DE69519675T2 - Eine grundlegende proteinzusammensetzung zur abtötung oder inhibierung mikrobieller zellen - Google Patents

Eine grundlegende proteinzusammensetzung zur abtötung oder inhibierung mikrobieller zellen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die zur Abtötung mikrobieller Zellen oder zur Hemmung wachsender mikrobieller Zellen imstande ist, d. h., eine bakterizide, bakteriostatische, fungizide und/oder fungistatische Zusammensetzung; eine Reinigungs- oder Detergenszusammensetzung, umfassend eine Substanz, die zur Abtötung mikrobieller Zellen oder zur Hemmung wachsender mikrobieller Zellen imstande ist; und Verfahren zur Abtötung mikrobieller Zellen, die auf einer harten Oberfläche, auf Haut oder in Wäsche vorliegen, und zur Konservierung von Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika etc.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In dieser Zeit von erhöhtem öffentlichen Interesse an der Verringerung des Einsatzes chemischer Additive ist es wichtig, natürliche Alternativen für antimikrobielle Agenzien, die beispielsweise zur Konservierung von Nahrungsmitteln, als Desinfektionsmittel und als antimikrobielle Komponente von Detergens- und Reinigungszusammensetzungen eingesetzt werden, in Betracht zu ziehen. Dies erhöhte das Interesse an einer Konservierung unter Einsatz von lebenden Bakterienkulturen (Jeppesen & Huss 1993) und Enzymen wie Lactoperoxidase (Farrag & Marth 1992), Glucoseoxidase (Jeong et al. 1992) und Lysozym (Johansen et al. 1994).
  • Protamine sind basische Proteine mit einem hohen Arginingehalt, die mit DNA aus den Spermatozoen-Nuklei von Fischen, Vögeln, Säugern etc. assoziiert gefunden werden (Rodman et al. 1984; Kossel 1928). Protamin wird klinisch eingesetzt als Gegenmittel zu Heparin (Jaques 1973) und als Träger von Insulin, welcher die Absorption von subkutan verabreichtem Insulin verlängert (Brange 1987). Aufmerksamkeit wurde auch den funktionellen Eigenschaften von Protamin als Stabilisierungsmittel geschenkt (Phillips et al. 1989). Es wurde gezeigt, daß Protamin eine antibakterielle Wirkung aufweist (Hitsch 1958), dieser Aspekt wurde jedoch nicht eingehend untersucht.
  • Synergistische Kombinationen von Protaminen mit Polylysin oder Lysozym sind aus JP-A-63109762, JP-A-2002329 und JP-A-5276910 bekannt.
  • Die Gram-negativen Bakterien sind aufgrund der wirksamen Funktion der äußeren Membran als Permeabilitätsbarriere oft gegenüber einer großen Anzahl schädlicher Agenzien resistent (Nakae 1985). Jedoch sind Protamin und die meisten anderen kationischen Peptide unter bestimmten Bedingungen anscheinend in der Lage, die äußere Membran von Gram-negativen Bakterien zu passieren (Vaara 1992, Vaara & Vaara 1983), vermutlich als Folge ihrer Bindung an die mit anionischem Lipopolysaccharid bedeckte Oberfläche der Gram-negativen Zelle. Der Mechanismus der antibakteriellen Wirkung von basischen Peptiden ist nicht bekannt, es wurde jedoch postuliert, daß sie einen Kanal in der zytoplasmischen Membran bilden und dadurch den Elektronentransport entkoppeln und Leckverluste verursachen (Christensen et al. 1988; Hugo 1978; Kagan et al. 1990). Es wurde auch postuliert, daß sie aufgrund von Aktivierung der autolytischen Enzyme eine Autolyse induzieren (Bierbaum & Sahl 1991).
  • Im allgemeinen ist das Auftreten von hochbasischen Peptiden wie Protamin in der Natur relativ selten. Jedoch wurden von denjenigen, die untersucht wurden, mehrere befunden, antibakterielle Eigenschaften zu zeigen: z. B. Nisin (Sahl 1987), Defensin (Lehrer et al. 1993), Cecropine (Christensen et al. 1988), Pep5 (Bierbaum & Sahl 1987) und Melittine (Vaara 1992).
  • Die antibakterielle Aktivität wird gewöhnlich als Abnahme von Kolonienzahlen, als Abnahme der Extinktion einer bakteriellen Suspension oder als Hemmzonen auf Agarplatten (Trevors 1986) gemessen. Wenn die antibakterielle Wirkung eines basischen Peptids oder Proteins wie Protamin untersucht wird, könnten diese Verfahren jedoch aufgrund der Agglutination des positiv geladenen Protamins und der negativ geladenen Bakterienzellen, wie von Islam et al. (1984) beschrieben, ungeeignet sein.
  • Somit war es die Aufgabe der Erfindung, eine antibakterielle und/oder antimykotische Zusammensetzung, umfassend eine natürliche aktive Verbindung oder Substanz, d. h., eine, welche nicht-toxisch, biologischen Ursprungs, leicht verfügbar und relativ preiswert ist, gegebenenfalls in Kombination mit anderen antimikrobiellen Verbindungen oder Substanzen, bereitzustellen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wurde nun überraschend festgestellt, daß es möglich ist, mit Hilfe eines basischen Proteins oder Peptids biologischen Ursprungs, z. B. Protamin oder Protaminsulfat, mikrobielle Zellen abzutöten oder wachsende mikrobielle Zellen zu hemmen. Für bestimmte Bakterien oder Pilze kann es erforderlich sein, das basische Protein mit einem zellwandabbauenden Enzym oder einer Oxidoreduktase zu kombinieren, um die gewünschte antimikrobielle Wirkung zu erzielen.
  • Dementsprechend wurde die wachstumshemmende Wirkung von Protamin und die potentielle tödliche Wirkung dieses basischen Proteins auf nicht-wachsende Zellen untersucht. Aufgrund der oben beschriebenen methodischen Unzulänglichkeiten wurden Impedanz-Messungen angewandt und mit traditionellen Plattenzählungen verglichen (Firstenberg-Eden & Eden 1984; Conolly et al. 1993).
  • So stellt die vorliegende Erfindung auf Basis dieser Befunde eine bakterizide, bakteriostatische, fungizide und/oder fungistatische Zusammensetzung bereit, die ein basisches Protein oder Peptid, welches zur Abtötung mikrobieller Zellen imstande ist, in Kombination mit einem zellwandabbauenden Enzym oder einer Oxidoreduktase umfaßt.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Detergens- oder Reinigungszusammensetzung bereit, die ein basisches Protein oder Peptid, welches zur Abtötung mikrobieller Zellen imstande ist, und ein Tensid umfaßt. Solche Zusammensetzungen besitzen einen pH-Wert im alkalischen Bereich und es wurde festgestellt, daß basische Proteine wie Protamin und Protaminsulfat ihre optimale antimikrobielle Wirkung bei alkalischem pH-Wert aufweisen, was solche Proteine somit sehr geeignet zur Inkorporation in Zusammensetzungen für Reinigungszwecke macht.
  • Die Zusammensetzung der Erfindung eignet sich als antimikrobielle Komponente, wo immer eine solche Komponente benötigt wird, beispielsweise für die Konservierung von Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Kontaktlinsen-Produkten. Nahrungsmittelkomponenten oder Enzymzusammensetzungen; als Desinfektionsmittel zur Anwendung bei z. B. menschlicher oder tierischer Haut, Schleimhäuten, Wunden. Quetschungen oder im Auge; zur Abtötung mikrobieller Zellen in Wäsche; und zur Inkorporation in Reinigungszusammensetzungen für die Reinigung harter Oberflächen.
    • ZEICHNUNGEN
  • Die Erfindung wird weiter illustriert durch die Zeichnungen, in denen Fig. 1 die Wirkung von Protamin auf das Wachstum von Yersinia enterocolitica. bei 25ºC in TSB wachsend, zeigt. Das Wachstum wird als prozentuale Veränderung der Leitfähigkeit gemessen;
  • Fig. 2 Eichkurven zeigt, welche die Nachweiszeiten von Leitfähigkeit Δ (Shewanella putrefaciens Stamm A2) oder kapazitiver Impedanz (Listeria monocytogenes Stamm 032) in TSB bei 25ºC in Abwesenheit von Protamin zu Kolonienzählungen in Beziehung setzen;
  • Fig. 3 die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Protamin auf das Gram- negative Bakterium Pseudomonas aeruginosa in Abhängigkeit vom pH-Wert zeigt;
  • Fig. 4 die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Protamin auf das Gram- positive Bakterium Listeria monocytogenes in Abhängigkeit von der Zellkonzentration zeigt (Impfgut, log CFU/ml);
  • Fig. 5 die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Protamin auf das Gram-negative Bakterium Shewanella putrefaciens in Abhängigkeit von der Zellkonzentration zeigt (Impfgut, log CFU/ml);
  • Fig. 6 ein Reaktionsoberflächendiagramm ist, welches die synergistische Wirkung einer Zusammensetzung der Erfindung (verschiedene Konzentrationen von Protamin und Lysozym) auf das Gram-negative Bakterium Shewanella putrefaciens in Abhängigkeit von der Zellkonzentration zeigt (Impfgut, log CFU/ml).
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Im vorliegenden Kontext ist der Begriff "bakterizid" als "zur Abtötung von Bakterienzellen imstande" zu verstehen.
  • Im vorliegenden Kontext ist der Begriff "bakteriostatisch" als "zur Hemmung von Bakterienwachstum imstande", d. h., zur Hemmung wachsender Bakterienzellen imstande, zu verstehen.
  • Im vorliegenden Kontext ist der Begriff "fungizid" als "zur Abtötung von Pilzzellen imstande" zu verstehen.
  • Im vorliegenden Kontext ist der Begriff "fungistatisch" als "zur Hemmung von Pilzwachstum imstande". d. h., zur Hemmung wachsender Pilzzellen imstande, zu verstehen.
  • Der Begriff "wachsende Zelle" ist zu verstehen als eine Zelle, die Zugang zu einem geeigneten Nährmittel hat und somit zur Reproduktion/Propagation in der Lage ist. Mit dem Begriff "nicht-wachsende Zelle" ist eine lebende, jedoch ruhende Zelle gemeint, d. h., eine Zelle im nicht-wachsenden, nicht-teilenden, nicht- vermehrenden und nicht-aktiven Zustand mit minimalen Stoffwechselprozessen.
  • Der Begriff "zellwandabbauendes Enzym" ist als ein Enzym zu verstehen, welches Komponenten der Zellwand, z. B. Peptidoglucane wie Murein und Pseudomurein, Chitin und Teichonsäure, abbaut. Beispiele von zellwandabbauenden Enzymen, welche sich für Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eignen, sind Endoglycosidasen vom Typ II, z. B. die in EP-A2-0 425 018 offenbarten Endoglycosidasen vom Typ II, Lysozyme und Chitinasen.
  • Der Begriff "Aminosäuren, die in Säugerzellen vorliegen" bezeichnet die 20 Aminosäuren, aus denen die Proteine aufgebaut sind, die Bestandteile von Säugern sind, d. h., Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin. Vorzugsweise bestehen die basischen Peptide oder Proteine der Zusammensetzung der Erfindung aus einer oder mehreren der genannten 20 Aminosäuren, d. h., die basischen Peptide oder Proteine könnten nicht aus beispielsweise Bakterien gewonnen werden, wie z. B. Nisin und Pep5.
  • Der Begriff "Oxidoreduktase" bedeutet ein Enzym, welches gemäß der Enzym- Nomenklatur (1992) als EC 1. klassifiziert ist, d. h. ein beliebiges Enzym, welches als EC 1.1 (Wirkung auf die CH-OH-Gruppe von Donoren), EC 1.2 (Wirkung auf die Aldehyd- oder Oxogruppe von Donoren), EC 1.3 (Wirkung auf die CH-CH- Gruppe von Donoren), EC 1.4 (Wirkung auf die CH-NH&sub2;-Gruppe von Donoren), EC 1.5 (Wirkung auf die CH-NH-Gruppe von Donoren), EC 1.6 (Wirkung auf NADH oder NADPH), EC 1.7 (Wirkung auf andere stickstoffhaltige Verbindungen als Donoren), EC 1.8 (Wirkung auf eine Schwefelgruppe von Donoren), EC 1.9 (Wirkung auf eine Häm-Gruppe von Donoren), EC 1.10 (Wirkung auf Diphenole und verwandte Substanzen als Donoren), EC 1.11 (Wirkung auf ein Peroxid als Akzeptor), EC 1.12 (Wirkung auf Wasserstoff als Donor), EC 1.13 (Wirkung auf einzelne Donoren unter Inkorporation von molekularem Sauerstoff (Oxygenasen), EC 1.14 (Wirkung auf gepaarte Donoren unter Inkorporation von molekularem Sauerstoff), EC 1.15 (Wirkung auf Peroxid-Radikale als Akzeptor), EC 1.16 (Oxidation von Metallionen), EC 1.17 (Wirkung auf -CH&sub2;- -Gruppen), EC 1.18 (Wirkung auf reduziertes Ferredoxin als Donor), EC 1.19 (Wirkung auf reduziertes Flavodoxin als Donor) und EC 1.97 (andere Oxidoreduktasen) klassifiziert ist.
  • Der Begriff "Peroxidase-Enzymsystem" ist zu verstehen als eine Peroxidase (EC 1.11.1) in Kombination mit einer Quelle von Wasserstoffperoxid, welche Wasserstoffperoxid oder ein Wasserstoffperoxidvorläufer zur in situ-Produktion von Wasserstoffperoxid, z. B. Percarbonat oder Perborat, sein kann oder ein Wasserstoffperoxid erzeugendes Enzymsystem, z. B. eine Oxidase und ein Substrat für die Oxidase oder eine Aminosäureoxidase und eine geeignete Aminosäure, oder eine Peroxycarbonsäure oder ein Salz davon.
  • Beispiele geeigneter Peroxidasen sind Lactoperoxidase, Meerrettichperoxidase, Peroxidasen, die durch Kultivierung eines Peroxidase-produzierenden Stammes Myxococcus virescens, DSM 8593, Myxococcus fulvus, DSM 8969, oder Myxococcus xanthus, DSM 8970, eines Peroxidase-produzierenden Stammes der Gattung Corallococcus, der vorzugsweise Corallococcus coralloides, DSM 8967, oder Corallococcus exiguus, DSM 8969, angehört, hergestellt werden können.
  • Im Falle von Lactoperoxidase kann Thiocyanat als Substrat eingesetzt werden.
  • Laccasen sind Enzyme, welche die Oxidation eines Substrats mit Sauerstoff katalysieren; sie sind mit mikrobiellem, pflanzlichem und tierischem Ursprung bekannt. Konkreter sind Laccasen (EC 1.10.3.2) Oxidoreduktasen, welche mit molekularem Sauerstoff als Elektronenakzeptor funktionieren. Molekularer Sauerstoff aus der Atmosphäre wird gewöhnlich in ausreichender Menge vorhanden sein, so daß es normalerweise nicht erforderlich ist, dem Prozeßmedium zusätzlichen Sauerstoff zuzusetzen. Beispiele eines Laccase-Enzyms, das sich für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eignet, ist Laccase, die aus dem Stamm Coprinus cinereus, IFO30116, erhältlich ist, oder eine Laccase mit immunchemischen Eigenschaften, die mit denjenigen einer Laccase, die aus Coprinus cinereus, IFO30116, erhalten wurde, identisch sind; oder die aus einem Stamm von Myceliophthora thermophile, wie in WO 91/05839 offenbart, erhältlich ist.
  • Der Begriff "mikrobielle Zellen" bezeichnet Bakterien- oder Pilzzellen.
  • Der Begriff "biologischen Ursprungs" ist so zu verstehen, daß die Substanz oder Verbindungen aus biologischem Material, wie z. B. Menschen, Tiere oder Pflanzen, gewonnen oder regeneriert wird/werden. Gleichermaßen gibt der Begriff "mikrobiologischen Ursprungs" an, daß die Substanz oder Verbindungen aus mikrobiologischem Material, wie z. B. Bakterien, Pilze, Hefe, gewonnen oder regeneriert wird/werden oder daß eine Ausgangssubstanz oder -verbindung oder native Substanz oder Verbindung von einem mikrobiologischen Organismus herstellbar ist.
  • Der Begriff "biologisches Material" bezeichnet lebendes Material, das aus der Natur erhältlich ist, oder ehemals lebendes Material, das aus der Natur erhältlich ist.
  • Der Begriff "synthetisiertes Polypeptid" bezeichnet eine synthetisierte Anordnung, d. h. eine Kette, die aus Peptid-Monomeren aufgebaut ist. Polypeptide, die sich für die vorliegenden Zusammensetzungen eignen, sind basische Polypeptide, d. h., Polylysine und Polyarginine und Copolymere davon. Es ist bevorzugt, daß die Polypeptide eine Kettenlänge von weniger als etwa 100 Aminosäuren aufweisen, es wird jedoch in Betracht bezogen, daß Polypeptide von weniger als etwa 1000 kD geeignet sind. Vorzugsweise weisen die in der Zusammensetzung der Erfindung einzusetzenden Polypeptide ein(e) fast identische(s) Kettenlänge oder Molekulargewicht auf, jedoch sind Mischungen von Polypeptiden mit unterschiedlichen Kettenlängen oder Molekulargewichten ebenfalls geeignet.
  • Es wird in Betracht gezogen, daß das basische Protein der Zusammensetzung der Erfindung ein rekombinantes Protein sein kann. Im Falle von Protamin wird in Betracht gezogen, daß das Protamin ein rekombinantes Protamin sein kann, d. h., durch Klonierung einer DNA-Sequenz, die für das Protein kodiert, und anschließende Transformation einer Zelle mit der DNA-Sequenz und Expression in einem Wirt, d. h., eine geeignete Pilz- oder Bakterienzelle, produziert wurde. Ein rekombinantes Protamin/Protaminsulfat kann nach Standardtechniken, die dem Fachmann vertraut sind, kloniert und exprimiert werden.
  • Bevorzugte basische Proteine zur Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind Protamine, Protaminsulfate, Defensine, Magainine, Melittin, Cecropine und Protegrine; bevorzugter Protamine und Protaminsulfate.
  • Bisher ist bekannt gewesen, daß Protamin aus Lachs eine bakterizide Wirkung auf wachsende Gram-positive Bakterien ausübt (1000 ug/ml). Islam et al. (1984) fanden heraus, daß es das Wachstum hemmte, stellten jedoch nicht fest, ob die Wirkung bakterizid oder bakteriostatisch war. Andere Studien berichteten, daß Protamin gegen Gram-negative Bakterien nicht wirksam ist (Islam et al. 1984; Yanagimoto et al. 1992). Im Gegensatz zu dieser Beobachtung wurde nun festgestellt, daß Protamin gegen Gram-positive Bakterien, Gram-negative Bakterien und Pilze wirksam ist. Dasselbe trifft für Protaminsulfat zu.
  • Es wurde postuliert, daß die primäre antibakterielle Wirkung vieler der basischen Peptide in ihrem Vermögen zur Durchdringung der zytoplasmatischen Membran, Unterbrechung des Elektronentransports und Induktion eines Austritts intrazellulärer Verbindungen liegt. Ohne sich auf diese Theorie festlegen zu wollen, könnte dieser Mechanismus die Wirkung von Protamin auf einige der Stämme, die in den in den folgenden Beispielen beschriebenen Experimenten getestet wurden, teilweise erklären.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Reinigungs- oder Detergenszusammensetzung, umfassend ein basisches Protein oder Peptid, das zur Abtötung mikrobieller Zellen imstande ist, und ein Tensid.
  • Die Detergens- oder Reinigungszusammensetzung kann ferner weitere Enzyme umfassen, die herkömmlicherweise in Detergens- oder Reinigungszusammensetzungen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfaßt die Detergens- oder Reinigungszusammensetzung der Erfindung mindestens ein Enzym, das aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Amylasen, Cellulasen und Lipasen, ausgewählt ist.
  • Das Tensid der Detergens- oder Reinigungszusammensetzung ist vorzugsweise ein Detergens-Tensid, bevorzugter ein Detergens-Tensid, das aus der Gruppe, bestehend aus anionischen, nichtionischen, ampholytischen, zwitterionischen und kationischen Tensiden, ausgewählt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Detergens- oder Reinigungszusammensetzung als basisches Protein ein Protamin oder ein Protaminsulfat in einer zur Abtötung von Zellen oder zur Hemmung des Wachstums von Zellen wirksamen Menge, vorzugsweise in einer Menge, die 1 bis 4000 ug pro ml Reinigungslauge oder Waschlauge, bevorzugter 1 bis 2000 ug pro ml Reinigungslauge oder Waschlauge, insbesondere 5 bis 1000 ug pro ml Reinigungslauge oder Waschlauge, entspricht.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung für verschiedene Zwecke, d. h., die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Abtötung mikrobieller Zellen, die auf einer harten Oberfläche vorliegen, welches Verfahren das Kontaktieren der Oberfläche mit einer Reinigungszusammensetzung der Erfindung, vorzugsweise einer Zusammensetzung, die ein Protamin oder Protaminsulfat umfaßt, in einer zur Abtötung der Zellen wirksamen Menge umfaßt.
  • In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Abtötung mikrobieller Zellen oder zur Hemmung wachsender mikrobieller Zellen, die auf Wäsche vorliegen, welches Verfahren das Kontaktieren der Wäsche mit einer Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise einer Zusammensetzung, die ein Protamin oder Protaminsulfat umfaßt, in einer zur Abtötung der Zellen oder zur Hemmung wachsender Zellen wirksamen Menge umfaßt.
  • In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Konservierung von Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, z. B. Lotionen, Cremes, Gele, Seifen, Shampoos, Conditioner, Transpirationshemmer, Kontaktlinsen- Produkten, Nahrungsmittelkomponenten oder Enzymzusammensetzungen, welches Verfahren die Inkorporation eines basischen Proteins oder basischen Peptids oder einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer zur Hemmung wachsender mikrobieller Zellen wirksamen Menge, vorzugsweise eines Protamins oder eines Protaminsulfats oder einer Zusammensetzung, die ein Protamin oder ein Protaminsulfat umfaßt, in die nicht-konservierten Nahrungsmittel, Getränke. Kosmetika, Kontaktlinsen-Produkte, Nahrungsmittelkomponenten oder Enzymzusammensetzungen umfaßt.
  • In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Abtötung mikrobieller Zellen, die auf menschlicher oder tierischer Haut, Schleimhäuten, Wunden, Quetschungen oder im Auge vorliegen, welches Verfahren das Kontaktieren der abzutötenden Zellen mit einem basischen Protein oder Peptid in einer zur Abtötung der Zellen wirksamen Menge, vorzugsweise mit einem Protamin oder Protaminsulfat, umfaßt. So können die Zusammensetzungen der Erfindung und/oder die basischen Peptide oder Proteine, die in diesen Zusammensetzungen eingesetzt werden, insbesondere Protamine und Protaminsulfate, als Desinfektionsmittel, z. B. bei der Behandlung von Akne, Infektionen im Auge, Hautinfektionen, für Transpirationshemmer, zur Reinigung und Desinfektion von Kontaktlinsen etc. geeignet sein.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele erläutert.
    • BEISPIEL 1 Bakterizide und bakteriostatische Wirkung von Protamin Materialien und Methoden BAKTERIEN, IMPFGUT, MEDIEN UND REAGENZIEN
  • Die bei der Untersuchung eingesetzten Bakterien sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Stammkulturen wurden in Trypton-Soja-Bouillon (TSB) (Oxoid CM129) mit 0,5% Glucose, 2% Magermilchpulver, 4% Glycerin aufrechterhalten und bei -80ºC gelagert.
  • Zellen aus der Stammkultur wurden auf TSB-Platten (TSB mit 1,2% Agar) ausgestrichen und 48 h bei 25ºC inkubiert. Eine Bakterienkolonie wurde in 5 ml TSB überimpft und 24-36 h bei 250 C gezüchtet. Diese Kultur wurde als Impfgut eingesetzt.
  • TSB mit 1, 2% Agar wurde für Plattenzählungen eingesetzt, welche mittels Oberflächenbeimpfung und Inkubation der Platten bei 25ºC durchgeführt wurden. Zehnfache Verdünnungsgrade wurden unter Verwendung von steriler Pepton- Salz-Lösung (0,1% Pepton, 0,85% NaCl) hergestellt.
  • Protamin aus Lachs (P-4005) wurde von Sigma Chemical Company (St. Louis, USA) erhalten, in destilliertem Wasser gelöst, filtersterilisiert (0,2 um) und sofort nach der Herstellung verwendet. Tabelle 1 Bakterienstämme, die hinsichtlich Sensitivität gegenüber Protamin getestet wurden
  • Die Stämme wurden erhalten von:
  • (a) Fish Pathology Laboratory, Royal Veterinary and Agricultural University, Dänemark.
  • (b) Dept. for Veterinary Microbiology and Hygiene, Royal Veterinary and Agricultural University, Dänemark.
  • (c) Environmental and Food Laboratory, Skovlunde, Dänemark.
  • (d) Department of Biotechnology, Technical University of Denmark.
  • (e) Campden Food and Drink Association, Chipping Campden, Vereinigtes Königreich.
  • (f) Department of Clinical Microbiology, Statens Seruminstitut, Dänemark.
  • (g) Knochel, 1989.
  • (h) Gram et al.. 1990.
  • (j) Jorgensen, 1986.
  • (k) Jorgensen und Huss, 1989.
  • (m) Ben Embarek und Huss, 1993.
  • (n) Chung, Steen und Hansen, 1994.
    • IMPEDANZ-BESTIMMUNGEN
  • Volumina (1,0 ml) von TSB-Medium wurden Bactometer®-Mulden zugegeben. Protaminlösungen (0,1 ml) wurden in die Mulden überführt, welche versiegelt, mit dem Bactometer B 123-2 (bioMérieux UK Ltd., Ver. Kgr.) verbunden und bei 25ºC inkubiert wurden, bis eine signifikante nachweisbare Erhöhung der elektrischen Leitfähigkeit des Mediums registriert wurde, und die Nachweiszeit (NZ) wurde aufgezeichnet (maximal 100 h). Der Nachweis tritt gewöhnlich ein, wenn die Zellkonzentration 10&sup6;-10&sup7; CFU/ml erreicht. Für die Gram-positiven Stämme wurde das Signal der kapazitiven Impedanz überwacht, während für Gram- negative Stämme von der Änderung der Leitfähigkeit Gebrauch gemacht wurde.
    • WIRKUNG VON PROTAMIN AUF WACHSENDE ZELLEN
  • Die antibakterielle Aktivität von Protamin gegenüber wachsenden Zellen wurde in den Bactometer-Modulen gemessen. Die Mulden (enthaltend 1 ml TSB und 0,1 ml Protaminlösung) wurden mit 0,1 ml einer 104-Verdünnung einer Impfkultur angeimpft, was eine Zellendkonzentration in der Mulde von etwa 10³ CFU/ml ergab. Die Konzentration an Protamin variierte von 1 bis 4000 ug/ml je nach der Sensitivität des untersuchten Stammes.
  • Die minimale Hemmkonzentration (MHK) wurde bestimmt als die geringste Konzentration an Protamin, welche die Abwesenheit einer NZ bewirkte.
  • Wenn keine NZ gemessen wurde, wurde die letale/hemmende Wirkung auf die Zellen durch Ausplattierung des gesamten Muldenvolumens getestet.
    • WIRKUNG VON PROTAMIN AUF NICHT-WACHSENDE ZELLEN
  • 1 ml Impfgut, auf 10&supmin;³ verdünnt, wurde in 250 ml TSB überimpft (etwa 10³ CFU/ml) und bei 25ºC 24 h lang inkubiert. Zellen wurden durch Zentrifugation (2000 · g für 10 Minuten) geerntet, zweimal mit 0,067 M sterilem Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (Weisner 1984) gewaschen und im gleichen Puffer resuspendiert. Die Extinktion bei 450 nm (OD&sub4;&sub5;&sub0;) der Bakteriensuspension wurde auf 1,0 (etwa 10&sup8; CFU/ml) eingestellt, gemessen mit einem Perkin Eimer Lambda 2 Spektralphotometer (Überlingen, Deutschland). Die Zellsuspension wurde in sterilem Phosphatpuffer auf Konzentrationen von 10&sup5; und 10³ CFU/ml verdünnt. Protamin wurde den Zeilsuspensionen (10³, 10&sup5; und 10&sup8; CFU/ml) in Konzentrationen von 0, 50, 100 und 500 ug/ml zugegeben und die Suspensionen wurden 24 h lang bei 25ºC inkubiert.
    • EICHKURVEN
  • Eine Reihe von 10fachen Verdünnungsgraden wurde aus der 10&sup8; CFU/ml- Suspension ohne zugesetztes Protamin hergestellt. Eine Eichkurve, die CFU/ml der 10fach-Verdünnungen zu den Nachweiszeiten (NZ) der kapazitiven Impedanz oder Leitfähigkeit in TSB in Beziehung setzt, wurde für jeden Stamm unter Verwendung eines Minimums von 8 Verdünnungsschritten erstellt.
  • Aus den protaminbehandelten Suspensionen wurde 0,1 ml in TSB in Bactometer- Mulden überimpft und die NZ bestimmt. Diese NZ wurde mit Hilfe der Eichkurve in eine Kolonienzählung umgerechnet. Somit wurden Kolonienzählungen nicht direkt mit den protaminbehandelten Suspensionen durchgeführt, da Protamin eine signifikante Verklumpung der Bakterienzellen verursachte.
  • Wenn keine NZ gemessen wurde, wurde das gesamte Muldenvolumen auf Agarplatten pipettiert, um festzustellen, ob Protamin eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung hatte.
    • Ergebnisse
  • Die anhand der NZ für kapazitive Impedanz oder Leitfähigkeit von in TSB wachsenden Zellen bestimmten MHK-Werte sind in Tabelle 2 angegeben.
    • Tabelle 2: Minimale Hemmkonzentration (MHK), impedimetrisch als Gesamtinhibierung nach 100 h bei 25ºC gemesssen
  • Stamm MHK (ug/ml)
  • Aeromonas sobria > 4000
  • Aeromonas salmonicidae 4000
  • Escherichia coli 0157: H7 1000
  • Pseudomonas aeruginosa 4000
  • Pseudomonas fluorescens 3000
  • Shewanella putrefaciens (4 Stämme) 500-1000
  • Vibrio anguillarum 1000
  • Vibrio paraheamolytleus 500-1000
  • Yersinia enterocolitica > 4000
  • Bacillus subtilis 100
  • Brochotrix thermosphacta 20
  • Corynebacterium jeikeium 100
  • Listeria monocytogenes (2 Stämme) 1000
  • Staphylococcus aureus (2 Stämme) 500-1000
  • Die Gram-positiven Stämme waren gegenüber Protamin sensitiver als die Gram- negativen Stämme. Die für Gram-positive Stämme bestimmten MHK-Werte variierten von 20 bis 1000 ug/ml und für die Gram-negativen Stämme variierten sie von 500 ug/ml bis mehr als 4000 ug/ml.
  • Brochotrix thermosphacta war der sensitivste Stamm und eine Protaminkonzentration von 20 ug/ml TSB verursachte eine vollständige Abtötung des Impfguts (10³ CFU/ml), gemessen durch Ausplattierung des Muldenvolumens nach 100 h Inkubation in dem Bactometer. Eine Protaminkonzentration von 1000 ug/ml resultierte in einer zu 100% tödlichen Wirkung auf die beiden Stämme von Listeria monocytogenes und Staphylococcus aureus (10³ CFU/ml). Der MHK- Wert für Protamin auf S. aureus betrug 500 ug/ml, diese Konzentration hatte jedoch keine tödliche Wirkung.
  • Die NZ für Aeromonas sobria und Yersinia enterocolitica nahmen mit zunehmender Protaminkonzentration zu, was eine verlängerte Anlaufphase nahelegte. Die Kulturen wurden jedoch nicht vollständig gehemmt und kein MHK-Wert bestimmt. Die NZ für eine Suspension von A. sobria mit 10³ CFU/ml betrug 33 h bei einer Inkubation mit 4000 ug/ml, im Vergleich zu 12 h, wenn kein Protamin zugesetzt wurde. Für Y. enterocolitica wurde die Nachweiszeit von 10³ CFU/ml von 21 h auf 60 h verlängert, wenn 4000 ug/ml Protamin zugesetzt wurden (siehe Fig. 1). Aeromonas salmonicidae und Pseudomonas fluorescens wurden durch Protamin in Konzentrationen von 4000 bzw. 3000 ug/ml TSB gehemmt. So war keine Änderung der Leitfähigkeit nach 100 h Inkubation zu beobachten, jedoch wurden lebende Zellen aus der Mulde isoliert. Shewanella putrefaciens (A2), (A11) und (A22) und Vibrio anguillarum wurden durch Protamin in der Konzentration von 1000 ug/ml TSB gehemmt und Vibrio paraheamolytleus und S. putrefaciens (A6) wurden durch 500 ug/ml TSB gehemmt. S. putrefaciens war das einzige Gram-negative Bakterium, welches durch Protamin abgetötet wurde, so töteten 2000 ug/ml Protamin 100% des Impfguts (103 CFU/ml) aller vier getesteten Stämme ab.
  • Die bakterizide Wirkung von Protamin auf nicht-wachsende Zellen wurde bei vier Stämmen von S. putrefaciens und zwei Stämmen von L. monocytogenes getestet. Nach der Protaminbehandlung wurden Nachweiszeiten gemessen und mit Hilfe der für den speziellen Stamm erstellten Eichkurve (Fig. 2) in eine Zellzählung umgerechnet. Die Sensitivität von S. putrefaciens variierte von Stamm zu Stamm, siehe Tabelle 3 unten (siehe auch Tabelle 1 hinsichtlich Code und Referenz für jeden Stamm). Stamm A2 und A11 waren in der Sensitivität ähnlich und resistenter als A6 und A22. So töteten 100 ug Protamin/ml die S. putrefaciens- Stämme A6 und A22 bei Suspension in niedrigen Zellkonzentrationen (10&sup5; und 10³ CFU/ml). Dasselbe Niveau war bei den S. putrefaciens-Stämmen A2 und A11 nicht zu 100% tödlich, obwohl die Zellzahl um 90-99,9% verringert wurde.
  • Die anfängliche Zellzahl wurde durch Extinktionsmessungen bestimmt. Tabelle 3 Anzahl der Bakterienzellen, die 24 h Protaminbehandlung überlebten, wie anhand von Eichkurven der kapazitiven Impedanz/Leitfähigkeit bestimmt
  • k: Keine überlebenden Zellen (bestimmt durch Ausplattieren des Mediums aus der Mulde).
  • c: Lange Nachweiszeit (NZ), entsprechend einer sehr niedrigen Zellzahl (etwa 1 überlebende Zelle).
  • Protamin bei 100 und 500 ug/ml hatte keine Wirkung auf nicht-wachsende L. monocytogenes-Zellen und eine Erhöhung der Protaminkonzentration auf 1000 ug/ml ergab keinerlei letale Wirkung von Protamin auf nicht-wachsende L. monocytogenes.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß Salmin (Lachs-Protamin) in Konzentrationen von 100-4000 ug/ml die Anlaufphase mehrerer Gram-negativer Bakterien signifikant verlängerte. Protamin war gegenüber aktiv wachsenden L. monocytogenes-Zellen im Vergleich zu Zellen, die in Puffer suspendiert waren, wirksamer. Die bakterizide Wirkung von Protamin auf Shewanella putrefaciens war sowohl bei wachsenden als auch nicht-wachsenden Zellen sichtbar. Eine Protaminkonzentration von 2000 ug/ml war erforderlich, um wachsende S. putrefaciens (10³ CFU/ml) abzutöten, wohingegen nicht-wachsende Zellen durch lediglich 50 ug/ml abgetötet wurden. Wenn die Zellkonzentration erhöht wurde, nahm die bakterizide Wirkung von Protamin ab, wahrscheinlich als Folge des höheren Zell/Protamin- Verhältnisses.
  • Das in dieser Studie eingesetzte impedimetrische Verfahren erwies sich als geeignet für die Messung der antibakteriellen Aktivität eines kationischen Proteins, welches Zellagglutination verursachte. Es liegen ausgezeichnete Korrelationen zwischen Nachweiszeit und CFU unbehandelter Zellen vor, siehe Fig. 2. Die Korrelation zwischen protaminbehandelten Zellen und CFU war der Korrelation für unbehandelte Zellen statistisch ähnlich (Daten nicht gezeigt), jedoch verursachte die Ausplattierung der protaminbehandelten Zellen ein hohes Maß an Variation hinsichtlich der Zellzählung. Es wird nachgewiesen, daß Protamin das Wachstum aller getesteten Stämme hemmt, bestimmt als verlängerte Anlaufphase für die am meisten resistenten Bakterien oder eine letale Wirkung auf einige der getesteten Stämme, insbesondere der Gram-positiven Stämme. Die Tatsache, daß Protamin in der Natur vorkommt und nicht-toxisch ist, macht es zu einem antibakteriellen Protein, welches für die Bekämpfung von beispielsweise Fäulnisbakterien und durch Nahrungsmittel übertragenen Pathogenen sehr vielversprechend sein könnte.
    • BEISPIEL 2 Vergleich von minimalen Hemmkonzentrationen für basische Proteine und Enzyme
  • Die minimale Hemmkonzentration (MHK) verschiedener Substanzen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
  • Es wurden die folgenden Substanzen getestet: Protamin (A), Protaminsulfat (B), ein Peroxidase-Enzymsystem (d. h. Lactoperoxidase/Glucoseoxidase (C)), Subtilisin A (D), Polyarginin (E) mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 6 kD und Lysozym (F) (150 000 Einheiten/mg; Johansen, C. et al., 1994). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt.
  • Es wird demonstriert, daß Protamin und Protaminsulfat sehr wirksame Substanzen zur Hemmung aller getesteten Stämme sind, wohingegen Polyarginin zur Hemmung aller Stämme außer Pseudomonas spp. wirksam ist. Abgesehen von der Wirkung von Lysozym auf Listeria monocytogenes zeigte keines der getesteten Enzyme irgendeine Wirkung. Tabelle 4: Vergleich minimaler Hemmkonzentrationen
  • n.d.: nicht durchgeführt
  • n.w.: nicht wirksam
  • * Das Lactoperoxidase-System war für maximal 70 h wirksam. Die Definition der MHK erfordert eine Hemmung von mindestens 100 h.
    • BEISPIEL 3 Der Einfluß von pH-Wert und Zellkonzentration auf die antibakterielle Wirkung von Protamin
  • Der Einfluß des pH-Werts auf die antibakterielle Wirkung von Protamin wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Materialien und Methoden getestet.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt und demonstrieren eindeutig, daß die antibakterielle Wirkung von Protamin signifikant vom pH-Wert abhängt. Bei niedrigem pH-Wert hat Protamin (1 mg/ml) keine Wirkung auf das Gram- negative Bakterium Pseudomonas aeruginosa, jedoch verlängerte Protamin (1 mg/ml) bei hohem pH-Wert die Nachweiszeit von 32 auf 71 h. Die Wechselwirkung zwischen pH-Wert und Protamin wurde für alle getesteten Stämme beobachtet.
  • Ferner wurde der Einfluß der Zellkonzentration auf die antibakterielle Wirkung von Protamin unter Verwendung der im Beispiel 1 beschriebenen Materialien und Methoden getestet, d. h., die Korrelation zwischen Zellkonzentration und Protaminkonzentration wurde mit dem impedimetrischen Assay gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 4 und Fig. 5 dargestellt und demonstrieren eindeutig, daß ein signifikanter Synergismus zwischen der Zellkonzentration und der Protaminkonzentration beobachtet wurde. So verursachte bei niedriger Zellkonzentration Protamin (1 mg/ml) eine Verlängerung der Nachweiszeit von 12 auf etwa 100 h für das Gram-negative Bakterium Shewanella putrefaciens (4 Stämme) im Vergleich zu einer Verlängerung von 6 auf 18 h bei hoher Zellkonzentration. Die Nachweiszeit für das Gram-positive Bakterium Listeria monocytogenes (2 Stämme) bei niedriger Zellkonzentration war bei einer Behandlung mit Protamin (1 mg/ml) von 18 auf 55 h verlängert, bei hoher Zellkonzentration verlängerte die gleiche Protaminkonzentration die Nachweiszeit lediglich von 4 auf 15 h.
    • BEISPIEL 4 Antimikrobieller Synergismus zwischen einem basischen Protein, einem zellwandabbauenden Enzym und einem Peroxidase-Enzymsystem
  • Impedimetrische Messungen, die wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurden, zeigten einen Synergismus zwischen basischen Proteinen wie Protamin, Polyarginin oder Polylysin und Lysozym und/oder Glucoseoxidase und/oder dem Lactoperoxidase-Enzymsystem in Abhängigkeit von pH-Wert und NaCl- Konzentration.
  • Es wurden auch Experimente zur Wachstumshemmung durchgeführt, wobei synergistische und zusätzliche Wirkungen durch Mischen von Verbindungen in niedrigen Konzentrationen, die allein keinerlei Aktivität aufwiesen, und Verwendung eines faktoriellen Versuchsaufbaus bestimmt wurden. Die Wirkungen wurden gemessen als Wachstumshemmung oder eine 100%ige bakterizide Wirkung mit einer vollständigen Abtötung des Impfguts.
  • Protamin (250 ug/ml) oder Polylysin (500 ug/ml) in Kombination mit Lactoperoxidase (2 E/ml) und Glucoseoxidase (2 E/ml) besaß eine 100%ige tödliche Wirkung auf Pseudomonas fluorescens, wohingegen derselbe Stamm bei einer Behandlung mit irgendeiner dieser drei Verbindungen allein in den oben genannten Konzentrationen nicht gehemmt wurde.
  • Gegenüber Pseudomonas fluorescens wurde bei einer Kombination von Protamin (250 ug/ml) und Polylysin (500 ug/ml) und Lysozym (50.000 E/ml) und Lactoperoxidase (2 E/ml) und Glucoseoxidase (1 E/ml) oder Lysozym (50.000 E/ml) und Polylysin (500 ug/ml) und Lactoperoxidase (2 E/ml) und Glucoseoxidase (1 E/ml) eine synergistische Wirkung beobachtet.
  • Experimente, bei denen die antibakterielle Wirkung als Wachstumshemmung von Shewanella putrefaciens in TSB bei 25ºC und pH 7,2 gemessen wurde, zeigten einen Synergismus zwischen Protamin und Lysozym; die Ergebnisse sind in Fig. 6 als Reaktionsoberflächendiagramm dargestellt. Lysozym allein besaß keine Wirkung auf das Gram-negative Bakterium Shewanella putrefaciens, noch hatte Protamin bei Konzentrationen unterhalb 500 ug/ml eine solche, wohingegen Kombinationen eine 100%ige bakterizide Aktivität bei Protaminkonzentrationen über 300 ug/ml und Lysozymkonzentrationen von 10&sup4;-10&sup6; E/ml (Lysozymaktivität: 150.000 E/mg) ergaben.
    • BEISPIEL 5 Fungistatische und fungizide Aktivitäten
  • Dieses Experiment wurde wie im Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung des Bactometer-Substrats: 0,75 g Hefeextrakt (Difco), 3,0 g D-(+)-Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,8 g Isogel-Agarose, IEF (Pharmacia) und 100 ml destilliertes Wasser, durchgeführt.
  • Protamin wurde dem Substrat unmittelbar vor der Beimpfung mit einer Sporensuspension der Testpilze zugesetzt (etwa 10³-10&sup4; CFU/ml).
  • Die minimale Hemmkonzentration wurde bestimmt als die niedrigste Konzentration an Protamin, welche die Abwesenheit einer Nachweiszeit (NZ) während 100 h Messung bewirkte (siehe Tabelle 5 unten). Wenn keine NZ bestimmt wurde, wurde eine fungizide Aktivität durch Ausplattieren einer Verdünnung des gesamten Muldenvolumens festgestellt. Tabelle 5
  • Die fungistatische und fungizide Wirkung von Protamin war ebenso wie die Wirkung auf Bakterien bei hohem pH-Wert und geringer Impfgutgröße optimal. Eine Erhöhung des pH-Wertes verursachte eine signifikante Abnahme des MHK- Werts. Eine fungistatische Wirkung wurde erhalten mit einer 2-5fach geringeren Protaminkonzentration als bei der Bestimmung eines fungiziden Effekts eingesetzt wurde. Die am meisten resistenten Stämme, die in Tabelle 5 angegeben sind, wurden durch Protamin bei niedrigen pH-Werten keine 100 h gehemmt, somit wurde eine 100-h-Inhibierung nicht erhalten, bevor der pH-Wert auf die in der Tabelle angegebenen Werte erhöht wurde.
    • BEISPIEL 6 Überleben und Übertragung von Bakterien während eines Miniwaschvorgangs
  • Materialien:
  • Ariel Color (DF-9412330).
  • Stoffproben (weiße Baumwolle, DF-9415585), sterilisiert durch Trypton-Soja- Bouillon (TSB).
  • Sterilisiertes Wasser (12º dH).
  • Stämme:
  • Staphylococcus aureus (Hautisolat)
  • Pseudomonas aeruginosa (Hautisolat)
  • Methoden:
  • Impfgut:
  • S. aureus und P. aeruginosa wurden in Trypton-Soja-Bouillon (TSB) 30 h lang bei 25ºC gezüchtet. Für jeden Stamm wurden sechs sterile Stoffproben mit etwa 106 CFU/Stoffprobe angeimpft und 30 Minuten lang luftgetrocknet.
  • Miniwaschvorgang:
  • 0,56 g Ariel Color wurden in 80 ml sterilem Wasser (12º dH, 35ºC) in jedem Waschbecher gelöst, was die Endkonzentration von 7 g/l ergab. Protamin, gelöst in Wasser und filtersterilisiert, wurde zu der Hälfte der Waschbecher hinzugegeben, was die Endkonzentration von 500 ug/ml ergab.
  • Nach 70 Sekunden wurde 1 beimpfte Stoffprobe und 2 sterile Stoffproben in jeden Waschbecher überführt und 15 Minuten lang bei 35ºC gewaschen. In einem Becher wurden 3 sterile Stoffproben als Kontrolle gewaschen.
  • Aus jedem Waschbecher wurden 0,1 ml Detergenslösung in (indirekte) Malthus-Zellen, enthaltend TSB, überführt und inkubiert.
  • Die Stoffproben wurden in sterilem Wasser 10 Minuten lang (unter Rühren) gespült. Aus jedem Becher wurden 0,1 ml Spülwasser in (indirekte) Malthus-Zellen inkubiert.
  • Nach dem Waschen wurden alle Stoffproben in steriler Luft 10 Minuten lang leicht luftgetrocknet und jede Stoffprobe in eine indirekte Malthus- Zelle überführt.
  • Alle Materialien und Instrumente mit Ausnahme des Detergens wurden vor Gebrauch sterilisiert, um eine Kontaminierung zu vermeiden.
    • Indirekter Malthus:
  • Bei der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen wurden indirekte Malthus-Messungen eingesetzt.
  • 3 ml TSB wurden in die äußere Kammer der indirekten Malthus-Zellen überführt und 0,5 ml steriles KOH (0,1 M) wurden in die Innenkammer überführt. Wenn Zellen in der Außenkammer wachsen, erzeugen sie CO&sub2; (g), welches sich in dem KOH in der Innenkammer lösen und dadurch die Leitfähigkeit des KOH ändern wird. Wenn die Leitfähigkeitsänderung von der Malthus-Zelle meßbar ist, wird eine Nachweiszeit (NZ) registriert. Die NZ wurden mit Hilfe einer Eichkurve, welche CFU/ml zu NZ in Beziehung setzt (siehe Fig. 1 und 2), in Kolonienzählungen umgerechnet.
  • Eine Reihe von 10fachen Verdünnungsgraden wurde aus der 108 CFU/ml-Suspension von Zellen hergestellt. Die Leitfähigkeits-NZ eines jeden Verdünnungsschritts wurde in TSB bestimmt und eine Eichkurve, welche CFU/ml der 10fach-Verdünnungen zu NZ in TSB in Beziehung setzt, wurde für jeden Stamm erstellt (siehe Fig. 1 und 2).
    • Ergebnisse:
  • Die Anzahl der den Miniwaschvorgang überlebenden Zellen in der Detergenslösung, an den kontaminierten Stoffproben haftend, in das Spülwasser oder auf die sterilen Stoffproben übertragen, wurden durch indirekten Malthus bestimmt (Tabelle 6).
  • Eine relativ hohe Anzahl Zellen wurde aus den Stoffproben gewaschen und im Waschwasser gefunden, jedoch hafteten etwa 10³ CFU nach dem Miniwaschvorgang und zehnminütigen Spülen immer noch an den Stoffproben, und während des Waschens wurden Zellen von der kontaminierten Stoffprobe auf die sterilen Stoffproben übertragen. Die S. aureus-Zellen wurden als sehr sensitiv gegenüber Protamin befunden, was durch die erhöhte antibakterielle Aktivität von Protamin bei hohem pH-Wert erklärt werden kann. Eine hohe Zahl von P. aeruginosa wurde in der Detergenslösung festgestellt und Protamin wurde als aktiv gegen die Zellen in der Detergenslösung befunden, jedoch wurden an den Stoffproben anhaftende P. aeruginosa durch Protamin nicht gehemmt oder abgetötet und alle sterilen Stoffproben in den Waschvorgängen, die mit P. aeruginosa beimpft waren, wurden während des Waschens kontaminiert.
  • Das Spülwasser war fast steril, somit könnten die Zellen aktiv an dem Stoff haften.
    • Tabelle 6
  • Zahl der Zellen in der Detergenslösung, im Spülwasser, an den kontaminierten Stoffproben haftend und auf sterile Stoffproben übertragen, vor und nach einem Miniwaschvorgang bei 35ºC für 15 Minuten mit Ariel Color. Jeder Waschvorgang erfolgte als Dreifachbestimmung, A, B und C sind die drei Waschbecher mit denselben Kombinationen von Stamm und Protamin.
  • (a): Keine NZ mittels Malthus bestimmt, Wachstum in der Malthus-Zelle wurde mit dem Auge beobachtet.
  • Aus den Ergebnissen kann geschlossen werden, daß Ariel Color keine signifikante bakterizide Wirkung auf S. aureus und P. aeruginosa (pathogene Hautisolate) besitzt.
  • Eine große Anzahl von Zellen wurde aus den Stoffproben gewaschen und in der Detergenslösung gefunden, und wenn kein Protamin zugesetzt wurde, kontaminierten Zellen aus der beimpften Stoffprobe die sterilen Stoffproben in dem Waschbecher.
    • REFERENZEN
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Claims (19)

1. Bakterizide, bakteriostatische, fungizide und/oder fungistatische Zusammensetzung, welche ein basisches Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus Protaminen, Protaminsulfaten, Defensinen, Magaininen, Melittin, Cecropinen und Protegrinen, ausgewählt ist, oder ein basisches Peptid, das aus der Gruppe, bestehend aus Polylysinen und Polyargininen und Copolymeren davon, ausgewählt ist, welches Protein oder Peptid zur Abtötung von mikrobiellen Zellen imstande ist, in Kombination mit einer Oxidoreduktase umfaßt oder im wesentlichen daraus besteht.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche ferner ein zellwandabbauendes Enzym, das zum Abbau von Peptidoglucan, Chitin und/oder Teichonsäure in der Lage ist, vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Endoglycosidasen vom Typ II, Lysozymen und Chitinasen, ausgewählt, umfaßt.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das basische Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus normalerweise in Säugerzellen vorkommenden Aminosäuren besteht.
4. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, worin das basische Protein biologischen oder mikrobiologischen Ursprungs ist.
5. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-4, worin das basische Protein aus biologischem Material gewonnen ist.
6. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-4, worin das basische Protein ein rekombinantes Protein ist.
7. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-6, worin die Oxidoreduktase aus der Gruppe, bestehend aus Oxidasen (EC 1.10.3) und Peroxidasen (EC 1.11.1), vorzugsweise aus Peroxidase-Enzymsystemen (EC 1.11.1.7) und Laccase-Enzymen (EC 1.10.3.2) ausgewählt ist.
8. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-7, worin das Peroxidase-Enzymsystem mindestens ein Peroxidase-Enzym und ein Wasserstoffperoxid erzeugendes Enzymsystem, wie z. B. eine Oxidase und ein Substrat für die Oxidase oder eine Aminosäureoxidase und eine geeignete Aminosäure, oder eine Peroxycarbonsäure oder ein Salz davon umfaßt.
9. Reinigungs- oder Detergenszusammensetzung, welche ein basisches Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus Protaminen, Protaminsulfaten, Defensinen, Magaininen, Melittin, Cecropinen und Protegrinen, ausgewählt ist, oder ein basisches Peptid, das aus der Gruppe, bestehend aus Polylysinen und Polyargininen und Copolymeren davon, ausgewählt ist, welches Protein oder Peptid zur Abtötung von mikrobiellen Zellen imstande ist, eine Oxidoreduktase, ein Tensid und gegebenenfalls ein mikrobielle Zellwände abbauendes Enzym, das zum Abbau von Peptidoglucan, Chitin und/oder Teichonsäure in der Lage ist, umfaßt.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das basische Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus normalerweise in Säugerzellen vorkommenden Aminosäuren besteht.
11. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-10, worin das zellwandabbauende Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Endoglycosidasen vom Typ II und Muramidasen, wie z. B. Lysozyme und Chitinasen, ausgewählt ist; und/oder die Oxidoreduktase aus Peroxidase-Enzymsystemen (EC 1.11.1.7) und Laccase-Enzymen (EC 1.10.3.2) ausgewählt ist.
12. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-11, worin das Peroxidase-System mindestens ein Peroxidase-Enzym und ein Wasserstoffperoxid erzeugendes Enzymsystem, wie z. B. eine Oxidase und ein Substrat für die Oxidase oder eine Aminosäureoxidase und eine geeignete Aminosäure, oder eine Peroxycarbonsäure oder ein Salz davon umfaßt.
13. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-12, welche ferner mindestens ein Enzym umfaßt, das aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Amylasen, Cellulasen und Lipasen, ausgewählt ist.
14. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-13, worin das Tensid ein Detergens-Tensid ist, das vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus anionischen, nichtionischen, ampholytischen, zwitterionischen und kationischen Tensiden, ausgewählt ist.
15. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-14, worin das basische Protein ein Protamin oder Protaminsulfat in einer zur Abtötung von Zellen oder zur Hemmung des Wachstums von Zellen wirksamen Menge ist, vorzugsweise in einer Menge, die 1 bis 4000 mg/l Reinigungslauge oder Waschlauge, bevorzugter 1 bis 2000 mg/l Reinigungslauge oder Waschlauge, insbesondere 5 bis 1000 mg/l Reinigungslauge oder Waschlauge, entspricht.
16. Verfahren zur Abtötung von mikrobiellen Zellen, die auf einer harten Oberfläche vorliegen, umfassend das Kontaktieren der Oberfläche mit einer Reinigungszusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-15 oder einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-8, vorzugsweise einer Zusammensetzung, die ein Protamin oder ein Protaminsulfat umfaßt.
17. Verfahren zur Abtötung mikrobieller Zellen oder zur Hemmung wachsender mikrobieller Zellen, die auf Wäsche vorliegen, umfassend das Kontaktieren der Wäsche mit einer Detergenszusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-15 oder einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-8, vorzugsweise einer Zusammensetzung, die ein Protamin oder ein Protaminsulfat umfaßt.
18. Verfahren zur Konservierung von Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Kontaktlinsen-Produkten, Nahrungsmittelkomponenten oder Enzymzusammensetzungen, umfassend die Inkorporation eines basischen Proteins, das aus der Gruppe, bestehend aus Protaminen, Protaminsulfaten, Defensinen, Magaininen, Melittin, Cecropinen und Protegrinen, ausgewählt ist, oder eines basischen Proteins, das aus der Gruppe, bestehend aus Polylysinen und Polyargininen und Copolymeren davon, ausgewählt ist, oder einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-8 in einer zur Hemmung wachsender mikrobieller Zellen wirksamen Menge, vorzugsweise eines Protamins oder eines Protaminsulfats oder einer Zusammensetzung, die ein Protamin oder ein Protaminsulfat umfaßt, in die nicht-konservierten Nahrungsmittel, Getränke, Kosmetika, Kontaktlinsen-Produkte, Nahrungsmittelkomponenten oder Enzymzusammensetzungen.
19. Verwendung einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-8 oder einer Reinigungszusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9-15 zur Herstellung eines Desinfektionsmittels, das sich zur Abtötung mikrobieller Zellen, die auf menschlicher oder tierischer Haut, Schleimhäuten, Wunden, Quetschungen oder im Auge vorliegen, eignet und ein basisches Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus Protaminen, Protaminsulfaten, Defensinen, Magaininen, Melittin, Cecropinen und Protegrinen ausgewählt ist, oder ein basisches Peptid, das aus der Gruppe, bestehend aus Polylysinen und Polyargininen und Copolymeren davon, ausgewählt ist, in einer zur Abtötung der Zellen wirksamen Menge, vorzugsweise ein Protamin oder Protaminsulfat oder eine Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1-8 oder 9-15, umfaßt.
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