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Insulinzubereitungen, Verfahren zu deren Herstellung und
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deren Verwendung Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von
neuartigen Insulinzubereitungen mit verzögerter Wirkung, die Herstellung von stabilisierten
Insulinzubereitungen für den Einsatz in automatischen Dosiergeräten, sowie deren
Verwendung zur Behandlung des Diabetes Mellitus.
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Es ist allgemein bekannt, daß an die parenterale Substitutionstherapie
mit Insulin spezielle Anforderungen gestellt werden. Dazu zählt insbesondere die
Frage einer verzögerten Pharmakokinetik, die es erlaubt, den Diabetiker mit einer
oder einigen wenigen Injektionen am Tag einzustellen. Zur Erzielung solcher Depoteffekte
existieren einige klinisch bewährte Prinzipien, darunter die Verwendung von Zink
oder Protaminsulfat als Depothilfsstoffe.
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Diese bekannten Depotprinzipien beruhen auf dem physikalischen Effekt
der langsamen Wiederauflösung einer bei physiologischem pH-Wert schwerlöslich vorliegenden
Form des Insulins, z.B. in Form des 2-Zink-Kristalls. Weist dabei das Präparat bereits
einen neutralen pH auf, was hinsichtlich der chemischen Stabilität bei langer Lagerung
vorteilhaft ist, so sind diese Präparate Suspensionen, die vor der Dosierung sehr
sorgfältig homogen aufgeschüttelt werden müssen, um Fehldosierungen zu vermeiden.
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Die bisher bekannten Insulin-Depotpräparate weisen darüberhinaus sehr
spezifische und nur innerhalb gewisser Grenzen durch Zusatz von gelöstem Insulin
variierbare Wirkprofile auf. Es gibt nun immer Patienten, für die alternative Wirkprofile,
z.B. solche mit etwas weniger schnellem Einsetzen bei etwa gleich langer Wirkung,
wünschenswert sind. Hat der Arzt solche Präparate zur Verfügung, so kann er auf
die spezifischen Gewohnheiten und Eigenheiten des Diabetikers eingehen. Würde man
hingegen vom Patienten die Umstellung seiner Gewohnheiten fordern, so würde dieses
das
Problem der Patienten-"Compliance" mit sich bringen, die letztlich wesentlich den
Therapieerfolg beeinflußt.
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Kraegen et al. berichten in Brit. Med. J. 1975,3, 464 -466 von einem
stabilisierenden Effekt eines Zusatzes von bis zu 3,5 % Haemaccel zu sehr verdünnten
Insulinlösungen (0,04 I.E./ml), wodurch sich unter anderem die Adsorption des Insulins
am Vorratsgefäß und Schlauchsystem in Infusionsystemen verhindern läßt.
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Es wurde nun gefunden, daß wäßrige Insulinzubereitungen, die bei 40C
eine Viskosität von mindestens 1,75 mPa-s und eine Insulinkonzentration von über
1 I.E./ml haben, überraschenderweise eine verbesserte physikalische Stabilität und
andere verbesserte Eigenschaften, z.B. hinsichtlich des Wirkprofils aufweisen. Nach
einer Ausführungsform der Erfindung können die Insulinzubereitungen noch zusätzlich
eine physiologisch verträgliche oberflächenaktive Substanz enthalten, wodurch sich
die Stabilität, insbesondere in Peristaltikpumpen, weiter erhöhen läßt.
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Diese Zubereitungen sind gegen mechanische Belastung, insbesondere
bei erhöhter Temperatur, z.B. Schütteln und Pumpbewegungen besonders gut stabilisiert.
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Die Frage der Stabilität von Insulinzubereitungen ist schon bisher
ein schwieriges Problem gewesen. So ist bekannt, daß gelöste Proteine wie Insulin
an Grenzflächen (dazu gehört auch die Grenzfläche wäßrige Lösung/Luft) adsorbiert
werden (C.W.N. Cumber und A.E. Alexander Trans. Faraday Soc. 46, 235 (1950)). Als
Folge dieser Adsorption an Grenzflächen werden verschiedene Sekundärreaktionen beobachtet,
die man allgemein unter dem Begriff "Denaturierung" zusammenfaßt. Es kommt zu einer
Formänderung der adsorbierten Proteinmoleküle (Anderung der Tertiär- und/oder Sekundärstruktur).
Daneben kann es zur Aggregation von adsorbierten Molekülen zu löslichen oder unlöslichen
polymeren Formen kommen. Auch die bei der Passage von Insulinlösungen durch enge
Kanäle auftretende Turbulenz scheint eine
Insulin-Denaturierung
zu begünstigen.
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Als ein Haupthindernis bei der Weiterentwicklung und der klinischen
Anwendung kontinuierlicher Infusionsvorrichtungen hat sich die Neigung des Insulins,
aus handelsüblichen Lösungen auszufallen und dadurch mechanische Teile sowie Versorgungswege
zu verstopfen, erwiesen.
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Weiterhin gibt es die Tendenz, die Größe dieser Vorrichtungen zu reduzieren,
um so implantierbare Systeme zu erhalten, wodurch sich ein Bedarf an höher konzentrierten,
stabilen Insulinlösungen ergibt, was wiederum die obengenannten Probleme noch schwerwiegender
macht.
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Die Frage der physikalischen Stabilität von Insulinlösungen wird insbesondere
seit der Entwicklung von automatlscilen Dosiergeräten diskutiert. Es ist allgemein
bekannt, daß in solchen Geräten speziell stabilisierte Insuline verwendet werden
müssen. Im Zusammenhang mit ungenügender physikalischer Stabilität von Insulinen
wird nicht nur eine reduzierte biologische Wirksamkeit, sondern neuerdings auch
ein über Stimulation der Makrophagen ablaufender Prozeß der Bildung von Amyloid-A-Protein
im Serum, das zur Amyloidose in verschiedenen Organen führen kann, diskutiert (Brownlee
et al., Lancet (1984), 411 - 413) Zur Lösung dieser Probleme ist schon eine Reihe
von Vorschlägen gemacht worden: Aus der DE-A 29 17 535 sind wäßrige Insulinlösungen
bekannt, die zum Schutz gegen Denaturierung eine oberflächenaktive Substanz der
allgemeinen Formel I
in der Ra Wasserstoff, Methyl oder Athyl, p die Zahl 2 - 80, vorzugsweise 8 - 45,
bedeuten und Rb und Rc gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Alkylalkoholreste
mit 1 - 20 C-Atomen, Carbonsäurereste mit
2 - 20 C-Atomen, Alkylphenolreste
mit einer Alkylkette von 1 - 10 C-Atomen oder Alkylaminreste mit 1 - 20 C-Atomen
bedeuten, als Homopolymerisat, Blockpolymerisat oder Mischpolymerisat in einer Konzentration
von 2 bis 200 mg/l enthalten.
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In der EP-A 18609 werden gegen Denaturierung beständige wäßrige Lösungen
von Insulin und einer Vielzahl anderer Proteine beschrieben, die gekennzeichnet
sind durch einen Gehalt an einer oberflächenaktiven Substanz mit kettenförmiger
Grundstruktur, deren Glieder schwach hydrophobe und schwach hydrophile Bereiche
in alternierender Anordnung enthalten.
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Die WO-A 83/00288 beschreibt stabile wäßrige Insulinzubereitungen
zur Anwendung in Insulindosiervorrichtungen, die einen pH-Wert von 6,5 bis 9 aufweisen
und die bis zu 1000 ppm eines Polyoxyäthylenalkyläthers der Formel R7-o-[CH2-CH2-o]m-H
(II) enthalten, worin R7 eine gesättigte oder ungesättigte (C8-C15)-Alkylgruppe
und m eine ganze Zahl von 2 bis 25 bedeuten.
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Aus der DE-A 32 40 177 sind schAießlich physikaisch stabilisierte
Insulinlösungen bekannt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie stabilisierende
Mengen an einem Phospholipid der Formel III enthalten
in der R4 und R5, die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoff, Alkylcarbonyl,
Alkenylcarbonyl, Alkandienylcarbonyl, Alkantrienylcarbonyl oder Alkantetraenylcarbonyl
stehen, mit der Maßgabe, daß R4 und R5 nicht gleichzeitig Wasserstoff sind, und
in der R6 für eine hydrophile Gruppe steht.
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Diese grenzflächenaktiven Stabilisatoren sind äußerst effektiv, indem
sie die Schüttelstabilität von Insulinlösungen deutlich erhöhen. Unzweifelhaft ist
das Schütteln ein wesentlicher negativer Einfluß auf das Insulin in Dosiergeräten.
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Nun hat sich aber gezeigt, daß insbesondere in Peristaltikpumpen das
Quetschen des Elastomer-Pumpschlauchs und/ oder Schereffekte, wie sie bei vielen
Pumpprinzipien auftreten, zusätzlich die Insulinstabilität beeinträchtigen.
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Auf diese Weise kann es trotz Zusatz der verschiedenen bisher bekannten
Stabilisatoren zu Insulinpräzipitation in Pumpschläuchen oder Kathetern kommen.
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Unter l'Insulinenll werden hier wie im folgenden einheitliche Produkte
oder Gemische mehrerer Insuline, und zwar nicht nur Humaninsulin und Insuline tierischen
Ursprungs, wie Säugerinsuline (beispielsweise aus Rind oder Schwein) verstanden;
man versteht darunter auch Insuline im weiteren Sinn, d.h. modifizierte Insuline,
wie des-PheBl-Insuline (vgl. z.B. DE-PS 20 05 658, EP-A 46 979) oder am C-Terminus
der B-Kette basisch modifizierte Insuline (wie Insulin-B31-Arg-OH oder Insulin-B31-Arg-Arg-OH,
vorgeschlagen in den deutschen Patentanmeldungen P 33 26 472.11, P 33 27 709.5,
P 33 33 640.7, P 33 34 407.8) und humanes oder andere Proinsuline oder Proinsulinanaloge
(vgl. z.B.
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DE-A 32 32 036) sowie die Alkali- und Ammoniumsalze.
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Es können auch mehrere dieser Insuline im Gemisch vorliegen. Die Insulinkonzentration
kann, abhängig von der Löslichkeit, bis etwa 1500 I.E./ml betragen, vorzugsweise
liegt sie zwischen 5 und etwa 1000 I.E./ml. In Depotformen kann ein beliebiger Anteil
eines oder mehrerer Insuline unabhängig voneinander jeweils in gelöster, amorpher
und/ oder kristalliner Form vorliegen.
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Als Verdickungsmittel (auch Geliermittel genannt) kommen physiologisch
verträgliche Polymere in Frage, wie Kollagen und seine Folgeprodukte, wie Gelatine,
Oxypolygelatine (Gelifundol (R)), modifizierte flüssige Gelatine (Physiogel (R)),
Gelatinepartialhydrolysate, die auch, z.B.
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mit Diisocyanaten, vernetzt sein können, (Polygeline, Haemaccel (R))
oder Polysaccharide und der Abkömmlinge, z.B. Dextrane, Laevane und Hydroxyäthylstärken,
oder auch Polyvinylpyrrolidon. Ein Teil der genannten Substanzen findet auch in
kolloidalen Plasmaersatzmitteln Verwendung.
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Die Verdickungsmittel bewirken, daß die Insulinzubereitung bei niedrigen
Temperaturen, z.B. 40C leicht dickflüssig bis dickflüssig oder als Hydrogel vorliegt.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen haben vorzugsweise eine Viskosität von mindestens
2 und insbesondere eine solche von mindestens 2,5 mPas. Die Gele verflüssigen sich
z.T. schon bei Raumtemperatur oder bei Temperaturen nahe Körpertemperatur.
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Die erfindungsgemäßen Zubereitungen, die eine hohe physikalische Stabilität
haben, enthalten vorzugsweise mehr als 1, insbesondere zwischen 2 und 20 Gew.-%
Verdickungsmittel. Doch können auch beim Zusatz geringerer Mengen Verdickungsmittel
schon Hydrogele entstehen; beispielsweise genügt hierzu der Zusatz von etwa 0,2
% Agar oder 0,6 % Gelatine. Nach oben hin kann der Gehalt an Geliermittel, abhängig
von dessen Art, 30 % und mehr betragen.
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Bei genügend hohem Anteil an Verdickungsmittel ist allen Zubereitungen
gemeinsam, daß sie unter Lagerungsbedingungen in fester Form als Hydrogel vorliegen.
Dies ist ein Vorteil in Bezug auf die physikalische Stabilität, da bekanntlich Oligomerenbildung
und Denaturierung durch Bewegung stark beschleunigt werden, also prinzipiell beim
Handhaben von flüssigen Insulinzubereitungen nicht sicher ausgeschlossen werden
können. Die Lagerung in Gelform kann
auch deshalb vorteilhaft sein,
weil diese Form bei der Lagerung wesentlich homogener bleibt als eine Lösung bzw.
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Suspension. Es ist z.B. bei sedimentierten Kristallsuspensionen bei
langer Lagerung durchaus denkbar, daß sich relativ stabile Kristallassoziate bilden,
die dann weniger leicht zu einer homogenen Suspension aufgeschüttelt werden können,
so daß Dosierungsfehler eintreten können. Liegt dagegen die Kristallsuspension homogen
in einem Gel "eingefroren vor, so können die Insulinmoleküle nur langsam an die
Gefäßwand oder die Grenzfläche Flüssigkeit/Luft diffundieren, und es sind solche
Effekte auszuschließen.
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Außerdem sind Bewegungen und Turbulenzen innerhalb der Gele während
der Handhabung erheblich reduziert. Die Zubereitungen, vor allem solche mit einem
Gehalt an oberflächenaktiven Substanzen, weisen daher eine besonders gute Lagerstabilität
auf.
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Vor der Anwendung werden die Gele, wie auch bei konventionellen Insulinen
üblich, auf Raum- bis Körpertemperatur gebracht, wobei sie sich verflüssigen, aber
trotzdem noch eine gegenüber konventionellen Insulinlösungen erhöhte Viskosität
aufweisen. Normalerweise werden dann Suspensionen nicht sofort sedimentieren, so
daß Inhomogenitäten und Dosierungsfehler weniger leicht auftreten können; ein Inhomogenitätsproblem
existiert selbstverständlich bei klaren Gelzubereitungen nicht. In jedem Fall lassen
sich die gebräuchlichen Injektionsgeräte verwenden.
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Die erhöhte physikalische Stabilität der erfindungsgemäßen Gele ist
auch noch bei Körpertemperatur, also in flüssigem Zustand, zu einem gewissen Maß
vorhanden. Werden solche Lösungen in einem Rotationsversuch bei 370C thermischmechanisch
belastet, so läßt sich eine relative Stabilität von ca. 3 bis 5 gegenüber konventionellen
Insulinlösungen beobachten, die kein Verdickungsmittel enthalten.
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Von den Insulinzubereitungen mit einem Gehalt an oberflächenaktiven
Substanzen sind solche bevorzugt, die eine aus der EP-A 18 609 bekannte oberflächenaktive
Substanz mit kettenförmiger Grundstruktur enthalten, deren Glieder schwach hydrophobe
und schwach hydrophile Bereiche in alternierender Anordnung aufweisen, insbesondere
solche, die ein Polymerisat, und zwar Homopolymerisat, Mischpolymerisat oder Blockpolymerisat,
der Formel R2Y-Xn - R3 (IV) sind, in der X eine Kette von n Gliedern der Formeln
-0H(R1)ffi0H(R1 )-0- (V) oder -CH(R1)-O- (VI) in beliebiger Reihenfolge und n= 2
- 80, vorzugsweise 8 - 45,ist, Y -0- oder -NH- und R1= H, -CH3 oder 02115 sind,
wobei die Reste R1 gleich oder verschieden sein können, jedoch mindestens in der
Hälfte der Kettenglieder X -OH oder -C H vorkommt, und in der R2 und R3 3 25 unabhängig
voneinander H oder ein organischer Rest sind.
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R2 und R3 bedeuten vorzugsweise jeweils Alkyl mit 1 - 20 C-Atomen,
Carboxyalkyl mit 2 - 20 C-Atomen oder Alkylpheny mit 1 - 10 Alkyl-C-Atomen, R2 ist
jedoch, falls Y -NH-bedeutet, nur Alkyl mit 1 - 20 C-Atomen. R2 und/oder R3 können
auch mehrwertig und mit drei oder mehreren Polyalkoxyketten Xn zu verzweigten Produkten
verbunden sein.
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Diese Verbindungen sind schon in Konzentrationen von 2 - 200 mg/l
wirksam.
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Als oberflächenaktive Substanzen können ferner die aus der DE-A 32
110 177 bekannten Phospholipide der obengenannten Formel III, in der R4 und R5 die
dort gerlarlrlte Bedeutung haben und jeweils 8 bis 22, vorzugsweise etwa 12 - 22
C-Atome enthalten, Verwendung finden.
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Die Konzentration dieser Verbindungen beträgt im allgemeinen 1 bis
20, vorzugsweise 1 bis 10, insbesondere 2,5 bis 7,5 Gewichts-%. Beispiele solcher
hydrophilen Gruppen sind 2-(Trimethylammonium)äthyl, 2-Aminoäthyl, 2-Carboxy-2-aminoäthyl,
2,3-Dihydroxypropyl oder 2,3,4,5 ,6-Pentahydroxycyclohexyl.
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Bevorzugt sind Verbindungen, in denen R4 und R5 je für Alkylcarbonyl
stehen. Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, in denen R6 für 2-(Trimethylammonium)äthyl
steht, wobei solche Verbindungen als Lecithine bekannt sind und solche Verbindungen,
in denen R4 und R5 je für Alkylcarbonyl mit etwa 8 bis 16 C-Atomen oder mit etwa
12 bis 16 C-Atomen und in denen R6 für 2-(Trimethylammonium) äthyl stehen, insbesondere
solche Verbindungen, in denen R4 und R5 je für Octanoyl stehen.
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Weiterhin kommen als oberflächenaktive Substanzen die aus der DE-A
29 17 535 und die aus der WO-A 83/00288 bekannten Polyoxyalkylenverbindungen in
Frage, z.B.
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Verbindungen der obengenannten Formel II, in welcher R7 für Alkyl
mit 8 bis 15 C-Atomen oder eine entsprechende olefinische Gruppe steht und m eine
ganze Zahl von 2 bis 25 bedeutet. Diese Verbindungen werden im allgemeinen in einer
Menge von 0,01 bis 20, vorzugsweise bis zu 10 Gewichts-% zugesetzt. R7 ist vorzugsweise
(C12 oder 013) Alkyl, m vorzugsweise 4 bis 23, insbesondere 6 bis 15.
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Alle erfindungsgemäßen Zubereitungen lassen sich prinzipiell aus gelöstem
oder aus amorphem oder kristallinem Insulin herstellen (klare bzw. trübe Gele).
Sie weisen im allgemeinen einen pH-Wert zwischen 2,5 und 8,5, insbesondere aber
zwischen 6 und 8 auf, enthalten vorzugsweise ein geeignetes Isotoniemittel, ein
geeignetes Konservierungsmittel und gegebenenfalls eine geeignete Puffersubstanz,
z.B. die weiter unten genannten. Der Wirkstoff liegt vorzugsweise gelöst vor.
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Die erfindungsgemäßen Zubereitungen ohne oberflächenaktive Substanzen
weisen im Tierversuch gegenüber entsprechenden Vergleichszubereitungen ohne Zusatz
von Verdickungsmitteln eine deutlich verzögerte Wirkung auf, wobei der Verzögerungseffekt
mit steigendem Anteil an Verdickungsmittel zunimmt (Fig. 3). Dies ist äußerst überraschend,
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besondere für jene untersuchten Zubereitungen, die bei Körpertemperatur
klar flüssig sind, bei denen der bei anderen Depotformen vorhandene Schwerlöslichkeitseffekt
(Kristalle oder amorphe Suspensionen) also nicht vorliegt.
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Es ist auch möglich, dn.Depoteffekt durch Kombination mit geläufigen
Hilfsmitteln mit verzögernder Wirkung, wie etwa durch Zugabe geeigneter Mengen von
Zink, Surfen, Globin oder Protaminsulfat, zu verstärken. Die zugesetzte Zinkmenge
kann dabei bis zu 100 iig In2 /100 Insulineinheiten betragen; bevorzugt liegt sie
über 35 und meistens unter 50 ßg Zu2+/100 Insulineinheiten. Die Protaminmenge kann
z.B. zwischen 0,28 mg und 0,6 mg pro 100 Einheiten betragen (bezogen auf Protaminsulfat).
Auf diese Weise sind bisher nicht zugängliche, besonders lang wirksame Präparationen
herstellbar, deren Anwendung interessant ist, weil nach neueren Erkenntnissen aus
der Therapie mit Insulindosiergeräten gerade eine Basalmenge an Insulin therapeutisch
vorteilhaft erscheint.
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Als physiologisch unbedenkliches und mit den Insulinen verträgliches
Trägermedium eignet sich eine sterile wäßrige Lösung, die zu Blut in der üblichen
Weise, z.B. durch Glycerin, Kochsalz, Glucose, isotonisch gemacht wird und daneben
noch eines oder mehrerer der gebräuchlichen Konservierungsmittel, z.B. Phenol, m-Kresol,
Benylalkohol oder p-Hydroxybenzoesäureester, enthält. Das Trägermedium kann zusätzlich
eine Puffersubstanz, z.B. Natriumacetat, Natriumcitrat, Natriumphosphat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
enthalten. Zur Einstellung des pH werden verdünnte Säuren (typischerweise HC1) bzw.
Laugen (typischerweise NaOH) verwendet.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von gegen
mechanische Belastung stablisierten wäßrigen Insulinzubereitungen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man einer wäßrigen Insulinzubereitung ein physiologisch verträgliches Geliermittel
und gegebenenfalls eine
physiologisch verträgliche oberflåchenaktive
Substanz zusetzt. Die Zubereitungen zeichnen sich durch besondere Stabilität und
- bei subkutaner oder intramuskulärer Gabe -durch eine verzögerte Wirkung aus.
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Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Insulinzubereitungen
bei der Behandlung des Diabetes mellitus, insbesondere mittels Vorrichtungen zur
kontinuierlichen Insulinabgabe sowie die Verwendung der Zubereitungen zur Vermeidung
der Adsorption oder Denaturierung von Insulin an Oberflächen und anderen Phasengrenzflächen,
insbesondere bei der Reinigung durch Chromatographie oder Kristallisation, bei Lagerung
und bei der therapeutischen Anwendung.
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Die erfindungsgemäßen Insulinzubereitungen können zur Behandlung des
Diabetes mellitus parenteral, d.h. intravenös, subkutan oder intramuskulär appliziert
werden. Der Depoteffekt der Zubereitungen mit oder ohne oberflächenaktive Substanzen
zeigt sich am ausgeprägtesten bei der subkutanen Applikationsweise, ist aber auch
deutlich bei intramuskulärer Injektion. Intravasal appliziert wirken die erfindungsgemäßen
klar gelösten Zubeteitungen rasch wie die bekannten gelösten Insuline. Sie sind
daher hervorragend geeignet zur Verwendung in automatischen Dosiergerätes, wie Pumpen,
bei denen das infundierte Insulin sofort wirksam sein muß, da nur so eine rasche
Steuerung, z.B. entsprechend dem Blutglucosespiegel, möglich ist.
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Bei einigen Dosierprinzipien ist es nötig, oder zumindest vorteilhaft,
entgaste Insulinlösung in das Reservoir einzufüllen. Luft, in Verbindung mit Werkstoffkontakt,
stellt, wie vielfach gezeigt, die nachteiligste Umgebung für Insulin dar. Dies ist
bei konventionellen Lösungen ein praktisches Problem, da vom Hersteller evtl. entgaste
Lösungen durch Bewegung (z.B. Transport) und Diffusion letztlich wieder Luft lösen.
Demgegenüber unterliegt ein
erstarrtes Gel, das als Flüssigkeit
entgast wurde, viel weniger diesem Einfluß ; auf ein umständliches Entgasen (und
der damit verbundenen Gefahr von Unsterilitäten) direkt vor der Anwendung in der
Pumpe kann dann möglicherweise verzichtet werden.
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Ein weiterer praktischer Vorteil der erfindungsgemäßen Zubereitungen
kann darin bestehen, daß, falls es sich um bei der Lagertemperatur erstarrte Gele
handelt, ein direkter Kontakt mit dem Stopfen vermieden wird. Die üblichen Stopfen
neigen nämlich z.B. zur Absorption der Stabilisatoren, was in Anbetracht der teilweise
geringen Mengen problematisch sein kann.
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Zur weiteren Erläuterung sollen die folgenden Beispiele dienen, ohne
daß die Erfindung auf diese eingeschränkt wäre. Die darin hergestellten Zubereitungen
haben bei 400 sämtlich eine Viskosität von über 1,75 mPas. Die Ziffern bei Dextran,
z.B. 60, geben, mit 103 multipliziert, das Molgewicht an. Das destillierte Wasser
war jeweils p.i.
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vom pH 7,3. Polygeline ist ein Produkt der Behringwerke AG, Marburg.
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Beispiele 1 bis 3) - Insulin-Zubereitungen mit 20 % Polygeline Gemäß
Beispiel 1 wurden unter sterilen Bedingungen vereinigt je eine sterile Lösung von
a) 250 g Polygeline, lyophylisiert, in dest. Wasser, auf 1 1 aufgefüllt, und b)
4,464 g Humaninsulin (28 I.E./mg), 21,25 g Glycerin, 7,50 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
3,375 g Phenol, so viel wasserfreiem Zinkchlorid, daß der Gesamt-Zink-Gehalt 0,035
g betrug, und 0,0125 g Polypropylenglykol, dem beidseitig jeweils etwa 5 % Polyäthylenglykol
anpolymerisiert worden war (mittleres Molekulargewicht 1800), in dest. Wasser auf
250 ml aufgefüllt.
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Gemäß Beispiel 2 wurde Beispiel 1 wiederholt mit der Ab-
weichung,
daß der Lösung b) kein Polypropylenglykol zugesetzt war.
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Gemäß Beispiel 3 wurden unter sterilen Bedingungen vereinigt je eine
sterile Lösung von a) 200 g Polygeline, in dest. Wasser, auf 800 ml aufgefüllt,
und von b) 1,429 g Humaninsulin (28 I.E./mg), 1,50 g m-Kresol, 1,00 g Phenol, 17,00
g Glycerin, so viel wasserfreiem Zinkchlorid, daß der Gesamt-Zink-Gehalt 0,028 g
betrug und 0,030 g Lecithin, in dest. Wasser, auf 200 ml aufgefüllt.
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Die gemäß Beispielen 1 bis 3 hergestellten Lösungen werden in üblicher
Weise in Glasfläschchen abgefüllt. Bei ca.
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1500 erstarrten sie als klare Gele mit 100 I.E./ml.
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4 bis 8) Insulinzubereitungen mit 8 bzw. 16 % Dextran Nach Beispielen
4 und 5 wurden unter sterilen Bedingungen vereinigt je eine sterile Lösung von a)
180 g Dextran 60 bzw. 160 g Dextran 60, in dest. Wasser auf 800 ml aufgefüllt, und
von b) 3,571 g Humaninsulin (28 I.E./mg), 6,00 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
2,00 g m-Kresol, 1,00 g Phenol, 17,00 g Glycerin und so viel wasserfreiem Zinkchlorid,
daß der Gesamt-Zink-Gehalt 0,028 g betrug, und 0,010 g Polypropylenglykol (s. Beispiel
1) in dest. Wasser, auf 200 ml aufgefüllt.
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Diese Zubereitungen wurde in üblicher Weise in Glasfläschchen abgefüllt.
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Nach Beispielen 6 bis 8 wurden analog Beispiel 4 Insulinzubereitungen,
jedoch mit 10 bzw. 20 % Dextran unterschiedlichen Molekulargewichts hergestellt
(s. Tabelle 1).
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9) Proinsulinzubereitung mit 20 % Polygeline Unter sterilen Bedingungen
wurden vereinigt je eine sterile Lösung von
a) 20 g Polygeline
in dest. Wasser, auf 80 ml aufgefüllt, und von b) 100 mg Proinsulin vom Schwein,
0,21 g NaH2PO4e2H2O, 0,30 g m-Kresol, so viel wasserfreiem Zinkchlorid, daß der
Gesamt-Zink-Gehalt 0,0012 g betrug, und 0,010 g Polyoxyäthylen-23-lauryläther vom
Molekulargewicht 1200 in dest. Wasser auf 20 ml aufgefüllt.
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10 + 11) Insulin-Zubereitung mit 8 % Polygeline Unter sterilen Bedingungen
wurden vereinigt Je eine sterile Lösung von a) 1 1 einer 10 %igen Lösung von Polygeline
und b) gemäß Beispiel 10 1,786 g Schweineinsulin bzw.
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gemäß Beispiel 11, 1,786 g Humaninsulin (jeweils 28 I.E./mg) und
4,25 g Glycerin, 1,50 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 2,50 g Phenol und so viel
wasserfreiem Zinkchlorid, daß der Gesamt-Zink-Gehalt 0,014 g betrug, in dest. Wasser,
auf 250 ml aufgefüllt.
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Die so hergestellten Zubereitungen enthielten nach biologischem Test
40 I.E./ml.
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Physikalische Stabilität der Zubereitungen gemäß Beispielen 1 und
4 bis 8 In einem standardisierten Pumpversuch durch eine Peristaltikpumpe (370C,
Bewegung, Pumprate 12 I.E./d) wurden folgende Stabilitätsdaten erhalten:
Tabelle
1 Lösung Zeitraum bis zur relative ersten Trübung ~ Stabilität H-Insulin Hoechst(R)
3 Tage 1 Zubereitung b) nach Beispiel 1,mit dest. Wasser 45 Tage 15 auf 1,25 1 aufgefüllt
Zubereitung nach Beispiel 1 >80 Tage >27 Zubereitung mit 8 % Dextran (Beispiel
4) >60 Tage >20 Zubereitung mit 16 % Dextran (Beispiel 5) >80 Tage >27
Zubereitung mit 10 % Dextran 32 (Beispiel 6) >60 Tage >20 Zubereitung mit
10 % Dextran 100 (Beispiel 7) >60 Tage >20 Zubereitung mit 20 % Dextran 100
(Beipiel 8) >80 Tage >27 Physikalische Stabilität der Zubereitungen gemäß
Beispielen 2 und 10 In einem standardisierten Rotationsversuch bei 370C, 1 Hz, werden
jeweils 5 Fläschchen einer Zubereitung nach Beispiel 2 und 10 getestet. Zum Vergleich
wurde ein Standardinsulin untersucht.
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Tabelle 2 Lösung Zeitraum bis zur relative ersten Trübung Stabilität
H-Insulin Hoechst(R) 2 Tage 1 Zubereitung b) nach Beispiel 10, mit dest. Wasser
4 Tage 2 auf 1,25 1 aufgefüllt Zubereitung nach 15 Tage 7,5 Beispiel 2 Zubereitung
nach 22 Tage 11 Beispiel 10
Physikalische Stabilität der Zubereitungen
gemäß Beispielen 3 und 9 Die hergestellten Lösungen wurden in einem standardisierten
Umpumpversuch durch eine Peristaltikpumpe (370C, Bewegung, rezyklisierendes Pumpen
mit einer Rate von 5 ml/h= 500 I.E./h= 12000 I.E./d) auf ihre physikalische Stabilität
untersucht.
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Tabelle 3 Lösung Zeitraum bis zur relative ersten Trübung ~~ Stabilität
H-Insulin Hoechst(R) 20 h 1 Zubereitung mit 20 % Polygeline (Beispiel 3) > 7
Tage > 8 Zubereitung gemäß Beispiel 3, Lösung b)* 2 Tage 2,4 Zubereitung mit
20 % Polygeline (Beispiel 9) > 7 Tage > 8 Zubereitung gemäß Beispiel 9, Lösung
b)* 30 h 1,5 * jeweils ohne Polygeline, jedoch auf 1 1 (Beispiel 3) bzw. 100 ml
(Beispiel 9) mit dest. Wasser aufgefüllt.
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12 + 13) kristalline Insulin-Zubereiung mit 10 bzw. 20 % Poligeline
Unter sterilen Bedingungen wurden vereinigt Je eine sterile Lösung von a) 125 bzw.
250 g Polygeline, lyophylisiert,in dest. Wasser, auf 1 1 aufgefüllt, b) 2,10 g NaH2PO4
2H2O, 16,00 g Glycerin, 0,60 g Phenol und 1,50 g Kresol in dest. Wasser, auf 100
ml aufgefüllt, und c) eine sterile Kristallsuspension von 1,786 g Humaninsulin (28
I.E./mg), 0,159 g Protaminsulfat, 0,525 g NaH2PO4s2H20, 4,00 g Glycerin, 0,15 g
Phenol, 0,375 g
m-Kresol und so viel wasserfreiem Zinkchlorid,
daß der Gesamt-Zink-Gehalt 0,0108 g betrug, in dest. Wasser, auf 150 ml aufgefüllt.
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Diese Suspensionen wurden in handelsübliche Glasfläschchen abgefüllt.
Man ließ dann bei 40C direkt nach der Abfüllung erstarren, wobei sich homogen trübe
Gele mit 40 I.E./ml mit 10 bzw. 20 % Polygeline bildeten.
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Sedimentationsversuch der Suspensionen gemäß Beispielen 12 und 13
Fläschchen der Suspensionen wurden ohne Bewegung bei 370C inkubiert und durch das
Septum eine Kanüle bis an den Gefäßboden, eine zweite knapp unter den Meniskus eingeführt.
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Ohne Bewegung des Fläschchens wurde in bestimmten Zeitabständen jeweils
ein Aliquot entnommen und der Insulingehalt mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
(High Performance Liquid Chromatography) bestimmt. Es wurden folgende Werte, berechnet
in I.E./ml, ermittelt.
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Tabelle 4 Entnahme 10 % Polygeline (Bsp.12) 20 % Polygeline (Bsp.
13) nach Gefäßboden Meniskus Gefäßboden Meniskus 0 min 40 I.E./ml 40 I.E./ml 40
I.E./ml 40 I.E./ml 5 min 41 39 41 40 15 min 41 40 40 41 30 min 40 40 40 41 60 min
46 35 40 40 120 min 66 14 46 35 14 + 15) Insulinzubereitungen mit 8 bzw. 16 % Dextran
60 mit verzögerter Wirkung Unter sterilen Bedingungen wurden vereinigt je eine sterile
Lösung von a) 80 bzw. 160 g Dextran 60 in dest. Wasser, auf 800 ml aufgefüllt, und
von
b) 1,455 g desPhe-(B1)-Schweineinsulin (27,5 I.E./mg), 17,00
g Glycerin, 6,00 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 1,50 g m-Kresol und 1,00 g
Phenol, in dest.
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Wasser, auf 200 ml aufgefüllt.
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Diese Lösungen, die bei 40C dickflüssig vorlagen, wurden in handelsübliche
Fläschchen gefüllt. Nach biologischem Test betrug die Wirksamkeit jeweils 40 I.E./ml.
In einer Dosierung von 0,2 I.E:/kg am Kaninchen wirken diese Insulinpräparate bei
s.c. Applikation so stark oder stärker verzögert als ein handelsübliches Neutral-Protamin-Hagedorn-Verzögerungspräparat
(Abb. 4).
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16) Insulinzubereitung mit 20 % Polygeline Unter sterilen Bedingungen
wurden vereinigt eine sterile Lösung von a) 200 g Polygeline, gelöst in dest. Wasser,
auf 800 ml aufgefüllt, und von b) 3,571 g Humaninsulin (28 I.E./mg), 2,10 g NaH2PO4v2H2O,
2,00 g m-Kresol und 1,00 g Phenol gelöst in dest. Wasser,auf 200 ml aufgefüllt.
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Das Präparat wurde in handelsübliche Fläschchen gefüllt.
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Der biologische Test ergab eine Wirksamkeit von 100 I.E./ml Die verzögerte
Wirkung wurde am Kaninchen bestätigt.
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17 - 19) Insulinzubereitungen mit 20 % Dextran unterschiedlichen
Molekulargewichts und deren verzögerte Wirkung.
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Unter sterilen Bedingungen wurden vereinigt je eine sterile Lösung
von a) 20 g Dextran 32 (Beispiel 17) bzw. Dextran 60 (Beispiel 18) bzw. Dextran
100 (Beispiel 19) in dest. Wasser, auf 80 ml aufgefüllt, und von b) 0,0071 g Humaninsulin
(28 I.E./mg), 0,60 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,20 g m-Kresol, 0,10 g Phenol,
17,00 g Glycerin und so viel wasserfreiem Zinkchlorid, daß der Gesamt-Zink-Gehalt
0,0028 g betrug, in dest.
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Wasser, auf 20 ml aufgefüllt.
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Diese Lösungen zeigten am Kaninchen in einer Dosierung von 0,2 I.E./kg
bei s.c. Applikation eine stark verzögerte Wirkung (Abb. 5). Die Wirkungsdauer war
am Kaninchen etwa gleich lange wie die von Basal-H-Insulin Hoechst(R).
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Wirkprofil von Insulinzubereitungen gemäß Beispielen 1, 2, 11, 14,
15 und 17 bis 19 A) i.v. Applikation am Hund und am Kaninchen Es wurden von der
Zubereitung gemäß Beispiel 1 jeweils 0,2 I.E./kg Körpergewicht in die Ohrvene appliziert.
Als Vergleichsinsulin diente Humaninsulin Hoechst(R) (11). Fig.
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1 und 2 zeigen den zeitlichen Verlauf des Blutglucosespiegels (x +
SEM). Die Werte wurden aus Messungen an jeweils 5 Tieren ermittelt. Die Zubereitung
gemäß Beispiel 1 (I) war sowohl beim Hund (Fig. 1) als auch beim Kaninchen (Fig.
2) so schnell oder sogar eher noch schneller wirksam als der Vergleich Altinsulin
(II).
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B) s.c. Applikation am Kaninchen Mit einer entsprechenden Placebolösung
wurden die Zubereitungen auf jeweils 10 I.E./ml verdünnt und dann in einer Dosierung
von 0,2 I.E./kg an jeweils 5 Kaninchen subcutan appliziert. Die Blutglucosewerte
(x+SEM) wurden nach 0, 0,5, 1, 2, 3, 5 und 7 h gemessen. In Figur 3 sind die bei
Applikation einer Lösung von Humaninsulin analog Beispiel 11 (Kurve I), einer Lösung
analog Beispiel 2 (Kurve II), sowie einer Lösung analog Beispiel 2, aber ohne Polygelinezusatz
(Kurve III) dargestellt. In Figur 4 sind die bei Applikation einer Lösung von desPhe-(Bl)-Schweininsulin
erhaltenen Werte gemäß Beispiel 14 (Kurve I), Beispiel 15 (Kurve II) sowie einer
handelsüblichen Suspension eines Human-Insulin-Verzögerungspräparats (Basal-Insulin-Hoechst
)) (Kurve III) wiedergegeben. In Figur 5 sind die gleichen Werte für Zubereitungen
gemäß Beispielen 17 (Kurve I), 18 (Kurve II), 19 (Kurve III) und für das genannte
Human-Insulin-Verzögerungspräparat (Kurve IV) wiedergegeben. In Figur 6 sind die
gleichen Werte für eine Zu-
bereitung gemäß Beispiel 1 (Kurve I)
und für das genannte Human-Insulin-VerzöSerungspräparat (Kurve II) wiedergegeben.
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In den Figuren 1 bis 6 deutet die Länge der Abstriche bei den einzelenen
Meßwerten in üblicher Weise die Standardabweichung vom Mittelwert (SEM) an.
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