DE69333731T2

DE69333731T2 - Glialmitogene faktoren, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69333731T2
Application number: DE69333731T
Authority: DE
Inventors: Andrew Goodearl; Paul Foster City STROOBANT; Luisa Minghetti; Michael Speen Newberry WATERFIELD; Mark Marchioni; Su Maio CHEN; Ian Hiles
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York; Acorda Therapeutics Inc
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research New York; Acorda Therapeutics Inc
Priority date: 1992-06-30
Filing date: 1993-06-29
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2013-06-30
Also published as: PT101297B; EP0653940A1; KR100307943B1; US5530109A; EP0653940A4; PT101297A; AU4769493A; US5606032A; US5792849A; AU4833897A; AU688270B2; KR100344006B1; US5854220A; DE69333731D1; US5602096A; ATE286126T1; US6232286B1; EP0653940B1; US6147190A; US5621081A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf in Wirbeltierarten gefundener Polypeptide, die mitogenetische Wachstumsfaktoren für Gliazellen, einschließlich Schwann-Zellen, darstelle. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von solchen Faktoren sowie die therapeutische Anwendung von diesen Faktoren.
Die Gliazellen von Wirbeltieren stellen das spezialisierte Bindegewebe des zentralen und peripheren Nervensystems dar. Wichtige Gliazellen umfassen die Schwann-Zellen, die eine metabolische Unterstützung für die Neuronen sowie die Myelinscheiden um die Axone von bestimmten peripheren Neuronen, wodurch individuelle Nervenfasern gebildet werden, bereitstellen. Die Schwann-Zellen unterstützen die Neuronen und stellen eine Scheidenwirkung durch die Ausbildung von konzentrischen Membranschichten um die benachbarten Nervenaxone bereit, wobei sie sich bei ihrer Entwicklung um die Axone drehen. Diese Myelinscheiden sind ein empfindliches Element von vielen Nervenfasern und eine Beschädigung der Schwann-Zellen oder ein Fehler im Wachstum und in der Entwicklung kann mit einer signifikanten Demyelinisation oder Nervendegeneration assoziiert sein, was für eine Anzahl von Krankheiten und Störungen des peripheren Nervensystems charakteristisch ist. Es wurde erkannt, dass bei der Entwicklung des Nervensystems, die Zellen verschiedene Faktoren benötigen, um ihre Teilung und ihr Wachstum zu steuern. Verschiedene Faktoren wurden in den vergangenen Jahren identifiziert, wobei auch einige gefunden wurden, die eine Wirkung auf die Teilung und die Entwicklung der Schwann-Zellen besitzen.
Brockes et al. beschreiben unter anderem in J. Neuroscience, 4 (1984), 75–83, einen Proteinwachstumsfaktor, der in Extrakten vom Rindergehirn und Hypophysengewebe vorhanden ist und der bezeichnet wurde als „Glial Growth Factor" (GGF). Dieser Faktor stimuliert kultivierte Schwann-Zellen aus der Ratte zur Teilung in einem Grundmedium, das 10% fötales Kälberserum enthielt. Es wurde auch beschrieben, dass dieser Faktor eine Molekülmasse von 31.000 Daltons hat und vollkommen dimerisiert ist. In Meth. Enz., 147 (1987), 217–225, beschreibt Brockes einen Test für GGF mit Schwann-Zellen.
Brockes et al., siehe oben, beschreiben auch ein Verfahren für die Reinigung von GGF bis zur augenscheinlichen Homogenität. In Kürze umfasst ein beschriebenes, größeres Reinigungsverfahren die Extraktion aus lyophilisierten Vorderlappen vom Rind und die Chromatographie des erzielten Materials unter Verwendung der NaCl-Gradientenelution von CM-Cellulose. Die Gelfiltration wird dann mit einer Ultrogel-Säule durchgeführt, gefolgt von einer Elution aus einer Phosphocellulosesäule. Abschließend erfolgt eine SDS-Gelelektrophorese im Labormaßstab. Alternativ wird das CM-Cellulosematerial direkt auf eine Phosphorcellulosesäule aufgetragen, die Fraktionen aus der Säule werden vereinigt und mit einer präparativen, nativen Gelelektrophorese und anschließend durch eine abschließende SDS-Gelelektrophorese gereinigt.
Brockes et al. haben beobachtet, dass bei den zuvor berichteten Gelfiltrationsexperimenten (Brockes et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 8374–8377) der Hauptpeak der Wachstumsfaktoraktivität bei einer relativen Molekülmasse von 56.000 Daltons auftrat, während bei dem ersten der oben beschriebenen Verfahren die Aktivität vorwiegend bei einer relativen Molekülmasse von 31.000 beobachtet wurde. Es wurde berichtet, dass das GGF-Dimer in einem großen Umfang als Ergebnis der Gradientenelution aus der CM-Cellutose bei diesem Verfahren entfernt wird.
Benveniste et al. (PNAS, 82 (1985), 3930–3934) beschreiben einen von T-Lymphozyten abstammenden, das Gliawachstum fördernden Faktor. Dieser Faktor zeigt unter reduzierenden Bedingungen einen Wechsel in der relativen Molekülmasse auf SDS-Gelen.
Kimura et al. (Nature, 348 (1990), 257–260) beschreiben einen Faktor, den sie als „Schwannoma-derived growth factor" (SDGF) bezeichnet haben, der von einem Tumor der Ischiasnervenscheiden abstammte. Die Autoren haben vermerkt, dass SDGF nicht die Einlagerung von Tritium markierten TdR in kultivierte Schwann-Zellen unter Bedingungen stimuliert, wo eine partiell gereinigte Hypophysenfraktion, die GGF enthält, aktiv ist. SDGF hat ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 31.000 und 35.000.
Davis und Stroobant (J. Cell. Biol., 110 (1990), 1353–1360) beschreiben die Testung von einer Reihe von möglichen Mitogenen. Es wurden Schwann-Zellen aus der Ratte verwendet und die ausgewählten Kandidatensubstanzen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit überprüft, die DNA-Synthese in den Schwann-Zellen in Gegenwart von 10% FCS (fötales Kälberserum) mit und ohne Forskolin zu stimulieren. Einer der getesteten Faktoren war die GGF-Carboxymethylcellulose-Fraktion (GGF-CM), die in Gegenwart von FCS, mit und ohne Forskolin mitogenetisch war. Die Arbeit zeigt, dass in Gegenwart von Forskolin der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor (PDGF) ein potentes Mitogen für die Schwann-Zellen ist, wobei zuvor geglaubt wurde, dass PDGF keinen Effekt auf die Schwann-Zellen besitzt.
Holmes et al. Science (1992) 256: 1205 und Wen et al. Cell (1992) 69 559 zeigen, dass die DNA-Sequenzen, welche für Proteine codieren, die an einen Rezeptor (p185^erbB2) binden, mit verschiedenen menschlichen Tumoren assoziiert sind.
Das p185^erbB2-Protein ist ein 185 Kilodalton, die Membran durchdringendes Protein mit Tyrosinkinaseaktivität. Das Protein wird durch das erbB2 Proto-Onkogen kodiert (Yarden und Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 443(1988)). Das erbB2-Gen, auch als „HER-2" (in menschlichen Zellen) und als „neu" (in Rattenzellen) bezeichnet, ist eng verwandt mit dem Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). Kürzliche Belege zeigen, dass Proteine, die interagieren mit (und die Kinase aktivieren von) p185^erbB2 die Proliferation in den Zellen, welche p185^erbB2 besitzen, induzieren (Holmes et al., Science 256: 1205 (1992); Dobashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8582 (1991); Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 2287 (1992)). Es ist ferner offensichtlich, dass das Gen, welches die p185^erbB2 Bindeproteine codiert, eine Reihe von unterschiedlich großen, unterschiedlich gespleißte RNA-Transkripte herstellt, die zu einer Serie von Proteinen führen, die unterschiedlich lang sind und einige gemeinsame Peptidsequenzen und einige einmalige Peptidsequenzen enthalten. Dies wird unterstützt durch unterschiedlich gespleißte RNA-Transkripte, die aus menschlichem Brustkrebs gewinnbar sind (MDA-MB-231) (Holmes et al. Science 256: 1205 (1992)). Eine weitere Unterstützung kommt von Proteinen mit einem breiten Größenbereich, die (wie hier offenbart) als Liganden für den p185^erbB2 Rezeptor agieren (siehe unten).
Die Erfindung stellt im Allgemeinen Verfahren für die Stimulierung der Mitogenese von Gliazellen (insbesondere von Schwann-Zellen und Gliazellen des Zentralnervensystems) sowie neue Proteine, die solch eine mitogenetische Aktivität auf Gliazellen ausüben, bereit. Ferner wird DNA bereitgestellt, die für diese Proteine und Antikörper codiert, welche an diese und an verwandte Proteine binden.
Die neuen Proteine gemäß der Erfindung umfassen alternative Spleißprodukte von Sequenzen, die für bekannte Polypeptide codieren. Diese bekannten Proteine sind im Allgemeinen Mitglieder der GGF/p185^erbB2-Proteinfamilie.
Die Erfindung stellt insbesondere Polypeptide mit einer beschriebenen Formel bereit und DNA-Sequenzen, die für diese Polypeptide codieren.
Die Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das von einem GGF/p185^erbB2 Ligandengen codiert wird und mit einem p185^erbB2-Rezeptor interagiert, wobei das Polypeptid eine E-Domäne, die von SEQ ID Nr. 163 codiert wird, oder eine E-Domäne, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 210 umfasst, und eine dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnliche Domäne umfasst, die

a) eine C-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 177) und entweder eine C/D Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 178) oder eine C/D' Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 143) in der 5' zu 3'-Reihenfolge C-C/D oder C-CD';
b) die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 151, 152, 220, 221, 222, 223, 224 oder 225; oder
c) die Aminosäuren 362–411 von SEQ ID Nr. 170

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung induziert das Polypeptid die Zellteilung von Gliazellen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung induziert das Polypeptid die Acetylcholinrezeptor-Synthese in einer Zelle.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung induziert das Polypeptid die Myelinisierung einer Neuralzelle durch eine Gliazelle.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 170.
Die Erfindung stellt ferner eine isolierte Nukleinsäuresequenz bereit, die für das oben definierte Polypeptid codiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 21.
Die Erfindung umfasst ferner Vektoren, die DNA-Sequenzen umfassen, welche für die oben definierten Aminosäuresequenzen codieren. Ferner umfasst ist eine Wirtszelle, welche die isolierte DNA enthält, welche für die oben definierten Aminosäuresequenzen codiert. Die Erfindung umfasst ferner solche Verbindungen, die an den p185^erbB2-Rezeptor binden und die Zellteilung von Gliazellen in vivo und/oder in vitro stimulieren, wie hierin definiert.
Ferner können Antikörper gegen die hier beschriebenen Peptide für die Reinigung der hier beschriebenen Polypeptide verwendet werden. Die Antikörper gegen die Polypeptide können auch für die therapeutische Hemmung der Zellteilung der Gliazellen verwendet werden.
Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren für die Herstellung eines mitogenetischen Faktors für die Gliazellen, dass die Kultur von modifizierten Wirtszellen, wie oben definiert, unter Bedingungen umfasst, welche die Expression der DNA-Sequenzen nach der Erfindung ermöglichen.
Ein Verfahren für die Stimulierung der Zellteilung von Gliazellen kann bewirkt werden durch das Inkontaktbringen der Gliazellen mit einem oben definierten Polypeptid als ein Gliazellenmitogen in vivo oder in vitro. Ein Verfahren für das Erzeugen eines mitogenetischen Effektes von Gliazellen in einem Wirbeltier (vorzugsweise einem Säugetier, mehr bevorzugt bei Menschen) kann bewirkt werden durch die Verabreichung einer wirksamen Menge des hier definierten Polypeptides.
Ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe für eine Nervenerkrankung oder Störung kann mit den hier beschriebenen Polypeptiden erreicht werden. Ein Verfahren für die Prophylaxe oder die Behandlung eines pathophysiologischen Zustandes des Nervensystems, bei dem ein Zelltyp involviert ist, der gegenüber den hier definierten Polypeptiden empfindlich oder reagierend ist, kann mit den vorliegenden Polypeptiden auch erzielt werden.
Die erwähnten Verfahren zur Behandlung umfassen Verfahren, welche die Störung eines peripheren Nervenschadens beinhaltet, einen Nervenschaden in dem zentralen Nervensystem, eine neurodegenerative Störung, eine Demyelinisation im peripheren oder im zentralen Nervensystem oder ein Schaden oder ein Verlust von Schwann-Zellen, Oligodendrozyte, Mikroglia oder Astrozyte. Zum Beispiel sind Nervenleiden von sensorischen oder motorischen Nervenfasern oder die Behandlung einer neurodegenerativen Störung mit umfasst. In jedem dieser Fälle besteht die Behandlung in der Verabreichung einer wirksamen Menge des Polypeptides.
Ein Verfahren zur Induktion der Nervenregeneration und/oder zur Reparatur kann auch durch die Verabreichung einer wirksamen Menge des oben definierten Polypeptides bewirkt werden. Solch ein Medikament wird hergestellt durch Verabreichung des Polypeptides mit einem pharmazeutisch wirksamen Träger.
Die Erfindung umfasst die Verwendung eines Polypeptides, wie oben definiert, bei der Herstellung eines Medikamentes.
Die oben definierten Polypeptide können verwendet werden

– um ein Säugetier zu immunisieren für die Produktion von Antikörpern, die optional für therapeutische oder diagnostische Zwecke verwendet werden können,
– in einer kompetitiven Prüfung zur Identifikation oder Quantifizierung von Molekülen mit Rezeptorbindungseigenschaften, die denen des Polypeptides entsprechen, und/oder
– für den Kontakt einer Probe mit einem Polypeptid, wie oben erwähnt, zusammen mit einem Rezeptor, der spezifisch an das Polypeptid binden kann, um die kompetitive Hemmung der Bindung an das Polypeptid nachzuweisen,
– in einem Affinitätsisolierungsverfahren, optional Affinitätschromatographie, für die Abtrennung eines entsprechenden Rezeptors.

Die Erfindung umfasst ferner EGFL1, EGFL2, EGFL3, EGFL4, EGFL5 und EGFL6 Polypeptide, die 38 bis 43 und die SEQ ID Nrn. 220–225 zur Verwendung bei der Stimulierung der Zellteilung von Gliazellen in vivo und in vitro.
Von der Erfindung ist auch die Verabreichung des GGF-II Polypeptides, dessen Sequenz in der 45A dargestellt ist, für die Stimulierung der Zellteilung von Gliazellen umfasst.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die hier beschriebenen, neuen Polypeptide dazu verwendet werden, um die Synthese von Acetylcholinrezeptoren zu stimulieren.
Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung neue Gliawachstumsfaktoren aus Säugetierquellen, einschließlich Rind und Mensch, bereit, welche von bekannten Faktoren verschieden sind. Diese Faktoren sind mitogenetisch für Schwann-Zellen gegenüber einem Hintergrund von fötalem Kälberplasma (FCP). Die Erfindung stellt ferner Verfahren für die Herstellung von diesen Faktoren bereit sowie ein verbessertes Verfahren für die Definition der Aktivität von diesen und anderen Faktoren. Therapeutische Anwendungen der Faktoren sind ferner ein signifikanter Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung umfasst ferner Sequenzen, die eine Sequenzidentität der Homologie zu den oben angezeigten Sequenzen von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 80%, haben.
Obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf eine besondere Gruppe an Hybridisierungsbedingungen beschränkt ist, gibt das folgende Protokoll eine allgemeine Anleitung, die befolgt werden kann, falls dies gewünscht ist.
DNA-Proben können mit einer hohen spezifischen Aktivität (etwa 10⁸ bis 10⁹ ³²Pdmp/μg) durch Nick-Translation oder durch PCR-Reaktionen gemäß Schowalter und Sommer (Anal. Biochem., 177: 90–94, 1989) markiert und durch Entsalzung auf G-150 Sephadex-Säulen gereinigt werden. Die Proben können denaturiert (10 Minuten in kochendem Wasser und anschließendem Eintauchen in Eiswasser) und dann zu Hybridisierungslösungen von 80% Puffer B gegeben werden (2 g Polyvinylpyrrolidin, 2 g Ficoll-400, 2 g Rinderserumalbumin, 50 ml 1 M Tris HCL (pH 7,5), 58 g NaCl, 1 g Natriumpyrophosphat, 10 g Natriumdodecylsulfat, 950 ml Wasser), der 10% Dextransulfat enthält, wobei die Zugabe mit 10⁶ dpm ³²P pro ml erfolgen kann.
Es erfolgt dann eine Inkubation über Nacht (etwa 16 Stunden) bei 60°C. Die Filter können dann bei 60°C gewaschen werden, zuerst in Puffer B für 15 Minuten und anschließend dreimal für jeweils 20 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS und dann einmal für 20 Minuten in 1 × SSC, 0,1% SDS.
In anderer Hinsicht stellt die Erfindung bereit:

(a) Einen Grundpolypeptidfaktor, der bei Erzielung aus Rinderhypophysenmaterial ein beobachtetes Molekulargewicht, ob unter reduzierenden Bedingungen oder nicht, von etwa 30 kD bis etwa 36 kD auf SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung der folgenden Molekulargewichtsstandards hat:

Lysozym (Hühnereiweiß)	14.400
Sojabohnen-Trypsininhibitor	21.500
Carboanhydrase (Rind)	31.000
Ovalbumin (Hühnereiweiß)	45.000
Rinderserumalbumin	66.200
Phosphorylase B (Kaninchenmuskel)	97.400;

wobei der Faktor eine mitogenetische Aktivität auf Gliazellen hat, einschließlich der Stimulierung der Teilung von Schwann-Zellen der Ratte in Gegenwart von fötalem Kälberplasma, und bei Isolierung unter Verwendung der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie an Umkehrphasen wenigstens 50% dieser Aktivität nach 10 Wochen Inkubation in 0,1% Trifluoressigsäure bei 4°C behält; und

(b) ein Grundpolypeptidfaktor, der bei Erzielung aus Rinderhypophysenmaterial ein beobachtetes Molekulargewicht unter nicht-reduzierenden Bedingungen von etwa 55 kD bis etwa 63 kD auf SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung der folgenden Molekulargewichtsstandards zeigt:

Lysozym (Hühnereiweiß) 14.400

Sojabohnen-Trypsininhibitor 21.500

Carboanhydrase (Rind) 31.000

Ovalbumin (Hühnereiweiß) 45.000

Rinderserumalbumin 66.200

Phosphorylase B (Kaninchenmuskel) 97.400;

wobei das menschliche Äquivalent von diesem Faktor durch den hierin beschriebenen DNA-Klon GGF2HBS5 codiert wird, und dieser Faktor eine mitogenetische Aktivität auf Gliazellen hat, einschließlich der Stimulierung der Teilung von Schwann-Zellen der Ratte in Gegenwart von fötalem Kälberserum, und bei Isolierung unter Verwendung der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie an Umkehrphasen wenigstens 50% der Aktivität nach 4 Tagen Inkubation in 0,1% Trifluoressigsäure bei 4°C behält.

Nur zur Darstellung in dieser Beschreibung werden die Niedrigmolekulargewichtsfaktoren und die Hochmolekulargewichtsfaktoren gemäß der vorliegenden Erfindung im Folgenden als „GGF-I" und „GGF-II" bezeichnet. Die „GGF2" Bezeichnung wird für alle Klone verwendet, die mit den Peptidsequenzdaten isoliert wurden, welche von dem GGF-II Protein abstammen (das heißt, GGF2HBS5, GGF2BPP3).
Es sei angemerkt, dass die Grenzen der Molekulargewichtsbereiche nicht exakt anzugeben sind, sondern Gegenstand von leichten Variationen in Abhängigkeit von der Quelle des einzelnen Polypeptidfaktors ist. Eine Variation von etwa 10% würde zum Beispiel nicht unmöglich sein für ein Material aus einer anderen Quelle.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung benutzt die Tatsache, dass die Gliawachstumsfaktoren und die p185^erbB2 Ligandenproteine von dem gleichen Gen codiert werden. Eine Reihe von messenger-RNA Spleißvarianten (und die daraus resultierenden Proteine) stammen von diesem Gen ab und viele von diesen Produkten zeigen eine p185^erbB2 Bindung und Aktivierung. Verschiedene (GGF-II) Genprodukte zeigen eine mitogenetische Aktivität für Schwann-Zellen. Die Erfindung stellt die Verwendung von all diesen bekannten Produkten des GGF/p185^erbB2 Ligandengens (beschrieben in den oben aufgeführten Referenzen) als Schwann-Zellmitogene bereit.
Diese Erfindung bezieht sich auch auf andere, noch nicht natürlich isolierte Spleißvarianten des Gens für den Gliawachstumsfaktor. Die 30 zeigt das bekannte Muster des Spleißens, welches von Polymerase-Kettenreaktions-Experimenten abstammt (auf umgekehrt transkribierter RNA) und die Analyse der cDNA-Klone (wie hier dargestellt), die abstammen von Sequenzen, die publiziert sind als Sequenzen, welche p185^erbB2 Liganden codieren (Peles et al., Cell 69: 205 (1992) und Wen et al., Cell 69: 559 (1992)). Diese Muster sowie die zusätzlichen, hier offenbarten Muster stellen vermutlich Spleißvarianten dar, die existieren. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die neue Proteinfaktoren codieren, welche von diesem Gen abstammen. Die Erfindung stellt ferner Verfahren für die Herstellung von diesen Faktoren bereit. Die therapeutische Anwendung von diesen neuen Faktoren ist ein weiterer Aspekt der Erfindung.
Diese anderen wichtigen Aspekte der Erfindung sind:
Eine Reihe von Polypeptidfaktoren, die mitogenetische Aktivität für Gliazellen besitzen, einschließlich der Stimulierung der Teilung von Schwann-Zellen, und deren Reinigung und Charakterisierung gemäß den Verfahren, die dargestellt sind durch Lupu et al., Science 249: 1552 (1990); Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 2287 (1992); Holmes et al., Science 256: 1205 (1992); Peles et al. 69: 205 (1992); Yarden und Peles, Biochemistry 30: 3543 (1991); Dobashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8582 (1991); Davin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 1536 (1991); Beaumont et al., Patentanmeldung PCT/US 91/03443 (1990); Greene et al., Patentanmeldung PCT/US 91/02331 (1990); Usdin und Fischbach, J. Cell. Biol. 103: 493–507 (1986); Falls et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55: 397–406 (1990); Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7664–7668 (1991) und Falls et al., Cell 72: 801–815 (1993).
Die menschlichen Peptidsequenzen, die oben beschrieben und in den 31, 32, 33 und 34 (SEQ ID Nrn. 192, 194, 195 und 147–219) dargestellt sind, stellen eine Reihe von Spleißvarianten dar, die aus vollständigen komplementären DNAs (cDNAs) aus natürlichen Quellen (cDNA-Bibliotheken, hergestellt mit den geeigneten Geweben) isoliert werden können oder die als DNA-Konstrukte mit einzelnen Exons (zum Beispiel abstammend von separaten Exons) durch Fachleute zusammengesetzt werden können.
Andere Verbindungen, insbesondere Peptide, die spezifisch an den p185^erbB2-Rezeptor binden, können auch als Gliazellenmitogen verwendet werden. Eine Kandidatenverbindung kann routinemäßig für eine p185^erbB2 Bindung überprüft werden und bei Bindung kann sie dann auf mitogenetische Aktivität für Gliazellen unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren getestet werden.
Die Erfindung umfasst jegliche Modifikationen oder Äquivalente der obigen Polypeptidfaktoren, sofern sie keine signifikant reduzierte Aktivität zeigen. Modifikationen, bei denen der Aminosäuregehalt oder die Aminosäuresequenz verändert sind, ohne das im Wesentlichen die Aktivität nachteilig beeinflusst wird, sind umfasst. Zur Darstellung sei auf die EP-A-109748 verwiesen, wo Mutationen von nativen Proteinen offenbart sind, bei denen die Möglichkeit einer nicht gewünschten Disulfidbindung dadurch vermieden ist, dass Cystein, das für die biologische Aktivität nicht notwendig ist, durch eine neutrale Aminosäure in der nativen Sequenz ersetzt ist. Die Feststellungen zur Wirkung und Verwendung, wie sie hier getroffen werden, treffen somit auch auf solche Verwendungen und Wirkungen zu, welche modifizierte oder äquivalente Faktoren, die Teil der Erfindung sind, verwenden.
Die neuen Sequenzen gemäß der Erfindung unterliegen den Vorteilen der rekombinanten Technologie. Die Erfindung umfasst somit auch die folgenden Aspekte:

(a) DNA-Konstrukte, welche die oben definierten DNA-Sequenzen umfassen, in operablen offenen Leserahmpositionen innerhalb von Vektoren (benachbart angeordnet zu Steuersequenzen, um die Expression der Sequenzen zu ermöglichen) in ausgewählten Wirtszellen nach deren Transformation durch die Konstrukte (vorzugsweise umfasst die Steuersequenz regulierbare Promotoren, zum Beispiel Trp). Es sei angemerkt, dass die Auswahl eines Promotors und der regulatorischen Sequenzen, falls notwendig, Gegenstände sind, die ein Fachmann auswählen kann;
(b) Wirtszellen, die durch die Einlagerung der in (a) definierten Konstrukte modifiziert sind, so dass diese DNA-Sequenzen in diesen Wirtszellen exprimiert werden können. Die Wahl des Wirtes ist nicht kritisch und die ausgewählten Zellen können prokaryontisch oder eukaryontisch sein und können genetisch modifiziert sein, um diese Konstrukte durch bekannte Verfahren einzubauen; und
(c) Verfahren für die Herstellung der oben definierten Faktoren, welches die Kultur der modifizierten Wirtszellen unter Bedingungen umfasst, welche die Expression der DNA-Sequenzen erlauben. Für jede besondere Ausführungsform können diese Bedingungen von Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie vollständig bestimmt werden. Gliazellmitogene, die durch diese Mittel hergestellt werden, sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Keiner der im Stand der Technik beschriebenen Faktoren hat die Kombination an Eigenschaften, welche die vorliegenden neuen Polypeptidfaktoren besitzen.

Wie dargelegt, verwendet der Schwann-Zelltest, der für die vorliegenden Faktoren zur Charakterisierung verwendet wird, einen Hintergrund aus fötalem Kalbsplasma. In allen anderen Aspekten kann der Test der gleiche sein, der von Brockes et al. in Meth. Enz., siehe oben, beschrieben ist, wobei aber 10% FCS ersetzt ist durch 10% FCP. Dieser Unterschied in der Testtechnik ist wichtig, da die Abwesenheit der aus Blutplättchen gewonnen Faktoren im fötalen Kalbsplasma (wie entgegensetzt zum Serum) eine strengere Definition der Affinität auf die Schwann-Zellen ermöglicht, da mögliche falsche Wirkungen von einigen anderen Faktoren eliminiert sind.

Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren für die Herstellung eines oben definierten Polypeptides, wobei aus Wirbeltiergehirnmaterial extrahiert wird, um das Protein zu erzielen. Der erzielte Extrakt wird einer chromatographischen Reinigung mittels Hydroxyapatit-HPLC unterworfen und dann wird mit diesen Fraktionen eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Die Fraktion, die ein beobachtetes Molekulargewicht von etwa 30 kD bis 36 kD hat, und/oder die Fraktion, die ein beobachtetes Molekulargewicht von etwa 55 kD bis 63 kD hat, werden gesammelt. In jedem Fall wird die Fraktion einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung der folgenden Molekulargewichtsstandards unterworfen:

Lysozym (Hühnereiweiß)	14.400
Sojabohnen-Trypsininhibitor	21.500
Carboanhydrase (Rind)	31.000
Ovalbumin (Hühnereiweiß)	45.000
Rinderserumalbumin	66.200
Phosphorylase B (Kaninchenmuskel)	97.400

Im Falle der kleineren Molekulargewichtsfraktion läuft das SDS- Polyacrylamidgel unter nicht reduzierenden Bedingungen, unter reduzierenden Bedingungen, oder im Falle der größeren Molekulargewichtsfraktion unter nicht reduzierenden Bedingungen. Die Fraktionen werden dann hinsichtlich ihrer Aktivität zur Stimulierung der Teilung von Schwann-Zellen der Ratte gegenüber einem Hintergrund von fötalem Kalbsplasma getestet.
Vorzugsweise startet das obige Verfahren mit der Isolierung einer relevanten Fraktion, die durch Carboxymethylcellulosechromatographie erzielt wird, das heißt, Material von der Rinderhypophyse. Es ist auch bevorzugt, das Hydroxylapatit-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie, Gelfiltration und/oder einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen vor der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt wird. Bei jedem Stadium in dem Verfahren kann die Aktivität bestimmt werden unter Verwendung der Einlagerung von radioaktivem Ioddeoxyuridin in die Schwann-Zellen als eine Maßnahme in dem Test, der allgemein beschrieben ist von Brockes in Meth. Enz., siehe oben, wobei aber 10% FCS ersetzt ist durch 10% FCP. Wie bereits angemerkt, ist solch ein Test ein Aspekt der Erfindung für die mitogenetischen Wirkungen einer Substanz auf die Zellen des zentralen Nervensystems oder des peripheren Nervensystems, zum Beispiel Schwann-Zellen.
Die Erfindung umfasst somit auch einen Test für die mitogenetische Aktivität von Gliazellen, wobei ein Hintergrund aus fötalem Kalbsplasma verwendet wird, um die DNA-Synthese in Gliazellen zu testen, die durch eine Testsubstanz (wenn überhaupt) stimuliert sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung oder Veterinärformulierung, die einen der oben definierten Faktoren umfasst, der für die pharmazeutische oder Veterinärverwendung formuliert ist und zwar optional zusammen mit einem akzeptablen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel und/oder in einer Einheitsarzneiform. Bei Verwendung der Faktoren gemäß der vorliegenden Erfindung kann die konventionelle pharmazeutische oder Veterinärpraxis angewandt werden, um geeignete Formulierungen oder Zusammensetzungen bereitzustellen.
Die Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung können somit angewandt werden für die parenterale Verabreichung, zum Beispiel die intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraorbitale, opthalmische, intraventrikuläre, intrakraniale, intrakapsuläre, intraspinale, intracisternale, intraperitoneale, lokale, intranasale, Aerosol-, Skarifikation- und auch orale, bukkale, rektale oder vaginale Verabreichung.
Die Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch durch Transplantation in den Patienten von Wirtszellen verabreicht werden, welche die DNA der vorliegenden Erfindung exprimieren, oder durch Verwendung von chirurgischen Implantaten, welche die Formulierungen der Erfindung freisetzen.
Parenterale Formulierungen können in der Form von Flüssiglösungen oder Suspensionen vorliegen. Für die orale Verabreichung können die Formulierungen in der Form von Tabletten oder Kapseln vorliegen. Für die intranasale Formulierung können Pulver, Nasentropfen oder Aerosole benutzt werden.
Im Stand der Technik gut bekannte Verfahren für die Herstellung von Formulierungen sind zum Beispiel dargestellt in „Remington's Pharmaceutical Sciences". Formulierungen für die parenterale Verabreichung können zum Beispiel als Bindemittel steriles Wasser oder Salzlösung enthalten. Polyalkylenglycole, wie Polyethylenglycol, Öle von pflanzlichem Ursprung oder hydrierte Naphthalene, biokompatible, bioabbaubare Lactidpolymere oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere können verwendet werden, um die Freisetzung der vorliegenden Faktoren zu steuern. Andere potentiell nützliche, parenterale Abgabesysteme für die Faktoren umfassen Ethylen-Vinylacetat-Copolymer-Partikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen. Formulierungen für die Inhalation können zum Beispiel als Bindemittel Laktose enthalten und können wässrige Lösungen sein, die zum Beispiel Polyoxyethylen-2-Laurylether, Glycocholat und Deoxycholat enthalten, oder können ölige Lösungen für die Verabreichung in Form von Nasentropfen sein oder können intranasal als ein Gel angewandt werden. Formulierungen für die parenterale Verabreichung können auch Glycocholat für die bukkale Verabreichung, Methoxysalicylat für die rektale Verabreichung oder Zitronensäure für die vaginale Verabreichung enthalten.
Die vorliegenden Faktoren können als alleiniges aktives Mittel oder können in Kombination mit anderen aktiven Mitteln verwendet werden, zum Beispiel mit anderen Wachstumsfaktoren, welche das neuronale Überleben bei neurologischen Krankheiten erleichtern, oder Peptidase- oder Proteaseinhibitoren.
Die Konzentration der vorliegenden Faktoren in den Formulierungen gemäß der Erfindung wird in Abhängigkeit von einer Reihe von Faktoren variieren, einschließlich der zu verabreichenden Dosierung und der Art der Verabreichung.
Im Allgemeinen können die Faktoren der vorliegenden Erfindung in einer wässrigen, physiologischen Pufferlösung bereitgestellt werden, die etwa 0,1 bis 10% (Gewicht/Volumen) Verbindung für die parenterale Verabreichung enthält. Allgemeine Dosisbereiche erstrecken sich von etwa 1 mg/kg bis etwa 1 g/kg Körpergewicht pro Tag. Ein bevorzugter Dosisbereich liegt bei etwa 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die bevorzugte, zu verabreichende Dosierung wird wahrscheinlich vom Typ und dem Ausmaß des Fortschreitens der pathophysiologischen Störung, die zu behandeln ist, abhängig sein sowie von dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten, der Herstellungsart der Formulierung und der Art der Verabreichung.
Wie oben angezeigt sind die Schwann-Zellen (die Gliazellen des peripheren Nervensystems) stimuliert, um in Gegenwart der Faktoren gemäß der vorliegenden Erfindung sich zu teilen. Schwann-Zellen des peripheren Nervensystems sind beteiligt bei der Unterstützung der Neuronen und bei der Schaffung der Myelinscheiden um die einzelnen Nervenfasern. Diese Scheiden sind wichtig für die geeignete Weiterleitung von elektrischen Impulsen zu den Muskeln und von den sensorischen Rezeptoren.
Es gibt eine Reihe von peripheren Nervenleiden, bei denen die Schwann-Zellen und die Nervenfasern beschädigt sind und zwar entweder primär oder sekundär. Es gibt viele Nervenleiden von sowohl sensorischen als auch motorischen Fasern (Adams und Victor, „Principles of Neurology"). Die wichtigsten dieser Nervenleiden sind wahrscheinlich die Nervenleiden, die mit Diabetes, multiple Sklerose, Landry-Guillain-Barr-Syndrom assoziiert sind, Nervenleiden, die durch Karzinome hervorgerufen werden sowie Nervenleiden, die durch toxische Mittel (einige von ihnen werden verwendet zur Behandlung von Karzinomen) hervorgerufen werden.
Die Erfindung zielt jedoch allgemein auf die Behandlung oder Prophylaxe von Zuständen, bei denen ein Schaden des Nervensystems durch jegliche Ursache entstanden ist, zum Beispiel durch Infektion oder Verletzung. Zusätzlich zu der Verwendung der vorliegenden Faktoren bei der Behandlung von Störungen oder Krankheiten des Nervensystems, wo eine Demyelinisation oder ein Verlust von Schwann-Zellen vorliegt, können solche Gliawachstumsfaktoren auch bei der Behandlung von Störungen des Nervensystems wertvoll sein, die hervorgerufen werden durch einen Schaden an den peripheren Nerven. Nach Schädigung von peripheren Nerven führt der Regenerationsprozess zu einem Wachstum oder Wiederherstellung der Schwann-Zellen, wobei sich die Beförderung der Nervenfasern zurück zu ihrem Ziel anschließt. Durch Erhöhung der Teilung der Schwann-Zellen könnte dieser regenerative Prozess nach einem Schaden gefördert werden.
Ähnliche Ansätze könnten benutzt werden, um Verletzungen oder neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems (Gehirn und Rückenmark) zu behandeln.
Ferner gibt es eine Reihe von Tumoren der Gliazellen, wobei der häufigste Tumor wahrscheinlich die Neurofibromatose ist, die einen unregelmäßigen, kleinen Tumor darstellt, der durch eine Überwachsung der Gliazellen erzeugt wird. Es wurde ferner gefunden, dass eine Aktivität, die GGF sehr ähnlich ist, in einigen Tumoren der Schwann-Zellen auftritt, wodurch Hemmstoffe der Wirkung der vorliegenden Faktoren auf ihre Rezeptoren eine Therapie für einen Gliatumor darstellen, was die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Substanz umfasst, welche die Bindung eines Faktors, wie oben definiert, an einen Rezeptor hemmt.
Im Allgemeinen erlaubt die Erfindung die Verwendung der vorliegenden Polypeptidfaktoren bei der Prophylaxe oder der Behandlung von jeglichem pathophysiologischen Zustand des Nervensystems, bei dem ein Faktor sensitiver oder ein auf den Faktor reagierender Zelltyp beteiligt ist.
Die Polypeptidfaktoren gemäß der vorliegenden Erfindung können auch als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern, wie monoklonale Antikörper, unter Benutzung von Standardtechniken verwendet werden. Solche Antikörper werden von der vorliegenden Erfindung umfasst. Diese Antikörper können andererseits für therapeutische oder diagnostische Zwecke verwendet werden. Zustände, die wahrscheinlich mit anormalen Mengen des Faktors assoziiert sind, können durch Verwendung von solchen Antikörpern erfasst werden. In vitro Techniken können benutzt werden, wobei unter Verwendung von Standardverfahren Anwendungstests auf isolierte Proben fallen. Bildgebende Verfahren, bei denen die Antikörper zum Beispiel mit radioaktiven Isotopen markiert werden, die außerhalb des Körpers dargestellt werden können, können unter Verwendung von Techniken hinsichtlich der Art der Tumordarstellung auch verwendet werden.
Die Erfindung zielt ferner auf die allgemeine Verwendung der vorliegenden Faktoren als Gliazell-Mitogene in vivo oder in vitro sowie auf Faktoren für solch eine Verwendung. Eine spezifische Ausführungsform umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Faktors gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein Verfahren für die Herstellung eines mitogenetischen Gliazelleffektes in einem Wirbeltier für die Behandlung oder die Prophylaxe einer Erkrankung oder Störung des Nervensystems.
Ein weiterer allgemeiner Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung eines Faktors gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikamentes, vorzugsweise für die Behandlung einer Nervenerkrankung oder Störung oder für die neurale Regeneration oder Reparatur.
Von der Erfindung ist ferner die Verwendung der Faktoren gemäß der vorliegenden Erfindung in kompetitiven Tests umfasst, um Moleküle mit Rezeptorbindungseigenschaften, die denen der Polypeptide entsprechen, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Die Polypeptide können markiert werden, optional mit einem Radioisotop. Ein kompetitiver Test kann sowohl Antagonisten als auch Agonisten des relevanten Rezeptors identifizieren.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von jedem einzelnen der Faktoren gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Affinitätsisolierungsverfahren, optional Affinitätschromatographie, für die Trennung der entsprechenden Rezeptoren bereit. Solche Verfahren für die Isolierung von Rezeptoren, die bestimmten Proteinen entsprechen, sind im Stand der Technik bekannt und eine Reihe von Techniken sind verfügbar und können auf die Faktoren gemäß der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Der Leser wird zum Beispiel in Bezug auf IL-6 und IFN_γ verwiesen auf Novick, D. et al., J. Chromatogr. (1990) 510: 331–7. In Bezug auf das Gonadotropin-Freisetzungshormon wird verwiesen auf Hazum, E., J. (1990) Chromatogr. 510: 233–8. In Bezug auf G-CSF-Referenz wird verwiesen auf Fukunaga, R., et al., J. Biol. Chem., 265: 13386–90. In Bezug auf den IL-2 Verweis wird verwiesen auf Smart, J. E., et al., (1990) J. Invest. Dermatol., 94: 158S–163S, und in Bezug auf den Verweis auf menschliches IFN-Gamma wird verwiesen auf Stefanos, S. et al., (1989) J. Interferon Res., 9: 719–30.
Die Zeichnungen werden als erstes beschrieben.
Zeichnungen
Die 1 bis 8 beziehen sich auf das Beispiel 1 und werden im folgenden kurz beschrieben:
1 ist das Profil für ein Produkt von der Carboxymethylcellulose-Chromatographie.
2 ist das Profil für ein Produkt von der Hydroxylapatit-HPLC.
3 ist das Profil für ein Produkt von Mono-S-FPLC.
4 ist das Profil für ein Produkt von der Gelfiltration FPLC.
Die 5 und 6 zeigen die Profile für zwei, teilweise gereinigte Polypeptidprodukte von der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen.
Die 7 und 8 zeigen Dosis-Effekt-Kurven für die GGF-I und GGF-II Fraktionen von HPLC mit umgekehrten Phasen unter Verwendung von fötalem Kalbsserum oder einem fötalen Kalbsplasma-Hintergrund.
Die 9 bis 12 zeigen die Peptidsequenzen, die abstammen von GGF-I und GGF-II, SEQ ID Nrn. 1–20, 22–29, 32–41, 43 und 44–169 (siehe folgendes Beispiel 2).
9 zeigt die 21 Peptidsequenzen (SEQ ID Nrn. 1–20 und 169), erzielt von Lysylendopeptidase- und Protease V8-Verdau von gereinigter Rinderhypophyse GGF-1.
In den 10A und 10B sind die Sequenzen der GGF-I Peptide aufgeführt, die für die Herstellung der degenerierten Oligonukleotidproben und degenerierten PCR-Primer verwendet wurden (SEQ ID Nrn. 1, 22–29 und 17). Einige von den Sequenzen in der 10A wurden auch für die Herstellung von synthetischen Peptiden verwendet. Die 10B zeigt die Sequenzen der Peptide, die zu kurz waren (weniger als 9 Aminosäuren) für die Erstellung der degenerierten Proben oder degenerierten PCR-Primer (SEQ ID Nrn. 19 und 32).
11 zeigt verschiedene Trypsinpeptidsequenzen und Lysylendopeptidase-C Peptidsequenzen, die abstammen von GGF-II, SEQ ID Nrn. 33–39, 164–166, 51 und 52.
In der 12 sind unter A die Sequenzen der GGF-II Peptide gezeigt, die verwendet wurden, um die degenerierten Oligonukleotidproben und die degenerierten PCR-Primer zu entwerfen (SEQ ID Nrn. 45–52). Einige der Sequenzen unter A wurden verwendet, um synthetische Peptide zu entwerfen. Unter B ist das Peptid gezeigt, das zu kurz war (weniger als 6 Aminosäuren), um degenerierte Proben oder degenerierte PCR-Primer (SEQ ID Nr. 53) zu entwerfen.
Die 13 bis 20 beziehen sich auf das Beispiel 3 und veranschaulichen die mitogenetische Aktivität der Faktoren gemäß der Erfindung.
13 ist ein Diagramm und zeigt den Vergleich der BrUdR ELISA und der [¹²⁵I]UdR Zählverfahren für die DNA-Syntheseanalyse in Schwann-Zellkulturen.
Die 14A und 14B sind Diagramme und zeigen die Br-UdR Immunoreaktivität mit der Zahl der Br-UdR markierten Zellen.
15 zeigt die mitogenetische Antwort von Schwann-Zellen des Ischiasnervs der Ratte auf GGFs.
16 ist ein Diagramm und zeigt die DNA-Synthese in Schwann-Zellen des Ischiasnervs der Ratte und in 3T3-Fibroplasten in Gegenwart von GGFs.
17 zeigt im Diagramm die mitogenetische Antwort von BHK 21 C13 Zellen auf FCS und GGFs.
18 zeigt im Diagramm das Überleben und die Vermehrung von BH 21 C13 Zellmikrokulturen nach 48 Stunden in Gegenwart von GGFs.
19 zeigt im Diagramm die mitogenetische Antwort von C6 Zellen auf FCS.
Die 20A und 20B zeigen im Diagramm die mitogenetische Antwort von C6 Zellen auf aFGF und GGFs.
Die 21 bis 28(a, b und c) beziehen sich auf das folgende Beispiel 4 und werden im Folgenden kurz dargestellt:
21 ist eine Liste von degenerierten Oligonukleotidproben (SEQ ID Nrn. 54–76, 78–88), entworfen von den Peptidsequenzen in der 10 unter A und der 12 unter A.
22 zeigt die mutmaßliche GGF-II Gensequenz vom Rind von dem rekombinanten genomischen Phagen GGF2BG1 (Rind), enthaltend die Bindungsstelle der degenerierten Oligonukleotidproben 609 und 650 (siehe die 21, SEQ ID Nrn. 69 und bzw. 72). Die Figur stellt den codierenden Strang der DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 89) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 169) im dritten Leserahmen dar. Die Sequenz von Peptid 12 vom Faktor 2 (Fett) ist Teil eines offenen Leserahmens von 66 Aminosäuren (Nukleotide 75272).
23 zeigt die degenerierten PCR-Primer (SEQ ID Nrn. 90–108) und die 23B zeigt die PCR-Primer (SEQ ID Nrn. 109–119), die in Experimenten verwendet wurden, um Segmente der GGF-II codierenden Sequenzen (Rind) zu isolieren, die in RNA von dem Hypophysenhinterlappen vorhanden sind.
24 zeigt die neun distinkten, benachbarten GGF-II cDNA-Strukturen und Sequenzen (Rind), die in PCR-Amplifikationsexperimenten erzielt wurden unter Verwendung der Primer der 12 unter A und B, und RNA von dem Hypophysenhinterlappen. Die obere Linie der Figur zeigt schematisch die codierenden Sequenzen, welche zu den cDNA-Strukturen beitragen, die charakterisiert wurden.
25 ist eine physikalische Karte des rekombinanten Phagen von GGF2BG1 (Rind). Das Rindfragment hat eine Länge von etwa 20 kb und enthält zwei Exons (Fett) des GGF-II Gens vom Rind. Die Restriktionsstellen für die Enzyme Xbal, SpeI, Ndel, EcoRI, Kpnl und SstI sind auf dieser physikalischen Karte angegeben. Die schraffierten Abschnitte entsprechen den Fragmenten, die für die Sequenzierung subkloniert wurden.
26 zeigt die schematische Struktur von drei alternativen Genprodukten des mutmaßlichen GGF-II Gens vom Rind. Die Exons sind von A bis E in der Reihenfolge ihrer Entdeckung gekennzeichnet. Die alternativen Spleißmuster 1, 2 und 3 erzeugen drei überlappende, abgeleitete Proteinstrukturen (GGF2BPP1, 2 und 3), die in den verschiedenen 28a b, c (unten beschrieben) angezeigt sind.
27 (SEQ ID Nrn. 120–132, 45, 52 und 53) ist ein Vergleich der GGF-I und der GGF-II Sequenzen, identifiziert in den abgeleiteten Proteinsequenzen, die in den 28A–28E gezeigt sind (siehe unten), mit den Peptidsequenzen, die in den 10 und 12 aufgeführt sind. Die Figur zeigt, dass sechs von neun GGF-II Peptidsequenzen in diesen abgeleiteten Proteinsequenzen berücksichtigt sind. Zwei Peptidsequenzen, die ähnlich zu den GGF-I Sequenzen sind, wurden auch gefunden.
28A zeigt die DNA-Sequenz des codierenden Stranges (SEQ ID Nr. 133) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 190) der cDNA, erzielt von dem Spleißmuster Nr. 1 in der 26. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rind GGF-II Gens codiert ein Protein von 206 Aminosäuren. Peptide in Fettdruck waren solche, die von den Listen der 10 und 12 identifiziert wurden. Potentielle Glykosilierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA) (SEQ ID Nr. 189).
Die 28B und 28C zeigen die DNA-Sequenz des codierenden Stranges (SEQ ID Nr. 134) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 191) der cDNA, erzielt aus dem Spleißmuster Nummer 2 der 26. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rind GGF-II Gens codiert für ein Protein von 281 Aminosäuren. Peptide im Fettdruck sind solche, die von den Listen der 10 und 12 identifiziert wurden. Potentielle Glykosilierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA) (SEQ ID Nr. 189).
Die 28D und 28E zeigen die DNA-Sequenz des codierenden Stranges (SEQ ID Nr. 135) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 193) der cDNA, erzielt aus dem Spleißmuster Nummer 3 in der 26. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rind GGF-II Gens codiert für ein Protein mit 257 Aminosäuren. Peptide im Fettdruck sind solche, die von den Listen der 10 und 12 identifiziert wurden. Potentielle Glykosilierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA) (SEQ ID Nr. 189).
29, die sich auf das folgende Beispiel 6 bezieht, ist ein Autoradiogramm einer Kreuzhybridisierungsanalyse der mutmaßlichen GGF-II Rindergensequenzen mit einer Reihe von Säugetier DNAs auf einem Southern Blot. Der Filter enthält Linien von mit EcoRI geschnittener DNA (5 μg pro Reihe) von den in der Figur aufgeführten Arten. Die Probe detektiert ein einzelnes starkes Band in jeder DNA-Probe, einschließlich eines vier Kilobasen Fragmentes in der Rind-DNA, wie dies durch die physikalische Mappe von 25 erwartet wurde. Banden mit relativ geringer Intensität wurden auch beobachtet und diese könnten verwandte DNA-Sequenzen darstellen. Das starke Hybridisierungsband von jeder der anderen Säugetier-DNA-Proben stellt vermutlich das GGF-II Homologe von diesen Arten dar.
30 ist ein Diagramm von beispielhaften Spleißvarianten. Die codierenden Segmente sind dargestellt durch F, E, B, A, G, C, C/D, C/D', D, D', H, K und L. Die Lokalisierung der Peptidsequenzen, die von dem gereinigten Protein abstammen, sind angezeigt durch „o".
Die 31A–R zeigen DNA-Sequenzen (SEQ ID Nrn. 42, 44, 77, 136–147, 160, 161, 163 und 173–210) und die vorhergesagten Peptidsequenzen der Codierungssegmente von GGF. Die Linie 1 zeigt die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von Rind-GGF, die Linie 2 zeigt die Nukleotidsequenzen von Rind-GGF, die Linie 3 zeigt die Nukleotidsequenzen von menschlichem GGF (Heregulin) (Nukleotidbasenübereinstimmungen sind mit einer vertikalen Linie angezeigt), und Linie 4 zeigt die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von menschlichen GGF/Heregulin, wo es von der vorhergesagten Rindsequenz abweicht. Die codierenden Segmente E, A' und K stellen nur die Rindsequenzen dar. Das codierende Segment D' stellt nur die menschliche (Heregulin) Sequenz dar.
Die 32A–B zeigen die vorhergesagte GGF2 Aminosäuresequenz und die Nukleotidsequenz von BPP5 (SEQ ID Nr. 195 und SEQ ID Nr. 148). Die obere Linie ist die Nukleotidsequenz und die untere Linie ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz.
Die 33A–B zeigen die vorhergesagte Aminosäuresequenz und die Nukleotidsequenz von GGF2BPP2 (SEQ ID Nr. 149 und SEQ ID Nr. 142). Die obere Linie ist die Nukleotidsequenz und die untere Linie ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz.
Die 34A–C zeigen die vorhergesagte Aminosäuresequenz und die Nukleotidsequenz von GGF2BPP4 (SEQ ID Nr. 194 und SEQ ID Nr. 150). Die obere Linie ist die Nukleotidsequenz und die untere Linie ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz.
35 (SEQ ID Nrn. 151–152) zeigt die Ausrichtung der zwei GGF Peptidsequenzen (GGF2bpp4 und GGF2bpp5) mit der menschlichen EGF (hEGF). Sternchen zeigen die Stellen der konservierten Cysteine an.
36 zeigt die Höhe der GGF-Aktivität (mitogenetischer Test mit Schwann-Zellen) und der Tyrosinphosphorilierung eines etwa 200 kD Proteins (Intensität einer 200 kD Bande auf einem Autoradiogramm eines Western Blots, entwickelt mit einem polyklonalen Antiphosphotyrosin-Antikörper) in Reaktion auf zunehmende Mengen an GGF.
Die 37A–B zeigen die Spleißvariante, die von den in der 31A–R gezeigten Sequenzen abstammen.
38 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz (unten; SEQ ID Nr. 220) und die Nukleinsäuresequenz (oben; SEQ ID Nr. 154) von EGFL1.
39 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz (unten; SEQ ID Nr. 221) und die Nukleinsäuresequenz (oben; SEQ ID Nr. 155) von EGFL2.
40 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz (unten; SEQ ID Nr. 222) und die Nukleinsäuresequenz (oben; SEQ ID Nr. 156) von EGFL3.
41 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz (unten; SEQ ID Nr. 223) und die Nukleinsäuresequenz (oben; SEQ ID Nr. 157) von EGFL4.
42 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz (unten; SEQ ID Nr. 224) und die Nukleinsäuresequenz (oben; SEQ ID Nr. 158) von EGFL5.
43 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz (unten; SEQ ID Nr. 225) und die Nukleinsäuresequenz (oben; SEQ ID Nr. 159) von EGFL6.
44 ist eine maßstabgerechte Mappe des codierenden Segmentes des Klons. T3 bezieht sich auf den verwendeten Bakteriophagen-Promotor zur Herstellung von mRNA von dem Klon. R = flankierende Stelle für das Restiktionsenzym EcoRI. 5' UT bezieht sich auf die 5' nicht-translatierte Region. E, B, A, C, C/D' und D beziehen sich auf die codierenden Segmente. 0 = Start der Translation. A = 5' Grenze der Region, die zu dem Rinder E-Segment homolog ist (siehe Beispiel 6) und 3' UT bezieht sich auf die 3' nicht-translatierte Region.
Die 45A–D zeigen die vorhergesagte Aminosäuresequenz (in der Mitte; SEQ ID Nr. 170) und die Nukleinsäuresequenz (oben; SEQ ID Nr. 21) von GGF2HBS5. Die untere (mit Unterbrechung) Sequenz stellt die Peptidsequenzen dar, die von den GGF-II Zubereitungen abstammen (siehe die 11, 12).
46 ist eine graphische Darstellung der mitogenetischen Aktivität von rekombinanten, menschlichen und vom Rind abstammenden Gliawachstumsfaktoren auf Schwann-Zellen.
47 ist eine Dosis-Effekt-Kurve und zeigt die Proliferationsaktivitätsdaten von Schwann-Zellen, die von der Verabreichung von Aliquots mit unterschiedlicher Größe von konditioniertem Medium von CHO-Zellen abstammen.
48 ist eine Dosis-Effekt-Kurve bei Schwann-Zellen und zeigt die mitogenetische Aktivität, die in das extrazelluläre Medium von SF9 Insektenzellen abgegeben wurde, welche mit Bacculovirus infiziert waren, die den GGF2HBS5 cDNA-Klon enthielten.
49 ist ein Western Blot des konditioniertem Mediums von rekombinanten CHO-Zellen unter Verwendung eines GGF Peptidantikörpers.
50(A) ist eine graphische Darstellung für Schwann-Zellen und zeigt die Proliferationsaktivität des rekombinanten (von COS-Zellen produzierten), menschlichen GGF-II (rhGGF-II) Peaks, der aus der Kationenaustauschersäule eluierte. (B) ist ein Immunoblot gegen den rekombinanten GGFII Peak unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers, der gegen das spezifische Peptid von rhGGFII gemacht wurde.
51(A) ist ein Diagramm und zeigt die Reinigung von rhGGF-II (von CHO-Zellen produziert) auf einer Kationenaustauschersäule mittels Fraktionierung. (B–C) sind Fotographien eines Western Blots, der unter Verwendung der Fraktionen von (A) und eines rhGGF-II spezifischen Antikörpers erstellt wurde.
52 ist die Fotographie eines Gels und veranschaulicht die Tyrosinphosphorilierung in Schwann-Zellen, die mit rekombinanten Gliawachstumsfaktoren behandelt wurden.
53 zeigt die Sequenzen der GGFHBS5-, GGFHFB1- und GGFBPP5-Polypeptide (SEQ ID Nrn. 170, 171 bzw. 172).
54 ist eine Karte des CHO-Zell-Expresionsvektors pcDHFRpolyA.
Die Erfindung bezieht sich auf die Isolierung und Reinigung von neuen Gliawachstumsfaktoren und auf die Klonierung von DNA-Sequenzen, welche für diese Faktoren codieren. Andere Komponenten der Erfindung sind verschiedene Genspleißvarianten, die potentiell eine Reihe von Gliawachtumsfaktoren codieren, insbesondere GGF2HBS5, insbesondere eine Variante, die für das menschliche Äquivalent von Rind GGF-II codiert. Es ist offensichtlich, dass das Gen, welches für die GGF's und p185^erbB2 Bindungsproteine codiert, eine Reihe von unterschiedlich großen, verschieden gespleißten RNA-Transkripte produziert, die zu einer Reihe von Proteinen führen, die eine unterschiedliche Länge besitzen und einige gemeinsame Peptidsequenzen und einige einzigartige Peptidsequenzen enthalten. Dies wird unterstützt durch unterschiedlich gespleißte Sequenzen, die gewonnen werden aus der RNA des Hypophysenhinterlappens vom Rind (wie hier dargestellt), menschlichem Brustkrebs (MDA-MB-231) (Holmes et al. Science 256: 1205 (1992) und RNA vom Hühnchengehirn (Falls et al. Cell 72: 1–20 (1993)). Eine weitere Unterstützung kommt von Proteinen mit einem breiten Größenbereich, die sowohl als Mitogene für Schwann-Zellen (wie hier offenbart) als auch als Liganden für den p185^erbB2 Rezeptor wirken (siehe unten).
Weitere Unterstützung für die Tatsache, dass die Gene, welche für GGF und p185^erbB2 codieren, homolog sind, kommt von einem Vergleich der Nukleotidsequenzen. Science, 256 (1992), 1205–1210, Holmes et al. zeigen die Reinigung eines 45 kD humanen Proteins (Heregulin-α), das spezifisch interagiert mit dem Rezeptorprotein p185^erbB2, welches mit verschiedenen menschlichen Bösartigkeiten verbunden ist. Mehrere komplementäre DNA-Klone, die für Heregulin-α codieren, wurden isoliert. Peles et al. (Cell 69: 205 (1992)) und Wen et al (Cell 69: 559 (1992)) beschreiben eine komplementäre DNA, die aus Rattenzellen isoliert wurde und für ein Protein codiert, das „neu differentiation factor" (NDF) genannt wurde. Das Translationsprodukt von der NDF cDNA hat eine p185^erbB2 Bindungsaktivität. Usdin und Fischbach, J. Cell. Biol. 103: 493–507 (1986); Falls et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55: 397–406 (1990); Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7664–7668 (1991) und Falls et al., Cell 72: 801–815 (1993) zeigen die Reinigung eines 42 kD Glycoproteins, das mit einem Rezeptorprotein p185^erbB2 interagiert und verschiedene komplementäre cDNA-Klone wurden isoliert (Falls et al., Cell 72: 801–815 (1993). Verschiedene andere Gruppen haben die Reinigung von Proteinen mit verschiedenen Molekulargewichten mit p185^erbB2 Bindungsaktivität berichtet. Diese Gruppen umfassen Lupu et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2287; Yarden und Peles (1991), Biochemistry 30: 3543; Lupu et al. (1990), Science 249: 1552; Dobashi et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1536, und Huang et al. (1992), J. Biol. Chem. 257: 11508–11512.
Andere Ausführungsformen:
Die Erfindung umfasst jedes Protein, welches im Wesentlichen homolog zu den Codierungssegmenten der 31 (wie im folgenden definiert) sowie zu anderen, natürlich vorkommenden GGF-Polypeptiden ist. Auch umfasst sind allelische Variationen, natürliche Mutanten, induzierte Mutanten, Proteine, die von DNA codiert werden, die unter hoch oder niedrig stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure hybridisieren, die natürlich vorkommt (für Definitionen einer hohen und niedrigen Stringens, siehe Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1–6.3.6), und Polypeptide oder Proteine, die spezifisch durch Antiseren an GGF-Polypeptid binden. Der Ausdruck umfasst auch chimäre Polypeptide, welche die GGF-Polypeptide umfassen, welche die Sequenzen der 31 umfassen.
Die folgenden Beispiele sollen nicht die Erfindung begrenzen, sondern sollen die Erfindung erläutern und eine spezifische Anleitung für wirksame Präparationstechniken bereitstellen.
Wie bei dem folgenden Beispiel 3 zu erkennen sein wird, zeigen die vorliegenden Faktoren eine mitogenetische Aktivität für eine Reihe von Zelltypen. Die Aktivität in Bezug auf Fibroplasten zeigt eine Wundreparaturfähigkeit an und die Erfindung umfasst diese Verwendung. Die allgemeinen Aussagen zu der Erfindung in Bezug auf Formulierungen und/oder Medikamente und ihre Herstellung sollen deutlich geeignete Produkte und Verwendungen umfassen. Dies ist klar eine angemessene Erwartung für die vorliegende Erfindung unter Betracht von Berichten von ähnlichen Aktivitäten für Fibroplastwachstumsfaktoren (FGFs). Es kann zum Beispiel verwiesen werden auf Sporn et al., „Peptide Growth Factors and their Receptors I", Seite 396 (Baird und Bohlen) in dem Abschnitt mit der Überschrift „FGFs in Wound Heating and Tissue Repair".
Beispiel 1
Reinigung von GGF-I und GGF-II aus Rinderhypophysenhinterlappen
I. Herstellung der Faktor-CM Fraktion
4.000 gefrorene ganze Rinderhypophysenhinterlappen (ca. 12 Kilo) wurden über Nacht aufgetaut, kurz mit Wasser gewaschen und dann mit einem gleichen Volumen von 0,15 M Ammoniumsulfat in Chargen in einem Waring-Mischer homogenisiert. Das Homogenat wurde mit 1,0 M HCl auf einen pH von 4,5 eingestellt und bei 4.900 g für 80 Minuten zentrifugiert. Jegliches fettiges Material in dem Überstand wurde durch eine Passage durch Glaswolle entfernt. Nach Einstellung des pH's des Überstandes auf 6,5 unter Verwendung von 1,0 M NaOH wurde festes Ammoniumsulfat zugegeben, um eine 36% gesättigte Lösung zu erzielen. Es wurde mehrere Stunden gerührt und die Suspension wurde dann bei 4.900 g für 80 Minuten zentrifugiert und der Niederschlag wurde verworfen. Nach Filtration durch Glaswolle wurde weiteres festes Ammoniumsulfat dem Überstand zugegeben, um eine 75% gesättigte Lösung zu erzielen, die dann einmal bei 4.900 g für 80 Minuten zentrifugiert wurde, nachdem zuvor mehrere Stunden gerührt wurde. Das Pellet wurde in ca. 2 L von 0,1 M Natriumphosphat, pH 6, 0, resuspendiert und gegen 3 × 40 L des gleichen Puffers dialysiert. Nach Bestätigung, dass die Leitfähigkeit des Dialysats unterhalb von 20,0 μSiemens lag, wurde das Dialysat auf eine Bioprocess-Säule geladen (120 × 113 mm, Pharmacia), die mit einer Fließrate von 2 ml pro Minute mit Carboxymethylcellulose (CM-52, Whatman) bepackt worden war. Die Säule wurde mit 2 Volumen 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0, gewaschen und anschließend mit 2 Volumen von 50 mM NaCl und abschließend mit 2 Volumen von 0,2 M NaCl, beides im gleichen Puffer. Während des abschließendes Schrittes wurden 10 ml (5 Minuten) Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 73 bis 118 wurden zusammengegeben, gegen 10 Volumen von 10 mM Natriumphosphat, pH 6,0, zweimal dialysiert und durch Zentrifugation bei 100.000 g für 60 Minuten geklärt.
II. Hydroxylapatit-HPLC
Hydroxylapaptit-HPLC war bisher keine Technik, die bei der Isolierung von Gliawachstumsfaktoren verwendet wurde. Bei der vorliegenden Erfindung hat sie sich jedoch als besonders effizient herausgestellt. Das von der obigen CM-Cellutosechromatographie erzielte Material wurde durch einen 0,22 μm Filter (Nalgene) filtriert, bei Raumtemperatur auf eine Hochleistungshydroxylapatit-Säule (50 × 50 mm, Biorad) geladen, die mit einer Vorsäule (15 × 25 mm, Biorad) ausgerüstet und mit 10 mM Kaliumphosphat, pH 6,0, äquilibriert wurde. Die Elution bei Raumtemperatur wurde mit einer Fließrate von 2 ml pro Minute unter Verwendung des folgenden, programmierten, linearen Gradienten durchgeführt:

Zeit (Min) %B

0,0 0

5,0 0

7,0 20

70,0 20

150,0 100

180,0 100

185,0 0

Lösungsmittel A: 10 mM Kaliumphosphat, pH 6,0
Lösungsmittel B: 1,0 M Kaliumphosphat, pH 6,0

6,0 ml (3 Minuten) Fraktionen wurden während der Gradientenelution gesammelt. Die Fraktionen 39–45 wurden zusammengefasst und gegen 10 Volumen von 50 mM Natriumphosphat, pH 6,0, dialysiert.
III. Mono S FPLC
Mono S FPLC ermöglicht ein stärker konzentrierteres Material für die nachfolgende Gelfiltration herzustellen.
Jedes partikuläre Material in dem zusammengefassten Material aus der Hydroxylapatitsäule wurde durch Klärzentrifugation bei 100.000 g für 60 Minuten entfernt vor der Beladung auf eine präparative HR10/10 Mono S Kationenaustauschersäule (100 × 10 mm, Pharmacia), die dann wieder äquilibriert wurde auf 50 mM Natriumphosphat, pH 6,0, bei Raumtemperatur mit einer Fließrate von 1,0 ml/Minute. Unter diesen Bedingungen wurde gebundenes Protein unter Verwendung des folgenden progammierten linearen Gradienten eluiert:

Zeit (Min) %B

0,0 0

70,0 30

240,0 100

250,0 100

260,0 0

Lösungsmittel A: 50 mM Kaliumphosphat, pH 6,0
Lösungsmittel B: 1,2 M Natriumchlorid, 50 mm Natriumphosphat, pH 6,0

1 ml (1 Minute) Fraktionen wurden während diesem Gradientenprogramm gesammelt. Die Fraktionen 99 bis 115 wurden zusammengefasst.
IV. Gelfiltration FPLC
Mit diesem Schritt beginnt die Trennung der zwei Faktoren gemäß der Erfindung vor der abschließenden Reinigung und liefert angereicherte Fraktionen.
Für die Zwecke von diesem Schritt wurde eine präparative Superose 12 FPLC-Säule (510 × 20 mm, Pharmacia) gemäß den Anleitungen des Herstellers gepackt. Um diese Säule zu standardisieren, wurde eine Messung der theoretischen Trennstufen gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt und es ergab sich ein Wert von 9.700 theoretischen Trennstufen.
Das zusammengefasste Material von dem Mono S eluiertem Material wurde bei Raumtemperatur in 2,5 ml Aliquots auf dieser Säule in 50 mM Natriumphosphat, 0,75 NaCl, pH 6,0 aufgebracht (zuvor durch eine C18 Umkehrphasensäule (Sep-pak, Millipore) passiert) bei einer Fließrate von 1,0 ml/Minute. 1 ml (0,5 Minuten) Fraktionen wurden nach 35 Minuten, nachdem jede Probe auf die Säule aufgetragen worden war, gesammelt. Die Fraktionen 27 bis 41 (GGF-II) und 42 bis 57 (GGF-I) wurden bei jedem Lauf zusammengefasst.
V. HPLC mit umgekehrten Phasen
Die GGF-I und GGF-II Pools von den obigen Superose 12 Läufen wurden jeweils in drei gleiche Aliquots aufgeteilt. Jedes Aliquot wurde auf eine C8 Umkehrphasensäule (Aquapore RP-300 7 μ C8 220 × 4,6 mm, Applied Biosystems) gebracht, geschützt durch eine Vorpatrone (RP-8, 15 × 3,2 mm, Applied Biosystems) und äquilibriert auf 40°C mit 0,5 ml pro Minute. Das Protein wurde unter diesen Bedingungen und unter Verwendung des folgenden, programmierten, linearen Gradienten eluiert:

Zeit (Min) %B

0

60 66,6

62,0 100

72,0 100

75,0 0

Lösungsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
Lösungsmittel B: 90% Acetonitril, 0,1% TFA

200 μl (0,4 Minuten) Fraktionen wurden in silikonisierte Röhrchen (aus „Multilube tubes", Bioquote) von 15,2 Minuten nach Beginn des programmierten Gradienten gesammelt.
VI. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Bei diesem Schritt wurden Proteinmolekulargewichtsstandards, niedriger Bereich, Katalog Nr. 161-0304, von Bio-Rad Laboratories Limited, Watford, England, verwendet. Die tatsächlich verwendeten Proteine und ihre Molekulargewichtsstandards wurden zuvor schon angegeben.
Die Fraktionen 47 bis 53 (GGF-I) und die Fraktionen 61 bis 67 (GGF-II) von den Umkehrphasenläufen wurden individuell zusammengefasst. 7 μl des zusammengefassten Materials wurden in einem gleichen Volumen von 0,0125 M Tris Cl, 4% SDS, 20% Glycerin und 10% β-Mercaptoethanol für GGF-I für 5 Minuten gekocht und auf ein 11% Polyacrylamid-Laemmli-Gel mit einem 4% Stacking-Gel geladen, und der Lauf erfolgte bei einer konstanten Spannung von 50 V für 16 Stunden. Dieses Gel wurde dann fixiert und gefärbt unter Verwendung eines Silberfärbekits (Amersham). Unter diesen Bedingungen wurden die Faktoren jeweils als eine etwas diffuse Bande bei relativen Molekulargewichten von 30.000 bis 36.000 Daltons (GGF-I) sowie bei 55.000 bis 63.000 Daltons (GGF-II) gemäß der Definition durch die Molekulargewichtsmarker erkannt. Aus der Gelfärbung war abzuleiten, dass es noch eine kleine Zahl an anderen Proteinspezies mit äquivalenten Mengen zu den GGF-I und GGF-II Spezies in dem aus den Umkehrphasenläufen zusammengefassten Material gab.
VII. Stabilität in Trifluoressigsäure
Die Stabilitätsdaten wurden für die vorliegenden Faktoren in Gegenwart von Trifluoressigsäure wie folgt erzielt:
GGF-I: Das Material von der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen wurde in Gegenwart von 0,1% TFA und Acetonitril innerhalb von 12 Stunden nach Fertigstellung des Säulenlaufs und dann nach 10-wöchiger Inkubation bei 40°C überprüft. Nach der Inkubation hatte GGF-I wenigstens 50% der Aktivität des Materials, welches direkt nach der Säule getestet wurde.
GGF-II: Das Material von der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen wurde in Gegenwart von 0,1% TFA und Acetonitril, und gelagert bei –20°C, nach dem Auftauen und dann nach 4-tägiger Inkubation bei 40°C getestet. Nach der Inkubation zeigte GGF-II wenigstens 50% der Aktivität des Materials, welches frisch aufgetaut worden war.
Es ist klar, dass die bei den obigen Studien verwendete Trifluoressigsäurekonzentration die am meisten verwendete für die Umkehrphasenchromatographie ist.
VIII. Bedingungen für den Aktivitätstest
Soweit nichts anderes angegeben ist, wurden alle Schritte bei 37°C und unter Verweis auf die 1 bis 6 wurde die Aktivität bei jeder Stufe gemäß den Brockes (Meth. Enz., siehe oben)-Techniken mit den folgenden Modifikationen bestimmt. Bei der Präparation der Schwann-Zellen wurde 5 μM Forskolin zusätzlich zu der Zugabe von DMEM (Sulbecco's modifiziertes Eagle's Medium), FCS und GGF zugesetzt. Die bei dem Test verwendeten Zellen waren fibroplastenfreie Schwann-Zellen mit einer Passagezahl von weniger als 10. Diese Zellen wurden aus den Flaschen mit Trypsin entfernt und in Platten mit einem flachen Boden und mit 96 Vertiefungen angeordnet zu 3,3 tausend Zellen pro Mikrovertiefung.
[¹²⁵I]ludR wurde für die abschließenden 24 Stunden nach der Testlösungszugabe zugesetzt. Die (nicht stimulierte) Hintergrundeinlagerung bei jedem Test betrug weniger als 100 cpm und die maximale Einlagerung war 20- bis 200-fach über diesem Hintergrund in Abhängigkeit von der Schwann-Zellcharge und der Passagezahl.
Im Falle der GGF-I und GGF-II Fraktionen von der oben beschriebenen Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen wurden zwei Dosis-Effekt-Kurven für jeden Faktor erstellt, wobei exakt das gleiche Verfahren für jede Kurve und für jeden Faktor verwendet wurde. Das obige Verfahren wurde bei dem Testaufbau nur durch Substitution des fötalen Kalbplasmas für fötales Kalbsserum modifiziert, um die andere Kurve für jeden Faktor zu erzielen. Die Ergebnisse sind in den 7 und 8 dargestellt.
Beispiel 2
Aminosäuresequenzen der gereinigten GGF-I und GGF-II
Die Studien für die Analyse der Aminosäuresequenz wurden durchgeführt unter Verwendung von hoch gereinigtem Rinderhypophysen GGF-I und GGF-II. Der konventionelle Einbuchstabencode wurde verwendet, um die Sequenzen darzustellen. Die Peptide wurden durch Lysylendopeptidase- und Protease V8-Verdau erzielt, durchgeführt mit reduzierten und carboxymethylierten Proben, wobei der Lysylendopeptidase-Verdau von GGF-II mit Material durchgeführt wurde, das von der 55–65 RD Region eines 11% SDS-PAGE eluiert wurde (Molekulargewicht relativ zu den oben angegebenen Markern).
Insgesamt wurden 21 Peptidsequenzen (siehe 9, SEQ ID Nrn. 1–20, 169) für GGF-I erzielt, von denen 12 Peptide (siehe 10, SEQ ID Nrn. 1, 22–29, 17, 19 und 32) nicht in den gegenwärtigen Proteindatenbanken vorhanden sind und somit einmalige Sequenzen darstellen. Insgesamt 12 Peptidsequenzen (siehe 11, SEQ ID Nrn. 33–39, 51, 52 und 164–166) wurden für GGF-II erzielt, wobei davon 10 Peptide (12, SEQ ID Nrn. 45–53) in den gegenwärtigen Proteindatenbanken nicht vorhanden sind und somit einmalige Sequenzen darstellen (eine Ausnahme ist das Peptid GGF-II 06, das identische Sequenzen in vielen Proteinen zeigt, die wahrscheinlich keine Bedeutung unter Anbetracht der kleinen Zahl an Resten besitzen). Die neuen Sequenzen entsprechen höchstwahrscheinlich den Abschnitten von wirklichen Aminosäuresequenzen von GGFs I und II.
Besondere Aufmerksamkeit sei auf die Sequenzen GGF-I 07 und GGF-II 12 gerichtet, die sehr stark miteinander verwandt sind. Diese Ähnlichkeiten deuten an, dass die Sequenzen von diesen Peptiden fast sicher diejenigen der zugeordneten GGF-Spezies sind, wobei es sehr unwahrscheinlich ist, dass sie von kontaminierenden Proteinen abstammen.
In dem Peptid GGF-II 02 ist die Sequenz X S S konsistent mit der Gegenwart einer N-verbundenen Kohlenhydratgruppe auf einem Asparagin bei der als X bezeichneten Position.
In den 9 und 11 stellt X im Allgemeinen einen unbekannten Rest dar und kennzeichnet einen Sequenzzyklus, wo eine einzelne Position nicht mit Sicherheit benannt werden konnte, weil entweder mehr als ein Signal von gleicher Größe in dem Zyklus vorlag oder weil kein Signal vorhanden war. Mit Sternchen sind solche Peptide gekennzeichnet, wo die zuletzt genannte Aminosäure der letzten Aminosäure entspricht, die in diesem Peptid vorhanden ist. In den restlichen Peptiden war die Signalstärke nach der zuletzt genannten Aminosäure nicht ausreichend, um die Sequenzbenennung bis zum Ende von diesem Peptid weiterzuführen. Die Säule zur rechten Hand zeigt die Ergebnisse einer Computerdatenbankrecherche unter Verwendung der GCG FASTA und TFASTA Paketprogramme, um die NBRF- und EMBL-Sequenzdatenbanken zu analysieren. Der Name eines Proteins in dieser Säule bezeichnet die Identität eines Teils von seiner Sequenz mit der Peptidaminosäuresequenz, wobei maximal zwei Fehlanpassungen erlaubt waren. Die verwendeten Abkürzungen sind die folgenden:

HMG-1 Hochmobilitätsgruppe Protein-1

HMG-2 Hochmobilitätsgruppe Protein-2

LH-alpha Alpha-Untereinheit des luteinisierenden Hormons

LH-beta Beta-Untereinheit des luteinisierenden Hormons
Beispiel 3
Mitogenetische Aktivität von gereinigtem GGF-I und GGF-II
Die mitogenetische Aktivität von hochgereinigten Proben, die GGFs I und II enthielten, wurden unter Verwendung einer quantitativen Methode studiert, die es ermöglicht, dass eine einzelne Mikrokultur hinsichtlich der DNA-Synthese, der Zellmorphologie, der Zellzahl und der Expression der Zellantigene getestet wird. Diese Technik wurde modifiziert von einem Verfahren, das zuvor berichtet wurde von Muir et al., Analytical Biochemistry 185, 377–382, 1990. Die Hauptmodifikationen waren: 1) die Verwendung von nicht-beschichteten Mikrotiterplatten, 2) die Zellzahl pro Vertiefung, 3) die Verwendung von 5% fötalem Rinderplasma (FBP) anstelle von 10% fötalem Kalbsserum (FCS), und 4) die Zeit der Inkubation in Gegenwart des Mitogens und Bromdeoxyuridin (BrdU), die simultan den Kulturen zugesetzt wurden. Ferner wurde die Zellmonoschicht vor der Fixierung nicht gewaschen, um einen Verlust an Zellen zu vermeiden. Die Inkubationszeit des monoklonalen Maus Anti-BrdU Antikörpers und des Peroxidase-konjugierten Ziege Anti-Maus Immunoglobulin (IgG) Antikörpers wurden verdoppelt, um die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen. Der Test, der für Schwann-Zellen des Schiasnervs der Ratte optimiert war, wurde auch für verschiedene Zelllinien nach geeigneter Modifikation der Zellkulturbedingungen verwendet.
I. Verfahren der Mitogenesetestung
Am Tag 1 wurden gereinigte Schwann-Zellen auf nicht-beschichtete Platten mit 96 Vertiefungen in 5% FBP/Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (5.000 Zellen/Vertiefung) aufgetragen. Am Tag 2 wurden GGFs und andere Testfaktoren den Kulturen zugegeben, sowie BrdU mit einer Endkonzentration von 10 μm. Nach 48 Stunden (Tag 4) wurde die BrdU-Einlagerung durch Absaugen des Mediums beendet und die Zellen wurden mit 200 μl/Vertiefung von 70% Ethanol für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden dann mit Wasser gewaschen und die DNA wurde durch Inkubation mit 100 μl 2 N HCl für 10 Minuten bei 37°C denaturiert. Nach Absaugung wurde die Restsäure durch Füllen der Vertiefungen mit 0,1 M Boratpuffer, pH 9,0, neutralisiert und die Zellen wurden mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 50 μl Blockpuffer (PBS, 0,1% Triton × 100 und 2% normales Ziegenserum enthaltend) für 15 Minuten bei 37°C behandelt. Nach Absaugung wurde der monoklonale Maus Anti-BrdU Antikörper (Dako Corp., Santa Barabara, CA) (50 μl/Vertiefung; 1,4 μg/ml, verdünnt in Blockpuffer) zugegeben und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nicht gebundene Antikörper wurden durch drei Waschungen in PBS entfernt. Mit Peroxidase konjugierter Ziege Anti-Maus IgG Antikörper (Dako Corp., Santa Barbara, CA) (50 μl/Vertiefung; 2 μg/ml, verdünnt in Blockpuffer) wurde zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS/Triton und einer abschließenden Spülung in PBS wurden 100 μl/Vertiefung von 50 mM Phosphat/Citrat-Puffer, pH 5,0, in die Vertiefungen gegeben, wobei der Puffer 0,05% an löslichem Chromogen o-Phenylendiamin (OPD) und 0,02% H₂O₂ enthielt. Die Reaktion wurde nach 5–20 Minuten bei Raumtemperatur durch Pipettieren von 80 μl von jeder Vertiefung zu einer sauberen Platte beendet, die 40 μl/Vertiefung an 2 N Schwefelsäure enthielt. Die Extinktion wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Plattenlesers (Dynatech Labs) bestimmt. Die Testplatten, welche die Zellmonoschichten enthielten, wurden zweimal mit PBS gewaschen und immunozytochemisch gefärbt für BrdU-DNA, indem 100 μl/Vertiefung des Substrates Diaminobenzidin (DAB) und 0,02% H₂O₂ hinzugegeben wurde, um ein nicht lösliches Produkt zu bilden. Nach 10–20 Minuten wurde die Farbreaktion durch Waschen mit Wasser gewaschen und die BrdU-positiven Kerne wurden unter Verwendung eines Umkehrmikroskops beobachtet und gezählt. Gelegentlich wurden negative Kerne mit 0,001% Toluidinblau gegengefärbt und wie oben gezählt.
II. Zelllinien, die für die Mitogenesetests verwendet wurden
Swiss 3T3 Fibroplasten: Zellen von Flow Labs wurden in DMEM, ergänzt mit 10% FCS, Penicillin und Streptomycin bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 10% CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden gefüttert oder alle zwei Tage subkultiviert. Für den mitogenetischen Test wurden die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen/Vertiefung in Komplettmedium gegeben und für 1 Woche inkubiert, bis die Zellen zusammenfließend und ruhig waren. Das Medium enthaltende Serum wurde entfernt und die Zellmonoschicht wurde zweimal mit Serum freiem Medium gewaschen. 100 μl von Serum freiem Medium, das die Mitogene und 10 μM an BrdU enthielt, wurden zu jeder Vertiefung gegeben und für 48 Stunden inkubiert. Die Dosisreaktionen auf GGFs und Serum oder PDGF (als eine positive Kontrolle) wurden aufgenommen.
BHK (Babyhamsternieren) 21 C13 Fibroplasten: Die Zellen von European Coltection of Animal Cell Cultures (ECACC), wurden gehalten in Glasgow Modified Eagle Medium (GMEM), das mit 5% Tryptosephosphatnährtösung, 5% FCS, Penicillin und Streptomycin ergänzt war. Die Zellen wurden bei 37°C in feuchter Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden gefüttert oder alle 2 bis 3 Tage subkultiviert. Für den mitogenetischen Test wurden die Zellen mit einer Dichte von 2.000 Zellen/Vertiefung in einem Komplettmedium für 24 Stunden angeordnet. Das Serum enthaltende Medium wurde dann entfernt und es wurde mit Serum freiem Medium gewaschen und ersetzt mit 100 μl von 0,1% FCS, das GMEM enthielt, oder GMEM alleine. GGFs und FCS oder bFGF als positive Kontrollen wurden zugegeben, zusammen mit 10 μM BrdU, und für 48 Stunden inkubiert. Die Zellkulturen wurden dann verarbeitet, wie oben für die Schwann-Zellen beschrieben.
C6 Ratten Glioma-Zelllinie: Zellen, die bei der Passage 39 erzielt wurden, wurden in DMEM, das 5% FCS, 5% Pferdeserum (HS), Penicillin und Streptomycin enthielt, bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 10% CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden gefüttert oder alle 3 Tage subkultiviert. Für den mitogenetischen Test wurden die Platten mit einer Dichte von 2.000 Zellen/Vertiefung in einem Komplettmedium angeordnet und für 24 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium nach Waschung in Serum freiem Medium ersetzt durch einer Mischung von 1 : 1 DMEM und F12 Medium, das 0,1% FCS enthielt. Die Dosisreaktionen auf GGFs, FCS und αFGF wurden dann durchgeführt und die Zellen wurden mittels ELISA verarbeitet, wie dies zuvor für die anderen Zelltypen beschrieben worden war.
PC12 (Rattennebennieren-Pheochromocytomazellen): Zellen von ECACC wurden in RPMI 1640, ergänzt mit 10% HS, 5% FCS, Penicillin und Streptomycin, in Kollagen beschichteten Flaschen bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 5 CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden gefüttert alte 3 Tage durch Ersatz von 80% des Mediums. Für den mitogenetischen Test wurden die Zellen mit einer Dichte von 3.000 Zellen/Vertiefung in Komplettmedium auf Kollagen beschichteten Platten angeordnet (50 μl/Vertiefung Kollagen, Vitrogen Collagen Corp., verdünnt 1 : 50, 30 Minuten bei 37°C) und für 24 Stunden inkubiert. Das Medium wurde dann ersetzt durch frisches RPMI, entweder alleine oder 1 mM Insulin oder 1% FCS enthaltend. Dosisreaktionen auf FCS/HS (1 : 2) als positive Kontrolle und auf GGFs wurden wie oben durchgeführt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen fixiert und ELISA wurde, wie oben beschrieben, durchgeführt.
III. Ergebnisse der mitogenetischen Tests
Alle Experimente in diesem Beispiel wurden unter Verwendung einer hoch gereinigten Probe aus dem Sepharose 12 Chromatographiereinigungsschritt (siehe Beispiel 1, Abschnitt D), die eine Mischung von GGF-I und GGF-II (GGFs) enthielt, durchgeführt.
Zunächst wurden die Ergebnisse, die mit dem BrdU Einlagerungstest erzielt wurden, mit dem klassischen mitogenetischen Test für Schwann-Zellen verglichen, der basiert auf einer [125] I-UdR Einlagerung in DNA von sich teilenden Zellen, wie dies beschrieben ist von J. P. Brockes (Methods Enzymol. 147: 217, 1987).
13 zeigt den Vergleich der mit den beiden Tests erzielten Daten, wobei die gleichen Zellkulturbedingungen (5.000 Zellen/Vertiefung in 5% FBP/DMEM; inkubiert in Gegenwart von GGFs für 48 Stunden) angelegt wurden. Wie deutlich zu erkennen ist, sind die Ergebnisse vergleichbar, wobei der BrdU-Einlagerungstest etwas mehr empfindlich erscheint, wie dies durch die Verlagerung der Kurve zur linken Seite der graphischen Darstellung erscheint, das heißt, zu niedrigeren Konzentrationen von GGFs.
Wie unter dem Abschnitt „Verfahren für die Mitogenesetestung" beschrieben, können die Originaltestplatten, welche die Zellmonoschichten enthalten, die zweite Reaktion durchführen, was zu dem unlöslichen DAB-Produkt führt, welches die BrdU positiven Kerne erbt, nachdem die immunoreaktive BrdU-DNA durch Lesen der Intensität des löslichen Produktes der OPD Peroxidasereaktion quantifiziert worden ist. Die Mikrokulturen können dann unter einem Umkehrmikroskop überprüft werden und die Zellmorphologie und die Zahl der BrdU positiven und der negativen Kerne können beobachtet werden.
In der 14a und in der 14b ist die BrdU-DNA Immunoreaktivität, die durch Ablesen der Extinktion bei 490 nm bestimmt wurde, verglichen mit der Zahl der BrdU positiven Kerne und mit dem Prozentsatz der BrdU positiven Kerne hinsichtlich der Gesamtzahl der Zellen pro Vertiefung, was in den gleichen Kulturen gezählt wurde. Die Standardabweichungen waren weniger als 10%. Die zwei Prüfverfahren zeigen eine gute Korrelation und die Diskrepanz zwischen den Werten bei der höchsten Dosis der GGFs kann durch das unterschiedliche Maß der DNA-Synthese in den Zellen, die als BrdU positiv detektiert wurden, erklärt werden.
Der BrdU Einlagerungstest kann somit nützliche zusätzliche Information über die biologische Aktivität der Polypeptide auf die Schwann-Zellen bereitstellen, wenn der Test mit dem (125) I-UdR Einlagerungstest verglichen wird. Die in der 15 dargestellten Daten zeigen, dass GGFs auf die Schwann-Zellen wirken kann, um die DNA-Synthese zu induzieren, wobei aber bei niedrigeren Dosen die Zahl der negativen Zellen, die in der Mikrokultur nach 48 Stunden vorhanden sind, zunimmt.
Der Test wurde dann auf verschiedene Zelllinien von unterschiedlichem Ursprung angewandt. In der 16 sind die mitogenetischen Reaktionen der Schwann-Zellen und der Swiss 3T3 Fibroplasten auf GGFs verglichen. Trotz der schwachen Antwort bei den 3T3 Fibroplasten wurden in diesen Kulturen einige deutliche BrdU positive Kerne nachgewiesen. Kontrollkulturen liefen parallel in Gegenwart von unterschiedlichen Dosierungen von FCS oder menschlichem rekombinanten PDGF, was anzeigt, dass die Zellen in der Lage waren, auf geeignete Anreize zu reagieren (nicht gezeigt).
Die Fähigkeit der Fibroplasten zur Reaktion auf GGFs wurde ferner untersucht unter Verwendung der BHK 21 C13 Zelllinie. Diese Fibroplasten, die von der Niere abstammten, zeigten keine Kontakthemmung und erreichten ein Ruhestadium, wenn sie zusammen geflossen waren. Deshalb wurden die experimentellen Bedingungen so gewählt, dass eine sehr geringe Hintergrundproliferation vorhanden war, ohne dass die Zellvitalität beeinträchtigt wurde. GGFs besitzen eine signifikante mitogenetische Aktivität auf die BHK 21 C13 Zellen, wie dies in den 17 und 18 dargestellt ist. Die 17 zeigt die BrdU Einlagerung in die DNA durch BHK 21 C13 Zellen, welche durch GGFs in Gegenwart von 0,1% FCS stimuliert war.
Die gute mitogenetische Reaktion auf FCS zeigt, dass die Zellkulturbedingungen nicht limitierend waren. In der 18 ist der mitogenetische Effekt von GGFs als Zahl der BrdU positiven Zellen und der BrdU negativen Zellen und als die Gesamtzahl der Zellen, die pro Vertiefung gezählt wurden, ausgedrückt. Die Daten sind repräsentativ für zwei experimentelle Läufe in zweifacher Ausfertigung, wobei wenigstens drei Felder pro Vertiefung gezählt wurden. Wie bei Schwann-Zellen beobachtet, führt GGFs zusätzlich zu einem proliferativen Effekt bei niedrigen Dosen auch zu einer Erhöhung der Zahl der überlebenden Zellen, die nicht reagieren. Der Prozentsatz der BrdU positiven Zellen ist proportional zu der Zugabemenge von GGFs, das den Kulturen zugesetzt wurde. Die Gesamtzahl der Zellen nach 48 Stunden in Gegenwart von höheren Dosen von GGFs ist wenigstens verdoppelt, was bestätigt, dass GGFs die DNA-Synthese und die Proliferation in den BHK 21 C13 Zellen induziert. Unter den gleichen Bedingungen zeigten Zellen, die für 48 Stunden in Gegenwart von 2% FCS gehalten wurden, eine Zunahme um das 6-fache (nicht gezeigt).
C6 Gliomazellen sind ein nützliches Modell zum Studium der Eigenschaften von Gliazellen. Der exprimierte Phenotyp scheint abhängig von der Zellpassage zu sein. Zu einem frühen Stadium ähneln die Zellen mehr dem Astrozytenphänotyp, während ein Oligodentrozytenphänotyp zu späteren Stadien auftritt (jenseits von Passage 70). C6 Zellen, die bei diesen Experimenten verwendet wurden, stammten von der Passage 39 bis Passage 52. C6 Zellen sind eine hoch proliferierende Population, so dass die experimentellen Bedingungen so optimiert wurden, dass nur ein sehr geringer Hintergrund an BrdU Einbau auftrat. Die Gegenwart von 0,1% Serum war notwendig, um die Zellvitalität zu erhalten, ohne dass dies signifikant die mitogenetischen Reaktionen beeinflusste, wie dies durch die Dosisreaktion auf FCS (19) dargestellt ist.
In der 20 sind die mitogenetischen Reaktionen auf aFGF (saurer Fibroplastenwachstumsfaktor) und auf GGFs als Prozentsätze des maximalen BrdU Einbaus dargestellt, der in Gegenwart von FCS (8%) erzielt wurde. Die Werte sind Durchschnittswerte von zwei Experimenten in zweifacher Ausfertigung. Die Wirkung der GGFs war vergleichbar mit der einer reinen Zubereitung von aFGF. AFGF wurde als ein spezifischer Wachstumsfaktor für C6 Zellen beschrieben (Lim R. et al., Cell Regulation 1: 741–746, 1990) und deshalb wurden sie als positive Kontrolle hier verwendet. Das direkte Zählen der BrdU positiven und negativen Zellen war nicht möglich, da in den Mikrokulturen eine hohe Zelldichte vorlag. Im Gegensatz zu den bisher berichteten Zelllinien zeigten PC12 Zellen keine deutliche Reaktion auf GGFs, wenn sie unter Kulturbedingungen behandelt wurden, bei denen PC12 auf Seren reagieren kann (Mischung von FCS und HS, wie dies routinemäßig für die Zellerhaltung verwendet wird). Die Zahl der pro Vertiefung vorhandenen Zellen scheint jedoch das Verhalten der PC12 Zellen zu beeinflussen, so dass weitere Experimente erforderlich sind.
Beispiel 4
Isolierung und Klonierung von Nukleotidsequenzen, die für Proteine codieren, welche GGF-I und GGF-II Peptide enthalten
Die Isolierung und die Klonierung der GGF-II Nukleotidsequenzen wurde durchgegeführt, wie hier dargestellt, unter Verwendung der Peptidsequenzinformation und Selektion aus einer Bibliothek. Diese wurde durchgeführt, wie unten dargestellt. Es ist deutlich, dass die Peptide der 4 und 5 als Ausgangspunkt für die Isolierung und Klonierung der GGF-I Sequenzen gemäß den hier beschriebenen Techniken verwendet werden können. In der Tat zeigt die 21, SEQ ID Nrn. 54–76 und 78–88 mögliche degenerierte Oligonukleotidproben für diesen Zweck und die 23(A–B), SEQ ID Nrn. 90–119, listet mögliche PCR Primer auf. Die DNA-Sequenz und die Polypeptid-Sequenz sollte mit diesen Mitteln erhältlich sein, wie bei GGF-II, und auch die DNA-Konstrukte und die Expressionsvektoren, welche solche DNA-Sequenzen aufnehmen, Wirtszellen, die genetisch verändert sind durch Einbau von solchen Konstrukten/Vektoren sowie Proteine, die durch die Kultivierung von solchen Wirtszellen erzielbar sind. Die Erfindung umfasst solche Gegenstände.
I. Aufbau und Synthese von Oligonukleotidsonden und Primer
Degenerierte DNA-Oligomersonden wurden durch Rücktranslation der Aminosäuresequenzen (abstammend von den Peptiden, die von dem gereinigten GGF-Protein erzeugt wurden) in Nukleotidsequenzen erstellt. Die Oligomere stellten entweder den codierenden Strang oder den nicht-codierenden Strang der DNA-Sequenz dar. Wenn Serin, Arginin oder Leucin in dem Oligomeraufbau vorhanden waren, wurden zwei getrennte Synthesen durchgeführt, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden. Serin wird zum Beispiel durch TCN oder durch AGY, wie bei 537 und 539 oder bei 609 und 610, codiert. Eine ähnliche Codonaufteilung wurde für Arginin oder Leucin vorgenommen (zum Beispiel 544, 545). Die DNA-Oligomere wurden auf einem Biosearch 8750 4-Säulen DNA-Synthesegerät unter Verwendung der β-Cyanoethylchemie und betrieben auf der 0,2 Mikromol-Syntheseskala, synthetisiert. Die Oligomere wurden von der Säule (500 Angstrom CpG Harze) abgespalten und in konzentriertem Ammoniumhydroxid für 6–24 Stunden bei 55–60°C entschützt. Die entschützten Oligomere wurden unter Vakuum (Speedvac) getrocknet und mittels Elektrophorese in Gelen von 15% Acrylamid (20 Mono 1 Bis) gereinigt mit 50 mM Tris-Borat-EDTA Puffer, der 7 M Harnstoff enthielt. Die Oligomere mit voller Länge wurden in Gelen durch UV-Abschattung nachgewiesen und dann wurden die Banden ausgeschnitten und die DNA-Oligomere wurden unter Schütteln in 1,5 ml H₂O für 4 bis 16 Stunden eluiert. Das Eluat wurde getrocknet, in 0,1 ml H₂O wieder gelöst und bei 260 nm wurde die Extinktion gemessen.
Die Konzentrationen wurden gemäß der folgenden Formel bestimmt: (A 260 × Einheiten/ml)(60,6/Länge = × μM)
Durch Zugabe von H₂O wurden alle Oligomere auf 50 μM Konzentration eingestellt.
Die wie oben aufgebauten, degenerierten Sonden sind in der 21, SEQ ID Nrn. 54–76 und 78–88, gezeigt.
Die PCR-Primer wurden im Wesentlichen mit den gleichen Verfahren hergestellt, die auch für die Sonden verwendet wurden, wobei aber die folgenden Modifikationen eingeführt wurden. Linker von dreizehn Nukleotiden, die Restriktionsstellen enthielten, wurden an den 5' Enden der degenerierten Oligomere, um die Restriktionsstellen beim Klonieren in Vektoren zu benutzen. Die DNA-Synthese wurde auf der 1 Mikromol-Skala unter Verwendung von 1.000 Angstrom CpG Harzen durchgeführt und Inosin wurde an den Positionen verwendet, wo alte vier Nukleotide normal in die degenerierten Proben eingeführt wurden. Die Reinigung der PCR-Primer umfasste eine Ethanolfällung mit anschließender Gelelektrophoresereinigung.
II. Aufbau der Bibliothek und Screening
Eine genomische Rinder-DNA-Bibliothek wurde von Stratagene (Katalog Nr. 945701) gekauft. Die Bibliothek enthielt 2 × 10⁶ 15–20 kb Sau3A1 partielle Rinder-DNA-Fragmente, die in den Vektor Lambda DashII kloniert waren. Eine cDNA-Bibliothek von dem gesamten Rindergehirn wurde gekauft von Clonetech (Katalog Nr. BL 10139). Komplementäre DNA-Bibliotheken wurden von mRNA hergestellt (In Vitrogen; Stratagene), wobei die mRNA aus dem Rindergesamthirn, der Rinderhypophyse und dem Rinderhypophysenhinterlappen hergestellt wurde. In Vitrogen stellte zwei cDNA-Bibliotheken her: Eine Bibliothek war in dem Vektor Lambda g10 und die andere Bibliothek war in dem Vektor pcDNAI (eine Plasmidbibliothek). Die Stratagene-Bibliotheken wurden in dem Vektor Lambda unizap hergestellt.
Zusammenfassend enthielten die cDNA-Bibliotheken 14 Millionen primär rekombinante Phagen.
Die genomische Rinderbibliothek wurde auf E. Coli K12 Wirtsstamm LE392 auf 23 × 23 cm Platten (Nunc) mit 150.000 bis 200.000 Phagenplaques pro Platte aufgetragen. Jede Platte stellte etwa ein genomisches Rinderäquivalent dar. Nach einer über Nacht Inkubation bei 37°C wurden die Platten abgekühlt und Replikafilter wurden gemäß dem Verfahren von Maniatis et al. (2: 60–81) hergestellt. Vier Plaquelifts wurden von jeder Platte auf nicht-beladenen Nylonmembranen hergestellt (Pall Biodyne A oder MSI Nitropure). Die DNA wurde auf den Membranen durch Quervernetzung unter UV-Licht für 5 Minuten oder durch Backen bei 80°C unter Vakuum für 2 Stunden immobilisiert. Die DNA-Sonden wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (New England Biotabs) mit gamma-32P ATP (New England Nuclear; 6500 Ci/mMol) gemäß den Angaben des Lieferanten markiert. 50 pMole von degenerierten DNA-Oligomeren wurden in Gegenwart von 600 μCi gamma ³²P-ATP und 5 Einheiten der T4-Polynukleotidkinase für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden beendet, der Ladepuffer für die Gelelektrophorese wurde hinzugefügt und die radiomarkierten Sonden wurden mit Elektrophorese gereinigt. Die 32P markierten Sonden wurden aus den Gelstückchen ausgeschnitten und im Wasser eluiert. Alternativ wurden die DNA-Sonden über die PCR-Amplifizierung durch Einlagerung von α-32P-dATP oder α-32P-dCTP markiert gemäß dem Protokoll von Schowalter und Sommer, Anal. Biochem 177: 90–94 (1989). Die in den PCR-Reaktionen markierten Sonden wurden mittels Entsalzung auf Sephadex G-150 Säulen gereinigt.
Die Prehybridisierung und die Hybridisierung wurden durchgeführt in GMC Puffer (0,52 M NaPi, 7% SDS, 1% BSA, 1,5 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 10 mg/ml tRNA). Das Waschen wurde durchgeführt in Oligowaschungen (160 ml 1 M Na₂HPO₄, 200 ml 20% SDS, 8,0 ml 0,5 M EDTA, 100 ml 5 M NaCl, 3632 ml H₂O). Typischerweise wurden 20 Filter (jeweils 400 cm²), die Replikatkopien von zehn Rindergenomäquivalenten darstellten, in 200 ml Hybridisierungslösung mit 100 pMole degenerierter Oligonukleotidsonde (128–512 fach degeneriert) inkubiert. Die Hybridisierung geschah über Nacht mit 5°C unterhalb der Minimumschmelztemperatur, die für die degenerierte Sonde berechnet wurde. Die Berechnung der Minimumschmelztemperatur basiert auf 2°C für ein AT-Paar und auf 4°C für ein GC-Paar.
Die Filter wurden unter wiederholtem Wechseln der Oligowaschungen bei den Hybridisierungstemperaturen für 4 bis 5 Stunden gewaschen und abschließend in 3,2 M Tetramethylammoniumchlorid, 1% SDS, zweimal für 30 Minuten bei einer Temperatur in Abhängigkeit von der DNA-Sondenlänge. Für 20mers betrug die abschließende Waschtemperatur 60°C. Die Filter wurden aufgelegt und dann wurde mit Röntgenstrahlfilm (Kodak XAR5) unter Verwendung von Verstärkerfolien (Dupont Cronex Lightening Plus) entwickelt. Normalerweise war eine drei- bis fünftägige Filmentwicklung bei –80°C ausreichend, um die Duplikatsignale in diesen Bibliothekstests zu detektieren. Nach Analyse der Ergebnisse konnten die Filter abgezogen und wieder verwendet werden. Die Filter wurden abgezogen durch Inkubation über zwei aufeinander folgende Zyklen von 15 Minuten in einem Mikrowellenofen mit voller Kraft in einer Lösung von 1% SDS, das 10 mM EDTA pH 8, enthielt. Die Filter wurden wenigstens für drei bis vier Zyklen von Stripping und wieder beladen mit verschiedenen Sonden verwendet.
III. Isolierung und Wachstum von rekombinanten Phagen und DNA-Aufarbeitung
Diese Verfahren wurden gemäß dem Standardprotokoll durchgeführt, das beschrieben ist in „Recombinant DNA" (Maniatis et al. 2: 60–2: 81).
IV. Analyse der isolierten Klone unter Verwendung von DNA-Verdau und Southern Blots
Rekombinante Phagen-DNA-Proben (2 Mikrogramm) wurden gemäß den Bedingungen geschnitten, die von dem Lieferanten der Restriktionsendonuklease empfohlen waren (New England Biolabs). Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Reaktionsprodukte in Gegenwart von 0,1 M Natriumacetat und drei Volumen Ethanol gefällt. Die gefällte DNA wurde mittels Zentrifugation gesammelt, in 75% Ethanol gespült und dann getrocknet. Alle resuspendierten Proben wurden auf Agarosegels aufgetragen (typischerweise 1% in TAE-Puffer; 0,04 M Tris-Acetat; 0,002 M EDTA). Die Gele liefen bei 1 Volt pro Zentimeter für 4 bis 20 Stunden. Die Marker umfassten lambda Hind III DNA-Fragmente und/oder ∅X174HaeIII DNA-Fragmente (New England Biolabs). Die Gele wurden mit 0,5 Mikrogramm/ml von Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Für das Southern Blotting wurde die DNA in dem Gel durch Behandlung mit 0,125 N HCl depuriniert, in 0,5 N NaOH denaturiert und in 20 × SSC überführt (3 M Natriumchlorid; 0,03 M Natriumcitrat), um die Nylonmembranen zu entladen. Das Blotting wurde über einen Zeitraum von 6 bis 24 Stunden durchgeführt und dann wurden die Filter in 0,5 Tris-HCL, pH 7,5, 0,15 M Natriumchlorid neutralisiert und dann kurz in 50 mM Tris-Borat-EDTA gespült.
Für die Vernetzung wurden die Filter zuerst in eine transparente Kunststofffolie eingewickelt und die DNA-Seite wurde dann für 5 Minuten ultraviolettem Licht ausgesetzt. Die Hybridisierung und das Waschen wurde durchgeführt, wie dies für die Bibliothekstestung (siehe Abschnitt 2 von diesem Beispiel) beschrieben ist. Für die Hybridisierungsanalyse zur Bestimmung, wo ähnliche Gene in anderen Arten existieren, wurden leichte Modifikationen durchgeführt. Der DNA-Filter wurde gekauft von Clonetech (Katalog Nr. 7753-1) und enthielt 5 Mikrogramm von EcoRI geschnittene DNA von verschiedenen Arten pro Linie. Die Sonde wurde mit den PCR-Amplifikationsreaktionen markiert, wie dies oben im Abschnitt 2 beschrieben ist. Die Hybridisierungen wurden durchgeführt in 80% Puffer B (2 g Polyvinylpyrrolidin, 2 g Ficoll-400, 2 g Rinderserumalbumin, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) 58 g NaCl, 1 g Natriumpyrophosphat, 10 g Natriumdodecylsulfat, 950 ml H₂O), der 10% Dextransulfat enthielt. Die Sonden wurden durch Kochen für 10 Minuten und anschließendes schnelles Abkühlen in Eiswasser denaturiert. Die Sonde wurde dem Hybridisierungspuffer mit 106 dpm 32P pro ml zugegeben und über Nacht bei 60°C inkubiert. Die Filter wurden bei 60°C zunächst gewaschen in Puffer B, gefolgt von 2 × SSC, 0,1% SDS, dann in 1 × SSC, 0,1% SDS. Für Experimente mit hoher Stringens wurden die abschließenden Waschungen in 0,1 × SSC, 1% SDS durchgeführt und die Temperatur wurde auf 65°C angehoben.
Die Ergebnisse der Southern Blots wurden verwendet, um eine Restriktionskarte des genomischen Klons herzustellen und um darzustellen, welche Subfragmente mit den GGF-Sonden (Kandidaten für die Subklonierung) hybridisierten.
V. Subklonierung der DNA-Segmente, die zu den Hybridisierungssonden homolog waren
Die DNA-Verdaus (zum Beispiel 5 Mikrogramm) wurden auf 1% Agarosegels aufgebracht und geeignete Fragmente wurden nach Anfärbung aus den Gelen geschnitten. Die DNA wurde durch Adsorption an Glaskügelchen und anschließender Elution unter Verwendung des Protokolls, wie es von dem Lieferanten (Bio 101) beschrieben war, gereinigt. Die gewonnenen DNA-Fragmente (100–200 ng) wurden in linearisierte, dephosphorilierte Vektoren, zum Beispiel pT3T7 (Ambion), was ein Derivat von pUC18 ist, unter Verwendung der T4-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Dieser Vektor trägt das E. Coli β-Lactamasegen, so dass die Transformanten auf Platten mit Ampicillin selektiert werden können. Der Vektor führt auch zu einer β-Galactosidase-Komplementierung der Wirtszelle, so dass nicht-Rekombinanten (blau) unter Verwendung von Isopropylthiogalactosid und Bluogal (Bethesda Research Labs) delektiert werden konnten. Ein Teil der Ligierungsreaktionen wurde verwendet für die Transformation von E. Coli K12 XL1 blau-kompetente Zellen (Stratagene, Katalog Nr. 200236). Die Transformanten wurden dann auf LB-Platten selektiert, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthielten. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und Plasmid-mini-Präparationen wurden für den DNA-Verdau und für die DNA-Sequenzanalyse hergestellt. Die ausgewählten Klone wurden wieder getestet, um zu bestimmen, ob ihre insertierte DNA mit den GGF-Sonden hybridisierte.
VI. DNA-Seguenzierung
Doppelsträngige Plasmid-DNA-Template wurden hergestellt aus 5 ml Kulturen gemäß Standardprotokollen. Die Sequenzierung wurde durch die Dideoxy-Kettenabbruchreaktion unter Verwendung von Sequenase 2.0 und einem Dideoxynukleotid-Sequenzierkits (US Biochemical) gemäß dem Protokoll der Hersteller durchgeführt (eine Modifikation von Sanger et al. PNAS; USA 74: 5463 (1977)). Alternativ wurde die Sequenzierung in einem thermischen DNA-Zyklussequenzierer (Perkin Elmer, Modell 4800) unter Verwendung eines Zyklussequenzierkits (New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories) durchgeführt, wobei die Angaben des Herstellers unter Verwendung eines 5'-endmarkierten Primers angewandt wurden. Die Sequenzprimer waren solche, die mit den Sequenzierkits geliefert wurden, oder wurden gemäß der Sequenz synthetisiert, die von den Klonen bestimmt wurde. Die Sequenzierreaktionsansätze wurden auf ein 0,4 mm dickes Sequenziergel von 6% Polyacrylamid geladen und dort aufgelöst. Die Gele wurden getrocknet und mit Röntgenstrahlfilm entwickelt. Typischerweise wurde 35S eingelagert, wenn Standardsequenzierkits verwendet wurden, und 32P endmarkierte Primer wurden verwendet für die Zyklussequenzierreaktionen. Die Sequenzen wurden in einem DNA-Sequenziereditor vom Boden der Gele bis zu ihrer Spitze (5' zu 3' Richtung) gelesen und die Daten wurden analysiert unter Verwendung von Programmen, die von Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin) geliefert wurden.
VII. RNA-Zubereitung und PCR-Amplifizierung
Offene Leserahmen, die in der genomischen DNA entdeckt wurden und die Sequenzen für die Kodierung von GGF-Peptiden enthielten, wurden via PCR-Amplifizierung von Hypophysen-RNA verlängert. Die RNA wurde hergestellt aus gefrorenem Rindergewebe (Pelfreeze) gemäß dem Guanidin neutal-CsCl Verfahren (Chirgwin et. al. Biochemistry 18: 5294 (1979). Polyadenylierte RNA wurde ausgewählt mit Oligo-dT Cellulosesäulenchromatographie (Aviv und Leder, PNAS (USA) 69: 1408 (1972)).
Spezifische DNA-Zielsequenzen wurden amplifiziert, wobei entweder mit Gesamt-RNA begonnen wurde oder mit polyadenylierten RNA-Proben, die zu cDNA unter Verwendung des Perkin Elmer PCR/RNA Kits Nr.: N808-0017 umgewandelt worden waren. Die strangreversen Transkriptionsreaktionen verwendeten 1 μg Templat-RNA und Primer von Oligo-dT mit angehefteten Linkern mit Restriktionsenzymstellen, oder spezifische Antisense-Primer mit angehefteten Restriktionsorten, wobei die Primer von klonierten Sequenzen bestimmt wurden. Um den zweiten Strang herzustellen, waren die Primer entweder einmalige Plusstrangsequenzen, wie sie verwendet wurden bei den 3' RACE Reaktionen (Frohman et. al., PNAS (USA) 85: 8998 (1988)), oder Oligo-dT Primer mit angebrachten Restriktionsstellen, wenn die zweite Zielstelle durch terminales Transferasetailing an die ersten Strangreaktionsprodukte mit dATP hinzugefügt worden ist (z. B. 5' RACE Reaktion, Frohman et. al., ibid). Alternativ, wie bei anchored-PCR-Reaktionen, wurden die zweiten Strangprimer degeneriert und repräsentierten somit besondere Peptidsequenzen.
Das Amplifizierungsprofil folgte dem folgenden allgemeinen Schema: 1) Einweichen des Ansatzes für 5 Minuten bei 95°C; 2) thermaler Zyklus Ansätze von 1 Minute, 95°C; 1 Minute abflachen auf eine Schmelztemperatur von 45°C, 50°C oder 55°C; Aufrechterhaltung der Schmelztemperatur für 1 Minute; Erwärmen über 1 Minute auf 72°C; Ausdehnen bei 72°C für 1 Minute oder für 1 Minute plus eine 10 Sekunden Autoausdehnung; 3) Ausdehnungszyklus bei 72°C, 5 Minuten und 4) Einweichen des Ansatzes bei 4°C für unbegrenzte Zeit. Die thermischen Zyklusansätze (Nr. 2) liefen normalerweise für 30 Zyklen. Eine sechzehn μl Probe von jeder 100 μl Amplifizierungsreaktion wurde durch Elektrophorese in 2% Nusieve 1% Agarose Gels analysiert, welche in TAE-Puffer bei 4 Volt pro Zentimeter für 3 Stunden tiefen. Die Gele wurden gefärbt und dann gegen nicht beladene Nylonmembranen geblottet, welche mit markierten DNA-Sonden, die intern zu den Primern waren, getestet.
Spezifische Sets der DNA-Amplifizierungsprodukte konnten bei den Blottingexperimenten identifiziert werden und ihre Positionen wurden als Anhaltspunkt für die Reinigung und Reamplifikation verwendet. Wo es geeignet war, wurden die restlichen Teile der ausgewählten Proben auf präparative Gele geladen und nach Elektrophorese wurden vier bis fünf Stücke von 0,5 mm Dicke (welche die erwartete Position des spezifischen Produktes umfassten) dem Gel entnommen. Die Agarose wurde zerdrückt und dann in 0,5 ml Elektrophoresepuffer bei 40°C für 2–16 Stunden eingeweicht. Die zerdrückte Agarose wurde für 2 Minuten zentrifugiert und die wässrige Phase wurde in frische Röhrchen transferiert.
Die Reamplifikation wurde auf fünf Mikroliter (etwa 1% des Produktes) des eluierten Materials durchgeführt, wobei die gleichen Sets von Primer und Reaktionsprofilen, wie bei den Originalreaktionen, verwendet wurden. Nach Vollendung der Reamplifikationsreaktionen wurden die Proben mit Chloroform extrahiert und in frische Röhrchen transferiert. Konzentrierte Restriktionsenzympuffer und Enzyme wurden den Reaktionen zugesetzt, um sie an den Restriktionsstellen, die in den Linkern vorhanden waren, zu schneiden. Die verdauten PCR-Produkte wurden mit Gelelektrophorese gereinigt und dann in Vektoren subkloniert, wie dies oben in dem Subklonierungsabschnitt beschrieben ist. Die DNA-Sequenzierung wurde wie oben beschrieben, durchgeführt.
VIII. DNA-Sequenzanalyse
Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung eines Fragmentassemblierprogramms bereitgestellt und die Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung der GCG-Programme GelAssemble, Map und Translate abgeleitet. Die abgeleiteten Proteinsequenzen wurden verwendet als Abfragesequenz, um Proteinsequenzdatenbanken unter Verwendung von WordSearch zu durchsuchen. Die Analyse wurde auf einer VAX Station 3100 Workstation, die unter VMS 5.1 lief, gemacht. Die Datenbankrecherche wurde gemacht auf SwissProt Freigabenummer 21 unter Verwendung der GCG Version 7,0.
IX. Ergebnisse der Klonierung und der Sequenzierung von Genen, die für GGF-I und GGF-II codieren
Wie oben dargelegt wurden zur Identifikation der DNA-Sequenz, die für Rind GGF-II codiert, degenerierte Oligonukleotidsonden aus GGF-II Peptidsequenzen erstellt. GGF-II 12 (SEQ ID Nr. 44), ein Peptid, welches via Lysylendopeptidaseverdau einer gereinigten GGF-II Zubereitung (siehe die 11 und 12) erstellt wurde, zeigte eine starke Aminosäuresequenzhomologie mit GGF-I 07 (SEQ ID Nr. 39), ein tryptisches Peptid, das aus einer gereinigten GGF-I Zubereitung hergestellt wurde. GGF-II 12 wurde somit verwendet, um zehn degenerierte Oligonukleotidproben zu erzeugen (siehe Oligos 609, 610 und 649 bis 656 in der 21, SEQ ID Nrn. 69, 70, 71 und 79). Ein zweifacher Satz an Filtern wurden mit zwei Sätzen (Satz 1 = 609, 610; Satz 2 = 649–5656) von Sonden getestet, die für zwei überlappende Abschnitte von GGF-II 12 codieren. Hybridisierungssignale wurden beobachtet, wobei aber nur ein Klon mit beiden Sondensätzen hybridisierte. Der Klon (als GGF2BG1 bezeichnet) wurde gereinigt.
Die Southern Blot Analyse der DNA aus dem Phargenklon GGF2BG1 bestätigte, dass beide Sätze der Sonden mit dieser Rind-DNA-Sequenz hybridisierten und zeigte ferner, dass beide Sonden mit dem gleichen Satz an DNA-Fragmenten innerhalb des Klons reagierte. Basierend auf diesen Experimenten wurde ein 4 kb Eco RI Subfragment des Ursprungsklons identifiziert, subkloniert und partiell sequenziert. Die 22 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 89) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 196) der anfänglichen DNA-Sequenzlesungen, welche die Hybridisierungsstellen der Sonden 609 und 650 umfassten, und bestätigte, dass ein Teil dieser genomischen Rind DNA für das Peptid 12 (KASLADSGEYM; SEQ ID Nr. 129) codiert.
Die weitere Sequenzanalyse zeigte, dass GGF-II 12 auf einem offenen Leserahmen von 66 Aminosäuren beruht (siehe unten), was der Startpunkt wurde für die Isolierung der überlappenden Sequenzen, die ein mutmaßliches GGF-II Rindergen und eine cDNA darstellen.
Verschiedene PCR-Verfahren wurden verwendet, um zusätzliche Codiersequenzen für das mutmaßliche GGF-II Rindergen zu erhalten. Gesamt-RNA und Oligo dT-ausgewählte (Poly A enthaltend) RNA Proben wurden aus der Rindergesamthypophyse, des Hypophysenvorderlappens, des Hypophysenhinterlappens und aus dem Hypothalamus hergestellt. Unter Verwendung der Primer aus der Liste, die in der 23 gezeigt ist, SEQ ID Nrn. 109–119, wurden einseitige PCR-Reaktionen (RACE) verwendet, um die cDNA-Enden in der 3' sowie in der 5' Richtung zu amplifizieren. Anchored PCR-Reaktionen wurden mit den degenerierten Oligonukleotidprimern durchgeführt, welche zusätzliche GGF-II Peptide darstellen. Die 24 fasst die angrenzenden DNA-Strukturen und die Sequenzen, die bei diesen Experimenten erzielt wurden, zusammen. Von den 3' RACE-Reaktionen wurden drei alternativ gespleißte cDNA-Sequenzen hergestellt, die kloniert und sequenziert wurden. Eine 5' RACE-Reaktion führte zur Enddeckung eines zusätzlichen Exons, das die codierende Sequenz für wenigstens 52 Aminosäuren enthielt. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz ergab die Peptide GGF-II-6 und eine Sequenz ähnlich zu GGF-I-18 (siehe unten). Die anchored-PCR-Reaktionen führten zu der Identifikation der (cDNA) codierenden Sequenzen der Peptide GGF-II-1, 2, 3 und 10, die innerhalb eines zusätzlichen cDNA-Segmentes von 300 Basenpaaren enthalten waren. Die 5' Grenze dieses Segmentes (das heißt Segment E, siehe 31) wird durch das Oligonukleotid definiert, welches für das Peptid GGF-II-1 codiert und das in der PCR-Reaktion verwendet wurde (zusätzliche 5' Sequenzdaten existieren, wie dargestellt, für den menschlichen Klon von Beispiel 6). Somit enthält dieser Klon die Nukleotidsequenz, die für sechs von den insgesamt neun neuen GGF-II Peptidsequenzen codieren.
Das klonierte Gen wurde zunächst charakterisiert durch die Erstellung einer physikalischen Karte von GGF2BG1, welche es uns erlaubte, die codierenden Sequenzen, wie sie gefunden worden waren (siehe unten, 25), zu positionieren. Die DNA-Sonden von den codierenden Sequenzen, die oben beschrieben sind, wurden verwendet, um weitere DNA-Fragmente zu identifizieren, welche die Exons von diesem Phagenklon enthielten, und um Klone, welche in beiden Richtungen überlappen, zu identifizieren. Das mutmaßliche GGF-II Rindergen wird in wenigstens fünf codierende Segmente aufgeteilt. Die codierenden Segmente werden als diskrete Längen der DNA-Sequenz definiert, die in Polypeptidsequenzen unter Verwendung des universellen genetischen Codes translatiert werden können. Die in der 31 beschriebenen, codierenden Segmente, auf die in der vorliegenden Anwendung verwiesen wird, sind: 1) einzelne Exons, die innerhalb des GGF-Gens (zum Beispiel codierendes Segment a) vorhanden sind oder 2) abstammen von Sätzen von zwei oder mehr Exons, die in spezifischen Untergruppen der mRNAs erscheinen, wobei jeder Satz in die spezifischen Polypeptidsegmente, wie in den Genprodukten gezeigt, translatiert werden können. Die Polypeptidsegmente, auf die in den Ansprüchen bezogen wird, sind die Translationsprodukte der analogen codierenden DNA-Segemente. Nur die codierenden Segmente A und B wurden als Exons definiert und sequenziert und bisher kartiert. Die Übersicht für die angrenzenden, identifizierten, codierenden Sequenzen ist in der 26 wiedergegeben. Die Exons sind aufgelistet (alphabetisch) in der Reihenfolge ihrer Entdeckung. Es ist von den Intron/Exon-Grenzen erkennbar, das Exon B in den cDNAs enthalten sein kann, welche das codierende Segment E und das codierende Segment A verbinden. Dies bedeutet, dass Exon B nicht herausgespleißt werden kann, ohne den Leserahmen zu beeinträchtigen. Deshalb vermuten wir, dass drei alternative Spleißmuster die mutmaßlichen GGF-II cDNA-Rindsequenzen 1, 2 und 3 herstellen können. Die codierenden Sequenzen davon, bezeichnet als GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS und GGF2BPP3.CDS, sind dargestellt in den 28A (SEQ ID Nr. 133), 28B–C (SEQ ID Nr. 134) bzw. 28D–E (SEQ ID Nr. 135). Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von diesen drei cDNAs sind auch in den 28A (SEQ ID Nr. 190), 28B–C (SEQ ID Nr. 191) und 28D–E (SEQ ID Nr. 143) gezeigt.
Die drei abgeleiteten Strukturen codieren für Proteine mit einer Länge von 206, 281 und 257 Aminosäuren. Die ersten 183 Reste der abgeleiteten Proteinsequenzen sind in allen drei Genprodukten identisch. An der Position 184 unterscheiden sich die Klone signifikant. Ein Codon für Glycin GGT in GGF2BPP1 dient auch als Spleißdonor für GGF2BPP2 und GGF2BPP3, der alternativ auf den Exons C, C/D, C/D' und D oder C, C/D bzw. D hinzugefügt ist und in der 33 (SEQ ID Nr. 149) gezeigt ist. GGFIIBPP1 ist ein abgestumpftes Genprodukt, das erzeugt wird durch Lesen vorbei an der Spleißstelle des codierenden Segmentes A in die folgende Intron-Sequenz (Intron). Dies stellt das codierende Segment A' in der 31 dar (SEQ ID Nr. 140). Das Transkript endet benachbart zu einer kanonischen AATAAA Polyadenylierungssequenz, wobei wir vermuten, dass dieses abgestumpfte Genprodukt ein echtes reifes Transkript darstellt. Die zwei anderen, längeren Genprodukte teilen sich die gleiche 3' nicht translatierte Sequenz und die Polyadenylierungsstelle.
Alle drei Moleküle enthalten sechs der neun, neuen GGF-II Peptidsequenzen (siehe 12) und ein anderes Peptid ist hoch homolog zu GGF-I-18 (siehe 27). Dieses Ergebnis beinhaltet eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass dieses rekombinante Molekül wenigstens für einen Teil des Rind GGF-II codiert. Ferner sind die berechneten, isoelektrischen Punkte für die drei Peptide konsistent mit den physikalischen Eigenschaften von GGF-I und II. Da die Molekülgröße von GGF-II etwa 60 kD beträgt, sollte die längste der drei cDNAs für ein Protein codieren mit annähernd der Hälfte der vorausgesagten Zahl an Aminosäuren.
Eine Probe, welche die Exons B und A umfasste, wurde mittels PCR-Amplifizierung markiert und verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen, welche aus RNA hergestellt wurde, die aus Rinderhypophysenhinterlappen isoliert wurde. Ein Klon (GGF2BPP5) zeigte das Muster, das in der 30 angezeigt ist, und enthielt ein zusätzliches codierendes DNA-Segment (G) zwischen den codierenden Segmenten A und C. Die gesamte Nukleinsäuresequenz ist in der 32 gezeigt (SEQ ID Nr. 148). Das vorhergesagte Translationsprodukt von dem längsten offenen Leserahmen hat 241 Aminosäuren. Ein Teil von einer zweiten cDNA (GGF2BPP4) wurde auch aus der Bibliothek des Rinderhypophysenhinterlappens unter Verwendung der oben beschriebenen Sonde isoliert. Dieser Klon zeigte das Muster, das in der 30 dargestellt ist. Dieser Klon ist an dem 5' Ende nicht vollständig, wobei er aber eine Spleißvariante in dem Sinne darstellt, dass die codierenden Segmente G und D fehlen. BPP4 zeigt auch ein neues 3' Ende mit den Regionen H, K und L jenseits der Region C/D. Die Sequenz von BPP4 ist in der 34(A–C) gezeigt (SEQ ID Nr. 150).
Beispiel 5
GGF-Sequenzen in verschiedenen Arten
Eine Datenbankrecherche hat keine bedeutungsvollen Ähnlichkeiten zwischen einem prognostizierten GGF Translationsprodukt und bekannten Proteinsequenzen ergeben. Dies lässt vermuten, dass GGF-II das erste Mitglied einer neuen Familie oder Superfamilie von Proteinen ist. Bei Kreuzhybridisierungsstudien mit hoher Stringens (DNA-Blottingversuche) mit anderen Säugetier-DNAs haben wir klar gezeigt, dass DNA-Sonden von diesem rekombinanten Rindermolekül spezifische Sequenzen in einer Reihe von getesteten Proben ohne weiteres nachweisen kann. Eine hoch homologe Sequenz wurde auch in der menschlichen genomischen DNA detektiert. Das Autoradiogramm ist in der 29 gezeigt. Die Signale in den Spuren, die Ratten und menschliche DNA enthielten, stellen die menschlichen und Ratten Äquivalente des GGF Gens dar, wobei die Sequenzen für die verschiedenen cDNA's, welche für dieses Gen codieren, vor kurzem dargestellt wurden von Holmes et al., (Science 256: 1205 (1992)) und Wen et al. (Cell 69: 559 (1992)).
Beispiel 6
Isolierung der menschlichen Sequenz, die für das menschliche GGF2 codiert
Verschiedene menschliche Klone, die Sequenzen aus dem GGF-II codierenden Segment E vom Rind enthielten, wurden durch Screening einer menschlichen cDNA-Bibliothek isoliert, welche aus dem Gehirnstamm isoliert wurde (Stratagene Katalog Nr. 935206). Diese Strategie wurde verfolgt auf Basis der starken Verbindung zwischen den meisten GGF2-Peptiden (einmalig vorhanden für GGF2) und der prognostizierten Peptidsequenz aus den Klonen, die das E-Rindersegment enthielten. Diese Bibliothek wurde, wie im Beispiel 4, Abschnitt II beschrieben, getestet unter Verwendung der Oligonukleotidsonde 914–919, die im folgenden aufgeführt sind.
Die mit diesen Sonden nachgewiesenen Klone wurden ferner mittels Hybridisierung analysiert. Eine von dem codierenden Segment A (siehe 21) abstammende Sonde, welche durch Markierung eines Polymerasekettenreaktion (PCR)-Produktes vom Segment A hergestellt wurde, wurde auch verwendet, um die primäre Bibliothek zu testen. Verschiedene Klone, die mit den von A und E abstammenden Sonden hybridisierten, wurden ausgewählt und ein besonderer Klon, GGF2HBS5, wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Dieser Klon ist dargestellt durch das Muster der codierenden Segmente (EBACC/D'D, wie in der 31 gezeigt). Das E-Segment in diesem Klon ist das menschliche Äquivalent der abgestumpften Rinderversion von E, die in der 37 gezeigt ist. GGF2HBS5 ist der wahrscheinlichste Kandidat für die Codierung von GGF-II von all den „mutmaßlichen" GGF-II Kandidaten. Die Länge des codierenden Sequenzsegmentes E beträgt 786 Nukleotide plus 264 Basen einer nicht-translatierten Sequenz. Die prognostizierte Größe des Proteins, welches von GGF2HBS5 codiert wird, beträgt etwa 423 Aminosäuren (ungefähr 45 Kilodaltons, siehe 45(A–D), SEQ ID Nr. 170), was in etwa der Größe der deglykosylierten Form von GGF-II entspricht (siehe Beispiel 16). Ferner haben sieben der GGF-II Peptide, die in der 27 aufgeführt sind, äquivalente Sequenzen, die in die Proteinsequenz, die von der Region E prognostiziert wurde, fallen. Die Peptide II-6 und II-12 sind Ausnahmen und fallen in das codierende Segment B bzw. in das codierende Segment A. Die GGF2HBS5 proteincodierende RNA wurde in einem in vitro Transkriptionssystem hergestellt, das von dem Bakteriophagen T7-Promotor angetrieben wird, der in dem Vektor (Bluescript SK (Stratagene Inc.) siehe 44) vorliegt, welcher das GGF2HBS5-Insert enthält. Diese RNA wurde in einem zellfreien (Kaninchen-Reticulyt) Transtationssystem translatiert und die Größe des Proteinproduktes betrug 45 kD.
Das zellfreie Produkt wurde ferner in einem mitogenetischen Schwann-Zelltest überprüft, um die biologische Aktivität zu bestätigen. Die mit konditioniertem Medium behandelten Schwann-Zellen zeigten eine erhöhte Proliferation, gemessen durch die Einlagerung von ¹²⁵I-Uridin, und eine Phosphorilierung am Tyrosin von einem Protein im 185 Kilodalton-Bereich. Die Größe des von GGF2HBS5 codierten Produktes und die Gegenwart der DNA-Sequenzen, welche für menschliche Peptide codieren, die hoch homolog zu den Rinderpeptiden sind, gezeigt in der 12, bestätigen, dass GGF2HBS5 für das menschliche Äquivalent von Rind-GGF2 codiert. Die Tatsache, dass konditioniertes Medium, welches aus mit diesem Klon transformierten Zellen hergestellt wurde, die mitogenetische Aktivität der Schwann-Zellen auslöst, bestätigt, dass das GGFIIHBS5-Genprodukt (verschieden von dem BPP5-Genprodukt) sekrediert wird. Ferner scheint das GGFIIBPP5-Genprodukt die Reaktion der Schwann-Zellproliferation über eine Rezeptortyrosinkinase, wie p185^erbB2, oder einen nahen verwandten Rezeptor (siehe Beispiel 14) zu vermitteln.
Beispiel 7
Expression von menschlichem rekombinanten GGF2 in Säugetierzellen und Insektenzellen
Der GGF2HBS2 cDNA Klon, der für das menschliche GGF2 codiert (wie im Beispiel 6 beschrieben und hier auch als HBS5 bezeichnet) wurde kloniert in den Vektor pcDL-SRα296 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8: 466–472 (1988) und COS-7 Zellen wurden in 100 mm Schalen transfiziert mittels dem DEAE-Dextranverfahren (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage CSH Laboratory NY (1989). Zelllysate oder konditioniertes Medium von Transient exprimierenden COS-Zellen wurden drei oder vier Tage nach der Transfektion geerntet. Um die Lysate herzustellen, wurden die Zellmonoschichten mit PBS gewaschen, von den Schalen abgekratzt und durch drei Einfrier/Auftau-Zyklen in 150 μl von 0,25 M Tris-HCl, pH 8,0, lysiert. Die Zelltrümmer wurden pelletiert und der Überstand wurde verwendet. Proben von konditionierten Medien (7 ml) wurden gesammelt, dann konzentriert und der Puffer wurde ausgetauscht mit 10 mM Tris, pH 7,4, unter Verwendung von Centiprep-10 und Centricon-10-Einheiten, wie vom Hersteller beschrieben (Amicon, Beverly, MA). Schwann-Zellen von Rattennerven wurden hinsichtlich der Einlagerung von DNA-Synthesevorläufern, wie beschrieben (Beispiel 3), getestet. Proben von konditionierten Medien oder Zelllysaten wurden in dem Schwann-Zellproliferationstest überprüft, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Die mitogenetischen Aktivitätsdaten sind in der 46 dargestellt. Die cDNA, GGF2HBS5, die GGF2 codiert, steuerte die Sekretion es Proteinproduktes in das Medium. Ein kleiner Teil der Gesamtaktivität war innerhalb der Zellen nachweisbar, wie dies durch Tests unter Verwendung von Zelllysaten bestimmt wurde. GGF2HFB1 und GGFBPP5 cDNA's steuerten nicht die Sekretion des Produktes zu dem extrazellulären Medium. Die GGF-Aktivität von diesen Klonen wurde nur in den Zelllysaten nachgewiesen (46).
Rekombinantes GGF2 wurde auch in CHO-Zellen exprimiert. Die GGF2HBS5 cDNA, die für GGF2 codiert, wurde in die EcoRI-Stelle des Vektors pcdhfrpolyA (54) kloniert und in die DHFR negative CHO-Zelllinie (DG44) transfiziert mittels des Calciumphosphat-Coprezipitationsverfahrens (Graham und Van Der Eb, Virology 52: 456–467 (1973). Die Klone wurden in einem nukleotid- und nukleosidfreien α-Medium (Gibco) in Platten mit 96 Vertiefungen ausgewählt. Nach 3 Wochen wurden Proben von konditioniertem Medium von unterschiedlichen Klonen hinsichtlich der Expression von GGF durch den Schwann-Zellproliferationstest, beschrieben in Beispiel 3, getestet. Stabile Klone, die signifikante Mengen von GGF-Aktivität in das Medium abgaben, wurden identifiziert. Die Daten der Schwann-Zellproliferationsaktivität von verschiedenen Volumenaliquots von CHO-Zellen konditioniertem Medium wurden verwendet, um die Dosisreaktionskurve aufzustellen, die in der 47 gezeigt ist (Graham und Van Der Eb, Virology 52: 456, 1973). Dieses Material wurde auf einem Western-Blot analysiert, der mit polyklonalen Antiseren, die gegen ein GGF2 spezifisches Peptid erstellt wurden, untersucht wurde. Ein breites Band von etwa 69–90 kD (die erwartete Größe von GGF2, extrahiert von Hypophysen und höher Molekulargewichts-Glycoformen) wurde spezifisch markiert (49, Spur 12).
Rekombinantes GGF2 wurde auch in Insektenzellen unter Verwendung der Bacculovirusexpression exprimiert. Sf9 Insektenzellen wurden mit Bacculovirus infiziert, welche den GGF2HBS5 cDNA Klon enthielten, mit einer Menge von 3–5 (10⁶ Zellen/ml) und in Sf900-II Medium (Gibco) kultiviert. Die mitogenetische Aktivität der Schwann-Zellen wurde in das extrazelluläre Medium (48) abgegeben. Verschiedene Volumen von konditioniertem Medium der Insektenzellen wurden in dem Schwann-Zellproliferationstest in Abwesenheit von Forskolin getestet und die verwendeten Daten zur Herstellung der Dosisreaktionskurve sind in der 48 gezeigt.
Dieses Material wurde auch auf einem Western-Blot (47) analysiert, der mit dem oben beschriebenen GGF-II spezifischen Antikörper untersucht wurde. Ein Band von 45 kD, was der Größe von deglycosiliertem GGF-II (siehe Beispiel 16) entspricht, wurde gesehen.
Die in diesem Beispiel verwendeten Verfahren waren die folgenden:
Die mitogenetische Schwann-Zellaktivität von rekombinanten, menschichen und Rinder-Gliawachstumsfaktoren wurde wie folgt bestimmt:
Die mitogenetischen Reaktionen von kultivierten Schwann-Zellen wurden in Gegenwart von 5 μM Forskolin gemessen, wobei rohe rekombinante GGF-Zubereitungen verwendet wurden, die von den transienten Säugetierexpressionsexperimenten erzielt wurden.
Einlagerung von [¹²⁵I]-Uridin wurde bestimmt nach einer 18 bis 24 Stunden Exposition von Materialien, die von transfizierten oder scheintransfizierten COS-Zellen, wie beschrieben bei den Verfahren, erzielt wurden. Die mittlere und die Standardabweichung von vier Datensätzen sind dargestellt. Die mitogenetische Reaktion auf die partiell gereinigte, native Rinderhypophysen GGF (Carboxymethylcellulosefraktion; Goodearl et al., eingereicht) als Standard von 100% Aktivität dargestellt (GGF).
cDNAs (53) wurden in pcDL-SRα296 (Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8: 466–472 (1988)) kloniert und COS-7 Zellen wurden in 100 mm Schalen transfiziert mittels des DEAE-Dextranverfahrens (Sambrook et al., In Motecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)). Zelllysate oder konditionierte Medien wurden 3 oder 4 Tage nach der Transfektion geerntet. Um die Lysate herzustellen, wurden die Zellmonoschichten mit PBS gewaschen, von den Schalen abgekratzt und durch drei Einfrier/Auftau-Zyklen in 150 μl von 0,25 M Tris-HCl, pH 8, lysiert. Die Zelltrümmer wurden pelletiert und der Überstand wurde verwendet. Proben von konditionierten Medien (7 ml) wurden gesammelt, dann konzentriert und der Puffer wurde mit 10 mM Tris, pH 7,4, ausgetauscht unter Verwendung von Centriprep-10 und Centricon-10 Einheiten, wie dies von dem Hersteller beschrieben ist (Amicon, Beverly, MA). Schwann-Zellen vom Rattenischiasnerv wurden hinsichtlich der Einlagerung von DNA-Synthesevorläufern getestet, wie beschrieben von Davis und Stroobant, J. Cell Biol. 110: 1353–1360 (1990); Brockes et al., Brain Res. 165: 105–118 (1979)).
Western-Blots von konditionierten Medien von rekombinanten CHO-Zellen wurden wie folgt durchgeführt: Ein rekombinanter CHO-Klon wurde in 7 ml von MCDB302 proteinfreiem Medium für 3 Tage kultiviert. 2 ml des konditionierten Mediums wurde konzentriert, und der Puffer wurde gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, ausgetauscht und bis zur Trockenheit lyophilisiert. Das Pellet wurde in SDS-PAGE Probenpuffer resuspendiert und einer reduzierenden SDS-Gelelektrophorese unterworfen und durch Western-Blotting mit einem GGF-Peptidantikörper analysiert. Eine CHO-Kontrolle wurde unter Verwendung von konditioniertem Medium von nicht-transfiziertem CHO-DG44 Wirt durchgeführt und die CHOHBS5 Mengen wurden unter Verwendung von konditioniertem Medium aus einem rekombinanten Klon getestet.
Beispiel 8
Isolierung von anderen menschlichen Sequenzen, die mit Rind-GGF verwandt sind
Die Ergebnisse der Beispiele 5 und 6 zeigen, dass verwandte Sequenzen von GGF aus menschlichen Quellen auch einfach isoliert werden können unter Verwendung der DNA-Sonden, die von GGF-Rindersequenzen abstammen. Alternativ kann das von Holmes et al. (Science 256: 1205 (1992)) beschriebene Verfahren verwendet werden. In diesem Beispiel wurde ein menschliches Protein (Heregulin α), welches an den p185^erbB2 Rezeptor bindet und diesen aktiviert (und das mit GGF verwandt ist), aus einer Tumorzelllinie gereinigt und die erhaltende Peptidsequenz wurde verwendet, um Oligonukleotidsonden herzustellen, die verwendet wurden, um cDNAs, welche für Heregulin codieren, zu klonieren. Der biochemische Test für die p185^erbB2 Rezeptoraktivierung ist verschieden von der Schwann-Zellproliferation. Dies ist ein ähnliches Verfahren zu den in den Beispielen 1–4 für die Klonierung der GGF-Sequenzen aus Hypophysen-cDNAs verwendeten Verfahren. Das Heregulinprotein und die komplementären DNAs wurden aus den Tumorzelllinien gemäß den folgenden Verfahren isoliert.
Heregulin wurde aus Medium gereinigt, das durch MDA-MB-231 Brustkrebszellen konditioniert war (ATCC # HTB 26), gewachsen auf Percell Biolytica Microcarrier-Beads (Hyclone Labs). Das Medium (10 Liter) wurde 25-fach durch Filtration durch eine Membran (10 kD Absperrung) (Millipore) konzentriert und durch Zentrifugation und Filtration durch einen Filter (0,22 μm) gereinigt. Das Filtrat wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgetragen und die Proteine wurden in Schritten von 0,3, 0,6 und 0,9 M NaCl in physiologische Kochsalzlösung, gepuffert mit Phosphat, eluiert. Die Aktivität in den verschiedenen chromatographischen Fraktionen wurde gemessen durch Quantifizierung der Zunahme bei der Tyrosinphosphorilierung von p185^erbB2 in MCF-7 Brusttumorzellen (ATCC # HTB 22). MCF-7 Zellen wurden auf Costar-Platten mit 24 Vertiefungen und F12 (50%) Dulbecco's essentielles Minimalmedium (50%) gegeben, das Serum (10%) (10⁵ Zellen pro Vertiefung) enthielt. Zur Festhaftung standen die Zellen für wenigstens 24 Stunden. Vor dem Test wurden die Zellen in ein Medium ohne Serum für mindestens 1 Stunde überführt. Die Säulenfraktionen (10 bis 100 μl) wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden dann verdampft und die Reaktion wurde durch Zugabe von SDS-PAGE Probenpuffer (100 μl) gestoppt. Die Proben wurden für 5 Minuten auf 100°C erhitzt und Teile (10 bis 15 μl) wurden auf ein Tris-Glycingel aufgetragen (4 bis 20%) (Novex). Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran elektrogeblottet und dann mit Rinderserumalbumin (5%) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (0,05%) (TBST) blockiert. Die Blots wurden mit einem monoklonalen Antikörper (1 : 1.000 Verdünnung) gegen Phosphotyrosin (Upstate Biotechnology) für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur getestet. Die Blots wurden mit TBST gewaschen, mit einem Antikörper gegen Mausimmunoglubolin G, konjugiert gegen alkalische Phosphatase (Promega) (verdünnt 1 : 7.500) für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur überprüft. Reaktive Banden wurden visualisiert mit 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-1-phosphat und Nitro-Blautetrazolium. Immunblots wurden mit einem Scan Jet Plus (Hewlett-Packard) Densitometer gescannt. Die Intensitäten der Signale für die nicht-stimulierten MCF-7 Zellen betrugen 20 bis 30 Einheiten. Voll stimulierte, von p185^erbB2 abstammende Signale hatten 180 bis 200 Einheiten. Der 0,6 M NaCl Pool, welcher die meiste Aktivität enthielt, wurde auf einer Polyaspartinsäure (PolyLC)-Säule aufgetragen, die mit 17 mM Natriumphosphat (pH 6,8), welches Ethanol (30%) enthielt, äquilibriert war. Ein linearer Gradient von 0,3 M bis 0,6 M NaCl in dem Äquilibrierungspuffer wurde verwendet, um die gebundenen Proteine zu eluieren. Ein Aktivitätspeak (bei ca. 0,45 M NaCl) wurde ferner auf einer C4-Umkehrsäule (SynChropak RP-4) weiter fraktioniert, die mit Puffer, der TFA (0,1%) und Acetonitril (15%) enthielt, äquilibriert war. Die Proteine wurden von dieser Säule mit einem Acetonitrilgradienten von 25 bis 40% über 60 Minuten eluiert. Die Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt, hinsichtlich ihrer Aktivität getestet und mit SDS-PAGE auf Tris-Glycingelen (4–20%, Novex) analysiert.
HPLC gereinigte HRG-α wurde mit Lysin C in SDS (0,1%), 10 mM Dithiothreitol, 0,1 M NH₄HCO₃ (pH 8,0) für 20 Stunden bei 37°C verdaut und die erzielten Fragmente wurden auf einer Synchrom C4-Säule aufgelöst (4.000 A, 0,2–10 cm). Die Säule war in 0,1% TFA äquilibriert und wurde mit einem 1-Propanolgradienten in 0,1% TFA (W. J. Henzel, J. T. Stults, C. Hsu, D. W. Aswad, J. Biol. Chem. 264, 15905 (1989)) eluiert. Die Peaks von dem chromatographischen Lauf wurden unter Vakuum getrocknet und sequenziert. Eines der Peptide (eluierend bei etwa 24% 1-Propanol) gab die Sequenz [A]AEKEKTF[C]VNGGEXFMVKDLXNP (SEQ ID Nr. 162). Die Reste in den Klammern waren nicht sicher und ein X stellt einen Zyklus dar, bei dem es nicht möglich war, die Aminosäure zu identifizieren. Der Anfangsertrag betrug 8,5 pMol und die Sequenz entsprach keinem bekannten Protein. Die Reste 1, 9, 15 und 22 wurden später als Cystein in der cDNA-Sequenz identifiziert. Eine direkte Sequenzierung der etwa 45 kD Bande von dem Gel, welches überladen war und auf eine PVDF Membran geblottet wurde, ergab eine geringe Häufigkeitssequenz XEXKE[G][R]GK[G]K[G]KKKEXGXG[K] (SEQ ID Nr. 30) mit einem sehr geringen anfänglichen Ertrag (0,2 pMol). Diese entsprach den Aminosäureresten 2 bis 22 von Heregulin-α (31), was vermuten lässt, dass Serin 2 der NH₂-Terminus von proHRG-α ist. Obgleich der NH₂-Terminus blockiert war, wurde beobachtet, dass gelegentlich eine geringe Menge eines normal blockierten Proteins nicht post-translational modifiziert werden kann.
Die NH₂ terminate Stellung wurde durch Massenspektrometrie des Proteins nach Verdau mit Cyanogenbromid bestätigt. Der COOH-Terminus des isolierten Proteins wurde nicht definitiv identifiziert. Durch Mischungssequenzierung der proteolytischen Fragmente scheint jedoch die Reifesequenz sich nicht über den Rest 241 hinaus zu erstrecken. Die Abkürzungen für die Aminoreste sind: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; 5, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; und Y, Tyr.
Als eine Quelle der cDNA-Klone wurde eine Oligo(dT)-primed λgt10 (T. V. Huynn, R. A. Young, R. W. Davis, λgt10 und λgt11 DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, D. Glover, Ed. (ICR Press, Oxford, (1984)) cDNA-Bibliothek hergestellt (U. Gubler und B. J. Hoffman, Gene 25, 263 (1983)) mit gereinigter mRNA (J. M. Chirwin, A. E. Przbyla, R. J. MacDonald, W. J. Rutter, Biochemistry 18, 5294 (1979)) aus MDA-MB-231 Zellen. Das folgende, achtfach degenerierte Antisens-Deoxyoligonukleotid, welches die 13-Aminosäuresequenz AEKEKTFCVNGGE (SEQ ID Nr. 31) (13) codiert, wurde aufgebaut auf Basis der menschlichen Codonhäufigkeitsoptima (R. Lathe, J. Mol. Biol. 183, 1 (1985)) und chemisch synthetisiert: 5'-CTCGCC (G oder T) CC (A oder G) TTCAC (A oder G) CAGAAGGTCTTCTCCTTCTCAGC-3' (SEQ ID Nr. 40). Für den Zweck eines Sondenaufbaus wurde ein Cystein für einen unbekannten Rest in der Aminosäuresequenz verwendet. Die Sonde wurde durch Phosphorilierung markiert und unter Niedrigstringensbedingungen mit der cDNA-Bibliothek hybridisiert. Das proHRG-α Protein wurde in dieser Bibliothek identifiziert. HRB-β1 cDNA wurde durch Testung einer sekundären Oligo(dT)-primed λgt10-Bibliothek identifiziert, die aus MDA-MB-231Zell-mRNA hergestellt wurde, mit Sequenzen, die von den 5' und 3' Enden von proHRG-α abstammten. Der Klon 13 (2A) war ein Produkt der Testung eines primed (5'-CCTCGCTCCTTCTTCTTGCCCTTC-3' Primers (SEQ ID Nr. 41); proHRG-α Antisens-Nukleotide 33 bis 56) MDA-MB-231 λgt10 Bibliothek mit 5' HRG-α Sequenz. Eine Sequenz, die dem 5'-Ende des Klons 13 entsprach, wurde als eine Sonde verwendet für die Identifizierung von proHRGβ2 und proHRGβ3 in einer dritten Oligo(dT)-primed λgt10 Bibliothek, die von MDA-MB-231 Zell-mRNA abstammte. Zwei cDNA Klone, die für jede der vier HRGs codieren, wurden sequenziert (F. Sanger, S. Milken, A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463 (1977)). Eine andere, als Klon 84 bezeichnete cDNA hatte eine Aminosäuresequenz, die bis zur Aminosäure 420 mit proHRGβ2 identisch war. Dem Stoppcodon in der Position 421 folgt eine unterschiedliche 3' nicht-translatierte Sequenz.
Beispiel 9
Isolierung einer weiteren Spleißvariante
Die Verfahren nach Beispiel 6 ergaben vier nahe verwandte Sequenzen (Heregulin α, β1, β2, β3), die als ein Ergebnis der Spleißvariation entstanden sind. (Peles et al. (Cell 69, 205 (1992) und Wen et al. (Cell 69, 559 (1992)) haben eine andere Spleißvariante (von der Ratte) unter Verwendung eines Reinigungs- und Klonierungsansatzes isoliert, der ähnlich zu dem ist, der in den Beispielen 1 bis 4 und 6 beschrieben ist, wobei ein Protein, dass an p185^erbB2 bindet, beteiligt ist. Der cDNA-Klon wurde wie folgt erzielt (über die Reinigung und Sequenzierung eines p185^erbB2 Bindungsproteins von einer transformierten Fibroplastenzelllinie der Ratte). Ein p185^erbB2 Bindungsprotein wurde aus konditioniertem Medium wie folgt gereinigt. Die konditionierten Medien von drei Ernten von 500 Rollerflaschen (insgesamt 120 Liter) wurden gesammelt und durch Filtration durch 0,2 μ Filter gereinigt und 31-fach mit einem Pelicon-Ultrafiltrationssystem unter Verwendung von Membranen mit einer molekularen Größenabsperrung von 20 kD konzentriert. Alte Reinigungsschritte wurden durchgeführt unter Verwendung eines schnellen-Protein-Flüssigkeitschromatographiesystems von Pharmacia. Das konzentrierte Material wurde direkt auf eine Säule von Heparin-Celtulose (150 ml, preäquilibriert mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) gegeben. Die Säule wurde mit PBS, das 0,2 M NaCl enthielt, gewaschen, bis keine Extinktion bei 280 nm Wellenlänge entdeckt werden konnte. Die gewonnenen Proteine wurden dann mit einem kontinuierlichen Gradienten (250 ml) von NaCl (von 0,2 M bis 1,0 M) eluiert und 5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Proben (0,01 ml) der gesammelten Fraktionen wurden verwendet für den quantitativen Test der Kinase stimulierenden Aktivität. Aktive Fraktionen von drei Säulenläufen (Gesamtvolumen 360 ml) wurden zusammengegeben, auf 25 ml unter Verwendung einer YM10-Ultrafiltrationsmembran (Amicon, Danvers, MA) konzentriert und Ammoniumsulfat wurde zugegeben, um eine Konzentration von 1,7 M zu erzielen. Nach Reinigung durch Zentrifugation (10.000 × g, 15 Minuten) wurde das gepoolte Material auf eine Phenyl-Superose-Säule geladen (HR10/10, Pharmacia). Die Säule wurde entwickelt mit einem 45 ml Gradienten aus (NH₄)₂SO₄ (von 1,7 M bis kein Salz) in 0,1 M Na₂PO₄ (pH 7,4) und 2 ml Fraktionen wurden gesammelt und getestet (0,002 ml pro Probe) für die Kinasestimulierung (wie im Beispiel 6 beschrieben). Der Hauptpeak der Aktivität wurde zusammengefasst und gegen 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,3) dialysiert. Eine Mono-S-Kationenaustauschersäule (HR5/5, Pharmacia) wurde preäquilibriert mit 50 mM Natriumphosphat. Nach Beladung des aktiven Materials (0,884 mg Protein; 35 ml) wurde die Säule mit dem Startpuffer gewaschen und dann entwickelt mit einer Rate von 1 ml/Minute mit einem Gradienten von NaCl. Die stimulierende Kinaseaktivität wurde bei 0,45–0,55 M Salz entdeckt und über vier Fraktionen von jeweils 2 ml verteilt. Diese wurden zusammengefasst und direkt auf eine Cu⁺² Chelatsäule (1,6 ml, HR2/5 Chelatsuperose, Pharmacia) geladen. Der Großteil des Proteins adsorbierte an dem Harz und wurde graduell eluiert mit einem 30 ml linearen Gradienten aus Ammoniumchlorid (0–1 M). Die Aktivität eluierte in einem einzelnen Proteinpeak im Bereich von 0,05 bis 0,2 M NH₄Cl. Proben von den verschiedenen Schritten der Reinigung wurden mit Gelelektrophorese analysiert und anschließend mit Silber gefärbt unter Verwendung eines Kits von ICN (Costa Mesa, CA). Die Proteingehalte wurden bestimmt mit einem Coomassie-Blau-Färbungstest unter Verwendung eines Kits von Bio-Rad (Richmond, CA).
Das p44-Protein (10 μg) wurde in 200 μl von 0,1 M Ammoniumbicarbonatpuffer (pH 7,8) wieder gelöst. Der Verdau wurde durchgeführt mit L-1-Tosyl-Amid-2-phenylethylchlormethylketon behandeltem Trypsin (Serva) bei 37°C für 18 Stunden bei einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1 : 10. Die erzielte Peptidmischung wurde mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen getrennt und bei 215 nm unter Verwendung einer Vydac C4 Mikrosäule (2,1 mm Innendurchmesser × 15 cm, 300 A) und einem HP 1090 Flüssigkeitschromatographiesystems, ausgerüstet mit einem Diodenarraydetektor und einer Arbeitsstation, überwacht. Die Säule wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure (mobile Phase A) äquilibriert und die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 0%–55% mobile Phase B (90% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure) über 70 Minuten durchgeführt. Die Fließrate betrug 0,2 ml/Minute und die Säulentemperatur betrug 25°C. Ein dritter Aliquot der Peptidpeaks, die manuell von dem HPLC-System gesammelt wurden, wurde charakterisiert durch N-terminate Sequenzanalyse durch Edman-Abbau. Die nach 27,7 Minuten (T 27,7) eluierte Fraktion enthielt die gemischten Aminosäuresequenzen und wurde nach Reduktion wie folgt weiter chromatographiert. Ein 70% Aliquot der Peptidfraktion wurde im Vakuum getrocknet und in 100 μl von 0,2 M Ammoniumbicarbonatpuffer (pH 7,8) wieder gelöst. DTT (Endkonzentration 2 mM) wurde der Lösung zugegeben, die dann für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Die reduzierte Peptidmischung wurde dann mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen unter Verwendung einer Vydac-Säule (2,1 mm Innendurchmesser × 15 cm) getrennt. Die Elutionsbedingungen und die Fließrate waren identisch mit dem oben beschriebenen Verfahren. Die Analyse der Aminosäuresequenz des Peptides wurde durchgeführt mit einem Modell 477 Proteinsequenziergerät (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), das mit einem on-line Phenylthiohydantoin (PTH)-Aminosäureanalysator und einem Modell 900 Datenanalysesystem ausgerüstet war (Hunkapiller et al. (1986) In Methods of Protein Microchracterization, J. E. Shively, ed. (Clifton, New Jersey: Humana Press; S. 223–247). Das Protein wurde auf eine Glasfaserscheibe geladen, die mit Trifluoressigsäure behandelt war und präcyclesiert mit Polypren und NaCl. Die PTH-Aminosäureanalyse wurde mit einem Mikroflüssigkeitschromatographiesystem (Modell 120) unter Verwendung von zwei Spritzpumpen und englumigen Umkehrphasen (C-18)-Säulen (Applied Biosystems, 2,1 mm × 250 mm) durchgeführt.
RNA wurde isoliert aus Rat1-EJ Zellen durch Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York (1982) und Poly (A)⁺ wurde selektiert unter Verwendung eines mRNA-Separatorkits (Clontech Lab, Inc., Palo Alto, CA). cDNA wurde synthetisiert mit dem Superscript Kit (von BRL Life Technologies, Inc., Bethesda, MD). Säulen-fraktionierte, doppelsträngige cDNA wurde in einen Sal1- und Not1-geschnittenen pJT-2 Plasmidvektor legiert, ein Derivat von dem pCD-X Vektor (Okayama und Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280 (1983), und transformiert in DH10B E. Coli Zellen durch Elektroporation (Dower et al., Nucl. Acids Res. 16: 6127 (1988)). Etwa 5 × 10⁵ primäre Transformanten wurden mit zwei Oligonukleotidproben getestet, die abstammten von den Proteinsequenzen des N-Terminus von NDF (Reste 5–24) und von dem T40.4 tryptischen Peptid (Reste 7–12). Ihre entsprechenden Sequenzen waren wie folgt (N zeigt alle 4 nt):
Die synthetischen Oligonukleotide wurden endmarkiert mit (γ-³²p)ATP mit T4 Polynukleotidkinase und wurden verwendet, um Replikasets von Nitrocellulosefilter zu screenen. Die Hybridisierungslösung enthielt 6 × SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 2 × Denhardt's Lösung, 50 μg/ml Lachssperma-DNA und 20% Formamid (für Probe 1) oder kein Formamid (für Probe 2). Die Filter wurden entweder bei 50°C mit 0,5 × SSC, 0,2% SDS, 2 mM EDTA (für Probe 1) oder bei 37°C mit 2 × SSC, 0,2% SDS, 2 mM EDTA (für Probe 2) gewaschen. Die Autoradiographie der Filter ergab zehn Klone, die mit beiden Sonden hybridisierten. Diese Klone wurden durch Wiederplattieren und Probenhybridisierung, wie oben beschrieben, gereinigt.
Die cDNA-Klone wurden sequenziert unter Verwendung eines Applied Biosystems 373A automatischer DNA Sequenzierer und Applied Biosystems Taq DyeDeoxy^TM Terminator cycle sequencing Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. In einigen Fällen wurden die Sequenzen erzielt unter Verwendung von [³⁵S]dATP (Amersham) und Sequenase^TM Kits von U.S. Biochemicals gemäß den Anweisungen des Herstellers. Beide Stränge des cDNA-Klons 44 wurden verwendet unter Verwendung der synthetischer Oligonukleotide als Primer. Die Sequenz der meisten 5' 350 nt wurde in sieben unabhängigen cDNA-Klonen bestimmt. Der erzielte Klon zeigte das Muster, welches in der 30 (NDF) gezeigt ist.
Beispiel 10
Strategien für den Nachweis von anderen möglichen Spleißvarianten
Die Ausrichtung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von den cDNA-Klonen und den PCR-Produkten vom Rind mit den veröffentlichten menschlichen (31) und Rattensequenzen zeigen ein hohes Maß an Ähnlichkeit, was anzeigt, dass diese Sequenzen von homologen Genen innerhalb der drei Arten abstammen. Die variable Zahl der Boten-RNA-Transkripte, die auf dem cDNA/PCR Produktenniveau nachweisbar ist, beruht wahrscheinlich auf einem intensiven gewebespezifischen Splicing. Die erzielten und in der 30 gezeigten Muster lassen vermuten, dass andere Spleißvarianten existieren. Eine Liste von wahrscheinlichen Spleißvarianten ist in der 37 angezeigt. Viele von diesen Varianten können durch spezifische codierende Segmenttestung von cDNA-Bibliotheken, die von verschiedenen Geweben abstammen, und durch PCR-Experimente unter Verwendung von Primerpaaren, die spezifisch zu besonderen codierenden Segmenten sind, erzielt werden. Alternativ können die Varianten von spezifischen cDNA-Klonen, PCR-Produkten oder genomischen DNA-Regionen über einen Fachmann bekannte Schneid- und Spleißtechniken zusammengestellt werden. Zum Beispiel kann eine seltene Stelle zum Schneiden mit einem Restriktionsenzym in einem allgemein codierenden Segment (zum Beispiel A) verwendet werden, um den FBA-Aminoterminus von GGF2BPP5 mit den terminalen Carboxysequenzen von GGF2BPP1, GGFBPP2, GGFBPP3 oder GGFBPP4 zu verbinden. Wenn die Gegenwart oder die Abwesenheit von den codierenden Segmenten E und/oder G einen Vorteil für die betrachteten und angegebenen Verwendungen bereitstellt, können diese codierenden Segmente in die Expressionskonstrukte aufgenommen werden. Diese Variantensequenzen können in rekombinanten Systemen exprimiert werden und die rekombinanten Produkte können getestet werden, um die mitogenetische Aktivität auf Schwann-Zellen zu bestimmen sowie hinsichtlich der Fähigkeit an den p185^erbB2 Rezeptor zu binden und diesen zu aktivieren.
Beispiel 11
Identifikation von funktionalen Elementen von GGF
Die abgeleiteten Strukturen der Familie der GGF-Sequenzen zeigen, dass die längsten Formen (repräsentiert durch GGF2BPP4) für Transmembranproteine codieren, wo der extrazelluläre Teil eine Domäne enthält, die dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnelt (siehe Carpenter und Wahl in Peptide Growth Factors and Their Receptors I, Seite 69–133, Springer-Verlag, NY 1991). Die Positionen der Cysteinreste in den codierenden Segmenten C und C/D oder C/D' Peptidsequenzen sind konserviert bezüglich den analogen Resten in der Peptidsequenz des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (siehe 35, SEQ ID Nrn. 151–153). Dies lässt vermuten, dass die extrazelluläre Domäne als Rezeptorerkennungs- und biologische Aktivierungsstelle fungiert. Verschiedene Variantenformen fehlen, wie H, K und L codierende Segmente und können somit als sekreierte, diffusionsfähige, biologisch aktive Proteine exprimiert werden. Die GGF DNA-Sequenzen, die für Polypeptide codieren, welche die EGF-änliche Domäne (EGFL) umfassen, können eine volle biologische Aktivität für die Stimulierung der mitogenetischen Glialzellaktivität besitzen.
Membrangebundene Versionen von diesem Protein können die Schwann-Zellproliferation induzieren, wenn sie auf der Oberfläche von Neuronen während der Embryogenese oder während der Nervenregeneration exprimiert werden (wo die Oberflächen der Neuronen eng assoziiert sind mit den Oberflächen der proliferierenden Schwann-Zellen). Sekregierte (nicht Membran gebundene) GGFs können als klassisch diffusionsfähige Faktoren wirken, die mit den Schwann-Zellen in einiger Entfernung von ihrem Sekretionsort interagieren können. Andere Formen können durch Gewebeverletzung und Zellzerstörung freigesetzt werden. Ein Beispiel für ein sekregiertes GGF ist das Protein, das durch GGF2HBS5 (siehe Beispiel 6) codiert wird. Dies ist das einzig bekannte GGF, das aus der Zelle (Beispiel 7) herausgeführt wird. Sekretion ist wahrscheinlich über eine N-terminate, hydrophobe Sequenz gesteuert, die nur in der Region E gefunden wird, was die N-terminale Domäne darstellt, die innerhalb des rekombinanten GGF-II, das von GGF2HBS5 codiert wird, enthalten ist.
Andere GGFs scheinen nicht sekregiert zu werden (siehe Beispiel 6). Diese GGFs können Formen auf Verletzungsreaktionen sein, die als Konsequenz einer Gewebeschädigung freigesetzt werden.
Andere Regionen der prognostizierten Proteinstruktur von GGF-II (codiert von GGF2HBS5) und andere Proteine, welche die Region B und A enthalten, zeigen Ähnlichkeiten zu dem menschlichen Basalmembran-Heparan-Sulfat-Proteoglycan-Kernprotein (Referenz). Das Peptid ADSGEY, das als nächstes zu dem zweiten Cystein der C2 Immunoglobulinfalte in diesen GGFs lokalisiert ist, tritt in neun von zweiundzwanzig C-2 Wiederholungen auf, die in diesem Basalmembranprotein gefunden werden. Dieser Hinweis lässt stark vermuten, dass diese Proteine mit Matrixproteinen assoziiert sein können, wie solche, die mit Neuronen und der Glial assoziiert sind und es kann ein Verfahren für die Absonderung von Gliawachstumsfaktoren an den Zielorten vermutet werden.
Beispiel 12
Reinigung von GGFs aus rekombinanten Zellen
Um die volle Länge oder Teile von GGFs zu erzielen für den Test auf biologische Aktivität, können die Proteine unter Verwendung von klonierter DNA überproduziert werden. Verschiedene Ansätze können angewandt werden. Eine rekombinante E. Coli Zelle, welche die oben beschriebenen Sequenzen enthält, kann hergestellt werden. Expressionssysteme, wie pNH8a oder pHH16a (Stratagene, Inc.), können für diesen Zweck gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Alternativ können diese Sequenzen in einen Säugetierexpressionsvektor eingefügt werden und eine überproduzierende Zelllinie kann so aufgebaut werden. Für diesen Zweck wurde zum Beispiel DNA, die für einen GGF codiert, Klon GGF2BPP5, in COS-Zellen und in Chinesischen Hamstereizellen exprimiert (siehe Beispiel 7) (J. Biol. Chem. 263, 3521–3527, (1981)). Dieser Vektor enthält die GGF DNA-Sequenzen und kann in Wirtszellen unter Verwendung von etablierten Verfahren transfiziert werden.
Die transiente Expression kann überprüft werden oder G418 resistente Klone können in Gegenwart von Methotrexat wachsen, um solche Zellen auszuwählen, die das dhfr Gen amplifizieren (enthaltend auf dem pMSXND Vektor) und bei dem Verfahren die benachbarte GGF Protein codierende Sequenz co-amplifizieren. Da die CHO-Zellen in einem total serumfreien, proteinfreien Medium (Hamilton und Ham, in vitro 13, 537–547 (1977)) gehalten werden können, kann das gewünschte Protein aus dem Medium gereinigt werden. Western-Analyse unter Verwendung der im Beispiel 9 hergestellten Antiseren kann verwendet werden, um die Gegenwart des gewünschten Proteins in dem konditionierten Medium der überproduzierenden Zellen nachzuweisen.
Das gewünschte Protein (rGGF-II) wurde aus dem Medium gereinigt, das durch transientexprimierende COS-Zellen konditioniert war. rGGF-II wurde von dem konditionierten Medium geerntet und partiell gereinigt unter Verwendung der Kationenaustauscherchromatographie (POROS-HS). Die Säule wurde äquilibriert mit 33,3 mM MES, pH 6,0. Konditionierte Medien wurden mit einer Fließrate von 10 ml/Minute geladen. Der Peak, der die Schwann-Zellproliferationsaktivität enthielt und immunreaktiv war (unter Verwendung der polyklonalen Antiseren gegen ein oben beschriebenes GGFII Peptid) wurde eluiert mit 50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8,0, (50A und 50B).
rGGF-II wurde auch unter Verwendung einer stabilen Eizelllinie vom Chinesischen Hamster exprimiert. rGGF-II von den geernteten, konditionierten Medien wurde teilweise gereinigt unter Verwendung der Kationenaustauscherchromatographie (POROS-HS). Die Säule wurde äquilibriert mit PBS, pH 7,4. Die konditionierten Medien wurden bei 10 ml/Minute beladen. Der Peak, der die Schwann-Zellproliferationsaktivität und die Immunoreaktivität enthielt (unter Verwendung der GGFII polyklonalen Antiseren) wurde eluiert mit 50 mM Hepes, 500 mM NaCl, pH 8,0. Ein zusätzlicher Peak wurde beobachtet bei 50 mM Hepes, 1 M Na Cl, pH 8,0, mit sowohl Proliferation als auch Immunoreaktivitätsaktivität (51).
rGGF-II kann ferner gereinigt werden unter Verwendung der hydrophoben Interaktionschromatographie als ein hochauflösender Schritt, der Kationenaustauscher/Umkehrphasenchromatographie (falls notwendig als zweiter hochauflösender Schritt), eines viralen Inaktivitätsschrittes und eines DNA-Entfernungsschrittes, wie eine Anionenaustauscherchromatographie.
Es folgt eine detaillierte Beschreibung der verwendeten Verfahren:
Die Schwann-Zellproliferationsaktivität des rekombinanten GGF-II Peaks, der von der Kationenaustauschersäule eluiert wurde, wurde wie folgt bestimmt: Die mitogenetischen Reaktionen der kultivierten Schwann-Zellen wurden gemessen in Gegenwart von 5 M Forskolin unter Verwendung des Peaks, der bei 50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8,0, eluiert wurde. Der Peak wurde zugegeben zu 20 1, 10 1 (1 : 10) 10 1 und (1 : 100) 10 1. Die Einlagerung von ¹²⁵I-Uridin wurde bestimmt und nach 18 bis 24-stündiger Exposition exprimiert als (CPM).
Ein Immunoblot unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der gegen ein Peptid von GGF-II gebildet wurde, wurde wie folgt durchgeführt: 10 μl von verschiedenen Fraktionen liefen auf 4–12 Gradientengelen. Die Gele wurden auf Nitrocellulosepapier übertragen und die Nitrocelluloseblots wurden mit 5% BSA blockiert und gegen GGF-II spezifischen Antikörper (1 250 Verdünnung) entwickelt. ¹²⁵I Protein A (1 : 500 Verdünnung, spezifische Aktivität = 9,0/Ci/g) wurde als zweiter Antikörper verwendet. Die Immunoblots wurden auf Kodak Röntenfilmen für 6 Stunden entwickelt. Die Peakfraktionen, die mit 1 M NaCl eluierten, zeigten ein breites immunoreaktives Band bei 65–90 kD, was der erwartete Größenbereich für die GGFII und die Glycoformen mit höheren Molekulargewichten ist.
Die GGF-II Reinigung auf den Kationenaustauschersäulen wurde wie folgt durchgeführt: Konditionierte Medien von CHO-Zellen, welche rGGFII exprimierten, wurden auf die Kationenaustauschersäule mit 10 ml/Minute geladen und die Säule wurde äquilibriert mit PBS, pH 7,4. Die Elution wurde erzielt mit 50 mM Hepes, 500 mM NaCl, pH 8,0, und 50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 8,0. Alle Fraktionen wurden unter Verwendung des hier beschriebenen Schwann-Zellproliferationstests (CPM) analysiert. Die Proteinkonzentration (mg/ml) wurde unter Verwendung des Bradford Tests unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt.
Ein Western-Blot unter Verwendung von 10 μl von jeder Fraktion wurde durchgeführt. Wie in den 51A und 51B angezeigt, comigrierte die Immunoreaktivität und die Schwann-Zellaktivität.
Der hier beschriebene, mitogenetische Schwann-Zelltest kann verwendet werden, um das exprimierte Produkt des Klons mit voller Länge oder jeden biologisch aktiven Teil davon zu testen. Der Klon mit voller Länge GGF2BPP5 wurde transient in COS-Zellen exprimiert. Intrazelluläre Extrakte von transfizierten COS-Zellen zeigen eine biologische Aktivität, wenn sie in dem in Beispiel 1 beschriebenen Schwann-Zellproliferationstest überprüft wurden. Ferner wurde der GGF2HBS5 codierende Klon mit voller Länge transient in CHO und in Insekten (Beispiel 7)-Zellen exprimiert. In diesem Fall zeigten sowohl der Zellextrakt als auch die konditionierten Medien eine biologische Aktivität in dem in Beispiel 1 beschriebenen Schwann-Zellproliferationstest. Jedes Mitglied der spleißvarianten Familie von komplementärer DNAs, die von dem GGF-Gen (einschließlich den Heregulinen), kann auf diese Weise exprimiert und in dem Schwann-Zellproliferationstest durch einen Fachmann getestet werden.
Alternativ kann das rekombinante Material von anderen Varianten gemäß Wen et al. (Cell 69, 559 (1992)) isoliert werden, die die Splicingvariante neu Differenzierungsfaktor (NDF) in COS-7 Zellen exprimierten. CDNA Klone, die in dem pJT-2 eukaryontischen Plasmidvektor inseriert sind, sind unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors und werden 3'-flankiert von den SV40 Terminierungs- und Polyadenylierungssignalen. COS-7 Zellen wurden mit der pJT-2 Plasmid-DNA durch Elektroporation wie folgt transfeziert: 6 × 10⁶ Zellen (in 0,8 ml DMEM und 10% FEBS) wurden in eine 0,4 cm Cuvette überführt und gemischt mit 20 μg Plasmid-DNA in 10 μl TE Lösung (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA). Die Elektroporation wurde bei Raumtemperatur und bei 1.600 V und 25 μF unter Verwendung eines Bio-Rad Gene Pulser Gerätes durchgeführt, wobei die Pulskontrolleinheit auf 200 Ohm eingestellt wurde. Die Zellen wurden dann in 20 ml DMEM, 10% FBS verdünnt und in eine T75 Flasche (Falcon) überführt. Nach 14 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Medium ersetzt durch DMEM, 1% FBS und die Inkubation wurde für weitere 48 Stunden fortgeführt. Konditioniertes Medium, das rekombinantes Protein enthielt, wurde von den Zellen geerntet, was die biologische Aktivität in einer Zelllinie anzeigt, die den Rezeptor für dieses Protein exprimiert. Diese Zelllinie (kultivierte, menschliche Brustkarzinomzelllinie AU 565) wurde mit dem rekombinanten Material behandelt. Die behandelten Zellen zeigten eine morphologische Veränderung, was charakteristisch für die Aktivierung des erbB2 Rezeptors ist. Konditioniertes Medium von diesem Typ kann auch in dem Schwann-Zellproliferationstest getestet werden.
Beispiel 13 Reinigung und Test der anderen Proteine, die den p185^erbB2 Rezeptor binden
I. Reinigung von gp30 und p70
Lupu et al. (Science 249, 1552 (1990)) und Lippman und Lupu (Patentanmeldung Nr. PCT/US91/03443 (1990)), hiermit durch Verweis eingeführt, haben ein Protein aus konditioniertem Medium einer menschlichen Brustkrebszelllinie, MDA-MB-231, wie folgt gereinigt.
Das Sammeln der konditionierten Medien wurde unter Verwendung von bekannten Verfahren durchgeführt. Die Medien wurden 100-fach in einer Amicon Ultrafiltrationszelle (YM5 Membran) (Amicon, Danvers, MA) konzentriert. Nach Reinigung und Konzentrierung wurden die Medien bei –20°C gelagert, wobei aufeinander folgende Sammlungen während den folgenden Tagen gemacht wurden. Die konzentrierten Medien wurden dialysiert unter Verwendung von Spectra/por^® 3 Tubing (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) gegen 100 Volumen von 0,1 M Essigsäure über einen zwei Tageszeitraum bei 4°C. Das Material, welches während der Dialyse gefällt wurde, wurde durch Zentrifugation bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten und bei 4°C entfernt. Proteaseinhibitoren wurden zugesetzt. Die gereinigte Probe wurde dann lyophilisiert.
Lyophilisiertes, konditioniertes Medium wurde in 1 M Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von etwa 25 mg/ml Gesamtprotein gelöst. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 10.000 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten entfernt. Die Probe wurde dann auf eine Sephadex G-100 Säule (XK 16, Pharmacia, Piscataway, NJ) geladen, äquilibriert und mit 1 M Essigsäure bei 4°C mit einem Aufwärtsstrom von 30 ml/Stunde eluiert. 100 ng Protein wurde aus 4 ml von 100-fach konzentriertem Medium gewonnen. Fraktionen, die 3 ml des Eluates enthielten, wurden lyophilisiert und resuspendiert in 300 μl PBS für den Test und dienten als Quelle für die weitere Reinigung.
Sephadex G-100 gereinigtes Material lief auf einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen (HPLC). Der erste Schritt umfasste einen steilen Acetonitrilgradienten. Der steile Acetonitrilgradient und alle anderen HPLC-Schritte wurden bei Raumtemperatur nach Äquilibrierung der C3-Umkehrphasensäule mit 0,05% TFA (Trifluoressigsäure) in Wasser (HPLC-Qualität) durchgeführt. Die Proben wurden geladen und die Fraktionen wurden mit einem linearen Gradienten (0–45% Acetonitril in 0,05% TFA) bei einer Fließrate von 1 ml/Minute über einen Zeitraum von 30 Minuten eluiert. Die Extinktion wurde bei 280 nm aufgenommen. Ein ml Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert vor Analyse auf die EGF-Rezeptor-Konkurrenzreaktion.
Ein zweiter HPLC-Schritt umfasste einen flachen Acetonitrilgradienten. Der Pool der aktiven Fraktionen von dem vorherigen HPLC-Schritt wurde über die gleiche Säule wieder chromatographiert. Die Elution wurde durchgeführt mit einem 0–18% Acetonitrilgradienten in 0,05% TFA über einen Zeitraum von 5 Minuten, worauf sich ein linearer 18–45% Acetonitrilgradient in 0,05% TFA über einen Zeitraum von 30 Minuten anschloss. Die Fließrate betrug 1,0 ml/Minute und 1 ml Fraktionen wurden gesammelt. Der menschliche TGFα-ähnliche Faktor wurde bei einer 30–32% Acetonitrilkonzentration als ein einzelner Peak, nachweisbar durch RRA, eluiert.
Lupu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 2287 (1992)) reinigten ein anderes Protein, das an den p185^erbB2 Rezeptor bindet. Dieses besondere Protein, p75, wurde aus konditioniertem Medium gereinigt, das für das Wachstum von SKBr-3 (eine menschliche Brustkrebszelllinie) verwendet wurde.
Die Zelllinie wurde vermehrt in verbessertem Eagle's Medium (IMEM: GIBCO), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (GIBCO). Das Protein p75 wurde gereinigt aus konzentriertem (100-fach), konditioniertem Medium unter Verwendung einer p185^erbB2 Affinitätssäule. Die 94 Kilodalton extrazelluläre Domäne von p185^erbB2 (die p75 bindet) wurde über eine rekombinante Expression hergestellt und an eine Polyacrylamid-Hydrazido-Sepharose Affinitätschromatographiematrix gebunden. Nach Bindung wurde die Matrix intensiv mit eiskalter, 1,0 M HCl gewaschen und die Kügelchen wurden mit 0,5 M NaNO₂ aktiviert. Die Temperatur wurde auf 0°C für 20 Minuten gehalten. Anschließend wurde filtriert und mit eiskalter 0,1 M HCl gewaschen. 500 ml an konzentriertem, konditioniertem Medium lief aufgrund der Schwerkraft durch die Kügelchen. Die Säule wurde gewaschen und stufenweise eluiert mit 1,0 M Zitronensäure bei pH-Werten von 4,0 bis 2,0 (um die Dissozation von erbB2 und p75 zu erlauben). Alle Fraktionen wurden auf Pharmacia PD10 Säulen entsalzt. Die Reinigung ergab ein homogenes Polypeptid von 75 kDa bei einem 3,0–3,5 Elutions-pH (bestätigt durch Analyse auf SDS/PAGE durch Silberfärbung).
II. Bindung von gp30 an p185^erbB2
Das gereinigte gp30 Protein wurde in einem Test überprüft, um zu bestimmen, ob es an p185^erbB2 bindet. Ein Konkurrenztest mit einem monoklonalen Antikörper gegen p185^erbB2. Das gp30 Protein verdrängte die Antikörperbindung an p185^erbB2 in SK-BR-3 und MDA-MB-453 Zellen (menschliche Brustkarzinomzelllinien, die den p185^erbB2 Rezeptor exprimieren). Die Schwann-Zellproliferationsaktivität von gp30 kann auch nachgewiesen werden durch Behandlung der Schwann-Zellkulturen mit gereinigtem gp30 unter Verwendung des in den Beispielen 1–3 beschriebenen Testverfahrens.
III. Bindung von p75 an p185^erbB2
Um zu bestimmen, ob das 75 kDa Polypeptid (p75), das aus dem SKBr-3 konditioniertem Medium erzielt worden war, tatsächlich ein Ligand für das erbB2 Onkoprotein in den SKBr-3 Zellen ist, wurde ein Verdrängungstest, wie oben für gp30 beschrieben, durchgeführt.
Es wurde gefunden, dass das p75 eine Bindungsaktivität zeigte, wobei das Material von anderen Chromatographiefraktionen solch eine Aktivität nicht zeigte (Daten nicht gezeigt). Das Durchflussmaterial zeigte einige Bindungsaktivität. Dies kann aufgrund der Gegenwart von ausgeschüttetem erbB2 ECD erfolgt sein.
IV. Andere p185^erbB2 Liganden
Peles et al. (Cell 69, 205 (1992)) haben auch einen p185^erbB2 stimulierenden Liganden aus Rattenzellen gereinigt (NDF, siehe Beispiel 8 für die Methode). Holmes et al. (Science 256, 1205 (1992)) haben Heregulin α aus menschlichen Zellen gereinigt, das an 185^erbB2 bindet und dieses stimuliert (siehe Beispiel 6). Tarakovsky et al. Onkogene 6: 218 (1991) haben die Bindung eines 25 kD Polypeptides, das aus aktivierten Makrophagen isoliert worden war, an den neu Rezeptor gezeigt, eine p185^erbB2 Homologie, hier durch Verweis eingeführt.
VI. NDF-Isolierung
Yarden und Peles (Biochemistry 30, 3543 (1991) haben ein 35 kD Glycoprotein identifiziert, das den 185^erbB2 Rezeptor stimuliert. Das Protein wurde in konditioniertem Medium gemäß dem folgenden Verfahren identifiziert. I-EJ Rattenzellen wuchsen bis zum Zusammenströmen in 175 cm² Flaschen (Falcon). Einzelschichten wurden mit PBS gewaschen und in einem serumfreien Medium für 10 bis 16 Stunden belassen. Das Medium wurde verworfen und durch frisches, serumfreies Medium ersetzt, das nach dreitägiger Kultur gesammelt wurde. Das konditionierte Medium wurde durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit gereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle mit einer YM2-Membran (Absperrung bei einem Molekulargewicht von 2.000) konzentriert. Die biochemischen Analysen der neu stimulierenden Aktivität in dem konditionierten Medium zeigten, dass der Ligand ein 35-kD Glycoprotein ist, welches hitzestabil aber empfindlich gegenüber einer Reduktion ist. Der Faktor ist entweder durch hohe Salzkonzentrationen oder durch sauren Alkohol fällbar. Eine partielle Reinigung des Moleküls durch selektive Fällung, Heparin-Agarose-Chromatographie und Gelfiltration in verdünnter Säure führte zu einem aktiven Liganden, der zur Stimulierung des protoonkogenen Rezeptors in der Lage ist, und der aber nicht wirksam ist auf tumorerzeugendes neu Protein, welches konstitutiv aktiv ist. Die gereinigte Fraktion zeigte jedoch die Fähigkeit auch zur Stimulierung des verwandten Rezeptors von EGF, was vermuten lässt, dass diese zwei Rezeptoren durch einen bidirektionalen Mechanismus funktional verbunden sind. Alternativ interagiert der angenommene Ligand simultan mit beiden Rezeptoren. Die dargestellte biochemische Charakterisierung des Faktors kann benutzt werden, um einen vollständig gereinigten Faktor zu erzielen, mit dem diese Möglichkeiten zu testen sind.
In anderen Publikationen beschreiben Davis et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 1536 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 8582 (1991) und Greene et al., PCT-Patentanmeldung PCT/US91/02331 (1990) die Reinigung eines Proteins aus konditioniertem Medium einer menschlichen T-Zell (ATL-2)-Zelllinie.
Die ATL-2 Zelllinie ist eine IL-2 unabhängige HTLV-1 (+) T Zelllinie. Mycoplasmenfreie ATL-2 Zellen wurden in RPMI 1640 Medium, das 10% FCB enthielt, als Kulturmedium (10% FCS-RPMI 1640) bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ gehalten.
Für die Reinigung der proteinartigen Substanz wurden die ATL-2 Zellen zweimal in 1 × PBS gewaschen und zu 3 × 10⁵ ml in serumfreiem RPMI 1640 Medium/2 mM L-Glutamin kultiviert für 72 Stunden. Anschließend wurden die Zellen pelletiert. Der Kulturüberstand, der so hergestellt wurde, wird als „konditioniertes Medium" (C. M.) bezeichnet.
C. M. wurde 100-fach von 1 Liter auf 10 ml konzentriert unter Verwendung einer YM-2 Diaflo-Membran (Amicon, Boston, MA) mit einer Absprerrung bei 1.000 Dalton. Zur Verwendung bei einigen Tests wurde konzentriertes Kulturmedium, das Komponenten mit einem größeren Molekulargewicht als 1.000 enthielt, wieder auf das Ursprungsvolumen mit RPMI Medium verdünnt. Eine Gelelektrophorese unter Verwendung eines Polyacrylamid-Gradientengels (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MD oder Phorecast System by Amersham, Arlington Heights, IL) mit anschließender Silberfärbung von einigem Material aus diesem zwei-Säulen-gereinigtem Material von der 1 Liter Zubereitung ergab wenigstens vier bis fünf Banden, von denen die 10 kD und die 20 kD Banden für dieses Material einzigartig waren. Passiertes Kulturmedium mit Komponenten mit einem Molekulargewicht von weniger als 1.000 wurde ohne Verdünnung verwendet.
Konzentriertes, konditioniertes Medium wurde filtersterilisiert mit einem 0,45 μ Uniflo-Filter (Schleicher und Schuell, Keene, NH) und dann weiter gereinigt durch Anwendung einer DEAE-SW Anionenaustauschersäule (Waters, Inc., Milford, MA), die zuvor mit 10 mM Tris-Cl, pH 8,1, preäuquilibriert worden war. Konzentrierte C. M. Proteine, die 1 Liter des ursprünglichen ATL-2 konditionierten Medium pro HPLC-Lauf darstellten, wurden an die Säule absorbiert und dann mit einem linearen Gradienten von 0 mM bis 40 mM NaCl bei einer Fließrate von 4 ml/Minute eluiert. Die Fraktionen wurden getestet unter Verwendung eines in vitro Immunkomplex-Kinasetests mit 10% der geeigneten DEAE-Fraktion (ein Säulen gereinigtes Material) oder 1% der geeigneten C18 Fraktion (zwei Säulen gereinigtes Material). Die Aktivität, welche die Tyrosinkinaseaktivität von p185c-neu in einer dosisabhängigen Weise unter Verwendung des in vitro Immunkomplex-Kinasetests ansteigen ließ, wurde als ein dominanter Peak über vier bis fünf Fraktionen (36–40) bei etwa 220 bis 240 mM von NaCl eluiert. Nach HPLC-DEAE Reinigung wurden die Proteine in den aktiven Fraktionen konzentriert und vereinigt, konzentriert und einer C18 (Millionenmatrix) Umkehrphasenchromatographie (Waters, Inc. Milford, MA) (bezeichnet als der C18 + 1 Schritt oder zwei Säulen gereinigtes Material) unterworfen. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 2-Propanol gegen 0,1% TFA durchgeführt. Alle Fraktionen wurden gegen RPMI 1640 Medium dialysiert, um das 2-Propanol zu entfernen, und unter Verwendung des in vitro Immunkomplex-Kinasetests getestet, der unten beschrieben ist, und eine 1% Konzentration der geeigneten Fraktion. Die Aktivität, welche die Tyrosinkinaseaktivität in p185c-neu ansteigen ließ, wurde in zwei Peaks eluiert. Ein Peak eluierte in der Fraktion 11–13, während ein zweiter, etwas weniger aktive Peak in den Fraktionen 20–23 eluierte. Diese zwei Peaks entsprachen etwa 5 bis 7% Isopropanol beziehungsweise 11 bis 14% Isopropanol. C18#1 erzeugte Fraktionen 11–13 wurden in den Charakterisierungsstudien verwendet. Die aktiven Fraktionen, die von dem zweiten Chromatographieschritt erzielt wurden, wurden zusammengefasst und als die proteinartige Substanzprobe bezeichnet.
Eine 20 Liter Zubereitung verwendete die gleiche Reinigungsstrategie. Die DEAE aktiven Fraktionen 35–41 wurden gesammelt und einer C18 Chromatographie, wie oben diskutiert, unterworfen. Die C18#1 Fraktionen 11–13 und 21–24 hatten beide eine dosisabhängige Aktivität. Der Pool der Fraktion 11–13 wurde einem zusätzlichen C18 Chromatographieschritt unterworfen (bezeichnet als C18#2 oder drei Säulen gereinigtes Material). Wiederum hatten die Fraktionen 11–13 und 21–24 die Aktivität. Die Dosisreaktion der Fraktion 23 wurde durch den in vitro Immunkomplex-Kinasetest, wie im Beispiel 8 beschrieben, bestimmt und kann erzielt werden durch Zugabe von 0,005 Volumenprozent an Fraktion 23 und 0,05 Volumenprozent an Fraktion 23. Dies stellt die größte erzielte Reinheit dar.
Die Molekulargewichtsbereiche wurden auf Basis einer Gelfiltrationschromatographie und einer Ultrafiltrationsmembrananalyse bestimmt. Nahezu gleiche Mengen an Tyrosinkinaseaktivität wurden beibehalten und passierten einen Filter mit einer Absperrung bei einem Molekulargewicht von 10.000. Fast die gesamte Aktivität passierte einen Filter mit einer Absperrung bei einem Molekulargewicht von 30.000. Die Molekulargewichtsbereiche für die aktiven chromatographischen Fraktionen wurden bestimmt durch Vergleich der Fraktionen, welche die dosierungsabhängige, neu aktivierende Aktivität enthielten, mit den Elutionsprofilen eines Satz an Proteinen als Molekulargewichtsstandards (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), die unter den gleichen Laufbedingungen erzeugt wurden. Eine Aktivität mit einem niedrigen Molekulargewicht wurde zwischen 7.000 und 14.000 Daltons identifiziert. Ein zweiter Bereich an Aktivität ergab sich bei 14.000 bis etwa 24.000 Daltons.
Nach der Gelelektrophorese unter Verwendung eines Polyacrylamid- Gradientengels (integrated Separation Systems, Hyde Park, MD oder Phorecase System von Amersham, Arlington Heights, IL), wurde die Silberfärbung des drei Säulen gereinigten Materials (C18#2) mit einem kommerziell verfügbaren Silberfärbungskit (BioRad, Rockville Centre, NY) durchgeführt. Die Fraktionen 21, 22, 23 und 24 von der C18#2 Reinigung der 20 Liter Zubereitung liefen mit den Markern. Die Fraktionen 22 und 23 zeigten die höchsten Dosierungsreaktionen in dem 185^erbB2 (neu) Kinasetest (siehe unten). Die Tatsache, dass die ausgewählten Molekulargewichtsfraktionen mit 185^erbB2 interagieren, wurde mit einem Immunkomplex-Kinasetest demonstriert.
Huang et al. (1992, J. Biol. Chem. 257: 11508–11512), hiermit durch Referenz eingeführt, isolierten einen zusätzlichen neu/erbB2 Ligandenwachstumsfaktor aus der Rinderniere. Der 25 kD Polypeptidfaktor wurde durch ein Verfahren mit Säulenfraktionierung und anschließender sequenzieller Säulenchromatographie auf DEAE/Cellulose (DE52), Sulfadex (sulfatiertes Sephadex G-50), Heparin-Sepharose 4B und Superdex 75 (schnelle Proteinflüssigchromatographie) isoliert. Der Faktor, NEL-GF, stimuliert die tyrosinspezifische Autophosphorilierung des neu/erbB2 Genproduktes.
VII. Immunkomplextest NDF für die Ligandenbindung an p185^erbB2
Dieser Test zeigt die Unterschiede in der Autophosphorilierungsaktivität von immungefälltem p185 durch die Präinkubation von PN-NR6 Zelllysat mit verschiedenen Mengen von ATL-2 konditioniertem Medium (C. H.) oder der proteinartigen Substanz, und wird folgenden bezeichnet als die neu aktivierende Aktivität.
Die bei dem Immunkomplex-Kinasetest verwendeten Zelllinien wurden erzielt, hergestellt und kultiviert gemäß den Verfahren, die offenbart sind in Kokai et al., Cell 55, 287–292 (Juli 28, 1989), deren Offenbarungen hiermit durch Verweis eingeführt sind, als seien sie selbst hier aufgeführt, und in der US-Anmeldung mit der Nummer 386,820, eingereicht am 27. Juli 1989 im Namen von Mark I. Green, bezeichnet „Methods of Treating Cancerous Cells with Anti-Receptor Antibodies", deren Offenbarungen hiermit durch Verweis eingeführt sind als seien sie vollständig hier aufgeführt.
Die Zelllinien wurden alle erhalten in DMEM Medium, das 5% FCS enthielt, als das Kulturmedium (5% FCS-DMEM) bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre bei 5% CO₂.
Dichte Kulturen von Zellen in 150 mm Schalen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen, in 10 ml gefrorenem-aufgetauten Puffer (150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 20 mM Hepes, pH 7,2, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 1% Aprotinin) gekratzt und zentrifugiert (600 × 6, 10 Minuten). Zellpellets wurden resuspendiert in 1 ml Lysispuffer (50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 3% Brij 35, 1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl₂, 1% Aprotinin, 1 mM EGTA, 20 μM Na₃VO₄, 10% Glycerin) und für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Alle Chemikalien stammten von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, soweit nichts anderes angegeben ist. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 40.000 × g für 30 Minuten entfernt. Der klare Überstand, der im folgenden verwendet wurde, wird als Zelllysat bezeichnet.
Die Zelllysate wurden für 15 Minuten mit 50 μl von 50% (Volumen/Volumen) Protein A-Sepharose (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) inkubiert und für zwei Minuten zentrifugiert, um die Lysate zu klären. 50 μl Aliquots der geklärten Zelllysate wurden auf Eis für 15 Minuten mit konditioniertem Medium, der proteinartigen Substanz oder anderen Faktoren, wie spezifiziert, in einem Endvolumen von 1 ml mit Lysispuffer inkubiert. Die Proben wurden dann mit 5 μg von 7,164 monoklonalem Antikörper inkubiert, der die extrazelluläre Domäne von p185neu und p185c-neu erkennt, oder mit anderen geeigneten Antikörpern für 20 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend erfolgte eine 20 Minuten Inkubation mit 50 μl von 50% (Volumen/Volumen) Protein A-Sepharose mit Drehung bei 4°C. Immunkomplexe wurden durch Zentrifugation gesammelt, viermal mit 500 μl Waschpuffer (50 mM Hepes, pH 7,5, 0,1% Brij 35, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Aprontinin, 30 μm Na₃VO₄) gewaschen, dann zweimal mit Reaktionspuffer (20 mM Hepes (pH 7,4), 3 mM MnCl₂ und 0,1% Brij 35, 30 μm Na₃VO₄). Die Pellets wurden resuspendiert in 50 μl Reaktionspuffer und (Gamma-³³P)-ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,2 μm zu erzielen. Die Proben wurden bei 27°C für 20 Minuten inkubiert oder bei 4°C für 25 Minuten mit reineren Proben. Die Reaktionen wurden beendet durch Zugabe von 3 × SDS Probenpuffer, der 2 mM ATP und 2 mM EDTA enthielt, und wurden dann bei 100°C für 5 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann einer SDS-PAGE Analyse aus 10% Acrylamidgel unterworfen. Die Gele wurden gefärbt, getrocknet und mit Kodak XAR oder XRP Film mit Verstärkerfolien entwickelt.
VIII. Reinigung der den Acetylcholin-Rezeptor induzierenden Aktivität (ARIA)
ARIA, ein 24 kD Protein, welches die Acetylcholin-Rezeptorsynthese stimuliert, wurde im Labor von Gerald Fischbach (Falls et al., Cell 72: 801–815 (1993)) isoliert. ARIA induziert die Tyrosinphosphorilierung eines 185 kD Muskelmembranproteins, das p185^erbB2 ähnelt und die Acetylcholinrezeptorsynthese in kultivierten Embryomyotubes stimuliert. Die Sequenzanalyse der cDNA Klone, die ARIA codieren, zeigt, dass ARIA ein Mitglied der GGF/erbB2 Ligandengruppe von Proteinen ist, wobei dies potentiell nützlich bei der Stimulierung der Gliazellmitogenese und anderen Anwendungen von zum Beispiel GGF2, wie hier beschrieben, ist.
Beispiel 14
Proteintyrosinphosphorilierung, vermittelt durch GGF in Schwann-Zellen
Schwann-Zellen der Ratte zeigen eine Stimulierung der Proteintyrosinphosphorilierung (36) nach Behandlung mit ausreichenden Mengen an Gliawachstumsfaktor, um die Proliferation zu induzieren. Unterschiedliche Mengen an partiell gereinigtem GGF wurden bei einer primären Kultur von Schwann-Zellen der Ratte gemäß dem Verfahren, das im Beispiel 3 dargestellt ist, angewandt. Die Schwann-Zellen wuchsen in DMEM/10% fötales Kalbsserum/5 μM Forskolin/0,5 μg pro ml GGF-CM (0,5 ml pro Vertiefung) in Poly-D-Lysin beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen. Wenn die Zellen zusammenflossen, wurden die Zellen mit DMEM/10% fötalem Kälberserum mit 0,5 ml pro Vertiefung gefüttert und in einem Inkubator über Nacht belassen, um sie still zu legen. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 0,2 ml von DMEM/10% fötalem Kälberserum gefüttert und im Inkubator für 1 Stunde belassen. Testproben wurden dann direkt dem Medium mit verschiedenen Konzentrationen zugesetzt und für verschiedene Zeiträume, wie erforderlich. Die Zellen wurden dann in kochendem Lysispuffer (Natriumphosphat, 5 mM, pH 6,8; SDS, 2%, β-Mercapteothanol, 5%; Dithiothreitol, 0,1 M; Glycerin, 10%; Bromphenol-Blau, 0,4%; Natriumvanadat, 10 mM) lysiert, im kochenden Wasserbad für 10 Minuten inkubiert und dann entweder direkt analysiert oder bei –70°C eingefroren.
Die Proben wurden analysiert durch einen Lauf auf 7,5% SDS-PAGE Gelen und durch Elektroblotting auf Nitrocellulose unter Verwendung der Standardverfahren, wie sie beschrieben sind von Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76: 4350–4354. Die geblottete Nitrocellulose wurde mit Antiphosphotyrosin-Antikörper unter Verwendung von Standardverfahren getestet, wie sie beschrieben sind in Kamps und Selton (1983), Oncogene 2: 305–315. Die entwickelten Blots wurden über Nacht einem Autoradiographiefilm ausgesetzt und unter Verwendung eines Standardlaborentwicklers entwickelt. Die densiometrischen Messungen wurden durchgeführt unter Verwendung eines Ultrascan XL Enhanced Laserdensitometer (LKB). Die Molekulargewichtsbestimmungen wurden relativ zu vorgefärbten Standards mit hohem Molekulargewicht (Sigma) gemacht. Die Dosisreaktionen der Proteinphosphorilierung und der Schwann-Zellproliferationen waren sehr ähnlich (36). Das Molekulargewicht der phosphorilierten Bande ist sehr nahe an dem Molekulargewicht von p185^erbB2. Ähnliche Resultate wurden erzielt, wenn Schwann-Zellen direkt mit konditionierten Medien behandelt wurden, die von COS-Zellen hergestellt wurden, die mit dem GGF2HBS5 Klon translatiert worden waren. Diese Ergebnisse korrelieren sehr gut mit der erwarteten Interaktion der GGFs mit und der Aktivierung von 185^erbB2.
Dieses Experiment wurde mit rekombinantem GGF-II wiederholt. Das konditionierte Medium, das von einer CHO Zelllinie abstammte, die stabil mit dem GGF-II Klon (GGF2HBS5) transformiert war, stimulierte die Proteintyrosinphosphorilierung unter Verwendung des oben beschriebenen Tests. Pseudotransfizierte CH Zellen stimulierten diese Aktivität nicht ( 52).
Beispiel 15
Test für die Schwann-Zellproliferation durch den Proteinfaktor aus der MDA-MB-231 Zelllinie
Die Schwann-Zellproliferation wird vermittelt durch das konditionierte Medium, das von der menschlichen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 abstammt. Am Tag 1 des Tests wurden 10⁴ primäre Schwann-Zellen der Ratte in 100 μl von Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium gegeben, das mit 5% fötalem Rinderplasma pro Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen ergänzt war. Am Tag 2 des Tests wurden 10 μl des konditionierten Mediums (von der menschlichen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, kultiviert wie in Beispiel 6 beschrieben) zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zugesetzt. Am Tag 6 wurde die Zahl der Schwann-Zellen pro Platte bestimmt unter Verwendung eines sauren Phosphatasetests (gemäß dem Verfahren von Connolly et al. Anal. Biochem. 152: 136 (1986)). Die Schale wurde mit 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 100 μl Reaktionspuffer (0,1 M Natriumacetat, (pH 5,5), 0,1% Triton X-100 und 10 mM p-Nitrophenylphosphat) wurde pro Vertiefung zugesetzt. Die Schale wurde bei 37°C für 2 Stunden inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl von 1 N NaOH gestoppt. Die optische Dichte von jeder Probe wurde in einem Spektrophotometer bei 410 mm bestimmt. Eine 38% Stimulation der Zellzahl von Schwann-Zellen, die mit konditioniertem Medium behandelt waren, gegenüber einer Kontrollzelllinie (HS-294T, ein Nichtproduzent von den erbB-2 Liganden) wurde beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Protein, das durch die MDA-MB-231Zelllinie abgegeben wird (welche eine p185^erbB2 Bindungsaktivität abgibt), die Schwann-Zellproliferation stimuliert.
Beispiel 16
N-Glykosilierung von GGF
Die Proteinsequenz, die von der cDNA Sequenz der GGF-II Kandidatenklone GGF2BPP1, 2 und 3 abgeleitet ist, enthält eine Reihe an Consensus-N-Glykosilierungsmotiven. Eine Lücke in der GGFII02 Peptidsequenz stimmt mit dem Asparaginrest in einem von diesen Motiven überein, was anzeigt, dass ein Kohlenhydrat wahrscheinlich an dieser Stelle gebunden ist.
Die N-Glykosilierung der GGFs wurde untersucht durch Beobachtung der Mobilitätsveränderungen auf SDS-PAGE nach Inkubation mit N-Glycanase, was ein Protein ist, das die kovalenten Bindungen zwischen Kohlenhydraten und Asparaginresten in Proteinen spaltet.
Die N-Glycanasebehandlung von GGF-II ergab eine Hauptbande bei MW 40–42 kDa und eine kleinere Bande bei 45–48 kDa. Aktivitätselutionsexperimente unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigten eine einzelne, aktive deglykosilierte Spezies von etwa 45–50 kDa.
Aktivitätselutionsexperimente mit GGF-I zeigten auch eine Zunahme der elektrophoretischen Mobilität, wenn eine Behandlung mit N-Glycanase erfolgte, was eine aktive Spezies von MW 26–28 kDa ergab. Die Silberfärbung bestätigte, dass eine Mobilitätsveränderung vorlag, obgleich keine N-deglycolisierte Bande entdeckt werden konnte aufgrund der Hintergrundfärbung in der verwendeten Probe.
Hinterlegung
Die Nukleinsäure, codierend für GGF-II (cDNA, GGF2HBS5) Protein (Beispiel 6) in einem Plasmid pBluescript 5k unter der Kontrolle des T7 Promotors wurde hinterlegt bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 2. September 1992 und erhielt die ATCC Zugangsnummer 75298. Der Anmelder erkennt seine Verantwortlichkeit hinsichtlich des Ersatzes dieses Plasmides, wenn dieses vor Ende des Ablaufs des herausgegebenen Patentes nicht lebensfähig werden sollte, sowie seine Verantwortlichkeit hinsichtlich der Information des ATCC bei der Erteilung von solch einem Patent, wobei dann die Hinterlegung der Öffentlichkeit verfügbar gemacht werden wird. Vor diesem Zeitpunkt wird die Hinterlegung verfügbar sein durch den „Commissioner of Patents" gemäß 37 CFR § 1.14 und 35 USC § 112.
Sequenzliste

Claims

Polypeptid, das von einem GGF/p185erbB2-Ligandengen codiert wird und mit einem p185erbB2-Rezeptor interagiert, wobei das Polypeptid eine E-Domäne, die von SEQ ID Nr. 163 codiert wird, oder eine E-Domäne, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 210 umfasst, und eine dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnliche Domäne umfasst, die a) eine C-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 177) und entweder eine C/D-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 178) oder eine C/D'-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 143) in der 5' zu 3'-Reihenfolge C-C/D oder C-C/D'; b) die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 151, 152, 220, 221, 222, 223, 224 oder 225; oder c) die Aminosäuren 362–411 von SEQ ID Nr. 170 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Zellteilung von Gliazellen induziert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Acetylcholinrezeptor-Synthese in einer Zelle induziert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Myelinisierung einer Neuralzelle durch eine Gliazelle induziert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 170 umfasst.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, welche für das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 21 umfasst.
Rekombinanter Vektor, umfassend das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, das funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist.
Zelllinie, die mit dem isolierten Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6 transformiert oder transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptides nach Anspruch 1, welches die Bereitstellung der Zelllinie nach Anspruch 9, die Kultivierung dieser Zelllinie unter Bedingungen, welche die Expression der Nukleinsäuresequenz erlauben, und die Isolierung des Polypeptides umfasst.
Antikörper, der spezifisch zu einem Polypeptid nach Anspruch 1 ist.
Verfahren zur Reinigung eines Polypeptides mit einer mitogenen Aktivität für Gliazellen, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Zellextraktes mit einem Antikörper nach Anspruch 11 umfasst.
Verfahren zur Identifizierung der Gegenwart eines Rezeptors für das Polypeptid nach Anspruch 1 in einer Probe, welches das Inkontaktbringen der Probe mit dem Polypeptid und die Bestimmung einer Bindung zwischen der Probe und dem Polypeptid umfasst, wobei eine Bindung die Gegenwart des Rezeptors anzeigt.
Pharmazeutische oder Veterinärformulierung, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1, weiches für die pharmazeutische oder die Veterinäranwendung zusammen mit einem akzeptablem Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel und/oder in einer Einheitsarzneiform formuliert ist.