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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung einer Immunglobulin-G enthaltenden Fraktion aus menschlichem oder tierischem Plasma zur Herstellung von Präparationen zur intravenösen Anwendung für die Behandlung von primären und sekundären Immundefekten, A- oder Hypogammaglubulinämie, bei Antikörpermangelsyndrom, bei Virusinfektionen oder bakteriellen Infektionen sowie bei Autoimmun- und Immunkomplexerkrankungen.
Zur Gewinnung von immunglobulinhältigen Präparationen aus menschlichem und tierischem
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Weiters ist eine Methode bekannt, nach der Immunglobulin aus Plasma mittels Ammonsulfat und Polyäthylenglykol gefällt wird (A. Polson, G. M. Potgieter, J. F. Largrier, G. E. F. Mears und F. J. Jourbet, Biochim. Biophys. Acta. 82,463 [1964]). Nach andern Verfahren wurde die Anwendung von Ionenaustauschern vorgeschlagen (E. A. Peterson und H. A. Sober, J. Am. Chem. Soc.
78, 751 [1956]).
Diese Methoden hatten den Nachteil, dass die gewonnenen Präparate lediglich für eine intramuskuläre Applikation geeignet waren. Bei intravenöser Anwendung zeigten sie unerwünschte Nebenreaktionen, wie eine vasoaktive Wirkung.
Man hat sich daher bemüht, Nebenerscheinungen bzw. Nebenwirkungen zu verringern, zu welchem Zweck immunglobulinhältige Präparate mit löslichen proteolytischen Enzymen, wie Pepsin, Plasmin, Papain u. a. behandelt wurden (DE-PS 1148037). Bei dieser Behandlung wird jedoch die Molekülstruktur der Immunglobuline verändert, mit der Folge einer verkürzten biologischen Halbwertszeit. Es wurde auch festgestellt, dass Enzymreste in den Präparaten zurückbleiben, wodurch diese kontaminiert werden. Die Lagerstabilität ist dementsprechend gering, die Gefahr des Fortschreitens der proteolytischen Spaltung gross.
Es wurde gefunden, dass es für Immunglobulin-G-hältige Fraktionen, die zur Herstellung von Präparationen zur intravenösen Anwendung geeignet sind, wesentlich ist, dass sie einen bestimmten Mindestgehalt an funktionell intakten IgG-Molekülen aufweisen und eine bestimmte pharmakologische Reinheit, ausgedrückt in Kennwerten von vasoaktiven und leukopenisch wirksamen sowie von bronchospastischen Substanzen, besitzen.
Erfindungsgemäss ist für die in Aussicht genommene Verwendung der Immunglobulin-G-hältigen Fraktionen charakteristisch, dass die Fraktionen bei der Bestimmung gemäss der Protein-A-Sepharose Methode (FEBS Letters, Vol. 28,1972, 73 ff., H. Hjelm et al.) mindestens 90% funktionell intakte IgG-Moleküle enthalten und im wesentlichen frei sind von vasoaktiv und leukopenisch wirksamen sowie von bronchospastischen Substanzen, ausgedrückt durch folgende Merkmale :
a) dass die vasoaktive Wirkung im Hundetest als Durchschnitt bei vier Tieren, d. h. ein
Blutdruckabfall von höchstens 30%, erst bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg Körper- masse b) dass die leukopenische Wirkung im Hundetest als Durchschnitt bei vier Tieren, d. h. ein Abfall der Leukozytenzahl von höchstens 50%, erst bei einer Dosis von mehr als
500 mg/kg Körpermasse, und c) dass die bronchospastische Wirkung im Meerschweinchentest als Durchschnitt bei vier
Tieren, d. h. ein Atemdruckanstieg von höchstens 30%, erst bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg Körpermasse feststellbar ist.
Die vasoaktive Wirkung wird in folgender Weise festgestellt :
Versuchstieren (Mischlingen beiderlei Geschlechts) wird nach Narkotisierung die Vena jugularis und die Arteria carotis präpariert. Vor der Anästhesie wird eine Fastenzeit vom mindestens 12 h angesetzt. Pro Testsubstanz werden je vier qualifizierte Hunde, d. h. solche Tiere benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem intramuskulär anwendbarem Immunglobulin ("Standardsubstanz") eine vasoaktive Wirkung (Blutdruckabfall) von mindestens 30% bei einer Dosierung von 50 mg/kg Körpergewicht zeigen. Dieses standardisierte intramuskulär anwend-
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gezogen werden.
Von der Standardsubstanz werden 160 mg in 1 ml Aqua ad iniectabilia gelöst und mit isotoner NaCl-Lösung auf 16, 7 mg/ml verdünnt. Das aufgelöste Material wird innerhalb von
4 h verwendet.
Ein erfindungsgemäss verwendbares Immunglobulin-G wird mit Aqua ad iniectabilia so gelöst, dass 1 ml 165 mg Protein enthält. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h ver- wendet.
Die Tiere werden mit einer intravenösen Einzeldosis von 40 mg/5, 5-Diäthylbarbitursäure (Barbitural) /kg Körpermasse anästhesiert, und die Vena jugularis externa wird nach ihrer Auf- teilung am unteren Rand des Unterkiefers präpariert und ein Katheter eingebunden. Danach wird die Arteria carotis vom gleichen Hautschnitt aus freigelegt und ein Katheter eingebunden.
Nach der Präparation der Arterie wird 30 min zugewartet, um stabile Ausgangswerte zu erreichen.
Über den tiefen Venenkatheter wird der zentrale Venendruck und über den seichten arteriellen
Katheter wird der arterielle Blutdruck mit Hilfe eines Drucktransducers gemessen. Über den arteriellen Katheter wird zuerst das iv. anwendbare Immunglobulin-G und dann die Standard- substanz injiziert.
Während der gesamten Zeit der Versuchsdurchführung wird über den Arterienkatheter der systolische und diastolische Blutdruck mit Hilfe des Drucktransducers aufgezeichnet.
Der Blutdruckmittelwert (systolisch und diastolisch) sowie der Mittelwert der Leukozyten- zahl vor der Injektion der Testsubstanz und der Standardsubstanz werden bestimmt. Der maxi- male Blutdruckabfall wird durch Messung des Blutdruckes über 20 min nach Injektion der Test- substanzen bestimmt.
Die vasoaktive Wirkung von iv. anwendbarem Immunglobulin-G wird so ermittelt, dass
500 mg/kg Körpermasse Hund injiziert werden und der durchschnittliche prozentuelle systoli- sche und diastolische Blutdruckabfall bei vier Hunden mit der blutdrucksenkenden Wirkung von im. anwendbarer Standardsubstanz verglichen wird.
Die Bestimmung der leukopenischen Wirkung wird in folgender Weise durchgeführt :
Versuchstieren (Mischlingshunden beiderlei Geschlechts) wird nach Narkotisierung die Vena jugulars und die Arteria carotis präpariert. Vor der Anästhesie wird eine Fastenzeit von mindestens 12 h angesetzt. Pro Testsubstanz werden je vier qualifizierte Hunde benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem intramuskulär anwendbarem Immunglobulin (Standardsubstanz) eine leukopenische Wirkung (Leukozytenabfall) von mindestens 50% bei einer Dosierung von 50 mg/kg Körpermasse zeigen. Hunde, die auf die Standardsubstanz keine Reaktion zeigen, können für die Vergleichstests nicht herangezogen werden.
Die Vorbereitung der Versuchstiere und der Testsubstanzen erfolgt in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben.
Zur Untersuchung der Leukozytenzahl werden Blutproben gezogen. Bei der ersten Blutprobe werden 40 ! LI Blut mit 20 ml Isotone II (COULTER) und sechs Tropfen Zapoglobin (COULTER) versetzt und im Coulter Counter gemessen. Anschliessend werden nach 10,15, 16,17, 18 und 19 min weitere Blutproben zur Bestimmung der Leukozytenzahl gezogen. Dann werden sofort 500 mg Immunglobulin/kg Körpermasse iv. anwendbaren Immunglobulins-G innerhalb von 90 s intraarteriell injiziert. 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min nach Injektion werden weitere Blutproben gezogen. Nach 20 min werden 50 mg Immunglobulin/kg Körpermasse der Standardsubstanz innerhalb von 90 s injiziert. Blutproben werden wieder nach 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min gezogen.
Die maximale Senkung der Leukozytenzahl wird durch Bestimmung von Blutproben, die 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min nach der Injektion der Probe gezogen werden, bestimmt.
Die leukopenische Wirkung von iv. anwendbarem Immunglobulin-G wird so ermittelt, dass 500 mg/kg Körpermasse Hund injiziert werden und der durchschnittliche prozentuelle Leukozytenabfall bei vier Hunden mit der leukopenischen Wirkung von im. anwendbarer Standardsubstanz
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verglichen wird.
Die Bestimmung der bronchospastischen (atemdrucksteigernden) Wirkung beim Meerschwein- chen erfolgt in folgender Weise :
Versuchstieren (Meerschweinchen männlichen Geschlechts) wird nach Narkotisierung die
Luftröhre im Kehlkopfbereich präpariert. Nach Intubation wird das Versuchstier mittels eines
Beatmungsgerätes mit einem dem Körpergewicht des Tieres entsprechenden Atemvolumen bei einer
Atemfrequenz von 80/min beatmet. Danach wird die Arteria carotis vom gleichen Hautschnitt aus freipräpariert. Nach intraarterieller Injektion der Testsubstanz wird der Atemdruck laufend gemessen.
Für den Test werden laborgezüchtete Meerschweinchen männlichen Geschlechts mit einem
Körpergewicht zwischen 500 und 700 g verwendet. Pro Testsubstanz werden vier qualifizierte
Meerschweinchen benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem im. anwend- barem Immunglobulin (Standardsubstanz) einen Atemdruckanstieg um mindestens 30% bei einer
Dosierung von 50 mg/kg Körpermasse zeigen. Meerschweinchen, die auf die Standardsubstanz keine Reaktion zeigen, können für die Vergleichstests nicht herangezogen werden.
Von der Standardsubstanz werden 160 mg in 1 ml Aqua ad iniectabilia gelöst und mit isotoner NaCl-Lösung auf 16, 7 mg/ml verdünnt. Das aufgelöste Material wird innerhalb von
4 h verwendet.
Ein iv. anwendbares Immunglobulin-G wird mit Aqua ad iniectabilia so gelöst, dass 1 ml
165 mg Protein enthält. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h verwendet.
Die Tiere werden narkotisiert ; dann wird die Luftröhre im Kehlkopfbereich präpariert, und eine Trachealkanüle wird eingebunden. Mittels eines Beatmungsgerätes wird das Versuchstier mit einem dem Körpergewicht entsprechenden Atemvolumen bei einer Atemfrequenz von 80/min beatmet. Als Beatmungsgerät wird eine Harvard Pumpe Type 681 verwendet.
Danach wird die Arteria carotis vom gleichen Hautschnitt aus freipräpariert und ein Katheter eingebunden. Die Beatmungsdruckregistrierung erfolgt über einen Drucktransducer, der an den Beatmungsschlauch mit Hilfe eines T-Stückes angeschlossen ist.
Nach der Präparation wird zumindest 10 min gewartet, um stabile Ausgangswerte zu erreichen. Danach wird der Nullpunkt festgestellt und nach weiteren 2 bis 3 min 150 mg Immunglobulin/kg Körpermasse iv. anwendbares Immunglobulin-G innerhalb von 90 s intraarteriell über den Katheter injiziert.
Nach 20 min werden 50 mg Standardsubstanz/kg Körpermasse innerhalb von 90 s intraarteriell injiziert.
Der maximale Atemdruckanstieg während der auf die Injektion der Probe folgenden 20 min wird bestimmt und auf den Ausgangsmittelwert bezogen.
Die bronchospastische Wirkung von iv. anwendbarem Immunglobulin-G wird so ermittelt, dass 500 mg/kg Körpermasse Meerschweinchen intraarteriell injiziert werden, und der durchschnittliche prozentuelle Atemdruck bei vier Meerschweinchen mit der atemdrucksteigernden Wirkung von im. anwendbarem Immunglobulin-G, Standardsubstanz, verglichen wird.
Erfindungsgemäss verwendbare Immunglobulin-G enthaltende Fraktionen, die in optimaler Weise nebenwirkungsfrei sind, können dadurch hergestellt werden, dass eine aus menschlichem oder tierischem Blut gewonnene Fraktion mit an wasserunlösliches Trägermaterial gebundenen Pankreasenzymen, wie Trypsin oder Chymotrypsin oder Pankreasprotease, behandelt wird und die behandelte Fraktion gegebenenfalls einer weiteren Fraktionierung und Konzentrierung unterworfen wird.
Hiebei wird vorteilhaft als wasserunlösliches Trägermaterial Sepharose 4 B-Gel verwendet.
Das gereinigte Immunglobulin kann aus der mit an wasserunlösliches Trägermaterial gebundenen Enzymen behandelten immunglobulinhältigen Fraktion, gegebenenfalls nach Entfernen unerwünschter Begleitstoffe, mit Proteinfällungsmittel ausgefällt und zu einem Endprodukt verarbeitet werden.
Im besonderen hat sich eine Kombination der folgenden Reinigungs- und Konzentrationsmassnahmen bewährt : dass aus menschlichem oder tierischem Plasma durch Behandeln mit Äthanol bei einer Tem-
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Tabelle 1 Gelpermeationschromatographie
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<tb> Ve <SEP> IV <SEP> 0 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 1,29 <SEP> 1,30 <SEP> - <SEP> 2,20 <SEP> 2,21 <SEP> - <SEP> 2,70
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> Spuren <SEP> 92, <SEP> 4% <SEP> 7, <SEP> 6% <SEP>
<tb> Beispiel <SEP> 2-93, <SEP> 2% <SEP> 6, <SEP> 8% <SEP>
<tb> Beispiel <SEP> 3-91, <SEP> 8% <SEP> 8, <SEP> 2% <SEP>
<tb>
In der Tabelle 2 ist das Verhältnis der an Protein A gebundenen und der nichtgebundenen IgG-Moleküle dargestellt, wobei die gefundenen den funktionell intakten entsprechen. Wie ersichtlich, ist der Gehalt der funktionell intakten IgG-Moleküle in der gesamten Fraktion über 90%.
Tabelle 2
Affinitätschromatographie mit Protein A-Sepharose
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<tb>
<tb> % <SEP> von <SEP> gesamter <SEP> Immun-
<tb> % <SEP> von <SEP> Fraktion <SEP> Ve/Vo <SEP> globulin-G <SEP> enthaltender
<tb> 1, <SEP> 30-2, <SEP> 30 <SEP> Fraktion
<tb> nichtgebunden <SEP> gebunden
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 98, <SEP> 5 <SEP> 91, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Beispiel <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 99, <SEP> 1 <SEP> 92, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Beispiel <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 98, <SEP> 8 <SEP> 90, <SEP> 7 <SEP>
<tb>
In Tabelle 3 sind die Werte für die antikomplementäre Aktivität und für die Elektrophorese angegeben, woraus ersichtlich ist,
dass bei den Präparationen nach allen Beispielen Werte der antikomplementären Aktivität von mehr als 50 mg Immunglobulin-G enthaltender Fraktion zur
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Y-Globulin von mehr als 97% erhalten wurden.
Tabelle 3
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<tb>
<tb> Antikomplementäre
<tb> Aktivität <SEP> Elektrophorese
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> > 50 <SEP> mg/C'H-50 <SEP> > 97, <SEP> 0% <SEP> reines <SEP> Y <SEP> -Globulin <SEP>
<tb> Beispiel <SEP> 2 <SEP> > 50 <SEP> mg/C'H-50 <SEP> > 97, <SEP> 0% <SEP> reines <SEP> y-Globulin <SEP>
<tb> Beispiel <SEP> 3 <SEP> > 50 <SEP> mg/C'H-50 <SEP> > 97, <SEP> 0% <SEP> reines <SEP> y-Globulin
<tb>
Die pharmakologischen Merkmale bzw.
Kennwerte der nach den Beispielen 1 bis 3 hergestellten Immunglobulin-G enthaltenden Fraktionen, nämlich die vasoaktive und leukopenische Wirkung im Hundetest und die bronchospastische Wirkung im Meerschweinchentest, wurden wie im Vorherstehenden beschrieben bestimmt ; diese Werte sind aus den folgenden Tabellen zu ersehen :
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Tabelle 4 Durchschnittsblutdruck von vier Hunden in % des Ausgangs- wertes nach Injizierung von 500 mg der
Präparation pro kg Körpermasse
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<tb>
<tb> Systolischer <SEP> Diastolischer
<tb> Blutdruck <SEP> Blutdruck
<tb> Präparation <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 91% <SEP> 86%
<tb> Präparation <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 2 <SEP> 93% <SEP> 89%
<tb> Präparation <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 3 <SEP> 81% <SEP> 79% <SEP>
<tb>
Tabelle 5 Durchschnittsleukozytenzahl von vier Hunden in % des
Ausgangswertes nach Injizierung von 500 mg der
Präparation pro kg Körpermasse
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 73%
<tb> Beispiel <SEP> 2 <SEP> 62%
<tb> Beispiel <SEP> 3 <SEP> 52%
<tb>
Tabelle 6
Durchschnittsatemdruckanstieg von vier Meerschweinchen in % des Ausgangswertes
nach Injizierung von 500 mg der
Präparation pro kg Körpermasse
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 102%
<tb> Beispiel <SEP> 2 <SEP> 110%
<tb> Beispiel <SEP> 3 <SEP> 125%
<tb>
Die Überlegenheit der erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G enthaltenden Fraktionen gegenüber den bekannten, intramuskulär anwendbaren ist mit grosser Anschaulichkeit aus den Diagrammen II bis IV zu ersehen.
Im Diagramm II sind die Blutdruckkurven bei systolischer und diastolischer Messung von jeweils vier Hunden aufgezeichnet, wobei auf der Abszisse jeweils die verabreichten Mengen in mg/kg Körpermasse der Tiere aufgetragen sind. Die voll ausgezeichnete Linie im Bereich von A bis B entspricht dem Verlauf des Blutdruckes bei Verabreichung von erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G enthaltenden Präparaten ;
der Verlauf der Kurve von A bis C (voll ausgezogene Linie und strichlierte Linie) entspricht dem Verlauf der Blutdruckkurve bei Applikation der im.-Standardsubstanz. Es ist ersichtlich, dass bei einer Applikation der im. anwendbaren Standardsubstanz von 5 mg/kg Körpermasse der Blutdruck um 30% abgefallen ist, wogegen bei der Applikation des erfindungsgemäss verwendbaren Präparates dieser Abfall erst bei einer Dosierung von 500 mg/kg Körpermasse auftritt, d. h. das erfindungsgemäss verwendbare Immunglobulin hat eine um das mindestens 100fach geringere vasoaktive Wirkung als die bekannten im. anwendbaren Präparate unter sonst gleichen Bedingungen.
Aus dem Diagramm III ist die leukopenische Wirkung im Hundetest als Durchschnitt von vier Tieren im Vergleich zwischen dem erfindungsgemäss verwendbaren Präparat und dem standardisierten, im. anwendbaren Standardpräparat zu ersehen. Die voll ausgezogene Linie im Bereich von A bis B entspricht dem erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G enthaltenden Präparat, und die Linie von A bis C (voll ausgezogene Linie und strichlierte Linie) dem Abfall der Leukozy-
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tenzahl bei Applikation der im. anwendbaren Standardsubstanz.
Es ist ersichtlich, dass bei einer Applikation der im. anwendbaren Standardsubstanz die Leukozyten um 50% abgefallen sind, wogegen bei der Applikation des erfindungsgemäss verwendbaren Präparates dieser Abfall erst bei einer Dosierung von 500 mg/kg Körpermasse auftritt, d. h. das erfindungsgemäss verwend- bare Immunglobulin-G enthaltende Präparat hat eine um das mindestens 1000fach niedrigere leukopenische Wirkung als die bekannten, im. anwendbaren Präparate unter sonst gleichen Be- dingungen.
Ähnlich sieht der Vergleich der bronchospastischen Wirkungen im Meerschweinchentest gemäss dem Diagramm IV aus, wobei der Verlauf der Kurve von A bis B (voll ausgezogene Linie) dem erfindungsgemäss verwendbaren Präparat und der Verlauf der Kurve von A bis C (voll ausgezogene und strichlierte Linie) dem standardisierten im. anwendbaren Präparat entspricht. Der 30%ige
Atemdruckanstieg erfolgt beim bekannten im. anwendbaren Präparat schon bei einer Dosierung von 2 mg/kg Körpermasse, wogegen der gleiche Anstieg beim iv. anwendbaren Präparat erst bei einer Dosis von 500 mg/kg Körpermasse erfolgt, d. h. dass die bronchospastische Nebenwir- kung bei dem erfindungsgemäss anwendbaren Präparat um das 250fache geringer ist.
Auf Grund ihrer chemischen Zusammensetzung und ihrer pharmakologischen Eigenschaften sind die erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G enthaltenden Fraktionen in hervorragender
Weise zur Verwendung für die Behandlung von primären und sekundären Immundefekten, Aoder Hypogammaglobulinamie, bei Antikörpermangelsyndrom, bei Virusinfektionen oder bakteriellen
Infektionen sowie bei Autoimmun- und Immunkomplexerkrankungen geeignet.