DK144569B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotisk anthracyclin-glycosid-kompleks kaldet baumycinkompleks eller komponenterf syreadditionssalte eller deoxyribonukleinsyrekomplekser dera - Google Patents

Description

(19) DANMARK

/«$»

É| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 11(4569 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 255V77 (51) int.CI.3 C 12 P 19/56 (22) Indleveringsdag 26. maj 1977 q gy ^ 15/24 (24) Løbedag 26. maj 1977 (41) Aim. tilgængelig 1 · dec. 1 977 (44) Fremlagt 29· mar. 1982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr.

(30) Prioritet 51. maj 1976* 51 /65810* JP

(71) Ansøger ZAIMNHOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYUKAI, Tokyo, JP.

(72) Opfinder Hamao Umezawa, JP: Toraio Takeuchi, JP: Masa Hamada* JP: Masaaki Ishizuka, JP: Hiroshi Naganawa, JP: m. fl.

(74) Fuldmægtig Th. Ostenfeld Patentbureau A/S- (54) Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk anthracyclin-gly= cosid-kompleks kaldet baumycin-kompleks eller komponenter* syre= additionssalte eller deoxyribo= nukleinsyrekomplekser deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til frem- qq stilling af et hidtil ukendt anthracyclin-glycosid-kompleks, kaldet (7) baumycin-kompleks eller dets komponenter baumycin Α^Λ A2r B^ og B2/ ^ hvor baumycin A^ og A2 er stereoisomere med formlen: rt ct T— *

Q

2 144569

O OH

Il li Jl x°h iji ™2

E

hvori R betegner

CH-0-CH-CH3 CH„ CH.OH

i 2. 2 OCf

CHOH

i CH3 baumycin og B2 er stereoisomere med formlen I, hvori R betegner

CH-0-CH-CH3 CH„ COOH CHOH

ch3 eller syreadditionssalte eller deoxyribonukleinsyrekomplekser deraf.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker en stamme af Streptomyces udvalgt fra gruppen bestående af Streptomyces coeruleorubidus ME 130-A4 (FERM-P3540, ATCC 31276), Streptomyces peuceticus subsp. cameus ATCC 21354, Streptomyces coeruleorubidus ATCC 13740, Streptomyces peuceticus subsp. caestus NRRL B-5337, Streptomyces peuceticus NRRL B-3826 og Streptomyces coeruleorubidus NRRL B-3045 i et vandigt næringsmedium under submerse aerobe betingelser og udvinder det dannede baumycin-kompleks fra dyrkningsmediet og, om ønsket, opdeler det i sine bestanddele og/eller overfører dem i syreadditionssalte eller deoxyribonuklein-syrekompleks er.

En særlig foretrukket af nævnte baumycin-producerende stammer er isoleret af opfinderne til den foreliggende opfindelse fra en jordprøve opsamlet ved The Institute of Microbial Chemistry, Osaki, 3 144569

Tokyo, Japan, og betegnet stamme HE 130-A4. Kulturer af denne stamme er deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og i The Fermentation Research Institute, Japan, og føjet til deres permanente samlinger af mikroorganismer som hhv. ATCC 31276 og FERM P-3540.

Stamme ME 130-A4 har de følgende egenskaber: 1) Morphologiske egenskaber:

Under mikroskop iagttages det, at åbne spiraler og kroge udvikles godt fra forgrenede substrat-mycelier. Ingen kranse er tilstede, og den modne sporekæde er af moderat længde med mere end 10 sporer. Sporerne måler 0,6 til 0,8 μx 1,0 til 1,2 μ, og deres overflade er pigget.

2) Vækst på forskellige medier:

Beskrivelsen i parentes følger farvestandarden "Color Hamony Manual", udgivet af Container Corporation of America, U.S.A.

a) På glycerol-asparagin-agar (ISP medium nr. 5), inkuberet ved 27 °C:

Blegrødlig gul til mørkerød (4ic, "Pastel orange" til 6 1/2 nc, "Catchup") vækst; lysegråt (17 ge, "Dusty Aqua Blue" til 19 fe, "Aqua Gray") luftmycelium; lyst rødligt gul opløseligt pigment.

b) På saccharose-nitrat-agar, inkuberet ved 27 °C:

Blegrødligt gul, bleg rød til mørkerød (6 1/2 le, "Cedar") vækst; svagt hvidt luftmycelium; svagt mørkerødt opløseligt pigment.

c) På glucose-asparagin-agar, inkuberet ved 27 °C:

Farveløs, bleggul til bleg orange vækst; svagt hvidt til lysegråt luftmycelium, som bliver stærkt udbredt efter 14 dages inkubation; intet opløseligt pigment.

d) På stivelse-uorganiske salte-agar (ISP medium nr. 4), inkuberet ved 27 °C:

Bleg gulligt brun til bleg rødligt gul vækst; lysegråt (19 dc, "Aqua Gray") luftmycelium; intet opløseligt pigment.

e) På tyrosin-agar (ISP medium nr. 7), inkuberet ved 27 °C:

Grålig rødbrunt til brun (4 ni, "Chestnut Brown") vækst; blåhvidt til lyseblåt (19 dc, "Aqua Gray") luftmycelium; mørkebrunt opløseligt pigment.

f) På nærings-agar, inkuberet ved 27 °C:

Gullig brun vækst; hvidt luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

4 144569 g) På gærekstrakt-maltekstrakt-agar (ISP medium nr. 2), inkuberet ved 27 °C:

Mat orange (5 ne, "Tile Red) vækst; lysegråt (19 fe, "Aqua Gray") luftmycelium; svagt brun opløseligt pigment.

h) På havremels-agar (ISP medium nr. 3), inkuberet ved 27 °C:

Farveløs til bleg orange vækst; lysegråt (19 fe, "Aqua Gray") luftmycelium; intet opløseligt pigment.

i) På glycerol-nitrat-agar, inkuberet ved 27 °C:

Farveløs til bleg orange vækst; hvidt til lysegråt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

j) På stivelses-agar, inkuberet ved 27 °C:

Lys orange vaskst; hvidt til lysegråt luftmycelium, som er svagt under 14 dages inkubation; svagt bleg orange opløseligt pigment.

k) På calciummalat-agar, inkuberet ved 27 °C:

Farveløs, bleg orange til mat orange vækst; hvidt til lysegråt (17 ge, "Dusty Aqua Blue") luftmycelium; svagt lyserødt opløseligt pigment.

l) På cellulose, inkuberet ved 27 °C:

Farveløs vækst; hvidt til mat blågrønt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

m) På gelatine-stik, inkuberet ved 20 °C:

Svag gullig brun vækst; intet luftmycelium; svagt brunt opløseligt pigment.

n) På glucose-pepton-gelatine-stik, inkuberet ved 27 °C:

Bleg gulligtbrunt til gulligtbrun vækst; svagt hvidt luftmycelium; mørkebrunt opløseligt pigment.

o) På skummetmælk, inkuberet ved 27 °C:

Bleg gulligt brun, gulligt brun til bleg rød vaskst; svagt hvidt luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

3) Fysiologiske egenskaber: a) Væksttemperatur undersøgtes på glucose-asparagin-agar ved c 144569

D

20, 24, 27, 30, 37 og 50 °C, og den optimale temperatur er ca. 30-37 °C.

b) Gelatinesmeltning på 15% gelatine-stik ved 20 °C og på glucose-pepton-gelatine-stik ved 27 °C: På det førstnævnte medium iagttoges gelatinesmeltning i svag grad efter 20 dages inkubation, men på det sidstnævnte begyndte smeltning i svag eller moderat grad efter 14 dages inkubation.

c) Stivelseshydrolyse på stivelse-uorganiske salte-agar og på stivelses-agar ved 27 °C:

Stærk hydrolyse iagttoges efter 3 dages inkubation på det førstnævnte medium og efter 5 dages inkubation på det sidstnævnte medium.

d) Peptonisering og koagulering af skummetmælk ved 37 °C:

Svagt til moderat peptonisering begyndte efter 7 dages inkubation, og koagulering var afsluttet på ca. 10 til 14 dage.

e) Melanindannelse på trypton-gærekstrakt-substrat (ISP medium nr. 1), på pepton-gærekstrakt-jernagar (ISP medium nr. 6) og på tyrosin-agar (ISP medium nr. 7) ved 27 °C:

Positivt på alle medier.

f) Carbonhydratudnyttelse fra Pridham-Gottlieb basal medium (ISP medium nr. 9), inkuberet ved 27 °C:

Udbredt vækst med glucose, L-arabinose, D-xylose, saccharose, raffinose.

g) Smeltning af calciummalat på calciummalat-agar ved 27 °C:

Stærk til moderat smeltning omkring væksten iagttoges efter 3 dages inkubation.

h) Nitratreduktion på pepton-vand indeholdende 1% natriumnitrat (ISP medium nr. 9), inkuberet ved 27 °C:

Negativ.

Ved opsummering af de ovenfor anførte kendetegn for stamme nr. ME 130-A4, kan det afgøres, at stammen tilhører slægten Streptomyces. Luftmyceliet danner åbne spiraler, men ingen kranse. Sporeoverfladen er pigget. Det viser sig, at væksten på forskellige medier er blegorange til mat rød, og at luftmyceliet er lysegråt. Svagt blegt orange opløseligt pigment dannes. Melanindannelse er positiv. Pro- 6 144569 teolytisk virkning er svag til moderat, og stivelseshydrolyse er stærk. Blandt kendte arter af Streptomyces ligner stamme nr. ME 130-A4 Actinomyces coeruleorubidus på basis af de ovennævnte egenskaber. (Reference 1: International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 312, 1968; Ref. 2: G.F. Gause, Zur Klassifizierung der Actinomyceten, p. 98 Veb. Guotab Fischer Verlag Jena, 1958).

Stamme ME 130-A4 og Act. coeruleobidus ISP 5145 sammenlignedes ved parallelle dyrkninger. Resultaterne er som følger:

Act. coeruleorubidus ME 130-A4__ISP 5145_

Spiraler positiv positiv sporeoverflade pigget pigget luftmycelium lysegråt lysegråt vækst bleg orange bleg gulligt brun mat rød til mat rød

Melanindannelse: ISP medium nr. 1 positiv positiv ISP medium nr. 6 positiv positiv ISP medium nr. 7 positiv positiv stivelseshydrolyse positiv positiv koagulering af mælk positiv positiv peptonisering af mælk positiv positiv gelatinesmeltning positiv positiv nitratreduktion negativ positiv carbonhydratudnyttelse: glucose positiv positiv L-Arabinose positiv positiv D-Xylose positiv positiv D-Fructose positiv positiv saccharose positiv positiv inositol positiv positiv L-Rhamnose positiv positiv raffinose positiv positiv D-Mannitol positiv positiv optimal temperatur for

vækst ca. 37 °C ca. 37 °C

antibiotica dannet baumycin rubidomycin daunomycin (daunomycin) * X Reference, Journal of Pharmaceutical Science J56, 1691 p, 1967.

144569 7

Af resultaterne fremgår det, at den omhandlede stamme ME 130-A4 er i meget nær overensstemmelse med Actinomyces coeruleoru-bidus med hensyn til morphologiske og fysiologiske egenskaber. Der er kun en lille forskel i farven af vasksten, idet ME 130-A4 stammen er lidt mere rød end Act. coeruleorubidus.

Ifølge reference 2 er nitratreduktion af St. coeruleorubidus variabel, alt afhængig af stammen af denne art. Således kan stamme nr. ME 130-A4 identificeres som en ny stamme af Streptomyces coeruleorubidus .

Fremstilling af de omhandlede forbindelser udføres ved dyrkning af en af de nævnte baumycin-producerende stammer af Streptomyces i et konventionelt vandigt næringsmedium indeholdende kendte næringskilder for Actinomycetes, dvs. carbon-, nitrogen- og uorganiske salte-kildér. Submers aerob dyrkning anvendes fortrinsvis ved fremstilling af væsentlige mængder baumycin, ligesom ved andre antibiotica. De til dyrkning af andre Actinomycetes' anvendte generelle fremgangsmåder er anvendelige til den her omhandlede dyrkning. Mediet indeholder fortrinsvis, kommercielt tilgængelige carbonkilder, såsom glycerol, glucose, stivelse, dextrin, saccharose, maltose, olier, fedtarter og så videre i enten renset eller rå tilstand og kommercielt tilgængelige nitrogenkilder, såsom soyabønnepulver, gærekstrakt, pepton, bomuldsfrøpulver, tørret gær, majsstøbevand eller uorganiske salte, såsom ammoniumsulfat, natriumnitrat eller ammoniumchlorid. Uorganiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid eller phosphater anvendes fortrinsvis, og der kan også om nødvendigt tilsættes spormetaller og skumdæmpningsmidler, såsom "Adekanol" (varemærke, Asahi Denka Ind. CO.) eller "silicone" (varemærke, Shinetsu Chem. Ind. Co.). Dyrkningstemperaturen bør ligge i området på ca. 20-35 °C, fortrinsvis ca. 25-30 °C. Produktion af baumycin i dyrkningssubstratet når et maksimum efter 3 til 7 dages forløb i enten rystekolbe-fermente-ring eller submers aerob fermentering med beluftning og omrystning eller -røring, tilvejebragt som i de senere anførte eksempler.

De omhandlede forbindelser, baumycin, kan udvindes fra dyrk- δ 144569 ningssubstratet og adskilles fra hverandre ved de følgende fremgangsmåder.

Baumycin fremstillet ved fermentering er tilstede intracellu-lært såvel som ekstracellulært, men findes hovedsageligt i myceliet. Til udvinding af baumycin-kompleks fra dyrkningssubstratet kan substratet filtreres og filtratet derefter ekstraheres med et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel, såsom ethylacetat, butyl-acetat, chloroform eller n-butanol. Baumycin i myceliet kan udvindes ved ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, acetone, n-butanol, methanol, ethanol, ethylacetat eller methylethyl-keton, eller en vandig opløsning af en organisk eller uorganisk syre, såsom saltsyre, svovlsyre eller eddikesyre. Alternativt kan baumycin ekstraheres direkte fra dyrkningssubstratet ved hjælp af de ovennævnte ekstraktionsfremgangsmåder uden forudgående fraskillelse af myceliet. Efter koncentrering i vakuum kan baumycin-ekstrakterne genekstraheres med et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel ved en pH-værdi på mellem 7 og 9 og baumycinet derefter opløses i en sur vandig opløsning med en pH-værdi mindre end 4. Baumycin i denne sure vandige opløsning genekstraheres derefter med et organisk opløsningsmiddel efter indstilling til en svag basisk pH-værdi. Ved gentagelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder efter behov kan baumycin-kompleks fremstilles i renset form. Som et alternativ til anvendelse af en opløsningsmiddelekstraktion-udvindingsmetode eller i kombination med en sådan metode kan baumycin udvindes fra dyrkningssubstratet ved søjlekromatografi under anvendelse af adsorptionsmidler, såsom aktiveret carbon, aluminiumoxid, kiselsyre, eller en modificeret dextran, såsom den under varemærket "Sephadex LH-20" (Pharmacia Fine Chemical Co., New York, New York) kommercielt tilgængelige dextran, modstrømsfordelings- eller væske-kromatografi ved anvendelse af velegnede organiske opløsningsmidler. Aktive ekstrakter opnået ved sådanne metoder koncentreres under formindsket tryk og opnås som et råt rødt pulver af baumycin-kompleks.

Til opnåelse af de enkelte baumycin-bestanddele A^, A£, og B2 fra baumycin-komplekset kan yderligere rensning og adskillelse udføres ved anvendelse af standardadskillelsesteknikker, såsom søjlekromatografi under anvendelse af forskellige adsorptionsmidler, såsom kiselsyre, modificerede dextraner (f.eks. "Sephadex LH-20"), svagt sure ionbytter-harpikser eller aktiveret carbon, modstrøms 9 144569 fordelings- eller væske-kromatografi under anvendelse af velegnede organiske opløsningsmidler, eller en kombination af en eller flere af de ovennævnte fremgangsmåder. Som et eksempel på en velegnet adskillelsesmetode kan baumycin-kompleks opløses i en lille mængde chloroform, udsættes for søjlekromatografi over kiselsyre og derefter elueres med et velegnet organisk opløsningsmiddel, f.eks. chloroform-methanol, til dannelse af baumycin-bestanddelene A^, A3# og &2· De aktive eluater adskilles og koncentreres under formindsket tryk, og baumycin-bestanddelene renses hver for sig ved kromatografi over "Sephadex LH-20". Efter koncentrering af de aktive eluater kan baumycin A^, A2, B^ og B3 opnås i renset krystallinsk form ved omkrystallisation fra et velegnet organisk opløsningsmiddel.

De fysicokemiske egenskaber af baumycin A^, A3/ B^ og B2 er anført nedenfor, idet der henvises til tegningen, hvori:

Figur 1 viser det ultraviolette og synlige lys absorptionsspektrum af baumycin A^ i methanol, figur 2 det infrarøde absorptionsspektrum af baumycin A^, pelleteret i kaliumbromid, figur 3 NMR-spektret af baumycin A^ i CDC13 (100 MHz) , figur 4 det ultraviolette og synlige lys absorptionsspektrum af baumycin A2 i methanol, figur 5 det infrarøde absorptionsspektrum af baumycin A3/ pelleteret i kaliumbromid, figur 6 NMR-spektret af baumycin A2 i CDCl^ (100 MHz), figur 7 det ultraviolette og synlige lys absorptionsspektrum af baumycin B3 i methanol, figur 8 det infrarøde absorptionsspektrum af baumycin B^, pelleteret i kaliumbromid, figur 9 NMR-spektret af baumycin B^ i en blanding af CDC13 og CD30D (100 MHz), figur 10 det ultraviolette og synlige lys absorptionsspektrum af baumycin B3 i methanol, figur 11 det infrarøde absorptionsspektrum af baumycin B2, pelleteret i kaliumbromid, figur 12 NMR-spektret af baumycin B2 i en blanding af CDC13 og CD3OD (100 MHZ), 10 144569 figur 13 felt-desorptionsmasse-spektret af baumycin (emitter-strøm 11 mA), figur 14 felt-desorptionsmasse-spektret af baumycin A£ (emitter-strøm 12 mA), figur 15 felt-desorptionsmasse-spektret af baumycin B^-methylester-derivat (emitter-strøm 14 mA), figur 16 felt-desorptionsmasse-spektret af baumycin Bj-methylester-derivat (emitter-strøm 14 mA).

11 144569

Baumycin

Fremtræden Svagt basisk amorft rødt pulver

Grundstof-

analyse CHNOCHNO

Fundet 39ΤΗΓ b, 65 27θΓ 29,83 ~5o^T 6,72 2,31 29,52

Beregnet 6o,6l M3 2,08 30,88 60,6l 6,43 2,08 30,88

Empirisk formel C34H43^°13

Molekylvægt &73s7

Smeltepunkt (°c) 182 - 185 185 - 189

Specifik rotation „ .__n 2o +150” +155° D (CHCls, C0,1)

Opløselig i surt vand, DMSO, methylcello-solv, methanol, ethanol, n-propanol, Opløselighed n-butanol, ethylacetat, butylacetat, acetone, methylethylketon, methylen-chlorid og chloroform. Uopløselig i vand, n-hexan, cyclohexan og petroleums-ether.

værdier ** *C:M = 10:1 0,25 0,08 C:M:B * 7:5:5 j 0,39 0,28 C:M:F = 90:10:1 0,26 0,17 C :M:A = 80:20:4 0,74 0,64

Sur vandig opløsning og methanolopløsning Reaktion er rød og bliver rødlig violet i basisk tilstand. Baumycin A.^ og A2 giver positiv ninhydrinreaktion og reducerer ikke Fehlings væske.

12 144569

Baumycin A

-------i___^2__ UV og synligt Pig. i pig ^ absorptionsspek- 231,5 (4B), 252,5 (327)j 234,5 (K27)\ 252j5 (3n) trun, og 289 (120), 478 (127)j ^ 8 ^ (Ea^rks.= 497 (128), 532 ( 76) ,97 (128)j S2 I > i MeOH (kurve 1) i 0,1N HC1- 234,5 (459), 252,5 (326),234,5 (447), 252,5 (511)

Me0H 289 (121)i ^79 (133), 289 (111), 4?8 (131) (kurve 2) |497 (133), 532 (78) if97 (131), 532 (70) i 0,1N 250,5 (4l6), 350 (83), 250,5 (421), 350 (80),

NaOH-MeOH 558 (164), 597 (152) 553 (170), 596 (164) (kurve 3)

Infrarødtabsorp- tionsspektrum Fig. 2 Fig> 5 (KBr) NMR spektrum Pig. 3 pig. g (PMR) (100 MHz, i CDCl-j) NMR Karakteristisk karakteristisk spektrum C-l" toP c-l" top ved 106,7 ppm ved 101,6 ppm C = chloroform, M = methanol, B = benzen, F = myresyre, A = eddikesyre.

13 144569

Baumycin Bg

Fremtræden Svagt basisk amorft rødt pulver

Grundstof-

analyse CHNOCHITO

Fundet 57 >32 6,45 2,01 52,58 56,59~5^96 1,92 31,91

Beregnet 59,38 6,01 2,04 32,57 59.,38 6,01 2,04 32,57

Empirisk formel C34H4lNOl4

Molekylvægt 687,7

Smeltepunkt (°C) l8l - I89 197 - 201

Specifik rotation + 170° + ijq°

Γ 1 20 α D

(CHC13 : Me0H = 1 : 1, C = 0,1)

Opløselig i surt vand, methylcellosolv, methanol, ethanol, n-propanol og n-butanol.

Opløselighed

Uopløselig i vand, ethylacetat, acetone, methylenchlorid, chloroform, carbontetra-chlorid, benzen, toluen, ethylether og n-hexan, bortset fra, at baumycin Bj er opløselig i vand.

værdier ** *C:M = 10:1 0,0? 0,01 C:M:B = 7:3:3 0,59 0,14 C:M:P = 90:10:1 0,l8 0,10 C:M:A = 80:20:4 0,64 0,30

Sur vandig opløsning og methanolopløsning j^ø t i o n er rød og bliver rødlig violet i basisk tilstand. Baumycin og giver positiv ninhydrin-reaktion og reducerer ikke Fehlings væske.

--- - . _ 14 144569

Baumycin _ ---—^---B5 w og synligt Pig. 7 absorption spek- 234,5 (550* . 0 ' S* 10 trum 290 (X 2 ;7f' K <575)> 852 <4l4>> w maks h 476 (W). 290 (130), it78 (176), ^ΓΜβΟΗ ^ (181)> S0 (101> 4^ (183), 530 (120) (kurve 1) i o.M H01- 234 (580), as (397), ' U (616), 253 (*19),

Me0H Hl 14/’ *76 (182), 290 (1*5), *76 (195), (kurve 2) 495 (184), 530 (i00) 494 (191), 529 (105)

NaOH-MeOH ^ 350 (65)> 251 <4">> 350 <74)> (kurve 3) 556 (2°6^ 594 (195) 556 (231), 594 (218)

Infrarødt absorptionsspektrum Pig. g ^ (KBr) KMR spektrum Fig. g Fig> j2 (PMR) (100 MHz, i CDCl^ og CD^OD blanding) ***C^ NMR Karakteristisk karakteristisk spektrum C-l" top C-l" top ved 107,1 ppm .vedi02,l ppm st? C = chloroform, M = methanol, B = benzen, F = myresyre, A = eddikesyre.

sM* TLC-betingelse: kiselsyre-tyndtlag 60F254 (Merc^ Co*), 23 °C.

*** Spektrum målt på "Varian XL 100"-instrument ved 25,2 MHz. Indre reference er IMS. Prøver: = 45 mg/0,6 ml CDC13: methanol(5:1)? B^ = 30 mg/0,6 ml CDCl^:methanol (1:1).

15 1*4569

Strukturerne af de omhandlede baumycln A^, A2> B^ og B2 bestemtes som følger:

Ved hydrolyse med 0,1N saltsyre i 30 minutter ved 85 °C giver baumycin A^, A2/ B^ og B2 daunomycinon og daunosamin, og daunomycin opnås fra de ovennævnte baumycin-bestanddele ved partiel hydrolyse med 1% svovlsyre i 15 minutter ved 32 °C. Fysicokemiske egenskaber, såsom NMR-, masse- og infrarødt absorptions-spektrum, smeltepunkt og R^-værdier på tyndlag af daunomycinon, daunosamin og daunomycin opnået ud fra baumycin A og B ved sur hydrolyse falder ind sammen med de tilsvarende værdier for autentisk daunomycin. (Journal of American Chemical Society, £6, 5334-5335, 5335-5336 (1964)).

Yderligere klarlæggelse af strukturerne af de omhandlede baumycin og A2 udførtes som følger:

Hydrogenolyse af baumycin A2 med Pd/BaSO^ i methanol gav en aglycon-del og en sukker-del. Fra analyse af PMR- og masse-spektrale data bestemtes aglyconen at være 7-deoxydaunomycinon. Med hensyn til sukkerenheden i baumycin A^ og A2 analyseredes tetracetylderivatet, som opnås ved behandling af hver del (dvs. delen fra eller A2) med eddikesyreanhydrid i pyridin, ved PMR- og Cl- (kemisk ionisering) massespektrum, og den følgende struktur foresloges:

CHr, I NH

^ CiL· I

H I ^ C°CH? ocochj \ _CH? OCOCH.

Til yderligere bekræftelse af strukturerne af baumycin A^ og A2 bestemtes molekyliontoppen for hver af dem ved den fornyligt udviklede FD (felt-desorptions) massespektrumanalyse og viste sig at være: m/e = 674 (M + 1), som vist i fig. 13 og fig. 14. Følgelig er molekylformlen for både baumycin A^ og A2 C34H43NOi3· 1 lyset af forskellene i smeltepunkter, specifikke rotationer, tyndlags-kroma- 13 tografi-Rf-værdier og C NMR-toppe er det afgjort, at baumycin A^ 16 144569 og A2 er indbyrdes stereoisomere.

Strukturerne af baumycin og B2 bestemtes som følger:

Hydrogenolyse af baumycin B^ med Pd/BaSO^ i methanol gav en aglycon-del og en sukker-del. Fra analyse af PMR- og masse-spektrale data bestemtes aglycon-delen at være 7-deoxydaunomycinon. Med hensyn til sukkerdelen analyseredes diacetylderivatet deraf, som opnås ved behandling af hver sukkerdel med eddikesyreanhydrid i pyridin, ved PMR- og CI-massespektrum, og den følgende struktur foresloges:

VoCOCKj

H I

H f H3C-4/ ° \ 'COCH.

j fe

Til yderligere bekræftelse af strukturerne af baumycin B^ og B2 bestemtes molekyliontoppen for hver enkelt ved FD-massespektrum. Eftersom iontoppen ikke kunne opnås fra baumycin B^ og B2 hver for sig, analyseredes deres methylesterderivat opnået ved behandling med diazomethan, og dette derivat viste en molekyliontop ved m/e = 702 (M + 1), som vist i fig. 15 og fig. 16. Toppene ved m/e = 716, 730 og 744, vist i fig. 15 og 16 indicerer methylering af amino-grupperne i daunosamin. Skønt baumycin B^ og B2 således har samme molekylformel, er det påvist fra forskelle i deres smeltepunkter, 13 tyndtlagskromatografi-R^-værdier og C NMR-toppe, at de er indbyrdes stereoisomere.

Ved opsummering af resultaterne fra det ovennævnte arbejde kan det afgøres, at baumycin A^ og A2 har den fælles struktur: 144569 17

O

O OH || — CEj

|| OH

igi ^oh y ΗΟ-ζ ch3 medens baumycin B^ og B£ har den fælles struktur: Λ 0

i° 0H II

j/yyyv' ~ch3

OCH, 0 OH I

p o ^

vvN

»w ch3 18 144569

Som ovenfor anført er henholdsvis baumycin A^ og A2 og bau-mycin B1 og B2 indbyrdes stereoisomere og kan let skelnes fra hinanden ved hjælp af forskelle i fysiske egenskaber, såsom smeltepunkter, specifik rotation (A, og A„) , tyndtlags-R^-værdier eller 13 1. z z C NMR-toppe.

Det fremgår klart af de ovenfor anførte formler, at baumycin A^, A2, og B2 er hidtil ukendte anthracyclin-glycosid-antibiotica, som indeholder den samme aglycon og den samme aminosukker (nemlig daunosamin) som daunomycin, men som afviger fra daunomycin ved at have de yderligere hidtil ukendte sukkerdele, som er vist ovenfor.

De omhandlede baumycin-antibiotica er også differentieret af opfinderne af den foreliggende opfindelse fra kendte anthracyclin-anti-biotica ved hjælp af R^-værdisammenligninger under anvendelse af silicageltyndtlagskromatografi med forskellige opløsningsmiddelsystemer.

Baumycin A^, A2, B^ og B2 udviser antimikrobielle aktiviteter mod forskellige typer af mikroorganismer. Den mindste inhiberende koncentration af de foreliggende antibiotica, bestemt ved substratfortyndingsmetoden, er vist i Tabel I.

144569 19

TABEL I

Antimikrobiel spektrum af baumycin A^, A^· Bi og B2 mindste inhiberende

Testorganisme koncentration (mcg/ml) BM-A1 BM-Ag BM-B1 BM-Bg

Staph, aureus FDA209P 1,56 3,12 50 100

Staph. aureus Smith 0,78 1,56 50 50 B. subtilis ATCC 6635 0,78 3,12 100 >100 B. cereus ATCC 963^ 1,56 3,12 100 >100 B. megaterium NBBL B-958 1,56 6,25 100 >100

Sarcina lutea ATCC 93^1 0,78 3,12 50 25

Micrococcus flays 0,78 1,56 50 50

Coryne. bovis l8l0 1,56 6,25 50 50

Ps. fluorescens nihjb-254 >100 100 100 >100

Proteus morganii >100 >100 >100 >100

Mycobacterium smegmatis ATCC 607 6,25 12,5 100 >100

Candida albicans IAM 4905 100 100 100 >100

Candida tropicalis 100 100 100 >100 BM: baumy c in 20 144569

Som vist ovenfor har de omhandlede baumycin A^, A^, og B2 antimikrobiel aktivitet, især mod gram-positive bakterier, og de er således terapeutisk nyttige ved behandling af dyr, indbefattet mennesker, mod diphtheria, tuberculosis, pneumonia, tetanus og andre infektionssygdomme, som er forårsaget af gram-positive bakterier.

De omhandlede baumycin A^, A^> B^ og udviser en udpræget antitumor-aktivitet med lav toksicitet i eksperimentelle dyretests og er således terapeutisk nyttige ved hæmning af væksten af tumorer i pattedyr, indbefattet mennesker. Især udviste baumycin A^, AB^ og B„ udpræget inhiberende virkninger på muse-L-1210-leukemia.

^ 6 F.eks. podedes BDF-^-mus intraperitonealt med 1 x 10 L-1210 celler/ mus, og 24 timer efter podning injiceredes medikamentet intraperitonealt én gang daglig i 10 dage efter hinanden. På dag 30 var den procentvise forlængelse af overlevelsestiden i forhold til kontrollen som følger:

Dosis Forlængelse af overlevelsestid (mg/kg/dag) _;_T/C (%)_ BM-A1 BM-Ag BM-B1 BM-B2 8 1*7 155 6 165 135 ^ 136 111 2 117 99 1 167 105 99 0.5 173 99 0.25 163 99 0.125 151 93 0.06 >300 141 0.03 187 0.015 155 0.008 131 0.004 131 BM = Baumycin 21 144569

Akut toksicitet.

LD^q-værdierne bestemt efter intraperitonealt injektion af de omhandlede antibiotics er vist i den følgende tabel.

LD50 (mg/kg) BM-A^ 1,5 - 2,5 BM-A2 15 - 20 BM-B1 40 - 60 BM-B2 75 - 100 BM = baumycin.

Som ovenfor anført er de omhandlede forbindelser baumycin A^, A2, B^ og B2 hidtil ukendte antibiotica, som er nyttige til både human og veterinær medicinsk brug, og som også har udpræget inhiberende virkning mod ondartede tumorer i pattedyr, indbefattet mennesker, især ascitiske og faste tumorer.

De omhandlede forbindelser danner ikke-toksiske syreadditionssalte med forskellige organiske og uorganiske salt-dannende reagenser og danner ikke-toksiske komplekser med deoxyribonucleinsyre. Således kan syreadditionssalte, dannet med farmaceutisk acceptable syrer, såsom svovl-, phosphor-, salt-, eddike-, propion-, olie-, palmitin-, citron-, rav-, vin-, glutamin-, pantothensyre osv., og ikke-toksiske komplekser med deoxyribonucleinsyre anvendes på samme måde som baumycin-forbindelserne i sig selv. Saltene dannes, isoleres, renses og formuleres ved metoder, som sædvanligvis anvendes ved saltdannelse for antibiotica. I tilfælde af DNA-kom-plekser kan DNA, som er ekstraheret fra dyr og mikroorganismer, såsom kalvethymrs, hela-celler, menneske- og dyre-embryo-celler, gærarter osv., anvendes. Fremstilling af baumycin-DNA-komplekser kan udføres ved metoder, som er beskrevet i litteraturen for fremstilling af DNA-komplekser af andre anthracyclin-antibiotica, såsom adriamycin, daunorubicin osv. [se f.eks. Nature, New Biol. 239:110 (1973) og Europ. J. Cancer 10:399 (1974)].

22

U456S

Farmaceutiske præparater, som indeholder en effektiv antibakteriel eller tumor-inhiberende mængde af baumycin A^, A2, eller eller en blanding deraf eller af et ikke-toksisk syreadditionssalt eller DNA-kompleks deraf i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder,kan fremstilles i en hvilken som helst farmaceutisk form, som er passende til parenteral administrering.

Sådanne præparater til parenteral administrering omfatter sterile vandige eller ikke-vandige opløsninger, suspensioner eller emulsioner. De kan også fremstilles i form af sterile faste præparater, som kan opløses i sterilt vand, fysiologisk saltvandsopløsning eller et andet sterilt injicerbart medium umiddelbart før brug.

Det er indlysende, at de aktuelle foretrukne mængder af de anvendte baumycin-antibiotica vil variere alt efter den anvendte bestemte forbindelse, det formulerede bestemte præparat, anbringel-sesmåen og det bestemte udspring, den bestemte værtsorganisme og den bestemte sygdom, som skal behandles. Sædvanligvis injiceres baumycin-antibioticaene intraperitonealt, intravenøst, subcutant eller lokalt i dyr og intravenøst eller lokalt i mennesker. Mange faktorer, som modificerer medikamentets virkning, skal tages i betragtning af fagmanden, f.eks. alder, legemsvægt, køn, diæt, administreringstid, administreringsvej, ekskretionshastighed, patientens tilstand, medikamentkombinationer, reaktionsoverfølsomheds-tilfælde og sygdommens alvor. Administrering kan udføres kontinuert eller periodisk indenfor den størst tålte dosis. Optimale anbringelseshastigheder for et givet sæt betingelser kan fagmanden skaffe sig kendskab til under anvendelse af konventionelle doseringsbestemmelses-tests under hensyn til de ovennævnte ledetråde.

23 144569

Med henblik på anvendelse som et antibakterielt middel administreres baumycin-præparaterne sædvanligvis således, at koncentrationen af aktiv bestanddel er større end den mindste inhiberende koncentration for den bestemte organisme, som behandles.

De følgende eksempler skal nærmere belyse opfindelsen yderligere.

Eksempel 1.

Et næringsmedium med den følgende sammensætning foruden vand fremstilledes:

Kartoffelstivelse 1 % glucose 1 "Prorich" (soyabønnepulver) 1,5 k2hpo4 0,1

MgS04,7H20 0,1

NaCl 0,3 mineraler 1 (pH-værdi 7,4) 0,125 - mineraler CuS04,5H20 2,8 g

FeS04,7H20 0,4 -

MnCl2,4H20 3,2 -

ZnS04,7H20 0,8 - i 500 ml vand.

50 ml af dette medium steriliseredes ved 120 °C i 15 minutter i en 500 ml kolbe, som podedes fra en agar-skråglaskultur af Strep-tomyces coeruleorubidus ME 130-A4 ved hjælp af en platinøjenål.

Inkubering fortsatte i 72 timer ved 28 °C på en rotations-ryster (230 omdr./min.). Dette var podekulturen. 7 1 af det følgende medium fremstilledes, og 50 ml portioner af mediet fordelt og steriliseret i 500 ml kolber podedes aseptisk med 1 ml af den ovennævnte podekultur. Fermentering udførtes ved 28 °C i 7 dage på en rotations-ryster (130 omdr./min.).

Saccharose 4 % "Prorich" 2 5 (soyabønneprotein, Ajinomoto Co.) '

NaCl 0,25 - calciumcarbonat 0,32 mineraler 1 (pH-værdi 7,4) 0,125 - 24 U6569 + mineraler CuSC>4,5H20 1,25 g

MnCl2,4H20 1,25 -

ZnS04,7H20 12,5 i 500 ml vand.

Det opnåede dyrkede substrat filtreredes til adskillelse af dyrkningsfiltratet og myceliet. Filtratet ekstraheredes 3 gange med 1/5 volumen chloroform. Myceliet ekstraheredes 3 gange med 2 1 acetone pr. 1 kg kage, og den resulterende acetoneekstrakt koncentreredes til halvt volumen under formindsket tryk.

Koncentratet ekstraheredes 3 gange med 2 1 chloroform, kombineredes med den fra dyrkningsfiltratet opnåede chloroformopløsning og koncentreredes til tørhed under formindsket tryk. 10 g opnået olieagtigt stof opløstes i 50 ml chloroform, og det ved tilsætning af 300 ml n-hexan dannede bundfald centrifugeredes i 5 minutter ved 3000 omdr./min. til fjernelse af urene, i n-hexaner opløselige stoffer. Det resulterende bundfald (1,4 g) opløstes i 100 ml chloroform og ekstraheredes 3 gange med 150 ml 0,01M eddikesyre til opnåelse af syre-opløselige stoffer. Til denne ekstrakt sattes 2M tris-hydroxyamino-methanopløsning til indstilling af pH-værdien på 8,5, og opløsningen ekstraheredes derefter 3 gange med 100 ml chloroform. Der opnåedes 230 mg rødt råt pulver (baumycin-kompleks) fra chloro-formlaget ved koncentrering til tørhed under formindsket tryk.

Eksempel 2.

Det rå pulver opnået ifølge Eksempel 1 (230 mg) opløstes i 2 ml chloroform-methanol-blanding (10:1), overførtes til en søjle med 65 cm længde og 8 cm diameter fyldt med 80 g kiselsyre og udvaskedes med chloroform-methanol-blanding (10:1). Baumycin A-^-frak-tionen elueredes først, efterfulgt i rækkefølge af baumycin A2, og B2 under anvendelse som det respektive elueringsmiddel af 8:1, 5:1 og 2:1 blandinger af chloroform-methanol.

Efter at hver aktiv fraktion var forenet hver for sig og koncentreret til tørhed under formindsket tryk, overførtes hver fraktion til en søjle med 25 cm længde og 1,8 cm diameter fyldt med "Sephadex LH-20" og udvaskedes med 3:1 toluen-methanol-blanding.

Efter koncentrering af de ovenfor opnåede fraktioner opnåedes røde pulvere af 10 mg baumycin A^, 18 mg baumycin A2, 3 mg baumycin B^ og 1 mg baumycin B2 ved tilsætning af n-hexan til koncentratet.

144569 25

Eksempel 3.

Et næringsmedium med den følgende sammensætning foruden vand fremstilledes:

Kartoffelstivelse 2 % glucose 2 gærekstrakt n r - (Daigo Eyo Co.) '

NaCl 0,25- calciumcarbonat 0,32- soyamel ("Nishin Oil KK") 2 - mineraler + 0,2 - (pH-værdi 7,4) + mineraler, som i Eksempel 1.

8 1 af det ovennævnte medium fremstilledes, hvoraf 50 ml portioner fordeltes i 500 ml kolber, steriliseredes ved 120 °C i 15 minutter og podedes med 1 ml podekultur af Streptomyces peuceticus subsp. carneus ATCC 21354 fremstillet ved den i Eksempel 1 beskrevne metode. Fermentering udførtes på en rotation-ryster ved 28 °C i 6 dage. Det dyrkede substrat filtreredes til adskillelse af myceliet fra dyrkningsfiltratet. Ekstraktion med chloroform og acetone foregik som i Eksempel 1, og 10 g olieagtigt stof opnåedes. Det olieag-tige stof opløstes i 100 ml methanol, og 1,2 g bundfald opnåedes efter fjernelse af n-hexan-opløselige stoffer ved tilsætning af 100 ml n-hexan. Det røde bundfald opløstes i 100 ml chloroform og ekstraheredes med 600 ml natriumacetat-puffer (pH-værdi 3,0) til opnåelse af et syre-opløseligt stof. Efter tilsætning af 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre til ekstrakten, indtil denne var 0,01M, indstilledes pH-værdien til 8 med 4M natriumhydroxid.

De aktive bestanddele i denne vandige opløsning ekstraheredes 4 gange med 200 ml chloroform og ekstraheredes derefter 2 gange med 500 ml n-butanol. De resulterende chloroform- og n-butanol-lag koncentreredes hver for sig under formindsket tryk, og 200 mg rødt pulver, som hovedsageligt bestod af baumycin , opnåedes. Dette rå pulver opløstes i 5 ml chloroform-methanol, overførtes til en søjle med 23 cm længde og 3,0 cm diameter fyldt med 80 g kiselsyre og udvaskedes med en 20:1 blanding af chloroform og methanol. Baumycin og B^ elueredes i rækkefølge med 5:1 og 2:1 blandinger af chloroform og methanol. Fraktioner af baumycin B^ og B2 koncentreredes hver for 144569 26 sig under formindsket tryk, og 50 mg baumycin og 8 mg baumycin B2 opnåedes. De resulterende baumycin og B2 omkrystalliseredes fra methanol, og henholdsvis 31 mg og 6,5 mg krystallinsk materiale opnåedes. Ved denne metode fremstilles meget lidt baumycin A^ og A2.

Eksempel 4.

I overensstemmelse med de almene metoder beskrevet i Eksempel 1 og 2 opnåedes baumycin A^, A2, B^ og B2 som følger ved anvendelse af de anførte Streptomyces-stammer: baumycin opnået (mg)

Stamme A-j^ A2 B1 B2

Streptomyces peuceticus subsp.

carneus ATCC 21354 8 12 4 2

Streptomyces coeruleorubidus ATCC 13740 16 21 8 3

Streptomyces peuceticus subsp.

caestus NRRL B-5337 11 10 7 3

Streptomyces peuceticus NRRL B-3826 10 5 1 3

Streptomyces coeruleorubidus NRRL B-3045 26 17 5 6

Claims (2)

144569 27 Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk anthracyclin-glycosid-kompleks kaldet baumycin-kompleks eller dets komponenter baumycin A^, A2, og B2, hvor baumycin A^ og A2 er stereoisomere med formlen

0 OH JJ JL ooch3 0H J— o /M oN|_/ NHg R hvori R betegner ch-o-ch-ch3 CH0 CH0OH ,22 og CHOH CH3 baumycin B3 og B2 er stereoisomere med formlen I, hvori R betegner ch-o-ch-ch3 ch9 COOH CHOH ch3 eller syreadditionssalte eller deoxyribonukleinsyrekomplekser deraf, KENDETEGNET ved, at man dyrker en stamme af Streptomyces udvalgt fra gruppen bestående af Streptomyces coeruleorubidus ME 130-A4 (FERM-P3540, ATCC 31276), Streptomyces peuceticus subsp. carneus ATCC 21354, Streptomyces coeruleorubidus ATCC 13740, Streptomyces