DE972336C - Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders fuer die Oraltherapie geeigneten Penicillinen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

AUSGEGEBEN AM 2. JULI 1959

DEUTSCHES PATENTAMT

PATENTSCHRIFT

KLASSE 30 h GRUPPE 2 30 INTERNAT. KLASSE A 61 k; C12d

B 23846IVaj30h

Dr. Ernst Brandl, Kundl,

und Dr. Hans Margreiter,

Radfeld, Post Rattenberg, Tirol (Österreich)

sind als Erfinder genannt worden

BIOCHEMIE Gesellschaft mit beschränkter Haftung, Innsbruck (Österreich)

Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders für die Oraltherapie geeigneten Penicillinen

Patentiert im Gebiet der Bundesrepublik Deutschland vom 20. Januar 1953 an Patentanmeldung bekanntgemacht am 21. April 1955

Patenterteilung bekanntgemadit am 18. Juni 1959

Die Priorität der Anmeldung in Österreich, vom 22. April und 29. April 1952 ist in Anspruch genommen

Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Penicillinen, die sich von den normalen, klinisch untersuchten und angewendeten Penicillinen G, X, F und K durch die Art der Seitenkette unterscheiden, sind bereits in großer Zahl durchgeführt worden. Die Einführung der gewünschten Radikale in das Penicillinmolekül wird, wie z. B. in der britischen Patentschrift 643 514 beschrieben ist, durch Zusatz chemischer Verbindungen (sogenannter Precursors) bei der Fermentation bewirkt. Das

Formelbild der so erhaltenen Penicilline kann durch die Formel

C₈H₁₀O₃NS-NHCO-R,

wobei R die verschiedenen eingeführten Radikale bedeutet, dargestellt werden.

Es ist bekannt, Penicillin aus seinen wässerigen Lösungen mittels Säuren in Verbindung mit organischen Lösungsmitteln zu extrahieren. Da die bisher hergestellten Penicilline, wie Penicillin G, X,

F und K, von Säuren in kurzer Zeit inaktiviert werden, war es notwendig, dieselben möglichst schnell und unter Verwendung besonders konstruierter Extraktionsvorrichtungen in die organische Phase überzuführen und sie daraus in Form ihrer Salze mit Aminen oder Alkalien zu gewinnen. Es wurde nun gefunden, daß Penicilline, die der allgemeinen Formel

C₈H₁₀O₃NS-NHCO-(R₁X)_n-R₂,

worin R₁ einen zweiwertigen, gegebenenfalls substituierten aliphatischen Rest, X Sauerstoff, Schwefel oder die NH-Gruppe, η eine ganze Zahl von ι bis 5 und R₂ einen aliphatischen, araliphatischen und/oder aromatischen, gegebenenfalls substituierten Rest bedeutet, entsprechen, sich in ihren Eigenschaften typisch von den normalen Penicillinen G, X, F und K unterscheiden. Im Gegensatz

ao zu den normalen Penicillinen weisen, wie festgestellt wurde, die Penicilline dieser Formel eine völlig unerwartete und hohe Stabilität unter verschiedenen Bedingungen und vor allem gegen den Einfluß von Säuren auf. Es wurde gefunden, daß

as Penicilline der oben angeführten Struktur in homogener Lösung bei einem p_H von ι bis 2 und bei 24⁰ C eine wesentlich größere Stabilität besitzen als beispielsweise reines Penicillin G bei einem p_H von 2,i und bei 24⁰ C, dessen Halbwertzeit nur 18 Minuten beträgt. Im Vergleich dazu besitzt

z. B. das Phenoxymethylpenicillin eine solche von 500 Minuten. Die freie kristallisierte Säure ist bei Zimmertemperatur praktisch unbegrenzt haltbar.

Auf Grund dieser neuen Erkenntnisse besteht nun das Verfahren gemäß der Erfindung im wesentlichen darin, daß man aus den bei der Fermentation erhaltenen Rohlösungen oder aus bei der nachfolgenden Aufarbeitung der Rohlösungen erhaltenen wässerigen Lösungen, welche Penicilline der allgemeinen Formel

C₈H₁₀O₃NS-NHCO-(R₁X)_n-R₂,

worin R₁ einen zweiwertigen, gegebenenfalls substituierten aliphatischen Rest, X Sauerstoff, Schwefel oder eine N Η-Gruppe, η eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 und R₂ einen aliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, bedeutet, enthalten, diese Penicilline als freie Säuren abscheidet, beispielsweise indem man diese Penicilline aus den wässerigen Lösungen (Rohlösungen oder wässerige Extraktionsstufen) durch Fällung mit Säuren gewinnt oder aus diesen Lösungen in Gegenwart von Säuren in organische Lösungsmittel überführt und durch Abdunsten des Lösungsmittels isoliert. Der Isolierung der oben bezeichneten Penicilline in Form ihrer freien Säuren kann eine weitere Reinigung zum Zwecke der Entfernung begleitender Precursorsäuren, z. B. durch Waschen mit Wasser, Umfällung usw., folgen. Es können aber auch Lösungen vor der Isolierung der freien Säuren der Penicilline durch Entfernung von Verunreinigungen, insbesondere restliche Mengen von Precursorsäuren, gereinigt werden. Gemäß dem Verfahren der Erfindung gelingt es erstmalig, Penicilline als freie Säuren in definierter, kristallisierter Form zu gewinnen. Die isolierten Säuren weisen demgemäß scharfe Schmelzpunkte auf; sie sind in Wasser nur wenig löslich, lösen sich aber unter Bildung der Salze leicht in Pufferlösungen von z. B, p_H 7,2.

Das Verfahren gemäß der Erfindung hat sich insbesondere zur Gewinnung von Phenoxymethylpenicillin

C₈H₁₀O₃NS-NHCO-CH₂OC₈H₅,

das unter Verwendung von /?-Phenoxyäthanol oder Phenoxyessigsäure als Precursor bei der Fermentation gebildet wird, bewährt, wobei die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung isolierte freie Säure einen Schmelzpunkt von 120 bis 128⁰ C hat. Ebenso kann man das mit Hilfe von p-Oxy-/?-Phenoxyäthanol oder p-Oxyphenoxyessigsäure als Precursor erhältliche p-Oxy-Phenoxymethylpenicillin in dieser Weise als kristallisierte Säure gewinnen.

Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung werden beispielsweise die unter Verwendung von Precursors bei der Fermentation erhaltenen Penicilline der oben bezeichneten Struktur aus den wässerigen Rohlösungen oder aus einer wässerigen Extraktionsstufe durch Ansäuerung mit Mineralsäuren auf ein pg unter 2, z. B. zwischen Pj₁ 1,5 und i,8, in unlöslicher kristallisierter Form abgeschieden und allenfalls durch Waschen mit Wasser gereinigt, wobei gleichzeitig begleitende Precursorsäuren und deren Salze abgetrennt werden. Eine solche Säurefällung würde, auf Penicillin G angewendet, zu einer völligen Zerstörung und Bildung von biologisch inaktiven Zersetzungsprodukten führen.

Bei Isolierung der freien Säuren der genannten Penicilline durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Säuren — eine Arbeitsweise, die auf Lösungen von Penicillin G gleichfalls nicht anwendbar ist — werden als Extraktionsmittel zweckmäßig solche organische Lösungsmittel gewählt, die die Precursorsäuren schwer, das Penicillin dagegen sehr leicht aufnehmen, so daß man das Penicillin nach Verdunsten des organischen Lösungsmittels und allfälligem Waschen mit Wasser in der Säureform in reinem Zustand erhält. Beispielsweise kann man, wenn als Precursor /S-Phenoxyäthanol, das während der aeroben Fermentation zu Phenoxyessigsäure oxydiert wird, oder Phenoxyessigsäure selbst verwendet wurde, mit Chloroform als Extraktionsmittel arbeiten, für welches Lösungsmittel größere Unterschiede in den Verteilungsverhältnissen von Phenoxyessigsäure und dem gebildeten Phenoxymethylpenicillin gegen die wässerige Phase bestehen. So besitzt z. B. die Phenoxyessigsäure bei p_H2,i und 24⁰ C einen Verteilungskoeffizienten von 0,48, sofern die Chloroform- und wässerige Phase im Verhältnis 1 :1 angewendet werden. (Beim Ver-

hältnis 6 Wasser: ι Chloroform erhöht sich dieser Koeffizient auf 2,3.) Das Phenoxymethylpenicillin dagegen hat entsprechend seiner Unlöslichkeit in Wasser bei p_H 2,1 und seiner großen Chloroforralöslichkeit einen so kleinen Koeffizienten, daß bei der Extraktion der wässerigen Phasen mit Chloroform das Phenoxymethylpenicillin in das Chloroform übergeht, während die Phenoxyessigsäure größtenteils in der wässerigen Phase verbleibt.

Führt man aber die Penicilline der genannten Art in Gegenwart von Säuren in organische Lösungsmittel über, welche die freien Begleitsäuren aufnehmen, was beispielsweise bei der Anwendung von Butanol zur Extraktion aus der wässerigen Phase der Fall ist, so werden zuerst durch azeotrope Destillation das Butanol-Wasser-Gemisch und dann die immer wasserärmer werdenden Butanolgemische (z. B. im Vakuum) abgetrieben, wobei die aktiven Penicilline als freie Säuren, jedoch mit den Precursorsäuren verunreinigt, übrigbleiben, da Precursorsäuren, wie z. B. Phenoxyessigsäure (pK = 3,25), ähnliche p_H-Werte aufweisen wie die Penicilline selbst (pK = 3,12 bei Phenoxymethylpenicillin). Die durch Ausfällung oder Verdunsten des Lösungsmittels erhaltenen Penicillinsäuren werden daher gewünschtenfalls durch wiederholtes Extrahieren oder Waschen mit Wasser od. dgl. von den begleitenden Precursorsäuren, die vom Wasser aufgenommen werden, während die Säuren der Penicilline praktisch ungelöst verbleiben, gereinigt. Man kann ferner die Penicilline der bezeichneten Art in an sich bekannter Weise als Alkalipenicilline aus den Rohlösungen gewinnen und die abgeschiedenen Alkalipenicilline, die durch die Alkalisalze der Precursorsäuren verunreinigt sind, in der Weise reinigen und in Form der freien Säuren gewinnen, daß man die Alkalisalze in Wasser löst und die Penicillinsäuren mit Säuren, wie Salzsäure, ausfällt, wobei die Precursorsäuren bei Anwendung entsprechender Wassermengen in Lösung bleiben.

Man kann ferner Salze der Penicilline aus der

Rohlösung über mehrere Extraktionsstufen in Chloroform überführen, durch Waschung mit Wasser begleitende Precursorsäuren entfernen und dann über eine wässerige Pufferlösung (p_H 7,2) in Gegenwart von Säuren bei etwa p_H 1,8 z. B. in Butylacetat oder Amylacetat überführen und die freien Säuren durch Verdunstung des Lösungsmittels gewinnen.

Weiter können die Rohlösungen und wässerigen Extraktionsstufen durch Zusatz von Erdalkalisalzen, z. B. Bariumsalzen, gereinigt werden, da die Bariumsalze der hier in Betracht kommenden Penicilline wasserlöslich, die der Precursorsäure dagegen in Wasser schwer- bis unlöslich sind (beispielsweise löst sich Bariumphenoxyacetat zu 1,4 g/ 100 cm³ Wasser bei 20⁰C). Anschließend können die Penicilline in organische Lösungsmittel, wie z. B. Butylacetat, übergeführt und aus dieser Lösung als Alkalisalze, z. B. mittels wasserfreier alkoholischer Kaliumacetatlösung als Kalisalze, ausgefällt werden; aus den wässerigen Lösungen der Kalisalze können dann mit Hilfe von Mineralsäuren, wie Salzsäure, die freien Säuren dieser Penicilline ausgefällt werden. Diese Methode ist auch ohne vorhergehende Ausfällung der Begleitsäuren mit Erdalkalisalzen allgemein für die Reinigung der Lösungen der Penicillinsalze oder freien Säuren der Penicilline in organischen Lösungsmitteln anwendbar.

Die als freie Säuren gewonnenen Penicilline können, wenn erwünscht, hernach auch in Alkalioder Erdalkalisalze übergeführt werden, beispielsweise durch Lösen in einer äquivalenten Menge Lauge und lyophile Trocknung oder Ausfällen der im organischen Lösungsmittel, z. B. Butylacetat, gelösten Penicilline durch Alkalisalze organischer Säuren, z. B. durch Kaliumacetat bei Gegenwart eines wasserfreien polaren Lösungsmittels, z. B. Äthanol. Die Alkalisalze lassen sich auch z. B. durch Aluminiumsalze in wässeriger Lösung zu Aluminium-Penicillinen umsetzen.

Beispiele

Für die Fermentation wurde eine Stammnährlösung folgender Zusammensetzung verwendet:

FeSO₄ ■ 7H₂O 0,01%

H₃PO₄ 0,4%

MnSO₄-H₂O 0,025% go

CaCl₂ ο,οΐ %

Laktose 3,0 %

Glukose 1,0 %

Gearbeitet wurde in einem 5-l-Lüftungskolben, der mit 2 1 Nährlösung beschickt wurde. Diese bestand aus der Stammnährlösung und den in den einzelnen Beispielen variierenden Stickstoffquellen sowie den verschiedenen Precursors. Die Luftmenge betrug etwa 1 1 Luft pro Minute und Liter Nährlösung.

Nährlösung 1

1700 cm³ Stammnährlösung

300 cm³ Preßhefeautolysat (mit 10 g N/l)

0,075 °/o /J-Phenoxyäthanol

Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 24⁰ C; erreichter Penicillingehalt: 2200 O.E/cm³, biologisch getestet (jodometrisch: 1466 O.E/cm³).

^_x

Nährlösung 2

1850 cm³ Stammnährlösung
150 cm³ Corn Steep Liquor (mit 40 g Stickstoff/l)

0,05% p-Oxy-/?-phenoxyäthanol _X1j

Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 24⁰ C; erreichter Penicillingehalt: 1660 O.E/cm³, biologisch getestet.

Nährlösung 3

1800 cm³ Stammnährlösung

200 cm³ Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l)

0,2% Phenoxyessigsäure

Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 24⁰ C; erreichter Penicillingehalt: 2150 O.E/cm³, biologisch getestet (jodometrisch: 1432 O.E/cm³).

Nährlösung 4

1750 cm³ Stammnährlösung 280 cm³ Preßhefeautolysat 0,08% /?-Phenoxyäthanol

Gärzeit: 6 Tage; Gärtemperatur: 24⁰ C; erreichter Penicillingehalt: 2800 0.E/cm³, biologisch getestet (jodometrisch: 1854 O.E/cm³).

Nährlösung 5

1720 cm³ Stammnährlösung 300 cm³ Bierhefeautolysat
0,076% /?-Phenoxyäthanol Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 24⁰ C; erreichter Penicillingehalt: 2500 O.E/cm³, biologisch getestet (jodometrisch: 1704 O.E/cm³).

Nährlösung 6

1800 cm³ Stammnährlösung 200 cm³ Bierhefeautolysat
0,2% Phenoxyessigsäure Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 24⁰ C; erreichter Penicillingehalt: 2150 O.E/cm³, biologisch getestet (jodometrisch: 1432 O.E/cm³).

Werden die gleichen Nährlösungen, aber unter Verwendung von Phenylessigsäure als Precursor unter denselben Fermentationsbedingungen verwendet, werden nur Penicillingehalte von 400 bis 500 O.E/cm³ erzielt.

Großversuche in normalen Fermentern führten zu ähnlichen Ergebnissen, wobei die Fermentationszeiten wesentlich kürzer und praktisch gleich denen bei der normalen Großpenicillinproduktion (3 bis 4 Tage) waren. Aus den unter Verwendung der obigen oder ähnlichen Nährlösungen mit Hilfe von Precursors vom Typ

bzw.

COOH-(R₁X)_n-R₂ CH₂OH-(R₁X)_n-R₂,

(wobei R₁, X, R₂ und η die eingangs definierte Bedeutung haben), wie z. B. Phenoxyessigsäure, Phenylmercaptoessigsäure (C₆ H₅ S C H₂ COO H), p-Oxyphenoxyessigsäure (OHC₆H₄OCH₂COOH), p-Nitrophenoxyessigsäure(NO₂C₆H₄OCH₂COOH) bzw. Phenoxyäthanol usw. nach der Fermentation erhaltenen Rohlösungen können erfindungsgemäß die freien Säuren wie folgt erhalten werden:

I. Fällung der freien Penicillinsäure aus wässeriger Lösung mit Mineralsäuren

600 cm³ wässeriger Penicillinphase mit 47 000 O.E/cm³ (jodometrischer Test) mit einem Säureverhältnis ι : 0,9 wurden auf p_H 1,5 angesäuert. Das ausgeschiedene freie Penicillin wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 15,24 g Phenoxymethylpenicillin zu 1673 O.E/mg bzw. 14,78 g p-Oxyphenoxymethylpenicillin zu 1600 O.E/mg (jodometrischer Test).

Eine Weiterverarbeitung zu den Penicillinsalzen

kann etwa wie folgt vorgenommen werden:

a) 7,62 g der erhaltenen Penicillinsäure mit 1673 O.E/mg wurden in 230 cm³ Butanol gelöst und das Penicillin durch Zugabe von 42 cm³ o,7molarer Kaliumacetatlösung gefällt.

Ausbeute: 8,08 g Kalium-Phenoxymethylpenicillin mit 1500 O.E/mg (jodometrischer Test).

b) 7,62 g Penicillinsäure mit 1673 O.E/mg wurden mit 2n-Kalilauge neutralisiert; durch Zugabe von 30 cm³ ιo°/oiger Al Cl₃-OH₂ O-Lösung wird das Aluminium-Phenoxymethylpenicillin abgeschieden.

Ausbeute: 6,95 g mit 1660 O.E/mg (jodometrischer Test).

II. Extraktion des Kulturfiltrates mit Chloroform, wodurch die Penicillinbegleiter in der wässerigen Phase verbleiben; anschließende Verdunstung des

Chloroforms

3 1 enteiweißtes und filtriertes Kulturfiltrat mit 1200 O.E/cm⁸ (jodometrischer Test) wurden durch Ansäuern auf Pjj2,i in 500 cm³ Chloroform übergeführt. Hieraus erfolgte die Extraktion mit Puffer, dann wieder mit Chloroform usf., wobei schließlich 50 cm³ Chloroformphase mit 63 400 O.E/ cm³ erhalten wurden. Die Säurezahl betrug 1,21, was einem Säureverhältnis von nur 1:0,15 entspricht. Aus dieser Chloroformphase wurde dann das Penicillin, das in Säureform vorlag, durch Abdunsten des Lösungsmittels gewonnen. Es wurden in dieser Weise 1,90 g Phenoxymethylpenicillin als Säure mit 1500 O.E/mg erhalten. Eine weitere Reinigung wurde durch Aufschlämmen in 100 cm³ Wasser und Absaugen des so gereinigten Penicillins bewirkt.

Ausbeute: 1,75 g Penicillinsäure mit 1690 O.E/ mg (jodometrischer Test).

III. Extraktion und weitgehende Reinigung des Phenoxymethylpenicillins durch Ausfällung der Phenoxyessigsäure als Bariumsalz

Das in 1450 1 enteiweißtem Kulturfiltrat enthaltene Penicillin (1053 O.E/cm³ jodometrischer Test) wurde im Gegenstromverfahren unter Reduktion des Volumens (erste Stufe 1 :4, zweite Stufe 1 :3, dritte Stufe 1:2) in Butylacetat bei p_H2,i, dann wieder in Pufferlösung bei p_H 7,2 und dann wieder in Butylacetat bei p_H 2,1 übergeführt. Man erhielt 60 1 Butylacetatphase mit 23 715 O.E/cm³ (jodo- xio metrischer Test), Säurezahl: 2,57, was einem Säureverhältnis von 1 :5,6 entspricht. Aus der Butylacetatphase wurde das Penicillin durch NaO H in die wässerige Phase übergeführt (p_H 7,2); Endvolumen 20 1. Diese wässerige Lösung wurde mit 1,7 kg BaCl₂—2H₂O versetzt, wobei Bariumphenoxyacetat ausfiel. Nach istündigem Stehen wurde der Niederschlag abgesaugt und mit 5 1 Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden mit 35 1 Butylacetat versetzt, mit Schwefelsäure auf pji 2 gebracht und so das Penicillin in das organische Lösungsmittel befördert. Die Butylacetatphase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Natriumsulfat mit etwas Butylacetat gewaschen. Säurezahl der Butylacetatphase 1,00; jodometrischer Test 37 700 O.E/cm³; Endvolumen

37 I- Das Säureverhältnis betrug also ι : 0,58. Die Reduktion des Säureverhältnisses von 1 :5,6 auf ι : 0,58 bedeutet eine so starke Entfernung der Phenoxyessigsäure, daß aus der Butylacetatphase das Penicillin unmittelbar mit Kaliumacetatlösung ausgefällt werden konnte. Man erhielt auf diese Weise 986 g Kalium-Penicillin mit 1310 O.E/mg. Dieses Produkt wurde zur weiteren Reinigung in 25 1 Wasser gelöst und durch Ansäuern auf p_H 1,5 die freie Säure abgeschieden.

Ausbeute :748 g Penicillinsäure mit 1685 O.E/mg.

Die durch das Verfahren gemäß der Erfindung

erstmalig als freie kristallisierte, sehr stabile Säuren von definierten Eigenschaften erhaltenen Penicilline der bezeichneten Art weisen eine annähernd theoretische Aktivität auf. Beispielsweise erwiesen sich das Phenoxymethylpenicillin und das p-Oxy-phenoxymethylpenicillin, die also in der Seitenkette Atome mit einsamen Elektronenpaaren bzw. eine aktivierte Methylengruppe aufweisen, in Form der freien Säuren im Vitro-Versuch biologisch aktiver als Penicillin G mit 1667 O.E/mg. Dies wird dadurch bestätigt, daß die biologisch ermittelten Aktivitäten meist wesentlich höher waren als die durch jodometrische Testung gefundenen Werte. So ist z. B. das Phenoxymethylpenicillin gegen Staphylokokkus aureus um etwa 50 °/o aktiver, als seine jodometrische Aktivität anzeigt.

Die Säurestabilität und überhaupt die erhöhte Stabilität unter verschiedenen Verhältnissen, wozu auch die lange praktisch unbegrenzte Haltbarkeit bei Zimmertemperatur in festem Zustand gehört, läßt die erfindungsgemäß erhaltenen freien Penicillinsäuren als für die Oraltherapie und Depot-Penicillintherapie besonders geeignet erscheinen. Sie sind ungiftig und weisen eine hohe antibakterielle Wirksamkeit auf. Während die normalen Penicilline im Magen zum größten Teil zerstört werden und nur durch Zugabe großer Puffermengen zu einer ohne merklichen Aktivitätsverlust verlaufenden Passage durch den Magen befähigt sind, gelangen die freien Penicillinsäuren ohne jeden Zusatz von Stabilisierungsmitteln mit praktisch unveränderter Aktivität durch den Magen in die resorbierenden Darmpartien. Zahlreiche Tier- und Humanversuche haben die Eignung dieser Penicilline insbesondere für die ovale Applikation erwiesen.

IV. Ausscheidung der freien Penicillinsäure ^⁰ aus einem Äther durch Kühlung

a) 5 g Roh-Kaliumsalz des Phenoxymethylpenicillins mit 1030 E/mg (jodometrischer Test) werden in 100 cm³ Wasser gelöst; die Lösung wird mit 100 cm³ Diisopropyläther versetzt und das Penicillin unter Ansäuerung der wäßrigen Lösung auf p_H 1,8 in Form der freien Säure in das organische Lösungsmittel (Diisopropyläther) übergeführt. Nach Abtrennung von der wässerigen Phase und Trocknung der Diisopropylätherlösung wird diese auf — io° C gekühlt, wobei sich nach mehrstündigem Stehen das Phenoxymethylpenicillin in Säureform abscheidet.

Ausbeute: 2,13 g Phenoxymethylpenicillinsäure mit 1685 E/mg (jodometrischer Test) =69,7%.

Die noch in der Diisopropylätherphase verbleibende restliche Penicillinsäure wird wieder in 100 cm³ Pufferlösung von p_H 7,2 übergeführt und daraus mit 2n-HCl gefällt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird gut mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 0,78 g Phenoxymethylpenicillinsäure mit 1680 E/mg=25,4%. Daraus ergeben sich als Gesamtausbeute 95,1% Phenoxymethylpenicillinsäure.

b) 300 cm³ wässerige Lösung von Phenylmercaptomethylpenicillin mit 20000 E/cm³ (jodometrischer Test) werden bei p_H 1,8, somit in der Form der freien Säure, mit 100 cm³ Isoamyläther extrahiert. Die ätherische Phase wird abgetrennt, getrocknet und die Lösung auf — 20⁰ C abgekühlt, wobei sich bald ein Niederschlag von reinem Phenylmercaptomethylpenicillin (als Säure) auszuscheiden beginnt. Nach I2stündigem Stehen wird der Niederschlag abgesaugt und getrocknet.

Ausbeute: 3,10 g Phenylmercaptomethylpenicillinsäure mit 1600 E/mg (theoretisch 1621 E/mg) = 82,7%.

V. Ausscheidung der freien Penicillinsäure

aus Butylacetat durch Zusatz eines apolaren

Lösungsmittels

50 cm³ Butylacetatphase aus einer Betriebsextraktionsstufe mit 91200 E/cm³ Phenoxymethylpenicillinsäure werden mit 250 cm³ Petroläther versetzt, wobei sich sehr rasch ein Niederschlag, bestehend aus Phenoxymethylpenicillinsäure und Penicillinbegleitsäuren ausscheidet. Nach 3stündigem Stehen wird dieser Niederschlag isoliert, getrocknet und dann zur Entfernung der Penicillinbegleitsäuren in 50 cm³ Wasser auf geschlämmt, wobei diese in Lösung gehen. Nach 2stündigem Stehen wird die ungelöste Penicillinsäure abfiltriert und getrocknet.

Ausbeute: 2,41 g Phenoxymethylpenicillinsäure mit 1660 E/mg=87,7 °/o.

VI. Es wird ein Kulturmedium hergestellt, welches aus 4 g p-Cresoxyessigsäure, 300 ecm Bierhefeautolysat mit einem Stickstoffgehalt von 20 g Stickstoff pro Liter und 2800 ecm einer Stammnährlösung der folgenden Zusammensetzung besteht :

FeSO₄-7 H₂O o,oi«/o

H₃PO₄ 0,40/0

MnSO₄- H₂O 0,0250/0

CaCl₂ 0,01%

Laktose 3,0 °/o

Glukose 1,0%

Die Flüssigkeit wird in einen 5-l-Kolben gebracht, angeimpft, und durch das Medium wird Luft in einer Menge von 2 l/Min, geleitet. Die Mischung wird bei 24⁰ C unter sterilen Bedingungen 7 Tage lang fermentiert. Dabei werden 3 1 KuI-turmedium erhalten, welches etwa 1500 E Penicillin

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pro ecm Lösung enthält (jodometrischer Test). Das Kulturmedium wird filtriert, auf einen p_H-Wert von 1,2 angesäuert und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird mit Aktivkohle entfärbt und mit einer Pufferlösung extrahiert. Die Pufferlösung wird angesäuert, auf pg 2,1 und mit 50 ecm Chloroform extrahiert, wobei eine Chloroformlösung erhalten wird, die 78 200 E Penicillin pro ecm Lösung enthält. Das Chloroform wird zur Trockne verdampft, wobei 2,24 g feste p-Cresoxymethylpenicillinsäure mit einer Aktivität von 1520 E je mg erhalten werden. Die Penicillinsäure wird zur Reinigung in der Weise weiterbehandelt, daß sie in einer so großen Menge o,i%iger wässeriger Natriumhydroxydlösung aufgenommen wird, daß eine neutrale Lösung entsteht. Diese Lösung wird unter Salzsäurezusatz auf einen p_H-Wert von 1,7 eingestellt, wodurch die freie Penicillinsäure ausgefällt wird. Die Penicillinsäure wird abfiltriert und mit ungefähr 10 ecm kaltem Wasser gewaschen. 1,91 g p-Cresoxymethylpenicillinsäure mit einer Aktivität von 1630 E in mg wurden erhalten. Smp. i2o° C.

Zur Herstellung der freien Säuren des p-Cresoxymethylpenicillins kann auch in folgender Weise vorgegangen werden:

Die Pufferlösung wird auf einen p_H-Wert von 2,1 angesäuert und mit 50 ecm Butylacetat extrahiert; dabei entsteht eine Butylacetatlösung der freien Säure des p-Cresoxymethylpenicillins, welche eine Aktivität von 78 200 E pro ecm Lösung aufweist. Aus dieser Butylacetatphase wird das p-Cresoxymethylpenicillin durch Zusatz von 18 ecm einer o,5molaren Lösung von Kaliumacetat in Butanol als Kaliumsalz gefällt. Die Ausbeute beträgt 2,60 g Kalium-p-cresoxymethylpenicillin mit einer Aktivität von 1345 E/mg. Das p-Cresoxymethylpenicillin wird weiter durch Aufnahme des Kaliumsalzes in 300 ecm destilliertem Wasser und An-Säuerung der so erhaltenen Lösung mit Sn-SaIzsäure auf einen p_H-Wert von ungefähr 1,5 gereinigt. Die ausgefällte, kristallisierte freie Säure des p-Cresoxymethylpeniciilins wird abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und im Vakum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 1,94 g p-Cresoxymethy!penicillin mit einer Aktivität von 1600 E/mg (jodometrischer Test).

Claims (5)

1. PATENTANSPRÜCHE:

   i. Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders für die Oraltherapie geeigneten Penicillinen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus den bei der Fermentation erhaltenen Rohlösungen oder aus bei der nachfolgenden Aufarbeitung der Rohlösungen erhaltenen wässerigen Lösungen, welche Penicilline der allgemeinen Formel

   3H₁₀O₃NS-NHCO-(R₁X)_n-R₂, worin R₁ einen zweiwertigen, gegebenenfalls substituierten aliphatischen Rest, X Sauerstoff, Schwefel oder eine NH-Gruppe, η eine ganze Zahl von 1 bis 5 und R₂ einen aliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, bedeutet, enthalten, diese Penicilline als freie Säuren abscheidet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus den Rohlösungen oder wässerigen Extraktionsstufen die Penicilline durch Ansäuerung auf tiefe, vorzugsweise unter 2 liegende p_H-Werte in fester Form als Säuren abscheidet, woran sich eine weitere Reinigung der abgeschiedenen Penicilline durch Waschen mit Wasser anschließen kann.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicilline aus den Rohlösungen oder wässerigen Extraktionsstufen in Gegenwart von Säuren in solche organische Lösungsmittel überführt, die wie Chloroform begleitendePrecursorsäuren schwer, die Penicilline als freie Säuren dagegen leicht aufnehmen, und die Penicilline durch Verdunstung des Lösungsmittels als freie Säuren gewinnt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach einer unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wie

   z. B. Butylacetat, und von wässerigen Pufferlösungen üblicherweise vorgenommenen Extraktion die begleitenden Precursorsäuren aus einer Extraktionsstufe, z. B. durch Fällung mit Erdakalisalzen anorganischer Mineralsäuren, vorzugsweise Bariumchlorid, entfernt, die Penicilline in Form ihrer Säuren in ein organisches Lösungsmittel, beispielsweise Butylacetat, überführt und aus dem organischen Lösungsmittel als Alkalisalze, z. B. mit akoholischer Kaliumacetatlösung, in wasserfreiem Zustand ausfällt und die in wässerige Lösung übergeführte Alkalisalze durch Mineralsäuren bei einem p_H-Wert unter 2 zerlegt, wobei die freien Säuren der Penicilline in gereinigter fester Form abgeschieden werden.
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Säureform erhaltenen Penicilline in an sich bekannter Weise in ihre Salze, insbesondere Alkalisalze, überführt.

   In Betracht gezogene Druckschriften: »The Chemistry of Penicillin«, 1949, S. 91

   und 672;

   französische Patentschrift Nr. 942 528; USA.-Patentschriften Nr. 2 493 625, 2 528 175; britische Patentschrift Nr. 630 462; J. am. ehem. Soc, 70 (1948), S. 2964/2965; Chemisches Zentralblatt, 1949, Bd. Ill, S. 1704;

   1951, Bd. II, S. 2224.

   & 909 545/45 6.59