DE2606118A1

DE2606118A1 - Gamma-globuline fuer intravenoese injektion und verfahren zur herstellung von solchem gamma-globulin

Info

Publication number: DE2606118A1
Application number: DE19762606118
Authority: DE
Inventors: Myer Louis Coval
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1976-02-16
Publication date: 1976-08-26
Also published as: CA1064396A; FR2301266B1; DE2606118C2; FR2301266A1; US4093606A

Description

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MYER LOUIS GOVAL, Oakland, California / USA

Gamma-Globuline für intravenöse Injektion und Verfahren zur Herstellung von solchem Gamma-Globulin

Die Erfindung "betrifft Gamma-Globuline, die sich zur intravenösen Injektion eignen, und ein Verfahren zur Herstellung von Gamma-Globulin.

Das Gamma-Globulin, die Immunoglobulin G (IgG)-Fraktion von gepooltem Plasma, enthält Antikörper für viele infizierende Agenzien. Immunoglobuline sind wirksam bei der klinischen Behandlung einer großen Zahl von Krankheitszuständen. Sie werden in der Prophylaxe und Therapie von Infektionen bei Patienten angewandt,

die unter einem Mangel an verschiedenen Antikörpern leiden. Bei Patienten mit normalem Immunoglobulin-Spiegel werden sie in der Prophylaxe viraler Infektionen eingesetzt, z.B. der Hepatitis, bei Masern, Röteln, Windpocken, Mumps, Gelbfieber, Tollwut, Bläschenausschlag und Blattern, bei bakteriellen Infektionen, wie Diphtherie, Keuchhusten und Tetanus, Rh-Unverträglichkeit, wie in der Therapie von schweren antibiotisch-bakterienresistenten Infektionen, wie Staphylococcus und CoIi sepsis, Pseudomonas und Pyocyaneaus septicemia. Das volle klinische Potential der

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ORlGlMAL (NSPGCTED

Immunoglobuline ist noch nicht bestimmt worden.

Humane Immunoglobuline wurden zurr, ersten Mal während, des zweiten Weltkrieges in großem Umfange isoliert. Sehr bald wurde beobachtet, daß eine intravenöse Injektion dieser Präparate Schockreaktionen bei manchen Patienten hervorrief, und anschließend wurde festgestellt, daß die anticomplementäre Aktivität der IgG-Präparate für diese Schockreaktionen verantwortlich ist. Sie ist bedingt durch IgG-Aggregate, die sich während der Fraktionierung bilden.

Mit Rücksicht auf diese Schockreaktionen bei intravenöser Anwenwendung der Immunoglobuline wurden diese therapeutisch wertvollen Stoffe statt dessen intramuskulär gegeben. Aber auch diese intramuskuläre Verabreichung ist in vieler Hinsicht begrenzt. Im besonderen, v/eil

a) sie Schmerzen bereitet,

b) die anwendbare Menge begrenzt ist,

c) die Proteolyse an der Injektionsstelle das verfügbare IgG verringert, und

d) maximale Blutspiegel erst nach drei bis vier Tagen erreicht werden, was einen ernsten Nachteil in jenen Fällen darstellt, wenn hohe Blutspiegel an IgG unmitbeibar nach der Injektion- erforderlich sind.

Darüber hinaus gibt die intravenöse Verabreichung von Immunoglo- bulinen "breitere klinische Anwendungsmöglichfeßiten, weil die volle Dosis an IgG sofort in den Blutkreislauf eintritt, ohne

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daß ein Abbau an der Injektionsstelle eintritt, und weil beträchtlich höhere Blutspiegel erreicht werden können. Diese Überlegungen Laben dazu geführt, daß nach Methoden zur Herstellung von IgG mit niedriger anticoinplementärer Aktivität geforscht wurde, die für intravenöse Injektion brauchbar sind. Die entwickelten Methoden basieren auf einer proteolytischen oder chemischen Behandlung zur Vernichtung der anticomplementären Eigenschaften der Aggregate.

Beispiele für Herstellungen nach diesen Methoden sind:

1) Mit Pepsin behandeltes Immunoglobulin. Das Protein wird weitgehend zu Antikörper fragment en abgebaut (.5S, F(äb')₂). Seine Brauchbarkeit zur Bekämpfung bakterieller Infektionen ist dadurch beschränkt, daß es eine nur kurze Halbwertszeit (etwa 30 Stunden im Vergleich mit 20 bis 30 Tagen für natives IgG) besitzt. Nach Kombination mit Antigenen fixieren die 5S-Fragmente kein Komplement. Es findet in der Prophylaxe keine Anwendung.

2) Mit Plasmin behandeltes Immunoglobulin. Mehr als 60 % dieses Präparats werden zu Fragmenten (Pab und Fc) abgebaut. Das verbleibende 7S-Globulin hat eine normale Halbwertszeit (drei bis vier Wochen), aber sein Antikörperspektrum ist beschränkt»

3) Bei einem pH-Vertvon 4 behandeltes Immunoglobulin. Dieses Präparat neigt dazu, während der Lagerung anticomplementär zu werden. Seine Verträglichkeit ist daher begrenzt und große Dosen hönnen nicht gegeben werden. Die Halbwertszeit ist ein wenig

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geringer (12 bis 14 Tage) und die antibakteriell Aktivität auf einen unbekannten Grad reduziert.

4) Mit ß-Propiolacton behandeltes Immunoglobulin. Die Moleküle sind weitgehend geändert, wahrscheinlich unter Bildung neuer, antigener Determinanten. Die Halbwertszeit beträgt etwa 10 Tage. Die bakteriolytische Aktivität ist vermindert.

Die vier IgG-Unterklassen sind gegen Proteolyse verschieden empfindlich. Die Pepsin-, Plasmin und pH-4-(Iepsin-)Präparate unterscheiden sich daher in ihrer Verteilung in den Unterklassen deutlich vom nnbehandelten IgG.

Wie bereits erwähnt, ist die anerwünschte, anticomplementäre Aktivität, welche die Ursache für die -Schockreaktion bei der intravenösen Verabreichung von IgG bildet, durch die Anwesenheit von Aggregaten bedingt, die während der Fraktionierung entstehen. Bei aen oben erwähnten Präparaten werden diese Aggregate nach ihrer Bildung aeratört, in den meisten Fällen durch chemischen oder enzymatischen Abbau. Dieser Abbau führt aber auch zu einer gewissen Degradation des IgG und demzufolge einem Verlust an Aktivität. Zur Entwick-lung von Methoden, welche aie Bildung von Aggregaten verhindern und Herstellungsweisen für IgG ohne praktisch anticomplementäre Aktivität bringen,ist nur wenig Mühe aufgewandt worden.

In der Deutschen Offenlegungsschrift 2 357 8°° ist ein Verfahren zur Herstellung eines Gamma-Globulins beschrieben worden, das

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sich für intravenöse Verabreichung eignet. Dieses Verfahren erfordert jedoch wie auch andere veröffentlichte Vorfahren zur Herstellung von Gamma-Globulin eine verhältnismäßig reine üainma-Globulin-Fraktion als Ausgangsmaterial. Darüber hinaus besitzt das nach diesem Verfahren erhaltene Gamma-Globulin immer noch hohe anticomplementäre Aktivität.

Gemäß der Erfindung wird «in Verfahren zur Herstellung eines Gamma-Globulins vorgeschlagen, das im wesentlichen keine anticomplementäre Aktivität pufweist und sich für intravenöse Verabreichung eignet, und zwar dadurch, daß lud η unter Aurechterhaltung einer Temperatur von O bis 2U⁰C während des Verfahrens

(a) eine Fraktion II ο ier II+III eines pastenförmigen l'lasniaproteins mit einem Proteingehalt von 25 bis JO % in Wasser suspendiert, eine Lösung mit einer Ionenkonzentration bildet, die

" eine Leitfähigkeit nicht größer als etwa 300 x 10 cm Ohm bei einem pH-Wert von 4,8 bis 6,5 besitzt, und eine Fällung und ein Filtrat herstellt,

(b) Verunreinigungen aus dem Filtrat durch Zugabe von Polyäthylenglykol auf etwa 4# Gewicht/Volumen und danach auf etwa ¹5# Gewicht/Volumen fraktioniert niederschlägt und

(c) das Gamma-Globulin bei einem pH-Wert von etwa 8 durch Zugabe von Polyäthylenglykol auf 12 % Gewicht/Volumen fällt.

Das resultierende Gamma-Globulin-Präparat hat eine biologische Halbwertszeit von etwa drei bis vier Wochen und die Fähigkeit, ein Komplement zu fixieren, wenn es mit dem entsprechenden Antigen kombiniert wird. Sein Antikörper-Spektrum ist bei einem Vergleich

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mit den Typen und Spiegeln der Gaimna-Globulin-Antikörper im Ausgangs-Plasma-Pool und im Ltandard-Gamma-Globulin, das nach der klassischen Äthaiiol-Fraktionic-rur g von Plasma nach (John erhalten wird, praktisch unverändert. ;.o ist das Ausgangsmaterial die leicht zugängliche Fraktion II oder II+III der Plasmaproteine nach Cohn et al., beschrieben im J. Am. Chem. Soc. 68, 459 - 4-75 (194-6). Diese Fraktion, die fast alle Immunoglobuline neben anderen Proteinen enthält, wird der Fraktionierungs-Technik gemiLB der Erfindung unterworfen, welche die Bildung von Aggregaten verhindert, die bislang entstanden; man erhält ein aktives Gamma-Globulin, das praktisch keine anticomplemantäre Aktivität be-.it.st uriu sich für intravenöse Anwendung eignet.

Nach dem Verfahren wxrd eine l'aste aus derj Plasmaproteinen der Fraktion II oder Il+ill mit Wasser bei einem pH-Wert von etwa 4,8 bis 6,5i vorzugsweise von 5 »5 oder 5j7 bis 5» 9, extrahiert. Verwendet wird pyrogenfreies Wasser, üblicherweise in einem Volumen von 25 bis 45, vorzugsweise etwa 3®i -Litern je Kilogramm Paste mit einem Proteingehalt von etwa 25 bis ^O Gew.-%. Zur Einstellung des pH-Werten kann jede nichttoxische, pharmazeutisch verträgliche, organische oder anorganische Säure, wie Essig-, Milch-, Chlorwasserstoff- oder Schwefelsäure verwendet werden. Das wasserunlösliche Material wird abgetrennt, das FiI-trat fraktionierenden Fällungen mit Polyäthylenglykol mit aufeinander folgenden Gewicht/Volumen-Konzentrationen von 4, 5 und 12 %i zuletzt bei einem pH-Wert von .etwa' 8,0, unterworfen. Die ersten zwei fraktionierenden Fällungen entfernen Verunreinigungen und die letzte Fällung führt zum angestrsbten Gan.ma-Globulin

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gemäß der Erfindung. Das bevorzugte Polyäthylenglykol hat ein Molekulargewicht von etwa 4 uOO bis 6 000. Jede nichttoxische, pharmazeutisch verträgliche, anorganische oder organische Base kann zur Einste lung des pH- /erts auf etwa 8,0 in der Endstufe eingesetzt werd ;n. Das Verfahren kann bei einer Temperatur von etwa 0 bis LO, /orzugsweise von etwa 0 bis 5⁰C₁ durchgeführt werden.

Es wird angenommen, daß das Ausbleiben einer Bildung von Aggregaten in erster Linie der Verwendung von Polyäthylenglykol und eines Mediums niedriger Ionenkonzentration bei der Fraktionierung zuzuschreiben .st, die dazu dient, eine Denatarierung der Proteine merklich herabzumindern. Die niedrige Leitfähigkeit des Mediums (300 χ 10" cm C hm ) ist ein Anzeichen für seine geringe Ionenkonzentration.

Das Verfahren wird im Beispiel 1 ausführlich beschrieben.

Beispiel 1

Ein Kilogram pastenform-£es Plasmaprotein der Fraktion II+III mit einem Protein gehalt von 25 bis 30 % wird in 30 Litern pyrogenfreiem, destillierte© Wasser suspendiert und gerührt, bis -sich eine schwachgelbliche Suspension gebildet hat. Die Temperatur wird bei 5°C gehalten. Durch Zugabe von 20 ml 10-prozentiger Essigsäure auf jedes Kilogramm Fraktion II und III-Paste wird der pH-Wert auf 5,8 erniedrigt. Nach 15 Minuten Rühren läßt man zwei oder drei Stunden absetzen. Die klare, überstehende Flüssigkeit wird dann durch Filtration über ein saures Filter,

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Nummer 9, Asbest-Watte, gereinigt.

Polyäthylenglykol (IEG), Molecule- rgewicht im Durchschnitt 4GüO, Qualität gemäß eier US-Pharmakopoc , wird in Pulver- oder Flockenform auf eine Konzentration von 4 Gramm je 100 Milliliter Filtrat zugesetzt. Das (,emisch wird gerührt, bis die PEG-Su sp ens ion in Lösung gegangen ist; die resultierende Fällung läßt man eine oder zwei Stunden absetzen. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Filtration über ein Säurefilter, Nummer 9, Asbest-Watte, aufgenommen.

Danach wird die l^jEG- konzentration auf 5 % Gewicht/Volumen erhöht. Beim Rühre ι ge it das Polyäthylenglykol in Lösung; diese läßt man eine oa3r mehrere Stunden stehen. Danach wird die überstehende Flüssig ceit wieder über Asbest-Watte Nummer 9 filtriert.

Durch Zugabe von 6 % Tri-hydroxy-äthyl-amino-methan (THAM) wird der pH-Wert auf 3 erhöht. Das Garuma-Globulin wird dann durch Zupatz von PEG auf 12 % gefällt. Nach Absetzen der weißen Fällung wird zentrifugiert und die Fällung aufgenommen.

Das auf diese Weise erhaltene Gamma-Globulin ist ein immunologisch aktives, nicht modifiziertes IgG mit einem Titer von etwa ■ 0 bis 0,02 Einheiten per Milligramm anticompleraentärer Aktivität, bestimmt nach der Methode von Kabat und Mayer, Experimental Immunoeftemistry, 2. Ausgabe, Thomas (Springfield, 111.), Seite 905 ff' es kann unmittelbar in pharmazeutische Präparate für intravenöse Anwendung eingearbeitet werden.

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Darüber hinaus hat das Gamtna-Globulin einen üedimentationskoeffizienten von 7 S und enthält keine Lggref;ate und Abbauprodukte, wie !'(ab)., F(ab)p und I¹C. Geire wässerigem Lösungen :;ind klar und farblos, sie opalescieren nicht oder weruon trüb wie wässerige Lösungen von Gamma-Globulinen, die nach anderen Methoden erhalten wurden. Abweichend von einem nach digestiven Methoden gewonnenem Gamma-Globulin besitzt das erhaltene Gamma-Globulin ein Antikörper-Spektrum, das sich gegenüber dem Ausgangs-Plasma nicht geändert hat. l)ie Unterklassen-Verteilung des Gamma-Globulins (d.h. die relativen iiengen von IgG 1, 2, 3, 4) ist von der des Ausgangs-Plasmas nicht verschieden.

Das Gamma-Globulin gemäß der Erfindung kam. ohne Mühe in pharmazeutische Präparate eingearbeitet werden, ei Le für intravenöse Anwendung bestimmt ί iivd. Bei der Formulierung solcher Präparate wird das Gamma-Gaooulin in. geeigneter Weise in einer wässerigen Lösung gelöst, üij zwisctien etwa Ij,4- bis 6,7 gepuffert ist und Glycin uni Albuniii enthält. Der pil-Wert des Präparates wird nach Wunsch im allgemeinen auf etwa 5,4 bis 6,7 eingestellt. Die Konzentration des G&>nua-Globalins im rräparat betrügt zweckmäßig etwa 5 Gew.-^. Geeignete Puffer schließen Phosphat- und imtriumacetat-E:.sigsäure-Systerne ei.i.

" Zur Vermeidung oder Verminderung eine;" Denaturierung an einer llüssigkeit/Luft- oder Flüsvigkeit/Fe.-ststoff-Zwischenfläche des in Lösung befindlichen Produkts ist e.; von Vorteil, der pharmazeutischen Zusammensetzung ein oberflächenaktives Mittel zuzusetzen. Geeignete Mittel die ser A.'t sind nichtionische ober-

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flächenaktive Kittel wi« die Block-Copolymeriüate aus iropylen- und Äthylenoxiden , z.B. Pluronic 68 (poloxamer 1Ö8) und die Teilester von Sorbit unc ΡοΓ/cxyäthylenoxid langkettiger 1-ettsäuren, v/ie die Tweens ί j, 40, 60, 80 und 85 (Polysorbate 20, 40, 60, bO und 95)» wasserlösliche Stoffe, die in der Ausgabe 1973 des GTFA Cosmetic ingredient Dictionary der Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., beschrieben sind, und fluorhaltige oberflächenaktive Mittel, wie Zonyl FuA₁ FSB, FSC und FSN. Dieso nichtionischen oberflächenaktiven Mittel stabilisieren die Proteine gegen eine ti an turierung an der Oberfläche j sie enthalten ;.ls Teil ihrer Struk .u · keine chemische Gruppen, die irgendwie nit den Proteinen rt ^; oren oder sie abbauen körnen

Das erfindurigs :emäße Gamma-Globulin zeigt bei Lagerung in der Form solcher pnarmazeutischer Zusammensetzungen im allgemeinen eine längere Halbwertszeit als die anderen, zur Zeit auf dem Markt befindlichen Gamma-Globulin-Präparate.

Beispiel 2 üT'l iutert dlt,· Heratellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die d_as erfindungsgemäße Gamma-Globulin für intravenöse Anwendung enthält„

Beispiel 2

Der in Beispiel 1 hergestellte Niederschlag wird in einer Lösung bei 5°C in Lösung gebracht, die 5 g/l Albumin, 0,1 % Tween 80, Q,15 Mol Glycin, 0,025 WoI Natriumacetat und 0,0125 Mol Essigsäure enthält; dabei wird so wenig wie möglich Schaum erzeugt.

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Es stellt sich ein pH-Wert von ^,4- ois 5»5 ein. Auf Wunsch kann er durch vorsichtige Zugabe von THAii in einer Wange von 0,O^ Mol auf einen Wert von 6,4 gebracht werben. Dann wird der Gehalt an IgG gemessen und die Lösung so gestellt, daß sie 5 g IgG je 10Q ml Lösung enthält, indem mehr verdünnt oder mehr Niederschlag aus Beispiel 1 zagegeben wird. An Stelle von Twoen 80 können andere Tweens odor KLuronic u8 verwendet werden.

Für ein flüssiges Produkt wird die Lösung steril filtriert und abgefüllt. Für iin lyoptiilisiertes Produkt wird das flüssige Produkt in AmpuLlen gefüllt und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird es in pyro enfreieu, sterilen Wasser aufgelöst.

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Claims

Patentansprüche

Gamma-Globulin für intravenöse Anwendung,das O bis etwa 0,02 Einheiten je Milligramm an anticomplementärer Aktivität aufweist, einen Sedimentationskoeffizienten von 7 S besitzt, von Aggregaten und Abbauprodukten P(ab)^, P(ab)o oder Pc praktisch, frei ist, sich in Wasser zu klaren und farblosen Lösungen löst und dessen Antikörper-Spektrum und Unterklassen-Verteilung gegenüber Plasma im wesentlichen unverändert ist.
2. Gamma-Globulin nach Anspruch 1 in wässriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung Albumin, Glycin und einen Puffer, vorzugsweise einen Essigsäure-Acetat-Puffer, bei einem pH-Wert von 5>4- bis 6,7 enthält.
3. Gamma-Globulin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung etwa 5 Gew.-% Gamma-Globulin enthält.
4. Gamma-Globulin nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung ein nichtionisches, oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise ein Polyoxyäthylen-Derivat eines Fettsäure-Partialesters von Sorbit oder ein Äthylenoxid- Addukt eines PolypropylenglykoIs enthält.

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5. Verfahren zur Herstellung eines Gamma-Globulins nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet;', daß man unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von O bis 20, vorzugsweise O bis 5°G, während des Verfahrens

(a) eine Fraktion II oder II+III eines pastenförmigen Plasmaproteins mit einem Proteingehalt von 25 bis 30 % in Wasser suspendiert, eine Lösung mit einer Ionenkonzentration bildet, die eine Leitfähigkeit nicht größer als etwa 300 χ 10"⁶cm~¹0hm~¹ bei einem pH-Wert von 4,8 bis 6,5,
vorzugsweise 5>7 bis 5»9 und insbesondere etwa 5j8 besitzt, und eine Fällung und ein Filtrat herstellt,

(b) Verunreinigungen aus dem Filtrat durch Zugabe von Polyäthylenglykol auf etwa 4 % Gewicht/Volumen und danach auf etwa 5 % Gewicht/Volumen fraktioniert niederschlägt und

(c) das Gamma-Globulin bei einem pH-Wert von etwa 8 durch Zugabe von Polyäthylenglykol auf 12 % Gewicht/Volumen fällt.
6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß in der Verfahrensstufe (a) etwa 30 Liter pyrogenfreies Wasser verwendet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4 000 bis 6 000, vorzugsweise etwa 4 000, verwendet wird.

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ORIGINAL INSPECTED