ES2240067T3 - Proteina que permite bloquear la adhesion de plaquetas. - Google Patents
Proteina que permite bloquear la adhesion de plaquetas.Info
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Abstract
Un polipéptido aislado de H. medicinalis que tiene un peso molecular de alrededor de 12000 ñ 1 kD con la actividad biológica de un inhibidor de adhesión plaquetaria dependiente del colágeno, el cual es al menos 80% idéntico a la secuencia del aminoácido de la SEQ. ID. No. 2 sobre toda su longitud.
Description
Proteína que permite bloquear la adhesión de
plaquetas.
Se describe una proteína de ocurrencia natural
aislada de la saliva de la sanguijuela medicinal Hirudo
medicinalis, la cual se enlaza fácilmente al colágeno actuando
así como un inhibidor de la adhesión natural de las plaquetas al
colágeno. La proteína tiene un peso molecular de alrededor de
12.000, un punto isoeléctrico ácido y contiene seis cisteínas. La
proteína fue secuenciada y el gen fue clonado a partir de una
biblioteca cADN del H. medicinalis. Se describen
procedimientos para producir tal polipéptido por técnicas
recombinantes. Las proteínas recombinantes y de ocurrencia natural,
son potentes inhibidores de la adhesión de las plaquetas dependiente
del colágeno, y por lo tanto son útiles para el tratamiento
terapéutico de varias condiciones relacionadas con una enfermedad
difícil y con enfermedades del sistema circulatorio. Además, la
proteína es útil para recubrir las superficies naturales o
artificiales del colágeno con miras a volverlas no adhesivas para
las células y para prevenir la activación de las mismas.
En casos de hemostasis o trombosis, las plaquetas
se adhieren a la matriz extracelular de la célula de un vaso
lesionado y recubren la superficie del área dañada. La prevención de
este importante paso inicial en la patogénesis de la trombosis y la
oclusión arterial, debe ser de beneficio terapéutico en el esfuerzo
para prevenir las enfermedades trombóticas. Se considera que el
colágeno es el componente de superficie más trombogénico, y ha
mostrado ser un estimulante fuerte para la adhesión de plaquetas,
agregación y la liberación de sus gránulos que salen al
restablecimiento de (Ruggeri, Z.M. y colaboradores; Seminars in
Haematology, 1994, 31, 229-39) plaquetas adicionales
en esta área para formar agregados, o un trombo. El contacto inicial
de las plaquetas con la superficie del vaso es mediado por el
enlazamiento del colágeno del Factor de von Willebrand (vWF) y por
un receptor específico vWF sobre las plaquetas, el complejo de
glicoproteína ib-V-IX. Además, los
factores ADP, epinefrina y de coagulación de la circulación, dirigen
los procesos de activación adicionales de las plaquetas, mientras
que simultáneamente un incremento en la actividad de la trombina
contribuye a la formación del entrecruzamiento del coagulo de
fibrina. La agregación plaqueta- plaqueta soporta este proceso, y
está dirigida principalmente por el fibrinógeno como un mediador que
conecta las células a través del receptor IIb/IIIa de
glicoproteína.
Esta respuesta fisiológica normal es muy crítica
en el curso del proceso patológico donde las plaquetas se adhieren a
los colágenos expuestos en las lesiones escleróticas (Van der Rest
M. y colaboradores; FASEB Journal, 1991, 5,
2814-23) y comienzan a desarrollarse oclusiones.
Dependiendo de la localización y del grado de la oclusión,
complicaciones severas tales como infarto al miocardio, ataque
fulminante, inflamación o embolia pulmonar pueden ser el grave
resultado de este proceso.
La heparina como agente antitrombótico de acción
directa, que bloquea la actividad de la trombina previniendo así la
formación de trombos ricos en fibrina, es actualmente la droga más
conocida que se utiliza en las intervenciones antitrombóticas. La
heparina es ampliamente usada en eventos tales como: Angina
inestable e infarto agudo al miocardio. Sin embargo, a pesar de su
amplio uso, diferentes defectos severos tales como su aplicación
intravenosa, el requerimiento de antitrombina III como cofactor, su
reducida afinidad por la trombina enlazada al coágulo, su
desactivación por diferentes proteínas del plasma, la inducción
ocasional de trombocitopenia y su heterogeneidad biológica,
permanecen sin resolver. Como consecuencia, los resultados de usar
la heparina en el medio clínico no han sido abrumadores hasta
ahora.
El desarrollo reciente de heparina de bajo peso
molecular ha contribuido a una versión para aplicación subcutánea,
sin embargo, el beneficio terapéutico sobre la heparina estándar ha
sido modesto. Infortunadamente, lo mismo aplica para las otras
antitrombinas que actúan directamente, tales como Hirudina, Hirulog
y Warfarina. Resultó ser que uno de los principales problemas
parece estar relacionado con la mayor producción de trombina bajo
el tratamiento antitrombótico ( Rao, A.K. y colaboradores,
Circulation, 1996, 94, 389-2395).
Otras estrategias recientes se han enfocado por
lo tanto en los procesos de activación de la protrombina que esta
dirigida por el Factor Xa. El mayor reto es el diseño de
inhibidores apropiados dirigidos a este factor. En resumen, se
argumentaría por lo tanto que el potencial terapéutico total de este
tipo de intervención no ha sido verificado aún.
Otro grupo de terapéuticos está representado por
los regímenes tromboliticos y se han enfocado en el desarrollo de
estafiloquinasa, estreptoquinasa, Activador Plasminógeno de tipo
uroquinasa, activador plasminógeno tipo tejido y complejo activador
anisoilado-plasminógeno-estreptoquinasa.
Las diferencias en el tiempo necesario para inducir una nueva
perfusión son marcadamente diferentes para cada uno de estos agentes
trombóliticos, sin embargo, la contribución en términos de reducir
la mortalidad total, es igual para todos los productos. Además, una
nueva oclusión o un sangrado prolongado, son complicaciones
frecuentes. Esto puede ser debido a la especificidad relativamente
baja por la fibrina y a la corta vida media en el plasma de estos
compuestos. Actualmente se prueban varios regímenes de aplicación y
combinaciones de diferentes principios fibrinolíticos con miras a
superar algunos de los defectos actuales en la terapia trombolítica.
Las mejoras que se esperan son sin embargo muy pequeñas.
Recientemente se presentó un nuevo grupo de
pacientes con problemas tales como oclusión trombótica aguda y
reestenosis tardía debido a procedimientos tales como angioplastia,
aterectomía, injertos arteriales o aplicación de una cánula
intraluminal dentro de la pared vascular. Las posibles
intervenciones terapéuticas comprenden estrategias antiplaqueta,
antitrombóticas y trombolíticas. Varios otros agentes tales como la
ticlopdina actúan como antagonistas del ADP o el ionóforo de
calcio A-23187 y especialmente la Aspirina, tienen
una influencia directa sobre la función plaquetaria, y han sido
sugeridos o usados para prevenir o minimizar la agregación
plaquetaria. La nueva sustancia para adhesión antiplaquetaria de
acuerdo con esta invención, podría ayudar también a superar estas
complicaciones clínicas cuando se la aplica durante una cirugía.
Otra complicación relacionada con este tópico
surge si se ponen en contacto superficies artificiales con la
sangre, incrementándose entonces la tendencia a inducir eventos
trombóticos por activación de plaquetas y/o inducción de
coagulación. Estos efectos pueden causar una falla de los injertos
vasculares, válvulas cardíacas, cánulas intraluminales, catéteres o
cualquier otro dispositivo o material que entre en contacto con la
sangre. La capacidad de la proteína descrita aquí para crear
superficies no trombogénicas, puede por lo tanto aprovecharse además
para la inmovilización de esta proteína a los materiales y
dispositivos descritos aquí. Tal tratamiento volvería a tales
materiales o dispositivos, biocompatibles y tromboresistentes.
Debido a las limitaciones asociadas con los
agentes antitrombóticos disponibles, existe actualmente la necesidad
de estrategias y terapias alternativas nuevas.
Puede contribuirse al potencial de mejoras
futuras en el tratamiento de desórdenes cardiovasculares por
propuestas como las descritas en esta invención, las cuales
interfieren directamente con el colágeno y/o con la adhesión
plaquetaria inducida por el factor vWF.
Varios inhibidores nuevos que previenen la
adhesión plaquetaria son anticuerpos monoclonales dirigidos al
factor vWF. También se ha sugerido que los inhibidores IIb/IIIa de
glicoproteína pueden ser benéficos en la inhibición de la adhesión
plaquetaria.
Algunos de estos inhibidores como el Ab c7E3
monoclonal ya han sido probados clínicamente, mientras que otros
como los inhibidores KGD y RGDF están aún bajo estudio. Sin embargo,
la especificidad de la mayoría de estos nuevos inhibidores no está
bien estudiada, y por lo tanto, el espectro de efectos secundarios
que se inducirían por el uso de estos inhibidores está aún abierto y
merece un examen cuidadoso.
Una fuente rica para la investigación de nuevos
compuestos que interfieren con la adhesión plaquetaria inducida por
el colágeno se da en la naturaleza a través de los anímales que
succionan sangre. Varios inhibidores han sido aislados de la
naturaleza como se describe en la literatura: Una proteína 65 kD
llamada Calin aislada de Hirudo medicinalis (US 5.587.360, WO
92/07005) (Munro, R., y colaboradores, Blood Coagulation and
Fibrinolysis, 1991, 2, 179-1849) y una proteína 16
kD (LAPP) aislada de las glándulas salivales de la sanguijuela
Haementeria officinalis (US 5.324.715). Ambas proteínas han
sido descritas como inhibidores de agregación como se probó en
ensayos estáticos de agregación plaquetaria dependiente del
colágeno.
A pesar de una probada actividad in vitro,
LAPP falló al actuar en varios modelos in vivo bien
establecidos ( Schaffer L.W. y colaboradores; Arterioscler. Thromb.,
1993, 13, 1593-1601) y Connolly T. M. y
colaboradores; Thromb. Haemostas., 1993, 69, 589). La garrapata
blanda, Ornithodoros moubata, también contiene una proteína
antiplaquetaria (Moubatin) que es activa en la prevención de la
agregación plaquetaria estimulada por el colágeno (Waxman, L. y
colaboradores; J. Biol..Chem., 1983, 268, 5445-49).
Otro inhibidor de agregación plaquetaria de un insecto succionador
de sangre fue descrito en WO 9309137 por
Noeske-Jungblut C. y colaboradores. Smith y
colaboradores han aislado una proteína 50 kDa a partir del veneno de
una serpiente y, una proteína 19 kDa fue aislada de la saliva de
Triatoma pallidipennis, un insecto succionador de sangre. Se
encontró que la proteína contenía un factor que inhibe
específicamente la agregación plaquetaria inducida por colágeno. La
proteína 19 kDa llamada palidipina, inhibe la agregación de
plaquetas mediada por colágeno en el plasma. No se detectó
inhibición de agregación estimulada por otros efectores (ADP,
trombina, U46619 agente mimético del tromboxano A2, forbol éster).
La palidipina no tuvo efecto sobre la adhesión plaquetaria al
colágeno, pero inhibió la liberación de ATP de las plaquetas.
Interactuó reversiblemente con las plaquetas y puede compartir con
el colágeno un objetivo común sobre ellas. El mecanismo preciso de
acción y el beneficio terapéutico de esta proteína, está bajo
investigación. Gan y colaboradores describieron la Echistatina como
un inhibidor de enlazamiento del receptor GP IIa/IIIb del
dependiente de la fibrinógeno (J. Biol.. Chem., 1988, 263,
19827-32).
A pesar de estos desarrollos excitantes, continúa
existiendo la necesidad de proveer más anticoagulantes y
antitrombina los cuales han incrementado su eficiencia en la
inhibición de la formación del coágulo, la activación plaquetaria
inducida por vWF o la activación celular endotelial y que pueden ser
usados farmacéuticamente y ser producidos en cantidades
comercialmente viables.
Ya que ninguna de las proteínas conocidas
descritas hasta ahora se ha desarrollado dentro de un compuesto con
un perfil terapéutico ideal, los inventores de la presente invención
decidieron seguir adelante con una nueva estrategia de investigación
con miras a detectar proteínas más relevantes.
En esta invención se describe a un inhibidor
aislado de H. medicinalis el cual actúa directamente en la
interacción plaqueta-colágeno, inhibiendo así la
activación plaquetaria y la interacción temprana
plaqueta-plaqueta.
Hasta ahora, no ha habido un ejemplo positivo en
la literatura que indique que usando un planteamiento investigativo
que excluiría a los inhibidores de agregación así como a las
proteínas líticas de una fuente de compuestos de ocurrencia natural,
se podrían identificar nuevos mecanismos o compuestos antiadhesivos.
Sin embargo, esta estrategia fue utilizada en esta invención. Ya que
se conocen por lo menos 6 diferentes glicoproteínas de superficie
plaquetaria que están involucradas en la adhesión al colágeno y
además varios compuestos derivados de plaquetas tales como el factor
de von Willerbrand, la fibronectina y la trombospondina, han
mostrado estar involucrados como mediadores indirectos de la
adhesión plaqueta-colágeno, ha habido poco optimismo
en el comienzo, para identificar nuevos inhibidores de adhesión.
Sin embargo, se usó este planteamiento para
investigar la saliva del Hirudo medicinalis, sabiendo que no
todos los inhibidores documentados o desconocidos relacionados con
vWF, así como los compuestos que actúan directamente sobre los
receptores plaquetarios podrían ser excluidos. Así, el resultado de
la investigación fue una sorpresa: una nueva proteína llamada
Sabatina, con actividad antiadhesiva para las plaquetas, que puede
aislarse a partir de los tejidos y secreciones de las bien
investigadas sanguijuelas de la especie Hirudo
medicinalis.
La presente invención comprende al polipéptido
activo de la Saratina aislado de la sanguijuela Hirudo
medicinalis. La proteína fue aislada de la saliva por una
combinación de diálisis presurizada y al menos una etapa
cromatográfica como la cromatografía de intercambio aniónico y al
menos una etapa de cromatografía de alto rendimiento en fase reversa
(RP-HPLC). La etapa de diálisis a presión resultó
ser absolutamente crítica durante la recuperación de la Saratina a
partir de la saliva, ya que la fuerte concentración de ésta ayudó a
superar lo que de otra manera sería una tremenda pérdida de Saratina
bioactiva. La Saratina aislada se enlaza fuertemente a varios
colágenos y bloquea la adhesión de plaquetas a tales superficies
recubiertas de colágeno en una forma que depende de la dosis.
Con miras a optimizar la cascada de
investigaciones, las técnicas actualmente disponibles se han
desarrollado para distinguir la adhesión plaquetaria y la agregación
plaquetaria: la capacidad de las plaquetas para retardar o detener
el flujo a través de las fibras, la contribución de las plaquetas a
la formación del coagulo in vitro, los laboratorios de
adhesión a las cuentas de vidrio, o el flujo de sangre entera a
través del filtro y de la adhesión plaquetaria del plasma rico en
plaquetas anticoaguladas para filtrar las fibras compuestas de
vidrio o colágeno bajo un gradiente de presión regulado.
La proteína (llamada Saratina) se caracteriza por
las secuencias de aminoácidos descritas en la secuencia (SEQ. ID No.
2) y está constituida de 103 aminoácidos que conforman un peso
molecular teórico relativo de aproximadamente 12068 dalton \pm 1
kDa. La proteína exhibe una estructura primaria única sin ninguna
similitud significativa con otras secuencias previamente descritas.
La proteína es rica en ácidos aspártico y glutámico que contribuyen
con el bajo punto isoeléctrico de pH 3,7 \pm 0,5 de la molécula,
como se la midió por IEF-PAGE.
Los análisis por SDS-PAGE
demostraron un fuerte cambio en movilidad por la reducción de la
proteína antes de la electroforesis, indicando modificaciones
postraslacionales. El secuenciamiento del polipéptido ha revelado
seis moléculas de cisteína que podrían configurar modificaciones
postraslacionales de la proteína. La espectrometría de masas
mediante electroaspersión de la Saratina reveló un peso molecular
real de 12061 indicando que están involucrados hasta tres enlaces
disulfuro en la formación de la estructura secundaria de la forma
nativa de la proteína. El inhibidor de adhesión de acuerdo con la
presente invención es nuevo porque difiere de los inhibidores de
agregación conocidos aislados de las sanguijuelas, especialmente de
Calin o LAPP en el peso molecular, el punto isoeléctrico y en la
secuencia de aminoácidos y actividades biológicas.
La presente invención provee también ADN aislado
que comprende un polinucleótido que codifica al inhibidor de
adhesión plaquetaria derivado de la sanguijuela, que tiene una
secuencia de aminoácidos como la mostrada por la proteína. La
secuencia nucleótida representa al clón del cADN se muestra en la
SEQ. ID. No. 1. La posición 1-63 de la secuencia de
nucleótidos representa una secuencia putativa líder de 21
aminoácidos, y la posición 64-372 contiene una
estructura de lectura abierta que codifica para un polipéptido de
103 residuos aminoácidos, y una secuencia de aminoácidos como la
mostrada para la proteína madura en la SEQ. ID. No.2.
La presente invención también se relaciona con
vectores recombinantes que incluyen el gen sintético que codifica
para el inhibidor de adhesión plaquetaria derivado de la sanguijuela
de la presente invención, y una célula hospedadora que contiene los
vectores recombinantes. Los métodos para la recuperación y
aislamiento de las proteínas expresadas se han basado en tecnologías
de marcación, o han sido adaptados del esquema de purificación
desarrollado para la Saratina de ocurrencia natural. Dependiendo de
los protocolos individuales usados para la expresión extracelular o
intracelular en células de levaduras, células de insectos, células
de riñón de Hámster bebé y células de E. coli transformadas
con los vectores apropiados, las etapas para recuperar la proteína
recombinante del sobrenadante o de los sedimentos tienen que ser
adaptadas por técnicas conocidas por el experto. Se encontró una
excelente expresión en E. coli como hospedadora, donde se
contribuyó a la expresión periplasmática por inserción de la
secuencia líder peIB. La recuperación de productos de la
Escherichia coli (E. coli) se logró (alrededor de 5
mg/l) después de osmólisis y centrifugación: la Saccharomyces
cerevisiae (S.cerevisiae) (> 10 mg/l caldo de cultivo)
con el vector alternativo adoptado por la levadura, fue usada en un
experimento paralelo. El material secretado fue aislado por
centrifugación. La purificación se logró por filtración de flujo
cruzado y cromatografía de intercambio iónico. En otras
aproximaciones de expresión usando ya sea células COS o células CHO,
los productos de expresión fueron de alrededor de 750 ng/ml. El
material recombinante purificado probó ser puro y homogéneo por
análisis electroforético y cromatográfico, e idéntico a la Saratina
derivada de la saliva como se demostró por la determinación de la
secuencia de aminoácidos y de la masa molecular.
La invención también comprende métodos para
purificar la proteína activa a partir de la saliva cruda de la
sanguijuela y la medición de su actividad contra las plaquetas por
métodos de ensayo estáticos y dinámicos, así como el uso de este
método para aislar la proteína recombinante.
Las técnicas para la producción de Saratina
incluyen los Ejemplos 6, 7, 8 y 13, aunque los métodos de expresión
utilizados no se restringen a estos ejemplos. Por ejemplo, los
ratones transgénicos, u otros organismos, incluidos otros mamíferos,
también pueden ser utilizados para expresar la Saratina.
Las proteínas de la presente invención incluyen
variantes que conservan la actividad de las secuencias descritas,
incluidos los fragmentos o subunidades, las variantes de ocurrencia
natural, las variantes alélicas, los mutantes artificiales generados
en forma aleatoria y las variaciones intencionales de la secuencia
tales como la adición que conservan la actividad. Los fragmentos o
subunidades se refieren a cualquier porción de la secuencia que
contiene menos aminoácidos que la proteína completa, por ejemplo,
secuencias parciales que excluyen las porciones con N y/o C
terminales de la proteína completa.
La invención cubre además a las proteínas
híbridas, tales como proteínas de fusión o las proteínas que
resultan de la expresión de múltiples genes dentro del vector de
expresión, y que pueden incluir un polipéptido que tiene la
actividad específica de una proteína enlazada por uniones peptídicas
a un segundo polipéptido. Notablemente, otras variantes de las
proteínas de la presente invención están incluidas, especialmente
cualquier variante que difiera de la proteína aislada solamente por
una sustitución conservadora de aminoácidos. Tales sustituciones
conservadoras de aminoácidos se definen en Taylor y colaboradores,
J. Mol. Biol., 1986, 188, 233.
También se incluyen los métodos para usar las
proteínas para prevenir o retardar la activación plaquetaria por
inhibición de las interaccione plaqueta-colágeno. La
proteína es útil en la prevención, profilaxis, terapia y tratamiento
de enfermedades trombóticas. A diferencia de todas estas proteínas
anteriormente descritas, que actúan con diferentes proteínas de
superficie sobre la plaqueta, la proteína de esta invención tiene un
único mecanismo de acción. Se enlaza firmemente a la superficie de
colágeno y un mecanismo de acción viene dado por el cubrimiento de
los costados específicos del colágeno de tal manera que no quedan
disponibles para interactuar y enlazarse con las plaquetas. Este
tipo de nuevo mecanismo tiene la gran ventaja de que las plaquetas
se mantienen funcionalmente intactas durante la aplicación de la
proteína, de tal manera que por medio de este tratamiento no hay
tendencia al sangrado o es muy
baja.
baja.
Otra importante área de uso es el tratamiento de
diferentes superficies con la proteína para volverlas no adhesivas
para las plaquetas y de esa manera crear dispositivos compatibles
con la sangre.
Como se indicó antes, los polipéptidos de acuerdo
con la presente invención son apropiados como compuestos
farmacéuticamente efectivos en composiciones farmacéuticas y
combinaciones.
Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la
invención opcionalmente pueden comprender ingredientes activos
adicionales como Aspirina, anticoagulantes como hirudina o heparina,
o agentes trombolíticos tales como un activador plasminógeno o
estreptoquinasa.
El nuevo polipéptido de acuerdo con la invención
puede formar sales farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido
orgánico o inorgánico no tóxico. Los ácidos inorgánicos son, por
ejemplo, los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico o fosfórico
y sales metálicas de ácidos tales como ortofosfato monoácido de
sodio y sulfato ácido de potasio. Ejemplos de ácidos orgánicos son
los mono, di y tri carboxílicos tales como los ácidos, acético,
glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succinico, glutárico,
fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico,
hidroximaleico, benzóico, hidrobenzóico, fenilacético, cinámico,
salicílico y sulfónico, tal como el ácido metano sulfónico. Las
sales de las fracciones de aminoácidos carboxi terminales incluyen
las sales de los ácidos carboxílicos no tóxicos formadas con
cualquier base orgánica o inorgánica adecuada. Estas sales incluyen,
por ejemplo, metales alcalinos tales como sodio y potasio, metales
alcalino térreos tales como calcio y magnesio, metales livianos del
Grupo IIIa que incluyen aluminio, y aminas orgánicas primarias,
secundarias y terciarias tales como trialquilaminas, incluida la
trietilamina, procaina, dibencilamina, 1-etenamina,
N,N'-dibenciletilén-diamina,
dihidroabietilamina y N-alquilpiperidina.
Como se la usa aquí, el término "excipiente
farmacéuticamente aceptable" significa un relleno inerte líquido
o sólido no tóxico, material diluyente o de encapsulado, que no
reacciona adversamente con el compuesto activo o con el paciente.
Los excipientes adecuados, preferiblemente líquidos, son bien
conocidos en el estado de la técnica, tales como el agua estéril,
solución salina, dextrosa acuosa, soluciones de azúcar, etanol,
glicoles y aceites, incluidos aquellos de petróleo, animal, vegetal,
o de origen sintético, por ejemplo, aceite de maní, aceite de soya y
aceite
mineral.
mineral.
Las formulaciones de acuerdo con la invención
pueden administrarse como dosis unitarias que contienen excipientes
no tóxicos farmacéuticamente aceptables, diluyentes, adyuvantes y
vehículos que son típicos para administración parenteral.
El término "parenteral" incluye aquí
técnicas de infusión o de inyección subcutáneas, intravenosas,
intra-articulares e intratecales. También son
posibles otras formas de dosificación tales como administración oral
y aplicación tópica. Las composiciones parenterales y las
combinaciones, se las administra preferiblemente en forma
intravenosa o en forma de píldora o como una infusión constante de
acuerdo con procedimientos conocidos.
Las tabletas y las cápsulas para administración
oral contienen excipientes convencionales tales como tales como
agentes enlazantes, rellenos, diluyentes, agentes para tabletear,
lubricantes, desintegrantes, y agentes de humectación. Las tabletas
pueden recubrirse de acuerdo con métodos bien conocidos en el estado
de la técnica.
Las preparaciones líquidas orales pueden estar en
forma de suspensiones acuosas o en aceite, soluciones, emulsiones,
jarabes o elíxires, o pueden presentarse como un producto seco para
reconstitución con agua u otros vehículos adecuados antes de su uso.
Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales
tales como agentes de suspensión, agentes emulsificantes, vehículos
no acuosos y preservativos.
Las aplicaciones tópicas pueden estar en la forma
de suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones, emulsiones,
gelatinas o preferiblemente pomadas en emulsión.
Las dosis unitarias de acuerdo con la invención
pueden contener las cantidades requeridas diariamente de la proteína
de acuerdo con la invención, o submúltiplos de las mismas para
conformar las dosis deseadas. La dosis óptima farmacéuticamente
aceptable y la frecuencia de la misma para un paciente dado
(mamíferos, incluidos los humanos) dependen de una variedad de
factores, tales como la actividad del material activo
específicamente empleado, la edad, el peso corporal, el estado de
salud general, el sexo, la dieta, el tiempo y la vía de
administración, la velocidad de aclaración, el objeto del
tratamiento, esto es, terapia o profilaxis, y la naturaleza de la
enfermedad trombótica a ser tratada, actividad antiplaquetaria o
anticoagulante.
Por lo tanto, en composiciones y en combinaciones
útiles como antitrombóticos en el tratamiento de un paciente tratado
(in vivo), una dosis diaria farmacéuticamente efectiva de los
péptidos de esta invención está entre alrededor de 0,01 y 100 mg/kg
de peso corporal, preferiblemente entre 0,1 y 10 mg/kg de peso
corporal. De acuerdo con la forma de aplicación, una dosis sencilla
puede contener entre 0,5 y 10 mg del inhibidor de trombina. Para
lograr el efecto anticoagulante en sangre extracorporal, una
cantidad farmacéuticamente efectiva de los péptidos de la invención
está entre 0,2 y 150 mg/l, preferiblemente entre 1 mg y 20 mg/l de
sangre extracorporal.
También es un objeto de esta invención el proveer
un dispositivo médico extracorporal o implantable para ser usado en
contacto con fluidos corporales, con miras a rendir una superficie
de dispositivo sustancialmente tromboresistente, recubierta con un
polipéptido inmovilizado como se define más adelante en las
reivindicaciones. El polipéptido de acuerdo con la invención es
inmovilizado sobre un dispositivo médico en forma tal de que rinda
la superficie biocompatible y tromboresistente. Tales dispositivos
tienen a veces propiedades superficiales que típicamente incluyen
agregación plaquetaria, lo cual es una desventaja para los usos
deseados para ellos en dispositivos implantables y extracorporales
en contacto con sangre u otros fluidos corporales. Ejemplos de tales
dispositivos que son comúnmente elaborados de materiales plásticos y
fibras sintéticas son las prótesis, órganos artificiales, lentes
oculares, suturas, segmentos vasculares artificiales, catéteres,
dializadores, tubos y vasos para transporte de
sangre.
sangre.
La opacificación de la cápsula posterior (PCO) es
una complicación común después de la extracción de una catarata, a
pesar de las modernas técnicas quirúrgicas y de los lentes que son
usados para este procedimiento. La PCO es causada por la
proliferación y migración de células epiteliales de la lente a
través de la cápsula posterior, reduciendo así la agudeza visual.
Tratamientos físicos así como lentes modificadas químicamente han
sido propuestos para reducir la formación de PCO. El recubrimiento
de la lente con heparina o el uso de gotas tópicas con heparina para
los ojos, han sido utilizados para reducir la PCO, indicando que
mecanismos trombogénicos están involucrados en la formación de la
PCO.
Se ha mostrado que la Saratina tiene ventajas
significativas sobre la heparina para prevenir y bloquear la
trombogenicidad. Es por lo tanto otra característica de esta
invención el proveer un recubrimiento que comprende Saratina, la
cual reduce la trombogenicidad del material del lente usado para los
implantes oculares refractivos en la cámara anterior o posterior,
que pueden ser quirúrgicamente implantados dentro del ojo. Este
nuevo tipo de recubrimiento evita los problemas aportados por el
crecimiento estimulado de las células. En combinación con otros
medicamentos que confieren por ejemplo muerte celular, el
recubrimiento con Saratina ayuda a superar completamente la
opacificación de la cápsula posterior.
Los detalles de las figuras se explican en los
ejemplos 1 a 100.
Separación de los componentes de la saliva. La
elución de la Saratina se marca con *
- a)
- muestra el perfil de separación de la saliva después de intercambio aniónico DEAE. Las fracciones de Saratina han sido recolectadas del pico 3 (Ejemplo 2).
- b)
- Muestra el nuevo paso por cromatografía de las fracciones reunidas sobre MONO Q HR5/5. Las muestras han sido recolectadas de la última parte del pico principal como lo indica la barra (Ejemplo 2).
- c)
- Muestra la última etapa de la cromatografía sobre RP-HPLC analítica semi-preparativa de las fracciones positivas para Saratina, recolectadas de Mono Q HR5/5 (Ejemplo 2). La Saratina activa se recuperó del pico principal (pico 3).
SDS-PAGE de las fracciones
recolectadas a partir de RP-HPLC. Las fracciones
positivas para Saratina están marcadas * (Ejemplos 2 y 3).
Vector de expresión del E. coli para
Saratina (Ejemplo 7).
Plásmido donor del Báculo virus para Saratina
(Ejemplo 8)
La sangre entera ha sido expuesta a una
superficie con colágeno artificial y la adhesión de las plaquetas se
ha visualizado por tinción. La Saratina ha sido usada como un
inhibidor (Proteína #607) Ejemplo 9.
Inhibición de la adhesión plaquetaria sobre
colágeno tipo III recubierto con cubreobjetos bajo condiciones
cortantes. Comparación de la saliva y la Saratina. Ejemplo 9.
La Saratina exhibe una inhibición que depende de
la dosis de adhesión por enlazamiento de plaquetas al colágeno tipo
III recubierto con cubreobjetos bajo condiciones cortantes. Ejemplo
9.
Vector de expresión de la levadura para Saratina
(Ejemplo 13).
La adición de las plaquetas al colágeno ha sido
el antecedente funcional para investigar los componentes de la
saliva. Además, han sido usadas cuatro pruebas adicionales
disponibles para la evaluación de diferentes acciones de las drogas
anitrombóticas, tales como el ensayo AZOCOLL, el ensayo de la
actividad de la amidasa, el ensayo de enlazamiento dependiente del
factor de vWillebrand y el ensayo de agregación plaquetaria para
excluir las propiedades funcionales que idealmente no estarían
relacionadas con un inhibidor de adhesión. Mientras que la mayoría
de estos ensayos usados aquí son ensayos estándar, el ensayo de
adhesión plaquetaria tuvo que ser modificado para adecuarse a
nuestras necesidades específicas. En resumen: el colágeno Horm
(Nycomed) ha sido colocado en placas de 96 pozos (Nunc) usando
colágeno acidificado en una concentración de 20 \mug/ml e
incubadas las placas durante la noche. Después de lavar las placas
tres veces con PSB, la superficie residual de los pozos ha sido
bloqueada con BSA al 1%. Las plaquetas aisladas en forma fresca de
sangre humana citronilada han sido añadidas simultáneamente con
fracciones derivadas de las etapas individuales de columna. Cuando
se requirió, la activación previa de las plaquetas se realizó por
incubación de las mismas antes de usarlas en TBS, en presencia de
iones bivalentes de magnesio. La saliva cruda, estandarizada a una
concentración de proteína total de 200 \mug/ml, ha sido usada como
estándar para comparar la actividad inhibitoria. El ensayo de
inhibición plaquetario resultó ser altamente susceptible a los
cambios en la solución amortiguadora y a concentraciones elevadas de
sal. Ya que toas las muestras han sido procesadas por cromatografía
de intercambio iónico, el análisis directo de las fracciones en el
ensayo de inhibición resultó ser complicado y no confiable. Por lo
tanto, todas las muestras para el análisis han sido llevadas a una
etapa de concentración con base en un Centricon, el cual redujo
simultáneamente la fuerza iónica y mantiene la concentración antes
de la medición.
La invención usó saliva recogida de H.
medicinalis que es conocida por contener un cierto número de
proteínas bioactivas tales como hirudina, inhibidores de elastasa,
colágenos e inhibidores de agregación plaquetaria tales como calin
(Munro, R. y colaboradores, Blood Coagulation and Fibrinolysis,
1991, 2, 179-184) y LAPP (Schaffer, L. W. Y
colaboradores; Arterioscler. Thromb., 1993, 13,
1593-1601). Además de estas proteínas
caracterizadas, la mayoría de las aproximadamente ochenta proteínas
detectables por SDS-PAGE son aún desconocidas. En la
presente invención, la saliva fraccionada y la estrategia de
investigación que se describió en el Ejemplo 1 fueron utilizadas con
miras a investigar las nuevas proteínas que interfieren directamente
con la interacción colágeno-plaqueta.
La separación de una actividad inhibidora de
adhesión a partir de la saliva cruda resultó ser una tarea crítica,
principalmente debido a la pérdida irreversible de la mayoría de los
inhibidores de la actividad de adhesión en la primera etapa
cromatográfica. Aditivos tales como etanol al 12% y cationes
divalentes como los recomendados por Munro, R. y colaboradores, no
mejoraron la situación. Sin embargo, la alta concentración de sal de
la saliva en combinación con la baja concentración de proteína total
(190-250 \mug/ml) requirió de una concentración
inicial o etapa de intercambio de solución amortiguadora. Así pues,
fueron exploradas diferentes estrategias para enriquecimiento,
concentración o intercambio de solución amortiguadora. La diálisis
tradicional conduce a la pérdida completa de actividad. La mayoría
de las otras técnicas estándar tales como intercambiadores iónicos,
columnas de afinidad, exclusión por tamaño (la pérdida fue sin tener
en cuenta la resina de la columna) fallaron, independientemente de
la naturaleza de la tecnología de separación o de la solución
amortiguadora y de los aditivos utilizados. Sorprendentemente,
resultó que la diálisis presurizada de 500 ml de saliva fue un
método exitoso para concentrar las proteínas de la saliva (alrededor
de 30-40 veces) y simultáneamente, para liberarse de
los componentes no deseados de la solución amortiguadora.
Inesperadamente, el material crudo de la saliva procesado de esta
manera, fue un material de partida ideal para purificaciones
adicionales y la recuperación de la bioactividad de los componentes
antiadhesivos por fuera de la saliva, no fue más un problema real.
Ya que los intercambiadores catiónicos o las columnas de afinidad
resultaron ser etapas insuficientes en la purificación, se utilizan
intercambiadores aniónicos débiles tales como
DEAE-Fastflow o
EMD-DEAE-Fractogel. El etanol al 12%
y los cationes divalentes han sido probados, sin embargo los
resultados fueron similares con o sin estos aditivos. La
optimización adicional de la etapa cromatográfica condujo a una
secuencia de columna DEAE, columna Mono Q y como paso final, una
columna RP18 de fase reversa. La optimización de las condiciones
cromatográficas se ha realizado sobre un sistema cromatográfico
BiaCore utilizando columnas analíticas disponibles en Pharmacia. Los
gradientes usados para operar la columna DEAE, la columna Mono Q y
las columnas RP18 se dan en las Figuras 1a, b, c. La separación
basada en el BiaCore ha sido amplificada utilizando técnicas FPLC.
Las condiciones optimizadas de la corrida han sido directamente
convertidas a escala semipreparativa de separación, siguiendo las
instrucciones del fabricante, con la excepción de la etapa de la
columna RP18 que fue mantenida con la técnica BiaCore con miras a
minimizar la pérdida del material purificado. La recuperación de la
proteína purificada a partir de la última etapa cromatográfica RP
fue hecha por centrifugación al vacío de alta velocidad. Las
muestras recolectadas de la última etapa RP han sido recogidas y
analizadas por SDS-PAGE (Figura 2) Posteriormente,
las muestras han sido resuspendidas en PBS y usadas para realizar
pruebas tanto analíticas como de funcionamiento. Típicamente, se
tuvo un rendimiento de alrededor de 750 \mug/l de Saratina a
partir de la saliva no procesada.
La purificación de la Saratina como se describió
en el Ejemplo 1 condujo a una proteína esencialmente pura con un
peso molecular aparente de alrededor de 21 kDa mostrada bajo
condiciones de reducción en SDS-PAGE (Figura 2). La
secuencia completa de aminoácidos se obtuvo por secuenciación
directa de los primeros 48 aminoácidos de la proteína purificada, y
se completo por la secuenciación de varios de varios péptidos
internos generados por medio de degradación enzimática. La secuencia
de la proteína completa se describe en SEQ. ID. No. 2
La proteína esta compuesta de 103 aminoácidos con
un peso molecular calculado de 12067,9 y un peso molecular real de
12061,9 como se dedujo por la espectrometría de masas ESI. Esta
diferencia entre el peso molecular teórico y el medido indica que
todas las seis cisteínas identificadas en la Saratina están
involucradas en la formación de puentes S-S. Este
hallazgo está soportado por la observación de un cambio fuerte en la
movilidad de la proteína cuando se la cromatografía en
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no
reductoras. Además, la proteína es rica en ácidos acidicos tales
como Glu y Asp. La técnica de enfoque isoeléctrico usando
IEF-PAGE (immobilina) reveló un punto isoeléctrico
de pH 3,7 \pm 0,5. En un estudio comparativo hemos usado la
proteína purificada de sanguijuela como referencia y la hemos
comparado con las propiedades fisicoquímicas de la Saratina
recombinante derivada de la expresión del Báculo virus, la levadura
y E. coli. Todas las tres proteínas resultaron ser idénticas
en sus propiedades. La caracterización de la proteína por
SDS-PAGE visualizada por Coomassie (Figura 2) o
teñida de plata y/o el análisis de Western blot revelaron que la
proteína era homogénea y en una forma no glicosilada.
El ARN se preparó a partir de la sanguijuela
medicinal, Hirudo medicinalis; usando el método del
tiocianato de guanidinio. El mARN se purificó a partir del ARN total
usando un "Oligotex mRNA juego" (QIAGEN).
El cADN se sintetizó usando un "Maratón cDNA
Amplification juego" (CLONTECH). La secuencia de ADN que codifica
la Seratina fue inicialmente amplificada usando iniciadores
oligonucleotidos PCR de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Después de la síntesis de cADN, se ligó un adaptador universal a
ambos extremos del cADN. Las secuencias del adaptador universal y
los iniciadores universales AP1 o AP2 fueron escogidos de acuerdo
con las instrucciones del proveedor de dicho juego.
Los iniciadores degenerados han sido sintetizados
con base en el N-terminal próximo de la secuencia de
aminoácidos de la Saratina traducida en forma reversa.
Estos iniciadores 01 y 02 han sido diseñados para
hibridar específicamente el extremo 5' del cADN de la Saratina. El
diseño del iniciador se basó en la secuencia de los aminoácidos
traducida en forma reversa de los ocho aminoácidos
N-terminales determinados experimentalmente de la
proteína purificada Saratina. Los dos iniciadores, 01 y 02, fueron
sintetizados para mantener la degeneración tan baja como sea posible
y para darle a los iniciadores en el extremo crítico 3' una
extensión de 8 pares de bases acopladas perfectamente con la
secuencia cADN de la Saratina, con miras a asegurar una
amplificación eficiente y especifica de la plantilla cONA. De
acuerdo con el alfabeto degenerado del ADN (código IUPAC) R = A o G;
M = A o C; Y = C o T; y N = A o G o C o T.
Una reacción PCR 3'-RACE fue
llevada a cabo usando una mezcla del iniciador 01 y del iniciador 02
y un iniciador universal AP1 o AP2. Los productos del PCR fueron
clonados en un vector de clonación TA, pCR2.1 o en un vector pCR
Script SK(+) y secuenciado. Después de secuenciar varios de los
fragmentos PCR 3'-RACE obtenidos, se obtuvo la
secuencia del gen de la Saratina, con excepción de la región no
traducida 5', la secuencia del péptido señal y la secuencia de
codificación para los primeros 8 aminoácidos del
N-terminal de la proteína madura. Con miras a
obtener esta información perdida de la secuencia cADN de la
Saratina, se llevo a cabo un experimento 5'-RACE
usando un iniciador específico del gen de la mitad del cADN de la
Saratina y uno de los iniciadores universales AP1 o AP2. Después de
secuenciar varios de los fragmentos PCR 5'-RACE
resultantes, se obtuvo la secuencia completa del gen de la Saratina.
La amplificación del gen de la Saratina por PCR usando un gen
específico, iniciadores no degenerados de ambos extremos 3' y 5' del
gen de la Saratina, dio como resultado la longitud total del gen de
la Saratina.
La secuenciación del ADN fue realizada con más de
15 diferentes clones PCR. Sin embargo, solamente se encontró un
cambio significativo que causó un cambio en la secuencia de amino
ácidos en un clon solamente. Es muy probable que este cambio fuera
causado por la PCR. Se encontraron otros cinco cambios silenciosos
que no causan cambio en la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto,
es improbable que estos cambios fueran causados por la PCR, ya que
los mismos cambios fueron encontrados en diferentes clones.
El gen ORF de la Saratina es 372bp y contiene una
secuencia señal de 21 aminoácidos y una secuencia de 103 aminoácidos
que codifican a la proteína madura. La secuencia de aminoácidos
deducida a partir del clon PCR se encontró que es idéntica a la
secuencia obtenida por secuenciación de la proteína derivada de la
saliva natural.
Con miras a expresar el gen de la Saratina en
células de mamíferos tales como COS o CHO, el gen de la Saratina fue
cortado del vector pCR Script SK(+) usando Xhol+Xbal y clonado
dentro del vector pCl-neo (Promega) de expresión de
las células del mamífero. Se escogió a pCl-neo
porque contiene a los promotores T7 y T3 para la expresión in
vitro y el gen resistente a la neomicina para la selección G418,
y puede ser usado tanto en células COS como CHO.
Además de la secuencia de la señal y la secuencia
de la proteína madura, el inserto contiene una secuencia Koz. En el
extremo 5' para una traducción eficiente y el
his-tac MRGS(H)_{6} en el extremo 3'
(C-Terminal) para la detección de la proteína,
purificación y concentración. La construcción del plásmido fue
llamada pNC-31.
El ADN del plásmido pNC-31fue
usado para la transfección de células COS. Las células COS que
crecieron en fase log fueron lavadas dos veces con PBS y disueltas
en PBS a una concentración 1x10^{7}/ml. Luego se añadieron 12
\mug de ADN plásmido (menos de 50 \mul en H_{2}O o solución
amortiguadora TE) en 0,7-0,8 ml de suspensión de
células COS y se mezclaron en un vaso de electroporación. La
electroporación fue realizada a 1.9 kv, 25 \muFD durante 10
minutos y se transfirió a una placa de 90 mm. Después de añadir 8 ml
de medio DMEM que contenía FCS al 10% y antibióticos, las células
crecieron durante tres días. Los sobrenadantes y las células han
sido usadas para aislamiento adicional de proteína y detección. La
proteína expresada fue detectada por el método Western blotting
usando un anticuerpo
anti-MRGS(H)_{6}. La purificación
fue realizada usando queladores tales como NTA o ácido iminoacético
inmovilizado sobre una matriz de columna y modificado con iones
metálicos tales como Co, Ni o Cu.
Debido al uso del codón variable en diferentes
sistemas biológicos, algunos codones son usados muy raramente en
E. Coli. Con miras a permitir la expresión de una versión
optimizada en E. coli, el gen tuvo que ser convertido a la
usanza del codón E. Coli de acuerdo con los procedimientos
estándar.
La expresión en E. Coli fue realizada
usando una versión modificada del plásmido pASK75, el cual
transporta la región promotora tet. (Skerra, A., y colaboradores.
Gene, 1994, 151, 131-135). En resumen: la
modificación se hizo por clonación de un nuevo enlazador entre Xbal
y los sitios Hind III (Figura 3). El nuevo enlazador contiene la
secuencia la secuencia líder ompA, otro sitio de clonación múltiple
y el marcador 6xHis en vez del marcador strep.
Para construir el vector de expresión para la
Saratina, fue necesario introducir los sitios d restricción 5' Cla I
y 3' Eco47III por el método PCR.
Por lo tanto, se utilizaron el
5'-iniciador03 y el 3'-iniciador04.
El producto PCR fue primero clonado dentro del sistema del vector
PCR II (Invitrogen) y secuenciado.
En una segunda etapa, el gen de la Saratina fue
clonado dentro del vector modificado pASK75 usando los sitios de
restricción 5'Clal y 3'HindIII.
Después de expresar y probar la actividad de esta
Saratina recombinante en una segunda reacción PCR, el marcador His
fue removido, y el codón de inicio del gen de la Saratina fue
directamente fusionado a la secuencia líder ompA. El
5'-iniciador05 y el 3'-iniciador 06
para esta reacción PCR se dan en le listado de secuencias.
Como ejemplo para la expresión en E. Coli
el vector de expresión pRG72 (Figura 3), que contiene el gen
estructural de la Saratina fusionado a la secuencia líder ompA, fue
transformado dentro de las células competentes W3110. Las células
han sido inducidas después de que han crecido hasta la fase
mid-log. Una hora después, la Saratina recombinante
puede ser claramente detectada.
Para la expresión de la Saratina en el sistema de
expresión del Báculo virus, fue usado el
Bac-To-Bac^{TM} Báculo virus
Expresión System The Gibco Life Technologies. Para conseguir un
sistema de selección, la secuencia líder melitina Honeybee fue
fusionada al gen de la Saratina, y para introducir los sitios de
restricción 5' BamHI y 3' Kpnl, fue llevada a cabo una reacción
sencilla PCR usando el 5'-iniciador07 y el
3'-iniciador08. El producto PCR correspondiente fue
clonado dentro del Vector PCR II (Invitrogen) y secuenciado. Después
de que la fusión Melitina-Saratina fue clonada
dentro del vector pFastBac usando los sitios de restricción 5'BamHI
y 3'Kpnl resultando en pTD13 (Figura 4). La generación de báculo
virus recombinantes y la expresión de la Saratina fueron realizadas
con el Bac-To-Bac Expresión System.
El plásmido donor pTD13 fue transformado dentro de las células
competentes DH10Bac que contienen al bacmido con un sitio objetivo
mini-attTn7 y el plásmido colaborador. El elemento
mini-Tn7 sobre el plásmido donor se transpone
alrededor del sitio objetivo mini-attTn7 sobre el
bacmido en presencia de proteínas de transposición proveídas por el
plásmido colaborador. Las colonias que contienen los bacmidos
recombinantes fueron identificadas por interrupción del gen lacZ. El
DNA miniprep de alto peso molecular se prepara a partir de clones
E. coli seleccionados que contienen al bacmido recombinante,
y éste ADN, fueron usados entonces para transfectar células de
insectos. Las descripciones detalladas se incluyen en le manual de
instrucciones del juego de expresión.
En el ensayo de adhesión plaquetaria, la sangre
humana entera es asperjada a través de una cámara de flujo paralelo
para examinar la actividad adhesiva de las plaquetas a un colágeno
recubierto con cubreobjetos bajo condiciones de alto flujo cortante
(condiciones de simulación arterial in vivo) como
describieron originalmente Sakariassen y colaboradores (Meth. Enz.,
1988, 169, 37-70). El colágeno humano de placenta,
tipo III (Sigma), solubilizado en ácido acético 50 mmol/L, fue
rociado sobre cubreobjetos de vidrio limpios (18 mm x 18 mm) con un
aerógrafo de retoque. Los cubreobjetos fueron almacenados en PBS a
4ºC durante la noche.
La sangre humana fresca completa (anticoagulada
con heparina de bajo peso molecular; 20 U/ml) fue precalentada a
37ºC durante 10 minutos antes de ser usada. Las preparaciones de
proteínas de acuerdo con esta invención fueron pipeteadas sobre
cubreobjetos (30 \mul por cubreobjeto) e incubadas durante 10
minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente antes de ser
insertadas dentro de la cámara de perfusión. Ala sangre se le
permitió prefundirse a través de la cámara (a 37ºC durante 5 minutos
con una velocidad de corte de 1300s^{-1}).
Posteriormente, se removieron los cubreobjetos,
se lavaron en PBS y se fijaron en glutaraldehido al 0,25% durante 30
minutos, y después de eso se tiñeron con
May-Grünwald Giemsa. La figura 9 muestra un ejemplo
típico. El recubrimiento extensivo con plaquetas teñidas es visto en
la superficie de control no tratada. Una superficie comparable
pretratada con Saratina muestra un enlazamiento de plaquetas
dramáticamente disminuido (en un 80%). La adhesión plaquetaria fue
cuantificada con un microscopio de luz como se muestra en la Figura
5 (magnificación x 1000) acoplado a un analizador de imágenes
computarizado (Leica). Los resultados fueron expresados como el
porcentaje de la superficie recubierta con plaquetas y agregados
plaquetaruios.
La comparación de la actividad inhibitoria de la
saliva ha sido comparada con la proteína purificada como se
demuestra en la Figura 6. La adhesión plaquetaria sobre colágeno
tipo III recubierto sobre cubreobjetos con una velocidad de corte de
1300 s^{-1} con saliva cruda (#616) produjo una inhibición de
alrededor del 48% comparada con el control. La proteína purificada
((#607; saratina) demostró una reducción en la deposición
plaquetaria de alrededor del 81% en concentraciones estandarizadas
de proteína. La inhibición inducida por la Saratina se incrementa en
una forma que depende de la dosis con concentraciones mayores de
proteína purificada como se demuestra en la Figura 7.
Con el primer lote disponible de proteína natural
altamente purificada, ha sido iniciada la inmunización de animales
inmediatamente. Los sueros inmunes fueron aumentados en los conejos
y los reactivos de título alto estuvieron disponibles para otras
investigaciones. Los antisueros adicionales estuvieron disponibles
cuando la secuencia de péptidos de la proteína completa estuvo
disponible y tres péptidos sintéticos fueron acoplados
sintéticamente (secuencia de aminoácidos 83-103,
13-30, 58-69) a KLH con un
procedimiento enlazador estándar, y usados para inmunización. Se han
establecido tres sueros dirigidos a un segmento de péptido
N-terminal y dos sueros específicos para péptidos
C-terminales. Con los sueros inmunes de título alto
disponibles, ha sido posible establecer y usar la tecnología Elisa
para hacer seguimiento y una purificación cuantitativa de la
proteína purificada naturalmente así como de la proteína
recombinante. Por lo tanto, el consumo de tiempo y el muy intenso
trabajo para el ensayo de inhibición plaquetaria pueden ser
reemplazados y fue realizado únicamente para confirmar el potencial
inhibitorio de la proteína finalmente purificada.
El colágeno acidificado Horm (Nycomed) ha sido
usado para el recubrimiento de placas de microtitulación de 96 pozos
(Nunc). 50 \mul de la solución de colágeno (20 \mug/ml) han sido
usados para recubrir las placas durante la noche. Antes de analizar
las placas, estas han sido lavadas tres veces con PBS e incubadas
con una solución de BSA (1%) con miras a prevenir una adhesión no
específica. 50 \mul de Saratina han sido añadidos en dilución
serial y han sido incubadas durante una hora. Las placas fueron
lavadas tres veces antes de la aplicación del anticuerpo anti
Saratina para la detección: Después de una hora adicional de
nuestra etapa de incubación, el exceso de anticuerpo ha sido
removido y un segundo anticuerpo marcado con biotina ha sido usado
para la detección. La lectura ha sido realizada por medio de una
reacción de color catalizada con estreptavidina-POD,
con sustratos tales como tabletas de ODB (Dako) medidas a 490
nm.
La Saratina recombinante marcada (marcador His)
preparada como se describió en el Ejemplo 7 ha sido comparada con la
Saratina nativa no marcada para el enlazamiento con colágeno. Han
sido preparadas placas recubiertas con colágeno acidificado Horm
(Nycomed) como se describió en el Ejemplo 11. La detección se
realizó con anticuerpos anti Saratina de conejo. Las Saratinas
marcada y no marcada mostraron idénticas propiedades de
enlazamiento. Alternativamente, la versión de la Saratina no marcada
ha sido modificada por biotinilación (Pierce, juego de
biotinilación) y comparada con la Saratina no modificada. Las
propiedades de enlazamiento con el colágeno han sido idénticas. Se
han realizado experimentos adicionales usando la Saratina
biotinilada para competencia cruzada con la Saratina no modificada,
los péptidos, la Saratina derivada de la saliva, la saliva completa
o los anticuerpos dirigidos a la Saratina. El enlazamiento de los
diferentes "competidores" con el colágeno ha sido analizado
estimando el enlazamiento de la Saratina biotinilada, usando un
conjugado de estreptavidina-POD y la reacción del
sustrato de ODB para la detección. Este ensayo que comprende a la
Saratina biotinilada fue típicamente usado para la estimación de la
concentración de Saratina en saliva (750 \mug/l), el mapeo del
epítopo de los anticuerpos dirigidos a la Saratina, la evaluación de
la Saratina bioactiva, la Saratina mutada, y también ha sido usado
con miras a explorar el potencial del ensayo de bloqueo, así como
los anticuerpos no bloqueadores anti Saratina elevados con los
péptidos específicos de la Saratina.
Los sistemas de expresión multicopia del genero
pichia (Invitrogen) han sido usados como un ejemplo típico para
expresión de la levadura. La construcción del vector de expresión de
la levadura se muestra en la Figura 8. Para la generación del vector
de expresión para Saratina se ha usado el método de amplificación
PCR para generar extremos de restricción (5' EcoR I, 3'Not I)
compatibles con la ligación dentro del vector apropiado (pPIC9K). Se
emplearon 5'-iniciador09 y el
3'-iniciador10.
Antes de transformar al Pichia
spheroplasts, el vector de expresión ha sido linearizado con Sal
I. Las colonias han sido investigadas en cuanto a los mutantes
positivos His^{+} Mut^{+} para asegurar la integración del gen
de la Saratina. Las condiciones típicas de crecimiento han sido:
28-30ºC, hasta una densidad óptica de OD
2-6. La inducción de expresión fue realizada después
de resuspender las células centrifugadas en medio y de la adición de
metanol hasta una concentración final de 0,5%, y manteniendo esta
condición por un período extendido de tiempo que típicamente sería
de 24 horas. Después de un período de fermentación típico de 6 días,
el producto fue recuperado del sobrenadante y analizado por
SDS-PAGE y ELISA.
<110> Merck Patent GMBH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína para bloquear la adhesión de
plaquetas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Secuencia de la Saratina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hiduro medicinalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)..(372)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hirudo medicinalis
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador01 degenerado
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgargarmgng argaytgttg gac
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador02 degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgargarmgng argaytgctg gac
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador03
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatcgatgg aagaacgtga agac
\hfill24
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<210> 6
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador04
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptagcgctttt gacgtcgtcg tca
\hfill23
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<210> 7
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador05
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagaatgca aggatgagga ttattg
\hfill26
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<210> 8
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttctag tcttcgtcaa cttcg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador07
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador08
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacctcac atatcttcat caac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador09
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipgcatgcggcc gcctaatctt catcaacttc
\hfill30
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador10
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgaattc gaagaacgtg aagattg
\hfill27
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Claims (21)
1. Un polipéptido aislado de H.
medicinalis que tiene un peso molecular de alrededor de 12000
\pm 1 kD con la actividad biológica de un inhibidor de adhesión
plaquetaria dependiente del colágeno, el cual es al menos 80%
idéntico a la secuencia del aminoácido de la SEQ. ID. No. 2 sobre
toda su longitud.
2. Un polipéptido de la reivindicación 1 que
tiene un punto isoeléctrico de pH 3,7 \pm 0,5.
3. Un polipéptido de la reivindicación 1 o 2 que
tiene seis moléculas de cisteína capaces de formar puentes
-S-S-.
4. Un polipéptido de cualquiera de las
reivindicación 1-3 que consiste de las secuencias de
aminoácidos de la SEQ. ID. No. 2.
5. Un polinucleótido aislado que codifica a un
polipéptido de la reivindicación 1-4.
6. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de ADN de la SEQ. ID. No. 2, o una secuencia de ADN
complementaria de dicha secuencia de ADN, en donde dicho
polinucleótido está codificando a un polipéptido de la
reivindicación 1-4.
7. El polinucleótido de la reivindicación 6, en
donde dicho polinucleótido comprende una secuencia de ADN que es al
menos 80% idéntica a aquella de la SEQ. ID. No. 1 sobre toda su
longitud.
8. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de ADN de las reivindicaciones 6-7.
9. Una célula hospedadora que comprende al vector
de expresión de la reivindicación 8.
10. Un sistema de expresión que comprende a una
célula hospedadora de la reivindicación 9.
11. Un proceso para producir un polipéptido de
las reivindicaciones 1-4 que comprende un hospedador
de la reivindicación 10 cultivando a dicho hospedador bajo
condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y
recuperar al polipéptido del sobrenadante del cultivo o del residuo
de la célula.
12. Un anticuerpo inmunoespecífico para un
polipéptido seleccionado de la SEQ ID. No. 2.
13. Una formulación farmacéutica la cual
comprende un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones
1-4, y un portador farmacéuticamente aceptable o
excipiente de la misma.
14. Un agente farmacéuticamente activo de la
reivindicación 13 para el tratamiento de procesos
tromboembólicos.
15. Una formulación farmacéutica de las
reivindicaciones 13 ó 14 que comprende drogas adicionales, en donde
la droga adicional se selecciona de aspirina, heparina o
estreptoquinasa o una combinación de las mismas.
16. El uso de un polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas.
17. El uso de un polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 para el recubrimiento ex
vivo de las superficies artificiales.
18. El uso de un polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 para la modificación ex
vivo de lentes intraoculares con miras a disminuir la
trombogenicidad del material del lente.
19. El uso de un polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 para el recubrimiento ex
vivo de la superficie de la lente.
20. El uso de un polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 para el entrecruzamiento
covalente ex vivo para modificar dicho material de la
lente.
21. El uso de anticuerpos de acuerdo con la
reivindicación 12 y de un polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 para medir ex vivo el
polipéptido derivado de la reivindicación 11 o a un sujeto
tratado.
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