DE3851696T2

DE3851696T2 - Faktor VIII- Gelfiltration.

Info

Publication number: DE3851696T2
Application number: DE3851696T
Authority: DE
Inventors: William J Brockway; Richard L Seng
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-12-13
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2008-12-14
Also published as: EP0321835B1; EP0321835A3; AU626275B2; JP2689390B2; CA1339477C; EP0321835A2; JPH01301625A; ATE112287T1; AU2731088A; DE3851696D1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung des Antibluterfaktors (antihämophiler Faktor AHF) aus menschlichem Plasma. Man weiß, daß AHF aus mehreren Bestandteilen besteht, der Wirkstoff bei der Behandlung der Hämophilie A ist Faktor VIII:C.
Es gibt zahllose Patente und Veröffentlichungen, die die Herstellung von AHF-Konzentraten als Teil der Fraktionierung von menschlichem Plasma betreffen. Solche Verfahren werden kommerziell seit ca. 20 Jahren verwendet, und zahllose Verfahrensvarianten sind beschrieben worden, wobei die Mehrzahl von ihnen die inhärenten Probleme solcher Verfahren, nämlich Virussicherheit, Ausbeute und spezifische Aktivität des erhaltenen Konzentrats betreffen. Die spezifische Aktivität bezieht sich auf die Aktivität des Faktors VIII, ausgedrückt in internationalen Einheiten, gemäß dem z. Zt. anerkannten Standard, pro mg Gesamtprotein.
Obwohl Gelfiltration oder Chromatographie, mit Ausnahme der Affinitätschromatographie, wie bei Zimmerman et al., Re. 32011 (US 4 361 509) beschrieben, nach dem Wissen der Erfinder gegenwärtig nicht kommerziell verwendet wird, sind verschiedene Chromatographieverfahren beschrieben worden. Es ist wichtig festzuhalten, daß die gesamte Affinitätschromatographie oder rDNA-Verfahren zu AHF mit nachweisbaren Mengen nicht-humanen Proteins führen.
Z. B. offenbart die PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 86 04486 ein Verfahren zur Reinigung von AHF durch "Hydrationsadditive", d. h. unter Verwendung von Säulenchromatographie in Gegenwart von Zuckern, Polyolen, Aminosäuren oder Salzen. Es wird eine niedrige Ausbeute bei Chromatographieverfahren aus dem Stand der Technik beschrieben.
Die Hydrationsadditive dienen zur Stabilisierung des AHFs. Kryopräzipitat wird in einem Puffer gelöst, es kann Aluminiumhydroxid zugegeben werden, und der Überstand wird gesammelt. Es wird ein PEG-Präzipitationsschritt durchgeführt. Anschließend erfolgen eine oder zwei Säulenchromatographieschritte unter Verwendung von Harzen wie QAE-Sephadex® A-25, QAE-Sepharose® 4B oder Arninohexal(A-H)- Sepharose®. Der erste Chromatographieschritt beruht auf einem Anionenaustausch, der zweite auf hydrophober Affinität.
Andersson, EP 197901, offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von AHF unter Verwendung der Immunaffinitätschromatographie mit nachfolgender HPLC auf einem Anion-Austausch-Adsorbens. Das Anion-Austauch-Adsorbens kann Mono® Q-Gel oder TSK® DEAE 5 PW-Gel sein. Fragmente werden anschließend durch Inkubation mit Thrombin erhalten.
Johnson, US-Patent 4 397 841, offenbart die Herstellung von Faktor VIII:C durch Fraktionierung von Plasma mit einer Folge von Adsorptionsschritten unter Verwendung von Polyelektrolyt- Copolymeren in Gegenwart von Heparin. Ein geeignetes Harz ist ein Copolymer von Ethylen und Maleinsäureanhydrid.
Chavin et al., US-Patent 4 495 175, offenbart die Herstellung eines hoch gereinigten AHFs aus AHF-Konzentrat. Das Konzentrat wird einer Trennung auf der Grundlage seines Stokes-Radius unterworfen, die z. B. durch Gelpermeationschromatographie auf vernetzter Agarose (z. B. BioGel® A-15M oder Sepharose® CL-4B) erfolgen kann. Der Pool wird anschließend durch Präzipitation oder Diafiltration konzentriert; Kalzium- oder Magnesiumkationen werden zur Verminderung des Stokes'schen Radius zugegeben und wiederum wird eine Trennung auf Grundlage des Stokes'schen Radius durchgeführt.
Verschiedene andere Schritte, wie sie im vorliegenden Verfahren durchgeführt werden, sind im Stand der Technik offenbart worden. Jedoch werden wie unten beschrieben, neue und unerwartete Ergebnisse und Modifikationen durch die Erfindung erreicht.
Liu et al., US-Patent 4 170 639, offenbaren z. B. ein Verfahren zur Herstellung von AHF, umfassend die Schritte: Unterwerfen des resolubilisierten Kryopräzipitats einer Aluminiumhydroxidadsorption bei einem sauren pH und 4ºC, Filtration, und wahlweise Ultrafiltration.
Rasmussen et al., US-Patent 4 650 858, offenbaren ein Verfahren zur Herstellung von AHF unter Verwendung eines 4%- PEG-Präzipitationsschrittes bei 18 bis 22ºC unter Entfernung des Fibrinogens. Darauffolgt ein zweiter PEG- Präzipitationsschritt bei 18 bis 22ºC mit 12%-PEG in Gegenwart einer Aminosäure wie 2M-Glycin zur Präzipitation des AHFs.
Shanbrom, US-Patent 4 069 216, diskutiert die PEG- Präzipitation, wie im Stand der Technik offenbart, z. B. in seiner 3 613 018, worin eine Präzipitation bei Raumtemperatur einen anschließenden Wasch- und/oder Glycin- oder Alkohol- Präzipitationsschritt erfordert, da das PEG in hohen Konzentrationen (10 bis 12%) eingesetzt wird. Kaltpräzipitation unter Verwendung von niedrigen PEG- Konzentrationen (2½ %) führte zu einem weniger gereinigten Produkt.
Liautaud et al., US-Patent 4 387 092, offenbaren eine Verbesserung gegenüber Shanbrom 4 069 216 darin, daß der Fibrinogen-Präzipitationsschritt unterhalb 15ºC mit weniger als 4% Polyol ausgeführt wird.
Polson, US-Patent 3 415 804, offenbart eine Plasmafraktionierung mit PEG bei Raumtemperatur um die 20ºC. Bei 0 bis 4% PEG präzipitierte Fibrinogen, gamma-Globulin präzipitierte bei 4 bis 8%, beta-Globulin bei 8 bis 12% und alpha-1- und alpha-2-Globuline und Albumine bei mehr als 12% PEG.
Schließlich existiert relevanter Stand der Technik hinsichtlich der Virusinaktivierung von AHF-Konzentraten.
Neurath et al., US-Patent 4 540 573, offenbaren die virale Inaktivierung von Faktor-VIII-Präparationen durch die Verwendung von Tri-(n-butyl)phosphat (TNBP). Dort wird vorgeschlagen, daß TNBP dem Plasmapool zugesetzt werden kann, und AHF kann von TNBP über einen Präzipitationsschritt, so z. B. mit Glycin, abgetrennt werden. In den Beispielen wird TNBP zu AHF-Lösungen mit einer Faktor-VIII-Aktivität von 8 bis 10 E/ml zugesetzt.
Andersson et al., US-Patent 4 168 300, offenbaren ein Verfahren zur Entfernung von Hepatitisvirus aus Plasma durch Adsorbieren des HBsAg oder AV-Antigens auf Agarosegel-Perlen, oder ein Copolymergel, woran ein hydrophober Ligand gekoppelt ist.
Lembach, US-Patent 4 534 972, offenbart die Verwendung von Kupfer-Phenanthrolin zur Virusinaktivierung von AHF- Präparationen. Die Substanz wird nach der Fraktionierung zugesetzt und kann durch Diafiltration entfernt werden.
Hohe Ausbeuten von Antibluterfaktor (AHF) können unter Verwendung von milderen Verfahrensschritten in Kombination mit einem chemischen Virusinaktivierungsprozeß und einem Gelfiltrationsschritt unter Bereitstellung von hoch gereinigtem AHF erreicht werden, welches im wesentlichen frei von infektiösen Agenzien ist, ohne wesentlichen Verlust der therapeutischen oder immunologischen Aktivität.
Jüngste Entwicklungen haben verbesserte Verfahren zur Befreiung von Plasmaproteinen von infektiösen Agenzien zur Verfügung gestellt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4 534 972, welches z. B. die Verwendung von Kupfer-Phenanthrolin offenbart. Tri-N-butylphosphat (TNBP) kann auch als ein chemischer Virusinaktivierungsschritt, im Gegensatz zu einem solchen durch Hitze, verwendet werden.
In einem besonderen Aspekt der Erfindung wird Kryopräzipitat durch Zentrifugation aus aufgetauten Pools von frischem gefrorenen humanen Plasma gewonnen. Überschüssige Nicht-AHF- Proteine werden durch Säurepräzipitation und Adsorption mit Al(OH)&sub3; und PEG-Präzipitation unter Bedingungen, welche eine hohe Präzipitation von Nicht-AHF-Proteinen gewährleisten, entfernt. Als Ergebnis ist kein Abkühlschritt erforderlich. Das AHF wird anschließend mit Glycin und Natriumchlorid präzipitiert. Das solubilisierte AHF-Konzentrat wird dann für die Virusaktivierung behandelt und hierauf gelfiltriert. Das bevorzugte Gel hat ein Ausschlußvolumen von 5 Millionen Dalton und 100 bis 200 mesh; es dient dazu, das AHF von der (den) Virusinaktivierungsverbindung(en) abzutrennen, wie auch das AHF von anderen Plasmakomponenten abzutrennen.
Anschließend wird das AHF nach Sterilfiltration in Gegenwart von Albumin lyophilisiert. Das durch dieses Verfahren hergestellte AHF ist frei von solchen nicht-humanen Proteinen, die bei einem monoklonal-gereinigten Produkt gefunden würden, hat eine hohe spezifische Aktivität und erwünschte Mengen an Willebrand-Faktor.

BEISPIEL 1

Kryopräzipitat (Kryo) aus einem normalen Plasmapool von plasmapherisierten Spendern wurde durch Zugabe von 3 kg WFI (Wasser für die Injektion)/kg Kryo gelöst. Das WFI kann bis zu 60 E/ml Natriumheparin enthalten bevor das Kryo zugegeben wird. 30,2 kg Kryo wurden zu 90,5 kg WFI bei einer Temperatur von 27ºC zugegeben und unter Auflösung des Kryos gemischt. Der Temperaturbereichs des WFI ist vorzugsweise 17 bis 37ºC, besonders bevorzugt 24 bis 30ºC. Obwohl das Verhältnis von 1 Teil Kryo zu 3 Teilen WFI im Beispiel verwendet wird, kann 1 Teil Kryo auf 4 Teile WFI unter Erhalt der gleichen Ergebnisse eingesetzt werden.
Die Kryo/WFI-Mischung wurde 30 Minuten bis zur Lösung gerührt. Die erhaltene Temperatur war 21ºC, wobei der bevorzugte Bereich 18 bis 25ºC ist. Die A&sub2;&sub8;&sub0; war 41,2, wobei der bevorzugte Bereich zwischen 38 und 44 ist, und der pH war 7,75, mit einem bevorzugten Bereich von 7,6 bis 8,0.
Der pH der gelösten Kryo/WFI-Lösung wurde auf 7,0 eingestellt, wobei der bevorzugte Bereich 6,0 bis 8,0, der besonders bevorzugte von 6,8 bis 7,2 ist, unter Zutropfen von 270 ml 1N Essigsäure, und die Suspension wurde 15 Minuten gerührt. Die mittlere Ausbeute war 116% mit einem Ausbeutebereich von 110 bis 127%. Die scheinbare Ausbeute stieg aufgrund des Entfernens von Fibrinogen und anderer Komponenten, die im AHF-Test stören. Die vorangehenden Schritte können bei Raumtemperatur unter Vermeidung eines Abkühlschrittes und anschließender Präzipitation, und unter Vermeidung von Proteindenaturierung ausgeführt werden.
Für den Adsorptionsschritt wurden 4826 ml Aluminiumhydroxid- Al(OH)&sub3;-Gel zu der sauren Kryosuspension zugegeben und 10 Minuten unter Bindung der Vitamin-K-abhängigen Faktoren gerührt. Die Menge von Al(OH)&sub3;-Gel entspricht 160 ml Al(OH)&sub3;- Gel pro kg Ausgangskryo, wobei der bevorzugte Bereich 100 bis 250 ml Al(OH)&sub3;-Gel pro kg des Kryos ist. Die mittlere Ausbeute über diesen Schritt ist 94% mit einem Ausbeutebereich von 90 bis 100%.
Für die Polyethylenglykol-(PEG)-Präzipitation wurden 3,6 kg PEG 3350 (3% PEG) zu der Al(OH)&sub3;-sauren Kryosuspension zugegeben, und der pH auf 7,06 mit 16 ml 1M Essigsäure readjustiert. Der pH-Bereich ist 6,0 bis 8,0, besonders bevorzugt 6,8 bis 7,3. Die Konzentration von PEG kann im Bereich von 2,5 bis 5% liegen. Die Suspension wurde 23 Minuten vor Zentrifugation gerührt. Die Temperatur der Suspension war 21,5ºC, vorzugsweise nicht weniger als 10ºC.
Die Suspension wurde mit einer Westphalia® BKA-6-Zentrifuge mit einer Flußrate von 4 ml/min, vorzugsweise in einem Bereich von 2 bis 6 ml/min, zentrifugiert. Die Ausflußtemperatur wurde auf 20ºC aufrechterhalten, mit einem bevorzugten Bereich von 18 bis 25ºC, mit einer Einlaßtemperatur von 21,5ºC, deren bevorzugter Bereich 20 bis 25ºC ist.
Das erhaltene Präzipitat wurde gesammelt, gewogen und abgenommen. 10,7 kg Präzipitat entsprachen 35,4% des Ausgangskryos. Das mittlere Präzipitat ist 32,4% mit einem Bereich von 29,0 bis 36,3%.
Der PEG-Auslaß wog 116,6 kg, hatte eine A&sub2;&sub8;&sub0; von 20,4 und einen pH-Wert von 7,26 bei einer Temperatur von 20ºC. Der Temperaturbereich ist vorzugsweise 20 bis 23ºC, falls erforderlich kann ein Aufwärmschritt für einen PEG-Auslaß mit einer Temperatur niedriger als 20ºC zusätzlich vorgesehen werden. Die mittlere Ausbeute an AHF, welches durch den PEG- Schritt gewonnen wurde, war 78% mit einem Bereich von 74,3 bis 86,1.
Ein wesentlicher Vorteil liegt in der Eliminierung des Abkühlschrittes, der üblicherweise bei der PEG-Präzipitation eingesetzt wird. Dies ist ein Vorteil, da der Abkühlschritt Fribinogen, Fibronectin, usw., aber auch AHF präzipitiert, und so die Ausbeute erniedrigt.
Zum PEG-Auslaß wurden 12,2 kg festes L-Glycin (oder 13% Glycin) unter Aufrechterhaltung des pHs bei 7,0, vorzugsweise in einem Bereich von 6,0 bis 8,0, unter Zugabe von 200 ml 1M Natriumhydroxid zugegeben. Die Zugabe von Glycin erniedrigte die Temperatur des PEG-Auslasses auf ca. 15ºC. Die Lösung wurde auf 20ºC erwärmt, wobei der bevorzugte Bereich 20 bis 22ºC ist. Die Lösung wurde 20 Minuten gerührt bis sie sich auflöste.
Zur Glycin-PEG-Auslaßlösung wurden 16,3 kg festes NaCl (oder 14% NaCl), während der pH bei 7,0 mit einem bevorzugten Bereich von 6,0 bis 8,0 mit 200 ml 1M NaOH aufrechterhalten wurde, zugegeben. Die Endtemperatur wurde auf 20ºC eingestellt, bevorzugt ist 20 bis 23ºC. Der End-pH war 7,03 mit einem Bereich von 6,9 bis 7,2. Die Lösung wurde 25 Minuten gerührt bis sie sich auflöste.
Der Glycin-NaCl-PEG-Auslaß wurde unter Entfernung der AHF- Paste mit einer Flußrate von 2,0 l/min zentrifugiert. Die Einlaßtemperatur war 20ºC, bevorzugt 20 bis 23ºC. Die Auslaßtemperatur wurde 21 bis 22ºC mit einem bevorzugten Bereich von 18 bis 25ºC aufrechterhalten. Die A280 des Auslasses wurde zu 9,1 bestimmt, und der Auslaß verworfen.
Die erhaltene abschließende AHF-Paste hat ein sehr gutes Verarbeitungsgewicht unter Vermeidung von AHF-Verlust oder großem Volumen an Säulengel. Ein zu niedriges Pastengewicht führt zu einem Verlust von AHF, in zu hohes Pastengewicht erfordert ein hohes Volumen an Säulengel vor dem Gelfiltrationsschritt.
Die gewonnene AHF-Paste wog 1,03 kg. Sie wurde in einem Puffer mit 0,02M L-Histidin, 0,10 M Ammoniumformiat, 1,5% Mannitol, 0,001 M CaCl&sub2; bei einem pH von 7,0 mit einem bevorzugten Bereich von 6,9 bis 7,1 gelöst. Der Puffer kann nicht mehr als 0,2 M Ammoniumformiat, 0,06 M L-Histidin, 0,003 M CaCl&sub2; und 3% Mannitol enthalten. Der Puffer soll die Proteinmodifikation minimieren, d. h. nicht-spezifische Bindung von Kupferpheanthrolin. Alternativpuffer können verwendet werden, z. B.: Wasser für die Injektion (WFI); 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,2; 0,05 M Imidazol, pH 7,0; oder 0,05 M Tris-HCl/0,15 M NaCl, pH 7,0, oder 0,02 M L- Histidin, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,2.
Das erhaltene gelöste AHF-Konzentrat hatte eine A&sub2;&sub8;&sub0; von 33,2, ein Gewicht von 3,84 kg und eine Aktivität von 432 E/ml. In vorhergehenden Läufen war die mittlere Aktivität bei 232 E/ml, der Bereich war 130 bis 287,5 E/ml. Aufgrund dieser viel höheren als normalen Aktivität im Vergleich zu höheren PEG-Präzipitationsverfahren werden die chemische Behandlung zur Virusinaktivierung und die Gelfiltrationsschritte ohne das Erfordernis eines weiteren Konzentrationsschrittes, wie früher notwendig, z. B. Ultrafiltration, durchgeführt. Die Ausbeute von AHF-Einheiten im Vergleich zum gelösten Kryo war 63,2%, im Mittel 67,3% mit einem Bereich von 56,7 bis 71,8%. In früheren Läufen war die Ausbeute von AHF aus dem PEG-Auslaß zum gelösten AHF- Konzentrat im Mittel 78,3% mit einem Ausbeutebereich von 68,3 bis 90,0%.
Das solubilisierte AHF kann bei -20ºC oder kälter eingefroren werden und bei -70ºC gelagert oder unmittelbar verarbeitet werden.
Das gefrorene (-70ºC) AHF-Konzentrat wurde in einem 27ºC warmem Wasserbad ca. 4 Stunden aufgetaut, bis die Temperatur des aufgetauten AHF-Konzentrats 25,2ºC war.
Es ist wichtig festzuhalten, daß alle diese Schritte bis zum wahlweisen Einfrierschritt bei Raumtemperatur durchgeführt wurden.
Ein 40-fach konzentrierter Kupfer-Phenanthrolin (CuPH)-Puffer wurde durch Mischen von 10 ml 0,1 M Histidin, 8 ml 0,01 M Kupfersulfatpentahydrat und 8 ml 0,5 M 1,10-Phenanthrolin hergestellt. Das Endvolumen wurde auf 200 ml mit WFI eingestellt. Ein Volumen von 87,5 ml CuPH-Puffer wurde zu 3500 ml des AH-Konzentrats in einem sterilisierten geschlossenen Reaktionsgefäß zugesetzt. Das geschlossene CuPH-Reaktionsgefäß wurde so konstruiert, daß es von einem zum anderen Ende rotiert um alle inneren Oberflächen zu benetzen. Die Sauerstoffzufuhr wurde über die Fusion durch einen 25 Fuß langen silastischen Schlauch für die medizinische Verwendung, der um eine Haltevorrichtung im Inneren des Reaktionsgefäßes aufgewickelt war, zur Verfügung gestellt. Während der Reaktion wurde Sauerstoff zur medizinischen Verwendung mit 2,5 psi dem Reaktionsgefäß zugeführt, welches mit einer Geschwindigkeit von 3 Upm rotierte.
Die CuPH-Reaktion wurde durch Zugabe von 35 ml 0,2 M L- Cysteinhydrochloridmonohydrat, wie in dem obigen US-Patent Nr. 4 534 972 beschrieben, eingeleitet. Wie in diesem Patent beschrieben, wurde eine zweite Zugabe von 17,5 ml 0,2 M L- Cysteinhydrochlorid injiziert, nachdem die erste Zugabe verbraucht war. Die Zugabe wurde ebenfalls oxidiert.
Vor der Entleerung und Spülung des Reaktionsgefäßes wurde dieses in einen virusfreien Raum überführt, und das Äußere des Reaktionsgefäßes mit Natriumhypochlorid desinfiziert. Die CuPH-Reaktionsmischung wurde auf nicht mehr als 37ºC erwärmt und vorfiltriert. Der Vorfiltrationsschritt ist nicht erforderlich, wird jedoch angewandt, um die Standzeit der Gelfiltrationssäule zu verlängern. Vier Pharmacia KS 370/15- Moduleinheiten wurden in Serie geschaltet und vom Boden bis zum oberen Ende unter Verwendung einer MasterFlex® gefahren. Das vorgefilterte AHF wurde auf die mit BioGel® A-5M (100 bis 200 mesh) gepackte Pharmacia-Modulsäule mit 8,4 l/h mit einem Beladungsbereich von 6 bis 12 l/h gepumpt.
Das aus dem CuPH-Reaktionsgefäß gewonnene AHF war 90% des AHFs im AHF-Konzentrat, im Mittel 88,3% mit einem Bereich von 80,7 bis 93,5%. In offenen CuPH-Reaktionsgefäßen, wie in einem Rührkolben, wurde eine mittlere Ausbeute von 93,7% mit einem Bereich von 88 bis 98,7% erreicht. Dies sind sehr hohe Ausbeuten im Vergleich zu konventionelleren nassen Hitze-Virusinaktivierungsschritten, bei denen ein ca. 25%iger Verlust der AHF-Aktivität durch die Pasteurisierung, Diafiltration und Ultrafiltration beobachtet wird. Zusätzlich minimieren die milden Verfahrensschritte auch die Wahrscheinlichkeit von schädlichen Effekten auf die Proteine.
Die Modulsäure wurde mit einem 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,16 haltigen Puffer bei 22ºC äquilibriert. Die Bereiche für den Puffer sind nicht mehr als 0,2 M NaCl, nicht mehr als 0,003 M CaCl&sub2;, pH 6,8 bis 7,8 und die Temperatur von 16 bis 26ºC. Nach dem die gesamten 3,9 kg des CuPH-behandelten AHFs durch die Säule gepumpt worden waren, wurde derselbe Puffer der zur Äquilibrierung der Säule benutzt worden war, als Elutionspuffer verwendet. Der Elutionspuffer wurde auf die Säule mit einer Flußrate von 9,0 l/h, mit einem Bereich von 6 bis 12 l/h gepumpt. Es können alternative Puffer verwendet werden, z. B. 0,05 M Trizmabase, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,4 oder 0,02 M L-Histidin, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,2. Da der Elutionspuffer im letzten Behälter vorliegt, sollte er nicht-toxisch sein und die Ionenstärke sollte nicht so hoch sein, daß er den AHF vom Willebrand-Faktor dissoziiert.
Der vorgefilterte CuPH-behandelte AHF, 3,9 kg, wurde unter Verwendung von einer 64 l-A-5M (100 bis 200 mesh) Bio-Gel®- Säule von Bio-Rad, die mit dem obigen Elutionspuffer äquilibriert worden war, mit einer Aufbringmenge von 6,1% des Gelvolumens, wobei der bevorzugte Bereich 5 bis 8,0% des Gelvolumens für eine wirksame Trennung und Ausbeute ist, gelfiltriert. Mehr Gelvolumen würde zu einem Verlust der Aktivität im AHF-Pool führen, weniger Gelvolumen würde die Ausbeute erniedrigen. Die Zeit zwischen der Aufgabe des AHFs auf die Säule bis zum Beginn der Sammlung des AHF-Pools war 2,35 Stunden. Die Sammlung des AHF-Pools wurde begonnen, wenn der UV-Monitor eine Elution von A&sub2;&sub8;&sub0; anzeigte. Das Leervolumen (Vo) war 20,03 kg.
Der AHF-Pool wurde gesammelt, bis eine direkte A&sub2;&sub8;&sub0;- Spektrometerablesung anzeigte, daß eine A&sub2;&sub8;&sub0; von 2,0 erreicht war. Es wurde ein Gewicht von 14,8 kg AHF-Pool gesammelt. Gelfiltration ist ein wirksames Mittel zur Entfernung der Kupfer-Phenanthrolinreaktanten, was durch die Tatsache nachgewiesen wird, daß, wenn der AHF-Pool einmal eluiert ist, die rosaroten CuPH-Reaktanten immer noch weniger als die Hälfte des Weges durch die Säule zurückgelegt haben. Ferner werden große Proteine wie Fibrinogen und Fibronectin ebenfalls durch Gelfiltration abgetrennt.
Es wurden Experimentreihen durchgeführt um zu bestätigen, daß die CuPH-Reaktanten entfernt waren, und zur Bestimmung des Restgehalts von Phenanthrolin (PF) unter Verwendung von radioaktiv-markiertem ¹&sup4;C. ¹&sup4;C-PH wurde hergestellt und zur Überwachung der Entfernung der Verbindung während verschiedener Verfahrensschritte verwendet. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß Gelfiltration ein wirksames Verfahren zur Entfernung von freiem PH vom AHF und anderen Proteinen ist. Weitere Untersuchungen zeigten, daß die Assoziation von PH mit Protein sich um ca. 4- bis 5-fach erniedrigte, wenn die Reaktion in Gegenwart von Ammoniumformiat Histidin und Mannitol durchgeführt wurde. Diese Verbindungen werden dem Verfahren zugesetzt, um das Vorliegen kleiner Restmengen von mit dem Protein assoziiertem PH zu minimieren.
Der gewonnene AHF-Pool hatte einen pH von 6,85, eine A&sub2;&sub8;&sub0; von 1,21, ein Gewicht von 14,8 kg und eine Aktivität von 56,6 E/ml. Dies ergibt eine spezifische Aktivität von 56,6/1,21 = 46,8 E/A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheit und eine Reinheit von 46,8/13 (für das AHF-Konzentrat) = 3,6-fach. Die Ausbeute durch die Säule war 75,5%, mit einer mittleren Ausbeute von 79,5% und einem Bereich von 70,1 bis 89,9% aus vorhergehenden Läufen. Aufgrund der hohen Aktivität des AHF-Pools (56,6 E/ml) wurde keine Ultrafiltration durchgeführt. Tatsächlich mußte der AHF-Pool mit Säulenpuffer bis auf ca. 35 E/ml für die weitere Verarbeitung herab verdünnt werden. Falls jedoch eine höhere Endbehälterkonzentration erwünscht ist, kann der AHF-Pool leicht auf 100 bis 300 E/ml, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt, ultrafiltiert werden.
Obwohl dieser bestimmte AHF-Pool-Lauf nicht eingefroren wurde, wurden vorhergehende AHF-Pools von der Gelfiltrationssäule eingefroren und bei -70ºC als ein Zwischenschritt bis zur Abpackung und Gefriertrocknung gelagert.
Es wurde normales Serumalbumin zugegeben, so daß die berechnete Endbehälteraktivität ca. 25 E/ml ist. 492 ml 25%iges Albumin wurde zugegeben, um die Rekonstitution im Endbehälter zu unterstützen. Diese Albuminmenge entspricht 5 mg Albumin pro ml AHF-Lösung, mit einem Bereich von 1 bis 10 mg Albumin, bevorzugt 3 bis 5 mg Albumin pro ml AHF. Zusätzlich zum Albumin kann der Endbehälter Stabilisatoren, wie 0,2 M Glycin und 0,001 M CaCl&sub2; oder 0,15 M NaCl und 0,001 M CaCl&sub2; enthalten.
Der Human-Serumalbumin-(HSA)-Pool wurde mit einem 10inch- Duofine, einem 12inch-CWSS und als Sterilfilter, einem 10inch-Millipore TP, steril filtriert. Die Sterilfilter wurden mit frischem Säulenpuffer auf ein Endsammelgewicht von 24,6 kg gespült. Die AHF-Ausbeute über die Sterilfiltration war 91,5%, im Mittel 85% und einem Bereich von 78 bis 92,6%. Die A&sub2;&sub8;&sub0; des steril filtrierten AHFs war 5,15.
Die sterile AHF-HSA-Lösung wurde in einem sterilen Sammelbehälter gemischt und aseptisch in 50ml-Flaschen gefüllt, jeweils 20 ml in eine Flasche, in einen Produktions- Gefriertrockner eingebracht und gefriergetrocknet. Die Ausbeute über die Gefriertrocknung war 89,8%, im Mittel 89,4% und einem Bereich von 78 bis 11%.
Die Endbehälter wurden einer intensiven Qualitätskontrollanalyse unterworfen und erwiesen sich als eine stabile Pyrogen-freie, sterile, sichere Präparation mit sehr niedrigen Mengen an IgG, IgM, IgA, Fibrinogen und Fibronectin.
Die Konzentration des Endbehälters war 610 AHF- Einheiten/20 ml mit einer spezifischen Aktivität von 5,7 AHF- Einheiten/mg Protein, und es wurden sehr geringe Mengen von Kupfer und Phenanthrol in nachgewiesen.

BEISPIEL 2

Proben von derselben Charge des ultrafiltrierten AHF- Endbehälterkonzentrats mit niedriger spezifischer Aktivität wurden über verschiedene Gelfiltrations-(GF)-Säulen filtriert und auf ihre Effizienz bei der Abtrennung von AHF vom Rückstand und anderen Verunreinigungen verglichen. Die verschiedenen Gelfiltrationsharze wurden in 2,6 · 25 cm- Säulen gegossen, und es wurden 10 ml des Konzentrats aufgebracht und gelfiltriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Pool 1 entspricht dem AHF-Pool, der bei Überwachung des Anstiegs von A&sub2;&sub8;&sub0; auf 2,0, wie oben beschrieben, aufgefangen wurde. Pool 2 entspricht dem Rest des aus der bestimmten Gelfiltrationssäule eluierten A&sub2;&sub8;&sub0;. Die gesamte Ausbeute entspricht der Summe der Ausbeuten im Pool 1 und 2.
Der Tabelle kann entnommen werden, daß Pharmacia Cl-4B, BioGel® A-15M und LKB Ultrogel® A4 ebenfalls Resultate ergeben, die ähnlich denen sind, wie sie mit BioGel® A-5M von Bio-Rad erreicht werden. In getrennten Experimenten wurde gefunden, daß das 100 bis 200 mesh BioGel® A-5M-Harz im Vergleich zu den anderen beiden Mesh-Größen optimal war. "Mesh" bezieht sich auf den US-Standard "Wet Mesh Designation" (hydratisiert).
Diese Gele werden so ausgewählt, daß sie Fraktionierungsbereiche haben, welche die Abtrennung des AHF/von Willebrand-Komplexes von der Mehrzahl der anderen Verunreinigungen, wie Fibrinogen, Fibronectin, usw. erlauben.
Einige der in Tabelle 1 gezeigten Gele führten zu weniger als 50% Ausbeute an AHF, vermutlich aufgrund ungenügender Fraktionierungsbereiche. Alle erlauben die Entfernung chemischer Reaktanten aus den beschriebenen Virusinaktivierungsschritten, da solche Reaktanten ein Molekulargewicht von weniger als 300 d haben.
Die Pharmacia-Gele sind alle vernetzte Agarose in Perlenform. Die BioGel®-Harze sind alle Gele auf Agarosebasis. LKB- Ultrogel® A4R hat 4% Agaroseperlen. Die Fractogele® sind hydrophile halbfeste kugelförmige Gele, die aus Vinylpolymeren hergestellt sind. Die CPG-Reihe entspricht Glasperlen mit kontrollierten Poren. TABELLE I VERGLEICH DER GELFILTRATIONSHARZE Anzahl Läufe Pool 1 Ausbeute spez. Aktivität Reinigung Pool 2 Gesamtanreicherung Pharmacia

BEISPIEL 3

Um zu zeigen, daß Kupfer-Phenanthrolin einen geeigneten Weg zur Verminderung des Risikos einer Virusübertragung von therapeutischen biologischen Produkten darstellt, wurden solubilisierte AHF-Konzentrate mit Viren aus verschiedenen taxonomischen Gruppen kontaminiert und mit CuPH behandelt.
Es wurde ein geschlossenes Reaktionsgefäß entworfen, konstruiert und auf seine Fähigkeit zur Inaktivierung der Modellviren getestet. Es wurden Volumen von 3,5 bis 4,0 l AHF-Konzentrat verwendet, um das Reaktionsgefäß zu testen. Die Temperatur war von 23 bis 27ºC. Sauerstoff zur Durchführung der CuPH-Reaktion wurde durch Diffusion bei 2,5 psig durch 25 Fuß lange silastische Schläuche, die auf einer Haltevorrichtung im Inneren des Reaktionsgefäßes aufgewickelt waren (siehe Beispiel 1), zugeführt. Es wurde eine Schüttelrate von 3 Upm gewählt. Es wurden Sindbis-, visikularer Stomatitisvirus (VSV)- und Visnaviren vor der Initiierung der CuPH-Reaktion zum Reaktionsgefäß gegeben. Die folgende Tabelle faßt die Bewertung der Virusinaktivierung durch CuPH für die großmaßstäblichen Produktionskonzentrate zusammen. TABELLE II CuPH-Reaktionsgefäß-Virusbelastungen Kontrolle Zeit Ende der ersten CuPH-Reaktion Ende der zweiten CuPH-Reaktion
a betrifft P.F.U./ml oder "Plaque Forming Units/ml" von VSV
b betrifft T.C.I.D.&sub5;&sub0;/ml oder "Tissue Culture Infectious Dose - 50%/ml"
Wie man aus der Tabelle ersehen kann wurden alle Modellviren in einem hohen Maß inaktiviert. Es konnte kein nachweisbares Virus nach der CuPH-Reaktion im Reaktionsgefäß gefunden werden, wenn SINDBIS oder 2 Läufe von VISNA-Virus zugesetzt wurden. Aufgrund der Toxizität der AHF-GF-CuPH-Reaktanten konnten unverdünnte proben nicht titriert werden. Der Endtiter von ≤1,5 logs an Virus entspricht keinem nachweisbaren Virus in irgendeiner der bei einer Verdünnung von 1 : 10 geprüften Proben. Bei der VSV-Belastung wurde ein Plaque auf einer der Zweifach-Testplatten beobachtet. Es wurden jedoch 6,5 logs VSV in diesem Reaktionslauf inaktiviert. Diese Ergebnisse belegen, daß das Ausmaß der Virusinaktivierung bei großmaßstäblichen Produktionsbedingungen vergleichbar mit den Virusbelastungen war, die in gerührten kleinmaßstäblichen Gefäßen durchgeführt wurden.

BEISPIEL 4

In Zusammenarbeit mit U.C. Davis wurden Virusbelastungen mit dem Human-Immunschwächevirus (HIV), VSV und Visnavirus in gerührten kleinmaßstäblichen Zellen durchgeführt. Die getesteten AHF-Lösungen umfaßten 10% normales HIV negatives Serum und AHF-Konzentrate wie in Beispiel 3 beschrieben. Der Virus wurde zum gerührten Serum oder AHF-Konzentrat zugegeben und die CuPH-Reaktion durch Zusatz von 0,002 M L-Cystein eingeleitet. Es wurde ein zweites Volumen von Cystein zu jeder Probe nach 30 Minuten zugegeben (siehe Tabelle II). Die CuPH-Reaktion inaktivierte HIV im 10%igen Serum, wie auch im AHF-Konzentrat. Wie zuvor für Beispiel 3 konnten die Viren unverdünnt (siehe Tabelle III) aufgrund der Toxizität der CuPH-Reagenzien selbst nicht titriert werden. Daher wird der Endtiter ausgedrückt als 1,0 log von HIV. Es gab kein nachweisbares HIV oder Visna in einer AHF-Konzentration bei einer Verdünnung von 1 : 10; 5,25 logs VSV wurden während der CuPH-Reaktion im AHF-Konzentrat inaktiviert. TABELLE III Virusbelastungen Zeit VSV-Kontamination Serum AHF Visna-Kontamination HIV
* Virustiter, log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml

BEISPIEL 5

Zusätzlich zur üblichen Lokalisation des chemischen Behandlungsschrittes zur Inaktivierung kontaminierender Viren wurden zwei andere Schritte im beschriebenen Verfahren ebenfalls mit CuPH behandelt. Die beiden geprüften Verfahrensstufen waren 1) gelöste Kryolösung und 2) PEG- Ausfluß. Nach der CuPH-Behandlung der entsprechenden Stufen wurde die normale Verarbeitung einschließlich der BioGel® A- 5M-Säule fortgesetzt. Das Ausgangsvolumen war 1260 ml gelöstes Kryo (1 Teil Kryo auf 3 Teile WFI). Zu 400 ml des gelösten Kryos, pH 7,0, wurden 10 ml eines 40-fach konzentrierten CuPH-Puffers (siehe Beispiel 1) zugesetzt, worauf die Zugabe von 4 ml 0,2 M L-Cystein zur Einleitung der CuPH-Reaktion folgte. Ein zweites Volumen an 0,2 M L-Cystein wurde 15 Minuten nach der ersten Zugabe zugegeben. Der Rest der Kryolösung wurde gleichzeitig, (860 ml) bis zum PEG- Ausfluß verarbeitet, als 400 ml dieser Lösung mit CuPH behandelt wurden. Am Ende der Gelfiltrationssäulen gab es vier Proben: 1) Kontrolle: überhaupt kein CuPH, 2) CuPH- behandeltes Kryo, pH 7,0, 3) CuPH-behandelter PEG-Ausfluß, 4) CupH-behandeltes AHF-Konzentrat (normales Verfahren). Die Ergebnisses dieser Untersuchungsreihe sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Es gibt nur sehr geringe Unterschiede zwischen den Proben. Die Gesamtausbeute aus dem gelösten Kryo bis zum gelfiltrierten AHF-Pool 1 sind sehr nahe (45,1% bis 50,7%). Diese Ergebnisse liegen nahe, daß die Stufe der Virusinaktivierungsbehandlung auf diese Stufen ausgedehnt werden könnte. Der einzige mögliche Nachteil würde sein, daß alle anschließende Schritte nach der CuPH-Behandlung in einem virusfreien Raum ausgeführt werden müßten, um eine sichere Umgebung zu gewährleisten. TABELLE IV Alternative Stufen für die CuPH-Behandlung Kontrolle kein CuPH Kryo PEG Ausfluß AHF Konzentrat AHF-Ausbeute - CuPH-Stufe Ausufluß Konzentrat bis Pool 1 Spez. Aktivität

BEISPIEL 6

Ein weiteres Virusinaktivierungsverfahren, welches im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, ist im US-Patent 4 540 573 beschrieben. Kurz gefaßt ist an diesem Verfahren das Inkontaktbringen von AHR-Konzentraten mit Tri- N-butylphosphat (TNBP) plus einem Detergens, wie Tween® 80, Triton® X-100 oder Cholat, beteiligt,
Eine Probe eines typischen AHF-Konzentrats (gerade vor der Gelfiltration) wurde mit verschiedenen TNBP/Detergenzien 6 Stunden bei 30ºC zusammen mit einer AHF-Kontrolle, die kein TNBP/Detergens enthielt, behandelt. Die zum Konzentrat zugesetzten TNBP-Mengen und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V gezeigt. TABELLE V Effekt des TNBP/Detergens auf die AHF-Anreicherung Probe Zeiit bei 30ºC AHF % Verlust Kontroll-AHF Triton
Die obige Tabelle V zeigt, daß eine TNBP/Detergens-Behandlung im gleichen Verfahrensschritt wie der zuvor beschriebene CuPH-Schritt zu keinen großen AHF-Verlusten im erfindungsgemäßen Verfahren führt. Bei den gezeigten Verfahrensbedingungen kann ein Ausbeuteverlust von 10% oder weniger eintreten.

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel zeigt, daß ein Gelfiltrationsschritt erfindungsgemäß nach der oben beschriebenen TNBP/Detergens- Behandlung zur Entfernung der zugesetzten Chemikalien durchgeführt werden kann.
Eine Probe des gleichen AHF-Konzentrats wie in Beispiel 6, wurde mit 0,3% TNBP/1% Tween® 6 Stunden bei 30ºC behandelt.
Exakt 8,75 ml des behandelten AHF-Konzentrats wurde anschließend über eine 125 ml BioGel® A-5M-Säule, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, filtriert. Der erhaltene AHF- Pool 1 und Pool 2, im Zusammenhang mit Tabelle 1 beschrieben, wurden auf das Vorliegen von TNBP, Tween® und AHF-Aktivität geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV gezeigt. TABELLE VI Gelfiltration von TNBP/Tween® 80 behandeltem AHF Probe AHF Spez. Aktivität Stufenausbeute TNBP Tween Kontroll-AHF Pool
In diesem Experiment verblieben 93,9% des ursprünglichen AHFs nach der TNBP/Tween® 80-Behandlung, und es wurde gefunden, daß der AHF-Pool (Pool 1) 87,1% des aufgegebenen AHFs ohne nachweisbares TNBP oder Tween® enthielt. Die spezifische Aktivität des Pools 1 von 41,6 war sehr ähnlich derjenigen, die für dieses Konzentrat, wie in Beispiel 1 verwendet, erhalten wurde, indem das Konzentrat nach vorhergehender CuPH-Behandlung gelfiltriert wurde.
Ein identisches Experiment zu demjenigen wie in Tabelle VI angegeben, wurde unter Verwendung von 0,3% TNBP/1% Triton® X-100 durchgeführt, und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

BEISPIEL 8

Der AHF-Pool aus einem Produktionssäulenlauf wurde unter Verwendung von Amicon-Hohlfaser-Kartuschen (10 sq. ft.) ultrafiltriert (UF). Der AHF-Pool (16,2 kg) wurde in einer Stunde bis zu einem Gewicht von 4,8 kg ultrafiltriert. Die folgende Tabelle faßt die wesentlichen Daten für den Ultrafiltrationsschritt zusammen. TABELLE VII Ultrafiltration von gelfiltriertem AHF Stufe Gewicht AHF Spez. Aktivität Gesamt-AHF Einheiten Ausbeute AHF-Pool U.F. Pool
Der AHF-Pool ließ sich leicht ohne Reinheitsverlust und sehr geringen Ausbeuteverlust (ca. 5%) ultrafiltrieren. Die AHF- Aktivität wurde auf > 180 Einheiten pro ml konzentriert. In getrennten Experimenten war es möglich den AHF-Pool (1) auf größer als 300 Einheiten AHF pro ml leicht zu ultrafiltrieren. Bei dieser hohen Aktivität ermöglicht ein sehr kleines Volumen des rekonstituierten Endbehälters, daß der Bluterkranke in großer Menge an AHF schnell erhält. Die Endbehälteraktivität hängt vom Ausmaß der Ultrafiltration ab. Der erwartete Bereich der Endbehälteraktivitäten ist zwischen 50 und 300 Einheiten pro ml AHF.

BEISPIEL 9

Der ultrafiltrierte AHF-Pool (1) aus Beispiel 8 wurde mit Säulenpuffer verdünnt, und es normales Serumalbumin in einer solchen Weise zugegeben, daß die berechnete Endbehälteraktivität ca. 100 E/ml war. Nach Sterilfiltration (wie in Beispiel 1) und Lyophilisierung wurde das Endbehälter-AHF-Konzentrat getestet, und einige dieser Ergebnisse sind tabellarisch in Tabelle VIII aufgeführt.

TABELLE VIII

Endbehälter-Testergebnisse von TNBP/Tween-AHF

Test Ergebnisse
AHF-Aktivität 104 E/ml
von Willebrand-Faktor (vWF) 95 E/ml
Spez. Aktivität 16,8 Einheiten/mg Protein
TNBP ≤ 0,8 ppm
Tween® 80 ≤ 8 ppm
Kaninchen-Pyrogen Kontrolle passiert
Sterilität Kontrolle passiert
Sicherheit Kontrolle passiert
Fibronectin 0,39 mg/ml
Fibrinogen < 0,6 mg/ml
IgG < 0,015 mg/ml
Wie man aus der Tabelle entnehmen kann, kann ein AHF- Konzentrat mit der 4-fachen als der gewöhnlichen 25-E/ml- Dosis hergestellt werden und beeinträchtigt die Endbehältereigenschaften nicht. Beim sterilfiltrieren dieses AHF-Pools traten keine Probleme auf. Der Kaninchen- Pyrogentest wurde durch Injektion von 100 Einheiten AHF pro kg Kaninchen durchgeführt, und der Gesamttemperaturanstieg bei 3 Kaninchen war 0,3ºC. Das berechnete Verhältnis von von Willebrand zum AHF-Faktor von 0,91 legt ein beinahe ideales Plasmaverhältnis von 1,0 im Endbehälter nahe. Jeder Wert von 0,5 bis 2,0 kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden, wobei 0,75 bis 2,0 bevorzugt ist. Im erfindungsgemäßen Verfahren können die Konzentrationen in hohen Maßen eingestellt werden, obwohl mindestens 25 E/ml vWF als Minimum für das erfindungsgemäße Verfahren angesehen wird.
In diesem Endbehälter AHF-Konzentrat konnte kein TNBP und Tween® 80 nachgewiesen werden. Ein großmaßstäblicher Lauf bestätigt die Ergebnisse im kleinen Maßstab, wie bereits in Beispiel 7 und Tabelle VI dokumentiert. TABELLE IX Charge Füllgröße (ml/Ampulle) AHF vWF Protein Pool 1 spez. Aktivität Verhältnis Nicht-Protein-Stickstoff Einheiten Fibrinogen Fibronectin IgA
Tabelle IX zeigt die zusätzlichen Testergebnisse aus verschiedenen Chargen. Das Verhältnis von vWF zu AHF wird als Verhältnis VIII RcoF/VIII:C angegeben.
Es ist ebenfalls festzuhalten, daß keine Aminosäuren zur Stabilisierung der vorliegenden Zusammensetzung zugegeben wurden. Daher ist das Nicht-Proteinstickstoff (d. h. Aminosäuren) weniger als 1%.
Es wurde daher ein Verfahren zur Herstellung von AHF beschrieben, umfassend die Abfolge einer Präzipitation, Solubilisierung, viralen Inaktivierung und Gelfiltrationsschritten. Unbeschadet der Tatsache, daß auf spezifische bevorzugte Ausführungsformen Bezug genommen wurde, ist es selbstverständlich, daß die Erfindung nicht auf diese beschränkt ausgelegt werden soll, sondern auf den gesetzmäßig gewährleisteten Umfang der anliegenden Ansprüche.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Antibluterfaktors (antihemophiler Faktor, AHF) aus Kryopräzipitat, umfassend die Schritte:

(a) Auflösen des Kryopräzipitats;

(b) Entfernen von Nicht-AHF-Proteinen durch

Präzipitation mit Polyethylenglcol (PEG);

(c) Behandlung des AHFs mit einem chemischen Mittel zur Virusinaktivierung; anschließend

(d) Durchleiten des AHFs durch eine Gelfiltrationssäule, die ein Größenausschlußharz enthält, unter Entfernung des chemischen Mittels und Isolierung des AHFs bis zu mindestens 35

Einheiten von Faktor-VIII-Aktivität pro ml des gepoolten Konzentrats.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritte (a) bis (d) bei 20 bis 25ºC ausgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Harz einen Fraktionierungsbereich von 200 bis 15.000.000 Daltons hat.

4. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner einen Präzipitationsschritt von AHF mit einer Mischung von Glycin und NaCl vor der Gelfiltration umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemische Substanz zur Virusinaktivierung ausgewählt ist aus Kupfer- Phenanthrolin und Tri-N-butylphosphat.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin PEG in einer Menge von 2 bis 5% zugegeben wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner den Schritt umfaßt, das Konzentrat unter Erhalt von mindestens 100 Einheiten Faktor-VIII-Aktivität pro ml Konzentrat zu ultrafiltrieren.

8. Verfahren zur Herstellung eines Antibluterfaktors- (AHF)- Konzentrat, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen eines Kryopräzipitats;

(b) Auflösen des Kryopräzipitats unter Bildung einer AHF-Lösung;

(c) Inkontaktbringen der AHF-Lösung mit Aluminiumhydroxid unter Bildung einer Vitamin-K- abhängigen proteinbindenden Suspension;

(d) Präzipitieren der Suspension durch Zugabe von Polyethylenglyclol bei einer Temperatur von 20 bis 25ºC unter Bildung eines AHF-haltigen Ausflusses; und

(e) Behandlung des AHFs mit einer chemischen Substanz zur Virusinaktivierung; anschließend

(f) präzipiertendes AHF mit einer Mischung von Glycin und NaCl; und

(g) direktes Aufbringen des resuspendierten AHF- Präzipitats aus Schritt (f) auf eine ein Größenausschlußharz enthaltende Gelfiltrationssäule ohne weiteren Konzentrierungsschritt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Harz ausgewählt ist aus vernetzten Agaroseperlen, sphärischen Gelen aus Vinylpolymer und Glas mit kontrollierten Poren.

10. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Präzipitation von AHF mit einer Mischung von Glycin und NaCl bei 20 bis 22ºC erfolgt.