testissä. Lisättäessä hepariinia on edullista käyttää kaksivaiheista testiä, koska silloin voidaan poistaa kaikki mahdolliset hepariinin vaikutukset testiin helpommin laimentamalla.
5 Tekijä VIII:Ag määritettiin ELISAa käyttämällä käyttäen tekijä VIII -inhibiittori-potilaasta peräisin olevia vasta-aineita mikrotiitterilevyjen päällystysaineina (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Tanska) ja käyttämällä samasta inhibiittoripotilaasta peräisin olevia peroksidaasilla merkittyjä F(AB')2-fragmentteja sitoutuneen tekijän VIII määrittämiseen (Thromb. Haemost., 53(3), 1985, 346-350). Standardikäyrät 10 valmistettiin käyttämällä yhdistettyä normaalia plasmaa, joka oli kalibroitu vasten WHO-standardia (1st IRP, established 1982).
vWF:Ag määritettiin myös käyttämällä ELISAa mutta käyttämällä kanin antihu-maania vWG (DAKO, Tanska) päällystysmateriaalina ja peroksidaasilla merkittyä 15 kanin antihumaania vWF (DAKO, Tanska) sitoutuneen vWF:n määrittämiseen. Standardikäyrät valmistettiin käyttämällä samaa normaalia plasmaa kuin tekijä VIII:Ag:n ELISAn osalta.
Tekijä IX määritettiin käyttämällä yksivaiheista hyytymistestiä samalla tavoin kuin 20 tekijässä VIII:C käyttäen vain tekijä IX -puutteista plasmaa. IgG määritettiin käyttämällä säteisimmunodiffuusiota (Immunochemistry, 2, 1965, 235-254) ja albumiini, fibrinogeeni, alfa-2-makroglobuIiini, tekijä X, proteiini C ja antitrombiini III havaittiin käyttämällä raketti-immunoelektroforeesia (Anal. Biochem., 15, 1966, 45.52). OD28o määritettiin käyttämällä spektrofotometriä (Spectronic 601, Milton 25 Roy Company) ja proteiini käyttäen Kjeldahlia määritettiin Ph. Eur. 2. painos, I, V.3.5.2 mukaisesti presipitoimatta TCA:lla. Puhdistettujen fraktioiden spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijän VIII:C-konsentraation suhteena joko OD28o:aan tai proteiinin konsentraatioon määritettynä Kjeldahlia käyttäen. Käytettäessä OD28o spesifisen aktiivisuuden laskemiseen eivät erilaisten kokeiden tulokset ole suoraan 30 verrattavissa, jollei käytetä samaa lähtöplasmaa, koska tekijää VIII sisältävä plasma on usein sameaa, katso Ratnoff et al.:n tulokset (J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962).
Erilaiset kokeissa käytetyt geelisuodatusväliaineet olivat seuraavista lähteistä: 35 Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 ja Sephacryl S-500 olivat kaikki Pharmaciasta (Hiller<j>d, Tanska), Biogel A-5m, Fine oli BioRadista (Bie & Bemtsen, R<|>dovre, Tanska), „ 103510
Fractogel TSK HW-65(F) oli Merckiltä (Struers, R<|>dovre, Tanska) ja Matrex Cel-lufine GCL 2000 oli Amiconista (Helsingborg, Ruotsi).
Esimerkki 2 5
Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia geeli-suodatusväliaineita
Halkaisijaltaan 2,6 cm:n kolonniin pakattiin erilaisia geelisuodatusväliaineita, joilla 10 on erilainen fraktionointialue ja erilainen rakenne. Kaikissa tapauksissa pakatun kerroksen lopullinen korkeus oli 60 cm. Plasma sulatettiin kuten esimerkissä 1 kuvataan ja 1 IU hepariinia lisättiin. Jokaista geelisuodatusta varten kolonniin panostettiin 50 ml plasmaa (16 % pakatun kolonnin tilavuudesta). Kolonnin panostus ja puskurilla eluointi suoritettiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan. Virtausnopeus oli kaikissa 15 tapauksissa sama paitsi kokeessa, jossa käytettiin Biogel A-5m, jossa virtausnopeus laskettiin 50 ml:aan/h nousseesta vastapaineesta johtuen. Fraktiot kerättiin ja jokaisesta fraktiosta määritettiin OD28o ja tekijä VIII:C käyttämällä Coatestiä. Tekijän VIII pääfraktion spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijän VIII:C/ml suhteena OD28o:een. Kokeet toistettiin n kertaa käyttäen erilaisia plasmoja kutakin panostusta 20 kohti ja saannon keskiarvot ja spesifinen aktiivisuus laskettiin. Tekijän VIII pääfraktio valittiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1 kuvataan ja saanto on annettu tekijän VIII:C pitoisuutena tekijän VOI pääfraktiossa lisätyn plasman tekijän VIII:C pitoisuusprosenttina.
* · · 25 Fraktionointialue ja partikkelikoko erilaisten väliaineiden osalta ja lasketut keskiarvot on annettu seuraavassa taulukossa I.
12 103510
Taulukko I
Geelisuodatus- Fraktionoin- Kokeiden Saanto- Spesifinen Partikkelien väliaine alue MW määrä n % aktiivisuus halk. märkä, pm A 1x104-4x106 3 95 0,16 40-165 B 6x104-2x107 4 82 0,88 40-165 C 7x105-4x107 3 68 0,24 60-200 D 1x104-4x106 3 96 0,71 40-165 E 6x104-2x107 3 86 1,35 40-165 F 6x104-8x107 3 91 0,28 40-105 G 1x104-5x106 1 71 0,12 40-80 H 5x104-5x106 2 84 0,18 32-63 I 1x104-3x106 2 92 0,18 45-105 J 1x104-8x106 3 101 0,75 40-105 A: Sepharose CL-6B; B: Sepharose CL-4B; C: Sepharose CL-2B; D: Sepharose 5 6FF; E: Sepharose 4FF; F: Sephacryl S-500; G: Biogel A-5m, Fine; H:, Fractogel TSK HW-65(F); I: Matrex Cellufme GCL 2000; J: Sephacryl S-400.
Esimerkki 3 10
Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia kolonnin _____ panostuksia
Halkaisijaltaan 2,6 cm kolonniin pakattiin Sepharose 4FF lopulliseen korkeuteen 15 60 cm. Plasma sulatettiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan. Sulattamisen jälkeen plas
man pH säädettiin 7,0:aan käyttämällä 0,5 M HC1, 1 IU hepariinia ml kohti lisättiin ja plasma suodatettiin 10 mikrometrin nailonsuodattimen läpi. Kolonniin lisättiin 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml ja 70 ml plasmaa vastaavasti. Lisääminen, virtaus ja puskurilla eluointi suoritettiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan, joskin puskuri säädettiin 20 7,0:aan. Fraktiot kerättiin ja jokaisesta fraktiosta määritettiin OD280 ja tekijä VIII:C
käyttämällä Coatestiä. Tekijän VIII pääfraktion spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijän VIII:C/ml suhteena OD2go:een. Kokeet toistettiin kolme kertaa käyttäen erilaisia plasmoja kutakin panostusta kohti ja keskiarvot (X) laskettiin. Tekijän VIII pääfrak-* tion tilavuus (ml) on tekijää VIII sisältävän fraktion tilavuus, joka voidaan kerätä en- ,3 103510 nen kuin suuri leveä proteiinihuippu (OD280) eluoidaan ja se valitaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1 kuvataan. Saanto on annettu tekijän VIII:C pitoisuutena tekijän VIII pääfraktiossa lisätyn plasman tekijän VIII:C pitoisuusprosenttina.
5 Lasketut arvot on annettu seuraavassa taulukossa II.
Taulukko II
Lisätyn plasman määrä Tekijän VIII Saanto pro- Spesif. aktiivi- pääfraktio sentteinä suus millilitroina miina % pakatun osa kolonnin tilav. no.
1 70 88 0,81 2 70 95 0,18 30 9,4 3 70 90 0,63 x 70 91 0,54 1 70 76 0,68 2 70 85 0,17 40 12,6 3 70 93 0,61 x 70 85 0,49 1 80 91 0,57 2 80 90 0,20 50 15,7 3 80 85 0,53 x 80 89 0,43 1 80 79 0,81 2 80 85 0,16 60 18,8 3 90 95 0,61 x 83 86 0,53 1 80 85 0,82 2 100 90 0,21 70 22,0 3 100 93 0,53 x 93 89 0,52 m 103510
Esimerkki 4
Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia eluoin-tiarvoja 5
Samaan kolonniinn kuin esimerkissä 3 käytettiin, lisättiin 50 ml plasmaa, joka sulatettiin kuten edelllä. Sulattamisen jälkeen plasman pH säädettiin 7,0:aan käyttämällä 0,5 M HC1, 1 IU hepariinia ml kohti lisättiin ja plasma suodatettiin 10 mikrometrin nailonsuodattimen läpi. Käyttämällä kolmea erilaista annosta plasmaa virtausnopeu-10 det 100, 200 ja 300 ml/h tutkittiin vastaavasti. Plasman lisäyksen ja sitä seuraavan eluoinnin aikana käytettiin samaa virtausta. Eluointi suoritettiin käyttämällä samaa puskuria kuin esimerkissä 3 kuvataan. Fraktiot kerättiin ja jokaisesta fraktiosta määritettiin OD280 ja tekijä VIII:C käyttämällä Coatestiä. Tekijän VIII pääfraktion spesifinen aktiivisuus ja saanto kuten esimerkissä 3. Tekijän VIII pääfraktion tila-15 vuuden keskiarvot (X), saanto ja spesifinen aktiivisuus laskettiin. Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa III.
Taulukko III
Virtaus Plasman Tekijän VIII Saanto pro- Spesifi aktiivi- osa no. pääfraktio sentteinä suus millilitroina ml/h pakatun kolonnin tilav.
1 80 89 0,75 2 80 88 0,17 100 0,31 3 80 80 0,65 x 80 86 0,52 1 80 84 0,99 2 80 88 0,18 200 0,63 3 80 89 0,79 x 80 87 0,65 1 70 85 0,72 2 80 96 0,18 300 0,94 3 80 83 0,44 x 77 88 0,45 20
Esimerkki S
15 103510
Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia kolonnin panostuksia 5
Halkaisijaltaan 10 cm kolonniin pakattiin Sepharose 4FF lopulliseen korkeuteen 60 cm. Eräästä tanskalaisesta veripankista peräisin oleva jäädytetty plasma sulatettiin 30 °C:ssa vesikylvyssä. Kolonniin lisättiin 925 g, 1427 g ja 2000 g plasmaa vastaavasti. Virtausta pidettiin noin 4200 ml/h plasman lisäämisen ja eluoinnin ai-10 kana käyttäen Masterflex-letkupumppua (Buch & Holm, Herlev, Tanska), mikä vastaa noin 0,89 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa. Eluointiin käytettiin samaa puskuria kuin esimerkissä 1. OD2go:tä tarkkailtiin jatkuvasti käyttämällä Pharmacia Monitor UV-l:tä. Kim OD28o alkoi nousta välisijatilavuuteen, aloitettiin tekijän VIII pääfraktion kerääminen ja se lopetettiin, kun OD28o osoitti, että suuri proteii-15 nihuippu alkoi olla eluoitunut. Tekijän VIII pääfraktiossa olevat tekijä VIII:C-pitoisuudet määritettiin käyttämällä yksivaiheista hyytymistestiä ja proteiini määritettiin käyttämällä Kjeldahlia. Spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijä Vlll-pääfrak-tiossa olevien tekijä VHI.C-yksikköjen kokonaisluvun suhteena tekijän VIII pääfraktiossa olevan proteiinin milligrammojen kokonaismäärään. Tekijän VIII:C 20 saanto laskettiin tekijän VIII pääfraktiossa olevan tekijän VIII:C pitoisuuksina lisätyssä plasmassa olevan tekijän VIILC pitoisuuksien prosentteina.
Tulokset on annettu taulukossa IV.
25 Taulukko IV
Lisätyn plasman määrä Tekijän VIII Saanto pro- Spesifi aktiivi- pääfraktio sentteinä suus IU/mg grammoina grammoina % panostetun •« kolonnin tilavuudesta 925 19,6 1192 74 2,50 1497 31,8 1860 73 2,24 2000 42,4 2200 81 1,08
Esimerkki 6 16 103510
Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä teollisuusko-koista kolonnia 5
Halkaisijaltaan 29 cm:n kolonniin pakattiin Sepharose 4FF. Sen jälkeen kun oli tasapainotettu samalla puskurilla kuin esimerkissä 1, geelikorkeus oli 53 cm. 10 kg eräästä tanskalaisesta veripankista peräisin olevaa jäädytettyä plasmaa sulatettiin ja se kuumennettiin 30 °C:een, minkä jälkeen se lisättiin kolonniin. Lisätty määrä oli 10 28,8 % pakatun kolonnin tilavuudesta. Virtausta 30 ml/h, joka vastaa 0,86 pakatun kolonnin tilavuutta, ylläpidettiin käyttäen Masterflex-letkupumppua lisäämisen ja eluoinnin aikana käyttäen tasapainotuspuskuria. OD28o:tä tarkkailtiin jatkuvasti käyttämällä Pharmacia Monitor UV-l:tä ja silloin kuin osoitettiin ensimmäinen OD280:n nousu välisijatilavuuteen, kerättiin tekijän VIII pääfraktio. Kaiken kaikki-15 aan kerättiin 11,73 kg tekijän VIII pääfraktiota. Sitten määritettiin tekijä VIII:C-pitoisuudet käyttämällä yksivaiheista hyytymistestiä ja proteiini määritettiin käyttämällä Kjeldahlia. Tekijän VIII fraktiosta havaittiin kaiken kaikkiaan 8798 IU tekijää VIII:C ja alle 2346 milligrammaa proteiinia, mikä tuottaa tekijän VIII:C saannon 880 IU/kg plasmaa, mikä vastaa 88 % saantoa tuotteen muodossa, jonka 20 spesifinen aktiivisuus on yli 3,75 IU/mg proteiinia.
Keksinnön mukaisella menetelmällä saatu tekijän VIII fraktio voidaan puhdistaa lisäksi tavalla, joka on analoginen uudelleen liuotetun kryopresipitaatin konventionaalisen puhdistuksen kanssa ja käsittää esimerkiksi lisäkromatografrapuhdistuksen « · · 25 ja lyofilisoinnin käyttäen tavallisia täyteaineita vakaan valmisteen muodostamiseksi. Valmiste rekonstruoidaan ennen käyttämistä käyttäen sopivaa konventionaalista apuainetta.
i
Claims (6)
1. Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi muista veren plasmassa olevista proteiineista käyttämällä geelisuodatusväliainetta, tunnettu siitä, että eristetty plasma 5 tai sulatettu äskettäin jäädytetty plasma, joka on esikäsitelty optionaalisesti, kunhan optionaalisella esikäsittelyllä ei ole mitään merkittävää vaikutusta plasman tekijä Vili -pitoisuuksiin, alistetaan suoraan geelisuodatukseen ryhmäerotusolosuh-teissa, jolloin lisätyn plasman tilavuus on vähintään 5 % pakatun kolonnin tilavuudesta ja jolloin virtausnopeus on vähintään 0,3 pakatun kolonnin tilavuutta 10 tunnissa geelisuodatusväliaineen ollessa koostettu partikkeleista, jotka ovat inertte-jä tekijälle VIII ja joiden fraktionointialue on välillä Ixl03-lxl08, ja tekijän VIII pääfr aktio kerätään.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geelisuoda-15 tusväliaine koostuu geelimateriaalista, jonka fraktionointialue on välillä lxlO4- 8x107.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geelisuoda-tusväliaine koostuu geelimateriaalista, jonka fraktionointialue on välillä 5xl04- 20 4xl07.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätyn plasman tilavuus on 15-40 % pakatun kolonnin tilavuudesta.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virtausnopeus on 0,5-2 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu tekijä VIII puhdistetaan lisäksi tavalla, joka on analoginen uudelleen liuote-30 tun kryopresipitaatin konventionaalisen puhdistamisen kanssa analoginen ja käsit-tää esimerkiksi lisäkromatografiapuhdistamisen ja lyofilisoinnin käyttämällä tavallisia täyteaineita stabiilin valmisteen muodostamiseksi.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK562189 | 1989-11-09 | ||
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
| DK9000279 | 1990-11-05 | ||
| PCT/DK1990/000279 WO1991007438A1 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | A method for isolating factor viii |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI922105A0 FI922105A0 (fi) | 1992-05-08 |
| FI922105A FI922105A (fi) | 1992-05-08 |
| FI103510B1 FI103510B1 (fi) | 1999-07-15 |
| FI103510B true FI103510B (fi) | 1999-07-15 |
Family
ID=8144000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI922105A FI103510B (fi) | 1989-11-09 | 1992-05-08 | Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5245014A (fi) |
| EP (1) | EP0524172B1 (fi) |
| JP (1) | JP2509407B2 (fi) |
| CN (1) | CN1044121C (fi) |
| AT (1) | ATE118508T1 (fi) |
| AU (1) | AU631471B2 (fi) |
| BG (1) | BG61231B1 (fi) |
| CA (1) | CA2073012C (fi) |
| CZ (1) | CZ537190A3 (fi) |
| DE (1) | DE69017050T2 (fi) |
| DK (1) | DK162233C (fi) |
| ES (1) | ES2068404T3 (fi) |
| FI (1) | FI103510B (fi) |
| HU (1) | HU214905B (fi) |
| IE (1) | IE66836B1 (fi) |
| IL (1) | IL96277A (fi) |
| NO (1) | NO180741C (fi) |
| NZ (1) | NZ236004A (fi) |
| PL (1) | PL164894B1 (fi) |
| PT (1) | PT95830B (fi) |
| RU (1) | RU2055593C1 (fi) |
| SK (1) | SK278640B6 (fi) |
| UA (1) | UA29421C2 (fi) |
| WO (1) | WO1991007438A1 (fi) |
| YU (1) | YU47524B (fi) |
| ZA (1) | ZA908599B (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0399321T3 (da) * | 1989-05-24 | 1993-08-09 | Miles Inc | Gelfiltrering af varmebehandlet faktor VIII |
| US6180371B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-01-30 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US5859204A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
| US6290527B1 (en) * | 1998-07-03 | 2001-09-18 | Nippon Telegraph And Telephone Corp. | Nippon telegraph and telephone corporation |
| MXPA01008515A (es) * | 1999-02-22 | 2003-06-06 | Baxter Int | Formulaciones novedosas de factor viii libres de albumina. |
| JP2002348300A (ja) * | 1999-04-12 | 2002-12-04 | Fujimori Kogyo Co Ltd | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子および血液凝固第ｖｉｉｉ因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法 |
| AUPR638801A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Life Therapeutics Limited | Factor viii separation |
| PT1750733E (pt) | 2004-05-03 | 2014-02-14 | Baxter Healthcare Sa | Método de administração de factor viii suíno sem domínio b |
| WO2006021584A2 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Novo Nordisk Health Care Ag | Purification of factor xiii polypeptides from biological materials |
| US20060226086A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Robinson Thomas C | Centrifuge for blood processing systems |
| ES2706296T3 (es) * | 2008-11-07 | 2019-03-28 | Univ Connecticut | Formulaciones de Factor VIII |
| ES2740825T3 (es) * | 2010-03-30 | 2020-02-06 | Octapharma Ag | Un procedimiento de purificación de proteínas dependientes de vitamina K |
| RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
| EA035447B1 (ru) | 2010-11-05 | 2020-06-17 | Баксалта Инкорпорейтид | Выделенный рекомбинантный вариант фактора viii (fviii) с частично удаленным в-доменом |
| SG191186A1 (en) | 2010-12-15 | 2013-07-31 | Baxter Int | Eluate collection using conductivity gradient |
| CN103506080A (zh) * | 2012-06-19 | 2014-01-15 | 汪志友 | 一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法 |
| JP6284481B2 (ja) * | 2012-09-28 | 2018-02-28 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固反応の評価方法 |
| US9663553B2 (en) * | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
| US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
| AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
| DE3851696T2 (de) * | 1987-12-21 | 1995-02-23 | Miles Inc | Faktor VIII- Gelfiltration. |
| WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
| DK0399321T3 (da) * | 1989-05-24 | 1993-08-09 | Miles Inc | Gelfiltrering af varmebehandlet faktor VIII |
-
1989
- 1989-11-09 DK DK562189A patent/DK162233C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-26 ZA ZA908599A patent/ZA908599B/xx unknown
- 1990-11-01 CZ CS905371A patent/CZ537190A3/cs unknown
- 1990-11-01 SK SK5371-90A patent/SK278640B6/sk unknown
- 1990-11-05 JP JP3500067A patent/JP2509407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90917201A patent/EP0524172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 UA UA94020494A patent/UA29421C2/uk unknown
- 1990-11-05 ES ES90917201T patent/ES2068404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 AU AU67470/90A patent/AU631471B2/en not_active Ceased
- 1990-11-05 WO PCT/DK1990/000279 patent/WO1991007438A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-05 HU HU9201551A patent/HU214905B/hu unknown
- 1990-11-05 DE DE69017050T patent/DE69017050T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-05 CA CA002073012A patent/CA2073012C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 RU SU905052211A patent/RU2055593C1/ru active
- 1990-11-05 AT AT90917201T patent/ATE118508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-07 NZ NZ236004A patent/NZ236004A/xx unknown
- 1990-11-07 YU YU210590A patent/YU47524B/sh unknown
- 1990-11-07 US US07/610,480 patent/US5245014A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-08 PT PT95830A patent/PT95830B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IL IL9627790A patent/IL96277A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IE IE402290A patent/IE66836B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-09 CN CN90109030A patent/CN1044121C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-09 PL PL90287703A patent/PL164894B1/pl unknown
-
1992
- 1992-05-08 FI FI922105A patent/FI103510B/fi active
- 1992-05-08 NO NO921839A patent/NO180741C/no not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 BG BG96316A patent/BG61231B1/bg unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI103510B (fi) | Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi | |
| JP3110292B2 (ja) | フォンウィルブランド因子の高分子および低分子フラクション | |
| FI106721B (fi) | Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi | |
| US5880265A (en) | Method for isolation of highly pure von willebrand factor | |
| US4341764A (en) | Method of preparing fibronectin and antihemophilic factor | |
| AU737986B2 (en) | Purification of von willebrand factor by cation exchange chromatography | |
| CA2189947C (en) | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation | |
| JP2000506869A (ja) | 安定な因子ｖｉｉｉ／▲下ｖ▼ｗｆ複合体 | |
| JP2009161547A (ja) | 高度に精製された第ｖｉｉｉ因子コンプレックス | |
| JP4250769B2 (ja) | 高度に精製されたｖＷＦまたは因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を得る方法 | |
| US4455300A (en) | Fibronectin compositions | |
| US7939643B2 (en) | Production of a von Willebrand factor preparation using hydroxylapatite | |
| Holmberg et al. | Factor VIII: C and VIII: CAg response in patients with haemophilia A and von Willebrand's disease after administration of different factor VIII concentrates or plasma | |
| HRP930277A2 (en) | A method for isolating biologically active compounds |