EA033565B1 - Композиции и способы, предназначенные для минимизации синтеза норникотина в растениях табака - Google Patents

Композиции и способы, предназначенные для минимизации синтеза норникотина в растениях табака Download PDF

Info

Publication number
EA033565B1
EA033565B1 EA201201004A EA201201004A EA033565B1 EA 033565 B1 EA033565 B1 EA 033565B1 EA 201201004 A EA201201004 A EA 201201004A EA 201201004 A EA201201004 A EA 201201004A EA 033565 B1 EA033565 B1 EA 033565B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
plant
seq
tobacco
nicotine demethylase
amino acid
Prior art date
Application number
EA201201004A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201201004A1 (ru
Inventor
Ralph E Dewey
Ramsey S Lewis
Original Assignee
Univ North Carolina State
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ North Carolina State filed Critical Univ North Carolina State
Publication of EA201201004A1 publication Critical patent/EA201201004A1/ru
Publication of EA033565B1 publication Critical patent/EA033565B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/823—Nicotiana, e.g. tobacco
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
    • A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
    • A24B13/00—Tobacco for pipes, for cigars, e.g. cigar inserts, or for cigarettes; Chewing tobacco; Snuff
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

В изобретении представлены композиции и способы снижения уровня норникотина и N'-нитрозонорникотина (NNN) в растениях и частях растений табака. Композиции содержат выделенные полинуклеотиды и полипептиды специфических для корня никотиндеметилаз, CYP82E10, и их вариантов, которые принимают участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в этих растениях. Композиции, предлагаемые в изобретении, включают также растения или части растения табака, которые содержат мутацию в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E10, при этом мутация приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилазы CYP82E10. В изобретении описаны также семена указанных растений табака или их потомство и табачные изделия, полученные из растений табака, предлагаемых в изобретении, или из частей растений или их потомства. В изобретении описаны также способы уменьшения уровня норникотина или снижения уровня превращения никотина в норникотин в растении или части растения табака. Способы заключаются в том, что интродуцируют в геном растения табака мутацию по меньшей мере в один аллель каждого из по меньшей мере трех генов никотиндеметилаз, при этом мутация снижает экспрессию гена никотиндеметилазы и при этом первый из указанных генов никотиндеметилаз кодирует специфическую для корня никотиндеметилазу, участвующую в метаболическом превращении никотина в норникотин в растении или частях растения табака. Способы находят применение в производстве табачных изделий, имеющих пониженные уровни норникотина и его онкогенного метаболита NNN, снижая тем самым онкогенный потенциал для индивидуумов, которые потребляют указанные табачные изделия или подвергаются воздействию вторичного дыма, образующегося из указанных изделий.

Description

Информация о включении перечня последовательностей
Официальная копия перечня последовательностей предоставляется через EFS-Web в виде электронной версии перечня последовательностей в формате ASCII (американский стандартный код обмена информацией), файл обозначен как 13521766SeqListReplacement.txt, он создан 20 января 2015 г., имеет размер 150 кБ и зарегистрирован одновременно с описанием изобретения для замены. Перечень последовательностей, входящий в указанный документ в формате ASCII, представляет собой часть описания изобретения и полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, предназначенным для минимизации синтеза норникотина и, следовательно, его метаболита N'-нитрозонорникотина, в растениях и частях растений табака, прежде всего к композициям и способам, предназначенным для ингибирования экспрессии или функции специфической для корня никотиндеметилазы в сочетании с никотиндеметилазой зеленых листьев и индуцированной старением никотиндеметилазой.
Предпосылки создания изобретения
Преобладающим алкалоидом, присутствующим в коммерческих сортах табака, является никотин, на долю которого, как правило, приходится 90-95% от общего пула алкалоидов. Остальная часть алкалоидной фракции состоит в основном из трех дополнительных пиридиновых алкалоидов: норникотина, анабазина и анатабина. Норникотин образуется непосредственно из никотина в результате активности фермента никотин-Ы-деметилазы. На долю норникотина, как правило, приходится менее 5% от общего пула пиридиновых алкалоидов, но в результате процесса, который называют превращением (конверсией), растения табака, в которых первоначально продуцируются очень небольшие количества норникотина, дают потомство, в котором происходит метаболическое превращение большого процента присутствующего в листьях никотина в норникотин. В растениях табака, которых подвергали генетическому превращению (обозначены как конвертеры) основная часть производства норникотина имеет место в процессе старения и сушки зрелых листьев (томление) (Wernsman и Matzinger, Tob. Sci. 12, 1968, c. 226228). Табак сорта Бёрли особенно подвержен генетическому превращению, уровень которого для некоторых культиваров достигает 20% на поколение.
В процессе сушки и переработки листьев табака часть норникотина в результате метаболизма превращается в такое соединение, как N-нитрозонорникотин (NNN), специфический для табака нитрозамин (TSNA), который, как было установлено в опытах на лабораторных животных, является канцерогенным (Hecht и Hoffmann, Cancer Surveys 8, 1990, c. 273-294; Hoffmann и др., J. Toxicol. Environ. Health 41, 1994, c. 1-52; Hecht, Chem. Res. Toxicol. 11, 1998, c. 559-603). Было установлено, что при трубоогневой сушке табака TSNA формируются главным образом в результате взаимодействия алкалоидов с очень небольшими количествами оксидов азота, которые присутствуют в газообразных продуктах сгорания, образующихся в системах прямого огневого нагрева, используемых в традиционных сушильных амбарах (Peele и Gentry, Formation of Tobacco-specific Nitrosamines in Flue-cured Tobacco, CORESTA Meeting, Agro-Phyto Groups, Сучжоу, Китай, 1999). Переоснащение этих сушильных амбаров теплообменниками фактически устраняет смешение газообразных продуктов сгорания с воздухом, применяемым для сушки, и резко снижает образование TSNA в листьях табака, которые подвергали сушке таким образом (Boyette и Hamm, Rec. Adv. Tob. Sci. 27, 2001, c. 17-22.). В противоположность этому, в подвергаемом воздушной сушке табаке сорта Бёрли образование TSNA происходит, прежде всего, в результате взаимодействия алкалоидов табака с нитритом, этот процесс катализируется живущими в листьях микроорганизмами (Bush и др., Rec. Adv. Tob. Sci. 27, 2001, c. 23-46). В результате попытки снижать уровень TSNA посредством модификации условий сушки с сохранением при этом соответствия стандартам качества оказались безуспешными для табака, подвергаемого воздушной сушке.
Результаты современных исследований позволяют предположить, что норникотин, присутствующий в табачных изделиях, помимо того, что он служит в качестве предшественника NNN, может оказывать дополнительные нежелательные воздействия на здоровье. Dickerson и Janda (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, c. 15084-15088) продемонстрировали, что норникотин вызывает неправильную гликацию белков в клетке.
Обнаружено, что в плазме курильщиков концентрации модифицированных норникотином белков являются существенно более высокими по сравнению с плазмой некурящих. В этом же исследовании установлено, что норникотин может ковалентно модифицировать обычно назначаемые стероидные лекарственные средства, такие как преднизон. Указанные модификации могут изменять как эффективность, так и токсичность указанных лекарственных средств. Кроме того, опубликованы результаты исследований, в которых установлена связь норникотина, присутствующего в табачных изделиях, с возрастной дегенерацией желтого пятна, врожденными дефектами и болезнью периодонта (Brogan и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, c. 10433-10438; Katz и др., J. Periodontal. 76, 2005, c. 1171-1174).
В табаке сорта Бёрли обнаружена положительная корреляция между содержанием норникотина в листьях и количеством NNN, накапливаемом в высушенном продукте (Bush и др., Rec. Adv. Tob. Sci, 27, 2001, c. 23-46; Shi и др., Tob. Chem. Res. Conf. 54, реферат 27, 2000). Таким образом, стратегии, обеспечивающие эффективное снижение содержания норникотина в листьях, могут не только сами по себе спо
- 1 033565 собствовать снижению потенциальных негативных воздействий норникотина на состояние здоровья, что описано выше, но также могут параллельно снижать уровни NNN. Указанная корреляция нашла дополнительное подтверждение в современном исследовании Lewis и др., Plant Biotech. J. 6, 2008, c. 346-354, в котором продемонстрировано, что снижение уровней норникотина с использованием трансгенной конструкции для РНК| (РНК-интерференция), мишенью которой является ген CYP82E4v2, кодирующий индуцируемую старением никотиндеметилазу, приводит к сопутствующему снижению содержания NNN в высушенном листе. Хотя в указанном исследовании продемонстрировано, что для значительного снижения содержания норникотина и NNN в табаке можно применять трансгенные технологии, сочетание проблем, связанных с общественным мнением и интеллектуальной собственностью, очень затрудняет их применения для коммерциализации продуктов, полученных из трансгенных растений.
Таким образом, существует выраженная потребность в способах эффективной минимизации накопления норникотина в табаке, которая не основана на применении трансгенов.
Краткое изложение сущности изобретения
Предложены композиции и способы, предназначенные для минимизации содержания норникотина в растениях и частях растений табака. Композиции содержат выделенный специфический для корней полинуклеотид цитохрома Р450, обозначенный как полинуклеотид CYP82E10, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1, и кодируемый им полипептид никотиндеметилазы CYP82E10, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, и его варианты и фрагменты, включая (но не ограничиваясь только ими) полипептиды, которые имеют последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5-12 или 13, а также полинуклеотиды, которые кодируют полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 5-12 или 13. Полипептид CYP82E10, предлагаемый в изобретении, представляет собой никотиндеметилазу, которая принимает участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в корнях растений табака. Выделенные полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении, включают также полинуклеотиды, которые содержат последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или 4, и ее варианты и фрагменты. Композиции, предлагаемые в изобретении, включают также растения или части растений табака, которые имеют мутацию в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E10, при этом мутация приводит к снижению экспрессии или функции никотиндеметилазы CYP82E10. В некоторых вариантах осуществления изобретения растения табака, предлагаемые в изобретении, содержат также мутацию в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E4, и/или мутацию в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E5, при этом мутация в этих генах приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилазы CYP82E4 или CYP82E5. Изобретение относится также к семенному материалу этих растений табака или их потомству и к табачным изделиям, приготовленным из растений табака, предлагаемых в изобретении, или из частей этих растений или их потомства.
Предложены также способы снижения уровня норникотина или снижения уровня превращения никотина в норникотин в растении или частях растения табака. Способы заключаются в том, что интродуцируют в геном растения табака мутацию по меньшей мере в один аллель каждого из по меньшей трех генов никотиндеметилазы, где мутация снижает уровень экспрессии гена никотиндеметилазы, и где первый из этих генов никотиндеметилазы кодирует специфическую для корня никотиндеметилазу, которая участвует в метаболическом превращении никотина в норникотин в растениях или частях растений табака. В некоторых вариантах осуществления изобретения специфическая для корня никотиндеметилаза представляет собой CYP82E10 или ее вариант. В других вариантах осуществления изобретения способы заключаются в том, что интродуцируют в геном растения табака мутацию по меньшей мере в один аллель гена никотиндеметилазы, который кодирует CYP82E10 или ее вариант, и мутацию по меньшей мере в один аллель гена никотиндеметилазы, который кодирует CYP82E4 или ее вариант, и/или гена никотиндеметилазы, который кодирует CYP82E5 или ее вариант. Описаны также способы идентификации растения табака с низкими уровнями норникотина, в которых растения или часть растения подвергают скринингу в отношении присутствия мутации в гене, который кодирует CYP82E10 или ее вариант, индивидуально или в сочетании со скринингом в отношении присутствия мутации в гене, который кодирует CYP82E4 или ее вариант, и/или присутствия мутации в гене, который кодирует CYP82E5 или ее вариант.
Под объем изобретения подпадают следующие варианты осуществления.
1. Растение или часть растения табака, содержащее/содержащая мутацию в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E10, где указанная мутация приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилазы CYP82E10.
2. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 1, где никотиндеметилаза CYP82E10 имеет последовательность, выбранную из группы, которая включает последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2, 5-8 и 9.
3. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 1 или 2, где мутация приводит к модификации никотиндеметилазы CYP82E10 в положении, выбранном из группы, включающей аминокислотные остатки 79, 107, 381, 419 и любую их комбинацию, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 2.
4. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 3, где мутация выбрана из группы, включающей:
- 2 033565
а) замену остатком серина остатка глицина в положении 79;
б) замену остатком серина остатка пролина в положении 107;
в) замену остатком серина остатка пролина в положении 381;
г) замену остатком серина остатка пролина в положении 419; и
д) любую их комбинацию.
5. Растение или часть растения табака по одному из вариантов осуществления изобретения 1-4, которое/которая дополнительно содержит мутацию в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E4, где указанная мутация приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилазы CYP82E4.
6. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 5, где последовательность никотиндеметилазы CYP82E4 выбрана из группы, которая включает последовательности, представленные в SEQ ID NO: 14-19 и 20.
7. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 5 или 6, где мутация приводит к модификации никотиндеметилазы CYP82E4 в положении, выбранном из группы, включающей аминокислотные остатки 329, 364, 376, 381 и 458, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 14.
8. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 7, где мутация выбрана из группы, включающей:
а) замену стоп-кодоном остатка триптофана в положении 329;
б) замену остатком аспарагина остатка лизина в положении 364;
в) замену остатком метионина остатка валина в положении 376;
г) замену остатком серина остатка пролина в положении 381;
д) замену остатком серина остатка пролина в положении 458; и
е) любую их комбинацию.
9. Растение или часть растения табака по одному из вариантов осуществления изобретения 1-8, которое/которая дополнительно содержит мутацию в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E5, где указанная мутация приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилазы CYP82E5.
10. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 9, где последовательность никотиндеметилазы CYP82E5 выбрана из группы, которая включает последовательности, представленные в SEQ ID NO: 26-31 и 32.
11. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 9 или 10, где мутация приводит к модификации никотиндеметилазы CYP82E5 в положении, выбранном из группы, включающей аминокислотные остатки 422 и 449, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 26.
12. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 11, где мутация выбрана из группы, включающей:
а) замену стоп-кодоном остатка триптофана в положении 422;
б) замену остатком лейцина остатка пролина в положении 449; и
в) любую их комбинацию.
13. Растение или часть растения табака по одному из вариантов осуществления изобретения 9-12, которое/которая содержит мутацию в гене никотиндеметилазы CYP82E10 и гене никотиндеметилазы CYP82E4.
14. Растение или часть растения табака по одному из вариантов осуществления изобретения 1-13, где растение или часть растения табака является гомозиготным/гомозиготной по указанной мутации.
15. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 14, где никотиндеметилаза CYP82E10 содержит мутацию в положении 381, никотиндеметилаза CYP82E4 сдержит мутацию в положении 329 и никотиндеметилаза CYP82E5 содержит мутацию в положении 422, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 2, 14 и 26 соответственно.
16. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 15, где мутация выбрана из группы, включающей:
а) замену остатком серина остатка пролина в положении 381;
б) замену стоп-кодоном остатка триптофана в положении 329;
в) замену стоп-кодоном остатка триптофана в положении 422; и
г) любую их комбинацию.
17. Растение или часть растения табака по одному из вариантов осуществления изобретения 13-16, где в растении или его части превращается в норникотин меньше 1,5% никотина.
18. Растение или часть растения табака по варианту осуществления изобретения 17, где в растении или его части превращается в норникотин не более 0,5% никотина.
19. Семя растения табака по одному из вариантов осуществления изобретения 1-18 или его потомство.
20. Табачное изделие, изготовленное из растения или части растения табака или его потомства по одному из вариантов осуществления изобретения 1-19.
21. Способ снижения онкогенного потенциала табачного изделия, заключающийся в том, что приготавливают табачное изделие из растения или части растения табака или его потомства по одному из вариантов осуществления изобретения 1-18.
- 3 033565
22. Способ снижения уровня норникотина или снижения уровня превращения никотина в норникотин в растении табака или части растения табака, заключающийся в том, что интродуцируют в геном растения мутацию по меньшей мере в один аллель каждого из по меньше мере трех генов никотиндеметилазы, где мутация снижает экспрессию указанного гена никотиндеметилазы и где первый из указанных генов никотиндеметилазы кодирует специфическую для корня никотиндеметилазу, которая участвует в метаболическом превращении никотина в норникотин в растении или части растения табака.
23. Способ по варианту осуществления изобретения 22, в котором специфическая для корня никотиндеметилаза представляет собой никотиндеметилазу CYP82E10, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
а) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 5-9 или 10; и
б) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 5-9 или 10.
24. Способ по варианту осуществления изобретения 23, в котором аминокислотная последовательность никотиндеметилазы CYP82E10 имеет замену аминокислотного остатка в положении, выбранном из группы, включающей остатки 79, 107, 381, 419 и любую их комбинацию, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 2.
25. Способ по варианту осуществления изобретения 24, в котором замена в положении 79, 107, 381 или 419 представляет собой замену на остаток серина.
26. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 22-25, в котором второй из указанных генов никотиндеметилазы кодирует никотиндеметилазу CYP82E4.
27. Способ по варианту осуществления изобретения 26, в котором никотиндеметилаза CYP82E4 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
а) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21; и
б) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21.
28. Способ по варианту осуществления изобретения 27, в котором аминокислотная последовательность никотиндеметилазы CYP82E4 имеет замену аминокислотного остатка в положении, выбранном из группы, включающей остатки 329, 364, 381, 458 и любую их комбинацию, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 14.
29. Способ по варианту осуществления изобретения 28, в котором замена представляет собой замену в положении 329 на стоп-кодон, замену в положении 364 на остаток аспарагина, замену в положении 381 на остаток серина, замену в положении 458 на остаток серина или любую их комбинацию.
30. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 22-29, в котором третий из указанных генов никотиндеметилазы кодирует никотиндеметилазу CYP82E5.
31. Способ по варианту осуществления изобретения 30, в котором никотиндеметилаза CYP82E5 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
а) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26-31 или 32; и
б) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 26-31 или 32.
32. Способ по варианту осуществления изобретения 31, в котором аминокислотная последовательность никотиндеметилазы CYP82E5 имеет замену аминокислотного остатка в положении, выбранном из группы, включающей остатки 422 и 449 и любую их комбинацию, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 26.
33. Способ по варианту осуществления изобретения 32, в котором замена представляет собой замену в положении 422 на стоп-кодон, замену в положении 449 на остаток лейцина или любую их комбинацию.
34. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 22-33, в котором растение или часть растения табака является гомозиготным по указанной мутации.
35. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 22-34, в котором интродукция предусматривает применение протокола селекции.
36. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 22-35, в котором растение представляет собой растение табака сорта Бёрли, Вирджиния, растение табака, предназначенное для сушки на пару, воздушной сушки, огневой сушки, растение сорта Ориентальный (восточный) или растение, из которого получают темный сорт табака.
37. Растение или часть растения табака по одному из вариантов осуществления изобретения 1-18, где растение представляет собой растение табака сорта Бёрли, Вирджиния, растение табака, предназначенное для сушки на пару, воздушной сушки, огневой сушки, растение сорта Ориентальный (восточный) или растение, из которого получают темный сорт табака.
38. Способ идентификации растения табака с низкими уровнями норникотина, заключающийся в том, что подвергают скринингу образец ДНК из представляющего интерес растения табака в отношении присутствия мутации в SEQ ID NO: 1 или 3.
- 4 033565
39. Способ по варианту осуществления изобретения 38, в котором растение табака не является конвертером.
40. Способ по варианту осуществления изобретения 38 или 39, в котором скрининг осуществляют с использованием последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 3, 35-37 и 38.
41. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 38-40, заключающийся также в том, что подвергают скринингу указанный образец ДНК или другой образец ДНК из представляющего интерес растения табака в отношении присутствия мутации в SEQ ID NO: 14, присутствия мутации в SEQ ID NO: 26 или присутствия мутации в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 26.
42. Выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей:
а) нуклеотидную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 1, 3 или 4;
б) нуклеотидную последовательность, которая содержит фрагмент, состоящий по меньшей мере из 20 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, 3 или 4;
в) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична полной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, где полинуклеотид кодирует полипептид, который принимает участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в растении;
г) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и 5-13, или его фрагмент, содержащий по меньшей мере 115 смежных остатков;
д) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, последовательность которого идентична по меньшей мере на 98% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13; и
е) нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности по одному из предыдущих подпунктов (а)-(д).
43. Выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
а) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13;
б) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13; и
в) аминокислотную последовательность, которая представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13, где фрагмент содержит по меньшей мере 115 смежных остатков аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13.
44. Растение или часть растения табака, гомозиготное/гомозиготная по мутации в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E10, гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E4, и гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E5, где мутация приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилазы CYP82E10, CYP82E4 и CYP82E5, где никотиндеметилаза CYP82E10 содержит мутацию в положении 381, никотиндеметилаза CYP82E4 содержит мутацию в положении 329 и никотиндеметилаза CYP82E5 содержит мутацию в положении 422, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 2, 14 и 26 соответственно.
45. Мутация в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E10, где мутация приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилазы CYPe2E10.
46. Растение, имеющее мутацию в гене CYP82E10, которая ингибирует активность никотиндеметилазы в корнях, мутацию в гене CYP82E4v2, которая ингибирует активность никотиндеметилазы в стареющих листьях, и мутацию в гене CYP83E5, которая ингибирует активность никотиндеметилазы в зеленых листьях.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1А-1В - последовательности ДНК (SEQ ID NO: 4) и предсказанные белковые последовательности гена никотиндеметилазы CYP82E10. Кодирующие белок последовательности обозначены прописными буквами, а 5'- и 3'-фланкирующие последовательности обозначены строчными буквами. Интронная последовательность (SEQ ID NO: 3) обозначена строчными буквами и выделена курсивом. Номера нуклеотидных последовательностей представлены слева, а номера белковых последовательностей представлены справа. Нуклеотидные последовательности, соответствующие ПЦР-праймерам, применяемым для специфической амплификации экзона 1 при скрининге мутаций, подчеркнуты (не выделены жирным шрифтом), а подчеркнутые последовательности, которые выделены жирным шрифтом, обозначают сайты специфических для экзона 2 праймеров. Индивидуальные нуклеотиды и аминокислотные остатки, которые, как установлено с помощью скрининга мутаций (табл. 2), можно изменять, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 2А-2В - сравнительный анализ первичной структуры геномных последовательностей CYP82E10 (SEQ ID NO: 4), CYP82E5v2 (SEQ ID NO: 38) и CYP82E4v2 (SEQ ID NO: 37). Кодирующие белок последовательности обозначены прописными буквами; 5'- и 3'-нетранслируемые области обозначены строчными буквами; а интронные последовательности обозначены строчными буквами и курсивом. Идентичные положения в последовательностях обозначены затемненными прямоугольниками;
- 5 033565 на фиг. 3 - данные, полученные с помощью тонкослойной хроматографии, об активности никонтиндеметилазы микросомальных мембран из клеток дрожжей, которые экспрессируют CYP82E10 и несущую мутацию Ser381Pro (S381P) CYP82E10, которая получена из растения 1041. СРМ обозначает число импульсов в минуту;
на фиг. 4А и 4Б - средний процент превращения никотина в растениях табака сорта Бёрли, несущих различные комбинации мутаций в локусах CYP82E4v2, CYP82E5v2 и CYP82E10. Средние значения, обозначенные различными буквами, обозначают достоверные различия с уровнем Р < 0,05.
Описание последовательностей, входящих в перечень последовательностей
Ниже представлена информация о последовательностях, входящих в перечень последовательностей. Использовали стандартное обозначение аминокислотных замен. Так, например, CYP82E10 P419S обозначает вариант белка, в котором остаток пролина заменен на остаток серина в положении 419, где нумерация соответствует последовательности дикого типа, в данном случае последовательности CYP82E10, которая представлена в SEQ ID NO: 2. В качестве другого примера: CYP82E4 P38L обозначает вариант белка, в котором остаток пролина заменен на остаток лейцина в положении 38, где нумерация соответствует последовательности дикого типа, в данном случае последовательности CYP82E4, которая представлена в SEQ ID NO: 14. И в качестве еще одного примера: CYP82E5 P72L обозначает вариант белка, в котором остаток пролина заменен на остаток лейцина в положении 72, где нумерация соответствует последовательности дикого типа, в данном случае последовательности CYP82E5, которая представлена в SEQ ID NO: 26.
SEQ ID NO: 1 соответствует кодирующей последовательности CYP82E10.
SEQ ID NO: 2 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10.
SEQ ID NO: 3 соответствует нуклеотидной последовательности интрона CYP82E10.
SEQ ID NO: 4 соответствует геномной последовательности CYP82E10.
SEQ ID NO: 5 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 L148F.
SEQ ID NO: 6 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 G172R.
SEQ ID NO: 7 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 A344T.
SEQ ID NO: 8 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 A410T.
SEQ ID NO: 9 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 R417H.
SEQ ID NO: 10 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 P419S.
SEQ ID NO: 11 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 G79S.
SEQ ID NO: 12 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 P107S.
SEQ ID NO: 13 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E10 P381S.
SEQ ID NO: 14 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4.
SEQ ID NO: 15 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 P38L.
SEQ ID NO: 16 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 D171N.
SEQ ID NO: 17 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 E201K.
SEQ ID NO: 18 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 R169Q.
SEQ ID NO: 19 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 G459R.
SEQ ID NO: 20 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 T427I.
SEQ ID NO: 21 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 V376M.
SEQ ID NO: 22 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 W329Stop.
SEQ ID NO: 23 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 K364N.
SEQ ID NO: 24 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 P381S.
SEQ ID NO: 25 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E4 P458S.
SEQ ID NO: 26 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5.
SEQ ID NO: 27 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 P72L.
SEQ ID NO: 28 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 L143F.
SEQ ID NO: 29 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 S174L.
SEQ ID NO: 30 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 M224I.
SEQ ID NO: 31 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 P235S.
SEQ ID NO: 32 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 A410V.
SEQ ID NO: 33 s соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 W422Stop.
SEQ ID NO: 34 соответствует аминокислотной последовательности CYP82E5 P449L.
SEQ ID NO: 35 соответствует последовательности прямого праймера экзона 1 CYP82E10.
SEQ ID NO: 36 соответствует последовательности обратного праймера экзона 1 CYP82E10.
SEQ ID NO: 37 соответствует последовательности прямого праймера экзона 2 CYP82E10.
SEQ ID NO: 37 соответствует последовательности обратного праймера экзона 2 CYP82E10.
SEQ ID NO: 38 соответствует геномной последовательности CYP82E4v2.
SEQ ID NO: 39 соответствует геномной последовательности CYP82E5v2.
Определения
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, предназначенным для ингибирования экспрессии или функции специфических для корня полипептидов никотиндеметилазы, которая при
- 6 033565 нимает участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в корнях растения, прежде всего растений рода Nicotiana, включая растения табака различных коммерческих сортов.
В контексте настоящего описания понятия ингибировать, ингибирование, ингибирующий относятся к снижению экспрессии или функции представляющего интерес генного продукта (т.е. генного продукта-мишени), в данном случае никотиндеметилазы, такой как специфическая для корня никотиндеметилаза, предлагаемая в изобретении, что оценивают с помощью любого метода, известного в данной области, или представленного в настоящем описании. Установлено, что полипептиды никотиндеметилазы можно ингибировать с помощью любого приемлемого метода, известного в данной области, включая смысловое и антисмысловое подавление, подавление на основе РНЮ, подходы, предусматривающие выключение, такие как мутагенез, и т.п. Наиболее предпочтительными являются методы, приводящие к выключению или частичному подавлению (замалчиванию) экспрессии и/или функции указанных специфических для корня никотиндеметилаз, прежде всего подходы на основе мутагенеза, которые позволяют осуществлять селекцию в отношении предпочтительных мутаций в гене CYP82E10 никотиндеметилазы.
Под предпочтительной мутацией подразумевают мутацию, которая приводит к замене, инсерции, делеции или укорочению полипептида CYP82E10, в результате чего ингибируется его никотиндеметилазная активность. В некоторых вариантах осуществления изобретения никотиндеметилазная активность ингибируется по меньшей мере на 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60% по сравнению с активностью полипептида CYP82E10 дикого типа в одинаковых условиях тестирования. В других вариантах осуществления изобретения никотиндеметилазная активность ингибируется по меньшей мере на 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95%. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения предпочтительная мутация обеспечивает полное ингибирование (т.е. 100%-ное ингибирование), и никотиндеметилазная активность является выключенной (т.е. уровень активности находится ниже предела измерения).
Ингибирование можно рассматривать с позиций сравнения между двумя растениями, например, генетически измененного растения и растения дикого типа. Можно осуществлять сравнение между растениями, например, растением дикого типа и растением, в котором отсутствует последовательность ДНК, обладающая способностью продуцировать специфическую для корня никотиндеметилазу, которая превращать никотин в норникотин. Ингибирование экспрессии или функции генного продукта-мишени можно рассматривать также с позиций сравнения между растительными клетками, органеллами, органами, тканями или частями растения, присутствующими в одном и том же растении, или между различными растениями, и это понятие включает сравнение между стадиями развития или ограниченными временем стадиями развития одного и того же растения или части растения или между растениями или частями растений.
Ингибирование может включать любое относительное уменьшение функции или производства представляющего интерес генного продукта, в данном случае специфической для корня никотиндеметилазы, вплоть до и включительно полного элиминирования функции или производства указанного генного продукта. При сравнении уровней генного продукта указанное сравнение предпочтительно осуществляют между организмами со сходным генетическим фоном. Предпочтительно сходный генетический фон представляет собой фон, при котором для организмов характерна идентичность последовательностей ядерного генетического материала, составляющая 50% или более, более предпочтительно 75% или более и еще более предпочтительно 90% или более. Сходный генетический фон представляет собой фон, при котором, если сравниваемые организмы представляют собой растения, растения являются изогенными за исключением любого генетического материала, первоначально интродуцированного с помощью методов трансформации растений или с помощью мутации, созданной благодаря вмешательству человека. Оценку уровня или количества генного продукта можно осуществлять с помощью любого приемлемого метода, примерами которого являются (но не ограничиваясь только ими) сравнение уровней мРНКтранскриптов, уровней белков или пептидов и/или фенотипа, прежде всего касательно превращения никотина в норникотин. В контексте настоящего описания мРНК-транскрипты могут представлять собой процессированные и непроцессированные мРНК-транскрипты, а полипептиды или пептиды могут представлять собой полипептиды или пептиды, которые имеют какую-либо пост-трансляционную модификацию или не имеют ее.
В контексте настоящего описания вариант означает практически сходную последовательность. Вариант может обладать другой функцией или практически сходной функцией с представляющим интерес полипептидом дикого типа. Касательно никотиндеметилазы практически сходная функцию представляет собой функцию, которая по меньшей мере на 99, 98, 97, 95, 90, 85, 80, 75, 60, 50, 25 или 15% соответствует свойственной ферменту дикого типа функции по превращению никотина в норникотин в таких же условиях или в практически изогенной линии. Последовательность CYP82E10 дикого типа представлена в SEQ ID NO: 2. Последовательность CYP82E4 дикого типа представлена в SEQ ID NO: 14. Последовательность CYP82E5 дикого типа представлена в SEQ ID NO: 26. Примеры вариантов CYP82E10 дикого типа, предлагаемые в настоящем изобретении, включают полипептиды, которые содержат последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5-12 или 13. Особенностью варианта, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 10 (CYP82E10 P419S), является наличие предпочти
- 7 033565 тельной мутации, результатом которой является то, что фермент обладает только примерно 25% никотиндеметилазной активности полипептида CYP82E10 дикого типа. Особенностью вариантов, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 11 (CYP82E10 G79S), SEQ ID NO: 12 (CYP82E10 с P107S) и SEQ ID NO: 13 (CYP82E10 с P381S), является наличие предпочтительных мутаций, результатом которых является выключение их никотиндеметилазной активности (т.е. 100% ингибирование, приводящее к получению нефункционального полипептида). Аналогично этому, примерами вариантов CYP82E4 дикого типа являются полипептиды, которые содержат последовательности, представленные в SEQ ID NO: 15-24 или 25. Особенностью варианта, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 21 (CYP82E4 V376M), является наличие предпочтительной мутации, результатом которой является то, что фермент обладает только примерно 50% никотиндеметилазной активности полипептида CYP82E4 дикого типа. Особенностью вариантов, последовательность которых представлена в SEQ ID NO: 22 (CYP82E4 W329Stop), SEQ ID NO: 23 (CYP82E4 K364N), SEQ ID NO: 24 (CYP82E4 P381S) и SEQ ID NO: 25 (CYP82E4 P458S), является наличие предпочтительных мутаций, результатом которых является выключение их никотиндеметилазной активности (т.е. 100% ингибирование). Аналогично этому, примерами вариантов CYP82E5 дикого типа являются полипептиды, которые содержат последовательности, представленные в SEQ ID NO: 27-33 или 34. Особенностью варианта, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 34 (CYP82E5 P449L), является наличие предпочтительной мутации, результатом которой является ингибирование его никотиндеметилазной активности, а особенностью варианта, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 33, является наличие предпочтительной мутации, результатом которой является выключение его никотиндеметилазной активности (т.е. 100% ингибирование).
В контексте настоящего описания вариант полинуклеотида или вариант полипептида означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность не представляет собой последовательность дикого типа.
Вариант может иметь одно/одну добавление, делецию или замену; два или меньшее количество добавлений, делеций или замен; три или меньшее количество добавлений, делеций или замен; четыре или меньшее количество добавлений, делеций или замен; или пять или меньшее количество добавлений, делеций или замен. Мутация может приводить к добавлениям, делециям и заменам. Указанные делеции или добавления могут затрагивать С-конец, N-конец или и С-, и N-концы. Под объем настоящего изобретения подпадают также слитые полипептиды или меченные эпитопом полипептиды. Молчащие мутации нуклеотидов не изменяют кодируемую аминокислоту в данном положении. Аминокислотные замены могут быть консервативными. Консервативная замена представляет собой замену аминокислоты на аминокислоту из такого же семейства аминокислот, что и исходная аминокислота. Семейство определяется боковой цепью индивидуальных аминокислот. Семейство аминокислот может иметь основные, кислотные, незаряженные полярные или неполярные боковые цепи (см. Alberts и др., Molecular biology of the cell, 3-е изд., изд-во Garland Publishing Inc., New York, New York, 1994, c. 56-57), публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). Делеция, замена или добавление может затрагивать аминокислоту другого представителя семейства CYP82E в этом положении. В контексте настоящего описания фрагмент означает часть полинуклеотида или часть полипептида и, следовательно, кодируемого белка.
В контексте настоящего описания понятие часть растения обозначает клетки растения, протопласты растения, культуры тканей, клеток растения, из которых можно регенерировать целое растение, каллусы растения, маточные корневища растения и клетки растения, которые являются интактными в растениях или частях растений, такие как зародыши, пыльца, пыльниковые мешки, семяпочки, семена, листья, цветки, стебли, ветви, плоды, корни, верхушечные корни и т.п. Под объем настоящего изобретения подпадают также потомство, варианты и мутанты регенерированных растений, при условии, что они содержат интродуцированные полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении. В контексте настоящего описания понятие материал растения табака обозначает любую составляющую часть растения или любые комбинации частей растения.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новому гену никотиндеметилазы, CYP82E10 (геномная последовательность представлена в SEQ ID NO: 4), и к кодируемой им никотиндеметилазе CYP82E10 (SEQ ID NO: 2), которая участвует в специфическом для корня превращении никотина в норникотин в корнях растений табака, и к их применению для снижения или минимизации превращения никотина в норникотин и, как следствие, к снижению уровней норникотина в растениях и частях растений табака. Под специфической для корня подразумевается экспрессия, происходящая главным образом в корнях растений табака, в отличие от других органов растения, таких как листья или семена. Путем интродукции отобранных предпочтительных мутаций в указанную специфическую для корня никотиндеметилазу или ее варианты, которые обладают никотиндеметилазной активностью, в сочетании с интродукцией одной или нескольких отобранных предпочтительных мутаций в ген, который кодирует присутствующую в зеленых листьях никотиндеметилазу (например, CYP82E5, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 26) или ее вариант, который обладает никотиндеметилазной активностью, а также в сочетании с
- 8 033565 интродукцией одной или нескольких отобранных предпочтительных мутаций в ген, который кодирует индуцируемую старением никотиндеметилазу (например, CYP82E4, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14) или ее вариант, который обладает никотиндеметилазной активностью, можно получать нетрансгенные растения табака, которые отличаются минимальным превращением никотина в норникотин, в которых уровень превращения составляет менее примерно 1,5%, предпочтительно менее примерно 1%.
Пониженные уровни норникотина в табаке являются очень желательными, поскольку этот алкалоид служит предшественником хорошо известного карциногена N'-нитрозонорникотина (NNN). Два гена, которые кодируют белки, обладающие никотиндеметилазной активностью в табаке, были ранее идентифицированы и обозначены как CYP82E4v2 и CYP82E5v2. Полипептид CYP82E4 (SEQ ID NO: 14) представляет собой индуцируемую старением никотиндеметилазу. Ген CYP82E4v2 (включающий кодирующую и интронную области), его роль в производстве норникотина в растениях табака и методы ингибирования его экспрессии и функции описаны в заявке на патент США № 11/580765, которая опубликована в виде публикации заявки на патент США № 2008/0202541 А1. Полинептид CYP82E5 (SEQ ID NO: 26) представляет собой присутствующую в зеленых листьях никотиндеметилазу (т.е. экспрессия которой главным образом происходит в зеленых листьях). Ген CYP82E4 (включающий кодирующую и интронную области), его роль в производстве норникотина в растениях табака и методы ингибирования его экспрессии и функции описаны в заявке на патент США № 12/269531, которая опубликована в виде публикации заявки на патент США № 2009/0205072 А1. Содержание двух указанных заявок на патент США и соответствующие их публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Однако растения, гомозиготные по предпочтительным мутантным аллелям cyp82e4v2 и cyp82e5v2 (т.е. мутантные аллели, которые обеспечивают замалчивание или выключение экспрессии указанных соответствующих генов никотиндеметилазы), все еще могут метаболизировать более 2% присутствующего в них никотина в норникотин, т.е. приводить к получению уровней норникотина, которые все еще могут приводить к заметному образованию NNN. Открытие гена CYP82E10 никотиндеметилазы представляет собой дополнительный путь минимизации уровня превращения никотина в норникотин в растениях табака и таким образом дополнительного снижения уровней норникотина и, следовательно NNN, в растениях табака и полученных из них растительных материалах. Объединение предпочтительных мутантных аллелей cyp82e10 с предпочтительными мутантными аллелями cyp82e4v2 и cyp82e5v2 позволяет получать растения табака, отличающиеся снижением более чем в 3 раза уровня норникотина по сравнению с растениями табака, которые несут только мутацию cyp82e4v2 или в сочетании с мутацией cyp82e5v2. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения являются гены никотиндеметилазы, гомозиготные по комбинации трех мутантов (cyp82e4v2, cyp82e5v2 и cyp82e10), которые позволяют получать нетрансгенные растения табака, в которых продуцируются очень низкие уровни норникотина по сравнению с уровнями, которые ранее были достигнуты на основе подходов подавления с помощью трансгенов, например, описанных в публикациях заявок на патент США № 2008/0202541 А1 и 2009/0205072 А1.
Полинуклеотиды и полипептиды никотиндеметилаз и их варианты и фрагменты
Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, включают полипептид CYP82E10 и его варианты и фрагменты. Указанные полинуклеотиды и полипептиды никотиндеметилаз участвуют в метаболическом превращении никотина в норникотин в растениях, включая коммерческие сорта растений табака. В частности, композиции, предлагаемые в изобретении, включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, которые представлены в SEQ ID NO: 2 и 5-13, выделенные полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, которые представлены в SEQ ID NO: 1, 3 и 4, и выделенные полинуклеотиды, кодирующие аминокислотные последовательности, которые представлены в SEQ ID NO: 2 и 5-13. Полинуклеотиды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут найти применение для ингибирования экспрессии полипептидов никотиндеметилаз или их вариантов, которые принимают участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в растениях, в частности, в растениях табака. Некоторые полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении, имеют мутации, которые приводят к ингибированию никотиндеметилазной активности никотиндеметилазы дикого типа. Ингибирование полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, эффективно снижает уровни норникотина в линиях табака, при этом конверсия гена встречается у менее чем 30, 50, 70, 90% популяции, такой как предназначенные для сушки на пару сорта табака. Ингибирование полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, эффективно снижает уровни норникотина в популяциях растений табака, в которых конверсия гена встречается по меньшей мере у 90, 80, 70, 60, 50% популяции растений. В популяции предпочтительно присутствует более примерно 25, 50, 100, 500, 1000, 5000 или 25000 растений, при этом более предпочтительно по меньшей мере примерно 10, 25, 50, 75, 95 или 100% растений содержат полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении.
Полинуклеотиды никотиндеметилаз и кодируемые ими полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, включают новый ген цитохрома Р450, обозначенный как ген CYP82E10 никотиндеметилазы, для которого впервые установлена роль в метаболическом превращении никотина в норникотин в корнях растений табака. Трансгенные подходы, такие как смысловое и антисмысловое подавление и по
- 9 033565 давление на основе PHKi, можно применять для частичного подавления экспрессии указанной никотиндеметилазы, таким же образом, как это описано для никотиндеметилаз CYP82E4 и CYP82E5 в публикациях заявок на патент США № 2008/0202541 А1 и № 2009/0205072 А1, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительный подход основан на интродукции одной или нескольких предпочтительных мутаций в указанный ген, поскольку преимуществом этого подхода является получение нетрансгенных растений табака, имеющих пониженные уровни превращения никотина в норникотин и в результате пониженные уровни норникотина и NNN. Указанные подходы включают (но не ограничиваясь только ими) мутагенез и т.п., как это будет описано ниже.
Изобретение относится к композициям, предлагаемым в настоящем изобретении, которые содержат выделенные или практически очищенные полинуклеотиды или белки. Выделенный или очищенный полинуклеотид или белок или их биологически активный фрагмент представляет собой субстанцию, практически или в значительной степени очищенную от компонентов, которые в норме сопутствуют или взаимодействуют с полинуклеотидом или белком в их естественном окружении. Таким образом, выделенный или очищенный полинуклеотид или белок является практически свободным от другого клеточного материала или культуральной среды при получении с помощью методов рекомбинации или практически свободным от химических предшественников или других химических соединений при получении путем химического синтеза. В оптимальном варианте выделенный полинуклеотид свободен от последовательностей (предпочтительно последовательностей, кодирующих белок), которые в естественных условиях фланкируют полинуклеотид (т.е. последовательностей, локализованных на 5'- и 3'-концах полинуклеотида) в геномной ДНК организма, из которого получен полинуклеотид. Например, в различных вариантах осуществления изобретения выделенный полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность длиной менее чем примерно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 т.п.н., которая в естественных условиях фланкирует полинуклеотид в геномной ДНК клетки, из которой получен полинуклеотид. Белок, практически свободный от клеточного материала, включает препараты белка, содержащие загрязняющий белок в количестве менее чем примерно 30, 20, 10, 5 или 1% (в пересчете на сухую массу). Когда белок, предлагаемый в изобретении, или его биологически активный фрагмент получают методом рекомбинации, то предпочтительно культуральная среда содержит химические предшественники или не представляющие интерес небелковые соединения в количестве, составляющем менее чем примерно 30 20, 10, 5 или 1% (в пересчете на сухую массу).
Под объем настоящего изобретения подпадают также фрагменты описанных полинуклеотидов и кодируемых ими полипептидов. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать белковые фрагменты, который сохраняют биологическую активность нативного белка и поэтому участвуют в метаболическом превращении никотина в норникотин в растении. В альтернативном варианте фрагменты полинуклеотида, которые можно применять в качестве зондов для гибридизации или ПЦР-праймеров, как правило, не кодируют белковые фрагменты, сохраняющие биологическую активность. Кроме того, фрагменты описанных нуклеотидных последовательностей включают фрагменты, которые можно собирать в рекомбинантных конструкциях, предназначенных для замалчивания гена с помощью любого метода, известного в данной области, включая (но не ограничиваясь только ими) смысловое подавление/косупрессию, антисмысловое подавление, интерференцию с использованием двухцепочечной РНК (dsPHK), интерференцию с использованием шпилечной РНК и интерференцию с использованием содержащей интрон шпилечной РНК, опосредуемую ампликоном интерференцию, рибозимы и методы с использованием малых интерферирующих РНК или микроРНК, известные в данной области и описанные ниже. Таким образом, в зависимости от требуемой цели фрагменты нуклеотидной последовательности могут состоять из по меньшей мере примерно 20 нуклеотидов, примерно 50 нуклеотидов, примерно 70 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов, примерно 150 нуклеотидов, примерно 200 нуклеотидов, 250 нуклеотидов, 300 нуклеотидов и иметь длину вплоть до длины полноразмерного полинуклеотида, кодирующего белки, предлагаемые в изобретении. В одном из объектов изобретения фрагменты нуклеотидной последовательности могут представлять собой фрагмент, включающий от 100 до примерно 350 нуклеотидов, от 100 до примерно 325 нуклеотидов, от 100 до примерно 300 нуклеотидов, от примерно 125 до примерно 300 нуклеотидов, от примерно 125 до примерно 275 нуклеотидов, от примерно 200 до примерно 320 смежных нуклеотидов, от примерно 200 до примерно 420 смежных нуклеотидов, от примерно 250 до примерно 450 смежных нуклеотидов. В другом варианте осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит от примерно 300 до примерно 450 смежных нуклеотидов.
Фрагмент полинуклеотида никотиндеметилазы, предлагаемый в настоящем изобретении, который кодирует биологически активный фрагмент полипептида CYP82E10, предлагаемого в настоящем изобретении, может кодировать по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 смежных аминокислот, или вплоть до полного количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном полипептиде никотиндеметилазы, предлагаемой в изобретении (например, 517 аминокислот в случае SEQ ID NO: 2 и 5-13). Биологически активный фрагмент полипептида никотиндеметилазы можно получать путем выделения части одного из полинуклеотидов CYP82E10, предлагаемых в настоящем изобретении, экспрессии кодируемого фрагмента полипептида CYP82E10 (например, путем рекомбинантной экспрессии in vitro) и оценки активности кодируемого фрагмента полипептида
- 10 033565
CYP82E10, т.е. способности усиливать превращение никотина в норникотин, с помощью анализов, известных в данной области и представленных ниже в настоящем описании.
Полинуклеотиды, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности CYP82E10, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат по меньшей мере 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650 или 1700 смежных нуклеотидов, или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в полноразмерном полинуклеотиде CYP82E10, представленном в настоящем описании (например, 1551 в случае SEQ ID NO: 1; 2636 в случае SEQ ID NO: 4). Полинуклеотиды, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности CYP82E10, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат фрагменты, содержащие от примерно 20 до примерно 1700 смежных нуклеотидов, от примерно 50 до примерно 1600 смежных нуклеотидов, от примерно 75 до примерно 1500 смежных нуклеотидов, от примерно 100 до примерно 1400 нуклеотидов, от примерно 150 до примерно 1300 смежных нуклеотидов, от примерно 150 до примерно 1200 смежных нуклеотидов, от примерно 175 до примерно 1100 смежных нуклеотидов, от примерно 200 до примерно 1000 смежных нуклеотидов, от примерно 225 до примерно 900 смежных нуклеотидов, от примерно 500 до примерно 1600 смежных нуклеотидов, от примерно 775 до примерно 1700 смежных нуклеотидов, от примерно 1000 до примерно 1700 смежных нуклеотидов, от примерно 300 до примерно 800 смежных нуклеотидов из полинуклеотида CYP82E10, представленного в настоящем описании. В одном из объектов изобретения фрагменты полинуклеотидов содержат полинуклеотидную последовательность, включающую полинуклеотидную последовательность, которая начинается с нуклеотида примерно в положении 700 и простирается примерно до положения 1250 кодирующей последовательности CYP82E10, которая начинается с нуклеотида примерно в положении 700 и простирается примерно до положения 1250 геномной последовательности CYP82E10, которая начинается с нуклеотида примерно в положении 10 и простирается примерно до положения 900 интронной последовательности CYP82E10 или которая начинается с нуклеотида примерно в положении 100 и простирается примерно до положения 800 интронной последовательности CYP82E10.
Под объем настоящего изобретения подпадают также варианты описанных полинуклеотидов и кодируемых ими полипептидов. К встречающимся в естественных условиях вариантам относятся варианты, последовательности которых практически идентичны последовательностям полинуклеотидов и полипептидов CYP82E10, представленных ниже в настоящем описании. В другом варианте осуществления изобретения встречающиеся в естественных условиях варианты функционально практически идентичны полинуклеотидам CYP82E10, представленным в настоящем описании. Композиции и способы, предлагаемые в изобретении, можно применять для целенаправленного воздействия на экспрессию или функцию встречающегося в естественных условиях CYP82E10, последовательность которого практически идентична последовательности описанных полипептидов CYP82E10. Указанные полипептиды CYP82E10 могут обладать соответствующей никотиндеметилазной активностью, т.е. принимать участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в растениях, или не обладать указанной активностью. Такие варианты могут возникать, например, в результате генетического полиморфизма или человеческого воздействия, что имеет место при разведении и селекции, в том числе при использовании основанных на применении мутагенеза подходов. Последовательности биологически активных вариантов белка CYP82E10, предлагаемого в изобретении, например, вариантов полипептида, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 2 и 5-13, должны быть идентичны по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более аминокислотной последовательности белка дикого типа при оценке с помощью программ сравнительного анализа первичной структуры последовательностей и параметров, которые указаны ниже в настоящем описании, и они могут быть охарактеризованы по их функции, включающей участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в растениях, или по отсутствию указанной функции. Биологически активный вариант белка, предлагаемого в изобретении, может отличаться от белка как минимум 1-15 аминокислотными остатками, как минимум 10, как минимум 9, как минимум 8, как минимум 7, как минимум 6, как минимум 5, как минимум 4, как минимум 3, как минимум 2 или как минимум 1 аминокислотным остатком. Биологически неактивный вариант белка, предлагаемого в изобретении, может отличаться от белка как минимум 1-15 аминокислотными остатками, как минимум 10, как минимум 9, как минимум 8, как минимум 7, как минимум 6, как минимум 5, как минимум 4, как минимум 3, как минимум 2 или как минимум 1 аминокислотным остатком.
Варианты конкретного полинуклеотида, предлагаемого в настоящем изобретении, включают встречающиеся в естественных условиях полинуклеотиды, которые кодируют полипептид CYP82E10, принимающий участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в корнях растений. Указанные варианты полинуклеотида могут отличаться делецией и/или добавлением одного или несколько нуклеотидов в одном или нескольких сайтах в нативном полинуклеотиде, представленном в настоящем описании, и/или заменой одного или несколько нуклеотидов в одном или нескольких сайтах в нативном полинуклеотиде. В результате вырожденности генетического кода консервативные варианты полинуклеотидов включают последовательности, которые кодируют аминокислотную последовательность одного из
- 11 033565 полипептидов CYP82E10, предлагаемых в изобретении. Встречающиеся в естественных условиях варианты, такие как указанные выше, можно идентифицировать с помощью хорошо известных методов молекулярной биологии, таких, например, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методы гибридизации, хорошо известные в данной области и представленные в настоящем описании. Варианты полинуклеотидов включают также полученные синтетическим путем полинуклеотиды, например, полученные с помощью сайт-направленного мутагенеза, но последовательности которых все еще являются практически идентичными встречающимся в естественных условиях последовательностям, представленным в настоящем описании, и которые в результате можно применять в способах, предлагаемых в изобретении, предназначенных для ингибирования экспрессии или функции никотиндеметилазы, которая участвует в метаболическом превращении никотина в норникотин, включая полипептиды никотиндеметилазы, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. Как правило, последовательности вариантов конкретного полинуклеотида, предлагаемого в изобретении, например, полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3, или полинуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 и 5-13, должны быть идентичны по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более последовательности конкретного полинуклеотида при оценке с помощью программ сравнительного анализа первичной структуры последовательностей и параметров, которые указаны ниже в настоящем описании.
Варианты конкретного полинуклеотида, предлагаемого в настоящем изобретении (обозначенного также в контексте настоящего описания как референс-полинуклеотид) можно оценивать также путем сравнения идентичности последовательности полипептида, кодируемого референс-полинуклеотидом, и полипептида, кодируемого вариантом полинуклеотида. Процент идентичности между любыми двумя полипептидами можно рассчитывать с использованием программ сравнительного анализа первичной структуры последовательностей и параметров, которые описаны ниже в контексте настоящего описания. Когда любую конкретную пару полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении, оценивают путем сравнения процента идентичности последовательностей, характерного для двух кодируемых ими полипептидов, процент идентичности последовательностей двух кодируемых полипептидов составляет по меньшей мере примерно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более.
Кроме того, полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении, можно применять для выделения соответствующих последовательностей специфических для корня никотиндеметилаз, прежде всего последовательностей CYP82E10, из других представителей рода Nicotiana. ПЦР, гибридизацию и другие аналогичные методы можно применять для идентификации указанных последовательностей на основе гомологии этих последовательностей и последовательностей, представленных в настоящем описании. Под объем настоящего изобретения подпадают последовательности, выделенные на основе идентичности их последовательностей с нуклеотидными последовательностями, представленными в настоящем описании, или с их вариантами или фрагментами. Указанные последовательности включают последовательности, которые являются ортологами описанных последовательностей.
Согласно настоящему изобретению ортологами являются гены, выведенные из общего родового гена и которые присутствуют в различных видах в результате специализации. Гены, обнаруженные в различных видах, рассматриваются как ортологи, когда для их нуклеотидных последовательностей и/или кодируемых белковых последовательностей характерна идентичность, составляющая по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более. Функции ортологов часто являются высококонсервативными в различных видах. Таким образом, под объем настоящего изобретения подпадают выделенные полинуклеотиды, которые кодируют полипептид никотиндеметилазы, участвующей в метаболическом превращении никотина в норникотин, и которые гибридизуются в строгих условиях с последовательностью CYP82E10, представленной в настоящем описании, или с ее вариантами или фрагментами. Указанные последовательности можно применять в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, ингибирования экспрессии полипептидов никотиндеметилаз, которые участвуют в метаболическом превращении никотина в норникотин в растениях.
С помощью ПЦР можно создавать олигонуклеотидные праймеры, предназначенные для применения в ПЦР-реакциях для амплификации соответствующих последовательностей ДНК с кДНК или геномной ДНК, экстрагированной из любого представляющего интерес растения. Методы создания ПЦРпраймеров и ПЦР-клонирования, в целом, известны в данной области и описаны у Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989; в: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications под ред. Innis и др., изд-во Academic Press, New York, 1990; в: PCR Strategies, под ред. Innis и Gelfand, изд-во Academic Press, New York, 1995; и в: PCR Methods Manual, под ред. Innis и Gelfand, изд-во Academic Press, New York, 1999. Известные методы осуществления ПЦР включают (но не ограничиваясь только ими) методы, основанные на использовании пар праймеров, гнездовых праймеров, односпецифических праймеров, вырожденных праймеров, генспецифических праймеров, векторспецифических праймеров, в частности, не обеспечивающих строгое соответствие (приблизительных) праймеров и т.п.
Методы гибридизации включают применение всего или части известного полинуклеотида в качест
- 12 033565 ве зонда, который избирательно гибридизуется с другими соответствующими полинуклеотидами, присутствующими в популяции клонированных фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК (т.е. библиотеки геномной ДНК или кДНК) из выбранного организма.
Гибридизацию можно осуществлять в строгих условиях. Под строгими условиями или строгими условиями гибридизации понимают условия, при которых зон гибридизуется с его последовательностью-мишенью в значительно большей степени, чем с другими последовательностями (например, с уровнем гибридизации, превышающим фоновый уровень по меньшей мере в 2 раза). Строгие условия зависят от последовательности и должны быть разными в различных ситуациях. Контролируя строгость условий гибридизации и/или отмывки, можно идентифицировать последовательности-мишени, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). В альтернативном варианте строгие условия можно регулировать таким образом, чтобы допускать наличие нескольких мисмэтчей в последовательностях, в результате чего наблюдается более низкая степень сходства (гетерологичное зондирование). Как правило, зонд содержит менее примерно 1000 нуклеотидов, предпочтительно менее 500 нуклеотидов.
Как правило, строгие условия представляют собой условия, при которых концентрация соли составляет менее примерно 1,5 М в пересчете на ионы Na, как правило, концентрация составляет примерно от 0,01 до 1,0 М в пересчете на ионы Na (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3 и при температуре, составляющей по меньшей мере примерно 30°C. Для достижения строгих условий можно также добавлять дестабилизирующие агенты, такие как формамид. Примером гибридизации в условиях пониженной строгости является гибридизации с использованием буферного раствора, содержащего от 30 до 35% формамида, 1 М NaCl, 1% ДСН (додецилсульфат натрия), при 37°C и отмывки в 1-2х SSC (20х SSC = 3,0 М NaCl/0,3 M тринатрийцитрат) при 50-55°C. Примером гибридизации в условиях умеренной строгости является гибридизация с использованием от 40 до 45% формамида, 1,0 М NaCl, 1% ДСН при 37°C и отмывки в 0,5-1 х SSC при 50-60°C. Примером гибридизации в строгих условиях является гибридизации с использованием 5% формамида, 1 М NaCl, 1% ДСН при 37°C и отмывки в 0,1 х SSC при 60-65°C. Необязательно буфер для отмывки может содержать от примерно 0,1% до примерно 1% ДСН. Продолжительность гибридизации, как правило, составляет менее чем примерно 24 ч, как правило, от примерно 4 до примерно 12 ч. Продолжительность отмывки должна быть по меньше мере достаточной для достижения равновесия.
В конкретных вариантах осуществления изобретения гибридизация в строгих условиях представляет собой гибридизацию в растворе, содержащем 5xSSC, 0,5% ДСН, 5х раствор Денхарда, 0,45 мкг/мкл полиА-РНК, 0,45 мкг/мл ДНК тимуса теленка и 50% формамида, при 42°C и с использованием по меньшей мере одной отмывки после гибридизации в растворе, содержащем от примерно 0,01 х SSC до примерно 1х SSC. Продолжительность гибридизации составляет от примерно 14 до примерно 16 ч.
Специфичность, как правило, зависит от условий отмывок после гибридизации, при этом имеющими решающее значение факторами являются ионная сила и температура конечного отмывочного раствора. Для гибридов типа ДНК-ДНК 1пл можно аппроксимировать из уравнения, указанного у Meinkoth и Wahl, Anal. Biochem. 138, 1984, c. 267-284: tra = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) 500/L; в котором М обозначает молярность одновалентных катионов, %GC обозначает процентное содержание гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % form обозначает процентное содержание формамида в растворе для гибридизации и L обозначает длину гибрида в парах оснований. tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с точно соответствующим зондом. tm снижается примерно на 1°C при наличии каждого 1% мисмэтчей; таким образом, tm, условия гибридизации и/или отмывки можно регулировать для гибридизации с последовательностями требуемой идентичности. Например, если требуются последовательности с идентичностью >90%, то 1пл можно снижать на 10°C. Как правило, строгие условия выбирают, используя температуру примерно на 5°C ниже, чем термическая точка плавления (1пл) конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и значении рН. Однако при применении строгих условий гибридизацию и/или отмывку можно осуществлять при температуре, которая на 1, 2, 3 или 4°C ниже термической точки плавления (1пл); при применении умеренных условий гибридизацию и/или отмывку можно осуществлять при температуре, которая на 6, 7, 8, 9 или 4°C ниже термической точки плавления (1пл); при применении расслабленных условий гибридизацию и/или отмывку можно осуществлять при температуре, которая на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°C ниже термической точки плавления (1пл). Обычному специалисту в данной области должно быть очевидно, что при использовании указанного уравнения, составов для гибридизации и отмывки и требуемой 1пл, можно изменять строгость растворов для гибридизации и/или отмывки. Если допускаемый уровень мисмэтчей приводит к тому, что 1пл, составляет менее 45°C (водный раствор) или 32° С (раствор формамида), то предпочтительно повышать концентрацию SSC для того, чтобы применять более высокую температуру. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот представлено у Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, часть I, глава 2, изд-во Elsevier, New York, 1993; и в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel и др., глава 2,
- 13 033565 изд-во Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995 (см. Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989).
Применяемые для гибридизации зонды могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, кДНК-фрагменты, РНК-фрагменты или другие олигонуклеотиды и могут быть мечены выявляемой группой, такой как 32P или другой выявляемый маркер. Например, зонды для гибридизации можно создавать путем мечения синтетических олигонуклеотидов, основной которых являются полинуклеотидные последовательности CYP82E10, предлагаемые в настоящем изобретении. Методы получения зондов для гибридизации и конструирования библиотек кДНК и геномных ДНК, в целом, известны в данной области и описаны у Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989.
Например, полинуклеотидные последовательности CYP82E10, представленные в настоящем описании, или одну или несколько их частей можно использовать в качестве зондов, которые могут специфически гибридизоваться с соответствующими полинуклеотидами специфических для корня никотиндеметилаз и матричными РНК. Для достижения специфической гибридизации в различных условиях указанные зонды включают последовательности, которые являются уникальными для полинуклеотидных последовательностей CYP82E10 или являются уникальными для одной из полинуклеотидных последовательностей CYP82E10, включая расположенные против хода транскрипции относительно кодирующей последовательности 5'-области и расположенные по ходу транскрипции относительно кодирующей последовательности 3'-области и интронную область (например, SEQ ID NO: 3), и предпочтительно содержат по меньшей мере примерно 10 смежных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере примерно 20 смежных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере примерно 50 смежных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере примерно 75 смежных нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 100 смежных нуклеотидов. Указанные зонды можно применять для амплификации соответствующих полинуклеотидов CYP82E10. Этот метод можно применять для выделения дополнительных кодирующих последовательностей или мутаций из требуемого растения или в качестве диагностического анализа, позволяющего определять присутствие кодирующих последовательностей в растении. Метод гибридизации включает гибридизационный скрининг высеянных ДНКбиблиотек (либо бляшек, либо колоний; см., например, Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989).
В контексте настоящего описания касательно взаимосвязей между двумя или большим количеством полинуклеотидов или полипептидов понятие референс-последовательность относится к основе, применяемой для сравнения последовательностей. Референс-последовательность можно представлять собой частично или полностью специфическую последовательность; например, сегмент полноразмерной последовательности кДНК или последовательности гена, или полную последовательность кДНК или последовательность гена.
В контексте настоящего описания понятие окно сравнения относится к состоящему из смежных нуклеотидов конкретному сегменту полинуклеотидной последовательности, при этом находящаяся в окне сравнения полинуклеотидная последовательность может нести добавления или делеции (т.е. бреши) по сравнению с референс-последовательностью (в которой отсутствуют добавления или делеции), применяемые для оптимального выравнивания двух полинуклеотидов. Как правило, окно сравнения содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов и необязательно может содержать 30, 40, 50, 100 или большее количество нуклеотидов. Специалистам в данной области известно, что для избежания высокого уровня сходства с референс-последовательностью, достигаемого за счет включения брешей в полинуклеотидную последовательность, как правило, вводят штраф за брешь и вычитают его из количества совпадений.
Методы выравнивания последовательностей с целью их сравнения хорошо известны в данной области. Так, для определения процента идентичности последовательностей любых двух последовательностей можно применять математический алгоритм. Примерами таких математических алгоритмов являются (но не ограничиваясь только ими) алгоритм, описанный у Myers и Miller, CABIOS 4, 1988, c. 11-17; алгоритм локального выравнивания, описанный у Smith и др., Adv. Appl. Math. 2, 1981, с. 482; алгоритм глобального выравнивания, описанный у Needleman и Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 1970, c. 443-453; метод выравнивания, основанный на локальном поиске, описанный у Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1988, c. 2444-2448; алгоритм, описанный у Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, с. 2264, модифицированный согласно Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, c. 5873-5877.
Программы BLAST, описанные у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, с. 403, основаны на алгоритме Karlin и Altschul, 1990, выше. Исследование нуклеотидных последовательностей с использованием программ BLAST можно осуществлять с помощью программы BLASTN, в которой балл=100, длина слова=12, определяя тем самым нуклеотидные последовательности, гомологичные с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует белок, предлагаемый в изобретении. Исследование белков с использованием программ BLAST можно осуществлять с помощью программы BLASTX, в которой балл=50, длина слова=3, определяя тем самым аминокислотные последовательности, гомологичные белку или полипептиду, предлагаемому в изобретении. Для выравнивания включающих бреши последовательно
- 14 033565 стей с целью сравнения можно примерять программу Gapped BLAST (входящую в пакет программ BLAST 2.0), которая описана у Altschul и др., Nucleic Acids Res. 25, 1997, с. 3389. В альтернативном варианте для осуществления итерационного поиска можно применять программу PSI-BLAST (входящую в пакет программ BLAST 2.0), которая позволяет определять отдаленные взаимосвязи между молекулами (см. Altschul и др., 1997, выше). При применении BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST можно использовать задаваемые по умолчанию параметры соответствующих программ (например, BLASTN для нуклеотидных последовательностей, BLASTX для белков) (см. www.ncbi.nlna.nih.gov). Выравнивание можно осуществлять вручную на основе визуальной оценки.
В некоторых вариантах осуществления изобретения уровни идентичности/сходства последовательностей, указанные в настоящем описании, рассчитывали с использованием алгоритмов BLASTX (Altschul и др., 1997, выше), Clustal W (Higgins и др., Nucleic Acids Res. 22, 1994, c. 4673-4680) и GAP (входит в пакет программ, разработанных группой вычислительной генетики Висконсинского университета (University of Wisconsin Genetic Computing Group)) с использованием задаваемых по умолчанию параметров. Под объем настоящего изобретения подпадает также применение эквивалентной программы для анализа и сравнения нуклеотидных и белковых последовательностей. Под эквивалентной программой подразумевают любую программу, предназначенную для анализа последовательностей, которая позволяет для любых двух рассматриваемых последовательностей осуществлять выравнивание, включающее соответствие идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков, и дает такой же процент идентичности последовательностей, что и полученный при соответствующем выравнивании с помощью программ BLASTX, Clustal W или GAP.
Для целей приведенного ниже обсуждения вариантов нуклеотидных и полипептидных последовательностей, подпадающих под объем настоящего изобретения, понятие идентичность последовательностей или идентичность в контексте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия в конкретном окне сравнения. Когда процент идентичности последовательностей применяют касательно белков, то принимают, что положения неидентичных остатков часто отличаются консервативными аминокислотными заменами, при которых аминокислотный остаток заменен на другие аминокислотные остатки со сходными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность) и поэтому не происходит изменения функциональных свойств молекулы. Когда последовательности отличаются консервативными заменами, то процент идентичности последовательностей можно повышать для корректировки с учетом консервативной природы замены. Говорят, что последовательности, которые отличаются консервативными заменами, обладают сходством последовательностей или сходством. Пути осуществления такой корректировки, хорошо известны специалистам в данной области. Как правило, они заключаются в том, что при назначении балльной оценки консервативную замену рассматривают как частичный, а не полный мисмэтч, что повышает процент идентичности последовательностей. Так, например, если идентичность аминокислот характеризуется баллом 1, а неконсервативная замена характеризуется баллом ноль, то консервативная замена характеризуется баллом, находящийся между 0 и 1. Для расчета баллов, которые присваиваются консервативным заменам, например, используют программу PC/GENE (фирма Intelligenetics, Маунтин-Вью, шт. Калифорния).
В контексте настоящего описания процент идентичности последовательностей означает величину, которую определяют путем сравнения двух оптимальным образом выровненных последовательностей в окне сравнения, при этом часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может нести добавления или делеции (т.е. бреши) по сравнению с референс-последовательностью (в которой отсутствуют добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают, определяя количество положений, в которых находятся идентичные нуклеотидные основания или аминокислотные остатки в обеих последовательностях, устанавливая количество соответствующих положений, осуществляя деление количества соответствующих положений на общее количество положений в окне сравнения, и умножая результат на 100, получая тем самым процент идентичности последовательностей.
Так, полинуклеотидные и полипептидные последовательности CYP82E10 можно идентифицировать с использованием последовательностей, которые представлены в настоящем описании. Такие методы заключаются в том, что получают полинуклеотидную или полипептидную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99% полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, 3 или 4, или ее комплементу или фрагменту, или идентична полипептидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или 5-13. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид, соответствующий SEQ ID NO: 2, имеет серин в положении 79, 107 или 381 полипептида CYP82E10, где нумерация соответствует SEQ ID NO: 2.
Способы ингибирования экспрессии или функции никотиндеметилазы
Предложены способы снижения концентрации, содержания и/или активности полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, в растениях или частях растений Nicotiana, в частности, в корневой ткани. Целый ряд способов можно использовать индивидуально или в сочетании для снижения или элиминации активности полипептида CYP82E10 (SEQ ID NO: 2), предлагаемого в настоящем изобретении, и
- 15 033565 его вариантов, которые сохраняют активность никотиндеметилаз (например, SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10). Кроме того комбинации способов можно применять для снижения или элиминации активности двух или большего количества различных никотиндеметилаз, более конкретно, специфической для корня никотиндеметилазы CYP82E10 и одной или обеих никотиндеметилаз, таких как специфическая для зеленых листьев никотиндеметилаза CYP82E5 и индуцируемая старением никотиндеметилаза CYP82E4. В конкретном варианте осуществления изобретения CYP82E5 представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну мутацию аминокислоты в последовательности, представленной в SEQ ID NO: 26, которая оказывает отрицательное воздействие на превращение в зеленых листьях, и CYP82E4 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, которая содержит по меньшей мере одну мутация аминокислоты, оказывающую отрицательное воздействие на превращение в стареющих листьях.
Согласно настоящему изобретению считается, что имеет место ингибирование экспрессии никотиндеметилазы CYP82E10, предлагаемой в настоящем изобретении, если уровень белка, представляющего собой полипептид CYP82E10, статистически ниже уровня белка, представляющего собой этот же полипептид CYP82E10, в растении, которое не является генетически модифицированным или измененным с помощью мутаций, что приводит к ингибированию экспрессии указанного полипептида CYP82E10, и при этом указанные растения культивировали и собирали их урожай с использованием таких же протоколов. В конкретных вариантах осуществления изобретения уровень белка, представляющего собой полипептид CYP82E10, в модифицированном растении, предлагаемом в изобретении, ниже на 95%, ниже на 90%, ниже на 80%, ниже на 70%, ниже на 60%, ниже на 50%, ниже на 40%, ниже на 30%, ниже на 20%, ниже на 10% или ниже на 5% уровня белка, представляющего собой такой же полипептид CYP82E10, в растении, которое не является мутантным или генетически модифицированным, что приводит к ингибированию полипентида CYP82E10, и которое культивировали и собирали его урожай с использованием таких же протоколов. Уровень экспрессии полипептида CYP82E10 можно измерять непосредственно, например, оценивая уровень транскрипта CYP82E10 или полипептида CYP82E10, экспрессируемого в растении или части растения табака, или косвенно, например, измеряя уровень превращения никотина в норникотин в растении или части растения табака. Методы мониторинга уровня экспрессии белка известны в данной области и включают (но не ограничиваясь только ими) анализ методом Нозернблоттинга и анализ дифференцировки РНК. Методы определения активности целевого полипептида CYP82E10 в отношении превращения никотина в норникотин известны в данной области и представлены ниже в настоящем описании, и они включают (но не ограничиваясь только ими) анализ алкалоидов с помощью газовой хроматографии.
В настоящем изобретении предложны способы снижения уровня норникотина или снижения уровня превращения никотина в норникотин в растении или части растения табака. Способы заключаются в том, что интродуцируют в геном растения табака мутацию по меньшей мере в один аллель каждого из по меньшей мере трех генов никотиндеметилаз, где мутация снижает экспрессию гена никотиндеметилазы и где первый из указанных генов никотиндеметилаз кодирует специфическую для корня никотиндеметилазу, которая принимает участие в метаболическом превращении никотина в норникотин в растении или части растения табака. В некоторых вариантах осуществления изобретения специфическая для корня никотиндеметилаза представляет собой CYP82E10 или ее вариант. В других вариантах осуществления изобретения указанные способы заключаются в том, что интродуцируют в геном растения табака мутацию по меньшей мере в один аллель гена никотиндеметилазы, который кодирует CYP82E10 или ее вариант, и мутацию по меньшей мере в один аллель гена никотиндеметилазы, который кодирует CYP82E4 или ее вариант, и/или гена никотиндеметилазы, который кодирует CYP82E5 или ее вариант.
Для объединения мутаций в одном растении использовали ряд подходов, в том числе половое скрещивание. Растение, имеющее предпочтительную мутацию в гене CYP82E10, которая ингибирует активность никотиндеметилаз в корнях, можно скрещивать с растением, имеющим предпочтительную мутацию в гене CYP82E4v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в стареющих листьях, или скрещивать с растением, имеющим предпочтительную мутацию в гене CYP83E5v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в зеленых листьях, с получением растения, которое обладает пониженным уровнем превращения никотина в норникотин. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения скрещивания осуществляют для интродукции предпочтительной мутации в ген CYP82E10, CYP82E4v2 и CYP82E5v2 в одном и том же растении. Таким образом, растение, имеющее предпочтительную мутацию в гене CYP82E10, которая ингибирует активность никотиндеметилаз в корнях, скрещивают с растением, имеющим предпочтительную мутацию в гене CYP82E4v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в стареющих листьях, и предпочтительную мутацию в гене CYP83E5v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в зеленых листьях. В альтернативном варианте растение, имеющее предпочтительную мутацию в гене CYP82E4v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в стареющих листьях, скрещивают с растением, имеющим предпочтительную мутацию в гене CYP82E10, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в корнях, и предпочтительную мутацию в гене CYP83E5v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в зеленых листьях. В следующем варианте осуществления изобретения растение, имеющее предпочтительную мутацию в гене CYP82E5v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в зеленых ли
- 16 033565 стьях, скрещивают с растением, имеющим предпочтительную мутацию в гене CYP82E10, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в корнях, и предпочтительную мутацию в гене CYP83E4v2, которая ингибирует никотиндеметилазную активность в стареющих листьях. Путем интродукции предпочтительной мутации в каждый из указанных генов никотиндеметилаз можно получать растение, имеющее пониженные уровни превращения никотина в норникотин, при этом уровни превращения не превышают примерно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7%.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения растение, имеющее одну или несколько предпочтительных мутаций, которая(ые) приводит(ят) к модификации полипептида CYP82E10 в положении 79, 107, 381 или 419 (где нумерация соответствует SEQ ID NO: 2), можно скрещивать с растением, имеющим одну или несколько предпочтительных мутаций, которая(ые) приводит(ят) к модификации полипептида CYP82E4 в положении 329, 364, 376, 381 или 458, и/или имеющим одну или несколько предпочтительных мутаций, которая(ые) приводит(ят) к модификации полипептида CYP82E5 в положении 422 или 449, с получением растения, в котором уровни превращения не превышают примерно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7%. Наиболее предпочтительный уровень превращения никотина в норникотин может составлять от 0,05 до 0,4%, от 0,1 до 0,6%, от 0,1 до 0,3%, от 0,1 до 0,5%, от 0,1 до 0,4%, от 0,1 до 0,7%, от 0,1 до 1,0%, от 0,1 до 1,1%, от 0,1 до 1,2%, от 0,1 до 1,3%, от 0,1 до 1,4% или от 0,1 до 1,5%. Любая мутация в полинуклеотиде, предлагаемом в настоящем изобретении, которая приводит к укорочению полипептида CYP82E10, CYP83E4 или CYP83E5 перед консервативным связывающим гем мотивом должна ингибировать фермент и ее можно применять в указанном выше скрещивании. Домены белков цитохрома Р450 известны в данной области (см., например, Xu и др., Physiologia Plantarum 129, 2007, c. 307-319, публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки). Путем скрещивания растений с нефункциональным или заингибированным геном CYP82E10, с растениями с нефункциональным или заингибированным геном CYP82E4v2, с нефункциональным или заингибированным геном CYP82E5v2 или с нефункциональными или заингибированными генами CYP82E4v2 и CYP82E5v2 можно получать растение табака с пониженными уровнями норникотина.
Активность полипептида никотиндеметилазы CYP82E10, CYP82E4 или CYP82E5 в отношении превращения никотина в норникотин в растении или части растения табака является заингибированной согласно настоящему изобретению, если активность в отношении указанного превращения статистически ниже, чем активность в отношении превращения полипептида такой же никотиндеметилазы в растении или части растения табака, которое не подергалось генетической модификации для ингибирования активности в отношении превращения полипептида такой же никотиндеметилазы и которое культивировали и собирали его урожай с использованием таких же протоколов. В конкретных вариантах осуществления изобретения активность полипептида никотиндеметилазы в отношении превращения никотина в норникотин в модифицированном растении или части растения табака, предлагаемого/предлагаемой в изобретении, является заингибированной, если активность составляет менее 95%, менее 90%, менее 80% менее 70%, менее 60%, менее 50%, менее 40%, менее 30%, менее 20%, менее 10%, менее 5%, менее 2% или менее 1% от активности в отношении превращения полипептида такой же никотиндеметилазы в растении табака, которое не подергалось генетической модификации для ингибирования экспрессии полипептида такой же никотиндеметилазы и которое культивировали и собирали его урожай с использованием таких же протоколов. Активность полипептида никотиндеметилазы в отношении превращения никотина в норникотин в растении или части растения табака является элиминированной согласно изобретению, когда она находится ниже предела обнаружения с помощью методов, представленных в настоящем описании. Методы определения активности полипептида никотиндеметилазы в отношении превращения никотина в норникотин в растении табака с использованием газовой хроматографии представлены ниже в примерах.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предпочтительную мутацию интродуцируют в растение или часть растения табака с помощью мутагенеза и интродуцированную мутацию выбирают с помощью методов, известных специалистам в данной области, таких как (но не ограничиваясь только ими) анализ методом Саузерн-блоттинга, секвенирование ДНК, анализ на основе ПЦР или фенотипический анализ. Растение или часть растения, измененного или модифицированного согласно указанным выше вариантам осуществления изобретения, выращивают в условиях, в которых происходит образование растения, в течение периода времени, достаточного для модуляции концентрации и/или активности полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, в растении. Условия, в которых происходит образование растения, хорошо известны в данной области и кратко указаны ниже в настоящем описании.
Модифицированное растение табака, содержащее предпочтительную мутацию в никотиндеметилазе, представленную в настоящем описании, отличается пониженным уровнем превращения никотина в норникотин. В конкретных вариантах осуществления изобретения уровень превращения никотина в норникотин в модифицированном растении или части растения табака, предлагаемом/предлагаемой в изобретении, составляет менее 95%, менее 90%, менее 80%, менее 70%, менее 60%, менее 50%, менее 40%, менее 30%, менее 20%, менее 10%, менее 5%, менее 2% или менее 1% от уровня превращения в растении табака, которое не подергалось генетической модификации для ингибирования экспрессии полипептида такой же никотиндеметилазы и которое культивировали и собирали его урожай с использованием таких
- 17 033565 же протоколов. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированное растение табака представляет растение табака, являющееся конвертером. В других вариантах осуществления изобретения модифицированное растение табака представляет собой растение табака, не являющееся конвертером. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированное растение табака отличается более низким уровнем превращения по сравнению с уровнем, обнаруженным в коммерческих растениях табака, которые не являются конвертерами.
Согласно настоящему изобретению изменения в уровнях, соотношениях, активности или распределении полипептидов CYP82E10, предлагаемых в настоящем изобретении, или изменения фенотипа растения или части растения табака, прежде всего снижение накопления норникотина и его онкогенного метаболита NNN можно измерять, сравнивая анализируемое растение или часть растения с контрольным растением или частью растения, где анализируемое растение или часть растения и контрольное растение или часть растения культивировали и/или собирали их урожай с использованием таких же протоколов. В контексте настоящего описания анализируемое растение или часть растения представляет собой растение или часть растения, в котором генетическое изменение, например, полученное с помощью мутагенеза, влияет на представляющий интерес полипептид никотиндеметилазы или представляет собой растение или часть растения табака, являющееся потомком растения или части растения табака, измененного таким образом и содержащего указанную модификацию. Контрольное растение или часть растения представляет собой стандарт для оценки изменений фенотипа анализируемого растения или части растения. Оценку изменений фенотипа растения или части растения можно осуществлять в любой момент времени, в том числе в процессе развития, старения растения или после сушки. В других вариантах осуществления изобретения оценку изменений фенотипа можно осуществлять в растениях, выращенных в какихлибо других условиях, в том числе в растениях, выращенных в вегетационной камере, теплице или в поле. В одном из вариантов осуществления изобретения оценку изменения фенотипа можно осуществлять путем определения уровня превращения никотина в норникотин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения уровень превращения можно оценивать путем деления процентного содержания норникотина (в виде процента относительно общей массы ткани) на сумму процентного содержания никотина и норникотина (в виде процента относительно общей массы ткани) и умножения на 100.
Согласно настоящему изобретению контрольное растение или часть растения может представлять собой растение или часть растения табака дикого типа, т.е. такого же генотипа, что и исходный материал для генетического изменения, приводящего к получению анализируемого растения или части растения. Контрольное растение или часть растения может представлять собой также растение или часть растения табака такого же генотипа, что и исходный материал, но быть трансформированным нулевой конструкцией (т.е. конструкцией, для которой отсутствуют данные о воздействии на представляющий интерес признак, например, конструкцией, которая содержит селектируемый маркерный ген). Во всех случаях анализируемое растение или часть растения и контрольное растение или часть растения культивируют и собирают их урожай с использованием таких же протоколов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения активность полипептида никотиндеметилазы, предлагаемого в настоящем изобретении, можно снижать или элиминировать, нарушая ген, который кодирует полипептид никотиндеметилазы. Изобретение относится к подвергнутым мутагенезу растениям, которые несут мутации в генах никотиндеметилазы, где мутации приводят к снижению экспрессии гена никотиндеметилазы или ингибированию активности кодируемого полипептида никотиндеметилазы, предлагаемого в настоящем изобретении.
В других вариантах осуществления изобретения активность полипептида никотиндеметилазы, предлагаемого в настоящем изобретении, снижают или элиминируют путем нарушения гена, который кодирует полипептид никотиндеметилазы. Г ен, который кодирует полипептид никотиндеметилазы можно нарушать с помощью любого метода, известного в данной области, например, транспозонного мечения или мутагенеза растений посредством неспецифического или направленного мутагенеза, и отбора растений с пониженным уровнем никотиндеметилазной активности или с мутациями только в CYP82E10 или в сочетании с мутациями в CYP82E4 или CYP82E5.
Транспозонное мечение можно применять для снижения или элиминации активности одного или нескольких полипептидов никотиндеметилаз CYP82E10, предлагаемых в изобретении. Транспозонное мечение предусматривает встраивание транспозона в эндогенный ген никотиндеметилазы для снижения или элиминации экспрессии полипептида никотиндеметилазы.
Методы транспозонного мечения конкретных генов в растениях хорошо известны в данной области (см., например, Maes и др., Trends Plant Set 4, 1999, c. 90-96; Dharmapuri и Sonti, FEMS Micerobiol. Lett. 179, 1999, c. 53-59; Meissner и др., Plant J. 22, 2000, c. 265- 274; Phogat и др., J. Biosci. 25, 2000, c. 57-63; Walbot, Curr. Opin. Plant Biol. 2, 2000, c. 103-107; Gai и др., Nucleic Acids Res. 28, 2000, c. 94-96; Fitzmaurice и др., Genetics 153, 1999, c. 1919-1928).
В данной области известны также и другие методы снижения или элиминации экспрессии эндогенных генов в растениях и их также можно применять согласно настоящему изобретению. Указанные методы включают другие формы мутагенеза с использованием мутагенных или онкогенных соединений, например, индуцированный этилметансульфонатом (ЭМС) мутагенез, делеционный мутагенез и делеци
- 18 033565 онный мутагенез с использованием быстрых нейтронов, применяемый для обратной генетики (с использованием ПЦР) для идентификации линий растений, в которых удален путем делеции эндогенный ген. Примеры указанных методов представлены у Ohshima и др., Virology 213, 1998, c. 472-481; Okubara и др., Genetics 137, 1994, c. 867-874 и у Quesada и др., Genetics 154, 2000, c. 421-4315; каждая из публикаций включена в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, согласно изобретению можно применять также быстрый и автоматизированный метод скрининга индуцируемых химическими соединениями мутаций, TILLING (введение индуцированных локальных повреждений в геном (Targeting Induced Local Lesions In Genomes), методы с применением денатурирующей ЖХВР или избирательного эндонуклеазного расщепления отобранных ПЦР-продуктов (см. McCallum и др., Nat. Biotechnol. 18, 2000, c. 455457, публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки).
Мутации, которые нарушают экспрессию гена или оказывают воздействие на функцию кодируемого белка никотиндеметилазы, можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области. Инсерционные мутации в экзонах гена, как правило, приводят к получению нуль-мутантов. Мутации в консервативных остатках могут оказаться особенно эффективными в отношении ингибирования метаболической функции кодируемого белка. Описаны консервативные остатки полипептидов растительных никотиндеметилаз, пригодные для мутагенеза с целью элиминации активности полипептида никотиндеметилазы в отношении превращения никотина в норникотин в растении или части растения табака (см. фиг. 1А-В опубликованной заявки на патент США № 2009/0205072 А1, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки, где остатки, отличающиеся от других полипептидов Р450, выделены серым цветом). Консервативный остаток представляет собой остаток в каждом положении, который не выделен серым цветом. Указанные мутанты можно выделять согласно процедурам, хорошо известным в данной области.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения можно применять доминантные мутации для обеспечения молчания РНК посредством инверсии гена и рекомбинации содержащего два аллеля локуса гена (см. например, Kusaba и др., Plant Cell 15, 2003, c. 1455-1467).
Согласно другому варианту осуществления изобретения композиции, предлагаемые в изобретении, находят применение в методах скрининга для идентификации растений, не являющихся конвертерами, которые предназначены для применения в программах селекции. Для этого можно применять нуклеотидные последовательности, предлагаемые в изобретении, для скрининга нативной зародышевой плазмы растений, не являющихся конвертерами, которые имеют стабильную мутацию в гене CYP82E10, идентифицированную согласно настоящему описанию. Указанные растения, не являющиеся конвертерами, идентифицированные с помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, можно применять для создания чистых линий.
Помимо нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептиды CYP82E10, представленные в настоящем описании, композиции, предлагаемые в изобретении, включают интронную последовательность в последовательности гена CYP82E10, которую можно применять в методах скрининга. Не вдаваясь в какой-либо механизм действия, можно считать, что ген(ы) CYP82E10 может(гут) являться только представителем(ями) семейства цитохрома Р450, участвующего в метаболическом превращении никотина в норникотин в корнях табака. Для ряда вариантов применения может оказаться полезным иметь средства для диагностической дифференциации указанного конкретного представителя семейства генов цитохрома Р450 от остальных близкородственных последовательностей в этой семействе. Например, возможно, что во встречающейся в естественных условиях зародышей плазме табака (или в подвергнутых мутагенезу популяциях) могут существовать дополнительные варианты, в которых этот ген в естественных условиях имеет нарушенную функцию и поэтому может являться ценным в качестве перманентного источника неконвертеров. Указанные последовательности с нарушенной функцией могут представлять собой последовательности, которые кодируют полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 11, 12 или 13. Метод специфического анализа указанных генотипов (например, делеционных мутантов, реаранжировок и т.п.) может служить в качестве эффективного инструмента. В настоящем изобретении описаны праймеры, созданные для специфической амплификации экзона 1 и экзона 2 CYP82E10, при этом одна из двух пар праймеров соответствует интрону, расположенному между экзонами. Примеры праймеров, которые можно применять для амплификации экзонов CYP82E10, имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 35 плюс SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37 плюс SEQ ID NO: 38. Эти же праймеры можно применять для анализа последовательностей продуктов.
Поскольку интронные области генов, как правило, являются менее консервативными по сравнению с экзонами, можно предположить, что применение специфического для интрона зонда должно с большей эффективностью отличать ген(ы), соответствующие гену CYP82E10, от других представителей семейства CYP82E. Применение специфического для интрона CYP82E10 зонда и/или ПЦР-праймеров, используемых для создания продуктов, представляет собой эффективные инструменты в анализах, предназначенных для решения вопроса о том, несут ли любые встречающиеся в естественных условиях или подвергнутые мутагенезу растения табака делеции или реаранжировки, которые делают ген неактивным. Указанное растение можно затем применять в программах селекции для создания линий табака, в которых не может происходить указанное превращение.
- 19 033565
Растения, части растений табака и изделия с пониженным содержанием норникотина и NNN
Полинуклеотиды CYP82E10, предлагаемые в изобретении, и их варианты и фрагменты можно применять в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, для ингибирования экспрессии или функции никотиндеметилаз CYP82E10, которые участвуют в метаболическом превращении никотина в норникотин в растении. Таким образом, предпочтительные мутации можно интродуцировать в представляющий интерес ген CYP82E10. Способы, предлагаемые в изобретении, не зависят от конкретного метода интродукции предпочтительной мутации в ген CYP82E10 никотиндеметилазы.
Композиции и способы, предлагаемые в изобретении, можно применять для снижения содержания норникотина, в частности в листьях и стеблях любого растения рода Nicotiana, включая (но не ограничиваясь только ими) следующие виды: acuminata, affinis, alata, attenuate, bigelovii, clevelandii, excelsior, forgetiana, giauca, glutinosa, langsdorffii, longiflora, obtusifolia, palmeri, paniculata, plumbaginifoliia, qudrivalvis, repanda, rustica, suaveolens, sylvestris, tabacum, tomentosa, trigonophylla и х sanderae. Настоящее изобретение можно также воплощать на практике с использованием любых сортов растения рода Nicotiana, включая (но не ограничиваясь только ими) Nicotiana acuminata multiflora, Nicotiana alata grandiflora, Nicotiana bigelovii quadrivalvis, Nicotiana bigelovii wallacei, Nicotiana obtusifolia obtusifolia, Nicotiana obtusifolia plameri, Nicotiana quadrivalvis bigelovii, Nicotiana quadrivalvis quadrivalvis, Nicotiana quadrivalvis wallacei и Nicotiana trigonophylla palmeri, а также различных известных сортов, известных как сорта, подвергаемые сушке на пару, или светлые сорта, сорта табака Бёрли, темные сорта и восточные/турецкие сорта. В некоторых вариантах осуществления изобретения представляющее интерес растение табака представляет собой растение сорта Бёрли, Вирджиния, растение, предназначенное для сушки на пару, воздушной сушки, огневой сушки, растение сорта восточный или растение, из которого получают темный сорт табака.
Растения табака и сорта, представленные в настоящем описании, можно применять для выращивания и сбора урожая с помощью общепринятых методов, таких как культивирование в богатых перегноем почвах или без перегноя, с помещением цветков в мешки или без указанной защиты или с укорачиванием верхушек или без укорачивания. Собранные листья и стебли можно применять в любых традиционных табачных изделиях, включая (но не ограничиваясь только ими) трубочный, сигарный и сигаретный табак и жевательный табак в любой форме, в том числе листовой табак, раскрошенный табак или нарезанный табак.
Таким образом, настоящее изобретение относится к растению или части растения табака, содержащего/содержащей мутации в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E10, где мутация приводит к пониженной экспрессии или функции никотиндеметилаз CYP82E10 и к уменьшенному количеству норникотина и N'-нитрозонорникотина. В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие уменьшенное количество или пониженный уровень относятся к количеству норникотина и/или N'нитрозонорникотина в растении, предлагаемом в настоящем изобретении, или части растения табака или табачном изделии, более низкому по сравнению с обнаруженным в растении рода Nicotiana или части растения или табачном изделии из такого же сорта табака, обработанного (т.е. культивированного и собранного) таким же образом, но которое не было генетически модифицировано с целью снижения уровня норникотина и/или N'-нитрозонорникотина. Количество норникотина может быть снижено от примерно на 10% до более чем примерно на 90%, в том числе более чем примерно на 20%, примерно на 30%, примерно на 40%, примерно на 50%, примерно на 60%, примерно на 70% и примерно на 80%. Превращение никотина в норникотин может составлять менее 0,3%, менее 0,5%, менее 0,7%, менее 0,1-0,5%, от 0,1 до 0,4%, от 0,1 до 0,7% или от 0,1 до 1,0% в растениях, частях растений и продуктах, предлагаемых в настоящем изобретении, и более конкретно в растения, частях растений, имеющих мутации в CYP82E10, CYP82E4v2 и CYP825v2.
Понятие табачные изделия в контексте настоящего описания относится (но не ограничиваясь только ими) к продуктам, предназначенным для курения (например, любые сигареты, включая сигариллы (сигара в табачном листе), сигареты с невентилируемым фильтром или сигареты с вентилируемым рецесс-фильтром, сигары, трубочный табак), продукты, не пригодные для курения (например, нюхательный табак, жевательный табак, биоразложимые вставки (например, гумми, лепешки, растворимые полоски)) (см., например, US 2005/0019448, который включен в настоящее описание в качестве ссылки). Настоящее изобретение относится также к смесевым табачным изделиям, которые можно получать, объединяя обычный табак с различными количествами табака с низким уровнем норникотина и/или N'нитрозонорникотина, представленного в настоящем описании. В других вариантах осуществления изобретения растение или часть растения рода Nicotiana, описанное/описанная выше, представляет собой высушенный табак.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения табачное изделие характеризуется пониженным онкогенным потенциалом дыма табака, который непосредственно вдыхается при использовании табачного изделия (такого как сигары, сигареты или трубочный табак) или вдыхается в виде вторичного табачного дыма (т.е. в том случае, когда индивидуум вдыхает табачный дым, который образуется при курении другим индивидуумом табачного изделия, такого как сигары, сигареты или трубочный табак). Высушенный табак, представленный в настоящем описании, можно применять для изготовления табачного изделия, прежде всего изделия, которое подвергнуто химическим изменениям в результате
- 20 033565 нагревания, которое содержит уменьшенное количество норникотина и/или N'-нитрозонорникотина в струе дыма, который вдыхают непосредственно или вдыхают в виде вторичного дыма. Аналогично этому табачные изделия, предлагаемые в изобретении, можно применять для изготовления бездымных табачный изделий, таких как жевательный табак, нюхательный табак и т.п.
Таким образом, табачные изделия, изготовленные из растений табака, предлагаемых в настоящем изобретении, находят применение в способах снижения онкогенного потенциала указанных табачных изделий и снижения воздействия на людей онкогенного нитрозамина NNN, прежде всего на индивидуумов, которые употребляют табачные изделия. Представленные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения и не направлены на ограничение его объема.
Экспериментальный раздел
Ссылки, процитированные в представленном ниже разделе, приведены сразу после Экспериментального раздела.
Известный уровень техники
Данные о том, что CYP82E4v2 представляет собой локус никотиндеметилазы, ответственной для высокий уровень накопления норникотина в растениях-конвертерах (Siminszky и др., 2005), открыли путь к нетрансгенным, а также трансгенным подходам, которые позволяют решать проблему, связанную с превращением, и снижать содержание норникотина в состарившихся высушенных листьях. В частности, это позволяет исследователям создавать популяции табака, обработанные химическим мутагеном, и отбирать особи, которые несут нефункциональные аллели в локусе CYP82E4v2. Действительно, на основе указанной стратегии три независимые группы исследователей уже создали линии табака, в которых не происходит превращение (Dewey и др., 2007; Xu и др., 2007б; Julio и др., 2008).
Как указано ранее, растение табака, обозначенное 775, идентифицировали в популяции линии сорта Бёрли DH98-325-6, для обработки которой в качестве мутагена применяли ЭМС, и у этого растения обнаружена вызывающая выключение мутация в гене CYP82E4v2 (Dewey и др., 2007). Осенью 2008 г. растения, гомозиготные по мутации 775, выращивали на исследовательской станции Upper Coastal Plains в г. Роки-Маунт, шт. Северная Каролина и подвергали воздушной сушке согласно стандартной промышленной практике. Анализ алкалоидов в этом материале осуществляли согласно LC Protocol (протокол ЖХ), описанного у Jack и др., 2007. Как видно из табл. 1, у растений, несущих мутацию 775, средний уровень превращения никотина в норникотин составлял 2,6%. В отличие от этого у родительской линии DH98-325-6, которая имела сильный конвертерный генотип, был обнаружен уровень превращения, составлявший >60%. Практически идентичные результаты опубликованы Julio и др., 2008, было установлено, что для растений, гомозиготных по вызывающей выключение мутации cyp82e4v2, у линии сорта Бёрли с сильным конвертерным генотипом BB16NN (уровень превращения у родительской линии составлял от 68 до 98%) процент превращения составлял от 2,82 до 3,37. Таким образом, ослабляющие мутации, введенные только в ген CYP82E4v2, вероятно, являются эффективными в отношении устранения проблем, связанных с нестабильным генетическим феноменом, который ассоциирован с поколением растений-конвертеров.
Таблица 1
Профили алкалоидов в экспериментальном материале, которые оценивали в полевом опыте в 2008 г. Ве личины, выраженные в процентах, представляют собой средние значения
Генотип Ген-мишень Мутация6 Аминокислотная замена Содержание никотина8 (%) Содержание норникотина (%) Содержание анабазина (%) Содержание анатабина (%) % превращенияг
DH98-325-6 контроль (15)а контроль - - 1,228 2,014 0,016 0,125 62,5
TN90LC (14) контроль - - 4,680 0,157 0,022 0,155 3,2
DH98-325-6 ΡΗΚΪ 300-08 №1 (15) CYP82E4v2 и родственные гены - - 3,351 0,040 0,016 0,101 1,2
DH98-325-6 PHKi 300-02 №1 (15) CYP82E4v2 и родственные гены - - 3,741 0,026 0,017 0,106 0,7
DH98-325-6 №775 гомозиготный (15) CYP82E4v2 G986A W329Stop 2,941 0,077 0,013 0,093 2,6
DH98-325-6 гомозиготный (14) CYP82E5V2 G1266A W422Stop 1,005 1,876 0,012 0,097 65,2
DH98-325-6 двойной гомозиготный мутант(9) двойная двойная 3,160 0,076 0,015 0,117 2,3
а Числа в скобках обозначают общее количество проанализированных растений. б Нумерация относительно стартового кодона последовательности кДНК.
в Проценты рассчитывали на основе сухой массы табака.
г Процент превращения никотина определяли из уравнения: [% норникотина/(% норникотина + % никотина)] х 100.
Хотя применение растений табака, несущих мутацию 775 или сопоставимые мутации в CYP82E4v2,
- 21 033565 может представлять собой эффективное средство элиминации интродукции растений-конвертеров в популяции табака, в этих растениях все еще сохраняется небольшое, но имеющее существенное значение количество норникотина. С учетом того, что в трансгенных растениях, экспрессирующих конструкцию для РНК1, мишенью которой является CYP82E4v2 (Lewis и др., 2008), обнаружены уровни превращения никотина в норникотин, близкие к 0,45%, очевидно, что по меньшей мере еще один другой ген, последовательность которого обладает высокой гомологией с последовательностью ДНК CYP82E4v2, должен быть ответствен за основной синтез норникотина, присутствующий как в растениях, не являющихся конвертерами, так и в растениях-конвертерах, которые имеют неактивированный ген CYP82E4v2. Это предположение нашло дополнительное подтверждение, когда был обнаружен ген CYP82E5v2, последовательность ДНК которого на 92,7% идентична последовательности гена CYP82E4v2, который, как установлено, кодирует также функциональный фермент никотиндеметилазу (Dewey и др., 2007; Gavilano и Siminszky, 2007). Низкий уровень экспрессии гена CYP82E5v2 никотиндеметилазы обнаружен в зеленых табачных листьях растений-конвертеров, а также растений, не являющихся конвертерами, в отличие от гена CYP82E4v2, для которого характерны очень высокие уровни экспрессии, но только в листьях растений-конвертеров в процессе старения и воздушной сушки.
Как описано у Dewey и др., 2007, скрининг популяции табака DH98-325-6, для обработки которой в качестве мутагена применяли ЭМС, позволил идентифицировать индивидуальное растение (растение 1013), несущее приводящую к выключению мутацию в гене CYP82E5v2. Для определения воздействия нефункционального аллеля cyp82e5v2 на накопление норникотина осуществляли скрещивания, которые позволяли объединять мутации из растений 775 и 1013. Молекулярное генетипирование нескольких особей Е2-поколения, полученных из Е1-потомства начального скрещивания, позволило идентифицировать девять особей, гомозиготных по обоим мутациям (е4е4/е5е5). Эти девять растений включали также в полевой опыт, проведенный в 2008 г. Несмотря на тот факт, что, как установлено, CYP82E5v2 кодирует функциональный фермент никотиндеметилазу (Dewey и др., 2007; Gavilano и Siminszky, 2007), объединение нарушающей функцию мутации cyp82e5v2 с вызывающей выключение мутацией cyp82e4v2 оказывало очень небольшое воздействие на уровни норникотина в листьях. Как видно из табл. 1, у растений, гомозиготных по двойной мутации (е4е4/е5е5), средний уровень превращения никотина составлял 2,3%, для сравнения средний уровень превращения в растениях, несущих только мутацию cyp82e4v2 (e4e4), составлял 2,6%. Небольшое различие в среднем уровне превращения между двумя генотипами оказалось статистически незначимым (Р = 0,118). В отличие от этого, в одной из трансгенных линий, включенной в этот опыт, в которой молчание CYP82E4v2 достигалось с помощью РНКц средний уровень превращения в которой составлял 0,7%, количество оказалось значимо более низким (Р < 0,001), чем полученное как для генотипа е4е4, так и для генотипа е4е4/е5е5. Таким образом, в геноме табака должен существовать другой ген с высокой гомологией с CYP82E4v2, который принимает участие в производстве норникотина в растении.
Пример 1. Выделение и характеризация гена cyp82e10 никотиндеметилазы.
Для идентификации других генов в геноме табака, которые могут кодировать ферменты никотиндеметилаз, исследовали гомологию с помощью алгоритмов BLASTN и BLASTX (Altschul и др., 1990, 1997) с использованием баз данных для экспрессируемых секвенированных меток (ярлыков) (EST) в GenBank, применяя ДНК и белковые последовательности CYP82E4v2 в качестве соответствующих запрашиваемых последовательностей. Кроме того, для идентификации последовательностей кДНК, соответствующих ранее охарактеризованным представителям суперсемейства CYP82E (таким как CYP82E2, CYP82E3 и CYP82E5v2), было обнаружено семь EST, которые не соответствовали точно ни одному из ранее охарактеризованных представителей этого семейства генов.
Важно отметить, что все из семи EST, получали либо из библиотек специфических для корня кДНК, либо библиотек кДНК, созданных из смешанных тканей, которые включали корни. Эти данные позволяют предположить, что новый ген CYP82E экспрессируется специфически в ткани корня, указанная особенность позволяет объяснить, почему этот конкретный представитель суперсемейства CYP82E Р450 ранее не был обнаружен, так как ранее исследования были сфокусированы на характеризации генов CYP82E, которые экспрессировались в листовой ткани. Поскольку никакой индивидуальной последовательности EST недостаточно для перекрытия полной кодирующей области этого нового гена, создавали ПЦР-праймеры, которые обладали способностью обеспечивать амплификацию полной последовательности кДНК из первой цепи кДНК, которую создавали из РНК, выделенной из ткани корня табака. Кроме того, применяли праймеры для амплификации соответствующей геномной области гена, которая включала центральный крупный интрон. Эта новая кДНК CYP82E характеризовалась идентичностью на уровне 92,4% от нуклеотидной последовательности кДНК гена CYP82E4v2 табака и предсказанной идентичностью на уровне 91,1% аминокислотных последовательностей. В соответствии с рекомендациями по номенклатуре гена Р450 этот новый ген обозначили как CYP82E10. При сравнении со всеми охарактеризованными представителями суперсемейства CYP82E ген CYP82E10 отличается наиболее высоким уровнем сходства последовательностей с геном CYP82E5v2, при этом идентичность на уровне нуклеотидных последовательностей кДНК составляет 96,5% и предсказанная идентичность на уровне аминокислотных последовательностей составляет 95,7%. Последовательность ДНК CYP82E10 и пред
- 22 033565 сказанная белковая последовательность представлены на фиг. 1.
Хотя кДНК различных представителей семейства CYP82E имеют тенденцию к высокой консервативности, геномные версии этих генов отличаются существенно большим разнообразием последовательностей. Это прежде всего является следствием значительной дивергенции последовательностей, обнаруженной в крупном центральном интроне. Сравнительный анализ первичной структуры геномных последовательностей CYP82E4v2, CYP82E5v2 и CYP82E10 представлен на фиг. 2. Как рассчитано с помощью алгоритма выравнивания пар оснований EMBOSS (www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html), нуклеотидные последовательности генов CYP82E4v2 и CYP82E10 идентичны на 78,3%, а нуклеотидная последовательность гена CYP82E10 идентична на 84,9% нуклеотидной последовательности гена CYP82E5v2, поскольку они присутствуют в геноме табака (геномные последовательности CYP82E4v2 и CYP82E5v2 идентичны на 75%).
Как подробно описано в нескольких публикациях, большинство генов суперсемейства CYP82E, обнаруженных в геноме табака, не кодируют функциональные ферменты никотиндеметилазы (Siminszky и др., 2005; Chakrabarti и др., 2007; Dewey и др., 2007; Gavilano и др., 2007; Xu и др., 2007а). Таким образом, только степень гомологии последовательностей является не очень точным индикатором функции генов семейства CYP82E. Вместо этого анализ экспрессии либо в трансгенных растениях (Siminszky и др., 2005), либо в дрожжах (Gavilano и Siminszky, 2007; Xu и др., 2007а) представляет собой признанное средство решения вопроса о том, кодируют ли индивидуальные представители этого семейства генов никотиндеметилазную активность.
Для решения вопроса о том, функционирует ли CYP82E10 в качестве гена никотиндеметилазы, его кДНК клонировали в дрожжевом экспрессионном векторе pYeDP60 и трансформировали им штамм дрожжей W(R). Штамм W(R) представляет собой клеточную линию дрожжей, которая была сконструирована с целью сверхэкспрессии дрожжевой НАДФ-H-зависимой Р450-редуктазы, фермента, который служит в качестве непосредственного донора электронов для Р450; эта система позволяет в значительной степени повышать уровень выявления активности чужеродного фермента Р450, экспрессируемого в дрожжах (Pompon и др., 1995). Анализы никотиндеметилазы осуществляли путем инкубации препаратов микросомальных мембран дрожжей с [14С]-никотином и разделения продуктов с помощью тонкослойной хроматографии, согласно методу, описанному у Siminszky и др., 2005.
Как показано на фиг. 3, никакой никотиндеметилазной активности не удалось обнаружить при использовании микросом дрожжей штамма W(R), экспрессирующих только вектор pYeDP60. В противоположность этому выраженную никотиндеметилазную активность удалось обнаружить при оценке микросом, полученных из дрожжевых клеток, которые экспрессировали кДНК CYP82E10. Путем измерения ферментативной активности фермента CYP82E10 с использованием широкого спектра концентраций [14С]-никотина создавали кривую насыщения субстратом и с использованием анализа микросом было рассчитано кажущееся значение Km, составлявшее 3,9 мкМ. Этот кинетический параметр для CYP82E10 очень близок к значениям Km, опубликованным для ферментов CYP82E4v2 и CYP82E5v2 при их аналогичной экспрессии в дрожжах (Gavilano и др., 2007; Gavilano и Siminszky, 2007; Xu и др., 2007а).
Пример 2. Идентификация растений, несущих мутантные аллели CYP82E10.
Для точной оценки специфического вклада CYP82E10 в общий уровень норникотина в растении табака необходимо: (1) идентифицировать растение табака, в гене которого присутствует приводящая к выключению мутация; и (2) объединить эту мутацию с мутациями cyp82e4v2 и cyp82e5v2, полученными из растений 775 и 1013 соответственно. Для идентификации потенциально ослабляющих мутаций в гене CYP82E10 подвергали скринингу популяцию DH98-325-6, для обработки которой в качестве мутагена применяли ЭМС, для чего проводили широкомасштабный анализ последовательностей ДНК с использованием праймеров, которые обеспечивают специфическую амплификацию участков CYP82E10 (без одновременной амплификации других представителей суперсемейства CYP82E). Для специфической амплификации экзона 1 CYP82E10 применяли следующие ПЦР-праймеры: 5'GTGATAGTTTGATTCCCAAGTGC-3' (прямой) и 5'-CTCCCAAAGTTAGATTAGTCCG-3' (обратный); для специфической амплификации экзона 2 примеряли праймеры 5'-AGGTCGCGCTGATTCTTG-3' (прямой) и 5'-AGATGAATACCCATCTATCTAGGAGT-3' (обратный). Для гарантии максимальной специфичности обратный праймер для экзона 1 и прямой праймер для экзона 2 соответствовали последовательностям в интроне CYP82E10 (фиг. 1). ПЦР-амплификацию и анализ последовательностей мутантных растений осуществлял в 96-луночном формате согласно методу, описанному у Dewey и др., 2007.
Широкомасштабный анализ последовательностей свыше 1200 особей из мутантной популяции табака позволил идентифицировать 15 особей, несущих мутации в CYP82E10. Наиболее значимые из них представлены в табл. 2. Кроме того, на фиг. 1 выделены подчеркиванием измененные в результате мутации нуклеотиды и аминокислотные остатки в этих растениях. Хотя в этих особях не обнаружены укорачивающие мутации, в нескольких случаях идентифицированы мутации, которые изменяют аминокислотный остаток в высококонсервативной области фермента. Для определения воздействий конкретной мутации на активность фермента CYP82E10 применяли сайт-направленный мутагенез для интродукции специфических мутаций, которые соответствовали семи из девяти мутаций, представленных в табл. 2, в
- 23 033565 кДНК CYP82E10 в дрожжевом экспрессионном векторе pYeDP60. Препараты микросом из штаммов дрожжей, экспрессирующих каждый из семи вариантов CYP82E10, анализировали in vitro в отношении никотиндеметилазной активности при использовании как ненасыщающей (2,45 мкМ), так и насыщающей (50 мкМ) концентрации [14С]-никотина. Результаты, полученные на основе анализов экспрессии в дрожжах, продемонстрировали, что мутации, обнаруженные в растениях 693, 817 и 1035, не изменяли ферментативную активность, а мутации, обнаруженные в растениях 1041, 1512 и 2476, приводили к полной инактивации фермента. Мутация, обнаруженная в растении 1442, приводила к снижению активности на 75% по сравнению с активностью фермента CYP82E10 дикого типа.
Полученные с помощью тонкослойной хроматографии данные анализов in vitro, касающиеся экспрессии в дрожжах при наличии соответствующей мутации в растении 1041, представлены на фиг. 3. Указанная конкретная мутация была выбрана для более подробного изучения. Для дополнительного подтверждения того, что замена аминокислоты Pro на Ser в положении 381, которая соответствует мутации растения 1041, не совместима с функцией деметилирования никотина, именно эту мутацию интродуцировали в кДНК CYP82E4v2, которую клонировали аналогичным образом в векторе pYeDP60. Результаты анализов этих дрожжей представлены в табл. 3. Замена на Ser Pro в положении 381, если она присутствовала в ферменте CYP82E10 или CYP82E4v2, приводила к полной элиминации никотиндеметилазной активности в этом анализе. Важно отметить, что хотя активность ферментов CYP82E10 и CYP82E4v2 дикого типа была сопоставима при использовании ^^-никотина в не насыщающей концентрации (2,45 мкМ), при применении субстрата в концентрации 25 мкМ уровень синтеза ^^-норникотина был примерно в три раза выше в препаратах микросом, содержащих фермент CYP82E10, чем в препаратах, содержащих CYP82E4v2.
Таблица 2 Обработанные ЭМС линии DH98-325-6, несущие мутации в гене CYP82E10
Номер растения Мутацияа Аминокислотная замена Активность мутантного фермента6
2476 G235A G79S не выявлена
1512 C319T P107S не выявлена
319 С442Т L148F не тестировали
634 G514A G172R не тестировали
1035 G1030А А344Т 100%
1041 С1141Т P381S не выявлена
817 G1228A A410T 100%
693 G1250A R417H 100%
1442 С1255Т P419S 25%
а Нумерация относительно стартового кодона последовательности кДНК CYP82E10.
б Относительно активности фермента дикого типа при экспрессии в дрожжах.
Таблица 3
Никотиндеметилазная активность ферментов CYP82E4v2 и CYP82E10, несущих мутацию 1041 (Pro381Ser)
Вектор CPM норникотина при использовании в качестве 14 субстрата 2,45мкМ [ С]никотина СРМ норникотина при использовании в качестве 14 субстрата 50,0мкМ [ С]никотина
pYeDP60-CYPE4v2 1,813±623б 5,383±505
pYeDP60-CYPE4v2/1041 не выявлено не выявлено
pYeDP60-CYPE10 2,296±99 15,253±465
pYeDP60-CYPE10/1041 не выявлено не выявлено
а Количество импульсов в минуту ^^-норникотина/мг микросомального белка.
б Стандартное отклонение, полученное при применении двух технических повторностей.
Никотиндеметилазную активность клеток дрожжей, экспрессирующих CYP82E10 дикого типа и мутант 1041, анализировали также in vivo. Культуры дрожжей встряхивали в течение ночи в присутствии 55 мкМ ^^-никотина, экстрагировали метанолом и анализировали с помощью тонкослойной хроматографии. ^^-Норникотин был обнаружен в экстрактах дрожжей, экспрессирующих CYP82E10 дикого типа, но он не был обнаружен в мутантной версии 1041 гена (данные не представлены). В целом, анализ экспрессии в дрожжах позволил предположить, что функция фермента CYP82E10 с большой вероятностью полностью элиминируется при интродукции мутации 1041.
Пример 3. Объединение мутантных аллелей cyp82е10, cyp82e4v2 и cyp82e5v2.
С учетом того, что исходная мутация 1041 присутствует в генетическом фоне (DH98-325-6), который соответствует как аллелю сильного конвертера CYP82E4v2, так и гену CYP82E5v2 дикого типа,
- 24 033565 единственный путь точного анализа специфического вклада CYP82E10 в общее содержание норникотина в растении, предусматривал интродукцию мутации 1041 в растения табака, которые несли также приводящие к выключению мутации CYP82E4v2 и CYP82E5v2. Для этой цели растения, гетерозиготные по мутации 1041 (e10E10), скрещивали с растениями, гетерозиготными по обеим описанным выше мутациям 775 и 1013 (е4Е4/е5Е5). Последние растения представляли собой потомков, полученных после скрещивания 775/1013//TN90/3/TN90/4/TN90. Растения поколения F1, гетерозиготные по всем трем мутациям никотиндеметилаз (е4Е4/е5Е5/e10Е10), идентифицировали путем молекулярного генотипирования и давали самоопыляться. Молекулярное генотипирование применяли также для скрининга свыше 400 растений поколения F2 и затем группировали их в следующие генотипические классы: Е4Е4/Е5Е5/e10e10 (всего 3 растения); е4е4/Е5Е5/e10e10 (всего 4 растения); Е4Е4/е5е5/e10e10 (всего 5 растений) и e4e4/e5e5/e10e10 (всего 5 растений).
Все указанные выше растения пересаживали и выращивали в полевых условиях на исследовательской станции Upper Coastal Plains в г. Роки-Маунт, шт. Северная Каролина летом 2009 г. В этом опыт включали также два из тестированных в полевом опыте, проведенных в 2008 г., генотипов, которые представлены в табл. 1. В частности, для сравнения в опыт включали десять растений DH98-325-6, гомозиготных только по мутации cyp82e4v2 (е4е4/Е5Е5/Е10Е10), и одиннадцать растений DH98-325-6, имеющих генотип, гомозиготный по двум мутациям е4е4/е5е5/Е10Е10. В опыт включали также в качестве контролей отдельные растения, произвольно отобранные из лота поступающих в продажу семян слабого конвертера (TN90LC), особи DH98-325-6 дикого типа и растения из наиболее эффективных трансгенных линий, у которых для подавления CYP82E4v2 использовали РНКт После достижения растениями высоты в среднем 30 см (35 дней после пересадки) собирали листья, одинаково расположенные на стебле, обрабатывали этефоном и сушили на воздухе согласно протоколу, разработанному Jack и др., 2007. Содержание алкалоидов высушенного листового материала определяли с помощью газовой хроматографии согласно указанному протоколу.
В табл. 4 и на фиг. 4 представлены результаты анализа алкалоидов, полученные при проведении полевого опыта в 2009 г. В соответствии с полученными ранее данными индивидуальная вызывающая выключение мутация cyp82e4v2 оказывала отрицательное воздействие на фенотип сильного конвертера линии DH98-325-6, а также приводила к проявлению фенотипа, отличающегося существенно более низким уровнем накопления норникотина по сравнению с растениями, выращенными из поступающих в продажу семян TN90LC (уровень превращения 2,2% по сравнению с 7,1% соответственно). Как установлено в полевом опыте, проведенном в 2008 г. (табл. 1), объединение мутации cyp82e5v2 с мутацией cyp82e4v2 не приводило к дальнейшему снижению содержания норникотина. Так, средний уровень превращения в растениях генотипа e4e4/E5E5/E10E10 был фактически ниже по сравнению с уровнем превращения в особях генотипа е4е4/е5е5/Е10Е10 (2,2% по сравнению с 2,3%), однако указанное небольшое различие оказалось статистически незначимым. Как и ожидалось, мутация сур82e10 не влияла на высокий уровень норникотина, обусловленный активным геном CYP82E4v2, либо индивидуально (генотипы Е4Е4/Е5Е5/e10e10), либо в сочетании с мутантным аллелем cyp82e5v2 (генотипы Е4Е4/е5е5/e10e10) (фиг. 4А). Аналогично результатам, полученным для двойного мутанта cyp82e4v2 и cyp82e5v2 (табл. 1 и 4), интродукция сур82e10 в генетический фон cyp82e4v2 не обладала эффективностью в отношении снижения уровней норникотина по сравнению с уровнями, которые достигались при наличии только мутации cyp82e4v2 (фиг. 4Б). Для генотипов е4е4/Е5Е5/e10e10 характерно превращение в среднем 1,85%, что статистически незначимо отличалось от среднего уровня превращения 2,2%, обнаруженного для особей, имеющих генотип е4е4/Е5Е5/Е10Е10 (Р = 0,235).
- 25 033565
Таблица 4 Профили алкалоидов в экспериментальном материале, которые оценивали в полевом опыте в 2009 г. Для оценки использовали листья, собранные через 35 дней после пересадки. Величины, выраженные в процентах, представляют собой средние значения
Генотип Ген-мишень Мутация6 Аминокислотная замена Содержание никотина (%) Содержание норникотина (%) Содержание анабазина (%) Содержание анатабина (%) % превращения'
DH98-325-6 контроль (8)а контроль - 0,133 1,553 0,009 0,085 92,21
TN90LC (11) контроль - - 1,519 0,104 0.002 0,065 7,15
DH98-325-6 PHKi 30002 №1 (10) CYP82E4v2 и родственные гены - 1,747 0,009 0,003 0,063 0,64
DH98-325-6 №775 гомозиготный (10) CYP82E4v2 G986A W329Stop 1,375 0,030 0,0002 0,057 2,20
DH98-325-6 двойной гомозиготный мутант (И) CYP82E4v2 CYP82E5v2 двойная двойная 1,524 0,036 0,003 0,084 2,34
DH980325-6 №1041 гомозиготный (3) CYP82E10 C1141T P381S 0,082 1,302 0,007 0,073 93,87
DH98-325-6 двойной гомозиготный мутант (5) CYP82E5v2 CYP82EI0 двойная двойная 0,081 1,345 0,010 0,068 94,31
DH98-325-6 двойной гомозиготный мутант (4) CYP82E4v2 CYP82E101 двойная двойная 2,168 0,045 0,004 0,087 1,85
DH98-325-6 двойной гомозиготный мутант (5) CYP82E4v2 CYP82E5v2 CYP82E10 тройная тройная 1,793 0,012 0,003 0,056 0,055
а Числа в скобках обозначают общее количество проанализированных растений.
б Нумерация относительно стартового кодона последовательности кДНК.
в Проценты рассчитывали на основе сухой массы табака.
г Процент превращения никотина определяли из уравнения [% норникотина/(% норникотина + % никотина)] х 100.
Хотя мутации cyp82e5v2 и сур82e10 не приводили к значимому снижению содержания норникотина в несущих cyp82e4v2 растениях, при объединении индивидуальных мутаций наличие всех трех мутаций никотиндеметилаз оказывало заметное действие. Превращение никотина в норникотин в несущих три мутации растениях (е4е4/е5е5/e10e10) составляло в среднем только 0,55%, т.е. процент фактически идентичен 0,54%, обнаруженному в трансгенной линии, полученной путем подавления с помощью РНК1 (Р = 0,893; фиг. 4Б). Это представляет собой практически 3-кратное снижение превращения никотина по сравнению со снижением, опосредуемой только мутацией cyp82e4v2. Различия в проценте превращении никотина (и накоплении норникотина в процентах в пересчете на общую сухую массу) между генотипами е4е4/Е5Е5/Е10Е10 и е4е4/е5е5/e10e10 оказалось статистически высокозначимыми (Р < 0,0001). Аналогично результатам, полученным в исследовании опосредуемого РНК1-подавления превращения никотина (Lewis и др., 2008), не является очевидным, что наличие нетрансгенного изменения активности никотиндеметилаз в растении табака, может приводить к существенному изменению содержания минорных видов алкалоидов анатабина и анабазина.
Влияние одновременного присутствия трех независимых мутаций генов никотиндеметилаз тестировали также в полевом опыте, проведенном в вегетационный сезон в 2010 г. Для этого исследования осуществляли скрещивание полного генетического фона DH98-325-6 (в отличие от опыта, проведенного в 2009 г., в котором применяли также в качестве родителя TN90). И в этом исследовании применяли молекулярное генотипирование для создания каждой из возможных комбинаций, необходимых для определения относительного вклада каждого локуса CYP82E в фенотип, касающийся норникотина. Получали данные о профилях алкалоидов в растениях табака, которые выращивали до стадии созревания и сушили согласно стандартной промышленной практике. Как видно из табл. 5, высокой уровень превращения никотина (составляющий от 52,4 до 65,59%) обнаружен во всех генотипах, гомозиготных по гену CYP82E4v2 дикого типа (генотипы Е4Е4/Е5Е5/Е10Е10, Е4Е4/е5е5/Е10Е10, Е4Е4/Е5Е5/e10е10 и Е4Е4/е5е5/e10е10). В растениях, гомозиготных только по мутации cyp82e4v2 (e4e4/E5E5/E10E10), средний уровень превращения никотина в норникотин составлял 2,91%.
Аналогично результатам, полученным в 2009 г., установлено, что воздействие мутаций cyp82E5v2 и сур82Е10 не было аддитивным и проявлялось только в случае, когда все три мутантных локуса накапливались вместе. В растениях DH98-325-6 (е4е4/Е5Е5/e10е10) средние уровни превращения составляли 2,89%, и в особях DH98-325-6 (е4е4/е5е5/Е10Е10) средние уровни превращения составляли 2,52%, т.е. эти значения не отличались статистически достоверно от уровней, обнаруженных при наличии только мутации cyp82e4v2. В противоположность этому, снижение уровня норникотина, обнаруженное в растениях с включающим три мутации генотипом DH98-325-6 (е4е4/е5е5^10е10) (уровень превращения никотина 1,11%) оказался в 2,6 раз ниже по сравнению с уровнем, обусловленным присутствием только мутации cyp82e4v2. Снижение уровня превращения никотина, связанное с наличие комбинации трех мутаций, оказалось статистически высоко значимым (Р<0,001) по сравнению с присутствием как только мутации cyp82e4v2, так и комбинации двух мутаций.
- 26 033565
Таблица 5 Профили алкалоидов для генотипов DH98-325-6, несущих различные комбинации мутаций в локусах CYP82E4v2 (E4), CYP82Ev25 (Е5) и CYP82E10 (E10). Данные представляют собой средние значения, полученные по пяти повторностям, и полученные с помощью анализа смеси, содержащей измельченные образцы четвертого и пятого листа, взятых с верхушки растения
Генотип Содержание никотина(%) Содержание норникотина(%) Содержание анабазина (%) Содержание анатабина (%) % превращения
DH98-325-6 Е4Е4 Е5Е5 Е10Е10 1,76 2,46 0,02 0,17 58,66
DH98-325-6 е4е4 Е5Е5 ЕЮЕЮ 2,61 0,08 0,01 0,09 2,91
DH98-325-6 Е4Е4 е5е5 Е10Е10 1,08 2,06 0,02 0,14 65,59
DH98-325-6 Е4Е4 Е5Е5 еЮеЮ 1,40 1,96 0,01 0,13 59,30
DH98-325-6 е4е4 е5е5 ЕЮЕЮ 3,25 0,09 0,02 0,16 2,89
DH98-325-6 е4е4 Е5Е5 еЮеЮ 3,59 0,09 0,01 0,12 2,52
DH98-325-6 Е4Е4 е5е5 еЮеЮ 1,59 1,72 0,01 0,09 52,40
DH98-325-6 е4е4 е5е5 еЮеЮ 4,18 0,05 0,02 0,13 1,11
Процентное содержание алкалоидов рассчитывали на основе сухой массы. Процент превращения никотина определен из уравнения: [% норникотина/(% норникотина + % никотина)] х 100.
Заключение.
На основе представленного и охарактеризованного в настоящем описании нового гена никотиндеметилазы, CYP82E10, оказалось возможным разработать стратегию снижения уровней превращения никотина (и, как следствие, снижения уровней норникотина) в листьях имеющих коммерческое значения высушенных на воздухе растений табака до уровней, которые ранее можно было получать только с использованием подходов, основанных на применении трансгенов. Такая не основанная на применении ГМО технология может обеспечивать снижение уровней норникотина до уровня, близкого к уровню, который достигался с помощью основанных на применении трансгенов стратегий, при этом она обладает очень большим преимуществом, поскольку открывает пути создания сортов табака с ультранизким содержанием норникотина, обходя при этом значительные барьеры, ассоциированные с коммерциализацией трансгенных культур, такие как: (1) переговоры и оплата лицензионных пошлин за некоторые разрешенные технологии, требуемые для создания трансгенных растений; (2) необходимость избегать больших временных и обременительных материальных затрат, ассоциированных с нарушением регуляции трансгенных случаев; и (3) возможность получения отказа от продукта конечными потребителями, жизненная философия которых не допускает применение ГМО. Исследование, представленное в настоящем описании, представляет собой очень значительное достижение с позиций возможности снижения уровней одного из наиболее хорошо известных сильных карциногенов, обнаруженного в табачных изделиях, по сравнению с описанными ранее стратегиями, не основанными на использовании ГМО, направленными на интродукцию мутаций только в ген CYP82E4v2 никотиндеметилазы (Julio и др., 2008; Xu и др., 2007б) или объединенных мутаций CYP82E4v2 и CYP82E5v2 (Dewey и др., 2007). С помощью трансгенных технологий ранее продемонстрировано, что снижение уровней превращения никотина с ~2,6 до ~0,5% в высушенных листьях приводит также к соответственному снижению NNN в листьях (Lewis и др., 2008). Следует ожидать также аналогичного снижения содержания NNN в листьях табака, содержащих комбинацию трех мутаций (е4е4/е5е5/e10е10), представленную в настоящем описании. Хотя эта технология исходно была разработана для табака, предназначенного для сушки на воздухе, ее с успехом можно применять для сортов, которые предназначены для сушки на пару. По мере старения теплообменников их способность удалять газы NOx в процессе сушки на пару может снижаться. Кроме того, в современных исследованиях установлено, что при хранении высушенных листьев может происходить образование значительных количеств TSNA. Минимизация уровней норникотина посредством интродукции комбинации трех мутантов в сорта, предназначенные для сушки на пару, может являться средством защиты от образования NNN либо в процессе хранения, либо в результате неэффективного теплообмена в процессе сушки.
- 27 033565
Ссылки
Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W. и Lipman D.J., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410.
Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. и Lipman D.J., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res 25, 1997, cc. 3389-3402.
Brogan A.P., Dickerson T.J., Boldt G.E. и Janda K.D., Altered retinoid homeostasis catalyzed by nicotine metabolite: implications in macular degeneration and normal development, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 10433-10438.
Boyette M.D. и Hamm L.A., Results of year 2000 TSNA sampling program in flue-cured tobacco, Rec. Adv. Tob. Sci. 27, 2001, cc. 17-22.
Bush L.P., Cui M., Shi PL, Burton H.R., Fannin F.F., Lei L. и Dye N., Formation of tobacco-specific nitrosamines in air-cured tobacco, Rec. Adv. Tob. Sci. 27, 2001, cc. 23-46.
Chakrabarti M., Meekins K.M., Gavilano L.B. и Siminszky B., Inactivation of the cytochrome P450 gene CYP82E2 by degenerative mutations was a key event in the evolution of the alkaloid profile of modern tobacco, New Phytol. 175, 2007, cc. 565-574.
Dewey R.E., Siminszky B., Bowen S.W. и Gavilano L., Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome P450 genes, заявка на патент США 60/987243, 2007.
Dickerson T.J. и Janda K.D., A previously undescribed chemical link between smoking and metabolic disease, Proc. NatL Acad. Sci. USA 99, 2002, cc. 1508415088.
- 28 033565
Gavilano L.B., Coleman N.P., Bowen S.W. и Siminszky B., Functional analysis of nicotine demethylase genes reveals insights into the evolution of modern tobacco, J. Biol. Chem. 282, 2007, cc. 249-256.
Gavilano L.B. и Siminszky B., Isolation and characterization of the cytochrome P450 gene CYP82E5v2 that mediates nicotine to nornicotine conversion in the green leaves of tobacco, Plant Cell Physiol. 48, 2007, cc. 1567-1574.
Hecht S.S., Biochemistry, biology and carcinogenicity of tobacco-specific Nnitrosamines, Chem. Res. Toxicol. 11, 1998, cc. 559-603.
Hecht S.S., Tobacco carcinogens, their biomarkers and tobacco-induced cancer, Nature Rev. 3, 2003, cc. 733-744.
Hecht S.S. и Hoffmann D., The relevance of tobacco specific nitrosamines to human cancer, Cancer Surveys 8, 1990, cc. 273-294.
Hoffmann D., Brunnemann K.D., Prokopczyk В. и Djordjevic M.V., Tobaccospecific N-nitros amines and Areca-derived N-nitrosamine chemistry, biochemistry, carcinogenicity and relevance to humans, J. Toxicol. Environ. Health 41, 1994, cc. 152.
Jack A., Fannin N. и Bush L.P., Implications of reducing nornicotine accumulation in burley tobacco: Appendix A - The LC Protocol. Rec. Adv. Tob. Sci. 33, 2007, cc. 58-79.
Julio E., Laporte F., Reis S., Rothan С. и Dorlhac de Borne F., Reducing the content of nornicotine in tobacco via targeted mutation breeding, Mol. Breed. 21, 2008, cc. 369-381.
Katz J., Caudle R.M., Bhattacharyya I., Stewart CM. и Cohen D.M., Receptor for advanced glycation end product (RAGE) upregulation in human gingival fibroblasts incubated with nornicotine, J. Periodontal. 76, 2005, cc. 1171-1174.
Lewis R.S., Jack A.M., Morris J.W., Robert V.J.M., Gavilano L., Siminszky B., Bush L.P., Hayes A. J. и Dewey R.E., RNAi-induced suppression of nicotine demethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves, Plant Biotech. J. 6, 2008, cc. 346-354.
Peele D.M. и Gentry J.S., Formation of tobacco-specific nitrosamines in fluecured tobacco, COPvESTA Meeting, Agro-Phyto Groups, Suzhou, China, 1999.
Pompon D., Louerat B., Bronne А. и Urban P., Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments, Methods Enzymol. 272, 1995, cc. 5164.
Siminszky B., Gavilano L., Bowen S.W. и Dewey R.E., Conversion of nicotine to nornicotine in Nicotiana tabacum is mediated by CYP82E4, a cytochrome P450 monooxygenase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 14919-14924.
Wernsman E.A. и Matzinger D.F., Time and site of nicotine conversion in tobacco, Tob. Sci. 12, 1968, cc. 226-228.
Xu D., Shen Y., Chappell J., Cui M. и Nielsen M., Biochemical and molecular characterization of nicotine demethylase in tobacco, Physiol. Plantarum 129, 2007a, cc. 307-319.
Xu D., Nielsen M.T. и Shen Y., Tobacco plants having a mutation in a nicotine demethylase gene, заявка на патент CHIA 20070199097, 2007b.
Целый ряд модификаций и других вариантов осуществления представленного в настоящем описании изобретения должен стать очевидным для специалиста в области, к которой относится данное изо
- 29 033565 бретение, после ознакомления с его преимуществами, изложенными в приведенном выше описании, и прилагаемыми чертежами. Таким образом, следует понимать, что объем изобретения не ограничен конкретными представленными в настоящем описании вариантами изобретения и под объем перечисленных вариантов осуществления изобретения и прилагаемой формулы изобретения подпадают также модификации и другие варианты осуществления изобретения. Хотя в настоящем описании использованы конкретные понятия, они применяются только в их общем и описательном смысле и не направлены на ограничение объема изобретения.
Все процитированные в описании публикации и заявки на патент отражают уровень техники, известный специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и заявки на патент включены в настоящее описание в качестве ссылки в той же самой степени, как если бы было указано, что каждая индивидуальная публикация или заявка на патент была конкретно и индивидуально включена в качестве ссылки.
Перечень последовательностей <110> НОРТ КАРОЛИНА СТЕЙТ ЮНИВЕРСИТИ <120> Композиции и способы, предназначенные для минимизации синтеза никотина в растениях табака <130> 035051/400712 <150> 61/295,671 <151> 2010-01-15 <160> 40 <170> FastSEQ для версии 4.0 Windows <210> 1 <211> 1551 <212> ДНК <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> CDS <222> (1) . . . (1551) <223> Кодирует никотиндеметилазу CYP82E10 <400> 1
atg Met 1 gtt Vai tet Ser ccc Pro gta Vai 5 gaa Glu gcc Ala ate He gta Vai gga Gly 10 eta Leu gta Vai act Thr ett Leu аса Thr 15 ett Leu 48
etc ttc tac ttc ata egg acc aaa aaa tet caa aaa cct tea aaa cca 96
Leu Phe Tyr Phe lie Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
tta cca ccg aaa ate ccc gga ggg tgg ccg gta ate ggc cat ett ttc 144
Leu Pro Pro Lys lie Pro Gly Gly Trp Pro Vai lie Gly His Leu Phe
35 40 45
tat ttc gat gac gac age gac gac cgt cca tta gca ega aaa etc gga 192
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
gac tta get gac aaa tac ggc ccg gtt ttc act ttt egg eta ggc ett 240
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
- 30 033565
ccg Pro ett Leu gtg Vai tta Leu gtt Val 85 gta Val age Ser agt Ser tac Tyr gaa Glu 90 get Ala ata He aaa Lys gac Asp tgc Cys 95 ttc Phe 288
tct аса aat gat gee att ttc tcc aat cgt cca get ttt ett tat ggc 336
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
gaa tac ett ggc tac aat aat gcc atg eta ttt ttg аса aaa tac gga 384
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
cct tac tgg ega aaa aat aga aaa tta gtc att cag gaa gtt etc tgt 432
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Cys
130 135 140
get agt cgt etc gaa aaa ttg aag cac gtg aga ttt ggt gaa att cag 480
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
acg age att aag aat tta tac act ega att gat gga aat teg agt acg 528
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
ata aat eta acc gat tgg tta gaa gaa ttg aat ttt ggt etg ate gtg 576
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
180 185 190
aaa atg ate get ggg aaa aat tat gaa tcc ggt aaa gga gat gaa caa 624
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
gtg gag aga ttt agg aaa geg ttt aag gat ttt ata att tta tea atg 672
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
gag ttt gtg tta tgg gat get ttt cca att cca ttg ttc aaa tgg gtg 720
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
gat ttt caa ggc cat gtt aag gcc atg aaa agg аса ttt aag gat ata 768
Asp Phe Gin Gly His Va 1 Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
gat tct gtt ttt cag aat tgg tta gag gaa cat gtc aag aaa aaa gaa 816
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
- 31 033565
ааа Lys atg Met gag Glu 275 gtt Vai aat Asn gca Ala gaa Glu gga Gly 280 aat Asn gaa Glu caa Gin gat Asp ttc Phe 285 att He gat Asp gtg Val 864
gtg ett tea aaa atg agt aat gaa tat ett gat gaa ggc tac tet cgt 912
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
gat act gtc ata aaa gca аса gtg ttt agt tta gtc ttg gat get geg 960
Asp Thr Vai lie Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
gac аса gtt get ett cac atg aat tgg gga atg gca tta ttg ata aac 1008
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
aat caa cat gee ttg aag aaa geg caa gaa gag ata gat aaa aaa gtt 1056
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Val
340 345 350
ggt aag gat aga tgg gta gaa gag agt gat att aag gat ttg. gta tac 1104
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp lie Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
etc caa act att gtt aaa gaa gtg tta ega tta tat cca ccg gga cct 1152
Leu Gin Thr lie Vai Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
tta tta gta ccc cat gaa aat gta gag gat tgt gtt gtt agt gga tat 1200
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 3 90 395 400
cac att cct aaa ggg act aga eta ttc geg aac gtt atg aaa tta cag 1248
His lie Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gin
405 410 415
ege gat cct aaa etc tgg tea aat cct gat aag ttc gat cca gag aga 1296
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
ttt ttc get get gat att gac ttt cgt ggt caa cac tat gag ttt ate 1344
Phe Phe Ala Ala Asp lie Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
cca ttt ggt tet gga e.ga ega tet tgt ccg ggg atg act tat gca atg 1392
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
- 32 033565
450 455 460
саа Gin 465 gtg Vai gaa Glu cac His eta Leu аса Thr 470 ate lie gca Ala cac His ttg Leu ate He 475 cag Gin ggt Gly ttc Phe aat Asn tac Tyr 480 1440
ааа act cca aat gac gag ccc ttg gat atg aag gaa ggt gca gga tta 1488
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
act ata cgt aag gta aat cct ata gaa gtg gta att acg cct ege etg 1536
Thr lie Arg Lys Vai Asn Pro He Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
аса cct gag ctt tat 1551
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 2 <211> 517
<212 <213 > PRT tabacum
:> N: icotiana
<400 > 2
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala lie Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
Thr Ser lie Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
- 33 033565
He Asn Leu Thr 180 Asp Trp Leu Glu Glu 185 Leu Asn Phe Gly Leu 190 He Vai
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 3 90 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp lie Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro He Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 3
- 34 033565
<211> 818
<212> ДНК
<213> Nictoiana tabacum
<220>
<221> интрон
<222> (1) ... (818)
<223> Интрон гена CYP82E10
<400> 3
gtaagttcat ctcatttttc atttattctt tgaggaatag acaggttaat agtaatttaa60 gtaattagat tatctaaata ctaaggatga gtaaatatgg caaaaatata gaatgataaa120 tggaaaagga tgataatttt ttatgcccgg actaatctaa ctttgggagt taaagcactt180 cctaccaata gggacttttc ttcaagctcg atcttgatga aactctgtgg ttaaaaaaat240 gagatatanc caattataat tgatagaata aaactttatt actcccattg agcataacaa300 aacaaaaaaa agtaaaggga cttcttctct tttttaggga gaaattcttt gattgtttgt360 taatatagat tcatgttttt ttttatttct aataataatt gtgcttgaat caggtcgcgc420 tgattcttgg ctttttagca gcaatagagt caaagctaat atacatatta tttggttttc480 gaataagtta tactgaaatt atataatacg ggtattaaat aataacatga ttatttatag540 gatatgcttt ttttattggg taaatatatt ttttttaatt aaaaatgaaa tatacaagta600 aggtataaaa cactatttga ttttacacta gataaatttg ccctcgtaca tctctaagag660 aagagctgaa ataaatgaat tttaaatttc agaaaaaaat aaattcatta gtataatgag720 atgtcgatac ttgacaatta ctatactaac tagaacaagg ttcagcagat agtgacgcta780 acctattttt gtattgaatt attctaattt gtccacag818 <210> 4 <211> 2636 <212> ДНК <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> 5'UTR <222> (1).,. (114) <223> 5' UTR CYP82E10 <220>
<221> экзон <222> (115)...(1053) <223> Последовательность экзона 1 CYP82E10 <220>
<221> интрон <222> (1054) . . . (1871) <223> Последовательность интрона CYP82E10 <220>
<221> экзон <222> (1872) ...(2483) <223> Последовательность экзона 2 CYP82E10 <220>
- 35 033565 <221> 3'UTR
<222> (2484)...(2636)
<223> 3’ UTR CYP82E10
<400> 4
ttttcaattt ttgttacttt tgtatttatc atattattat gcatagccct aaattatcta 60
taaaagggaa gttggtgata gtttgat t cc caagtgcttt tctaaaaatc cataatggtt 120
tctcccgtag aagccatcgt aggactagta actcttacac ttctcttcta cttcatacgg 180
accaaaaaat ctcaaaaacc ttcaaaacca ttaccaccga aaatccccgg agggtggccg 240
gtaatcggcc atcttttcta tttcgatgac gacagcgacg accgtccatt agcacgaaaa 300
ctcggagact tagctgacaa atacggcccg gttttcactt ttcggctagg ccttccgctt 360
gtgttagttg taagcagtta cgaagctata aaagactgct tctctacaaa tgatgccatt 420
ttctccaatc gtccagcttt tctttatggc gaataccttg gctacaataa tgccatgcta 480
tttttgacaa aatacggacc ttactggcga aaaaatagaa aattagtcat tcaggaagtt 540
ctctgtgcta gtcgtctcga aaaattgaag cacgtgagat ttggtgaaat tcagacgagc 600
attaagaatt tatacactcg aattgatgga aattcgagta cgataaatct aaccgattgg 660
ttagaagaat tgaattttgg tctgatcgtg aaaatgatcg ctgggaaaaa ttatgaatcc 720
ggtaaaggag atgaacaagt ggagagattt aggaaagcgt ttaaggattt tataatttta 780
tcaatggagt ttgtgttat g ggatgctttt ccaattccat tgttcaaatg ggtggatttt 840
caaggccatg ttaaggccat gaaaaggaca tttaaggata tagattctgt ttttcagaat 900
tggttagagg aacatgtcaa gaaaaaagaa aaaatggagg ttaatgcaga aggaaatgaa 960
caagatttca ttgatgtggt gctttcaaaa atgagtaatg aatatcttga tgaaggctac 1020
tctcgtgata ctgtcataaa agcaacagtg tttgtaagtt catctcattt ttcatttatt 1080
ctttgaggaa tagacaggtt aatagtaatt taagtaatta gattatctaa atactaagga 1140
tgagtaaata tggcaaaaat atagaatgat aaatggaaaa ggatgataat tttttatgcc 1200
cggactaatc taactttggg agttaaagca cttcctacca atagggactt ttcttcaagc 1260
tcgatcttga tgaaactctg tggttaaaaa aatgagatat anccaattat aattgataga 1320
ataaaacttt attactccca ttgagcataa caaaacaaaa aaaagtaaag ggacttcttc 1380
tcttttttag ggagaaattc tttgattgtt tgttaatata gattcatgtt tttttttatt 1440
tctaataata attgtgcttg aatcaggtcg cgct gattct tggcttttta gcagcaatag 1500
agtcaaagct aatatacata ttatttggtt ttcgaataag ttatactgaa attatataat 1560
acgggtatta aataataaca tgattattta taggatatgc tttttttatt gggtaaatat 1620
atttttttta attaaaaatg aaatatacaa gtaaggtata aaacactatt tgattttaca 1680
ctagataaat ttgccctcgt acatctctaa gagaagagct gaaataaatg aattttaaat 1740
ttcagaaaaa aataaattca ttagtataat gagatgtcga tacttgacaa ttactatact 1800
aactagaaca aggttcagca gatagtgacg ctaacctatt tttgtattga attattctaa 1860
tttgtccaca gagtttagtc ttggatgctg cggacacagt tgctcttcac atgaattggg 1920
gaatggcatt attgataaac aatcaacatg ccttgaagaa agcgcaagaa gagatagata 1980
aaaaagttgg t aaggataga tgggtagaag agagtgatat taaggatttg gtatacctcc 2040
aaactattgt taaagaagtg ttacgattat atccaccggg acctttatta gtaccccatg 2100
aaaatgtaga ggattgtgtt gttagtggat atcacattcc taaagggact agactattcg 2160
cgaacgttat gaaattacag cgcgatccta aactctggtc aaatcctgat aagttcgatc 2220
cagagagatt tttcgctgct gatattgact ttcgtggtca acactatgag tttatcccat 2280
ttggttctgg aagacgatct tgtccgggga tgacttatgc aatgcaagtg gaacacctaa 2340
caatcgcaca cttgatccacj ggtttcaatt acaaaactcc aaatgacgag cccttggata 2400
tgaaggaagg tgcaggatta actatacgta aggtaaatcc tatagaagtg gtaattacgc 2460
ctcgcctgac acctgagctt: tattaaaatc taagatgttt tatcttggtt gatcattgtt 2520
taatactcct agatagatggt gtattcatct atctttttaa aattaattgt cagtacgagt 2580
- 36 033565 gtttctaatt tggtaagttt gtaacaacaa gtaaagaagg attgtgctag tatgta 2636
<210> 5
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант <222> (1) . . . (517) <223> Вариант CYP82E10 L148F <400> 5
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Phe Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met lie Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
- 37 033565
275 280 285
Val Leu 290 Ser Lys Met Ser Asn 295 Glu Tyr Leu Asp Glu 300 Gly Tyr Ser Arg
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr lie Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp lie Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Val Glu His Leu Thr He Ala His Leu lie Gin Gly Phe Asn Tyr
465 4 70 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro He Glu Val Val He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 6 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1)...(517) <223> Вариант CYP82E10 G172R <400> 6
Met Val Ser Pro Val Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
- 38 033565
Leu Pro Pro 35 Lys He Pro Gly Gly 40 Trp Pro Vai He Gly 45 His Leu Phe
Туг Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Arg Asn Ser Ser Thr
165 170 175
lie Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met lie Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
- 39 033565
405 410 415
Arg Asp Pro Lys 420 Leu Trp Ser Asn Pro 425 Asp Lys Phe Asp Pro 430 Glu Arg
Phe Phe Ala Ala Asp He Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe lie
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr lie Arg Lys Vai Asn Pro He Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 7
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222> (1) . . · (7)
<223> Вариант CYP82E10 A344T
<400> 7
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala 11 e Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn 165 Leu Tyr Thr Arg He 170 Asp Gly Asn Ser Ser 175 Thr
lie Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Thr Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp He Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe lie
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 4 70 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro He Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
- 41 033565
<210> 8
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант <222> (1) . .. (517) <223> Вариант CYP82E10 Α410Τ <400> 8
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe lie He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
- 42 033565
275280
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu
290295
Asp Thr Vai lie Lys Ala Thr Vai
305310
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn
325
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala
340
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu
355360
Leu Gin Thr lie Vai Lys Glu Vai
370375
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai
385390
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu
405
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn
420
Phe Phe Ala Ala Asp He Asp Phe
435440
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser
450455
Gin Vai Glu His Leu Thr He Ala
465470
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu
485
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro He
500
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
285
Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
300
Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
315320
Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
330335
Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
345350
Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr 365.
Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
380
Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
395400
Phe Thr Asn Vai Met Lys Leu Gin
410415
Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
425430
Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe lie
445
Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
460
His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
475480
Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
490495
Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
505510 <210> 9 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1),.. (517) <223> Вариант CYP82E10 R417H <400> 9
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He
5
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys
Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
15
Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly
3540
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp
5055
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro
6570
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser 85
Ser Thr Asn Asp Ala Tie Phe Ser
100
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala
115120
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys
130135
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys
145150
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr
165
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu
180
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr
195200
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe
210215
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe
225230
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala
245
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu
260
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly
275280
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu
290295
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai
305310
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn
325
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala
340
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu
355360
Leu Gin Thr He Vai Lys Glu Vai
370375
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai
385390
His lie Pro Lys Gly Thr Arg Leu
Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe 45
Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly 60
Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
7580
Tyr Glu Ala lie Lys Asp Cys Phe
9095
Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
105110
Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly 125
Leu Vai lie Gin Glu Vai Leu Cys
140
His Vai Arg Phe Gly Glu lie Gin
155160
Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
170175
Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
185190
Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
205
Lys Asp Phe He lie Leu Ser Met
220
Pro lie Pro Leu Phe Lys Trp Vai
235240
Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
250255
Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
265270
Asn Glu Gin Asp Phe lie Asp Vai 285
Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg 300
Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
315320
Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
330335
Gin Glu Glu lie Asp Lys Lys Vai
345350
Ser Asp lie Lys Asp Leu Vai Tyr 365
Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 380
Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
395 400
Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
- 44 033565
405 410 415
His Asp Pro Lys 420 Leu Trp Ser Asn Pro 425 Asp Lys Phe Asp Pro 430 Glu Arg
Phe Phe Ala Ala Asp He Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Val Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro He Glu Val Val He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 10
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант <222> (1)...(517) <223> Вариант CYP82E10 P419S <400> 10
Met Val Ser Pro Val Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala lie Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu He Gin
- 45 033565
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 4 10 415
Arg Asp Ser Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp He Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro He Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
- 46 033565
<210> 11
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант <222> (1) . . . (517) <223> Вариант CYP82E10 G79S
<400> 11
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Туг Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Ser Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 270
- 47 033565
Lys Met Glu 275 Val Asn Ala Glu Gly 280 Asn Glu Gin Asp Phe 285 He Asp Val
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr He Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp He Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Val Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro lie Glu Val Val He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 12 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotians tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1) . .. (517) <223> Вариант CYP82E10 P107S <400> 12
Met Val Ser Pro Val Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
10 15
- 48 033565
Leu. Phe Tyr Phe 20 He Arg Thr Lys Lys 25 Ser Gin Lys Pro Ser 30 Lys Pro
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 7 5 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Ser Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu lie Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu lie Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Val
34 0 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr He Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
- 49 033565
400
385
390
395
His He Pro Lys Gly 405 Thr Arg Leu Phe Ala 410 Asn Vai Met Lys Leu 415 Gin
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp Tie Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr lie Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 4 70 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro He Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 13
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222 :> (1) .. .(517)
<223 :> Вариант CYP82E10 P381S
<400 > 13
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe He Arg Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala He Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 HO
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Cys
- 50 033565
130
135
140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Glu He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg lie Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met lie Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 2 30 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Lys Glu
260 265 27 0
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Thr He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Ser Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 3 90 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp He Asp Phe Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
4 65 4 70 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro He Glu Vai Vai He Thr Pro Arg Leu
500 505 510
- 51 033565
Thr Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 14 <2H> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 14
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Phe Thr Phe
10 15
Leu Phe Phe Phe 20 Leu Trp Thr Lys Lys 25 Ser Gin Lys Pro Ser 30 Lys Pro
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala lie Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai Tie Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175 lie Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He 195 Ala Gly Lys Asn Tyr 200 Glu Ser Gly Lys Gly 205 Asp Glu Gin
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
- 52 033565
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
P.he He Ala Thr Asp He Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Arg Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
485 490 495
Thr lie Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 15 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1) . . . (517) <223> Вариант CYP82E4 P38L <400> 15
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Leu Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg lie Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
- 54 033565
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp
420
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe
435440
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser
450455
Gin Vai Glu His Leu Thr Met Ala
465470
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu 485
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai
500
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
425 430
Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr lie 445
Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu 4 60
His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
475480
Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly lie
490495
Glu Leu lie He Ala Pro Arg Leu
505510 <210> 16 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (])... (517) <223> Вариант CYP82E4 D171N <400> 16
Met Leu Ser Pro He Glu Ala lie 1 5
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys 20
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly
3540
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp
5055
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro
65TO
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser 85
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser
100
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala
115120
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys
130135
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys
145150
Vai Gly Leu Vai Thr Phe Thr Phe
1015
Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro 2530
Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe 45
Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly 60
Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
7580
Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
9095
Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
105110
Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
125
Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Ser
140
His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
155 160
- 55 033565
Ala Ser He Lys Asn 165 Leu Tyr Thr Arg He 170 Asn Gly Asn Ser Ser 175 Thr
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu lie Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Ash Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met . Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu lie Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 3 90 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe He Ala Thr Asp lie Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 4 70 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
- 56 033565 <210> 17 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1) . . . (517) <223> Вариант CYP82E4 Е201К <400> 17
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Lys Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Val
- 57 033565
275280
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu
290295
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val
305310
Asp Thr Val Ala Leu His He Asn
325
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala
340
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu
355360
Leu Gin Ala He Val Lys Glu Val
370375
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val
385390
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu
405
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp
420
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe
435440
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser
450455
Gin Val Glu His Leu Thr Met Ala
465470
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu
485
Thr He Arg Lys Val Asn Pro Val
500
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
285
Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg 300
Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
315320
Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
330335
Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Val
345350
Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
365
Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 380
Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
395400
Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gin
410415
Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
425430
Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
445
Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
460
His Leu lie Gin Gly Phe Asn Tyr
475480
Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
490495
Glu Leu lie lie Ala Pro Arg Leu
505510 <210> 18 <2H> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1)...(517) <223> Вариант CYP82E4 R169Q <400> 18
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He
5
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys
Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
15
Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
- 58 033565
Leu Pro Pro 35 Lys He Pro Gly Gly 40 Trp Pro Vai lie Gly 45 His Leu Phe
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Gin He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro lie Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp lie
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 3 90 395 400
- 59 033565
His He Pro Lys Gly 405 Thr Arg Leu Phe Ala 410 Asn Val Met Lys Leu 415 Gin
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 19
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222> (1).··(517)
<223> Вариант CYP82E4 G459R
<400> 19
Met Leu Ser Pro lie Glu Al a He Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Ser
130 135 140
- 60 033565
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met lie Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe lie Ala Thr Asp lie Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Arg Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
- 61 033565
515
<210> 20
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант <222> (1) . . . (517) <223> Вариант CYP82E4 T427I <400> 20
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 2 30 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp lie
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
- 62 033565
260 265 270
Lys Met Glu 275 Vai Asn Ala Glu Gly 280 Asn Glu Gin Asp Phe 285 He Asp Vai
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai lie Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala lie Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Tie Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr lie
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 4 70 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly lie
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 21
<2H> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант <222> (1)..,(517) <223> Вариант CYP82E4 V376M <400> 21
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Phe Thr Phe
10 15
Leu Phe Phe Phe 20 Leu Trp Thr Lys Lys 25 Ser Gin Lys Pro Ser 30 Lys Pro
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val lie Gin Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Val Lys Glu Met Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
- 64 033565
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 22
<211> 328
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222 > (1) . · .(328)
<223 > Вариант CYP82E4 W329Stop
<400 > 22
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
- 65 033565
Pro Tyr 130 Trp Arg Lys Asn Arg 135 Lys Leu Vai He Gin 140 Glu Vai Leu Ser
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His lie Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn
325
<210> 23
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222> (1) . . - (517)
<223> Вариант CYP82E4 K364N
<400> 23
Met 1 Leu Ser Pro He 5 Glu Ala He Vai Gly 10 Leu Vai Thr Phe Thr 15 Phe
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
- 66 033565
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Vai Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp lie
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Asn Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He. Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr lie
- 67 033565
435440
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser
450455
Gin Val Glu His leu Thr Met Ala
465470
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu
485
Thr He Arg Lys Val Asn Pro Val
500
Ala Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 24 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1) ... (517) <223> Вариант CYP82E4 P381S <400> 24
Met Leu Ser Pro He Glu Ala lie
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly
3540
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp
5055
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro
6570
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser
100
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala
115120
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys
130135
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys
145150
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr
165 lie Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu
445
Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
460
His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
475480
Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly lie
490495
Glu Leu lie lie Ala Pro Arg Leu
505510
Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1015
Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
2530
Trp Pro Val He Gly His Leu Phe 45
Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly 60
Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
7580
Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
9095
Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
105110
Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
125
Leu Val He Gin Glu Val Leu Ser
140
His Val Arg Phe Ala Arg lie Gin
155 160
Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
170 175
Glu Leu Asn Phe Gly Leu lie Val
- 68 033565
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu lie Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Ser Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 3 90 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Vai Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 25 <211> 517
- 69 033565 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1)...(517) <223> Вариант CYP82E4 P458S <400> 25
Met Leu Ser Pro He Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala lie Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg He Gin
145 150 155 160
Ala Ser He Lys Asn Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His He Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
- 70 033565
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Al a Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His He Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Thr Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala lie Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His lie Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe He Ala Thr Asp He Asp Phe Arg Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Ser Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly He
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu He He Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210 > 26
<211 > 517
<212 > PRT
<213 > Nicot: Lana tabacum
<400 > 26
Met Val Ser Pro Val Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
- 71 033565
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai lie Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Lys lie Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Gin Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai lie Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp lie Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala lie Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 3 90 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp lie Asp Tyr Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
- 72 033565
Gin Ala Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Vai Thr He Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 27
<211> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222> (1)...(517)
<223> Вариант CYP82E5 P72L <400> 27
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Leu Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 HO
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Lys He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
- 73 033565
Val Glu 210 Arg . Phe Arg Lys Ala 215 Phe Lys Asp Phe He 220 He Leu Ser Met
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gin Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His lie Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp He Asp Tyr Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Ala Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr He Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 28 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum
- 74 033565 <220>
<221> Вариант <222> (1) . . . (517) <223> Вариант CYP82E5 L143F <400> 28
Met 1 Vai Ser Pro Vai 5 Glu Ala He Vai Gly 10 Leu Vai Thr Leu Thr 15 Leu
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Туг Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Phe Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Lys lie Gin
145 15 0 155 160
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu lie Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Gin Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
- 75 033565
325 330 335
Asn Gin His Ala 340 Leu Lys Lys Ala Gin 345 Glu Glu He Asp Lys 350 Lys Vai
Gly Lys Glu Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp He Asp Tyr Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Ala Glu His' Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Vai Thr He Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 29
<2H> 517
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222> (1)...(517)
<223> Вариант CYP82E5 S174L
<400> 29
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
- 76 033565
70
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser
100
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala
115120
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys
130135
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys
145150
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr
165 lie Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu
180
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr
195200
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe
210215
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe
225230
Asp Phe Gin Gly His Val Lys Ala
245
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu
260
Lys Met Glu Val Asn Ala Gin Gly
275280
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu
290295
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val
305310
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn
325
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala
340
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu
355360
Leu Gin Ala lie Val Lys Glu Val
370375
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val
385390
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu
405
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn
420
Phe Phe Ala Asp Asp lie Asp Tyr
435440
7580
Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
9095
Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
105110
Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
125
Leu Val lie Gin Glu Val Leu Ser
140
His Val Arg Phe Gly Lys He Gin
155160
Arg He Asp Gly Asn Leu Ser Thr
170175
Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
185190
Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
205
Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
220
Pro lie Pro Leu Phe Lys Trp Val
235240
Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
250255
Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
265270
Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Val
285
Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg 300
Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
315320
Trp Gly Met Ala Leu Leu lie Asn 330335
Gin Glu Glu lie Asp Lys Lys Val
345350
Ser Asp lie Lys Asp Leu Val Tyr 365
Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 380
Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
395400
Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gin
410415
Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
425430
Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe lie
445
- 77 033565
Pro Phe 450 Gly Ser Gly Arg Arg 455 Ser Cys Pro Gly Met 460 Thr Tyr Ala Leu
Gin Ala Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr He Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 30 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1) . . . (517) <223> Вариант CYP82E5 M224I <400> 30
Met Val Ser Pro Val Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Pile Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 7 0 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
180 185 190
- 78 033565
Lys Met He 195 Ala Gly Lys Asn Tyr 200 Glu Ser Gly Lys Gly 205 Asp Glu Gin
Vai Glu Arg .Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser He
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro lie Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Gin Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp He Asp Tyr Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Ala Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Vai Thr He Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 31 <211> 517 <212> PRT
- 79 033565 <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1)..,(517) <223> Вариант CYP82E5 P235S <400> 31
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Vai He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Vai He Gin Glu Vai Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Vai Arg Phe Gly Lys He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Ser Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp lie
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Gin Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
- 80 033565
305
Asp Thr Val Ala
Asn Gin His Ala
340
Gly Lys Glu Arg
355
Leu Gin Ala He
370
Leu Leu Val Pro
385
His He Pro Lys
Arg Asp Pro Lys
420
Phe Phe Ala Asp
435
Pro Phe Gly Ser
450
Gin Ala Glu His
465
Lys Thr Pro Asn
Thr He Arg Lys
500
Ala Pro Glu Leu
515
310
Leu His Met Asn
325
Leu Lys Lys Ala
Trp Val Glu Glu
360
Val Lys Glu Val
375
His Glu Asn Val
390
Gly Thr Arg Leu
405
Leu Trp Ser Asn
Asp He Asp Tyr
440
Gly Arg Arg Ser
455
Leu Thr lie Ala
470
Asp Glu Pro Leu
485
Val Asn Pro Val
Tyr
315
Trp Gly Met Ala
330
Gin Glu Glu He
345
Ser Asp He Lys
Leu Arg Leu Tyr
380
Glu Asp Cys Val
395
Phe Ala Asn Val
410
Pro Asp Lys Phe
425
Arg Gly Gin His
Cys Pro Gly Met
460
His Leu He Gin
475
Asp Met Lys Glu
490
Glu Val Thr He
505
320
Leu Leu lie Asn
335
Asp Lys Lys Val
350
Asp Leu Val Tyr
365
Pro Pro Gly Pro
Val Ser Gly Tyr
400
Met Lys Leu Gin
415
Asp Pro Glu Arg
430
Tyr Glu Phe He
445
Thr Tyr Ala Leu
Gly Phe Asn Tyr
480
Gly Ala Gly Leu
495
Thr Ala Arg Leu
510
<210> 32
<211> 517 .
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222> (1)...(517)
<223> Вариант CYP82E5 A410V
<400> 32
Met Val Ser Pro Val Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys lie Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
- 81 033565
55
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro
70
Pro Leu Vai Leu Vai Vai Ser Ser 85
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser
100
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala
115120
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys
130135
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys
145150
Thr Ser lie Lys Ser Leu Tyr Thr
165
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu
180
Lys Met lie Ala Gly Lys Asn Tyr
195200
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe
210215
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe
225230
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala
245
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu
260
Lys Met Glu Vai Asn Ala Gin Gly
275280
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu
290295
Asp Thr Vai He Lys Ala Thr Vai
305310
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn
325
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala
340
Gly Lys Glu Arg Trp Vai Glu Glu
355360
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai
370375
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai
385390
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu
405
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn
420
Vai Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
7580
Tyr Glu Ala Vai Lys Asp Cys Phe
9095
Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
105110
Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly 125
Leu Vai lie Gin Glu Vai Leu Ser
140
His Vai Arg Phe Gly Lys lie Gin
155160
Arg lie Asp Gly Asn Ser Ser Thr
170175
Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Vai
185190
Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
205
Lys Asp Phe lie lie Leu Ser Met
220
Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Vai
235240
Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
250255
Glu Glu His Vai Lys Lys Arg Glu
265270
Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
285
Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg 300
Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
315320
Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
330335
Gin Glu Glu lie Asp Lys Lys Vai
345350
Ser Asp lie Lys Asp Leu Vai Tyr 365
Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 380
Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
395400
Phe Vai Asn Vai Met Lys Leu Gin
410415
Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
425430
- 82 033565
Phe Phe Ala 435 Asp Asp He Asp Tyr 440 Arg Gly Gin His Tyr 445 Glu Phe He
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Ala Glu His Leu Thr He Ala His Leu lie Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr He Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 33
<211> 421
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> Вариант
<222 :> (1) . . .(421)
<22 3 l> Вариант CYP82E5 W422Stop
<400 i> 3;
Met Val Ser Pro Val Glu Ala He Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gin He Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 TO 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val He Gin Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
- 83 033565
He Asn Leu Thr 180 Asp Trp Leu Glu Glu 185 Leu Asn Phe Gly Leu 190 lie Vai
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Vai Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Vai Leu Trp Asp Ala Phe Pro lie Pro Leu Phe Lys Trp Vai
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Vai Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Vai Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Vai Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Vai Asn Ala Gin Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Vai
275 280 285
Vai Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Vai' He Lys Ala Thr Vai Phe Ser Leu Vai Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Vai Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu lie Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Vai
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Vai Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Vai Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Vai Lys Glu Vai Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Vai Pro His Glu Asn Vai Glu Asp Cys Vai Vai Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu
420 <210> 34 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> Вариант <222> (1).,. (517) <223> Вариант CYP82E5 P449L <400> 34
Met Vai Ser Pro Vai Glu Ala He Vai Gly Leu Vai Thr Leu Thr Leu
10 15
- 84 033565
Leu Phe Tyr Phe 20 Leu Trp Pro Lys Lys 25 Phe Gin He Pro Ser 30 Lys Pro
Leu Pro Pro Lys He Pro Gly Gly Trp Pro Val He Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys. Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala He Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val lie Gin Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys He Gin
145 150 155 160
Thr Ser He Lys Ser Leu Tyr Thr Arg He Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
He Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu He Val
180 185 190
Lys Met He Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gin
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe He He Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro He Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gin Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp He
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gin Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gin Gly Asn Glu Gin Asp Phe He Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val He Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 32 0
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu He Asn
325 330 335
Asn Gin His Ala Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu He Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp He Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gin Ala He Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
- 85 033565
385 390 395 400
His He Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Vai Met Lys Leu Gin
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp He Asp Tyr Arg Gly Gin His Tyr Glu Phe He
435 440 445
Leu Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gin Ala Glu His Leu Thr He Ala His Leu He Gin Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro’ Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr He Arg Lys Vai Asn Pro Vai Glu Vai Thr He Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515 <210> 35 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность ' <220>
<223> «Прямой» праймер для экзона 1 гена CYP82E10 <400> 35 gtgatagttt gattcccaag tgc . 23 <210> 36 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> «Обратный» праймер для экзона 1 гена CYP82E10 <400> 36 ctcccaaagt tagattagtc eg 22 <210> 37 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 86 033565 <223> «Прямой» праймер для экзона 2 гена CYP82E10 <400> 37 aggtcgcgct gattcttg 18 <210> 38 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> «Обратный» праймер для экзона 2 гена CYP82E10 <400> 38 agatgaatac ccatctatct aggagt 26 <210> 39 <211> 2752 <212> ДНК <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> 5'UTR <222> (1) ... (50) <223> 5' UTR CYP82E4v2 <220>
<221> экзон <222> (51)...(989) <223> Последовательность экзона 1 CYP82E4v2 <220>
<221> интрон <222> (990)...(1990) <223> Последовательность интрона CYP82E4v2 <220>
<221> экзон <222> (1991)...(2602) <223> Последовательность экзона 2 CYP82E4v2 <220>
<221> 3'UTR <222> (2603)...(2685) <223> 3' UTR CYP82E4v2 <400> 39 aaggaagttg ccgatagtta tattctcaac ttcttatcta aaaatccata atgctttctc60 ccatagaagc cattgtagga ctagtaacct tcacatttct cttcttcttc ctatggacaa120 aaaaatctca aaaaccttca aaacccttac caccgaaaat ccccggagga tggccggtaa180
- 87 033565
tcggccatct tttccacttc aatgacgacg gcgacgaccg tccattagct cgaaaactcg 240
gagacttagc tgacaaatac ggccccgttt tcacttttcg gctaggcctt ccccttgtct 300
tagttgtaag cagttacgaa gctgtaaaag actgtttctc tacaaatgac gccatttttt 360
ccaatcgtcc agcttttctt tacggcgatt accttggcta caataatgcc atgctatttt 420
tggccaatta cggaccttac tggcgaaaaa atcgaaaatt agttattcag gaagttctct 480
ccgctagtcg tctcgaaaaa ttcaaacacg tgagatttgc aagaattcaa gcgagcatta 540
agaatttata tactcgaatt gatggaaatt cgagtacgat aaatttaact gattggttag 600
aagaattgaa ttttggtctg atcgtgaaga tgatcgctgg aaaaaattat gaatccggta 660
aaggagatga acaagtggag agatttaaga aagcgtttaa ggattttatg attttatcaa 720
tggagtttgt gttatgggat gcatttccaa ttccattatt taaatgggtg gattttcaag 780
ggcatgttaa ggctatgaaa aggactttta aagatataga ttctgttttt cagaattggt 840
tagaggaaca tattaataaa agagaaaaaa tggaggttaa tgcagaaggg aatgaacaag 900
atttcattga tgtggtgctt tcaaaaatga gtaatgaata tcttggtgaa ggttactctc 960
gtgatactgt cattaaagca acggtgtttg taagttcatc tgtcattttt catttattca 1020
cttttatttt gaggagcaga catgttaata ataatttgga gcaactgtaa agttatctat 1080
gtgtacaggt tcgagcctca ggtgcaacca ctaatgcttg tattagatta tgttgtctgc 1140
atcatacccc taattggagt gtggctcttc ccgaaccctg caatgctgga tgctggatgc 1200
tttatgtatc agactgacct ttttgttaaa ctatctaaat actaaggatg atgatttaat 1260
aaaaatatag aatggtaaac agaaaaagat gagattattt ttggggctat atggattcgc 1320
ccgggctttg ggaggtaaaa cggtatctac cagttgagac tttactccag aactttatct 1380
cgagagctct gaataaaaat gaaatagtat ttaccactcc aaaatctttg atggtaaaaa 1440
gatgagatat aacctcttat aattgattga accacgttga tagaataaaa cttctttact 1500
cccattcagc ataagaaaaa tgaaaccaaa cggaattctt ctctttttta gggggaaatt 1560
ccttaattgc ttgttgaata tagattcatg tcgttattct atttttaata atgatgaaaa 1620
tcaatatagt caaagttaat acttatgtca tttggtttgc ggacaagtta tattggaact 1680
atataatacg tctattatag aatagtgatt atttagagga tatacatttt ttttggataa 1740
atatttgatt tattggatta aaaatagaat atacaggtaa ggtctaaaac gtgtgtttgc 1800
ttttacacta aataaacttg acctcgtaca attctaagaa aatatttgaa ataaatgaat 1860
tattttattg ttaatcaatt aaaaaaatca tagtatagat gagatgtgtg catacttgac 1920
aataactata ctaactaaaa caaggtatgt gaataattga tattcctttt ttaattattc 1980
ttttttccag agtttggtct tggatgcagc agacacagtt gctcttcaca taaattgggg 2040
aatggcatta ttgataaaca atcaaaaggc cttgacgaaa gcacaagaag agatagacac 2100
aaaagttggt aaggacagac gggtagaaga gagtgatatt aaggatttgg tatacctcca 2160
agctattgtt aaagaagtga tacgattata tccaccagga cctttgttag taccacacga 2220
aaatgtagaa gattgtgttg ttagtggata tcacattcct aaagggacaa gattattcgc 2280
aaacgtcatg aaactgcaac gtgatcctaa actctggtct gatcctgata ctttcgatcc 2340
agagagattc attgctactg atattgactt tcgtggtcag tactataagt atatcccgtt 2400
tggttctgga agacgatctt gtccagggat gacttatgca ttgcaagtgg aacacttaac 2460
aatggcacat ttgatccaag gtttcaatta cagaactcca aatgacgagc ccttggatat 2520
gaaggaaggt gcaggcataa ctatacgtaa ggtaaatcct gtggaactga taatagcgcc 2580
t cgcctggca cctgagcttt attaaaacct aagatctttc atcttggttg atcattgtat 2640
aatactccta aatggatatt catttacctt ttatcaatta attgtcagta cgagtttttc 2700
taatttggta catttgtaat aataagtaaa gaataattgt gctaatatat aa 2752
210> 40
211> 2685
212> ДНК
- 88 033565 <213> Nicotiana tabacum <220>
<221> 5'UTR <222> (1)...(30) <223> 5'UTR CYP82E5v2 <220>
<221> экзон <222> (31)...(969) <223> Последовательность экзона 1 CYP82E5v2 <220>
<221> интрон <222> (970)...(2023) <223> Последовательность интрона CYP82E5v2 <220>
<221> экзон <222> (2024)...(2635) <223> Последовательность экзона 2 CYP82E5v2 <220>
<221> 3'UTR <222> (2636)...(2685) <223> 3'UTR CYP82E5v2 <400> 40
gattcccaag ttcttttcta aaactccata atggtttctc ccgtagaagc cattgtagga 60
ctagtaaccc ttacacttct cttctacttc ctatggccca aaaaatttca aataccttca 120
aaaccattac caccgaaaat tcccggaggg tggccggtaa tcggccatct tttctacttc 180
gatgatgacg gcgacgaccg tccattagct cgaaaactcg gagacttagc tgacaaatac 240
ggcccggttt tcactttccg gctaggcctt ccgcttgtgt tagttgtaag cagttacgaa 300
gctgtaaaag actgcttctc tacaaatgac gccattttct ccaatcgtcc agcttttctt 360
tacggtgaat accttggcta cagtaatgcc atgctatttt tgacaaaata cggaccttat 420
tggcgaaaaa atagaaaatt agtcattcag gaagttctct ctgctagtcg tctcgaaaaa 480
ttgaagcacg tgagatttgg taaaattcaa acgagcatta agagtttata cactcgaatt 540
gatggaaatt cgagtacgat aaatctaact gattggttag aagaattgaa ttttggtctg 600
atcgtgaaaa tgatcgctgg gaaaaattat gaatccggta aaggagatga acaagtggag 660
agatttagga aagcgtttaa ggattttata attttatcaa tggagtttgt gttatgggat 720
gcttttccaa ttccattgtt caaatgggtg gattttcaag gccatgttaa ggccatgaaa 780
aggacattta aggatataga ttctgttttt cagaattggt tagaggaaca tgtcaagaaa 840
agagaaaaaa tggaggttaa tgcacaaggg aatgaacaag atttcattga tgtggtgctt 900
tcaaaaatga gtaatgaata tcttgatgaa ggttactctc gtgatactgt cataaaagca 960
acagtgtttg taagttcatt ttcatttttc at.tattcagt ctgattttga ggaatagaca 1020
ggttaataat aatttaagta attagattat ctaaatacta aggatgatta tatatagtaa 1080
aaatgtagaa tgataaatgcj aaaaaagatg agaatttttt gtgcctcgac taatctatat 1140
- 89 033565 atctttggga gttaaaagtg cttcaccaaa ggggactttt cctcatagct caagttagaa 1200 gtttgattat agatgaaaga gtatttatca cttcacgaac tctgatgata aaagtaaatg 1260 agatataacc agttataatt gatagaataa aacttcatta ctcccattga gcataaaaaa 1320 aaaagtaaaa gggacttctt ctcttttttt tagggagaaa ttctttaatt gtttgttaaa 1380 tatagattca tgtttttttt ttcttctatt tctaataata atggttcttg aatcaggtcg 1440 ttgactttgt agcagcaata tagtcaaagc taatatccat gttatttggt tttcgaacaa 1500 gttatactga aattatatat acgggtatta aataataaca ttattattta taggatatac 1560 tttttttatt gggtaaatat tacaacaaca acaactgact cagtaaaatt ttactagtgg 1620 ggtatgggga gggtagtgtg tatgcagacc ttacccctac cccgaaggag tagagggatt 1680 gtttccgaaa gaccctcggc tcaagaaaac aaaaagagac aatatcagta ccaccacaga 1740 tcatattatt aggtaaatgt tattttattg aattaaagat gaaatataca ggtaaggtat 1800 aaaacgtgta tttgatttta cactagataa atttgacctc gtacatctct aagagaaagc 1860 tgaaataaat gaattttaaa tttaaaaaaa aaattcatta gtataatgag atgtgcatac 1920 ttgacaatta ctatactaaa tagaacaagg ttcggcagat agtgacacta acctactttt 1980 gtattgaatt atccttttta attttattct aatttgtcta cagagtttgg tcttggatgc 2040 tgcggacaca gttgctcttc acatgaattg gggaatggca ttactgataa acaatcaaca 2100 tgccttgaag aaagcacaag aagagatcga taaaaaagtt ggtaaggaaa gatgggtaga 2160 agagagtgat attaaggatt tggtctacct ccaagctatt gttaaagaag tgttacgatt 2220 atatccacca ggacctttat tagtacctca tgaaaatgta gaggattgtg ttgttagtgg 2280 atatcacatt cctaaaggga ctagactatt cgcgaacgtt atgaaattgc agcgcgatcc 2340 taaactctgg tcaaatcctg ataagtttga tccagagaga ttcttcgctg atgatattga 2400 ctaccgtggt cagcactatg agtttatccc atttggttct ggaagacgat cttgtccggg 2460 gatgacttat gcattacaag tggaacacct aacaatagca catttgatcc agggtttcaa 2520 ttacaaaact ccaaatgacg agcccttgga tatgaaggaa ggtgcaggat taactatacg 2580 taaagtaaat cctgtagaag tgacaattac ggctcgcctg gcacctgagc tttattaaaa 2640 ccttagatgt tttatcttga ttgtactaat atatatagca gaaaa 2685

Claims (36)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Растение или часть растения табака, имеющие пониженный уровень содержания норникотина и содержащие мутацию в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E10, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, причем указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E10 в положениях, соответствующих положениям 79, 107, 381 или 419 SEQ ID NO: 2, и где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    a) замены серином остатка глицина в положении 79;
    b) замены серином остатка пролина в положении 107;
    c) замены серином остатка пролина в положении 381;
    d) замены серином остатка пролина в положении 419 и
    e) любой их комбинации.
  2. 2. Растение или часть растения табака по п.1, где указанная никотиндеметилаза CYP82E10 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 5-8 и 9.
  3. 3. Растение или часть растения табака по любому из пп.1 или 2, дополнительно включающие мутацию в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E4, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 14, причем указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E4 в положениях, соответствующих положениям 329, 364, 376, 381 или 458 SEQ ID NO: 14, и где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    a) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 329;
    b) замены аспарагином остатка лизина в положении 364;
    c) замены метионином остатка валина в положении 376;
    d) замены серином остатка пролина в положении 381;
    e) замены серином остатка пролина в положении 458 и
    f) любой их комбинации.
  4. 4. Растение или часть растения табака по п.3, где указанная никотиндеметилаза CYP82E4 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14-19 и 20.
  5. 5. Растение или часть растения табака по любому из пп.1-4, дополнительно содержащие мутацию в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E5, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 26, причем указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E5 в положениях, соответствующих положениям 422 или 449 SEQ ID NO: 26, и где указанная замена выбрана из группы, со-
    - 90 033565 стоящей из:
    a) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 422;
    b) замены лейцином остатка пролина в положении 449 и
    c) любой их комбинации.
  6. 6. Растение или часть растения табака по п.5, где указанная никотиндеметилаза CYP82E5 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26-31 и 32.
  7. 7. Растение или часть растения табака по любому из пп.1-6, где растение или часть растения табака является гомозиготным/гомозиготной по указанной мутации.
  8. 8. Растение или часть растения табака по п.7, где указанная никотиндеметилаза CYP82E10 содержит замену аминокислотного остатка в положении, соответствующем положению 381 SEQ ID NO: 2, указанная никотиндеметилаза CYP82E4 содержит замену аминокислотного остатка в положении, соответствующем положению 329 SEQ ID NO: 14, и указанная никотиндеметилаза CYP82E5 содержит замену аминокислотного остатка в положении, соответствующем положению 422 SEQ ID NO: 26, где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    а) замены серином остатка пролина в положении 381;
    б) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 329;
    в) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 422 и
    г) любой их комбинации.
  9. 9. Растение или часть растения табака по любому из пп.1-8, где в указанном растении или его части менее 1,5% никотина превращается в норникотин.
  10. 10. Растение или часть растения табака по п.9, где в указанном растении или его части не более 0,5% никотина превращается в норникотин.
  11. 11. Растение или часть растения табака по любому из пп.1-10, где указанное растение табака представляет собой растение темного табака.
  12. 12. Растение или часть растения табака по любому из пп.1-11, где указанное растение табака представляет собой растение, предназначенное для сушки на пару, воздушной сушки или огневой сушки.
  13. 13. Растение или часть растения табака по любому из пп.1-10, где указанное растение табака представляет собой Бёрли, Вирджинию или Ориентальный (восточный) табак.
  14. 14. Семя растения табака по любому из пп.1-13.
  15. 15. Потомство растения табака по любому из пп.1-13.
  16. 16. Табачный продукт, изготовленный из растения или части растения табака по любому из пп.1-13.
  17. 17. Табачный продукт по п.16, выбранный из группы, состоящей из биоразлагаемого наполнителя, сигареты, сигариллы, невентилируемой сигареты с фильтром, вентилируемой папиросы с фильтром, сигары, трубочного табака, нюхательного табака, жевательного табака, жевательной резинки, пастилки для рассасывания и растворимой пластинки.
  18. 18. Способ снижения онкогенного потенциала табачного продукта, включающий приготовление табачного продукта из растения или части растения табака по любому из пп.1-13.
  19. 19. Способ снижения уровня норникотина или снижения уровня превращения никотина в норникотин в растении или части растения табака, включающий введение мутации в ген никотиндеметилазы указанного растения или его части, кодирующий никотиндеметилазу CYP82E10, где указанная никотиндеметилаза CYP82E10 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2, причем указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E10 в положениях, соответствующих положениям 79, 107, 381 или 419 SEQ ID NO: 2, и где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    i) замены серином остатка глицина в положении 79;
    ii) замены серином остатка пролина в положении 107;
    iii) замены серином остатка пролина в положении 381;
    iv) замены серином остатка пролина в положении 419 и
    v) любой их комбинации.
  20. 20. Способ по п.19, дополнительно включающий введение мутации в ген никотиндеметилазы указанного растения, кодирующий никотиндеметилазу CYP82E4, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 14, причем указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E4 в положениях, соответствующих положениям 329, 364, 376, 381 или 458 SEQ ID NO: 14, и где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    i) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 329;
    ii) замены аспарагином остатка лизина в положении 364;
    iii) замены метионином остатка валина в положении 376;
    iv) замены серином остатка пролина в положении 381;
    v) замены серином остатка пролина в положении 458 и vi) любой их комбинации.
  21. 21. Способ по п.19 или 20, дополнительно включающий введение мутации в ген никотиндеметила
    - 91 033565 зы указанного растения, кодирующий CYP82E5 никотиндеметилазу, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 26, причем указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E5 в положениях, соответствующих положениям 422 или 449 SEQ ID NO: 26, и где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    i) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 422;
    ii) замены лейцином остатка пролина в положении 449 и iii) любой их комбинации.
  22. 22. Способ по любому из пп.19-21, где указанная никотиндеметилаза CYP82E10 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 5-8 и 9.
  23. 23. Способ по любому из пп.19-22, в котором указанная никотиндеметилаза CYP82E4 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14-19 и 20.
  24. 24. Способ по любому из пп.19-23, в котором указанная никотиндеметилаза CYP82E5 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26-31 или 32.
  25. 25. Способ по любому из пп.19-24, в котором указанное растение или часть растения табака является гомозиготным/гомозиготной по указанной мутации.
  26. 26. Способ по любому из пп.19-25, в котором указанные мутации вводят посредством скрещивания.
  27. 27. Способ по любому из пп.19-26, в котором указанное растение табака представляет собой растение темного табака.
  28. 28. Способ по любому из пп.19-26, в котором указанное растение табака представляет собой растение, предназначенное для сушки на пару, воздушной сушки или огневой сушки.
  29. 29. Способ по любому из пп.19-26, в котором указанное растение табака представляет собой Бёрли, Вирджинию или Ориентальный (восточный) табак.
  30. 30. Способ идентификации растения табака с низкими уровнями норникотина, включающий скрининг образца ДНК из представляющего интерес растения табака на присутствие мутации в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E10, раскрытую в любом из пп.1-10, где указанный ген включает последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1 или 3.
  31. 31. Способ по п.30, в котором указанное растение табака обладает неконвертируемым фенотипом.
  32. 32. Способ по п.30 или 31, в котором указанный скрининг осуществляют с использованием последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 35-37 и 38.
  33. 33. Способ по любому из пп.30-32, дополнительно включающий скрининг образца ДНК из представляющего интерес растения табака, в отношении присутствия мутации в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E4, определенную в п.3, присутствия мутации в гене, кодирующем никотиндеметилазу CYP82E5, определенную в п.5, или присутствия комбинации указанных мутаций.
  34. 34. Выделенный полипептид никотиндеметилазы CYP82E10, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13;
    б) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13; и
    в) аминокислотной последовательности, которая представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 115 смежных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 5-12 или 13;
    где указанная аминокислотная последовательность содержит мутацию, определенную в п.1.
  35. 35. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.34, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    а) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 4;
    б) нуклеотидной последовательности, которая содержит фрагмент по меньшей мере из 900 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, 3 или 4;
    в) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична на всем протяжении последовательности SEQ ID NO: 1;
    г) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности по одному из предыдущих подпунктов (а)-(в), где нуклеотидная последовательность не кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
  36. 36. Растение или часть растения табака, гомозиготное/гомозиготная по мутации в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E10, в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E4, и в гене, который кодирует никотиндеметилазу CYP82E5, где указанная мутация приводит к пониженной экспрессии или функции указанной никотиндеметилазы CYP82E10, CYP82E4 и CYP82E5, где:
    а) указанная никотиндеметилаза CYP82E10 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2, и указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E10 в положениях, соответствующих положениям 79, 107, 381 или 419 SEQ ID NO: 2, и где указанная замена выбрана из группы,
    - 92 033565 состоящей из:
    i) замены серином остатка глицина в положении 79;
    ii) замены серином остатка пролина в положении 107;
    iii) замены серином остатка пролина в положении 381;
    iv) замены серином остатка пролина в положении 419 и
    v) любой их комбинации;
    б) указанная никотиндеметилаза CYP82E4 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную последовательности SEQ ID NO: 14, и указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E4 в положениях, соответствующих положениям 329, 364, 376, 381 или 458 SEQ ID NO: 14, и где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    i) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 329;
    ii) замены аспарагином остатка лизина в положении 364;
    iii) замены метионином остатка валина в положении 376;
    iv) замены серином остатка пролина в положении 381;
    v) замены серином остатка пролина в положении 458 и vi) любой их комбинации;
    в) указанная никотиндеметилаза CYP82E5 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO: 26, и указанная мутация приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности никотиндеметилазы CYP82E5 в положениях, соответствующих положениям 422 или 449 SEQ ID NO: 26, и где указанная замена выбрана из группы, состоящей из:
    i) замены стоп-кодоном остатка триптофана в положении 422;
    ii) замены лейцином остатка пролина в положении 449 и iii) любой их комбинации.
EA201201004A 2010-01-15 2011-01-13 Композиции и способы, предназначенные для минимизации синтеза норникотина в растениях табака EA033565B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29567110P 2010-01-15 2010-01-15
PCT/US2011/021088 WO2011088180A1 (en) 2010-01-15 2011-01-13 Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201201004A1 EA201201004A1 (ru) 2013-02-28
EA033565B1 true EA033565B1 (ru) 2019-11-05

Family

ID=43722405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201201004A EA033565B1 (ru) 2010-01-15 2011-01-13 Композиции и способы, предназначенные для минимизации синтеза норникотина в растениях табака

Country Status (13)

Country Link
US (6) US9247706B2 (ru)
JP (1) JP6055311B2 (ru)
KR (1) KR101611847B1 (ru)
CN (1) CN102858983B (ru)
AR (2) AR080636A1 (ru)
AU (1) AU2011205282B2 (ru)
BR (1) BR112012017565A2 (ru)
CA (1) CA2786813C (ru)
EA (1) EA033565B1 (ru)
MX (1) MX337123B (ru)
PH (1) PH12017500180B1 (ru)
WO (1) WO2011088180A1 (ru)
ZA (1) ZA201205426B (ru)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10266836B2 (en) 2001-11-13 2019-04-23 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
EP1851317B1 (en) 2005-02-23 2011-10-26 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
US9370160B2 (en) 2006-12-15 2016-06-21 Altria Client Services Llc Tobacco inbred plants ALBEX1F and ALBEX1MS
WO2009064771A2 (en) 2007-11-12 2009-05-22 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
AU2011205282B2 (en) * 2010-01-15 2014-10-02 North Carolina State University Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco
WO2012118779A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 North Carolina State University Tobacco inbred plants ncbex1f, ncbex1ms, and nc ex90
MX2015008084A (es) 2012-12-21 2016-03-31 Philip Morris Products Sa Reduccion de nitrosamina especifica de tabaco en plantas.
CN105517430A (zh) * 2013-01-11 2016-04-20 北卡罗莱纳州立大学 烟草近交植物k326 src、cms k326 src、k346 src、cms k346 src、nc1562-1 src、nctg-61 src、cms nctg-61 src和杂交种nc196 src
WO2014137802A1 (en) * 2013-03-05 2014-09-12 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and uses thereof
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
US9710787B2 (en) * 2013-07-31 2017-07-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods for representing, diagnosing, and recommending interaction sequences
EP4449859A2 (en) * 2013-12-06 2024-10-23 Altria Client Services LLC Tobacco plants having altered amounts of one or more alkaloids in leaf and methods of using such plants
US9596822B2 (en) * 2014-03-03 2017-03-21 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof
CN106659232A (zh) * 2014-03-03 2017-05-10 北卡罗莱纳州立大学 烟草近交和杂种植物以及由其制得的烟草产品
US9596823B2 (en) * 2014-03-03 2017-03-21 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof
US20150322451A1 (en) 2014-04-08 2015-11-12 Altria Client Services Inc. Tobacco having altered leaf properties and methods of making and using
CN106459923B (zh) * 2014-05-08 2020-08-11 菲利普莫里斯产品有限公司 植物中烟碱向降烟碱转化的减少
MX2017003932A (es) 2014-09-26 2017-06-30 Philip Morris Products Sa Reduccion de nitrosaminas especificas del tabaco mediante la alteracion de la via de asimilacion de nitrato.
US10435700B2 (en) 2014-10-06 2019-10-08 Altria Client Services Llc Genetic control of axillary bud growth in tobacco plants
WO2016179356A1 (en) * 2015-05-05 2016-11-10 North Carolina State University Methods and compositions for reducing the tobacco specific nitrosamine nnk in tobacco
WO2016210303A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN105602961B (zh) * 2015-09-07 2018-10-23 中国农业科学院烟草研究所 突变的烤烟cyp82e4基因及其应用
CN108697059B (zh) 2016-01-29 2023-06-16 菲利普莫里斯生产公司 减少田地生长烟草植物中的镉累积
CN117126815A (zh) 2016-03-11 2023-11-28 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产烟杈减少或消除的烟草植物和制品的组合物和方法
WO2018067985A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Altria Client Services Llc Composition and methods for producing tobacco plants and products having reduced tobacco-specific nitrosamines (tsnas)
BR112019010484A2 (pt) 2016-12-20 2019-09-10 Philip Morris Products Sa plantas com tempo reduzido para floração
WO2018119124A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN106636146B (zh) * 2017-02-16 2019-09-13 云南省烟草农业科学研究院 一种降低尼古丁转化率的cyp82e5基因突变体及其应用
CN111108205B (zh) 2017-09-11 2024-05-28 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产烟杈减少或消除的烟草植物和制品的组合物和方法
EP3480314A1 (en) * 2017-11-03 2019-05-08 Philip Morris Products S.A. Regulation of alkaloid content
WO2019113360A1 (en) * 2017-12-07 2019-06-13 University Of Kentucky Research Foundation bZIP TRANSCRIPTION FACTORS REGULATE CONVERSION OF NICOTINE TO NORNICOTINE
US12075746B2 (en) 2018-01-12 2024-09-03 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN108192900B (zh) * 2018-01-16 2021-11-30 西南大学 烟草烟碱去甲基化酶基因cyp82e4的编辑失活载体及其应用
BR112020018187A2 (pt) 2018-03-05 2021-04-27 Altria Client Services Llc composições e métodos para a produção de plantas e produtos de tabaco que possuem níveis alterados de alcaloides com qualidade de folha desejável
AR115023A1 (es) 2018-03-28 2020-11-18 Philip Morris Products Sa Modulación del contenido de azúcar reductor en una planta
BR112020017500A2 (pt) 2018-03-28 2020-12-22 Philip Morris Products S.A. Modulação do teor de aminoácidos em uma planta
EP3773017B1 (en) 2018-04-03 2022-06-08 Altria Client Services LLC Composition and methods for producing tobacco plants and products having increased phenylalanine and reduced tobacco-specific nitrosamines (tsnas)
CN108424922B (zh) * 2018-04-20 2021-04-16 云南省烟草农业科学研究院 一种降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m271及其应用
KR20210039421A (ko) 2018-07-26 2021-04-09 알트리아 클라이언트 서비시즈 엘엘씨 알칼로이드 수준이 변경된 담배 식물 및 제품을 생산하기 위한 pmt 공학에 기초한 조성물 및 방법
EP3902390A1 (en) 2018-12-30 2021-11-03 Philip Morris Products S.A. Modulation of nitrate levels in plants via mutation of nitrate reductase
CN113660857A (zh) 2019-01-24 2021-11-16 奥驰亚客户服务有限公司 包含降低的烟碱和降低的烟草特异性亚硝胺的烟草植物
US20220213496A1 (en) * 2019-06-05 2022-07-07 University Of Kentucky Research Foundation bZIP TRANSCRIPTION FACTORS REGULATE CONVERSION OF NICOTINE TO NORNICOTINE AND REDUCE LEVELS OF TOBACCO SPECIFIC (TSNA) PRECURSORS
BR112022005552A2 (pt) 2019-10-01 2022-06-28 Philip Morris Products Sa Modulação da redução do teor de açúcar em uma planta (inv)
US20230200344A1 (en) 2019-10-01 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulating sugar and amino acid content in a plant (sultr3)
US20230399651A1 (en) 2019-10-10 2023-12-14 Altria Client Services Llc Compositions and Methods Based on QPT Engineering for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels
EP4041898A1 (en) 2019-10-10 2022-08-17 Altria Client Services LLC Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels with desirable leaf quality via manipulating leaf quality genes
US20240218386A1 (en) 2019-12-03 2024-07-04 Altria Client Services Llc Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels
US20210230627A1 (en) 2020-01-17 2021-07-29 Altria Client Services Llc Methods and compositions related to improved nitrogen use efficiency
WO2021154738A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Altria Client Services Llc Compositions and methods based on pmt engineering for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
WO2021221752A2 (en) 2020-02-06 2021-11-04 Trustees Of Boston University High throughput assay for identifying microbial redox enzymes
WO2021158973A1 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Trustees Of Boston University Enzyme-based electrochemical nicotine biosensor
US20210360960A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Altria Client Services Llc Hybrid air and fire curing combination process to reduce harmful and potentially harmful constituents in cured tobacco
CN111662912A (zh) * 2020-06-01 2020-09-15 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草NtARF6基因突变体及分子鉴定方法和应用
EP4161255A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Altria Client Services LLC Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
WO2023117661A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase
WO2023117701A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants
WO2023230433A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco field
US20240229054A9 (en) 2022-08-05 2024-07-11 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco
WO2024079137A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Philip Morris Products S.A. Increasing leaf biomass and nitrogen use efficiency by regulating ntp2
WO2024160860A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Philip Morris Products S.A. Modulation of genes coding for lysine ketoglutarate reductase
WO2024160864A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Philip Morris Products S.A. Modulation of sugar transporters

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009064771A2 (en) * 2007-11-12 2009-05-22 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
EP0131624B1 (en) 1983-01-17 1992-09-16 Monsanto Company Plasmids for transforming plant cells
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4732856A (en) 1984-04-03 1988-03-22 Carnegie Institution Of Washington Transposable elements and process for using same
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
AU7360087A (en) 1986-04-30 1987-11-24 Boyce Thompson Institute For Plant Research Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
GB8615676D0 (en) * 1986-06-26 1986-07-30 Stoppers Co Ltd Nicotine containing lozenge
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
US4801540A (en) 1986-10-17 1989-01-31 Calgene, Inc. PG gene and its use in plants
EP0267159A3 (de) 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
ATE125418T1 (de) 1987-05-20 1995-08-15 Ciba Geigy Ag Zeamays-pflanzen und transgenetische zeamays- pflanzen, die aus protoplasten oder aus von protoplasten erhaltenen zellen regeneriert wurden.
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5013658A (en) 1988-05-13 1991-05-07 Dna Plant Technology Corporation Transposon tagging of genes in transformed plants
EP0342926B1 (en) 1988-05-17 1994-09-28 Mycogen Plant Science, Inc. Plant ubiquitin promoter system
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
EP0426641B1 (en) 1989-10-31 2000-09-13 Monsanto Company Promoter for transgenic plants
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5260205A (en) 1990-11-14 1993-11-09 Philip Morris Incorporated Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine
US5641664A (en) 1990-11-23 1997-06-24 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
ATE207957T1 (de) 1992-02-19 2001-11-15 Oregon State Produktion virus-resistenter pflanzen durch einführung von nicht-translatierbarer viraler plus-strang-rna
JPH07505531A (ja) 1992-04-15 1995-06-22 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ 単子葉植物細胞の形質転換法
US5311143A (en) 1992-07-02 1994-05-10 Motorola, Inc. RF amplifier bias control method and apparatus
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
ES2105415T3 (es) 1993-06-04 1997-10-16 Cavis Srl Dispositivo de inercia para interrumpir el circuito electrico de un vehiculo con un motor de combustion interna.
EP0865499B1 (en) 1995-09-14 2009-03-18 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Production of lysosomal enzymes in plant-based expression systems
US5713376A (en) 1996-05-13 1998-02-03 Berger; Carl Non-addictive tobacco products
US7238860B2 (en) 2001-04-18 2007-07-03 Mendel Biotechnology, Inc. Yield-related polynucleotides and polypeptides in plants
EP1033405A3 (en) 1999-02-25 2001-08-01 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
WO2000067558A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 Michael Timko Regulation of gene expression in tobacco for manipulation of plant growth and secondary metabolism
US6781033B2 (en) 2000-04-26 2004-08-24 Monsanto Technology Llc Method for the transformation of plant cell plastids
AU2002244262B2 (en) 2001-03-09 2007-07-12 University Of Kentucky Research Foundation Cytochrome P450s and uses thereof
CN1638655A (zh) 2001-06-08 2005-07-13 韦克多烟草有限公司 修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平
US20060157072A1 (en) 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
US6953040B2 (en) 2001-09-28 2005-10-11 U.S. Smokeless Tobacco Company Tobacco mint plant material product
US7032601B2 (en) 2001-09-28 2006-04-25 U.S. Smokeless Tobacco Company Encapsulated materials
US20040103449A1 (en) 2001-11-13 2004-05-27 U.S. Smokeless Tobacco Company Identification and use of cytochrome P450 nucleic acid sequences from tobacco
US20040111759A1 (en) 2001-11-13 2004-06-10 U.S. Smokeless Tobacco Company Identification and use of cytochrome P450 nucleic acid sequences from tobacco
US7812227B2 (en) 2001-11-13 2010-10-12 U.S. Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana
US7700851B2 (en) 2001-11-13 2010-04-20 U.S. Smokeless Tobacco Company Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
US7855318B2 (en) 2001-11-13 2010-12-21 U.S. Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome P450 genes from Nicotiana
US8592663B2 (en) 2001-11-13 2013-11-26 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
US7700834B2 (en) 2001-11-13 2010-04-20 U.S. Smokless Tobacco Company Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
US20040117869A1 (en) 2002-01-11 2004-06-17 U.S. Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome P450 genes from Nicotiana
US20040162420A1 (en) 2002-10-16 2004-08-19 U.S. Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana
WO2003078577A2 (en) 2002-03-12 2003-09-25 U.S. Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana
AU2004282576B2 (en) 2002-10-16 2010-01-28 U S Smokeless Tobacco Company Llc Cloning of cytochrome P450 genes from nicotiana
AU2003301431A1 (en) 2002-10-16 2004-05-04 U.S. Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana
US20050019448A1 (en) 2003-07-22 2005-01-27 Kevin Engelhardt Liquid flavoring dissolving strips and method of use thereof
US8637731B2 (en) 2003-10-16 2014-01-28 U.S. Smokeless Tobacco Company Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
BRPI0415362A (pt) 2003-10-16 2006-12-12 Us Smokeless Tobacco Co molécula de ácido nucleico isolada a partir de nicotina, proteìna isolada de nicotina, planta transgênica, métodos de produção de uma planta transgênica, de seleção de uma planta contendo uma molécula de ácido nucleico, e de aumento ou diminuição dos nìveis de nornicotina em uma planta, produto e folha de tabaco tendo quantidades reduzidas de nìveis de nornicotina, e, método de isolamento de um gene de uma planta
ZA200602938B (en) 2003-10-16 2008-06-25 Us Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome p450 genes from Nicotiana
US8627828B2 (en) 2003-11-07 2014-01-14 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco compositions
BRPI0415741B1 (pt) 2003-11-07 2013-07-23 composições de tabaco e métodos de fabricação de uma composição de tabaco
TW200531647A (en) 2003-12-22 2005-10-01 Us Smokeless Tobacco Co Conditioning process for tobacco and/or snuff compositions
EP1751278B1 (en) 2004-04-29 2015-03-18 U.S. Smokeless Tobacco Company LLC Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
US8586837B2 (en) * 2004-04-29 2013-11-19 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
EP1781123A1 (en) 2004-08-23 2007-05-09 U.S. Smokeless Tobacco Company Nicotiana compositions
US20060185686A1 (en) 2004-08-23 2006-08-24 Lawrence Robert H Jr Nicotiana diversity
US20070199097A1 (en) * 2004-09-03 2007-08-23 U.S. Smokeless Tobacco Company Tobacco plants having a mutation in a nicotine demethylase gene
EP1851317B1 (en) 2005-02-23 2011-10-26 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
US7950399B2 (en) 2005-04-29 2011-05-31 Philip Morris Usa Inc. Non-tobacco pouch product
US7757697B2 (en) 2005-12-22 2010-07-20 Swisher International, Inc. Method for reducing nitrosamines in tobacco
EP2087123B1 (en) 2006-10-13 2011-08-10 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
US8319011B2 (en) * 2006-12-15 2012-11-27 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity
US8186360B2 (en) 2007-04-04 2012-05-29 R.J. Reynolds Tobacco Company Cigarette comprising dark air-cured tobacco
US7667104B2 (en) 2007-11-06 2010-02-23 Alliance One International, Inc. Tobacco cultivar AOB 171
AU2011205282B2 (en) 2010-01-15 2014-10-02 North Carolina State University Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco
JP5550433B2 (ja) 2010-04-22 2014-07-16 任天堂株式会社 操作装置および情報処理システム
WO2012118779A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 North Carolina State University Tobacco inbred plants ncbex1f, ncbex1ms, and nc ex90
CN105517430A (zh) 2013-01-11 2016-04-20 北卡罗莱纳州立大学 烟草近交植物k326 src、cms k326 src、k346 src、cms k346 src、nc1562-1 src、nctg-61 src、cms nctg-61 src和杂交种nc196 src
WO2014137802A1 (en) 2013-03-05 2014-09-12 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and uses thereof
US9596823B2 (en) 2014-03-03 2017-03-21 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof
CN106659232A (zh) 2014-03-03 2017-05-10 北卡罗莱纳州立大学 烟草近交和杂种植物以及由其制得的烟草产品
US9560823B2 (en) 2015-05-01 2017-02-07 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of hybrid corn variety CH103948
US9560822B2 (en) 2015-05-01 2017-02-07 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of hybrid corn variety CH100298
US9560824B2 (en) 2015-05-01 2017-02-07 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of hybrid corn variety CH138178

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009064771A2 (en) * 2007-11-12 2009-05-22 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAKRABARTI MANOHAR, ET AL: "Inactivation of the cytochrome P450 gene CYP82E2 by degenerative mutations was a key event in the evolution of the alkaloid profile of modern tobacco", NEW PHYTOLOGIST, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD., GB, vol. 175, no. 3, 1 August 2007 (2007-08-01), GB, pages 565 - 574, XP002524136, ISSN: 0028-646X, DOI: 10.1111/J.1469-8137.2007.02116.X *
DATABASE EMBL "CHO_OF040xc14f1.ab1 CHO_OF Nicotiana tabacum genomic 5', genomic survey sequence.", XP002629029 *
DATABASE EMBL "CHO_OF3490xi05r1.ab1 CHO_OF3 Nicotiana tabacum genomic 3', genomic survey sequence.", XP002629031 *
DATABASE EMBL "CHO_OF4790xg08f1.ab1 CHO_OF4 Nicotiana tabacum genomic 5', genomic survey sequence.", XP002629032 *
DATABASE EMBL "Nicotiana tabacum cDNA, clone: TBK02GR0013_1_H12, 5'-end sequence.", XP002629030 *
DATABASE EMBL "Nicotiana tabacum cultivar DH98-325-6 nicotine N-demethylase (CYP82E10) gene, complete cds.", XP002629034 *
Dr. Nelson: "P450:CYP82", Metabolomics.JP, 20 June 2009 (2009-06-20), XP002629107, Retrieved from the Internet: URL:https://metabolomics.jp/mediawiki/index.php?title=P450:CYP82&printable=yes, the whole document *
GAVILANO LILY B., ET AL: "Functional analysis of nicotine demethylase genes reveals insights into the evolution of modern tobacco", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 282, no. 1, 5 January 2007 (2007-01-05), US, pages 249 - 256, XP002524135, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/JBC.M609512200 *
RAMSEY S. LEWIS, ANNE M. JACK, JERRY W. MORRIS, VINCENT J.M. ROBERT, LILY B. GAVILANO, BALAZS SIMINSZKY, LOWELL P. BUSH, ALEC J. H: "RNA interference (RNAi)-induced suppression of nicotine demethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves", PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL, BLACKWELL PUB., GB, vol. 6, no. 4, 1 May 2008 (2008-05-01), GB, pages 346 - 354, XP002629035, ISSN: 1467-7644, DOI: 10.1111/j.1467-7652.2008.00324.x *
RAMSEY S. LEWIS, STEVEN W. BOWEN, MATTHEW R. KEOGH, AND RALPH E. DEWEY: "Three nicotine demethylase genes mediate nornicotine biosynthesis in Nicotiana tabacum L.: Functional characterization of the CYP82E10 gene", PHYTOCHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 71, no. 17-18, 1 December 2010 (2010-12-01), AMSTERDAM, NL, pages 1988 - 1998, XP002629033, ISSN: 0031-9422, DOI: 10.1016/j.phytochem.2010.09.011 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201205426B (en) 2014-09-25
US20240122151A1 (en) 2024-04-18
MX337123B (es) 2016-02-12
AR080636A1 (es) 2012-04-25
BR112012017565A2 (pt) 2015-09-01
AU2011205282B2 (en) 2014-10-02
CA2786813A1 (en) 2011-07-21
US20180255738A9 (en) 2018-09-13
US20220225590A1 (en) 2022-07-21
US10681883B2 (en) 2020-06-16
CN102858983B (zh) 2015-08-12
KR20120124065A (ko) 2012-11-12
US20200344967A1 (en) 2020-11-05
PH12017500180A1 (en) 2017-11-20
MX2012008060A (es) 2013-01-14
US11304395B2 (en) 2022-04-19
US11877556B2 (en) 2024-01-23
CA2786813C (en) 2023-03-28
EP2524044A1 (en) 2012-11-21
US10194624B2 (en) 2019-02-05
WO2011088180A1 (en) 2011-07-21
PH12017500180B1 (en) 2017-11-20
US20170359994A1 (en) 2017-12-21
EA201201004A1 (ru) 2013-02-28
AU2011205282A1 (en) 2012-08-30
JP6055311B2 (ja) 2016-12-27
CN102858983A (zh) 2013-01-02
US20160120142A1 (en) 2016-05-05
AR120271A2 (es) 2022-02-09
KR101611847B1 (ko) 2016-04-14
US20130037040A1 (en) 2013-02-14
US9247706B2 (en) 2016-02-02
JP2013516990A (ja) 2013-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11877556B2 (en) Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco
US11981903B2 (en) Tobacco having altered leaf properties and methods of making and using
EP2220231B1 (en) Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
KR20170078599A (ko) 니트레이트 동화 경로의 변경을 통한 담배 특이적 니트로소아민의 감소
KR20220038606A (ko) 타바코 식물에서 알칼로이드 함량을 조정하는 방법
EP2524044B1 (en) Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco
KR20240132133A (ko) 담배 식물들에서 알칼로이드 함량을 조절하는 방법
WO2024153938A1 (en) Method
KR20240132131A (ko) 담배 식물들에서 알칼로이드 함량을 조절하는 방법
KR20240132132A (ko) 담배 식물들에서 알칼로이드 함량을 조절하는 방법
WO2023194747A1 (en) Method of modulating the alkaloid content of tobacco
WO2023194746A1 (en) Method for modulating the alkaloid content of tobacco
WO2023209373A1 (en) Method of modulating the alkaloid content of tobacco

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM