ES2626327T3 - Agentes enlazantes de calcio que inducen crecimiento del cabello y/o crecimiento de las uñas - Google Patents

Abstract

Un péptido de unión al calcio para uso en la inducción del crecimiento del cabello o inhibición de la pérdida del cabello y/o inducir el crecimiento de las uñas en un mamífero, en el que: dicho péptido de unión de calcio comprende la secuencia de aminoácidos (X-Y-Z)n, donde X es ácido aspártico, Y y Z son serina, y n es un número de 2 a 100.

Description

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DESCRIPCION

Agentes enlazantes de calcio que inducen crecimiento del cabello y/o crecimiento de las unas Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la USSN 61/150,623, presentada el 6 de febrero de 2009, que se incorpora aqu como referencia en su totalidad para todos los fines.

Declaracion sobre los derechos a invenciones realizadas bajo investigacion o desarrollo con patrocinio federal No aplicable

Referencia a una "lista de secuencias", una tabla o un apendice de listado de programas informaticos presentados en un disco compacto

No aplicable

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a metodos para promover el crecimiento de pelo y/o unas en un mairnfero, y mas particularmente relacionados con un uso novedoso de peptidos que se unen al calcio para promover el crecimiento del cabello y/o para reducir la perdida del cabello y/o para inducir o para aumentar la tasa de crecimiento de las unas.

Antecedentes de la invencion

En la actualidad, los metodos eficaces para el tratamiento de la alopecia androgenetica incluyen formulaciones orales y topicas de finasterida (PROPECIA®) o minoxidil (oxido de 6-(1-piperidinil)-2,4-pirimidano-diamina, veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,382,247 y 3,644,363), y diversas tecnicas quirurgicas para el autotrasplante de folfculos pilosos de zonas no afectadas por la perdida del cabello o para la redistribucion de los folfculos desde una zona afectada por la cafda del cabello. Debido en gran medida al coste y/o invasividad de estos tratamientos, tambien existe un mercado significativo para remedios para la perdida del cabello cuya eficacia permanece sin demostrar (ver, por ejemplo, Sawaya y Shapiro (2000), Dermatologic Clinics I8: 47-61). El documento JP2005239695 describe un peptido, Asn-Ser-Ala-Ser-Ala, para su uso como restaurador de cabello. El documento WO98/06844 describe el peptido, KGF-2, que comprende la secuencia EAT-NSS, para promover el crecimiento del cabello. El documento US2004/220094 describe peptidos, tales como peptido TIP que contiene Asp-Ala-Ala en su extremo N, para estimular/inhibir el crecimiento del cabello. El documento WO2007/085846 describe un peptido que tiene la secuencia Glu-Ser-Ser, que retarda el crecimiento del cabello. El documento WO2008/114082 describe calmodulina para promover el crecimiento del cabello. La perdida de cabello de patron femenino puede tratarse adicionalmente, con tasas mucho mas bajas de exito, usando terapia antiandrogenica, acetato de ciproterona, espironolactona, flutamida (ver, por ejemplo, Ross y Shapiro (2005), Dermatologic Clinics 23: 227-243). Mas alla de estos, la perdida de cabello es tratada mas a menudo por la ocultacion o mediante tratamiento cosmetico. La alopecia areata es una enfermedad autoinmune que puede ser tratada con inmunomoduladores y tratamientos inmunomoduladores, tales como la terapia con psoraleno/UVA. La finasterida tambien se ha utilizado con resultados muy variados.

Breve resumen de la invencion

En diversas realizaciones esta invencion se refiere al descubrimiento de que los peptidos que enlazan al calcio y/u otros agentes de union al calcio (por ejemplo, como se describe en el presente documento) pueden inducir el re- crecimiento del cabello en marnfferos y se cree que son utiles para inducir el crecimiento del vello y/o para prevenir la perdida de cabello en hombres o mujeres (por ejemplo, para calvicie en el cuero cabelludo para hombres (alopecia androgenetica), alopecia inducida por farmacos y similares).

La presente invencion proporciona un peptido de union al calcio para su uso en la induccion del crecimiento del cabello o la inhibicion de la perdida del cabello y/o la induccion del crecimiento de las unas en un mamffero, donde dicho peptido de union al calcio comprende la secuencia de aminoacidos (X-Y-Z)n, donde X es acido aspartico, Y y Z son serina, y n es un numero de 2 a 100.

En diversas realizaciones, el mamffero es un mamffero humano o no humano. En diversas realizaciones, la unidad estructural de union al calcio y/o el peptido que se une al calcio se formulan para administracion topica. En diversas realizaciones, la invencion es para inducir el crecimiento del cabello o inhibir la perdida del cabello, incluyendo el tratamiento de un ser humano diagnosticado con una condicion seleccionada del grupo que consiste en alopecia areata, alopecia androgenetica, alopecia inducida farmaceuticamente y alopecia inducida por radiacion y similares. En diversas realizaciones, la unidad estructural de union al calcio y/o dicho peptido de union al calcio es un componente de una formulacion seleccionada del grupo que consiste en un champu, un acondicionador del cabello, un desenredante del cabello, un agente colorante del cabello, un tonico para el crecimiento del cabello, un protector solar, crema, gel, balsamo, aclarado, tonico, solucion, emulsion, espuma, unguento, polvos, linimento, balsamo y locion. En

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diversas realizaciones, el uso comprende inducir crecimiento de unas. En ciertas realizaciones, el medicamento comprende la unidad estructural de union al calcio y/o el peptido de union al calcio formulado para su aplicacion a una region seleccionada del grupo que consiste en una una, un lecho ungueal, una cuticula, el area de la coronilla de un casco, la base de un cuerno. En ciertas realizaciones, el medicamento comprende la unidad estructural de union al calcio y/o el peptido de union al calcio como un componente de una formulacion seleccionada del grupo que consiste en un esmalte de unas, un consolidador de unas y un balsamo para casco. En diversas realizaciones, los peptidos o dominios peptfdicos son un peptido D o un peptido beta o tienen un PEG u otro esqueleto no peptfdico. En diversas realizaciones, los peptidos o dominios peptfdicos comprenden dos o mas copias de la secuencia de aminoacidos de una subunidad peptfdica enumerada en la Tabla 2. En ciertas realizaciones, los peptidos o dominios peptfdicos tienen una longitud de aproximadamente 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24, 27 o 30 a aproximadamente 100 aminoacidos. En ciertas realizaciones, los peptidos o dominios peptfdicos tienen una longitud de 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 o 30 aminoacidos. En ciertas realizaciones n es un numero de 2 a 8 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8). En ciertas realizaciones X es acido aspartico o una sustitucion conservativa de las mismas. En ciertas realizaciones Y y Z son sustituciones de serina o conservativas para las mismas. En una realizacion, el peptido de union al calcio comprende un peptido “L”, un peptido “D” o peptido beta y X es acido aspartico, Y es serina o fosfoserina, y Z es serina o fosfoserina. En ciertas realizaciones, el peptido de union al calcio comprende un peptido "L", un peptido "D", o un peptido beta seleccionado del grupo que consiste en 4DSS, 5DSS, 6DSS, 7DSS, 8dSs, 9DSS y 10DSS. En una realizacion, el peptido de union al calcio es un peptido L. En ciertas realizaciones, la unidad estructural de union al calcio o el peptido de union al calcio no esta fosforilado. En una realizacion alternativa, la unidad estructural de union al calcio o el peptido de union al calcio estan fosforilados. En ciertas realizaciones, la unidad estructural de union al calcio o peptido de union al calcio lleva un grupo protector en el extremo amino y/o carboxilo. En ciertas realizaciones, el extremo carboxilo del peptido que se une al calcio esta amidado.

En ciertas realizaciones, la invencion comprende inducir crecimiento del cabello o inhibir la perdida del cabello (por ejemplo, en un ser humano diagnosticado con una condicion seleccionada del grupo que consiste en alopecia areata, alopecia androgenetica, alopecia inducida farmaceuticamente y alopecia inducida por radiacion). En ciertas realizaciones, la administracion comprende administrar la unidad estructural de union al calcio y/o el peptido de union al calcio a la region del cuero cabelludo, ceja, bigote (labio superior), pecho y similares (es decir, a una region donde se desea el crecimiento capilar). En ciertas realizaciones la administracion comprende administrar la unidad estructural de union al calcio y/o el peptido de union al calcio como un componente de una formulacion seleccionada del grupo que consiste en un champu, un acondicionador del cabello, un desenredante del cabello, un agente colorante del cabello, un tonico para el crecimiento del cabello, crema, gel o pomada.

En ciertas realizaciones, la invencion comprende inducir crecimiento de unas. En ciertas realizaciones, la administracion comprende administrar la unidad estructural de union al calcio y/o el peptido de union al calcio a una region seleccionada del grupo que consiste en una una, un lecho ungueal, una cutfcula, el area de coronilla de un casco, la base de un cuerno. En ciertas realizaciones, la administracion comprende administrar la unidad estructural de union al calcio y/o el peptido de union al calcio como un componente de una formulacion seleccionada del grupo que consiste en un esmalte de unas, un consolidador de unas, un balsamo para casco, un barniz, un pegamento para cascos unas, un sellador, una crema, una locion, un bano para pies, un bano para cascos, y similares.

Definiciones

El termino "unidad estructural de union al calcio" incluye peptidos que se unen al calcio asf como moleculas no peptfdicas que se unen al calcio como se describe en el presente documento.

El termino "peptido" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un polfmero de residuos de aminoacidos que vana tfpicamente en longitud de 2 a aproximadamente 50, 80 o aproximadamente 100 residuos. En ciertas realizaciones el peptido vana en longitud de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 o 11 residuos a aproximadamente 50, 45, 40, 45, 30, 25, 20 o 15 residuos. En ciertas realizaciones, el peptido vana en longitud de aproximadamente 8, 9, 10, 11 o 12 residuos a aproximadamente 15, 20 o 25 residuos. En ciertas realizaciones los residuos de aminoacidos que comprenden el peptido son residuos de aminoacidos de "forma L", sin embargo, se reconoce que en diversas realizaciones, pueden incorporarse aminoacidos “D” en el peptido. Los peptidos tambien incluyen polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos es un analogo qrnmico artificial de un aminoacido correspondiente de origen natural, asf como a polfmeros de aminoacidos naturales. Ademas, el termino se aplica a los aminoacidos unidos por un enlace peptfdico o por otros "enlaces modificados" (por ejemplo, cuando el enlace peptfdico se sustituye por un a-ester, p-ester, tioamida, fosfonamida, carbomato, hidroxilato, y similares (vease, por ejemplo, Spatola, (1983) Chem. Biochem. Amino Acids and Proteins 7: 267-357), donde la amida se reemplaza con una amina saturada (vease, por ejemplo, Skiles et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,496,542 y Kaltenbronn et al., (1990) Pag. 969-970 en Proc. 11th American Peptide Symposium, ESCOM Science Publishers, Pafses Bajos, y similares).

El termino "residuo", tal como se utiliza aqrn, se refiere a aminoacidos naturales, sinteticos o modificados. Diversos analogos de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a acido 2-aminoadfpico, acido 3-aminoadfpico, beta-alanina (acido beta aminopropionico), acido 2-aminobutmco, acido 4-aminobutmco, acido piperidmico, acido 6-aminocaproico, acido 2-aminoheptanoico, acido 2-aminoisobutmco, acido 3-aminoisobutmco, acido 2-aminopimelico, acido 2,4- diaminobutmco, desmosina, acido 2,2'-diaminopimelico, acido 2,3-diaminopropionico, n-etilglicina, n-etilasparagina,

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hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, n-metilglicina, sarcosina, n-metilisoleucina, 6-n-metililisina, n-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina y similares. Estos aminoacidos modificados son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Los “peptidos DSS”, tal como se usan aqm, incluyen peptidos que se unen al calcio que comprenden repeticiones del motivo Asp-Ser-Ser (por ejemplo, como se describe en la publicacion PCT WO 2007/038683) y/o variaciones de los mismos, por ejemplo, como se describe aqm. En ciertas realizaciones, los “peptidos DSS” incluyen peptidos/protemas de union al calcio que tienen dominios multiples que comprenden repeticiones del motivo Asp-Ser-Ser y variaciones de los mismos. Los peptidos “DSS” pueden tambien comprender conjugados en los que dos o mas dominios que comprenden repeticiones del motivo Asp-Ser-Ser y sus variaciones estan unidos por ligantes no peptfdicos formando de este modo un conjugado de multiples dominios.

Los "B-peptidos" comprenden "p-aminoacidos", que tienen su grupo amino unido al carbono p y no al carbono a como en los 20 aminoacidos biologicos estandar. El unico aminoacido p comunmente presente en la naturaleza es la p- alanina.

Los peptoides, o glicinas N-sustituidas, son una subclase espedfica de peptidomimeticos. Estan estrechamente relacionados con sus homologos de peptidos naturales, pero difieren qmmicamente en que sus cadenas laterales se anaden a los atomos de nitrogeno a lo largo del esqueleto de la molecula, en lugar de hacerlo a los carbonos a (como sucede en los aminoacidos naturales).

Los terminos "convencionales" y "naturales" tal como se aplican a peptidos en el presente documento se refieren a peptidos, construidos unicamente a partir de los aminoacidos naturales: Ala, Cys, Asp, Glu, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr. Un compuesto de la invencion "corresponde" a un peptido natural si provoca una actividad biologica (por ejemplo, actividad de union a Ca) similar a la del peptido natural. La actividad provocada puede ser la misma que, mayor o menor que la del peptido natural. En general, un peptoide tendra una secuencia de monomero esencialmente correspondiente, en la que un aminoacido natural se sustituye por un derivado de glicina N-sustituido, si el derivado de glicina N-sustituido se asemeja al aminoacido original en hidrofilicidad, hidrofobicidad, polaridad, etc. A continuacion se citan reemplazos de glicina sustituidos en N ilustrativos, pero no limitativos: N-(1 -metilprop-1 -il)glicina sustituida por isoleucina (Ile), N-(prop-2-il)glicina por valina (Val), N-bencilglicina para fenilanlama (Phe), N-(2-hidroxietil)glicina por serina (Ser), y similares. En ciertas realizaciones las sustituciones no necesitan ser "exactas". Asf, por ejemplo, en ciertas realizaciones la N-(2-hidroxietil) glicina puede sustituir a Ser, Thr, Cys y/o Met; la N-(2-metilprop-1-il)glicina puede sustituir a Val, Leu y/o Ile. En ciertas realizaciones se puede usar N-(2-hidroxietil)glicina para sustituir a Thr y Ser, a pesar de las diferencias estructurales: la cadena lateral en N-(2- hidroxietil) glicina es un grupo metileno mas largo que el de Ser y difiere de Thr en el sitio de hidroxisustitucion. En general, se puede usar una glicina sustituida con N-hidroxialquilo para sustituir cualquier aminoacido polar, una glicina sustituida por N-bencilo o N-aralquilo en sustitucion de cualquier aminoacido aromatico (por ejemplo, Phe, Trp, etc.), y una glicina N-alquil-sustituida tal como N-butilglicina para reemplazar cualquier aminoacido no polar (por ejemplo Leu, Val, He, etc.) y un derivado N-(aminoalquil)glicina para reemplazar cualquier aminoacido polar basico (por ejemplo, Lys y Arg).

Cuando se proporciona una secuencia de aminoacidos en el presente documento, tambien se contemplan versiones de aminoacidos L-, D- o beta de la secuencia asf como isoformas retro, inversion y retroinversion. Ademas, se contemplan sustituciones conservadoras. Tambien se contemplan esqueletos no proteicos, tales como PEG, alcano, puente de etileno, esqueleto ester y otras cadenas principales. Ademas, los fragmentos que vanan en longitud de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoacidos se contemplan hasta la longitud completa menos un aminoacido del peptido donde el fragmento retiene al menos 50%, preferiblemente al menos 60% 70% u 80%, mas preferiblemente al menos 90%, 95%, 98%, 99% , o se contemplan al menos el 100% de la actividad (por ejemplo, especificidad de union y/o avidez) del peptido no sustituido correspondiente.

En ciertas realizaciones, se contemplan sustituciones conservadoras de los aminoacidos que comprenden cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento. En diversas realizaciones se sustituyen uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos diferentes. El termino "sustitucion conservativa" se usa para reflejar sustituciones de aminoacidos que no alteran sustancialmente la actividad (por ejemplo, actividad antimicrobiana y/o especificidad) de la molecula. Tfpicamente, las sustituciones conservadoras de aminoacidos implican la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido con propiedades qmmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Ciertas sustituciones conservadoras incluyen "sustituciones analogas" en las que un aminoacido estandar se reemplaza por un aminoacido no estandar (por ejemplo, raro, sintetico, etc.) que difiere mmimamente del residuo parental. Se considera que los analogos de aminoacidos se derivan sinteticamente de los aminoacidos estandar sin cambio suficiente a la estructura del progenitor, son isomeros o son precursores de metabolitos. Ejemplos de tales “sustituciones analogas” incluyen, pero no se limitan a 1) Lys-Orn, 2) Leu-Norleucina, 3) Lys-Lys [TFA], 4) Phe-Phe [Gly] y 5) 6-aminobutilglicina--4-amino hexilglicina, donde Phe [gly] se refiere a fenilglicina (un derivado de Phe con un componente H en lugar de CH3 en el grupo R), y Lys [TFA] se refiere a un Lys en el que un ion cargado negativamente (por ejemplo TFA) esta unido al grupo amina R. Otras sustituciones conservativas incluyen "sustituciones funcionales" en las que las qmmicas generales de los dos residuos son similares y pueden ser suficientes para imitar o recuperar parcialmente la funcion del peptido nativo. Las sustituciones funcionales fuertes incluyen, pero no se limitan a 1) Gly/Ala, (2) Arg/Lys, 3)

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Ser/Tyr/Thr, 4) Leu/Ile/Val, 5) Asp/Glu, 6) Gln/Asn y 7) Phe/Trp/Tyr, mientras que otras sustituciones funcionales incluyen, pero no se limitan a, 8) Gly/Ala/Pro, 9) Tyr /His, 10) Arg/Lys/His, 11) Ser/Thr/Cys, 12) Leu/Ile/Val/Met y 13) Met/Lys (caso especial bajo condiciones hidrofobas) Diversas "sustituciones conservadoras amplias" incluyen sustituciones donde los aminoacidos reemplazan a otros aminoacidos del mismo grupo bioqmmico o bioffsico. Esta es la similitud en un nivel basico y se deriva de los esfuerzos para clasificar los 20 aminoacidos naturales originales. Dichas sustituciones incluyen 1) cadenas laterales no polares:

Gly/Ala/Val/Leu/Ile/Met/Pro/Phe/Trp, y/o 2) cadenas laterales polares no cargadas Ser/Thr/Asn/GIn/Tyr/Cys. En ciertas realizaciones, las sustituciones de nivel amplio tambien pueden ocurrir como sustituciones emparejadas. Por ejemplo, cualquier par hidrofflico neutro [Ser, Thr, Gln, Asn, Tyr, Cys]+[Ser, Thr, Gln, Asn, Tyr, Cys] puede ser reemplazado por un par cargado con carga neutra [Arg, Lys, His]+[Asp, Glu]. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoacidos que, en ciertas realizaciones, son sustituciones conservativas tfpicas entre sf: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) acido aspartico (D), acido glutamico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), triptofano (W). Cuando se describen aqrn secuencias de aminoacidos, tambien se contemplan las secuencias de aminoacidos que comprenden una o mas de las sustituciones conservativas identificadas anteriormente.

En ciertas realizaciones, los peptidos que comprometen al menos el 80%, preferiblemente al menos el 85% o 90%, y mas preferiblemente al menos el 95% o el 98% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias descritas aqrn (y preferiblemente retienen al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 98% o 100% o mas especificidad de union y/o avidez del peptido no modificado). Los terminos “identico” o porcentaje de “identidad” se refieren a dos o mas secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoacidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para correspondencia maxima, medida con uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. Con respecto a los peptidos de esta invencion, la identidad de secuencia se determina sobre toda la longitud del peptido. Para la comparacion de secuencias, tfpicamente una secuencia actua como una secuencia de referencia, a la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parametros de programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parametros de programa designados. La alineacion optima de las secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Mates. 2: 482, por el algoritmo de alineacion de homologfa de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la busqueda del metodo de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr, Madison, WI) o mediante inspeccion visual.

"Tratar" o "tratamiento" de una condicion tal como se utiliza en el presente documento puede referirse a prevenir la afeccion, retardar la aparicion o tasa de desarrollo de la afeccion, reducir el riesgo de desarrollar la afeccion, prevenir o retrasar el desarrollo de smtomas asociados con la afeccion, reducir o terminar smtomas asociados con la condicion, generando una regresion completa o parcial de la enfermedad, o alguna combinacion de los mismos.

El termino "que consiste esencialmente en" cuando se usa con respecto a un peptido que se une al calcio u otra unidad estructural como se describe aqrn, indica que el peptido u otra unidad estructural comprendida por variantes, analogos o derivados de los mismos poseen sustancialmente la misma o mayor actividad y/o especificidad y/o avidez de union como unidad estructural referenciada.

Los terminos "aislado" "purificado" o "biologicamente puro" se refieren a material que esta sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompanan tal como se encuentra en su estado nativo. En el caso de un peptido, un peptido aislado (natural) tfpicamente esta sustancialmente libre de componentes con los que esta asociado en la celula, tejido u organismo. El termino aislado tambien indica que el peptido no esta presente en un despliegue de fagos, un despliegue de levaduras u otra biblioteca de peptidos.

Los terminos "coadministracion" o "administracion conjunta con" cuando se usa en referencia al uso de un peptido que se une al calcio o una unidad estructural que se une al calcio y otro agente (por ejemplo, agente desensibilizante y/o remineralizante) un peptido de union o una unidad estructural de union al calcio y otro agente se administran de manera que haya al menos una cierta superposicion cronologica en la actividad de los dos agentes. En la administracion secuencial puede haber incluso cierto retraso sustancial (por ejemplo, minutos o incluso horas) entre la administracion de los dos agentes, siempre y cuando el agente de administracion presente la actividad de cada uno de manera que proporcione un resultado aumentado/mejorado.

En diversas realizaciones se usan las abreviaturas de aminoacidos mostradas en la Tabla 1.

Tabla 1. Abreviaturas de aminoacidos.

Abreviaturas

Nombre

3 letras 1 letra

Alanina

Ala A

P-Alanina (NH2-CH2-CH2-COOH)

pAla

Arginina

Arg R

Asparagina

Asn N

Acido aspartico

Asp D

Cistema

Cys C

Acido glutamico

Glu E

Glutamina

Gln Q

Glicina

Gly G

Histidina

His H

Homoserina

Hse -

Isoleucina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Sulfoxido de metionina

Met (O) -

Metionina metilsulfonio

Met (S-Me) -

Norleucina

Nle -

Fenilalanina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Treonina

Thr T

Triptofano

Trp W

Tirosina

Tyr Y

Valina

Val V

Acido epsilon-aminocaproico (NH2-(CH2)5-COOH)

Ahx J

Acido 4-aminobutanoico (NH2-(CH2)3-COOH)

gAbu

Acido tetrahidroisoquinolina-3-carbox^lico

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Lys (N (epsilon)-trifluoroacetilo)

K[TFA]

Acido a-aminoisobutmco

Aib B

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Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra ratones tratados con DSS (abajo) y simulados (arriba) que muestran rebrote del cabello 13 dfas despues del afeitado del cuero cabelludo.

La Figura 2 ilustra el efecto de los compuestos de union al calcio sobre el crecimiento del cabello en ratones. El panel mas a la izquierda de cada serie muestra ratones en el dfa 0 despues de la preparacion y antes del tratamiento. Los paneles de la derecha muestran los ratones en el dfa 23, la fecha del punto final. La serie superior muestra el control negativo que recibe tratamiento diario con solucion salina topica. La serie inferior muestra ratones que reciben tratamiento diario con una formulacion topica de un compuesto DSS aplicado en parches delineados, lo que demuestra un crecimiento significativo del cabello en comparacion con los controles.

La Figura 3 ilustra la nucleacion de hidroxiapatita en superficies de esmalte (superior) y de dentina (inferior). Las superficies se prepararon y trataron como se indica mediante las etiquetas, seguido de formacion de imagenes utilizando Microscopfa Electronica de Barrido. El grupo superior (dos filas superiores) representa las muestras de esmalte, mientras que el grupo inferior (las dos filas inferiores) representa las muestras de dentina. Dentro de cada grupo, la fila superior representa muestras que no fueron desmineralizadas antes del tratamiento, y la fila inferior representa muestras que fueron desmineralizadas por tratamiento con acido fosforico. Se muestran micrograffas electronicas de barrido, barras de escala = 1 0 pM. Columna izquierda: muestras que no fueron expuestas a ningun tratamiento previo a la nucleacion y crecimiento del cristal. Columna central: muestras que se expusieron a regulador solo antes de la nucleacion y crecimiento de cristales. Columna derecha: muestras que fueron expuestas a peptido 8DSS 12.5 pM antes de la nucleacion y crecimiento de cristales. El crecimiento cristalino indica la nucleacion temprana.

La Figura 4 proporciona micrograffas de fluorescencia que muestran la especificidad del tejido en la union de peptidos y variantes de DSS. Los dientes humanos adultos se expusieron a peptido marcado con 5(6)-carboxifluorescema 12.5 pM sin desmineralizacion, se lavaron exhaustivamente y se formaron imagenes por CLSM. Para cada seccion se recolectaron y ensamblaron multiples escaneres en un modo automatizado para generar paneles de imagenes que representan un area de 13x13 mm, suficientes en la mayona de los casos para abarcar toda la seccion. Los peptidos usados para cada seccion se etiquetan debajo de cada panel y dentro de cada panel el diente esta orientado con la rafz hacia la parte superior de la imagen y la corona hacia el fondo. Las capas de tejido estan marcadas como sigue: RTD = Dentina de punta de rafz; CPD = Dentina Circumpulpal; MD = manto dentina; P = pared de la cavidad pulpar; DEJ = union dentina-esmalte; E = esmalte; BE = esmalte basal; CE = esmalte cortical; CL = Lesion Cariosa; PB = hueso periodontal.

La Figura 5 proporciona micrograffas de fluorescencia que muestran union espedfica de peptidos DSS y variantes a lesiones cariosas en dientes. Los dientes humanos adultos se expusieron a un peptido marcado con 5(6)- carboxifluorescema 12.5 |jM sin desmineralizacion, se lavaron extensamente y se formaron imagenes por CLSM. Los ajustes del microscopio y de la camara se optimizaron por separado para cada muestra. Cada panel muestra una region de la seccion del diente que abarca una lesion cariosa. Las huellas blancas en el lado derecho de cada panel identifican la posicion de la superficie del diente, mientras que las flechas indican la posicion de la lesion manchada.

La Figura 6 ilustra que las unidades estructurales de fijacion de calcio descritos en el presente documento aumentan sustancialmente la velocidad de cicatrizacion en defectos de boveda craneal de rata de diametro cntico. La microTC muestra deposicion osea a las 3 semanas (escala incrustada en foto CT).

Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran isotermas de equilibrio para la union de peptidos y variantes seleccionados (DSS)n con HA. Figura 7A: Union de peptidos que contienen (DSS)n de diversas longitudes. Figuras 7B y 7C: union de variantes de secuencia,

La Figura 8, paneles A-D, muestran la union de peptido 6DSS marcado fluorescentemente a nodulos de medula osea mineralizados. Los cultivos de MBM se cultivaron y se formaron imagenes como se describe en el Ejemplo 6. Panel A: Imagen de campo brillante de nodulos de medula osea de raton mineralizados (MBMN) de un cultivo tratado con 6DSS. Panel B: Imagen de fluorescencia del campo mostrado en el panel A. Panel C: Imagen de campo brillante de MBMNs mineralizadas de un cultivo tratado con peptido de control mezclado. Panel D: Imagen de fluorescencia del campo mostrado en el panel C. Barras = 600 jm.

La Figura 9, paneles A-D, muestra la interaccion del peptido 8DSS inmovilizado con CaHPO4. Se incubaron perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina (diametro medio de 4 jm) con peptido 8DSS conjugado con biotina (Paneles A, C) o biotina no conjugada (Paneles B, D). Panel A: Micrograffas de campo luminoso de agregados de fosfato de calcio amorfo acumulados alrededor de perlas recubiertas con DSS. Barra = 4 jm. Panel B: Imagen de campo brillante de perlas representativas bloqueadas con biotina (sin peptido DSS). Barra = 12 jm. Panel C: Micrograffa de contraste de fase de un cordon recubierto con DSS con una acumulacion mas ordenada de fosfato de calcio alrededor de su exterior. Barra = 4 jm. Panel D: Muestra de control (bloqueada con biotina, sin peptido DSS). Barra = 4 jm

La Figura 10 muestra la union de DSS marcado a dentina en dientes humanos. Superior: Imagen confocal de un peptido marcado con fluorescencia (DSS)a en un diente humano seccionado, mostrando el esmalte (E) y la dentina (D). Las flechas indican la DEJ. Parte inferior: Imagen confocal del mismo diente, en la region entre la dentina del

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manto (derecha) y la cavidad pulpar (izquierda), mostrando preferencia de este peptido por la dentina del manto sobre la dentina circumpulpal y el esmalte. Baras = 50 pm

La Figura 11, paneles A-D, muestran micrograffas electronicas de barrido de secciones de diente sagital, tratadas como se indica: Panel A: control no tratado; Panel B: pretratado con 8DSS durante 1 h, enjuagado y remineralizado usando desensibilizador Quell; Panel C: preincubado con regulador (50 mM HEPES, pH 7,0), seguido por remineralizacion como en el panel B; Panel D: sin preincubacion, remineralizacion como en el panel B. Barras = 50 pm.

Figura 12 Figura 1: Comparacion de las unas tratadas con peptido (izquierda 2 dedos, marcadas con "A") y tratadas simultaneamente (dientes a la derecha, marcadas con "P") el dfa 19 del experimento. Los dedos 1 y 2 se trataron con (D)-DSS en la nanoemulsion de AOT/isopropanol cada tres dfas durante 19 dfas. Significativamente mas crecimiento se observa en estos clavos que en los dedos 3 y 4, que fueron tratadas con PBS.

La Figura 13 muestra una comparacion del crecimiento de unas relacionado con diversos tratamientos. Despues de 19 dfas de tratamiento, se midieron las unas y se determino la cantidad de nuevo crecimiento para cada tratamiento. El nuevo crecimiento fue significativamente mayor en las unas tratadas con formulaciones (D)-DSS

Descripcion detallada de la invencion

En ciertas realizaciones esta invencion se refiere al descubrimiento de que los agentes de union al calcio (por ejemplo, los peptidos) descritos en el presente documento y en la publicacion PCT No. WO/2007/038683 inducen crecimiento del cabello y/o crecimiento de las unas. Se cree que los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de union al calcio descritos en el presente documento pueden usarse para restaurar el cabello y/o para inhibir la perdida del cabello en los mairnferos y/o para inducir el crecimiento y/o la reparacion de las unas.

En ciertas realizaciones, los metodos implican administrar a un sujeto que lo necesite uno o mas peptidos de union al calcio (por ejemplo, como se describe en el presente documento y/o solicitud PCT WO/2007/038683) y/o uno o mas de las demas unidades estructurales descritas en el presente documento. En diversas realizaciones, los peptidos que se unen al calcio y/u otras unidades estructurales se proporcionan en formas no degradables. Los peptidos no degradables ilustrativos pueden consistir, por ejemplo, en peptidos con todos los aminoacidos constituyentes en el estereoisomero (D), peptidos con esqueletos modificados, peptidomimeticos o polfmeros derivatizados tales como polfmeros, copolfmeros o dendnmeros lineales conjugados con peptidos.

La administracion de estos peptidos a sitios con perdida de cabello hace que el cabello crezca a velocidades significativamente mayores que las normalmente observadas. En ciertas realizaciones, esta administracion puede conseguirse mediante administracion topica, administracion dermica, administracion intradermica, administracion transdermica, administracion subdermica, inyeccion transdermica, iontoforesis transdermica (vease la Patente de los Estados Unidos No. 6,526,316), implantacion quirurgica u otros medios. En ciertas realizaciones, el compuesto se formula con un vehfculo aceptable tal como, por ejemplo, micelas inversas de polfmero, dimetilsulfoxido (DMSO), y similares para administracion topica, o solucion salina normal para inyeccion o implantacion quirurgica. Ademas, las formas de dendnmeros en sf mismas pueden mostrar una penetracion transdermica mejorada en aplicacion topica sin el uso de portadores exoticos.

Las ventajas de este enfoque incluyen, pero no se limitan a su eficacia, ya que los enfoques actualmente existentes, incluyendo la finasterida, proporcionan solo un rebrote limitado del cabello. El crecimiento observado hasta ahora usando peptidos de union al calcio en un modelo de raton es mas significativo que el informado para otros compuestos usando otros sistemas experimentales. Estos metodos han sido probados en un modelo animal (raton) y han demostrado ser seguros y eficaces en ensayos en este sistema.

Ademas, los diversos unidades estructurales de union a calcio descritos en el presente documento pueden unirse a superficies de una manera espedfica del tejido. En ciertas realizaciones se han identificado variantes que se unen espedficamente a dentina o esmalte (ver, por ejemplo, Figura 3), hueso periodontal (humano), huesos largos (rata), superficies minerales degradadas (caries en el modelo dental) y titanio (con una interfaz de union). Las pruebas de toxicidad no muestran toxicidad aguda, ningun dano en los organos y ninguna respuesta antigenica.

En diversas realizaciones, estas construcciones se pueden dirigir a 1) reclutar capas de fosfato de calcio a superficies de dientes pretratadas (vease la Figura 3); 2) formacion de cristales nucleares de hidroxiapatita en el esmalte, dentina y superficies abioticas; 3) proporcionar la administracion dirigida de compuestos antimicrobianos a biopelfculas microbianas portadoras de calcio; 4) aumentar sustancialmente la tasa de curacion en defectos cnticos; 5) unirse a cristales de oxalato de calcio; y 6) distinguir entre los fosfatos de calcio y los cristales de fosfato de estroncio. Estos usos son ilustrativos y no limitativos.

En diversas realizaciones, los peptidos que enlazan al calcio y/o las unidades estructurales de union al calcio descritos en el presente documento y/o las construcciones quimericas que los comprenden pueden usarse para remineralizar defectos dentales; diagnosticar defectos oseos y dentales, mejorar la osteointegracion en implantes dentales y otros implantes oseos; mejorar la curacion osea; tratar la osteomielitis y la osteoporosis; inhibir la mineralizacion inapropiada; y dirigir los efectos terapeuticos a defectos de tejido mineralizado o sitios de mineralizacion inapropiados. Estos usos

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son ilustrativos y no limitativos.

Agentes de union al calcio.

Peptidos de union al calcio (peptidos “DSS”).

En ciertas realizaciones, los agentes de union al calcio incluyen, pero no se limitan a, peptidos que se unen al calcio. Los peptidos de union al calcio son unidades estructurales que comprenden o consisten en uno o mas dominios peptidicos de union al calcio (por ejemplo, dominios peptfdicos DSS tales como los descritos en la Publicacion PCT WO 2007/038683 que se incorpora en el presente documento como referencia para los peptidos que enlazan al calcio descritos aqm). Cuando estan presentes multiples dominios peptfdicos de union al calcio, pueden conjugarse qmmicamente conjuntamente o pueden unirse directamente, por ejemplo, a un enlace peptfdico o unirse, por ejemplo a traves de un enlazante peptfdico para formar peptidos de union al calcio de multiples dominios.

En ciertas realizaciones, se proporcionan una serie de peptidos de union al calcio formados por variaciones del motivo Asp-Ser-Ser (peptidos "DSS"), asf como porciones que comprenden multiples peptidos que se unen al calcio. Se ha demostrado que estos peptidos "DSS" se unen firmemente y espedficamente a las superficies de fosfato de calcio. Ademas, se ha demostrado que estos peptidos reclutan fosfato de calcio a tales superficies y sirven como unidades estructurales de union para la union de marcadores fluorescentes a superficies calcificadas independientemente de su estado de fosforilacion.

Los peptidos/dominios peptfdicos descritos en el presente documento, referidos generalmente como peptidos DSS, pueden estar compuestos de varios numeros y/o combinaciones de una subunidad; el motivo de Asp-Ser-Ser de tres aminoacidos de DpP o variaciones de los mismos. Ejemplos de tres repeticiones de aminoacidos que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, Asp-Ser-Ser (DSS), Glu-Ser-Ser (EsS), Asp-Thr-Thr (DTT), Glu-Thr-Thr (ETT), Asn- Ser-Ser (NSS), Asn-Thr-Thr (NtT), Gln-Ser-Ser (QSS), Gln-Thr-Thr (QTT) y sus variaciones. Alternativamente o ademas de estas secuencias repetidas, los peptidos descritos en el presente documento pueden incluir variaciones menores de estas repeticiones, incluyendo pero sin limitarse a Asp-Ser-Thr (DST), Asp-Ala-Ala (DAA) o Ala-Ser-Thr (AST), y similares. En diversas realizaciones uno o mas residuos de aminoacidos dentro de una repeticion de tres aminoacidos pueden ser modificados qmmicamente. Por ejemplo, en ciertas realizaciones los peptidos pueden contener uno o mas residuos Ser o Thr en los que un grupo hidroxilo ha sido modificado por la adicion de un grupo fosfato (pSer, pThr), etc. En diversas realizaciones los peptidos vanan en longitud desde tres a mas de cincuenta o 100 aminoacidos. En ciertas realizaciones otros residuos modificados incluyen, pero no se limitan a, la version fosforilada, sulfatada, sulfonada o acilada de Ser, Thr, Gly o Ala.

La afinidad de union de los peptidos descritos en el presente documento para las superficies calcificadas se puede controlar alterando la composicion y el numero de repeticiones. Por ejemplo, la inclusion de una o mas repeticiones de Asp-Ser-Ser aumentara la afinidad de union del peptido, porque esta secuencia exhibe la afinidad mas alta de cualquiera de las repeticiones probadas. La afinidad de union del peptido tambien puede aumentarse aumentando el numero de tres repeticiones de aminoacidos. Los peptidos que contienen mas de seis repeticiones muestran generalmente una mayor afinidad de union que aquellos con menos repeticiones. En ciertas realizaciones, los peptidos descritos en el presente documento pueden tener una afinidad de union (KA) para hidroxiapatita superior a 15.000 M' 1. En ciertas realizaciones, esta afinidad de union puede ser superior a 50.000 M-1, en otras realizaciones superiores a 100.000 M-1, en otras realizaciones superiores a 200.000 M-1, y en otras realizaciones superiores a 300.000 M-1.

En ciertas realizaciones, los peptidos pueden contener uno o mas aminoacidos adicionales que no forman parte de una secuencia de repeticion de tres aminoacidos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la porcion repetida del peptido puede fusionarse con una secuencia de aminoacidos que tiene una funcionalidad adicional, tal como por ejemplo una secuencia de peptidos antimicrobiana tal como 2c-4 (RWRWRWF, SEQ ID NO: 1), PL135 (FHFHLHF, SEQ ID NO: 2), b-34 (LKRF LKWF KRF, SEQ ID NO: 3), y similares. En ciertas de estas realizaciones, la porcion repetida del peptido puede fusionarse a la secuencia de aminoacidos adicional a traves de una secuencia enlazante, tal como por ejemplo una secuencia de triglicina.

En ciertas realizaciones, los peptidos descritos en la presente invencion comprenden la secuencia de subunidad (X- Y-Z)n, en la que X es un aminoacido seleccionado entre acido aspartico (Asp), acido glutamico (Glu), asparagina (Asn), alanina (Ala) y glutamina (Gln), Y y Z son aminoacidos seleccionados de alanina (Ala), serina (Ser), treonina (Thr), fosfoserina (pSer), fosfotreonina (pThr) y sus derivados y n es un numero entre 1 y 100, con preferencia entre aproximadamente 2 a aproximadamente 50 o 100, variando mas preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 20. En ciertas realizaciones, n oscila entre 1 y 15, en otras realizaciones, n oscila entre 1 y 10 y en ciertas realizaciones n oscila entre 3 y 4, 6, u 8. En ciertas realizaciones, n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25. Se muestran en la Tabla 2 subunidades ilustrativas de 3 aminoacidos "DSS" ("XYZ").

Tabla 2. Subunidades "DSS" (XYZ) ilustrativas.

X

Y Z X Y Z

Asp

Ala Ala Asn Thr pSer

Asp

Ala Ser Asn Thr pThr

Asp

Ala Thr Asn pSer Ala

Asp

Ala pSer Asn pSer Ser

Asp

Ala pThr Asn pSer Thr

Asp

Ser Ala Asn pSer pSer

Asp

Ser Ser Asn pSer pThr

Asp

Ser Thr Asn pThr Ala

Asp

Ser pSer Asn pThr Ser

Asp

Ser pThr Asn pThr Thr

Asp

Thr Ala Asn pThr pSer

Asp

Thr Ser Asn pThr pThr

Asp

Thr Thr Ala Ala Ala

Asp

Thr pSer Ala Ala Ser

Asp

Thr pThr Ala Ala Thr

Asp

pSer Ala Ala Ala pSer

Asp

pSer Ser Ala Ala pThr

Asp

pSer Thr Ala Ser Ala

Asp

pSer pSer Ala Ser Ser

Asp

pSer pThr Ala Ser Thr

Asp

pThr Ala Ala Ser pSer

Asp

pThr Ser Ala Ser pThr

Asp

pThr Thr Ala Thr Ala

Asp

pThr pSer Ala Thr Ser

Asp

pThr pThr Ala Thr Thr

Glu

Ala Ala Ala Thr pSer

Glu

Ala Ser Ala Thr pThr

Glu

Ala Thr Ala pSer Ala

Glu

Ala pSer Ala pSer Ser

Glu

Ala pThr Ala pSer Thr

Glu

Ser Ala Ala pSer pSer

Glu

Ser Ser Ala pSer pThr

Glu

Ser Thr Ala pThr Ala

Glu

Ser pSer Ala pThr Ser

Glu

Ser pThr Ala pThr Thr

Glu

Thr Ala Ala pThr pSer

Glu

Thr Ser Ala pThr pThr

Glu

Thr Thr Gln Ala Ala

Glu

Thr pSer Gln Ala Ser

Glu

Thr pThr Gln Ala Thr

Glu

pSer Ala Gln Ala pSer

Glu

pSer Ser Gln Ala pThr

Glu

pSer Thr Gln Ser Ala

Glu

pSer pSer Gln Ser Ser

Glu

pSer pThr Gln Ser Thr

Glu

pThr Ala Gln Ser pSer

Glu

pThr Ser Gln Ser pThr

Glu

pThr Thr Gln Thr Ala

Glu

pThr pSer Gln Thr Ser

Glu

pThr pThr Gln Thr Thr

Asn

Ala Ala Gln Thr pSer

Asn

Ala Ser Gln Thr pThr

Asn

Ala Thr Gln pSer Ala

Asn

Ala pSer Gln pSer Ser

Asn

Ala pThr Gln pSer Thr

Asn

Ser Ala Gln pSer pSer

Asn

Ser Ser Gln pSer pThr

Asn

Ser Thr Gln pThr Ala

Asn

Ser pSer Gln pThr Ser

Asn

Ser pThr Gln pThr Thr

Asn

Thr Ala Gln pThr pSer

Asn

Thr Ser Gln pThr pThr

Asn

Thr Thr

En diversas realizaciones, se contemplan sustituciones conservadoras de aminoacidos para cada posicion (X, y/o Y, y/o Z).

Las subunidades pueden repetirse de forma contigua (por ejemplo, 8DSS: DSS, DSS, DSS, DSS, DSS, DSS, DSS, 5 DSS, SEQ ID NO: 4), o, en ciertas realizaciones, una o mas subunidades pueden intercalarse con una o mas subunidades (por ejemplo, DSS NSS DSS NSS (SEQ ID NO: 5), y similares), y/o con secuencias de no subunidades. En ciertas formas de realizacion, dominios que comprenden una o mas subunidades (por ejemplo, n = 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, etc.) entre sf para formar agentes de union al calcio que comprenden multiples dominios de union al calcio. Los dominios se pueden unir a cada uno directamente, o a 10 traves de un enlazante qmmico para formar conjugados o pueden unirse a traves de un enlazante peptfdico para

formar un peptido/protema de dominio multiple.

En ciertas realizaciones, la unidad estructural de dominio de union multiple comprende al menos dos dominios, al menos tres dominios, al menos cuatro dominios, al menos cinco dominios, al menos seis dominios o mas. Los dominios de union a Ca que comprenden tal constructo pueden ser iguales o diferentes.

5 Como se indico anteriormente, varios dominios de union a Ca que comprenden tal constructo pueden unirse directamente entre sf, o dos, o mas de dichos dominios pueden unirse entre sf a traves de un enlazante. En la Tabla 3 se proporciona una lista ilustrativa, pero no limitativa, de conectores adecuados.

Tabla 3. Agentes de union peptfdicos y no peptfdicos ilustrativos para unir dominios de union a Ca y/o para unir una unidad estructural de union a Ca (por ejemplo, peptido) a uno o mas efectores (por ejemplo, AMPs, marcadores 10 detectables y similares).

Vinculador

SEQ ID NO:

AAA

SAT

PYP

ASA

GGG

SGG

GGGG

6

GGGGG

7

GGSGGS

8

ASASA

9

PSGSP

10

PSPSP

11

ASASA

12

PSPSP

13

KKKK

14

RRRR

15

Gly4Ser

16

(Gly4Ser)2

17

(Gly4Ser)3

18

(Gly4Ser)4

19

(Gly4Ser)5

20

(Gly4Ser)6

21

2-nitrobenceno u O-nitrobencilo

Disulfuro de nitropiridilo

Dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE)

Acido S-acetilmercaptosuccmico

1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetracetico (DOTA)

p-glucuronido y variantes de p-glucuronido

Poli(acido alquilacnlico)

Enlazantes basados en benceno (por ejemplo: 2,5-bis (hexiloxi)-1,4-bis[2,5-bis(hexiloxi)-4- formil-fenilenilvinileno]benceno) y similares.

Uniones disulfuro

Poli(amidoamina) o dendnmeros similares que enlazan multiples peptidos diana y letales en una molecula

Nanotubos de carbono

Enlazantes de hidrazona y variantes de hidrazona

PEG de cualquier longitud de cadena

Succinato, formiato, acetato, butirato, otros acidos organicos similares

Aldoles, alcoholes o enoles

Peroxidos

Grupos alcano o alqueno de cualquier longitud de cadena

Una o mas moleculas de porfirina o colorantes que contienen grupos amida y acido carboxflico libres

Uno o mas nucleotidos de ADN o ARN, incluyendo variantes que contienen poliamina y policarboxilo

Inulina, sacarosa, glucosa, u otros mono, di o polisacaridos

Acido linoleico u otros acidos grasos poliinsaturados

Variantes de cualquiera de los enlazantes anteriores que contienen grupos halogeno o tiol

(Todos los enlazantes basados en aminoacidos podnan ser L, D, p, esqueleto de PEG, u otras formas)

Compuestos similares a DSS.

En ciertas realizaciones se proporcionan unidades estructurales de fijacion de calcio de tipo DSS mas generales. Tfpicamente tales compuestos DSS se componen de monomeros que tienen por lo menos 9 atomos de longitud, con 5 una unidad estructural de acido acetico o su equivalente fisicoqmmico unidos al segundo atomo y una unidad estructural metanolica o de hidroximetilo o su equivalente fisicoqmmico unida a los atomos 5 y 8. Este monomero puede repetirse cualquier numero de veces y puede estar unido a cualquier otra unidad estructural.

Incluso de forma mas general, esto representa un polfmero o concatamero de subunidades de la forma mostrada a continuacion en la Formula I:

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Tfpicamente, las posiciones E, G, L, M, T y X pueden cada una consistir en carbono, nitrogeno, oxfgeno, silicio, fosforo, azufre, boro o selenio, en cualquier combinacion o configuracion qmmicamente compatible, R3, R3', R4 R4', R6, Ra', R7, R7', R9, R9', R10, R10', presente o ausente segun se requiera para satisfacer la Valencia del atomo de cadena principal pertinente.

15 En diversas realizaciones, preferiblemente, los enlaces E-G, y/o L-M, y/o T-X tienen un caracter de doble enlace

imagen1

significativo, ya sea como doble enlace directo o como parte de un sistema orbital conjugado extendido. Ejemplos de sistemas de esta naturaleza incluyen, pero no se limitan a estructuras de acuerdo con las Formulas II-XII:

imagen2

imagen3

En ciertas realizaciones es posible que enlaces estructuralmente restringidos o aromaticos puedan llenar estas posiciones. Tales enlaces incluyen, pero no se limitan a, estructuras de acuerdo con las formulas XNI-XVIN:

10

imagen4

imagen5

imagen6

5

y

y similares.

Cuando R2 se compone de cualquier unidad estructural distinta de H, Cl, I, F, Br o CH3, R2' es preferiblemente H, Cl, 15 I, F, Br o CH3 y viceversa. En diversas realizaciones, las unidades estructurales distintas de H, Cl, I, F, Br o CH3 en esta posicion tienen la forma de la Formula XIX:

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imagen7

en la que el atomo Q es carbono, nitrogeno, oxfgeno, silicio, fosforo, azufre, boro o selenio, en cualquier configuracion qmmicamente compatible, con R2d presente o ausente segun se requiera para satisfacer la Valencia del atomo Q, y donde R2a y R2b cada uno de ellos consiste en un pequeno grupo no impedido estericamente tal como H, Cl, I, F, Br o CH3 y similares, y R2d o R2c consisten en un grupo cargado negativamente, tal como sulfato (SO42-), fosfato (PO42-), o un oxfgeno de carboxilato, y similares. En ciertas realizaciones en las que R2c es una unidad estructural con carga negativa y R2d esta presente, R2d es un pequeno grupo no impedido estericamente tal como un oxfgeno de carbonilo o H, Cl, I, F, Br o CH3, y similares, y viceversa.

Ejemplos de unidades estructurales para R2 o R2' incluyen, pero no se limitan a estructuras de acuerdo con las Formulas XX-XXIV:

imagen8

En diversas realizaciones, R3, R3', Ra, R4', R6, R6', R7, R7', R9, R9', R10, R10', puede ser cualquier unidad estructural

relativamente libre, como qmmicamente apropiada dada la identidad de E, G, L, M, T y X. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a -OH, -CH3, -NH2, -SiH3, -SH, -Sh, -BH2, H, I, Cl, Br, F, o grupos etilo, carbonilo o amina secundaria incluyendo, pero sin limitarse a, estructuras de acuerdo con las Formulas XXV-XXVII:

imagen9

En ciertas realizaciones en las posiciones R5 y R5', una posicion puede estar ocupada por un grupo hidroxilo situado a un centro del esqueleto, y el otro ocupado por un pequeno grupo estericamente libre de obstaculos, preferiblemente H, pero tambien Cl, I, Br, F, -OH, -CH3, -NH2, -SiH3, -SH, -SH, -BH2 y similares no estan prohibidos.

Un ejemplo de un grupo hidroxilo situado a un centro de distancia del esqueleto es una estructura de acuerdo con la Formula XVIII:

imagen10

XVIII

Aqm, en diversas realizaciones, R5' es carbono, nitrogeno, oxfgeno, silicio, fosforo, azufre, boro o selenio, en cualquier configuracion qmmicamente razonable y R5a, R5b son pequenos grupos independientemente seleccionados no impedidos estericamente (por ejemplo, H, Cl, Br, I, F, CH3, OH, etc.).

5

Los compuestos espedficos con actividad adecuada incluyen, pero no se limitan a: Compuestos con un esqueleto de polietilenglicol (PEG) incluyendo, pero sin limitarse a, estructuras de acuerdo con las formulas XXIX y XXX:

imagen11

Estas estructuras son equivalentes excepto cuando Ri y R2 imparten direccionalidad.

Compuestos con un esqueleto alcano que incluyen, pero no se limitan a estructuras de acuerdo con las Formulas XXXI y XXXII:

imagen12

10 Estas estructuras son equivalentes excepto cuando Ri y R2 imparten direccionalidad.

Compuestos con una cadena principal puenteada con etileno incluyendo, pero sin limitarse a, estructuras de acuerdo con las formulas XXXIII y XXXIV:

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Estas estructuras son equivalentes excepto cuando Ri y R2 imparten direccionalidad.

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Compuestos con un esqueleto de ester incluyen, pero no se limitan a, esqueletos representados por las estructuras de acuerdo con las formulas XXXV y XXXVI:

imagen15

Estas estructuras son equivalentes excepto cuando R1 y R2 imparten direccionalidad. De nuevo se apreciara que se contemplan concatameros que comprenden estas subunidades (y/u otras subunidades descritas en el presente documento) con o sin enlazantes intermedios. Cuando uno o mas enlazantes separan subunidades, en ciertas realizaciones, el concatamero comprende al menos 2, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 4, todavfa mas preferiblemente al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2o subunidades. En diversas realizaciones en las que las subunidades estan separadas por uno o mas enlazantes, al menos dos de las subunidades estan separadas por un enlazante que proporciona una longitud de persistencia equivalente o superior a aproximadamente 4 aminoacidos (por ejemplo, aproximadamente 14 A o mayor).

Compuestos adicionales incluyen compuestos con un esqueleto peptidico.

En diversas realizaciones, las subunidades de los compuestos descritos en el presente documento son adyacentes entre sf y el compuesto es un polfmero de estas subunidades. En ciertas realizaciones, uno o mas enlazantes pueden separar las subunidades. Tfpicamente, sin embargo, al menos dos subunidades seran adyacentes entre sf en una unidad estructural de enlace de calcio. Por lo tanto, por ejemplo, en ciertas realizaciones ilustrativas, la unidad estructural de union al calcio puede comprender una estructura de la forma S1w-S2x-L1y-S3z-S4m, o S1w-S2x-L1-S3z-L2- S4m donde el "S" indica una subunidad como se describe en el presente documento, "L" indica un enlazante (por ejemplo, como se muestra en la Tabla 3), y w, x, y, z y m estan en el intervalo de 0 a 100, mas preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente para "n"), mas preferiblemente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25. Tfpicamente, cuando las subunidades no son adyacentes, estan separadas por un enlace que tiene una longitud de persistencia mayor o igual a al menos uno, dos o tres aminoacidos, preferiblemente mayor quel o igual a 4 aminoacidos.

En ciertas realizaciones las unidades estructurales descritas en el presente documento pueden comprender regiones representadas por la Formula XXXVII:

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en la que R1 y R11 estan presentes o ausentes de manera independiente y cuando estan presentes se seleccionan del grupo que consiste en un sustrato solido (por ejemplo, una superficie, una partfcula, nanopartfculas, etc.) y/o un efector (por ejemplo, como se describe en el presente documento), y n oscila entre aproximadamente 2, 3, o 4 hasta aproximadamente 100 (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente). Diversos efectores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, marcadores detectables, farmacos, vetnculos para farmacos, peptidos antimicrobianos, y similares.

En diversas realizaciones, los agentes descritos en el presente documento (por ejemplo, las unidades estructurales de tipo DSS) excluyen expresamente uno o mas de los agentes descritos en la Publicacion PCT WO 2007/038683. De acuerdo con esto, en ciertas realizaciones, las formulas aqrn descritas excluyen expresamente los peptidos que comprenden o consisten en la secuencia de aminoacidos (X-Y-Z)n, donde X es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en acido aspartico (Asp), acido glutamico (Glu) asparagina (Asn), alanina (Ala) y glutamina (Gln) e Y y Z son aminoacidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en alanina (Ala), serina (Ser), treonina

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(Thr), fosfoserina (pSer), fosfotreonina (PThr) y sus derivados; y n oscila entre 1 y 100. En ciertas realizaciones las formulas descritas aqu excluyen expresamente una o mas de las subunidades mostradas en la Tabla 2.

Grupos protectores.

Aunque los diversos peptidos descritos en el presente documento se pueden mostrar sin grupos protectores, en ciertas realizaciones pueden soportar uno, dos, tres, cuatro o mas grupos protectores. En diversas realizaciones, los grupos protectores pueden acoplarse al extremo C y/o N del peptido o peptidos y/o a uno o mas residuos internos que comprenden el peptido (es decir, uno o mas grupos R en los aminoacidos constituyentes puede ser bloqueado). Por lo tanto, por ejemplo, en ciertas realizaciones, cualquiera de los peptidos descritos en el presente documento puede soportar, por ejemplo, un grupo acetilo que protege el extremo amino y/o un grupo amida que protege el extremo carboxilo.

En diversas realizaciones, la adicion de un grupo protector, particularmente al carboxilo y en ciertas realizaciones, al extremo amino puede mejorar la estabilidad y/o la eficacia del peptido.

Un gran numero de grupos protectores son adecuados para este proposito. Tales grupos incluyen, pero no se limitan a, grupos acetilo, amida y alquilo, siendo particularmente preferidos los grupos acetilo y alquilo para la proteccion N- terminal y siendo preferidos los grupos amida para la proteccion del terminal carboxilo. En ciertas realizaciones particularmente preferidas, los grupos protectores incluyen, pero no se limitan a, cadenas alqrnlicas como acidos grasos, propeonilo, formilo y otros. Los grupos protectores de carboxilo particularmente preferidos incluyen amidas, esteres y grupos protectores formadores de eter. En una realizacion preferida, se utiliza un grupo acetilo para proteger el terminal amino y se usa un grupo amida para proteger el extremo carboxilo. Estos grupos bloqueantes mejoran las tendencias formadoras de helices de los peptidos. Algunos grupos bloqueantes particularmente preferidos incluyen grupos alquilo de diversas longitudes, por ejemplo, grupos que tienen la formula: CH3-(CH2)n-CO- donde n oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20, preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 16 o 18, mas preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 13, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 10.

En ciertas realizaciones, los grupos protectores incluyen, pero no se limitan a, cadenas alqrnlicas como en acidos grasos, propeonilo, formilo y otros. Los grupos protectores de carboxilo particularmente preferidos incluyen amidas, esteres y grupos protectores formadores de eter. En una realizacion, se usa un grupo acetilo para proteger el terminal amino y/o se usa un grupo amino para proteger el terminal carboxilo (es decir, el C-terminalarboxilo amidado). En ciertas realizaciones los grupos de bloqueo incluyen grupos alquilo de diversas longitudes, por ejemplo, grupos que tienen la formula: CH3-(CH2)n-CO- donde n oscila entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20, preferiblemente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 16, mas preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 13, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 10.

En ciertas realizaciones, el grupo acido en el C-terminal se puede bloquear con un grupo alcohol, aldehndo o cetona y/o el residuo N-terminal puede tener el grupo amida natural, o bloquearse con un grupo acilo, acido carboxflico, alcohol, aldehfdo o cetona.

Otros grupos protectores incluyen, pero no se limitan a, Fmoc, t-butoxicarbonilo (t-BOC), grupo 9-fluorenoacetilo, grupo 1-fluorencarboxflico, grupo 9-florencarboxflico, grupo 9-fluorenona-grupo 1-carboxflico, benciloxicarbonilo, xantilo (Xan), Tritil (Trt), 4-metiltritilo (Mtt), 4-metoxitritilo (Mmt), 4-metoxi-2,3,6-trimetil-bencenosulfonilo (Mtr), mesitileno-2- sulfonilo (Mts), 4,4-dimetoxibencidrilo (Mbh), tosilo (Tos), 2,2,5,7,8-pentametil croman-6-sulfonilo (Pmc), 4-metilbencil (Mebzl), 4-metoxibencilo (MeOBzl), benciloxi (BzlO), bencil (Bzl), benzoilo (Bz), 3-nitro-2-piridinasulfenilo (Npys), 1- (4,4-dimetil-2,6-diaxociclohexilideno)etilo (Dde), 2,6-diclorobencil (2,6-DiCl-Bzl), 2-clorobenciloxicarbonilo (2-Cl-Z), 2- bromobenciloxicarbonilo (2-Br-Z), benciloximetilo (Bom), ciclohexiloxi (cHxO), t-butoximetilo (Bum), t-butoxi (tBuO), t- butilo (tBu), acetilo (Ac) y trifluoroacetilo (TFA).

Los grupos protectores/bloqueantes son bien conocidos por los expertos en la tecnica, asf como los metodos de acoplamiento de tales grupos al residuo o unidades estructurales apropiados que comprenden los peptidos de esta invencion (vease, por ejemplo, Greene et al., (1991) Projective Groups in Organic Synthesis, 2a ed., John Wiley & Sons, Inc. Somerset, nJ). En la realizacion ilustrativa, por ejemplo, la acetilacion se lleva a cabo durante la smtesis cuando el peptido esta sobre la resina usando anhndrido acetico. La proteccion de la amida puede conseguirse mediante la seleccion de una resina apropiada para la smtesis. Por ejemplo, se puede usar una resina de amida de pista. Despues de la terminacion de la smtesis, los grupos protectores semipermanentes sobre aminoacidos bifuncionales acidos tales como Asp y Glu y el aminoacido basico Lys, hidroxilo de Tyr se eliminan simultaneamente. Los peptidos liberados a partir de una resina de este tipo usando tratamiento acido salen con el N-terminal protegido como acetilo y el carboxilo protegido como NH2 y con la eliminacion simultanea de todos los otros grupos protectores.

Cuando se describen secuencias de aminoacidos en el presente documento, se contemplan tambien las secuencias de aminoacidos que comprenden uno o mas grupos protectores, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente (o cualquier otro grupo protector comercialmente disponible para aminoacidos usado, por ejemplo, en una smtesis de peptidos boc o fmoc).

Circulacion peptfdica.

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En ciertas realizaciones, las unidades estructurales descritas en el presente documento (por ejemplo, peptidos de union al calcio, constructos quimericos que comprenden unidades estructurales de union al calcio, etc.) se circularizan/ciclizan para producir peptidos dclicos. Los peptidos dclicos, como se contempla en el presente documento, incluyen cabeza/cola, cabeza/cadena lateral, cola/cadena lateral y peptidos ciclizados de cadena lateral/cadena lateral. Ademas, los peptidos contemplados aqm incluyen homodet, que contiene solo enlaces peptfdicos, y heterodet que contiene ademas enlaces disulfuro, ester, tioester u otros enlaces.

Los peptidos dclicos se pueden preparar utilizando practicamente cualquier tecnica conocida en el arte para la preparacion de peptidos dclicos. Por ejemplo, los peptidos se pueden preparar en forma lineal o no ciclizada usando smtesis de peptidos en solucion o fase solida convencionales y se ciclan usando qmmica estandar. Preferiblemente, la qmmica utilizada para ciclizar el peptido sera suficientemente suave para evitar degradar sustancialmente el peptido. Los procedimientos adecuados para sintetizar los peptidos descritos en el presente documento, asf como las qmmicas adecuadas para ciclizar los peptidos, son bien conocidos en la tecnica.

En diversas realizaciones, la ciclizacion puede conseguirse mediante acoplamiento directo del extremo N y C para formar un enlace peptfdico (u otro), pero tambien puede ocurrir a traves de las cadenas laterales de aminoacidos. Ademas, puede basarse en el uso de otros grupos funcionales, incluyendo pero sin limitarse a amino, hidroxi, sulfhidrilo, halogeno, sulfonilo, carboxi y tiocarboxilo. Estos grupos pueden estar situados en las cadenas laterales de aminoacidos o estar unidos a su extremo N o C-terminal.

Por consiguiente, debe entenderse que el enlace qmmico utilizado para ciclizar covalentemente los peptidos de la invencion no necesita ser un enlace amida. En muchos casos, puede ser deseable modificar los extremos N y C del peptido lineal o no ciclizado para proporcionar, por ejemplo, grupos reactivos que se pueden ciclizar bajo condiciones de reaccion suaves. Tales enlaces incluyen, a modo de ejemplo y no limitativo, amida, ester, tioester, CH2-NH, etc. Las tecnicas y reactivos para sintetizar peptidos que tienen terminales modificados y productos qmmicos adecuados para ciclizar tales peptidos modificados son bien conocidos en la tecnica.

Alternativamente, en los casos en los que los extremos del peptido estan conformacionalmente o de otro modo restringidos para hacer difmil la ciclizacion, puede ser deseable fijar conectores a los terminales N y/o C-terminales para facilitar la ciclizacion del peptido. Por supuesto, se apreciara que dichos enlazantes soportaran grupos reactivos capaces de formar enlaces covalentes con los extremos del peptido. Los enlazantes y las sustancias qmmicas adecuados son bien conocidos en la tecnica e incluyen los descritos anteriormente.

Los peptidos y depsipeptidos dclicos (peptidos heterodeticos que incluyen enlaces ester (depsidos) como parte de su esqueleto) han sido bien caracterizados y muestran un amplio espectro de actividad biologica. La reduccion en la libertad conformacional provocada por la ciclizacion a menudo da lugar a mayores afinidades de union al receptor. Frecuentemente en estos compuestos dclicos, tambien se incorporan restricciones conformacionales adicionales, tales como el uso de aminoacidos D- y N-alquilados, aminoacidos a,p-deshidro o residuos de aminoacidos a,a- disustituidos.

Los procedimientos para formar enlaces disulfuro en peptidos son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Eichler y Houghten (1997) Protein Pept, Lett., 4: 157-164).

Tambien se puede hacer referencia a Marlowe (1993) Biorg. Med. Chem. Lett. 3: 437-44 que describe la ciclizacion de peptidos sobre resina de TFA usando ester de trimetilsililo (TMSE) como un grupo protector ortogonal; Pallin and Tam (1995) J. Chem. Soc. Chem. Comm. 2021-2022) que describen la ciclizacion de peptidos no protegidos en solucion acuosa por formacion de oxima; Algin et al. (1994) Tetrahedron Lett. 35: 9633-9636 que describen la smtesis en fase solida de peptidos dclicos de cabeza a cola mediante anclaje de cadena lateral de lisina; Kates et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34: 1549-1552 que describen la produccion de peptidos dclicos de cabeza a cola mediante una estrategia de fase solida tridimensional; Tumelty et al. (1994) J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1067-1068, que describen la smtesis de peptidos dclicos a partir de un intermedio activado inmovilizado, donde la activacion del peptido inmovilizado se lleva a cabo con el grupo N-protector intacto y la eliminacion subsiguiente conduce a la ciclizacion; McMurray et al. (1994) Peptide Res. 7: 195-206) que describen la ciclizacion de cabeza a cola de peptidos unidos a soportes insolubles por medio de las cadenas laterales de acido aspartico y glutamico; Hruby et al. (1994) Reactive Polymers 22: 231-241) que ensenan un metodo alternativo para ciclizar peptidos a traves de soportes solidos; y Schmidt and Langer (1997) J. Peptide Res. 49: 67-73, que describen un metodo para sintetizar ciclotetrapeptidos y ciclopentapeptidos.

Estos metodos de ciclizacion de peptidos son ilustrativos y no limitantes. Utilizando la ensenanza que se proporciona en el presente documento, los expertos en la tecnica tendran a disposicion otros metodos de ciclizacion.

Usos de los agentes de union al calcio.

Crecimiento del cabello.

Fue un descubrimiento sorprendente e inesperado que los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en la presente invencion pueden inducir el crecimiento del cabello cuando se aplican a la piel de un mairnfero (vease, por ejemplo, las Figuras 1 y 2). Se cree que los agentes pueden usarse para inducir el

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crecimiento del pelo, el rebrote del cabello y/o para inhibir la perdida del cabello en un mai^ero afectado con una condicion que induce perdida del cabello (por ejemplo, alopecia, quimioterapia, etc.). ^picamente, el agente se aplicara al sujeto que lo necesite en una cantidad suficiente para inducir el crecimiento del cabello y/o para reducir la perdida del cabello.

El agente o agentes pueden administrate a traves de cualquiera de un numero de vfas incluyendo, por ejemplo, administracion topica, administracion dermica/intradermica, administracion transdermica, administracion subdermica, iontoforesis transdermica, administracion transdermica de dendnmeros, usando micelas reversas de polfmero, usando micelas inversas de lfpidos, y similares.

En diversas realizaciones, el crecimiento del cabello o la inhibicion de la perdida del cabello comprende la inhibicion de la perdida del cabello en una o mas regiones donde se desea el crecimiento/mantenimiento del cabello (por ejemplo, una o mas regiones tales como la cabeza, la ceja, la region del bigote (labio superior), el pecho, y similares).

En ciertas realizaciones, los peptidos de union al calcio y/u otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en la presente invencion se formulan para administracion topica, dermica, intradermica, transdermica o subdermica (por ejemplo, como enjuagues, tonicos, soluciones, emulsion, espuma, crema, gel, unguentos, polvos, linimento o balsamo, locion, unguento, etc.).

En ciertas realizaciones, los peptidos de union al calcio y/o otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en el presente documento y/o formulaciones de los mismos se proporcionan como componentes usados en el tratamiento, mantenimiento, limpieza o coloracion del cabello. Por lo tanto, por ejemplo, en ciertas realizaciones, los peptidos de union al calcio y/u otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en el presente documento y/o formulaciones de los mismos se proporcionan como componentes de un champu, un acondicionador para el cabello, un agente colorante para el cabello, un desenredante para el cabello, un enjuague para el cabello, y similares.

Crecimiento de las unas.

Fue un descubrimiento sorprendente e inesperado que los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en la presente invencion pueden inducir crecimiento de unas cuando se aplican a la una, matriz de unas, cutfcula y similares de un mairnfero (veanse, por ejemplo, las Figuras 12 y 13). Los peptidos y otras unidades estructurales de union al calcio tambien pueden usarse para mejorar el crecimiento y la salud de las unas, las unas de los pies, los cascos de los animales, las garras y los cuernos.

En ciertas realizaciones, los peptidos que se unen al calcio y otras unidades estructurales de union al calcio descritos en la presente se aplican a la matriz de unas (cutfcula), al area de la corona de un casco o a la base del cuerno para aumentar el crecimiento de la una, garra, casco, o cuerno. Las formulaciones desarrolladas para administracion dermica, intradermica, subdermica y transdermica son tambien eficaces para este proposito.

En ciertas realizaciones, los peptidos de union al calcio y/o otras unidades estructurales de union al calcio descritos en el presente documento y/o formulaciones de los mismos se proporcionan como componentes usados en el tratamiento, mantenimiento, limpieza o coloracion de unas, cascos o cuernos. Por lo tanto, por ejemplo, en ciertas realizaciones, los peptidos de union al calcio y/o otras unidades estructurales de union al calcio descritos en el presente documento y/o formulaciones de los mismos se proporcionan como componentes de una formulacion seleccionada del grupo que consiste en un esmalte de unas, un consolidador de unas, un balsamo, un barniz, un pegamento de unas o cascos, un sellador, una crema, una locion, un bano de pies, un bano de cascos y similares.

En ciertas realizaciones, los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en el presente documento se aplican diariamente o con menos frecuencia hasta que se alcanza el resultado deseado.

Remineralizacion

Los peptidos que se unen al calcio y otras unidades estructurales de union al calcio descritos en este documento inducen el crecimiento del cristal de fosfato de calcio en el esmalte desmineralizado y en dentina desmineralizada y no desmineralizada, dependiendo de las condiciones de tratamiento. Asf mismo, estos agentes pueden inducir la remineralizacion del hueso. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden los agentes de union al calcio descritos en el presente documento pueden usarse para aumentar la mineralizacion reclutando partfculas de fosfato de calcio que flotan libremente a superficies calcificadas. Estos agentes pueden unirse a superficies calcificadas y/o agregados de fosfato de calcio libremente flotantes. La union concurrente de superficies calcificadas y agregados libremente flotantes da como resultado una concentracion aumentada de fosfato de calcio cerca de la superficie calcificada, lo que conduce a una remineralizacion mejorada de la superficie. Modulando el tamano y la afinidad de union de los agentes, es posible alterar la cantidad de calcio unida a la superficie. En ciertas realizaciones, la remineralizacion de los dientes da como resultado una oclusion completa o parcial de los tubulos dentinarios.

Las composiciones que comprenden los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales descritas en la presente pueden ser utilizadas para remineralizar un diente, prevenir o ralentizar la desmineralizacion de los dientes, tratar el dano de los dientes, formar capas minerales en la superficie de un diente o por debajo de ella, Tal como por

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ejemplo aumento o disminucion de la densidad mineral, o sellar un sitio dental. De igual modo, estas composiciones pueden usarse para tratar un defecto oseo, lesion, tumor, crecimiento anomalo, enfermedad o perdida de hueso, causar la formacion de capas minerales en o por debajo de la superficie de un hueso, o alterar la densidad de un hueso, tal como por ejemplo aumentando o disminuyendo la densidad. En estas realizaciones, una composicion que comprende uno o mas agentes de union al calcio como se ha descrito anteriormente se aplica en o cerca del sitio del hueso o huesos afectados. En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden los agentes de union al calcio descritos en el presente documento pueden usarse para tratar la calcificacion, lesiones calcareas o defectos mineralizados en tejidos y organos distintos del hueso, incluida la placa arterial.

Como se muestra en el Ejemplo 6, los peptidos que se unen al calcio y otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en el presente documento pueden mejorar la desmineralizacion cuando se usan conjuntamente con un desensibilizador/remineralizador de dientes (por ejemplo, desensibilizador QUELL®). Por consiguiente, se contemplan metodos en los que los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de union al calcio se utilizan conjuntamente entre sf para potenciar la remineralizacion y/o la desensibilizacion de los dientes. De manera similar, se contemplan composiciones que comprenden uno o mas de los peptidos que se unen al calcio y otras unidades estructurales de union al calcio descritos en el presente documento y uno o mas agentes desensibilizadores/remineralizantes. En ciertas realizaciones, el agente desensibilizante/remineralizante incluye calcio (por ejemplo, cloruro de calcio y/o fosfato de potasio), pero no necesita ser limitado de esta manera. En la Tabla 4 se muestran agentes desensibilizantes/remineralizantes ilustrativos.

Tabla 4. Agentes desensibilizadores/remineralizantes ilustrativos, pero no limitantes, para uso en conjuncion con uno o mas peptidos de union al calcio y/o unidades estructurales de union al calcio descritos en el presente documento.

Producto

Fabricante Agentes activos

ADMIRA® PROTECT SINGLEDOSE

Voco Gmbh HEMA, Fluoruro, Ormocer

D/SENSE CRYSTAL®

Centrix Nitrato de potasio, oxalato de calcio

DURAFLOR® fluoruro de sodio barniz

Medicom Fluoruro de sodio

DURAPHAT®

Colgate Oral Pharmaceuticals Fluoruro de sodio

GEL-KAM DENTINBLOC®

Colgate Oral Pharmaceuticals Fluoruro de sodio y fluoruro estannoso

GLUMA® DESENSITIZER

Heraeus Kulzer Glutaraldehfdo

HEALTH-DENT® DESENSITIZER

Healthdent'l Cloruro de benzalconio

HEMASEAL® & CIDE®

Advantage Dental Products Clorhexidina, HEMA

HURRISEAL®

Beutlich Pharmaceuticals HEMA

QUELL® DESENSITIZER

Pentron Clinical Technologies Cloruro de calcio, fosfato de potasio

SUPER SEAL®

Phoenix Dental Oxalato Acido, Sal de Potasio

SYSTEMP® DESENSITIZER

Ivoclar Vivadent Glutaraldehfdo, acido maleico, polietilenglicol, dimetacrilato

ULTRAEZ®

Ultradent Nitrato de potasio, Fluoruro

ZAROSEN®

Cetylite Industries Cloruro de estroncio

Productos que contienen NovaMin®

Sultan Healthcare Calcio, fosforo, sflice y sodio

En ciertas realizaciones, el peptido/unidad estructural de union al calcio y el agente desensibilizante/remineralizante se proporcionan en un producto tal como una pasta dental, un enjuague bucal, una crema desensibilizante, gel, pasta y similares.

A diferencia de los enfoques actuales de remineralizacion de superficies de dientes que se basan en inundar la cavidad oral con formulaciones de calcio libre o enlazado a protemas (por ejemplo, formulaciones de calcio libre, calcio ligado a protema, fluoruro de sodio, fluoruro estannoso y similares), estos compuestos hacen que los agregados de fosfato de calcio se adhieran espedficamente a la superficie del diente, aumentando asf la concentracion local de calcio y fosfato y aumentando la probabilidad de que este fosfato de calcio se incorpore en las regiones desmineralizadas del

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diente. Las terapias farmaceuticas actuales para lesiones o enfermedades de tejidos calcificados dependen de rodear el area de la superficie deseada, ya sea directamente (topicamente) o por administracion sistemica, con soluciones libres del compuesto terapeutico de interes, con la esperanza de que alguna fraccion interactuara con la superficie calcificada.

Adhesion a superficies/substratos calcificados.

En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en el presente documento pueden usarse como un medio para la union espedfica de porciones o partfculas qmmicas deseables a las superficies calcificadas, tales como las de los huesos y los dientes. Los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de enlace de calcio pueden proporcionarse con un enlazante unido, y/o un sitio reactivo, o una unidad estructural unida (por ejemplo, antibiotico, marcador detectable, etc.) y la union del peptido u otra unidad estructural de enlace de calcio a un sustrato que contiene calcio proporciona el grupo reactivo, un enlazante localizado en ese sitio para la posterior fijacion de un efector deseado o donde el efector de interes esta unido al peptido de union al calcio u otra unidad estructural, el efector se administra de este modo al sustrato.

Ensayos para la calcificacion disfuncional.

En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales de union al calcio descritos en el presente documento pueden usarse para ensayos in situ e in vivo para la calcificacion inapropiada. Por ejemplo, estas composiciones pueden usarse para diagnosticar, identificar, localizar o tratar calcificaciones, lesiones calcareas o defectos mineralizados en tejidos y organos distintos del hueso, incluyendo por ejemplo placa arterial, calculos renales o sesamoides. Los ensayos actualmente en uso para determinar la presencia de calcificacion incluyen metodos de union de colorantes, incorporacion de isotopos radiactivos, analisis de transmision de rayos X y analisis qmmico cuantitativo. Cada uno de estos metodos sufre de ciertas desventajas. En los metodos de union de colorantes, se expone una muestra a un colorante fluorescente quelante de calcio tal como tetraciclina, calcema o alizarina, y se visualiza la incorporacion del colorante en el tejido de interes. Aunque los colorantes pueden introducirse in vivo, la visualizacion de la senal requiere la escision del tejido de interes. El tratamiento de tejido fijo con iones de plata (tincion de von Kossa) tambien puede usarse para identificar sitios de calcificacion, pero este metodo no puede aplicarse in vivo y esta sujeto a niveles significativos de tincion de fondo. La incorporacion de isotopos radiactivos tales como 45Ca proporciona informacion precisa y cuantitativa sobre la localizacion y la tasa de calcificacion in vivo, pero tiene el inconveniente de exponer a sujetos experimentales a altos niveles de radiacion ionizante. El analisis de transmision de rayos X proporciona una alta resolucion espacial y puede lograrse en animales vivos, pero no puede identificar de forma unica depositos de calcio entre las otras caractensticas visibles en una imagen de rayos X. El analisis qmmico cuantitativo in vitro de los depositos de calcio proporciona determinaciones solidas del tipo y la cantidad de mineral presente, pero estos metodos son laboriosos y dan lugar a la perdida de informacion sobre la ubicacion y estructura del tejido involucrado.

Visualizacion/deteccion de tejidos o regiones calcificadas.

En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden los peptidos que se unen al calcio y otras unidades estructurales descritas en el presente documento pueden marcarse de manera fluorescente o de otro modo y utilizarse como un medio mejorado para visualizar regiones calcificadas en un tejido de interes. Estos agentes se pueden sintetizar facilmente con altos rendimientos, y tienen una seguridad, toxicidad y facilidad de uso mejoradas en comparacion con los metodos actualmente disponibles. La secuencia o composicion del agente puede ser alterada para cambiar la afinidad relativa del agente para tipos espedficos de tejido o superficie (por ejemplo, como se describe en el presente documento en los ejemplos). Esto permitira al agente discriminar entre dentina, esmalte, hueso y otros tejidos o superficies calcificados y entre tejidos sanos y enfermos. Esta propiedad permite que estos compuestos se utilicen como sondas para lesiones o lesiones patologicas en tejido calcificado. Los agentes pueden usarse solos, o en conjuncion con otros metodos conocidos para detectar calcificacion. En contraste con los fluoroforos de fijacion de calcio disponibles actualmente, que estan limitados a los que pueden quelar los iones de calcio, manteniendo su fluorescencia, los peptidos y otros agentes de union al calcio descritos en el presente documento pueden unirse a cualquier fluoroforo. Esto amplfa enormemente la paleta de colores que se pueden utilizar para etiquetar las superficies calcificadas y permite adaptar con precision las longitudes de onda de emision y las tecnologfas de deteccion a cada experimento individual. Mediante la conjugacion de estos agentes con colorantes fluorescentes, colorimetricos, radiactivos, activos en RMN u otros colorantes o indicadores y el tratamiento de muestras biologicas con estos conjugados, se hace posible realizar observaciones cuantitativas de la extension de la calcificacion in situ e in vivo sin fijar o alterar considerablemente la muestra. Debido a su alta especificidad y velocidades de union rapidas, tales conjugados pueden proporcionar una tincion de fondo mas baja que los metodos de tincion con iones de plata de von Kossa. La gran variedad de etiquetas que se pueden unir a estos agentes aglutinantes de calcio ofrece una enorme flexibilidad con respecto a las condiciones de union y los metodos de deteccion, lo que aumenta enormemente la facilidad y calidad con la que pueden ser llevadas a cabo investigaciones biologicas, biomedicas, biotecnologicas, ambiental, y otras.

Agentes de diagnostico.

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.Los peptidos y otras unidades estructurales de enlace de calcio descritos en la presente invencion tienen un gran potencial como agentes de diagnostico porque, a diferencia de los procedimientos actuales de identificacion de lesiones, infecciones, tumores u otras lesiones de tejidos calcificados, que se basan principalmente en observacion visual o radiologica, los peptidos aqu descritos puede usarse para detectar tales eventos sin depender del ojo humano. Se ha demostrado que diversos agentes descritos en el presente documento se dirigen espedficamente al esmalte desmineralizado y a la dentina no desmineralizada. En particular, estos agentes han mostrado la capacidad de unirse preferentemente las lesiones de los dientes cariados. Ademas, diversas variantes han mostrado la capacidad de dirigir subporciones precisas de la estructura dental, tales como, por ejemplo, la dentina de la punta de la rafz, el esmalte basal, la dentina del manto, el esmalte cortical y la superficie del esmalte. Las composiciones que comprenden agentes aglutinantes de calcio conjugados con diversos unidades estructurales detectables, tales como por ejemplo colorantes fluorescentes, colorimetricos, radiactivos, Activos en RMN u otros colorantes o indicadores, se pueden administrar a un sujeto a porciones espedficas de diana del diente e identificar aquellas porciones del diente que exhibe la desmineralizacion u otro dano. La composicion de los agentes puede seleccionarse de tal manera que puedan dirigirse tipos espedficos de tejido o dano de tejido. El uso de estos agentes permite la identificacion espedfica de las regiones danadas, incluidas aquellas que pueden haber sido demasiado pequenas para verlas u oscurecidas de otro modo, aumentando enormemente la facilidad y exactitud del diagnostico para estas lesiones. Del mismo modo, en ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden los agentes de union al calcio descritos en el presente documento pueden usarse como agentes de contraste para radiograffa, tomograffa computarizada o imagenes de resonancia magnetica.

Direccionamiento de unidades estructurales.

En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden los peptidos de union al calcio y otras unidades estructurales descritas en el presente documento pueden usarse para dirigir compuestos terapeuticos a las superficies de huesos, dientes u otros tejidos calcificados. Por ejemplo, las unidades estructurales de enlace de calcio pueden conjugarse con compuestos antimicrobianos, moduladores de desarrollo de huesos y dientes, o cualquier otro compuesto que se pueda unir a la unidad estructural. La conjugacion de un compuesto terapeutico a uno de estos unidades estructurales puede usarse para localizar el compuesto terapeutico a una superficie calcificada, dando lugar a una concentracion local aumentada del compuesto ya una eficacia mejorada. Al localizar el compuesto en un tejido de interes, estos unidades estructurales reducen la concentracion del compuesto necesaria para conseguir el efecto deseado. Ademas de mejorar la eficacia, el direccionamiento espedfico del compuesto terapeutico a un tejido de interes evita que los tejidos no objetivo sufran los efectos potencialmente daninos del compuesto. La composicion o longitud de la unidad estructural de union al calcio se puede ajustar para permitir el direccionamiento espedfico a regiones danadas o enfermas del tejido.

Tratamiento infecciones microbianas.

En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden las unidades estructurales de enlace de calcio descritas en el presente documento pueden usarse para tratar una infeccion microbiana, tal como por ejemplo una infeccion bacteriana. En estas realizaciones, los peptidos pueden estar unidos a un peptido antimicrobiano, tal como por ejemplo un peptido 2c-4, b-34 o PL-135 (SEQ ID NO: 26, 30 y 32, en el documento WO 2007/038683, respectivamente) o a otra unidad estructural antimicrobiana.

Basandose en la capacidad de los agentes de union al calcio descritos en el presente documento para unir selectivamente de calcio o fosfatos de calcio, las composiciones que comprenden estos agentes pueden incorporarse en un sensor para la deteccion de calcio en agua potable, aguas residuales, soluciones industriales, alimentos, bebidas, aplicaciones de investigacion, o cualquier solucion para la que se desea la determinacion de la presencia de calcio. De igual modo, estas composiciones pueden usarse para controlar la deposicion de minerales de calcio en, por ejemplo, aplicaciones industriales, de fabricacion, medicas, de investigacion, domesticas o personales. Ademas, estas composiciones se pueden emplear para determinar la presencia o cantidad de diversos minerales de calcio en, por ejemplo, cultivos celulares, tejidos, animales experimentales, sujetos humanos experimentales u otras aplicaciones de investigacion.

Construcciones quimericas.

Los peptidos de union al calcio y/o las unidades estructurales de union al calcio similares a los peptidos descritos en el presente documento pueden unirse directa o indirectamente, covalentemente o no covalentemente, a uno o mas conjugados o unidades estructurales. Tales conjugados o unidades estructurales incluyen, pero no se limitan a, otros peptidos, polipeptidos, protemas, carbohidratos, acidos nucleicos, lfpidos, compuestos organicos, compuestos inorganicos, compuestos organometalicos, unidades estructurales terapeuticas tales como por ejemplo un agente anticanceroso o antimicrobiano. Otros ejemplos de conjugados o unidades estructurales que se pueden unir a los peptidos enlazantes de calcio descritos en la presente invencion incluyen marcadores detectables tales como por ejemplo fluoroforos, cromoforos, marcadores de afinidad, marcadores radiactivos o marcadores de rotacion. Ademas, uno o mas atomos dentro de un peptido de union al calcio o un conjugado o unidad estructural unida se pueden sustituir, por ejemplo, con un isotopo radioactivo o activo en RMN.

La union entre un agente de union al calcio y un conjugado o unidad estructural puede ocurrir en el extremo amino de

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un peptido, el extremo carboxi de un peptido, o a traves de un sitio interno en el peptido, o a traves de un grupo conveniente en un fragmento no-peptido de union al calcio. En ciertas realizaciones, el agente puede estar enlazado a un conjugado o unidad estructural a traves de un enlazante de aminoacidos, tal como por ejemplo una secuencia enlazante de triglicina, o un enlazante no aminoacido. En la Tabla 3 se muestran enlaces adecuados ilustrativos.

Conjugacion qrnmica.

Las unidades estructurales quimericas pueden formarse uniendo uno o mas de los peptidos que se unen al calcio u otras unidades estructurales descritas en la presente invencion a uno o mas efectores. En ciertas realizaciones, las unidades estructurales de union a Ca se unen directamente a los efectores a traves de grupos reactivos naturales o la unidad estructural de direccionamiento y/o los efectores pueden ser funcionalizados para proporcionar tales grupos reactivos.

En diversas realizaciones, las unidades estructurales de union a Ca estan unidas a un efector(es) a traves de uno o mas agentes de union. Asf, En diversas realizaciones, las unidades estructurales de union al Ca y los efectores pueden conjugarse por medio de un solo agente de union o de multiples agentes de union. Por ejemplo, la unidad estructural de enlace Ca y el efector pueden conjugarse por medio de un unico agente multifuncional (por ejemplo, bi, tri- o tetra) o un par de agentes de union complementarios. En otra realizacion, la unidad estructural de union al Ca y el efector se conjugan mediante dos, tres o mas agentes de union. Agentes de union adecuados incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, grupos funcionales, agentes de afinidad, grupos estabilizadores y combinaciones de los mismos.

En ciertas realizaciones, el agente de union es o comprende un grupo funcional. Los grupos funcionales incluyen ligandos monofuncionales que comprenden un grupo reactivo, asf como reticulantes multifuncionales que comprenden dos o mas grupos reactivos capaces de formar un enlace con dos o mas objetivos funcionales diferentes (por ejemplo, marcadores, protemas, macromoleculas, nanocristales semiconductores o sustrato). En algunas realizaciones preferidas, los reticuladores multifuncionales son reticulantes heterobifuncionales que comprenden dos o mas grupos reactivos diferentes.

Los grupos reactivos adecuados incluyen, pero sin limitacion, tiol (-SH), carboxilato (COOH), carboxilo (-COOH), carbonilo, amina (NH2), hidroxilo (-OH), aldehndo (-CHO), alcohol (ROH), cetona (R2CO), hidrogeno activo, ester, sulfhidrilo (SH), fosfato (-PO3) o unidades estructurales fotorreactivos. Los grupos reactivos con amina incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, isotiocianatos, isocianatos, acilazidas, esteres de NHS, cloruros de sulfonilo, aldehndos y glioxales, epoxidos y oxiranos, carbonatos, agentes arilantes, imidoesteres, carbodiimidas y anhndridos. Los grupos reactivos con tiol incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, derivados de haloacetilo y haluros de alquilo, maleimidas, aziridinas, derivados de acriloilo, agentes arilantes y reactivos de intercambio de disulfuros de tiol. Los grupos reactivos con carboxilato incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, diazoalcanos y compuestos diazoacetilo, tales como carbonildiimidazoles y carbodiimidas. Los grupos reactivos con hidroxilo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, epoxidos y oxiranos, carbonildiimidazol, oxidacion con peryodato, carbonato de N,N'-disuccinimidilo o cloroformiato de N-hidroxilsuccimidilo, oxidacion enzimatica, halogenos de alquilo e isocianatos. Los grupos reactivos con aldehndo y cetona incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, derivados de hidrazina para la formacion de bases de Schiff o aminacion por reduccion. Los grupos reactivos con hidrogeno activo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, derivados de diazonio para las reacciones de condensacion y de yodacion de Mannich. Los grupos fotorreactivos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, arilazidas y arilazidas halogenadas, benzofenonas, compuestos diazoicos y derivados de diazirina.

Otros grupos reactivos adecuados y clases de reacciones utiles en la formacion de unidades estructurales quimericas incluyen aquellos que son bien conocidos en la tecnica de la qrnmica del bioconjugado. Las clases actualmente favorecidas de reacciones disponibles con quelatos reactivos son aquellas que se desarrollan en condiciones relativamente suaves. Estos incluyen, pero no se limitan a, sustituciones nucleofilas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, esteres activos), sustituciones electrofflicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces multiples carbono-carbono y carbono-heteroatomo (por ejemplo, reaccion de Michael, adicion de Diels-Alder). Estas y otras reacciones utiles se discuten en, por ejemplo, March (1985) Advanced Organic Chemistry, 3a edicion, John Wiley & Sons, Nueva York, Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego; y Feeney et al. (1982) Modificacion de Protemas; Advances in Chemistry Series, vol. 98, American Chemical Society, Washington, D.C.

En ciertas realizaciones, el agente de union comprende un quelante. Por ejemplo, el quelante que comprende la molecula, DOTA (1,4,7,10-tetrakis (carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano), puede marcarse facilmente con un radiomarcador, tal como Gd3+ y 64Cu, resultando en Gd3+ -DOTA y 64Cu-DOTA respectivamente, unidos a la porcion de union a Ca. Otros quelatos adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, los derivados de acido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N”-triacetico (NOTA) estan entre los mas conocidos (vease, por ejemplo, Lee Et al (1997) Nucl Med Biol. 24: 2225-23019).

Un "enlazante" o "agente de enlace" tal como se usa en el presente documento descriptiva, es una molecula que se usa para unir dos o mas moleculas. En ciertas realizaciones, el enlazante es tfpicamente capaz de formar enlaces covalentes a ambas moleculas (por ejemplo, la unidad estructural de union a Ca y el efector). Los enlazantes adecuados son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, los enlazantes de

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carbono de cadena lineal o ramificada, los enlazantes de carbono heterodclicos o los enlazantes peptidicos. En ciertas realizaciones los enlazantes pueden unirse a los aminoacidos constituyentes a traves de sus grupos laterales (por ejemplo, a traves de un enlace disulfuro a cistema). Sin embargo, en ciertas realizaciones, los enlazantes se uniran a los grupos alfa carbono amino y carboxilo de los aminoacidos terminales.

Se puede usar un enlazante bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo en una molecula (por ejemplo, un peptido que se une al Ca), y otro grupo reactivo sobre la otra molecula (por ejemplo, un peptido antimicrobiano), para formar el enlace deseado conjugado. Alternativamente, la derivacion se puede realizar para proporcionar grupos funcionales. Asf, por ejemplo, tambien se conocen procedimientos para la generacion de grupos sulfhidrilo libres sobre peptidos (vease Patente de los Estados Unidos No. 4,659,839).

En ciertas realizaciones, el agente de union es un reticulante heterobifuncional que comprende dos o mas grupos reactivos diferentes que forman un anillo heterodclico que puede interactuar con un peptido. Por ejemplo, un reticulante heterobifuncional tal como cistema puede comprender un grupo reactivo amina y un grupo reactivo tiol puede interactuar con un aldetndo sobre un peptido derivatizado. Combinaciones adicionales de grupos reactivos adecuados para agentes de reticulacion heterobifuncionales incluyen, por ejemplo, grupos reactivos de amina y sulfhidrilo; grupos carbonilo y sulfhidrilo reactivos; grupos amina y fotorreactivos; sulfhidrilo y grupos fotorreactivos; grupos carbonilo y fotorreactivos; carboxilato y grupos fotorreactivos; y arginina y grupos fotorreactivos. En una realizacion, el reticulante heterobifuncional es SMCC.

Se conocen muchos procedimientos y moleculas enlazantes para la union de diversas moleculas a peptidos o protemas (vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea No. 188,256, las Patentes de los Estados Unidos No. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784, 4,680,338, 4,569,789 y 4,589,071; y Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075). En los Ejemplos 2 y 3 se proporcionan protocolos de union ilustrativos. Los enlazantes adecuados ilustrativos incluyen, pero no se limitan a los mostrados en la Tabla 3.

Protemas de fusion.

En ciertas realizaciones en las que la unidad estructural de union al Ca y el efector son ambos peptidos o ambos comprenden peptidos, la unidad estructural quimerica puede sintetizarse qmmicamente o expresarse de forma recombinante como una protema de fusion (es decir, una protema de fusion quimerica).

En ciertas realizaciones las protemas de fusion quimericas se sintetizan usando metodologfa de ADN recombinante. Generalmente esto implica crear una secuencia de ADN que codifica la protema de fusion, colocar el ADN en un casete de expresion bajo el control de un promotor particular, expresar la protema en un huesped, aislar la protema expresada y, si es necesario, volver a marcar la protema.

El ADN que codifica las protemas de fusion puede prepararse mediante cualquier metodo adecuado, incluyendo, por ejemplo, clonacion y restriccion de secuencias apropiadas o smtesis qmmica directa por metodos tales como el metodo de fosfotriester de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el metodo fosfodiester de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el metodo dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; y el metodo de soporte solido de la Patente de los Estados Unidos No. 4,458,066.

La smtesis qmmica produce un oligonucleotido monocatenario. Este puede convertirse en ADN bicatenario por hibridacion con una secuencia complementaria o por polimerizacion con una ADN polimerasa usando la hebra simple como molde. Un experto reconocera que mientras que la smtesis qmmica de ADN esta limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias mas largas mediante la ligacion de secuencias mas cortas.

Alternativamente, las subsecuencias pueden clonarse y las subsecuencias apropiadas se escindieron usando enzimas de restriccion apropiadas. Los fragmentos pueden ser entonces ligados para producir la secuencia de ADN deseada.

En ciertas realizaciones, el ADN que codifica las protemas de fusion de la presente invencion puede clonarse usando metodos de amplificacion de ADN tales como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Asf, por ejemplo, el acido nucleico que codifica una unidad estructural de enlazamiento al Ca se amplifica por PCR, utilizando un cebador en sentido que contiene el sitio de restriccion para Ndel y un cebador antisentido que contiene el sitio de restriccion para HindIII. Esto produce un acido nucleico que codifica la secuencia de union a Ca y que tiene sitios de restriccion terminales. De forma similar, puede proporcionarse un efector y/o efector/enlazante/espaciador que tiene sitios de restriccion complementarios. La ligacion de secuencias y la insercion en un vector produce un vector que codifica la protema de fusion.

Aunque las unidades estructurales de union al Ca y los efectores pueden unirse directamente entre sf, uno de los expertos apreciara que pueden separarse por un espaciador/enlazante peptfdico que consiste en uno o mas aminoacidos. Generalmente, el espaciador no tendra actividad biologica espedfica aparte de unir las protemas o preservar alguna distancia minima u otra relacion espacial entre ellas. Sin embargo, los aminoacidos constituyentes del espaciador pueden seleccionarse para influir en alguna propiedad de la molecula tal como el plegamiento, la carga neta o la hidrofobicidad.

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Las secuencias de acido nucleico que codifican las protemas de fusion pueden expresarse en una variedad de celulas huesped, incluyendo E. coli, otros huespedes bacterianos, levadura y varias celulas eucariotas superiores tales como las lmeas de celulas COS, CHO y HeLa y celulas de mieloma lmeas. El gen de la protema recombinante estara operativamente unido a secuencias de control de expresion apropiadas para cada huesped. Para E. coli esto incluye un promotor tal como los promotores T7, trp, o lambda, un sitio de union al ribosoma y preferiblemente una senal de terminacion de la transcripcion. Para las celulas eucariotas, las secuencias de control incluiran un promotor y preferiblemente un potenciador derivado de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilacion, y pueden incluir secuencias de donante y aceptor de empalme.

Los plasmidos se pueden transferir a la celula huesped elegida por metodos bien conocidos tales como la transformacion de cloruro de calcio para E. coli y el tratamiento con fosfato de calcio o electroporacion para celulas de mairnfero. Las celulas transformadas por los plasmidos pueden seleccionarse por resistencia a antibioticos conferidos por genes contenidos en los plasmidos, tales como los genes amp, gpt, neo e hyg.

Una vez expresadas, las protemas de fusion recombinantes pueden purificarse segun procedimientos estandar de la tecnica, incluyendo precipitacion con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatograffa en columna, electroforesis en gel y similares (vease, en general, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Gma para la purificacion de protemas, Academic Press, Inc. N.Y.). Se prefieren composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad y una preferencia entre 98 y 99% o mas de homogeneidad para usos farmaceuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad segun se desee, los polipeptidos pueden utilizarse entonces terapeuticamente.

Un experto en la tecnica reconocena que despues de smtesis qmmica, expresion biologica o purificacion, la protema de fusion puede poseer una conformacion sustancialmente diferente de las conformaciones nativas de los polipeptidos constituyentes. En este caso, puede ser necesario desnaturalizar y reducir el polipeptido y luego hacer que el polipeptido se repliegue en la conformacion preferida. Los metodos para reducir y desnaturalizar las protemas e inducir el repliegue son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Debinski et al (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070, Kreitman and Pastan 1993) Biaconjug, Chem., 4: 581-585, y Buchner et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270).

Un experto reconocera que se pueden hacer modificaciones a las protemas de fusion sin disminuir su actividad biologica. Se pueden hacer algunas modificaciones para facilitar la clonacion, expresion o incorporacion de la molecula de enlazamiento al Ca en una protema de fusion. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, una metionina anadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de iniciacion o aminoacidos adicionales colocados en cualquiera de los extremos para crear sitios de restriccion convenientemente situados o codones de terminacion.

Como se ha indicado anteriormente, en diversas realizaciones se utiliza un ligante peptidico/espaciador para unir los uno o mas unidades estructurales de union a Ca a uno o mas efectores. En diversas realizaciones, el enlazante peptfdico es relativamente corto, tfpicamente menos de aproximadamente 10 aminoacidos, preferiblemente menos de aproximadamente 8 aminoacidos y mas preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 5 aminoacidos. Los enlazantes ilustrativos adecuados incluyen, pero no se limitan a, varios enlazantes peptfdicos mostrados anteriormente en la Tabla 3.

Administracion y formulaciones.

En ciertas realizaciones, los agentes de union al calcio descritos en este documento y/o las construcciones quimericas que comprenden tales unidades estructurales (por ejemplo, agentes de union al calcio unidos a peptido(s) antimicrobiano, marcadores detectables, etc.) se administran a un mamnfero que lo necesita, a una celula, a un tejido, a una composicion (por ejemplo, un alimento), etc.). En diversas realizaciones, las composiciones se pueden administrar para detectar y/o localizar, y/o cuantificar la presencia de calcificacion anormal y/o desmineralizacion, y similares. En diversas realizaciones, las composiciones se pueden administrar para inhibir la perdida del cabello y/o para inducir el crecimiento del cabello, y/o para aumentar el crecimiento o la reparacion de las unas, el crecimiento o reparacion de los cascos, el crecimiento o reparacion de los cuernos y similares.

Estos agentes activos (fragmentos de union al calcio y/o peptidos de union al calcio y/o construcciones quimericas que comprenden unidades estructurales de union al calcio y/o peptidos unidos al calcio unidos a uno o mas efectores (por ejemplo, marcadores detectables, antimicrobianos, etc.) se pueden administrar en la forma "nativa" o, si se desea, en forma de sales, esteres, amidas, profarmacos, derivados y similares, siempre que la sal, ester, amida, profarmaco o derivado sea farmacologicamente adecuado, es decir, eficaces en el presente metodo o metodos. Las sales, esteres, amidas, profarmacos y otros derivados de los agentes activos pueden prepararse usando procedimientos estandar conocidos por los expertos en la materia de qmmica organica sintetica y descritos, por ejemplo, por March (1992) Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms and Structure, 4a Ed. N.Y. Wiley-Interscience.

Los metodos de formulacion de tales derivados son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las sales de disulfuro de un numero de agentes de administracion se describen en la Publicacion PCT WO 00/059863. De forma similar, las sales acidas de peptidos terapeuticos, peptoides u otros mimeticos, y se pueden preparar a partir de la

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base libre utilizando una metodologfa convencional que tipicamente implica la reaccion con un acido adecuado. Generalmente, la forma de base del farmaco se disuelve en un disolvente organico polar tal como metanol o etanol y se anade el acido al mismo. La sal resultante precipita o puede sacarse de la solucion por adicion de un disolvente menos polar. Los acidos adecuados para preparar sales de adicion acida incluyen, pero no se limitan a ambos acidos organicos, por ejemplo acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido malico, acido malonico, acido succmico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido salidlico y similares, asf como acidos inorganicos, por ejemplo acido clorhndrico, acido bromhndrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares. Una sal de adicion acida puede reconvertirse a la base libre por tratamiento con una base adecuada. Ciertas sales de adicion acida particularmente preferidas de los agentes activos de la presente invencion incluyen sales de haluro, tales como las que pueden prepararse usando acidos clorhndrico o bromhndrico. Por el contrario, la preparacion de sales basicas de los agentes activos de esta invencion se preparan de manera similar usando una base farmaceuticamente aceptable tal como hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de amonio, hidroxido de calcio, trimetilamina o similares. En ciertas realizaciones, las sales basicas incluyen sales de metales alcalinos, por ejemplo, la sal de sodio y sales de cobre.

Para la preparacion de formas salinas de farmacos basicos, el pKa del contraion es preferiblemente al menos aproximadamente 2 pH inferior al pKa del farmaco. De manera similar, para la preparacion de formas salinas de farmacos acidos, el pKa del contraion es preferiblemente al menos aproximadamente 2 pH mas alto que el pKa del farmaco. Esto permite que el contraion traiga el pH de la solucion a un nivel inferior al pHmax para alcanzar la meseta salina, en la que prevalece la solubilidad de la sal sobre la solubilidad del acido o base libre. La regla generalizada de diferencia en las unidades pKa del grupo ionizable en el ingrediente farmaceutico activo (API) y en el acido o la base esta destinada a hacer la transferencia de protones energeticamente favorable. Cuando el pKa del API y el contraion no son significativamente diferentes, puede formarse un complejo solido, pero puede desproporcionarse rapidamente (es decir, descomponerse en las entidades individuales del farmaco y el contraion) en un medio acuoso.

Preferiblemente, el contraion es un contraion farmaceuticamente aceptable. Las formas de sal anionicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, acetato, benzoato, bencilato, bitartrato, bromuro, carbonato, cloruro, citrato, edetato, edisilato, estolato, fumarato, gluceptato, gluconato, hidrobromuro, hidrocloruro, yoduro, lactato, lactobionato, malato , maleato, mandelato, mesilato, bromuro de metilo, sulfato de metilo, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), fosfato y difosfato, salicilato y disalicilato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato, trietyoduro, valerato y similares, mientras que las formas de sales cationicas adecuadas incluyen, pero sin limitacion, aluminio, benzatina, calcio, etilendiamina, lisina, magnesio, meglumina, potasio, procama, sodio, trometamina, zinc y similares.

En diversas realizaciones, la preparacion de esteres implica tfpicamente la funcionalizacion de grupos hidroxilo y/o carboxilo que estan presentes dentro de la estructura molecular del agente activo. En ciertas realizaciones, los esteres son tfpicamente derivados sustituidos con acilo de grupos alcohol libres, es decir, unidades estructurales que se derivan de acidos carboxflicos de la formula RCOOH en la que R es alquilo, y preferiblemente es alquilo inferior. Los esteres se pueden reconvertir en los acidos libres, si se desea, usando procedimientos convencionales de hidrogenolisis o hidrolisis.

Las amidas tambien se pueden preparar usando tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica o descritas en la bibliograffa pertinente. Por ejemplo, las amidas pueden prepararse a partir de esteres, usando reactivos de amina adecuados, o pueden prepararse a partir de un anhndrido o un cloruro de acido por reaccion con amoniaco o una alquilamina inferior.

En diversas realizaciones, los agentes activos identificados en el presente documento son utiles para administracion parenteral, topica, dermica, intradermica, subdermica, oral, nasal (o de otra manera inhalada), pulmonar, rectal u otra local, tal como por aerosol o transdermicamente para inducir la calcificacion y/o crecimiento de las unas, y/o crecimiento del cabello y/o entregar un efector a un sitio de calcificacion o calcificacion defectuosa. Las composiciones se pueden administrar en una variedad de formas de dosificacion unitarias dependiendo del metodo de administracion. Las formas de dosificacion unitaria adecuadas incluyen, pero no se limitan a, polvos, comprimidos, pfldoras, capsulas, pastillas, supositorios, parches, aerosoles nasales, inyectables, formulaciones implantables de liberacion sostenida, complejos lipfdicos, etc.

Los agentes activos (por ejemplo, agentes de union al calcio y/o constructos quimericos) descritos en el presente documento tambien pueden combinarse con un vehnculo (excipiente) farmaceuticamente aceptable para formar una composicion farmacologica. Los vehnculos farmaceuticamente aceptables pueden contener uno o mas compuestos fisiologicamente aceptables que actuan, por ejemplo, para estabilizar la composicion o para aumentar o disminuir la absorcion del (de los) agentes activos. Los compuestos fisiologicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como acido ascorbico o glutation, agentes quelantes, protemas de bajo peso molecular, mejoradores de la proteccion y de la captacion tales como lfpidos, surfactantes, composiciones que reducen la eliminacion o la hidrolisis de los agentes activos, o excipientes u otros estabilizadores y/o reguladores.

Otros compuestos fisiologicamente aceptables, particularmente de uso en la preparacion de comprimidos, capsulas, capsulas de gel y similares, incluyen, pero no se limitan a aglutinantes, diluyentes/cargas, desintegrantes, lubricantes,

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agentes de suspension y similares.

En ciertas realizaciones, para fabricar una forma de dosificacion oral (por ejemplo, un comprimido), un excipiente (por ejemplo, lactosa, sacarosa, almidon, manitol, etc.), un desintegrante opcional (por ejemplo carbonato de calcio, carboximetilcelulosa calcica, glicolato, crospovidona, etc.), un aglutinante (por ejemplo, almidon alfa, goma arabiga, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa, ciclodextrina, etc.) y un lubricante opcional (por ejemplo, talco, estearato de magnesio, polietilenglicol 6000, etc.), por ejemplo, se anaden al componente o componentes activos (por ejemplo, principios activos) y la composicion resultante se comprime. Cuando sea necesario, el producto comprimido se recubre, por ejemplo, por metodos conocidos para enmascarar el sabor o para disolucion enterica o liberacion sostenida. Los materiales de recubrimiento adecuados incluyen, pero no se limitan a, etilcelulosa, hidroximetilcelulosa, polioxietilenglicol, ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y Eudragit (Rohm & Haas, Alemania; copolfmero acnlico metacnlico).

Otros compuestos fisiologicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes que son particularmente utiles para prevenir el crecimiento o la accion de microorganismos. Diversos conservantes son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, fenol y acido ascorbico. Un experto en la tecnica apreciana que la eleccion de vetuculos farmaceuticamente aceptables, incluyendo un compuesto fisiologicamente aceptable depende, por ejemplo, de la via de administracion de los agentes activos y de las caractensticas fisicoqmmicas particulares de los agentes activos.

En ciertas realizaciones los excipientes son esteriles y generalmente libres de materia indeseable. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante tecnicas de esterilizacion convencionales bien conocidas. Para diversos excipientes de forma de dosificacion oral tales como comprimidos y capsulas no se requiere esterilidad. El estandar USP/NF suele ser suficiente.

En ciertas aplicaciones terapeuticas, las composiciones de esta invencion se administran, por ejemplo, administradas por via topica, administradas transdermicamente (por ejemplo, para inducir el crecimiento del cabello y/o para inhibir la perdida del cabello) en una cantidad suficiente para prevenir y/o curar y/o al menos parcialmente prevenir o detener la patologfa y/o sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapeuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y del estado general de la salud del paciente. Pueden suministrarse administraciones unicas o multiples de las composiciones dependiendo de la dosificacion y frecuencia segun se requiera y toleradas por el paciente. En cualquier caso, la composicion debe proporcionar una cantidad suficiente de los agentes activos de las formulaciones de esta invencion para tratar eficazmente (mejorar uno o mas smtomas en) el paciente.

La concentracion de agentes activos puede variar ampliamente, y se seleccionara principalmente basandose en la actividad los ingredientes activos, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administracion seleccionada y las necesidades del paciente. Las concentraciones, sin embargo, se seleccionaran tfpicamente para proporcionar dosificaciones que vanan desde aproximadamente 0.1 o 1 mg/kg/dfa hasta aproximadamente 50 mg/kg/ dfa y a veces mas altas. Las dosificaciones tfpicas oscilan entre aproximadamente 3 mg/kg/dfa y aproximadamente 3.5 mg/kg/dfa, preferiblemente de aproximadamente 3.5 mg/kg/dfa a aproximadamente 7.2 mg/kg/dfa, mas preferiblemente de aproximadamente 7.2 mg/kg/dfa a aproximadamente 11.0 mg/kgMa, y mas preferiblemente de aproximadamente 11.0 mg/ kg/dfa a aproximadamente 15.0 mg/kgMa. En ciertas realizaciones preferidas, las dosificaciones vanan de aproximadamente 10 mg/kgMa a aproximadamente 50 mg/kgMa. En ciertas realizaciones, las dosificaciones vanan desde aproximadamente 20 mg hasta aproximadamente 50 mg administradas oralmente dos veces al dfa. Se apreciara que dichas dosificaciones se pueden variar para optimizar un regimen terapeutico y/o profilactico en un sujeto o grupo particular de sujetos.

En ciertas realizaciones, los agentes activos de esta invencion se administran a la cavidad oral. Esto se logra facilmente mediante el uso de pasta de dientes, enjuague bucal, pastillas, aerosoles, tiras que se adhieren a los dientes (por ejemplo, blanqueadores), hisopos recubiertos, geles, barnices, tiras de disolucion rapida (por ejemplo, tiras orales de alivio del dolor (por ejemplo ORAFILM®), tiras refrescantes del aliento, tiras antihistammicas y similares.

En ciertas realizaciones, el agente o agentes activos de esta invencion se administran topicamente, por ejemplo, a la superficie de la piel, a una lesion o herida topica, a un sitio quirurgico, a un implante quirurgico y similares.

En ciertas realizaciones, los agentes activos de esta invencion se administran por via sistemica (por ejemplo, oralmente o como inyectables) de acuerdo con metodos estandar bien conocidos por los expertos en la tecnica. En otras realizaciones preferidas, los agentes tambien pueden administrarse a traves de la piel usando sistemas de administracion transdermicos convencionales de farmacos, es decir, parches transdermicos, en los que el agente o agentes activos estan contenidos tfpicamente dentro de una estructura laminada que sirve como un dispositivo de suministro de farmaco para ser fijado a la piel. En una estructura de este tipo, la composicion de farmaco esta tfpicamente contenida en una capa, o "deposito", subyacente a una capa de respaldo superior. Se apreciara que el termino "deposito" en este contexto se refiere a una cantidad de "ingrediente(s) activo(s)" que esta finalmente disponible para el suministro a la superficie de la piel. Asf, por ejemplo, el "deposito" puede incluir el ingrediente o ingredientes activos en un adhesivo sobre una capa de soporte del parche, o en cualquiera de una variedad de diferentes formulaciones de matriz conocidas por los expertos en la tecnica. El parche puede contener un solo

deposito, o puede contener multiples depositos.

En una realizacion, el deposito comprende una matriz polimerica de un material adhesivo de contacto farmaceuticamente aceptable que sirve para fijar el sistema a la piel durante la administracion del farmaco. Ejemplos de materiales adhesivos de contacto con la piel adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenos, polisiloxanos, 5 poliisobutilenos, poliacrilatos, poliuretanos y similares. Alternativamente, el deposito que contiene el farmaco y el adhesivo de contacto con la piel estan presentes como capas separadas y distintas, con el adhesivo subyacente al deposito que, en este caso, puede ser una matriz polimerica como se ha descrito anteriormente, o puede ser un deposito lfquido o de hidrogel, o puede tomar alguna otra forma. La capa de soporte de estos laminados, que sirve como superficie superior del dispositivo, funciona preferiblemente como un elemento estructural primario del "parche" 10 y proporciona al dispositivo mucha de su flexibilidad. El material seleccionado para la capa de soporte es preferiblemente sustancialmente impermeable al agente o agentes activos y cualquier otro material que este presente.

Otras formulaciones para administracion topica incluyen, pero no se limitan a, unguentos, geles, pulverizaciones, fluidos y cremas. Los unguentos son preparaciones semisolidas que se basan tfpicamente en vaselina u otros derivados de petroleo. Las cremas que contienen el agente activo seleccionado son tfpicamente emulsiones lfquidas 15 viscosas o semisolidas, a menudo aceite en agua o agua en aceite. Las bases de crema son tfpicamente lavables al agua, y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. La fase oleosa, tambien denominada a veces fase "interna", esta generalmente constituida por vaselina y un alcohol graso tal como alcohol cetflico o esteanlico; la fase acuosa usualmente, aunque no necesariamente, excede la fase oleosa en volumen, y generalmente contiene un humectante. El emulsionante en una formulacion de crema es generalmente un tensioactivo no ionico, anionico, 20 cationico o anfotero. La pomada espedfica o la base de crema que se va a usar, como apreciaran los expertos en la tecnica, es aquella que proporcionara un suministro optimo de farmaco. Al igual que con otros portadores o vehfculos, una base de unguento debe ser inerte, estable, no irritante y no sensibilizante.

Como se ha indicado anteriormente, tambien se contemplan diversas formulaciones bucales y sublinguales.

En ciertas realizaciones, uno o mas agentes activos de la presente invencion pueden proporcionarse como un 25 "concentrado", por ejemplo, en un recipiente de almacenamiento (por ejemplo, en un volumen premedido) listo para la dilucion o en una capsula soluble lista para su adicion a un volumen de agua, alcohol, peroxido de hidrogeno u otro diluyente.

B) Formulacion de nanoemulsiones.

En ciertas realizaciones, las unidades estructurales que enlazan al calcio y/o los peptidos que enlazan al calcio y/o las 30 unidades estructurales quimericas descritos en el presente documento se formulan en una nanoemulsion. Las nanoemulsiones incluyen, pero no se limitan a, nanoemulsiones de aceite en agua (O/W) y nanoemulsiones de agua en aceite (W/O). Las nanoemulsiones se pueden definir como emulsiones con diametros medios de gotita que vanan de aproximadamente 20 a aproximadamente 1000 nm. Usualmente, el tamano medio de las gotitas esta entre aproximadamente 20 nm o 50 nm y aproximadamente 500 nm. Los terminos emulsion submicronica (SME) y 35 miniemulsion se usan como sinonimos.

Las nanoemulsiones ilustrativas de aceite en agua (O/W) incluyen, pero no se limitan a:

Micelas de tensioactivo - micelas compuestas de pequenas moleculas de tensioactivos o detergentes (por ejemplo, SDS/PBS/2-propanol) que son adecuadas para peptidos predominantemente hidrofobos.

Micelas de polfmero - micelas compuestas de agentes tensioactivos de polfmeros, copolfmeros o copolfmeros de 40 bloques (por ejemplo, Pluronic L64/PBS/2-propanol) que son adecuados para peptidos predominantemente hidrofobos;

Micelas mezcladas: micelas en las que hay mas de un componente tensioactivo o en las que una de las fases lfquidas (generalmente un alcohol o compuesto de acido graso) participa en la formacion de la micela (por ejemplo, acido octanoico/PBS/EtOH) que son adecuados para peptidos predominantemente hidrofobos;

45 Micelas de peptido integradas - micelas mezcladas en las que el peptido sirve como un tensioactivo auxiliar, formando una parte integral de la micela (por ejemplo, peptido anfipatico/PBS/aceite mineral) que son adecuadas para peptidos anfipaticos; y

Emulsiones de Pickering (fase solida) - emulsiones en las que los peptidos estan asociados con el exterior de una nanopartfcula solida (por ejemplo, nanopartfculas de poliestireno/PBS/ninguna fase oleosa) que son adecuadas para 50 peptidos anfipaticos.

Las nanoemulsiones ilustrativas de agua en aceite (W/O) incluyen, pero no se limitan a:

Micelas de tensioactivo - micelas compuestas de pequenas moleculas de tensioactivos o detergentes (por ejemplo, dioctil sulfosuccinato/PBS/2-propanol, isopropilmiristate/PBS/2-propanol, etc.) que son adecuadas para peptidos predominantemente hidrofilos;

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Micelas de poKmero - micelas compuestas de agentes tensioactivos de poKmero, copoUmero o copoKmero de bloque (por ejemplo, PLURONIC® L121/PBS/2-propanol), que son adecuados para peptidos predominantemente hidrofilos;

Micelas mezcladas - micelas en las que hay mas de un componente tensioactivo o en las que una de las fases lfquidas (generalmente un alcohol o compuesto de acido graso) participa en la formacion de la micela (por ejemplo, diglicerido caprico/capnlico/PBS/EtOH) que son adecuados para peptidos predominantemente hidrofilos;

Micelas de peptido integradas - micelas mezcladas en las que el peptido sirve como un tensioactivo auxiliar, formando una parte integral de la micela (por ejemplo, peptido anfipatico/PBS/polipropilenglicol) que son adecuados para peptidos anfipaticos; y

Emulsiones de Pickering (fase solida) - emulsiones en las que los peptidos estan asociados con el exterior de una nanopartfcula solida (por ejemplo, nanopartfculas de quitosano/ninguna fase acuosa/aceite mineral) que son adecuadas para peptidos anfipaticos.

Como se ha indicado anteriormente, en ciertas realizaciones las nanoemulsiones comprenden uno o mas tensioactivos o detergentes. En algunas realizaciones, el tensioactivo es un detergente no anionico (por ejemplo, un tensioactivo polisorbato, un eter de polioxietileno, etc.). Los tensioactivos que encuentran uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos tales como las familias de compuestos TWEEN®, TRITON® y TYLOXAPOL®.

En ciertas realizaciones, las emulsiones comprenden ademas uno o mas compuestos cationicos que contienen halogeno, incluyendo, pero sin limitarse a, cloruro de cetilpiridinio. En otras formas de realizacion adicionales, las composiciones comprenden ademas uno o mas compuestos que aumentan la interaccion ("intensificadores de interaccion") de la composicion con microorganismos (por ejemplo, agentes quelantes como acido etilendiaminotetraacetico o acido etilenbis (oxietilenitrilo) tetraacetico en un regulador).

En algunas realizaciones, la nanoemulsion comprende ademas un agente emulsionante para ayudar en la formacion de la emulsion. Los agentes emulsionantes incluyen compuestos que se agregan en la interfase aceite/agua para formar una clase de membrana continua que impide el contacto directo entre dos gotitas adyacentes. Ciertas realizaciones de la presente invencion presentan composiciones de emulsion de aceite en agua que pueden diluirse facilmente con agua hasta una concentracion deseada sin perjudicar sus propiedades (por ejemplo, union al calcio, induccion/aceleracion del crecimiento del cabello o de las unas, etc.).

Ademas de gotitas de aceite discretas dispersas en una fase acuosa, ciertas emulsiones de aceite en agua tambien pueden contener otras estructuras lipfdicas, tales como pequenas vesfculas lipfdicas (por ejemplo, esferas lipfdicas que a menudo consisten en varias bicapas lipfdicas sustancialmente concentricas separadas una de otra por capas de fase acuosa), micelas (por ejemplo, moleculas anfifflicas en pequenos grupos de 50-200 moleculas dispuestas de manera que los grupos de cabeza polar se dirigen hacia afuera hacia la fase acuosa y las colas apolares se secuestran hacia adentro lejos de la fase acuosa) o laminares (dispersiones lipfdicas en las que cada partfcula consiste en bicapas anfifflicas paralelas separadas por pelfculas delgadas de agua).

Estas estructuras lipfdicas se forman como resultado de fuerzas hidrofobas que conducen a los residuos apolares (por ejemplo, cadenas largas de hidrocarburos) lejos del agua. Las preparaciones lipfdicas anteriores se pueden describir generalmente como preparaciones de lfpidos tensioactivos (SLP). Las SLP son mmimamente toxicas para las membranas mucosas y se cree que son metabolizadas dentro del intestino delgado (vease, por ejemplo, Hamouda et al., (1998) J. Infect. Disease 180: 1939).

En ciertas realizaciones la emulsion comprende una fase de aceite discontinua distribuida en una fase acuosa, un primer componente que comprende un alcohol y/o glicerol, y un segundo componente que comprende un tensioactivo o un compuesto que contiene halogeno. La fase acuosa puede comprender cualquier tipo de fase acuosa que incluye, pero no limitandose a, agua (por ejemplo, agua desionizada, agua destilada, agua del grifo) y soluciones (por ejemplo, tamponada con fosfato solucion salina, u otros sistemas de regulador). La fase de aceite puede comprender cualquier tipo de aceite, que incluye, pero no limitandose a, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de soja, aceite de aguacate, aceite de linaza, aceite de coco, aceite de semilla de algodon, aceite de escualeno, aceite de oliva, aceite de canola, aceite de mafz, aceite de colza, aceite de cartamo y aceite de girasol), aceites animales (por ejemplo, aceite de pescado), aceite de sabor, vitaminas insolubles en agua, aceite mineral y aceite de motor. En ciertas realizaciones, la fase oleosa comprende 30-90% en volumen de la emulsion de aceite en agua (es decir, constituye 30-90% del volumen total de la emulsion final), mas preferiblemente 50-80%.

En ciertas realizaciones, el alcohol, cuando esta presente, es etanol.

Aunque la presente invencion no esta limitada por la naturaleza del tensioactivo, en algunas realizaciones preferidas, el tensioactivo es un tensioactivo de polisorbato (por ejemplo, TWEEN 20®, TWEEN 40®, TWEEN 60®, y TWEEN 80®), una fenoxipolietoxietanol (por ejemplo, TRITON® X-100, X-301, X-165, X-102 y X-200, y TYLOXAPOL ®), o dodecil sulfato de sodio, y similares.

En ciertas realizaciones esta presente un componente que contiene halogeno. La naturaleza del compuesto que contiene halogeno, en algunas realizaciones preferidas, el compuesto que contiene halogeno comprende una sal de

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cloruro (por ejemplo, NaCI, KCl, etc.), un haluro de cetilpiridinio, un haluro de cetiltrimetilamonio, un haluro de cetildimetiletilamonio, un haluro de cetildimetilbencilamonio, una haluro, haluros de dodeciltrimetilamonio, haluros de tetradeciltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de cetiltrimetilamonio, cloruro de cetilbencildimetilamonio, bromuro de cetilpiridinio, bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de cetiltributilfosfonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de tetradeciltrimetilamonio, y similares.

En ciertas realizaciones, la emulsion comprende un compuesto de amonio cuaternario. Los compuestos de amonio cuaternario incluyen, pero no se limitan a, sacarinato de N-alquildimetilbencilamonio, 1,3,5-triazina-1,3,5(2H,4H,6H)- trietanol; cloruro de 1-decanaminio, N-decil-N,N-dimetil-, cloruro (o) didacetil dimetilamonio; cloruro de 2-(2-(p- (diisobutil)cresosil)etoxi) etil dimetil bencil amonio; cloruro de 2-(2-(p-(diisobutil)fenoxi)etoxi)etil dimetil bencil amonio; cloruro de alquilo 1 o 3 bencil-1-(2-hidroxietil)-2-imidazolinio; cloruro de alquil-bis(2-hidroxietil) bencilamonio; cloruro de alquil desmetil bencil amonio; cloruro de alquil-dimetil-3,4-diclorobencil-amonio (100% de C12); cloruro de alquil- dimetil-3,4-diclorobencil-amonio (50% de C14, 40% de C12, 10% de C16); cloruro de alquil-dimetil-3,4-diclorobencil- amonio (55% de C14, 23% de C12, 20% de C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio; cloruro de alquil dimetil bencil amonio (100% de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (100% de C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (41% de C14, 28% de C12); cloruro de alquil dimetilbencilamonio (47% de C12, 18% de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (55% de C16, 20% de C14); cloruro de alquil dimetil bencilamonio (58% de c14, 28% de C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (60% de C14, 25% de C12); cloruro de alquil dimetilbencilamonio (61% de C11, 23% de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (61% de C12, 23% de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (65% de C12, 25% de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (67% de c12, 24% de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (67% de C12, 25% de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (90% de C14, 5% de C12); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (93% de C14, 4% de C12); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (95% de C16, 5% de C18); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (y) cloruro de didecil dimetil amonio; cloruro de alquil dimetil bencil amonio (como en los acidos grasos); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (C12-C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (C12-C18); alquil dimetil bencil y cloruro de dialquil dimetil amonio; cloruro de alquil dimetil dimetilbencil amonio; bromuro de alquil dimetil etilamonio (90% de C14, 5% de C16, 5% de C12); bromuro de alquil dimetil etilamonio (grupos alquilo y alquenilo mixtos como en los acidos grasos del aceite de soja); cloruro de alquil dimetil etilbencil amonio; cloruro de alquil dimetil etilbencil amonio (60% de C14); cloruro de alquil dimetil isoproilbencil amonio (50% de C12, 30% de C14, 17% de C16, 3% de C18); cloruro de alquil trimetil amonio (58% de C18, 40% de C16, 1% de C14, 1% de C12); cloruro de alquil trimetil amonio (90% de C18, 10% de C16); cloruro de alquildimetil (etilbencil) amonio (C12- 18); cloruro de di-(C8-10)-dimetil amonio; cloruro de dialquil dimetil amonio; cloruro de dialquil dimetil amonio; cloruro de dialquil dimetil amonio; cloruro de dialquil metil bencil amonio; cloruro de didecildimetilamonio; cloruro de diisodecil dimetil amonio; cloruro de dioctil dimetil amonio; cloruro de dodecil bis(2-hidroxietil)octil amonio; cloruro de dodecil dimetil bencil amonio; cloruro de dodecilcarbamoil metil dimetil bencil amonio; cloruro de heptadecil hidroxietilimidazolinio; hexahidro-1,3,5-tri(2-hidroxietil)-s-triazina; cloruro de miristalconio (y) Quaternium 14; polfmero de cloruro de N,N-dimetil-2-hidroxipropilamonio; cloruro de n-alquil dimetil bencil amonio; cloruro de n-alquil dimetil etilbencil amonio; cloruro de n-tetradecil dimetil bencilamonio monohidrato; cloruro de octil-decilo-dimetil-amonio; cloruro de octil dodecil dimetil amonio; cloruro de octilfenoxietoxietil dimetil bencil amonio; oxiodietilenbis (cloruro de alquil dimetil amonio); compuestos de amonio cuaternario, dicoco alquildimetilo, cloruro; cloruro de trimetoxisil-propil- dimetil-octadecil-amonio; trimetoxisililo cuat., cloruro de trimetil dodecilbencil amonio; cloruro de n-dodecil dimetil etilbencil amonio; cloruro de n-hexadecil dimetil bencil amonio; cloruro de n-tetradecil dimetil bencil amonio; cloruro de n-tetradecil dimetil etilbencil amonio; y cloruro de n-octadecil dimetil bencil amonio.

Las formulaciones de nanoemulsion y los metodos para prepararlas son bien conocidos por los expertos en la tecnica y descritos por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,476,393, 7,468,402, 7,314,624, 6,998,426, 6,902,737, 6,689,371, 6,541,018, 6,464,990, 6,461,625, 6,419,946, 6,413,527, 6,375,960, 6,335,022, 6,274,150, 6,120,778, 6,039,936, 5,925,341, 5,753,241, 5,698,219, y d5,152,923 y en Fanun et al. (2009) Microemulsions: Properties and Applications (Surfactant Science), CRC Press, Boca Raton Fl.

C) Formulaciones que optimizan la actividad.

En ciertas realizaciones, las formulaciones se seleccionan para optimizar la especificidad de union, y/o la avidez de union, y/o estabilidad/conformacion, y/o suministro/actividad de la unidad estructural de union al calcio, peptido de union al calcio, y/o quimerico descrito aqrn. En ciertas realizaciones, las formulaciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a lo siguiente:

Para la inyeccion, una unidad estructural de enlace de calcio y/o peptido de union al calcio (por ejemplo, 4DSS, 6DSS, 8DSS, 10DSS, (D)-4DSS, (D)-6DSS, (D)-8DSS, (D)-10DsS, etc.) se disuelve/mezcla en solucion esteril de agua destilada, solucion salina, o de Ringer y se ajusto a un pH que oscila entre aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 8, o aproximadamente pH 4.6 a aproximadamente pH 7.9, o un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, pH 7.3). En ciertas realizaciones, el peptido de union al calcio y/o la unidad estructural de union al calcio esta presente en una concentracion que vana de aproximadamente 0.4 o aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 500 mg/mL, o de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, o de aproximadamente 25 mg/mL a aproximadamente 75 mg/mL, y en ciertas realizaciones aproximadamente 40-50 mg/mL. En la formulacion ilustrativa, el peptido se disuelve/mezcla a una concentracion de 46.7 mg/ml en agua destilada esteril, pH ajustado a 7.3 con NaOH 5M.

Las formulaciones topicas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a:

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1) Una formulacion que comprende (o consiste esencialmente en) el peptido de union al calcio (por ejemplo, 4DSS, 6DSS, 8DSS, 10DSS, (D)-4DsS, (D)-6DSS, (D)-8DSS, (D)-10DSS, etc.) y/o unidad estructural de enlace de calcio esta presente en una concentracion que vana de aproximadamente 0.4 o aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 500 mg/ml, o de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, o de aproximadamente 25 mg/mL a aproximadamente 75 mg/mL, o aproximadamente 40-50 mg/mL, o aproximadamente 0.466 mg/mL a aproximadamente 46.7 mg/mL en DMSO.

2) Una emulsion que comprende (o consiste esencialmente en):

a) aproximadamente 1% a aproximadamente 80%, o aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, o aproximadamente 1% a aproximadamente 20% de resto de union al calcio y/o peptido de union al calcio en una solucion, suspension o mezcla en una solucion reguladora farmaceuticamente aceptable con un pH que vana desde aproximadamente pH 4 hasta aproximadamente pH 8, o aproximadamente pH 4.6 a aproximadamente pH 7.9, o aproximadamente pH 5 o 6 a aproximadamente pH 7,9;

b) aproximadamente 1% a aproximadamente el 60%, aproximadamente el 50% o aproximadamente el 40% de Pluronic 17R4, 22R4, 25R4, L62, L63, L64, P65, P75, P84, P85, F68, F77, F87, o un copolfmero de bloque comparable,; y

c) resto o alcohol sustancialmente remanente (por ejemplo, 2-propanol, etanol, propanol, o alcohol similar). Tfpicamente, la solucion de peptido y la solucion pluronica se preparan por separado y luego se combinan. Una formulacion ilustrativa comprende 10% de una solucion de (D)-8DSS de 46.7 mg/mL en agua destilada esteril, pH ajustado a 7.0 con NaOH 5M suspendido en una solucion de 10% de Pluronic 17R4 (poli(propilenglicol) (etilenglicol)- bloqueo-poli(propilenglicol), BASF, Florham Park, NJ) en 2- propanol.

3) Una emulsion que comprende (o consiste esencialmente en):

a) aproximadamente 1% a aproximadamente 80%, o aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, o aproximadamente 1% a aproximadamente 20% de resto de union al calcio y/o peptido de union al calcio en una solucion, suspension o mezcla en una solucion reguladora farmaceuticamente aceptable con un pH que vana desde aproximadamente pH 4 hasta aproximadamente pH 8, o aproximadamente pH 4.6 a aproximadamente pH 7.9, o aproximadamente pH 5 o 6 a aproximadamente pH 7.9;

b) aproximadamente 1% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50%, o aproximadamente 40% de sulfosuccinato de dioctilo, lecitina, miristato de isopropilo, o un tensioactivo comparable capaz de formar emulsiones de agua en aceite; y

c) resto o alcohol sustancialmente remanente (por ejemplo, 2-propanol, etanol, propanol, o alcohol similar). Tfpicamente, la solucion de peptido y la solucion de tensioactivo se preparan por separado y luego se combinan. Una formulacion ilustrativa comprende 10% de una solucion de (D)-8DSS de 46.7 mg/mL en agua destilada esteril, pH ajustado a 7.0 con NaOH 5M suspendido en una solucion de 17.8% de dioctil sulfosuccinato en 2-propanol.

4) Emulsiones (2) y/o (3), incorporando adicionalmente 1-50%, 1-30%, o 1-20% emoliente (por ejemplo, uno o mas emolientes seleccionados del grupo que consiste en glicerina, glicerol, monooleato de glicerilo, diprobasa, aloe vera, aceite de jojoba, glicerina, vitamina A (por ejemplo, retinil, acido retinoico, palmitato, retinal, tretinoma e isotretinoma, etc.), trietanolamina, vitamina E, aceite de soja, aceite de aguacate, aceite de coco, etc.).

5) Las composiciones que comprenden 0.00001-30%, o 0.00001-20%, o 0.00001-10% (p/v) de la unidad estructural de union al calcio y/o peptido de union al calcio unido al fosfato de calcio (incluyendo hidroxiapatita, fosfato de tricalcio beta, fosfato de octacalcio u otras formas de fosfato de calcio) nano o micropartfculas (con un tamano medio de partfcula entre 1 nm y 400 nm, o entre 1 nm y 1 pm, o entre 1 nm y 1.000 pm) suspendido en un vehfculo farmaceuticamente aceptable (incluyendo, no limitado a alcohol isopropflico, solucion salina tamponada, una emulsion, y similares).

Aunque los metodos y composiciones se describen en el presente documento con respecto al uso en seres humanos, son tambien adecuados para uso animal, por ejemplo, veterinarios. Por lo tanto, ciertos organismos adecuados incluyen, pero no se limitan a humanos, primates no humanos, caninos, equinos, felinos, porcinos, ungulados, lagomorfos y similares.

Las formulaciones y metodos de administracion anteriores pretenden ser ilustrativos y no limitativos. Se apreciara que, usando la ensenanza proporcionada aqrn, pueden formularse facilmente otras formulaciones y modos de administracion adecuados.

Kits.

En otra realizacion, esta invencion proporciona kits para inducir el crecimiento del cabello y/o inhibir la perdida de cabello, para detectar calcificacion anormal y/o desmineralizacion, para inducir remineralizacion, y similares. Los kits tfpicamente comprenden un recipiente que contiene uno o mas de los agentes activos (es decir, los agentes de union al calcio y/o unidades estructurales quimericas) descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el agente

o agentes activos pueden proporcionarse en una formulacion de dosificacion unitaria (por ejemplo, supositorio, tableta, comprimido, parche, etc.) y/o se pueden combinar opcionalmente con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.

Ademas, los kits incluyen opcionalmente materiales de marcaje y/o de instruccion que proporcionan directivas (es 5 decir, protocolos) para la practica de los metodos o uso de los agentes terapeuticos o profilacticos o reactivos de deteccion de esta invencion. Ciertos materiales de instruccion describen el uso de uno o mas agentes activos de esta invencion para inducir el crecimiento del pelo y/o inhibir la perdida de cabello, para detectar calcificacion anormal y/o desmineralizacion, para inducir remineralizacion, y similares. Los materiales de instruccion tambien pueden, opcionalmente, ensenar dosificaciones preferidas/regimen terapeutico, contraindicaciones y similares.

10 Aunque los materiales de instruccion tipicamente comprenden materiales escritos o impresos, no estan limitados a tales. Cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final esta contemplado por esta invencion. Tales medios incluyen, pero no se limitan a medios de almacenamiento electronicos (por ejemplo, discos magneticos, cintas, cartuchos, chips), medios opticos (por ejemplo, CD ROM) y similares. Tales medios pueden incluir direcciones a sitios de internet que proporcionan tales materiales de instruccion.

15 Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invencion reivindicada.

Ejemplo 1

Los peptidos vinculantes al calcio inducen el crecimiento del cabello

La Figura 1 muestra ratones tratados con DSS (derecha) y tratados simuladamente (izquierda) que muestran rebrote 20 del cabello 13 dfas despues del afeitado del cuero cabelludo. La Figura 2 ilustra el efecto de los compuestos de union al calcio sobre el crecimiento del cabello en ratones. El panel mas a la izquierda de cada serie muestra ratones al dfa 0 despues de la preparacion y antes del tratamiento. Los paneles de la derecha muestran los ratones el dfa 23, la fecha del punto final. La serie superior muestra el control negativo que recibe tratamiento diario con solucion salina topica. La serie inferior muestra ratones que reciben tratamiento diario con una formulacion topica de un compuesto 25 DSS aplicado en parches descritos, lo que demuestra un crecimiento significativo del cabello en comparacion con los controles.

Ejemplo 2

Nucleacion de hidroxiapatita en el esmalte de los dientes y dentina por peptidos DSS

Para determinar si la aplicacion de DSS a diversas preparaciones de nucleacion de HA promovido por tejido, que 30 podna conducir en ultima instancia a la remineralizacion tisular, se pulieron con una rueda abrasiva Streurs y se prepararon para experimentos de nucleacion dientes humanos adultos seccionados sagitalmente (obtenidos despues de extraccion durante la practica clmica normal). La mitad de las secciones se desmineralizaron con acido fosforico al 35% durante 15 minutos, despues se aclararon a fondo con agua desionizada. La otra mitad no fue tratada. Todas las muestras se sometieron a sonicacion despues durante cinco minutos para eliminar el exceso de residuos dejados por 35 el corte y la molienda y/o la desmineralizacion. Las muestras se trataron con 8DSS 12.5 |jM disuelto en solucion reguladora HEPES 50 mM (pH 7.0), solucion reguladora solamente, o se dejaron sin tratar. Las muestras se sumergieron entonces en un fluido corporal simulado (SBFn), destinado a acelerar la nucleacion de cristales de hidroxiapatita (HA), durante 4 horas. Despues de la etapa de nucleacion, las muestras se sumergieron en una solucion libre de magnesio y bicarbonato (SBFg) para permitir que los cristales de HA nucleados crecieran. La Tabla 5 muestra 40 la composicion de las soluciones SBFn y SBFg en comparacion con el plasma sangumeo. Ambas soluciones se ajustaron a pH 6.8. Los cristales se cultivaron con el fin de amplificar los cristales nucleados para facilitar la visualizacion por SEM.

Tabla 5. Composicion de la solucion de SBFn y SBFg.

Concentracion ionica

Na+ K+ Ca2+ Mg2+ HCO3- Cl- HPO42- SO42-

Plasma sangumeo

142.0 5.0 2.5 1.5 27.0 103.0 1.0 0.5

SBFn

284.0 10.0 5.0 3.0 54.0 206.0 2.0 1.0

SBFg

284.0 4.0 5.0 0 0 294.0 2.0 0

45 La superficie del esmalte no desmineralizado, no tratado y tratado con regulador permanecio ampliamente amorfa, indicando poco o ningun crecimiento de cristales (y por lo tanto poca o ninguna nucleacion) (Figura 3, dos filas superiores). Sin embargo, se observo un crecimiento cristalino significativo (que indica una nucleacion temprana y

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robusta) en esmalte desmineralizado expuesto al peptido 8DSS (Figura 3, dos filas superiores). Esto indica que los peptidos DSS pueden reconocer espedficamente el esmalte desmineralizado y el crecimiento de hidroxiapatita nucleada sobre la superficie del esmalte desmineralizado.

La superficie de la dentina no desmineralizada mostro cierto grado de crecimiento de cristales en las muestras no tratadas y tratadas con regulador. Sin embargo, el crecimiento mas significativo, y por lo tanto la nucleacion mas temprana y mas robusta, se produjo en la muestra tratada con el peptido 8DSS (Figura 3, dos filas inferiores). Hemos demostrado previamente la capacidad de los peptidos DSS, junto con los regfmenes de remineralizacion existentes, para causar la deposicion de capas gruesas de fosfato de calcio suficientes para ocluir los tubulos dentinarios en la dentina desmineralizada. Estos resultados indican que con un tratamiento ligeramente diferente, la nucleacion del cristal se produce principalmente en la dentina no desmineralizada. De este modo, dependiendo del regimen de tratamiento espedfico empleado, se pueden usar peptidos DSS para depositar capas de fosfato de calcio sobre dentina desmineralizada o para provocar una nucleacion robusta del crecimiento cristalino de hidroxiapatita en superficies totalmente mineralizadas. Esto significa que los peptidos DSS pueden usarse, por ejemplo, para tratar la sensibilidad de los dientes debido a la exposicion de los tubulos dentinarios, para remineralizar la dentina desbridada mecanicamente implicada en caries, o para reparar las superficies dentinarias fracturadas.

Ejemplo 3

Union espedfica de tejidos de peptidos DSS en dientes humanos:

Con el fin de investigar la especificidad del enlazamiento del peptido DSS tejido dental, secciones de dientes humanos fueron expuestas a peptidos DSS y variantes, y a continuacion se generaron imagenes por CLSM. Los peptidos utilizados para estos experimentos fueron 8DsS, 8ASS, 8DAA, 8NAA, 4DSS, 4ESS, 4NSS, 4DTT, 4ETT, 4NtT y 6DSS. Las secciones sagitales de dientes humanos extrafdas durante la practica clmica normal se pulieron y luego se incubaron durante diez minutos en una solucion del peptido marcados con 5(6)-carboxifluorescema (12.5 pM) que contema NaCl 10 mM y HEPES 50 mM, pH 7.0. Se prepararon muestras de control sin peptido. Las muestras se lavaron extensamente despues del tratamiento y se formaron imagenes mediante CLSM usando iluminacion laser azul (A=488 nm) y un filtro de emision FITC, con ajustes identicos de camara y microscopio para cada muestra. Para cada seccion se recolectaron y ensamblaron multiples escaneres en un modo automatizado para generar paneles de imagenes que representan un area de 13x13 mm, suficientes en la mayona de los casos para abarcar toda la seccion. Como se sugiere en los resultados anteriores de afinidad de union, los peptidos que contienen la secuencia (DSS) exhibieron los niveles mas altos de union a las superficies de los dientes, con 6DSS y 8DSS mostrando los mayores niveles de tincion. Los resultados de estos experimentos se exponen en la Figura 4. 8DSS, 6DSS y 4DSS se unen principalmente a la dentina del manto, con una union dentina-esmalte bien delineada, baja o ninguna union a la dentina de la punta de la rafz o el esmalte basal y no detectable que se une al esmalte cortical o a la superficie del esmalte. Tambien se observo una union significativa a los bordes de la cavidad pulpar. 8ASS, 4ESS y 4NSS exhibieron patrones similares, aunque a niveles mas bajos de union. 8DAA exhibio una inversion de este patron de union, con union primaria a la dentina de la punta de la rafz y el esmalte cortical, asf como a la union dentina-esmalte y la pared de la cavidad pulpar. 8DAA exhibio poca o ninguna union a la dentina del manto, dentina circumpulpal, o esmalte basal. 4DTT y 4ETT exhibieron patrones de union similares a los de 4DSS y 4ESS, aunque a niveles muy reducidos.

El 8NAA mostro muy poca union a cualquier tejido sano, pero se unio ligeramente a una lesion cariosa presente en la muestra (vease el Ejemplo a continuacion). El 4NTT exhibio union fuerte a un fragmento de hueso periodontal unido a la muestra, pero muy bajos niveles de union al tejido dental sano. Estos resultados sugieren que las capas espedficas del diente pueden ser buscadas con alta especificidad usando peptidos espedficos.

Ejemplo 4

Union preferente de peptidos DSS a lesiones cariosas en los dientes

Se pulieron secciones de dientes humanos que contienen lesiones cariosas evidentes, que consisten en esmalte desmineralizado, y se expusieron a peptidos DSS marcados con 5(6)-carboxifluorescema y variantes. Las secciones se lavaron extensamente y se formaron imagenes mediante CLSM usando iluminacion laser azul (A=488 nm) y un filtro de emision FITC, con ajustes de microscopio y camara ajustados para cada muestra para optimizar la serial detectada de cada peptido. Las imagenes se examinaron para identificar los niveles relativos de union de peptidos en tejidos sanos frente a caries. 4ESS, 4NSS, 8DAA, 8NAA, 4ETT, 4DSS, 8ASS, 8DSS y 6DSS mostraron una union altamente espedfica a lesiones cariosas, con poca o ninguna union al esmalte sano circundante (Figura 5, algunas de estas lesiones son visibles en la Figura 4 como bien). Otros peptidos no se probaron, pero basandose en estos resultados se supone la union a lesiones cariosas. De estos peptidos, 4ESS, 4NAA, 8DSs, 6DSS, 4DSS, 8DAA y 8ASS presentaron una tincion excepcionalmente fuerte a lesiones cariosas con union relativamente debil (a menudo completamente ausente) al esmalte circundante. La capacidad de estos peptidos de unirse a las lesiones cariosas, aunque presentan poca o ninguna union a la superficie totalmente mineralizada del esmalte saludable, indican que estos peptidos pueden usarse para identificar caries o lesiones dentarias del diente. Dada su capacidad para remineralizar en sitios de degradacion del esmalte, tambien pueden usarse para iniciar la remineralizacion en sitios de degradacion del esmalte tal como caries o sitios de lesion sin causar nucleacion inapropiada en superficies de tejido sanas.

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Ejemplo 5

Actividades antimicrobianas de las fusiones de peptido-compuesto antimicrobiano DSS:

Con el fin de determinar la idoneidad de los peptidos que se unen al calcio para servir como unidades estructurales de direccionamiento para suministrar compuestos terapeuticos a las superficies mineralizadas, se sintetizaron peptidos que conteman un peptido N-terminal (DSS)4, (DSS)5 o (DSS)6, un triglicina (GGG), y un peptido antimicrobiano 2c-4 (RWRWRWF, SeQ ID NO: 22 (SEQ ID nO: 26 en WO 2007/038683)). Las secuencias de estas protemas de fusion son DSS, DSS, DSS, DSS, GGG, RWRWRWF (SEQ ID NO:23), DSS, DSS, DSS, DSS, DSS, GGG, RWRWRWF (SEQ ID NO: 24) y DSS DSS DSS DSS DSS DSS GGG RWRWRWF (SEQ ID NO: 25) (ver SEQ ID NO: 27-29, respectivamente en WO 2007/038683). La actividad antimicrobiana de estos peptidos contra bacterias planctonicas anaerobicas se determino mediante una modificacion de un ensayo descrito anteriormente. En resumen, las celulas UA159 de la cepa Streptococcus mutans se diluyeron a -1x105 cfu/mL en medio de caldo Todd-Hewitt (TH) y se mezclaron con nanocristales de hidroxiapatita suspendida (Berkeley Advanced Biomaterials, Inc., 0.03% p/v) o, para muestras de control, un volumen equivalente de agua desionizada. Las almuotas se transfirieron a placas de 96 pocillos (Fisher). Despues se hicieron diluciones en serie de los peptidos y se anadieron a las bacterias. La concentracion inhibitoria minima (CIM) de cada peptido se determino identificando la concentracion de peptido que inhibfa completamente el crecimiento bacteriano despues de una incubacion de aproximadamente 24 horas, medida por la absorbancia de suspensiones celulares a una longitud de onda de 600 nm. El peptido 2c-4 muestra una CIM de 2 pM frente a S. mutans planctonico por sf misma. Cuando se conjuga con una unidad estructural (DSS)4 para generar el peptido 4DSS-2c4, su CIM aumenta hasta 52.5 pM, una perdida significativa de eficacia que no se ve afectada por la adicion de hidroxiapatita al 0.03% (p/v). Sin embargo, tal como se ha mostrado anteriormente, la unidad estructural (DSS)4 muestra menor afinidad por la hidroxiapatita que los peptidos con mas repeticiones de DSS y la alta carga positiva del peptido 2c-4 puede interactuar con la alta carga negativa de la unidad estructural (DSS)4 para inhibir algo la actividad. No obstante, se mantiene cierta actividad antimicrobiana por este peptido.

Alternativamente, la conjugacion de una unidad estructural (DSS)6 (SEQ ID NO: 26) al peptido antimicrobiano b-34 (DSS DSS DSS DSS DSS DSS GGG LKRF LKWF KRF (SEQ ID NO:27) (SEQ ID NO:30 en el documento WO 2007/038683) para generar el peptido 6DSS-b-34 (SEQ ID NO: 31 en el documento WO 2007/038683) conduce a una mejora en la actividad antimicrobiana sobre la del peptido parental (CIM=3.1 pM para 6DSS-b-34 frente a 5.6 pM para b-34. Aunque la adicion de 0.03% de HA reduce ligeramente la actividad antimicrobiana de 6DSS-b-34, la CIM resultante de 12.5 pM todavfa representa una actividad considerable frente a Streptococcus mutans. En otra alternativa, el peptido PL-135 (SEQ ID No. 32 en el documento WO 2007/038683) mostro una CIM de 21 pM frente a S. mutans planctonica en medio solo. La conjugacion de este peptido con una unidad estructural (DSS)5 (SEQ ID NO: 28) para generar el peptido 5DSS-PL135 (DSS DSS DSS DSS DSS GGG FHFHLHF (SEQ ID NO: 29) ((SEQ ID NO: 33 en el documento WO 2007/038683)) reduce su actividad antimicrobiana contra S. mutans a >170 pM en medio solo. La adicion de una suspension de hidroxiapatita al 0.03% al medio conduce a la recuperacion de gran parte de esta actividad, reduciendo el CIM a 42.5 pM.

Esto muestra que otros compuestos pueden mantener su actividad cuando se conjugan con peptidos DSS. Ademas, esto demuestra que se pueden generar facilmente compuestos que solo tienen actividad significativa en presencia de un objetivo de peptido DSS, lo que sugiere un medio facil de desarrollar compuestos que solo son activos en superficies calcificadas (hueso, diente, etc.) y son inertes en otros entornos. Tales compuestos representan un paso importante hacia la mejora de la seguridad y la eficacia de los enfoques terapeuticos para los trastornos de los tejidos mineralizados.

Ejemplo 6

Union espedfica y mineralizacion de superficies calcificadas mediante peptidos pequenos

Se han disenado varios peptidos pequenos (<25 aa) basados en la secuencia de la fosfoprotema dentinaria, una de las principales protemas no colagenosas que se cree que esta implicada en la mineralizacion de la matriz extracelular de la dentina durante el desarrollo del diente. Estos peptidos, que consisten en multiples repeticiones del tripeptido aspartato-serina-serina (DSS), se unen con alta afinidad a compuestos de fosfato de calcio y, cuando estan inmovilizados, pueden reclutar fosfato de calcio a perlas de poliestireno percibidas o a superficies de dentina humana desmineralizada. La afinidad de la union a las superficies de hidroxiapatita aumenta con el numero de repeticiones (DSS)n, y aunque secuencias repetidas similares -(NTT)n, (DTT)n, (ETT)n, (NSS)n, (ESS)n, (DAA)n, (ASS)n, y (NAA)n - tambien mostro actividad de union a HA, generalmente no estaba al mismo nivel que la secuencia natural. Se demostro que la union de los peptidos (DSS)n a los dientes humanos seccionados era espedfica de tejido, con altos niveles de union a la dentina del manto, menores niveles de union a la dentina circumpulpal y poca o ninguna union al esmalte saludable. Se encontro que la fosforilacion de las serinas de estos peptidos afectaba a la avidez, pero no a la afinidad, de la union. Se discute la utilidad potencial de estos peptidos en la deteccion de lesiones cariosas, el suministro de compuestos terapeuticos a los tejidos mineralizados y la modulacion de la remineralizacion.

Materiales y metodos

Smtesis de peptidos

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Se sintetizaron las secuencias peptfdicas siguientes: 2DSS (DSS DSS, SEQ ID NO:30), 4DSS (DSS DSS DSS DSS, SEQ ID NO:31), 6DSS (DSS DSS DSS DSS DSS DSS, SEQ ID NO:32), 8DSS (DSS DSS DSS DSS DSS DSS DSS DSS, SEQ ID NO:33), 4ESS (ESS ESS ESS ESS, SEQ ID NO:34), 4NSS (NSS NSS NSS NSS, SEQ ID NO:35), 4DTT (DTT DTT DTT DTT, SEQ ID NO:36), 4ETT (ETT ETT ETT ETT, SEQ ID NO:37), 4NTT (NTT NTT NTT NTT, SEQ ID NO:38), 8DAA (DAA DAA DAA DAA DAA DAA DAA DAA, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40), 8NAA (NAA NAA NAA NAA NAA NAA NAA NAA, SEQ ID NO:41), 8ASS (ASS ASS ASS ASS ASS ASS ASS ASS, SEQ ID NO:42), #3-1 (LIKHILHRL, SEQ ID NO:43).

Se sintetizaron peptidos usando qmmica de fase solida Fmoc estandar en un sintetizador de peptidos multiples Apex 396 (AAPPTec, Louisville, KY) a escala de 0.015 mM. Los peptidos completados se escindieron de la resina con acido trifluoroacetico al 95% y catalizadores apropiados. El peptido en bruto se purifico hasta una pureza del 90-95% usando cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa (ACTA Purifier, Amersham, Arlington Heights, IL) y la masa de peptidos se confirmo mediante espectroscopfa de masas por desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI). Los peptidos para uso en analisis de union se marcaron con 5(6)-carboxifluorescema antes de la escision, y los peptidos para uso en ensayos que requirieron inmovilizacion de peptidos se marcaron en el extremo C con biotina inmediatamente despues de la etapa de escision.

Ensayo de union de HA

Los peptidos marcados con fluorescema marcados con DSS de varias longitudes se sometieron a ensayos de despliegue como sigue: Se prepararon muestras que conteman concentraciones variables de peptido marcado con fluorescema (0-100 |jM) y una cantidad fija (0.3 mg) de nanocristales de HA con una superficie espedfica de 100 m2/g (Berkeley Advanced Biomaterials, Berkeley, CA). Se tomaron medidas de la absorbancia del peptido marcado a 488 nm (la maxima absorbancia del marcador de fluorescema) antes y despues de la exposicion a HA. La cantidad de peptido unido se calculo comparando la relacion de las absorbancias finales (Af) e iniciales (Ai) con la concentracion inicial (C0) [Cligado = (Af/Ai)Ct)]. Se generaron graficos de la cantidad de peptido unido por metro cuadrado de superficie de HA frente a la concentracion de peptido no unido en equilibrio. Las isotermas resultantes se ajustaron a la isoterma de Langmuir, x/m = (KANmaxCeq)/(1+KACeq), donde x/m representa la cantidad molar de peptido unido por unidad de superficie HA, Ka es la constante de afinidad del peptido para la superficie de HA (L/Mol), Nmax es la concentracion superficial maxima (mol/m2) y Ceq es la concentracion molar de peptido no unido en equilibrio (Calis et al., (1995) Pharm Res., 12: 1072-1076 ).

Union de fosfato de calcio a peptidos DSS inmovilizados

Se incubaron perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina con un diametro medio de 4 jm (Spherotech, Lake Forest, IL) con peptido 8DSS conjugado con biotina o biotina no conjugada (perlas de control). Las perlas se lavaron con PBS para eliminar el peptido no unido (o biotina no unida en perlas de control) y se incubaron en una solucion de PBS + CaCl21 mM + NaHPO41 mM durante 12 dfas antes de la formacion de imagenes.

Cultivo de medula osea de raton

Se hicieron crecer cultivos de medula osea de raton hasta confluencia en DMEM + FBS al 10% y luego se trataron continuamente durante 3 semanas con 6DSS marcado con 5(6)-carboxifluorescema 2.5 p.M o peptido marcado con 5(6)-carboxifluorescema 2.5 p.M #3-1 (peptido de control) en a-MEM + FBS al 10% + acido ascorbico 50 p.g/mll, p- glicerofosfato 4 mM. Los cultivos se visualizaron mediante microscopfa de fluorescencia utilizando un conjunto de filtros de excitacion/emision FITC.

Union y mineralizacion de superficies dentales

Se seccionaron sagitalmente molares humanos adultos, extrafdos durante la practica clmica normal, (Accutom-50, Copenhague, Dinamarca, lamina de diamante CA-231) y se desmineralizaron con gel de acido etilendiaminotetraacetico al 19% (EDTA) durante 1 hora, seguido de inmersion en agua desionizada y ultrasonicacion para eliminar los desechos. Las muestras se trataron con peptido 8DSS de 12.5 p.M en regulador HEPES 50 mM (pH 7.0) o regulador solo (sin peptido) o se dejaron sin tratar durante 1 hora antes de la remineralizacion con Quell Desensitizer (Pentron Technologies, Wallingford, CT), una solucion de remineralizacion consistente en soluciones acuosas de cloruro de calcio y fosfato potasico, durante 15 minutos. Las muestras se aclararon minuciosamente antes de la formacion de imagenes mediante microscopfa electronica de barrido.

Para experimentos de union, se incubaron los molares humanos adultos seccionados sagitalmente durante 10 minutos en una solucion de peptido 6DSS marcado con 5(6)-carboxifluorescema 12.5 p.M que contema NaCl 10 mM y HEPES 50 mM, pH 7.0. Se prepararon muestras de control sin peptido. Las muestras se enjuagaron despues del tratamiento y se formaron imagenes mediante microscopfa confocal de barrido laser (CLSM) con iluminacion mediante un laser Kr/Ar azul (A = 488 nm) y un filtro de emision FITC.

Resultados

Analisis Cuantitativo de DSS- Peptido que se liga a las superficies de HA

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Con el fin de evaluar cuantitativamente la intensidad de la interaccion DSS-HA as^ como para determinar las funciones de longitud y secuencia de peptidos en la union, los peptidos que contienen DSS marcados con fluorescema de varias longitudes se sometieron a ensayos de despliegue como se describe en "Materiales y metodos".

Los datos experimentales se ajustaron a la isoterma de Langmuir, que describe la union de moleculas a superficies con las condiciones de que (1) todos los sitios de union tengan la misma afinidad para el peptido y (2) el peptido formara una monocapa en la superficie, pero no pueden acumularse a niveles mas altos (Atkins (1994) Physical chemistry, Freeman, New York). El excelente ajuste de la isoterma de Langmuir a los datos experimentales valida estas condiciones, y las constantes obtenidas de este analisis se utilizaron para las comparaciones entre peptidos. Como se muestra en la Figura 7A y se resume en la Tabla 6, tanto la afinidad de union (Ka) como la concentracion de monocapa (NMax) de los diversos peptidos aumentaron con el numero de repeticiones de DSS por peptido. Ademas, se probaron varios peptidos variantes (Figuras 7B, 7C, Tabla 6): un peptido que contema una cadena lateral mas larga en la primera posicion (4ESS), peptidos que conteman un grupo hidroxilo estericamente mas impedido en la segunda y tercera posiciones (4DTT, 4NTT, 4ETT), peptidos que carecen de un grupo cargado en la primera posicion (4NSS, 8ASS) y peptidos que carecen de grupos hidroxilo en la segunda y tercera posiciones (DAA-8, 8NAA). Comparando las afinidades de estas variantes con las de peptidos que contienen DSS del mismo tamano, se determino que la eliminacion del residuo cargado negativamente (4NSS, 4NTT; Figura 7B, 8ASS, Figura 7C) dio como resultado una perdida significativa de afinidad de union, mientras que el reemplazo de los residuos de Ser con Thr o Ala (4DTT, 4ETT, Figura 7B; DAA8, Figura 7C) tuvo poco efecto observable en este parametro (por ejemplo, DAA-8 tiene un KA que esta dentro del error experimental del KA para 8DSS) . Los peptidos en los que tanto el residuo acido en la primera posicion como los residuos de serina en las posiciones 2 y 3 se reemplazaron (4NTT, Figura 7B; 8NAA Figura 7C) condujo a una perdida casi total de actividad de union.

Debido a que la actividad de union esta determinada tanto por la afinidad de union (Ka) como por la maxima concentracion de monocapa (NMax), los peptidos que muestran afinidades similares pueden variar ampliamente en su actividad global debido a diferencias en NMax. Por lo tanto, aunque la presencia de una carga negativa en la posicion 1 de la repeticion es claramente el parametro de secuencia clave para determinar la afinidad de union, estos datos sugieren que tanto los residuos acidos como las serinas estan implicados en la union de estos peptidos a superficies HA: Asp-Ser-Ser es la secuencia optima que da lugar a la actividad de union a HA (debido al efecto de las serinas en la maxima concentracion de monocapa), mientras que todos los peptidos variantes muestran una union marcadamente reducida a HA in vitro. De manera interesante, la fosforilacion de la primera posicion del peptido repetido 4DS(P)S de DSS no condujo a un cambio significativo en la afinidad de union con respecto a un peptido no fosforilado del mismo tamano (peptido 4DSS) sino que dio un gran aumento en la densidad de union en superficie, lo que sugiere una alteracion en el modo de enlace mas que simplemente la afinidad de la interaccion (Tabla 6].

Tabla 6. Parametros de Langmuir de los peptidos descritos en este estudio, sobre la base de ajustes de la ecuacion de Langmuir a los datos brutos.

Ka(M-1) Nmax (mol/m2 r

2DSS

57.000 ± 24.000 2 x 10-8 ± 5 x 10-9 0.94

4DSS

94.000 ± 26.000 5.8 x 10-8 ± 6 x 10-9 0.98

5DSS

148.000 ± 14.000 9.2 x 10-8 ± 2 x 10-9 0.99

6DSS

272.000 ± 26.000 1.3 x 10-7 ± 3 x 10-9 0.99

8DSS

290.000 ± 70.000 8.2 x 10-8 ± 6 x 10-9 0.99

4ESS

81.000 ± 18.000 4.6 x 10-8 ± 4 x 10-9 0.99

4NSS

16.000 ± 4.000 3.0 x 10-8 ± 1 x 10-9 0.99

4DTT

161.000 ± 79.000 1.3 x 10-8 ± 1 x 10-9 0.92

4ETT

79.000 ± 25.000 8.8 x 10-8 ± 9 x 10-9 0.94

4NTT

17.000 ± 7.000 5.8 x 10-8 ± 2 x 10-8 0.98

8DAA

310.000 ± 74.000 6.0 x 10-8 ± 6 x 10-9 0.99

8ASS

ND ND ND

8NAA

ND ND ND

4DS(P)S

83.000 ± 9.000 1.2 x 10-7 ± 5 x 10-9 0.99

Union de cultivos que contienen DSS a cultivos de tejidos mineralizantes

Habiendo establecido que los peptidos que contienen (DSS)n son capaces de unirse activamente a HA, buscamos determinar si se uninan a sitios emergentes de mineralizacion en tejido derivado biologicamente. Los cultivos de medula osea de raton (MBM), cultivados en condiciones osteogenicas, se trataron continuamente durante 3 semanas 5 con peptido 6DSS marcado o peptido marcado #3-1 (peptido de control no cationico). Los cultivos se visualizaron mediante microscopfa de fluorescencia utilizando un conjunto de filtros de excitacion/emision FITC. En la Figura 8, el panel B muestra una tincion brillante de los nodulos de MBM mineralizantes en la muestra tratada con DSS, sin union observada en la muestra de control (Figura 8, panel D), indicando no solo que el peptido 6DSS marcado se une a nodulos mineralizantes en MBM pero tambien que esta union es una propiedad de la secuencia DSS, en lugar de una 10 propiedad general de peptidos pequenos.

Union de fosfato de calcio amorfo por peptidos que contienen DSS

Para ensayar la capacidad de los peptidos que contienen DSS de reclutar fosfato de calcio y nuclear el crecimiento de cristales, se combino el peptido 6DSS 25 pM con concentraciones variables de CaCl2 y NaHPO4 y se incubaron como se describe en "Materiales y Metodos". Aunque se esperaba que la presencia del peptido que contema DSS libre 15 mejorara la formacion de cristales de HA a concentraciones de CaHpO4 subcnticas, esto no se observo (datos no mostrados). Los peptidos conteniendo DSS que conteman marcadores C-terminales de biotina se sintetizaron e inmovilizaron en perlas recubiertas con estreptavidina. Las perlas se lavaron e incubaron en soluciones que conteman concentraciones variables de CaHPO4 como antes. De acuerdo con observaciones previas para las fosfoprotemas fosforicas de la dentina, asf como otras fosfoprotemas (Saito et al. (1997) Bone 21: 305-311, Saito et al. (2000) J Bone 20 Miner Res., 15: 1615-1619), estos peptidos inmovilizados causaron la coagregacion de las perlas con partmulas de CaHPO4 amorfo y eventualmente condujeron a la deposicion de material cristalino alrededor de la perla. Como se ilustra en la Figura 9, panel A, casi todas las perlas recubiertas con peptido se incorporaron en grandes agregados de fosfato de calcio amorfo precipitado. En comparacion, en la muestra de control bloqueada con biotina, casi todas las perlas estaban desagregadas y no asociadas con precipitado (Figura 9, panel B). Curiosamente, varias perlas 25 recubiertas de peptido se cubrieron con capas mas ordenadas de mineral durante el experimento (un representante se muestra en la Figura 9, panel C), mientras que todas las perlas de control no recubiertas/bloqueadas con biotina no acumulaban minerales (Figura 9, panel D).

Union espedfica de tejidos de peptidos DSS a superficies dentales

Para ensayar la union de peptidos que contienen DSS al tejido biologico, se incubaron dientes humanos seccionados 30 sagitalmente tratados con 6DSS (las muestras de control se prepararon sin peptido), se lavaron y se formaron imagenes por CLSM. La Figura 10 muestra la intensa tincion fluorescente del diente por el peptido marcado. Las secciones de control tratadas simuladamente tenidas con peptido revuelto o con 5(6)-carboxifluorescema libre no mostraron fluorescencia (no se muestra). Curiosamente, este peptido se une espedficamente a la dentina ya que no se observo union al esmalte (el borde izquierdo del area manchada en la Figura 10 corresponde a la union dentina- 35 esmalte [DEJ]). El examen del patron espacial de la union de la dentina con 6DSS marcado (Figura 10) revela que la tincion es mas brillante en la dentina del manto mas proxima a la DEJ, con niveles notablemente mas bajos de tincion en la dentina circumpulpal, cerca de la cavidad pulpar.

Remineralizacion mediada por DSS de superficies dentales in vitro

Habiendo establecido que los peptidos que contienen (DSS)n pueden unirse a la superficie de la dentina y que los 40 peptidos inmovilizados podnan causar la acrecion de fosfato de calcio, se busco determinar si estos peptidos podnan usarse para reclutar fosfato de calcio en la superficie de la dentina. Las secciones desmineralizadas de dientes humanos extrafdos se trataron con peptido 8DSS y luego se sometieron a remineralizacion con Quell Desensitizer (Pentron Technologies), un producto de remineralizacion comercialmente disponible que consistfa en soluciones acuosas de cloruro de calcio y fosfato potasico. Como se muestra en las micrograffas electronicas de la Figura 11, las 45 muestras tratadas simuladamente (Figura 11, panel C) y no tratadas (tratadas solo con el desensibilizador, Figura 11, panel D) mostraron bajos niveles de acumulacion de minerales, quedando varios tubulos dentinarios expuestos. Por el contrario, las muestras de dentina tratadas con DSS (Figura 11, panel B) acumulaban una capa continua de precipitado de fosfato de calcio en presencia de solucion desensibilizante, ocluyendo completamente los tubulos dentinarios.

50 Discusion

La biomineralizacion es uno de los procesos centrales en el desarrollo y la evolucion de los vertebrados (Kawasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101: 11356-11361) y referencias dentro de la misma, que afectan procesos tan diversos como la alimentacion, locomocion, evitacion de depredadores, audicion y equilibrio. Los defectos en la mineralizacion o en las protemas de los tejidos mineralizados estan involucrados en enfermedades humanas que van 55 desde la sordera hereditaria (Xiao et al. (2001) Nat Genet., 27: 201-204) y aterosclerosis (Magne et al. (2005) Bioessays 27: 708-716) a la caries dental y la osteoporosis. Las protemas que median el proceso de mineralizacion nos ofrecen una plantilla para entender como manipular la deposicion de compuestos de calcio y asf potenciar potencialmente el tratamiento de los defectos del tejido calcificado.

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La presencia omnipresente de DPP en sitios de deposicion de fosfato de calcio en mairnferos sugiere que esta protema desempena un papel directo en el proceso de mineralizacion (Hao et al. (2004) Bone 34: 921-923; Rahima et al. (1988) J Histochem Cytochem., 36: 153-157; Begue-Kirn et al. (1998) Eur J Oral Sci., 106: 963-970; Bleicher et al. (l999) Matrix Biol., 18: 133-143; Baba et al. (2004) Eur J Oral Sci., 112: 163-170). Los estudios bioqmmicos han demostrado que la DPP puede afectar efectivamente a la formacion de cristales de HA biologicamente relevantes causando nucleacion (a bajas concentraciones) o inhibicion (a altas concentraciones) del crecimiento de los cristales (Lussi et al., 1988), Arch Oral Biol., 33: 685; Saito et al. (2000) J Bone Miner Res., 15: 1615-1619). Las protemas implicadas en procesos de mineralizacion en vertebrados (incluyendo DPP) a menudo contienen dominios de carga negativa, Asp o Glu (Harris et al. (2000) Bone 27: 795-802, y referencias dentro). Esta observacion se combino con estudios computacionales y bioqmmicos de la region de repeticion (DSS)n (Veis et al., (1998) Eur J Oral Sci., 106 (Suppl 1): 234-238; Lee y Veis (1980) Int J Pept Protein Res., 16: 231-240; George et al., 1996, J Biol Chem., 271: 32869-32873; Chang et al. (2006) Calcif Tissue Int., 78: 55-61) indicaron que esta corta secuencia repetida regula la union de minerales y la actividad de nucleacion de DPP.

Dada la conocida dependencia de la actividad de DPP en su estado de fosforilacion (Saito et al., (1997) Bone 21: 305311; He et al (2005) J Biol Chem., 280: 33109-33114), no es sorprendente que los peptidos no fosforilados que contienen DSS fallaran en nuclear la formacion de HA en solucion libre. Sin embargo, se encontro que incluso en ausencia de fosforilacion, estos peptidos se uman estrecha y espedficamente a compuestos de fosfato de calcio, lo que sugiere que el propio motivo (DSS)n puede ser util para identificar, iluminar y manipular superficies calcificadas.

Al caracterizar el comportamiento de estas moleculas, se encontro que las afinidades de union medidas para los peptidos DSS se comparan favorablemente con afinidades medidas para otras protemas y peptidos conocidos de union a HA. Por ejemplo, la afinidad de union a HA del peptido 8DSS (290.000 M'1), que consiste en 24 aminoacidos, es solo siete veces menor que la de las nanoesferas de amelogenina completamente montadas (1.970.000 M’1) (Bouropoulos y Moradian-Oldak (2003) Calcif. Tissue Int., 72: 599-603), que consisten en hasta 40 subunidades individuales de ~25-kDa. Ademas, se ha informado que la region C-terminal de la amelogenina tiene una afinidad de union a HA de 6.200 M_1 (Aoba et al. (1989) J Dent Res., 68: 1331-1336), mientras que en contraste, el peptido 4DSS tiene una afinidad de 94.000 M-1. La afinidad de union de 8DSS se compara favorablemente con los valores medidos para las histatinas de tamano comparable (K = 353.000-1.903.000 M_1 Yin et al. (2003) Arch Oral Biol., 48: 361-368), una clase de pequenos peptidos antimicrobianos que son conocidos por unir HA con alta afinidad.

La union de peptidos que contienen DSS a sustratos definidos de HA depende fuertemente de la longitud de los peptidos, con la afinidad aumentando en proporcion al tamano del peptido hasta una longitud de seis repeticiones (18 aminoacidos), con poco aumento adicional en la afinidad vista en peptidos con ocho repeticiones (Tabla 6). Por lo tanto, seis repeticiones parecen ser optimas para la interaccion con las superficies de HA, reflejando posiblemente el numero maximo de grupos funcionales del peptido que pueden interactuar eficazmente con la superficie en un momento dado. En el otro extremo de la escala de longitud, el peptido 2DSS, que contiene solo dos repeticiones de la secuencia DSS, muestra una afinidad de union a HA mucho mas baja que la de las variantes mas largas (57.000 M_1), pero muy por encima de los valores observados para la union de aminoacidos individuales (5.000-13.200 M_1 para fosfoserina (Moreno et al., 1984), Calcif Tissue Int., 36: 48-59, Benaziz et al (2001) J. Colloid Interface Sci., 238: 48-53 ), 220 M_1 para Asp (Moreno y otros (1984) Calcif Tissue Int., 36: 48-59), 206 M_1 para acido glutamico (Kresak et al., (1977) Colloid Interface Sci., 59 : 283-292).

La union del peptido a las superficies de HA tambien dependfa de su secuencia, mostrando, casi todos los peptidos variantes, reducciones significativas en la afinidad de union con relacion a la secuencia DSS parental (Tabla 6, Figuras 7B, 7C). Nuestros resultados muestran que la secuencia primaria determinante de la union es una carga negativa en la posicion 1 de la repeticion. Los estudios de polfmeros extremadamente grandes de acido aspartico muestran una afinidad de union HA muy alta (3.000.000 M_1 para un polfmero de 28.8-kDa (Tsortos and Nancollas (1999) J. Colloid Interface Sei., 209: 109-115)). Las sustituciones de las serinas en la repeticion DSS tambien conducen a reducciones en la actividad de union, aunque mucho menos severamente. En el pasado, las mediciones de la afinidad de union de serina a HA han variado desde aquellas demasiado bajas para someterse al analisis de Langmuir (Benaziz et al. (2001) J. Colloid Interface Sci., 238: 48-53) a valores mucho mas altos (317.000 M-1, pero con un numero muy pequeno de sitios de union por metro cuadrado de HA (Moreno et al., (1984) Calcif Tissue Int., 36: 48-59) dependiendo de la preparacion espedfica de HA utilizada, sugiriendo la posibilidad de una interaccion compleja y posiblemente muy espedfica entre la serina y las regiones discretas de las superficies de HA. Nuestros experimentos iniciales indican que la union de peptidos que contienen DSS a HA resulta principalmente de las contribuciones de los residuos de acido aspartico, con las serinas jugando un papel mas pequeno pero significativo.

La union de peptidos que contienen (DSS)n a superficies de HA definidas in vitro nos llevo a investigar la union de estos peptidos a tejidos biologicos calcificados. El peptido 8DSS marcado con fluorescema se une fuertemente a la dentina de los molares humanos adultos extrafdos con una notable especificidad tisular, uniendose principalmente a la dentina del manto, con la union al esmalte casi completamente ausente. Debe observarse que los cristales de HA de la dentina presentan morfologfas muy diferentes de las del esmalte, que consisten en cristales mas pequenos, en forma de placa, con orientaciones esencialmente aleatorias, en lugar de los cristales de HA alargados y bien orientados de la superficie del esmalte (Paine et al. 2005) J Biol Chem., 280: 31991-31998; Bath-Balogh and Fehrenbach (2006) Embriologfa, histologfa y anatomna dental., Elsevier Saunders, St. Louis). Por lo tanto, es posible que la especificidad de union de los peptidos que contienen (DSS)n a las regiones de la dentina pueda ser debida a la union selectiva de

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esta forma cristalina espedfica de HA o (especialmente a la luz de la union observada a fosfatos de calcios amorfos) puede reflejar una preferencia simple de estos peptidos para superficies menos ordenadas. Tambien se observo la union a mineralizacion de nodulos de medula osea de raton, indicando ademas que estos peptidos pueden ser utiles en la identificacion y manipulacion de una amplia variedad de tejidos mineralizados.

Aunque los peptidos no fosforilados que contienen DSS examinados en este estudio fallaron en nuclear la formacion de HA en solucion libre, pudieron unirse efectivamente a los agregados amorfos de fosfato de calcio. Al inmovilizar estos peptidos sobre un soporte solido, pudimos aprovechar esta capacidad como un medio para controlar el sitio de deposito de fosfato de calcio en soluciones saturadas. Se encontro que las perlas de poliestireno con el peptido 8DSS inmovilizado sobre sus superficies agregaban eficazmente fosfato de calcio amorfo a partir de soluciones saturadas de CaHPO4. Sin embargo, tras la incubacion adicional, se encontro que las cuentas individuales acrecen capas de fosfato de calcio cristalino mas ordenado, incluso sin fosforilacion de los peptidos. Este comportamiento inesperado marca un alejamiento de lo que se ha observado para la protema DPP y sugiere que la protema de longitud completa probablemente contiene mecanismos reguladores adicionales para ayudar a gobernar la nucleacion de HA. Este resultado tambien sugiere que los peptidos que contienen (DSS)n pueden ser enormemente versatiles en la manipulacion de la deposicion de fosfato de calcio.

Nuestras investigaciones de la capacidad de los peptidos que contienen (DSS)n para iniciar la deposicion de minerales sobre las superficies de los dientes revelaron que el pretratamiento con el peptido 8DSS mejoro notablemente la eficacia de un producto de remineralizacion comercialmente disponible causando la agregacion de mineral en la superficie de la dentina parcialmente desmineralizada. Las simulaciones de dinamica molecular utilizando los peptidos ricos en Asp/Ser y Asp/fosforosina teoricos han mostrado que estos peptidos probablemente adoptan conformaciones extendidas, presentando grupos funcionales a ambos lados de un plano paralelo a la superficie de interaccion (George et al. (1996) J Biol Chem., 271: 32869-32873; Dahlin et al., (1998) Eur J Oral Sci., 106 (Supl. 1): 239-248). En el caso espedfico de los peptidos basados en la repeticion Asp-Ser-Ser, esto tiene el efecto de proporcionar dos caras de union mineral equivalentes, permitiendo que los peptidos inmovilizados en la superficie se unan activamente a las partroulas de fosfato de calcio amorfo, conduciendo asf al aumento observado de acumulacion amorfa de fosfato de calcio en superficies de HA pretratadas con 8DSS. Esta actividad presenta estos peptidos como alternativas prometedoras para mejorar la remineralizacion de los dientes.

La capacidad para unirse espedficamente a superficies calcificadas y para reclutar fosfato de calcio ofrece muchas otras oportunidades unicas para intervenciones diagnosticas y terapeuticas. Aunque estas actividades residfan en protemas grandes, no era practico contemplar su uso en aplicaciones clmicas; pero la presente demostracion de un comportamiento similar por peptidos pequenos facilmente sintetizados proporciona la posibilidad de poderosas herramientas nuevas para diagnosticar y tratar trastornos de los tejidos calcificados. Ya hemos presentado el ejemplo de mejorar la eficacia de los regfmenes de remineralizacion existentes mediante el pretratamiento de superficies con peptidos que contienen (DSS)n, y aun quedan por explorar muchas otras posibilidades. Los metodos actuales de diagnostico de la caries dental, por ejemplo, se basan en el sondeo manual, la tincion colorimetrica o la fluorimetna o interferometna laser para identificar los sitios de lesiones cariosas (Audette et al. (2004) Biochemistry 43: 1142711435; Tranaeus et al. (2005) Community Dent Oral Epidemiol., 33: 265-273). Dada la afinidad de los peptidos (DSS)n para el fosfato de calcio amorfo y su falta de union al esmalte sano, los peptidos marcados con fluorescencia (DSS)n pueden usarse para identificar rapidamente lesiones cariosas y precariosas en los dientes. Este metodo tendna una precision mucho mas alta que los colorantes colorimetricos (dependencia de la cual puede conducir a la eliminacion del esmalte sano (Yip et al. (1994) Br Dent J., 176: 417-421)) y sensibilidad mejorada en comparacion con la radiograffa o con los metodos basados en fluorescencia que se apoyan en la fluorescencia del tejido nativo.

Debido a que los peptidos que contienen (DSS)n pueden unirse facilmente a cualquier numero de marcadores o compuestos accesorios, su utilidad en aplicaciones de diagnostico esta limitada solamente por el intervalo de su especificidad de tejido. Hemos hecho un uso extensivo de peptidos marcados con fluorescencia en este estudio, pero tambien es posible unir compuestos yodados para su uso como agentes de contraste radiograficos (Lee et al. (2003) J Anat., 203: 161-172) para mejorar el contraste en la resonancia magnetica. Yokogawa et al. (2001) Endocrinology 142: 1228-1233, mostraron que era posible dirigir estradiol a tejidos calcificados uniendolo a cadenas cortas de poliaspartato. De forma similar, es posible unir compuestos terapeuticos, tales como antimicrobianos o factores de crecimiento, a peptidos que contienen (DSS)n para dirigir su liberacion a superficies calcificadas espedficas con aun mayor precision.

Actualmente, se estan realizando esfuerzos para identificar la gama de especificidad tisular de estos peptidos y para disenar variantes con especificidad expandida o estrechada que nos permita aprovechar su actividad de union mineral de manera mas precisa. El DPP se compone en gran parte de repeticiones de (DSS)n y ejerce efectos poderosos sobre la tasa y el tipo de mineralizacion en los dientes en desarrollo (Paine et al. (2005) J Biol Chem., 280: 3199131998). Mediante la aplicacion de las herramientas de ingeniena de peptidos a peptidos similares a (DSS)n derivados de DPP, vamos a desbloquear todo el potencial de este unico motivo de union a minerales.

Ejemplo 7

Los agentes que unen el calcio inducen el crecimiento de las unas.

A conejos blancos de Nueva Zelanda se afeitaron sus patas y se recortaron sus unas recortadas a una longitud uniforme con respecto al aspecto visible del nuevo crecimiento dentro de la una, y cada dedo se trato con peptido (D)- 8DSS en sulfosuccinato de dioctilo (aerosol OT o AOT)/nanoemulsion agua en aceite (W/O) de isopropanol (formulacion AID), con peptido (D)-8DSS en dimetilsulfoxido (DMSO, formulacion DID) o con solucion salina 5 tamponada con fosfato (PBS) cada tres d^as durante 19 dfas, como se describe a continuacion.

Se ensayaron dos formulaciones, incorporando ambas la forma D de 8DSS:A1D (aerosol OT/isopropanol) y DID (solucion de DMSO). Ademas, se incluyeron controles negativos, consistentes en solucion salina topica normal. Se usaron dos animales y se trataron ocho sitios en cada animal: en cada pie, se trataron los lechos de las unas de dos dedos con el compuesto de la muestra, mientras que los lechos de las unas de los dos dedos restantes se trataron 10 con solucion salina normal. En un animal, se trataron los primeros y segundos dedos con el compuesto activo, mientras que el tercero y cuarto dedos se trataron con una solucion de control (solucion salina normal); en el otro animal este patron se invierte para controlar efectos espedficos de posicion dentro de la pata. Al final del experimento, se fotografiaron los pies de los animales y se sometieron las fotograffas a un analisis de imagenes para determinar el efecto de las formulaciones de ensayo sobre la extension o la velocidad de crecimiento de las unas. Los detalles de 15 la configuracion se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Configuracion del tratamiento.

Formulaciones de tratamiento:

Nombre de la muestra

Formulacion

AID

AOT micelas inversas que contienen peptido (D)-8DSS 20 mM resuspendido en 2-propanol. La concentracion efectiva de peptidos en la formulacion es de 100 pM. Aplicado topicamente.

DID

(D)-8DSS disuelto en DMSO a una concentracion de 200 pM. Aplicado topicamente.

C2

Control negativo. Solucion salina normal aplicada topicamente

Tratamiento:

Miembro

Dedos Tratamiento

Pierna delantera derecha

1, 2 A1D administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

3, 4

PBS administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

Pierna delantera izquierda

1, 2 D1D administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

3, 4

PBS administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

Pata trasera derecha

1, 2 D1D administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

3, 4

PBS administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

Pata trasera izquierda

1, 2 A1D administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

3, 4

PBS administrado topicamente al lecho ungueal cada dos dfas

Al comienzo de los experimentos, las unas se rasparon en la cutfcula para indicar la posicion del crecimiento de unas antes de la administracion del farmaco.

20 Se administraron formulaciones topicas al lecho ungueal, 20 f 1 por administracion, cada dos dias.

Los animales se mantuvieron de acuerdo con directrices de cna estandar y se observaron en busca de cualquier defecto evidente en el comportamiento o en la salud general. Se observo irritacion de la piel.

Al final del experimento, los pies se fotografiaron desde multiples angulos segun fuera necesario para mostrar la extension del crecimiento de las unas, as^ como cualquier espesamiento o cambios morfologicos macroscopicos en 5 cada dedo; las mediciones se realizaron mediante analisis cuantitativo de las imagenes. Las unas se rasparon de nuevo para indicar la posicion del crecimiento de unas al final del experimento.

El dfa 19, se registraron las imagenes y se midio cada una. Como se muestra en la Figura 12, las unas tratadas mostraron un crecimiento significativamente mayor que las unas no tratadas. Las mediciones agregadas del estudio muestran aumentos significativos en el crecimiento de las unas para las unas tratadas con DID con respecto a las 10 unas tratadas con AID, y ambos grupos de tratamiento mostraron un crecimiento de 4 a 5 veces mayor durante el penodo de ensayo de 19 dfas que en el tratamiento de las unas no tratadas o simuladas (figura 13).

La nanoemulsion desarrollada para aplicaciones de crecimiento del cabello funciona bien para suministrar el compuesto tambien a la matriz de unas, mientras que las soluciones de DMSO del compuesto activo, que son solo marginalmente eficaces en fomentar el crecimiento del cabello, parecen proporcionar el crecimiento mas robusto de 15 unas. Esto es probablemente debido a la propension de las vesfculas de nanoemulsiones a acumularse en los folfculos pilosos, mientras que las soluciones de DMSo liberan sus solutos de una manera mas dispersa a traves del tejido en el que se aplican.

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento solo tienen fines ilustrativos y que se sugeriran a los expertos en la materia diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos y estaran dentro 20 del esprntu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aqrn se incorporan como referencia en su totalidad para todos los fines.

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   Reivindicaciones

   1. Un peptido de union al calcio para uso en la induccion del crecimiento del cabello o inhibicion de la perdida del cabello y/o inducir el crecimiento de las unas en un mairnfero, en el que:

   dicho peptido de union de calcio comprende la secuencia de aminoacidos (X-Y-Z)n, donde X es acido aspartico, Y y Z son serina, y n es un numero de 2 a 100.
2. 2. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho peptido de union al calcio comprende un peptido L, peptido D o peptido beta y X es acido aspartico, Y es serina o fosfoserina y Z es serina o fosfoserina.
3. 3. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho peptido de union al calcio comprende un peptido L, peptido D o peptido beta seleccionado del grupo que consiste en (DSS)4, (DSS)5, (DSS)6, (DSS)y, (DSS)8, (DSS)g, y (DSS)1o.
4. 4. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho peptido es un peptido "L".
5. 5. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho peptido no esta fosforilado.
6. 6. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho peptido esta fosforilado.
7. 7. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho peptido lleva un grupo protector en el extremo amino y/o carboxilo.
8. 8. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el extremo carboxilo de dicho peptido esta amidado.
9. 9. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho peptido de union al calcio se formula para administracion topica.
10. 10. El peptido de union al calcio para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho peptido es para el tratamiento de un ser humano diagnosticado con una afeccion seleccionada del grupo que consiste en alopecia areata, alopecia androgenetica, alopecia inducida farmaceuticamente y alopecia inducida por radiacion.
11. 11. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicho peptido es un componente de una formulacion seleccionada del grupo que consiste en champu, acondicionador del cabello, desenredante del cabello, un agente colorante del cabello, un tonico para crecimiento del cabello, un protector solar, una crema, un gel, o una pomada, un enjuague, un tonico, una solucion, una emulsion, una espuma, una crema, un gel, un unguento, un polvo espolvoreable, un linimento o un balsamo, una locion y un unguento.
12. 12. El peptido de union al calcio para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho peptido es para inducir el crecimiento de las unas.
13. 13. El peptido de union al calcio para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 12, en el que dicho peptido se formula para la administracion a una region seleccionada del grupo que consiste en una una, un lecho ungueal, una cutfcula, el area de coronilla de un casco, la base de un cuerno.